BRPI0622099A2

BRPI0622099A2 - processo para a produÇço biolàgica de 1,3-propanodiol a partir de glicerol com alto rendimento

Info

Publication number: BRPI0622099A2
Application number: BRPI0622099-1A
Authority: BR
Inventors: Philippe Soucaille
Original assignee: Metabolic Explorer Sa
Priority date: 2006-10-31
Filing date: 2006-10-31
Publication date: 2011-12-27
Also published as: US20100137655A1; EP2400027A1; US8236994B2; AR065833A1; MX2009004659A; WO2008052595A1; KR20090090319A; CN101528936A; JP2010508013A; EP2084288A1; CA2665448A1; TW200835793A

Abstract

PROCESSO PARA A PRODUÇçO BIOLàGICA DE 1,3-PROPANODIOL A PARTIR DE GLICEROL COM ALTO RENDIMENTO. A presente invenção fornece um método para a produção anaeróbica de 1,3-propanodiol através de cultura de uma cepa de Clostridium em um meio de cultura apropriado compreendendo glicerol como uma fonte de carbono, em que a referida cepa de Clostridi um não produz substancialmente outros produtos do metabolismo de glícerol selecionados dentre o grupo consistindo de: butirato, lactato, butanol e etanol e recuperação de 1,3-propanodiol.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção Para "PROCESSO PARA A PRODUÇÃO BIOLÓGICA DE 1,3-PROPANODIOL A PARTIR DE GLICEROL COM ALTO RENDIMENTO".

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção compreende um processo para a bioconversão de glicerol em 1,3-propanodiol em alto rendimento por um

Clostridium metabolicamente manipulado.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O 1,3-propanodiol é um monômero usado na produção de fibras de poliéster e com uso potencial na fabricação de poliuretanos e compostos cíclicos.

O 1,3-propanodiol pode ser produzido através de diferentes vias químicas a partir de i) acroleína, água e hidrogênio -e ii) óxido de etileno, monóxido de carbono e água na presença de fosfina e partir de glicerol e hidrogênio na presença de monóxido de carbono. Todos esses métodos têm, em comum, o fato de que são caros e geram correntes residuais contendo substâncias poluentes.

O 1,3-propanodiol pode ser produzido como uma mistura de acetato/butirato/lactato/1,3-propanodiol através da fermentação de glicerol por diferentes Clostridia. O metabolismo geral do glicerol em Clostridia é- apresentado na Figura 1.

Em uma forma, o glicerol é convertido em 1,3- propanodiol em uma seqüência de reação enzimática em duas etapas. Em uma primeira etapa, uma glicerol dehidratase catalisa a conversão do glicerol em 3-hidróxipropionaldeído (3-HPA) e água. Na segunda etapa, 3-HPA é reduzido para 1,3-propanodiol através de uma 1,3-propanodiol dehidrogenase dependente de NADH. A maioria da produção do 1,3-propanodiol por Clostridia usa uma glicerol dehidratase dependente de B12 codificada pelos genes estruturais dhaBlB2B3, enquanto que Clostridium butyricum usa uma enzima independente de B12 codificada pelo gene estrutural dhaBl. Para as glicerol dehidratases dependentes de B12, orfX e orfZ codificam o fator de reativação da glicerol dehidratase enquanto que, para a única enzima independente de B12 conhecida, dhaB2 codifica um fator de ativação dependente de S-Adenosil-Metionina (SAM). Próximo dos genes que codificam os fatores estruturais e de ativação, um gene que codifica uma 1,3-propanodiol dehidrogenase (dhaT) também está presente. A produção de 1,3-propanodiol a partir de glicerol consome NADH.

Em outra forma, quando glicerol não é transformado em 1,3-propanodiol, ele é oxidado em dihidroxiacetona-fosfato (DHAP) com a concomitante produção de NADH através de uma glicerol quinase e uma glicerol-3-fosfato dehidrogenase codificadas, respectivamente, por glpk e glpA ou por uma glicerol dehidrogenase, seguido por uma DHA quinase codificada, respectivamente, por dhaD e dhaKlK2. A DHAP, irá então, entrar na via glicolitica com a produção de piruvato e acetil-CoA como intermediários chave. Piruvato e acetil-CoA podem ser reduzidos, respectivamente, para lactato e etanol através de uma lactato dehidrogenase codificada pelo gene Idh e uma aldeido-álcool dehidrogenase bifuncional codificada por adhE. Acetil-CoA pode também ser convertida em butiril-CoA, um produto intermediário que pode ser:

i) convertida a ácido butirico por uma fosfo- transbutirilase e uma butirato quinase codificadas, respectivamente, pelos genes ptb e buk ou

ii) reduzida a butanol por uma aldeido-álcool dehidrogenase bifuncional codificada pelo adhE.

Em Clostridia solventogênicas, acetona é produzida a partir de aceto-acetil-CoA (um intermediário na produção de butiril-CoA) através de uma CoA-transferase e uma acetoacetato descarboxilase codificadas, respectivamente, pelos genes CtfAB e adc. Hidrogênio é produzido por uma única ferro hidrogenase codificada pelo gene hydA.

Tanto Clostridia naturais e recombinantes produzem 1, 3-propanodiol em um rendimento máximo de 0,55 g/g de glicerol devido a co-produção de compostos reduzidos, tais como ácido butírico (butirato), ácido láctico (Iactato), etanol ou butanol. Para aumentar o rendimento da produção de 1,3-propanodiol, é necessário evitar a produção de todos os co-produtos reduzidos e associar a produção de 1,3- propanodiol a um co-produto oxidado.

Cepas de Clostridium acetobutylicum incapazes de produzir butirato também já foram descritas no artigo (Green e colaboradores, 1996). A formação de butirato foi dramaticamente reduzida em virtude de inativação do gene buk obtido através de cruzamento único com um plasmideo não replicável. Essa cepa mutante foi testada para a produção de 1,3-propanodiol, conforme mostrado em (Gonzalez-Pajuelo, 2005, Metabolic Engineering). Essa cepa recombinante produz eficazmente 1,3-propanodiol como o principal produto da fermentação, mas produz também butanol, o qual diminui o rendimento de 1,3-propanodiol.

A fermentação de 1,3-propanodiol pelo glicerol por Clostridia pode ser realizada em batelada, alimentação em batelada ou culturas continuas.

