BRPI0622128A2 - conjugado de polietileno glicol-g-csf - Google Patents

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Won-Young Yoo
Hyun-Kyu Jeon
Yun-Kyu Choi
Hye-In Jang
Byong-Moon Kim
Sung-Hee Lee
Soo-Hyung Kang
Moo-Hi Yoo
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Dong A Pharm Co Ltd
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Abstract

CONJUGADO DE POLIETILENO GLICOL-G-CSF A presente invenção se refere ao conjugado de PEG-G-CSF de três ramificaçõesda fórmula geral (1) na qual a relação de ligação de polietileno glicol (PEG) de três ramificações e G-CSF é 1 : 1 (moi/moI), na qual o PEG tem um peso molecular médio a partir de 200 a 45.000 daltons; uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo, e um método de preparação desta.

Description

"CONJUGADO DE POLIETILENO GLICOL-G-CSF"
Campo da Técnica
A presente invenção se refere a um conjugado de PEG-G-CSF de três ramificações.
Técnica Antecedente
O fator estimulador de colônias (CSF)1 como uma glicoproteína agindo na produção, divisão, e atividade de célula hematopoiética, é classificado no fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF)1 fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF), fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), fator estimulador de multi-colônias (multi-FEC), etc.
É sabido que o G-CSF aumenta a liberação de neutrófilos amadurecidos no sangue periférico por facilitar a produção e divisão de precursor neutrofílico na medula óssea; induz a uma atividade fagocítica por ativação de neutrófilos amadurecidos; representa uma citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo; produz superóxidos; e aumenta a reatividade em relação ao fator quimiotático.
Fator estimulador de colônias de granulócitos humano (hG-CSF) foi em primeiro lugar separado da linhagem de célula de carcinoma da bexiga 5637 por Welt e outros, em 1985, e hG-CSF recombinante (rhG-CSF) foi produzido por clonagem de gene de biblioteca de cDNA de uma célula de câncer por Nagata e outros, Souza e outros em 1986. O rhG- CSF comumente empregado em testes clínicos é metionina de ligação de filgrastim em terminal de N de proteína sem glicosilação, produzida em Escherichia coli, e Ienograstim com glicosilação, produzida em célula animal.
No caso de empregar rhG-CSF clinicamente, o rhG-CSF tem que ser administrado uma vez ou mais por dia para diminuir o leucócito porque o rhG-CSF tem uma curta duração de efeito farmacológico. Deste modo, muitos estudos têm sido conduzidos para aumentar uma meia vida de circulação de rhG-CSF empregando polímero solúvel em água, desse modo desenvolvendo o fármaco para ter uma longa duração da atividade e estabilidade elevada, e diminui a freqüência de administração.
Ε, o polietileno glicol no polímero solúvel em água é fortemente hidrofílico, e pode aumentar a solubilidade no momento da ligação com proteína para tratamento. Da mesma forma, polietileno glicol é eficaz para aumentar a quantidade molecular da proteína ligada a este, com manutenção das funções biológicas principais tais como atividade enzimática e ligação de receptor. Deste modo, o polietileno glicol pode diminuir a filtragem do rim, e efetivamente proteger a proteína da enzima proteolítica para decompor a proteína. Por esse motivo, muitos estudos têm sido conduzidos para descobrir métodos de modificação de proteína por empregar polietileno glicol porque tem as vantagens de impedir a decomposição da proteína, aumentar a estabilidade e tempo de circulação da proteína, e diminuir a imunogenicidade.
Patente Coreana N0. 0508358 descreveu conjugados e um método de preparação destes, na qual os conjugados têm atividades biológicas e estão na forma de ligação de um polímero de biocompatibilidade para tiol de resíduo de cisteína de G-CSF1 na relação molar do polímero: G-CSF para estequiometricamente 0,7 ~ 1,3 : 1, de preferência 1:1. Porém, uma vez que o resíduo de cisteína de G-CSF que não forma ligações de dissulfeto no G- CSF é parte da ligação principal com o receptor de G-CSF, o conjugado empregando o resíduo de cisteína tendo uma desvantagem que seu efeito de proliferação atual para neutrófilo é pequeno. E, porque os conjugados imediatamente agregam-se para ligar um PEG aos resíduos de cisteína de G-CSF, há uma desvantagem que uma pequena quantidade de SDS deve ser adicionada ao conjugado para impedir a agregação para proteção e o SDS foi removido por ultrafiltragem para administração in vivo.
Patente Coreana N0. 0507796 descreveu conjugados de PEG homodímero ligando o polipeptídeo ativo biológico e um PEG, para aumentar a meia vida in vivo de polipeptídeo. Particularmente, descreveu que o homodímero liga um grupo amino de resíduos de Iisina de polipeptídeo bioativo de duas moléculas a um PEG para aumentar o tempo residual e sustenta as atividades biológicas durante muito tempo. Porém, os conjugados têm menos ή atividade do que conjugados de mono PEG por causa da conjugação de PEGs excessivos e características biológicas e físico-químicas e dos conjugados não estão uniformes por causa de conjugação não específica.
Ε, o método de ligação de rhG-CSF a SCM-MPEG linear (Sucinimidila carboximetila éster de metóxi de PEG) é conhecido. Os conjugados de mono PEG-G-CSF preparados pelo método tem 3 tipos de isômeros de posição modificados em terminal de N, resíduos de Iisina 35, e Iisina 45. Particularmente, o conjugado modificado na Iisina 35 tem uma desvantagem fornecendo PEGs do conjugado (Patente Coreana N0. 0248111. Patente dos Estados Unidos N0. 5.824.784).
Patente dos Estados Unidos N0. 5.951.974 descreveu os conjugados de ligação de um SC-PEG linear (polietileno glicol-N-succinimida carbonato) para interferon alfa de recombinação de gene. Os conjugados consistem de conjugados covalentes de ligação de uretano em grupo e-amino de resíduos de Iisina de interferon, grupo σ-amino de resíduos de cisteína de terminal de N, e um grupo amino de resíduos de histidina. Porém, os conjugados têm uma desvantagem fornecendo PEGs do conjugado porque a ligação de uretano de conjugados é instável.
