BRPI0622256A2 - formulações estáveis adequadas para administração subcutánea compreendendo moléculas de ctla4ig - Google Patents

Abstract

FORMULAçõES ESTáVEIS ADEQUADAS PARA ADMINISTRAçãO SUBCUTáNEA COMPREENDENDO MOLéCULAS DE CTLA4IG. A presente invenção se refere, de modo geral, à formulações estáveis compreendendo moléculas de CTLA4Ig, incluindo formulações liofilizadas e líquidas, para administração através de várias vias incluindo, por exemplo, vias tais como intravenosa (IV) e subcutânea (SC) para tratamento de doenças do sistema imune e indução de tolerância.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULA-ÇÕES ESTÁVEIS ADEQUADAS PARA ADMINISTRAÇÃO SUBCUTÂNEACOMPREENDENDO MOLÉCULAS DE CTLA4IG".

Dividido do PI0620186-5, depositado em 19.12.2006.

O presente pedido de patente reivindica a prioridade do U.S. N0de Série 60/752.150, depositado em 20 de Dezembro de 2005, o qual é aquiincorporado por referência em sua totalidade.

Todas as patentes, pedidos de patente e publicações citadosaqui são aqui incorporados por referência em sua totalidade. As divulgaçõesdessas publicações em suas totalidades são incorporadas aqui por referên-cia ao presente pedido de forma a descrever mais completamente o estadoda técnica, conforme conhecido por aqueles habilitados na mesma, no mo-mento de depósito da invenção descrita e reivindicada aqui.

Campo da Invenção

A presente invenção se refere, em geral, à formulações estáveiscompreendendo moléculas de CTLA4lg, incluindo formulações Iiofilizadas elíquidas, para administração através de várias vias incluindo, por exemplo,vias tais como intravenosa (IV) e subcutânea (SC).

Antecedentes da Invenção

Durante as duas últimas décadas, a tecnologia de DNA recom-binante levou à comercialização de muitos produtos terapêuticos de proteí-na. A via mais convencional de distribuição para fármacos de proteína temsido administração intravenosa (IV) em virtude da pobre biodisponibilidadepela maioria das outras vias, maior controle durante administração clínica edesenvolvimento farmacêutico mais rápido. Para produtos que requeremadministração freqüente e crônica, a via de distribuição subcutânea (SC)alternativa é mais apelativa. Quando associada à tecnologia de dispositivoauto-injetor e seringa pré-enchida, a distribuição SC permite a administraçãoem casa e aceitação aperfeiçoada de administração.

Tratamentos com altas doses de mais de 1 mg/kg ou 100 mg pordose freqüentemente requerem o desenvolvimento de formulações em con-centrações excedendo a 100 mg/ml em virtude do pequeno volume (< 1,5ml) que pode ser fornecido pelas vias SC. Para proteínas que têm uma pro-pensão em agregar em maiores concentrações, obtenção de tais formula-ções em alta concentração é um desafio de desenvolvimento. Mesmo para avia de distribuição IV, onde grandes volumes podem ser administrados, con-centrações de proteína de dez miligramas por mililitro podem ser necessá-rias para regimes em alta dosagem e isso pode impor desafios de estabili-dade para algumas proteínas.

Os princípios que orientam a solubilidade de proteína são maiscomplicados do que aqueles para pequenas moléculas sintéticas e, assim,superação do problema de solubilidade da proteína segue diferentes estra-tégias. Operacionalmente, a solubilidade para proteínas poderia ser descritapela quantidade máxima de proteína na presença de co-solutos, pelo que asolução permanece visivelmente transparente (isto é, não mostra precipita-dos, cristais ou géis de proteína). A dependência da solubilidade da proteínada resistência iônica, forma de sal, pH, temperatura e determinados excipi-entes foi mecanisticamente explicada por alterações na tensão de superfícieda água em geral e ligação de proteína aos íons de água versus auto-associação por Arakawa e colaboradores em Theory of protein solubility,Methods of Enzymology, 114: 49-77, 1985; Schein em Solubility as a functi-on of protein structure and solvent components, BioTechnoIogy 8 (4): 308-317, 1990; Jenkins em Three solutions ofthe protein solubility problem, Pro-tein Science 7 (2): 376-382, 1998; e outros. A ligação de proteínas a excipi-entes ou sais específicos influencia a solubilidade através de alterações naconformação de proteína ou disfarçando determinados aminoácidos envolvi-dos em auto-interação. Proteínas também são, de preferência, hidratadas (eestabilizadas como conformações mais compactas) por determinados sais,aminoácidos e açúcares, levando à sua solubilidade alterada.

Espera-se que a agregação, a qual requer colisão bi-molecular,seja a via de degradação primária em soluções de proteína. A relação deconcentração para formação de agregado depende do tamanho dos agrega-dos, bem como do mecanismo de associação. Agregação de proteína poderesultar em associação covalente (por exemplo, dissulfeto-ligada) ou nãocovalente (reversível ou irreversível). Agregação irreversível através de as-sociação não covalente geralmente ocorre via regiões hidrofóbicas expostasatravés de processos térmicos, mecânicos ou químicos que alteram a con-formação nativa da proteína. Agregação de proteína pode ter um impactosobre a atividade, farmacocinética e segurança da proteína, por exemplo,em virtude de imunogenicidade.

Uma abordagem típica para minimizar a agregação é restringir amobilidade de proteínas de forma a reduzir o número de colisões. Liofiliza-ção com excipientes apropriados pode melhorar a estabilidade da proteínacontra agregação através de diminuição da mobilidade de proteína e restri-ção de flexibilidade conformacional, com o benefício adicional de minimiza-ção de reações hidrolíticas conseqüentes à remoção de água. A adição deexcipientes apropriados, incluindo lioprotetores, pode prevenir a formação deagregados durante o processo de liofilização, bem como durante armaze-namento do produto final. Um parâmetro chave para proteção eficaz é a pro-porção molar do Iioprotetor para proteína. Geralmente, proporções molaresde 300:1 ou maiores são requeridas para proporcionar estabilidade adequa-da, especialmente para armazenamento em temperatura ambiente. Taisproporções também podem, contudo, levar a um aumento indesejável naviscosidade.

Liofilização permite projetar uma formulação com estabilidade etonicidade apropriadas. Embora a isotonicidade não seja necessariamenterequerida para administração SC, ela pode ser desejável para minimizar ador quando de administração. A isotonicidade de um Iiofilizado é difícil deobter porque a proteína e os excipientes são concentrados durante o pro-cesso de reconstituição. Proporções molares de excipiente:proteína de 500:1resultarão em preparados hipertônicos se a concentração final de proteína éobjetivada a >100 mg/ml. Se o desejo é obter uma formulação isotônica, en-tão, uma escolha de proporção molar menor de excipiente:proteína resultaráem uma formulação potencialmente menos estável.

Determinação da maior concentração de proteína obtenível per-manece um exercício empírico em virtude da natureza lábil da conformaçãode proteína e da propensão de interagir consigo mesma, com superfícies ecom solutos específicos.Exemplos que indivíduos que podem se beneficiar de formula-ções SC são aqueles que têm condições que requerem administração fre-qüente e crônica, tais como indivíduos com a doença do sistema imune artri-te reumatóide e distúrbios imunes associados ao transplante de enxerto.

Produtos de fármaco de proteína comercialmente disponíveis para o trata-mento de artrite reumatóide incluem HUMIRA®, ENBREL® e REMICADE®.

HUMIRA® (Abbott) é fornecido em seringas de vidro pre-enchidas de 1 ml de uso único como uma solução estéril isenta de conser-vante para administração subcutânea. A solução de HUMIRA® é transparen- te e incolor, com um pH de cerca de 5,2. Cada seringa distribui 0,8 ml (40mg) de produto de fármaco. Cada 0,8 ml de HUMIRA® contém 40 mg de a -dalimumab, 4,93 mg de cloreto de sódio, 0,69 mg de dihidrato de fosfato desódio monobásico, 1,22 mg de dihidrato de fosfato de sódio dibásico, 0,24mg de citrato de sódio, 1,04 mg de monohidrato de ácido cítrico, 9,6 mg demanitol, 0,8 mg de polisorbato 80 e água para injeção, USP. Hidróxido desódio é adicionado, conforme necessário, para ajustar o pH.

ENBREL® (Amgen) é fornecido como uma seringa de 1 ml pre-enchida de uso único como uma solução estéril, isenta de conservante parainjeção subcutânea. A solução de ENBREL® é transparente e incolor e éformulada em um pH de 6,3 ± 0,2. Cada seringa pré-enchida de único usode ENBREL® contém 0,98 ml de uma solução a 50 mg/ml de etanercept com10 mg/ml de sacarose, 5,8 mg/ml de cloreto de sódio, 5,3 mg/ml de hidroclo-reto de L-arginina, 2,6 mg/ml de monohidrato de fosfato de sódio monobási-co e 0,9 mg/ml de fosfato de sódio dibásico anídrico. Administração de umaseringa pré-enchida de 50 mg/ml de ENBREL® proporciona uma dose equi-valente a dois frascos de 25 mg de ENBREL® liofilizado, quando os frascossão reconstituídos e administrados conforme recomendado. Frascos EN-BREL® para uso múltiplo contêm pó liofilizado estéril, branco, isento de con-servante. Reconstituição com 1 ml de água para injeção bacteriostática esté-ril fornecida (BWFI), USP (contendo álcool benzílico a 0,9%) proporcionauma solução transparente e incolor para uso múltiplo com um pH de 7,4 ±0,3 contendo 25 mg de etanercept, 40 mg de manitol, 10 mg de sacarose e1,2 mg de trometamina.

