BRPI0621760A2

BRPI0621760A2 - molécula de ácido nucléico recombinante que não ocorre naturalmente, célula recombinante, composição imunogênica, anticorpo, método para detectar a presença de proteìna pilus de campylobacter e método para detectar um anticorpo que se liga especificamente a uma proteìna pilus de campylobacter jejuni

Info

Publication number: BRPI0621760A2
Application number: BRPI0621760-5A
Authority: BR
Inventors: Lynn A Joens; James R Theoret; Ryan J Reeser; Bibiana Law
Original assignee: Univ Arizona State
Priority date: 2006-07-10
Filing date: 2006-12-01
Publication date: 2011-12-20
Also published as: WO2008008092A2; US20090285821A1; JP2009542257A; EP2043434A2; WO2008008092A3; EP2043434A4

Abstract

MOLéCULA DE áCIDO NUCLéICO RECOMBINANTE QUE NãO OCORRE NATURALMENTE, CéLULA RECOMBINANTE, COMPOSIçãO IMUNOGENICA, ANTICORPO, MéTODO PARA DETECTAR A PRESENçA DE PROTEìNA PILUS DE CAMPYLOBACTER E MéTODO PARA DETECTAR UM ANTICORPO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE A UMA PROTEìNA PILUS DE CAMPYLOBACTER JEJUM. A presente invenção proporciona seqüências de codificação e de aminoácidos para uma proteína pilus de Campylobacter jejuni (e de outras espécies também). Essa proteína, quando administrada a um humano ou animal, origina a expressão de uma resposta imune a CampyIobacter jejuni, com o resultado de que colonização e/ou infecção por esse organismo é reduzida. Material de proteína ou biofilme recombinante que compreende a proteína pilus é formulado em composições imunogênicas, especialmente para administração via mucosa. Assim, a presente invenção proporciona métodos para aperfeiçoamento da qualidade microbiana de produtos alimentícios, incluindo aves domésticas, ovos, produtos derivados de carnes e laticínios, e indiretamente de alimentos de origem vegetal que poderão entrar em contato com lixo agrícola, proveniente de fertilização ou de água de irrigação.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO RECOMBINANTE QUE NÃO OCORRE NATU- RALMENTE, CÉLULA RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, ANTICORPO, MÉTODO PARA DETECTAR A PRESENÇA DE PROTEÍNA PILUS DE CAMPYLOBACTER E MÉTODO PARA DETECTAR UM ANTI- CORPO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE A UMA PROTEÍNA PILUS DE CAMPYLOBACTER JEJUNI"

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS CORRELATOS

Este pedido reivindica o benefício de Pedido Provisório Norte- americano No. 60/819.589, depositado em 10 de julho de 2006, pedido este que é incorporado aqui como referência até o grau em que não haja incon- sistência com a presente descrição.

DECLARAÇÃO COM REFERÊNCIA A PESQUISA OU DESEN- VOLVIMENTO COM APOIO FEDERAL

Esta invenção foi produzida com apoio governamental sob Sub- venção USDA/CSREES No. 2005-51110-02333 concedida pelo Departa- mento de Agricultura dos Estados Unidos. O governo tem certos direitos na invenção.

REFERÊNCIA A LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS, UMA TABELA OU UM APÊNDICE EM DISCO COMPACTO DE LISTAGEM DE PROGRA- MA DE COMPUTADOR

A Listagem de Seqüências depositada nesta mesma data é in- corporada aqui como referência.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

O campo desta invenção é a área de composições imunogêni- cas, métodos, vacinas e genes que codificam determinantes de virulência bacteriana, particularmente aqueles genes que codificam uma proteína pilus de Campylobacter jejuni ou outra espécie de Campylobacter e aquelas com- posições imunogênicas que compreendem essa proteína pilus.

C. jejuni é um bastonete gram-negativo curvado em espiral com flagelos polares e cresce melhor em um ambiente microaerófilo que varia de 37°C a 42°C (4; 7; 12; 23; 26). Nos Estados Unidos, estima-se que aproxi- madamente 2,1 a 2,4 milhões de casos de campilobacteriose ocorrem anu- almente com um custo de US$ 8 bilhões (16; 17).

Campilobacteriose pode ser assintomática ou resultar em uma variedade de sintomas. Em países em desenvolvimento, a infecção poderá ser assintomática ou resultar em diarréia relativamente branda. Em países industrializados, infecções campilobacterianas apresentam-se como infec- ções gastrintestinais autolimitantes caracterizadas por diarréia com ou sem sangue ou muco, vômito, cãibra e febre. Infecções sintomáticas consistem de um início agudo de diarréia aquosa, dor abdominal, febre e a presença de sangue e leucócitos em amostras de fezes e são usualmente autolimitantes, durando de dois a onze dias, mas em indivíduos imunocomprometidos as infecções podem persistir por mais de 3 meses (4; 6; 16). Efeitos secundá- rios de longo prazo de infecção poderão incluir artrite reativa, síndrome de Reiters, oftalmite em pacientes positivos de HLA B 27 e síndrome de Guillain Barre (15; 18).

Campylobacters são consideradas flora normal do instestino de vários animais domésticos e aves (1; 2; 5; 8; 31). A capacidade dessas aves em espalhar Campylobacter pode causar contaminação de cursos de água ou sistemas hídricos, e, assim, atuar como fonte de contaminação de outros animais ou humanos. Infecções por Campylobacter ocorrem por meio de vias orais, incluindo: ingestão de água contaminada, leite ou queijo não- pasteurizado, consumo de alimentos semicozidos ou crus tais como aves domésticas (5; 8; 31). Entretanto, consumo de leite cru e aves domésticas insuficientemente cozidas/malcozidas é a principal fonte de infecções por Campylobaeter. A capacidade de C. jejuni em formar biofilmes e tornar-se uma fonte contínua de inóculo para animais domesticados e humanos tem também sido o objeto de outros estudos (8; 31). C. jejuni tem a capacidade de formar biofilmes nos abastecimentos de água e sistemas de bombeamen- to em instalações agrícolas de criação de animais e plantas de processa- mento de animais, tornando-se assim uma fonte de infecção e contaminação (8; 31). No entanto, essa possibilidade é sustentada por um número muito limitado de publicações que mostram que C. jejuni pode formar biofilmes em superfícies abióticas.

Devido aos custos de saúde, há uma necessidade no estado da técnica de vacinas eficazes em reduzir a colonização de aves domésticas e/ou gado com C. jejunie reduzir a incidência de infecções por C. jejuni.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objetivo da presente invenção é proporcionar uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína pilus de Campylobacter jejuni. Como especificamente exemplificado, a proteína pilus codificada apresenta uma seqüência de codificação conforme dado em ID SEQ NO: 1. A proteína pilus codificada apresenta uma seqüência de aminoácidos conforme dado em ID SEQ NO: 2. Seqüências de codificação e seqüências de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade de seqüências com as seqüências es- pecificamente exemplificadas estão dentro do escopo da presente invenção.

Trata-se de um objetivo adicional da invenção proporcionar mo- léculas de ácidos nucléicos que não ocorrem naturalmente ("recombinan- tes") para a produção recombinante da proteína pilus de C. jejuni da presen- te invenção e métodos para produzir recombinantemente essa proteína.

Aquele habilitado no estado da técnica entende que a seqüência de codificação e a seqüência de aminoácidos da proteína pilus exemplificada podem ser usadas para identificar e isolar seqüências de nucleotídeos adi- cionais não-exemplificadas que codificarão uma proteína da mesma seqüên- cia de aminoácidos conforme dado em ID SEQ NO: 2, ou uma seqüência de aminoácidos com mais de 70%, 80%, 85%, 90%, 95% (e todas as porcenta- gens inteiras entre 70 e 100) de identidade com aquela e apresentando ati- vidade biológica equivalente. Quando se deseja que a seqüência que codifi- ca uma proteína pilus da presente invenção seja expressa, então aquele ha- bilitado no estado da técnica liga operavelmente seqüências reguladoras de controle de transcrição e de tradução com a seqüência de codificação, com a escolha das seqüências reguladoras sendo determinada pela célula hos- pedeira em que a seqüência de codificação deve ser expressa. Com respeito a uma molécula de DNA recombinante que transporta uma seqüência de codificação de proteína pilus de C. jejuni, aquele habilitado no estado da técnica pode escolher um vetor (tal como um plasmídeo ou um vetor viral) que pode ser introduzido e que pode replicar-se na célula hospedeira. A cé- lula hospedeira pode ser uma bactéria, preferencialmente Escherichia coli ou uma Salmonella typhimurium não-virulenta ou, alternativamente, uma célula de lêvedo ou de mamífero.

Em outra modalidade, são proporcionados polinucleotídeos re- combinantes que codificam uma proteína pilus que inclui, por exemplo, fu- sões ou supressões de proteína, bem como sistemas de expressão. Siste- mas de expressão são definidos como polinucleotídeos que, quando trans- formados em uma célula hospedeira apropriada, podem expressar a proteí- na pilus da presente invenção ou uma proteína funcionalmente equivalente. Os polinucleotídeos recombinantes possuem uma seqüência de nucleotí- deos que é substancialmente similar a um polinucleotídeo natural que codifi- ca proteína pilus de C. jejuni ou um fragmento deste. A expressão poderá estar sob o controle do promotor normalmente associado ao gene ou a se- qüência que codifica proteína pilus pode ser expressa sob o controle regula- dor de um promotor heterólogo (um promotor de natureza não associada à seqüência que codifica proteína pilus). A cepa bacteriana entérica hospedei- ra preferida para produção de proteína pilus é uma cepa de E. coli.

Adicionalmente proporcionados pela presente invenção são oli- gonucleotídeos e polinucleotídeos que são capazes de hibridizar-se especifi- camente, usando condições padrões bem compreendidas por aquele habili- tado no estado da técnica, com DNA genômico de C. jejuni, DNA clonado (ou o mRNA cognato) que codifica a proteína pilus da presente invenção. Essas seqüências específicas de proteína pilus podem também ser usadas na preparação de primers para uso na reação em cadeia de polimerase (RCP) para a amplificação de ácido nucléico que codifica proteína pilus. Hi- bridização ou RCP podem ser adaptadas para uso na detecção de C. jejuni em amostras biológicas, alimentícias, de queijo, fecais ou ambientais, ou na diagnose de doença causada por C. jejuni.

Os polinucleotídeos incluem RNA, cDNA, DNA genônimco, for- mas sintéticas e polímeros mistos, tanto fitas sentido quanto fitas anti- sentido, e poderão ser química ou bioquimicamente modificados ou conter bases nucleotídicas não-naturais ou derivatizadas. DNA é preferido. Polinu- cleotídeos recombinantes que compreendem seqüências diferentes daque- las que não ocorrem naturalmente são também proporcionados por esta in- venção, como o são alterações de uma seqüência que codifica proteína pilus de C. jejuni do tipo selvagem, incluindo, mas sem se limitar às mesmas, su- pressão, inserção, substituição de um ou mais nucleotídeos, ou por fusão com outras seqüências de polinucleotídeos, contanto que essas alterações na seqüência primária da proteína pilus não alterem o(s) epítopo(s) capazes de produzir imunidade protetora.

A presente invenção também proporciona polipeptídeos de fusão que compreendem uma proteína pilus de C. jejuni ou uma porção antigênica desta. Poderão ser construídas fusões heterólogas que exibiriam uma com- binação de propriedades ou atividades das proteínas de que elas são deri- vadas. Parceiros potenciais de fusão incluem, mas sem se limitar aos mes- mos, imunoglobulinas, ubiquitina, β-galactosidase bacteriana, trpE, proteína A, β-lactamase, alfa-amilase, álcool desidrogenase e fator de ligação alfa de lêvedo (Godowski e colaboradores (1988), Science, 241, 812-816) ou várias seqüências de "cauda" protéicas (antígeno flagelar, poli-histidina, estreptavi- dina, glutationa S-transferase, entre outros conhecidos no estado da técni- ca). Proteínas de fusão são tipicamente produzidas por métodos recombi- nantes, mas poderão ser quimicamente sintetizadas, como bem entendido no estado da técnica.

Composições e preparações imunogênicas, incluindo, mas sem se limitar aos mesmos, vacinas que compreendem proteínas p/7/'de C. jejuni expressas naturalmente ou proteína pilus de C. jejuni recombinante e um veículo adequado, são proporcionadas pela presente invenção, e essas composições e preparações podem vantajosamente compreender de modo adicional pelo menos um adjuvante. Também abrangidas pela presente in- venção são composições imunogênicas que compreendem Campylobacter viva atenuada que expressa pilus com proteína pilus expressa (por exemplo, em um biofilme) ou material de biofilme de células mortas que contém a pro- teína pilus. Essas composições são úteis, por exemplo, na imunização de um humano contra doença diarréica resultante de infecção por C. jejuni ou na redução da incidência de C. jejuni em aves domésticas ou bovinos, de modo a reduzir contaminação em produtos alimentícios e no ambiente. As preparações compreendem uma quantidade imunogênica de uma proteína pilus da presente invenção ou um fragmento imunogênico dessa proteína. Essas composições imunogênicas podem vantajosamente compreender de forma adicional proteínas pilus ou determinantes antigênicos destas de um ou mais outros tipos sorológicos ou outros materiais antigênicos derivados de C. jejuni. Por "quantidade imunogênica" entende-se uma quantidade ca- paz de originar a produção de anticorpos, preferencialmente conferindo imu- nidade protetora dirigida contra colonização ou infecção por C. jejuni com a mesma proteína pilus ou uma proteína pilus imunologicamente reativa de forma cruzada como na composição imunogênica. As composições imuno- gênicas podem adicionalmente compreender um adjuvante, por exemplo, toxina de cólera ou uma subunidade B de toxina de cólera para composições projetadas para administração via mucosa.

Também dentro do escopo da presente invenção estão métodos para reduzir a incidência de C. jejuni em aves domésticas ou em carne de boi ou de vaca ou gado leiteiro mediante administração de uma composição imunogênica que compreende a proteína pilus de C. jejuni, como ensinado aqui, a aves domésticas ou gado bovino. A via de administração pode ser mucosa (especialmente nasal ou oral) ou pode ser subcutânea, intramuscu- lar, intradérmica, intraperitoneal ou parenteral. Similarmente, incidência hu- mana de infecção e doença por Campylobacter pode ser reduzida adminis- trando tal composição imunogênica a um humano com necessidade da mesma, preferencialmente por administração via mucosa.

A presente invenção proporciona adicionalmente anticorpo que liga especificamente a proteína pilus e métodos para detectar C. jejuni, es- pecialmente em biofilmes e/ou produtos alimentícios, ou para diagnosticar infecção por Campylobacter. Adicionalmente, a proteína pilus pode ser usa- da em métodos para monitorar uma resposta imune ou para detectar anti- corpos a ela, por exemplo, para avaliar exposição a uma Campylobacter ou para acompanhar o desenvolvimento de uma resposta imune.

DESCRIÇÃO CONCISA DOS DESENHOS

A figura 1A ilustra os efeitos de meio de crescimento sobre for- mação de biofilme de C. jejuni. Caldos de MHB, de Brucella e de Bolton fo- ram avaliados em relação à sua capacidade de promover formação de bio- filme de M129 de C. jejuni como medido por coloração com VC. Foram reali- zados experimentos em triplicata em três ocasiões separadas. Barras de erro representam um desvio padrão da média.

A figura 1B mostra os efeitos de temperatura e tensão de O2 so- bre formação de biofilme de M129 de C. jejuni como medido por coloração com Violeta Cristal (VC). As condições de crescimento, que foram favoráveis para o crescimento de M129 de C. jejuni, tais como 37°C e 10% de CO2, re- sultaram em formação melhor de biofilme. Foram realizados experimentos três vezes em triplicata. Barras de erro representam um desvio padrão da média.