Comumente empregado polietileno glicol linear tem um peso molecular de cerca de 1.000-25.000 daltons, porém tem uma limitação na ligação de muitas moléculas elevadas lineares à proteína ou peptídeo, com manutenção de suas atividades, devido a regiões ativas biológicas limitas de proteína e peptídeo. Patente Coreana N0. 0254097 descreveu conjugados ligando um PEG de duas ramificações de uma estrutura esquelética de Iisina a interferon alfa de recombinação de gene. Os conjugados têm um mérito para impedir PEG de ligação de multi partes de interferon, e tem 2 vezes o peso molecular de PEG próximo aquele do PEG linear porque dois PEGs lineares ligados a uma parte única do interferon. Porém, o PEG de duas ramificações pode ser hidrolisado para uma cadeia única para proteger ou reagir sob uma condição álcali porque o PEG de duas ramificações tendo uma estrutura esquelética de Iisina tem duas ligações de uretano no PEG.
De modo geral, é sabido que a atividade biológica, durabilidade, etc. de conjugados ligando um PEG a proteína de recombinação de gene é dependente no tamanho e na parte modificada no PEG. Porém, não foi conhecido até agora se um tamanho de PEG nos conjugados ligando PEG e rhG-CSF afeta as atividades biológicas de uma proteína. Por esse motivo, tem havido uma necessidade na técnica de superar as desvantagens do método conhecido através do controle de um tamanho de PEG e de ligação para várias estruturas esqueléticas de PEG para não diminuir as bioatividades de G-CSF e para aumentar a estabilidade das partes de ligação.
Descrição da Invenção
Problema Técnico
O objeto da presente invenção é para fornecer conjugados de polietileno glicol (PEG)-G-CSF de três ramificações preparado por conjugar G-CSF e PEG de três ramificações, tendo estabilidade elevada e a mesma ou mais bioatividades de G-CSF do que os conjugados de PEG-G-CSF e G-CSF conhecidos na técnica; um método de preparação do mesmo; e uma composição farmacêutica contendo o mesmo.
Solução Técnica
Para se obter o objeto acima, a presente invenção fornece conjugados de polietileno glicol (PEG)-G-CSF de três ramificações conjugadas entre G-CSF e derivados de PEG de três ramificações.
A presente invenção da mesma forma fornece um método de preparação de conjugados de PEG-G-CSF de três ramificações compreendendo conjugar G-CSF e derivados de PEG de três ramificações.
A presente invenção da mesma forma fornece uma composição farmacêutica compreendendo os conjugados.
A presente invenção da mesma forma fornece um método de tratamento de neutropenia, impedindo neutropenia, ou facilitando o aumento do número de neutrófilo no momento da mobilização da célula-tronco hematopoiética para transplante da célula-tronco hematopoiética e sangue periférico, compreendendo administrar o conjugado da presente invenção como um ingrediente eficaz. A presente invenção é explicada em detalhes abaixo.
Os conjugados de PEG-G-CSF de três ramificações da presente invenção podem ser preparados por conjugar polietileno glicol (PEG) de três ramificações, representados pela seguinte fórmula geral (I):
<formula>formula see original document page 5</formula>
na qual, η é um número inteiro de 1 a 1.000;
m é um número inteiro de 10 a 1.000;
Z é (CH2)S ou (CH2)sNHCO(CH2)S como um Iigador de G-CSF e PEG na qual S é um número inteiro de 1 a 6;
Y é uma ligação de amida formada por combinar o grupo funcional NH2 em G-CSF e um grupo funcional de derivado de PEG.
O PEG tem um peso molecular médio a partir de 200 a 45.000 daltons, de preferência de 20.000 a 45.000 daltons, mais de preferência de 23.000 a 43.000 daltons. Porque um tempo eficaz medicinalmente pode ser alterado de acordo com um peso molecular médio de PEG, o peso molecular médio do PEG empregado na presente invenção pode ser alterado, dependendo do tempo necessário para o tratamento.
O método de preparação do conjugado de PEG-G-CSF de três ramificações compreendendo conjugar derivados de PEG de três ramificações e G-CSF da presente invenção é explicada em detalhes abaixo.
Os conjugados de PEG-G-CSF de três ramificações da fórmula geral (1) são preparados por formar uma ligação convalente entre o derivado de PEG de três ramificações da seguinte fórmula geral (2) e G-CSF no qual o PEG tem um peso molecular médio a partir de 200 a 45.000 daltons, de preferência de 20.000 a 45.000 daltons, mais de preferência de 23.000 a 43.000 daltons:
<formula>formula see original document page 5</formula>
na qual, η é um número inteiro de 1 a 1.000;
m é um número inteiro de 10 a 1.000;
Z é (CH2)S ou (CH2)sNHCO(CH2)S como um Iigador de G-CSF e PEG no qual S é um número inteiro de 1 a 6; e o grupo funcional o qual pode quimicamente reagir com proteínas e peptídeos contendo G-CSF é N-hidrosuccinimida.
Os derivados de PEG de três ramificações da presente invenção ativa as moléculas elevadas tendo estrutura ramificada na qual três moléculas elevadas receptivas biológicas lineares são combinadas. Todas as três regiões de OH (hidróxi) na estrutura esquelética de glicerol são polimerizadas com moléculas com unidades de etileno glicol, e término de uma região é ativada como um grupo funcional. As outras duas regiões exceto para a região ativada são substituída com monometóxi, para impedir reações adicionais. Quando os derivados de PEG ramificados acima são preparados, o tamanho de cada PEG linear pode ser controlado livremente por um método conhecido na técnica.
Os derivados de PEG de três ramificações na presente invenção podem ser empregados como derivados de PEG1 com o grupo funcional quimicamente reagindo com a proteína e o peptídeo, conhecido na técnica. Os derivados de PEG da fórmula geral (2) (com N-hidroxisuccinimida) são preferíveis nos termos da produção do conjugado da presente invenção.
O G-CSF na presente invenção pode ser separado do organismo de mamífero ou sintetizado por um método conhecido na técnica tal como clonagem de gDNA, clonagem de cDNA, etc. Ε, o G-CSF pode ser comercializado no mercado.
E1 a ligação covalente entre G-CSF e os derivados de PEG de três ramificações pode ser formada em uma baixa temperatura. A reação é completada por adição de ácidos, e os conjugados de PEG-G-CSF de três ramificações preparados podem ser purificado por um método conhecido na técnica tal como o método de purificação empregando uma resina de permuta de cátion.