O problema a ser resolvido pela presente invenção é a produção biológica de 1,3-propanodiol a partir de glicerol em alto rendimento, sem nenhuma produção concomitante de compostos reduzidos, tais como butirato, lactato ou alcoóis. Essa produção é realizada através de fermentação anaeróbica com Clostridia.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

O requerente resolveu o problema estabelecido e a presente invenção proporciona um método para a produção anaeróbica de 1,3-propanodiol através de cultura de uma cepa de Clostridium em um meio de cultura apropriado compreendendo glicerol como uma fonte de carbono, em que a referida cepa de Clostridium não produz substancialmente outros produtos do metabolismo de glicerol dentre o grupo consistindo de: butirato, lactato, butanol e etanol e recuperação de 1,3-propanodiol.

O 1,3-propanodiol pode ser produzido concomitantemente com um único produto oxidado do metabolismo de glicerol.

Em um aspecto particular da invenção, a cepa de Clostridium é modificada para limitar a produção de metabólitos de glicerol, a qual a rota da biossintese consome NADH ou NADPH, exceto para 1, 3-propanodiol.

Em um aspecto da presente invenção, um Clostridium que produz naturalmente 1,3-propanodiol é geneticamente modificado para produzir 1,3-propanodiol em um maior rendimento através de deleção:

i) do gene que codifica a butirato quinase (buk) ou fosfo-transbutirilase (ptb) para evitar a produção de butirato ii) opcionalmente, todos os genes que codificam as lactato dehidrogenases (Idh) para evitar a produção de lactato

iii) opcionalmente, os genes que codificam aldeido- álcool dehidrogenases bifuncionais (adhE) para evitar a formação de álcool.

Em outro aspecto da presente invenção, um Clostridium que produz naturalmente butirato, mas incapaz de produzir 1,3-propanodiol é geneticamente modificado para produzir 1,3-propanodiol em alto rendimento. Esse resultado é obtido substituindo os genes ptb ou buk que codificam enzimas envolvidas na via de butirato com o óperon de C. butyricum que codifica enzimas envolvidas na via de 1,3-propanodiol independente de B12 e através de deleção:

i) opcionalmente, de todos os genes que codificam as lactato dehidrogenases (Idh) para evitar a produção de lactato

ii) opcionalmente, os genes que codificam aldeído- álcool dehidrogenases bifuncionais (adhE) para evitar a formação de álcool.

Em outro aspecto da presente invenção, um Clostridium que produz naturalmente etanol, mas incapaz de produzir 1,3-propanodiol é geneticamente modificado para produzir 1,3-propanodiol. Esse resultado é obtido substituindo um dos genes adhE que codificam enzimas envolvidas na via de etanol com o óperon de C. butyricum que codifica enzimas envolvidas na via de 1,3-propanodiol independente de B12 e através de deleção:

ii) opcionalmente, os genes que codificam aldeído- álcool dehidrogenases bifuncionais {adhE) para evitar a formação de álcool.

Em outro aspecto da presente invenção, o fluxo de produção de hidrogênio é diminuído e, então, o fluxo de equivalentes de redução é redirecionado para a produção de 1,3-propanodiol através de atenuação do gene que codifica a hidrogenase (hydA).

Em outro aspecto da invenção, o fluxo de produção de 1,3-propanodiol é aumentado através da introdução de cópias extras do óperon de 1,3-propanodiol de C. butyricum (que codifica enzimas envolvidas na via de 1,3-propanodiol independente de B12).

Também é um objetivo da presente invenção proporcionar uma cepa de Clostridium recombinante útil para o processo de produção de 1,3-propanodiol em alto rendimento.

BREVE DESCRIÇÃO DQS DESENHOS O desenho em anexo, o qual é incorporado e constitui uma parte da presente especificação, exemplifica a invenção e, junto com a descrição, serve para explanar os princípios da presente invenção.

A Figura 1 representa o metabolismo central de diferentes Clostridia.

1: piruvato-ferredoxina óxidoreductase; 2: tiolase; 3: β-hidróxibutiril-CoA dehidrogenase; 4: Crotonase; 5: butiril-CoA dehidrogenase; 6: lactato dehidrogenase; 7: Fosfo-transacetilase; 8: acetato quinase; 9: acetaldeído etanol dehidrogenase; 10: Hidrogenase; 11: CoA transferase (acetoacetil-CoA:acetato/butirato:CoA transferase; 12: acetoacetato decarboxilase; 13: Fosfo-transbutirilase; 14: butirato quinase; .15: butiraldeído-butanol dehidrogenase; 16: glicerol dehidratase; 17: 1,3-propanodiol dehidrogenase.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Conforme usado aqui, os termos a seguir podem ser usados para interpretação das reivindicações e relatório descritivo.

Os termos "Clostridium" e "Clostridia" se referem a todos os tipos de bactérias que pertencem a essa família.

Um meio de cultura apropriado se refere a um meio de cultura otimizado para o crescimento e a produção de diol da cepa de Clostridium especificamente usada.

O termo "substrato de carbono" ou "fonte de carbono" significa qualquer fonte de carbono capaz de ser metabolizada por um microorganismo, em que o substrato contém pelo menos um átomo de carbono. Na presente invenção, glicerol é a única fonte de carbono.

A frase "microorganismo é modificado" significa que a cepa foi transformada com o objetivo de alterar suas características genéticas. Genes endógenos podem ser atenuados, deletados ou superexpressados. Genes exógenos podem ser introduzidos, transportados por um plasmídeo ou integrados no genoma da cepa a ser expressa na célula.

O termo "atenuação" se refere a uma expressão diminuída de um gene ou uma atividade diminuída da proteína, produto do gene. Um técnico no assunto conhece numerosos meios para obter esse resultado e, por exemplo:

- introdução de uma mutação no gene, diminuindo o nível de expressão desse gene ou o nível de atividade da proteína codificada.

- Substituição de um promotor natural do gene por um promotor de baixa resistência, resultando em menor expressão.

- Uso de elementos que desestabilizam o RNA mensageiro correspondente ou a proteína. - Deleção do gene, se nenhuma expressão é necessária.

O termo "gene deletado" significa que uma parte substancial das seqüências de codificação do referido gene foi removida. De preferência, pelo menos 50% da seqüência de codificação foi removida e, mais preferivelmente, pelo menos 80%.