REMICADE® (Centocor) é fornecido como um pó estéril, branco,Iiofilizado para infusão intravenosa. Após reconstituição com 10 ml de águaestéril para injeção, USP, o pH resultante é de aproximadamente 7,2. Cadafrasco para uso único contém 100 mg de infliximab, 500 mg de sacarose, 0,5mg de polisorbato 80, 2,2 mg de fosfato de sódio monobásico, monohidratoe 6,1 mg de fosfato de sódio dibásico, dihidrato. Nenhum conservante estápresente.

Produtos de fármaco de proteína comercialmente disponíveispara o tratamento de distúrbios imunes associados ao transplante de enxertoincluem SIMULECT® e ZENAPAX®.

O produto de fármaco SIMULECT® (Novartis) é um Iiofilizadoestéril o qual está disponível em frascos de vidro incolores de 6 ml e estádisponível em resistências de 10 mg e 20 mg. Cada frasco de 10 mg contém10 mg de basiliximab, 3,61 mg de fosfato de potássio monobásico, 0,50 mgde hidrogen fosfato de dissódio (anídrico), 0,80 mg de cloreto de sódio, 10mg de sacarose, 40 mg de manitol e 20 mg de glicina, a ser reconstituído em2,5 ml de água estéril para injeção, USP. Cada frasco de 20 mg contém 20mg de basiliximab, 7,21 mg de fosfato de sódio monobásico, 0,99 mg de hi-drogen fosfato de dissódio (anídrico), 1,61 mg de cloreto de sódio, 20 mg desacarose, 80 mg de manitol e 40 mg de glicina, a ser reconstituído em 5 mlde água estéril para injeção, USP. Nenhum conservante é adicionado.

ZENAPAX® (Roche Laboratories), 25 mg/5 ml, é fornecido comoum concentrado incolor transparente, estéril para diluição adicional e admi-nistração intravenosa. Cada mililitro de ZENAPAX® contém 5 mg de daclizu-mab e 3,6 mg de monohidrato de fosfato de sódio monobásico, 11 mg deheptahidrato de fosfato de sódio dibásico, 4,5 mg de cloreto de sódio, 0,2 mgde polisorbato 80 e pode conter ácido clorídrico ou hidróxido de sódio paraajustar o pH para 6,9. Nenhum conservante é adicionado.

Moléculas de CTLA4lg interferem com a co-estimulação de célu-las T através de inibição da interação CD28-B7. Portanto, moléculas de C-TLA4lg podem proporcionar um uso terapêutico para doenças do sistemaimune, tal como artrite reumatóide e distúrbios do sistema imune associadosa transplante de enxerto.

Há uma necessidade por uma formulação estável eficaz, conve-niente compreendendo moléculas de CTLA4lg para tratamento de distúrbiosdo sistema imune.

Sumário da Invenção

A presente invenção proporciona formulações para tratamentode doenças do sistema imune através de administração, a um indivíduo, demoléculas de CTLA4lg, as quais se ligam à moléculas de B7 sobre célulasB7-positivas, desse modo, impedindo as moléculas de B7 endógenas de seligar à CTLA4lg e/ou CD28 sobre células T.

A formulação Iiofilizada da invenção compreende a molécula deCTLA4lg em uma proporção em peso de proteína para Iioprotetor de pelomenos 1:2. O Iioprotetor é, de preferência, açúcar, mais preferível mente dis-sacarídeos, ainda mais preferivelmente sacarose ou maltose. A formulaçãoIiofilizada também pode compreender um ou mais dos componentes selecio-nados da lista consistindo de agentes de tamponamento, tensoativos, agen-tes de composição de volume e conservantes.

Em determinadas modalidades, a quantidade de sacarose oumaltose útil para estabilização de do produto de fármaco Iiofilizado está emuma proporção em peso de proteína para sacarose ou maltose de pelo me-nos 1:2, de preferência em uma proporção em peso de proteína para saca-rose ou maltose de 1:2 a 1:5, mais preferivelmente em uma proporção empeso de proteína para maltose ou sacarose de cerca de 1:2.

A formulação subcutânea (SC) da invenção compreende a mo-lécula de CTLA4lg em uma concentração de proteína de pelo menos 100mg/ml em combinação com açúcar em níveis de estabilização, de preferên-cia em uma concentração de proteína de pelo menos 125 mg/ml em combi-nação com um açúcar em níveis de estabilização, em um veículo aquoso. Oaçúcar está, de preferência, em uma proporção em peso de proteína paraaçúcar de pelo menos 1:1,1. O estabilizante é, de preferência, empregadoem uma quantidade de não mais do que aquela a qual pode resultar em umaviscosidade indesejada ou inadequada para administração via uma seringaSC. O açúcar é, de preferência, dissacarídeos, mais preferivelmente sacaro-se. A formulação SC pode também compreender um ou mais dos compo-nentes selecionados da lista consistindo de agentes de tamponamento, ten-soativos e conservantes.

Em determinadas modalidades, a quantidade de sacarose útilpara estabilização do produto de fármaco SC de molécula de CTLA4lg estáem uma proporção em peso de proteína para sacarose de pelo menos 1:1,de preferência em uma proporção em peso de proteína para sacarose a1:1,3 a 1:5, mais preferivelmente em uma proporção em peso de proteínapara sacarose de cerca de 1:1,4.

A formulação líquida da invenção compreende a molécula deCTLA4lg em uma concentração de proteína de pelo menos 20 mg/ml emcombinação com um açúcar em níveis de estabilização, de preferência pelomenos 25 mg/ml em combinação com um açúcar em níveis de estabilizaçãoem um veículo aquoso. De preferência, o açúcar está em uma proporção empeso de proteína para açúcar de pelo menos 1:1.0 açúcar é, de preferência,dissacarídeos, mais preferivelmente sacarose. A formulação líquida tambémpode compreender um ou mais dos componentes selecionados da lista con-sistindo de agentes de tamponamento, tensoativos e conservantes.

Em determinadas modalidades, a quantidade de sacarose útilpara estabilização do produto de fármaco líquido está em uma proporção empeso de proteína para sacarose de pelo menos 1:1, de preferência em umaproporção em peso de proteína para sacarose de 1:2 a 1:10, mais preferi-velmente em uma proporção em peso de proteína para sacarose de cercade 1:2.

Em outra modalidade da invenção, um artigo de manufatura éproporcionado, o qual contém o produto de fármaco e, de preferência, pro-porciona instruções para seu uso.

A presente invenção ainda proporciona métodos para tratamentode doenças do sistema imune e indução de tolerância através de administra-ção das formulações de molécula de CTLA4lg da invenção.Breve Descrição dos Desenhos

A FIG. 1 apresenta a seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 1)de uma porção de um cassete de expressão para uma molécula de CTLA4-Ig. Também mostrada é a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 2) codifi-cada pelo ácido nucleico. Moléculas de CTLA4-lg que podem ser produzidasa partir desse cassete de expressão incluem moléculas tendo a seqüênciade aminoácido com resíduos: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 deSEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2 ou (iv) 26-382 de SEQ ID NO: 2ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2, ou (vi) 25-383 de SEQ IDNO: 2. O cassete de expressão compreende as seguintes regiões: (a) umaseqüência sinalizadora de Oncostatina M (nucleotídeos 11-88 de SEQ IDNO: 1; aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 2); (b) um domínio extracelular deCTLA4 humana (nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 27-151de SEQ ID NO: 2); (c) uma porção modificada da região constante de IgGIhumana (nucleotídeos 464-1159 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 152-383 deSEQ ID NO: 2), incluindo uma região de dobradiça modificada (nucleotídeos464-508 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 152-166 de SEQ ID NO: 2), umdmCH2 de IgGI humana modificado (nucleotídeos 509-838 de SEQ ID NO:1; aminoácidos 167-276 de SEQ ID NO: 2) e um domínio de CH3 de IgGIhumana (nucleotídeos 839-1159 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 277-383 deSEQ ID NO: 2).

A FIG. 2 representa uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO:3) e aminoácido (SEQ ID NO: 4) de CTLA4-L104EA29Y-lg (também conhe-cida como "L104EA29Ylg" e "LEA29Y") compreendendo um peptídeo sinali-zador; um domínio extracelular com mutação de CTLA4 começando na me-tionina na posição +1 e terminando em ácido aspártico na posição +124 oucomeçando em alanina na posição -1 e terminando em ácido aspártico naposição +124; e uma região de lg. SEQ ID NOs: 3 e 4 representam uma se-qüência de nucleotídeo e aminoácido, respectivamente, de L104EA29Ylgcompreendendo um peptídeo sinalizador; um domínio extracelular com mu-tação de CTLA4 começando na metionina na posição +27 e terminando emácido aspártico na posição +150 ou começando em alanina na posição +26e terminando em ácido aspártico na posição +150; e uma região de Ig.L104EA29Ylg pode ter a seqüência de aminoácido com resíduos: (i) 26-383de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4; (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4ou (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO:4 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4.Descrição Detalhada da InvençãoConforme utilizado aqui:

Uma formulação ou produto de fármaco "estável" é um no qual amolécula de CTLA4lg no mesmo retém essencialmente sua estabilidade físi-ca e química e integridade quando de armazenamento. Estabilidade dasformulações de molécula de CTLA4lg pode ser medida em temperaturasselecionadas após períodos de tempo selecionados. Por exemplo, um au-mento na formação de agregado após liofilização e armazenamento é umindicador para instabilidade de uma formulação de molécula de CTLA4lgliofilizada. Além de formação de agregado, retenção de clareza, cor e odororiginais no decorrer da vida útil são indicadores utilizados para monitorar aestabilidade das soluções da molécula de CTLA4lg. Espécies de HMW sãomultímeros (isto é, tetrâmeros, hexâmeros, etc.), os quais têm um peso mo-lecular maior do que os dímeros de molécula de CTLA4lg. Tipicamente, umproduto de fármaco "estável" pode ser um em que o aumento na agregação,conforme medido através de um aumento no percentual de espécies de ele-vado peso molecular (% de HMW), é menor do cerca de 5% e, de preferên-cia, menor do que cerca de 3% quando uma formulação é armazenada a 2-80C durante um ano. De preferência, o produto de fármaco fabricado compre-ende pelo menos cerca de 25% de espécies de HMW, de preferência menosde cerca de 15% de espécies de HMW, mais preferivelmente menos de cer-ca de 10% de espécies de HMW, ainda mais preferivelmente menos de cer-ca de 5% de espécies de HMW.