Na presente invenção, a relação molar da reação do G-CSF para o derivado de PEG de três ramificações é de 1 : 0,5 a 1 : 50. Uma relação molar preferível do G-CSF para derivado de PEG de três ramificações é de 1 : 0,5 a 1 : 5 porque a produção de conjugado de mono PEG-G-CSF é diminuída, como a relação molar de polietileno glicol para o G-CSF é aumentada.
A presente invenção da mesma forma fornece uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir sintomas causados por função hematopoiética diminuída ou função imunológica diminuída. Particularmente, os testes clínicos empregando o conjugado da presente invenção como um efetivo mostrou que o número de neutrófilo foi diminuído, e os sintomas foram aliviados ou controlados, para doenças causadas em um tratamento tal como quimioterapia de câncer ou terapia de radiação; doenças infectantes causadas por bactéria, vírus e fungos; outras doenças infectantes; doenças causadas por razão ambiental ou genética tal como leucemia e neutropenia crônica severa; ou doenças geriátricas causadas novamente. Por exemplo, sintomas causados por função hematopoiética diminuída ou função imunológica diminuída são neutropenia causada por quimioterapia de câncer a tumor sangüíneo ou câncer sólido, neutropenia causada por síndrome mielodisplásica, neutropenia causada por anemia aplásica, neutropenia idiopática congênita, e neutropenia causada de tratamento para vírus da imunodeficiência humana.
A composição pode ser composta por conjugados de PEG-G-CSF da presente invenção ou portador, e/ ou adjuvante, emulsificante, solubilizante, anti-sépticos, diluente farmaceuticamente aceitável.
As composições da presente invenção podem ser formuladas por agente de injeção, cápsula, comprimido, farmaco líquido, pílula, unguento, oculentum, colírio, agente absortivo transdérmico, pasta, cataplasma, aerossóis, etc.
E, a dosagem eficaz de G-CSF é muito pequena tal como 0,1 -500 pg (de preferência 5-50 pg). Ε, o fármaco compreendendo 0,1 -500 pg de G-CSF pode ser administrado a um adulto, de modo geral de 1 a 7 vezes por semana. Deste modo, a dosagem eficaz da composição farmacêutica da presente invenção pode ser calculada por uma quantidade de administração conhecida de G-CSF e um peso molecular de PEG empregado na presente invenção. A dosagem eficaz da composição farmacêutica da presente invenção pode ser variada, porém de modo geral uma vez por semana, e a composição pode ser administrada uma vez ou muitas vezes por dia em uma faixa de dosagem diariamente eficaz.
Os seguintes exemplos são entendidos para ilustrar a presente invenção, e o escopo da presente invenção não é entendido estar limitado, por meio disso, de qualquer forma.
Efeitos Vantajosos
Os conjugados de PEG-G-CSF de três ramificações da presente invenção são mais farmaceuticamente estáveis do que conjugados de PEG-G-CSF linear- ou de duas ramificações no aspecto de fornecer PEGs de conjugados de PEG-G-CSF e formação dos agregados dos conjugados. E, os conjugados da presente invenção podem ser empregados sem separações adicionais de isômeros de posição porque os conjugados consistem de isômeros de posição com atividades similares. E, a composição da presente invenção tem os efeitos de produção contínua de neutrófilos e meia vida aumentada in-vivo.
Descrição dos Desenhos
Figura 1 é um desenho esquemático ilustrando os resultados analíticos de uma mistura formada para preparar conjugados de PEG de três ramificações tendo MW 23.OOODa e G-CSF de acordo com o Exemplo 1, por cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão por tamanho.
Figura 2 é um desenho esquemático ilustrando os resultados analíticos de uma mistura formada para preparar conjugados de PEG com três ramificações tendo MW 43.OOODa e G-CSF de acordo com o Exemplo 2, por cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão por tamanho.
Figura 3 é um desenho esquemático ilustrando os resultados analíticos de uma mistura formada para preparar conjugados de PEG linear tendo M10.OOODa Megawatt e G- CSF de acordo com o Exemplo Comparativo 1, por cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão por tamanho.
Figura 4 é um desenho esquemático ilustrando os resultados analíticos das purezas de conjugados de mono PEG-G-CSF de três ramificações separadas da mistura do Exemplo 1, por cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão por tamanho.
Figura 5 é um desenho esquemático ilustrando os resultados analíticos das purezas de conjugados de mono PEG-G-CSF de três ramificações separadas da mistura do Exemplo 2, por cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão por tamanho.
Figura 6 é um desenho esquemático ilustrando os resultados analíticos das purezas de conjugados de mono PEG-G-CSF linear separados da mistura do Exemplo Comparativo 1, por cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão por tamanho.
Figura 7 é um desenho esquemático ilustrando os resultados analíticos de conjugados de mono PEG-G-CSF de três ramificações separadas da mistura do Exemplo 1, por Espectrometria de Massa de lonização de Desabsorção a Laser Assistida por Matriz (MALDI-MS).
Figura 8 é um desenho esquemático ilustrando os resultados analíticos de conjugados de mono PEG-G-CSF de três ramificações separadas da mistura do Exemplo 2, por Espectrometria de Massa de lonização de Desabsorção a Laser Assistida por Matriz (MALDI-MS).
Figura 9 é um desenho esquemático ilustrando os resultados analíticos de conjugados de mono PEG-G-CSF linear separados da mistura do Exemplo Comparativo 1, por Espectrometria de Massa de lonização de Desabsorção a Laser Assistida por Matriz (MALDI-MS).
Figura 10 é um desenho esquemático ilustrando os resultados analíticos dos isômeros de posição compreendendo conjugados de mono PEG-G-CSF de três ramificações separadas da mistura do Exemplo 1, por cromatografia de permuta de íon.
Figura 11 é um desenho esquemático ilustrando os resultados analíticos da atividade biológica dos isômeros de posição de conjugados de mono PEG-G-CSF de três ramificações separadas da mistura do Exemplo 1, de acordo com o Exemplo Experimental 1, pelo método do Exemplo Experimental 2.