O termo "plasmídeo" ou "vetor", conforme usado aqui, se refere a um elemento cromossômico extra, freqüentemente transportando genes os quais não são parte do metabolismo central da célula e usualmente na forma de moléculas de DNA fita dupla circular.

Na descrição da presente invenção, enzimas são identificadas por suas atividades especificas. Essa definição, assim, inclui todos os polipeptidios que têm atividade especifica definida também presentes em outros organismos, mais particularmente em outros microorganismos. Freqüentemente, enzimas com atividades similares podem ser identificadas com relação a seu agrupamento em determinadas famílias definida como PFAM ou COG.

PFAM (banco de dados de famílias de proteína de alinhamentos e modelos ocultos de Markov; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) representa uma grande coleção de alinhamentos de seqüência de proteína. Cada PFAM torna"possível visualizar múltiplos alinhamentos, ver domínios de proteína, avaliar a distribuição entre organismos, obter acesso a outros bancos de dados e visualizar estruturas de proteína conhecidas.

COGs (agrupamentos de grupos ortólogos de proteínas; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) são obtidos através de comparação de seqüências de proteína de 43 genomas totalmente seqüenciados que representam as 30 principais linhagens filogênicas. Cada COG é definido a partir de pelo menos três linhagens, o que permite a identificação dos primeiros domínios conservados.

O meio de identificação de seqüências homólogas e suas homologias percentuais são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem, em particular, os programas BLAST, o qual pode ser usado do website http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ com os parâmetros explícitos indicados nesse website. As seqüências obtidas podem ser exploradas (por exemplo, alinhadas) usando, por exemplo, os programas CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) ou MULTALIN (http:/prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi- bin/multalin.pl), com os parâmetros explícitos indicados nesses websites.

Usando as referências fornecidas no GenBank para genes conhecidos, aqueles versados na técnica são capazes de determinar os genes equivalentes em outros organismos, cepas bacterianas, levedos, fungos, mamíferos, plantas, etc. Esse trabalho de rotina é, vantajosamente, feito usando seqüências de consenso que podem ser determinadas fazendo os alinhamentos de seqüência com genes derivados de outros microorganismos e criando sondas degeneradas para clonar o gene correspondente em outro organismo. Esses métodos de rotina de biologia molecular são bem conhecidos para aqueles versados na técnica e são descritos, por exemplo, em Sambrook e colaboradores (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2a ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York).

A presente invenção fornece um método para a produção anaeróbica de 1,3-propanodiol através de cultura de uma cepa de Clostridium em um meio de cultura apropriado compreendendo glicerol como uma fonte de carbono, em que a referida cepa de Clostridium não produz substancialmente outros produtos do metabolismo de glicerol selecionados dentre o grupo consistindo de: butirato, lactato, butanol e etanol e recuperação de 1,3-propanodiol.

"Substancialmente" significa que a maioria dos traços de produtos ou reduções de glicerol são encontradas no meio de cultura. Traços significam, de preferência, quantidades que não devem interferir com o processo de recuperação de 1,3-propanodiol, mais preferivelmente menos do que 10 mM.

A frase "metabolismo de glicerol" se refere a todas as modificações bioquímicas de glicerol que acontecem nas bactérias. Isso inclui a biossíntese de moléculas orgânicas (anabolismo) e sua decomposição (catabolismo). Algumas reações metabólicas são consumidas e algumas outras produzem NADH/NADPH. O metabolismo de glicerol em cepas de Clostridium é ilustrado na Figura 1. Intermediários, bem como produtos finais de reações metabólicas, são denominados metabólitos.

O método da invenção é caracterizado pelo fato de que o metabolismo de glicerol é dirigido à produção de 1,3- propanodiol e, que nenhum outro produto reduzido dessa via de metabolismo, tal como butirato, lactato, butanol, etanol, é produzido concomitantemente com 1,3-propanodiol pela Clostridíum. Na verdade, a produção desses produtos reduzidos consome o estoque de NADH/NADPH da célula. Limite desse consumo permitirá que a energia de redução seja re- direcionada à produção de 1,3-propanodiol.

Em uma modalidade específica da invenção, o 1,3- propanodiol é produzido concomitantemente com um único produto oxidado do metabolismo de glicerol, tal como acetato, acetona ou dióxido de carbono. 0 termo "produto oxidado" se refere a produtos produzidos sem o consumo do estoque de NADH/NADPH da célula.

Vantajosamente, a cepa de Clostridium usada no processo produz apenas 1,3-propanodiol e acetato.

De acordo com a invenção, a cepa de Clostridium pode ser modificada para limitar a produção de metabólitos a partir de glicerol, a qual a via de biossintese consome NADH ou NADPH, exceto para 1,3-propanodiol.

Vantajosamente, essa modificação consiste da deleção de pelo menos um gene que codifica uma enzima envolvida na produção dos referidos metabólitos.

Em particular, essa enzima está envolvida na produção de um metabólito selecionado dentre o grupo consistindo de: butirato, lactato, butanol e etanol.

Em uma modalidade especifica da invenção, a Clostridium produz naturalmente 1,3-propanodiol, uma vez que ela compreende genes endógenos funcionais que codificam enzimas envolvidas na biossintese de 1,3-propanodiol. Esses genes são em particular: glicerol dehidratase e 1,3- propanodiol dehidrogenase.

Essa cepa pode ser geneticamente modificada para produzir 1,3-propanodiol como produto principal através de deleção de pelo menos um gene que codifica fosfo- transbutirilase iptb) ou butirato quinase (buk) para bloquear a conversão de butiril-CoA em butirato. Em outra modalidade específica, a referida Clostridium também teve deletados todos os genes que codifica lactato dehidrogenase (Idh) para bloquear a produção de lactato.

Em outra modalidade específica, a referida Clostridium também teve deletados todos os genes que codificam aldeído- álcool dehidrogenases bifuncionais (adhE) para bloquear a produção de alcoóis.

Deleção de genes em Clostridia pode ser feita usando o método recentemente descrito no pedido de patente PCT/EP2 006/ 0 66997 que permite a i) substituição do gene deletado por um gene de resistência à eritromicina e ii) remoção do gene de resistência à eritromicina através de expressão da FLP recombinase.

