ES2583484T3 - Vacuna de toxoide alfa de C. perfringens - Google Patents

Abstract

Una vacuna para un ave que comprende un antigeno toxoide alfa de C. perfringens de tipo A, en la que dicho antigeno tiene 2 o mas unidades de Potencia de Combinacion Total (TCP), a condicion de que solo este presente un antigeno toxoide alfa de un unico tipo de C. perfringens en dicha vacuna y en donde la vacuna comprenda un adyuvante, el adyuvante no sea un hidroxido de aluminio y el adyuvante este comprendido en una emulsion de agua-en-aceite junto con el antigeno.

Description

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DESCRIPCION

Vacuna de toxoide alfa de C. perfringens Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a vacunas que comprenden toxoides de tipo alfa de C. perfringens. La presente invencion se refiere adicionalmente a metodos de uso de estas vacunas para proteger a los animales contra las enfermedades clostridiales. La presente invencion tambien se refiere a metodos de fabricacion de estas vacunas.

Antecedentes

El Clostridium perfringens (C. perfringens) es una bacteria anaerobica que se encuentra de forma natural en el suelo, en la materia organica en descomposicion y como parte de la flora intestinal normal de los animales, incluyendo los seres humanos. El C. perfringens es tambien el agente etiologico de numerosas enfermedades clostridiales que se encuentran en animales domesticos economicamente valiosos. El C. perfringens produce una serie de toxinas que causan efectos patogenos en animales, incluyendo la toxina alfa, la toxina beta, la toxina beta 2, la toxina epsilon, la toxina teta, la toxina mu, la toxina delta, la toxina iota, la toxina kappa y la toxina lambda. Ademas, el C. perfringens codifica otras sustancias biologicamente activas que pueden provocar efectos patologicos, incluyendo: la hialuronidasa, la fosfatasa acida, la proteasa, la colagenasa, la sulfatasa y la neuraminidasa.

Las diferentes cepas de C. perfringens se senalan como los biotipos A a E, dependiendo del espectro de toxinas que produce la bacteria en particular [Justin et al., Biochemistry 41:6253-6262 (2O02); McDonel, PHARMACOLOGY OF BACTERIAL TOXINS; F Dorner y J Drews (eds.) Pergamon Press, Oxford (1986)]. Inicialmente, dicha tipificacion se basaba en ensayos de neutralizacion serologicos en ratones o cobayas. Mas recientemente, los metodos de tipificacion molecular emplean la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) dirigida a secuencias geneticas que codifican una de las numerosas toxinas de C. perfringens.

La clostridiosis intestinal en caballos se ha relacionado con altas concentraciones de C. perfringens de tipo A en el intestino. El equino afectado tiene una diarrea acuosa profusa y una alta tasa de mortalidad. El C. perfringens de tipo A tambien se ha ligado a la enfermedad enterica en cerdos amamantados y cerdos cebados, incluyendo los sintomas la enteritis necrotizante leve y la atrofia de las vellosidades [Songer, Clin. Micro. Rev, 9(2):216-234 (1996)].

Las enfermedades clostridiales provocadas por C. perfringens se caracterizan por la muerte subita en aves carnosas con lesiones fibrinonecroticas confluentes ("toalla turca") en el intestino delgado (formas entericas), y/o hepatitis asociada a C. perfringens con colangiohepatitis, o necrosis fibrinoide en el higado. Las aves afectadas experimentan un curso rapido de depresion, diarrea y deshidratacion. La mortalidad varia del 2 % al 50 %. La patologia hepatica conduce a la declaracion de no apto para el consumo humano de los cadaveres en la matanza.

La enteritis necrotica (EN) es un ejemplo de una enfermedad enterica clostridial provocada por C. perfringens que conduce a consecuencias economicas importantes en aves de corral. La enfermedad es especialmente comun en pollos de engorde criados en suelo de 2 a 10 semanas de edad, aunque la enfermedad tambien se ha notificado en pavos y gallinas ponedoras enjauladas. La enteritis necrotica se produce generalmente en aves de corral, ya sea como enfermedad secundaria o en una situacion en la que se altera la microflora intestinal normal de manera que se permite la proliferacion anormal del C. perfringens patogeno. La prevalencia de la enteritis necrotica subclinica es desconocida, ya que las lesiones solo pueden observarse a traves de un examen post-mortem. Sin embargo, los informes del deterioro de la conversion del alimento y del peso corporal reducido se han atribuido a la enfermedad subclinica [Lovland y Kadhusdal, Avian Path. 30:73-81 (2001)]. Los factores predisponentes que conducen a la enteritis necrotica tanto en los brotes naturales como en los modelos experimentales incluyen: (a) la coccidiosis, (b) la migracion de las larvas parasitarias, (c) los piensos ricos en harina de pescado o trigo y (d) las enfermedades inmunosupresoras. Ademas, la enteritis necrotica puede reproducirse experimentalmente: (i) proporcionando a los animales pienso contaminado por C. perfringens, (ii) administrando a los animales cultivos vegetativos por via oral o en el cultivo o (iii) administrando por via intraduodenal cultivos en caldo de toxinas en bruto libres de bacterias a los animales.

Los tipos A o C de C. perfringens son los dos biotipos que causan la enteritis necrotica en las aves de corral, siendo la toxina alfa la toxina detectada mas comun [Wages y Opengart, Necrotic Enteritis. pags.: 781-785, en: Diseases of poultry, 11a edicion, (eds., Saif et al.), Iowa State Press, Ames, IA (2003)]. De hecho, mas del 90 % de los aislados de C. perfringens obtenidos de cuarenta y dos aves infectadas produjo una toxina alfa letal, junto con sialidasa, y las toxinas teta y mu [Daube et al., AJVR 54:496-501 (1996)]. Ademas, la enterotoxina producida por el C. perfringens de tipo A se ha identificado en pollos con enteritis necrotica y puede desempenar un papel en la enfermedad intestinal [Niilo, Can. J. Comp. Med. 42:357-363 (1978)].

Recientemente, se ha notificado que los C. perfringens de tipo A o de tipo C pueden codificar el gen cpb2 [Gilbert et al., Gene 203:56-73 (1997)] y expresar su producto, la toxina beta 2. Se ha observado una fuerte relacion entre la

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expresion de la toxina beta 2 y la enteritis neonatal en cerdos [Bueschel et al., Vet Micro 94:121-129 (2003)]. Tambien se ha implicado a la toxina beta 2 como factor patogenico en la enteritis de caballos y ganado. Bueschel et al., citado anteriormente, informaron adicionalmente, que el 37,2 % de los tres mil veinte aislados de C. perfringens que obtuvieron codificaron la toxina beta 2 y de los aislados de C. perfringens de tipo A examinados, el 35,1 % codificaron la toxina beta 2. Se encontro que la muestra limitada (n = 5) de aislados de campo de C. perfringens de tipo A aviar fue positiva al =35 % para el genotipo cpb2, y el 40 % de estos tambien expresaron la toxina beta 2. Ademas, empleando la PCR, Engstrom et al., [Vet Micro 94:225-235 (2003)] encontraron que el 12 % de los aislados de C. perfringens de pollos con hepatitis tambien fueron positivos para cpb2. Tambien se ha demostrado que la enterotoxina del C. perfringens de tipo A es patogena en pollos, provocando la acumulacion de liquido en un modelo de bucle intestinal ligado [Niilo, Appl. Micro. 28:889-891 (1974)].

Los esfuerzos actuales para controlar el C. perfringens se basan en medidas sanitarias y de poner antibioticos en el pienso animal. El componente clostridial de la enfermedad responde bien a los antibioticos y generalmente es suprimido por los aditivos antibioticos para piensos y los farmacos anticoccidiales ionoforos. Sin embargo, los antibioticos son costosos y estan sujetos a preocupaciones crecientes relacionadas con la promocion de la resistencia bacteriana.

La vacunacion tambien se ha convertido en una importante medida de control en los animales domesticos, ya que el curso de muchas enfermedades asociadas a C. perfringens es rapido y con frecuencia mortal. Por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N.° 4.292.307 define una vacuna multivalente "universal" preparada a partir de toxoides de C. perfringens de tipo A, de tipo B y de tipo D que incluye adicionalmente toxoides de Cl. oedematiens y toxoide de Cl. septicum. Ademas, hay vacunas disponibles en el mercado que con frecuencia son multivalentes y consisten en celulas inactivadas, toxinas o combinaciones de estas dos [vease, Songer, Clin. Micro. Rev, 9(2):216-234 (1996)].

La vacunacion de ganado hembra tambien puede inducir la proteccion pasiva de su descendencia nacida posteriormente. La proteccion pasiva de los neonatos de mamiferos frente a infecciones clostridiales patologicas se basa en la transferencia de anticuerpos especificos en forma de anticuerpos del calostro. Por ejemplo, Smith y Matsuoka [Am. J. Vet. Res. 20:91-93 (1959)] emplearon una vacuna inactivada para inocular ovejas prenadas y notificaron la proteccion inducida por via materna de los corderos jovenes frente a la toxina epsilon de C. perfringens.

La inmunidad pasiva en los mamiferos jovenes normalmente dura de 2 a 3 semanas [Songer, Clin. Micro. Rev, 9(2):216-234 (1996)].

A diferencia de los mamiferos lactantes, la inmunidad pasiva en las aves tiene varias deficiencias evidentes, en particular, la ausencia completa de los anticuerpos maternos que se obtienen de la leche. Aunque la inmunidad pasiva es solo una posible explicacion para la correlacion observada, Heier et al., [Avian Diseases 45:724-732 (2001)] notificaron que la supervivencia de los pollos fue considerablemente mayor en la poblacion de pollos de Engorde Noruego que tenian mayores titulos de anticuerpos maternos de origen natural especificos frente a la toxina alfa de C. perfringens que en las poblaciones que tenian titulos bajos. Ademas, Lovland et al. [Avian Pathology 33(1):83-92 (2004)] notifico resultados que fueron coherentes con la proteccion pasiva modesta de la progenie de las gallinas que habian sido inoculadas con las vacunas a base de toxoides de C. perfringens de tipo A o de tipo C, en comparacion con la progenie de las gallinas sin vacunar.

Lovland et al. usaron una vacuna de toxoide alfa de C. perfringens de tipo A a 1 TCP/ml, para una dosis intramuscular de 0,25 ml por gallina. La vacuna era una composicion acuosa formulada con un adyuvante de hidroxido de aluminio (Alhidrogel™). Lovland et al. notificaron que "las respuestas inmunitarias fueron, en gran medida, independientes de los niveles de dosis que variaban de 0,25 a 1 ml".

Hasta ahora, la proteccion comercialmente importante frente a C. perfringens no parecia ser posible a menos que estuvieran presentes en el inoculo los anticuerpos maternos para la mayoria, si no todos, los componentes patologicos producidos por las bacterias C. perfringens. Por ejemplo, la vacunacion de la presa con un producto que no contenga la enterotoxina solo ofrece una proteccion parcial a los lechones y el anticuerpo anti-toxina epsilon en cabras madre protege frente a la muerte por toxemia, pero no frente a la enterocolitis [Songer, Clin. Micro. Rev, 9(2):216-234 (1996)].

En efecto, a pesar de la tabulacion de una cantidad impresionante de datos con respecto a los diversos biotipos de C. perfringens y sus correspondientes toxinas y sustancias bioactivas nocivas, las enfermedades clostridiales en animales de produccion de alimentos siguen siendo un problema economico importante para los agricultores. Por tanto, existe una necesidad de proporcionar medios adicionales para proteger al ganado contra los efectos patologicos de C. perfringens. Mas en particular, sigue habiendo una necesidad de proporcionar una vacuna segura y eficaz frente a C. perfringens en aves de corral. Ademas, existe una necesidad de proporcionar una vacuna simple frente a C. perfringens que pueda administrarse a animales hembras, especialmente ganado hembra fertil y/o prenado, que protegera pasivamente su descendencia. La cita de cualquier referencia en el presente documento no debe interpretarse como una admision de que dicha referencia este disponible como "tecnica anterior" de la presente solicitud.

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Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona vacunas frente a C. perfringens que comprenden un toxoide alfa de C. perfringens como antigeno. La presente invencion proporciona adicionalmente vacunas que consisten esencialmente en un toxoide alfa de un solo tipo de C. perfringens como antigeno, como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Preferentemente, de una a dos dosis de 0,25 - 0,6 ml por dosis de una vacuna de la presente invencion es suficiente para inducir al menos cuatro unidades de antitoxina (U.A.) de anticuerpo anti-toxina alfa por ml de antisuero de un animal (por ejemplo, un pollo) vacunado con la vacuna. En una realizacion de este tipo, la determinacion de las unidades de antitoxina (U.A.) de anticuerpo anti-toxina alfa por ml de antisuero de un animal vacunado con la vacuna se realiza de seis a siete semanas despues de la inmunizacion. En una realizacion particular, una sola dosis de la vacuna es suficiente para inducir al menos 4 unidades de antitoxina (U.A.) de anticuerpo anti-toxina alfa por ml de antisuero del animal vacunado, mientras que, en una realizacion alternativa, son necesarias dos dosis de la vacuna. En una realizacion, el antigeno uno tiene 2 o mas unidades de potencia de combinacion total (TCP, del ingles Total Combination Power).

En una de dichas realizaciones el animal es un ave. En una realizacion particular, el ave es un pollo. En otra realizacion, el ave es un pavo.

En una realizacion, el antigeno se origino a partir de una celula de C. perfringens de tipo A, por ejemplo, un alfa toxoide de C. perfringens de tipo A.

En una realizacion, una vacuna de la presente invencion comprende un antigeno que es antigeno de un solo tipo de C. perfringens, a condicion de que solamente este presente antigeno de un solo tipo de C. perfringens en dicha vacuna. En una realizacion particular de este tipo, el C. perfringens es de tipo A. En una realizacion especifica, la vacuna comprende un sobrenadante de toxoide alfa de un solo tipo de C. perfringens, de tipo A.

En una vacuna de la presente invencion, el antigeno es un toxoide alfa de una toxina alfa codificada de forma natural por una celula de C. perfringens. En otra vacuna de la presente invencion, el antigeno es un polipeptido recombinante, es decir, uno que es codificado por un gen que ha sido manipulado geneticamente. En una realizacion de este tipo, el polipeptido recombinante es un toxoide alfa en el que las regiones enzimaticas de la alfa toxina correspondiente se han retirado o alterado geneticamente, pero, uno o mas epitopos antigenicos se han conservado.