O monômero, dímero e espécies de HMW de molécula de C-TLA4lg podem ser separados através de cromatografia por exclusão de ta-manho (SEC). SEC separa moléculas baseado no tamanho molecular. Se-paração é obtida através da exclusão ou inclusão molecular diferencial àmedida que as moléculas migram ao longo do comprimento da coluna. As-sim, decomposição aumenta como uma função do comprimento da coluna.Amostras de molécula de CTLA4lg podem ser separadas usando um 2695Alliance HPLC (Waters, Milford, MA) equipado com colunas TSK Gel®G3000SWXL (300 mm χ 7,8 mm) e TSK Gel® G3000SWXL (40 mm χ 6,0mm) (Tosoh Bioscience, Montgomery, PA) aleatoriamente. Amostra a 10mg/ml (alíquotas de 20 μΙ) são separadas usando uma fase móvel consistin-do de KH2PO4 a 0,2 M, NaCI a 0,9%, pH de 6,8, em uma taxa de fluxo de 1,0ml/min. As amostras são monitoradas em uma absorbância de 280 nm u-sando um detector 2487 Dual Wavelength da Water. Usando esse sistema,as espécies de HMW têm um tempo de retenção de 7,5 min ± 1,0 min. Cadapico é integrado com relação à área sob a curva. O % de espécies de HMWé calculado dividindo a área de pico de HMW pela área de pico total.

Uma formulação "reconstituída" é uma a qual foi preparada atra-vés de dissolução de uma formulação Iiofilizada em um veículo aquoso, demodo que a molécula de CTLA4lg é dissolvida na formulação reconstituída.A formulação reconstituída é adequada para administração intravenosa (IV)a um paciente que precisa da mesma.

Uma formulação "isotônica" é uma a qual tem essencialmente amesma pressão osmótica que o sangue humano. Formulações isotônicasgeralmente terão uma pressão osmótica de cerca de 250 a 350 mOsmol/Kgde H2O. O termo "hipertônico" é usado para descrever uma formulação comuma pressão osmótica acima daquela do sangue humano. A isotonicidadepode ser medida usando um osmômetro do tipo pressão de vapor ou conge-lamento com gelo, por exemplo.

O termo "agente de tamponamento" se refere a um ou maiscomponentes que, quando adicionados a uma solução aquosa, são capazesde proteger a solução contra variações no pH quando de adição de ácido ouálcali ou quando de diluição com um solvente. Além dos tampões de fosfato,podem ser usados tampões de glicinato, carbonato, citrato e semelhantes,caso no qual íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como um con-tra-íon.Um "ácido" é uma substância que proporciona íons de hidrogê-nio em uma solução aquosa. Um "ácido farmaceuticamente aceitável" incluiácidos orgânicos e inorgânicos os quais são não tóxicos na concentração emaneira pela qual eles são formulados.

Uma "base" é uma substância que proporciona íons de hidroxilaem solução aquosa. "Bases farmaceuticamente aceitáveis" incluem basesorgânicas e inorgânicas as quais são não tóxicas na concentração e maneirapela qual elas são formuladas.

Um "lioprotetor" é uma molécula a qual, quando combinada comuma proteína de interesse, impede ou reduz a instabilidade química da pro-teína quando de liofilização e subseqüente armazenamento.

Um "conservante" é um agente que reduz a ação bacteriana epode ser opcionalmente adicionado às formulações aqui. A adição de umconservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação paramúltiplos usos (múltiplas doses). Exemplos de conservantes potenciais in-cluem cloreto de octadecil dimetilbenzil amônio, cloreto de hexametônio, clo-reto de benzalcônio (uma mistura de cloretos de alquilbenzil dimetil amôniona qual os grupos alquila são compostos de cadeia longa) e cloreto de ben-zetônio Outros tipos de conservantes incluem álcoois aromáticos, tais comofenol, álcool butílico e benzílico, alquil parabenos, tais como metil ou propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol e m-cresol.

Um "tensoativo" é uma molécula superfície-ativa contendo umaporção hidrofóbica (por exemplo, cadeia alquila) e uma porção hidrofílica(por exemplo, grupos carboxila e carboxilato). Tensoativo pode ser adiciona-do às formulações da invenção. Tensoativos adequados para uso em formu-lações da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, polisorba-tos (por exemplo, polisorbatos 20 ou 80); poloxâmeros (por exemplo, Polo-xamer 80); sorbitan ésteres e derivados; Iauril sulfato de sódio; octil glicosí-deo de sódio; lauril-, miristil-, Iinoleil- ou estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-,Iinoleil- ou estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- ou cetil-betaína; Iauramidopro-pil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- ouisoestearamido propil-betaína (por exemplo, lauramidopropil); miristamido-propil-, palmidopropil- ou isoestearamido propil-dimetilamina; metil cocoil-taurato de sódio ou metil oleil-taurato dissódico; e a série MONAQUAT™(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietileno glicol, polipropileno glicol ecopolímeros de etileno e propileno glicol (por exemplo, Pluronics, PF68 etc.).

Uma "substância de fármaco" se refere ao material de iniciaçãoutilizado na formulação do produto de fármaco final. A composição típica desubstância de fármaco de CTLA4lg compreende uma concentração de pro-teína de 20 mg/ml a 60 mg/ml, pH de 7 a 8 e % de espécies de HMW de <5%.

Uma "solução bruta formulada" se refere à formulação final an-tes de enchimento do recipiente, tal como a solução formulada antes de en-chimento dos frascos para liofilização ou a solução formulada antes de en-chimento da seringa para injeção SC.

Um "produto de fármaco" se refere à formulação final embaladaem um recipiente a qual pode ser reconstituída antes de uso, tal como comum produto de fármaco liofilizado; diluída antes de uso adicionalmente, talcomo com produto de fármaco líquido; ou utilizada como está, tal como comum produto de fármaco em solução SC.

Os termos "GTLA4lg" ou "molécula de CTLA4-lg" ou "moléculade CTLA4lg" são usados permutavelmente e se referem a uma molécula deproteína que compreende pelo menos um polipeptídeo tendo um domínioextracelular de CTLA4 ou porção do mesmo e uma região constante de imu-noglobulina ou porção da mesma. O domínio extracelular e a região constan-te de imunoglobulina podem ser do tipo silvestre ou mutantes ou modificadose de mamífero, incluindo de ser humano ou camundongo. O polipeptídeopode ainda compreender domínios de proteína adicionais. Uma molécula deCTLA4-lg também pode se referir à formas multiméricas do polipeptídeo, taiscomo dímeros, tetrâmeros e hexâmeros. Uma molécula de CTLA4-lg tam-bém é capaz de se ligar à CD80 e/ou CD86.

O termo "B7-1" se refere à CD80; o termo "B7-2" se refere àCD86; e o termo "B7" se refere à B7-1 e B7-2 (CD80 e CD86). O termo "B7-1-lg" ou "B7-1lg" se refere à CD80-lg; o termo "B7-2-lg"ou "B7-2lg" se refereà CD86-lg.

Em uma modalidade, "CTLA4lg" se refere a uma molécula deproteína tendo a seqüência de aminoácido com resíduos: (i) 26-383 de SEQID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2; (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2 ou (iv)27-382 de SEQ ID NO: 2 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 ou(vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2. Na forma monomérica, essas proteínas podemser referidas aqui como "monômeros de SEQ ID NO: 2" ou monômeros "ten-do uma seqüência SEQ ID NO: 2". Esses monômeros de SEQ ID NO: 2 po-dem dimerizar, de modo que combinações de dímero podem incluir, por e-xemplo: (i) e (i); (i) e (ii); (i) e (iii); (i) e (iv); (i) e (v); (i) e (vi); (ii) e (ii); (ii) e (iii);(ii) e (iv); (ii) e (v); (ii) e (vi); (iii) e (iii); (iii) e (iv); (iii) e (v); (iii) e (vi); (iv) e (iv);(iv) e (v); (iv) e (vi); (v) e (v); (v) e (vi); e (vi) e (vi). Essas diferentes combina-ções de dímero podem também se associar umas com as outras para formarmoléculas de CTLA4lg tetraméricas. Esses monômeros, dímeros, tetrâmerose outros multímeros podem ser referidos aqui como "proteínas de SEQ IDNO: 2" ou proteínas "tendo uma seqüência SEQ ID NO: 2". (DNA que codifi-ca CTLA4lg, conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, foi depositado em 31 deMaio de 1991 com o American Type Culture Collection (ATCC), 10801 Uni-versity Blvd., Manassas, VA 20110-2209 sob as condições do Tratado deBudapeste e receberam o número de acesso à ATCC ATCC 68629; umalinhagem de célula de Ovário de Hâmster Chinês (CHO) expressando C-TLA4lg, conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, foi depositada em 31 deMaio de 1991 com o número de identificação na ATCC CRL-10762). Con-forme utilizado aqui, "Abatacept" se refere à proteínas com SEQ ID NO: 2.

