BRPI0621800A2 - anticorpos monoclonais a fzd10 que têm como alvo tumores, e usos desses anticorpos - Google Patents

anticorpos monoclonais a fzd10 que têm como alvo tumores, e usos desses anticorpos Download PDF

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Katagiri Toyomasa
Nakatsuru Shuichi
Endo Keigo
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Oncotherapy Science, Inc.
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Abstract

ANTICORPOS MONOCLONAIS A FZDIO QUE TEM COMO ALVO TUMORES, E USOS DESSES ANTICORPOS. A presente invenção refere-se a um anticorpo ou um fragmento deste que é capaz de ligar-se a uma proteína homóloga encrespada 10 (FZDIO), tal como um anticorpo monoclonal de camundongo, um anticorpo quimérico e um anticorpo humanizado. Também, a presente invenção refere-se a um método para tratar e/ou prevenir doença associada a FZD1O, a um método para diagnose ou prognose de doença associada a FZDIO e a um método para formação de imagem in vivo de FZDIO em um indivíduo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPOS MONOCLONAIS A FZD10 QUE TÊM COMO ALVO TUMORES, E USOS DESSES ANTICORPOS".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO
Este pedido reivindica prioridade sob o Pedido Provisório Norte-americano N°. 60/815.257, depositado em 21 de junho de 2006. Todo o conteúdo do pedido acima é incorporado aqui em sua totalidade como referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um anticorpo ou um fragmento deste que é capaz de ligar-se a uma proteína homóloga encrespada 10 (FZD10), tal como um anticorpo monoclonal de camundongo, um anticorpo quimérico e um anticorpo humanizado. Também, a presente invenção re- fere-se a um método para tratar e/ou prevenir doença associada a FZD10; a um método para diagnose ou prognose de doença associada a FZD10; e a um método para formar in vivo imagem de FZD10 em um indivíduo. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Tem-se provado que anticorpos monoclonais contra moléculas específicas de câncer são úteis no tratamento de câncer (Harris, M. (2004). Lancet Oncol, 5, 292-302). Além de exemplos bem-sucedidos de aplicação clínica dos anticorpos humanizados ou quiméricos tais como trastuzumab (Baselga, J. (2004). Oncology, 61, Supl. 2 14-21), rituximab (Maloney, D.G. e outros (1997). Blood, 90, 2188-95) e bevacizumab (Ferrara, N. e outros (2004). Nat Rev Drug Discov, 3, 391-400) em câncer de mama, Iinfoma maligno e câncer do cólon, vários anticorpos monoclonais contra outros alvos moleculares estão em desenvolvimento e sendo avaliadas suas ati- vidades antitumor. Espera-se que esses anticorpos monoclonais propor- cionem uma esperança a pacientes que apresentam tumores que não possuem tratamento eficaz. Um dos outros importantes problemas desses anticorpos monoclonais é obtenção de efeitos terapêuticos seletivos em células cancerosas sem toxicidade grave devido à sua reação específica a células que expressam moléculas-alvo (Crist, W.M. e outros (2001). J Clin Oncol, 19, 3091-102.; Wunder, J.S. e outros (1998). J Bone Joint Surg Am, 80, 1020-33.; Ferguson, W.S. e Goorin, A.M. (2001). Câncer Invest, 19, 292-315).
Entre sarcomas de tecido mole, osteossarcoma, sarcoma de Ewing e rabdomiossarcoma são sensíveis à quimioterapia e essas doenças podem ser bem controladas por meio de quimioterapia. Por outro lado, sarcomas de células fusiformes são resistentes à quimio-radioterapia, e pacientes com esses sarcomas usualmente exibem prognose insuficiente.
Para sarcoma sinovial (SS)1 tratamento cirúrgico é eficaz para pacientes em estágio inicial, mas nenhum fármaco terapêutico eficaz é disponível para aqueles em estágio avançado. Portanto, espera-se desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas para aperfeiçoar prognose melhor dos pacientes.
Análise ampla de expressão de genes genômicos em tumores proporciona a informação útil para identificar os novos alvos moleculares para desenvolvimento de novos fármacos anticâncer e marcadores de tumores. Em estudo anterior, os presentes inventores analisaram perfil de expressão de genes de diversos sarcomas de tecido mole usando micro- arranjo amplo de cDNA genômico consistindo de 23.040 genes e demons- traram que homólogo encrespado 10 (FZD10) (Nos. de Acesso GenBank AB027464 (SEQ ID N01) e BAA84093 (SEQ ID N02)) foi induzido espe- cífica e freqüentemente em SSs (Nagayama, S. e outros (2002) Câncer Res, 62, 5859-66; e W02004/020668). O produto genético FZD10 é um membro da família de Proteínas Encrespadas e um receptor de sinal pu- tativo WNT (Koike, J. e outros (1999). Biochem Biophys Res Commun, 262, 39-43). Análise adicional mostrou que FZD10 é expressa especificamente em SS, e sob nenhum nível ou nível dificilmente detectável em outros ór- gãos normais, exceto a placenta, sugerindo que terapêutica que tem como alvo essa molécula não causaria nenhuma ou pequena reação adversa (Nagayama, S. e outros (2002). CancerRes, 62, 5859-66). Experimentos de RNAi implicaram que FZD10 era significativamente envolvida no cres- cimento de tumor de SS (W02006/013733). Adicionalmente, os presentes inventores geraram o anticorpo policlonal de coelho contra o domínio ex- tracelular de FZD10 (FZD10-ECD) e verificaram que esse anticorpo tinha atividade antitumor em modelo de xenoenxerto de SS em camundongo (Nagayama, S. e outros (2005). Oncogene, 24, 6201-12; e W02005/004912). Ao mesmo tempo, poderia esperar-se que a terapia de anticorpos contra FZD10 melhora o resultado clínico de SS.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Abaixo, registra-se essa geração dos anticorpos monoclonais murinos contra FZD10 por meio de método de imunização celular para possível aplicação clínica. Atividade de ligação a tumores in vivo desses anticorpos foi avaliada usando sistema de formação de imagem fluores- cente in vivo com fluorescência perto do infravermelho, além do método convencional com radionuclídeos. Aqui, revelou-se a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais anti-FZD10 tanto in vitro quanto in vivo, bem como internalização desses anticorpos nas células que expressam FZD10, e verificou-se que em camundongos xenoenxertados que portam SYO-1 tratados com Mab anti-FZD10 marcado com 90Y em uma única veia da cauda sob dose de 100 μΟί observou-se significativo efeito antitumor.
Com base nas verificações acima, os presentes inventores concluíram que os anticorpos monoclonais murinos contra FZD10 apre- sentam potencial terapêutico no tratamento e diagnose de SS e outros tumores que superexpressam FZD10.
Portanto, no primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo ou um fragmento deste que compreende uma região V (va- riável) de cadeia H (pesada) que compreende uma região determinadora de complementaridade (CDR), que apresenta as seqüências de aminoá- cidos mostradas em SEQ ID NOs: 15, 17 e 19 ou uma CDR funcionalmente equivalente e uma região V de cadeia L (leve) que compreende uma CDR que apresenta as seqüências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 23, 25 e 27 ou uma CDR funcionalmente equivalente, e que é capaz de ligar-se a uma proteína homóloga encrespada 10 (FZD10) ou um peptídeo parcial desta.
Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento deste é sele- cionado do grupo que consiste em um anticorpo de camundongo, um an- ticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um fragmento de anticorpo e anticorpo de cadeia única.
Em uma modalidade preferida, o anticorpo é um anticorpo de camundongo. Preferencialmente, o anticorpo de camundongo compreende uma cadeia H que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 57 e/ou uma cadeia L que apresenta a seqüência de aminoá- cidos mostrada em SEQ ID NO 59. Por exemplo, o anticorpo de camun- dongo pode ser produzido pelo clone de hibridoma 92-13 (FERM BP-10628).
Em uma modalidade alternativa preferida, o anticorpo é um anticorpo quimérico. Preferencialmente, o anticorpo quimérico compreende uma região V de cadeia H que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 13, por exemplo, o anticorpo quimérico poderá compreender uma cadeia H que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 46. Preferencialmente, o anticorpo quimérico compreende uma região V de cadeia L que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 21, por exemplo, o anticorpo qui- mérico poderá compreender uma cadeia L que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 48.
Mais preferencialmente, o anticorpo quimérico compreende uma região V de cadeia H que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 13 e uma região Vde cadeia Lqueapresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 21. Por exemplo, o anticorpo qui- mérico compreende uma cadeia H que apresenta a seqüência de aminoá- cidos mostrada em SEQ ID NO 46 e uma cadeia L que apresenta a se- qüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 48.
Em uma modalidade, o anticorpo quimérico compreende adi- cionalmente uma região C (constante) de anticorpos humanos.
Em uma modalidade alternativa preferida, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado compreende adicionalmente uma região FR (estrutura) de anticorpos hu- manos e/ou uma região C de anticorpos humanos.
No segundo aspecto, a presente invenção proporciona um an- ticorpo ou um fragmento deste que compreende uma região V (variável) de cadeia H (pesada) que compreende uma região determinadora de com- plementaridade (CDR) que apresenta as seqüências de aminoácidos mos- tradas em SEQ ID NOs: 31, 33 e 35 ou uma CDR funcionalmente equiva- lente e uma região V de cadeia L (leve) que compreende uma CDR que apresenta as seqüências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 39, 41 e 43 ou uma CDR funcionalmente equivalente, e que é capaz de ligar-se a uma proteína homóloga encrespada 10 (FZD10) ou um peptídeo parcial desta.
Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento deste é sele- cionado do grupo que consiste em um anticorpo de camundongo, um an- ticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um fragmento de anticorpo e anticorpo de cadeia única.
Em uma modalidade preferida, o anticorpo é um anticorpo de camundongo. Preferencialmente, o anticorpo de camundongo compreende uma cadeia H que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 61 e/ou uma cadeia L que apresenta a seqüência de aminoá- cidos mostrada em SEQ ID NO 63. Por exemplo, o anticorpo de camun- dongo pode ser produzido pelo clone de hibridoma 93-22 (FERM BP-10620).
Em uma modalidade alternativa preferida, o anticorpo é um anticorpo quimérico. Preferencialmente, o anticorpo quimérico compreende uma região V de cadeia H que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 29, por exemplo, o anticorpo quimérico com- preende uma cadeia H que apresenta a seqüência de aminoácidos mos- trada em SEQ ID NO 50. Preferencialmente, o anticorpo quimérico com- preende uma região V de cadeia L que apresenta a seqüência de aminoá- cidos mostrada em SEQ ID NO 37, por exemplo, o anticorpo quimérico compreende uma cadeia L que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 52.
Mais preferencialmente, o anticorpo quimérico compreende uma região V de cadeia H que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 29 e uma região V de cadeia L que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 37. Por exemplo, o anticorpo quimérico compreende uma cadeia H que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 50 e uma cadeia L que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 52.
Em uma modalidade, o anticorpo quimérico compreende adi- cionalmente uma região C (constante) de anticorpos humanos.
Em uma modalidade alternativa' preferida, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado compreende adicionalmente uma região FR (de moldura) de anticorpos humanos e/ou uma região C de anticorpos humanos.
Em ainda uma modalidade alternativa, o anticorpo ou fragmento deste pode ser marcado com um marcador de radioisótopo ou um marcador fluorescente. Esse marcador de radioisótopo inclui 90Itrio (90Y), 125iodo (125I) e 111Indio (111In).
No terceiro aspecto, a presente invenção proporciona um clone de hibridoma 92-13 (FERM BP-10628) que produz o anticorpo monoclonal de camundongo 92-13.
No quarto aspecto, a presente invenção proporciona um clone de hibridoma 93-22 (FERM BP-10620) que produz o anticorpo monoclonal de camundongo 93-22.
No quinto aspecto, a presente invenção proporciona um mé- todo para tratar ou prevenir uma doença que é associada a homólogo en- crespado 10 (FZD10) em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento acima. Em uma modalidade, a doença que é associada a FZD10 é selecionada de sarcoma sinovial (SS), câncer colorretal, câncer gástrico, leucemia mielóide crônica (CML) e leucemia mielóide aguda (AML). No sexto aspecto, a presente invenção proporciona um método para diagnose ou prognose de uma doença que é associated a homólogo encrespado 10 (FZD10) ou de uma predisposição para desenvolver a do- ença em um indivíduo, compreendendo
(a) contatar uma amostra ou um espécime do indivíduo com o anticorpo ou fragmento acima;
(b) detectar a proteína FZD10 na amostra ou espécime; e
(c) julgar se o indivíduo sofre ou não de ou está em risco de desenvolver a doença, com base na abundância relativa da proteína FZD10 em comparação com um controle.
Em uma modalidade, a doença que é associada a FZD10 é selecionada de sarcoma sinovial (SS), câncer colorretal, câncer gástrico, leucemia mielóide crônica (CML) e leucemia mielóide aguda (AML).
No sétimo aspecto, a presente invenção proporciona um mé- todo para formação de imagem in vivo de proteína homóloga encrespada 10 (FZD10) em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento acima.
No oitavo aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir uma doença associada a homólogo encrespado 10 (FZD10), compreendendo o anticorpo ou frag- mento acima e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Em Nono aspecto, a presente invenção proporciona um kit para diagnose ou prognose de uma doença associada a homólogo encrespado 10 (FZD10), compreendendo o anticorpo ou fragmento acima.
No décimo aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica para formação de imagem in vivo de proteína homóloga encrespada 10 (FZD10), compreendendo o anticorpo ou frag- mento acima.
No décimo primeiro aspecto, a presente invenção proporciona uso do anticorpo ou fragmento acima na produção de um kit para diagnose ou prognose de uma doença associada a homólogo encrespado 10 (FZD10). No décimo segundo aspecto, a presente invenção proporciona uso do anticorpo ou fragmento acima na produção de uma composição para prevenção ou tratamento de uma doença associada a homólogo en- crespado 10 (FZD10).
O termo "doença que é associada a FZD10" (doença associada a FZD10) refere-se a uma doença que é associada a superexpressão de proteína FZD10. Essas doenças incluem, mas sem se limitar às mesmas, sarcoma sinovial (SS)1 câncer colorretal, câncer gástrico, leucemia mie- lóide crônica (CML) e leucemia mielóide aguda (AML).
O termo "fragmento" significa qualquer fragmento de anticorpo que pode ser preparado do anticorpo contra proteína FZD10 e contém CDRs definidas. Esse fragmento inclui, mas sem se limitar aos mesmos, fragmento Fab, fragmento F (ab')2 e fragmento Fv.
O termo "anticorpo modificado" significa qualquer anticorpo que pode ser derivado do anticorpo contra FZD10 e contém CDRs definidas. Esse anticorpo modificado inclui, mas sem se limitar ao mesmo, um anti- corpo modificado com PEG. O fragmento de anticorpo ou fragmento modi- ficado pode ser imediatamente reconhecido por aquele habilitado no es- tado da técnica e produzido mediante uso de quaisquer métodos conhe- cidos no estado da técnica.
O termo "indivíduo", aqui, refere-se a um indivíduo que tem sofrido de doença associada a FZD10 e também a indivíduo suspeito de apresentar doença associada a FZD10. O indivíuo na presente invenção poderá ser animais que incluem mamíferos e animais aviários. Por exemplo, mamíferos poderão incluir seres humanos, camundongos, ratos, macacos, coelhos e cães.
DESCRIÇÃO CONCISA DOS DESENHOS
As figuras 1a a 1f mostram caracterização de especificidade de ligação de dois anticorpos monoclonais anti-FZD10.
A figura 1a mostra análise fluxocitométrica dos quatro anti- corpos 39-2 e 39-10 (descritos in W02005/004912), 92-13 e 93-22, usando cinco linhagens de SS (SYO-1, YaFuSS, HS-SY-2, Fuji e 1973/99) e uma linhagem de células de câncer do cólon (LoVo). Linhas sólidas mostram a intensidade fluorescente detectada por cada mAb; linhas interrompidas representam as intensidades fluorescentes de células incubadas com IgG de camundongo não-imunizado como controle negativo.
A figura 1b mostra RCP-TA semiquantitativa de FZD10 nas mesmas linhagens de células tumorais conforme usado na figurai a. Ex- pressão de gene para p2-microglobulina (t62MG) serviu como controle in- terno.
Afigura 1c mostra análise fluxocitométrica de 92-13 (painéis superiores) e 93-22 (painéis inferiores) contra FZD10 exógeno foram in- dicados. Linhagem de células de câncer de cólon, SNU-C5, foi transfectada com vetor vazio pCAGGS (painéis esquerdos) ou pCAGGS-FZD10-myc/His (painéis direitos) e analisados 48 horas após transfecção. Linhas sólidas mostram a intensidade fluorescente detectada por cada mAb; linhas interrompidas representam as intensidades fluores- centes de células incubadas com IgG de camundongo não-imunizado como controle negativo.
Afigura 1d mostra ligação de 39-10, 39-2, 92-13 e 93-22 mar- cados com 125I com células sangüíneas humanas normais. Mabs radio- marcados foram incubados com cada amostra de sangue humano normal novo de três indivíduos (A, B e C) na ausência (barra aberta) ou presença (barra fechada) de anticorpos idênticos não-marcados.
Afigura 1e mostra atividade de ligação de Mabs marcados com 125I. Uma quantidade constante de Mabs radiomarcados foi incubada com células SYO-1 quantidade crescente de anticorpos não-marcados. A ra- dioatividade percentual ligada a células foi plotada contra a quantidade de anticorpos não-marcados. Cículo fechado, 92-13; Círculo aberto, 93-22.
A figura 1f mostra análise fluxocitométrica de autoblocos e blocos cruzados. 92-13 marcados com Alexa-488 (painéis superiores) e 93-22 (painéis inferiores) foram incubados com células SYO-1 em (i) PBS, ou na presença de 100 μg de (ii) 92-13 não-marcado e (iii) 93-22 não-marcado. Histograma sombreado mostra a intensidade fluorescente detectada por cada Mab marcado com Alexa488; linhas interrompidas re- presentam as intensidades fluorescentes de células incubadas com PBS como controle negativo.
A figura 2 mostra análises imuno-histoquímicas em seções de tecido com SS congelado e de tecido humano normal congelado sem an- ticorpo (a, d, g, j, e m), 92-13 (b, e, h, k,en)e 93-22 (c, f, i, I, e o), (a-c), sarcoma sinovial; (d-f), rim; (g-i), fígado; (j-l), coração; (m-o), cérebro. Ampliação original: x100.
A figura 3 mostra biodistribuição de anticorpos marcados com 111In e com 125I. 10 kBq de (a), 92-13 marcado com 111In, (b), 92-13 marcado com 125I, (c), 93-22 marcado com 111In e (d), 93-22 marcado com 125I1 foram injetados intravenosamente em camundongos nus BALB/c portando tumor SYO-1. Os órgãos e o tumor foram dissecados em uma hora (barra aberta), 24 horas (barra hachurada) e 48 horas (barra fechada), e as radioativida- des foram medidas. Os dados mostrados são os dados representativos de dois experimentos independentes.
A figura 4a mostra formação de imagem por fluorescência in vivo de camundongos que portam tumor SYO-1 após injeção de 92-13 ou 93-22 marcado com Alexa 647. Mabs marcados com fluorescência foram administrados sob uma dose de 20 μg por camundongo intraperitoneal- mente. Todas as imagens de fluorescência foram adquiridas com um tempo de exposição de 60 segundos (f/parada = 2) antes de injeção, imediata- mente após injeção (0 hora), 24, 48 e 96 horas. As setas indicam a posição do tumor. Tumor de S.C. localiza-se no dorso para 92-13 (painéis superi- ores) e no tronco para 93-22 (painéis inferiores). Sinal de fluorescência de Alexa647 foi pseudocolorido de acordo com a barra de cor indicada à di- reita. Em 93-22 (painel inferior), as pontas das flechas indicam a posição de injeção.
As figuras 4b e 4c mostram imagens representativas de órgãos e tumores dissecados de camundongos mostrados nas figura 4a, 4b, 92-13, e 4c, 93-22; i, tumor SYO-1;ii, fígado; iii, baço; iv rim; v, pâncreas; vi, cólon. A figura 5a mostra formação de imagem por fluorescência in vivo de camundongos que portam tumor LoVo após injeção de 92-13 ou 93-22 marcado com Alexa647. Mabs marcados com fluorescência foram administrados como na figura4. Todas as imagens de fluorescência foram adquiridas com um tempo de exposição de 60 segundos (f/parada = 2) imediatamente após injeção (O hora), 48, 72, 96 e 120 horas (h). As setas indicam a posição do tumor. Tumor de S.C. localiza-se no antebraço direito tanto para 92-13 (painéis superiores) quanto para 93-22 (painéis inferio- res).
As figuras 5b e 5c mostram imagens representativas de órgãos e tumores dissecados de camundongos mostrados nas figuras 5a, 5b, 92-13, e 5c, 93-22; i, tumor LoVo; ii, fígado; iii, baço; iv, rim; v, pâncreas; vi, cólon.
Afigura 6 mostra internalização de 92-13 e 93-22 foi avaliado por microscopia confocal. Células foram tratadas com PBS (a, d e g), 50 pg/ml de 92-13 (b, e e h) ou 93-22 (c, f, i) por 3 horas em 37°C, 5% de CO2. Anticorpos ligados à superfície celular foram separados por ácido com tampão de glicina 0,1 M (pH 2,5). As células foram fixadas, permeabiliza- das e, em seguida, bloqueadas com BSA a 3%. Anticorpos intracelulares foram detectados com lgG-Alexa488 de cabra anticamundongo e o núcleo foi corado com DAPI. (a - c), SYO-1; (d - f), YaFuSS; (g - i) Lovo.