Modo da Invenção
Exemplo 1 - Preparação de conjugados de polietileno glicol (PEG de MW 23.000Da)-G-CSF de três ramificações 10 mg de rhG-CSF (Dong-A Pharm. Co.. Ltd.) foi filtrado com pH 8,5 e 50 mM de solução de tamponamento de borato de sódio. E em seguida 9,2 mg de PEG de três ramificações tendo N-hidroxisuccinimida (NOF Corporation, Japão) e o peso molecular de 23.000 daltons foram adicionados para a solução na relação molar de rhG-CSF : PEG de três ramificações a 1 : 0,75. E, a solução foi agitada a 4°C durante 90 minutos. A reação foi parada antes da adição de 100 mM de HCL para produzir a solução de pH 4 e por diluição com água destilada estéril de 5 vezes o volume da solução. E em seguida, a mistura foi fornecida por cromatografia de permuta de cátion de Fluxo Rápido de SP-Sefarose (Amersham Pharmacia Biotech) equalizado com 20 mM de solução de tamponamento de acetato de sódio (pH 4,0), e o conjugado de PEG-G-CSF de três ramificações foi separado. A mistura foi fracionada por empregar 0 ~ 1M de gradiente de concentração de cloreto de sódio (NaCI). A relação molar de PEG de três ramificações para G-CSF nos conjugados de PEG-G-CSF de três ramificações foi confirmada por HPLC e SDS-PAGE. E, os conjugados de di- ou mais (tri-, tetra- ...) PEG-G-CSF de três ramificações, G-CSF não reagido permanecendo após a reação, etc. foram excluídos. E, os eluídos foram concentrados e filtrados de forma esterilizada para obter o conjugado de mono PEG-G-CSF de três ramificações em que um G-CSF e um PEG de três ramificações (MW 23.000Da) são conjugados (ou chamado como conjugado de mono PEG-G-CSF de três ramificações).
Foi confirmado que a mistura de reação consistida em 35,4% de conjugado (conjugado de mono PEG-G-CSF) de mono PEG-G-CSF de três ramificações de cerca de 59,4% de G-CSF não modificado por PEG, e os outros [conjugados (conjugado de di- PEG- G-CSF) de di- PEG-G-CSF de três ramificações, e N-hidroxisuccinimida (NHS)], por uma cromatografia de alto desempenho de exclusão por tamanho (veja Figura 1, na qual 1 e 2 representam o conjugado de di- PEG-G-CSF, 3 representa o conjugado de mono PEG-G- CSF, 4 representa G-CSF não modificado por PEG, e 5 representa NHS fornecendo de PEG de três ramificações). E, a pureza de mono PEG-G-CSF de três ramificações separada da mistura foi medida por cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão por tamanho (veja Figura 4, na qual 2 representa o conjugado de di- PEG-G-CSF, e 3 representa conjugado de mono PEG-G-CSF) e o peso molecular foi medido por espectrometria de massa de tempo de escape de ionização/ desabsorção a laser assistida por matriz (MALDI- TOF) (veja Figura 7: o resultado analítico de mono PEG-G-CSF de três ramificações por MALDI-TOF/MS). E, os isômeros de posição foram separados por coluna analítica de resina de permuta de cátion (SP-5WP, TOSOH) para confirmar que a relação de cada isômero de posição é de cerca de 54%: 33%: 10% (veja Figura 10). E, foi confirmado que cada isômero de posição tem muita atividade similar, no experimento para atividade biológica de cada isômero de posição (veja Figura 11).
Exemplo 2 - Preparação de conjugados de polietileno glicol (PEG de MW 43.OOODa)-G-CSF de três ramificações
10 mg de rhG-CSF (Dong-A Pharm. Co., Ltd.) foi filtrado com pH 8,5 e 50 mM de solução de tamponamento de borato de sódio. E em seguida, 17,2 mg de PEG de três ramificações com N-hidroxisuccinimida (NOF Corporation, Japão) e o peso molecular de 43.000 daltons foi adicionado à solução para produzir a relação molar do rhG-CSF : o PEG de três ramificações a 1 : 0,75. E, a solução foi agitada a 4 0C durante 90 minutos. E, a reação foi parada antes da adição de 100 mM de HCI para produzir a solução de pH 4 e por diluição com água destilada estéril de 5 vezes o volume da solução. E, a mistura foi fornecida em cromatografia de permuta de cátion de Fluxo Rápido de Sefarose (Amersham Pharmacia Biotech) equalizada com 20 mM de solução de tamponamento de acetato de sódio (pH 4,0), e conjugado de PEG-G-CSF de três ramificações foi separado a partir deste. A mistura foi fracionada por empregar 0 ~ 1 M de gradiente de concentração de cloreto de sódio (NaCI). A relação molar de PEG de três ramificações para G-CSF nos conjugados de PEG-G-CSF de três ramificações foi confirmada por HPLC e SDS-PAGE. E, os conjugados de di- ou mais (tri, tetra ...) PEG-G-CSF de três ramificações, G-CSF não reagido permanecendo após a reação, etc. foram excluídos. E, os eluídos foram concentrados e filtrados de forma esterilizada para obter o conjugado de mono PEG-G-CSF de três ramificações em que um G-CSF e um PEG de três ramificações (MW 43.000Da) são conjugados (ou chamados como conjugado de mono PEG-G-CSF de três ramificações).
Foi confirmado que a mistura da reação consistida em 18,7% de conjugado (conjugado de mono PEG-G-CSF) de mono PEG-G-CSF de três ramificações de cerca de 40,1% de G-CSF não modificado por PEG, e os outros [conjugado (conjugado de di- PEG- G-CSF) de di- PEG-G-CSF de três ramificações e N-hidroxisuccinimida (NHS)] por cromatografia de alto desempenho de exclusão por tamanho (veja Figura 2, na qual 2 representa o conjugado de di- PEG-G-CSF, 3 representa o conjugado de mono PEG-G- CSF, e 4 representa o G-CSF não modificado por PEG). E1 a pureza de mono PEG-G-CSF de três ramificações separada da mistura foi medida por cromatografia líquida de alto desempenho tamanho de exclusão (veja Figura 5, na qual 1 representa o conjugado de oligo PEG-G-CSF, 2 representa o conjugado de di- PEG-G-CSF, e 3 representa conjugado de mono PEG- G-CSF), e o peso molecular foi medido por espectrometria de massa de tempo de escape de ionização/ desabsorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF) (veja Figura 8; o resultado analítico de mono PEG-G-CSF de três ramificações por MALDI-TOF/MS).
Exemplo Comparativo 1 - Preparação de conjugados de polietíleno glicol linear (PEG de MW 10.000)-G-CSF.