En una realizacion particular, el antigeno esta en una preparacion de celulas enteras. En otra realizacion, el antigeno esta en una preparacion sin celulas. En otra realizacion mas, el antigeno es un toxoide alfa en un sobrenadante de toxoide alfa de C. perfringens. En una realizacion particular de este tipo, el sobrenadante de toxoide alfa de C. perfringens es tambien una preparacion sin celulas.

En otro aspecto de la presente invencion, una vacuna tambien puede contener multiples antigenos que pueden dar como resultado la produccion de anticuerpos de diversas especificidades cuando se administra a un sujeto animal. No es necesario que todos estos anticuerpos sean protectores frente a una enfermedad. En una realizacion particular de este tipo, dichos antigenos tambien son de C. perfringens. Por tanto, una vacuna de la presente invencion puede contener otros diversos factores patogenos activos o inactivados, junto con un toxoide alfa. Por tanto, de acuerdo con la presente invencion, el toxoide alfa puede combinarse con otras celulas, toxoides y extractos clostridiales y no clostridiales asi como fragmentos antigenicos inactivos de toxina alfa.

Una vacuna multivalente de este tipo de la presente invencion comprende un toxoide alfa de C. perfringens y comprende adicionalmente un antigeno viral y/o un antigeno bacteriano y/o un antigeno parasitario. En una realizacion particular de este tipo, la fuente viral del antigeno es el virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa. En otra realizacion, la fuente viral del antigeno es el virus de la bronquitis infecciosa. En otra realizacion mas, la fuente viral del antigeno es el reovirus. En otra realizacion mas, la fuente viral del antigeno es el virus de la enfermedad de Newcastle. En otra realizacion mas, la fuente bacteriana del antigeno es E. coli. En otra realizacion mas, la fuente bacteriana del antigeno es Salmonella. En otra realizacion mas, la fuente bacteriana del antigeno es Campylobacter. En otra realizacion mas, la fuente parasitaria del antigeno es Eimeria. En una realizacion particular de esta tipo, el antigeno empleado en la vacuna es una parte de un merozoito de Eimeria, un ooquiste de Eimeria o una mezcla de los mismos. En una realizacion relacionada, el hospedador natural del parasito es un ave. En una realizacion particular de este tipo, el parasito es Eimeria y el hospedador natural del parasito es un pollo.

Una vacuna multivalente de la presente invencion tambien puede comprender uno o mas de los siguientes antigenos: toxina beta de C. perfringens, toxina beta 2 de C. perfringens, enterotoxina de C. perfringens, toxina epsilon de C. perfringens, toxina iota de C. perfringens, toxina kappa de C. perfringens, toxina lambda de C. perfringens, toxina teta de C. perfringens, toxina hemorragica de C. sordellii, toxina letal de C. sordellii, toxina A de C. difficile, toxina B de C. difficile, toxina alfa de C. septicum, toxina alfa de C. novyiy toxina beta de C. novyi.

En una vacuna multivalente particular de la presente invencion, la vacuna comprende un toxoide alfa de C. perfringens y comprende adicionalmente uno o mas antigenos virales del virus de la enfermedad infecciosa de la

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bolsa, y/o el virus de la bronquitis infecciosa, y/o el reovirus, y/o el virus de la enfermedad de Newcastle, y/o antigenos bacterianos de E. coli, y/o Salmonella, y/o Campylobacter, y/o un antigeno parasitario de Eimeria.

En una realizacion alternativa, una vacuna multivalente de la presente invencion consiste esencialmente en un toxoide alfa de un solo tipo de C. perfringens. En una realizacion relacionada, la vacuna contiene adicionalmente un antigeno viral y/o un antigeno bacteriano y/o un antigeno parasitario, como se proporciona en el presente documento.

Una vacuna de la presente invencion tambien puede comprender un adyuvante. Un adyuvante animal popular es un adyuvante de hidroxido de aluminio. Un adyuvante alternativo puede estar comprendido en una emulsion de agua- en-aceite junto con el antigeno. En una vacuna particular de este tipo, la emulsion de agua-en-aceite se prepara con una fase de aceite del 70 % y una fase acuosa del 30 %. En otra realizacion, el adyuvante especificamente no es un adyuvante de hidroxido de aluminio. En una de dichas realizaciones, la vacuna que incluye un adyuvante que no es de hidroxido de aluminio se administra a aves de corral. En una realizacion particular, una vacuna comprende un toxoide alfa de C. perfringens, un adyuvante y uno o mas antigenos protectores, ya sean recombinantes o naturales, obtenidos a partir de un virus, una bacteria y/o un extracto bacteriano.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona metodos para proporcionar inmunidad activa a un ave mediante la inmunizacion de un ave con una vacuna de la presente invencion. En una realizacion particular, la dosis de vacuna para dicha inmunidad activa es de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,1 ml. En una realizacion, el ave es un pavo. En otra realizacion, el ave es un pollo. En otra realizacion mas, el ave es un faisan. La presente invencion tambien proporciona un metodo de administracion de una vacuna multivalente de la presente invencion a un ave para protegerla frente a multiples enfermedades.

La presente invencion tambien proporciona metodos para proporcionar inmunidad pasiva a la progenie de un animal hembra (por ejemplo, una hembra prenada) que comprende la administracion de una vacuna de la presente invencion a un animal hembra (por ejemplo, la madre) antes del nacimiento de su progenie. En una realizacion, la hembra es un ave y la vacuna se administra a la hembra aviar antes de su puesta de los huevos que comprenden la progenie. De esta manera se proporciona a su progenie inmunidad pasiva. En una de dichas realizaciones, el ave es un pollo. En otra realizacion, el ave es un pavo. En otra realizacion mas, el ave es un faisan.

En una realizacion particular, el metodo proporciona inmunidad pasiva frente a una enfermedad clostridial a la progenie del animal vacunado. En un metodo de este tipo la enfermedad clostridial es una enfermedad enterica clostridial. En un metodo particular de este tipo, la enfermedad enterica clostridial es la enteritis necrotica. En otro metodo de este tipo la enfermedad clostridial es la colangiohepatitis. En otra realizacion mas, el metodo proporciona inmunidad pasiva frente a una enfermedad clostridial a la progenie del animal vacunado, asi como proporciona proteccion frente a la dermatitis gangrenosa, el C. septicum y/o la hepatitis.

En una realizacion, el metodo para proporcionar inmunidad pasiva a la progenie de un animal hembra comprende la administracion de una vacuna multivalente al animal hembra para proteger su progenie frente a multiples enfermedades. En una realizacion particular de este tipo, el animal hembra es de la familia de las aves de corral y su progenie se protege frente a multiples enfermedades de las aves de corral.

En una realizacion particular, la dosis para proporcionar inmunidad pasiva a la progenie de un animal hembra es de aproximadamente 0,25 ml por dosis de la vacuna. En otra realizacion, la dosis es de aproximadamente 0,4 ml por dosis de la vacuna. En otra realizacion mas, la dosis es de aproximadamente 0,6 ml por dosis de la vacuna. En una realizacion ejemplificada a continuacion, la dosis es de aproximadamente 0,5 ml por dosis de la vacuna.

La presente invencion proporciona adicionalmente un proceso para la fabricacion de una vacuna de toxoide alfa de C. perfringens de la presente invencion. Un metodo de este tipo comprende cultivar una celula de C. perfringens en un medio de cultivo para producir una cantidad de celulas cultivadas que secreten una toxina alfa de C. perfringens en el medio celular. Despues, se produce el toxoide alfa de C. perfringens mediante la inactivacion de la toxina alfa secretada. La mayor parte de las celulas cultivadas se retira del medio de cultivo para formar un sobrenadante de toxoide alfa de C. perfringens. En una realizacion particular del metodo, la concentracion de sobrenadante de toxoide alfa de C. perfringens se ajusta de modo que sea suficiente para inducir al menos cuatro unidades de antitoxina (U.A.) de anticuerpo anti-toxina alfa por ml de antisuero de un animal (por ejemplo, un pollo) que ha sido vacunado ya sea con una o dos dosis de 0,25-0,6 ml por dosis de dicha vacuna. En una realizacion de este tipo, el proceso de concentracion incluye la diafiltracion frente a una solucion tamponada con el fin de retirar los contaminantes de bajo peso molecular.

El proceso para fabricar una vacuna de toxoide alfa de C. perfringens de la presente invencion puede comprender adicionalmente la mezcla del sobrenadante de toxoide alfa de C. perfringens con un adyuvante. En una realizacion de este tipo, el sobrenadante de toxoide alfa de C. perfringens se mezcla en una emulsion de agua-en-aceite. En una realizacion particular de este tipo, la emulsion de agua-en-aceite se prepara con una fase de aceite del 70 % y una fase acuosa del 30 %.

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Las celulas de C. perfringens empleadas en el proceso pueden ser de una celula de un solo tipo de C. perfringens. En una realizacion particular de este tipo, la celula de un solo tipo de C. perfringens es una celula de C. perfringens de tipo A. En una realizacion alternativa, la celula de un solo tipo de C. perfringens es una celula de C. perfringens de tipo C.

Estos y otros aspectos de la presente invencion se apreciaran mejor por referencia a la siguiente description detallada.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona vacunas unicas frente a C. perfringens que son seguras y efectivas para la prevention de enfermedades clostridiales en animales. En una realizacion particular, la administration de una vacuna de la presente invencion a un sujeto animal hembra da como resultado tanto la inmunizacion del animal hembra como el desarrollo de anticuerpos que pueden ser transferidos pasivamente a su progenie nacida posteriormente. En una realizacion, la presente invencion proporciona una vacuna que comprende una cantidad minima especifica de un toxoide alfa de un solo tipo de C. perfringens que es eficaz frente a infecciones por C. perfringens perjudiciales. En una realizacion particular, la vacuna comprende una combination segura e inmunologicamente eficaz de un toxoide alfa de la presente invencion y un adyuvante farmaceuticamente aceptable.

Las vacunas de la presente invencion pueden usarse para proteger frente a cualquier afeccion o enfermedad en las que el C. perfringens desempene un papel. Dichas enfermedades incluyen las enfermedades clostridiales. En una realizacion de este tipo, la enfermedad clostridial es una enfermedad enterica clostridial. Por tanto, en una realizacion particular, la presente invencion proporciona vacunas que son eficaces para la prevencion de la enfermedad enterica clostridial en aves de corral conocida como enteritis necrotica. Tambien pueden prevenirse otros sindromes de enfermedad mediante las vacunas de la presente invencion e incluyen, pero no se limitan a, la hepatitis relacionada con clostridios, la colangiohepatitis y la dermatitis gangrenosa.

La presente invencion desvela que una vacuna que comprende una cantidad minima especifica de toxoide alfa (es decir, que tiene una TCP minima especifica) obtenida a partir de un solo tipo de C. perfringens, protege la progenie del sujeto animal hembra vacunado frente a enfermedades clostridiales, tales como la enteritis necrotica, con independencia de si se expresan cualesquier toxinas letales adicionales por el C. perfringens expuesto. La presente invencion desvela adicionalmente una vacuna que desencadena una respuesta anti-toxina alfa minima especifica del animal hembra vacunado, que tambien protege la progenie de ese sujeto animal hembra vacunado de enfermedades clostridiales, independientemente de si se expresan cualesquier toxinas letales adicionales por un C. perfringens de origen natural. Las vacunas de la presente invencion tambien pueden administrarse con un adyuvante aceptable.

Como se ejemplifica a continuation, vacunar las gallinas con una vacuna derivada de un aislado de C. perfringens de tipo A inactivado que expresa una toxina alfa, pero no una toxina beta 2 correspondiente, de forma inesperada, condujo a la inmunizacion pasiva de los pollos de la progenie, de tres semanas de edad, frente a una exposition a una cepa de C. perfringens que expresaba tanto la toxina alfa como la toxina beta 2. Hasta ahora, no habia habido ninguna evidencia de dicha protection cruzada frente a estas dos toxinas distintas. Por tanto, la presente invencion proporciona vacunas relativamente simples que son capaces de estimular una cantidad minima especifica de anti- toxinas alfa y, por tanto, proteger frente a enfermedades clostridiales, por ejemplo, la enteritis necrotica, independientemente de que otras toxinas pueda expresar la cepa de exposicion de C. perfringens.

De hecho, a pesar de la multitud de toxinas y otras proteinas biologicamente activas producidas por C. perfringens que han demostrado tener efectos patogenos en los animales, y de las multiples citas en la bibliografia sobre las contribuciones de estas diversas toxinas y otras proteinas a la patologia de la enteritis necrotica, las vacunas unicas desveladas en el presente documento proporcionan una respuesta inmune sustancial al C. perfringens en gallinas de engorde vacunadas e inmunidad pasiva a su descendencia nacida posteriormente.

Aunque la presente invencion es completamente independiente de cualquier teoria o modelo, los resultados proporcionados en el presente documento son coherentes con que la toxina alfa de C. perfringens sea el componente antigenico que es a la vez necesario y suficiente para la proteccion frente a la enteritis necrotica. Aunque la beta, la beta 2 y las enterotoxinas puedan ser criticas para la patologia de la enteritis necrotica, los resultados proporcionados en el presente documento son coherentes con que el toxoide alfa sea el unico toxoide necesario en una vacuna para la enteritis necrotica. Ademas, ya que generalmente la production mas alta de toxina alfa es en las cepas del tipo A, las cepas de C. perfringens de tipo A son particularmente utiles como fuente de toxina alfa de C. perfringens. Sin embargo, tambien pueden usarse otros tipos de C. perfringens satisfactoriamente, especialmente cuando se ha usado modification genetica para aumentar el nivel de produccion de toxina alfa en estos otros tipos.

Como se usan en el presente documento, los siguientes terminos tendran las definiciones que se exponen a continuacion: como se usa en el presente documento un "antigeno protector" es un antigeno que da como resultado la produccion de anticuerpos especificos que transmiten proteccion frente a la infection y/o la enfermedad al animal

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vacunado con que el antigeno y/o a su progenie. Una vacuna que contiene un antigeno protector de este tipo se denomina "inmunologicamente eficaz".

Como se usa en el presente documento, la expresion "toxoide alfa" se refiere a cualquier toxina alfa inactiva, (por ejemplo, una toxina alfa inactiva de longitud completa), pero no pretende limitar de ninguna manera los medios particulares de inactivacion de una toxina alfa para producir ese toxoide alfa. Dicha metodologia de inactivacion incluye: (i) metodos quimicos que modifican la protema intacta, por ejemplo, tratamiento con formaldehido o glutaraldehido; (ii) procedimientos fisicos, tales como el calentamiento; (iii) metodos enzimaticos que alteran la proteina; (iv) metodos recombinantes y/o combinaciones de todos o cualesquiera de los anteriores.