Em uma modalidade, CTLA4-L104EA29Y-lg (algumas vezesconhecida como "LEA29Y" ou "L104EA29Y") é uma proteína de fusão gene-ticamente manipulada similar, em estrutura, à molécula de CTAL4-lg, con-forme mostrado em SEQ ID NO: 1. L104EA29Y-lg tem o domínio de ligaçãoextracelular funcional da CTLA4 humana modificada e o domínio Fc da imu-noglobulina humana da classe IgGI. Duas modificações de aminoácido, Ieu-cina para ácido glutâmico na posição 104 (L104E), a qual é a posição 130 deSEQ ID NO: 2 e alanina para tirosina na posição 29 (A29Y), a qual é a posi-ção 55 de SEQ ID NO: 2, foram feitas na região de ligação B7 do domínio deCTLA4 para gerar L104EA29Y. SEQ ID NOS: 3 e 4 representam uma se-qüência de nucleotídeo e aminoácido, respectivamente, de L104EA29Ylgcompreendendo um peptídeo sinalizador; um domínio extracelular com mu-tação de CTLA4 começando na metionina na posição +27 e terminando emácido aspártico na posição +150 ou começando em alanina na posição +26e terminando em ácido aspártico na posição +150; e uma região de lg. DNAque codifica L104EA29Y-lg foi depositado em 20 de Junho de 200, com aAmerican Type Culture Collection (ATCC) sob as condições do Tratado deBudapeste. Ela recebeu o número de acesso à ATCC PTA-2104.L104EA29Y-lg é ainda descrita na Patente U.S. 7.094.874, emitida em 22 deAgosto de 2006 e no WO 01/923337 A2, os quais são incorporados por refe-rência em suas totalidades.

Expressão de L104EA29Ylg em células de mamífero pode resul-tar na produção de variantes N- e C-terminais, de modo que as proteínasproduzidas podem ter a seqüência de aminoácido com resíduos: (i) 26-383de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4; (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4ou (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO:4 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4. Na forma monomérica, essas proteínaspodem ser referidas aqui como "monômeros de SEQ ID NO: 4" ou monôme-ros "tendo a seqüência SEQ ID NO: 4". Essas proteínas podem dimerizar, demodo que combinações de dímero podem incluir, por exemplo: (i) e (i); (i) e(ii); (i) e (iii); (i) e (iv); (i) e (v); (i) e (vi); (ii) e (ii); (ii) e (iii); (ii) e (iv); (ii) e (v);(ii) e (vi); (iii) e (iii); (iii) e (iv); (iii) e (v); (iii) e (vi); (iv) e (iv); (iv) e (v); (iv) e(vi); (v) e (v); (v) e (vi); e (vi) e (vi). Essas diferentes combinações de dímeropodem também se associar umas com as outras para formar moléculas deL104EA29Ylg tetraméricas. Esses monômeros, dímeros, tetrâmeros e outrosmultímeros podem ser referidos aqui como "proteínas com SEQ ID NO: 4"ou proteínas "tendo uma seqüência SEQ ID NO: 4". Conforme utilizado aqui,"Belatacept" se refere à proteínas com SEQ ID NO: 4.Monômeros e multímeros de CTLA4-lq

Moléculas de CTLA4-lg podem incluir, por exemplo, proteínas deCTLA4-lg na forma de monômero, dímero, trímero, tetrâmero, pentâmero,hexâmero ou outras formas multiméricas. Moléculas de CTLA4-lg podemcompreender uma proteína de fusão com pelo menos um domínio extracelu-lar de CTLA4 e uma região constante de imunoglobulina. Moléculas de C-TLA4-lg podem ter seqüências do tipo silvestre ou mutantes, por exemplo,com relação ao domínio extracelular de CTLA4 e seqüências de região cons-tante de imunoglobulina. Monômeros de CTLA4-lg, sozinhos ou na forma dedímero, tetrâmero ou outro multímero, podem ser glicosilados.

Em algumas modalidades, a invenção proporciona populaçõesde moléculas de CTLA4-lg que têm pelo menos um determinado percentualde moléculas de dímero ou outro multímero. Por exemplo, a invenção pro-porciona populações de moléculas de CTLA4-lg que são maiores do que90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de dímeros de CTLA4-lg. Emuma modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas deCTLA4-lg que compreende de cerca de 95% a cerca de 99,5% de dímerosde CTLA4-lg e de cerca de 0,5% a cerca de 5% de tetrâmeros de CTLA4-lg.Em outra modalidade, a população de moléculas de CTLA4-lg compreendecerca de 98 % de dímero de CTLA4-lg, cerca de 1,5% de tetrâmero de C-TLA4-lg e cerca de 0,5% de monômero de CTLA4-lg.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população demoléculas de CTLA4lg em que a população é substancialmente isenta demoléculas de monômero de CTLA4lg. Substancialmente isenta de moléculasde monômero de CTLA4lg pode ser referir a uma população de moléculasde CTLA4lg que têm menos de 1%, 0,5% ou 0,1% de monômeros.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população demoléculas de CTLA4lg em que a população é substancialmente isenta demultímeros de CTLA4lg que são maiores do que dímeros, tais como tetrâ-meros, hexâmeros, etc. Substancialmente isentas de moléculas de multíme-ros de CTLA4lg maiores do que dímeros pode se referir a uma população demoléculas de CTLA4lg que têm menos de 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%ou 0,1% de multímeros de CTLA4-lg maiores do que a forma dimérica.

Em uma modalidade, uma molécula monomérica de CTLA4lgpode ter, por exemplo, a seqüência de aminoácido de: (i) 26-383 de SEQ IDNO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2 (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2 ou (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 ou (vi)25-383 de SEQ ID NO: 2. Quando um cassete de expressão compreenden-do a seqüência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 é expressa em célulasCHO, a forma monomérica predominante expressa tem o resíduo de amino-ácido no N-término de metionina (resíduo 27 de SEQ ID NO: 2), o qual cor-responde ao resíduo de aminoácido no N-término das amino da CTLA4 hu-mana do tipo silvestre. Contudo, em virtude do fato de SEQ ID NO: 1 tam-bém incluir a seqüência de codificação para a seqüência sinalizadora de On-costatina M (nucleotídeos 11-88 de SEQ ID NO: 1), a proteína expressa apartir de SEQ ID NO: 1 contém uma seqüência sinalizadora de OncostatinaΜ. A seqüência sinalizadora é clivada da proteína expressa durante o pro-cesso de exportação de proteína do citoplasma ou secreção da célula. Masclivagem pode resultar em variantes N-terminais, tal como clivagem entre osresíduos de aminoácido 25 e 26 (resultando em um N-término de resíduo 26,isto é, a "variante Ala") ou entre os resíduos de aminoácido 24 e 25 (resul-tando em um N-término de resíduo 2, isto é, a "variante Met-Ala"), em oposi-ção à clivagem entre resíduos de aminoácido 26 e 27 (resultando em um N-término de resíduo 27). Por exemplo, a variante Met-Ala pode estar presenteem uma mistura de moléculas de CTLA4lg em cerca de 1% e a variante Alapode estar presente em uma mistura de moléculas de CTLA4lg em cerca de8-10%. Além disso, a proteína expressa a partir de SEQ ID NO: 1 pode tervariantes C-terminais em virtude de processamento incompleto. O C-términopredominante é a glicina no resíduo 382 de SEQ ID NO: 2. Em uma misturade moléculas de CTLA4lg, monômeros tendo Iisina no C-término (resíduo383 de SEQ ID NO: 2) podem estar presentes, por exemplo, em cerca de 4-5%.

Uma molécula monomérica de CTLA4lg pode compreender umdomínio extracelular de CTLA4 humana. Em uma modalidade, o domínioextracelular pode compreender a seqüência de nucleotídeo dos nucleotídeos89-463 de SEQ ID NO: 1 que codifica os aminoácidos 27-151 de SEQ IDNO: 2. Em outra modalidade, o domínio extracelular pode compreender se-qüências mutantes da CTLA4 humana. Em outra modalidade, o domínio ex-tracelular pode compreender alterações de nucleotídeo nos nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 1, de modo que alterações conservativas de aminoácidosão feitas. Em outra modalidade, o domínio extracelular pode compreenderuma seqüência de nucleotídeo que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%,95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica aos nucleotídeos 89-463 de SEQ IDNO: 1.

Uma molécula monomérica de CTLA4lg pode compreender umaregião constante de uma imunoglobulina humana. Essa região constantepode ser uma porção de uma região constante; essa região constante podeter uma seqüência do tipo silvestre ou mutante. A região constante pode serde IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAI, IgA2, IgD ou IgE humana. A regiãoconstante pode ser de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de uma imu-noglobulina. Onde a região constante é de uma molécula de IgG, IgD ou IgA1a região constante pode compreender um ou mais dos seguintes domíniosde região constante: CL, CH1, dobradiça, CH2 ou CH3. Onde a região cons-tante é de IgM ou IgE1 a região constante pode compreender um ou maisdos seguintes domínios de região constante: CL, CH1, CH2, CH3 ou Ca4.Em uma modalidade, a região constante pode compreender um ou maisdomínios de região constante de IgG, IgD, IgA, IgM ou IgE.

Em uma modalidade, uma molécula monomérica de CTLA4lgcompreende uma região de dobradiça de IgGI humana modificada (nucleo-tídeos 464-508 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 152-166 de SEQ ID NO: 2),em que as serinas nos resíduos de aminoácido 156, 162 e 165 de SEQ IDNO: 2 foram manipuladas para cisteínas presentes na seqüência do tipo sil-vestre.

Em uma modalidade, uma molécula monomérica de CTLA4lgcompreende uma região CH2 de IgGI humana modificada e uma regiãoCH3 do tipo silvestre (o domínio CH2 de IgGI humana modificada tendo nu-cleotídeos 509-838 de SEQ ID NO: 1 e aminoácidos 167-276 de SEQ ID NO:2; o domínio CH3 de IgGI humana tendo nucleotídeos 839-1159 de SEQ IDNO: 1 e aminoácidos 277-383 de SEQ ID NO: 2).