10 mg de rhG-CSF (Dong-A Pharm. Co., Ltd.) foi filtrado com pH 8,5 e 50 mM de solução de tamponamento de borato de sódio. E, 5,2 mg de PEG linear com N- hidroxisuccinimida (NOF Corporation, Japão) e o peso molecular de 13.000 daltons foi adicionado à solução para produzir a relação molar do rhG-CSF : o PEG linear para 1 : 0,75. E, a solução foi agitada a 4 0C durante 90 minutos. E1 a reação foi parada antes da adição de 100 mM de HCL para produzir a solução de pH 4 e por diluição com água destilada estéril de 5 vezes o volume da solução. E1 a mistura foi fornecida na cromatografia de permuta de cátion de Fluxo Rápido de SP-Sefarose (Amersham Pharmacia Biotech) equalizada com 20 mM de solução de tamponamento de acetato de sódio (pH 4,0), e conjugado PEG-G-CSF linear ramificado foi separado a partir deste. A mistura foi fracionada por empregar 0 ~ 1M de gradiente de concentração de cloreto de sódio (NaCI). A relação molar de PEG linear para G-CSF no conjugado de PEG-G-CSF linear foi confirmado por 10 HPLC e SDS-PAGE. E, os conjugados de di- ou mais (tri, tetra ...) PEG-G-CSF lineares, G- CSF não reagido permanecendo após a reação, etc. foram excluídos. E, os eluídos foram concentrados e filtrados de forma esterilizada para obter o conjugado de mono PEG-G-CSF linear em que um G-CSF e um PEG (MW 13.000Da) linear são conjugados (ou chamados como conjugado de mono PEG-G-CSF linear).
Foi confirmado que a mistura da reação consistida em 45,6% de conjugado (conjugado de mono PEG-G-CSF) de mono PEG-G-CSF linear, de cerca de 45,9% de G- CSF não modificado por PEG, e os outros [conjugado de (conjugado de di- PEG-G-CSF) di- PEG-G-CSF linear, e N-hidroxisuccinimida (NHS)], por uma cromatografia de alto desempenho por exclusão por tamanho (veja Figura 3, na qual 1 representa conjugado de oligo PEG-G-CSF, 2 representa o conjugado de di- PEG-G-CSF, 3 representa o conjugado de mono PEG-G-CSF, e 4 representa o G-CSF não modificado por PEG). E, a pureza de mono PEG-G-CSF linear ramificado separada da mistura foi medida por cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão por tamanho (veja Figura 6, na qual 1 representa conjugado de oligo PEG-G-CSF, 2 representa o conjugado de di- PEG-G-CSF, 3 representa o conjugado de mono PEG-G-CSF, e 4 representa o G-CSF não modificado por PEG), e o peso molecular foi medido por tempo de escape de ionização/ desabsorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF) (veja Figura 9).
Exemplo Comparativo 2 - Preparação de conjugados de polietileno glicol linear (PEG de MW 20.000 Da)-G-CSF.
10 mg de rhG-CSF (Dong-A Pharm. Co., Ltd.) foi filtrado com pH 8,5 e 50 mM de solução de tamponamento de borato de sódio, e em seguida 8,0 mg de PEG linear tendo N- hidroxisuccinimida (NOF Corporation, Japão) e o peso molecular de 20.000 daltons foi adicionada à solução para produzir a relação molar do rhG-CSF : o PEG linear para 1 : 0,75. E, a solução foi agitada a 4 0C durante 90 minutos. A reação foi parada antes da adição de 100 mM de HCL para produzir a solução de pH 4 e por diluição com água destilada estéril de 5 vezes o volume da solução. E em seguida, a mistura foi fornecida na cromatografia de permuta de cátion de Fluxo Rápido de SP-Sefarose (Amersham Pharmacia Biotech) equalizada com 20 mM de solução de tamponamento de acetato de sódio (pH 4,0), e conjugado de PEG-G-CSF linear ramificado foi separado a partir deste. A mistura foi fracionada por empregar 0 ~ 1M de gradiente de concentração de cloreto de sódio (NaCI). A relação molar de PEG linear para G-CSF no conjugado de PEG-G-CSF linear foi confirmado por HPLC e SDS-PAGE. E, conjugados de di- ou mais (tri, tetra ...) PEG-G-CSF lineares, G- CSF não reagido permanecendo após a reação, etc. foram excluídos. E, os eluídos foram concentrados e filtrados de forma esterilizada para obter o conjugado de mono PEG-G-CSF linear em que um G-CSF e um PEG (MW 20.000 Da) linear são conjugados (ou chamados como conjugado de mono PEG-G-CSF linear).
Exemplo Comparativo 3 - Preparação de conjugados de polietileno glicol (PEG de MW 20.000 Da, estrutura esquelética de lisina)-G-CSF de duas ramificações.
10 mg de rhG-CSF (Dong-A Pharm. Co.. Ltd.) foi filtrado com pH 8,5 e 50 mM de solução de tamponamento de borato de sódio, e em seguida 9,1 mg de PEG de duas ramificações tendo N-hidroxisuccinimida (Nektar, USA) e o peso molecular de 20.000 daltons foi adicionado à solução para produzir a relação molar do rhG-CSF : o PEG linear para 1 : 0,75. E, a solução foi agitada a 4 0C durante 90 minutos. A reação foi parada antes da adição de 100 mM de HCL para produzir a solução de pH 4 e por diluição com água destilada estéril de 5 vezes o volume da solução. E em seguida, a mistura foi fornecida na cromatografia de permuta de cátion de Fluxo Rápido de SP-Sefarose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) equalizada com 20 mM de solução de tamponamento de acetato de sódio (pH 4,0), e conjugado de PEG-G-CSF linear ramificado foi separado a partir deste. A mistura foi fracionada por empregar 0 ~ 1M de gradiente de concentração de cloreto de sódio (NaCI). A relação molar de PEG de duas ramificações para G-CSF no conjugado de PEG-G-CSF de duas ramificações foi confirmado por HPLC e SDS-PAGE. E, conjugados de di- ou mais (tri, tetra ...) PEG-G-CSF de duas ramificações, G-CSF não reagido permanecendo após a reação, etc. foram excluídos. E, os eluídos foram concentrados e filtrados de forma esterilizada para obter o conjugado de mono PEG-G-CSF de duas ramificações em que um G-CSF e um PEG (MW 20.000Da) de duas ramificações são conjugados (ou chamados como conjugado de mono PEG-G-CSF linear).