Como se usa en el presente documento, un "sobrenadante de toxoide alfa" de C. perfringens es una solucion que comprende toxina alfa de C. perfringens inactivada, de la que se han retirado al menos la mayor parte de las celulas que producian la toxina (es decir, retirandose mas del 70 % de las celulas y, en una realizacion particular, retirandose mas del 90 % de las celulas). En una realizacion particular, la toxina alfa de C. perfringens inactivada habia sido secretada en el medio de cultivo por celulas de C. perfringens que se habian anadido y/o cultivado/desarrollado en ese medio de cultivo, y despues se inactivo. En otra realizacion, la toxina alfa de C. perfringens inactivada incluye la toxina alfa de C. perfringens asociada a las celulas, que se habia liberado a traves de lisis celular y despues se inactivo. No se pretende limitar de ninguna manera el medio de preparacion del "sobrenadante de toxoide alfa" a ningun metodo particular de retirada de las celulas o los residuos celulares de la solucion, e incluye la centrifugacion, la cromatografia en columna, la ultrafiltracion, etc.

Como se usa en el presente documento, una "solucion sin celulas" es una en la que se han retirado mas del 90 % de las celulas de un cultivo. No se pretende limitar de ninguna manera el medio de preparacion de la solucion "sin celulas" a ningun metodo particular de retirada de las celulas o residuos celulares de la solucion, e incluye la centrifugacion, la cromatografia en columna, la ultrafiltracion, etc.

Como se usa en el presente documento, la expresion "un solo tipo de C. perfringens" se refiere a un tipo de C. perfringens, por ejemplo, el tipo A o el tipo B o el tipo C, etc., en lugar de multiples tipos, por ejemplo, el tipo A y el tipo B y el tipo C. Por tanto, una celula, sobrenadante, composition, preparacion, vacuna, etc. que comprende un toxoide alfa de "un solo tipo de C. perfringens" es una celula, sobrenadante, composicion, preparacion, vacuna, etc., que contiene toxoide alfa solamente de ese tipo de C. perfringens especifico y no contiene toxoide alfa de ningun otro tipo de C. perfringens. Por otra parte, dichas celulas, sobrenadantes, composiciones, preparaciones, vacunas, etc., pueden contener otros componentes de toxoide no alfa, incluyendo otros toxoides de C. perfringens, y/o adyuvantes, y/o estimulantes inmunitarios, etc.

Como se usa en el presente documento, una "unidad de antitoxina" o "U.A." de anticuerpo anti-toxina alfa por ml de antisuero se usa indistintamente de unidades de "ensayo de neutralization de anti-toxina alfa" o unidades "TNT" (del ingles anti-alpha Toxin Neutralizing Test) y se define por la capacidad de los sueros para neutralizar los efectos toxicos de la toxina alfa en un bioensayo en raton. En este ensayo, una cantidad conocida de la toxina alfa establecida por las normas internacionales [Farmacopea de la UE 5.0.: 01/2005:0088, pags. 803-804] se mezcla con diluciones en serie de sueros de animales vacunados. La mezcla se incuba una hora a temperatura ambiente y despues se inyecta por via intravenosa en ratones. Los ratones sobreviviran si la toxina es completamente neutralizada por los sueros, de lo contrario mueren. Las unidades o titulo de antitoxina se determinan como el reciproco de la dilution de suero mas alta que neutraliza la toxina.

Como se usa en el presente documento, la expresion "potencia de combination total" se abrevia como "TCP" y se define como se describe por Batty [Toxin-Antitoxin Assay, Methods in Microbiology, Capitulo 8, Volumen 5A (1971), ed. JR Norris y DW Ribbons]. En este ensayo, un volumen especifico del sobrenadante de toxoide alfa se pone en contacto con una cantidad conocida de unidades de antitoxina. Despues de proporcionar un periodo de incubation adecuado para permitir que la antitoxina y el toxoide alfa se unan, por ejemplo, una hora a temperatura ambiente, se anade una cantidad conocida de la toxina alfa. Despues, a la antitoxina libre restante se le proporciona un periodo de tiempo adecuado para unirse con la toxina alfa, por ejemplo, una hora a temperatura ambiente. Despues, la cantidad de toxina alfa libre se determina mediante la adicion de un sustrato a la solucion para medir la actividad enzimatica de la toxina alfa. Los sustratos adecuados incluyen los globulos rojos (en particular, los globulos rojos de oveja) y la lecitina. Despues, el toxoide alfa puede cuantificarse a traves de un calculo basado en la cantidad de actividad enzimatica determinada. Cuanto mayor es la cantidad de toxoide alfa presente en la solucion de ensayo, mayor es la cantidad de actividad enzimatica medida en el ensayo.

Los terminos "tipo" y "biotipo" se usan indistintamente en la presente memoria y se refieren al fenotipo particular de un C. perfringens basado en la expresion de diversos genes de toxina. El Clostridium perfringens se divide en tipos basados en la production de las cuatro toxinas principales, alfa, beta, epsilon y iota. El C. perfringens de tipo A produce la toxina alfa; el tipo B produce las toxinas alfa, beta y epsilon; el tipo C produce las toxinas alfa y beta, el tipo D produce las toxinas alfa y epsilon, el tipo E produce las toxinas alfa e iota. Se han descrito nada menos que 17 exotoxinas de C. perfringens. Un biotipo de C. perfringens es una clasificacion basada en la produccion de algunas o todas las toxinas y/o enzimas clostridiales adicionales. Por ejemplo, un patotipo enterotoxigenico de C. perfringens de tipo A puede producir toxinas teta y mu ademas de la toxina alfa.

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Como se usa en el presente documento, una vacuna multivalente es una vacuna que comprende dos o mas antigenos diferentes. En una realizacion particular de este tipo, la vacuna multivalente estimula el sistema inmunitario del receptor frente a dos o mas patogenos diferentes.

Las expresiones "adyuvante" y "estimulante inmunitario" se usan indistintamente en el presente documento y se definen como una o mas sustancias que provocan la estimulacion del sistema inmunitario. En este contexto, un adyuvante se usa para potenciar una respuesta inmunitaria a uno o mas antigenos de la vacuna. Un adyuvante puede administrarse al animal de destino antes, en combinacion con o despues de la administracion de la vacuna. Los adyuvantes de la presente invention pueden obtenerse de cualquiera de una serie de fuentes, incluyendo de fuentes naturales, fuentes recombinantes, y/o sintetizarse quimicamente, etc. Los ejemplos de compuestos quimicos utilizados como adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, compuestos de aluminio, aceites metabolizables y no metabolizables, polimeros de bloque, ISCOM (complejos inmunoestimulantes), vitaminas y minerales (incluyendo pero no limitados a: vitamina E, vitamina A, selenio y vitamina B12), Quil a (saponinas) y CARBOPOL®. Los ejemplos adicionales de adyuvantes, que a veces se han denominado especificamente estimulantes inmunitarios, incluyen, componentes de la pared celular de bacterias y hongos (por ejemplo, lipopolisacaridos, lipoproteinas, glicoprotemas, muramilpeptidos, befa-1,3/1,6-glucanos), diversos hidratos de carbono complejos derivados de plantas (por ejemplo, glucanos, acemanano), diversas proteinas y peptidos derivados de animales (por ejemplo, hormonas, citocinas, factores co-estimulantes) y acidos nucleicos novedosos derivados de virus y otras fuentes (por ejemplo, ARN de doble cadena, CpG). Ademas, cualquier numero de combinaciones de las sustancias mencionadas anteriormente puede proporcionar un efecto adyuvante y por tanto, puede formar un adyuvante de la presente invencion.

Como se usa en el presente documento una "anti-toxina alfa" es un anticuerpo (monoclonal o policlonal) que se une a la toxina alfa. Los anticuerpos frente a una toxina alfa pueden medirse mediante un ensayo TNT como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, los anticuerpos pueden detectarse por su capacidad para bloquear el efecto hemolitico de la toxina alfa. En un ensayo de inhibicion de la hemolisis, una cantidad conocida de toxina alfa, suficiente para catalizar la lisis completa de una preparation dada de globulos rojos de oveja, se mezcla con diluciones en serie de sueros y se incuba durante una hora a 36 ± 2 °C. Despues, la mezcla se incuba con globulos rojos de oveja al 0,5 % durante tres horas a 36 ± 2 °C. Cuando el anticuerpo se une a la toxina alfa, la toxina es incapaz de hemolizar los globulos rojos. El titulo se determina por el reciproco de la dilution de suero mas alta que no da como resultado ninguna hemolisis. En un ensayo similar, la capacidad de los anticuerpos unidos a la toxina alfa para inhibir la actividad fosfolipasa se puede medir mediante la determination de la dilucion de antisueros mas alta que bloquea la escision enzimatica de lecitina.

Como se usa en el presente documento, el termino "polipeptido" se usa indistintamente del termino "proteina" y pretende abarcar adicionalmente a los peptidos. Por tanto, como se usa en el presente documento, un polipeptido es un polimero de dos o mas aminoacidos unidos entre si por enlaces peptidicos. Los polipeptidos de la presente invencion incluyen proteinas de origen natural; proteinas recombinantes; proteinas sintetizadas quimicamente; fragmentos de cualquiera de las proteinas de origen natural, recombinantes o sintetizadas quimicamente; y proteinas de fusion que comprenden cualquiera de las proteinas de origen natural, recombinantes, y/o sintetizados quimicamente, y/o cualquiera de sus fragmentos. Preferentemente, el termino polipeptido se usa para representar un polimero que comprende veinte o mas restos de aminoacidos unidos entre si por enlaces peptidicos, mientras que el termino peptido se usa para representar un polimero que comprende de dos a veinte restos de aminoacidos unidos entre si por enlaces peptidicos.

Una "secuencia de nucleotidos heterologa" como se usa en el presente documento es una secuencia de nucleotidos que se anade mediante metodos recombinantes a una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina de la presente invencion, por ejemplo, una toxina alfa de la presente invencion, o que codifica un fragmento de la misma (por ejemplo, un fragmento antigenico inactivo), para formar un acido nucleico que no se forma de forma natural en la naturaleza. Dichos acidos nucleicos pueden codificar proteinas de fusion. Ademas, como se usa en el presente documento, no es necesario que una secuencia de nucleotidos heterologa sea una unica secuencia de nucleotidos contiguos, pero puede incluir multiples secuencias de nucleotidos no contiguas que se han combinado con una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido de la presente invencion o una portion del mismo. Una secuencia de nucleotidos heterologa puede comprender secuencias no codificantes, incluyendo sitios de restriction, sitios reguladores, promotores y similares. En otra realizacion mas, el nucleotido heterologo puede funcionar como un medio para detectar una secuencia de nucleotidos de la presente invencion. La presente invencion proporciona secuencias de nucleotidos heterologas que cuando se combinan con secuencias de nucleotidos que codifican un polipeptido de la invencion o un fragmento del mismo, son necesarias y suficientes para codificar todas las proteinas de fusion de la presente invencion.

Como se usa en el presente documento, una vacuna "consistente esencialmente en" o que "consiste esencialmente en" un toxoide alfa de un solo tipo de C. perfringens, es una vacuna que contiene una cantidad inmunologicamente eficaz del toxoide alfa de un solo tipo de C. perfringens para proteger frente a una enfermedad clostridial, pero que no contiene una cantidad inmunologicamente eficaz de ningun otro antigeno conocido que se sepa que protege frente a una enfermedad clostridial tal como otro antigeno de C. perfringens o una toxina alfa, toxoide alfa o fragmentos de los mismos de un tipo alternativo de C. perfringens. Dichas vacunas pueden incluir adicionalmente

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antigenos relacionados con otras enfermedades tales como antigenos virales del virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa, del reovirus y del virus de la enfermedad de Newcastle; antigenos bacterianos de E. coli, Salmonella y Campylobacter, y antigenos parasitarios tales como uno de Eimeria.

Como se usa en el presente documento, el termino "aproximadamente" cuando se usa en conjunto con un valor de dosificacion particular significa que el valor de dosificacion esta dentro del veinte por ciento del valor indicado, por ejemplo, una dosis de aproximadamente 0,5 ml puede comprender entre 0,4 ml y 0,6 ml.

Aislamiento de C. perfringens de tipo A

Pueden obtenerse aislados de C. perfringens, tales como C. perfringens de tipo A, a partir de muestras fecales y/o raspados intestinales de animales infectados. Las muestras/raspados pueden sembrarse en estrias en placas de agar sangre, incubarse anaerobicamente a 35 ± 1 °C durante 24-48 horas y las colonias que se asemejan al C. perfringens de tipo A se recogen individualmente. Para confirmar su identidad como aislado o aislados de C. perfringens de tipo A, las colonias seleccionadas pueden ensayarse para determinar las propiedades bioquimicas caracteristicas de C. perfringens de tipo A, incluyendo la composicion genetica.

La presencia del gen de la toxina alfa en el aislado puede determinarse mediante el analisis genetico, por ejemplo, mediante PCR. La expresion de la toxina alfa puede demostrarse por su actividad lecitinasa en un ensayo usando yema de huevo y/o mediante un ensayo de hemolisis empleando globulos rojos de oveja. En una realizacion particular, se usan aislados de C. perfringens que expresan un alto nivel de toxina alfa en la preparacion de una vacuna de la presente invencion. Un aislado o aislados de C. perfringens seleccionados pueden cultivarse anaerobicamente en caldo de nutrientes durante 4-24 horas. El cultivo puede inactivarse, por ejemplo, con formalina, concentrarse y mezclarse en una vacuna de este tipo.

Toxinas de C. perfringens

Toxina alfa - La toxina alfa es producida por todos los tipos de C. perfringens. La toxina alfa es una fosfolipasa C multifuncional que puede dividir lecitina, formando fosforilcolina y un diglicerido. Cuando se administra por via intravenosa, la toxina alfa ha demostrado ser letal para los ratones. La toxina alfa tambien es notablemente hemolitica. Sin embargo, la susceptibilidad de los globulos rojos puede variar en gran medida dependiendo de la especie animal que se use como fuente de globulos rojos. La toxina alfa tambien provoca la agregacion de plaquetas, la lisis de plaquetas, leucocitos y otras celulas del cuerpo, asi como tambien provoca un aumento de la permeabilidad vascular.

