BRPI0621544A2

BRPI0621544A2 - biossensores para mensuração de produto de análise em fluido e de nìveis de glicose no sangue e respectivo método de produção

Info

Publication number: BRPI0621544A2
Application number: BRPI0621544-0A
Authority: BR
Inventors: Dennis Slomski; Natasha Popovich
Original assignee: Home Doagnostics Inc
Priority date: 2006-04-18
Filing date: 2006-04-18
Publication date: 2011-12-13
Also published as: AU2006342199A1; WO2007120149A1; EP2016400A1; MX2008013231A; NO20084811L

Abstract

BIOSSENSORES PARA MENSURAçãO DE PRODUTO DE ANáLISE EM FLUIDO E DE NìVEIS DE GLICOSE NO SANGUE E RESPECTIVO MéTODO DE PRODUçãO. é aqui revelado um biossensor para medir produto de análise num fluido que compreende uma camada de substrato tendo disposto sobre ela pelo menos um dentre cada um de um elétrodo, um cátodo, um ânodo e um material espaçador inovativo. O material espaçador de acordo com a presente revelação compreende uma camada orgânica vedável pelo calor que cobre pelo menos uma parte do ânodo e define pelo menos uma extremidade do ânodo, em que o material espaçador tem pelo menos um orificio perfurado através dele e define uma cavidade ou poço para aceitar produto quimico. Também é revelado um método de fazer esses biossensores.

Description

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Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido e de Níveis de Glicose no Sangue e Respectivo Método de Produção"

Relatório Descritivo

A presente revelação relaciona-se com biossensores para medir um produto de análise num fluido corpóreo, atl como sangue, em que o biossensor compreende um material espaçador orgânico vedável a quente que define particularmente pelo menos uma extremidade de um elétrodo operacional disposto no biossensor. A presente revelação também se relaciona com métodos de produzir o biossensor e métodos de medição de produtos de análise em fluido corpóreo usando o bios- sensor.

Os sensores eletroquímicos têm sido usados desde há longo tempo para detectar e/ou medir a presença de produtos de análise numa amostra fluida. No sentido mais básico, os sensores eletroquími- cos compreendem uma mistura de reativo contendo pelo menos um agente de transferência de elétrons (também chamado de um "mediador de elétrons") e uma proteína biocatalítica específica de produtos de análise e um ou mais elétrodos. Esses sensores contam com a transfe- rência de elétrons entre o mediador de elétrons e as superfícies de elétrodo e funcionam medindo reações redox eletroquímicas. Quando usadas num sistema ou dispositivo de biossensores eletroquímicos, as reações de transferência de elétrons são transformadas num sinal elétrico que se correlaciona com a concentração do produto de análise sendo medido na amostra fluida.

Os sensores de glicose eletroquímicos são baseados em medições da corrente resultante a partir da oxidação de uma forma reduzida do mediador, gerada por reações entre a molécula de glicose, uma oxidoredutase e a forma oxidada do mediador. O sinal medido num sensor de glicose é diretamente proporcional à área do ânodo; conseqüentemente, a precisão de um dispositivo/teste de glicose do sangue pode ser diretamente correlacionada com a definição de área de ânodo e controle. Se as extremidades de um elétrodo forem irregulares e variam de meio para meio, a área do elétrodo e, portanto, a medição também variará de meio para meio. Por estas razões, as extremidades do elétrodo são um fator importante para o desenvolvimento de bios- sensores mais precisos com extremidades lisas sendo desejáveis para assegurar a precisão e exatidão da medida.

Além da precisão melhorada, a resolução espacial do elétrodo é importante porque quanto menor a área de superfície do elétrodo, menor o volume de amostra exigido. Isto é desejável, por exemplo, com a monitoração de glicose para diabéticos, em que o paciente deve testar a sua glicose no sangue múltiplas vezes ao dia. Os requisitos de menor volume de sangue permitem que o paciente obte- nha sangue a partir de áreas com densidades capilares mais baixas do que os dedos, tais como o braço e antebraço superiores, que são menos dolorosos de lancetar.

Um método atualmente usado para o fabrico de biossenso- res é a impressão de tela. A impressão de tela envolve colocar uma tela de malha com um padrão de elétrodo sobre um substrato e, então, espalhar uma pasta eletroativa sobre a tela. Como a impressão de tela envolve extrudir a pasta através da tela sobre o substrato, é difícil obter padrões de elétrodo com pequena resolução e extremidades lisas. Por exemplo, no ânodo de sensores de glicose de tela impressa tradicional, a área é definida por extremidades da tinta de carbono de elétrodo e tinta dielétrica. Além disso, uma camada adicional é tipicamente necessária para formar o poço da amostra e, em muitos casos, esta camada é também uma tinta dielétrica de tela impressa. Com a tecnologia atual de impressão de tela, uma camada dielétrica é necessária para definir o ânodo. Portanto, a área do ânodo e, deste modo, a precisão do biossen- sor resultante é uma função do método de deposição da camada dielé- trica, assim como também a química desta camada.

Ligado à necessidade de melhor definir a área do ânodo, é um desejo simplificar as etapas de fabrico da nova geração de biossen- sores, a ílm de proporcionar um processo mais robusto, elevados rendimentos de produção e sensores de alta qualidade. Novos materiais estão sendo explorados que poderiam ser benéficos para atingir esta meta.

Para resolver os problemas precedentes, os Inventores desenvolveram um método único de definir a área de ânodo de um biossensor utilizando um material espaçador vedável pelo calor para definir com precisão uma ou mais extremidades do ânodo em vez de uma camada dielétrica. Os Inventores apuraram que este método é particularmente útil quando usado com uma técnica de ablação a laser. Com a técnica de ablação a laser, um material eletroativo, tal como o ouro é estalado (sputtered) num filme fino sobre um substrato. Um laser, então, localiza através do substrato e faz a ablação do material eletroativo, deixando um padrão de elétrodo no substrato. Esta técnica produz elétrodos de melhor resolução e de extremidades mais lisas do que com a impressão de tela. Além de melhorar muito a precisão e a reprodutibilidade da área de ânodo, o método de fabrico do biossensor é mais simples do que o processo atual, visto que não mais exige deposi- tar uma camada dielétrica separada.