Exemplo Comparativo 4 - Preparação de conjugados de (PEG de 20.000 Da Megawatt, estrutura esquelética de glicerina)-G-CSF polietileno glicol com duas ramificações.
10 mg de rhG-CSF (Dong-A Pharm. Co., Ltd.) foi filtrado com pH 8,5 e 50 mM de solução de tamponamento de borato de sódio. E, 8,0 mg de PEG de duas ramificações tendo N-hidroxisuccinimida (NOF, Japão) e o peso molecular de 20.000 daltons foi adicionado à solução para produzir a relação molar do rhG-CSF : o PEG linear para 1 : 0,75. A solução foi agitada a 4 0C durante 90 minutos. E, a reação foi parada antes da adição de 100 mM de HCL para produzir a solução de pH 4 e por diluição com água destilada estéril de 5 vezes o volume da solução. E em seguida, a mistura foi fornecida na cromatografia de permuta de cátion de Fluxo Rápido de SP-Sefarose (Amersham Pharmacia Biotech) equalizada com 20 mM de solução de tamponamento de acetato de sódio (pH 4,0), e conjugado de PEG-G-CSF linear ramificado foi separado a partir deste. A mistura foi fracionada por empregar 0 ~ 1M de gradiente de concentração de cloreto de sódio (NaCI). A relação molar de PEG de duas ramificações para G-CSF no conjugado de PEG-G-CSF de duas ramificações foi confirmado por HPLC e SDS-PAGE. E1 os conjugados de di- ou mais (tri, tetra ...) PEG-G-CSF de duas ramificações, G-CSF não reagido permanecendo após a reação, etc. foram excluídos. E, os eluídos foram concentrados e filtrados de forma esterilizada para obter o conjugado de mono PEG-G-CSF de duas ramificações em que um G-CSF e um PEG (MW 20.000 Da) de duas ramificações são conjugados (ou chamados como conjugado de mono PEG-G-CSF linear).
Exemplo Comparativo 5 - Preparação de conjugados de mono metoxipolietileno glicol-G-CSF de ligação em σ-amino resíduo de terminal de N.
O conjugado principal foi preparado por um método descrito na Patente Coreana N0. 0248111, e Patente dos Estados Unidos N0 5.824.784. O método como resumidamente descrito é como segue.
100 mM de fosfato de sódio contendo 20 mM de NaCNBH3, e 5mg/ ml de rhG-CSF foram agitados a 4 0C. E, 5 vezes mol de aldeído de metoxipolietileno glicol linear (mPEG) (Nektar, USA) foi adicionado à solução, o qual foi agitado durante 10 horas. A reação foi parada antes da adição de 100 mM de HCL para produzir a solução de pH 4 e por diluição com água destilada estéril de 5 vezes o volume da solução. E em seguida, a mistura foi fornecida em cromatografia de permuta de cátion de Fluxo Rápido de SP-Sefarose (Amersham Pharmacia Biotech) equalizada com 20 mM de solução de tamponamento de acetato de sódio (pH 4,0), e conjugado de PEG-G-CSF linear ramificado foi separado a partir deste. A mistura foi fracionada por empregar 0 ~ 1M de gradiente de concentração de cloreto de sódio (NaCI). E, os eluídos foram concentrados e filtrados de forma esterilizada para obter o conjugado de mono mPEG-G-CSF em que um G-CSF e um PEG de duas ramificações (MW 20.000Da) são conjugados (ou chamados como conjugado de mono PEG-G-CSF linear).
Exemplo Comparativo 6 - Preparação de conjugados de mono metoxipolietileno glicol-G-CSF de ligação em grupo de tiol de resíduo de cisteína de G-CSF
O conjugado principal foi preparado por um método descrito na Patente Coreana N0. 0508358. O método como resumidamente descrito é como segue.
1 mg de rhG-CSF (Dong-A Pharm. Co.. Ltd.) foi adicionado a 1 mL de solução de tamponamento de fosfato de sódio (0,1 M) tendo pH 8,5, e 52,6 mg de maleimida de polietileno glicol (NOF, Japão) foi adicionado à solução. E1 a solução foi agitada durante 1 hora a temperatura ambiente. E em seguida, os derivados de PEG permanecendo após a reação foram removidos da solução por centricon 30 (Amicon, USA). E, a solução foi concentrada e filtrada de forma esterilizada para obter o conjugado de mono mPEG-G-CSF mono.
A propriedade e os testes de atividade farmacológica foram conduzidos por empregar os conjugados preparados acima, e os resultados são como segue.
Exemplo Experimental 1 - Separação analítica dos isômeros de posição de conjugados de PEG-G-CSF de três ramificações
100 ug de conjugados de mono PEG-G-CSF de ramificações do Exemplo 1 foi fornecido a uma coluna (SP-5WP, TOSOH) analítica de resina de permuta de cátion equalizada com 25 mM de tampão de acetato de sódio (pH 4,0, controlado com ácido acético glacial), e cada isômero de posição dos conjugados foi separado por 100 mM de tampão de acetato de sódio, pH 7,8). Foi confirmado que a relação de cada isômero de posição é de cerca de 54%: 33%: 10% (veja Figura 10).
Exemplo Experimental 2 - Análise de atividades biológicas dos isômeros de posição dos conjugados de PEG-G-CSF de três ramificações
Atividades Biológicas Relativas dos isômeros de posição de conjugados de PEG-G- CSF de três ramificações do Exemplo 1 foram medidas por empregar aquela de G-CSF.
Linhagem celular NFS-60 cultivada em crescimento de RPMI 1640 contendo 10% de FBS e 1 ng/ ml de rmlL-3 foi lavada 3 vezes com teste de RPMI 1640 contendo 5% de FBS. E, a linhagem celular foi dividida em 100 ml (2 χ 105 células/ ml) em placa de 96 cavidades. E em seguida a amostra foi diluída com meio de teste para preparar uma amostra de 200 ng/ ml, e mais 9 amostras de 200 ng/ ml por 5 vezes gradiente, e as amostras foram divididas em 3 cavidades, cada 100 ml, por concentração em placas de 96 cavidades contendo as soluções da célula.