Toxina beta - La toxina beta es producida por el C. perfringens de tipos B y C. La toxina beta es responsable de la inflamacion del intestino y la perdida mayor de mucosa, asi como la inhibition del movimiento intestinal. La toxina beta es una proteina que tiene un peso molecular de 35 kDa y es mucho mas susceptible a las enzimas proteoliticas tales como la tripsina, que las otras toxinas de C. perfringens. Se ha notificado que la toxina beta es letal para los animales, siendo los ratones los mas sensibles y siendo los pollos los menos sensibles.

Toxina beta 2 - La toxina beta 2 es la descubierta mas recientemente de las toxinas de C. perfringens. A pesar de sus nombres similares, las secuencias de aminoacidos de la toxina beta 2 y de la toxina beta no muestran ninguna homologia. La bibliografia ha demostrado una fuerte asociacion entre la toxina beta 2 y la enteritis necrotica en ciertos animales [Garmory et al., Epidemiol. Infect. 124:61-67 (2000), Herholz et al., J. Clin. Morco, Feb:358-361 (1999)]. La toxina beta 2 tiene un peso molecular de 28 kDa. Se ha descubierto la toxina beta 2 es letal para los ratones y citotoxica para ciertas estirpes celulares, induciendo el redondeo de las celulas y la lisis sin afectar al citoesqueleto de actina [Manteca et al., Vet. Microbial. 86:191-202 (2002), Schotte et al., J. Vet Med B 51:423-416 (2004), Gilbert et al., Gene 203:65-73 (1997)].

Enterotoxina - La enterotoxina es producida normalmente por cepas de C. perfringens de tipo A. La presencia de enterotoxina se ha usado tradicionalmente para delinear las cepas asociadas a la enfermedad enterica de las que se asocian a la gangrena gaseosa tisular. Las cepas que provocan gangrena gaseosa normalmente no tienen enterotoxinas. La enterotoxina es una proteina sensible al calor que tiene un peso molecular de 34 kDa. La dosis letal para los ratones es de 10 microgramos. La interaction inicial de la enterotoxina es formar poros en la celula hospedadora, seguido de la permeabilidad alterada de la celula, la inhibicion de la sintesis macromolecular, la desintegracion del citoesqueleto y finalmente, la lisis [vease, Songer, Clin. Micro. Rev, 9(2):216-234 (1996)]. La enterotoxina efectua la inversion del transporte neto en las celulas de los intestinos.

Toxina epsilon - La toxina epsilon es producida por el C. perfringens de tipos B y D. La toxina epsilon se secreta como una protoxina que es convertida por la tripsina endogena en una neurotoxina extremadamente potente. Cuando se administra por via intravenosa, la toxina epsilon puede ser extremadamente letal para los ratones. La toxina epsilon tiene una alta afinidad por el tejido neural y tiene el efecto de provocar la permeabilidad vascular. La toxina epsilon tambien provoca la permeabilidad de la pared intestinal permitiendo que las moleculas grandes, incluso ella misma, entren en la sangre. Despues, la toxina epsilon progresa a traves del torrente sanguineo al cerebro, donde altera el equilibrio osmotico. Esta alteration del equilibrio osmotico en el cerebro da como resultado

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los signos neurologicos que se observan antes de la muerte del animal afectado.

Toxina kappa - La toxina kappa es una enzima que hidroliza colageno producida por el C. perfringens de tipos A, D, E y algunos tipos de B y C. La toxina kappa tiene un peso molecular de 80 kDa y es letal para los ratones. La inyeccion intravenosa de toxina kappa a un raton produce la muerte en el plazo de una hora debido a la intensa hemorragia de los pulmones.

Toxina teta - La mayoria de las cepas de C. perfringens produce toxina teta. La toxina teta es una proteina de 74 kDa responsable de las zonas transparentes de hemolisis que se ven alrededor de las colonias en las placas de agar sangre. La toxina teta purificada es extremadamente letal para los ratones, produciendo la muerte en cuestion de minutos. La toxina teta es inhibida por ciertos esteroides, siendo el colesterol el inhibidor mas potente.

Inmunidad pasiva

La presente invencion incluye una vacuna compuesta de una preparacion segura e inmunologicamente eficaz de una cantidad minima de un antigeno de la presente invencion, por ejemplo, un toxoide alfa, para la vacunacion de hembras no humanas, en particular de hembras fertiles y/o prenadas, que despues pueden transferir el efecto de la vacuna a su recien nacido. Dicha transferencia de inmunidad de la madre a la progenie se denomina "inmunidad pasiva". La inmunidad pasiva puede conseguirse, entre otros, a traves de la ingestion de calostros, como ocurre en los mamiferos, o de la absorcion de anticuerpos en el torrente sanguineo desde la yema del huevo, como ocurre en las aves de corral. Ademas, como se desvela en el presente documento, las aves de corral pueden consumir anticuerpos en el huevo, lo que da como resultado el aumento del nivel de anticuerpos sistemicos circulantes.

Como se demuestra en el presente documento, la transferencia pasiva de una cantidad especifica de anti-toxina alfa al animal neonatal protege a los neonatos frente a una exposicion virulenta de Clostridium perfringens. El grado proteccion, como se desvela a continuacion, fue completamente inesperado, ya que hasta ahora, se creia que el intestino tenia que estar banado por anticuerpos con el fin de proteger de forma significativa frente a una exposicion oral a C. perfringens de tipo A. De forma similar, es bastante sorprendente que exista una correlation entre la transferencia materna de anticuerpos de inmunidad mucosa a traves de la ingestion de calostro en el mamifero neonatal y la absorcion de los anticuerpos maternos en el huevo. Como se demuestra a continuacion para los pollos, los anticuerpos anti-toxina alfa son absorbidos en el torrente sanguineo en el huevo. Ademas, la presente invencion desvela que la induction de un titulo de anticuerpo anti-toxina alfa minirno definido, especifico, en el torrente sanguineo de la gallina es suficiente para proteger la descendencia vacunada de esa gallina frente una exposicion a C. perfringens de tipo A realizada semanas despues del nacimiento de la descendencia.

Inmunidad activa

La presente invencion incluye la vacunacion de polluelos de pollo (por ejemplo, polluelos de engorde) y/o pollos de pavo para proporcionar inmunidad activa frente a la enteritis necrotica, la dermatitis necrotica y la dermatitis gangrenosa. Los polluelos y/o los pollos de pavo se vacunan a edad temprana, aproximadamente el primer dia de vida o un poco mayores (dentro de la primera semana de vida) con una sola o dos dosis de la vacuna. Las dosis de vacuna adecuadas para conseguir la inmunidad activa pueden variar de aproximadamente 0,05 ml a aproximadamente 0,5 ml. En una realization particular, la dosis de la vacuna es de aproximadamente 0,05 ml a aproximadamente 0,1 ml.

Cultivo celular

Clostridium perfringens secreta toxina alfa en el medio durante el crecimiento. Despues de la inactivation y de retirar al menos la mayor parte de las celulas del medio de cultivo, la solution resultante se denomina un sobrenadante de toxoide alfa. Las celulas generalmente se retiran para minimizar los antigenos extranos en la vacuna que de otro modo podrian promover la reactividad y disminuir la respuesta inmunitaria. Sin embargo, tambien existe una cantidad finita de toxina alfa asociada a celulas. Por tanto, el antigeno de toxina alfa puede derivar de las celulas y/o del medio, ya sea en forma concentrada o no concentrada.

El C. perfringens puede cultivarse en cualquier recipiente apropiado, incluyendo matraces, frascos, jarras o fermentadores mecanicos. Las fermentaciones pueden ser controlarse durante el crecimiento de manera que el fermentador se recolecte cuando la production de toxina alfa este en su maximo. Los metodos tipicos incluyen la cromatografia de afinidad, la electroforesis en gel (sistema PHAST, etc.), los inmunoensayos, los ensayos de actividad de hemolisina y lecitinasa. El liquido de cultivo celular o el extracto celular pueden inactivarse con formaldehido (0,1-2,0 %) o una combination de formaldehido y calor. Otros productos quimicos que se usan normalmente para la desnaturalizacion de proteinas y que tambien pueden usarse incluyen, pero no se limitan a: glutaraldehido, fenol, diversos detergentes tales como Triton X-100, dodecil sulfato de sodio (SDS) y alcoholes. Los niveles de formaldehido residuales pueden controlarse durante la inactivacion de manera que se mantenga un nivel optimo sin sobre o subproduccion de toxoide. Los metodos tipicos para la medicion de formaldehido libre se enumeran en la Farmacopea Europea (01/2005:20418) o el CFR 9 (113.100). Existen metodos similares disponibles para la medicion de otros tipos de inactivadores de toxinas. En ciertos casos, la toxina alfa se transforma menos en

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toxoide deliberadamente en este punto con el fin de minimizar la desnaturalizacion de los epitopos criticos para el desarrollo de antitoxinas y, despues, se trata adicionalmente para la destoxificacion en un punto posterior del proceso. Tambien pueden usarse otros agentes quimicos o biologicos adecuados capaces de inactivar la toxina, tales como glutaraldehido, fenol, diversos detergentes tales como Triton X-100, dodecil sulfato de sodio (SDS) y alcoholes.

El toxoide alfa resultante puede almacenarse durante un periodo de tiempo antes de cualquier procesamiento adicional, sin efectos perjudiciales. Normalmente, un almacenamiento optimo es a 2-8 °C. Sin embargo, los toxoides clostridiales inactivados son extremadamente estables y tambien pueden almacenarse a una temperatura mas alta. Para periodos de almacenamiento de mas de 6 meses y a temperatura de mas de 8 °C, puede ser aconsejable volver a ensayar la potencia del toxoide mediante un ensayo de potencia de combinacion total (TCP) u otro ensayo inmunologico similar para determinar la estabilidad inmunogenica del toxoide.

Las celulas pueden retirarse del medio de cultivo inactivado mediante centrifugacion y/o filtracion para obtener el sobrenadante de toxoide. Retirar las celulas sirve para reducir la reactividad tisular que puede ser provocada por los componentes de la celula, mientras que, retirar los antigenos extranos de la preparacion ayuda a la respuesta inmunitaria a centrarse en el componente toxoide de la vacuna.

El medio de cultivo inactivado puede concentrarse mediante cualquiera de una serie de medios, incluyendo la ultrafiltracion (preferentemente usando membranas de ultrafiltracion de no mas de un limite de peso molecular de 30.000) o mediante liofilizacion. El proceso de concentracion puede incluir la diafiltracion frente a una solucion acuosa (por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfato) con el fin de retirar los contaminantes de bajo peso molecular de la preparacion. El liquido concentrado puede volverse a tratar una o mas veces, ya sea con formaldehido y/o calor hasta que un ensayo adecuado indique que el liquido esta libre de toxicidad residual. Dichos ensayos incluyen un bioensayo en ratones, es decir, inyectar el liquido en ratones y observar su efecto sobre los ratones; o la medicion de la actividad de la hemolisina o de la actividad de la lecitinasa, etc.

El pH de la solucion puede tener que ajustarse antes de la mezcla para asegurar una union optima a los adyuvantes, la emulsion con aceites y/o la estabilidad de la solucion. El punto isoelectrico (pl) de la toxina alfa es de aproximadamente 5,5 [Smith et al., The Pathogenic Anaerobic Bacteria, (3a Ed.) Charles Thomas Publishers, pag. 116 (1984)]. El ajuste del pH de la solucion del toxoide alterara la carga neta de la proteina, lo que es ventajoso para la potenciacion de la union a ciertos adyuvantes, tales como los adyuvantes de aluminio. El pH tambien puede ajustarse a un nivel que aumente la estabilidad del toxoide alfa para su almacenamiento durante un periodo prolongado de tiempo. Por ejemplo, las proteinas son mas propensas a separarse por precipitacion de la solucion en su pl, pero por lo general son estables a 1 unidad de pH por encima o por debajo de este valor.

Acidos nucleicos que codifican los polipeptidos de la presente invencion

Puede usarse un acido nucleico, tal como un ADNc, que codifique un polipeptido de la presente invencion, para generar celulas hospedadoras bacterianas recombinantes que expresen una proteina y/o antigeno de la presente invencion, por ejemplo, la toxina alfa. Dichas celulas hospedadoras recombinantes pueden inactivarse, es decir, convertirse en bacterinas y usarse en composiciones inmunogenicas tales como vacunas.

Ademas, la obtencion y/o la construccion de un acido nucleico que codifique un polipeptido de la presente invencion, incluyendo los que codifiquen una toxina alfa de la presente invencion, pueden facilitar la produccion de la toxina alfa o el toxoide alfa. La toxina alfa o el toxoide alfa son utiles para la fabricacion de ciertas vacunas de la presente invencion.

En consecuencia, la presente invencion incluye construcciones de acido nucleico que permiten la expresion y el aislamiento de las proteinas de la presente invencion. Las secuencias para dichos acidos nucleicos y las proteinas recombinantes correspondientes de los antigenos que se usen en este aspecto de la presente invencion son bien conocidos para el experto en la materia. Una pequena muestra de los antigenos que pueden usarse en las vacunas de la presente invencion, junto con su numero de referencia de GenBank y un articulo cientifico que desvela sus secuencias de aminoacidos se proporcionan a continuacion.

EJEMPLOS DE ANTIGENOS QUE PUEDEN USARSE EN VACUNAS

FUENTE del antiaeno

N.° DE REFERENCIA ARTfCULO

C. PERFRINGENS

toxina alfa

CAA35186 Saint-Joanis et al., Mol. Gen. Genet. 219 (3): 453-460 (1989)

toxina beta

CAA58246 Steinthorsdottir et al., FEMS Microbiol. Lett. 130 (2-3): 273-278 (1995)

toxina beta 2

NP_150010 Shimizu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (2): 996-1001 (2002)

enterotoxina

BAE79112 Miyamoto et al., J. Bacteriol. 188 (4): 1585-1598 (2006)

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toxina epsilon

AAA23236 Havard et al., FEMS Microbiol. Lett. 97: 77-82 (1992)

toxina iota

CAA51959 Perelle et al., Infect. Immun. 61 (12): 5147-5156 (1993)

toxina kappa

NP_561089 Shimizu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (2): 996-1001 (2002)

toxina lambda

CAA35187 Saint-Joanis et al., Mol. Gen. Genet. 219 (3): 453-460 (1989)

toxina teta

NP_561079 Shimizu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (2): 996-1001 (2002)

C. DIFFICILE

toxina A

A37052 Wren et al., FEMS Microbiol. Lett. 70: 1-6 (1990)

toxina B

CAA43299 von Eichel-Streiber et al., Mol. Gen. Genet. 233: (1-2), 260-268 (1992)

C. SEPTICUM

toxina alfa

AAB32892 Ballard et al., Infect. Immun. 63 (1): 340-344 (1995)

C. NOVYI

toxina alfa

AAB27213 Ball et al., Infect. Immun. 61 (7): 2912-2918 (1993)

Los acidos nucleicos que codifican antigenos de protemas que pueden usarse en las vacunas de la presente invention pueden contener, ademas, secuencias de nucleotidos heterologas. Para expresar una proteina recombinante de la presente invencion en una celula hospedadora, puede construirse un vector de expresion que comprenda el ADNc correspondiente. La presente invencion, por tanto, incluye los vectores de expresion que contienen acidos nucleicos que codifican proteinas recombinantes de la presente invencion, incluyendo las variantes de los mismos.