Em uma modalidade, uma população de moléculas de CTLA4lgcompreende monômeros tendo uma seqüência mostrada em qualquer umaou mais das Figuras 7, 8 ou 9 da patente U.S. No. 7.094.874, emitida em 22de Agosto de 2006 e pedidos de patente U.S. publicados como PublicaçõesNos.US20030083246 e US20040022787, as quais são aqui incorporadaspor referência em sua totalidade.

Em uma modalidade, uma molécula tetramérica de CTLA4lgcompreende dois pares ou dois dímeros de polipeptídeos de CTLA4lg, emque cada polipeptídeo tem uma das seguintes seqüências de aminoácido: (i)26-383 de SEO ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQID NO: 2 ou (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2 ou opcionalmente (v) 25-382 deSEQ ID NO: 2 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2. Cada membro do par de po-lipeptídeos ou dímero é covalentemente ligado ao outro membro e os doispares de polipeptídeos são não-covalentemente associados um ao outro,desse modo, formando um tetrâmero. Tais moléculas de tetrâmero são ca-pazes de ligação à CD80 ou CD86.

Em outra modalidade, tais moléculas de tetrâmero podem seligar à GD80 ou CD86 com uma avidez que é pelo menos 2 vezes maior doque a avidez de ligação de um dímero de CTLA4lg (cujos monômeros têmuma das seqüências de aminoácido acima) à CD80 ou CD86. Em outra mo-dalidade, tais moléculas de tetrâmero podem se ligar à CD80 ou CD86 comuma avidez que é pelo menos 2 vezes maior do que a afinidade ou avidezde ligação da CTLA4 do tipo silvestre à CD80 ou CD86. Essa maior avidezpode contribuir para maior eficácia no tratamento de distúrbios imunes e ou-tras doenças, conforme descrito abaixo. Além disso, avidez maior ou aper-feiçoada pode produzir o resultado de maior potência de um fármaco. Porexemplo, uma composição terapêutica compreendendo tetrâmero de C-TLA4lg teria uma maior avidez e, portanto maior potência do que a mesmaquantidade de uma composição terapêutica tendo um monômero de C-TLA4lg. Em outra modalidade, tais moléculas de tetrâmero podem ter pelomenos uma inibição 2 vezes maior sobre a proliferação de células T compa-rado com um dímero de CTLA4lg (cujos monômeros têm uma das seqüên-cias de aminoácido acima). Em outra modalidade, tais moléculas de tetrâme-ro podem ter pelo menos uma inibição 2 vezes maior sobre a proliferação decélulas T quando comparado com uma molécula de CTLA4 do tipo silvestre.

A proliferação de células T pode ser medida usando ensaios pa-drões conhecidos na técnica. Por exemplo, uma das formas mais comunspara avaliar a proliferação de células T é estimular células T via antígeno ouanticorpos agonísticos ao TCR e medir, por exemplo, a incorporação de ti-midina titulada (3H-TdR) em células T em proliferação ou a quantidade decitocinas liberadas por células T em proliferação em cultura. O efeito inibitó-rio de moléculas de CTLA4lg sobre a ativação ou proliferação de células Tpode, desse modo, ser medido.

A afinidade de uma molécula de CTLA4lg é a resistência de li-gação da molécula a um único ligante, incluindo CD80, CD86 ou proteínasde fusão CD80lg ou CD86lg. A afinidade da CTLA4lg por Iigantes pode sermedida usando, por exemplo, análise de interação de ligação (BIA) baseadana técnica de plasmônio de superfície. Além de medir a resistência de liga-ção, ela permite determinação em tempo real da cinética de ligação, tal co-mo as constantes de taxa de-associação e dissociação. Uma lasca sensora,consistindo de uma lâmina de vidro revestida com um filme fino de metal, àqual uma matriz na superfície é covalentemente presa, é revestida com umdos agentes de interação, isto é, CTLA4lg ou um dos ligantes. Uma soluçãocontendo o outro agente de interação é deixada fluir sobre sua superfície.Um feixe de luz contínuo é dirigido contra o outro lado da superfície e seuângulo de reflexão é medido. Quando de ligação de CTLA4lg ao ligante, oângulo de ressonância do feixe de luz altera (uma vez que ele depende doíndice refrativo do meio próxima o lado reativo do sensor o qual, por sua vez,está diretamente correlacionado à concentração de material dissolvido nomeio). Ele é subseqüentemente analisado com o auxílio de um computador.

Em uma modalidade, experimentos de ligação à CTLA4lg po-dem ser realizados através de ressonância de plasmônio em superfície (S-PR) sobre um instrumento BIAcore (BIAcore AG, Uppsala, Suécia). CTLA4lgpode ser covalentemente acoplada, através de grupos amina primária, auma matriz de dextrana carbóxi-metilada sobre uma lasca sensora BIAcore1desse modo, imobilizando a CTLA4lg à lasca sensora. Alternativamente, umanticorpo anti-região constante pode ser usado para imobilizar CTLA4lg indi-retamente à superfície sensora via o fragmento de Ig. Após o que, Iigantessão adicionados à lasca para medir a ligação de CTLA4lg aos ligantes. Me-dições de afinidade podem ser realizadas, por exemplo, conforme descritoem van der Merwe1 P. e colaboradores, J. Exp. Med. (1997) 185 (3): 393-404.

A avidez de moléculas de CTLA4lg também pode ser medida. Aavidez pode ser definida como a soma total da resistência de ligação de du-as moléculas ou células uma à outra em múltiplos sítios. A avidez é distintada afinidade, a qual é a resistência de ligação a um sítio sobre uma moléculaa seu ligante. Sem estar preso à teoria, maior avidez de moléculas de Ο-TLA4lg pode levar a uma potência aumentada de inibição pelas moléculasde CTLA4lg sobre a proliferação e ativação de células Τ. A avidez pode sermedida, por exemplo, através de duas categorias de ensaios em fase sólida:a) ensaios de inibição competitiva e b) ensaios de eluição. Em ambos, o li-gante é preso-a um suporte sólido. No ensaio de inibição competitiva, molé-cuias de CTLA4lg são, então, adicionadas em solução em uma concentra-ção fixa, junto com ligante livre em diferentes concentrações e a quantidadede ligante a qual inibe a ligação à fase sólida em 50% é determinada. Quan-to menos ligante necessário, mais forte a avidez. Em ensaios de eluição, oligante é adicionado em solução. Após obtenção de um estado de equilíbrio,um agente caotrópico ou agente de desnaturação (por exemplo, isotiociana-to, uréia ou dietilamina) é adicionado em diferentes concentrações pararomper as interações CTLA4lg/ligante. A quantidade de CTLA4lg que resisteà eluição é determinada depois com um ELISA. Quanto maior a avidez, maisagente caotrópico é necessário para eluir uma determinada quantidade deCTLA4lg. A avidez relativa de uma mistura heterogênea de moléculas deCTLA4lg pode ser expressa como o índice de avidez (Al), igual à concentra-ção de agente de eluição necessária para eluir 50% das moléculas de C-TLA4lg ligadas. Análise refinada de dados pode ser realizada determinandoos percentuais de CTLA4lg eluída em diferentes concentrações do agentede eluição.

Métodos para Produção das Moléculas de CTLA4lg da InvençãoExpressão de moléculas de CTLA4lg pode ser em células proca-riotas. Procariotas são, mais freqüentemente, representadas por várias ce-pas de bactérias. As bactérias podem ser gram positivas ou gram negativas.Tipicamente, bactérias gram-negativas, tal como E. coli, são preferidas. Ou-tras cepas microbianas podem também ser usadas.Seqüências, conforme descrito acima, que codificam moléculas

de CTLA4lg, podem ser inseridas em um vetor projetado para expressão deseqüências estranhas em células procariotas, tal como E. coli. Esses vetorespodem incluir seqüências de controle procariotas comumente usadas asquais são definidas aqui para incluir promotores para início de transcrição,opcionalmente com um operador, junto com seqüências de sítio de ligaçãoribossômica, incluem promotores comumente usados, tais como os sistemasde promotor de beta-lactamase (penicilinase) e Iactose (Iac) (Chang e cola-boradores, (1977) Nature 198: 1056), o sistema de promotor de triptofano(trp)-(Goeddel e colaboradores,(1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057) e o pro-motor Pl lambda-derivado e sítio de ligação ribossômica do N-gene (Shima-take e colaboradores, (1981) Nature 292: 128).

Tais vetores de expressão também incluirão origens de replica-ção e marcadores selecionáveis, tal como um gene de beta-lactamase oufosfotransferase de neocimina que confere resistência a antibióticos, de mo-do que os vetores possam se replicar em bactérias e células trazendo osplasmídeos podem ser selecionadas para crescimento na presença de anti-bióticos, tais como ampicilina ou canamicina.

O plasmídeo de expressão pode ser introduzido em células pro-cariotas via uma variedade de métodos padrões incluindo, mas não limitadoa, CaCl2-Choque (Cohen, (1972) Proc. NatL Acad. Sei. USA 69: 2110 e Sam-brook e colaboradores (eds.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2aEdição, Cold Spring Harbor Press, (1989)) e eletroporação.De acordo com a prática da invenção, células eucariotas sãotambém células hospedeiras adequadas. Exemplos de células eucariotasincluem qualquer célula animal, quer primária ou imortalizada, Ievedo (porexemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe e Piehiapastoris) e células de planta. Células de mieloma, COS e CHO são exem-plos de células animais que podem ser usadas como hospedeiros. CélulasCHO particulares incluem, mas não estão limitadas a, DG44 (Chasin e cola-boradores, 1986 Som. Celi. Moiee. Genet. 12: 555-556; Kolkekar 1997 Bio-ehemistry 36: 10901-10909), CHO-K1 (ATCC No. CCL-61), a linhagem decélula CHO-K1 Tet-On (Clontech), CHO designada ECACC 85050302 (CA-MR, Salisbury1 Wiltshire, Reino Unido), o clone 13 de CHO (GEIMG, Gêno-va, IT), clone B de CHO (GEIMG, Gênova, IT), CHO-K1/SF designada E-CACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido) e RR-CHOK1designada ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido).Células de planta ilustrativas incluem células de tabaco (plantas inteiras, cul-tura de células ou caule), milho, soja e arroz. Sementes de milho, soja e ar-roz também são aceitáveis.