Vantajosamente, a cepa de Clostridium é selecionada dentre o grupo consistindo de C. butyricum e C. pasteurianum.

Em uma modalidade específica da invenção, a cepa de Clostridium foi modificada para ser capaz de produzir 1,3- propanodiol. A modificação consiste na introdução de pelo menos um gene heterólogo que codifica uma enzima envolvida na via de 1,3-propanodiol independente de B-12. Esses genes podem ser, mas não estão limitados a, dhaBl, dhaB2, dhaT.

Vantajosamente, a cepa é modificada através de introdução do operon de Clostridium butyricum que codifica as enzimas envolvidas na via de 1,3-propanodiol independente de B12. A inserção do operon no cromossoma pode ser feita usando o método recentemente descrito no pedido de patente PCT/EP2006/066997.

Em uma modalidade especifica da invenção, a cepa de Clostridium usada produz naturalmente butirato, mas é incapaz de produzir 1,3-propanodiol antes de modificação; essa Clostridium especifica é geneticamente modificada para produzir 1,3-propanodiol através de substituição de pelo menos um gene que codifica uma enzima envolvida na formação de butirato, em particular a fosfo-transbutirilase (ptb) ou a butirato quinase (buk), por um gene heterólogo que codifica uma enzima envolvida na via de 1,3-propanodiol independente de B-12 para objetivar:

- bloqueio da conversão de butiril-CoA em butirato e permitir a produção de 1,3-propanodiol a partir de glicerol nessa cepa.

A inserção de um operon no cromossoma e deleção dos genes pode ser feita usando o método recentemente descrito no pedido de patente PCT/EP2006/066997.

De preferência, nessa cepa de Clostridium, todos os genes que codificam a lactato dehidrogenase (Idh) são deletadas para bloquear a produção de lactato.

De preferência, nessa cepa de Clostridium, todos os genes que codificam aldeido-álcool dehidrogenase bifuncionais (adhE) são deletadas para inibir a produção de alcoóis.

Vantajosamente, essa cepa de Clostridium é selecionada dentre o grupo consistindo de C. acetobutylicum, C. beijerinckii,C.saccharoperbutylacetonicum C. saccharobutylicum, C. butyricum ou C. cellulolyticum.

Em uma modalidade especifica da invenção, a Clostridium produz naturalmente etanol, mas é incapaz de produzir 1,3-propanodiol antes de modificação; essa cepa é geneticamente modificada para produzir 1,3-propanodiol através de substituição de pelo menos um gene que codifica aldeido-álcool dehidrogenases bifuncionais (adhE) com pelo menos um gene heterólogo que codifica uma enzima envolvida na via de 1,3-propanodiol independente de B12. Preferencialmente, esse gene heterólogo é o operon de C. butyricum que codifica enzimas envolvidas na via de 1,3- propanodiol independente de B12.

Essa substituição leva a:

- uma diminuição na conversão de acetil-CoA em etanol, e

- produção de 1,3-propanodiol a partir de glicerol.

De preferência, nessa cepa de Clostridium, todos os genes que codificam lactato dehidrogenase (Idh) são deletados para inibir a produção de lactato. De preferência, nessa cepa de Clostridium, todos os genes restantes que codificam aldeido-álcool dehidrogenases bifuncionais (adhE) são deletados para bloquear a produção de alcoóis.

A inserção do operon no cromossoma de Clostridium e a deleção dos genes previamente citados podem ser feitas usando o método recentemente descrito no pedido de patente PCT/EP2006/066997.

Vantajosamente, essa cepa de Clostridium é selecionada dentre o grupo consistindo de Clostridium thermocellum, Clostridium saccharolyticum (agora Thermoanaerobacter saccharolyticum), Clostridium thermosulfurogenes (agora Thermoanaerobacter thermosulfurigenes) ou Clostridium thermohydrosulfuricum (agora Thermoanaerobacter ethanolicus) .

Em uma modalidade especifica da invenção, a cepa de Clostridium teve um fluxo de produção de hidrogênio diminuído e, conseqüentemente, apresenta um redirecionamento do fluxo de equivalentes de redução em direção à produção de 1,3-propanodiol. Esse resultado pode ser obtido através de vários meios e, em particular, através de atenuação do gene que codifica a hidrogenase (hydA) , uma enzima que proporciona uma reserva para equivalentes de redução na forma da produção de hidrogênio. Atenuação de hydA pode ser feita substituindo o promotor natural por um promotor de baixa resistência ou usando um elemento de desestabilização do RNA mensageiro correspondente ou a proteína. Se necessário, atenuação completa do gene também pode ser obtida através de deleção parcial ou completa da seqüência de DNA correspondente.

Em outra modalidade da invenção, a cepa de Clostridium usada apresenta um fluxo aumentado de produção de 1,3- propanodiol; esse resultado é obtido através de introdução de cópias extra do operon de 1,3-propanodiol de C. butyricum (que codifica enzimas envolvidas na via de 1,3- propanodiol independente de B12) tanto superexpressado por um plasmídeo ou integrado no cromossoma da Clostridium recombinante. Por exemplo, o plasmídeo pSPD5 pode ser usado para uma superexpressão do operon de 1,3-propanodiol.

Em outro aspecto da invenção, a cepa de Clostridium é modificada para ser capaz de converter acetato em acetona. Essa modificação pode ser obtida através de introdução, no microorganismo, de um "operon de acetona" artificial contendo os genes thl, ctfAB e adc que codificam, respectivamente, a tiolase, a CoA-transferase e a aceto- acetato decarboxilase, essas enzimas estando envolvidas na formação de acetona em C. acetobutylicum e C. beijerinckii. Esse operon artificial pode ser tanto transportado por um plasmídeo ou pode ser integrado no cromossoma da Clostridium transformada.

Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para o preparo fermentativo de 1,3-propanodiol em alto rendimento, compreendendo:

(a) contato de uma cepa de Clostridium com glicerol para um processo de fermentação, em que 1,3-propanodiol é produzido,

(b) isolamento do 1,3-propanodiol e, opcionalmente, um único produto oxidado do metabolismo de glicerol (principalmente acetato ou acetona) através de destilação.

A fermentação é, geralmente, conduzida em fermentadores com um meio de cultura inorgânico de composição definida conhecida adaptado às bactérias usadas, contendo pelo menos glicerol e, se necessário, co-substrato necessário para a produção do metabólito.