A figura 2A mostra o efeito de sacarose ou glicose, e a figura 2B mostra o efeito de NaCl sobre a capacidade de M129 de C. jejuni em formar biofilmes como medido por coloração com VC. Na figura 2A, barras brancas representam sacarose, barras cinzas representam glicose. A figura 2B mos- tra o grau de formação de biofilme sob diferentes concentrações de NaCI. Foram realizados experimentos três vezes em triplicata. Barras de erro re- presentam um desvio padrão da média.

A figura 3 mostra que M129 de C. jejuni forma biofilmes em su- perfícies abióticas como medido por coloração com VC. Foram realizados experimentos três vezes em triplicata. Barras de erro representam um desvio padrão da média.

A figura 4 mostra que cloranfenicoi inibe formação de biofilme de M129 de C. jejuni e F38011. Cepas de C. jejuni foram tratadas com 0,5 μg/ml de cloranfenicoi por 15 minutos antes de ensaio para formação de bio- filme na ausência de antibiótico. Foram realizados experimentos três vezes em triplicata. Barras de erro representam um desvio padrão da média. As figuras 5A e 5C mostram que a presença de flagelos de M129 de C. jejuni influencia positivamente a formação de biofilme. Figura 5A: formação de biofilme como função de coloração com VC. Foram realiza- dos experimentos três vezes, em triplicata. Barras de erro representam um desvio padrão da média.

As figura 5B e 5C mostram que a capacidade de sensibilidade do número suficiente de M129 de C. jejuni influencia positivamente a forma- ção de biofilme. Figura 5B: formação de biofilme como medido por coloração com VC. Foram realizados experimentos três vezes, em triplicata. Barras de erro representam um desvio padrão da média. Figura 5C: poços representa- tivos mostrados em 24, 48 e 72 h pós-incubação, mostrando coloração com VC antes da descoloração.

A figura 6 mostra que fluidos sobrenadantes da cultura de bacté- rias gram-negativas e gram-positivas podem influenciar a formação de bio- filmes de M129 de C. jejuni. FSCs de Pseudomonas spp. e A. pyogenes promovem formação de biofilme de C. jejuni. Ensaios de biofilme foram rea- lizados com M129 de C. jejuni em misturas 1:1 de MHB e FSC de P. aerugi- nosa 9027, P. fluorescens PF5, Chromobacterium violaceum CV206, A. pyo- genes BBR1 ou C. perfringens cepa 13. TSB suplementado com soro de bezerro recém-nascido a 5% (TSB 5%) e TSB suplementado com extrato de lêvedo a 0,5% e cisteína a 0,05% (TSBYC) foram usados como controles para FSCs de A. pyogenes e C. perfringens, respectivamente. Foram reali- zados experimentos três vezes em triplicata e barras de erro representam o desvio padrão da média.

A figura 7 mostra que isolados de C. jejuni formam biofilmes em superfícies abióticas. Formação de biofilme por isolados de C. jejuni não se correlacionam com virulência. Foram realizados experimentos três vezes em triplicata. Barras de erro representam um desvio padrão da média.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Enquanto se estudava a capacidade de C. jejuni em formar bio- filmes, descobriu-se que essas bactérias produziam p/7/'não-polares, além de flagelos polares. Os pili foram produzidos em um mutante duplo não- fIagelado flaAB, como também em cepas do tipo selvagem. Uma vez que fatores ambientais e componentes do meio podem afetar a formação de biofilme, testamos várias condições de meio de banho em relação a seus efeitos sobre formação de biofilme de M129 de C. jejuni. Caldos de MHB, de Brucella e de Bolton foram avaliados em relação à sua capacidade de promover formação de biofilme. Os caldos de Brucella e de Bolton mais ricos em nutriente não sustentaram formação ótima de biofilme, enquanto formação significativa de biofilme ocorreu no MHB relativamente pobre de nutriente (figura 1A).

Temperaturas de incubação e tensão de oxigênio podem tam- bém influenciar formação de biofilme (figura 1B). Formação de biofilme de C. jejuni foi avaliada sob diferentes combinações de temperaturas e oxigena- ção. A influência de aerobiose e temperatura teve efeitos dramáticos na for- mação de biofilme. Como se antecipou, formação de biofilme diminuiu com condições de crescimento que são menos favoráveis.

A resposta de C. jejuni aos osmólitos glicose, sacarose e NaCl com respeito à capacidade de influenciar formação de biofilme foi também examinada. Como mostrado nas figura 2A e 2B, a presença de glicose, sa- carose ou NaCl, em todas as concentrações testadas, resultou em formação de biofilme significativamente reduzida. Assim, condições ambientais, bem como componentes do meio, influenciam a capacidade de C. jejuni em for- mar biofilmes.

Formação de biofilme em superfícies abióticas foi estudada. Cé- lulas M129 de C. jejuni formaram biofilmes em diferentes materiais hidrófilos tais como vidro e cobre e materiais hidrofóbicos tais como plásticos, incluin- do poliestireno, polipropileno, policarbonato, ABS e PVC em quantidades variáveis. Para estudar adicionalmente a capacidade de M129 de C. jejuni em formar biofilmes, materiais comumente usados em sistemas de abaste- cimento de água tais como ABS, PVC, cobre e um material de controle poli- estireno foram quantitativamente ensaiados quanto à sua promoção de for- mação de biofilme (figura 3). Pareceu que as propriedades físico-químicas dos materiais poderão afetar ligação e formação de biofilme por C. jejuni. Células de C. jejuni ligaram-se mais prontamente e formaram biofilmes em superfícies hidrofóbicas, embora em graus variáveis. Notavelmente, C. jejuni mostrou uma redução na formação de biofilme sobre o material hidrófilo cobre.

Síntese de proteína é exigida para formação de biofilme. Estu- dos de expressão de genes indicam que há uma diferença no perfil de prote- ínas sintetizadas por células planctônicas (suspensas) versus células de crescimento de biofilme, sugerindo que síntese de novo de certas proteínas poderá ser exigida para formação de biofilme (9; 10; 19). Inibidores de sínte- se de proteína reduziram notadamente formação de biofilme e podem tam- bém provocar a liberação de um biofilme de bactérias ligadas. Portanto, sem desejar estar ligado a qualquer teoria particular, estabelecemos a hipótese de que C. jejuni crescidas em um biofilme sintetizaram proteínas necessárias a essa fase de crescimento sob condições específicas. Quando células de C. jejuni foram incubadas na presença ou ausência de cloranfenicol (CM; 0,5 μg/ml), observou-se uma diferença na formação de biofilme entre as cé- lulas tratadas com CM em comparação com o controle não-tratado (figura 4).

Esses resultados indicam que células de C. jejuni sintetizam proteínas exigi- das para ligação e formação de biofilme em resposta a sinais e condições de crescimento apropriados.

Mostra-se que flagelos têm um papel na formação de biofilme e afetam a taxa de ligação mediante superação de forças associadas à super- fície (12; 14; 21; 22). Neste estudo, flagelo de C. jejuni menos mutante (M129v.fíaAB) foi ensaiado em relação à sua capacidade de formar biofilmes. M129-. JIaAB mostrou uma ligeira redução na formação de biofilme em com- paração com aquela de tipo selvagem em 24 h, mas nos pontos de tempo 48 e 72 h a formação de biofilme diminuiu notadamente (Fig 5A-5C). Também avaliamos diretamente a capacidade do mutante flaAB e M129 do tipo sel- vagem ligar-se a uma superfície de poliestireno usando microscopia óptica (figura 5B-C). A Figura 5B mostra um aumento de células aderentes em um período de tempo de 24, 48 e 72 h para M129 do tipo selvagem. Entretanto, na falta de flagelos, observamos pouquíssimas células aderentes na superfí- cie em 48 e 72 h em comparação com tipo selvagem. Esses dados indicam a importância de flagelos na formação de biofilme de C. jejuni. luxS e sinais de sensibilidade suficiente poderão influenciar for- mação de biofilme. Para ensaiar a possibilidade em que sensibilidade sufici- ente desempenha um papel em biofilmes de C. jejuni, foi introduzida uma mutação no gene de sensibilidade de quantidade suficiente de luxS com o resultado de que o auto-indutor e (Al 2) não foi produzido em células mutan- tes (11). Durante desenvolvimento de biofilme, Al 2 desempenhou um signi- ficativo papel no desenvolvimento de biofilme de C. jejuni, na medida em que nos pontos de tempo 48 e 72 h houve uma redução na formação de biofilme em relação ao mutante luxS, em comparação com o tipo selvagem de C. jejuni (ver figura 5A-5C).

Devido à estreita proximidade de células em um biofilme, o bio- filme é um ambiente ideal para que ocorra sensibilidade suficiente (3; 32). Durante este estudo, FSCs de várias bactérias gram-negativas e gram- positivas crescidas em meio apropriado foram coletadas de condições favo- ráveis para desenvolvimento de biofilme. M129 isoladas de C. jejuni foram crescidas na presença desses fluidos sobrenadantes de cultura; acreditou-se que algumas continham sinais de sensibilidade suficiente ou auto-indutores. Na presença de Pseudomonas spp. e Arcanobacterium pyogenes BBR1, observou-se que fluidos sobrenadantes de cultura causam um aumento no desenvolvimento de biofilme, mas com os outros fluidos sobrenadantes de cultura coletados não há mudança evidente no desenvolvimento de biofilme (figura 6). No entanto, as composições exatas desses fluidos sobrenadantes de cultura não foram definidas no estudo. Sem desejar estar ligado a teoria, acredita-se que Pseudomonas spp., que é comumente encontrada no ambi- ente, e Arcanobacterium pyogenes, um habitante comum de animais domés- ticos e selvagens, apresentam um sinal comum que C. jejuni reconhece para ativar a transcrição do(s) gene(s) necessário(s) para ligação e formação de biofilme.

Pili parecem desempenhar um papel na formação de biofilme. Em experimentos projetados para estudar biofilmes de C. jejuni por micros- copia eletrônica de varredura e de transmissão, os presentes inventores ob- servaram a presença de pili uniformemente distribuídos que interagem com a superfície e célula a célula em vários isolados de C. jejuni. Para determinar se os filamentos mostrados eram pili e não flagelos, um mutante deficiente de flagelos (M129::f/a/4B) foi construído e ensaiado quanto à sua capacidadé de produzir pili. O mutante deficiente de flagelos produziu pili uniformemente distribuídos, como seu pai do tipo selvagem.

Sinais de sensibilidade suficiente influenciam formação de bio- filme. Para ensaiar a possibilidade de que sensibilidade suficiente desempe- nhe um papel em biofilmes de C. jejuni, foi construído um mutante IuxS1 defi- ciente na produção da molécula de sinalização de sensibilidade suficiente Al 2(33). Al 2 desempenhou um significativo papel no desenvolvimento de bio- filme de C. jejuni, à medida que nos pontos de tempo 48 e 72 h houve uma redução na formação de biofilme para o mutante IuxS, em comparação com M129 de C. jejuni do tipo selvagem (figura 5B). Para confirmar essa obser- vação, o mutante IuxS foi crescido na presença de fluidos sobrenadantes de cultura de M129 do tipo selvagem misturado 1:1 com MHB. M129 foi cresci- da sob condições favoráveis para produzir moléculas de sensibilidade sufici- ente. Na presença de FSC de M129 do tipo selvagem observou-se um au- mento no biofilme de mutante IuxS. O mutante IuxS não era defeituoso quan- to a crescimento em comparação com o tipo selvagem.

Poucos biofilmes ambientais contêm uma única espécie bacteri- ana, e a estrutura de um biofilme, com células em estreita proximidade umas com as outras, presta-se a sinalização interespécies (13, 34). Durante este estudo, fluidos sobrenadantes de cultura foram preparados a partir de várias bactérias gram-negativas e gram-positivas crescidas sob condições favorá- veis para expressão de moléculas de sensibilidade suficiente. M129 isolada de C. jejuni foi crescida na presença desses FSCs misturados 1:1 com MHB, que foi exigido para sustentar o crescimento de C. jejuni. Na presença de FSCs de Pseudomonas spp. e Arcanobacterium pyogenes BBR1, observou- se um aumento no desenvolvimento de biofilme, enquanto FSCs de Ciostri- dium perfringens e Chromobacterium vioiaceum não tiveram efeito evidente no desenvolvimento de biofilme.

O papel de expressão de gene para virulência na formação de biofilme foi estudado. Para ensaiar a possibilidade de que genes para viru- lência desempenham um papel em biofilmes de C. jejuni, foram construídos um mutante ciaB e um tlyA, deficientes na produção de uma proteína tipo três sistemas de secreção e um gene associado a uma atividade de coloni- zação e hemolítica em tlyA de H. pylori. tlyA é um gene não-caracterizado em C. jejuni, e, portanto, o papel exato que ele desempenha na formação de biofilme não é conhecido. c/aB não parece desempenhar um papel na for- mação de biofilme, na medida em que tlyA mostrou um ligeiro aumento.

Isolados múltiplos de C. jejuni formam biofilmes. A capacidade de isolados clínicos e não-patogênicos de C. jejuni em formar biofilmes foi determinada. Formação de biofilme não pareceu correlacionar-se com a pa- togenicidade do isolado de C. jejuni. Isolado S2B foi capaz de formar biofil- mes em grau similar a M129 e aos outros isolados clínicos humanos. Contu- do, UMC3, um recente isolado clínico humano, foi o formador mais pobre de biofilme testado. NCTC11168 foi relatado não ligar-se a PS. Sabe-se bem que NCTC11168 perde motilidade em passagem de laboratório, e os resul- tados díspares poderão refletir tal variação nos dois isolados.

A capacidade de isolados clínicos e não-patogênicos de C. jejuni em formar biofilmes foi determinada. Formação de biofilme não pareceu cor- relacionar-se com a patogenicidade do isolado de C. jejuni. O isolado S2B não-patogênico foi capaz de formar biofilmes em grau similar a M129 è ao outro isolado clínico. Contudo, cepa UMC3, que foi isolada de um paciente, foi o formador mais pobre de biofilme testado.

Foi realizado experimento preliminar com uma dose de imuniza- ção, administrada subcutaneamente, de proteína piius de 0,15 mg por ave com 7 e 17 dias de idade. No 249 dia de idade, os pintos foram desafiados com 5 χ 108 células de C. jejuni do tipo selvagem (heterólogo de que a prote- ína piius foi derivada. No 359 dia, os pintos foram sacrificados e, embora em média, as aves de controle apresentavam números médios mais altos de células viáveis nos cecos; os frangos imunizados apresentaram números menores de células e 4 dos 19 frangos exibiram uma queda de pelo menos 100 vezes em C. jejuni viável. Sem desejar estar ligado a teoria, os invento- res acreditam que a dose de desafio de bactérias foi alta demais para permi- tir forte proteção evidente.

Discussão

O reconhecimento de Campylobacter spp. como importante pa- tógeno entérico humano ocorreu somente nos últimos vinte anos, e, até ago- ra, pouco se sabe sobre a patogênese e fatores de virulência desse orga- nismo. Um dos fatores menos entendido é a capacidade de C. jejuni formar biofilmes em superfícies abióticas e superfícies biológicas. Identificação de fatores ambientais responsáveis pela iniciação de biofilmes de C. jejuni é de importância fundamental a fim de estudar as capacidades de sobrevivência desse organismo externamente ao hospedeiro. Inibição de formação de bio- filme por esse patógeno poderia potencialmente impedir a colonização de vários animais domesticados para consumo e companhia e a contaminação de nossas redes de abastecimento de água que poderão servir como fontes de infecção humana.