Seqüências de ácido nucleico que codificam moléculas de C-TLA4lg descritas acima também podem ser inseridas em um vetor projetadopara expressão de seqüências estranhas em um hospedeiro eucariota. Oselementos regulatórios do vetor podem variar de acordo com o hospedeiroeucariota em particular.

Seqüências de controle eucariotas comumente usadas em veto-res de expressão incluem seqüências promotoras e de controle compatíveiscom células de mamífero tais como, por exemplo, promotor de CMV (vetorCDM8) e vírus sarcoma de aves (ASV) (vetor ttLN). Outros promotores co-mumente usados incluem os promotores precoce e tardio de Simian Virus 40(SV40) (Fiers e colaboradores, (1973) Nature 273: 113) ou outros promoto-res virais, tais como aqueles derivados de polioma, Adenovírus 2 e papilomavírus bovino. Um promotor induzível, tal como hMTII (Karin e colaboradores,(1982) Nature 299: 797-802) também pode ser usado.

Vetores para expressão de moléculas de CTLA4lg em eucario-tas também podem trazer seqüências denominadas regiões intensificadoras.Essas são importantes em otimização de expressão de gene e são encon-tradas a montante ou a jusante da região promotora.

Exemplos de vetores de expressão para células hospedeiraseucariotas incluem, mas não estão limitados a, vetores para células hospe-deiras de mamífero (por exemplo, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Mania-tis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies);Vetores pVPakc, vetores pCMV, vetores pSG5 (Stratagene)), vetores retrovi-rais (por exemplo, vetores pFB (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) ou for-mas modificadas dos mesmos, vetores adenovirais; vetores Adenovírus-associados, vetores de baculovírus, vetores de Ievedo (por exemplo, vetorespESC (Stratagene)).

Seqüências de ácido nucleico que codificam moléculas de C-TLA4lg podem se integrar no genoma da célula hospedeira eucariota e repli-car à medida que o genoma do hospedeiro se reproduz. Alternativamente, ovetor trazendo moléculas de CTLA4lg podem conter origens de replicaçãoque permitem replicação extracromossômica.

Para expressão das seqüências de ácido nucleico em Saccha-romyces cerevisiae, a origem de replicação do plasmídeo de Ievedo endó-gena, o círculo 2 μ, pode ser usada. (Broach, (1983) Meth. Enz. 101: 307).Alternativamente, seqüências do genoma de Ievedo capazes de promoverreplicação autônoma podem ser usadas (veja, por exemplo, Stinchcomb ecolaboradores, (1979) Nature 282: 39); Tschemper e colaboradores, (1980)Gene 10: 157; e Clarke e colaboradores, (1983) Meth. Enz. 101: 300).

Seqüências de controle transcricional para vetores de Ievedoincluem promotores para a síntese de enzimas glicolíticas (Hess e colabora-dores, (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149; Holland e colaboradores, (1978)Biochemistry 17: 4900). Promotores adicionais conhecidos na técnica inclu-em o promotor de CMV fornecido no vetor CDM8 (Toyama e Okayama,(1990) FEBS 268: 217-221); o promotor para quínase de 3-fosfoglicerato(Hitzeman e colaboradores, (1980) J. Biol. Chem. 255: 2073) e aqueles paraoutras enzimas glicolíticas.Outros promotores são induzíveis porque eles podem ser regu-lados por estímulos ambientais ou o meio de crescimento das células. Essespromotores induzíveis incluem aqueles dos genes para proteínas de choquetérmico, dehidrogenase 2 de álcool, isocitocroma C1 fosfatase ácida, enzi-mas associadas ao catabolismo de nitrogênio e enzimas responsáveis pelautilização de maltose e galactose.

Seqüências regulatórias também podem ser colocadas na ex-tremidade 3' das seqüências de codificação. Essas seqüências podem atuarpara estabilizar o RNA mensageiro. Tais terminadores são encontrados naregião não traduzida 3' após as seqüências de codificação em vários genesderivados de Ievedo e mamífero.

Vetores ilustrativos para plantas e células de planta incluem,mas não estão limitados a, plasmídeos Ti de Agrobacterium , vírus mosaicoda couve-flor (CaMV) e vírus mosaico dourado de tomate (TGMV).

Células de mamífero podem ser transformadas através de méto-dos incluindo, mas não limitado a, transfecção na presença de fosfato decálcio, microinjeção, eletroporação ou via transdução com vetores virais.

Métodos para introdução de seqüências de DNA estranhas emgenomas de-planta e Ievedo incluem (-1) métodos mecânicos; tal como mi-croinjeção de DNA em células simples ou protoplastas, turbilhonamento decélulas com glóbulos de vidro na presença de DNA ou disparo de esferas detungstênio ou ouro revestidas com DNA em células ou protoplastas; (2) in-trodução de DNA tornando as membranas celulares permeáveis à macromo-léculas através de tratamento com polietileno glicol ou sujeição a pulsos elé-25 tricôs de alta voltagem (eletroporação); ou (3) o uso de Iipossomas (conten-do cDNA), os quais se fundem às membranas celulares.

A publicação de pedido de Patente US Número 20050019859 ePublicação de pedido de patente US número 20050084933 ensinam proces-sos para a produção de proteínas da invenção, especificamente produtos deglicoproteína recombinante, através de culturas de células de animal oumamífero e são aqui incorporadas por referência.

Após a fase de produção de proteína do processo de cultura decélulas, moléculas de CTLA4lg são recuperadas do meio de cultura de célu-la usando métodos compreendidos por aqueles habilitados na técnica. Emparticular, a molécula de CTLA4lg é recuperada do meio de cultura como umpolipeptídeo secretado.

O meio de cultura é inicialmente centrifugado para remover res-tos celulares e partículas. A proteína desejada é subseqüentemente purifica-da do DNA contaminante, proteínas solúveis e polipeptídeos, com os seguin-tes procedimentos de purificação não Iimitativos bem estabelecidos na técni-ca: SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amônio; precipitação com eta-nol; fracionamento sobre colunas de imunoafinidade ou troca de íons; HPLCde fase reversa; cromatografia sobre sílica ou sobre uma resina de troca deânions, tal como QAE ou DEAE; cromatofocalização; filtração em gel usan-do, por exemplo, uma coluna Sephadex G-75™ ; e colunas de proteína ASepharose™ para remover contaminante, tal como IgG. A adição de um ini-bidor de protease, tal como fluoreto de fenil metil sulfonila (PMSF) ou umamistura de coquetel de inibidor de protease, também pode ser útil para inibirdegradação proteolítica durante purificação. Aqueles habilitados na técnicareconhecerão que métodos de purificação adequados para uma proteína deinteresse, por exemplo, uma glicoproteína, podem requerer alterações quelevem em conta mudanças no caráter da proteína quando de expressão emcultura de células recombinantes.

Técnicas e métodos de purificação que selecionam os gruposcarboidrato da glicoproteína também são de utilidade dentro do contexto dapresente invenção. Por exemplo, tais técnicas incluem HPLC ou cromatogra-fia de troca de íons usando resinas de troca de cátions ou ânions, em que afração mais básica ou mais ácida é coletada, dependendo de qual carboidra-to está sendo selecionado. O uso de tais técnicas também pode resultar naconcomitante remoção de contaminantes.

O método de purificação pode ainda compreender etapas adi-cionais que inativam e/ou removem vírus e/ou retrovírus que poderiam estarpotencialmente presentes no meio de cultura de células de linhagens de cé-lulas de mamífero. Um número significativo de etapas de eliminação viralestão disponíveis incluindo, mas não limitado a, tratamento com agentescaotrópicos, tais como uréia ou guanidina, detergentes, etapas adicionais deultrafiltração/diafiltração, separação convencional, tal como cromatografia detroca de íons ou por exclusão de tamanho, extremos de pH, calor, proteases,solventes orgânicos ou qualquer combinação dos mesmos.

A molécula de CTLA4lg purificada requer concentração e umatroca de tampão antes de armazenamento ou processamento adicional. Umsistema Pall Filtron TFF pode ser usado para concentrar e trocar o tampãode eluição da coluna de purificação anterior pelo tampão final desejado paraa substância de fármaco.