Esse processo pode ser realizado em um processo em batelada, bem como em um processo continuo. O técnico versado no assunto sabe como administrar cada uma dessas condições experimentais e definir as condições de cultura para os microorganismos de acordo com a invenção. Em particular, as Clostridia são fermentadas em uma temperatura entre 20°C e 60°C, de preferência entre 25°C e. 40°C para Clostridia mesofilicas e entre 45 e 60°C para Clostridia termofilicas.

A invenção também está relacionada ao microorganismo, conforme descrito previamente. De preferência, esse microorganismo é selecionado dentre o grupo consistindo de C. butyricum, C pasteurianum, C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C. saccharoperbutylacetonicum, C. saccharobutylicumf C butyricum, C. cellulolyticum, Clostridium thermocellum, Clostridium saccharolyticum (agora Thermoanaerobacter saccharolyticum), Clostridium thermosulfurogenes (agora Thermoanaerobacter thermosulfurigenes) ou Clostridium thermohydrosulfuricum (agora Thermoanaerobacter ethanolicus).

EXEMPLO 1

Construção de um Clostridivoa acetobutylicum recombinante que produz 1,3-propa.nodiol e incapaz de produzir butirato e butanol: C. acetobutylicum ApSOLl Acacl515 Aupp Abuk::PDO

Para obter uma cepa que pode ser geneticamente manipulada e é incapaz de produzir butanol e acetona, nós primeiro tratamos o megaplasmideo pSOLl da cepa C. acetobutylicum Acacl515 Aupp (descrita no pedido de patente PCT/EP2006/066997) através de i) realização de 20 sub- culturas em meio de glicose MS e ii) através de seleção sobre lâminas de agar (contendo amido (2%) e glicose (0,2%) conforme descrito por Sabathe e colaboradores (2003)) de clones que produzem um pequeno halo de hidrólise de amido para identificar uma cepa C. acetobutylicum ApSOLl Acacl515 Aupp. Para deletar o qene buk e introduzir o operon de 1,3- propanodiol de C. butyricum,· a estratégia de recombinação homóloga descrita por Croux & Soucaille (2006) no pedido de patente PCT/EP2006/066997 é usada. Um cassete de deleção de buk integrando o operon 1,3-propanodiol de C. butyricum no vetor pCons::upp foi construído como segue.

Dois fragmentos de DNA que circundam buk foram amplificados por PCR com a Pwo polimerase com DNA total da C. acetobutylicum como modelo e dois pares específicos de oligonucleotídeos. Com os pares de iniciadores BUK I-BUK 21 e BUK 31-BUK 4, dois fragmentos de DNA foram, respectivamente, obtidos. Ambos os iniciadores BUK 1 e BUK 4 introduzem um local BamHI, enquanto que os iniciadores BUK 21 e BUK 31 têm uma região complementar a qual introduz locais pvull e Nrul. Os fragmentos de DNA BUK I-BUK 21 e BUK 31-BUK 4 foram unidos, em um experimento de fusão por PCR, com os iniciadores BUK 1 e BUK 4 e o fragmento resultante foi clonado no pCR4-T0P0-Blunt para proporcionar pT0P0:buk. No local nrul único do pT0P0:buk, um gene MLS de resistência a antibiótico com seqüências FRT sobre ambos os lados foi introduzido a partir do fragmento StuI de 1372 bp do pUC18-FRT-MLS2. 0 cassete de deleção BUK, obtido após digestão com BamHI do plasmideo resultante, foi clonado no pCons::upp no local BamHI para proporcionar o plasmideo pREPABUK::upp. No local pvull único do pREPABUK::upp, o operon 1,3-propanodiol foi introduzido como um fragmento SalI tratado com Klenow com extremidade cega de 4854 bp do plasmideo pSPD5.

O plasmideo pREPABUK::PDO::upp foi usado para transformar, através 0 de eletroporação, a cepa C. acetobutylicum ApSOLlAcacl5Aupp. Após seleção sobre placa de Petri para clones resistentes à eritromicina (40 μg/ml)., uma colônia foi cultivada durante 24 horas em meio sintético de glicerol liquido com eritromicina a 40 μg/ml e 100 μl de cultura não diluída foram colocados sobre RCGA (meio de Clostridium reforçado, onde amido e glicose são substituídos por glicerol como uma fonte de carbono) com eritromicina a 40 μg/ml e 5-FU a 400 μΜ. Colônias resistentes tanto à eritromicina quanto a 5-FU foram colocadas em réplica tanto sobre RCA quanto com eritromicina a 40 μg/ml e RCA com tianfenicol a 50 μg/ml para selecionar clones onde resistência à 5-FU também está associada à sensibilidade ao tianfenicol. 0 genótipo de clones resistentes à eritromicina e sensíveis ao tianfenicol foi verificado através de análise por PCR (com os iniciadores BUK O e BUK 5 localizados fora do cassete de deleção buk).

A cepa ApSOLlAcac 15AuppAbuk:: PDO::mlsR, a qual tinha perdido pREPAbuk::upp, foi isolada.

A cepa ApSOLlAcacl 5 AuppAbuk:: PDO:: ml sR foi transformada com o vetor pCLFl.1 expressando o gene Flpl que codifica a Flp recombinase de S. cerevisiae. Após transformação e seleção para resistência ao tianfenicol (50 μg/ml) sobre placa de Petri, uma colônia foi cultivada sobre meio líquido sintético com tianfenicol' a 50 μg/ml e diluições apropriadas sobre RCA com tianfenicol a 50 μg/ml. Clones resistentes ao tianfenicol foram colocados em réplica tanto sobre RCA com eritromicina a 40 μg/mlquanto com RCA com tianfenicol a 50 μg/ml. 0 genótipo dos clones com sensibilidade à eritromicina e resistência ao tianfenicol foi verificado através de análise por PCR com iniciadores BUK 0 e BUK 5. Duas sucessivas culturas de 24 horas da cepa Aeac15AuppAbuk com sensibilidade à eritromicina e resistência ao tianfenicol foram realizadas de forma a perder pCLFl. 1. A cepa ApSOLIAeae 15AuppAbuk:: PDO, a qual perdeu pCLFl.l, foi isolada de acordo com sua sensibilidade à eritromicina e tianfenicol.

