BRPI0621967A2 - forma pura de rapamicina e um processo para recuperaÇço e purificaÇço da mesma - Google Patents
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Abstract
FORMA PURA DE RAPAMICINA E UM PROCESSO PARA RECUPERAÇçO E PURIFICAÇçO DA MESMA. A presente invenção diz respeito a uma forma pura de rapamicina com um teor de impureza total inferior a 1 ,2%, um processo para a recuperação e purificação da rapamicina incluindo as etapas de (a) tratamento do caldo de fermentação, extratos ou soluções contendo rapamicina com solvente imiscivel em água e concentração; (b) adição de um solvente miscível em água para obter a separação das impurezas presentes; (c) opcionalmente, união do solvente contendo o produto da etapa (b) a um sólido inerte, lavagem do sólido com uma base e um ácido, seguida por eluição; (d) submissão do eluato da etapa (c) ou do solvente contendo o produto da etapa (b) á cromatografia com sílica gel; (e) cristalização do produto obtido a partir da etapa (d); (f) submissão de uma solução do produto da etapa (e) à cromatografia de interação hidrofóbica ou de fase reversa; e (g) recristalização para obter a rapamicina na forma substancialmente pura.
Description
FORMA PURA DE RAPAMICINA E UM PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃ DA MESMA
CAMPO DA INVENÇÃO:
A presente invenção revela uma forma substancialmente pura de rapamicina. A invenção também diz respeito a um processo para a recuperação e purificação da rapamicina a partir do caldo de fermentação, extratos ou soluções contendo rapamicina em uma combinação de etapas.
DADOS PRELIMINARES E ARTE ANTERIOR:
Em 1975, Vezina et al. identifcaram a (3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)- 9,10,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,32,33,34,34a-Hexadecaidro-9,27-diidróxi-3- [(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-hidróxi-3-metoxiciclohexil]-1-metiletil]-10,21-dimetóxi -6,8,12,14,20,26-hexametil-23,27-epóxi-3H-pirido[2,1-c][1,4] oxaazacicloentriacontina-1,5,11, 28,29(4H,6H,31H)-pentona, também conhecida como rapamicina, bem como sirolimo, como um antibiótico antifúngico colhido a partir de uma cultura de Streptomyces hygroscopicus. Esta cultura foi isolada a partir de uma amostra de solo da Ilha da Páscoa (J. Antibiot. 28, 721-726 (1975); e a Patente Americana número 3,929,992 foi emitida para Sehgal et al. em 30 de dezembro de 1975. Martel, R. et al. (1977) descreveram a habilidade deste composto de inibir a resposta imune (Can. J. Physiol. Pharmacol., 55, 48-51). Mais recentemente, Calne, R. Y. et al. (1989) descreveram que a rapamicina é imunossupressora em ratos que receberam aloenxertos cardíacos (Lancet vol. 2, p. 227). Muitos outros derivados destes compostos bem como os análogos estruturais têm propriedade imunossupressora.
A patente americana 5,508,398 revela um processo para separar um macrólido não- polipeptídico neutro das impurezas neutras acídicas, básicas e não polares presentes em um concentrado de extratos de caldo de fermentação ou licores-mãe contendo tal macrólido neutro que inclui em qualquer ordem a etapa de extração (a) e opcionalmente uma ou ambas etapas (b) e (c), em que (a) envolve a extração com base aquosa, (b) envolve a extração com ácido aquoso e (c) envolve tratamento com um solvente de hidrocarbonos não aromáticos.
A patente americana 5,616,595 revela um processo para recuperação de compostos insolúveis em água (incluindo FK506, FK520 e rapamicina) a partir de um caldo de fermentação que inclui etapas seqüenciais de concentração, solubilização e diafiltração do composto de interesse, tudo através de um único sistema de recirculação fechada para recuperar o composto para a purificação a jusante adicional. Os métodos da arte anterior para a recuperação dos compostos macrolídeos são tediosos ou requerem uma preparação especial para a purificação e não resultam em um produto puro.