Em um aspecto, moléculas de CTLA4lg purificadas as quais te-nham sido concentradas e submetidas a uma etapa de diafiltração podemser enchidas em garrafas Biotainer® de 2 L, saco Bioprocess de 50 L ouqualquer outro vaso adequado. As moléculas de CTLA4lg em tais vasos po-dem ser armazenadas durante cerca de 60 dias a 2 a 8 °C antes de conge-lamento. Armazenamento prolongado de moléculas de CTLA4lg purificadasa 2 a 8 °C pode levar a um aumento da proporção de espécies de HMW.Portanto, para armazenamento a longo prazo, as moléculas de CTLA4lg po-dem ser congeladas em torno de -70 °G antes de armazenamento e arma-zenadas em uma temperatura de cerca de -40 °C. A temperatura de conge-lamento pode variar de cerca de -50 °C a cerca de -90 °C. O tempo de con-gelamento pode variar e depende grandemente do volume do vaso que con-tém as moléculas de CTLA4lg e do número de vasos que são carregados aocongelador. Por exemplo, em uma modalidade, moléculas de CTLA4lg estãoem garrafas Biotainer® de 2L. Carregamento de menos de quatro garrafasBiotainer® de 2L no congelador pode requerer um tempo de congelamentode cerca de 114 a pelo menos cerca de 18 horas. Carregamento de pelomenos quatro garrafas pode requerer um tempo de congelamento de cercade 18 a pelo menos 24 horas.Vasos com moléculas de CTLA4lg congeladassão armazenados em uma temperatura de cerca de -35 °C a cerca de -55°C. O tempo de armazenamento em uma temperatura de cerca de -35 °C acerca de -55 °C pode variar e pode ser tão curto quanto 18 horas. A subs-tância de fármaco congelada pode ser descongelada de uma maneira con-trolada para formulação do produto de fármaco.

Os pedidos de patente US co-pendentes No. de Série60/752.267, depositado em 20 de Dezembro de 2005 e 06/849.543, deposi-tado em 5 de Outubro de 2006 e pedido de patente PCT1 No. de Documentodo Procurador No. 10734 PCT1 intitulado " Cell Lines, Compositions and Me-thods for Producing a Composition" pelo inventor Kirk Leister, depositado em19 de Dezembro de 2006, ensinam processos para a produção de proteínasda invenção, especificamente produtos de glicoproteína recombinantes, a-través de culturas de células de animal ou mamífero, e são aqui incorpora-dos por referência.

Formulação Liofilizada da Invenção

A formulação Iiofilizada da invenção compreende a molécula deCTLA4lg em uma proporção em peso de proteína para Iioprotetor de pelomenos 1:2. O Iioprotetor é, de preferência, açúcar, mais preferivelmente dis-sacarídeos, ainda mais preferivelmente sacarose ou maltose. A formulaçãoliofilizada pode também compreender um ou mais dos componentes selecio-nados da lista consistindo de agentes de tamponamento, tensoativos, agen-tes de composiçãode volume econservantes.

Durante estudos de desenvolvimento de formulação, os efeitosde vários excipientes sobre a estabilidade em estado sólido Iiofilizada e emsolução da molécula de CTLA4lg, foram avaliados.

A instabilidade da molécula de CTLA4lg Iiofilizada na ausênciade um estabilizante realçou claramente a necessidade de inclusão de umlioprotetor na formulação. Estudos iniciais de triagem mostraram que o pro-duto de fármaco era estável na presença de açúcares, tais como maltose esacarose, e aminoácidos, tais como arginina e lisina. Polióis, tal como mani-tol e polissacarídeos, tal como dextrana 40, foram prejudiciais para sua es-tabilidade. Os Iioprotetores preferidos são os dissacarídeos maltose e saca-rose.

O Exemplo Vl descreve estudos de estabilidade do produto defármaco Iiofilizado abatacept na presença de maltose armazenado a 50 0C.Um aumento nas espécies de elevado peso molecular (HMW) foi monitoradousando um ensaio de cromatografia por exclusão de tamanho indicando es-tabilidade (SE-HPLC). Os resultados demonstram que a estabilidade da mo-lécula de CTLA4lg em uma forma em estado sólido Iiofilizada é intensificadana presença de maltose.

A quantidade de sacarose ou maltose útil para estabilização doproduto de fármaco Iiofilizado está em uma proporção em peso de proteínapara sacarose ou maltose de pelo menos 1:2, de preferência em uma pro-porção de em peso de proteína para sacarose ou maltose de 1:2 a 1:5, maispreferivelmente em uma proporção em peso de proteína para maltose ousacarose de 1:2.

Se necessário, o pH da formulação, antes de liofilização, é ajus-tado através da adição de um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável.O ácido farmaceuticamente aceitável preferido é ácido clorídrico. A base pre-ferida é hidróxido de sódio.

Durante desenvolvimento de formulação, a estabilidade do pro-duto de fármaco Iiofilizado foi estudada como uma função do pH. O pH dasolução foi ajustado para entre 6 a 8 antes de liofilização. As amostras foramcolocadas sob estabilidade e os frascos com produto constituído foram moni-torados com relação a um aumento nas espécies de elevado peso molecularem vários pontos de tempo usando um ensaio de cromatografia por exclusãode tamanho indicando estabilidade (SE-HPLC). Sob a condição de uso re-comendada de 2-8 0C1 nenhuma alteração significativa na taxa de formaçãode espécies de HMW foi observada. Adicionalmente, os dados de estabilida-de em estado de solução gerados durante um desenvolvimento anteriormostraram que o pH para estabilidade máxima deve estar entre 7 e 8. A fai-xa de pH aceitável para o produto de fármaco Iiofilizado é de 7 a 8, com umpH alvo preferido de 7,5.

Em outro aspecto, os sais ou componentes do tampão podemser adicionados em uma quantidade de pelo menos cerca de 10 mM, de pre-ferência 10-200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitá-veis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos),com metais ou aminas de "formação de base". Além de tampões de fosfato,podem ser usados tampões de glicinato, carbonato, citrato e semelhantes,caso no qual íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como um con-tra-ion.

Um "agente de composição de volume" é um composto o qualadiciona massa a uma mistura Iiofilizada e contribui para a estrutura física dobolo Iiofilizado (por exemplo, facilita a produção de um bolo Iiofilizado essen-cialmente uniforme o qual mantém uma estrutura de poro aberta). Agentesde composição de volume ilustrativos incluem manitol, glicina, polietilenoglicol e sorbitol. As formulações Iiofilizadas da presente invenção podemconter tais agentes de composição de volume.

Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formula-ções aqui para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode,por exemplo, facilitar a produção de uma formulação para uso múltiplo (múl-tiplas doses).

Aqueles habilitados na técnica selecionarão a quantidade deproduto de fármaco a ser enchido em um frasco dependendo das dosagense esquema de administração requerido para um tratamento específico. Porexemplo; a concentração de CTLA4Ig por frasco pode oscilar de 50 a 300mg/frasco, de preferência 100 a 250 mg/frasco.

Uma composição típica do produto de fármaco abatacept Iiofili-zado é listada na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1

Composição de produto de fármaco abatacept Iiofilizado (250 mg/frasco)

<formula>formula see original document page 30</formula>a Inclui um excesso de 5% para perdas no frasco, agulha, seringa

b Esses componentes estão presentes na solução de substância de fármacoabatacept

Uma composição típica do produto de fármaco belatacept Iiofili-zado é listada na Tabela 2 abaixo.Tabela 2

Composição de produto de fármaco belatacept liofilizado, 100 mg/frasco

<table>table see original document page 31</column></row><table>

a Cada frasco contém um excesso de 10% para perdas no frasco, agulha eseringa da solução reconstituída.

O produto de fármaco liofilizado é constituído com um veículoaquoso. O veículo aquoso de interesse aqui é um o qual é farmaceuticamen-te aceitável (seguro e não tóxico para administração a um ser humano) e éútil para o preparo da formulação líquida, após liofilização. Diluentes ilustrati-vos incluem água estéril para injeção (SWFI)1 água bacteriostática para inje-ção (BWFI)1 uma solução com pH tamponado (por exemplo, solução salinatamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solu-ção de dextrose.

De preferência, o produto de fármaco liofilizado da presente in-venção é constituído com água estéril para injeção, USP (SWFI) ou cloretode sódio a 0,9% para injeção, USP. Durante constituição, o pó liofilizado dis-solve rapidamente, proporcionando uma solução transparente, incolor.

Tipicamente, o produto de fármaco liofilizado da presente inven-ção é constituído para cerca de 25 mg/ml com 10 ml de água estéril parainjeção, USP (SWFI) ou cloreto de sódio a 0,9% para injeção, USP. A solu-ção constituída é ainda diluída para concentrações de produto de fármacoentre 1 e 10 mg/ml com cloreto de sódio a 0,9% para injeção, USP. O produ-to de fármaco diluído para injeção é isotônico e adequado para administra-ção através de infusão intravenosa.

Durante desenvolvimento clínico anterior, descobriu-se que assoluções constituídas de produto de fármaco Iiofilizado eram incompatíveiscom seringas siliconizadas descartáveis, as quais são comumente usadaspara o preparo e administração dos produtos parenterais. Especificamente, asolução de produto de fármaco constituída desenvolvia partículas gelatino-sas semelhantes a filamentos quando armazenadas nessas seringas duran-te mais de 10-15 minutos. Outros estudos demonstraram que essa incompa-tibilidade era em virtude da interação do produto de fármaco com óleo desilicone (dimetil-siloxano), o qual é usado como um lubrificante nessas serin-gas. A formação dessas partículas não afeta a potência da solução de pro-duto de fármaco durante seu tempo de uso. Seringas sem silicone são, depreferência, utilizadas para constituição do produto de fármaco e transferên-cia das soluções constituídas do frasco para o saco intravenoso.

Alternativamente, um tensoativo pode ser adicionado à formula-ção para reduzir ou prevenir a interação do produto de fármaco constituídocom a seringa siliconizada, por exemplo, em uma quantidade suficiente domesmo.

A condição de armazenamento recomendada para uma formula-ção Iiofilizada é de 2-8 °C com uma vida útil recomendada de pelo menos 12meses.

Preparação da Formulação Liofilizada

O processo de fabricação do produto de fármaco Iiofilizado en-volve formação de lote da solução formulada bruta para liofilização, filtraçãoasséptica, enchimento em frascos, congelamento dos frascos em uma câ-mara de congelamento-secagem, seguido por liofilização, colocação de tam-pas e vedação.