Tabela 1

<table>table see original document page 26</column></row><table>

EXEMPLO 2

Construção de cepas incapazes de produzir butirato, acetona e lactato: C. acetobutylicum ApSOLl Acacl515 Aupp Abuk::PDO Aldh

Para deletar o gene Idh, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Croux & Soucaille (2006) no pedido de patente PCT/EP2006/066997 é usada. Essa estratégia permite a inserção de um cassete de resistência à eritromicina, ao mesmo tempo em que deleta a maioria dos genes considerados. O cassete de deleção de Idh em pCons::upp foi construído como segue. Dois fragmentos de DNA que circundam o Idh (CAC267) foram amplificados por PCR com a Pwo polimerase com DNA total de C. acetobutylicum como modelo e dois pares específicos de oligonucleotideos. Com os pares de iniciadores LDH I-LDH 2 e LDH 3-LDH 4, fragmentos de DNA de 1135 bp e 1177 bp foram, respectivamente, obtidos. Ambos os iniciadores LDH 1 e LDH 4 introduzem um local BamHI, enquanto que os iniciadores LDH 2 e LDH 3 têm uma região complementar a qual introduz um local StuI. Fragmentos de DNA LDH I-LDH 2 e LDH 3-LDH 4 foram unidos em um experimento de fusão por PCR com os iniciadores LDH 1 e LDH 4 e o fragmento resultante foi clonado no pCR4-T0P0-Blunt para proporcionar o pT0P0:LDH. No local StuI único do pTOPO: LDH, um gene MLS de resistência a antibiótico, com seqüências FRT sobre ambos os lados foi introduzido a partir do fragmento StuI de 1372 bp do pUC18-FRT-MLS2. 0 cassete de deleção UPP, obtido após digestão com BamHI do plasmideo resultante, foi clonado no pCons::upp no local BamHI para proporcionar o plasmideo pREPΔLDH::upp.

0 plasmideo pREPΔLDH::upp foi usado para transformar, através de eletroporação, a cepa de C. acetobutylicum ΔpSOLlΔcacl5ΔuppΔbuk::PDO. Após seleção sobre placas de Petri (sobre RCGA) por clones resistentes à eritromicina (40 μg/ml) , uma colônia foi cultivada durante 24 horas em meio sintético de glicerol liquido com eritromicina a 40 μg/ml e 100 μl de cultura não diluída foram colocados sobre RCGA com eritromicina a 40 μg/ml e 5-FU a 400 μΜ. Colônias resistentes à eritromicina e 5-FU foram colocadas em réplica sobre RGCA tanto com eritromicina a 40 μg/ml quanto com RGCA com tianfenicol a 50 μg/ml para selecionar clones onde resistência à 5-FU também está associada à sensibilidade ao tianfenicol. O genótipo de clones resistentes à eritromicina e sensíveis ao tianfenicol foi verificado através de análise por PCR (com os iniciadores LDH 0 e LDH 5 localizados fora do cassete de deleção de ldh). A cepa AApSOLlAcacl5AuppAbuk:: PDOAldh: :mlsR, a qual perdeu pREPALDH::upp, foi isolada.

A cepa ApSOLlAcacl5AuppAbuk:: PDOAldh::mlsR foi transformada com o vetor pCLFl.1 expressando o gene Flpl que codifica a Flp recombinase de S. cerevisiae. Após transformação e seleção para a resistência ao tianfenicol (50 μg/ml) sobre placas de Petri, uma colônia foi cultivada sobre meio líquido sintético com tianfenicol a 50 μg/ml e diluições apropriadas foram colocadas sobre RCA com tianfenicol a 50 μg/ml. Clones resistentes ao tianfenicol foram colocados em réplica sobre RCA com eritromicina a 40 μς/ml e RCA com tianfenicol a 50 μς/ml. O genótipo dos clones com sensibilidade à eritromicina e resistência ao tianfenicol foi verificado através de análise por PCR com os iniciadores LDH 0 e LDH 5.

Duas culturas sucessivas de 24 horas da cepa ApSOLlAcacl5AuppAbuk::PDOAldh com sensibilidade à eritromicina e resistência ao tianfenicol foram realizadas de forma a perder o pCLFl. 1. A cepa ApSOLlAcacl5AuppAbuk::PDOAldh, a qual tinha perdido o pCLFl.1, foi isolada de acordo com sua sensibilidade à eritromicina e tianfenicol.

Tabela 2

<table>table see original document page 29</column></row><table> EXEMPLO 3

Construção de cepas com menor produção de hidrogênio: C. acetobutylicum ApSOL1 Acac1515 Aupp Abuk: :PDO Aldh AhydA

Para deletar o gene hydA, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Croux & Soucaille (2006) no pedido de patente PCT/EP2006/066997 é usada. Essa estratégia permite a inserção de um cassete de resistência à eritromicina, ao mesmo tempo em que deleta a maioria dos genes considerados.

O cassete de deleção de hydA no pCons::upp foi construído como segue.

Dois fragmentos de DNA que circundam o hydA (CAC028) foram amplificados por PCR com a Pwo polimerase com DNA total de C. acetobutylicum como modelo e dois pares específicos de oligonucleotídeos. Com os pares de iniciadores HYD I-HYD 2 e HYD 3-HYD 4, fragmentos de DNA de 1269 bp e 1317 bp foram, respectivamente, obtidos. Ambos os iniciadores HYD 1 e HYD 4 introduzem um local BamHI, enquanto que os iniciadores HYD 2 e HYD 3 têm uma região complementar a qual introduz um local StuI. Fragmentos de DNA HYD I-HYD 2 e HYD 3-HYD 4 foram unidos, em um experimento de fusão por PCR, com os iniciadores HYD 1 e HYD 4 e o fragmento resultante foi clonado no pCR4-T0P0- Blunt para proporcionar o pT0P0:HYD. No local StuI único do pTOPO:HYD, um gene MLS de resistência a antibiótico com seqüências FRT sobre ambos os lados foi introduzido a partir do fragmento StuI de 1372 bp do pUC18-FRT-MLS2. O cassete de deleção UPP, obtido após digestão com BamHI do plasmideo resultante, foi clonado no pCons::upp no local BamHI para proporcionar o plasmideo pREPAHYD::upp.