Cada cavidade foi cultivada a 37°C e 5% de CO2 incubado durante 48 horas, 40 μl de MTS foi adicionado a cada cavidade. Após 2 horas, uma absorvência da amostra foi medida a 490nm por uma leitora ELISA. EC50 foi calculado por uma curva de resposta à dose e uma análise de regressão linear do ponto compreendido linha linear de uma curva padrão, e as atividades de isômeros de posição foram determinadas (veja Figura 11). Os conjugados de PEG-G-CSF de três ramificações da presente invenção têm isômeros de posição tendo atividades similares. Isto é, não é necessário remover alguns isômeros de posição tendo atividade relativamente menor porque os conjugados de PEG-G-CSF de três ramificações da presente invenção são compostas de conjugados com atividades uniformizadas.
Exemplo Experimental 3 - Farmacocinéticos de teste dos conjugados de PEG-G- CSF de três ramificações
O teste farmacodinâmico foi conduzido para injetar hipodermicamente cada um dos G-CSF, os conjugados de PEG-G-CSF do Exemplo 1, e os conjugados de PEG-G-CSF do Exemplo 2 nos ratos de teste (Sprague Dawley) que tenham 240 ~ 260 de pesos corporais.
Após injetá-los na quantidade de 400 μg por rato, as amostras de sangue foram coletadas dos ratos a 0 minuto, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, e 7 dias, após a injeção. E, as concentrações dos conjugados de G-CSF na amostra foram quantitativamente analisadas por um kit de ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) (Biosource, USA).
A meia vida no sangue dos conjugados de PEG-G-CSF do Exemplo 1 e Exemplo 2 foi aumentada 3 vezes e 10,8, respectivamente, comparado com aquele de G-CSF, e as áreas sob a curva de tempo de concentração no sangue dos conjugados do Exemplo 1 e Exemplo 2 foram da mesma forma aumentadas para 7,6 vezes e 23,4 vezes, respectivamente, comparadas com aquelas do G-CSF [Tabela 1: Farmacocinéticos de teste dos conjugados de PEG-G-CSF de três ramificações e G-CSF no rato (rato Sprague Dawley)]. Foi confirmado por este teste que farmacocinéticos de conjugado de PEG-G-CSF é dependente em um tamanho de PEG.
Tabela 1
<table>table see original document page 15</column></row><table>
* As abreviações na tabela acima têm os seguintes significados:
Tmax: tempo para alcançar a concentração máxima
Cmax: concentração máxima
T1A: meia vida de eliminação
AUC: área sob a curva de tempo de concentração.
Exemplo Experimental 4 - Teste de estabilidade dos conjugados de PEG-G-CSF de três ramificações no fornecendo de PEGs dos conjugados
Conjugados de PEG-G-CSF dos Exemplos 1 e 2, e Exemplos Comparativos 2, 3, e 4 foram depositados sob pH 7 e 37 °C durante 7 dias, e os aspectos do PEGs de saída na extensão do tempo foram analisados por cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa, para estimular os graus dos PEGs de saída em uma estrutura esquelética, pesos moleculares, e tipos ramificados de PEG.
Na estrutura esquelética dos PEG, os PEGs de saída ocorridos mais freqüentemente no Exemplo Comparativo 2 empregando PEG linear. Entretanto, os PEGs de saída dos conjugados dos Exemplos 1 e 2, e Exemplo Comparativo 4 ocorrido menos freqüentemente do que aqueles dos Exemplos Comparativos 2 e 3 (Tabela 2: Comparação das taxas de geração do G-CSF em conjugados de PEG-G-CSF tendo várias estruturas esqueléticas de PEG). Este teste confirmou que o conjugado de PEG-G-CSF de três ramificações é mais estável do que o conjugado de PEG-G-CSF linear- de duas ramificações, e o conjugado com uma estrutura esquelética de glicerol é mais estável do que os conjugados com uma estrutura esquelética de lisina.
Tabela 2
<table>table see original document page 16</column></row><table>
Exemplo Experimental 5 - Teste de estabilidade para os conjugados de PEG-G- CSF de três ramificações em relação à formação de agregações de acordo com uma estrutura esquelética de PEG e um tipo de ligação de PEG para G-CSF.
Conjugado de mono PEG-G-CSF de três ramificações do Exemplo 1; conjugado de mono PEG-G-CSF dos Exemplos comparativos 2 e 4, tendo um peso molecular similar ao conjugado do Exemplo 1 e estrutura esquelética diferente do conjugado do Exemplo 1; e conjugado de mono PEG-G-CSF do Exemplo Comparativo 5 tendo tipo de ligação diferente do conjugado do Exemplo 1 foram testados para medir as estabilidades em relação à formação de agregações. Cada amostra foi coletada por 500 μΙ, e o solvente das amostras foram trocados 3 vezes com 100 mM de solução de tamponamento de fosfato tendo pH 7. E1 as amostras foram depositas a 37 0C durante 14 dias, e a formação de agregação dos conjugados foi analisada por cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão por tamanho.
Os resultados da análise de formação da agregação representam que o conjugado de mono PEG-G-CSF do Exemplo 1 tem mais estabilidade no aspecto dos PEGs de saída, e formando por pouco que seja agregação (Tabela 3: Taxas de geração de conjugados de agregação de acordo com uma estrutura esquelética de PEG e um tipo de ligação de PEG a G-CSF). Os conjugados de mono PEG-G-CSF dos Exemplos Comparativos 2 e 4 empregando PEG tendo a mesma estrutura esquelética de glicerol como os PEGs no Exemplo 1, e empregando o mesmo tipo de ligação para o Exemplo 1, assim como o conjugado do Exemplo 1, formando alguma agregação. Entretanto, os conjugados de mono PEG-G-CSF do Exemplo Comparativo 3 empregando PEG tendo estrutura esquelética diferente dos PEGs no Exemplo 1 (ainda que empregando o mesmo tipo de ligação como o Exemplo 1) formando muita agregação. E1 conjugados de mono PEG-G-CSF do Exemplo Comparativo 5 empregando PEG tendo estrutura esquelética diferente dos PEGs no Exemplo 1 e empregando o tipo de ligação diferente do Exemplo 1 formado 2 vezes ou mais de agregação, comparado com os conjugados do Exemplo 1.
Tabela 3
<table>table see original document page 17</column></row><table>
Na conclusão, o conjugado de mono PEG-G-CSF de três ramificações do Exemplo 1 é mais estável em ambos os PEGs de saída dos conjugados e formação de agregação. Isto é, este efeito vantajoso é das estruturas esqueléticas diferentes entre o PEG ramificado e o PEG ramificado empregado na presente invenção.