Debido a la degeneration de las secuencias codificantes de nucleotidos, pueden usarse en la practica de la presente invencion otras secuencias de nucleotidos que codifiquen sustancialmente la misma secuencia de aminoacidos que un acido nucleico que codifica un polipeptido de la presente invencion. Estas incluyen, pero no se limitan a, genes alelicos, genes homologos de otras cepas y/o los que estan alterados por la sustitucion de diferentes codones que codifican el mismo resto de aminoacido dentro de la secuencia, produciendo de este modo un cambio silencioso. Tambien se incluyen las celulas hospedadoras que comprenden los vectores de expresion de la presente invencion. Una celula hospedadora empleada habitualmente, es una celula de E.coli.

Se han descrito metodos generales para la donation de los ADNc y la expresion de sus proteinas recombinantes correspondientes [vease Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A laboratory Manual, 3a edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor L.I. (2000)].

Ademas, puede usarse cualquier tecnica para mutagenesis conocida en la tecnica para modificar una toxina alfa nativa de la presente invencion, incluyendo pero no limitada a, la mutagenesis dirigida al sitio in vitro [Hutchinson et al., J. Biol. Chem., 253:6551 (1978); Zoller y Smith, DNA, 3:479-488 (1984); Oliphant et al, Gene, 44:177 (1986); Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83:710 (1986); Wang y Malcolm, Bio Techniques 26:680-682 (1999)]. Tambien pueden emplearse el uso de enlazadores TAB (Pharmacia), etc. y tecnicas de pCr, para la mutagenesis dirigida al sitio [vease Higuchi, "Using PCR to Engineer DNA", en PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Capitulo 6, pags. 61-70 (1989)].

Polipeptidos de la presente invencion

La presente invencion incluye polipeptidos aislados y/o recombinantes, incluyendo, las toxinas alfa y los toxoides alfa de la presente invencion, variantes de cepas de los mismos y proteinas de fusion de los mismos. Ademas, tambien estan incluidos en la presente invencion los polipeptidos que contienen secuencias alteradas en las que residuos de aminoacidos funcionalmente equivalentes son sustituidos por los de secuencia de aminoacido de tipo silvestre dando como resultado una sustitucion conservadora de aminoacidos.

Por ejemplo, uno o mas de estos restos de aminoacidos dentro de la secuencia pueden sustituirse por otro aminoacido de una polaridad similar, que actua como un equivalente funcional, dando como resultado una alteration silenciosa. Los sustitutos para un aminoacido dentro de la secuencia pueden seleccionarse entre otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoacido.

Por ejemplo, los aminoacidos no polares incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina. Los aminoacidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteina, tirosina, aspar agine y glutamina. Los aminoacidos cargados positivamente (basicos) incluyen lisina y arginina. Los aminoacidos cargados negativamente (acidos) incluyen acido aspartico y acido glutamico.

Los intercambios de aminoacidos conservados particularmente preferidos son:

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a) Lys por Arg o viceversa de manera que pueda mantenerse una carga positiva;

b) Glu por Asp o viceversa de manera que pueda mantenerse una carga negativa;

c) Ser por Thr o viceversa de manera que pueda mantenerse un -OH libre;

d) Gin por Asn o viceversa de manera que pueda mantenerse un NH2 libre; y

e) Ile por Leu o por Val o viceversa como aminoacidos hidrofobos aproximadamente equivalentes.

Todos los polipeptidos de la presente invencion pueden ser parte de una proteina de fusion. En una realization especifica, un polipeptido de fusion se expresa en una celula procariota. Dicha proteina de fusion puede usarse por ejemplo, para potenciar la antigenicidad de un antigeno para reducir o eliminar su toxicidad sin negar su antigenicidad, o para aislar un antigeno de la presente invencion. El aislamiento de la proteina de fusion en el ultimo caso puede facilitarse mediante el uso de una columna de afinidad que es especifica para la proteina/peptido fusionado al antigeno. Dichas proteinas de fusion incluyen: una proteina de fusion de glutation-S-transferasa (GST), una proteina de fusion de proteina de union a maltosa (MBP), una proteina de fusion marcada con FLAG o una proteina de fusion marcada con poli-histidina. Tambien pueden ser parte de una proteina de fusion secuencias de union especificas, tales como un enlazador Ser-Gly.

De hecho, la expresion de un polipeptido de fusion puede facilitar la expresion estable y/o permitir la purification basada en las propiedades del companero de fusion. Por tanto, la purificacion de los polipeptidos recombinantes de la presente invencion puede simplificarse a traves del uso de proteinas de fusion que tienen marcadores de afinidad. Por ejemplo, la GST une un conjugado de glutation a una matriz de soporte solido, la MBP se une a una matriz de maltosa y los quelatos de poli-histidina a una matriz de soporte de quelacion de Ni [vease Hochuli et al., Biotechnology 6:1321-1325 (1998)].

La proteina de fusion puede eluirse de la matriz especifica con tampones apropiados o mediante el tratamiento con una proteasa que sea especifica para un sitio de escision que se ha modificado por ingenieria genetica entre una toxina alfa, por ejemplo, y su pareja de fusion. Como alternativa, una toxina alfa puede combinarse con una proteina marcadora tal como la proteina fluorescente verde [Waldo et al., Nature Biotech. 17:691-695 (1999); Patente de los EE.UU. N.° 5.625.048 y documento WO 97/26333].

Como alternativa o ademas, pueden utilizarse otras etapas de cromatografia en columna (por ejemplo, la filtration en gel, el intercambio ionico, la cromatografia de afinidad, etc.) para purificar los polipeptidos naturales o recombinantes de la presente invencion (vease a continuation). En muchos casos, dichas etapas de cromatografia en columna emplean la cromatografia liquida de alto rendimiento o metodos analogos en lugar de procedimientos mas clasicos basados en la gravedad.

Ademas, los polipeptidos de la presente invencion, incluyendo las toxinas alfa pueden sintetizarse quimicamente [vease, por ejemplo, Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman & Co., Nueva York, Nueva York, pags. 382, Grant, ed. (1992)].

Procedimientos generates de purificacion de polipeptidos

En general, las etapas iniciales para la purificacion de un polipeptido de la presente invencion pueden incluir la disolucion de proteinas por adicion de sal o la precipitation de proteinas por adicion de sal, por ejemplo, en fraccionamientos de sulfato de amonio; fraccionamientos de exclusion de disolvente, por ejemplo, una precipitacion en etanol. Ademas, puede usarse ultracentrifugacion de alta velocidad ya sea sola o junto con otras tecnicas de extraction.

En general, las buenas etapas secundarias de aislamiento o purificacion incluyen la absorcion en fase solida usando gel de fosfato de calcio, hidroxiapatita o la union en fase solida. La union en fase solida puede realizarse a traves de un enlace ionico, ya sea con un intercambiador anionico, tal como dietilaminoetil (DEAE) o dietil[2- hidroxipropil]aminoetil (QAE) SEPHADEX o celulosa; o con un intercambiador cationico tal como carboximetil (CM) o sulfopropil (Sp) SEPHADEX o celulosa. Los medios alternativos de union en fase solida incluyen el aprovechamiento de las interacciones hidrofobas, por ejemplo, el uso de un soporte solido tal como fenilSepharose y un tampon de alta concentration de sal; inmuno-union por union de afinidad, usando, por ejemplo, un anticuerpo-toxina alfa unido a un soporte activado. Otros soportes de fase solida incluyen los que contienen colorantes especificos o lectinas etc.

Una tecnica de soporte en fase solida adicional que a menudo se usa al final del procedimiento de purificacion se basa en la exclusion por tamano, tal como los geles SEPHADEX y SEPHAROSE. Como alternativa, puede emplearse una tecnica de membrana a presion o centrifuga, usando filtros de membrana de exclusion por tamano. Con frecuencia, estas dos metodologias se utilizan en tandem.

Las separaciones de soporte en fase solida generalmente se realizan por lotes con centrifugation a baja velocidad o mediante cromatografia en columna. La cromatografia liquida de alta resolution (HPLC), incluyendo las tecnicas relacionados como la FPLC, es actualmente el medio mas comun para realizar la cromatografia liquida. Tambien pueden realizarse tecnicas de exclusion por tamanos con la ayuda de la centrifugacion a baja velocidad. Ademas, pueden emplearse tecnicas de penetration por tamano tales como las tecnicas electroforeticas en gel. Estas

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tecnicas se realizan generalmente en tubos, planchas o mediante electroforesis capilar.

Casi todas las etapas que implican la purificacion de polipeptidos emplean una solucion tamponada. A menos que se especifique lo contrario, generalmente se usan concentraciones 25-100°mM de sales tampon. Los tampones de baja concentracion generalmente implican concentraciones 5-25°mM. Los tampones de alta concentracion en general implican concentraciones del agente tampon de entre concentraciones 0,1-2,0 M. Los tampones tipicos pueden adquirirse en la mayoria de los catalogos bioqmmicos e incluyen los tampones clasicos tales como Tris, pirofosfato, monofosfato y difosfato y los tampones Good tales como Mes, Hepes, Mops, Tricina y Ches [Good et al., Biochemistry, 5:467 (1966); Good e Izawa, Meth. Enzymol., 24B:53 (1972); y Fergunson y Good, Anal. Biochem., 104:300 (1980)].

Los materiales para realizar todas estas tecnicas estan disponibles en diversas fuentes comerciales tales como Sigma Chemical Company en San Luis, Misuri.

Componentes de la vacuna

Toxoide alfa de C. perfrinaens: En realizaciones particulares, es ventajoso que la vacuna animal contenga la cantidad minima de toxoide alfa requerida para la protection frente a la enteritis necrotica. Se determino que ese nivel era de 2 unidades de potencia de combination total (TCP) por dosis en las condiciones particulares que se ejemplifican a continuation. Las unidades de TCP se establecen sobre la base de normas internacionales [Batty, Toxin-Antitoxin Assay, Methods in Microbiology, Capitulo 8, Volumen 5A (1971) ed. JR Norris y DW Ribbons] y las vacunas de la presente invention pueden mezclarse facilmente para que tengan la potencia deseada. Pueden usarse menos de 2 unidades de TCP, incluso en estas condiciones, si la vacuna comprende adicionalmente estimulantes inmunitarios. En cualquier caso, es preferible que la vacuna induzca 4 o mas unidades de antitoxina por ml de sueros animales.

Cuantificacidn del toxoide alfa: Generalmente es deseable para cuantificar el toxoide alfa asegurar que los niveles optimos esten incluidos en la vacuna. Un metodo convencional de cuantificacion de toxoides emplea el ensayo de potencia de combinacion total (TCP). En este ensayo, un volumen especifico del sobrenadante de toxoide alfa se pone en contacto con una cantidad conocida de unidades de antitoxina. Despues de proporcionar un periodo de incubation adecuado para permitir que la antitoxina y toxoide alfa se unan, por ejemplo, 0,5-2 horas, se anade una cantidad conocida de la toxina alfa. Despues, se proporciona a la antitoxina libre restante un periodo adecuado para unirse a la toxina alfa. Despues, la cantidad de toxina alfa libre se determina mediante la adicion a la solucion de un sustrato para la actividad fosfolipasa C de la toxina alfa. Los sustratos adecuados incluyen los globulos rojos (en particular, los globulos rojos de oveja) y la lecitina. Despues, puede cuantificarse el toxoide alfa, a traves de un calculo basado en la cantidad de actividad fosfolipasa C. Cuanto mayor es la cantidad de toxoide alfa presente en la solucion de ensayo, mayor es la cantidad de actividad fosfolipasa C medida en el ensayo. Como alternativa, la determination puede hacerse sin la medicion de la actividad fosfolipasa C, por ejemplo, puede usarse cualquier analisis de union competitiva de anticuerpos, incluyendo la incorporation de una etapa de cromatografia, el ensayo por inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA) o el analisis de union competitiva mediante un instrumento Biacore o similares.

Antiaenos adicionales: Las enfermedades clostridiales con frecuencia se producen como infecciones mixtas y, por tanto, la adicion de otros toxoides clostridiales pueden reducir adicionalmente la patologia y los signos clinicos. Los ejemplos no limitantes de otros toxoides clostridiales de organismos que se sabe que provocan enteritis gastrica, incluyendo los del C. perfringens, que pueden anadirse a una vacuna de la presente invencion para aumentar la potencia frente a las infecciones mixtas incluyen: la toxina beta, la toxina beta 2, la toxina teta, la toxina epsilon, la enterotoxina, la toxina kappa, la toxina lambda y la toxina iota de C. perfringens; la toxina hemorragica (TH) y la toxina letal (TL) de C. sordellii, las toxinas A y B de C. difficile; la toxina alfa de C. septicum; y las toxinas alfa (A) y beta (B) de C. novyi.

Tambien pueden incluirse antigenos de otras bacterias, virus, hongos o parasitos en las vacunas de la presente invencion. Dichos antigenos incluyen otras toxinas o toxoides, bacterias y/o extractos de bacterias; hongos y/o extractos de hongos; virus y/o proteinas virales; y/o parasitos o proteinas de parasitos. Los antigenos virales, bacterianos y parasitarios apropiados de las fuentes proporcionadas en el presente documento son bien conocidos en la tecnica.

Son ejemplos no limitantes de organismos bacterianos: Escherichia coli, Campylobacter spp., Pasteurella spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Clamidia, Erisipela spp.. Pasteurella, Bordetella y Ornithobacterium.

Son ejemplos no limitantes de toxinas relacionadas: el lipopolisacarido (LPS) de bacterias gramnegativas, que se sabe que potencia la respuesta inmunologica de las vacunas y, por tanto, mejora la production de antitoxinas frente la toxina alfa de C. perfringens y a las micotoxinas.