Em seus ambientes naturais, as bactérias são freqüentemente desafiadas por tensões ambientais, incluindo falta de nutrientes, alterações osmóticas, variação de temperatura e tensões variadas de oxigênio (10; 13; 14; 19; 20; 25; 26). Pensa-se que bactérias formem biofilmes em resposta a mudanças ambientais, de modo que há uma transição para um estilo de vida séssil (14; 19; 22; 24; 28). Outros fatores que afetam a formação de biofilme incluem propriedades do substrato, hidrodinâmica, condicionamento do substrato e características do meio de banho (3; 10; 19; 27), todos os quais desempenham um papel na taxa de ligação bacteriana e formação de biofil- me. Em alguns modelos de biofilme, alterações nas forças iônicas e concen- trações dos nutrientes influenciaram a taxa em que bactérias se ligaram e formaram biofilmes em uma superfície (10; 13; 14). Uma vez que fatores ambientais e conteúdo do meio podem afetar a formação de biofilmes, tes- tamos várias condições de meios de banho em relação à sua capacidade de afetar biofilmes de C. jejuni. Os resultados obtidos indicaram que meios mais ricos em nutrientes não sustentam formação ótima de biofilme, levando à conclusão de que ambientes pobres em nutrientes tais como aqueles encon- trados em sistemas de água poderão favorecer o desenvolvimento de biofil- mes de C. jejuni. Examinamos também as respostas de formação de biofil- mes de C. jejuni em concentrações variáveis dos osmólitos glicose, sacarose e NaCI: elevações nos níveis de cada um desses osmólitos levou a uma no- tável diminuição na formação de biofilme. Formação de biofilme reduzida poderá ser o resultado de uma transformação morfológica de células em forma de bastonete ou espirais a esféricas.

Formas esféricas poderão representar uma forma degenerada de célula em que dano à membrana celular e degradação de componentes celulares poderão ocorrer durante períodos em que osmoadaptação é exigi- da.

Temperaturas de incubação e tensão de oxigênio podem tam- bém influenciar formação de biofilme. No entanto, há poucos estudos condu- zidos sobre o efeito direto de aerobiose na sobrevivência e biofilmes de C. jejuni. Em ambientes marinhos e outros ambientes aquáticos, concentrações de oxigênio dissolvido poderão ser diminuídas por meio de vazões de água menores, aumento de temperatura, matéria orgânica e turbulência reduzida (6). Mantendo a natureza microaerófila e termófila de C. jejuni, tensões de oxigênio menores e temperaturas mais altas favoreceram biofilmes, conside- rando que temperaturas ambientes altas, temperaturas termófilas e/ou con- dições aeróbicas inibiram formação de biofilme.

As propriedades físico-químicas de uma superfície podem afetar ligação de C. jejuni. C. jejuni foi capaz de ligar-se em graus variáveis a su- perfícies hidrofóbicas e hidrófilas. Portanto, parece que C. jejuni tem a capa- cidade de superar forças repulsivas associadas a superfícies hidrofóbicas e hidrófilas. Alguns dos fatores que poderão ajudar a superar essas forças re- pulsivas incluem a presença de flagelos e a produção de exopolissacarídeo (EPS) (10; 12; 14; 24). A hidrofobocidade da superfície bacteriana pode ser importante na adesão. Bactérias tendem a ser negativamente carregadas, mas elas contêm componentes superficiais hidrofóbicos tais como flagelos que podem interagir com uma superfície (10; 30). Estudos têm mostrado que tratamento de bactérias com inibidores de síntese de proteína podem mar- cadamente diminuir formação de biofilme e podem levar à liberação de bac- térias ligadas (3; 10; 21). Pré-incubação de células de C. jejuni com CM ini- biu formação de biofilme, sugerindo que células de C. jejuni sintetizam prote- ínas exigidas para ligação e formação de biofilme em resposta a sinais e condições de crescimento apropriados.

Flagelos de muitas espécies bacterianas apresentam um signifi- cativo papel na formação de biofilme e na taxa de ligação com uma superfí- cie (10; 21; 22). Neste estudo, flagelos de C. jejuni menos mutante (M129::fla/4S) reduziram formação de biofilme em comparação com a cepa do tipo selvagem. A falta de flagelos mostrou uma ligeira redução na forma- ção de biofilme em comparação com aquela de tipo selvagem em 24 h, mas nos pontos de tempo 48 e 72 h o biofilme marcadamente diminuiu. Essas verificações poderão sugerir que flagelos de C. jejuni poderão ser exigidos mais para desenvolvimento de biofilme do que para ligação com uma superfície.

Sensibilidade suficiente ou sinalização célula-célula desempe- nha um papel em ligação e desprendimento celular de biofilmes (10; 11; 29). M129 de C. jejuni foi crescida na presença de fluidos sobrenadantes de cul- tura bacteriana; acredita-se que alguns continham sinais de sensibilidade suficiente ou auto-indutores. Acredita-se que diversos fluidos estudados con- têm uma sinal comum reconhecido por células AI-2 de C. jejuni porque um aumento na formação de biofilme foi observado durante o estudo. Para en- saiar o papel de sensibilidade suficiente em biofilmes de C. jejuni, foi cons- truída uma mutação no gene IuxS, que não permite a produção de Al 2 (11). Sensibilidade suficiente em bactérias gram-negativas depende da molécula de sinalização homosserina lactona (HSL), que controla a expressão de di- versas características que incluem bioluminescência, formação de biofilme e fatores de virulência (11). Em C. jejuni, foi identificado um sistema de sensi- bilidade suficiente que produz a molécula de sinalização Al 2. Esse sistema é altamente conservado tanto em bactérias gram-positivas quanto em bacté- rias gram-negativas e pensa-se que é utilizado para comunicação interespé- cies (11). O gene luxS codifica a enzima final no caminho biossintético para produção de AI-2 (11). Nossos estudos indicam que desenvolvimento de bio- filme em C. jejuni exige Al 2, uma vez que foi observada uma redução na formação de biofilme entre o mutante luxS e o tipo selvagem. Embora a na- tureza exata de regulação de genes durante formação de biofilme de C. jeju- ni não seja entendida, claramente comunicação célula-célula via AI-2 de- sempenha um papel na indução de expressão de genes exigida para essas funções.

Formação de biofilme por isolados de C. jejuni foi estudada u- sando técnicas de microscopia e um ensaio quantitativo por coloração. For- mação de biofilme não pareceu estar correlacionada com a patogênese do isolado. Entretanto, cada um dos isolados formaram uma distribuição uni- forme de células sobre superfície de poliestireno. Embora haja diferenças na densidade de bactérias aderentes, poucas microcolônias de bactérias foram observadas durante microscopia. A capacidade de isolados de C. jejuni em formar biofilmes em uma superfície abiótica poderá ajudar a explicar sua capacidade de sobreviver externamente a seu hospedeiro normal e atuar como uma fonte contínua de colonização e/ou de contaminação por infecção de animais e humanos.

Apesar das limitações ambientais de células de C. jejuni, sobre- vivência em biofilmes poderá desempenhar um importante papel para a transmissão do patógeno a animais e carcaças em atividade agrícola e insta- lações de processamento de alimentos, afetando assim humanos. A variabi-l lidade dos biofilmes entre isolados contribuiria para que certas cepas sejam de particular interesse em infecções humanas. Nossos estudos devem, por- tanto, ser estendidos para determinar a influência de sistemas de distribui- ção de água nessas instalações e a correlação de isolados de C. jejuni veri- ficada em biofilmes e aquelas que colonizam animais e causam afetações em humanos. Conseqüentemente, é importante proporcionar composições imunogênicas para administração a humanos e a animais, especialmente aqueles animais que são colonizados por C. jejuni e que servem como fon- tes de contaminação de alimentos, leite, água e solo, e, assim, de infecções em humanos.

Abreviações usadas aqui para aminoácidos são padrões no es- tado da técnica. As abreviações para resíduos de aminoácidos como usado aqui são como seguem: A, Ala, alanina; V, Val1 valina; L1 Leu, leucina; I, lie, isoleucina; P, Pro, prolina; F, Phe, fenilalanina; W, Try, triptofano; M, Met, metionina; G, Gly, glicina; S, Ser, serina; T, Thr, treonina; C, Cys, cisteína; Y, Tyr, tirosina; N, Asn1 asparagina; Q, Gln, glutamina; D, Asp, ácido aspártico; E, Glu, ácido glutâmico; K, Lys, lisina; R, Arg, arginina; e H, His, histidina.

Como usado neste relatório, atenuado significa que uma cepa bacteriana é de virulência reduzida em comparação com uma cepa clínica do "tipo selvagem" que causa doença em um humano ou animal particular; a cepa atenuada não causa doença no humano ou animal particular. Exem- plos não-limitativos de cepas de Campylobacter atenuadas são aqueles que não expressam produtos funcionais dos genes fure/ou kat/K.

Com referência a uma mutação, inativação funcional de um gene significa que há pouca ou nenhuma atividade do produto genético. Por e- xemplo, onde o gene codifica uma enzima, o produto codificado apresenta menos de 10%, desejavelmente menos de 5% ou menos de 1%, da ativida- de enzimática do produto do gene do tipo selvagem, ou há menos de 10%, menos de 5% ou menos de 1% do produto de expressão. Isto é, a seqüência de codificação pode ser interrompida com um nucleotídeo ou seqüência in- traduzido, parcial ou totalmente suprimida, ou pode ser uma mutação substi- tuinte que muda a seqüência de aminoácidos da proteína codificada tal que a atividade seja significativamente reduzida. Alternativamente, pode haver uma inserção, supressão ou mudança em seqüências reguladoras de trans- crição e/ou tradução tal que expressão seja reduzida ou impedida no nível de transcrição e/ou tradução de mRNA de genes.

No presente contexto, material de biofilme de Campylobacter contém a proteína pilus da presente invenção, isto é, uma proteína pilus ca- racterizada pela seqüência de aminoácidos dada em ID SEQ NO: 2 ou uma seqüência com pelo menos 90% de identidade com ela. O material de biofil- me tipicamente contém polissacarídeo(s) extracelular(es) e células também. Vantajosamente, a Campylobacter é uma C. jejuni ou uma E. coli. Proteína pilus é expressa durante as fases de retardamento e estacionária de cresci- mento e em biofilmes. Condições estáticas de crescimento, por exemplo, em Meio de Mueller-Hinton, favorecem formação de biofilme. O biofilme adere ao recipiente, especialmente ao fundo do recipiente. Ele pode ser removido após remoção do meio gasto. Se a cepa de Campylobacter não é atenuada, as células viáveis podem ser mortas como sabido no estado da técnica.

As composições imunogênicas e/ou vacinas que contêm a prote- ína pilus de C. jejuni da presente invenção são formuladas por qualquer dos meios conhecidos no estado da técnica. Elas podem ser tipicamente prepa- radas como injetáveis ou como formulações para administração intranasal ou oral ou para administração por via oral forçada ou alimentação à vontade, por exemplo, em água potável, seja como soluções líquidas ou suspensões. Formas sólidas adequadas para solução, ou suspensão, em líquido antes de injeção ou outra via de administração poderão também ser preparadas. A preparação poderá também, por exemplo, ser emulsificada, ou a(s) proteí- na(s)/peptídeo(s) encapsulados em lipossomos.

Em vista das vias mais prováveis de infecção de humanos e a- nimais, imunidade via mucosa é especialmente vantajosa, e as composições imunogênicas vantajosamente contêm um adjuvante tal como a subunidade B não-tóxica de toxina de cólera (ver, por exemplo, a Patente Norte- americana No. 5.462.734). Subunidade B de toxina de cólera é comercial- mente disponível, por exemplo, da Sigma Chemical Company, St. Louis, MO. Ourtos adjuvantes adequados são disponíveis e poderão ser substituí- dos por eles. Prefere-se que um adjuvante para uma formulação imunogêni- ca de aerossol (ou vacina) seja capaz de ligar-se a células epiteliais e esti- mular imunidade via mucosa.

Entre os adjuvantes adequados para administração via mucosa e para estimular imunidade via mucosa estão organometalopolímeros, inclu- indo silicones lineares, ramificados ou reticulados que são ligados nas ex- tremidades ou ao longo do comprimento dos polímeros até a partícula ou seu núcleo. Esses polissiloxanos podem variar de peso molecular de cerca de 400 a acerca de 1.000.000 de dáltons; a faixa preferida de comprimentos é de cerca de 700 a cerca de 60.000 dáltons. Silicones funcionalizados ade- quados incluem polidialquilsiloxanos terminados em (trialcoxisilil)alquila e polidialquilsiloxanos terminados em trialcoxisilila, por exemplo, polidimetilsi- Ioxano terminado em 3-(trietioxisilil)propila. Ver Patente Norte-americana No. 5.571.531, incorporada aqui como referência. Polieletrólitos de fosfazeno podem também ser incorporados em composições imunogênicas para admi- nistração via mucosa (intranasal, vaginal, retal, sistema respiratório por ad- ministração por aerossol) (Ver, por exemplo, Patente Norte-americana No. 5.562.909).

Os ingredientes imunogênicos ativos são freqüentemente mistu- rados com excipientes ou veículos que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo. Excipientes adequados incluem, mas sem se limitar aos mesmos, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol ou similar, e combinações dos mesmos. A concentração do polipeptídeo i- munogênico em formulações injetáveis, de aerossol ou nasal situa-se usu- almente na faixa de 0,2 a 5 mg/ml. Dosagens similares podem ser adminis- tradas noutras superfícies mucosas. Essa vacina pode facilmente ser prepa- rada misturando a proteína com um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo farmaceuticamente aceitável é entendido como sendo um com- posto que não afeta adversamente a saúde do animal a ser vacinado, pelo menos não no grau em que o efeito adverso é pior do que os efeitos obser- vados quando o animal não está vacinado. Um veículo farmaceuticamente aceitável pode ser, por exemplo, água estéril ou uma solução salina fisiológi- ca estéril. Em um sistema mais complexo, o veículo pode, por exemplo, ser um tampão.

Se, contudo, vacinação oral por meio de água potável for consi- derada, quantidades de proteína possivelmente maiores têm de ser dadas devido a derramamento de água.

A vacina de acordo com a presente invenção poderá adicional- mente conter um adjuvante. Adjuvantes imunológicos em geral compreen- dem substâncias que intensificam a resposta imune do hospedeiro de uma maneira não-específica. Vários diferentes adjuvantes são conhecidos no es- tado da técnica. Exemplos de adjuvantes são Adjuvante Completo e Incom- pleto de Freunds1 vitamina Ε, polímeros em bloco não-iônicos e poliaminas tais como sulfato de dextrano, carbopol e pirano, bactérias tais como Borde- tella pertussis ou E coli ou matéria derivada de bactérias, oligopeptídeo, pa- rafina emulsificada Emulsigen. TM. (MVO Labs, Ralston, NE), adjuvante L80 contendo hidróxido de alumínio (Rehels, NJ), Quil A (Superphos) ou outros adjuvantes conhecidos daquele habilitado no estado da técnica. Também muito adequadas são substâncias de superfície ativa tais como Span, Twe- en, hexadecilamina, lisolecitina, metoxiexadecilglicerol e saponinas. Adicio- nalmente, peptídeos tais como muramildipeptídeos, dimetilglicina e tuftsina são freqüentemente utilizados. Além desses adjuvantes, Complexos Imuno- estimuladores (ISCOMS), óleo mineral, por exemplo, Bayol ou Markol, óleos vegetais ou emulsões destes e Diluvac.Forte podem vantajosamente ser usados. A vacina poderá também compreende um chamado "excipiente". Um excipiente é um composto ao que o polipeptídeo adere, sem ligar-se convalentemente a ele. Compostos excipientes com freqüência usados são, por exemplo, hidróxido de alumínio, fosfato, sulfato ou óxido; sílica; caulim ou bentonita. Uma forma especial desses excipiente, em que o antígeno está parcialmente embutido no excipiente, é o chamado ISCOM (EP 109.942, EP 1). A vacina poderá também conter conservantes tais como azida de sódio, timersol, gentamicina, neomicina e polimixina. 80.564, EP 242-380).