Os tabletes do inventor (Wyeth) são comercializados sob o nome de Rapamune. Os tabletes de Rapamune foram analisados por HPLC de acordo com o método descrito aqui e mostraram conter diversas impurezas. Sabe-se que a rapamicina existe em três formas isoméricas; isômero A, isômero B e isômero C. Excluindo esses isômeros, Rapamune continha 1,2% de impurezas totais, 0,39% de impureza em RRT (tempo relativo de retenção) 1,34, 0,15% de impureza em RRT 0,92 e 0,24% de impureza em RRT 0,69.
A invenção atual oferece rapamicina na forma mais pura e um método para obter a mesma. A presente invenção revela uma rapamicina com um teor de impureza total inferior a 1,2% obtida por HPLC. A presente invenção também diz respeito à rapamicina com um teor de impureza inferior a 0,15% em RRT 1,34. A presente invenção diz respeito à rapamicina com um teor de impureza inferior a 0,15% em RRT 0,92. A presente invenção diz respeito à rapamicina com um teor de impureza inferior a 0,15% em RRT 0,69.
A invenção atual também diz respeito a um processo para recuperação e purificação da rapamicina.
OBJETOS DA INVENÇÃO:
O principal objeto da presente invenção é a obtenção de uma forma pura de rapamicina com um teor de impureza total inferior a 1,2%.
Um outro objeto da presente invenção é a obtenção de uma forma pura de rapamicina com impureza inferior a 0,15% em RRT 1,34, 0,92 e 0,69 min.
Ainda outro objeto da presente invenção é a obtenção de uma forma pura de rapamicina através de Cromatografia Líquida de Alto Desempenho. Um outro objeto da presente invenção é o desenvolvimento de um processo para recuperação e purificação da rapamicina a partir do caldo de fermentação.
DECLARAÇÃO DA INVENÇÃO:
A presente invenção diz respeito a uma forma pura de rapamicina com um teor de impureza total inferior a 1,2%, um processo de recuperação e purificação da rapamicina incluindo as etapas de (a) tratamento do caldo de fermentação, extratos ou soluções contendo rapamicina com solvente imiscível em água e concentração; (b) adição de um solvente miscível em água para obter a separação das impurezas presentes; (c) opcionalmente, a união do solvente contendo o produto da etapa (b) a um sólido inerte, lavagem do sólido com uma base e um ácido, seguida por eluição; (d) submissão do eluato da etapa (c) ou do solvente contendo o produto da etapa (b) à cromatografia com sílica gel; (e) cristalização do produto obtido a partir da etapa (d); (f) submissão de uma solução do produto da etapa (e) à cromatografia de interação hidrofóbica ou de fase reversa; e (g) recristalização para obter a rapamicina na forma substancialmente pura.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS QUE ACOMPANHAM:
FIG 1 cromatograma de HPLC de Rapamune
FIG 2 cromatograma de HPLC da Rapamicina purificada
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO:
A presente invenção diz respeito a uma forma pura de rapamicina com um teor de impureza total inferior a 1,2%.
Em outra incorporação da presente invenção, a rapamicina com impureza inferior a 0,15% em RRT 1,34, 0,92 e 0,69 min.
Em outra incorporação da presente invenção, a rapamicina possui uma pureza entre 98,8% a 100%.
Em outra incorporação da presente invenção, a rapamicina possui uma pureza preferivelmente de 98,8%.
Em outra incorporação da presente invenção, a rapamicina é produzida pelo caldo de fermentação.
Em outra incorporação ainda da presente invenção, a rapamicina é obtida por Cromatografia Líquida de Alto Desempenho.
Em ainda outra incorporação da presente invenção, a rapamicina encontra-se em forma cristalina.
A presente invenção também diz respeito a um processo para recuperação e purificação da rapamicina incluindo as etapas de:
1. tratamento do caldo de fermentação, extratos ou soluções contendo rapamicina com solvente imiscível em água e concentração;
2. adição de um solvente miscível em água para obter a separação das impurezas presentes;
3. opcionalmente, a união do solvente contendo o produto da etapa (b) a um sólido inerte, lavagem do sólido com uma base e um ácido, seguida por eluição;
4. submissão do eluato da etapa (c) ou do solvente contendo o produto da etapa (b) à cromatografia com sílica gel;
5. cristalização do produto obtido a partir da etapa (d);
6. submissão de uma solução do produto da etapa (e) à cromatografia de interação hidrofóbica ou de fase reversa; e
7. recristalização para obter a rapamicina na forma substancialmente pura.