A figura 7 mostra o efeito de 92-13 marcado com 90Y sobre o crescimento de tumor. Quando os tumores foram estabelecidos (0,4-2,7cm3), camundongos receberam em uma única veia da cauda 100 μα de 92-13 marcado com 90Y.
A figura 8 mostra que tanto 92-13 quanto 93-22 quiméricos induziram ADCC (sigla em inglês para citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos) especificamente nas células SYO-1 que su- perexpressam FZD10. 1 μg/ml de anticorpo quimérico 93-22 (ch93-22) ou anticorpo quimérico 92-13 (ch92-13) sob várias razões Efetuador:Alvo. PBMCs (sigla em inglês para células mononucleares de sangue periférico) de vários doadores foram usados como célula efetuadora; (a), (c) ADCC de 92-13 quimérico contra célula SYO-1 com cinco doadores humanos sau- dáveis de PBMCs. (b), (d) ADCC de 93-22 quimérico contra célula LoVo com dois doadores humanos saudáveis de PBMCs. Quantificação de ci- totoxicidade com atividade de LDH é descrita in (Nagayama, S. e outros, Oncogene, 24, 6201-12).
DESCRIÇÃO DETALHADA E MODALIDADES PREFERIDAS DA PRE- SENTE INVENÇÃO
Homólogo encrespado 10 (FZD10) é um membro da família encrespada, que é um receptor de sinalização de Wnt. Como descrito a- baixo, estabeleceu-se de forma bem-sucedida que anticorpos monoclonais murinos e anticorpos quiméricos contra proteína FZD10 que poderão ser úteis para uso médico.
Os anticorpos monoclonais murinos específicos a FZD10 (Mabs 92-13 e 93-22) são estabelecidos mediante imunização de ca- mundongos com células transfectadas com FZD10. Mostrou-se que ambos os Mabs 92-13 e 93-22 apresentam atividade de ligação específica contra FZD10 em linhagem de células de SS1 células SYO-1 e células COS7 transfectadas com FZD10 mediante uso de análise de fluxocitometria (FACS). Para validar a atividade de ligação específica desses anticorpos in vivo, os presentes inventores injetaram intraperitoneal ou intravenosa- mente Mabs marcados com fluorescência nos camundongos que portam xenoenxertos de SS e verificaram que esses Mabs ligaram-se aos tumores que expressam FZD10, mas não a qualquer outro tecido normal de ca- mundongo, por meio de uso do sistema de formação de imagem fluores- cente in vivo e radioatividades. Análises imuno-histoquímicas subsequen- tes com os Mabs confirmaram uma ausência ou nível dificilmente detec- tável de proteína FZD10 em órgãos humanos normais, exceto a placenta.
Adicionalmente, de forma interessante os presentes inventores verificaram que os Mabs foram internalizados nalinhagem de células de SS, SYO-1, mas não em linhagem de células negativas a FZD10, LoVo, usando mi- croscopia confocal de varredura a laser. Surpreendentemente, obser- vou-se que camundongos xenoenxertados que portam SYO-1 tratados em uma única veia da cauda com Mab anti-FZD10 marcado com 90Y (92-13) sob dose de ΙΟΟμΟί apresentam significativo efeito antitumor. Tomados juntamente, concluiu-se que esses Mabs específicos contra FZD10 pode- riam ser utilizados como novo marcador de diagnóstico ou tratamento de SS com risco mínimo ou nenhum risco de reações adversas.
Devido à sua estrutura protéica complicada, é freqüentemente muito difícil gerar anticorpos contra sete proteínas de transmembrana. Em estudo anterior, os presentes inventores demonstraram que FZD10 for- mava homo-oligômero (Nagayama, S. e outros (2005). Oncogene, 24, 6201-12). Após falha de múltiplas tentativas de gerar anticorpos mono- clonais anti-FZD10 que poderiam reconhecer uma forma nativa de FZD10 pelo uso de proteínas FZD10 de comprimento completo ou parcialmente recombinantes, finalmente aplica-se a imunização por meio de injeção de células vivas COS-7 que superexpressam FZD10 na almofada do pé de camundongos Balb/c e obtêm-se com êxito os dois hibridomas que pro- duzem anticorpos anti-FZD10 que tinham a capacidade de reconhecer a forma nativa de FZD10 em células vivas por análise FACS. Uma vez que esses anticorpos não detectaram proteína FZD10 em Western blotting, os presentes inventores admitem que esses Mabs reconhecem a estrutura terciária de FZD10.
Para investigar a distribuição in vivo de Mabs 92-13 e 93-22, os presentes inventores aplicaram dois métodos, um baseado nas modali- dades de radionuclídeos usando anticorpos marcados com 125I e 111In, e outro baseado na formação de imagem por fluorescência utilizando anti- corpos marcados perto do infravermelho (Alexa647). Substância fluores- cente perto do infravermelho, principalmente corante indocianina, é agora amplamente usada na formação de imagem in vivo com fins diagnósticos porque a luz desse comprimento de onda penetra tecido vivo bastante eficientemente (Chen, X. e outros (2004). CancerRes, 64, 8009-14). Duas abordagens dos resultados obtidos foram muito concordantes e indicaram que 92-13 e 93-22 ligaram-se a células tumorais SYO-1, mas não a outros tecidos normais. Para confirmar se esses anticorpos podem ser aplicados em uso clínico, os presentes inventores examinaram adicionalmente a atividade de ligação de anticorpos contra células sangüíneas normais. A atividade de ligação de 92-13 e 93-22 marcados com 125I contra células sangüíneas humanas normais foi indetectável em todos os três doadores individuais (figurai d). Esses resultados foram consistentes com aqueles de análise FACS usando célula mononuclear de sangue periférico humano (dados não mostrados), sugerindo aplicabilidade clínica desses dois anti- corpos com pequena possibilidade de efeito adverso em pacientes de SS devido à afinidade de ligação muito específica pela molécula de FZD10.
Adicionalmente, experimentos in vitro utilizando microscopia confocal re- velaram que a ligação específica de Mabs 92-13 e 93-22 em FZD10 de superfície celular induziu a internalização dos anticorpos (figura6). Como descrito anteriormente (Stein, R. e outros (2001). Criti Rev Oncol Hematol, 39, 173-80; Stein, R. e outros (2005). Clin Câncer Res, 11, 2727-34), se Mabs marcados são internalizados após ligação, anticorpo marcado com 125I é metabolizado nos Iisossomos e difundidos de células tumorais alvo em que anticorpo marcado com 111In permanece nos lisossomos. Como observado na figura 3, as radioatividades de anticorpo marcado com 111In e anticorpo marcado com 125I em tumores foram significativamente diferentes (figura3, a e b, c e d). Essas verificações sugerem que Mabs 92-13 (e 93-22) podem internalizar-se especificamente nas células de SS via pro- teína FZD10.
Quando anticorpos são aplicados em terapia de câncer, os seguintes três mecanismos são ensinados para exercer a atividade anti- tumor: (i) no caso em que a molécula-alvo é involvida em aumento de crescimento, neutralização de anticorpos bloqueiaria a transdução de sinal de crescimento e, em seguida, suprimiria o crescimento de células tumo- rais; (ii) a segunda possibilidade é as atividades do efetuador induzirem citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC, em inglês); (iii) o ter- ceiro caso são radionuclídeos ou fármaco antitumor que são conjugados com anticorpos e são transportados até as células do tumor alvo de ma- neira eficaz. Embora os presentes inventores tenham demonstrado ante- riormente que a molécula-alvo FZD10 é involvida no crescimento de tu- mores de SS1 nem Mab 92-13 nem Mab 93-22 mostraram o efeito neutra- lizante in vitro quando adicionados ao meio de cultura celular (dados não mostrados) ou in vivo quando injetados nos camundongos que portam tumor (dados não mostrados).
Conjugação de radionuclídeo ou fármaco anticâncer com an- ticorpos tal como Zevalina (anticorpo anti-CD20 conjugado com 90ítrio) e Mylotarg (anticorpo anti-CD33 conjugado com caliqueamicina) provou ser altamente eficaz para conferir citotoxicidade aos anticorpos (Wiseman, G.A. e Witzig, T.E. (2005). Câncer Biother Radiopharm, 20, 185-8; van der Velden, V.H. e outros (2001). Blood, 97, 3197-204; Carter, P. (2001). Nat Rev Câncer, 1, 118-29). Mylotarg exerce sua atividade antitumor mediante liberação de fármaco antitumor, caliqueamicina, na célula cancerosa após ser internalizado (van der Velden1 V.H. e outros (2001). Blood, 97, 3197-204). Nos Exemplos, para experimentos terapêuticos, conjugado 90ítrio-DTPA-92-13 foi gerado e sua atividade antitumor investigada. Em modelo de xenoenxerto em camundongo, tumores rapidamente diminuíram após tratamento de 90ítrio-DTPA-92-13 (figura 7). Notavelmente, os tumo- res que incluem volume maior (> 1cm3) de tumor não mostraram refração até 34 dias após administração e nenhuma toxicidade intensa foi obser- vada. Uma vez que anticorpos 92-13 e 93-22 anti-FZD10 seriam prova- velmente internalizados de maneira eficaz em células positivas a antígenos como mostrado na figura 6, conjugação de fármaco anticâncer com ambos os Mabs 92-13 e 93-22 é também esperada exercer o alto efeito anticâncer em células de SS. Referindo-se à atividade efetuadora, tanto 92-13 quanto 93-22 quiméricos induziram ADCC especificamente nas células de SYO-1 que superexpressam FZD10 (figuras 8, a e c), mas não nas células LoVo negativas a FZD10 (figuras 8, b e d). Particularmente, 92-13 quimérico mostrou maior indução de citotoxicidade em comparação com 93-22 qui- mérico, entretanto, sua atividade depende de doador de células efetua- doras, possivelmente causada por polimorfismo de receptor de Fe. Em conclusão, os presentes inventores produziram com êxito anticorpos mo- noclonais que foram capazes de ligar-se especificamente a FZD10 em células tumoarais que superexpressam FZD10 in vitro e in vivo. Ao mesmo tempo, os presentes inventores estão confiantes de que anticorpos mono- clonais anti-FZD10 apresentam grande potencial de desenvolvimento de novas terapias com fármacos para tratamento de SS e outros tumores que superexpressam FZD10.
1. PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO
Anticorpos que podem ser usados na presente invenção espe- cificamente reagem contra uma proteína FZD10 derivada de uma doença associada a FZD10. O termo "anticorpo" usado aqui significa uma molécula de anticorpo como um todo, ou seus fragmentos tais como fragmentos Fab1 fragmentos F(ab')2 e fragmentos Fv1 que podem ligar-se à proteína ou seus peptídeos parciais como antígenos. O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal. Ele pode também ser um anticorpo humanizado ou anticorpo quimérico, ou um anticorpo de cadeia única Fv (scFv). Os anticorpos (anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais) para uso na presente invenção pode ser preparado, por exemplo, pelo processo seguinte. (1) Anticorpo monoclonal
Inicialmente, é preparado um antígeno para a produção de um anticorpo útil na presente invenção. Proteína FZD10 ou seu peptídeo par- cial pode ser usada como uma proteína imunogênica. Alternativamente, a célula que expressa proteína FZD10 ou peptídeo parcial pode também ser usada como imunógeno. A seqüência de aminoácidos de proteína FZD10 usada como imunógeno na presente invenção e a seqüência de cDNA que codifica a proteína são publicamente disponíveis em GenBank como Nos. de Acesso BAA84093 (SEQ ID NO 1) e AB027464 (SEQ ID NO 2), res- pectivamente. A proteína FZD10 ou peptídeo parcial para uso como imu- nógeno pode ser sinteticamente preparada de acordo com um procedi- mento conhecido no estado da técnica tal como um processo de síntese de peptídeo em fase sólida, usando a informação disponível sobre seqüência de aminoácidos. Os peptídeos parciais de proteína FZD10 incluem, mas sem se limitar aos mesmos, um peptídeo que contém resíduos 1-225 de uma seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 1, que corres- ponde ao domínio extracelular de término N da proteína FZD10 (FZD10-ECD).
A proteína ou peptídeo parcial, ou a célula que os expressa, podem ser preparados usando a informação de seqüência de cDNA que codifica proteína FZD10 ou peptídeo parcial, de acordo com um procedi- mento conhecido de recombinação genética. A produção da proteína ou peptídeo parcial, bem como a célula que os expressa, de acordo com esse procedimento de recombinação genética, serão ilustrados abaixo.
Um vetor recombinante para a produção de proteína pode ser obtido ligando a seqüência e cDNA acima a um vetor apropriado. Um transformante pode ser obtido mediante introdução do vetor recombinante para a produção de proteína em um hospedeiro, de modo que a proteí- na-alvo FZD10 ou peptídeo parcial possam ser expressos.
Como vetor, é usado um fago ou plasmídeo que é capaz de replicar autonomamente em um hospedeiro. Exemplos de um DNA de plasmídeo incluem pCAGGS, pET28, pGEX4T, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19 e outros DNAs de plasmídeo derivados de Escherichia colr, pUB110, pTP5, e outros DNAs de plasmídeo derivados de Bacillus subtilis; e YEp13, YEp24, YCp50 e outros DNAs de plasmídeo derivados de lêvedo. Exemplos de um DNA de fago incluem fagos lâmbda tais como Xgt11 e λΖΑΡ. Adi- cionalmente, vetores de vírus animal tais como vetor de retrovírus e vetor de vírus de vaccínia podem ser usados, e vetores de vírus de inseto tal como vetor de baculovírus podem também ser usados.
O DNA que codifica a proteína FZD10 ou peptídeo parcial (daqui por diante referido como DNA de FZD10) é inserido no vetor, por exemplo, por meio do método seguinte. Nesse método, DNA purificado é clivado por uma enzima de restrição apropriada e inserido em um sítio de enzima de restrição ou um sítio de clonagem múltipla de um DNA de vetor apropriado para ligar-se ao vetor. Além de um promotor e do DNA de FZD10, qualquer dentre intensificadores e outros elementos eis, sinais de ligação, sinais de adição de poli A, marcadores seletivos, sítio de ligação de ribossomos (RBS) e outros elementos podem ser ligados ao vetor recombinante para a produ- ção de proteína para uso em células de mamíferos, se desejado.
Para ligar o fragmento de DNA ao fragmento de vetor, uma DNA Iigase conhecida pode ser usada. O fragmento de DNA e o fragmento de vetor são recozidos e ligados, produzindo desse modo um vetor recombi- nante para a produção de uma proteína.
O hospedeiro para uso na transformação não é especificamente limitado, contanto que ele permita que a proteína FZD10 ou peptídeo parcial seja expresso nele. Exemplos do hospdedeiro incluem bactérias, por e- xemplo, E. coli, e Bacillus; lêvedo, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae\ células animais, por exemplo, células COS, células do Ovário de Hamster Chinês (CHO, em inglês) e células de inseto.
Por exemplo, quando uma bactéria é usada como hospedeiro, o vetor recombinante para a produção de proteína deverá preferencialmente ser capaz de replicar-se autonomamente na bactéria hospedeira e com- preender um promotor, um sítio de ligação de ribossomos, o DNA de FZD10 e uma seqüência de terminação de transcrição. O vetor recombinante po- derá compreender adicionalmente um gene para regular o promotor. Um exemplo de Eseheriehia coli inclui Eseheriehia coli BRL, e um exemplo de Bacillus é Bacillus subtilis. Qualquer promotor que pode ser expresso no hospedeiro tal como Escherichia coli pode ser usado aqui.
O vetor recombinante pode ser introduzido na bactéria hospe- deira por meio de qualquer procedimento conhecido no estado da técnica. Tais procedimentos incluem, por exemplo, um método que utiliza íons de cálcio e eletroporação. Quando célula de lêvedo, célula animal ou célula de inseto é usada como hospedeiro, um transformante pode ser produzido de acordo com um procedimento conhecido no estado da técnica, e, em se- guida, a proteína FZD10 ou peptídeo parcial pode ser produzido no hos- pedeiro (transformante). A proteína FZD10 ou peptídeo parcial para uso como imunó- geno na presente invenção pode ser obtida de uma cultura do transfor- mante gerado acima. A "cultura" refere-se a qualquer dentre sobrenadante de cultura, células cultivadas, microorganismos cultivados e homogenados dos mesmos. O transformante é cultivado em um meio de cultura por meio de um processo convencional de cultura de hospedeiro.
O meio de cultura para cultivar o transformante obtido mediante uso de Escherichia coli, lêvedo ou outros microorganismos como hospe- deiro pode ser um meio natural ou um meio sintético, contanto que ele compreenda uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio, sais inorgânicos e outros componentes utilizáveis pelo microorganismo e permita que o transformante cresça eficientemente.
O transformante é geralmente cultivado agitando vigorosa- mente a cultura ou cultura com aeração com agitação sob condições ae- róbicas a 25°C a 37°C por 3 a 6 horas. Durante cultura, o pH é mantido em um nível próximo de neutralidade mediante ajuste com, por exemplo, um ácido inorgânico ou orgânico e uma solução alcalina. Durante cultura, an- tibióticos tal como ampicilina ou tetraciclina poderão ser adicionados ao meio de acordo com o marcador seletivo introduzido no vetor de expressão recombinant, se necessário.
Após cultura, quando a proteína FZD10 ou peptídeo parcial é produzido no microorganismo ou célula, a proteína ou peptídeo parcial é extraído por homogeneização do microorganismo ou célula. Quando a proteína FZD10 ou peptídeo parcial é secretada do microorganismo ou célula, o meio de cultura é usado como tal, ou fragmentos do microorga- nismo ou célula são removidos do meio de cultura, por exemplo, por cen- trifugação. Em seguida, a proteína FZD10 ou peptídeo parcial pode ser isolado da cultura e purificada por meio de um método bioquímico conven- cional para o isolamento e purificação de proteínas, tal como precipitação por sulfato de amônio, cromatografia em gel, cromatografia de troca iônica e cromatografia de afinidade, seja individualmente, seja em combinação.
Se a proteína FZD10 ou peptídeo parcial foi ou não obtido pode ser confirmado, por exemplo, por eletroforese em SDS gel de poliacrila- mida.
Em seguida, a proteína FZD10 ou peptídeo parcial obtido, ou o transformante, é dissolvido em um tampão para preparar um imunógeno.
Onde necessário, um adjuvante pode ser adicionado para imunização efi- caz. Esses adjuvantes incluem, por exemplo, adjuvante de Freund completo comercialmente disponível e adjuvante de Freund incompleto. Qualquer um desses adjuvantes pode ser usado isoladamente ou em combinação.
O imunógeno assim preparado é administrado a um mamífero tal como coelho, rato ou camundongo. A imunização é realizada princi- palmente por injeção intravenosa, subcutânea ou intraperitoneal. O inter- valo de imunização não é especificamente limitado e o mamífero é imuni- zado uma a três vezes em intervalos que variam de diversos dias a se- manas. Células que produzem anticorpos são coletadas 1 a 7 dias após a última imunização. Exemplos das Células que produzem anticorpos incluem células do baço, células do nodo linfático e células de sangue periférico.
Para obter um hibridoma, são fundidas uma célula que produz anticorpos e uma célula de mieloma. Como célula de mieloma a ser fundida com a célula que produz anticorpos, pode ser usada uma linhagem de cé- lulas estabelecida geralmente disponível. Preferencialmente, a linhagem de células usada deverá apresentar seletividade a fármaco e propriedades tais que ela não possa sobreviver em um meio seletivo a HAT (contendo hi- poxantina, aminopterina e timidina) sob forma não-fundida e possa sobre- viver somente quando fundida com uma célula que produz anticorpos.
Células de mieloma possíveis incluem, por exemplo, linhagens de células de mieloma de camundongos tais como P3X63-Ag.8.U1 (P3U1) e NS-I.
Em seguida, a célula de mieloma e a célula que produz anti- corpos são fundidas. Para a fusão, essas células são misturadas, prefe- rencialmente à razão de 5:1 da célula que produz anticorpos para a célula de mieloma, em um meio de cultura para células animais que não contêm soro, tais como meios DMEM e RPMI-1640, e fundidas na presença de um agente promotor de fusão de células tal como polietilenoglicol (PEG). A fusão de células poderá também ser realizada utilizando um dispositivo de fusão de células comercialmente disponível, usando eletroporação.
Em seguida, o hibridoma é extraído das células após o trata- mento de fusão acima. Por exemplo, a suspensão de células é apropria- damente diluída com, por exemplo, o meio RPMI-1640 contendo soro bo- vino fetal e, por conseguinte, plaqueada em uma placa de microtitulação. Um meio seletivo é adicionado em cada cavidade, e as células são culti- vadas com substituição apropriada do meio seletivo. Como resultado, as células que crescem cerca de 30 dias após o início de cultura no meio se- letivo podem ser obtidas como hibridoma.
O sobrenadante da cultura do hibridoma em crescimento é então selecionado em relação à presença de um anticorpo que reage com a proteína FZD10 ou peptídeo parcial. A seleção de hibridoma pode ser rea- lizada de acordo com um procedimento convencional, por exemplo, usando ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), imunoensaio enzimático (EIA) ou rádio-imunoensaio (RIA, em inglês). As células fundidas são clo- nadas por meio de diluição Iimitativa para estabelecer um hibridoma, que produz o anticorpo monoclonal de interesse.
O anticorpo monoclonal pode ser coletado do hibridoma esta- belecido, por exemplo, por meio de um método convencional de cultura de células ou mediante produção de ascite. Se necessário, o anticorpo pode ser purificado no método de coleta de anticorpos descrito acima de acordo com um procedimento conhecido tais como precipitação por sulfato de amônio, cromatografia de troca iônica, filtração em gel, cromatografia de afinidade ou uma combination destas.