Freqüentemente, a composição imunogênica adicionalmente compreende estabilizantes, por exemplo, para proteger de degradação poli- peptídeos propensos a serem degradados, para aumentar a vida própria da vacina ou para aperfeiçoar a eficiência de secagem por congelamento. Esta- bilizantes úteis incluem, sem limitação, SPGA, leite desnatado, gelatina, so- roalbumina bovina ou outra soroalbumina, carboidratos, por exemplo, sorbi- tol, manitol, trealose, amido, sacarose, dextrano ou glicose, proteínas tais como albumina ou caseína ou produtos de sua degradação, e tampões, tais como fosfatos de metais alcalinos. Onde é usada uma albumina, ela é dese- javelmente da mesma espécie do animal (ou humano) ao qual a composição imunogênica que a contém será administrada. Secagem por congelamento é um método eficiente de conservação. Material secado por congelamento pode ser armazenado de forma estável por muitos anos. Temperaturas de armazenamento para material secado por congelamento poderão situar-se bem abaixo de zero grau, sem ser prejudicial ao material. Secagem por con- gelamento pode ser efetuada de acordo com todos os procedimentos pa- drões de secagem por congelamento bem conhecidos.

Vacinas que compreendem a proteína pilus, especialmente uma proteína pilus recombinantemente expressa, são preferencialmente adminis- tradas via mucosa. Isso pode ser feito por administração oral, por meio de mistura da vacina com água potável ou alimento. Especialmente para aves domésticas, métodos adicionais tais como vacinação intraocular e vacinação intranasal são também maneiras muito adequadas de vacinação via mucosa.

Adicionalmente, se desejado, as vacinas poderão conter quanti- dades menores de substâncias auxiliares tais como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento de pH e/ou adjuvantes que au- mentam a eficácia da vacina. Exemplos de adjuvantes que poderão ser efi- cazes incluem, mas sem se limitar aos mesmos, hidróxido de alumínio, N- acetil-muramil-L-troenil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L- alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, referido como nor-MDP), N-acetilmura- mil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanino-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifos- forilóxi)-etilamina (CGP 19835A, referido como MTP-PE) e RIBI, que contém três componentes extraídos de bactérias: monofosforil lipídeo A, dimicolato de trealose e esqueleto de parede celular (MPL+TDM+CWS) em uma emul- são esqualeno a 2%/Tween 80. A eficácia de um adjuvante poderá ser de- terminada medindo a quantidade de anticorpos (especialmente IgA, IgM ou IgG) dirigidos contra o imunógeno resultante de administração do imunógeno em vacinas que compreendem o adjuvante em questão. Formulações adi- cionais e modos de administração conforme conhecidos no estado da técni- ca poderão também ser usados.

Um antígeno de proteína pilus de interesse ou um peptídeo de seqüência derivada dessa proteína é formulado em vacinas como formas neutras ou salinas. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas sem se limitar aos mesmos, os sais de adição de ácidos (formados com grupos ami- no livres do peptídeo) que são formados com ácidos inorgânicos, por exem- plo, ácido clorídrico ou ácidos fosfóricos; e ácidos orgânicos, por exemplo, ácidos acético, oxálico, tartárico ou maléico. Sais formados com os grupos carboxila livres poderão também ser derivados de bases inorgânicas, por exemplo, hidróxido de sódio, de potássio, de amônio, de cálcio ou férrico, e bases orgânicas, por exemplo, isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino- etanol, histidina e procaína.

As composições imunogênicas ou vacinas são administradas de uma maneira compatível com a formulação da dosagem, e em quantidade e maneira tais que serão profilática e/ou terapeuticamente eficazes, de acordo com o que é sabido no estado da técnica. A quantidade a ser administrada, que se situa geralmente na faixa de cerca de 100 a 1.000 μg de proteína por dose, mais geralmente na faixa de cerca de 20 a 1.000 μg de proteína por dose, depende do indivíduo a ser tratado, da capacidade do sistema imune do indivíduo (ou do animal) em sintetizar anticorpos, e do grau de proteção desejado. Quantidades precisas do ingrediente ativo exigidas para serem administradas poderão depender do julgamento do médico ou veterinário e poderão ser peculiares a cada indivíduo, mas essa determinação está dentro da capacidade desse profissional.

Como alternativa ao uso de proteína pilus recombinante em composições imunogênicas, podem-se usar preparações de células inteiras de C. jejuni mortas de culturas estáticas (por exemplo, usando Caldo de Mu- eller-Hinton como meio de-cultura) colhendo o crescimento de biofilme em que os pili são expressos a partir da superfície do recipiente. Onde se usa um isolado clínico ou uma cepa do tipo selvagem, desejavelmente o biofilme é tratado para matar as células bacterianas que se encontram nelas. Elimi- nação de células viáveis é bem conhecida no estado da técnica; exemplos não-limitativos de agentes apropriados incluem formalina e BEI. Outra abor- dagem ao uso de composições imunogênicas de células inteiras (biofilme) é o uso de mutantes de C. jejuni atenuados crescidos sob condições que re- sultam em formação de pilus, como em condições formadoras de biofilme. Cepas patogênicas podem ser atenuadas inativando funcionalmente o gene para catalase {katA, ver Day e colaboradores, 2000) ou o gene fur, ou mu- tantes que carecem de uma ou de ambas essas funções podem ser isola- dos. Outras espécies de Campylobacter podem ser usadas em lugar de C. jejuni nos presentes métodos.

Antes de formulação em uma vacina, as células bacterianas na preparação poderão ser inativadas. As células bacterianas poderão ser inati- vadas usando calor (por exemplo, tratamento por duas horas a 60°C) ou a- gentes químicos, tipicamente aqueles comumente usados para preparações comerciais de vacina, seguindo procedimentos padrões conhecidos daque- Ies habilitados no estado da técnica. Agentes químicos adequados para ina- tivar as preparações bacterianas da invenção invenção β-propiolatona {β- Prone, Grand Laboratories, Inc., Larchwood, IA) ou etilenoinina binária 0,1 M (BEI). Outros métodos e materiais são bem conhecidos no estado da técni- ca. Inativação das culturas poderá ser confirmada, por exemplo, plaqueando amostras múltiplas sobre um sólido adequado e incubando as placas sob condições ótimas de crescimento.

A vacina ou outra composição imunogênica poderá ser dada em uma dose única; programa de duas doses, por exemplo, duas a oito sema- nas, separadamente; ou um programa de doses múltiplas ou em combina- ção com outras vacinas. Um programa de doses múltiplas é aquele em que um curso primário de vacinação poderá incluir 1 a 10 ou mais doses separa- das, seguidas de outras doses administradas em intervalos de tempo subse- qüente como exigido para manter e/ou reforçar a resposta imune, por exem- plo, em 1 a 4 meses para uma segunda dose, e, se necessário, uma dose ou doses subseqüentes após diversos meses. Humanos (ou outros animais) imunizados com o antígeno administrado de acordo com a presente inven- ção são protegidos de infecção pelo patógeno de que o antígeno de interes- se é derivado.

Os métodos para a preparação de uma vacina de acordo com a invenção não precisa ser complexo. Em princípio, é suficiente originar anti- corpos à proteína pilus descrita aqui em, por exemplo, um animal, seguido de coleta do sangue e isolamento do anti-soro de acordo com técnicas pa- drões. Animais adequados para originar esses anticorpos são, por exemplo, coelhos e galinhas. Quando são usadas galinhas, anticorpos podem alterna- tivamente ser obtidos da gema de ovo de galinhas sistemicamente imuniza- das. Em princípio, os anticorpos não precisam ser diluídos. Eles podem ser dados como tais ou, se necessário, então em uma forma concentrada. Alter- nativamente, se a concentração de anticorpos é muito alta, o anti-soro assim obtido pode, por exemplo, ser diluído antes de administração.

É também possível obter células que produzem os anticorpos desejados, anticorpos monoclonais ou anticorpos de cadeia única dessa es- pecificidade, e desenvolver estes em um fermentador ou aparelho de cultura de células. Anticorpos podem ser colhidos depois e podem ser misturados, se necessário, com um veículo farmaceuticamente aceitável. A vantagem desse método é que nenhum animal precisa ser usado para a preparação dos anticorpos.

Uma aplicação do aspecto de imunização da presente invenção é tratar frangos para assar antes do abate. Esses frangos para assar são usualmente abatidos em seis semanas de idade. Portanto, tratamento dos animais com uma composição imunogênica que compreende a proteína pi- lus ou uma vacina de células integrais que contém pilus, de uma a três se- manas antes de abate, leva a uma significativa diminuição no nível de con- taminação por Campylobacter.

Anticorpos específicos à proteína pilus da presente invenção podem ser dados como uma preparação preferencialmente bruta, por exem- plo, alimentando frangos com anti-soro bruto. Vias alternativas de adminis- tração incluem, sem limitação, misturar o soro com água potável ou com ali- mento para frangos. Com essa finalidade, uma alternativa é secagem dos anticorpos por congelamento, elevando desse modo sua estabilidade a lon- go prazo, antes de misturá-los com o alimento ou água. Também, os anti- corpos podem ser encapsulados antes de adicioná-los a alimento para fran- gos. Uma preparação de anti-soro ou anticorpos com especificidade à prote- ína pilus de Campylobacter da presente invenção pode ser usada no trata- mento de um paciente (especialmente um paciente humano) que sofre de uma infecção por Campylobacter.

Anticorpos específicos à proteína pilus da presente invenção podem ser usados para detectar Campylobacter, especialmente C. jejuni, em amostras de biofilme ou fecal, ou para a diagnose de infecção por Campylo- bacter, especialmente C. jejuni.

Outro uso da proteína pilus da presente invenção está na detec- ção de anticorpos específicos a essa proteína, por exemplo, para monitorar exposição de um animal ou humano a uma Campylobacter, especialmente C. jejuni, ou para monitorar o desenvolvimento de uma resposta imune (hu- moral) à proteína pilus de C. jejuni.

Outra estratégia para imunização de um humano ou animal é administrar uma molécula de DNA que codifica a proteína pilus da presente invenção, na qual a seqüência de codificação liga-se operavelmente a se- qüências de transcrição e tradução apropriadas para dirigir expressão no humano ou animal em que ela foi introduzida.

Ainda outra estratégia é usar uma cepa de Salmonella avirulenta para expressar a seqüência de codificação de pilus de interesse (para expe- rimentos prévios que não envolvem a proteína pilus, ver Pawelec e colabo- radores (1997), FEMS Immunology and Medicai Microbiology (FEMS Imuno- logia e Microbiologia Médica), 19:137-140). Pawelec e colaboradores sugeri- ram que construção de cepas de S. typhimurium que expressam genes para C. jejuni que codificam um antígeno de C. jejuni protetor, tais como CjaA, GjaC,: LPS, MOMP, flagelos ou-uma subunidade de flagelina, poderia pro- porcionar um método eficaz de obtenção de vacinas para frangos contra ambos os enteropatógenos. A Publicação de Patente Norte-americana 2001/0038844 A1 ensina a expressão de um antígeno ou fragmento flagelar em uma cepa de mutante recombinante de Salmonella. Várias cepas aviru- lentas de Salmonella capazes de originar respostas imunes via mucosa em frangos são descritas. Por exemplo, um mutante delta-cya-delta-crp de S. typhimurium foi desenvolvido por Curtiss e Kelly (Curtiss e Kelly, 1987, In- fect. Immun., 55:3035-3044) e adicionalmente modificado por Galen e cole- gas (Galen e colaboradores, 1990, Gene, 94:29-35). Ver, também, Patente Norte-americana No. 5.424.065, que descreve desenvolvimento de outra cepa de mutante de Salmonella com uma mutação no gene phoP, bem co- mo uso desses organismos mutantes avirulentos como componentes de va- cinas contra Salmonella typhimurium. X3985 A-cya-A-crp de S. typhimurium deu origem a significativa proteção contra redesafio com uma cepa virulenta de Salmonella em frangos, uma resposta que foi mostrada ser dependente de dose e cepa (Hassan e Curtiss, 1990, Res. Microbiol., 141:839-850). En- tretanto, como ensinado por Curtiss e colaboradores, Patente Norte- americana No. 5.424.065, uso bem-sucedido desses mutantes de Salmonel- la é dependente do hospedeiro, da espécie bacteriana e da via de imuniza- ção. Mutantes de Samonella são também usados como vetores para ex- pressar antígenos estranhos de mutantes de Steptoeoeeus, S. sobrinus (Dogget e colaboradores, 1993, lnfect. Immun., 61:1859-1966; Jagusztyn- Krynicka e colaboradores, 1993, lnfect. Immun., 61:1004-1015; Redman e colaboradores, 1995, lnfect. Imunn., 63:2004-2011; Redman e colaborado- res, 1996, Vaccine, 14:868-878), S. equi, Bordetella avium (Gentry-Weeks e colaboradores, 1992, J. Bacteriol., 174:7729-7742), B. pertussis, Myeobaete- rium (Curtiss e colaboradores, 1990, Res. Mierobiol., 141:797-805), vírus da hepatite (Schodel e colaboradores, 1994, lnfect. Imunn., 62:1669-1676), pro- teínas de fusão de toxinovirais termicamente lábeis de E. eoli (Smerdòu e colaboradores, 1996, Vírus Res., 41:1-9), e fragmento C de toxina de tétano (Karem e colaboradores, 1995, lnfect. Immun., 63:4557-4563).

Os aminoácidos que ocorrem, nas várias seqüências de aminoá- cidos referidas no relatório descritivo têm suas abreviações usuais de três e uma letra rotineiramente usadas no estado da técnica: A, Ala, Alanina; C, Cys, Cisteína; D, Asp, Ácido Aspártico; E, Glu, Ácido Glutâmico; F, Phe, feni- lalanina; G, Gly, glicina; H, His, Histidina; I, lie, Isoleucina; K, Lys, Lisina; L, Leu, Leucina; M, Met, Metionina; N, Asn, Asparagina; P, Pro, Prolina; Q, Gln, Glutamina; R, Arg, Arginina; S, Ser, Serina; T, Thr, Treonina; V, Val1 Valina; W, Try, Triptofano; Y, Tyr, Tirosina.

Uma proteína é considerada uma proteína isolada se ela é uma proteína isolada de uma célula hospedeira em que ela é recombinantemente produzida. Ela pode ser purificada ou pode simplesmente ser isenta de ou- tras proteínas e materiais biológicos com que ela é associada por natureza.

Um ácido nucléico isolado é um ácido nucléico cuja estrutura não é idêntica àquela de qualquer ácido nucléico que ocorre naturalmente ou àquela de qualquer fragmento de um ácido nucléico genômico que ocorre naturalmente que cobre mais de três genes separados. O termo, portanto, abrange, por exemplo, um DNA que apresenta a seqüência de parte de uma molécula de DNA genômico que ocorre naturalmente, mas que não é flan- queado por ambas as seqüências de codificação e de não-codificação que flanqueiam essa parte da molécula no genoma do organismo em que ele ocorre naturalmente; um ácido nucléico incorporado em um vetor ou no DNA genômico de um procarionte ou eucarionte de uma maneira tal que a molé- cula resultante não seja idêntica a qualquer vetor ou DNA genômico que o- corre naturalmente; uma molécula separada tal como um cDNA, um frag- mento genômico, um fragmento produzido por reação em cadeia de polime- rase (RCP), ou um fragmento de restrição; e uma seqüência de nucleotídeo recombinante que é parte de um gene híbrido, isto é, um gene que codifica uma proteína de fusão. Especificamente excluídos dessa definição estão ácidos nucléicos presentes em misturas de moléculas de DNA, células trans- formadas ou transfectadas, e clones de células, por exemplo, à medida que estes ocorrem em uma biblioteca de DNA, tal como uma biblioteca de cD- NAou de DNA genômico.

Como usado aqui, expressão dirigida por uma seqüência particu- lar é a transcrição de uma seqüência a jusante associada. Se apropriado e desejado para a seqüência associada, o termo expressão também abrange tradução (síntese de proteína) do RNA transcrito.