Em uma outra incorporação da presente invenção, o solvente imiscível em água é selecionado a partir de um grupo incluindo hidrocarbonos, compostos heterocíclicos, éteres e ésteres.
Em ainda uma outra incorporação da presente invenção, o solvente imiscível em água é selecionado a partir de um grupo incluindo benzeno, tolueno, butanol, diclorometano, clorofórmio, acetato de etila, acetato de isobutila e acetato de butila. Em ainda uma outra incorporação da presente invenção, o solvente imiscível em água é o acetato de etila.
Em ainda outra incorporação da presente invenção, o solvente miscível em água é selecionado a partir de um grupo incluindo água, álcoois, cetonas e solventes apróticos dielétricos.
Em ainda outra incorporação da presente invenção, o solvente miscível em água é selecionado a partir de um grupo incluindo água, metanol, etanol, álcool isopropílico, acetona e acetonitrila.
Em ainda outra incorporação da presente invenção, o sólido inerte é selecionado a partir de um grupo incluindo terra diatomácea, areia, carvão ativado, sílica gel e resina polimérica.
Em outra incorporação ainda da presente invenção, o sólido inerte é terra diatomácea.
Em uma outra incorporação da presente invenção, o sólido inerte é carvão ativado. Em uma outra incorporação ainda da presente invenção, a base utilizada é uma base orgânica ou inorgânica.
Em outra incorporação da presente invenção, a base utilizada é uma base inorgânica.
Em outra incorporação da presente invenção, a base é o bicarbonato de sódio.
Em ainda outra incorporação da presente invenção, o ácido utilizado é um ácido orgânico ou inorgânico.
Em ainda outra incorporação da presente invenção, o ácido utilizado é um ácido orgânico.
Em ainda outra incorporação da presente invenção, o ácido é o ácido clorídrico.
Em ainda outra incorporação da presente invenção, a eluição é realizada utilizando um solvente orgânico selecionado a partir de um grupo incluindo acetona, acetato de etila, clorofórmio, diclorometano, hexano, éter de petróleo, metanol e éter de dietila ou misturas dos mesmos.
Em outra incorporação da presente invenção, a eluição é realizada utilizando acetona.
Em ainda outra incorporação da presente invenção, a cristalização é realizada utilizando éteres.
Em outra incorporação da presente invenção, a cristalização é realizada utilizando éter de dietila. Em ainda outra incorporação da presente invenção, a cromatografia de interação hidrofóbica é realizada com uma resina polimérica selecionada a partir de um grupo incluindo poliestireno, poli(estireno-divinil benzeno), poli(acrilato) e poli(metacrilato). Em ainda outra incorporação da presente invenção, a cromatografia de fase reversa é realizada com uma resina selecionada a partir de um grupo incluindo sílica ligada a C4, C8eC18.
Em ainda outra incorporação da presente invenção, a eluição em cromatografia de interação hidrofóbica ou de fase reversa é realizada utilizando solventes selecionados a partir de um grupo incluindo metanol, acetona, acetonitrila, água, etanol, propanol, butanol e tetraidrofurano ou uma mistura dos mesmos.
Em ainda outra incorporação da presente invenção, a recristalização é realizada utilizando solvente orgânico selecionado a partir de um grupo incluindo acetonitrila, acetona, metanol, etanol, propanol, butanol, clorofórmio, diclorometano, acetato de etila, hexano e heptano.
Em ainda outra incorporação da presente invenção, o produto purificado é uma das formas isoméricas da rapamicina, a saber, o isômero A, isômero B ou isômero C. Em ainda outra incorporação da presente invenção, o produto purificado é o isômero B da rapamicina.