Son ejemplos no limitantes de virus apropiados: Coronavirus, Rotavirus, Astrovirus, virus similar al Enterovirus, Torovirus, Adenovirus, Reovirus, Birnavirus, Herpesvirus, Paramixovirus, Picornavirus, virus de la enfermedad de

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Marek, virus de la enteritis hemorragica y virus de la enfermedad de Newcastle.

Son ejemplos no limitantes de parasitos: Coccidios, las especies de Eimeria por ejemplo y Criptosporidios, [vease, documento US 2004/0018215A1].

Adyuvantes

Los adyuvantes tambien son utiles para mejorar la respuesta inmunitaria y/o aumentar la estabilidad de las preparaciones de vacunas. Los adyuvantes se describen normalmente como estimulantes no espedficos del sistema inmunitario, pero tambien pueden ser utiles para la direccion a ramas especificas del sistema inmunitario. Pueden anadirse a la vacuna uno o mas compuestos que tengan esta actividad. Por tanto, vacunas particulares de la presente invencion comprenden adicionalmente un adyuvante. Los ejemplos de compuestos quimicos que pueden usarse como adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, compuestos de aluminio (por ejemplo, hidroxido de aluminio), aceites metabolizables y no metabolizables, aceites minerales incluyendo derivados de oleato de manida en solucion de aceite mineral (por ejemplo, MONTANIDE ISA 70 de Seppic SA, Francia) y aceites minerales ligeros tales como DRAKEOL 6VR, polimeros de bloques, ISCOM (complejos estimulantes del sistema inmunitario), vitaminas y minerales (incluyendo pero no limitados a: vitamina E, vitamina A, selenio y vitamina B12) y CARBOPOL®.

Otros adyuvantes adecuados, que a veces se han denominado estimulantes inmunitarios, incluyen, pero no se limitan a: citocinas, factores de crecimiento, quimiocinas, sobrenadantes de cultivos celulares de linfocitos, monocitos, celulas de los organos linfoides, preparaciones de celulas y/o extractos de plantas, bacterias o parasitos (preparaciones de Staphylococcus aureus o lipopolisacarido) o mitogenos.

Generalmente, un adyuvante se administra al mismo tiempo que un antigeno de la presente invencion. Sin embargo, los adyuvantes pueden tambien, o como alternativa, administrarse en un periodo de dos semanas antes de la vacunacion y/o durante un periodo de tiempo despues de la vacunacion, es decir, mientras que el antigeno, por ejemplo, un toxoide alfa, persista en los tejidos.

Preparacion de vacunas

Tambien se proporcionan procesos para la fabricacion de las vacunas de la presente invencion. En una realization, la vacuna comprende mezclar una combination segura e inmunologicamente eficaz de un antigeno de la presente invencion, por ejemplo, un sobrenadante de toxoide alfa de un solo tipo de C. perfringens, y un adyuvante farmaceuticamente aceptable. La cantidad de toxoide alfa puede cuantificarse para contener al menos 2 unidades de potencia de combinacion total (TCP) por dosis de la vacuna. El sobrenadante de toxoide alfa puede concentrarse para minimizar el tamano de la dosis requerida para obtener al menos 4,0 unidades de antitoxina (U.A.) por ml de antisueros de un animal vacunado. La adicion de otros agentes de modulation inmunitaria farmaceuticamente aceptables puede reducir el requisito de TCP para que caiga por debajo de 2 unidades por dosis, mientras que la vacunacion aun de como resultado el requisito de 4,0 U.A. de anticuerpo anti-toxina alfa por ml de antisueros de los animales vacunados. En ciertas realizaciones, el toxoide alfa de C. perfringens se purifica adicionalmente a partir de los sobrenadantes de toxoide alfa mediante tecnicas tales como, pero no limitadas a, la concentracion/ultrafiltracion, la cromatografia y la centrifugation.

Administracion de las vacunas

Las vacunas pueden administrarse en forma de un liquido, emulsion, polvo seco y/o en una niebla a traves de cualquier via parenteral, por via intravenosa, intraperitoneal, intradermica, mediante escarificacion, por via subcutanea, intramuscular, o inocularse por una via mucosa, por ejemplo, por via oral, por via intranasal, en forma de un aerosol, mediante un colirio, mediante la administracion en el huevo, o implantarse en forma de un polvo secado por congelacion.

Sujetos animales

La expresion "sujeto animal" se refiere a una especie animal capaz de ser infectado por una bacteria patogena y en una realizacion particular incluye a los seres humanos. Los sujetos animales apropiados tambien incluyen los silvestres, los animales de granja (por ejemplo, los criados para carne, leche, mantequilla, huevos, piel, cuero, plumas y/o lana), las bestias de carga, los animales de investigation, los animales de compania, asi como los criados para/en parques zoologicos, habitats silvestres y/o circos.

En una realizacion particular, un sujeto animal de la invencion es un animal de "production de alimentos". Para los fines de la presente invencion, se entiende que la expresion animal de "produccion de alimentos" incluye todos los animales criados para su consumo (por ejemplo, pavos, pollos de engorde) o para articulos de consumo (por ejemplo, vacas lecheras, gallinas ponedoras y similares) por los seres humanos y/u otros animales. Una lista no limitante de dichos animales incluye aves, tales como aves de corral, es decir, pollos, pavos, gansos, patos, avestruces, etc., bovinos (por ejemplo, vacas, vacas lecheras, bufalo), ovinos (por ejemplo, cabras u ovejas),

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porcinos (por ejemplo, cerdos, jabalies o puercos) y equinos (por ejemplo, caballos). etc.

En otra realization, el sujeto animal es un animal de compania. Para los fines de la presente invention, se entiende que la expresion animal "de compania" incluye gatos domesticos (felinos), perros (caninos), especies de conejos, caballos (equinos), roedores (por ejemplo, cobayas, ardillas, ratas, ratones, jerbos y hamsteres), primates (por ejemplo, monos) y aves, tales como los pichones, las palomas, los loros, los guacamayos, los canarios y similares.

Tambien se considera que otros animales se beneficien de las vacunas de la invencion, incluyendo los marsupiales (tales como los canguros), los reptiles (tales como las tortugas de granja), las aves de caza, los cisnes, los ratites y otros animales domesticos economicamente importantes.

Los siguientes ejemplos estan destinados a la ejemplificacion de la presente invencion solamente y no debe interpretarse que limiten el alcance de la invencion de ninguna manera.

Ejemplos

EJEMPLO 1

EFICACIA DE LA VACUNA EN LAS GALLINAS DE ENGORDE VACUNADAS POR VIA SUBCUTANEA

Sumario

La vacunacion de gallinas de engorde por una via subcutanea con una vacuna que comprende un toxoide alfa de un solo tipo de C. perfringens (tipo A) da como resultado (i) una respuesta inmunogenica en las gallinas de engorde vacunadas, (ii) anticuerpo anti-toxoide alfa significativo en los huevos de las gallinas de engorde vacunadas y (iii) protection pasiva de la descendencia nacida posteriormente de las gallinas de engorde vacunadas.

Materiales

Toxoide alfa de C. Perfringens de tipo A: el toxoide alfa de C. Perfringens de tipo A se prepara de la siguiente manera: un cultivo de C. perfringens tipo A se hace crecer en condiciones anaerobicas en un fermentador a gran escala (5000 l) a una temperatura de 37 °C ± 2. Durante la fermentation se anade hidroxido de sodio con el fin de mantener un pH de 7,8 ± 2. Tambien se anade un carbohidrato (dextrina) durante la fermentacion (hasta el 1 % p/v) para promover el crecimiento. El cultivo se deja crecer durante 3-6 horas. Al final del periodo de crecimiento, se anade una solution de formaldehido al fermentador a un nivel final que no exceda del 0,5 %. Las celulas se retiran mediante centrifugation y el sobrenadante resultante se filtra con un filtro de profundidad que tiene tamanos de poro en el intervalo de 0,25-2,0°|jm. La temperatura se mantiene a 5 °C ± 3 °C durante este proceso. Despues, el sobrenadante del cultivo inactivado se diafiltra y se concentra de 10 a 30 veces usando ultrafiltracion con filtros no mayores que el limite de peso molecular de 20.000. El sobrenadante concentrado se almacena a 2-8 °C para la futura mezcla en vacunas. Antes de la mezcla, el sobrenadante concentrado se ensaya para determinar la potencia mediante el uso del ensayo de potencia de combination (TCP) descrito anteriormente. La potencia de cada lote de toxoide se asigna en unidades de TCP por ml.

Vacuna: El sobrenadante que comprende el toxoide alfa de C. Perfringens de tipo A inactivado se mezcla en forma de una emulsion agua-en-aceite que contiene 4 unidades de potencia de combinacion (TCP) por ml. La emulsion se prepara con una fase de aceite del 70 % y una fase acuosa del 30 %.

La fase oleosa se prepara de la siguiente manera:

Aceite mineral 89,20 %

Span 80 10,00 %

Alcohol bencilico 0,75 %

Trietanolamina 0,05 %

La fase acuosa se prepara de la siguiente manera:

Toxoide de C. perfringens de tipo A + solucion salina 88 %

Tween 80 al 33 %/solucion salina 12 %

Se anade lentamente un total de un 30 % de fase acuosa al 70 % de la fase oleosa y se emulsionaron con un homogeneizador Silverson. (Tambien pueden usarse otros homogeneizadores similares). El tiempo de homogeneizacion depende del volumen de la emulsion y se determina por la viscosidad, el tamano de particula y la estabilidad de la emulsion durante al menos tres dias a 37 °C. Se anade gentamicina a la fase acuosa para proporcionar una concentration final de hasta 30 jg/ml de volumen en serie. Se anade timerosol a la fase acuosa para proporcionar una concentracion final de hasta el 0,01 % del volumen en serie.

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Vacunacion: Las pollas se vacunan por via subcutanea con 0,5 ml por dosis de la vacuna mezclada. La primera dosis de vacuna se administra a las 14 semanas de edad y la segunda dosis se administra a las 20 semanas de edad. Se vacunan veinte pollas de engorde con la vacuna mezclada descrita anteriormente que contiene 1 TCP por dosis. Se vacuna un segundo grupo de veinte pollas con la vacuna mezclada descrita anteriormente que contiene 2 TCP por dosis. Un tercer grupo de veinte pollas se usa como control y no se vacuna. Se mezclan un total de 2-3 gallos con cada grupo de pollas para producir huevos fertilizados.

Inmunidad pasiva

Se recogen huevos de gallinas vacunadas y de control de 32, 52, 65 semanas de edad. Los polluelos de la progenie que eclosiona de estos huevos se usa para evaluar la proteccion pasiva como se enumeran en la Tabla 1.

TABLA 1

NUMERO DE POLLUELOS DE LA PROGENIE USADOS EN CADA PUNTO TEMPORAL

Edad de las Gallinas

Polluelos de la progenie en el grupo vacunado Polluelos de la progenie en el grupo de control de la exposicion

32 semanas

9 9

52 semanas

30 20

65 semanas

14 18

Los polluelos son alimentados con una dieta no medicada rica en proteinas durante las dos primeras semanas y despues se cambian a la alimentacion normal durante el resto del ensayo. Cada ave se expone por via oral a una cepa virulenta de C. perfringens de tipo A que expresa tanto la toxina alfa como la toxina beta 2. La dosis de exposicion contiene de 6,3 * 107 a 6,3 * 108 unidades formadoras de colonias por ml, en una dosis de 3 ml. Las aves se exponen durante 3 dias consecutivos a partir de los 18 o 19 dias de edad. Dos dias despues del ultimo dia de la exposicion a las aves se sacrifican y despues se examinan para determinar las lesiones de enteritis necrotica. Los resultados de eficacia para los polluelos de la progenie se enumeran en las Tablas 2-4, que representa el estado de vacunacion de la madre del polluelo individual y el grado de sus lesiones de enteritis necrotica, en su caso, de acuerdo con la escala de clasificacion que se proporciona a continuacion. La Tabla 2 representa los polluelos de la progenie de las gallinas de 32 semanas de edad, la Tabla 3 representa los polluelos de la progenie de las gallinas de 52 semanas de edad y la Tabla 4 representa los polluelos de la progenie de las gallinas de 65 semanas de edad. La Tabla 5 muestra la mediana de la puntuacion para los polluelos de la progenie de gallinas que fueron vacunadas con 2 TCP por dosis. Como se muestra, la progenie de las gallinas vacunadas esta protegida significativamente frente a la exposicion bacteriana administrada con respecto a la progenie de gallinas sin vacunar.

Escala de clasificacion de las lesiones de enteritis necrotica (EN)

0 = No hay lesiones macroscopicas de enteritis necrotica en el intestino delgado; el intestino tiene la elasticidad

normal (se enrolla de nuevo sobre si mismo despues de haber sido abierto).

1 = Pared intestinal delgada y flacida (el intestino permanece plano cuando se abre y no se enrolla de nuevo a su

posicion normal); moco en exceso o engrosado que cubre la membrana mucosa o leve enrojecimiento focal o multifocal de la mucosa o congestion de los vasos de la serosa.

2 = Una unica o pocas areas multifocales de enrojecimiento e inflamacion de la pared intestinal; una unica o pocas

areas multifocales de ulceracion o necrosis de la mucosa intestinal.

3 = Areas multifocales extensas de necrosis y ulceracion de la mucosa intestinal ± hemorragia significativa o capa de

fibrina o restos necroticos sobre la superficie de la mucosa (aspecto de toalla turca).

4 = Animales muertos con lesiones macroscopicas de enteritis necrotica puntuados con 2 o superior.