No presente contexto, um promotor é uma região de DNA que inclui seqüências suficientes para causar transcrição de uma seqüência as- sociada (a jusante). O promotor poderá ser regulado, isto é, não atuando constitutivamente para produzir transcrição da seqüência associada. Se passível de indução, há seqüências presentes que mediam regulação de expressão de modo que a seqüência associada seja transcrita somente quando uma molécula indutora está presente no meio em que o organismo é cultivado. No presente contexto, um seqüência reguladora de transcrição inclui uma seqüência promotora e pode adicionalmente incluir seqüências cis-ativas para expressão regulada de uma seqüência associada em respos- ta a sinais ambientais, também conhecida no estado da técnica.

Uma porção ou seqüência de DNA está a jusante de uma se- gunda porção ou seqüência de DNA quando se localiza 3' da segunda se- qüência. Uma porção ou seqüência de DNA está a montante de uma segun- da porção ou seqüência de DNA quando se localiza 5' dessa seqüência.

Uma molécula ou seqüência de DNA e outra seqüência são he- terólogas entre si se as duas não são derivadas da mesma fonte natural fi- nal. As seqüências poderão ser seqüências naturais, ou pelo menos uma seqüência pode ser projetada por homem, como caso de uma região de sí- tios de clonagem múltiplos. As duas seqüências podem ser derivadas de duas espécies diferentes ou uma seqüência pode ser produzida por síntese química, contanto que a seqüência de nucleotídeos da porção sintetizada não tenha sido derivada do mesmo organismo da outra seqüência.

Uma molécula de ácido nucléico ou polinucleotídeo substancial- mente puro é um polinucleotídeo que é substancialmente separado e outras seqüências de polinucleotídeo que acompanham naturalmente uma seqüên- cia reguladora de transcrição nativa. O termo abrange uma seqüência de polinucleotídeo que foi removida de seu ambiente de ocorrência natural e inclui isolados de DNA recombinantes-ou clonados, análogos quimicamente sintetizados e análogos biologicamente sintetizados por sistemas heterólo- gos.

Um polinucleotídeo é dito codificar um polipeptídeo se, em seu estado nativo ou quando manipulado por métodos conhecidos daqueles ha- bilitados no estado da técnica, pode ser transcrito e/ou traduzido para produ- zir o polipeptídeo ou um fragmento deste. Também se diz que a fita anti- sentido desse polinucleotídeo codifica a seqüência.

Uma seqüência de nucleotídeos liga-se operavelmente quando ela é colocada em uma reação funcional com outra seqüência de nucleotí- deos. Por exemplo, um promotor liga-se operavelmente a uma seqüência de codificação se o promotor efetua sua transcrição ou expressão. Geralmente, ligado operavelmente significa que as seqüências que são ligadas são contí- guas e, onde necessário, ligam duas regiões de codificação de proteína, contíguas e em estrutura de leitura. No entanto, sabe-se bem que certos e- Iementos genéticos, tais como intensificadores, poderão ser operavelmente ligados mesmo a uma distância, isto é, mesmo se não contíguos.

O termo polinucleotídeo recombinante refere-se a um polinucleo- tídeo que é produzido pela combinação de dois segmentos de seqüência diferentes separados realizada pela manipulação artificial de segmentos iso- lados de polinucleotídeos por meio de técnicas de engenharia genética ou por síntese química. Ao proceder desse modo, podem-se ligar juntamente segmentos de polinucleotídeos de funções desejadas para gerar uma com- binação desejada de funções.

Sondas de polinucleotídeos incluem um polinucleotídeo isolado ligado a uma molécula marcadora ou repórter e poderão ser usadas para identificar e isolar outras seqüências, por exemplo, aquelas de outras cepas de Campylobacter jejuni. Sondas que compreendem oligonucleotídeos sinté- ticos ou outros polinucleotídeos poderão ser derivadas de ácidos nucléicos de fita única ou dupla que ocorrem naturalmente ou recombinantes, ou ser quimicamente sintetizadas. Sondas de polinucleotídeos poderão ser marca- das por meio de qualquer dos métodos conhecidos no estado da técnica, por exemplo, marcação com hexâmero estatístico, tradução por incisão ou a re- ação de preenchimento de Klenow.

Grandes quantidades dos polinucleotídeos poderão ser produzi- das por replicação em uma célula hospedeira adequada. Fragmentos natu- rais ou sintéticos de DNA que codificam uma proteína de interesse são in- corporados em constructos de polinucleotídeos recombinantes, tipicamente constructos de DNA, capazes de introdução e replicação em uma célula pro- cariótica ou eucariótica, especialmente Escherichia coli, na qual se deseja expressão protéica. Usualmente, o constructo é adequado para replicação em um hospedeiro unicelular, tal como E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium ou uma Pseudomonasl mas um hospedeiro eucariótico multice- Iular poderá também ser apropriado, com ou sem integração no genoma da célula hospedeira. Células de hospedeiro eucariótico incluem lêvedo, fungos filamentosos, planta, inseto, anfíbio e espécie aviária. Fatores tais como faci- lidade de manipulação, capacidade de expressar proteínas apropriadamente glicosiladas, grau e controle de expressão de proteínas, facilidade de purifi- cação de proteínas expressas livres de contaminantes celulares ou outros fatores influenciam a escolha da células hospedeira.

Os polinucleotídeos poderão também ser produzidos por síntese química, por exemplo, pelo método de fosforamidita descrito por Beaucage e Caruthers (1981), Tetra Letts., 22:1859-1862, ou pelo método de triéster de acordo com Matteuci e colaboradores (1981), J. Am. Chem. Soc., 103:3185, e poderão ser realiados em sintetizadores de oligonucleotídeos automatiza- dos comerciais. Um fragmento de fita dupla poderá ser obtido do produto de fita única de síntese química, seja sintetizando a fita complementar e reco- zendo a fita juntamente sob condições apropriadas ou adicionando a fita complementar mediante uso de DNA polimerase com uma seqüência de primer apropriada.

Constructos de DNA preparados para introdução em um hospe- deiro procariótico ou eucariótico compreenderão tipicamente um sistema de replicação (isto é, vetor) reconhecido pelo hospedeiro, incluindo o fragmento de DNA pretendido que codifica o polipeptídeo desejado, e incluirá preferen- cialmente também seqüências reguladoras de iniciação de.transcrição ©tra- dução operavelmente ligadas ao segmento que codifica polipeptídeos. Sis- temas de expressão (vetores de expressão) poderão incluir, por exemplo, uma origem de replicação ou seqüência de replicação autônoma (SRA) e seqüências de controle de expressão, um promotor, um intensificador e sí- tios de informação de processamento necessários, tais como sítios de liga- ção de ribossomos, sítios de união de RNA, sítios de poliadenilação, se- qüências terminadoras de transcrição e seqüências de estabilização de mR- NA. Peptídeos sinalizadores poderão também ser incluídos onde apropriado a partir de polipeptídeos secretados da mesma espécie ou de espécie afim, que permitem que a proteína atravesse e/ou se aloje em membranas celula- res ou seja secretada da célula.

Um promotor apropriado e outras seqüências de vetor necessá- rias serão selecionados de modo a serem funcionais no hospedeiro. Exem- pios de combinações de linhagens celulares e vetores de expressão passí- veis de serem trabalhados são descritas in Sambrook e colaboradores (1989), vide infra; Ausubel e colaboradores (Eds.) (1995), Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos Correntes em Biologia Molecular), Greene Publishing and Wiley Interscience, Nova Iorque; e Metzger e colaboradores (1988), Nature, 334:31-36. Muitos vetores úteis para expressão em células de bactérias, de lêvedo, de fungos, de mamíferos, de insetos, de vegetal ou outras células são bem conhecidos no estado da técnica e poderão ser obti- dos de vendedores tais como Stratagene, New England Biolabs, Promega Biotech e outros. Adicionalmente, o constructo poderá ser ligado a um gene amplificável (por exemplo, DHFR) de modo que cópias múltiplas do gene possam ser produzidas. Para intensificador apropriado e outras seqüências de controle de expressão, ver também Enhancers and Eukaryotic Gene Ex- pression (lntensificadores e Expressão de Genes Eucarióticos), Cold Spring Harbor Press, Nova Iorque (1983). Embora esses vetores de expressão pos- sam replicar-se autonomamente, eles poderão menos preferencialmente replicar-se ao serem introduzidos no genoma da célula hospedeira.

Vetores de expressão e de clonagem contêm vantajosamente um marcador passível de ser selecionado, isto é, um gene que codifica uma proteína necessária para a sobrevivência ou crescimento de uma célula hospedeira transformada com o vetor. Embora esse gene marcador possa ser transportado em outra seqüência de polinucleotídeo co-introduzida na célula hospedeira, ele é mais freqüentemente contido no vetor de clonagem. Somente aquelas células hospedeiras em que o gene marcador foi introdu- zido sobreviverão e/ou crescerão sob condições seletivas. Genes de seleção típicos codificam proteínas que conferem resistência a antibióticos ou outras substâncias tóxicas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, etc.; deficiências auxotróficas de complemento; ou nutrientes críticos de alimen- tação não disponíveis de meios complexos. A escolha do marcador passível de ser selecionado apropriado dependerá da célula hospedeira; marcadores apropriados para diferentes hospedeiros são conhecidos no estado da técnica.

Células hospedeiras recombinantes, no presente contexto, são aquelas que foram geneticamente modificadas para conter uma molécula de DNA isolada da presente invenção. O DNA pode ser introduzido por qual- quer meio conhecido no estado da técnica que é apropriado para o tipo par- ticular de célula, incluindo, sem limitação, transformação, lipofecção ou ele- troporação.

Como usado aqui, colonização refere-se ao estabelecimento de C. jejuni em um animal hospedeiro ou humano. Em certos animais, por e- xemplo, aves domésticas (galinhas, perus, patos, gansos e similares), colo- nização não resulta em doença. Se colonização for reduzida ou impedida devido a administração de uma composição imunogênica que compreende a proteína pilus de C. jejuni como ensinado aqui, um benefício é que menos bactérias são introduzidas em produtos alimentícios e no ambiente. Infecção, no presente contexto, refere-se a colonização de um humano ou animal, com o resultado de que ocorrem sintomas de doença.

É reconhecido por aqueles habilitados no estado da técnica que as seqüências de DNA poderão variar devido à degeneração do código ge- nético e uso de códon. Todas as seqüências de DNA (sinônomas) que codi- ficam a proteína p//us de interesse são incluídas nesta invenção.

Adicionalmente, será reconhecido por aqueles habilitados no estado da técnica que poderão ocorrer variações alélicas nas seqüências de DNA, as quais não alterarão significativamente a atividade das seqüências de aminoácidos dos peptídeos que as seqüências de DNA codificam. Todas essas seqüências de DNA equivalentes são incluídas no âmbito desta in- venção e na definição da região promotora regulada. Aquele habilitado no estado da técnica entenderá que a seqüência relativa à seqüência exemplifi- cada pode ser usada para identificar e isolar seqüências adicionais de nu- cleotídeos não-exemplificadas que são funcionalmente equivalentes às se- qüências dadas.

Poderá haver ligeiras modificações na seqüência de aminoáci- dos da proteína pilus da presente invenção. Variação na seqüência de ami- noácidos poderá ser o resultado de substituição de um ou mais aminoácidos por equivalentes funcionais. Substituição por equivalentes funcionais é fre- qüentemente observada. Exemplos descritos por Neurath e colaboradores (The Proteins, Academic Press, Nova Iorque (1979), página 14, figura 6) são, entre outras, a substituição do aminoácido alanina por serina; Ala/Ser ou Val/lle, Asp/GIu, etc. Além das variações que levam a substituição por aminoácidos equivalentes funcionais mencionados acima, poderão ser en- contradas variações em que um aminoácido foi substituído por outro amino- ácido que não é um equivalente funcional. Essa espécie de variação apenas difere de substituição por equivalentes funcionais pelo fato de que ela pode produzir uma proteína que apresenta ligeira modificação em seu enovela- mento espacial. Ambos os tipos de variação são com freqüência observados em proteínas, e eles são conhecidos como variações biológicas. Entende-se que variações na seqüência de aminoácidos da proteína pilus são permitidas até o grau em que a atividade imunogênica do polipeptídeo é retida, isto é, que anticorpo produzido contra a proteína variante reage de forma cruzada com a proteína pilus especificamente exemplificada ou com a proteína pilus de outros isolados de C. jejuni.

Procedimentos de hibridização são úteis para identificar polinu- cleotídeos com homologia suficiente com as seqüências reguladoras em questão que serão úteis como ensinado aqui. A técnica particular de hibridi- zação não é essencial à presente invenção. À medida que aperfeiçoamentos são feitos em técnicas de hibridização, elas podem ser prontamente aplica- das por aquele habilitado no estado da técnica.

Uma sonda e amostra são combinadas em uma solução tampão de hibridização e mantidas em uma temperatura apropriada até ocorrer re- cozimento. Em seguida, a membrana é lavada para ficar livre de materiais estranhos, deixando a amostra e moléculas de sonda ligadas tipicamente detectadas e quantificadas por auto-radiografia e/ou cintilografia líquida. Como é bem sabido no estado da técnica, se a molécula de sonda e amos- tra de ácido nucléico hibridizam-se formando uma ligação não-covalente for- te entre as duas moléculas, pode-se razoavelmente assumir que a sonda e a amostra são essencialmente idênticas ou totalmente complementares se as etapas de recozimento e lavagem são realizadas sob condições de alto rigor. O marcador detectável de sonda proporciona um meio para determinar ser hibridização ocorreu.

No uso dos oligonucleotídeos ou polinucleotídeos como sondas, a sonda particular é marcada com qualquer marcador adequado conhecido daqueles habilitados no estado da técnica, incluindo marcadores radioativos e não-radioativos. Marcadores radioativos típicos incluem 32P, 35S ou similar. Marcadores não-radioativos incluem, por exemplo, Iigantes tais como biotina ou tiroxina, bem como enzimas tais como hidrolases ou peroxidases, ou um quimiluminescedor tal como Iuciferina1 ou compostos fluorescentes tal como fluoresceína e seus derivados. Alternativamente, as sondas podem ser tor- nadas inerentemente fluorescentes como descrito in Pedido Internacional WO 93/16094.

Vários graus de rigor de hibridização podem ser empregados. Quanto mais rigorosas as condições, maior a complementaridade que é exi- gida para formação de dúplex. O rigor pode ser controlado por meio de tem- peratura, concentração da sonda, comprimento da sonda, força iônica, tem- po e similares. Preferencialmente, hibridização é conduzida sob condições de rigonmoderadas a altas por técnicas bem conhecidas no-estado da técni- ca, como descrito, por exemplo, in Keller, G.H., M.M. Manak (1987), DNA Probes (Sondas de DNA), Stockton Press, Nova Iorque, NI, pp. 169-170, aqui incorporado como referência.

Como usado aqui, condições de rigor moderadas a altas para hibridização são condições que atingem o mesmo, ou cerca do mesmo, grau de especificidade de hibridização que as condições empregadas pelos pre- sentes inventores. Um exemplo de altas condições de rigor são hibridização a 68°C em solução de Denhardt 5X SSC/5X / SDS 0,1% e lavagem em 0,2X SSC/SDS0,1% a temperatura ambiente. Um exemplo de condições de rigor moderadas são hibridização a 68°C em solução de Denhardt 5X SSC/5X / SDS 0,1% e lavagem a 42°C em 3X SSC. Os parâmetros de temperatura e concentração salina podem ser variados para atingir o nível desejado de i- dentidade de seqüências entre sonda e ácido nucléico alvo. Ver, por exem- plo, Sambrook e colaboradores (1989), vide infra, ou Ausubel e colaborado- res (1995), Current Protocols iri Molecular Biology (Protocolos Correntes em Biologia Molecular), John Wiley & Sons, Nova Iorque, NI, para instrução adi- cional sobre condições de hibridização.