A presente invenção diz respeito à rapamicina com teor de impureza total inferior a 1,2% através do HPLC.
A presente invenção também diz respeito à rapamicina com um teor de impureza inferior a 0,15% em RRT 1,34. A análise de LC-MS da rapamune bem como da rapamicina da presente invenção mostra que a impureza em RRT 1,34 chega ao
pico em m/z de 951 correspondendo a [M+Na]+. Esta impureza tem massa 14Da acima daquela da rapamicina. A impureza em RRT 0,69 ou RRT 0,92 presente na rapamicina produzida utilizando o processo presente é inferior a 0,15% cada. Todos os RRTs aqui dizem respeito ao isômero B da rapamicina.
O método HPLC utilizado aqui para análise do Rapamune e rapamicina purificados de acordo com a presente invenção é o seguinte:
Coluna: Agilent Eclipse XDB-C8, 3.5 Dm, diâmetro - 4.6 mm, comprimento - 150 mm
Caudal: 1.5 ml/min
Comprimento de onda da detecção: 287 nm
10 Volume de injeção: 20 Dl
Diluente: Acetonitrila
Temperatura: 45°C
Tempo de retenção aproximado do isômero B da rapamicina: 26 min
Fase móvel: Tampão A - acetonitrila, Tampão B - 2 mM KH2PO4 na água. O gradiente é conforme apresentado na Tabela 1.
TABELA 1
<table>table see original document page 9</column></row><table>
A presente invenção também diz respeito a um processo para recuperação e purificação da rapamicina incluindo:
a) tratamento do caldo de fermentação, extratos ou soluções contendo rapamicina com solvente imiscível em água e concentração;
b) adição de um solvente miscível em água para obter a separação das impurezas presentes;
c) opcionalmente, a união do solvente contendo o produto da etapa (b) a um sólido inerte, lavagem do sólido com uma base e um ácido, seguida por eluição;
d) submissão do eluato da etapa (c) ou do solvente contendo o produto da etapa (b) à cromatografia com sílica gel;
e) cristalização do produto obtido a partir da etapa (d);
f) submissão de uma solução do produto da etapa (e) à cromatografia de interação hidrofóbica ou de fase reversa; e
g) recristalização para obter a rapamicina na forma substancialmente pura.
A rapamicina da presente invenção é produzida por fermentação. O caldo obtido pela fermentação pode ser diretamente extraído através de um solvente imiscível em água. O solvente imiscível em água pode ser selecionado a partir do acetato de etila, toluene, acetato de butila, acetato de isobutila, butanol, benzeno, clorofórmio e diclorometano. Qualquer material bruto em forma sólida, semissólida ou líquida obtido a partir do caldo pode ser tratado com solvente imiscível em água para obter a solubilização da rapamicina no solvente imiscível em água. O solvente imiscível em água contendo rapamicina pode ser concentrado. A concentração poderá ser obtida por métodos conhecidos. A concentração pode ser afetada pela vaporização do solvente. A vaporização do solvente pode ser realizada por aquecimento sem ou com pressão reduzida. O concentrado pode ser tratado com um solvente para efetuar a separação das impurezas presentes com a rapamicina. As impurezas poderão estar presentes na forma de sólido ou líquido, imiscíveis com o solvente, ou ambas. As impurezas poderão ser separadas por filtração, separação de fase ou ambas. O solvente poderá ser um solvente miscível em água. Preferivelmente, o solvente poderá ser selecionado a partir da acetona, metanol ou acetonitrila. Opcionalmente, o concentrado é ligado a um sólido inerte e lavado com uma base e/ ou ácido. A rapamicina é então eluída com um solvente orgânico. A base e o ácido podem ser selecionados a partir de ácidos e bases inorgânicos ou orgânicos.