Sumário da Invenção

São aqui revelados biossensores eletroquímicos para medir produtos de análise, tais como glicose, colesterol, lactato, ácido acetoa- cético (corpos de cetona), teofilina e hemoglobina Alc num fluido. Os biossensores inventivos compreendem uma camada de substrato compreendendo: pelo menos um elétrodo; pelo menos um cátodo; pelo menos um ânodo; e pelo menos um material espaçador. Numa modali- dade, o material espaçador compreende uma camada orgânica vedável pelo calor que ativa acima de 85°C. Por exemplo, o filme orgânico vedável pelo calor pode compreender um filme contendo poliéster, tal como tereftalato de polietileno (PET) com uma camada de poliolefina disposta sobre ele.

Qualquer que seja a composição do material espaçador, tipicamente tem pelo menos uma abertura perfurada através dele e cobre pelo menos uma parte do elétrodo operacional, tal como o ânodo. A abertura perfurada define pelo menos uma extremidade do ânodo e tipicamente duas extremidades opostas. As restantes duas extremida- des opostas são tipicamente definidas por linhas de ablação a laser e, deste modo, têm também excelente qualidade de extremidade.

Além de definir as extremidades do ânodo, uma vez que é aplicada ao substrato, a abertura perfurada pelo material espaçador define uma cavidade ou poço suficiente para aceitar a química deposi- tada nos biossensores aglomerados.

Também é aqui revelado um método de produzir o biossen- sor descrito. Numa modalidade, o método compreende depositar um material eletroativo sobre um substrato para formar um substrato revestido. O material eletroativo pode compreender um material condu- tor ou semicondutor. Os padrões são a seguir formados na camada de substrato coberto por ablação do material eletroativo com um laser. Esses padrões formam um conjunto ordenado de elétrodos compreen- dendo pelo menos um elétrodo, um cátodo e um ânodo.

Depois de ser formado conjunto ordenado de elétrodos, o material espaçador é aplicado sobre o substrato, de tal modo que cobre pelo menos uma parte do conjunto ordenado. Conforme mencionado, o material espaçador tem pelo menos uma abertura que é perfurada antes de ser depositada sobre o substrato. A abertura através do material espaçador é posicionada de modo a assegurar que cubra pelo menos uma parte do ânodo e define pelo menos uma extremidade do ânodo.

Uma vez aplicado, o filme espaçador é laminado sobre o substrato aplicando calor e pressão em condições suficientes para formar uma vedação com o conjunto ordenado de elétrodos e substrato, formando, deste modo, um biossensor aglomerado. A seguir, a química pode ser depositada dentro da cavidade ou poço definido pelo material espaçador. Uma vez que a química seque, é aplicada uma cobertura sobre as cavidades de amostra para formar intervalos capilares para os quais a amostra de sangue é puxada.

Deve ser entendido que tanto a descrição geral precedente como a descrição detalhada seguinte são apenas exempliílcativas e explicativas e não são restritivas da invenção, conforme reivindicada.

Os desenhos anexos, que são incorporados e constituem parte deste Relatório Descritivo, ilustram várias modalidades da inven- ção e, em conjunto com a descrição, servem para explicar os princípios da invenção.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 é uma imagem óptica de um biossensor (sem cobertura) de acordo com a presente revelação.

A Figura 2 é uma imagem SEM de uma exibição de um espaçador perfurado que mostra excelente definição de extremidades e nenhuma extrusão adesiva.

A Figura 3 são imagens CMM ópticas de uma exibição de espaçador perfurado mostrando excelente definição (a) circular e (b) de extremidade reta e nenhuma extrusão adesiva.

A Figura 4 são imagens SEM de uma exibição de um espaçador perfurado mostrando excelente definição de extremidade e nenhuma extrusão adesiva.

A Figura 5 é um histograma de um teste de cronoampero- metria mostrando um coeficiente de variação (%CV) de 0,85.

A Figura 6 são varreduras de perfilometria através da parte superior do material espaçador perfurado laminado sobre o substrato contendo elétrodo.

De acordo com a presente revelação são aqui proporciona- dos biossensores eletroquímicos desenvolvidos para medir um produto de análise numa amostra de fluido não homogêneo, tal como um fluido corpóreo escolhido a partir do sangue, urina, saliva e lágrimas. O biossensor inclui pelo menos um ou mais elétrodos e um sistema de reativos de reação compreendendo um mediador de elétrons e uma enzima de oxidação-redução específica para o produto de análise a ser mensurado.

O biossensor pode compreender uma camada de substrato que inclui pelo menos um elétrodo, pelo menos um cátodo, pelo menos um ânodo e pelo menos um material espaçador. Numa modalidade, o biossensor compreende dois elétrodos de deteção de enchimento, um ânodo e um cátodo.

O material espaçador compreende tipicamente uma camada orgânica vedável pelo calor que cobre pelo menos uma parte do ânodo, de tal forma que define pelo menos uma extremidade do ânodo. A camada orgânica vedável pelo calor pode cobrir ainda uma parte do elétrodo ou cátodo ou uma parte tanto do elétrodo como do cátodo. A camada vedável pelo calor compreende um polímero que tipicamente ativa em ou acima de 85°C. Por exemplo, a camada orgâni- ca vedável pelo calor pode compreender um filme contendo poliéster, tal como tereftalato de polietileno (PET), com uma camada de poliolefina disposta sobre ela. A camada de poliolefina pode ser disposta sobre o PET por um processo de co-extrusão ou pode ser depositada via uma técnica de pulverização.