Especificamente, hibridização de DNA imobilizado em Southern blots com sondas específicas a genes marcadas com 32P foi realizada por métodos padrões (Maniatis e colaboradores). Em geral, hibridização e sub- seqüentes lavagens foram efetuadas sob condições de rigor moderadas a altas que permitiram detecção de seqüências-alvo com homologia com as seqüências exemplificadas. Para sondas de genes para DNA de fita dupla, hibridização pode ser realizada da noite para o dia a 20-25°C abaixo da temperatura de fusão (Tm) do híbrido de DNA em solução de Denhardt 6X SSPE 5X, SDS 0,1%, 0,1 mg/ml de DNA desnaturado. A temperatura de fu- são é descrita pela seguinte fórmula (Beltz e colaboradores (1983), Methods of Enzimology (Métodos de Enzimologia), R. Wu, L, Grossman e K Moldave (eds.), Academic Press, Nova Iorque, 100:266-285):

Tm = 81,5°C + 16,6 Log[Na+]+0,41(+G+C)-0,61(% de formamida) -600/comprimento de dúplex em pares de bases.

As lavagens são tipicamente realizadas como segue: duas vezes a temperatura ambiente por 15 minutos em 1X SSPE, SDS 0,1% (lavagem sob baixo rigor), e uma vez a TM-200 por 15 minutos em 0,2X SSPE, SDS 0,1% (lavagem sob rigor moderado).

Para sondas de oligonucleotídeos, hibridização foi realizada da noite para o dia a 10-20°C abaixo da temperatura de fusão (Tm) do híbrido 6X SSPE, solução de Denhardt 5X, SDS 0,1%, 0,1 mg/ml de DNA desnatu- rado. Tm para sondas de oligonucleotídeos foi determinada pela seguinte fórmula: TM(°C)=2(número de bases de pares T/A + 4(número de bases de pares G/C) (Suggs, S.V. e colaboradores (1981), ICB-UCLA Symp. Dev. Bi- ol., Usando Genes Purificados, D.D. Brown (ed.), Academic Press, Nova Ior- que, 23:683-693).

As lavagens foram tipicamente realizadas como segue: duas vezes a temperatura ambiente por 15 minutos em 1X SSPE, SDS 0,1% (la- vagem sob baixo rigor), e uma vez à temperatura de hibridização por 15 mi- nutos em 1X SSPE, SDS 0,1% (lavagem sob rigor moderado).

Em geral, sal e/ou temperatura podem ser alterados para mudar o rigor. Com um fragmento de DNA marcado >70 ou bases de comprimento so, as seguintes condições podem ser usadas: Baixa, 1 ou 2X SSPE, tempe- ratura ambiente; Baixa, 1 ou 2X SSPE, 42°C; Moderada, 0,2X ou 1X SSPE, 65°C; e Alta, 0,1X SSPE, 65°C.

Formação de dúplex e estabilidade dependem de substancial complementaridade entre as duas fitas de um híbrido, e, como observado acima, de um certo grau de combinação imperfeita pode ser tolerado. Por- tanto, as seqüências da sonda da presente invenção incluem mutações (tan- to simples quanto múltiplas), supressões, inserções das seqüências descri- tas e combinações destas, mutações, inserções e supressões estas que permitem formação de híbridos estáveis com o polinucleotídeo-alvo de inte- resse. Mutações, inserções e supressões podem ser produzidas em uma dada seqüência de polinucleotídeo de muitas maneiras, e esses métodos são conhecidos daquele ordinariamente habilitado no estado da técnica. Ou- tros métodos poderão tornar-se conhecido no futuro.

Assim, variantes de-mutações, inserções e supressões das se- qüências de nucleotídeos descritos podem ser prontamente preparados por métodos que são bem conhecidos daqueles habilitados no estado da técni- ca. Essas variantes podem ser usadas da mesma maneira que as seqüên- cias de pimers exemplificadas, contanto que as variantes apresentam subs- tancial homologia de seqüências com a seqüência original. Como usado a- qui, homologia substancial de seqüências refere-se a homologia que é sufi- ciente para permitir que o polinucleotídeo variante funcione com a mesma capacidade que o polinucleotídeo de que a sonda foi derivada. Preferencial- mente, essa homologia é maior que 70% ou 80%, mais preferencialmente, essa homologia é maior que 85%, ainda mais preferencialmente, essa ho- mologia é maior que 90%, e ainda mais preferencialmente, essa homologia é maior que 95%. Todos os números inteiros entre 70 e 100% estão também dentro do escopo desta invenção. O grau de homologia ou identidade ne- cessário para que a variante funcione em sua capacidade pretendida depen- de do uso pretendido da seqüência. Encontra-se perfeitamente dentro da capacidade de uma pessoa treinada no estado da técnica produzir altera- ções por mutação, inserção e supressão que sejam de função equivalente ou sejam projetadas para aperfeiçoar a função da seqüência ou, então, pro- porcionar uma vantagem metodológica.

Reação em Cadeia de Polimerase (RCP) é uma síntese enzimá- tica repetitiva preparativa de uma seqüência de ácidos nucléicos. Esse pro- cedimento é bem conhecido e comumente utilizado por aqueles habilitados neste estado da técnica (ver Mullis, Patentes Norte-americanas Nos. 4.683.195, 4.683.202 e 4.800.159; Saiki e colaboradores (1985), Science, 230:1350-1354). Reagentes, equipamento e instruções são comercialmente disponíveis. Usando uma DNA polimerase termostável tal como a Taq poli- merase, que é isolada da bactéria termófila Thermus aquaticus, o processo de amplificação pode ser completamente automatizado. Outras enzimas que podem ser usadas são conhecidas daqueles habilitados no estado da técni- ca.

Sabe-se bem no estado da técnica que as seqüências de polinu- cleotídeo da presente invenção podem ser truncadas e/ou mudadas tal que certos fragmentos e/ou mutantes resultantes da seqüência original de com- primento completo possam reter as características desejadas da seqüência de comprimento. Uma ampla variedade de enzimas de restrição que são adequadas para gerar fragmentos de moléculas de ácidos nucléicos maiores é bem conhecida. Adicionalmente, é bem sabido que Bal31 exonuclease pode ser convenientemente usada para digestão de DNA limitada controlada com o tempo. Ver, por exemplo, Maniatis (1982), Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual (Clonagem Molecular: Manual de Laboratório), Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque, páginas 135-139, incorporado aqui como referência. Ver também Wei e colaboradores (1983), J. Biol. Chem., 258: 13006-13512. Mediante uso de Bal31 exonuclease (comumente referido co- mo procedimentos "apagar-uma-base"), aquele habilitado no estado da téc- nica pode remover nucleotídeos de uma ou outra ou ambas as extremidades dos ácidos nucléicos em questão para gerar um amplo espectro de fragmen- tos que são funcionalmente equivalentes às seqüências de nucleotídeos em discussão. Aquele habilitado no estado da técnica pode, dessa maneira, ge- rar centenas de fragmentos de comprimentos variáveis controlados de locais ao longo da molécula original. Aquele habilitado no estado da técnica pode testar ou selecionar rotineiramente por suas características os fragmentos gerados e determinar a utilidade dos fragmentos como ensinado aqui. Sabe- se também que as seqüências mutantes da seqüência de comprimento ple- no, ou fragmentos desta, podem ser facilmente produzidas com mutagênese orientada a sítios. Ver, por exemplo, Larionov, O.A. e Nikiforov, V.G. (1982), Genetika, 18(3):349-59; Shortle, D., DiMaio, D. e Nathans, D. (1981), Annu. Ver. Genet., 15:265-94; ambos incorporados aqui como referência. Aquele habilitado no estado da técnica pode rotineiramente produzir mutações do tipo supressão, inserção ou substituição e identificar aqueles mutantes resul- tantes que contêm as características desejadas da seqüência do tipo selva- gem de comprimento total, ou fragmentos dessa seqüência, isto é, aqueles mutantes que expressam uma proteína pilus da presente invenção, ou um fragmento dessa proteína, em que anticorpos que inibem colonização e/ou infecção são produzidos em um humano ou animal ao qual a proteína é ad- ministrada.

Como usado aqui, identidade percentual de seqüências de dois ácidos nucléicos é determinada usando o algoritmo de Karlin e Altschul (1990), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:2264-2268, modificado como in Karlin e Altschul (1993), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:5873-5877. Esse algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul e colaborado- res (1990), J. Mol. Biol., 215:402-410. Buscas de nucleotídeos por BLAST são realizadas com o programa NBLAST, classificação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter seqüências de nucleotídeos com a identidade percentual de seqüências desejada. Para obter alinhamentos com lacuna para fins de comparação, BLAST com Lacuna é utilizado como descrito in Altschul e colaboradores (1997), Nucl. Acids. Res., 25:3389-3402. Quando se utilizam programas BLAST e BLAST com Lacuna, são usados os parâme- tros padrões dos respectivos programas (NBLAST e XBLAST). Ver, por e- xemplo, o website de National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional Para Informação Sobre Biotecnologia) na internet.

Anticorpos monoclonais ou policlonais, anticorpos de cadeia simples, anticorpos de cadeia simples humanos ou humanizados ou um fragmento de ligação com antígeno de um anticorpo humano ou humaniza- do, que se liga especificamente a uma proteína p/7/' de C. jejuni, poderão ser produzidos por meio de métodos conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Harlow e Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual (Anticor- pos: Manual de Laboratório), Cold Spring Harbor Laboratory, Goding (1986), Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (Anticorpos Monoclonais: Princípios e Prática), 2- ed., Academic Press, Nova Iorque.

Técnicas padrões de clonagem, isolamento de DNA, amplifica- ção e purificação, para reações enzimáticas que envolvem DNA ligase, DNA polimerase, endonucleases de restrição e similares, e várias técnicas de se- paração, são aquelas conhecidas e comumente empregadas por aqueles habilitados no estado da técnica. Várias técnicas padrões são descritas in Sambrook e colaboradores (1989), Molecular Cloning (Clonagem Molecular), Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, Nova Iorque; Maniatis e colaboradores (1982), Molecular Cloning (Clonagem Molecular), Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, Nova Iorque; Wu (ed.) (1993), Meth. Enzymol., 218, Parte I; Wu (ed.) (1979), Meth. Enzymol., 68; Wu e co- laboradores (eds.) (1983), Meth. Enzymol., 100 e 101; Grossman e Moldave (eds.), Meth. Enzymol., 65; Miller (ed.) (1972), Experiments in Molecular Ge- netics (Experimentos em Genética Molecular), Cold Spring Harbor Labora- tory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque; Old e Primrose (1981), Principies of Gene Manipulation, Imprensa da Universidade da Califórnia, Berkeley; Sc- hleif e Wensink (1982), Practical Methods in Molecular Biology (Métodos Práticos em Biologia Molecular); Glover (ed.) (1985), DNA Cloning (Clona- gem de DNA), Vol. I e II, IRL Press, Oxford, Reino Unido; e Setlow e Holla- ender (1979), Genetic Engineering: Principies and Methods (Engenharia Ge- nética: Pincípios e Métodos), Vol. 1-4, Plenum Press, Nova Iorque. Abrevia- ções e nomenclatura, onde empregadas, são consideradas padrões no campo e comumente usadas em artigos profissionais tais como aqueles ci- tados aqui.

A invenção poderá ser adicionalmente entendida por meio dos exemplos seguintes não-limitativos. Esses exemplos são proporcionados com fins ilustrativos e não se pretende que limitem o escopo da invenção como reivindicada aqui. Pretende-se que quaisquer variações nos artigos exemplificados que ocorrem àquele habilitado no estado da técnica es en- quadrem no escopo da presente invenção.

Todas as referências citadas neste relatório descritivo são incor- poradas aqui como referência até o grau em que não haja inconsistência com a presente descrição. As referências citadas refletem o nível de habili- dade nos estados da técnica correspondentes.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Cepas e meios bacterianos.

Todos os isolados de C. jejuni (Tabela 1) foram mantidos em ágar de Mueller-Hinton (Difco) suplementado com sangue bovino a 5% a 37°C em uma incubadora com 10% de CO2.

Exemplo 2. Ensaio de formação de biofilme. :

Isolados de C. jejuni a serem ensaiados para formação de bio- filme foram desenvolvidos da noite para o dia em caldo de Mueller-Hinton (MHB) a 37°C e 10% de CO2 com agitação vigorosa até uma DOeoo de 0,25. Os poços de placas de poliestireno de 24 poços (Corning) contendo 1 ml de caldos de MHB, de Brueella A (Difeo) ou de Bolton (Difco) foram inoculados com culturas da noite para o dia de isolados de C. jejuni até uma D06oo = 0,025 (-2,5 χ 107 bactérias). As placas fora então incubadas a 25 ou 37°C em ar ambiente, atmosfera com 10% de CO2, por 24, 48 ou 72 h. Após incu- bação, o meio foi removido, os poços foram secados por 30 min a 55°C e 1 ml de violeta cristal (VC) foi adicionado por 5 min a temperatura ambiente. A VC não-ligada foi removida e os poços lavados duas vezes com H2O. Os poços foram secados a 55°C por 15 min, e VC ligada foi descorada com 80% de etanol:29% de acetona. Alíquotas de 100 μΙ dessa solução foram removidas dos poços, colocadas em placa de 96 poços e a DO570 determi- nada usando uma leitora de microplatas (Bio-tek) para determinar formação de biofilme.

A fim de determinar os efeitos de osmólitos sobre formação de biofilme, compostos foram adicionados a MHB antes do ensaio de biofilme. As placas foram incubadas a 37°C em uma atmosfera com 10% de CO2 por 24 horas antes de análise.

Exemplo 3. Formação de biofilme de C. jeiuniem superfícies abióticas.

Coupons estéreis de plástico acrinonitrila-butadieno-estireno (ABS) de ~1 χ 4 cm, plástico cloreto de polivinila (PVC), poliestireno ou co- bre foram colocados em tubos de polipropileno de 15 ml com 5 ml de MHB, tal que os coupons fossem completamente submersos. Os tubos foram ino- culados com C. jejuni até uma DOeoo = 0,025 e incubados por 24 h a 37°C em uma atmosfera com 10% de CO2. Os coupons foram assepticamente removidos, colocados em tubos estéreis de 15 ml com 2 ml de solução sali- na tamponada com fosfato a 0,1 M, pH 7,3 (PBS) e 20 contas de vidro de 4 mm estéreis, e os tubos foram submetidos a vórtice para remover células bacterianas sob velocidade plena por 1 min. Bactérias viáveis foram enume- radas plaqueando sob diluição sobre ágar da Mueller-Hinton suplementado com sangue a 5%.

Exemplo 4. Inibicão de síntese de proteína.

Culturas da noite para o dia de C. jejuni em MHB foram tratadas com 0,5 μg/ml de cloranfenicol (CM) por 15 min a temperatura ambiente an- tes de ensaio para formação de biofilme na ausência de antibiótico. Sob es- sa concentração de CM, síntese de proteína foi inibida, mas a viabilidade das células de C. jejuni não prejudicada. Formação de biofilme de C. jejuni tratada com CM foi ensaiada conforme descrito acima. Exemplo 5. Efeitos de fluidos sobrenadantes de cultura na formação de bio- filme.

Fluidos sobrenadantes de cultura de bactérias gram-negativas e gram-positivas foram coletados após 24 h de crescimento em meio de cultu- ra apropriado (Tabela 2). Células foram removidas por centrifugação a 5.000 g e os fluidos sobrenadantes da cultura foram filtrados através de filtros de 0,22 μm. O sobrenadante ou meio de cultura não-inoculado foi misturado 1:1 com MHB. C. jejuni foi inoculado nesse meio e formação de biofilme ensaia- da como descrito acima.