Preferivelmente, a base pode ser bicarbonato de sódio aquoso e o ácido pode ser ácido clorídrico aquoso. O solvente orgânico pode ser escolhido a partir dos solventes que são capazes de dissolver a rapamicina e as misturas dos mesmos. O eluato então poderá ser concentrado. O concentrado poderá ser submetido à cromatografia com sílica gel. A eluição poderá ser realizada com um dos solventes entre acetona, acetato de etila, clorofórmio, diclorometano, hexano, heptano, éter de petróleo, metanol e éter de dietila ou uma mistura dos mesmos. O produto contendo frações da cromatografia poderá ser misturado e concentrado. O concentrado poderá ser tratado com um solvente para isolar o produto. O produto poderá ser filtrado e secado. Opcionalmente, este tratamento do solvente poderá ser repetido.
O produto pode ser sujeito à cromatografia de interação hidrofóbica ou de fase reversa. A cromatografia de interação hidrofóbica poderá ser realizada com uma resina polimérica. Esta resina polimérica poderá ser selecionada entre poliestireno, poli(estireno-divinil benzeno), poli(acrilato) e poli(metacrilato). A resina para a cromatografia de fase. reversa poderá ser selecionada a partir da sílica ligada a C4, C8 ou C18. O solvente eluente para a cromatografia de interação hidrofóbica ou cromatografia de fase reversa poderá ser selecionado entre metanol, acetona, acetonitrila, água, etanol, propanol, butanol e tetraidrofurano ou uma mistura dos mesmos.
As frações contendo o produto com a pureza desejada poderão ser misturadas, concentradas, extraídas com um solvente imiscível em água. O extrato poderá ser concentrado.
O concentrado ou o produto obtido após a cromatografia de interação hidrofóbica ou cromatografia de fase reversa poderá ser recristalizado a partir de um solvente orgânico. Este solvente poderá ser selecionado entre acetona, acetonitrila, metanol, etanol, propanol, acetato de etila, clorofórmio e diclorometano.
A invenção é adicionalmente elaborada com a ajuda dos exemplos seguintes. Contudo, estes exemplos não devem ser interpretados como Iimitantes do escopo da invenção.
Exemplo 1: Recuperação da Rapamicina
O caldo de fermentação (11 kg) contendo rapamicina foi extraído duas vezes com 11 L de acetato de etila. O extrato do acetato de etila foi concentrado para obter 206 g de resíduo oleoso. O resíduo foi extraído três vezes com 600 ml de acetonitrila. Os extratos de acetonitrila foram concentrados para obter 90 g de resíduo oleoso. O resíduo foi misturado com 1 L de acetato de etila. 500 g de terra diatomácea foram adicionados a esta solução. A solução foi concentrada completamente. O concentrado foi misturado em 1 L de 0,01 M de solução de bicarbonato de sódio em água. A mistura foi filtrada. Os sólidos filtrados foram também lavados com 9 L de 0,01 M de solução de bicarbonato de sódio. A lavagem com base foi seguida por 10 L de 0,1 N de solução de ácido clorídrico aquosa. Os sólidos foram então enxaguados com água. O produto foi eluído utilizando acetato de etila. O eluato foi concentrado para obter 56 g de resíduo.
O resíduo foi aplicado a uma coluna empacotada com sílica gel. A coluna foi lavada com 15% de acetona em hexano e 25% de acetona em hexano. O produto foi eluído com 40% de acetona em hexano. O produto contendo as frações foi concentrado para obter 23 g de resíduo. O resíduo foi misturado com éter de dietila e a mistura foi agitada a 4°C. A mistura foi filtrada para isolar os cristais de rapamicina. Os cristais foram secados para obter 6 g de pó branco com ~95% de pureza. Exemplo 2: Recuperação da Rapamicina
O caldo de fermentação (2500 kg) contendo rapamicina foi extraído com acetato de etila (três extrações na razão de 1:05, 1:0.25, 1:0.25). O extrato de acetato de etila foi concentrado até cerca de 1000 kg. A camada de acetato de etila parcialmente concentrada foi lavada com água. A camada de acetato de etila foi concentrada para obter 50 kg de resíduo oleoso. O resíduo foi extraído três vezes com 150 kg de acetonitrila. Os extratos de acetonitrila foram concentrados para obter 11 kg de resíduo oleoso. O resíduo foi misturado com 200 kg de acetato de etila. 0,765 kg de carvão ativado foram adicionados a esta solução. A solução foi agitada e filtrada. O filtrado foi concentrado completamente para obter o resíduo.