O tipo de globulina dos anticorpos monoclonais úteis na pre- sente invenção não é especificamente limitado, contanto que eles sejam capazes de ligar-se especificamente à proteína FZD10 e pode ser qualquer dentre IgG, IgM, IgA, IgE e IgD. Dentre estes, IgG e IgM são preferidos.
Na presente invenção, anticorpos monoclonais murinos 93-22 e 92-13 são estabelecidos de forma bem-sucedida e preferencialmente u- sados. O clone de hibridoma 93-22 que produz anticorpo monoclonal de camundongo 93-22 foi depositado por Shuichi Nakatsuru internacional- mente no Depositário Internacional de Organismos de Patente IPOD do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (AIST Tsu- kuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-Ken1 305-8566 Japão) como de 14 de junho de 2006 sob o número de depósito de FERM BP-10620. Também, clone de hibridoma 92-13 que produz anticorpo mo- noclonal de camundongo 92-13 foi depositado por Shuichi Nakatsuru in- ternacionalmente no Depositário Internacional de Organismos de Patente IPOD do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (AIST) como de 28 de junho de 2006 sob o número de depósito de FERM BP-10628. O anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma poderá ser preferencialmente usado na presente invenção.
Na presente invenção, um anticorpo monoclonal do tipo re- combinante poderá também ser usado, que possa ser produzido mediante clonagem de gene para anticorpo do hibridoma, integrando o gene para anticorpo em um vetor adequado, introduzindo o vetor em um hospedeiro e produzindo o anticorpo a partir do hospedeiro de acordo com uma técnica convencional de recombinação genética (ver, por exemplo, Vandamme, A. M. e outros, Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-75).
Mais especificamente, mRNA que codifica região variável (V) do anticorpo monoclonal de camundongo anti-FZD10 é isolado do hibri- doma que produz anticorpos (por exemplo, aqueles descritos acima). O isolamento do mRNA é realizado preparando um RNA total por meio de qualquer método conhecido, tal como método de ultracentrifugação de guanídio (Chirgwin, J. M. e outros, Biochemistry (1979) 18, 5294-9) e AGPC método (Chomczynski, P. e outros, Anal. Biochem. (1987) 162, 156-9), e, em seguida, produzindo o mRNA desejado a partir do RNAtotaI utilizando Kit de Purificação de mRNA (Pharmacia) ou similar.
Alternativamente, o mRNA poderá também ser preparado di- retamente usando Kit de Purificação de mRNA QuickPrep (Pharmacia).
Em seguida, cDNA para a região V de anticorpos é sintetizado do mRNA com uma transcriptase inversa. A síntese do cDNA poderá ser realizada usando, urri kit comercialmente disponível, por exemplo, Kit Gene Race (Invitrogen). O cDNA poderá também ser sintetizado ou amplificado pelo método 5-RACE (Frohman, M.A. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. e outros, NucIeicAcids Res. (1989) 17, 2919-32), usando Kit 5'-Ampli FINDER RACE (CIontech) em combinação com um método de RCP.
As seqüências de aminoácidos de cadeia H e cadeia L de an- ticorpo monoclonal de camundongo 92-13 são mostradas em SEQ ID NOs: 57 e 59, respectivamente (codificadas pela seqüência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NOs: 58 e 60, respectivamente). As seqüências de aminoácidos de cadeia H e cadeia L de anticorpo monoclonal de ca- mundongo 93-22 são mostradas em SEQ ID NOs: 61 e 63, respectiva- mente (codificadas pela seqüência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NOs: 62 e 64, respectivamente). Com base na informação de se- quências, iniciadores usados para amplificar a cadeia H ou cadeia L de anticorpo monoclonal de camundongo de interesse podem ser projetados utilizando um método convencional.
Um fragmento de DNA de interesse é isolado e purificado do produto de RCP resultante e, em seguida, ligado em um DNA de vetor para obter um vetor recombinante. O vetor recombinante é introduzido em um hospedeiro tal como E. coli, e uma colônia contendo um vetor recombinante desejado é selecionado. A seqüência de nucleotídeos do DNAde interesse no vetor recombinante é confirmada usando, por exemplo, um sequenci- ador automatizado.
Uma vez obtido DNA que codifica a região V de anticorpos anti-FZD10, o DNA é integrado em um vetor de expressão que contém DNA que codifica a região constante (C) de anticorpos.
Para a produção do anticorpo anti-FZD10 usado na presente invenção, o gene para anticorpo é integrado em um vetor de expressão de modo que o gene para anticorpo possa ser expresso sob o controle de elementos de controle de expressão (por exemplo, intensificador, promo- tor). Uma célula hospedeira é transformada com o vetor de expressão para expressar o anticorpo.
Na expressão do gene para anticorpo, DNAque codifica cadeia pesada (H) e DNA que codifica cadeia leve (L) do anticorpo poderão ser integrados em vetores de expressão separados e, em seguida, uma célula hospedeira é co-transformada com os vetores de expressão recombinantes resultantes. Alternativamente, tanto DNA que codifica cadeia H e DNA que codifica cadeia L do anticorpo poderão ser integrados juntamente em um único vetor de expressão, e, em seguida, uma célula hospedeira é trans- formada com o vetor de expressão recombinante resultante (por exemplo, WO 94/11523).
O gene para anticorpo pode ser expresso por métodos conhe- cidos. Para a expressão em uma célula de mamífero, um promotor con- vencional útil, o gene para anticorpo a ser expresso e um sinal de poli(A) (localizado a jusante na extremidade 3' do gene para anticorpo) poderão ser operavelmente ligados. Por exemplo, como sistema útil promo- tor/intensificador, poderá ser usado um sistema inicial imediato promo- tor/intensificador de citomegalovírus humano.
Outros sistemas promotor/intensificador, por exemplo, aqueles derivados de vírus (por exemplo, retrovírus, vírus de polioma, adenovírus e vírus símios 40 (SV40)) e aqueles derivados de células de mamífero (por exemplo, fator de alongamento humano 1 alfa (HEF1 alfa)), poderão também ser usados para a expressão do anticorpo na presente invenção.
Quando sistema promotor/intensificador SV40 é usado, a ex- pressão genética poderá ser realizada imediatamente pelo método de Mulligan e outros (Nature (1979) 277, 108-14). Quando sistema promo- tor/intensificador HEF1 alfa é utilizado, a expressão genética poderá ser realizada imediatamente pelo método de Mizushima e outros (Nucleic A- cids Res. (1990) 18, 5322).
Para a expressão em E. coli, um promotor convencional útil, uma seqüência de sinal para secretar o anticorpo de interesse e o gene para anticorpo poderão ser operavelmente ligados. Como promotor, pro- motor IacZ ou promotor araB poderá ser usado. Quando promotor IacZ é usado, a expressão genética poderá ser realizada pelo método de Ward e outros (Nature (1098) 341, 544-6.; FASBE J. (1992) 6, 2422-7), enquanto quando promotor araB é usado, a expressão genética poderá ser realizada pelo método de Better e outros (Science (1988) 240, 1041-3).
Com relação à seqüência de sinal para secreção do anticorpo, quando se pretende que o anticorpo de interesse seja secretado em um espaço periplasmático da E. coli, seqüência de sinal pelB (Lei, S.P. e outros, J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-83) poderá ser usada. O anticorpo secretado no espaço periplasmático é isolado e em seguida reenovelado de modo que o anticorpo tome uma configuração apropriada.
A origem de replicação derivada de vírus (por exemplo, SV40, vírus de polioma, adenovírus, vírus de papiloma bovino (BPV) ou similar poderá ser usada. A fim de aumentar o número de cópias genéticas no sistema de células hospedeiras, o vetor de expressão poderá adicional- mente conter um gene marcador seletivo, tal como um gene para amino- glicosídeo fosfotransferase (ΑΡΗ, em inglês), um gene para timidina qui- nase (TK), um gene para xantina-guanina fosforribosiltransferase de E. coli (Ecogpt) e um gene para diidrofolato reductase (dhfr).
Para a produção do anticorpo útil na presente invenção, qual- quer sistema de expressão que inclui sistemas de células eucarióticas e procarióticas poderá ser usado. A célula eucariótica inclui linhagens de células estabelecidas de animais (por exemplo, mamíferos, insetos, bolo- res e fungos, lêvedo). A célula procariótica inclui células bacterianas tais como células de E. coli. É preferível que o anticorpo usado na presente invenção seja expresso em uma célula de mamífero, tal como célula CHO, COS, de mieloma, BHK, Vero e HeLa.
Em seguida, a célula hospedeira transformada é cultivada in vitro ou in vivo para produzir o anticorpo de interesse. A cultura da célula hospedeira poderá ser realizada por meio de qualquer método conhecido. O meio de cultura que pode ser usado aqui poderá ser meio DMEM, MEM, RPMI 1640 ou IMDM. O meio de cultura poderá conter um suplemento sérico, tal como soro de bezerro fetal (FCS). Na produção do anticorpo recombinante, além das células hospedeiras acima mencionadas, um animal transgênico poderá também ser utilizado como hospedeiro. Por exemplo, o gene para anticorpo é in- serido em um sítio predeterminado de um gene que codifica uma proteína inerentemente produzida no leite de um animal (por exemplo, be- ta-caseína) para preparar um gene de fusão. Um fragmento de DNA que contém o gene para anticorpo-gene de fusão introduzido é injetado em um embrião de um animal não-humano, e o embrião é, então, introduzido em um animal fêmeo. O animal fêmeo que apresenta o embrião nele transporta um animal transgênico não-humano. O anticorpo de interesse é secretado no leite do animal transgênico não-humano ou uma progênie deste. Com a finalidade de aumentar a quantidade do leite que contém anticorpo, um hormônio apropriado poderá ser administrado ao animal transgênico (Ebert, K.M. e outros, Bio/Technology (1994) 12, 699-702).
O anticorpo expresso e produzido como descrito acima poderá ser isolado das células ou do corpo do animal hospedeiro e purificado. O isolamento e purificação do anticorpo usado na presente invenção poderão ser realizados em uma coluna de afinidade. Outros métodos convencio- nalmente usados para o isolamento e purificação de um anticorpo poderão também ser utilizados; assim, o método não é particularmente limitado. Por exemplo, várias cromatografias, filtração, ultrafiltração, separação ácida e diálise poderão ser usadas isoladamente ou em combinação para isolar e purificar o anticorpo de interesse (Anticorpos A Laboratory Manual (Anti- corpos: Manual de Laboratório). Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
(2) Anticorpo quimérico e Anticorpo humanizado
Na presente invenção, um anticorpo recombinante artificial- mente modificado poderá ser usado, incluindo um anticorpo quimérico e um anticorpo humanizado. Esses anticorpos modificados podem ser prepa- rados por meio de qualquer método conhecido. Por exemplo, técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison e outros, 1984, Proc. Nati Acad. Sci., 81: 6851-5.; Neuberger e outros, 1984, Nature, 312: 604-8.; Takeda e outros, 1985, Nature, 314: 452-4) podem ser utilizadas. Um anticorpo quimérico é uma molécula em que diferentes porções são derivadas de diferentes espécies animais, tais como aquelas que apresentam uma região variável derivada de uma região constante murina mAb e uma região constante humana de imunoglobulina, por e- xemplo, "anticorpos humanizados".
Um anticorpo quimérico de acordo com a presente invenção pode ser preparado Iigante o DNA que codifica a região V de anticorpos a DNA que codifica uma região C de anticorpos humanos, integrando o produto de ligação em um vetor de expressão e introduzindo o vetor de expressão recombinante resultante em um hospedeiro para produzir o anticorpo quimérico.
Um anticorpo humanizado é também referido como "anticorpo humano reformado", em que as regiões determinadoras de complementa- ridade (CDRs) de um anticorpo de um mamífero não-humano (por exemplo, um camundongo) são enxertadas naquelas de um anticorpo humano. O procedimento geral de recombinação genética para produzir esse anticorpo humanizado é também conhecido (por exemplo, EP 125023; WO 96/02576).
Especificamente, uma seqüência de DNA em que CDRs de anticorpos de camundongo se ligam através de regiões de moldura (FRs) é projetada e sintetizada por um método de RCP usando diversos oligonu- cleotídeos como iniciadores que foram projetados para apresentar regiões que se superpõem às regiões terminais das CDRs e FRs. O DNA resultante liga-se a DNA que codifica a região C de anticorpos humanos, e o produto de ligação é integrado em um vetor de expressão. O vetor de expressão recombinante resultante é introduzido em um hospedeiro, produzindo desse modo o anticorpo humanizado (por exemplo, WO 96/02576).
As FRs ligadas por meio das CDRs são selecionadas de modo que as CDRs possam formar um sítio funcional de ligação de antígenos. Se necessário, aminoácido(s) nas FRs da região V de anticorpos poderá(ão) ser substituído(s) de modo que as CDRs do anticorpo humano reformado possam formar um sítio apropriado de ligação de antígenos (Sato, K. e outros, Câncer Res. (1993) 53, 851-6).
O anticorpo quimérico é composto de regiões V derivadas de um anticorpo de mamífero não-humano e regiões C derivadas de um an- ticorpo humano. O anticorpo humanizado é composto de CDRs derivadas de um anticorpo de mamífero não-humano e FRs e regiões C derivadas de um anticorpo humano. O anticorpo humanizado poderá ser útil para uso clínico, porque a antigenicidade do anticorpo contra um corpo humano é reduzida.
Um exemplo específico de um anticorpo quimérico ou um an- ticorpo humanizado usado na presente invenção é um anticorpo em que as CDRs são derivadas do anticorpo monoclonal de camundongo 92-13 ou um anticorpo em que as CDRs são derivadas do anticorpo monoclonal de camundongo 93-22. O método para produzir esses anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados é descrito abaixo.
Para clonar DNA que compreende uma seqüência de nucleo- tídeos que codifica região V do anticorpo monoclonal de camundongo an- ti-FZD10, mRNA pode ser isolado de hibridomas e cada cDNA nas regiões V de cadeias LeH pode ser sintetizado com o uso de transcriptase inversa como descrito acima. Na síntese de cDNA, poderá ser usado iniciador Oligo-dT ou outro iniciador apropriado que hibridiza com região C de cadeia L ou H. Por exemplo, mas sem se limitar aos mesmos, podem ser usados iniciador CH1 (lgG2a) que apresenta a seqüência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO 3 para região V de cadeia H e iniciador CL1 (capa) que apresenta a seqüência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO 4 para região V de cadeia L.
Amplificação de cDNA de ambas as cadeias LeH pode ser realizada por RCP (reação em cadeia de polimerase) usando um kit co- mercialmente disponível (por exemplo, kit GeneRacer^ da Invitrogen) ou utilizando um método conhecido que inclui método 5-RACE (Frohman, M.A. e outros, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 85, 8998-9002, 1988.; Belyavsky, A. e outros, NucIeicAcids Res., 17, 2919-32, 1989). Os iniciadores específicos para amplificar DNA para regiões V do anticorpo monoclonal de camundongo 92-13 incluem iniciadores que apresentam as seqüências de nucleotídeos mostradas em NOs ID SEQ: 5 e 6 para região V de cadeia H e iniciadores que apresentam as seqüências de nucleotídeos mostradas em NOs ID SEQ: 7 e 8 para região V de cadeia L. Usando esses iniciadores, um DNA que codifica região V de cadeia H que apresenta uma seqüência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO 13 e um DNA que codifica região V de cadeia L que apresenta uma seqüência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO 21 podem ser amplificados. Os iniciadores específicos para amplificar DNA para regiões V do anticorpo monoclonal de camundongo 93-22 incluem iniciadores que apresentam as seqüências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NOs: 53 e 54 para região V de cadeia H e iniciadores que apresentam as seqüên- cias de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NOs: 55 e 56 para região V de cadeia L. Usando esses iniciadores, podem ser amplificados um DNA que codifica região V de cadeia H que apresenta uma seqüência de aminoá- cidos como mostrado em SEQ ID NO 29 e um DNAque codifica região V de cadeia L que apresenta uma seqüência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO 37.
Em seguida, os produtos amplificados são submetidos a ele- troforese em gel de agarose de acordo com procedimentos convencionais, e fragmentos de DNAde interesse são excisados, recuperados, purificados e ligados em um DNA de vetor.
O DNA e DNA de vetor obtidos podem ser ligados usando um kit de ligação conhecido para construir um vetor recombinante. Um DNA de vetor poderá ser preparado segundo um método conhecido: J. Sambrook e outros, "Molecular Cloning" ("Clonagem Molecular"), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. O DNA de vetor é digerido com enzima(s) de res- trição e a seqüência de nucleotídeos de um DNA desejado pode ser de- terminada por meio de um método conhecido ou usando um sequenciador automatizado.
Uma vez clonados fragmentos de DNA que codificam regiões V de cadeias L e H de anticorpo monoclonal de camundongo (daqui por di- ante cadeia L ou H de um anticorpo poderá às vezes ser referida como "cadeia L ou H de camundongo" para anticorpos de camundongo e "cadeia humana Lou H" para anticorpos humanos), os DNAs que codificam regiões V de camundongo e DNAs que codificam regiões constantes de anticorpos humanos são ligados e expressos para produzir anticorpos quiméricos.
Um método padrão para preparar anticorpos quiméricos en- volve ligar uma seqüência de camundongo condutora e seqüência de re- gião V presente em um cDNA clonado a uma seqüência que codifica uma região C de anticorpos humanos já presente em um vetor de expressão de uma célula de mamífero. Alternativamente, uma seqüência de camun- dongo condutora e seqüência de região V presente em um cDNA clonado são ligadas a uma seqüência que codifica uma região C de anticorpos humanos seguido de ligação a um vetor de expressão de uma célula de mamífero.
O polipeptídeo que compreende região C de anticorpos hu- manos pode ser qualquer um de regiões C de cadeia H ou L de anticorpos humanos, incluindo, por exemplo, C gama 1, C gama 2, C gama 3 ou C gama 4 para cadeias humanas H ou C lâmbda ou C capa para cadeias L.
Para preparar um anticorpo quimérico, dois vetores de ex- pressão são primeiro construídos, isto é, são construídos um vetor de ex- pressão que contém DNAs que codificam região V de cadeia L de ca- mundongo e região C de cadeia L humana sob o controle de um elemento de controle de expressão tal como um sistema intensificador/promotor, e um vetor de expressão que contém DNAs que codificam região V de cadeia H de camundongo e região C humana de cadeia H sob o controle de um elemento de controle de expressão tal como um sistema intensifica- dor/promotor. Em seguida, células hospedeiras tais como células de ma- míferos (por exemplo, células COS) são co-transformadas com esses ve- tores de expressão e as células transformadas são cultivadas in vitro ou in vivo para produzir um anticorpo quimérico: ver, por exemplo, W091/16928.
Alternativamente, a seqüência de camundongo condutora presente nos cDNAs e DNAs clonados que codificam região V de cadeia L de camundongo e região C de cadeia L humana, bem como a seqüência de camundongo condutora e DNAs que codificam região V de cadeia H de camundongo e região C de cadeia H humana, são introduzidos em um único vetor de expressão (ver, por exemplo, W094/11523), e sse vetor é usado para transformar a célula hospedeira; em seguida, o hospedeiro transformado é cultivado in vivo ou in vitro para produzir um anticorpo quimérico desejado.
O vetor para a expressão de cadeia H de um anticorpo quimé- rico pode ser obtido introduzindo cDNA que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica região V de cadeia H de camundongo (daqui por diante referido também como "cDNA para região V de cadeia H") em um vetor de expressão adequado que contém o DNA genômico que compre- ende a seqüência de nucleotídeos que codifica região C de cadeia H de anticorpo humano (daqui por diante referido também como "DNA genômico para região C de cadeia H") ou cDNA que codifica essa região (daqui por diante referido também como "cDNA para região C de cadeia Η"). A região C de cadeia H inclui, por exemplo, 4 regiões C gama 1, C gama 2, C gama 3 ou C gama.
Os vetores de expressão que apresentam o DNA genômico que codifica região C de cadeia H, em particular, aqueles que codificam região C gamma 1, incluem, por exemplo, HEF-PMh-g gama 1 (W092/19759) e E-RVh-PMI-f COM INCREMENTO DHER (W092/19759). Alternativa- mente, biblioteca de região constante humana pode ser preparada usando cDNA de PBMCs humanas (células mononucleares de sangue periférico) como descrito anteriormente (Liu, A.Y. e outros, Proc. NatL Acad. Sei. USA, Vol.84, 3439-43, 1987; Reff1 M.E. e outros, Blood, Vol.83, No.2, 435-45, 1994).
Quando cDNA que codifica região V de cadeia H de camun- dongo é inserida nesses vetores de expressão, uma seqüência apropriada de nucleotídeos pode ser introduzida nesse cDNA pelo método de RCP. Por exemplo, RCP poderá ser efetuada usando um iniciador de RCP que é projetado tal que esse cDNA tenha uma seqüência de reconhecimento para uma enzima de restrição adequada em sua extremidade 5' e seqüência de consenso de Kozak imediatamente antes de seu códon de início de modo a aperfeiçoar a eficiência de transcrição, bem como um iniciador de RCP que é projetado tal que esse cDNA tenha uma seqüência de reconhecimento para uma enzima de restrição adequada em sua extremidade 3' e um sítio doador de ligação para ligar apropriadamente os produtos de transcrição primária do DNA genômico para fornecer um mRNA, para introduzir essas seqüências apropriadas de nucleotídeos no vetor de expressão.
O cDNA que codifica região V de cadeia H de camundongo assim construído é tratado com enzima(s) de restrição adequada(s), em seguida ele é inserido nesse vetor de expressão para construir um vetor de expressão de cadeia H quimérica que contém o DNA genômico que codi- fica região C de cadeia H (região C gama 1).
O cDNA que codifica região V de cadeia H de camundongo assim construído é tratado com enzima(s) de restrição adequada(s), ligado a cDNAque codifica essa região C gama 1 de cadeia H e inserido em um vetor de expressão tal como pQCXIH (CIontech) para construir um vetor de expressão que contém o cDNAque codifica uma cadeia H quimérica.