Exemplo Experimental 6 - Ensaios das atividades de proliferação de neutrófilo de conjugados de PEG-G-CSF em modelo animal para os quais um medicamento anti-câncer é administrada.
Atividades de proliferação de neutrófilo dos conjugados de mono PEG-G-CSF de três ramificações do Exemplo 1, conjugados de mono mPEG (metóxi de políetileno glicol)-G- CSF dos Exemplos Comparativos 5 e 6 tendo tipo de ligação diferente e peso molecular diferente dos conjugados do Exemplo 2 foram testado por modelo de camundongo para o qual um agente anti-câncer foi administrado.
Camundongos (BDFI) de 20 - 25 g foram administrados com 200 mg/ kg de um agente anti-câncer (ciclofosfamida) para diminuir o número de neutrófilo durante 2 dias.
E, cada do conjugado do Exemplo 1 e os conjugados dos Exemplos Comparativos 5 e 6 foi administrado subcutaneamente uma vez, 1 mg/ kg por camundongo, e o G-CSF foi administrado 8 vezes por 0,125 mg/ kg por camundongo para produzir a quantidade de administração total de 1 mg/ kg. Os sangues dos camundongos foram coletados a 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 12 dias, e os números totais de leucócito e neutrófilo foram medidos por instrumento de medição hematológico automático (HEMAVET 850, Drew Scientific Ltd., UK). Os períodos que começaram a recuperação de neutrófilos diminuídos por um agente anti- câncer e os tempos necessários para a recuperação de neutrófilo, no conjugado do Exemplo 1 e os conjugados dos Exemplos Comparativos 5 e 6 foram similares. Entretanto, o tempo de alcance do número máximo de neutrófilo no conjugado do Exemplo 1 foi de cerca de 12 horas mais rápida do que aquelas dos conjugados dos Exemplos Comparativos 5 e 6. A área sob a curva de tempo da contagem de neutrófilo aumentado (AU-NC) do conjugado do Exemplo 1 foi maior (Tabela 4: Ensaio de atividades de proliferação de neutrófilo dos conjugados de PEG-G-CSF em modelo animal ao qual um medicamente anti-câncer é administrada). Por esse motivo, foi confirmado que o conjugado de mono PEG-G-CSF de três ramificações têm um efeito rápido de proliferação de Neutrófilo.
Tabela 4
<table>table see original document page 18</column></row><table>
Tempo para o neutrófilo ser aumentado após administração de um medicamento
*: Time para alcançar 1.000/ mm3 ou mais de neutrófilo após a administração de um medicamento anti-câncer.
Aplicabilidade Industrial
Os conjugados de PEG-G-CSF de três ramificações da presente invenção são mais farmaceuticamente estáveis do que os conjugados de PEG-G-CSF linear- ou de duas ramificações nos termos dos PEGs de saída dos conjugados de PEG-G-CSF e formação dos agregados dos conjugados. E, os conjugados da presente invenção podem ser empregados sem separações adicionais dos isômeros de posição porque os conjugados consistem dos isômeros de posição com atividades similares. E, a composição da presente invenção tem os efeitos da produção contínua de neutrófilos e meia vida in vivo aumentada.

Claims (11)

1. Conjugado de PEG-G-CSF de três ramificações da seguinte fórmula geral (1): <formula>formula see original document page 19</formula> CARACTERIZADO pelo fato de que a relação de ligação de polietileno glicol (PEG) de três ramificações e G-CSF é 1 : 1 (mol/ mol), e o PEG tem um peso molecular médio a partir de 200 a 45.000 daltons. onde, η é um número inteiro de 1 a 1.000; m é um número inteiro de 10 a 1.000; Zé (CH2)S ou (CH2)sNHCO(CH2)s como um Iigador de G-CSF e PEG na qual S é um número inteiro de 1 a 6; Y é uma ligação de amida formada pela combinação do grupo funcional NH2 em G-CSF e um grupo funcional de derivado de PEG.
2. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o PEG tem um peso molecular médio a partir de 20.000 a 45.000 daltons.
3. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o PEG tem peso molecular médio a partir de 23.000 a 43.000 daltons.
4. Método, CARACTERIZADO pelo fato de que prepara conjugado de PEG-G-CSF de três ramificações da fórmula geral (1) de acordo com a reivindicação 1 compreendendo a formação de uma ligação covalente de derivado de PEG-G-CSF de três ramificações da seguinte fórmula geral (2) e G-CSF em que PEG (polietileno glicol) tem um peso molecular médio a partir de 200 a 45.000 daltons; <formula>formula see original document page 19</formula> na qual, η é um número inteiro de 1 a 1.000; m é um número inteiro de 10 a 1.000; Z é (CH2)S ou (CH2)sNHCO(CH2)S como um Iigador de G-CSF e PEG na qual S é um número inteiro de 1 a 6; e o grupo funcional, o qual pode reagir quimicamente com proteínas e peptídeos contendo G-CSF1 é N-hidrosuccinimida.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o PEG tem um peso molecular médio a partir de 20.000 a 45.000 daltons.
6. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o PEG tem um peso molecular médio a partir de 23.000 a 45.000 daltons.
7. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a relação molar de G-CSF e derivado de PEG de três ramificações é de 1 : 0,5 a 1 : 50.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a relação molar de G-CSF e derivado de PEG de três ramificações na reação é de 1 : 0,5 a 1 : 5.
9. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que trata ou previne sintomas causados por função hematopoiética diminuída e função imunológica diminuída, compreendendo o conjugado de acordo com quaisquer das reivindicações 1, 2 ou 3 como ingrediente eficaz.
10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que os sintomas causados por função hematopoiética diminuída e função imunológica diminuída são câncer sólido, neutropenia causada por quimioterapia de câncer para tumor sangüíneo, neutropenia causada por síndrome mielodisplásica, neutropenia causada por anemia aplásica, neutropenia idiopática congênita, e neutropenia causada por tratamento de vírus da imunodeficiência humana.
11. Uso do conjugado, conforme definido em quaisquer das reivindicações 1,2 ou 3, como um ingrediente eficaz CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de neutropenia, prevenção de neutropenia, ou facilitação do aumento do número de neutrófilo no momento da mobilização da célula-tronco hematopoiética para transplante da célula-tronco hematopoiética e sangue periférico.
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