Em certas modalidades, o material espaçador tem pelo menos um orifício perfurado através dele, em que o orifício define um poço quando colocado sobre o substrato. Em várias modalidades, o orifício pode ser perfurado com qualquer configuração ou perfurado múltiplas vezes dependendo da forma e/ou tamanho pretendidos. Por exemplo, conforme mostrado nas Figuras 2-4, o material espaçador perfurado de acordo com a presente revelação exibe excelente definição de extremidades sem nenhuma extrusão adesiva, se forem perfurados padrões retos ou circulares através dele.

O biossensor pode também compreender um sistema de reativos de reação localizado no poço. Tipicamente em sensores eletro- químicos, o sistema de reativos de reação compreende um mediador de elétrons e uma enzima de oxidação-redução específica para o produto de análise.

Numa modalidade, a camada vedável pelo calor define duas de quatro extremidades do ânodo. Nesta modalidade, as duas extremi- dades restantes do ânodo podem ser definidas pelas linhas retiradas por ablação na camada de substrato por um laser. A Figura 1 mostra padrões das linhas que são cauterizadas no substrato durante a fabri- cação do sensor. Nesta modalidade, as linhas paralelas horizontais definem duas extremidades opostas de um ânodo.

Um processo exemplificativo é a escrita direta de elétrodos (deposição a laser) como descrito no pedido de patente provisório comumente cedido, co-pendente 60/716,120 "Biosensor with Direct WHtten Electrode", depositado em 13 de setembro de 2005, cuja revela- ção é por este meio aqui incorporada por referência na sua totalidade.

Em razão da importância da definição da extremidade de ânodo, o material espaçador deve satisfazer pelo menos um dos seguin- tes requisitos:

• Nenhuma extrusão adesiva em cavidade de amostra visto que isto causaria variabilidade na definição do ânodo.

• Vedação hermética com o material de elétrodo para assegurar nenhum vazamento da solução de química ou sangue debaixo do espaçador.

• Nenhuma pegajosidade antes da ativação do adesivo para evitar o uso de um revestimento que necessitaria de ser removido antes da laminação. Além disso, o revestimento poderia interferir com a qualidade da extremidade perfurada.

• Boa qualidade de extremidade perfurada, que é uma função da ferramenta de punção, condições de punção e o material. A qualidade da extremidade é importante para a definição do ânodo e para formar uma boa vedação com o material de cobertura.

De acordo com outro aspecto da presente revelação, são aqui proporcionados biossensores compreendendo materiais de elétrodo únicos, incluindo materiais semicondutores e condutores. Os materiais condutores incluem metais tradicionais, assim como também materiais inovativos de carbono de filme fino.

Quando são usados materiais condutores, pelo menos um elétrodo pode compreender um metal escolhido a partir de ou derivado a partir do ouro, platina, ródio, paládio, prata, irídio, carbono, aço, metalorgânicos e suas misturas. Numa modalidade, um elétrodo de carbono pode ainda compreende Cr.

Quando pelo menos um elétrodo é semicondutor, pode compreender um material escolhido a partir de óxido de estanho, oxido de índio, dióxido de titânio, óxido de manganês, óxido de ferro e óxido de zinco. Numa modalidade, pelo menos um elétrodo semicondutor compreende óxido de zinco dopado com índio, óxido de estanho dopado com índio, óxido de índio dopado com zinco ou óxido de índio dopado com estanho.

Noutra modalidade, pelo menos um elétrodo semicondutor compreende um alótropo de carbono dopado com boro, nitrogênio ou fósforo.

Conforme afirmado, o biossensor aqui revelado inclui pelo menos um ou mais elétrodos e um sistema de reativos de reação com- preendendo um mediador de elétrons e uma enzima de oxidação- redução específica para o produto de análise a ser mensurado. Em várias modalidades, o produto de análise pode ser escolhido a partir de glicose, colesterol, lactato, ácido acetoacético (corpos de cetona), teofili- na e hemoglobina Ale.

Quando o biossensor é usado para medir um produto de análise compreendendo glicose, pelo menos uma enzima de oxidação- redução específica para o produto de análise pode ser escolhida a partir da oxidase da glicose, desidrogenase de glicose dependente de PQQ e desidrogenase de glicose dependente de NAD.

Noutras modalidades não limitativas, o mediador de elé- trons pode compreender um material de ferricianeto, tal como ferricia- neto de potássio, ácido ferroceno carboxílico ou um material contendo rutênio, tal como tricloreto de rutênio hexaamina (III). O sistema de reativos de reação pode também compreender uma variedade de tampões, surfactantes e ligantes. Por exemplo, numa modalidade, o material de tampão compreende fosfato de potássio. Os surfactantes podem ser escolhidos a partir de surfactantes não iônicos, aniônicos e zwitteriônicos. Além disso, o ligante polimérico pode ser escolhido a partir de hidroxipropilmetil celulose, alginato de sódio, celulose microcristalina, oxido de polietileno, hidroxietilcelulose, polipir- rolidona, PEG e álcool polivinílico.

Quando usado para medir produtos de análise no sangue, o sistema de reativos de reação tipicamente compreende ainda um agente de ligação de célula de sangue vermelho para capturar células de sangue vermelho. Esses agentes ligantes incluem lecitinas.

Dependendo do produto de análise de interesse, o sistema de reativos de reação pode incluir ingredientes opcionais tais como tampões, surfactantes e polímeros formadores de filmes. Os exemplos de tampões que podem ser usados na presente invenção incluem sem limitação fosfato, citrato, acetato de potássio, TRIS, HEPES, tampão de MOPS e MES. Além disso, os surfactantes típicos incluem surfactantes não iônicos, tais como Triton X-100®e Suríynol®, surfactantes aniônicos e surfactantes zwitteriônicos. Triton X-100® (um alquil fenoxi polietoxi etanol), e Surfynol® são uma família de detergentes baseados na quími- ca do diol acetilênico. Além disso, o sistema de reativos de reação pode incluir opcionalmente agentes molhantes, tais como surfactantes de organossilicones, incluindo Silwet® (um heptametiltrissiloxano modifi- cado por polialquilenóxido a partir de GE Silicones).