O vetor para a expressão de cadeia L de um anticorpo quimé- rico pode ser obtido ligando um cDNA que codifica região V de cadeia L de camundongo e um DNAgenômico ou cDNAque codifica região C de cadeia L de um anticorpo humano e introduzindo-os em um vetor de expressão adequado. A região C de cadeia L inclui, por exemplo, cadeia capa e cadeia lâmbda.
Quando um vetor de expressão que contém cDNA que codifica região V de cadeia L de camundongo é construído, seqüências apropriadas de nucleotídeos tal como uma seqüência de reconhecimento ou seqüência de consenso de Kozak podem ser introduzidas nesse vetor de expressão por meio de método de RCP.
A seqüência inteira de nucleotídeos de cDNA que codifica re- gião C de cadeia L lâmbda humana poderá ser sintetizada por um sinteti- zador de DNA e construída por meio de método de RCP. A região C de cadeia L lâmbda humana é conhecida por apresentar pelo menos 4 isotipos diferentes e cada isotipo pode ser usado para construir um vetor de ex- pressão.
O cDNA construído que codifica região C de cadeia L lâmbda humana e o cDNA acima construído que codifica região V de cadeia L de camundongo podem ser ligados entre sítios de enzima de restrição ade- quados e inseridos em um vetor de expressão tal como pQCXIH (Clontech), para construir um vetor de expressão que contém cDNA que codifica uma cadeia L lâmbda de um anticorpo quimérico.
O DNA que codifica região C de cadeia L capa humana a ser ligado ao DNA que codifica região V de cadeia L de camundongo pode ser construído a partir de, por exemplo, HEF-PM1k-gk que contém o DNA genômico (ver W092/19759). Alternativamente, biblioteca de região constante humana pode ser preparada usando cDNA de PBMCs humanas (células mononucleares de sangue periférico) conforme descrito anteri- ormente (Liu, A.Y. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol.84, 3439-43, 1987; Reff, M.E. e outros, Bhod1 Vol.83, No.2, 435-45, 1994).
Seqüências de reconhecimento para enzimas de restrição adequadas podem ser introduzidas, por meio de método de RCP, nas ex- tremidades 5' e 3' de DNAque codifica região C de cadeia L capa, e o DNA que codifica região V de cadeia L de camundongo como construído acima e o DNA que codifica região C de cadeia L capa podem ser ligados um ao outro e inseridos em um vetor de expressão tal como pQCXIH (CIontech) para construir um vetor de expressão que contém cDNA que codifica ca- deia L capa de um anticorpo quimérico.
Afim de tornar humanizado um anticorpo em que CDR de um anticorpo monoclonal de camundongo é enxertada em um anticorpo hu- mano, é desejável que exista uma alta homologia entre FR do anticorpo monoclonal de camundongo e FR do anticorpo humano. Consequente- mente, é feita uma comparação entre regiões V de cadeias HeL anticorpo monoclonal anti-FZD10 de camundongo e as regiões V de todos os anti- corpos conhecidos cujas estruturas foram elucidadas com o uso de Banco de Dados de Proteínas. Adicionalmente, elas são simultaneamente com- paradas com os subgrupos de anticorpos humanos (HSG: Subgrupo hu- mano) classificados por Kabat e outros com base no comprimento da FR do anticorpo, na homologia de aminoácidos e similares: Kabat, E.A. et al, US Dep. Health e Human Services, US Government Printing Offices (Depar- tamento Norte-Americano de Serviços de Saúde e Sociais, Imprensa Ofi- cial do Governo dos Estados Unidos), 1991.
A primeira etapa para projetar DNA que codifica uma região V de anticorpos humanizados é selecionar uma região V de anticorpos hu- manos como base para o projeto. Por exemplo, FR de uma região V de anticorpos humanos que apresenta uma homologia superior a 80% com FR de uma região V de anticorpos de camundongo pode ser usada na pro- dução de um anticorpo humanizado.
No anticorpo humanizado, a região C e as regiões de moldura (FR) da região V desse anticorpo são originadas de ser humano e as re- giões determinadoras de complementaridade (CDR) da região V são ori- ginadas de camundongo. Um polipeptídeo que compreende a região V do anticorpo humanizado pode ser produzido da maneira chamada enxerto de CDR pelo método de RCP, contanto que um fragmento de DNA de um an- ticorpo humano se tornasse disponível como padrão. O "enxerto de CDR" refere-se a um método em que um fragmento de DNA que codifica uma CDR derivada de camundongo é produzida e substituída pela CDR de um anticorpo humano como padrão.
Se um fragmento de DNAde um anticorpo humano a ser usado como padrão não é disponível, a seqüência de nucleotídeos registrada em um banco de dados poderá ser sintetizada em um sintetizador de DNA e um DNA para uma região V de um anticorpo humanizado pode ser produ- zido pelo método de RCP. Adicionalmente, quando somente uma sequên- cia de aminoácidos é registrada no banco de dados, toda a seqüência de nucleotídeos poderá ser deduzida da seqüência de aminoácidos com base em conhecimento no uso de códon em anticorpos como relatado por Kabat, Ε.A. e outros in US Dep.Health e Human Services, US Government Printing Offices, 1991. Essa seqüência de nucleotídeos é sintetizada em um sinte- tizador de DNA e um DNA de uma região V de anticorpos humanizados pode ser preparado por método de RCP e introduzido em um hospedeiro adequado seguido de sua expressão para produzir o polipeptídeo desejado.
Procedimentos gerais de enxerto de CDR pelo método de RCP são descritos abaixo quando um fragmento de DNA de um anticorpo hu- mano como padrão é disponível.
Primeiro, são sintetizados fragmentos de DNA derivados de camundongo correspondentes a respectivas CDRs. CDRs 1 a 3 são sinte- tizadas com base nas seqüências de nucleotídeos das regiões V de ca- deias H e L de camundongo anteriormente clonadas. Por exemplo, quando um anticorpo humanizado é produzido com base no anticorpo monoclonal de camundongo 92-13, seqüências de CDR de região V de cadeia H podem ser as seqüências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 15 (VH CDR1), 17 (VH CDR2) e 19 (VH CDR3); e seqüências de CDR de região V de cadeia L podem ser as seqüências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 23 (VL CDR1), 25 (VL CDR2) e 27 (VL CDR3). Quando um anti- corpo humanizado é produzido com base no anticorpo monoclonal de camundongo 93-22, seqüências de CDR de região V de cadeia H podem ser as seqüências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 31 (VH CDR1), 33 (VH CDR2) e 35 (VH CDR3); e seqüências de CDR de região V de cadeia L podem ser as seqüências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 39 (VL CDR1), 41 (VL CDR2) e 43 (VL CDR3).
O DNA para região V de cadeia H de um anticorpo humanizado poderá ser ligado a DNA de qualquer região C de cadeia H de anticorpos humanos, por exemplo, região C gama 1 de cadeia H humana. Como mencionado acima, o DNA de região V de cadeia H poderá ser tratado com uma enzima de restrição adequada e ligado a DNA que codifica a região C de cadeia H humana sob um elemento de controle de expressão tal como um sistema intensificador/promotor para produzir um vetor de expressão que contém DNAs para uma região V de cadeia H humanizada e uma re- gião C de cadeia H humana.
O DNA para região V de cadeia L de um anticorpo humanizado poderá ser ligado a DNA de qualquer região C de cadeia L de anticorpos humanos, por exemplo, região C lâmbda de cadeia L humana. O DNA para região V de cadeia L poderá ser tratado com uma enzima de restrição adequada e ligado a um DNA que codifica a região C de cadeia L lâmbda humana sob um elemento de controle de expressão tal como um sistema intensificador/promotor para produzir um vetor de expressão que contém DNAs que codificam uma região V de cadeia L humanizada e uma região C de cadeia L lâmbda humana.
O DNA que codifica região V de cadeia H de um anticorpo humanizado e uma região C de cadeia H humana e o DNAque codifica uma região V de cadeia L humanizada e região C de cadeia L humana poderão também ser introduzidos em um único vetor de expressão tal como aquele descrito no W094/11523, esse vetor poderá ser usado para transformar a célula hospedeira e o hospedeiro transformado poderá ser cultivado in vivo ou in vitro para produzir um anticorpo humanizado desejado.
Para produzir um anticorpo quimérico ou humanizado, deverão ser preparados dois vetores de expressão como mencionado acima. Assim, com relação a um anticorpo quimérico, são construídos um vetor de ex- pressão que compreende um DNA que codifica uma região V de cadeia H de camundongo e uma região C de cadeia H humana, sob o controle de um elemento de controle de expressão tal como um intensificador/promotor, e um vetor de expressão que compreende um DNA que codifica a região V de cadeia L de camundongo e a região C de cadeia L humana sob o controle de um elemento de controle de expressão. Com relação a um anticorpo humanizado, são construídos um vetor de expressão que compreende um DNA que codifica uma região V de cadeia H humanizada e uma região C de cadeia H humana sob o controle de um elemento de controle de expressão, e um vetor de expressão que compreende um DNA que codifica uma região V de cadeia L humanizada e uma região C de cadeia L humana sob o controle de um elemento de controle de expressão.
Em seguida, uma célula hospedeira tal como uma célula de mamífero (por exemplo, célula COS) poderá ser co-transformada com esses vetores de expressão e a célula transformada resultante poderá ser cultivada in vitro ou in vivo para produzir o anticorpo quimérico ou huma- nizado (ver, por exemplo, W091/16928).
Alternativamente, um DNAque codifica regiões V e C de cadeia H e um DNA que codifica regiões V e C de cadeia L poderão ser ligados a um único vetor e transformados em uma célula hospedeira adequada para produzir um anticorpo. Assim, na expressão de um anticorpo quimérico, um DNA que codifica uma seqüência de camundongo condutora presente no cDNA clonado, uma região V de cadeia H de camundongo e uma região C de cadeia H humana, bem como um DNA que codifica uma seqüência de camundongo condutora, uma região V de cadeia L de camundongo e uma região C de cadeia L humana, podem ser introduzidos em um único vetor de expressão tal como aquele descrito in, por exemplo, W094/11523. Na expressão de um anticorpo humanizado, um DNAque codifica uma região V de cadeia H humanizada e uma região C de cadeia H humana e um DNA que codifica um região V de cadeia L humanizada e uma região C de cadeia L humana poderão ser introduzidos em um único vetor de expressão tal como aquele descrito in, por exemplo, W094/11523. Esse vetor é usado para transformar uma célula hospedeira e o hospedeiro transformado é cultivado in vivo ou in vitro para produzir um anticorpo quimérico ou hu- manizado de interesse.
Qualquer sistema de expressão poderá ser usado para produzir o anticorpo quimérico ou humanizado contra proteína FZD10 de acordo com a presente invenção. Por exemplo, células eucarióticas incluem cé- lulas animais tais como linhagens de células de mamífero estabelecidas, células fúngicas e células de lêvedo; células procarióticas incluem células bacterianas tal como Escherichia coii. Preferencialmente, o anticorpo quimérico ou humanizado da presente invenção é expresso em uma célula de mamífero tal como célula COS ou CHO. Quaisquer promotores convencionais úteis para a expressão em célula de mamíferos poderão ser usados. Por exemplo, promotor inicial imediato de citomegalovírus humano (CMVH) é preferencialmente usado. Adicionalmente, promotores para expressão genética em células de ma- míferos poderão incluir promotores viróticos, tais como aqueles de retro- vírus, vírus de polioma, adenovírus e vírus simiesco (SV) 40, e promotores derivados de células de mamíferos, tais como aqueles de fator-1 alfa de alongamento de cadeia de polipeptídeo humano (HEF-1 alfa). Por exemplo, promotor SV40 poderá ser prontamente usado de acordo com método de Mulligan e outros (Nature, 277, 108-14, 1979); método de Mizushima, S. e outros (Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990) poderá ser facilmente utilizado com promotor HEF-1 alfa.
Origem de replicação inclui aquelas derivadas de SV40, vírus de polioma, adenovírus ou vírus de papiloma bovino (BPV). Adicionalmente, o vetor de expressão poderá compreender um gene para fosfotransferase APH(3') Il ou I (neo), timidina quinase (TK), xantina-guanina fosforribosil- transferase de E. coli (Ecogpt) ou diidrofolato reductase (DHFR) como marcador seletivo para aumentar o número de cópias genéticas em um sistema de células hospedeiras.
O anticorpo quimérico ou humanizado de interesse que é assim produzido mediante cultura do transformante transformado com um DNA que codifica o anticorpo quimérico ou humanizado poderá ser isolado da célula e em seguida purificado.
O isolamento e purificação do anticorpo quimérico ou huma- nizado de interesse poderão ser realizados usando uma coluna de agarose com proteína A, mas poderão também ser realizados por meio de quais- quer métodos utilizados no isolamento e purificação de uma proteína, e, desse modo, não são limitados. Por exemplo, cromatografia, ultrafiltração, separação ácida e diálise poderão opcionalmente ser selecionadas ou combinadas para isolar e purificar o anticorpo quimérico ou humanizado.
Após isolar o anticorpo quimérico ou anticorpo humanizado, a concentração do anticorpo purificado resultante pode ser determinada por ELISA.
A determinação da atividade de ligação a antígeno ou outras atividades, incluindo atividade de ligação a uma célula normal do anticorpo quimérico ou anticorpo humanizado poderá ser realizada por meio de quaisquer métodos conhecidos (Antibodies A Laboratory Manual (Anti- corpos: Manual de Laboratório), Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
Como método para a determinação da atividade de ligação a antígeno de um anticorpo, técnicas tais como ELISA (ensaio imunossor- vente ligado à enzima), EIA (imunoensaio enzimático), RIA (rá- dio-imunoensaio) ou ensaio fluorescente poderão ser empregados. (3) Fragmento de anticorpo e Anticorpo modificado
O anticorpo usado na presente invenção poderá ser qualquer fragmento do mesmo ou um anticorpo modificado, contanto que ele possa ligar-se a proteína FZD10 e inibir sua atividade. Por exemplo, o fragmento do anticorpo inclui Fab, F(ab')2, Fv ou uma única cadeia Fv (scFv) com- posta de um fragmento Fv de cadeia H ou um fragmento Fv de cadeia L ligados por meio de um Iigante adequado. Especificamente, tais fragmen- tos de anticorpo podem ser produzidos clivando o anticorpo com uma en- zima (por exemplo, papaína, pepsina) em fragmentos de anticorpo, ou construindo um gene que codifica o fragmento de anticorpo e inserindo o gene em um vetor de expressão e introduzindo o vetor de expressão re- combinante resultante em uma célula hospedeira adequada, expressando desse modo o fragmento de anticorpo (ver, por exemplo, Co, M. S. e outros, J. Immunol. (1994), 152, 2968-76; Better, M. & Horwitz, A.H., Methods in Enzymologyi 1989), 178, 476-96, Academic Press, lnc.\ Pluckthun, A. & Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515, Academic Press, Inc.] Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-63; Rousseaux, J. e outros, Methods in Enzymology (1989) 121, 663-9; e Bird, R.E. e outros, Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-7). Alternativamente, bibliotecas de ex- pressão de Fab poderão ser construídas (Huse e outros, 1989, Science, 246: 1275-81) para permitir rápida e fácil identificação de fragmentos monoclonais de Fab com a especificidade desejada.
Um scFv pode ser produzido ligando a região V de cadeia H à região V de cadeia L por meio de um ligante, preferencialmente um Iigante peptídico (Huston, J. S. e outros, Proc. Nati Acad. Sei. USA (1988) 85, 5879-83). A região V de cadeia Hea região V de cadeia L no scFv poderão ser derivadas de qualquer um dos anticorpos descritos aqui. O ligante peptídico que liga as regiões V poderá ser qualquer peptídeo de cadeia única, por exemplo, de 12-19 resíduos de aminoácidos.
Como anticorpo modificado, por exemplo, anticorpo anti-FZD10 ou fragmento do mesmo conjugado com qualquer molécula (por exemplo, polietilenoglicol) poderá também ser usado. Esses anticorpos modificados são também incluídos no "anticorpo" da presente invenção. Os anticorpos modificados podem ser preparados por meio de modificações químicas dos anticorpos. As técnicas de modificação química adequadas para este fim já foram estabelecidas no estado da técnica.
2. USOS TERAPÊUTICOS
São descritos abaixo métodos e composições farmacêuticas para tratar e/ou prevenir doença associada a FZD10 usando o anticorpo da presente invenção. O resultado de um tratamento é pelo menos produzir em um indivíduo tratado um benefício saudável, que, no caso de tumores, inclui, mas sem se limitar aos mesmos, remissão dos tumores, mitigação dos sintomas dos tumores e control de disseminação metastática dos tu- mores.
Especificamente, o método para tratar e/ou prevenir doença associada a FZD10 em um indivíduo de acordo com a presente invenção compreende administrar a um indivíduo com necessidade desse trata- mento e/ou prevenção o anticorpo ou o fragmento descrito acima.
O termo "indivíduo" aqui refere-se a um indivíduo que sofre de doença associada a FZD10 e também a um indivíduo suspeito de apre- sentar doença associada a FZD10. O indivíduo na presente invenção po- derá ser animais que incluem mamíferos e animais aviários. Por exemplo, mamíferos poderão incluir seres humanos, camundongos, ratos, macacos, coelhos e cães.
O termo "doença associada a FZD10" aqui refere-se a uma doença associada à superexpressão de proteína FZD10. Especificamente, doenças associadas a FZD10 incluem, mas sem se limitar às mesmas, sarcoma sinovial (SS)1 câncer colorretal, câncer gástrico, leucemia mie- lóide crônica (CML) e leucemia mielóide aguda (AML).
O anticorpo ou fragmento deste descrito aqui pode especifi- camente ligar-se à proteína FZD10, de modo que, quando o anticorpo ou fragmento deste é administrado a um indivíduo, ele se liga à proteína FZD10 no indivíduo e a atividade de proteína FZD10 poderá ser inibida. Alternativamente, quando o anticorpo ou fragmento deste poderá ser conjugado com uma porção terapêutica e administrado a um indivíduo, ele é derivado em uma região que expressa proteína FZD10 (isto é, região afetada) em um indivíduo e a porção terapêutica pode ser seletivamente transportada à região afetada e atuar nela. Essa porção terapêutica poderá ser qualquer substância terapêutica que é conhecida ou que será desen- volvida para apresentar uma eficácia terapêutica sobre doença associada a FZD10 e inclui, mas sem se limitar aos mesmos, um marcador de radioi- sótopo e agente quimioterapêutico. Um marcador de radioisótopo que pode ser usado como substância terapêutica pode ser selecionado dependendo de uma variedade de elementos que incluem energia de raios β e sua efi- ciência de emissão, a presença ou ausência de raios γ emitidos, sua e- nergia e eficiência de emissão, meia-vida física e procedimento de mar- cação. Geralmente, o marcador de radioisótopo baseado em ítrio (tal como 90Y) e iodo (tais como 125I e 131I) poderá ser usado. Um agente quimiote- rapêutico poderá ser qualquer agente que é conhecido ou que será de- senvolvido para tratar doença associada a FZD10 e inclui, mas sem se limitar aos mesmos, metotrexato, taxol, mercaptopurina, tioguanina, cis- platina, carboplatina, mitomicina, bleomicina, doxorrubicina, idarrubicina, daunorrubicina, dactinomicina, vinblastina, vincristina, vinorelbina, pacli- taxel e docetaxel. O anticorpo ou fragmento deste descrito aqui pode se- letivamente ligar-se à proteína FZD10 e não ligar-se a uma célula normal, de modo que efeito colateral que é causado pelo anticorpo ou fragmento deste, ou radioisótopo ou agente quimioterapêutico, possa ser eficazmente evitado e, portanto, a potência terapêutica possa ser alta.
O anticorpo ou fragmento deste descrito aqui pode ser admi- nistrado a um indivíduo sob doses eficazes para tratar ou prevenir a doença associada a FZD10. Uma dose eficaz refere-se àquela quantidade de um anticorpo ou um fragmento deste suficiente para resultar em um benefício saudável no indivíduo tratado. Formulações e métodos de administração que podem ser empregados quando a composição farmacêutica contém um anticorpo da presente invenção são descritos abaixo.
Composições farmacêuticas para uso de acordo com a pre- sente invenção podem ser formuladas de maneira convencional usando um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
Os anticorpos ou fragmentos destes podem ser formulados para administração parenteral (isto é, intravenosa ou intramuscular) por meio de injeção, via, por exemplo, injeção de bolo ou infusão contínua. Formulações para injeção pode ser apresentada em forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes multidoses, com um conservante adicionado. As composições podem tomar formas tais como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes formulatórios tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, o anticorpo pode ser em forma de pó Iiofilizado para constituição com um veiculo adequado, por exemplo, água estéril sem pirogênio, antes de uso.
Toxicidade e eficácia terapêutica do anticorpo ou fragmento, ou da porção terapêutica conjugada com ele, pode ser determinada por meio de procedimentos farmacêuticos padrão em cultura de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal em 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da po- pulação). A razão de doses entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expresso como a razão LD/ED.
Anticorpos ou porções terapêuticas que exibem grandes índi- ces terapêuticos são preferidos. Embora anticorpos ou porções que exibem efeitos colaterais tóxicos possam ser usados, deve-se tomar cuidado para projetar um sistema de transporte que tenha como alvo esses anticorpos ou porções no sítio de tecido afetado a fim de minimizar dano potencial a cé- lulas não-infectadas e, desse modo, reduzir efeitos colaterais.
Os dados obtidos dos ensaios de cultura com células e estudos animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagens para uso em seres humanos. A dosagem de tais anticorpos situa-se preferenci- almente em uma faixa de concentrações plasmáticas circulantes que in- cluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar nessa faixa dependendo da forma de dosagem empregada, da via de ad- ministração utilizada e tipos e quantidades da porção terapêutica conju- gada. Para qualquer anticorpo usado no método da invenção, a dose eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de culturas celulares.