Exemplo 6. Construção de mutantes flaAB e luxS de C. ieiuni.

Mutantes de C. jejuni em genes que codificam flagelos ou o au- to-indutor 2 (Al 2) de moléculas de sensibilidade suficiente foram construídos para avaliar o papel desses fatores na formação de biofilme. O mutante du- plo flaA e flaB de M129 de C. jejuni foi construído como segue. RCP foi utili- zada para amplificar um fragmento de 0,9 kb contendo a extremidade 5' de flaA de DNA genômico de M129 de C. jejuni com prímers 5'

ctttggctatctcgagacaggcactc 3' (|D SEQ NO: 3) e 5'

AAGCTGCAAGCTTGGTGTTAATACGA 3' (id SEQ NO: 4), enquan- to um fragmento de 0,9 kb contendo a extremidade 3' de flaB foi amplificado com prímers 5'

aaatcagagaattcattggttcggtg 3' (|D SEQ NO: 5) e 5' taacaacaggatcctcataggtcagg 3' (id SEQ NO: 6). Os produtos resultantes foram digeridos com Xhol Hindlll e EcoRI BamHI, res- pectivamente (sites^ de restrição ^ são sublinhados nas seqüências de prí- mers). Os dois fragmentos foram clonados consecutivamente no vetor pSJB21, que contém um gene para resistência a canamicina aphA 3 de Campylobacter coli clonado nos sítios Hindlll e EcoRI de pBC KS1 tal que os fragmentos flanqueassem o gene para resistência e fossem orientados na mesma direção. Esse plasmídeo de troca alélica foi introduzido na cepa M129 de C. jejuni por eletroporação e mutantes putativos foram seleciona- dos em ágar de Mueller-Hinton suplementado com sangue a 5% e 50 μg/ml de canamicina. Substituição alélica foi confirmada por RCP e Southern blot. Como flaA e flaB são adjacentes em C. jejuni, o mutante flaAB resultante continha apenas a extremidade 5' de flaA e a extremidade 3' de flaB, sepa- rando ambos os genes.

O mutante luxS de C. jejuni foi construído similarmente, clonan- do produtos de RCP derivados da extremidade 5' do gene IuxS de M129 de C. jejuni, amplificados com primers 5' CTTCTTGTAACTCQAGTTGTCGTATC 3' (ID SEQ NO: 7) e 5' AATCAAATAAGCTTATATCATCACCC 3' (ID SEQ NO: 8), e a extremidade 3' de IuxS foi amplificada com primers 5' GAACTTAAGAATTCCCAATGCGGAAC 3' (|D SEQ NO: 9) e 5' ATCTTTATGGGATCCTACGCCTTGAG 3' (|D SEQ NO: 10) em pSJB21. O plasmídeo resultante foi então usado para troca alélica como descrito acima.

Exemplo 7. Microscopia Eletrônica de Varredura e Transmissão

Isolados de C. jejuni foram desenvolvidos da noite para o dia em caldo de Mueller-Hinton (MHB, Difco) a 37°C e 10% de CO2 com agitação vigorosa até uma densidade óptica a 600 nm (DO600) de 0,25. Placas de 35 mm (Corning) contendo membranas de policarbonato estéreis e 3 ml de MHB foram inoculadas com culturas da noite para o dia de isolados de C. jejuni até uma DO600 = 0,025 (-2,5 χ 10^7 UFCs). As placas foram incubadas a 37°C em uma atmosfera com 10% de CO2 por 24 h. Após incubação, as membrans de policarbonato contendo biofilmes de C. jejuni foram assepti- camente removidas e colocadas em Formaldeído a 4% e Glutaraldeído a 1% em solução salina tamponada com fosfato 0,1 M (PBS) para fixação. Mem- branas pós-fixação foram colocadas em uma solução contendo tetróxido de ósmio a 1%-em H2O desionizada. Membranas foram então processadas a- través de um gradiente de EtOH 1 χ 80% 5 min, 2 χ 95% 5 min, 2 χ 100% 5 min, secadas até ponto crítico; revestidas com partículas de ouro, montadas e observadas usando microscopia eletrônica de transmissão. Biofilmes fo- ram também observados por meio de microscopia eletrônica de transmissão. Culturas foram desenvolvidas conforme descrito acima. Placas de 24 poços foram incubadas a 37°C em uma atmosfera com 10% de CO2 por 24 h. Após incubação, 10 μl de biofilme de C. jejuni foram pipetados por 10 min em gra- des de cobre de malha 400 revestidas com Formvar. Fluido foi absorvido usando um papel de filtro Whatman ligeiramente lavado duas vezes. Após ligeira lavagem, as grades foram negativamente coradas usando ácido fosfo- tungstênico a 1%. Imagens fotográficas foram feitas em várias ampliações instrumentais para revelar os pormenores de filamentos.

Exemplo 8. Colheita de pilus.

A cepa NCTC 11168 é desenvolvida em frascos de cultura de células de 225 cm sob condições formadoras de biofilme por 72 horas. Bio- filmes maduros são colhidos, reunidos e o meio removido por centrifugação (30.000Xg 30 min). O biofilme peletizado é ressuspenso em etanolamina (0,4 M1 pH 9,0) e os pili são removidos das células por cisalhamento mecâ- nico. A amostra é então centrifugada (2.500Xg, 60 min) e o sobrenadante contendo os pili solubilizados é coletado. Sulfato de amônio é adicionado ao sobrenadante até 45% de saturação, e a solução é incubada a 4°C da noite para o dia para precipitar os pili. Os pili são coletados por centrifugação (30.000Xg, 30 min) e ressuspensos em H2O duplamente destilada. A amos- 15 tra bruta é por conseguinte visualizada usando TEM para assegurar-se da presença de fibras na preparação bruta.

Exemplo 9. Produção de biofilme.

1 ml de caldo de Mueller-Hinton é inoculado até uma DO600 de 0,05 com uma cultura de caldo da noite para o dia de C. jejuni. Culturas são TPIGDGPVL η incubado sob condições formadoras de biofilme (37°C, 5% de CO2). Nos pontos de tempo de 24, 48 e 72 horas, o caldo é removido via aspiração e o biofilme lavado ligeiramente duas vezes com PBS estéril para remover células e fragmentos não-aderentes. O biofilme, resultante é então corado com violeta cristal e a quantidade de biofilme produzido medida utili- zando uma leitora de placa sob comprimento de onda de 405 nm.

Exemplo 10. Expressão e produção de proteína pilus recombinante.

Uma busca do gene cj1534c foi realizada usando software de sinal 3 P para determinar a presença de quaisquer seqüências de sinal no gene, mas nenhuma foi identificada. Sem desejar estar ligado a teoria, os inventores acreditam que o gene para proteína pilus da presente invenção é uma proteína secretora Tipo III.

Toda a região de codificação do gene CJ1534c foi clonada no vetor de expressão pTRC-HIS B (Invitrogen, Carlsbad, CA) utilizando técni- cas padrões em E. coli. Primers específicos foram projetados para amplifica- ção por RCP do gene para proteína pilus de C. jejunr, primer adiantado, cj1534Fl, aaaaaaaggaggatcccatgtcagttac (id SEQ NO: 11) e primer inverso, Cj1534R2, cataaagcccgaattcttacattttg (|D SEQ NO: 12). Essa estratégia introduziu um sítio BamHI a montante da seqüência de codi- ficação e um sítio de reconhecimento EcoRI a jusante da seqüência de codi- ficação. Os sítios de restrição cortados foram posicionados tal que o produto de RCP fosse clonado na estrutura de leitura apropriada no plasmídeo de expressão pTRC-HIS B. RCP foi realizada usando os primers habituais, e o produto de amplificação foi seqüenciado para assegurar que o gene correto fosse amplificado. Em seguida, o produto de RCP e o vetor pTRC-HIS B pu- rificado foram digeridos usando Bam H1 e EcoRI. As digestões resultantes foram limpas e dessalgadas, em seguida combinadas e ligadas. Uma vez ligado, o vetor contendo cj1534c foi dessalgado e eletroporado em DH5a de E. coli. Colônias contendo o plasmídeo foram selecionadas e seqüenciamen- to foi realizado para assegurar construção apropriada do plasmídeo.

O constructo de plasmídeo resultante foi então seqüenciado pa- ra assegurar inserção apropriada do gene. Após confirmação do constructo apropriado, 1 L de caldo LB foi inoculado até uma D06oo de 0,05 com a E. coli contendo o plasmídeo de expressão e incubado (37°C, 150 RPM) até uma DO de 0,8 ser atingida. IPTG foi adicionado até uma concentração final de 250 nM, e a incubação foi continuada por 3 horas adicionais. As-células foram então coletadas via centrifugação e a proteína recombinante coletada usando purificação por afinidade TALOI\F (BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA) conforme a instrução do fabricante. A proteína coletada é então concentrada utilizando um concentrador de proteína (Amincon Corporation, Danvers, MA) e uma amostra foi seqüenciada para assegurar produção a- propriada de proteína. Produção total de proteína é determinada usando um ensaio de BCA, e todas as amostras coletadas são ajustadas em uma con- centração final de 1 mg/ml com PBS estéril ou H2O duplamente destilada.

Exemplo 11. Protocolo de vacina. Frangos para assar comerciais são adquiridos de uma incubado- ra comercial. Após a chegada, é realizado um esfregaço cloceal para asse- gurar-se de que as aves são livres de C. jejuni, e as aves são separadas nos grupos necessários para o experimento. Alimento e água são disponíveis à vontade. Quatorze dias após incubação, os frangos recebem a primeira va- cinação e são monitorados em relação a efeitos colaterais adversos. Dez dias após a vacinação inicial, as aves recebem uma vacinação de reforço e novamente são observadas em relação a efeitos colaterais. Dez dias após vacinação de reforço, os frangos são desafiados com aproximadamente 5 χ 104 de UFCs de C. jejuni via alimentação oral forçada. Cinco dias após desa- fio, controles positivos são submetidos a esfregaço para assegurar-se de desprendimento de C. jejuni e contagens de células viáveis são determina- das. Dez dias após desafio, aves são humanamente sacrificadas, cecos são coletados e conteúdos de cecos são removidos, diluídos em série e plaque- ados para enumerar níveis de colonização. Adicionalmente, cecos e intesti- nos são examinados grosseiramente para assegurar-se de que nenhuma formação de lesão não-específica ocorreu.

Exemplo 12. Produção de lipossomos.

Preparações de lipossomos comerciais são adquiridas {Sigma, St. Louis, MO) e usadas de acordo com especificações do fabricante. Prote- ína recombinante é usada em uma concentração de 5 mg/ml para produção de lipossomos. Após conclusão da formulação de lipossomos, o volume é aumentado para 1 ml por ave e administrado via alimentação oral forçada. A dose de proteína pilus é de cerca de 0,010 a cerca de 0,500 mg, desejavel- mente de cerca de 0,250 mg/ave.

Exemplo 13. Adiuvante de TC.

Adjuvante comercial de toxina de cólera é adquirido {Sigma) e diluído com proteína recombinante até uma quantidade final de 0,033 μg de toxina/ave. Este é então diluído até um volume final de 1 ml e administrado via alimentação oral forçada.

Exemplo 14. Colonização de frangos é maior por cepas de C. jejuni piliadas do que por cepas não-piliadas. Um mutante falho de cepa NCTC 11168 de C. jejunióe proteína pilus foi produzido. Esse mutante resulta na falta de expressão de p/7/' na su- perfície de células de C. jejuni como determinado por microscopia eletrônica. O gene para proteína pilus da presente invenção é requerido para expressão da proteína pilus, que tem 18 kD. A seqüência de aminoácidos é proporcio- nada em ID SEQ NO: 2 e na Tabela 4.

A cepa mutante não-piliada foi introduzida em frangos de duas semanas de idade, e, em experimentos paralelos, a cepa do tipo selvagem NCTC 11168 foi introduzida em outros frangos de duas semanas de idade. Uma redução geral (pelo menos de 1.000 vezes) foi observada nos frangos que receberam a cepa mutante não-piliada. Todos os frangos em que a cepa do tipo selvagem foi introduzida foram colonizados (14/14). Para aqueles frangos desafiados com o mutante não-piliado, apenas 5/14 foram coloniza- dos. Isso indica que uma mutação no gene Cj 1534 (seqüência de codifica- ção, ID SEQ NO: 1) reduz a capacidade de o mutante colonizar frangos. Composições imunogênicas que compreendem essa proteína são eficazes em reduzir colonização e/ou infecção de humanos e animais por C. jejuni. Colonização reduzida de animais agrícolas aperfeiçoarão a qualidade micro- biana de produtos alimentícios e reduzirão contaminação ambiental com C. jejuni. Humanos a quem essas composições imunogênicas foram adminis- tradas apresentarão reduzida incidência e/ou gravidade de doença causada por C. jejuni.

Exemplo 15. Elisa para determinação de anticorpos

Placas de microtitulação de 96 poços são revestidas com o antí- geno apropriado (ou proteína recombinante ou nativa) da noite para o dia. Antígeno não-aderente é lavado ligeiramente das placas e o anticorpo primá- rio, derivado do animal vacinado, é diluído em série (duas vezes) com Soro Bovino Fetal a 1% (FBS) e adicionado às placas de microtitulação. Após in- cubação da noite para o dia, anticorpos primários não-aderentes são lavados ligeiramente das placas e um anticorpo secundário diluído 1:400 com FBS a 1% é adicionado. Os anticorpos secundários são comercialmente disponí- veis (KPL) e reconhecem anticorpos produzidos de várias espécies animais (incluindo galinha), e são conjugados com uma enzima. Após 4 horas de incubação, as placas são lavadas ligeiramente e um substrato cromogênico é adicionado em cada poço. Onde o anticorpo de interesse liga-se no poço ao revestimento de antígeno, a enzima ligada ao anticorpo secundário cliva o substrato, resultando em um desenvolvimento de cor, que é proporcional ao nível de anticorpos presentes, permitindo quantificação de anticorpos de interesse ligados, ou esse sistema pode servir para um ensaio qualitativo.

Anti-soros gerados em resposta à proteína pilus recombinante reconheceram a proteína pilus recombinante, bem como a pilus de C. jejuni nativa. Quando soro preparado de frangos vacinados sub Q com proteína pilus recombinante foi analisado, verificou-se que ele reage tanto com antí- geno de proteína pilus recombinante quanto com antígeno de proteína pilus de biofilme. Anticorpos (IgA) do material fecal de frangos vacinados com li- possomos contendo proteína pilus recombinante reagiram com pilus recom- binante (aumento de 3 vezes sobre a reação de frangos não-vacinados).

Exemplo 16. Expressão diferencial de genes.

Genes para C. jejuni expressos diferencialmente no modelo de frango e em um biofilme de 24 h em relação àqueles de genes para C. jejuni expressos em placas foram identificados e comparações foram feitas para genes que foram induzidos. Dois frangos para assar de 15 dias de idade fo- ram infectados com 107 C. jejuni por inoculação oral e o conteúdo cecal foi coletado 10 dias pós-infecção para a extração de RNA de C. jejuni. Caldo de Mueller-Hinton foi inoculado com C. jejuni e o RNA extraído do biofilme de 24 h. O RNA in vivo obtido e RNA extraído de células crescidas em placa foram submetidos a síntese de cDNA e marcação. Experimentos de hibridi- zação foram realizados em lâminas de microdisposições de DNA Combima- trix. Um Formador de Imagens de Microdisposições de Combimatrix foi utili- zado para extração de dados e os dados analisados em relação a expressão diferencial utilizando software GeneSpring.