O plasmideo pREPAHYD::upp foi usado para transformar, através de eletroporação, a cepa de C. acetobutylicum ApSOLl AcaclS AuppAbuk::PDO -Aldh. Após seleção sobre placa de Petri (sobre RCGA) por clones resistentes à eritromicina (40 pg/ml), uma colônia foi cultivada durante 24 horas em meio sintético de glicerol liquido com eritromicina a 40 μg/ml e 100 μΐ de cultura não diluída foram colocados sobre RCGA com eritromicina a 40 μς/πιΐ e 5-FU a 400 μΜ. Colônias resistentes à eritromicina e 5-FU foram colocadas em réplica sobre RGCA com eritromicina a 40 μς/πιΐ e RGCA com tianfenicol a 50 μς/πιΐ para selecionar clones onde resistência à 5-FU também está associada à sensibilidade ao tianfenicol. O genótipo de clones resistentes à eritromicina e sensíveis ao tianfenicol foi verificado através de análise por PCR (com os iniciadores HYD 0 e HYD 5 localizados fora do cassete de deleção de hydA) . A cepa ApSOLlAcacl5AuppAbuk::PDOAldhAhydA::mlsR, a qual perdeu pREPAHYD::upp, foi isolada.

A cepa ApS0LlAcacl5AuppAbuk:: PDOAldhAhydA: :mlsR foi transformada com o vetor pCLFl.1 expressando o gene Flpl que codifica a Flp recombinase de S. cerevisiae. Após transformação e seleção para a resistência ao tianfenicol (50 μg/ml) sobre placa de Petri, uma colônia foi cultivada sobre meio liquido sintético com tianfenicol a 50μg/mle diluições apropriadas foram colocadas sobre RCA com tianfenicol a 50 μg/ml. Clones resistentes ao tianfenicol foram colocados em réplica sobre RCA com eritromicina a 40 μg/ml e RCA com tianfenicol a 50 μg/ml. O genótipo dos clones com sensibilidade à eritromicina e resistência ao tianfenicol foi verificado através de análise por PCR com os iniciadores HYD 0 e HYD 5.

Duas culturas sucessivas de 24 horas da cepa

ApSOLlAcac15AuppAbuk::PDOAldhAhydA com sensibilidade à eritromicina e resistência ao tianfenicol foram realizadas de forma a perder o pCLFl.1. A cepa ApSOLlAcac15AuppAbuk::PDOAldhAhydA, a qual tinha perdido o pCLFl.1, foi isolada de acordo com sua sensibilidade à eritromicina e tianfenicol.

Tabela 3 <table>table see original document page 33</column></row><table>

EXEMPLO 4

Constxrução de cepas com fluxo aumentado na via de 1,3- propanodiol: C. acetobutylicum ApSOLl Acacl515 Aupp Abuk:: PDO Aldh pSPD5

Para construir uma cepa que converte glicerol em 1,3- propanodiol e acetato em maior fluxo, nós introduzimos o plasmideo pSPD5 (descrito no pedido de patente WO 01/04324) que expressava, como um operon, a via 1,3-propanodiol independente de B12 de C. butyricum. O plasmideo pSPD5 foi usado para transformar, através de eletroporação, a cepa C. acetobutylicum ApSOLl Acacl5 AuppAbuk::PDO Aldh. Após seleção sobre placa de Petri (RCGA) por clones resistentes à eritromicina (40 μς/πιΐ), uma colônia foi cultivada durante 24 horas em meio sintético de glicerol liquido com eritromicina a 40 μg/ml e usada para extrair o plasmídeo pSPD5 que foi caracterizado por seu perfil de restrição.

EXEMPLO 5

Construção de cepas que produzem 1,3-propanodiol e acetona: C. acetobutylicum ΔpSOLl Δcacl515 Δupp Δbuk.PDO Δldh pSOS95 thl

Para construir uma cepa que converte acetato em acetona, o plasmideo pSOS 95 thl, expressando um operon sintético de acetona, foi construído. Para essa finalidade, o gene thl, que codifica tiolase (de C. acetobutylicum) foi introduzido no local BamHI do vetor pSOS95 (No. de acesso ao Genbank AY 187686) já expressando, como um operon sintético os genes CtfAB e adc. 0 gene thl foi amplificado por PCR com a Pwo polimerase com DNA total de C. acetobutylicum como modelo e dois pares específicos de oligonucleotídeos. Com o par de iniciadores THL1-THL2, um fragmento de DNA de 1,2 kbp foi obtido e digerido com BamHI e Bglll, dois locais de restrição que foram, respectivamente, introduzidos pelos iniciadores THLl e THL2. Após ligação ao pSOS95 digerido com BamHI, o plasmídeo pSOS95-thl foi obtido.

Esse plasmídeo pSOS95-thl foi usado para transformar, através de eletroporação, a cepa C. acetobutylicum ΔpSOLl Acacl5 AuppAbuk::PDO Aldh. Após seleção sobre placa de Petri (RCGA) por clones resistentes à eritromicina (40 μg/ml) , uma colônia foi cultivada durante 24 horas em meio sintético liquido de glicerol com eritromicina a 40 μς/πιΐ e usada para extrair o plasmideo pSOS95-thl, que foi caracterizado por seu perfil de restrição.

Tabela 4

<table>table see original document page 35</column></row><table>

EXEMPLO 6

Fermentação em batelada de cepas que produzem 1,3- propanodiol

Cepas foram inicialmente analisadas em culturas em frasco anaeróbicas no meio sintético descrito por Soni e colaboradores (Soni e colaboradores, 1986, Appl. Microbiol.

Biotechnol. 32: 120-128) suplementado com 2,5 g/l de acetato de amônio e com substituição de glicose por glicerol. Uma cultura noturna a 35°C foi usada para inocular 30 ml de cultura até uma OD600 de 0,05. Após incubação da cultura durante 3 dias a 35°C, glicerol, ácidos orgânicos e 1,3-propanodiol foram analisados através de HPLC usando uma coluna Biorad HPX 97H para a separação e um refratômetro para a detecção.

Cepas cõm o fenótipo correto foram subseqüentemente testadas sob condições de produção em fermentadores de 300 ml (DASGIP) usando um protocolo em batelada anaeróbico.