Uma dose pode ser formulada em modelos animais para obter uma faixa de concentrações plasmáticas circulanttes que inclui a IC50 (isto é, a con- centração do anticorpo de teste que atinge uma inibição de sintomas me- tade da máxima) como determinado em cultura de células. Essa informa- ção pode ser usada para determinar mais precisamente doses úteis em seres humanos. Níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficácia.
Embora dependendo das condições e idade do indivíduo e/ou via de administração, aquele habilitado no estado da técnica pode sele- cionar uma dose apropriada da composição farmacêutica da presente in- venção. Por exemplo, a composição farmacêutica da presente invenção é administrada em uma quantidade tal que o anticorpo de acordo com a presente invenção seja administrado ao indivíduo em um dia em uma quantidade de cerca de 3 a cerca de 15 μg por kg de peso corporal do indivídio, e, preferencialmente, de cerca de 10 a cerca de 15 μg por kg de peso corporal do indivídio. O intervalo e tempos de administração podem ser selecionados em consideração da condição e idade do indivíduo, via de administração e resposta à composição farmacêutica. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser administrada ao indivíduo uma a cinco vezes, preferencialmente 1 vez ao dia por 5 a 10 dias.
A composição farmacêutica pode ser administrada sistêmica ou localmente. Ela é preferencialmente administrada sob uma maneira de transporte direcionada a alvo, de modo a transferir o componente ativo a um sítio afetado.
Em modalidades particulares, os métodos e composições da presente invenção são usados para o tratamento ou prevenção de doença associada a FZD10 juntamente com um ou uma combinação de agentes quimioterápicos que incluem, mas sem se limitar aos mesmos, metotrexato, taxol, mercaptopurina, tioguanina, cisplatina, carboplatina, mitomicina, bleomicina, doxorrubicina, idarrubicina, daunorrubicina, dactinomicina, vinblastina, vincristina, vinorelbina, paclitaxel e docetaxel.
Com respeito à terapia com radiação, qualquer protocolo de terapia com radiação pode ser usado dependendo do tipo de doença as- sociada a FZD10 a ser tratada. Por exemplo, mas não à guisa de limitação, radiação de raios X pode ser administrada. Radioisótopos que emitem raios gama, tais como isótopos radioativos de rádio, cobalto e outros e- lementos poderão também ser administrados a tecidos expostos.
Em outra modalidade, quimioterapia ou terapia com radiação é administrada, preferencialmente pelo menos uma hora, cinco horas, 12 horas, um dia, uma semana, um mês e mais preferencialmente diversos meses (por exemplo, até três meses) subsequentes ao uso dos métodos e composições que contêm o anticorpo da presente invenção. A quimiotera- pia ou terapia com radiação administrada antes, concorrentemente ou subseqüentemente ao tratamento com uso dos métodos e composições de acordo com a presente invenção pode ser realizada por meio de qualquer método conhecido no estado da técnica.
3. USOS DIAGNÓSTICOS e PROGNÓSTICOS
Anticorpos direcionados contra proteína FZD10 ou fragmentos desta poderão também ser usados como diagnósticos e prognósticos, conforme descrito aqui. Esses métodos de diagnósticos poderão ser usa- dos para detectar a presença ou ausência de doença associada a FZD10 e o risco de apresentar a doença. O método para diagnose e/ou prognose de uma doença associada a FZD10 da presente invenção compreende de- tectar ou determinar imunologicamente a proteína FZD10 derivada da doença em uma amostra usando um anticorpo ou um fragmento deste de acordo com a presente invenção. Especificamente, um método para di- agnose ou prognose de doença associada a FZD10 ou de uma predispo- sição para desenvolver a doença em um indivíduo de acordo com a pre- sente invenção compreende:
(a) contatar uma amostra do indivíduo com um anticorpo contra proteína FZD10 ou um fragmento deste;
(b) detectar a proteína FZD10 na amostra; e
(c) julgar se o indivíduo sofre ou não de ou está em risco de desenvolver a doença com base na abundância relativa da proteína FZD10 em comparação com um controle.
O método para diagnose ou prognose da presente invenção pode ser realizado com base em quaisquer procedimentos, contanto que seja um ensaio que utilize um anticorpo, isto é, um ensaio imunológico. Desse modo, pode-se detectar a proteína FZD10 usando o anticorpo ou um fragmento deste da presente invenção como anticorpo usado no ensaio. Por exemplo, a proteína FZD10 pode ser detectada utilizando uma colo- ração imuno-histoquímica, imunoensaio tais como imunoensaios enzimá- ticos (ELISA e EIA), ensaio imunofluorescente, rádio-imunoensaio (RIA) ou Western blotting.
Uma amostra a ser testada no método de diagnose e/ou prognose de doença associada a FZD10 da presente invenção não é es- pecificamente limitada, contanto que ela seja uma amostra biológica que possa conter a proteína FZD10 derivada da doença associada a FZD10. Exemplos da amostra incluem extrato de uma célula ou órgão, e seções de tecido, bem como sangue, soros, plasma, sobrenadante cultivado de Iin- fócitos, urina, fluido espinhal, saliva, suor e ascite. A abundância da pro- teína FZD10 como determinado em amostras tais como tecido de tumor, biópsia de tumor e tecido de metástase usando o anticorpo ou um frag- mento deste da presente invenção é especificamente útil como índice de uma doença associada a FZD10.
Por exemplo, anticorpos e fragmentos destes descritos aqui poderão ser usados para detectar Quantitativa ou qualitativamente a pro- teína FZD10. Os anticorpos (ou fragmentos destes) da presente invenção poderão, adicionalmente, ser empregados histologicamente, como mi- croscopia de imunofluorescência ou imunoeletrônica, para detecção in situ de proteína FZD10. Detecção in situ poderá ser realizada removendo uma amostra histológica de um indivíduo, tais como seções de tecido embutidas em parafina (tais como espécimes cirúrgicos), e aplicando-lhes um anti- corpo marcado da presente invenção. O anticorpo (ou fragmento deste) é preferencialmente applicado sobrepondo uma amostra com o anticorpo (ou fragmento deste) marcado. Usando a presente invenção, aqueles habili- tados no estado da técnica perceberão imediatamente que qualquer de uma variedade de métodos histológicos (tais como procedimentos de co- loração) pode ser modificada a fim de obter essa detecção in situ.
Imunoensaio para proteína FZD10 compreenderá tipicamente incubar uma amostra de um indivíduo a ser examinado, tais como um fluido biológico, um extrato de tecido, células colhidas recentemente ou Iisatos de células que foram incubadas em cultura de células, na presença de um anticorpo detectavelmente marcado da presente invenção, e detectar o anticorpo ligado por meio de qualquer de várias técnicas bem conhecidas no estado da técnica.
A amostra poderá ser levada a contato com e imobilizada em um suporte ou veículo em fase sólida tal como nitrocelulose, ou outro su- porte sólido que é capaz de imobilizar células, partículas celulares ou proteínas solúveis. O suporte poderá, então, ser lavado com tampões adequados seguido de tratamento com o anticorpo detectavelmente mar- cado contra FZD10. O suporte em fase sólida poderá, por conseguinte, ser lavado com o tampão uma segunda vez para remover anticorpo não-ligado. A quantidade de marcador ligado no suporte sólido poderá, então, ser detectada por meios convencionais.
O termo "suporte ou veículo em fase sólida" significa qualquer suporte capaz de ligar-se a um antígeno ou um anticorpo. Aqueles habili- tados no estado da técnica conhecerão muitos veículos adequados para ligar-se a anticorpos ou antígenos, ou serão capazes de avaliar os mesmos mediante uso de experimentação de rotina.
A atividade de ligação de um dado lote de anticorpos an- ti-FZD10 poderá ser determinada de acordo com métodos bem-conhecidos. Aqueles habilitados no estado da técnica serão capazes de determinar condições operativas e ótimas de ensaio para cada determinação empre- gando experimentação de rotina.
Para detectar facilmente uma reação entre o anticorpo (ou seu fragmento) da presente invenção e a proteína FZD10 derivada de um sítio afetado por doença associada a FZD10 em uma amostra, a reação pode ser diretamente detectada marcando o anticorpo da presente invenção ou indiretamente detectada usando um anticorpo secundário marcado. Esse último procedimento de detecção indireta, tal como um ensaio intercalado ou ensaio competitivo de ELISA, é preferencialmente usado no método da presente invenção para melhor sensibilidade.
Exemplos de marcadores para uso aqui são como seguem.
Peroxidases (PODs)1 fosfatases alcalinas, β-galactosidase, urease, cata- lase, glicose oxidase, Iactato desidrogenase, amilases e complexos bioti- na-avidina podem ser usados em um imunoensaio enzimático. Isotiocia- nato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), isotiocianato de rodamina substituído, isotiocianato de diclorotriazina e Alexa488 podem ser usados em um ensaio imunofluorescente. Trítio, iodo (tal como 125I e 131I) e índio (tal como 111In) podem ser usados em um rá- dio-imunoensaio. Ensaio de NADH-FMNhh-luciferase, sistema Iumi- nol-peróxido de hidrogênio-POD, ésteres de acridínio e compostos de di- oxetano podem ser usados em um ensaio imunoluminescente.
O marcador pode ser ligado ao anticorpo de acordo com um procedimento convencional. Por exemplo, o marcador pode ser ligado ao anticorpo por meio de um método de glutaraldeído, método de maleimida, método de dissulfeto de piridila ou método de periodato no imunoensaio enzimático, e por um método de cloramina T ou método de Bolton-Hunter no rádio-imunoensaio.
O ensaio pode ser realizado de acordo com um procedimento conhecido (Ausubel, F.M. e outros Eds., Short Protocols in Molecular Bio- logy (Protocolos Breves em Biologia Molecular), Capítulo 11, "Immunology", John Wiley & Sons, Inc., 1995).
Por exemplo, quando o anticorpo da presente invenção é di- retamente marcado com o marcador descrito acima, a amostra é levada a contato com o anticorpo marcado para formar desse modo um complexo entre a proteína FZD10 e o anticorpo. Em seguida, anticorpo marcado não-ligado é separado e o nível da proteína FZD10 na amostra pode ser determinado com base na quantidade de anticorpo marcado ligado ou na quantidade de anticorpo marcado não-ligado.
Quando um anticorpo secundário marcado é utilizado, o anti- corpo da presente invenção é deixado reagir com a amostra em uma re- ação primária, e o complexo resultante é deixado reagir com o anticorpo secundário marcado em uma reação secundária. A reação primária e a reação secundária podem ser realizadas em ordem inversa, concorren- temente, com algum intervalo de tempo entre elas. As reações primária e secundária produzem um complexo [proteína FZD10]-[o anticorpo da in- venção]-[o anticorpo secundário marcado] ou um complexo [o anticorpo da invenção]-[proteína FZD10]-[o anticorpo secundário marcado]. Anticorpo =secundário marcado não-ligado é, então, separado e nível da proteína FZD10 na amostra pode ser determinado com base na abundância de anticorpo secundário marcado ligado ou abundância de anticorpo secun- dário marcado não-ligado.
De acordo com outra modalidade, o anticorpo da presente in- =venção é marcado com um radioisótopo ou um marcador fluorescente, e o anticorpo marcado é parenteralmente administrado a um indivíduo. Assim, a localização de um tumor primário e o tumor com metástase correlato de doença associada a FZD10 pode ser rapidamente verificado de uma ma- neira não-invasiva. Esse método de diagnose é conhecido como formação de imagem de tumor in vivo, e aquele habilitado no estado da técnica pode facilmente entender seus procedimentos. O anticorpo marcado pode ser administrado ao indivíduo sistêmica ou localmente, preferencialmente por meio de uma via parenteral tais como injeção intravenosa, injeção intra- muscular, injeção intraperitoneal ou injeção subcutânea.
Os anticorpos de acordo com a presente invenção reagem especificamente com uma proteína FZD10 como mencionado acima e podem desse modo ser usados em kits para diagnose e/ou prognose de uma ddoença associada a FZD10.
O kit para diagnose e/ou prognose da presente invenção compreende um anticorpo ou um fragmento deste descrito aqui. Detec- tando a proteína FZD10 em uma amostra de um indivíduo que é suspeito de sofrer de uma doença associada a FZD10 com o uso do kit para diag- nose e/ou prognose da presente invenção, pode-se rápida e facilmente avaliar se o indivíduo sofre ou não da doença associada a FZD10. Kits para diagnose e/ou prognose de doenças usando tais reações imunológicas são amplamente conhecidos, e aquele habilitado no estado da técnica pode facilmente selecionar componentes apropriados diferentes de anticorpo.
Os kits para diagnose e/ou prognose da presente invenção podem ser usados em qualquer dispositivo, contanto que este seja um dispositivo para imunoensaio.
EXEMPLOS:
A presente invenção será adicionalmente ilustrada pelos e- xemplos seguintes não-limitativos.
Linhagens de células e espécimes de tecidos usados nos exemplos seguintes foram preparados conforme descrito abaixo. Especi- ficamente, linhagens de células derivadas de sarcomas sinoviais (HS-SY-2, YaFuSS1 1973/99, Fuji e SYO-1), cânceres do cólon (LoVo, SNU-C4 e SNU-C5), HEK293 e células COS7 foram desenvolvidas em monocamadas em meios apropriados suplementados com soro bovino fetal a 10% e 1% solução a 1% antibiótico/antimicótico e mantidas a 37°C em ar contendo 5% de CO2. Amostras de sarcoma sinovial (SS) primário foram obtidas após permissão informada e congeladas bruscamente em nitrogênio lí- quido imediatamente após ressecção e armazenadas a -80°C.
Exemplo 1
Geração de anticorpos monoclonais anti-FZD10
(1) Geração de anticorpos monoclonais com imunização celular
Anticorpos monoclonais anti-FZD10 de camundongo (Mabs) foram gerados mediante imunização de camundongos Balb/c de quatro semanas de idade em suas almofadas dos pés com 2 χ 107 células COS-7 transfectadas com 2 χ 10^7 de pCAGGS/neo-FZD10-myc/His (Medicai and Biological Laboratories, Nagóia, Japão). A construção de pCAGGS/neo-FZD10-myc/His foi relatada anteriormente (Nagayama, S. e outros (2005). Oncogene, 24, 6201-12) e esta expressa toda a seqüência de codificação de cDNA de FZD10 e pontas de epítopos Myc e His em seu término C. Os camundongos foram imunizadas com adjuvante de Freund completo (Mitsubishi Kagaku latron, Inc., Tóquio, Japão) um dia antes da imunização células. Células do baço dos camundongos imunizadas foram colhidas e fundidas com a linhagem de células de mieloma. Os hibridomas foram subclonados e ensaiados por ELISA celular em relação à capacidade de secretar imunoglobulina que se liga ao domínio extracelular de FZD10 (resíduos de aminoácidos 1-225 de FZD10). Para ELISA celular, células COS-7 que expressam FZD10-myc/His (toda a seqüência de codificação de cDNA de FZD10 e pontas de epítopos Myc e His em seu término C) foram semeadas em placas de 96 cavidades. Subseqüentemente, 50 μl dos sobrenadantes de cultura obtidos de hibridomas foram adicionados à placa e incubados por 30 minutos a temperatura ambiente. Após lavagem das células, IgG-POD de cabra anticamundongo (Medicai and Biological Laboratories, Nagóia, Japão) foi adicionado sob diluição de 1:10.000, in- 30 cubado por 30 minutos a temperatura ambiente. Anticorpos ligados foram detectados a DO450-620 nm- Clones positivos foram adicionalmente analisa- dos em relação a atividade de ligação específica. Esses clones incluem: clones 39-2 e 39-10 (descritos in W02005/004912, referidos como 5F2), bem como 92-13 e 93-22. Todos os Mabs eram do isotipo lgG2a como determinado por meio do kit de isotipificação de anticorpos monoclonais de camundongo IsoStrip (Roche). Os Mabs foram purificados por afinidade em proteína G-sefarose para caracterização adicional.
O clone de hibridoma 93-22 que produz anticorpo monoclonal de camundongo 93-22 foi depositado por Shuichi Nakatsuru internacio- nalmente no Depositário Internacional de Organismos de Patente IPOD do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (AIST Tsu- kuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-Ken1 305-8566 Japão) como de 14 de junho de 2006 sob o número de depósito de FERM BP-10620. Também, clone de hibridoma 92-13 que produz anticorpo mo- noclonal de camundongo 92-13 foi depositado por Shuichi Nakatsuru in- ternacionalmente no Depositário Internacional de Organismos de Patente IPOD do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (AIST) como de 28 de junho de 2006 sob o número de depósito de FERM BP-10628.
(2) Marcação de anticorpos com radionuclídeos
Mabs marcados com 125I foram preparados pelo método de cloramina T (Arano, Y. e outros (1999). CancerRes, 59, 128-34). 740 kBq/2 μl de Na125I foram adicionados a 10 μg de Mab em 100 μl de tampão de fosfato de sódio 0,3 M. Um μg de cloramina T em 3 μl de tampão de fosfato de sódio 0,3 M foi adicionalmente acrescentado, incubado por 5 min à temperatura ambiente. Anticorpo marcado foi purificado usando coluna 6 de Biospina (Bio-Rad).
Para marcar Mabs com 111In, 1 mg de Mab em 100 μΙ de tampão de borato 50 mM (pH 8,5) foi conjugado com isotiocianato ácido benzil dietilenotriaminopentacético (SCN-BZ-DTPA; Macrocyclics) em dimetilfor- mamida sob razão molar de 1:3. Após incubação a 37°C por 20 horas, conjugados de Mabs foram purificados usando coluna 6 de Biospina. 40 μl de 111In foram incubados em 60 μl de tampão de ácido acético 0,25 M (pH 5,5) e incorporados em 10 μ9/μΙ de conjugados Mab-DTPA por uma hora à temperatura ambiente. Anticorpo marcado foi purificado utilizando coluna 6 de Biospina.
Para gerar 92-13 conjugado com 90Y1 92-13 foi conjugado com DTPA em resíduos de lisina. DTPA-92-13 foi marcado com ítrio até uma atividade específica de 100 μCί/mg, e a imunorreatividade de 90Y-DTPA-92-13 foi de aproximadamente 70%.
(3) Síntese de Mabs marcados com Alexa647
Marcação de Mabs com Alexa-Flúor647 foi realizada de acordo com instrução do fabricante usando Kit de Marcação de Anticorpo Mono- clonal com Alexa647 (Molecular Probes, Eugene, Oregorí). O corante rea- tivo Alexa647 apresenta uma porção éster succinimidílico que reage com aminas primárias de proteínas, e conjugados Mabs-corante resultantes foram purificados por meio de coluna de exclusão por tamanho.
Exemplo 2
Atividades de ligação de anticorpos monoclonais anti-FZD10
Os presentes inventores aplicaram dois métodos para avalia- ção da afinidade de ligação de anticorpos monoclonais de camundongo: análise fluxocitométrica com corantes fluorescentes e medição radioativa usando 125I.
(1) Análise de fluxocitometria (FACS)
Para investigar as afinidades de ligação com célula dos quatro anticorpos, 39-2 e 39-10 (descritos no W02005/004912), 92-13 e 93-22, realizaram-se experimentos de fluxocitometria (FACS). Para análise fluxo- citométrica com fluorescência indireta, suspensões de 5 χ 106 células foram incubadas com 10 μg/ml de Mabs ou IgG de camundongos não-imunizados (Beckman Coulter) por 30 min a 4°C. Após lavagem com PBS, 2 μg de IgG fluorescente de cabra anticamundongo (Alexa Flúor 488, Molecular Probes, Eugene, Oregon) foram adicionados e a suspensão de células incubada por 30 min a 4°C para análise por FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Para ensaios de imunofluorescência direta, células foram in- cubadas com 2 μg de Alexa488-Mabs na presença ou ausência de quan- tidade em excesso (100 μg) de Mabs não-marcados por 30 min a 4°C e submetidos a análise por FACScan.
A fim de confirmar a expressão de FZD10 em linhagens de células, realizou-se RCP-TA. Para experimentos de RCP-TA1 RNAs totais foram extraídos de linhagens de células usando reagente TRIzoI (Invitro- geri, Carlsbad, CA, EUA), e alíquotas de 3 μg de cada RNA total foram inversamente transcritas. Amplificação por RCP foi realizada usando os cDNAs como padrões com os seguintes iniciadores: 5'-TATCGGGCTCTTCTCTGTGC-3' (SEQ ID NO 9) e 5'-GACTGGGCAGGGATCTCATA-3' (SEQ ID NO 10) para FZD10, e 5'-TTAGCTGTGCTCGCGCTACT-3' (SEQ ID NO 11) e 5'-TCACATGGTTCACACGGCAG-3' (SEQ ID NO 12) para p2-microglobulina (β2ΜΘ), o controle interno.
Como mostrado na figura 1a, todos os quatro Mabs, 39-2, 39-10, 92-13 e 93-22 ligaram-se a quatro linhagens de células de SS que expressam FZD10, SYO-1, YafuSS, HS-SY-2 e Fuji de maneira dependente de dose de FZD10, mas não se ligaram a duas linhagens de células, 1973/99 e LoVo, em que nenhum transcrito de FZD10 foi detectado. A Tabela 1 abaixo indica correlação entre Intensidades Médias Fluorescentes relativas (MFI) desses Mabs e os níveis de expressão de FZD10 mostrados na figura 1b. Adicionalmente, de forma particular, demonstramos que Mabs 92-13 e 93-22 também se ligaram à SNU-C5 transfectada com constructo FZD10-myc/His, enquanto nenhuma ligação foi detectada com células SNU-C5 transfectadas com vetor vazio (figuraic), sugerindo ligação es- pecífica desses Mabs 92-13 e 93-22 contra proteína FZD10.