O sistema de reativos de reação compreende ainda opcio- nalmente pelo menos um material de ligante polimérico. Esses materi- ais são geralmente escolhidos a partir do grupo que consiste em hidro- xipropilmetil celulose, alginato de sódio, celulose microcristalina, óxido de polietileno, polietileno glicol (PEG), poliporrolidona, hidroxietilcelulo- se, ou álcool polivinílico.

Numa modalidade, podem ser usados de 0,01 a 0,3%, tal como de 0,05 a 0,25% de um surfactante não-iônico tal como Triton X- 100 em combinação com 0,1 a 3%, tal como de 0,5 a 2,0% de um material de ligante polimérico.

Outros componentes opcionais incluem corantes que não interferem com a reação de glicose, mas facilitam a inspeção da deposi- ção. Numa modalidade não limitativa, pode ser usado um corante amarelo (fluoresceína) ou um corante azul (Azul de Cresil).

Além da enzima específica para o produto de análise e o mediador de elétrons, o sistema de reativos de reação mencionado acima pode também incluir os componentes opcionais previamente descritos, incluindo os materiais de tamponamento, os ligantes polimé- ricos e os surfactantes. A camada de reativo cobre geralmente pelo menos parte do elétrodo operacional assim como também o elétrodo contador.

Numa modalidade, usando um processo de carretei para carretei, são formados biossensores múltiplos do tipo aqui revelado numa folha de material que serve de substrato. Os outros componentes no biossensor acabado são, então, construídas camada a camada sobre o substrato para formar o produto acabado.

O processo de produção dos biossensores revelados pode começar depositando um electroativo sobre um substrato de plástico. Conforme aqui usado, pretende-se que um material "eletroativo" signifi- que material eletricamente condutor ou semicondutor.

Por exemplo, o material eletricamente condutor pode compreender um metal escolhido a partir de ou derivado a partir de ouro, platina, ródio, paládio, prata, irídio, carbono, aço, metalorgânicos, e misturas deles. Numa modalidade, um elétrodo de carbono pode ainda compreender Cr.

O material condutor ou semicondutor pode ser depositado de um modo conhecido, como sputterring uma camada variando desde 10nm a 100nm. Numa modalidade não limitativa, um filme fino de ouro variando de 25 nm até 35 nm é depositado sobre o substrato de plástico.

Os padrões pretendidos são a seguir formados sobre o substrato por ablação da camada condu^tora ou camada semicondutora usando um feixe de laser focalizado. Numa modalidade, são usados espelhos para dirigir o feixe de laser para fazer a ablação do material, de acordo com um padrão pretendido. Como mostrado na Figura 1, as linhas cauterizadas ou de ablação pelo laser formam pelo menos dois lados opostos do ânodo. Os restantes dois lados são formados pelo material espaçador aqui descrito e particularmente exemplificado abaixo.

O material espaçador de acordo com a presente invenção é então aplicado ao substrato. Diversamente dos materiais espaçadores tradicionais em que o lado inferior foi coberto com um adesivo para facilitar a ligação à camada e substrato dielétrico, o material espaçador inventivo não exige um adesivo. Ao contrário, um material espaçador pré-perfurado de acordo com a presente revelação liga-se ao substrato por uma camada vedável pelo calor.

Conforme afirmado, antes de ser aplicado ao substrato, pelo menos um orifício é perfurado pelo material espaçador. As Figuras. 2-4 mostram várias SEM e imagens óticas de material espaçador perfurado de acordo com a presente revelação. Conforme mostrado nestas Figu- ras, o material espaçador perfurado exibe excelente definição de extre- midade com pequena ou nenhuma extrusão adesiva. A extrusão adesiva é definida como definição de extremidade deficiente resultante a partir da adesão do material espaçador à ferramenta de punção usada para formar o orifício. O que também é evidente a partir destas Figuras na uniformidade da camada sobre o substrato.

Depois do processo de puncionamento, o material espaça- dor é posicionado sobre o substrato de tal forma que cobre pelo menos uma parte do ânodo. Numa modalidade, o material espaçador define duas extremidades do ânodo. Nesta modalidade, as duas extremidades que definem as extremidades de ânodo são aquelas que foram puncio- nadas. A fim de definir com precisão a área do ânodo, é desejável ter excelente definição de extremidade depois de puncionar o espaçador. Noutra modalidade, o material espaçador pode ser aplicado ao substra- to de tal forma que também cubra uma parte do elétrodo ou cátodo ou uma parte tanto do elétrodo como do cátodo.

Depois do material espaçador ser aplicado ao substrato da maneira descrita, é laminado no substrato para assegurar uma vedação hermética com o material de elétrodo. Se feito corretamente, não existirá nenhum vazamento da solução química ou sangue sob o espaçador. O procedimento de laminação é tipicamente realizado a uma temperatura variando desde 121 a 149°C e pressão variando desde 0,35 até 4,2 kgcrrr2.

O biossensor laminado mostra uma superfície uniforme- mente lisa com uma excelente definição de extremidade para o ânodo.

A uniformidade na definição do revestimento e da extremidade do ânodo é exemplificada nas varreduras de perfilometria proporcionadas na Figura 6. Estas varreduras foram tomadas através da parte superior do material espaçador puncionado laminado sobre o substrato contendo o elétrodo e mostram um declive de extremidade mínima entre a superfí- cie e a cavidade e a ausência de carrapichos ou outros defeitos ao longo das extremidades perfuradas.

Numa modalidade, depois de laminar o espaçador no substrato, o sensor montado compreende um ânodo, um cátodo e dois elétrodos de detecção de enchimento, com a área de ânodo definida sobre dois lados opostos por ablação a laser do material condutor ou semicondutor subjacente e os dois lados restantes pelo espaçador perfurado.

Além disso, pelo menos um orifício puncionado através do espaçador define uma cavidade ou poço suficiente para receber certas químicas depois da laminação. A química pode ser depositada nas cavidades ou poços do biossensor montado usando uma variedade de métodos, incluindo piezo dispensação, micropipetagem ou revestimento de spray.