Para essa finalidade, o fermentador foi preenchido com 250 ml de meio sintético, purgado com nitrogênio durante 30 min e inoculado com 25 ml de pré-cultura até uma densidade óptica (OD600 nm) entre 0,05 e 0,1.

A temperatura da cultura foi mantida constante a 35°C e o pH foi permanentemente ajustado a 6,5 usando uma solução de NH4OH. A taxa de agitação foi mantida a 300 rpm durante a fermentação.

EXEMPLO 7

Fermentação continua de cepas que produzem 1,3-propanodiol e acetato

A melhor cepa que produz 1,3-propanodiol e acetato foi analisada em culturas quimiostática no meio sintético descrito por Soni e colaboradores- (Soni e colaboradores, 1987, Appl. Microbiol. Biotechnol.), exceto que glicose foi substituída por glicerol. Uma cultura noturna a 35°C foi usada para inocular fermentadores de 300 ml (DASGIP) usando um protocolo quimiostato anaeróbico.

Para essa finalidade, o fermentador foi preenchido com 250 ml de meio sintético, purgado com nitrogênio durante 30 min e inoculado com 25 ml de pré-cultura até uma densidade óptica (OD600 nm) entre 0,05 e 0,1. Após 12 horas de cultura em batelada a 35 °C, pH de 6,5 (regulado usando uma solução de NH4OH) e uma taxa de agitação de 300 rpm, o fermentador foi continuamente alimentado com meio sintético isento de oxigênio em uma taxa de diluição de 0,05 h-1, enquanto o volume foi mantido constante através de remoção seqüencial de meio fermentado. A estabilidade da cultura foi acompanhada por análise dos produtos usando o protocolo de HPLC previamente descrito.

Claims

1. Método para a produção anaeróbica de 1,3-propanodiol através de cultura de uma cepa de Clostridium em um meio de cultura apropriado compreendendo glicerol como uma fonte de carbono caracterizado pelo fato de que a referida cepa de Clostridium não produz substancialmente outros produtos do metabolismo de glicerol selecionados dentre o grupo consistindo de: butirato, lactato, butanol e etanol e recuperação de 1,3-propanodiol.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o 1,3-propanodiol é produzido com um único produto oxidado do metabolismo de glicerol.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o único produto oxidado do metabolismo de glicerol é selecionado dentre o grupo consistindo de acetato, acetona ou dióxido de carbono.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a cepa de Clostridium produz apenas 1,3- propanodiol e acetato a partir de glicerol.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a cepa de Clostridium é modificada para limitar a produção de metabólitos de glicerol, a qual a via biossintética consome NADH ou NADPH, exceto para 1,3-propanodiol.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que pelo menos um gene que codifica uma enzima envolvida na produção dos referidos metabólitos é deletado.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido gene codifica uma enzima envolvida na produção de um metabólito selecionado dentre o grupo consistindo de: butirato, lactato, butanol e etanol.

8. Método, de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a cepa de Clostridium compreende genes endógenos funcionais para a produção de -1,3-propanodiol.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a Clostridium apresenta pelo menos um gene, selecionado dentre os seguintes envolvidos na formação de butirato, que é deletado: • ptb que codifica fosfo-transbutirilase • buk que codifica butirato quinase.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que todos os genes Idh que codificam lactato dehidrogenases são deletados.

11. Método, de acordo com as reivindicações 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que todos os genes adhE que codificam aldeido-álcool dehidrogenases são deletados.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que a cepa de Clostridium é selecionada dentre o grupo consistindo de C. butyricum e C. pasteurianum.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a cepa de Clostridium é modificada para produzir 1,3-propano.diol através de introdução de pelo menos um gene heterólogo que codifica uma enzima envolvida na via de 1,3-propanodiol independente de B12.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a cepa foi modificada através de introdução do operon de Clostridium butyricum que codifica as enzimas envolvidas na via de 1,3-propanodiol independente de B12.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações -13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a cepa de Clostridiuml antes de modificação, pode produzir butirato e pelo menos um gene heterólogo é introduzido para substituir pelo menos um gene que codifica uma enzima envolvida na formação de butirato.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o gene que codifica uma enzima envolvida na formação de butirato é selecionado dentre: • ptb que codifica fosfo-transbutirilase • buk que codifica butirato quinase.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que todos os qenes Idh que codificam lactato dehidrogenases são deletados.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que todos os genes adhE que codificam aldeido-álcool dehidrogenases são deletados.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações -15 a 18, caracterizado pelo fato de que a cepa de Clostridium é selecionada dentre o grupo consistindo de C. acetobutyIicumf C. beijerinckii, C. Saccharoperbutylacetonicum, C. saccharobutylicum, C. butyricum ou C. cellulolyticum.

20. Método, de acordo com uma das reivindicações 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a cepa de Clostridium, antes de modificação, pode produzir etanol e pelo menos um gene heterólogo é introduzido para substituir pelo menos um gene que codifica uma enzima envolvida na formação de etanol.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o gene que codifica a enzima envolvida na formação de etanol é selecionado dentre os genes adhE que codificam aldeido- álcool dehidrogenases.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que todos os genes Idh que codificam lactato dehidrogenases são deletados.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que todos os genes adhE que codificam aldeido-álcool dehidro'genases são deletados.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações -20 a 23, caracterizado pelo fato de que a cepa de Clostridium é selecionada dentre o grupo consistindo de Clostridium thermocellum, Clostridium saccharolyticum (agora Thermoanaerobacter saccharolyticum), Clostridium thermosulfurogenes(agora Thermoanaerobacter thermosulfurigenes) ou Clostridium thermohydrosulfuricum (agora Thermoanaerobacter ethanolicus).

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o fluxo de hidrogênio é diminuído e a energia de redução redirecionada para a produção de 1,3-propanodiol.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o gene hydA é atenuado.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é modificado para converter acetato em acetona.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que os genes que codificam as enzimas envolvidas na formação de acetona são exógenos e são introduzidos na cepa de Clostridium.

29. Método para o preparo fermentativo de 1,3-propanodiol conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a -25 caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: • fermentação do microorganismo que produz 1,3- propanodiol • isolamento de 1,3-propanodiol e, opcionalmente, um único produto oxidado do metabolismo de glicerol através de destilação.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que a cultura é continua.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 9, caracterizado pelo fato de que a cultura é feita em batelada.

32. Microorganismo caracterizado pelo fato de ser conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28.