Tabela 1. Ligação de mAbs anti-FZD10 a linhagens de células de SS hu- mano SYO-1, YaFuSS, HS-SY-II, Fuji, 1973/99 e linhagem de células de câncer do cólon humano, LoVo.
<table>table see original document page 54</column></row><table> O MFI de FZD10 é medido por fluxocitometria como descrito acima.
(2) Atividade de ligação contra células normais do sangue
Para confirmar se esses anticorpos podem ser aplicados em uso clínico, os presentes inventores examinaram adicionalmente a ativi- dade de ligação de anticorpos contra células normais do sangue. Para avaliar a atividade de ligação não-específica de Mabs contra células nor- mais do sangue, Mabs marcados com 125I foram incubados com 100 μΙ de sangue saudável novo. Após incubação por uma hora a temperatura am- biente, as radioatividades de péletes de células foram medidas conforme descrito acima.
A atividade de ligação de Mabs 92-13 e 93-22 marcados com 125I contra células sangüíneas humanas normais não foi detectável em todos os três doadores individuais, considerando que a atividade de ligação de Mabs 39-2 e 39-10 foi detectada em todos os três doadores individuais (figuraid). Esses resultados foram consistentes com aqueles de análise FACS usando células mononucleares de sangue periférico humano (dados não mostrados), sugerindo aplicabilidade clínica de somente anticorpos 92-13 e 93-22 com pequena possibilidade de efeito adverso em pacientes de SS devido à afinidade de ligação muito específica pela molécula de FZD10. Portanto, nos centralizamos apenas nos anticorpos 92-13 e 93-22 para análise adicional.
(3) Análises adicionais
Adicionalmente, foi realizado ensaio de ligação usando Mabs marcados com 125I (ver Exemplo 1 (2)) para avaliar a afinidade de ligação contra moléculas de FZD10 na superfície celular. Para análise de radioati- vidade, 0,5 kBq (0,001 μg de anticorpos) de Mabs marcados com 125I preparados no Exemplo 1 (2) foi adicionado a 100 μΙ de suspensão de células com várias quantidades de Mabs idênticos não-marcados. Após incubação por uma hora à temperatura ambiente, a suspensão de células foi centrifugada a 800 χ g. Sobrenadante foi removido e a radioatividade de péletes de células foi medida.
Os resultados mostraram maior afinidade de ligação de anti- corpos 92-13 do que anticorpos 93-22; aproximadamente 33% de 92-13 ligados às células e aproximadamente 9% de anticorpos 93-22 ligados às células sob a mesma condição (figurale). Aquantidade de anticorpos li- gados diminuiu à medida que anticorpos não-marcados foram adicionados de uma maneira dependente de dose.
Subseqüentemente, realizou-se análise de competição de li- gação de Mabs 92-13 com Mabs 93-22 utilizando fluxocitometria. Ligação entre si de células de ambos os anticorpos marcados com Alexa488 foi completamente bloqueada por meio de alta quantidade de anticorpos não-marcados (figuralf, ii e iii), sugerindo que Mabs 92-13 e 93-22 pro- vavelmente reconhecem epítopos muito similares ou iguais de FZD10. Essas verificações sugerem que esses Mabs são capazes de reconhecer especificamente FZD10 expressa na superfície de células de SS.
Exemplo 3
Imuno-histoquímica
Para avaliar a especificidade de ligação de 92-13 e 93-22 a tecidos humanos, realizou-se análise imuno-histoquímica usando seções congeladas de tecidos. Seções de tecidos de órgãos humanos adultos normais congelados (BioChain, Hayward, Califórnia) foram fixadas com paraformaldeído a 4% e a 4°C por 15 min, e incubadas com 5 μg/ml de Mabs por uma hora a temperatura ambiente. Subseqüentemente, Rea- gente Polimérico ENVISION de camundongo (DAKO) foi adicionado e vi- sualizado com substrato de peroxidase (Tetracloridreto de 3, 3'-Diaminobenzidina).
Os resultados são mostrados na figura 2. A figura2 mostra a- nálises imuno-histoquímicas em seções de tecidos humanos congelados normais e de SS sem anticorpos (a, d, g, j e m), 92-13 (b, e, h, k e n) e 93-22 (c, f, i, l e o); (a-c), sarcoma sinovial; (d-f), rim; (g-i), fígado; Q-I), coração; (m-o), cérebro. De modo esperado, observou-se forte imunorreatividade a FZD10 em espécimes de SS (figuras 2, a, b e c) e placenta (dados não mostrados), mas não detectada em rim, coração, cérebro e fígado (figuras 2, d-o), de maneira concordante com os resultados de northern-blot e ex- perimentos de RCP-TA (Nagayama, S. e outros (2005). Oncogene, 24, 6201-6212).
Exemplo 4
Biodistribuição de Mabs anti-FZD10 em modelo de xenoenxerto em ca- mundongos Balb/c
Distribuição de 92-13 e 93-22 em modelo in vivo foi examinada em camundongos BALB/c por meio de dois métodos independentes, for- mação de imagem por radionuclídeos e formação de imagem por fluores- cência.
(1) Formação de imagem por radionuclídeos in vivo
Experimentos in vivo foram realizados em instalação para animal de acordo com diretrizes institucionais. Camundongos Jcl-nu BALB/cA (7 semanas de idade) foram injetados subcutaneamente (s.c.) com células de tumor SYO-1 (5 χ 106 de células), em 0,1 ml de PBS, nos flancos. Para estudos de biodistribuição, camundongos com tumores ple- namente estabelecidos receberam 10 kBq (0,5-1 μg) de Mabs marcados com 125I e 10 kBq (0,5-1 μg) de Mabs marcados com 111In via veia da cauda. Nas 1, 24 e 48 horas, animais foram submetidos à eutanásia e o peso e radioatividade dos tecidos, medidos. A distribuição foi expressa como % de dose injetada/g de tecido para todas as amostras. Para formação de ima- gem óptica de biodistribuição, foram usados camundongos que portam tumores LoVo além de camundongos com tumores SYO-1. Células de tumor LoVo (1 χ 107 de células) foram injetadas s.c. em camundongos Jcl-nu BALB/cA como descrito acima. Quando tumores foram completa- mente estabelecidos, os camundongos foram submetidos ao estudo se- gundo formação de imagem.
Os resultados na figura3a demonstram que a radioatividade de 111ln-92-13 associada ao sangue diminuiu de 35% de doses injetadas por grama (% de Dl/g) em uma hora pós-injeção para 12% após 48 horas. Radioatividades de 111ln-92-13 associadas a fígado, rim, intestino, baço, pâncreas, pulmão, coração, estômago e músculo permaneceram razoa- velmente constantes ou decresceram ao longo da observação (figura 3a). Radioatividade de 111ln-92-13 associada a tumor acumulou-se durante o experimento, de 2% de Dl/g em uma hora pós-injeção para 11% de Dl/g após 48 horas. Por outro lado, a figura 3b demonstra que radioatividade de 92-13 marcado com 125I associada a tumor não aumentou significativa- mente, embora radioatividade associada ao sangue tenha caído de 25% em uma hora para 7% após 48 horas e radioatividades associadas a outros órgãos normais permaneceram constantes. Os anticorpos marcados com 125I foram possivelmente degradados na célula após internalização. 93-22 marcado com 111In acumulou-se também em tumor SYO-1 em 48 horas pós-injeção (figura 3c) e 93-22 marcado com 125I mostrou acumulação pobre (figura 3d), sugertindo sua internalização, bem como 92-13. (2) Formação de imagem por fluorescência in vivo
Formação de imagem por fluorescência in vivo foi realizada com Sistema de Formação de Imagem IVIS® série 100 (Xenogen, Alameda, CA). Um filtro otimizado Cy5.5 foi usado para adquirir fluorescência de Alexa647-Mabs in vivo. Camundongos SYO-1 que portam tumor foram injetados com 20 μg Mabs marcados com Alexa647 intraperitonealmente e submetidos à formação de imagem fluorescente em vários pontos de tempo. Os camundongos foram alimentados com alimento que não contém alfalfa por quatro dias antes de injetar Mabs a fim de reduzir a fluorescência de fundo. Quando da aquisição de imagens, camundongos foram aneste- siados com 2% de isoflurano (Abbott Laboratories) e colocados no sistema IVIS. Os camundongos foram submetidos à eutanásia em quatro dias após a injeção de Mabs, o tumor e a maior parte dos órgãos foram dissecados e imagem por fluorescência foi obtida.
Como mostrado na figura 4a, quantidade significativa de fluo- rescência foi detectada no local do tumor 24 horas após a injeção. Fluo- rescência ligada a tumor foi observada em ambos os Mabs, 92-13 e 93-22; os signais atingiram nível máximo cerca de 48 horas após a injeção, e podiam ser detectáveis 96 horas após a injeção. Os presentes inventores sacrificaram esses camundongos 120 horas pós-injeção e mediram sua intensidade de fluorescência no tumor e também em órgãos normais im- portantes (fígado, baço, rim, pâncreas, cólon) (Figuras 4b e 4c). Sinal de fluorescência muito intenso foi observado no tumor dissecado, conside- rando que nenhum sinal de fluorescência foi detectado em órgãos normais.
Para validar a especificidade de ligação, os presentes inventores geraram xenoenxertos usando linhagem de células negativas a antígenos, LoVo, em camundongos nus, e injetaram Mabs marcados com Alexa647, realizando análise de formação de imagem fluorescente. Em camundongos que por- tam LoVo, fluorescência não foi detectada nem no local do tumor (figura 5a), nem no tumor dissecado ou outros órgãos (figuras 5b e 5c). Esses resul- tados demonstraram que esses Mabs são também capazes de ligar-se especificamente a células de tumor que expressam FZD10 in vivo.
Exemplo 5
Internalização de Mabs anti-FZD10 em células positivas a antígenos
Para investigar comportamento molecular desses Mabs após ligação com as superfícies celulares, sua localização foi traçada usando sistema de formação de imagem in vitro.
Células foram plaqueadas em lâminas de câmara de 8 cavi- dades (Nalge Nunc International, Naperville, IL) sob densidade de 5 χ 104 células por cavidade. Células foram incubadas com Mabs por três horas a 37°C em câmara de ar contendo 5% de CO2. Mabs ligados à superfície cellular foram removidos por meio de tampão de separação ácido (glicina 0,1 M, 500mM NaCI, pH 2,5) a 4°C por 10 min e neutralizados com Tris 500mM (pH 7,5). Células foram então fixadas com formaldeído a 3,7% por 15 min à temperatura ambiente e permeabilizadas por exposição a Tri- tonX-100 0,2% por 10 min, seguido de bloqueio com soroalbumina bovina a 3% por uma hora à temperatura ambiente. Para detectar os Mabs interna- lizados na célula, amostras foram incubadas com IgG de cabra antica- mundongo marcado com Alexa488 (1:700 de diluição) por uma hora à temperatura ambiente. As lâminas foram montadas com DAPI (Vectashield, Vector Laboratories, Burlingame, CA) e analisadas óptica confocal Leica TCS SP1.
Como mostrado na figura 6, ambos os Mabs 92-13 e 93-22 foram eficientemente incorporados no citossol de células SYO-1 e de cé- lulas YaFuSS 3 horas após a incubação de Mab com células mediante formação de imagem com microscópio confocal detectada usando IgG de cabra anticamundongo marcado com Alexa488 (figura6, a-f). Por outro lado, os sinais de fluorescência desses Mabs foram dificilmente detectáveis em células LoVo sem expressão de FZD10 (figura6, g-i), demonstrando que a ligação específica de Mabs em FZD10 de superfície celular induziu a in- ternalização dos anticorpos.
Exemplo 6
Citotoxicidade específica de Mabs
92-13 e 93-22 não tiveram nenhum efeito sobre o crescimento de células tumorais quando adicionados diretamente nas células cultivadas (dados não mostrados). Para estudos de terapia, tumores SYO-1 foram desenvolvidos em camundongos Jcl-nu BALB/cA da mesma maneira que no Exemplo 4. Os diâmetros dos tumores foram medidos por meio de pa- químetro e o volume dos tumores foram determinados usando a seguinte fórmula: 0,5 χ (diâmetro maior) χ (diâmetro menor)2 como descrito anteri- ormente (Nagayama, S. e outros (2005). Oncogene, 24, 6201-12). Quando o volume dos tumores atingiu mais de 0,4-2,8 cm3, camundongos Balb/c nu que portam tumor subcutâneo SYO-1 foram designados aleatoriamente a grupos de tratamento e receberam injeções intravenosas de 100 μCί de Mabs marcados com 90Y ou Mabs de controle via veia da cauda. Os ca- mundongos foram pesados e o diâmetro dos tumores registrados.
A figura 7 mostrou que os volumes tumorais reduziram-se no- tavelmente de forma imediata após tratamento, quase até traços dentro de uma semana em todos os camundongos. Quando 50 μCi de 90Y-DTPA-92-13 foram dados aos camundongos, tumores > 1 cm3 de vo- lume refrataram-se duas semanas após tratamento, embora mostrassem notável redução no tamanho dos tumores imediatamente após tratamento. Os camundongos mostraram diminuição temporária do peso (10~15%), contudo, recuperaram-se em uma semana e nenhum sinal tóxico visível foi observado (dados não mostrados). Exemplo 7
Geração de Anticorpos quiméricos
Anticorpos quiméricos correspondendo aos anticorpos 92-13 e 93-22 de camundongo, ch92-13 e ch93-22, foram gerados mediante subs- tituição da seqüência de região variável de cada anticorpos de camun- dongo na região constante humana IgGi sob o controle do promotor CMV. Os RNAs totais foram extraídos de clones de hibridoma 92-13 e 93-22. cDNA foi sintetizado do RNA total utilizando Kit GeneRacei^ (Invitrogen). As seqüências de regiões variáveis de anticorpos monoclonais foram am- plificadas usando iniciador anterior (Iniciador 5' GeneRacer®) e iniciador inverso; CH1 (lgG2a); 5'-AATTTTCTTGTCCACCTTGGTG-3' (SEQ ID NO 3) para cadeia pesada e CL1 (capa); 5-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCT-3' (SEQ ID NO 4) para cadeia leve. Produtos de RCP foram sequenciados e as seqüências que codificam as regiões variáveis m92-13 e m93-22 determinadas.
Como resultado, as seqüências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeia H e regiões variáveis de cadeia Lde Ig de camundongo foram determinadas como segue: 92-13, região variável de cadeia H: MKCSWVIFFLMAWTGVNSEVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIND TYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYL QLSSLTSEDTAVYYCARGARGSRFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO 13) codificada pela seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO 14, e
92-13, região variável de cadeia L:
MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYS NLAWYQQKQGKSPQLLVYVATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQS EDFGSYYCQHWGTPYTFGGGTKL (SEQ ID NO 21) codificada pela se- qüência de nucleotídeos de SEQ ID NO 22; e
93-22, região variável de cadeia H:
MGWSRIFLFLLSITAGVHCQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSS SWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTA YMQLSSLTSVDSAVYFCARGGNYGWFAYWGQGTLVTVSAGS (SEQ ID NO 29) codificada pela seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO 30, e 93-22, região variável de cadeia L:
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPAS LAVS LGQ R ATISC RAS KSVST SGYSYM HWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIH PVEEEDAATYYCQHSRELYTFGGGTKLGS (SEQ ID NO 37) codificada pela seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO 38. Sublinhas indicam as seqüências de sinal.
As seqüências de CDR (região determinadora de comple- mentaridade) dos anticorpos foram determinadas como segue:
92-13, INDTYMH (SEQ ID NO 15) como VH CDR1, RID- PANGNTKYD (SEQ ID NO 17) como VH CDR2, e GSRFAY (SEQ ID NO 19) como VH CDR3, RASENIYSNLA (SEQ ID NO 23) como VL CDR1, VATNLAD (SEQ ID NO 25) como VL CDR2, e QHFWGTPY (SEQ ID NO 27) como VL CDR3; e
93-22, SSWMN (SEQ ID NO 31) como VH CDR1, RIYPGDGDTNYN (SEQ ID NO 33) como VH CDR2, e GGNYGWFAY (SEQ ID NO 35) como VH CDR3, RASKSVSTSGYSYMH (SEQ ID NO 39) como VL CDR1, LASNLES (SEQ ID NO 41) como VL CDR2, e QHSRELY (SEQ ID NO 43) como VL CDR3.
Adicionalmente, as seqüências de aminoácidos das cadeias H e cadeias L de anticorpos monoclonais de camundongo 92-13, 93-22 e 39-10 são determinadas como segue:
92-13, cadeia H: SEQ ID NO 58 (codificada pela seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO 57);
92-13, cadeia L: SEQ ID NO 60 (codificada pela seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO 59);
93-22, cadeia H: SEQ ID NO 62 (codificada pela seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO 61);
93-22, cadeia L: SEQ ID NO 64 (codificada pela seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO 63);
39-10, cadeia H: SEQ ID NO 66 (codificada pela seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO 65); 39-10, cadeia L: SEQ ID NO 68 (codificada pela seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO 67).
De acordo com a seqüência determinada, iniciadores especí- ficos foram projetados para a região variável m92-13:
Si-Aatagcggccgcaccatgaaatgcagctgggttatctt-S' (seq id
NO 5) e 5'-AATAGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCC-3' (SEQ ID NO 6) para cadeia pesada e 5'-AATAGCGGCCGCACCATGAGT GTGCCCACTCAGG-3' (SEQ ID NO 7) e 5'-TTCCAGCTTGGTCCCCCC-3' (SEQ ID NO 8) para cadeia leve. Também, iniciadores específicos foram projetados para a região variável m93-22:
5-AATAGCGGCCGCACCATGGGATGGAGCCGGATCTTT-3' (SEQ ID NO 53) e 5-AATAGGATCCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCC CTT-3' (SEQ ID NO 54) para cadeia pesada e 5-AATAGCGGCCGCACCATGGAGACAGACACACTCCT-3' (SEQ ID NO 55) e 5-AATAGGATCCCAGCTTGGTCCCCCCTCCGAACGT-3' (SEQ ID NO 56) para cadeia leve. Para construir o vetor de expressão para anti- corpos quiméricos, dois vetores cassette foram preparados. O fragmento de DNA que codifica IgGI humana (CH1-CH3) foi inserido em pQCXIH (CIontech) (pQCXCHIH) e o fragmento de DNA que codifica IgK humana (CL1) foi inserido em pQCXIP (pQCXCLIP). Para obter fagmentos de DNA que codificam IgGI humana ou IgK humana, biblioteca de região constante humana foi preparada usando cDNA de PBMCs humanas (células mono- nucleares de sangue periférico) pelo método relatado (Liu, A.Y. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol.84, 3439-43, 1987; Reff, M.E. e outros, Blood, Vol.83, No.2, 435-45, 1994). Os DNAs que codificam região variável de cadeia pesada e cadeia leva de m92-13 e m93-22 foram amplificados por RCP1 sequenciados e subclonados em pQCXCHIH e pQCXCLIP, res- pectivamente, usando sítios Notl e BamHI. Esses vetores foram co-transfectados em células CHO. Células transfectadas foram cultivadas em meio F-12 que contém 500 μg/ml de higromicina e 10 μg/ml de puro- micina. Quando células se desenvolveram subconfluentemente, o meio foi trocado por meio sem soro (CHO-S-SFM II; GIBCO) e anticorpo quimérico foi purificado do sobrenadante de células cultivadas usando coluna de afinidade de proteína A (GE Amersham) e sequenciado. A seqüência de cadeia pesada de anticorpo quimérico ch92-13 compreende SEQ ID NO 46 codificada pela seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO 45; e a sequên- cia de cadeia leve de anticorpo quimérico ch92-13 compreende SEQ ID NO 48 codificada pela seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO 47. A se- qüência de cadeia pesada de anticorpo quimérico ch93-22 compreende SEQ ID NO 49 codificada pela seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO 50; e a seqüência de cadeia leve de anticorpo quimérico ch93-22 com- preende SEQ ID NO 52 codificada pela seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO 51.
Exemplo 8
Atividade de ligação de Anticorpos quiméricos
Atividades de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) induzidas por anticorpos quiméricos 92-13 e 93-22 foram deter- minadas usando atividade de LDH conforme descrito anteriormente (Na- gayama, S. e outros (2005). Oncogene, 24, 6201-6212). Células efetua- doras novas foram isoladas de sangue periférico heparinizado de um do- ador saudável por meio de Ficoll-Plaque (Amersham Bioscience). Células efetuadoras (E) e células-alvo (T) (em cada caso, 5 χ 103/cavidade) foram co-incubadas por 6 h a 37°C em quadruplicata sob várias razões E:T, jun- tamente com anticorpos quiméricos 92-13, anticorpos quiméricos 93-22 ou IgG humana não-imunizada, em 0,1 ml de RPMI 1640 sem vermelho de fenol suplementado com FBS a 5% em uma placa de 96 cavidades. LDH liberado nos sobrenadantes de cultura foi determinado por absorbância a 490 nm. A porcentagem de citotoxicidade específica foi calculada de a- cordo com as instruções do fabricante.
Referindo-se à atividade efetuadora, ambos os anticorpos quiméricos 92-13 e 93-22 induziram ADCC especificamente nas células SYO-1 que superexpressam FZD10 (figuras 8, a e c), mas não nas células LoVo negativas a FZD10 (figuras 8, b e d). Particularmente, 92-13 quimé- rico mostrou maior indução de citotoxicidade em comparação com 93-22 quimérico; contudo, sua atividade depende de doador de células efetua- doras, possivelmente causada por polimorfismo do receptor Fc.