O resíduo foi aplicado a uma coluna empacotada com sílica gel. A coluna foi lavada com 15% de acetona em hexano e 25% de acetona em hexano. O produto foi eluído com 40% de acetona em hexano. O produto contendo frações foi concentrado para obter um resíduo oleoso. O resíduo foi misturado com 200 kg de acetato de etila. 0,765 kg de carvão ativado foram adicionados a esta solução. A solução foi agitada, filtrada e concentrada. O concentrado foi misturado com éter de dietila e a mistura foi agitada a 4°C. A mistura foi filtrada para isolar os cristais de rapamicina. Os cristais foram secados para obter 1,1 kg de pó branco com ~ 90% de pureza.
Exemplo 3: Purificação da Rapamicina 3 g do pó obtido no Exemplo 1 foram dissolvidos em 90 ml de acetonitrila. A solução foi concentrada e mantida a 4°C para a cristalização. Os cristais foram filtrados e secados. 2,5 g de cristais brancos foram obtidos. As impurezas totais nestes cristais eram 0,5% e a impureza em RRT 1,34 era de 0,25%. Exemplo 4: Purificação da Rapamicina
7 g do pó obtido no Exemplo 2 foram dissolvidos em acetonitrila a uma concentração de 150 mg/ml. A solução foi carregada em uma coluna empacotada com sílica ligada a C8. O diâmetro da coluna era de 100 mm e o comprimento era de 250 mm. O produto foi eluído com uma fase móvel de acetonitrila e água na razão de 60:40. As frações contendo o produto puro foram reunidas e concentradas. O concentrado foi extraído com acetato de etila. A camada de acetato de etila foi concentrada. Ao concentrado foram adicionados 200 ml de acetonitrila. A solução foi concentrada e mantida a 4°C para a cristalização. Os cristais foram filtrados e secados. Obteve-se 1,8 g de pó branco. As impurezas totais neste pó eram 0,15%. As impurezas nos RRTs 1,34 e 0,92 eram 0,07% e 0,03%, respectivamente. A impureza no RRT 0,69 não foi detectada.
Os cromatogramas de HPLC para Rapamune e para a rapamicina obtida conforme acima são apresentados na Fig. 1 e Fig. 2, respectivamente. Os detalhes do cromatograma da Fig. 1 são apresentados na Tabela 2 e os da Fig. 2 são apresentados na Tabela 3. A comparação da Fig. 1 e Fig. 2 e das tabelas correspondentes mostra que a rapamicina obtida com a presente invenção é substancialmente pura.
TABELA 2:
<table>table see original document page 14</column></row><table>
TABELA 3: <table>table see original document page 15</column></row><table>
Exemplo 5: Purificação da Rapamicina 7g do pó obtido no Exemplo 2 foram dissolvidas em 175 ml de acetona. A isto foram adicionados 175 ml de água. A solução foi passada através de uma coluna cheia de resina HP20SS. O diâmetro da coluna era de 20 mm e o comprimento era de 1 m. A coluna foi lavada com 50% de acetona em água e 60% de acetona em água. A eluição foi realizada com 70% de acetona em água. As frações contendo o produto puro foram reunidas e concentradas. O concentrado foi extraído com acetato de etila. A camada de acetato de etila foi concentrada. Foram adicionados 200 ml de acetonitrila ao concentrado. A solução foi concentrada e mantida a 4°C para a cristalização. Os cristais foram filtrados e secados. 1,6 g de pó branco foram obtidos. As impurezas totais neste pó foram 0,45% e as impurezas nos RRTs 1,34, 0,92 e 0,68 foram 0,03%, 0,14% e 0,13%, respectivamente.
Claims (30)
1. "FORMA PURA DE RAPAMICINA", caracterizado por um teor total de impurezas inferior a 1,2%,em que tal rapamicina possui uma impureza inferior a -0.15. em RRT 1,34, 0,92 e 0,69 min.