Numa modalidade, um sistema de reativos compreendendo um mediador de elétrons e uma enzima de oxidação-redução específica para o produto de análise é aplicado ao biossensor. Uma composição aquosa compreendendo o sistema de reativos pode ser aplicada via técnicas previamente mencionadas, sobre a parte exposta do elétrodo operacional e secando-a para formar a camada de reativo.

A composição aquosa compreendendo o sistema de reativos pode incluir um mediador de elétrons escolhido a partir de um material de ferricianeto, ácido ferroceno carboxílico ou um material contendo rutênio. Numa modalidade, o material de ferricianeto compreende ferricianeto de potássio e o material contendo rutênio compreende tricloreto de rutênio (Ill)hexaamina.

O sistema de reativos de reação depositado compreende ainda pelo menos um material tampão, tal como um compreendendo fosfato de potássio.

O sistema de reativos de reação pode também compreender uma variedade de tampões, surfactantes e ligantes. Por exemplo, numa modalidade, o material tampão compreende fosfato de potássio. Os surfactantes podem ser escolhidos a partir de surfactantes não iônicos, aniônicos e zwitteriônicos. Além disso, o ligante polimérico pode ser escolhido a partir de hidroxipropilmetil celulose, alginato de sódio, celulose microcristalina, óxido de polietileno, hidroxietilcelulose, poli- porrolidona, PEG e álcool polivinílico.

Numa modalidade não limitativa, o sistema de reativos de reação compreende de 0,01 a 0,3% de um surfactante não iônico, tal como de 0,05 a 0,25% de um alquil fenoxi polietoxi etanol, e de 0,1 a 3% de um material de ligante polimérico, tal como de 0,5 a 2,0% de álcool polivinílico.

Uma cobertura transparente pode, então, ser ligada à parte superior do espaçador para formar a cavidade de amostra.

Numa modalidade, uma sonda redox secundária ("SRP") pode ser adicionada à química do biossensor. Para propósitos desta revelação, "sonda redox" significa uma substância capaz de ser oxidada e/ou reduzida.

É possível que a sonda redox secundária compreenda uma substância mediadora de elétrons adicional capaz de sofrer uma reação redox eletroquímica. Conseqüentemente, da mesma maneira que o mediador de hexaamina de rutênio mencionado acima, a substância de sonda redox secundária gera uma corrente em resposta à aplicação de um pulso de voltagem. A sonda redox secundária, porém, difere da hexaamina de rutênio (isto é, a sonda redox primária) ou dos outros mediadores citados acima por que a corrente gerada não tem relação com a concentração de glicose, mas ainda dependente do nível de sangue particular da amostra, particularmente o nível de hematócrito (isto é, a porcentagem da quantidade de sangue que é ocupada por células de sangue vermelho) da amostra.

Conseqüentemente, o sinal eletroquímico produzido pela SRP será uma função do hematócrito da amostra, mas não dependente da glicose e, portanto, funcionará como um padrão interno para avalia- is ção de hematócrito.

Algumas das classes de compostos que poderiam funcionar como uma SRP incluem complexos de metal de transição, tais como derivados de ferroceno, íons simples, tais como Fe(III) e Mn(II), organo- metálicos, corantes orgânicos, tais como azul de cresil, produtos orgâ- nicos simples tais como tal como ácido gentísico (2,4-ácido benzóico) e ácido trihidroxibenzóico e outras moléculas orgânicas redox ativas, tais como peptídios contendo aminoácidos redox ativos e partículas da ordem de nm de tamanho que contêm componentes redox ativos.

O seguinte é uma lista exemplificativa de características que a SRP pode exibir:

• pequena ou nenhuma interferência com a medição de glicose (isto é, interação limitada com a enzima, mediador ou glicose);

• oxidado ou reduzido numa faixa potencial que pode ser facilmente distinguida daquela do mediador;

• solúvel na formulação da química de tiras; e

• pequena ou nenhuma interferência com a estabilidade do sensor ou qualquer outro parâmetro de desempenho.

Para que um composto eletroquimicamente ativo seja útil como SRP, é desejável que tenha um potencial distintamente diferente do mediador primário, mas não tão extremo que a sua mensuração resultaria num sinal ruidoso devido a interferência. Por exemplo, quando a hexaamina de rutênio é usada como mediador, existem geralmente duas 'janelas' na faixa de potencial. Numa abordagem baseada na oxidação, uma das janelas é desde mais ou menos 0,3 até cerca de 0,9V. A segunda janela é a técnica baseada em redução e estende-se a partir de aproximadamente -0,15V até -0,5V. É importan- te lembrar que os números aqui citados são apenas um exemplo muito específico e não devem ser interpretados como uma regra geral. Pode haver casos em que uma SRP que tem um pico em 0,2V ou em outras magnitudes fosse perfeitamente aceitável. A faixa real das janelas é dependente do potencial exigido para a medição primária.

Para além do escopo de dependência de hematócrito, faixas potenciais e uma preferência para evitar interferência com a medição primária, existem poucas restrições sobre o que exatamente pode ser usado como uma SRP. Isto possibilita o uso de uma ampla variedade de substâncias, incluindo, mas sem limitação: produtos orgânicos simples, macromoléculas, micropérolas funcionalizadas, complexos de metal de transição, nano-partículas e íons simples.

A presente revelação é ainda iluminada pelos seguintes exemplos não limitativos, que se pretende que sejam puramente exem- pliílcativos da invenção. Exemplos

Os Exemplos seguintes descrevem a fabricação e a teste de biossensores de acordo com uma modalidade da presente revelação. Nestes Exemplos, o biossensor teve elétrodos sujeitos à ablação com espaçador laminado puncionado sobre ele. O Exemplo 1 descreve testes realizados para determinar a precisão (rugosidade geométrica e de superfície) de áreas de ãnodo em biossensores que não têm nenhu- ma química sobre eles. O Exemplo 2 proporciona dados de testes de sangue de biossensores que compreendem ainda química.