TABLA 2

PUNTUACIONES DE LESIONES DE ENTERITIS NECR6TICA EN POLLUELOS DE LA PROGENIE

______________________INDIVIDUALES DE GALLINAS DE 32 SEMANAS DE EDAD______________________

Controles no vacunados no Controles de exposicion no Vacuna con 1 TCP por Vacuna con 2 TCP por expuestos vacunados dosis dosis

0

1 4 1

0

2 1

0

0

1 2

0

0

1 1 1

2 1 0

3 3 1

3 0 1

1 4 1

4 1 4

3

1

1

1

Media = 0

2,0 1,8 1,0

Mediana = 0

2,0 1,0 1,0

TABLA 3

PUNTUACIONES DE LESIONES DE ENTERITIS NECR6TICA EN POLLUELOS DE LA PROGENIE INDIVIDUALES DE GALLINAS DE 52 SEMANAS DE EDAD

Controles no vacunados no expuestos

Controles de exposicion no vacunados Vacuna con 2 TCP por dosis

4 0

0

3 1

0

3 1

0

1 1

0

1

0

2 1

1 2

1 1

1 1

2 0

2 0

2 0

1 0

1 1

2 2

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1 1

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1 0

0

2

1

0

1

0

1

0

2

0

Media = 0

1, 7 0,6

Mediana = 0

1,5 0,5

TABLA 4

PUNTUACIONES DE LESIONES DE ENTERITIS NECR6TICA EN POLLUELOS DE LA PROGENIE

INDIVIDUALES DE GALLINAS DE 65 SEMANAS DE EDAD

Controles no vacunados no expuestos

Controles de exposicion no vacunados Vacuna con 2 TCP por dosis

0

4

0

0

0

0

0

0

0

0

2 2

0 2

0 0

3 0

3 3

2 0

0 2

3 0

2 0

0 0

0 0

0

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15

20

25

30

2

3

3

Media = 0

1,5 0,6

Mediana = 0

2,0 0,0

TABLA 5

MEDIANA DE LA PUNTUACION EN POLLUELOS DE LA PROGENIE DE GALLINAS VACUNADAS CON UNA

_______________________________________DOSIS DE 2 TCP______________________________________

MEDIANA DE LA PUNTUACION DE LESIONES DE ENTERITIS NECROTICA DE LA

_____________________PROGENIES DE LAS GALLINAS_____________________

GRUPOS DE 32 SEMANAS DE EDAD 52 SEMANAS DE EDAD 65 SEMANAS DE EDAD

TRATAMIENTO_________________

Grupo vacunado 1

Grupo de control 2

Titulos de anticuerpos

Suero: Se recogen muestras de sangre de las gallinas a las 33 y 78 semanas de edad. Se permite que la sangre coagule durante 2-4 horas a temperatura ambiente y despues se obtienen los sueros tras la centrifugacion. Los sueros se almacenan a -10 °C o menos hasta que se ensayan para determinar el titulo de anticuerpos. El titulo de anticuerpos para la toxina alfa de C. perfringens se evalua mediante un ensayo de inhibition de la hemolisis usando diluciones en serie y globulos rojos de oveja de la siguiente manera: se realizan diluciones en serie (factor de dilucion 2) en una placa de microtitulacion de fondo en V para cada muestra ensayada. Se anade una cantidad conocida de toxina alfa a cada pocillo que contiene una dilucion de la muestra. Despues, las placas se incuban durante una hora a 36 ± 2 °C para permitir que los anticuerpos obtenidos a partir de los sueros formen complejos con la toxina alfa. Despues de esta incubation, se anade una solution al 0,5 % de globulos rojos de oveja a los pocillos y las placas se incuban durante tres horas a 36 °C ± 2 °C para permitir que la toxina alfa que no formo complejo lise los globulos rojos. Despues, las placas se comprueban para determinar la ausencia de hemolisis. El reciproco de la dilucion mas alta de la muestra de ensayo que no muestra ninguna hemolisis se considera el punto final. Los titulos de anticuerpos se muestran en las Tablas 6-8.

Yemas de huevo: Las yemas de huevo se procesan para determinar el titulo de anticuerpos. En resumen, la yema se separa y se mezcla con tampon de extraction comercial (Sistema EGGstract Promega®, n.° de catalogo de Promega G1531 y G2610, Madison, Wisconsin). Despues de la extraccion, se obtiene un sedimento de IgY, que despues se vuelve a suspender en el volumen original de la yema con solucion salina tamponada con fosfato. Se agrupa el extracto de yema de huevo de al menos 5 huevos y se ensaya para determinar el titulo de anticuerpos mediante un ensayo de inhibicion de la hemolisis (IH) como se ha descrito para los sueros anteriormente. Las yemas de huevos recogidos de ponedoras a las 40, 52 y 65 semanas de edad se evaluan para determinar el titulo de anticuerpo de esta manera. Los titulos de anticuerpos de las yemas de huevo se muestran en la Tabla 9.

TABLA 6

TiTULO DE ANTICUERPOS DE SUERO DE GALLINA INDIVIDUAL PARA LA TOXINA ALFA DE C ______________________PERFRINGENS DE TIPO A, A LAS 33 SEMANAS DE EDAD______________________

Gallinas vacunadas (2 TCP/Dosis)_________________________Gallinas de control*

1024

1

8192

2

256

1

1024

2

1024

2

256

2

256

2

1024

2

512

1

64

1

Media geometrica = 588

Media geometrica < 2

* Los valores < 2 se consideraron como 1 con el fin de calcular la media geometrica

0,5 0

1,5 2

TABLA 7

TfrULO DE ANTICUERPOS DE SUERO DE GALLINA INDIVIDUAL PARA LA TOXINA ALFA DE C. PERFRINGENS _____________________________DE TIPO A, A LAS 78 SEMANAS DE EDAD_____________________________

Gallinas vacunadas (2 TCP/Dosis)

Gallinas de control*

512

2

32

2

128

2

512

2

128

1

16

1

1024

1

512

2

8192

2

128

4

64

2

512

8

64

16

1024

256

128

Media geometrica = 588

Media geometrica < 2

* Los valores < 2 se consideraron como 1 con

el fin de calcular la media geometrica

TABLA 8

MEDIA GEOMETRICA DEL TiTULO DE INHIBICI6N DE HEM6LISIS EN SUEROS DE

GALLINAS EN DIVERSOS PUNTOS TEMPORALES

GRUPOS DE TRATAMIENTO

TiTULO EN SUERO (EDAD A LA RECOLECCI6N DE LA

MUES 1 RA)

33 SEMANAS 78 SEMANAS

GRUPO VACUNADO (2 TCP/DOSIS)

588 235

GRUPO DE CONTROL

< 2 2

TABLA 9

TiTULO DE INHIBICI6N DE HEM6LISIS EN YEMAS DE HUEVOS DE GALLINAS RECOLECTADAS EN DIVERSOS PUNTOS TEMPORALES

GRUPOS DE TRATAMIENTO

TITULO EN YEMA DE HUEVO (EDAD A LA RECOLECCI0N

40 SEMANAS 52 SEMANAS 65 SEMANAS

GRUPO VACUNADO

515 2048 64

GRUPO DE CONTROL

< 2 2 < 2

EJEMPLO 2

EFICACIA DE LA VACUNA EN LAS GALLINAS DE ENGORDE VACUNADAS POR UNA ViA INTRAMUSCULAR

10

RUTA

5

Sumario

La vacunacion de gallinas de engorde por una via intramuscular usando una vacuna que comprende un toxoide alfa 15 de un solo tipo de C. perfringens (tipo A) tambien da como resultado (i) una respuesta inmunogenica en las gallinas

de engorde vacunadas, (ii) anticuerpo anti-toxoide alfa significativo en los huevos de las gallinas de engorde vacunadas y (iii) proteccion pasiva para la descendencia nacida posteriormente de las gallinas de engorde vacunadas.

20 Inmunidad pasiva

Se vacunan por via intramuscular un total de 14 pollas de engorde con dos dosis de 0,5 ml de la vacuna del Ejemplo 1 anterior, que contiene 2 TCP. Se usa como control un grupo adicional de 40 pollas. Se mezclan tres gallos con cada grupo de pollas, como se ha descrito anteriormente. La primera dosis de la vacuna se administra a las 10 25 semanas de edad y la segunda dosis se administra a las 23 semanas de edad. Los huevos se recogen de las

gallinas a las 32 semanas de edad y se eclosionan para determinar la proteccion pasiva de los polluelos de la progenie despues de una exposicion a C. perfringens experimental.

La Tabla 10 muestra la incidencia de enteritis necrotica y la mediana de la puntuacion para sus lesiones correspondientes segun se determina mediante la escala de clasificacion del Ejemplo 1 anterior, para los polluelos de la progenie de gallinas vacunadas y de control. La Tabla 11 muestra esa mediana de la puntuacion para las lesiones de enteritis necrotica para los polluelos de la progenie individuales. La Tabla 12 enumera los titulos de 5 anticuerpos frente a la toxina alfa de C. perfringens de tipo A de los polluelos de la progenie individuales, mientras que los titulos de anticuerpos para las yemas de los huevos recogidas de las gallinas vacunadas y de control a las 32 semanas de edad se proporcionan en la Tabla 13.

10

TABLA 10

INCIDENCIA DE LA ENFERMEDAD Y LA LESION DE ENTERITIS NECR6TICA

GRUPOS DE TRATAMIENTO

Numero de aves % de incidencia Mediana de la puntuacion Puntuacion media

GRUPO VACUNADO

8 0 (0/8) 0 0

GRUPO DE CONTROL

29 76 (22/29) 2 1,7

TABLA 11

PUNTUACIONES DE LESIONES DE ENTERITIS NECR6TICA EN POLLUELOS DE LA PROGENIE INDIVIDUALES

DE GALLINAS DE 32 SEMANAS DE EDAD

Controles no vacunados no expuestos

0

0

0

0

0

0

Media = 0 Mediana = 0

Controles de exposicion no vacunados

1

2

1

0

0

1

3

0

1

0

2

2

1

3

3

3

2

2

3

1

3

0

2

0

0

3 2

4 4

1,7

2,0

Vacuna con 2 TCP por dosis

0

0

0

0

0

0

0

0

0,0

0,0

TABLA 12

T^ULO DE ANTICUERPOS EN SUERO DE GALLINAS INDIVIDUALES A LAS 35 SEMANAS DE EDAD1

GALLINAS VACUNADAS

GALLINAS DE CONTROL2

(2 TCP/dosis)

128

1

512

1

65536

1

4096

1

1024

1

512

1

2048

1

1024

1

512

2

256

1

1024

1

128

1

256

1

256

1

1024

1

1024

2

64

32

681

2

2

1

2

1

1

2

2

2

1

2

32

1

2

1

1

2

1

1

1

Media geometrica = 681

<2

1 Anticuerpos frente a toxina alfa de C. perfringens tipo A medidos mediante el ensayo de inhibition de hemolisis

descrito en el Ejemplo 1 anterior. 2 Los valores geometrica.

< 2 se consideraron como 1 con el fin de calcular la media

TABLA 13

TiTULO DE ANTICUERPOS EN YEMAS DE HUEVOS RECOLECTADAS DE GALLINAS A LAS _____________________________32 SEMANAS DE EDAD____________________________

GRUPOS DE TRATAMIENTO TiTULO DE INHIBICI6N DE HEM6LISIS * 5

GRUPO VACUNADO 512

GRUPO DE CONTROL <2

5

EJEMPLO3

SEROLOGIA EN POLLAS LEGHORN BLANCAS SPF VACUNADAS POR VIA SUBCUTANEA

10 Titulos de anticuerpos

Se evaluan titulos de anticuerpos en pollas Leghorn blancas SPF (libres de patogenos espedficos, por sus siglas en ingles) que se vacunan por via subcutanea con la vacuna del Ejemplo 1 anterior, que contiene 1, 2 o 3 TCP. Las pollas se vacunan a las 15 semanas de edad con 0,5 ml de la vacuna y se administra una dosis de refuerzo 4

10

15

20

semanas despues de la vacunacion inicial. Se recogen muestras de sangre 6 semanas despues de la vacunacion de refuerzo. El suero de cada ave individual se evalua para determinar el trtulo de anticuerpos mediante el ensayo de inhibicion de hemolisis como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1.

TABLA14

TfrULO DE ANTICUERPOS DE SUERO DE POLLA INDIVIDUAL PARA LA TOXINA ALFA DE

C. PERFRINGENS DE TIPO A

1 TCP/DOSIS

2 TCP/DOSIS 3 TCP/DOSIS CONTROLES

Id. del ave

Titulo Id. del ave Titulo Id. del ave Titulo Id. del ave Titulo

923

4096 932 1024 922 1024 921 4

924

1024 938 8192 927 64 928 <2

925

4 940 512 931 2048 929 2

926

2048 942 1024 935 4096 933 2

930

512 943 2048 945 1024 937 2

941

1024 948 2048 947 2048 946 2

953

32 949 2048 952 1024 957 2

954

2 950 2048 956 128 966 <2

955

32 951 512 959 512

962

512 958 512 960 64

965

4096 961 512 963 2048

967

512 964 2048 968 2048

Media geometrica

242 1290 724 < 2

* Los titulos de < 2 se consideran como 1 para determinar la media geometrica del titulo

El titulo de anticuerpos en los huevos recogidos a las 25 semanas de edad de las ponedoras Leghorn blancas se evalua para determinar el titulo de inhibicion de hemolisis. Los resultados se tabulan en la Tabla 15.

TABLA 15

TiTULO DE ANTICUERPOS DE LA YEMA DE HUEVO AGRUPADA PARA LA TOXINA

ALFA DE C. PERFRINGENS DE TIPO A

GRUPO

VACUNA TiTULO DE ANTICUERPO

1

1 TCP 512

2

2 TCP 512

3

3 TCP 512

4

Controles < 2

DETERMINACION DEL TITULO DE NEUTRALIZACION DE TOXINA (TNT) EN SUEROS AGRUPADOS DE GALLINAS LEGHORN BLANCAS

Se evalua el titulo de antitoxina para la toxina alfa de C. perfringens de tipo A en el suero agrupado de las gallinas usando ratones. Los sueros agrupados se ensayan para determinar el titulo de antitoxina usando un metodo segun se describe en el Codigo de Regulaciones Federales, Servicio de Inspeccion de Salud Animal y Vegetal del Departamento de Agricultura de los EE.UU. Los metodos utilizados para medir la antitoxina fueron similares al 9 CFR §113.111 (c) actual, excepto por que se usan la toxina alfa y los reactivos de la antitoxina en lugar de la toxina beta y la antitoxina. Los siguientes reactivos de ensayo se usan para determinar el titulo de antitoxina:

1) Antitoxina alfa de C. perfringens de tipo A: IRP 426 (obtenida del Centro de Productos Biologicos Veterinarios, USDA) 2

2) Toxina alfa de C. perfringens de tipo A: IRP 446 (obtenida del Centro de Productos Biologicos Veterinarios, USDA).

En resumen, se combinan la antitoxina o los sueros patron diluidos con una cantidad conocida de toxina alfa patron. Despues, se detecta la presencia de toxina si neutralizar, mediante la inyeccion de la mezcla en ratones. Despues, se evalua la comparacion con los efectos de cantidades conocidas de antitoxina alfa patron sobre la actividad de la toxina, mediante la determinacion de la dilucion de sueros patron o de ensayo que protege a los ratones de la 5 muerte en un bioensayo. Los titulos de la antitoxina en la agrupacion de sueros de pollas Leghorn blancas son como se muestran en la Tabla 16 a continuacion.