Cada um dos pedidos e patentes mencionados neste docu- mento, e cada documento citado ou referido em cada um dos pedidos e patentes acima são incorporados aqui como referência. Além disso, todos os documentos citados neste texto, e todos os documentos citados ou referidos em documentos citados neste texto, e quaisquer instruções do fabricante ou catálogos para quaisquer produtos citados ou mencionados neste texto, são incorporados aqui como referência.
Várias modificações e variações dos métodos descritos e sis- tema da invenção serão evidentes àqueles habilitados no estado da técnica, sem se afastar do escopo e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em relação a modalidades específicas preferidas, deve-se entender que a invenção como reivindicada não deverá ser indevidamente limitada a essas modalidades específicas e que muitas modificações e adições poderão ser feitas dentro do escopo da invenção. Na verdade, pretende-se que várias modificações das modalidades descritas para rea- lizar a invenção que são óbvias àqueles habilitados em biologia molecular ou campos afins estejam dentro do escopo das reivindicações. Adicio- nalmente, várias combinações das características das reivindicações se- guintes dependentes podem ser produzidas com as características das rei- vindicações independentes, sem se afastar do escopo da presente invenção. Listagem de Seqíência
<110> OncoTherapy Science, Inc. The University of Tokyo National University Corporation Gunma University
<120> ANTICORPOS MONOCLONAIS A FZDlO QUE TÊM COMO ALVO TUMORES, E USOS DESSES
ANTICORPOS
<130> PH-2818PCT
<150> US 60/815,257
<151> 2006-06-21 <160> 68
<170> Versão de Patente 3.1 <210> 1
<211> 2811
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gcaccgagca
cggtgctgtg
tggcggcgca
ctgcaggtga 60 ggcaaatgcc 120 atgcccaacc 180 gcgccgctgg 240 gcgccgatgt 300 caggcccggc 360 ctggactgcc 420 aacaacggct 480 cagcggcccc 540 tgcgacaacc 600 acgcccggcg 660 gccatctggg 720 gacccggccc 780 gtctactccg 840 cgggacagcg 900 gtcttcctgg 960 ctcacctggt 1020 agctacttcc 1080 atgcgcaggg 1140 aacgcgctca 1200 ttcatcctct 1260 gagaacacgg 1320 accgtgccgg 1380 tggaagatcc 1440 tgcctgatgg 1500 ctggtggtgg 1560 cagcaggtgt 1620 accagcggtg 1680 gagatccctg 1740 cgcccggagc 1800 tttttttttt 1860 atgctgtgat 1920 cagcgaaggg 1980 gttgattcag 2040 ccctcagaag aaaacttttg tttagagccc tccgtaaata tacatctgtg tatttgagtt 2100
ggctttgcta cccatttaca aataagagga cagataactg ctttgcaaat tcaagagcct 2160
cccctgggtt aacaaatgag ccatccccag ggcccacccc caggaaggcc acagtgctgg 2220
gcggcatccc tgcagaggaa agacaggacc cggggcccgc ctcacacccc agtggatttg 2280
gagttgctta aaatagactc tggccttcac caatagtctc tctgcaagac agaaacctcc 2340
atcaaacctc acatttgtga actcaaacga tgtgcaatac atttttttct ctttccttga 2400
aaataaaaag agaaacaagt attttgctat atataaagac aacaaaagaa atctcctaac 2460
aaaagaacta agaggcccag ccctcagaaa cccttcagtg ctacattttg tggcttttta 2520
atggaaacca agccaatgtt atagacgttt ggactgattt gtggaaagga ggggggaaga 2580
gggagaagga tcattcaaaa gttacccaaa gggcttattg actctttcta ttgttaaaca 2640
aatgatttcc acaaacagat caggaagcac taggttggca gagacacttt gtctagtgta 2700
ttctcttcac agtgccagga aagagtggtt tctgcgtgtg tatatttgta atatatgata 2760
tttttcatgc tccactattt tattaaaaat aaaatatgtt ctttaaaaaa a 2811
<210> 2
<211> 581
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Gln Arg Pro Gly Pro Arg Leu Trp Leu Val Leu Gln Val Met Gly 1 5 10 15
Ser Cys Ala Ala Ile Ser Ser Met Asp Met Glu Arg Pro Gly Asp Gly
20 25 30
Lys Cys Gln Pro Ile Glu Ile Pro Met Cys Lys Asp Ile Gly Tyr Asn 35 40 45
Met Thr Arg Met Pro Asn Leu Met Gly His Glu Asn Gln Arg Glu Ala 50 55 60
Ala Ile Gln Leu His Glu Phe Ala Pro Leu Val Glu Tyr Gly Cys His 65 70 75 80
Gly His Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Leu Tyr Ala Pro Met Cys Thr 85 90 95
Glu Gln Val Ser Thr Pro Ile Pro Ala Cys Arg Val Met Cys Glu Gln
100 105 110
Ala Arg Leu Lys Cys Ser Pro Ile Met Glu Gln Phe Asn Phe Lys Trp 115 120 125
Pro Asp Ser Leu Asp Cys Arg Lys Leu Pro Asn Lys Asn Asp Pro Asn 130 135 140
Tyr Leu Cys Met Glu Ala Pro Asn Asn Gly Ser Asp Glu Pro Thr Arg 145 150 155 160
Gly Ser Gly Leu Phe Pro Pro Leu Phe Arg Pro Gln Arg Pro His Ser 165 170 175
Ala Gln Glu His Pro Leu Lys Asp Gly Gly Pro Gly Arg Gly Gly Cys
180 185 190
Asp Asn Pro Gly Lys Phe His His Val Glu Lys Ser Ala Ser Cys Ala 195 200 205
Pro Leu Cys Thr Pro Gly Val Asp Val Tyr Trp Ser Arg Glu Asp Lys 210 215 220
Arg Phe Ala Val Val Trp Leu Ala Ile Trp Ala Val Leu Cys Phe Phe 225 230 235 240
Ser Ser Ala Phe Thr Val Leu Thr Phe Leu Ile Asp Pro Ala Arg Phe 245 250 255
Arg Tyr Pro Glu Arg Pro Ile Ile Phe Leu Ser Met Cys Tyr Cys Val 260 265 270 Tyr Ser Val Gly Tyr Leu Ile Arg Leu Phe Ala Gly Ala Glu Ser Ile
275 280 285
Ala Cys Asp Arg Asp Ser Gly Gln Leu Tyr Val Ile Gln Glu Gly Leu
290 295 300
Glu Ser Thr Gly Cys Thr Leu Val Phe Leu Val Leu Tyr Tyr Phe Gly 305 310 315 320
Met Ala Ser Ser Leu Trp Trp Val Val Leu Thr Leu Thr Trp Phe Leu
325 330 335
Ala Ala Gly Lys Lys Trp Gly His Glu Ala Ile Glu Ala Asn Ser Ser
340 345 350
Tyr Phe His Leu Ala Ala Trp Ala Ile Pro Ala Val Lys Thr Ile Leu
355 360 365
Ile Leu Val Met Arg Arg Val Ala Gly Asp Glu Leu Thr Gly Val Cys
370 375 380
Tyr Val Gly Ser Met Asp Val Asn Ala Leu Thr Gly Phe Val Leu Ile 385 390 395 400
Pro Leu Ala Cys Tyr Leu Val Ile Gly Thr Ser Phe Ile Leu Ser Gly
405 410 415
Phe Val Ala Leu Phe His Ile Arg Arg Val Met Lys Thr Gly Gly Glu
420 425 430
Asn Thr Asp Lys Leu Glu Lys Leu Met Val Arg Ile Gly Leu Phe Ser
435 440 445
Val Leu Tyr Thr Val Pro Ala Thr Cys Val Ile Ala Cys Tyr Phe Tyr
450 455 460
Glu Arg Leu Asn Met Asp Tyr Trp Lys Ile Leu Ala Ala Gln His Lys 465 470 475 480
Cys Lys Met Asn Asn Gln Thr Lys Thr Leu Asp Cys Leu Met Ala Ala
485 490 495
Ser Ile Pro Ala Val Glu Ile Phe Met Val Lys Ile Phe Met Leu Leu
500 505 510
Val Val Gly Ile Thr Ser Gly Met Trp Ile Trp Thr Ser Lys Thr Leu
515 520 525
Gln Ser Trp Gln Gln Val Cys Ser Arg Arg Leu Lys Lys Lys Ser Arg
530 535 540
Arg Lys Pro Ala Ser Val Ile Thr Ser Gly Gly Ile Tyr Lys Lys Ala 545 550 555 560
Gln His Pro Gln Lys Thr His His Gly Lys Tyr Glu Ile Pro Ala Gln
565 570 575
Ser Pro Thr Cys Val 580
<210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial
<220> um iniciacjor sintetizado artificialmente por RCP-TA <223>
<400> 3
aattttcttg tccaccttgg tg 22
<210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> uma secIugncia de primer sintetizada artificialmente por RCP-TA
<400> 4
ctaacactca ttcctgttga agctct 26
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> uma seqüência de primer sintetizada artificialmente por RCP
<400> 3
aatagcggcc gcaccatgaa atgcagctgg gttatctt 38
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Uma seqüência de primer sintetizada artificialmente por RCP
<400> 6
aatagctagc tgcagagaca gtgaccagag tcc 33
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Uma seqüência de primer sintetizada artificialmente por RCP
<400> 7
aatagcggcc gcaccatgag tgtgcccact cagg 34
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Uma seqüência de primer sintetizada artificialmente por RCP
<400> 8
ttccagcttg gtcccccc 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Uma seqüência de primer sintetizada artificialmente por RCP-TA
<400> 9
tatcgggctc ttctctgtgc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Uma seqüência de primer sintetizada artificialmente por RCP-TA
<400> 10
gactgggcag ggatctcata 20 <210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Uma seqüência de primer sintetizada artificialmente por RCP-TA
<400> 11
ttagctgtgc tcgcgctact 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Uma seqüência de primer sintetizada artificialmente por RCP-TA
<400> 12
tcacatggtt cacacggcag 20
<210> 13 <211> 137 <212> PRT <213> Mouse <400> 13
Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly 1 5 10 15
Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
35 40 45
Asn Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp 65 70 75 80
Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ser Arg Phe Ala Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135
<210> 14
<211> 411 <212> DNA <213> Mouse <400> 14
atgaaatgca gctgggttat cttcttcctg atggcagtgg ttacaggggt caattcagag 60 gttcagctgc agcagtctgg ggcagagctt gtgaagccag gggcctcagt caagttgtcc 120 tgcacagctt ctggcttcaa cattaacgac acctatatgc actgggtgaa gcagaggcct 180 gaacagggcc tggagtggat tggaaggatt gatcctgcga atggtaatac taaatatgac 240 ccgaagttcc agggcaaggc cactataaca gcagacacat cctccaacac agcctacctg 300 cagctcagca gcctgacatc tgaggacact gccgtctatt actgtgctag aggagcacgg 360 gggagtagat ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 411
<210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Mouse <400> 15
Ile Asn Asp Thr Tyr Met His 1 5
<210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Mouse <400> 16
attaacgaca cctatatgca c 21
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 17
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp 1 5 10
<210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Mouse <400> 18
aggattgatc ctgcgaatgg taatactaaa tatgac 36
<210> 19
<211> 6
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 19
Gly Ser Arg Phe Ala Tyr 1 5
<210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Mouse <400> 20
gggagtagat ttgcttac 18
<210> 21 <211> 124 <212> PRT <213> Mouse <400> 21
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
20 25 30
Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gln Leu Leu Val Tyr Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn
85 90 95
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp
100 105 110
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120
<210> 22 <211> 372 <212> DNA
<213> Mouse <400> 22
atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgtt gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 300 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaagc tg 372
<210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Mouse <400> 23
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala 15 10
<210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Mouse <400> 24
cgagcaagtg agaatattta cagtaattta gca 33
<210> 25 <211> 7 <212> PRT
<213> Mouse <400> 25
Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> Mouse
<400> 26
gtctatgttg caacaaactt agcagat 27
<210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Mouse
<400> 27
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr 1 5 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Mouse <400> 28
caacattttt ggggtactcc gtac 24
<210> 29 <211> 139 <212> PRT <213> Mouse <400> 29
Met Gly Trp Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala Gly 1 5 10 15
Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe
35 40 45
Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80
Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Ser 130 135
<210> 30
<211> 417 <212> DNA <213> Mouse <400> 30
atgggatgga gccggatctt tctcttcctc ctgtcaataa ctgcaggtgt ccattgccag 60 gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcctcagt gaagatttcc 120 tgcaaagctt ctggctacgc attcagtagc tcttggatga actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacagggtc ttgagtggat tggacggatt tatcctggag atggagatac taactacaat 240 gggaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 caactcagca gcctgacctc tgtggactct gcggtctatt tctgtgcaag agggggtaac 360 tacggctggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc aggatcc 417
<210> 31 <211> 5 <212> PRT
<213> Mouse <400> 31
Ser Ser Trp Met Asn 1 5
<210> 32
<211> 18
<212> DNA <213> Mouse <400> 32
agtagctctt ggatgaac 18
<210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> Mouse <400> 33
Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn
1 5 10
<210> 34
<211> 36
<212> DNA
<213> Mouse
<400> 34
cggatttatc ctggagatgg agatactaac tacaat 36
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 35
Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr
1 5
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> Mouse
<400> 36
gggggtaact acggctggtt tgcttac 27
<210> 37
<211> 129
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 37
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser
35 40 45
Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln His Ser Arg Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gly 115 120 125
Ser
<210> 38 <211> 456 <212> DNA <213> Mouse <400> 38
atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120 atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggtac 180 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 240 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga gctgtacacg 360 ttcggagggg ggaccaagct gggatccgaa atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatct 456
<210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Mouse <400> 39
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 15
<210> 40
<211> 45
<212> DNA <213> Mouse <400> 40
agggccagca aaagtgtcag tacatctggc tatagttata tgcac 45
<210> 41
<211> 7 <212> PRT <213> Mouse <400> 41 Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5
<210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Mouse <400> 42
cttgcatcca acctagaatc t 21
<210> 43 <211> 7 <212> PRT
<213> Mouse <400> 43
Gln His Ser Arg Glu Leu Tyr 1 5
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> Mouse
<400> 44
cagcacagta gggagctgta c 21
<210> 45
<211> 1404 <212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Uma seqüência de cadeia H de anticorpo quimérico anti-REG4 com seqüência de sinal. <400> 45
atgaaatgca gctgggttat cttcttcctg atggcagtgg ttacaggggt caattcagag 60 gttcagctgc agcagtctgg ggcagagctt gtgaagccag gggcctcagt caagttgtcc 120 tgcacagctt ctggcttcaa cattaacgac acctatatgc actgggtgaa gcagaggcct 180 gaacagggcc tggagtggat tggaaggatt gatcctgcga atggtaatac taaatatgac 240 ccgaagttcc agggcaaggc cactataaca gcagacacat cctccaacac agcctacctg 300 cagctcagca gcctgacatc tgaggacact gccgtctatt actgtgctag aggagcacgg 360 gggagtagat ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc agctagcacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ccccgggtaa atga 1404
<210> 46 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Uma seqüência de cadeia H de anticorpo quimérico anti-REG4 com seqüência de sinal. <400> 46
Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly 15 10 15
Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
35 40 45
Asn Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp 65 70 75 80
Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ser Arg Phe Ala Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys 465
<210> 47 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Uma seqüência de cadeia L de anticorpo quimérico anti-REG4 com seqüência de sinal. <400> 47
ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60 tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 120 gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 180 ctcagctcct ggtctatgtt gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 240 gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 300 ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 360 tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgaca 600 cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705
<210> 48 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Uma seqüência de cadeia L de anticorpo quimérico anti-REG4 com seqüência de sinal. <400> 48
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 15 10 15
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
20 25 30
Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gln Leu Leu Val Tyr Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn
85 90 95
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp
100 105 110
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230
<210> 49
<211> 1398
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Uma seqüência de cadeia H de anticorpo quimérico anti-REG4 com seqüência de sinal
<400> 49
atgggatgga gccggatctt tctcttcctc ctgtcaataa ctgcaggtgt ccattgccag 60 gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcctcagt gaagatttcc 120 tgcaaagctt ctggctacgc attcagtagc tcttggatga actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacagggtc ttgagtggat tggacggatt tatcctggag atggagatac taactacaat 24 0 gggaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 caactcagca gcctgacctc tgtggactct gcggtctatt tctgtgcaag agggggtaac 360 tacggctggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc aggatccgcc 420 tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca acttcggcac ccagacctac 660 acctgcaacg taaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagacagt tgagcgcaaa 720 tgttgtgtcg agtgcccacc gtgcccagca ccacctgtgg caggaccgtc agtcttcctc 780 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 840 gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg 900 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaatga 1398
<210> 50 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial <22 0>
<223> Uma seqüência de cadeia H de anticorpo quimérico anti-REG4 com seqüência de sinal
<400> 50
Met Gly Trp Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala Gly 1 5 10 15
Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe
35 40 45
Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80
Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys 225 230 235 240
Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro
245 250 . 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
260 265 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
275 280 285
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
290 295 300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 305 310 315 320
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
325 330 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
340 345 350
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
355 360 365
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
370 375 380
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 385 390 395 400
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
405 410 415
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
420 425 430
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
435 440 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 460
Lys 465
<210> 51 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> Uma seqüência de cadeia L de anticorpo quimérico anti-REG4 com seqüência de sinal. <400> 51
atggagacag acacactcct gacattgtgc tgacacagtc atctcatgca gggccagcaa caacagaaac caggacagcc ggggtccctg ccaggttcag cctgtggagg aggaggatgc ttcggagggg ggaccaagct ttcatcttcc cgccatctga ctgaataact tctatcccag tcgggtaact cccaggagag agcagcaccc tgacgctgag gtcacccatc agggcctgag <210> 52 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Uma seqüência de cadeia L de anticorpo quimérico anti-REG4 com seqüência de sinal. <400> 52
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser
35 40 45
Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln His Ser Arg Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gly
115 120 125
Ser Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
130 135 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
165 170 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
180 185 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
195 200 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120 aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggtac 180 acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 240 tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300 tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga gctgtacacg 360 gggatccgaa atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 420 tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480 agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540 tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600 caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 720 210 215 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235
<210> 53 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> Uma seqüência de primer sintetizada artificialmente por RCP <400> 53
aatagcggcc gcaccatggg atggagccgg atcttt 36
<210> 54
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Uma seqüência de primer sintetizada artificialmente por RCP <400> 54
aataggatcc tgcagagaca gtgaccagag tccctt 36
<210> 55 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> Uma seqüência de primer sintetizada artificialmente por RCP <400> 55
aatagcggcc gcaccatgga gacagacaca ctcct 35
<210> 56
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Uma seqüência de primer sintetizada artificialmente por RCP <400> 56
aataggatcc cagcttggtc ccccctccga acgt 34
<210> 57
<211> 1404
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> polipeptideo sintético: cadeia H de 92-13 <220> <221> CDS <222> (1) . . (1404) <223> <400> 57
atg aaa tgc age tgg gtt Met Lys Cys Ser Trp Val 1 5
gtc aat tca gag gtt cag Val Asn Ser Glu Val Gln
ate ttc ttc ctg atg gea gtg gtt aca ggg
Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly
10 15
ctg cag cag tet ggg gea gag ctt gtg aag
Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 25 30 cca ggg gcc tca gtc aag ttg tcc tgc aca gct tct ggc ttc aac att 14 4
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
35 40 45
aac gac acc tat atg cac tgg gtg aag cag agg cct gaa cag ggc ctg 192
Asn Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu
50 55 60
gag tgg att gga agg att gat cct gcg aat ggt aat act aaa tat gac 240
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp
65 70 75 80
ccg aag ttc cag ggc aag gcc act ata aca gca gac aca tcc tcc aac 288
Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn
85 90 95
aca gcc tac ctg cag ctc age age ctg aca tct gag gac act gcc gtc 336
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
tat tac tgt gct aga gga gca cgg ggg agt aga ttt gct tac tgg ggc 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ser Arg Phe Ala Tyr Trp Gly
115 120 125
caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca gcc aaa aca aca gcc cca tcg 432
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser 130 135 140
gtc tat cca ctg gcc cct gtg tgt gga gat aca act ggc tcc tcg gtg 480
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val 145 150 155 160
act cta gga tgc ctg gtc aag ggt tat ttc cct gag cca gtg acc ttg 528 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu
165 170 175
acc tgg aac tct gga tcc ctg tcc agt ggt gtg cac acc ttc cca gct 576 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190
gtc ctg cag tct gac ctc tac acc ctc age age tca gtg act gta acc 624
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr
195 200 205
tcg age acc tgg ccc age cag tcc ate acc tgc aat gtg gcc cac ccg 672
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro 210 215 220
gca age age acc aag gtg gac aag aaa att gag ccc aga ggg ccc aca 720 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr 225 230 235 240
ate aag ccc tgt cct cca tgc aaa tgc cca gca cct aac ctc ttg ggt 7 68 Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
245 250 255
gga cca tcc gtc ttc ate ttc cct cca aag ate aag gat gta ctc atg 816
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met 260 265 270
ate tcc ctg age ccc ata gtc aca tgt gtg gtg gtg gat gtg age gag 864
Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
275 280 285
gat gac cca gat gtc cag ate age tgg ttt gtg aac aac gtg gaa gta 912 Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val 290 295 300
cac aca gct cag aca caa acc cat aga gag gat tac aac agt act ctc 960 His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu 305 310 315 320
cgg gtg gtc agt gcc ctc ccc ate cag cac cag gac tgg atg agt ggc 1008 Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly 325 330 335
aag gag ttc aaa tgc aag gtc aac aac aaa gac ctc cca gcg ccc ate 1056 Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
gag aga acc ate tca aaa ccc aaa ggg tca gta aga gct cca cag gta 1104 Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val 355 360 365
tat gtc ttg cct cca cca gaa gaa gag atg act aag aaa cag gtc act 1152 Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr 370 375 380
ctg acc tgc atg gtc aca gac ttc atg cct gaa gac att tac gtg gag 1200 Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu 385 390 395 400
tgg acc aac aac ggg aaa aca gag cta aac tac aag aac act gaa cca 1248 Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro 405 410 415
gtc ctg gac tet gat ggt tet tac ttc atg tac age aag ctg aga gtg 1296 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
420 425 430
gaa aag aag aac tgg gtg gaa aga aat age tac tcc tgt tca gtg gtc 1344 Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val 435 440 445
cac gag ggt ctg cac aat cac cac acg act aag age ttc tcc cgg act 1392 His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr 450 455 460
ccg ggt aaa tga 1404
Pro Gly Lys 465
<210> 58 <211> 467 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> polipeptideo sintético: cadeia H de 92-13 <400> 58
Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly 1 5 10 15
Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile 35 40 45
Asn Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp 65 70 75 80
Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ser Arg Phe Ala Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser
130 135 140
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val 145 150 155 160
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu
165 170 175
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr
195 200 205
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro
210 215 220
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr 225 230 235 240
Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
260 265 270
Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
275 280 285
Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
290 295 300
His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu 305 310 315 320
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
325 330 335
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr
370 375 380
Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu 385 390 395 400
Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
420 425 430
Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val
435 440 445
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr
450 455 460
Pro Gly Lys 465
<210> 59 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> polipeptídeo sintético: cadeia L de 92-13 <22 0> <221> CDS <222> (1)..(705) <223>
<400> 59
atg agt gtg ccc act cag gtc ctg ggg ttg ctg ctg ctg tgg ctt aca 48
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15
gat gcc aga tgt gac ate cag atg act cag tet cca gcc tcc cta tet 96
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
20 25 30
gta tet gtg gga gaa act gtc acc ate aca tgt cga gea agt gag aat 144
Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 35 40 45
att tac agt aat tta gea tgg tat cag cag aaa cag gga aaa tet cct 192
Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro
50 55 60
cag ctc ctg gtc tat gtt gea aca aac tta gea gat ggt gtg cca tca 240 Gln Leu Leu Val Tyr Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80
agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca cag tat tcc ctc aag ate aac 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn 85 90 95
age ctg cag tet gaa gat ttt ggg agt tat tac tgt caa cat ttt tgg 336 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp
100 105 110
ggt act ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa cgg 384 Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
gct gat gct gea cca act gta tcc ate ttc cca cca tcc agt gag cag 432 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
130 135 140
tta aca tet gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg aac aac ttc tac 480
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160
ccc aaa gac ate aat gtc aag tgg aag att gat ggc agt gaa cga caa 528
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 165 170 175
aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac age aaa gac age acc 576 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