Duas lâminas foram usadas para a hibridização para cada mo- delo animal, com cada lâmina consistindo de 6.000 sondas únicas (em dupli- cata) até o total de 12.000 sondas por disposição. Os corantes (Cy3, Cy5) representando dados principais ou dados de controle foram sanduichados entre as lâminas. Dados medianos (versus dados médios) foram utilizados para minimizar sensibilidade a elementos estranhos. Após normalização dos dados, quatro sondas únicas (para um total de oito sondas) por lâmina que eram específicas ao gene cj1534 superexpressaram uma média de 7,0 ve- zes no modelo de frango (faixa de 2,1 a 16,4) e uma média de 1,8 vez no biofilme de 24 h (faixa de 1,3 a 2,2). Esses dados sustentam que o gene cj1534 está desempenhando um papel na colonização do hospedeiro aviá- rio.

Exemplo 17. Elisa para Determinação de Anticorpos.

Placas de microtitulação de 96 poços são revestidas com o antí- geno apropriado (ou proteína recombinante ou nativa) da noite para o dia. Antígeno não-aderente é lavado ligeiramente das placas e o anticorpo primá- rio, derivado do animal vacinado, é diluído em série (duas vezes) com Soro Bovino Fetal a 1% (FBS) e adicionado às placas de microtitulação. Após in- cubação da noite para o dia, anticorpos primários não-aderentes são lavados ligeiramente das placas e um anticorpo secundário diluído 1:400 com FBS a 1% é adicionado. Os anticorpos secundários são comercialmente disponí- veis (KPL) e reconhecem anticorpos produzidos de várias espécies animais (incluindo galinha), e são conjugados com uma enzima. Após 4 horas de incubação, as placas são lavadas ligeiramente e um substrato cromogênico é adicionado em cada poço. Onde o anticorpo de interesse liga-se no poço ao revestimento de. antígeno, a enzima ligada ao anticorpo secundário cliva o substrato, resultando em um desenvolvimento de cor, que é proporcional ao nível de anticorpos presentes, permitindo quantificação de anticorpos de interesse ligados, ou esse sistema pode servir para um ensaio qualitativo.

Anti-soros gerados em resposta à proteína pilus recombinante reconheceram a proteína pilus recombinante, bem como a pilus de C. jejuni nativa. Quando soro preparado de frangos vacinados subcutaneamente com proteína pilus recombinante foi analisado, verificou-se que ele reage tanto com antígeno de proteína pilus recombinante quanto com antígeno de prote- ína pilus de biofilme. Frangos vacinados desafiados com uma alta dose de C. jejuni (cerca de 108) apresentaram uma média de 25% menos bactérias colonizadas do que frangos de controle. Notavelmente, um subconjunto dos frangos vacinados apresentou até um quarto de ordem de magnitude de C. jejuni menos colonizado, embora alguns dos frangos vacinados tenham a- presentado números similares àqueles dos controles. Sem desejar estar li- gado a teoria, acredita-se que a dose de desafio foi alta demais para predi- zer apropriadamente resultados de infecção natural.

Anticorpos (IgA) do material fecal de frangos vacinados com Ii- possomos contendo proteína pilus recombinante reagiram com pilus recom- binante (aumento de 3 vezes sobre a reação de frangos não-vacinados).

Embora esta descrição contenha certos exemplos e informação específicos, estes não devem ser considerados como Iimitativos do escopo da invenção, mas como ilustrações meramente fornecidas de algumas das modalidades da invenção presentemente preferidas. Por exemplo, desse modo o escopo da invenção deve ser determinado pelas reivindicações ane- xas e seus equivalentes, em vez de pelos exemplos dados.

Tabela 1. Isolados de C. jejuni neste estudo.

<table>table see original document page 52</column></row><table> Tabela 2

<table>table see original document page 53</column></row><table> Tabela 3. Seqüência de nucleotídeos que codifica proteína pilus de C. jejuni (ID SEQ NO: 1)

l atgtoagrta caaaacsatt attacaaatg caagcagatg ctcatcattt atgggrttaaa

61 tttcataatt ate&ctggaa tgtaaaaggt; ttgcaatttt tttctataca cgaataCAca

121 uagett atgaagaaat ggcagaactt tttgataçtt gtgctgaaag agttttacaa

181 cttggcgaaa aagctatcac ttgceaaaea gttrtaatgg aaaatgcaaa aagtccaaaa

241 gttgcaaaag attgctttac tccgctcgaa gtcatagaac tgatcaaaca agattatgaa 301 tatcttttag cagaatttaa aaaactcaat gaagcagcag aaaaagaaag tgatactaca

361 acagctgctt ttgcacaaga aaatatcgca aaatatgaaa aaagtcfcttg çatgatagac 421 gctactttac saggtgcttg caaaatgtaa V 9 9gc

Tabela 4. Seqüência de aminoácidos de proteína pilus de C. jejuni (ID SEQ NO: 2)

Tabela 5. Colonização de frangos para assar de duas semanas de idade com mutante deficiente de pilus e uma cepa do tipo selvagem NCTC11168, inoculando dose de cerca de 10^4 células viáveis.

<table>table see original document page 54</column></row><table> Tabela 6. Colonização de frangos para assar de duas semanas de idade com mutante deficiente de pilus e uma cepa do tipo selvagem NCTC11168, inoculando dose de cerca de 104 células viáveis.

<table>table see original document page 55</column></row><table>

ND = Não detectado; o limite de detecção foi de 2,0E+2

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<110> The Arizona Board of Regents on Behalf of the University of Arizona Joens, Lynn Theoret, James Reeser, Ryan Law, Bibiana

<120> MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO RECOMBINANTE QUE NÃO OCORRE NATURALMENTE, CÉLULA RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, ANTICORPO, MÉTODO PARA DETECTAR A PRESENÇA DE PROTEÍNA PILUS DE CAMPYLOBACTER E MÉTODO PARA DETECTAR UM ANTICORPO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE A UMA PROTEÍNA PI- LUS DE CAMPYLOBACTER JEJTJNI

<130> 175-06 WO

<140> não determinado <141> 2006-12-01

<150> US 60/819,589 <151> 2006-07-10

<160> 12

<170> PatentIn versão 3.4

<210> 1

<211> 450

<212> DNA

<213> Campylobacter jejuni

<220>

<221> CDS <222> (1)..(447)

<400> 1

atg tca gtt aca aaa caa tta tta caa atg caa gca gat gct cat cat 48

Met Ser Val Thr Lys Gln Leu Leu Gln Met Gln Ala Asp Ala His His 1 5 10 15

tta tgg gtt aaa ttt cat aat tat cac tgg aat gta aaa ggt ttg caa

96 Leu Trp Val Lys Phe His Asn Tyr His Trp Asn Val Lys Gly Leu Gln 20 25 30

ttt ttt tct ata cac gag tac aca gaa aaa gct tat gaa gaa atg gca 144

Phe Phe Ser Ile His Glu Tyr Thr Glu Lys Ala Tyr Glu Glu Met Ala 35 40 45

gaa ctt ttt gat agt tgt gct gaa aga gtt tta caa ctt ggc gaa aaa 192

Glu Leu Phe Asp Ser Cys Ala Glu Arg Val Leu Gln Leu Gly Glu Lys 50 55 60

gct ate act tgc caa aaa gtt tta atg gaa aat gca aaa agt cca aaa 240

Ala Xle Thr Cys Gln Lys Val Leu Met Glu Asn Ala Lys Ser Pro Lys 65 70 75 80

gtt gca aaa gat tgc ttt act ccg ctt gaa gtc ata gaa ctg ate aaa 288

Val Ala Lys Asp Cys Phe Thr Pro Leu Glu Val Ile Glu Leu Ile Lys 85 90 95

caa gat tat gaa tat ctt tta gca gaa ttt aaa aaa ctc aat gaa gca 336

Gln Asp Tyr Glu Tyr Leu Leu Ala Glu Phe Lys Lys Leu Asn Glu Ala 100 105 110

gca gaa aaa gaa agt gat act aca aca gct gct ttt gca caa gaa aat 384

Ala Glu Lys Glu Ser Asp Thr Thr Thr Ala Ala Phe Ala Gln Glu Asn 115 120 125

ate gca aaa tat gaa aaa agt ctt tgg Ile Ala Lys Tyr Glu Lys Ser Leu Trp 130 135

ggt gct tgc aaa atg taa Gly Ala Cys Lys Met 145

<210> 2

<211> 149

<212> PRT

<213> Campylobacter jejuni

<400> 2

atg ata ggc gct act tta caa 432

Met Ile Gly Ala Thr Leu Gln 140

450

Met Ser Val Thr Lys Gln Leu Leu Gln Met Gln Ala Asp Ala His His 15 10 15 Leu Trp Val Lys Phe His Asn Tyr His Trp Asn Val Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Phe Phe Ser Ile His Glu Tyr Thr Glu Lys Ala Tyr Glu Glu Met Ala 35 40 45

Glu Leu Phe Asp Ser Cys Ala Glu Arg Val Leu Gln Leu Gly Glu Lys 50 55 60

Ala Ile Thr Cys Gln Lys Val Leu Met Glu Asn Ala Lys Ser Pro Lys 65 70 75 80

Val Ala Lys Asp Cys Phe Thr Pro Leu Glu Val Ile Glu Leu Ile Lys 85 90 95

Gln Asp Tyr Glu Tyr Leu Leu Ala Glu Phe Lys Lys Leu Asn Glu Ala 100 105 110

Ala Glu Lys Glu Ser Asp Thr Thr Thr Ala Ala Phe Ala Gln Glu Asn 115 120 125

Ile Ala Lys Tyr Glu Lys Ser Leu Trp Met Ile Gly Ala Thr Leu Gln 130 135 140

Gly Ala Cys Lys Met 145

<210> 3 <211> 26 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220> -

<223> Constructo sintético: oligonucleotídeo útil como um iniciaãor. <400> 3

ctttggctat ctcgagacag gcactc 26

<210> 4

<211> 26

<212> DHA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Constructo sintético: oligonucleotídeo útil como um iniciador. <400> 4

aagctgcaag cttggtgtta atacga 26

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Constructo sintético: oligonucleotiâeo útil como um iniciaâor.

<400> 5

aaatcagaga attcattggt tcggtg 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Constructo sintético: oligonucleotiâeo útil como um iniciaâor.

<400> 6

taacaacagg atcctcatag gtcagg 26

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Constructo sintético: oligonucleotiâeo útil como um iniciaâor.

<400> 7

cttcttgtaa ctcgagttgt cgtatc 26

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Synthetic sequence: oligonucleotiâeo útil como um iniciaâor. <400> 8

aatcaaataa gcttatatca tcaccc 26

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Constructo sintético: oligonucleotídeo útil como vim iniciador.

<400> 9

gaacttaaga attcccaatg cggaac 26

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Constructo sintético: oligonucleotídeo útil como um iniciador.

<400> 10

atctttatgg gatcctacgc cttgag 26

<210> 11

<211> <212>

28 DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Constructo sintético: oligonucleotídeo útil como um iniciador.

<400> 11

aaaaaaagga ggatcccatg tcagttac

28

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Constructo sintético: oligonucleotídeo útil como um iniciador. <400> 12

cataaagccc gaattcttac attttg

Claims

1. Molécula de ácido nucléico recombinante que não ocorre na- turalmente, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência que codifica a proteína pilus de Campylobacter jejuni que apresenta a seqüência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a ela.

2. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína pilus apresenta a seqüência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 2.

3. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a seqüência que codifica a proteína pilus é dada em SEQ ID NO: 1.

4. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente seqüências de vetores.

5. Célula recombinante, caracterizada pelo fato de que na referi- da célula foi introduzida a molécula de ácidos nucléicos que não ocorre natu- ralmente como definida na reivindicação 1.

6. Célula recombinante de acordo com a reivindicação 5, carac- terizada pelo fato de que a referida célula é uma célula bacteriana.

7. Célula bacteriana como definida na reivindicação 6, caracteri- zada pelo fato de que a referida célula é uma célula bacteriana entérica.

8. Célula bacteriana entérica como definida na reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a referida célula é uma célula de Salmonella não-patogênica.

9. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína pilus de Campylobacter, descrita pela seqüência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com ela, e um veículo farmaceuticamen- te aceitável.

10. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a proteína pilus de Campylobacter é descrita pela seqüência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 2.

11. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a proteína pilus de Campylobacter é a proteí- na pilus de Campylobacter jejuni produzida recombinantemente.

12. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que compreende material de biofilme de Camp- ylobacter.

13. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o material de biofilme de Campylobacter é um material de biofilme de células de Campylobaeter mortas.

14. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o material de biofilme de Campylobaeter é um material de biofilme de Campylobaeter atenuada.

15. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o material de biofilme de Campylobaeter ate- nuada é um material de biofilme de Campylobaeter deficiente de kat/K, ou um material de biofilme de Campylobaeter deficiente de fur.

16. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15, caracterizada pelo fato de que compreende adicio- nalmente um adjuvante imunológico.

17. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o adjuvante imunológico compreende subuni- dade B de toxina de cólera.

18. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de vacina de DNA capaz de expressar a proteína pilus de Campylobaeter jejuni que apresenta a seqüência de aminoácidos dada em SEQ ID NO: 2, ou uma seqüência de aminoácidos que apresenta pelo menos 95% de identidade com ela.

19. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a molécula de vacina de DNA é capaz de ex- pressar uma proteína com a seqüência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: -2.

20. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que se liga especifica- mente a uma proteína pilus de Campylobacter jejuni descrita pela seqüência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 2, ou uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com ela.

21. Método para tratar infecção por Campylobacter, caracteriza- do pelo fato de que compreende administrar uma quantidade terapeutica- mente eficaz de um anticorpo que se liga especificamente a proteína pilus de Campylobacter jejuni descrita pela seqüência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 2, ou uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 95% de iden- tidade com ela, em um ser humano ou animal com necessidade desse tra- tamento.

22. Método para reduzir infecção e/ou colonização em um ser humano ou animal com Campylobacter jeuni, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administrar uma composição imunogênica que com- preende uma proteína pilus de Campylobacter jejuni com a seqüência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 2, ou uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com ela, em um ser humano ou animal com necessidade desse tratamento.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe- lo fato de que a proteína pilus de Campylobacter jejuni compreende á se- qüência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 2.

24. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracteri- zado pelo fato de que a composição é administrada a uma superfície muco- sa do ser humano ou animal.

25. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracteri- zado pelo fato de que a composição é administrada oralmente ao ser huma- no ou animal.

26. Método de acordo com qualquer das reivindicações 21 a 25, caracterizado pelo fato de que a composição compreende adicionalmente um adjuvante imunológico.

27. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracteri- zado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de coletar a pro- teína pilus.

28. Método para detectar a presença de proteína pilus de Camp- ylobacter descrita pela seqüência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 2, ou uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com ela, o referido método sendo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) proporcionar uma amostra que poderá conter proteína pilus de Campylobacter, (b) contatar a amostra com o anticorpo como definido na rei- vindicação 20 sob condições que permitam a ligação do anticorpo com a proteína pilus de Campylobacter, e (c) detectar a ligação do anticorpo com a proteína pilus.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pe- lo fato de que a amostra é uma amostra não-biológica.

30. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pe- lo fato de que a amostra é uma amostra biológica.

31. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pe- lo fato de que a amostra é uma amostra cecal, fecal, cloacal, de aves do- mésticas, de carne de porco, ou de laticínio.

32. Método para detectar um anticorpo que se liga especifica- mente a uma proteína pilus de Campylobacter jejuni descrita pela seqüência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 2, ou uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com ela, o referido método sendo carac- terizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) proporcionar uma amostra que poderá conter anticorpo que se liga especificamente a uma proteína pilus de Campylo- bacter jejuni descrita pela seqüência de aminoácidos dada na SEQ ID NO: 2, ou uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com ela; (b) contatar a amostra com a proteína pilus sob condições que permitam a ligação da proteína pilus com o anticorpo; e (c) detectar a ligação da proteína pilus com o anticorpo.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pe- lo fato de que a amostra é uma amostra biológica de um ser humano ou a- nimal.