2. "FORMA PURA DE RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela rapamicina possuir uma pureza preferivelmente de 98,8%.
3. "FORMA PURA DE RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela rapamicina ser produzida através de um caldo de fermentação.
4. "FORMA PURA DE RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela rapamicina ser obtida através de Cromatografia Líquida de Alto Desempenho.
5. "FORMA PURA DE RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela rapamicina encontrar-se em forma cristalina.
6. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", caracterizado por abranger: -1. o tratamento do caldo de fermentação, extratos ou soluções contendo rapamicina com solvente imiscível em água e concentração; -2. adição de um solvente miscível em água para efetuar a separação das impurezas presentes; -3. opcionalmente, união do solvente contendo o produto da etapa (b) a um sólido inerte, lavagem do sólido com uma base e um ácido, seguida por eluição; -4. submissão do eluato da etapa (c) ou do solvente contendo o produto da etapa (b) à cromatografia com sílica gel; -5. cristalização do produto obtido a partir da etapa (d); -6. submissão de uma solução do produto da etapa (e) à cromatografia de interação hidrofóbica ou de fase reversa; e recristalização para obter a rapamicina em forma substancialmente pura.
7. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo solvente imiscível na água ser selecionado a partir de um grupo incluindo hidrocarbonos, compostos heterocíclicos, éteres e ésteres.
8. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo solvente imiscível na água é selecionado a partir de um grupo contendo benzeno, tolueno, butanol, diclorometano, clorofórmio, acetato de etila, acetato de isobutila e acetato de butila.
9. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo solvente imiscível em água ser o acetato de etila.
10. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo solvente miscível em água ser selecionado a partir de um grupo contendo água, álcoois, cetonas e solventes apróticos dielétricos.
11. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo solvente miscível em água ser selecionado a partir de um grupo contendo água, metanol, etanol, álcool isopropílico, acetona e acetonitrilo.
12. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo sólido inerte ser selecionado a partir de um grupo incluindo terra diatomácea, areia, carvão ativado, sílica gel e resina polimérica.
13. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo sólido inerte ser terra diatomácea.
14. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo sólido inerte ser o carvão ativado.
15. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela base utilizada ser uma base orgânica ou inorgânica.
16. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela base utilizada ser uma base inorgânica.
17. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela base ser o bicarbonato de sódio.
18. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo ácido utilizado ser um ácido orgânico ou inorgânico.
19. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo ácido utilizado ser um ácido inorgânico.
20. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo ácido ser o ácido clorídrico.
21. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela eluição ser realizada utilizando um solvente orgânico selecionado a partir de um grupo incluindo acetona, acetato de etila, clorofórmio, diclorometano, hexano, éter de petróleo, metanol e éter de dietila ou misturas dos mesmos.
22. O "PR0CESS0 PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela eluição ser realizada utilizando acetona.
23. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela cristalização ser realizada utilizando éteres.
24. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela cristalização ser realizada utilizando éter de dietila.
25. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela cromatografia de interação hidrofóbica ser realizada com uma resina polimérica selecionada a partir de um grupo incluindo poliestireno, poli(estireno-divinil benzeno), poli(acrilato) e poli(metacrilato).
26. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela cromatografia de fase reversa ser realizada com uma resina selecionada a partir de um grupo incluindo sílica ligada a C4, C8 e C18.
27. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela eluição na cromatografia de interação hidrofóbica ou de fase reversa ser realizada utilizando solventes selecionados a partir de um grupo incluindo metanol, acetona, acetonitrila, água, etanol, propanol, butanol e tetraidrofurano ou mistura dos mesmos.
28. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela recristalização ser realizada utilizando solventes orgânicos selecionados a partir de um grupo incluindo acetonitrila, acetona, metanol, etanol, propanol, butanol, clorofórmio, diclorometano, acetato de etila, hexano e heptano.
29. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo produto purificado ser uma das formas isoméricas da rapamicina, a saber, o isômero A, isômero B ou isômero C.
30. "PROCESSO PARA RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA RAPAMICINA", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo produto purificado ser o isômero B da rapamicina.
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