TABLA16

TITULO DE NEUTRALIZACI6N DE TOXINA (TNT) EN POLLAS VACUNADAS Y DE

CONTROL

TITULO DE ANTITOXINA EN SUERO

GRUPO

VACUNA Pre-vacunacion Post-vacunacion

1

1 TCP <1 > 2 Y <4

2

2 TCP <1 > 4

3

3 TCP <1 > 4

4

Controles <1 <1

10 EJEMPLO4

SEROLOGIA EN POLLAS LEGHORN BLANCAS SPF VACUNADAS POR UNA VIA INTRAMUSCULAR

Se evaluan los trtulos de anticuerpos en pollas Leghorn blancas SPF (libres de patogenos especificos, por sus siglas 15 en ingles) que se vacunan dos veces por via intramuscular con la vacuna del Ejemplo 1 anterior, que contiene 1,2 o 3 TCP. Las pollas se vacunan a las diez semanas de edad con 0,5 ml de la vacuna y se proporciona una dosis de refuerzo cuatro semanas despues de la vacunacion inicial. Se recogen muestras de sangre siete semanas despues de la vacunacion de refuerzo. Los sueros de pollas individuales se evaluan para determinar el titulo de anticuerpos mediante un ensayo de inhibition de hemolisis como se ha descrito en el Ejemplo 1 anteriormente y se tabula en las 20 Tablas 17 y 18 a continuacion.

TABLA 17

TITULO DE ANTICUERPOS DE SUERO DE POLLA INDIVIDUAL PARA LA TOXINA ALFA DE C.

PERFRINGENS DE TIPO A

1 TCP

2 TCP 3 TCP Controles

Id. del ave

Titulo Id. del ave Titulo Id. del ave Titulo Id. del ave *Titulo

951

256 631 1024 646 4096 661 < 2

952

128 632 2048 647 4096 662 < 2

953

1024 633 2048 648 2048 663 8

954

128 634 256 649 2048 664 < 2

955

2048 635 128 650 4096 665 8

956

512 636 2048 651 2048 666 4

957

1024 637 512 652 2048 667 < 2

958

256 638 2048 653 1024 668 < 2

960

512 639 1024 654 4096 669 < 2

961

2048 640 2048 655 4096 670 < 2

962

1024 641 2048 656 4096 671 < 2

964

1024 642 1024 657 4096 672 < 2

965

256 643 1024 658 1024 673 16

644 512 660 1024 674 16

645

2048 966 4096 675 16

5

10

15

20

25

30

35

Media geometrica

540 1024 2580 3

* Los tttulos de < 2 se consideran como 1 para determinar la media geometrica del titulo

Se evalua el titulo de neutralizacion de toxina (TNT) en sueros agrupados de gallinas usando el procedimiento que se ha descrito en el Ejemplo 1 anterior y los resultados se proporcionan en la Tabla 18 a continuacion.

TABLA 18

TiTULO DE NEUTRALIZACI6N DE TOXINA (TNT) EN POLLAS VACUNADAS Y DE

CONTROL

TiTULO DE ANTITOXINA EN SUERO

GRUPO

VACUNA Pre-vacunacion Post-vacunacion

1

1 TCP <1 > 4

2

2 TCP <1 > 4

3

3 TCP <1 > 4

4

Controles <1 <1

Se evalua el titulo de anticuerpos en los huevos recogidos a las 25 semanas de edad de estas ponedoras Leghorn blancas para determinar el trtulo de inhibicion de hemolisis como se ha descrito en el Ejemplo 1 anterior. Los resultados se resumen a continuacion en la Tabla 19.

TABLA 19

TiTULO DE ANTICUERPOS DE LA YEMA DE HUEVO AGRUPADA PARA LA TOXINA

ALFA DE C. PERFRINGENS DE TIPO A

GRUPO

VACUNA TiTULO DE ANTICUERPO

1

1 TCP 512

2

2 TCP 256

3

3 TCP 512

4

Controles < 2

EJEMPLO 5

COMPARACI6N DE UNA VACUNA DE TOXOIDE ALFA DE C. PERFRINGENS MULTIVALENTE Y UNA MONOVALENTE EN CERDO

Sumario

Se describen metodos para proporcionar proteccion pasiva en cerdos neonatales mediante la vacunacion de las cerdas/puercas jovenes prenadas con las vacunas de toxoide alfa de C. perfringens de tipo A de la presente invention. Los resultados muestran una respuesta de anticuerpos en las cerdas que pueden transferirse a los lechones a traves del calostro.

Materiales

Toxoide alfa de C. perfringens de tipo A: se preparo toxoide alfa de C. perfringens de tipo A como se ha descrito en el Ejemplo 1 anteriormente.

Vacuna: Una vacuna de la presente invencion puede mezclarse con un toxoide alfa de C. perfringens de tipo A inactivado que contenga > 2 unidades de potencia de combination total. La vacuna puede mezclarse con cualquier adyuvante desvelado en el presente documento, incluyendo la emulsion aceite-en-agua que contiene aceites minerales, aceites vegetales (aceite de cacahuete, aceite de soja), escualeno, escualano y otros aceites metabolizables. Tambien pueden usarse otros adyuvantes tales como Seponin, CARBOPOL® y adyuvantes que contengan aluminio (hidroxido de aluminio, fosfato de aluminio) en la preparation de vacunas. La vacuna puede contener adicionalmente otros antigenos incluyendo E. coli (K88, K99, 987P, Tipo 1), toxoides de C. perfringens y/o toxoides de otras bacterias patogenas incluyendo el Clostridium difficile, el rotavirus y/o el Cryptosporidium.

5

10

15

20

25

30

Administracion

Las vacunas se administran a puercas jovenes/cerdas prenadas antes de parir ya sea por via intramuscular o subcutanea con el fin de proporcionar proteccion pasiva en los cerdos neonatales a traves de la ingestion de calostro.

Resultados

El estudio se realiza en cerdas de 32 semanas de edad comparando tres vacunas:

Vacuna n.° 1: mezclada con un adyuvante de hidroxido de aluminio que contiene 4 TCP de toxoide alfa de C. perfringens de tipo A en una dosis de 2 ml.

Vacuna n.° 2: mezclada con 4 TCP de toxoide alfa de C. perfringens de tipo A, E. coli K88, E. coli K99, E. coli 987P, E. coli de tipo 1 y toxoide beta de C. perfringens de tipo C en una dosis de 2 ml.

Vacuna n.° 3: preparada como una vacuna placebo que no contiene ningun toxoide alfa de C. perfringens de tipo A, pero que contiene E. coli k88, E. coli K99, E. coli 987P, E. coli de tipo 1 y toxoide beta de C. perfringens de tipo C en una dosis de 2 ml.

Se vacuna un grupo de diez cerdas por via intramuscular con 2 ml de vacuna n.° 1. Se vacuna un segundo grupo de diez cerdas por via intramuscular con 2 ml de vacuna n.° 2. El tercer grupo de siete cerdas se vacuna con 2 ml de vacuna n.° 3. Se proporciona una dosis de refuerzo de 2 ml 20 dias despues de la vacunacion inicial. Las muestras de suero se recogen en el momento de la vacunacion inicial (dia 0), 20 dias despues de la vacunacion de refuerzo (dia 40) y 41 dias despues de la vacunacion de refuerzo (dia 61). Despues, las muestras de suero se evaluan para determinar el trtulo de anticuerpo para la toxina alfa mediante el ensayo de inhibicion de hemolisis descrito en el Ejemplo 1 anterior. Los resultados para las tres vacunas se muestran individualmente en las Tablas 20-22, respectivamente.

TABLA 20

VACUNA MONOVALENTE DE TOXOIDE ALFA DE C. PERFRINGENS

DE TIPO A

Titulo de inhibicion de hemolisis

Cerda n.°

Dia 0 (Pre-vac) Dia 40 Dia 61

10268

32 256 256

10277

2 8 8

10278

16 32 32

10295

16 64 128

10307

16 64 128

10312

8 64 64

10316

2 16 16

10317

--- 64 64

10324

64 128 256

10331

16 32 32

Media geometrica

12 49 60

TABLA 21

VACUNA COMBINADA DE TOXOIDE ALFA DE C. PERFRINGENS DE TIPO A CON E. COLI- TOXOIDE BETA DE

C. PERFRINGENS DE TIPO C

Titulo de inhibicion de hemolisis

Cerda n.°

Dia 0 (Pre-vac) Dia 40 Dia 61

10264

16 64 64

10266

32 128 128

10269

2 32 32

10276

2 256 256

10280

8 32 32

10282

4 32 32

10287

16 64 64

10290

16 256 256

10321

16 128 64

10330

4 64 64

Media geometrica

8 79 74

TABLA 22

E. COLI- TOXOIDE BETA DE C. PERFRINGENS DE TIPO C

Titulo de inhibicion de hemolisis

Cerda n.°

Dia 0 (Pre-vac) Dia 40 Dia 61

Grupo 3

Dia 0 Dia 40 Dia 61

10272

4 32 32

10292

16 32 32

10303

2 16 16

10305

2 32 32

10313

8 8 8

10318

4 16 16

10319

4 64 64

Media geometrica

4 24 24

5 EJEMPLO 6

DETERMINACI6N DEL TITULO DE NEUTRALIZACldN DE TOXINA (TNT) EN SUEROS AGRUPADOS DE CERDAS VACUNADAS

10 Cuatro cerdas prenadas se dividen por igual en dos grupos de tratamiento. Un grupo se vacuna por via intramuscular con 2,0 ml de vacuna que contiene 4 TCP en una dosis de 2 ml de la Vacuna n.° 1 del Ejemplo 5 anterior. El otro grupo es el de los controles que no se vacunan. Las cerdas se vacunan aproximadamente a las 6-7 semanas antes del parir y se proporciona una dosis de refuerzo tres semanas mas tarde. Se recogen muestras de sangre antes de la vacunacion y justo antes del parto. La Tabla 23 muestra la evaluacion de las muestras de sueros 15 para determinar el titulo de antitoxina para la toxina alfa usando un ensayo de neutralizacion de toxina (TNT) como se ha descrito en el Ejemplo 3 anteriormente.

TABLA 23

mULO DE TNT

Grupo de tratamiento

Numero de cerda Pre-vacunacion (TNT) Post-vacunacion de refuerzo (TNT)

Vacunada

10614 <1 >4 <8

Vacunada

10616 <1 >4 <8

Control

10615 <2 <2

Control

10617 <1 <2

La presente invencion no debe limitarse en su alcance por las realizaciones espedficas descritas en el presente documento. De hecho, diversas modificaciones de la invencion, ademas de las descritas en el presente documento, 5 seran evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripcion anterior.

Debe entenderse, ademas, que todos los tamanos de bases o los tamanos de aminoacidos y todos los valores de peso molecular o masa molecular, proporcionados para los acidos nucleicos o polipeptidos son aproximados y se proporcionan para su descripcion.

10

Claims (13)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Una vacuna para un ave que comprende un antigeno toxoide alfa de C. perfringens de tipo A, en la que dicho antigeno tiene 2 o mas unidades de Potencia de Combinacion Total (TCP), a condicion de que solo este presente un antigeno toxoide alfa de un unico tipo de C. perfringens en dicha vacuna y en donde la vacuna comprenda un adyuvante, el adyuvante no sea un hidroxido de aluminio y el adyuvante este comprendido en una emulsion de agua-en-aceite junto con el antigeno.
2. 2. La vacuna de la reivindicacion 1, en la que el antigeno esta en una preparacion sin celulas.
3. 3. La vacuna de la reivindicacion 1, en la que el antigeno es un toxoide alfa en un sobrenadante de toxoide alfa de C. perfringens de tipo A.
4. 4. La vacuna de la reivindicacion 1, en la que el antigeno es un polipeptido recombinante.
5. 5. La vacuna de la reivindicacion 2, en la que dicho toxoide alfa se purifica a partir del sobrenadante de toxoide alfa por ultrafiltracion.
6. 6. La vacuna de las reivindicaciones 1 a 5, que es una vacuna multivalente que comprende ademas una o mas de las siguientes toxinas: toxina beta de C. perfringens, toxina beta 2 de C. perfringens, enterotoxina de C. perfringens, toxina epsilon de C. perfringens, toxina iota de C. perfringens, toxina kappa de C. perfringens, toxina lambda de C. perfringens, toxina teta de C. perfringens, toxina hemorragica de C. sordellii, toxina letal de C. sordellii, toxina A de C. difficile, toxina B de C. difficile, toxina alfa de C. septicum, toxina alfa de C. novyi y toxina beta de C. novyi.
7. 7. La vacuna de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende ademas uno o mas antigenos adicionales; en la que el antigeno adicional es de una o mas de las siguientes fuentes: virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa, virus de la bronquitis infecciosa, reovirus, virus de la enfermedad de Newcastle, E. coli, Salmonella, Campylobacter y Eimeria.
8. 8. La vacuna de las reivindicaciones 1-7 en la que la emulsion de agua-en-aceite se preparo con una fase oleosa del 70 % y una fase acuosa del 30 %.
9. 9. Una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1-8, para su uso en un metodo para proporcionar inmunidad pasiva frente a una enfermedad clostridial a la progenie de un ave hembra, comprendiendo dicho metodo la administracion de la vacuna al ave hembra antes de la puesta de los huevos que comprenden la progenie; en donde se proporciona a la progenie inmunidad pasiva.
10. 10. La vacuna de la reivindicacion 9 en donde el ave es un pollo o un pavo.
11. 11. La vacuna de la reivindicacion 10 en donde la enfermedad clostridial es una enfermedad enterica clostridial.
12. 12. La vacuna de la reivindicacion 11 en donde la enfermedad enterica clostridial es la enteritis necrotica.
13. 13. Un metodo de fabricacion de una vacuna de toxoide alfa de C. perfringens de tipo A que comprende:

    a) cultivar una celula de C. perfringens en un medio de cultivo para producir una cierta cantidad de celulas cultivadas; en donde dicha cantidad de celulas cultivadas secretan una toxina alfa de C. perfringens de tipo A en el medio celular;

    b) inactivar la toxina alfa secretada para producir un toxoide alfa de C. perfringens;

    c) retirar la mayor parte de la cantidad de celulas cultivadas del medio de cultivo para formar un sobrenadante de toxoide alfa de C. perfringens;

    d) ajustar la concentracion del sobrenadante de toxoide alfa de C. perfringens para que tenga 2 o mas TCP; y

    e) mezclar el sobrenadante de toxoide alfa de C. perfringens con una emulsion de agua-en-aceite.