tac age atg age age acc ctc acg ttg acc aag gac gag tat gaa cga 624 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 195 200 205
cat aac age tat acc tgt gag gcc act cac aag aca tca act tca ccc 672
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
210 215 220
att gtc aag age ttc aac agg aat gag tgt tag 705
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230
<210> 60 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> polipeptideo sintético: cadeia L de 92-13 <400> 60
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
20 25 30
Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gln Leu Leu Val Tyr Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser
65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn
85 90 95 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp
100 105 110
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 130 135 140
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
165 170 175
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
195 200 205
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 210 215 220
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230
<210> 61 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> polipeptideo sintético: cadeia H de 93-22 <220> <221> CDS
<222> (1) . . (1404) <22 3> <400> 61
atg gga tgg age cgg ate ttt ctc ttc ctc ctg tca ata act gea ggt 48
Met Gly Trp Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala Gly
1 5 10 15
gtc cat tgc cag gtc cag ctg cag cag tet gga cct gag ctg gtg aag 96
Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30
cct ggg gcc tca gtg aag att tcc tgc aaa gct tct ggc tac gca ttc 144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe 35 40 45
agt age tct tgg atg aac tgg gtg aag cag agg cct gga cag ggt ctt 192
Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
gag tgg att gga cgg att tat cct gga gat gga gat act aac tac aat 240
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80
ggg aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc age 288
Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
aca gcc tac atg caa ctc age age ctg acc tct gtg gac tct gcg gtc 336
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val 100 105 110
tat ttc tgt gca aga ggg ggt aac tac ggc tgg ttt gct tac tgg ggc 384
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 115 120 125
caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca gcc aaa aca aca gcc cca tcg 432
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser
130 135 140
gtc tat cca ctg gcc cct gtg tgt gga gat aca act ggc tcc tcg gtg 480
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val 145 150 155 160
act cta gga tgc ctg gtc aag ggt tat ttc cct gag cca gtg acc ttg 528
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu
165 170 175
acc tgg aac tct gga tcc ctg tcc agt ggt gtg cac acc ttc cca gct 57 6
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190
gtc ctg cag tct gac ctc tac acc ctc age age tca gtg act gta acc 624
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr 195 200 205
tcg age acc tgg ccc age cag tcc ate acc tgc aat gtg gcc cac ccg 672
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro
210 215 220
gca age age acc aag gtg gac aag aaa att gag ccc aga ggg ccc aca 720
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr 225 230 235 240
ate aag ccc tgt cct cca tgc aaa tgc cca gca cct aac ctc ttg ggt 768
Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
245 250 255
gga cca tcc gtc ttc ate ttc cct cca aag ate aag gat gta ctc atg 816
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met 260 265 270
ate tcc ctg age ccc ata gtc aca tgt gtg gtg gtg gat gtg age gag 864
Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu 275 280 285
gat gac cca gat gtc cag ate age tgg ttt gtg aac aac gtg gaa gta 912
Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val 290 295 300 cac aca gct cag aca caa acc cat aga gag gat tac aac agt act ctc 960
His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu 305 310 315 320
cgg gtg gtc agt gcc ctc ccc ate cag cac cag gac tgg atg agt ggc 1008 Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly 325 330 335
aag gag ttc aaa tgc aag gtc aac aac aaa gac ctc cca gcg ccc ate 1056 Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350
gag aga acc ate tca aaa ccc aaa ggg tca gta aga gct cca cag gta 1104 Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val
355 360 365
tat gtc ttg cct cca cca gaa gaa gag atg act aag aaa cag gtc act 1152 Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr 370 375 380
ctg acc tgc atg gtc aca gac ttc atg cct gaa gac att tac gtg gag 1200 Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu 385 390 395 400
tgg acc aac aac ggg aaa aca gag cta aac tac aag aac act gaa cca 1248 Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro 405 410 415
gtc ctg gac tet gat ggt tet tac ttc atg tac age aag ctg aga gtg 1296 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val 420 425 430
gaa aag aag aac tgg gtg gaa aga aat age tac tcc tgt tca gtg gtc 1344 Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val
435 440 445
cac gag ggt ctg cac aat cac cac acg act aag age ttc tcc cgg act 1392 His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr 450 455 460
ccg ggt aaa tga 1404
Pro Gly Lys 465 <210> 62 <211> 467
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipeptideo sintético: cadeia H de 93-22
<400> 62
Met Gly Trp Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala Gly 15 10 15
Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30
45 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe 35 40 45
Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn 50 65 70 75 80
Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser
130 135 140
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val 145 150 155 160
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu
165 170 175
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr
195 200 205
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro
210 215 220
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr 225 230 235 240
Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
260 265 270
Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
275 280 285
Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
290 295 300
His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu 305 310 315 320
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
325 330 335
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr
370 375 380
Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu 385 390 395 400
Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
420 425 430
Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val
435 440 445
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr
450 455 460
Pro Gly Lys 465
<210> 63 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> polipeptídeo sintético: cadeia L de 93-22 <220> <221> CDS <222> (1) . . (714) <223> <400> 63
atg gag aca gac aca ctc ctg tta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca 48
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
ggt tcc act ggt gac att gtg ctg aca cag tct cct gct tcc tta gct 96
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
gta tct ctg ggg cag agg gcc acc ate tca tgc agg gcc age aaa agt 144
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser 35 40 45
gtc agt aca tct ggc tat agt tat atg cac tgg tac caa cag aaa cca 192
Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60
gga cag cca ccc aaa ctc ctc ate tat ctt gea tcc aac cta gaa tct 240 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80
ggg gtc cct gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc acc 288 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95
ctc aac ate cat cct gtg gag gag gag gat gct gea acc tat tac tgt 336 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
cag cac agt agg gag ctg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa 384
Gln His Ser Arg Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125
ata aaa cgg gct gat gct gea cca act gta tcc ate ttc cca cca tcc 432 Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser 130 135 140
agt gag cag tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg aac 480 Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn 145 150 155 160
aac ttc tac ccc aaa gac ate aat gtc aag tgg aag att gat ggc agt 528 Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser 165 170 175
gaa cga caa aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac age aaa 576
Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys
180 185 190
gac age acc tac age atg age age acc ctc acg ttg acc aag gac gag 624 Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu 195 200 205
tat gaa cga cat aac age tat acc tgt gag gcc act cac aag aca tca 672
Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser 210 215 220
act tca ccc att gtc aag age ttc aac agg aat gag tgt tag 714
Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 64 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> polipeptideo sintético: cadeia L de 93-22 <400> 64
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser
35 40 45
Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln His Ser Arg Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
115 120 125
Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn 145 150 155 160
Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser
165 170 175
Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys
180 185 190
Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu
195 200 205
Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser
210 215 220
Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235
<210> 65 <211> 1395 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> polipeptideo sintético: cadeia H de 39-10
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1395)
<223>
<400> 65
atg gat tgg ctg tgg aac ttg cta ttc ctg atg gca gct gcc caa agt Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15
ate caa gca cag ate cag ttg gtg cag tet gga cct gag ctg aag aag Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
20 25 30
cct gga gag aca gtc aag ate tcc tgc aag gct tet ggg tat acc ttc 144
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45
aca aac tat gga atg aac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta 192 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
aag tgg atg ggc tgg ata aac acc aac act gga gag cca aca tat gct 240 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80
gaa gag ttc aag gga cgg ttt gcc ttc tet ttg gaa acc tet gcc age 288 Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 90 95
act gcc tat ttg cag ate aac aac ctc aaa aat gag gac acg gct aca 336 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr
100 105 110
tat ttc tgt gea aga ggg ggg tac ggg gac tac tgg ggc caa ggc acc 384 Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125
act ctc aca gtc tcc tca gcc aaa aca aca gcc cca tcg gtc tat cca 432
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro
130 135 140
ctg gcc cct gtg tgt gga gat aca act ggc tcc tcg gtg act cta gga 480
Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly 145 150 155 160
tgc ctg gtc aag ggt tat ttc cct gag cca gtg acc ttg acc tgg aac 528 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn 165 170 175
tet gga tcc ctg tcc agt ggt gtg cac acc ttc cca gct gtc ctg cag 57 6 Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
180 185 190
tet gac ctc tac acc ctc age age tca gtg act gta acc tcg age acc 624
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr 195 200 205
tgg ccc age cag tcc ate acc tgc aat gtg gcc cac ccg gea age age 672
Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser
210 215 220
acc aag gtg gac aag aaa att gag ccc aga ggg ccc aca ate aag ccc 720
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro
225 230 235 240
tgt cct cca tgc aaa tgc cca gea cct aac ctc ttg ggt gga cca tcc 768
Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser
245 250 255
gtc ttc ate ttc cct cca aag ate aag gat gta ctc atg ate tcc ctg 816
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu
260 265 270
age ccc ata gtc aca tgt gtg gtg gtg gat gtg age gag gat gac cca 864
Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro
275 280 285
gat gtc cag ate age tgg ttt gtg aac aac gtg gaa gta cac aca gct 912
Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala 290 295 300
cag aca caa acc cat aga gag gat tac aac agt act ctc cgg gtg gtc 960
Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val 305 310 315 320
agt gcc ctc ccc ate cag cac cag gac tgg atg agt ggc aag gag ttc 1008
Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe
325 330 335
aaa tgc aag gtc aac aac aaa gac ctc cca gcg ccc ate gag aga acc 1056
Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr 340 345 350
ate tca aaa ccc aaa ggg.tca gta aga gct cca cag gta tat gtc ttg 1104
Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu
355 360 365
cct cca cca gaa gaa gag atg act aag aaa cag gtc act ctg acc tgc 1152
Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys 370 375 380
atg gtc aca gac ttc atg cct gaa gac att tac gtg gag tgg acc aac 1200
Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn 385 390 395 400
aac ggg aaa aca gag cta aac tac aag aac act gaa cca gtc ctg gac 1248
Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp
405 410 415
tet gat ggt tet tac ttc atg tac age aag ctg aga gtg gaa aag aag 1296
Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys 420 425 430
aac tgg gtg gaa aga aat age tac tcc tgt tca gtg gtc cac gag ggt 1344
Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly
435 440 445
ctg cac aat cac cac acg act aag age ttc tcc cgg act ccg ggt aaa 1392
Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 450 455 460 tga 1395 <210> 66 <211> 464
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> polipeptideo sintético: cadeia H de 39-10 <400> 66
Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15
Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45
Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80
Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly 145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
180 185 190
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr
195 200 205
Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser
210 215 220
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro 225 230 235 240
Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser
245 250 255
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu
260 265 270
Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro
275 280 285
Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala
290 295 300
Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val 305 310 315 320
Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe
325 330 335
Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr
340 345 350
Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu
355 360 365
Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys
370 375 380
Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn 385 390 395 400
Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp
405 410 415
Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys
420 425 430
Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly
435 440 445
Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 67 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial <22 0>
<223> polipeptídeo sintético: cadeia L de 39-10 <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <223> <400> 67
atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gtg ctg ctg ctc tgg gtt cca 48
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15
ggt tcc aca ggt gac att gtg ctg acc caa tct cca gct tct ttg gct 96
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
gtg tct cta ggg cag agg gcc acc ata tcc tgc aga gcc agt gaa agt 144
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
35 40 45
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Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
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Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
ggg ate cct gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct agg aca gac ttc acc 288
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr
85 90 95
ctc acc att aat cct gtg gag gct gat gat gtt gea acc tat tac tgt 336
Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
cag caa agt aat gag gat cct cgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg 384
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
gaa ate aaa cgg gct gat gct gea cca act gta tcc ate ttc cca cca 432
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
130 135 140
tcc agt gag cag tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc ttg 480
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
145 150 155 160
aac aac ttc tac ccc aaa gac ate aat gtc aag tgg aag att gat ggc 528
Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
165 170 175
agt gaa cga caa aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac age 57 6
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
180 185 190
aaa gac age acc tac age atg age age acc ctc acg ttg acc aag gac 624
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
195 200 205
gag tat gaa cga cat aac age tat acc tgt gag gcc act cac aag aca 672
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr
210 215 220
tca act tca ccc att gtc aag age ttc aac agg aat gag tgt tag 717
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235
<210> 68
<211> 238 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> polipeptídeo sintético: cadeia L de 39-10 <400> 68
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 15 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
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Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
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Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
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Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr
85 90 95
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100 105 110
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
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165 170 175
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
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Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
195 200 205
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu, Ala Thr His Lys Thr
210 215 220
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235

Claims (42)

1. Anticorpo ou fragmento deste, o qual compreende uma re- gião V (variável) de cadeia H (pesada) que compreende uma região de- terminadora de complementaridade (CDR) que apresenta as seqüências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 15, 17 e 19, ou uma CDR func- tionalmente equivalente, e uma região V de cadeia L (leve) que compreende uma CDR que apresenta as seqüências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 23, 25 e 27, ou uma CDR functionalmente equivalente, e que é capaz de ligar-se a uma proteína homóloga encrespada 10 (FZD10) ou um peptídeo parcial desta.
2. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindicação -1, no qual o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo de camundongo, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um fragmento de anticorpo e anticorpo de cadeia única.
3. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindicação -1, no qual o anticorpo é um anticorpo de camundongo.
4. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindicação -3, no qual o anticorpo de camundongo compreende uma cadeia H que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 57 e/ou uma cadeia L que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 59.
5. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindicação -3, no qual o anticorpo de camundongo é produzido pelo clone de hibridoma -92-13 (FERM BP-10628).
6. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindicação -1, no qual o anticorpo é um anticorpo quimérico.
7. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindicação -6, no qual o anticorpo quimérico compreende uma região V de cadeia H que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 13.
8. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindicação -6 ou 7, no qual o anticorpo quimérico compreende uma cadeia H que a- presenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 46.
9. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindicação -6, no qual o anticorpo quimérico compreende uma região V de cadeia L que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 21.
10. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindi- cação 6 ou 9, no qual o anticorpo quimérico compreende uma cadeia L que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 48.
11. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindi- cação 6, no qual o anticorpo quimérico compreende uma região V de cadeia H que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 13 e uma região V de cadeia L que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 21.
12. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindi- cação 6 ou 11, no qual o anticorpo quimérico compreende uma cadeia H que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 46 e uma cadeia L que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 48.
13. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6-12, no qual o anticorpo quimérico compreende adi- cionalmente uma região C (constante) de anticorpos humanos.
14. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindi- cação 1, no qual o anticorpo é um anticorpo humanizado.
15. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindi- cação 14, no qual o anticorpo humanizado compreende adicionalmente uma região FR (de moldura) de anticorpos humanos e/ou uma região C de an- ticorpos humanos.
16. Anticorpo ou fragmento deste, o qual compreende uma re- gião V (variável) de cadeia H (pesada) que compreende uma região de- terminadora de complementaridade (CDR) que apresenta as seqüências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 31, 33 e 35, ou uma CDR func- tionalmente equivalente, e uma região V de cadeia L (leve) que compreende uma CDR que apresenta as seqüências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 39, 41 e 43, ou uma CDR functionalmente equivalente, e que é capaz de ligar-se a uma proteína homóloga encrespada 10 (FZD10) ou um peptídeo parcial desta.
17. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindi- cação 16, no qual o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo de camundongo, um anticorpo quimérico, um anticorpo humani- zado, um fragmento de anticorpo, e anticorpo de cadeia única.
18. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindi- cação 16, no qual o anticorpo é um anticorpo de camundongo.
19. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindi- cação 18, no qual o anticorpo de camundongo compreende uma cadeia H que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 61 e/ou uma cadeia L que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 63.
20. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindi- cação 18, no qual o anticorpo de camundongo é produzido pelo clone de hibridoma 93-22 (FERM BP-10620).
21. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindi- cação 16, no qual o anticorpo é um anticorpo quimérico.
22. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindicação -21, no qual o anticorpo quimérico compreende uma região V de cadeia H que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 29.
23. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindi- cação 21 ou 22, no qual o anticorpo quimérico compreende uma cadeia H que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 50.
24. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindi- cação 21, no qual o anticorpo quimérico compreende uma região V de cadeia L que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 37.
25. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindi- cação 21 ou 24, no qual o anticorpo quimérico compreende uma cadeia L que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 52.
26. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindi- cação 21, no qual o anticorpo quimérico compreende uma região V de cadeia H que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 29 e uma região V de cadeia L que apresenta a seqüência de aminoá- cidos mostrada em SEQ ID NO 37.
27. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindi- cação 21 ou 26, no qual o anticorpo quimérico compreende uma cadeia H que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 50 e uma cadeia L que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 52.
28. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21-27, no qual o anticorpo quimérico compreende adi- cionalmente uma região C (constante) de anticorpos humanos.
29. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindi- cação 16, no qual o anticorpo é um anticorpo humanizado.
30. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindi- cação 29, no qual o anticorpo humanizado compreende adicionalmente uma região FR (estrutura) de anticorpos humanos e/ou uma região C de anti- corpos humanos.
31. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-30, o qual é marcado com um marcador de radioisó- topo ou um marcador fluorescente.
32. Anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindica- ção 31, no qual o marcador de radioisótopo é selecionado de 90Itrio (90Y), -125iodo (125I) e 111índio (111In).
33. Clone de hibridoma 92-13 (FERM BP-10628), o qual produz o anticorpo monoclonal de camundongo 92-13.
34. Clone de hibridoma 93-22 (FERM BP-10620), o qual produz o anticorpo monoclonal de camundongo 93-22.
35. Método para tratar ou prevenir uma doença que é associ- ada a homólogo encrespado 10 (FZD10) em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento como definido em qualquer uma das reivindicações 1-32.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, no qual a do- ença que é associada a FZD10 é selecionada de sarcoma sinovial (SS), câncer colorretal, câncer gástrico, leucemia mielóide crônica (CML) e leucemia mielóide aguda (AML).
37. Método para diagnose ou prognose de uma doença que é associada a homólogo encrespado 10 (FZD10) ou de uma predisposição para desenvolver a doença em um indivíduo, compreendendo (a) contatar uma amostra ou um espécime do indivíduo com o anticorpo ou fragmento como definido em qualquer uma das reivindicações -1-32; (b) detectar a proteína FZD10 na amostra ou espécime; e (c) julgar se o indivíduo sofre ou não de ou está em risco de desenvolver a doença com base na abundância relativa da proteína FZD10 em comparação com um controle.
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, no qual a do- ença que é associada a FZD10 é selecionada de sarcoma sinovial (SS), câncer colorretal, câncer gástrico, leucemia mielóide crônica (CML) e leucemia mielóide aguda (AML).
39. Método para formação de imagem in vivo de proteína ho- móloga encrespada 10 (FZD10) em um indivíduo, compreendendo admi- nistrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento como definido na reivindicação 31 ou 32.
40. Composição farmacêutica para tratar ou prevenir uma do- ença associada a homólogo encrespado 10 (FZD10), compreendendo o anticorpo ou fragmento como definido em qualquer uma das reivindicações -1-32, e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
41. Kit para diagnose ou prognose de uma doença associada a homólogo encrespado 10 (FZD10), compreendendo o anticorpo ou frag- mento como definido em qualquer uma das reivindicações 1-32.
42. Composição farmacêutica para formação de imagem in vivo de proteína homóloga encrespada 10 (FZD10), compreendendo o anti- corpo ou fragmento como definido na reivindicação 31 ou 32.
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