Exemplo 1

Um filme fino de ouro (30 nm) foi sputtered sobre um substrato de filme de plástico (PET). A camada de ouro foi, então, sujeita a ablação a laser usando uma abordagem de feixe enfocado, em que foram usados espelhos Galvo para direcionar o feixe de laser para fazer a ablação do material de acordo com um padrão de elétrodo pretendido. A camada de ouro restante foi formada em padrões deseja- dos para um conjunto ordenado de elétrodos, que incluiu um ânodo, um cátodo e dois elétrodos de detecção de enchimento.

A seguir, a segunda camada ou camada de espaçador do biossensor foi formada primeiro puncionando cavidades de amostra num filme de poliéster tendo um revestimento de vedação térmica. O filme de poliéster usado para o espaçador era um filme PET comercial- mente disponível (3M Scotchpak™ MA370M), que tinha uma espessura total de 0,094 milímetros, incluindo a camada de vedação térmica de 0,02 milímetros.

O material espaçador perfurado foi laminado sobre substra- to elétrodo sujeito a ablação a laser para formar biossensores montados tendo um ânodo, um cátodo e dois elétrodos de detecção de enchimen- to. Conforme mostrado na Figura 1, a área de ânodo foi definida sobre os dois lados pela ablação a laser da camada de ouro e as outras duas pelas cavidades de amostra puncionadas do espaçador.

Além dos elétrodos de ablação e do espaçador descrito acima, uma solução de cronoamperometria compreendendo ferrocianeto 5 mM e ferricianeto 200 mM em tampão de 100 mM de fosfato, com 0,1% de Triton X-100 foi aplicado às amostras. O biossensor não teve nenhuma outra química ou cobertura.

Os biossensores fabricados foram analisados usando cronoamperometria que permitiu reprodutibilidade da área de ânodo a ser determinada. Conforme mostrado na Figura 5, o coeficiente de variação (%CV) é de 0,85, que era essencialmente o erro da medição do instrumento, indicando que todos os 57 sensores testados de acordo com este Exemplo foram quase idênticos. Como é evidente, os valores %CV, que determina a precisão na área do ânodo, ilustram excelente reprodutibilidade tanto da ablação a laser como da definição de espaça- dor puncionado, os dois limites que definem o ânodo.

Exemplo 2

Uma vez que os sensores foram montados de acordo com o Exemplo 1, a química foi dispensada para dentro das cavidades de amostra usando micropipetagem. O volume de sangue exigido para encher a cavidade de amostra deste biossensor era de 0,25 μl, quando foi usada uma camada de espaçador de 100 μπι de espessura. A Tabela 1 abaixo mostra as porcentagens relativas em peso dos vários ingredi- entes dispensados nas cavidades de amostra. Tabela 1

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A solução de química foi, então, seca e foi aplicada uma cobertura sobre as cavidades de amostra para formar intervalos capila- res para dentro dos quais a amostra de sangue pudesse ser puxada. Os dados de teste de sangue foram tomados sobre as amostras acabadas, com tamanhos de amostra variando desde 40-60 por nível de sangue para os valores mostrados na Tabela 2. Como no Exemplo 1, o coefici- ente de variação (%CV) foi tanto baixo quanto uniforme através dos níveis de sangue mensurados indicando um alto grau de precisão para as amostras testadas. Tabela 2

<table>table see original document page 22</column></row><table> A menos que de outra forma indicado, todos os números que expressam quantidades de ingredientes, condições de reação e assim por diante usados no Relatório Descritivo e Reivindicações devem ser entendidos como sendo modificados em todos os exemplos pelo termo "cerca de". Conseqüentemente, a menos que indicado de outra forma, os parâmetros numéricos descritos no Relatório Descritivo e Reivindicações anexas são aproximações que podem variar, dependendo das propriedades pretendidas buscadas ser obtidas pela presente invenção.

Outras modalidades da invenção serão evidentes para aqueles qualificados na técnica a partir da consideração do Relatório Descritivo. Outras modalidades da invenção serão evidentes para aqueles qualificados na técnica a partir de consideração do Relatório Descritivo e da prática da invenção aqui revelada. Pretende-se que o Relatório Descritivo e os Exemplos sejam considerados apenas como exemplificativos, com um escopo e espírito verdadeiros da invenção sendo indicados pelas Reivindicações seguintes.

Claims

1. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, caracterizado por que o referido biossensor compreende: uma camada de substrato, compreendendo a citada cama- da de substrato: pelo menos um elétrodo; pelo menos um cátodo; pelo menos um ânodo; pelo menos um material espaçador, em que dito material espaçador compreende uma camada orgânica vedável pelo calor que cobre pelo menos uma parte do ânodo e define pelo menos uma extremidade do referido ânodo, em que o citado material espaçador tem pelo menos um orifício puncionado através dele, definindo dito orifício pelo menos uma cavidade de amostra ou poço; um sistema de reativos de reação localizado na referida pelo menos uma cavidade ou poço, compreendendo o citado sistema de reativos de reação um mediador de elétrons e uma enzima de oxidação-redução específica para dito produto de análise; e uma cobertura disposta acima da cavidade de amostra ou poço para formar pelo menos um intervalo capilar para dentro do qual o sangue possa ser puxado.

2. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a referida camada orgânica vedável pelo calor compreende um filme contendo poliéster com uma camada de poliolefina disposta sobre ele.

3. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por que o referido filme contendo poliéster compreende tereftalato de polietileno (PET).

4. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a referida camada vedável pelo calor ativa-se a ou acima de 85°C.

5. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a referida camada vedável pelo calor define duas de quatro extremidades do citado ânodo.

6. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por que as duas extremidades restantes do ânodo são definidas pelas linhas sujeitas a ablação na citada camada de substrato por um laser.

7. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que compreende dois ou mais elétrodos de detecção de enchimento.

8. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que pelo menos um elétrodo é condutor e compreende um metal escolhido a partir de ou derivado a partir de ouro, platina, ródio, paládio, prata, irídio, carbono, aço, metalorgânicos e suas misturas.

9. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que pelo menos um elétrodo de carbono compreende ainda Cr.

10. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que pelo menos um elétrodo é semicondutor.

11. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado por que o elétrodo semicondutor compreende um material escolhido a partir do óxido de estanho, óxido de índio, dióxido de titânio, óxido de manganês, óxido de ferro e óxido de zinco.

12. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado por que pelo menos um elétrodo semicondutor compreende óxido de zinco dopado com índio, óxido de estanho dopado com índio, óxido de índio dopado com zinco ou óxido de índio dopado com estanho.

13. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado por que pelo menos um elétrodo semicondutor compreende um alótropo de carbono dopado com boro, nitrogênio ou fósforo.

14. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o produto de análise é escolhido a partir da glicose, colesterol, lactato, ácido acetoa- cético (corpos de cetona), teofilina e hemoglobina Ale.

15. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 14, caracterizado por que o produto de análise compreende glicose e pelo menos uma enzima de oxidação- redução específica para o produto de análise é escolhida a partir da oxidase de glicose, desidrogenase de glicose dependente de PQQ e desidrogenase de glicose dependente de NAD.

16. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o mediador de elétrons compreende um material de ferricianeto, ácido ferroceno carboxílico ou um material contendo rutênio.

17. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 16, caracterizado por que o material de ferricianeto compreende ferricianeto de potássio e o material contendo rutênio compreende tricloreto de rutênio (III) hexaamina.

18. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o sistema de reativos de reação compreende ainda pelo menos um material tampão que compreende fosfato de potássio.

19. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o sistema de reativos de reação compreende ainda pelo menos um surfactante escolhido a partir de surfactantes não iônicos, aniônicos e zwitteriôni- cos.

20. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o sistema de reativos de reação compreende ainda pelo menos um ligante polimérico escolhido a partir de hidroxipropilmetil celulose, alginato de sódio, celulose microcristalina, oxido de polietileno, hidroxietilcelulose, poli- porrolidona, PEG e álcool polivinílico.

21. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o sistema de reativos de reação compreende de 0,01 a 0,3% de um surfactante não iônico e de 0,1 a 3% de um material de ligante polimérico.

22. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o sistema de reativos de reação compreende de 0,05 a 0,25% de um alquil fenoxi polietoxi etanol e de 0,5 a 2,0% de álcool polivinílico.

23. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o sistema de reativos de reação compreende uma ou mais sondas redox secundárias escolhidas a partir de complexos de metal de transição, íons simples, organometálicos, corantes orgânicos, produtos orgânicos simples e moléculas orgânica redox ativas.

24. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 23, caracterizado por que os complexos de metal de transição compreendem derivados de ferroceno, os íons simples compreendem Fé (III) ou Mn (II), os corantes orgânicos compre- is endem azul de cresil, os produtos orgânicos simples compreendem ácido gentísico (ácido 2,4-benzóico) e ácido trihidroxibenzóico e as moléculas orgânicas redox ativas compreendem peptídios contendo aminoácidos redox ativos e partículas na ordem de nm de tamanho que contêm componentes redox ativos.

25. Biossensor Para Mensuração de Produto de Análise em Fluido, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a camada orgânica vedável pelo calor cobre pelo menos uma parte do elétrodo ou cátodo ou uma parte tanto do elétrodo como do cátodo.

26. Método de Produção de Biossensor Para Mensuração de Produ- to de Análise, caracterizado por que o referido método compreende: aplicar um material eletroativo sobre um substrato para formar um substrato coberto; formar padrões na citada camada de substrato coberto por ablação do material eletroativo com um laser, em que ditos padrões formam um conjunto ordenado de elétrodos compreendendo pelo menos um elétrodo, um cátodo e um ânodo; aplicar um filme orgânico sobre o referido substrato de tal forma que ele cubra pelo menos uma parte dos citados padrões, em que pelo menos um orifício foi puncionado em dito filme orgânico antes de deposita-lo sobre o referido substrato, formando o citado orifício pelo menos um poço, quando depositado sobre dito substrato, em que o referido filme orgânico compreende uma camada vedável pelo calor que cobre pelo menos uma parte do ânodo e define pelo menos uma extre- midade do citado ânodo; laminar dito filme orgânico sobre o referido substrato aplicando calor e pressão no citado filme orgânico; e depositar dentro de dito pelo menos um poço um sistema de reativos de reação compreendendo um mediador de elétrons e uma enzima de oxidação-redução específica para o referido produto de análise; e aplicar opcionalmente uma cobertura para formar um vaso capilar para aplicação de amostra.

27. Método de Produção de Biossensor Para Mensuração de Produ- to de Análise, de acordo com a Reivindicação 26, caracterizado por que o referido material eletroativo é depositado por sputtenng.

28. Método de Produção de Biossensor Para Mensuração de Produ- to de Análise, de acordo com a Reivindicação 27, caracterizado por que o referido material eletroativo compreende um material condutor ou semicondutor.

29. Método de Produção de Biossensor Para Mensuração de Produ- to de Análise, de acordo com a Reivindicação 28, caracterizado por que o referido material condutor compreende um metal escolhido a partir de ou derivado a partir do ouro, platina, ródio, paládio, prata, irídio, carbono, aço, metalorgânicos e suas misturas.

30. Método de Produção de Biossensor Para Mensuração de Produ- to de Análise, de acordo com a Reivindicação 29, caracterizado por que pelo menos um elétrodo de carbono compreende ainda Cr.

31. Método de Produção de Biossensor Para Mensuração de Produ- to de Análise, de acordo com a Reivindicação 28, caracterizado por que o material semicondutor é escolhido a partir de óxido de estanho, óxido de índio, dióxido de titânio, óxido de manganês, óxido de ferro e óxido de zinco.

32. Método de Produção de Biossensor Para Mensuração de Produ- to de Análise, de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por que o material semicondutor compreende óxido de zinco dopado com índio, óxido de estanho dopado com índio, óxido de índio dopado com zinco ou óxido de índio dopado com estanho.

33. Método de Produção de Biossensor Para Mensuração de Produ- to de Análise, de acordo com a Reivindicação 28, caracterizado por que o material semicondutor compreende um alótropo de carbono dopado com boro, nitrogênio ou fósforo.

34. Método de Produção de Biossensor Para Mensuração de Produ- to de Análise, de acordo com a Reivindicação 26, caracterizado por que o mediador de elétrons compreende um material de ferricianeto, ácido ferroceno carboxílico ou um material contendo rutênio.

35. Método de Produção de Biossensor Para Mensuração de Produ- to de Análise, de acordo com a Reivindicação 34, caracterizado por que o material de ferricianeto compreende ferricianeto de potássio e o material contendo rutênio compreende tricloreto de rutênio (III) hexaa- mina.

36. Método de Produção de Biossensor Para Mensuração de Produ- to de Análise, de acordo com a Reivindicação 26, caracterizado por que o sistema de reativos de reação compreende ainda pelo menos um material tampão que compreende fosfato de potássio.

37. Método de Produção de Biossensor Para Mensuração de Produ- to de Análise, de acordo com a Reivindicação 26, caracterizado por que o sistema de reativos de reação compreende ainda pelo menos um surfactante escolhido a partir de surfactantes não iônicos, aniônicos e zwitteriônicos.

38. Método de Produção de Biossensor Para Mensuração de Produ- to de Análise, de acordo com a Reivindicação 26, caracterizado por que o sistema de reativos de reação compreende ainda pelo menos um ligante polimérico escolhido a partir de hidroxipropilmetil celulose, alginato de sódio, celulose microcristalina, óxido de polietileno, hidroxi- etilcelulose, poliporrolidona, PEG e álcool polivinílico.

39. Método de Produção de Biossensor Para Mensuração de Produ- to de Análise, de acordo com a Reivindicação 26, caracterizado por que o sistema de reativos de reação compreende de 0,01 a 0,3% de um surfactante não iônico e de 0,1 a 3% de um material de ligante polimé- rico.

40. Método de Produção de Biossensor Para Mensuração de Produ- to de Análise, de acordo com a Reivindicação 26, caracterizado por que o sistema de reativos de reação compreende de 0,05 a 0,25% de um alquil fenoxi polietoxi etanol e de 0,5 a 2,0% de álcool polivinílico.

41. Método de Produção de Biossensor Para Mensuração de Produ- to de Análise, de acordo com a Reivindicação 26, caracterizado por que o sistema de reativos de reação compreende uma ou mais sondas redox secundárias escolhidas a partir de complexos de metal de transi- ção, íons simples, organometálicos, corantes orgânicos, produtos orgânicos simples e moléculas orgânicas redox ativas e suas combina- ções.

42. Método de Produção de Biossensor Para Mensuração de Produ- to de Análise, de acordo com a Reivindicação 41, caracterizado por que os complexos de metal de transição compreendem derivados de ferroceno, os íons simples compreendem Fe(III) ou Mn(II), os corantes orgânicos compreendem azul de cresil, os produtos orgânicos simples compreendem ácido gentísico (ácido 2,4-benzóico) e ácido trihidroxiben- zóico e as moléculas orgânicas redox ativas compreendem peptídios contendo aminoácidos redox ativos e partículas na ordem de nm de tamanho que contêm componentes redox ativos.

43. Método de Produção de Biossensor Para Mensuração de Produ- to de Análise, de acordo com a Reivindicação 26, caracterizado por que a referida laminação do filme orgânico sobre o citado substrato é realizada a uma temperatura que varia desde 149 a 204°C e uma pressão que varia desde 1,4 a 4,2 kgcrrr2.

44. Biossensor Para Mensuração de Níveis de Glicose no Sangue, caracterizado por que o referido biossensor compreende: uma camada de substrato, compreendendo a referida camada de substrato: pelo menos um elétrodo; pelo menos um cátodo; pelo menos um ânodo; pelo menos um material espaçador que com- preende um tereftalato de polietileno (PET) com uma camada de poliole- fina nela disposta, em que o citado material espaçador ativa-se em ou acima de 85°C e define duas de quatro extremidades de dito ânodo, sendo as duas extremidades restantes do ânodo definidas pelas linhas sujeitas a ablação na referida camada de substrato por um laser, em que o citado material espaçador tem pelo menos um orifício nele puncionado, definindo dito orifício uma cavidade ou poço de amostra; um sistema de reativos de reação localizado na referida cavidade ou poço, compreendendo o citado sistema de reativos de reação um mediador de elétrons escolhido a partir de um material de ferricianeto, ácido ferroceno carboxílico ou um material contendo rutênio e uma enzima de oxidação-redução escolhida a partir de oxidase de glicose, desidrogenase de glicose dependente de PQQ e desidrogenase de glicose dependente de NAD; e uma cobertura disposta acima da cavidade ou poço de amostra para formar pelo menos um intervalo capilar para dentro do qual o sangue possa ser puxado.

45. Biossensor Para Mensuração de Níveis de Glicose no Sangue, de acordo com a Reivindicação 44, caracterizado por que o sistema de reativos de reação compreende uma ou mais sondas redox secundárias escolhidas a partir de complexos de metal de transição, íons simples, organometálicos, corantes orgânicos, produtos orgânicos simples e moléculas orgânicas redox ativas.

46. Biossensor Para Mensuração de Níveis de Glicose no Sangue, de acordo com a Reivindicação 45, caracterizado por que os complexos de metal de transição compreendem derivados de ferroceno, os íons simples compreendem Fe (III) ou Mn (II), os corantes orgânicos compre- endem azul de cresil, os produtos orgânicos simples compreendem ácido gentísico (ácido 2,4-benzóico) e ácido trihidroxibenzóico e as moléculas orgânicas redox ativas compreendem peptídios contendo aminoácidos redox ativos e partículas na ordem de nm de tamanho que contêm componentes redox ativos.