Os Exemplos Ill e IV descrevem a fabricação dos produtos defármaco abatacept e CTLA4lg liofilizados, respectivamente.A solução bruta formulada é, tipicamente, ajustada em uma con-centração fixa de proteína, de modo que o volume desejado de enchimentodo frasco seja mantido constante. Durante a adição de lioprotetor, a veloci-dade do misturador é controlada a 250 ± 50 rpm, de modo a minimizar a es-pumação na solução de formação de lote e assegurar dissolução completado lioprotetor dentro de 10 a 20 minutos. A solução bruta formulada pode serarmazenada sob 2-8 0C ou temperatura ambiente e luz ambiente durantepelo menos 32 horas antes de liofilização.

A solução bruta formulada não é terminalmente esterilizada emvirtude da sensibilidade ao calor da molécula de CTLA4lg. A solução brutaformulada pode ser esterilizada usando dois filtros com grau de esterilizaçãoMillipore Millipak® de 0,22 μίτι em série antes de enchimento em frascos paraliofilização.

O ciclo de congelamento-secagem selecionado para esse produ-to é otimizado de forma a ter sublimação e evaporação suficientes duranteas fases primária e secundária de secagem, respectivamente, sem compro-meter a qualidade do produto.

Para auxiliar na dissolução rápida do pó Iiofilizado e impedir aformação de espuma excessiva durante constituição do produto de fármaco,os frascos Iiofilizados são tampados sob uma pressão de câmara de 500 ±100 mícrons ao final do ciclo de congelamento-secagem.

Aqueles habilitados na técnica estarão cientes da necessidadede encher o recipiente em excesso de modo a compensar perdas no frasco,agulha, seringa durante preparo e injeção. Por exemplo, cada frasco de pro-duto de fármaco abatacept, 250 mg/ml, contém um excesso de 5% do produ-to de fármaco para levar em conta perdas quando de reconstituição e extra-ção.

Formulação Subcutânea Líquida

Aqueles habilitados na técnica reconhecerão a inconveniênciade uma formulação IV para o paciente que precisa de terapia crônica fre-qüente. O paciente tem de fazer visitas freqüentes ao hospital para receberseu fármaco via uma infusão IV que pode durar tanto quanto uma hora.Conseqüentemente, uma formulação SC que pudesse ser auto-administradaem casa seria muito benéfica para tal paciente.

Para administração subcutânea, uma forma de dosagem comaltas concentrações de proteína é desejada. Tratamentos com altas dosesde mais de 1 mg/kg (>100 mg por dose) requerem desenvolvimento de for-mulações em concentrações excedendo a 100 mg/ml em virtude do pequenovolume (< 1,5 ml) que pode ser fornecido através de vias SC. De forma aotimizar a estabilidade a longo prazo em alta concentração contra a forma-ção de espécies de elevado peso molecular, estudos de desenvolvimento deformulação foram conduzidos para avaliar o efeito de vários excipientes so-bre a estabilidade em estado de solução das formulações SC líquidas dainvenção.

A formulação SC da invenção compreende a molécula de C-TLA4lg em uma concentração de proteína de pelo menos 100 mg/ml emcombinação com um açúcar em níveis de estabilização, de preferência emuma concentração de proteína de pelo menos 125 mg/ml em combinaçãocom um açúcar em níveis de estabilização, em um veículo aquoso. O açúcarestá, de preferência, em uma proporção em peso de proteína para açúcar depelo menos 1:1,1. O estabilizante é, de preferência, empregado em umaquantidade não maior do que aquela a qual pode resultar em uma viscosida-de indesejável ou inadequada para administração via uma seringa SC. Oaçúcar é, de preferência, dissacarídeos, mais preferivelmente sacarose. Aformulação SC também pode compreender um ou mais dos componentesselecionados da lista consistindo de agentes de tamponamento, tensoativose conservantes.

O perfil de estabilidade da formulação SC foi avaliado na pre-sença de vários estabilizantes, incluindo açúcares, polissacarídeos, aminoá-cidos, tensoativos, polímeros, ciclodextranas, proteínas, etc. Dentre todos osexcipientes avaliados, açúcares tais como sacarose, manitol e trealose, tive-ram um melhor efeito de estabilização contra a formação de espécies deelevado peso molecular.

Os Exemplos V e Vlll descrevem estudos de estabilidade doproduto de fármaco belatacept e abatacept SC, respectivamente, na presen-ça de sacarose armazenados em várias temperaturas durante vários perío-dos de tempo. Um aumento nas espécies de elevado peso molecular foi mo-nitorado usando um ensaio de cromatografia por exclusão de tamanho indi-cando estabilidade (SE-HPLC). Os resultados demonstram que a estabilida-de da molécula de CTLA4lg na formulação SC é intensificada na presençade sacarose. Estabilização através de sacarose foi melhor em uma maiorproporção em peso de sacarose:proteína. Baseado nesses estudos, sacaro-se foi selecionada com o estabilizante em uma proporção que fornece esta-bilidade ótima sem resultar em uma solução SC com hipertonicidade exces-siva.

A quantidade de sacarose útil para estabilização do produto defármaco SC está em uma proporção em peso de proteína para sacarose depelo menos 1:1, de preferência em uma proporção em peso de proteína parasacarose de 1:1,3 a 1:5, mais preferivelmente em uma proporção em pesode proteína para sacarose de cerca de 1:1,4.

Se necessário, o pH da formulação é ajustado através da adiçãode um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável. O ácido farmaceutica-mente aceitável preferido é ácido clorídrico. A base preferida é hidróxido desódio.

Durante desenvolvimento de formulação, a estabilidade do pro-duto de fármaco SC foi estudada como uma função do pH. O Exemplo Vdescreve estudos de estabilidade com o produto de fármaco belatacept SCcomo uma função do pH. O pH da formulação SC foi ajustado entre 7 e 8,2,amostras foram colocadas sob estabilidade e o produto de fármaco foi moni-torado com relação a um aumento nas espécies de elevado peso molecularem vários pontos de tempo usando um ensaio de cromatografia por exclusãode tamanho indicando estabilidade (SE-HPLC). Sob a condição de armaze-namento recomendada de 2-8 0C1 nenhuma alteração significativa na taxade formação de espécies de HMW foi observada após 3 meses.

Além de agregação, deamidação é uma variante de produto co-mum de peptídeos e proteínas que podem ocorrer durante fermentação, co-leta/clarificação de células, purificação, armazenamento de substância defármaco/produto de fármaco e durante análise de amostra. Deamidação é aperda de NH3 de uma proteína formando um intermediário de succinimidaque pode sofrer hidrólise. O intermediário de succinimida resulta em umadiminuição de 17 u na massa do peptídeo precursor. A subseqüente hidróli-se resulta em um aumento de 18 u na massa. Isolamento do intermediáriode succinimida é difícil em virtude da instabilidade sob condições aquosas.Como tal, a deamidação é, tipicamente, detectável como aumento de 1 u namassa. Deamidação de uma asparagina resulta em ácido aspártico ou iso- aspártico. Os parâmetros que afetam a taxa de deamidação incluem pH,temperatura, constante dielétrica do solvente, resistência iônica, seqüênciaprimária, conformação de polipeptídeo local e estrutura terciária. Os resíduosde aminoácido adjacentes à Asn na cadeia peptídica afetam as taxas de de-amidação. Gly e Ser após Asn em seqüências de proteína resultam em umamaior suscetibilidade à deamidação.

Estudos de estabilidade preliminares em escala de laboratóriosugerem que deamidação excederá os níveis de referência do método deteste de mapeamento de peptídeo a 24 meses usando a formulação SC deabatacept em um pH de 7,8. Os dados em seis meses sob 2-8 0C e 25 0Cem umidade de 60% mostraram que a taxa de deamidação era menor emum pH de 7,2 e maior em um pH de 8 quando comparado com a amostra SCde abatacept em um pH de 7,8. Os Exemplos IX e Xll descrevem estudos depH em escala de laboratório projetados para avaliar a deamidação de formu-lações de produto de fármaco SC na faixa de pH de 6 a 7,2.

A faixa de pH aceitável para o produto de fármaco SC é de 6 a8, de preferência 6 a 7,8, mais preferivelmente 6 a 7,2.

Em outro aspecto, os sais ou componentes do tampão podemser adicionados em uma quantidade de pelo menos 10 mM, de preferência10-200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis e sãoderivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos) com metaisou aminas de "formação de base". Além de tampões de fosfato, podem serusados tampões de glicinato, carbonato, citrato e semelhantes, caso no qualíons de sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-íons.

O Exemplo Vlll descreve o efeito da resistência do tampão sobreo produto de fármaco SC abatacept. A estabilidade foi melhor em tampão defosfato a 10 mM comparado com tampão de fosfato a 5 mM em um pH de7,5 em uma concentração de 100 mg/mL de produto de fármaco abatacept.Além disso, a melhor capacidade de tamponamento do tampão de fosfato a10 mM ofereceu melhor controle de pH da formulação comparado com tam-pão a 5 mM.

O veículo aquoso de interesse aqui é um o qual é farmaceutica-mente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um ser humano)e é útil para o preparo de uma formulação líquida. Veículos ilustrativos inclu-em água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BW-Fl), uma solução com pH tamponado (por exemplo, solução salina tampona-da com tampão), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de15 dextrose.

Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formula-ções aqui para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode,por exemplo, facilitar a produção de uma formulação para múltiplo uso (dosemúltipla).

Conforme discutido com o produto de fármaco liofilizado, a mo-lécula de CTLA4lg é incompatível com o silicone encontrado em seringaspadrões pelo fato de que ela interage com o silicone para formar partículasvisíveis, desse modo, limitando o paciente a utilizar seringas sem silicone. Aformulação SC pode opcionalmente compreender um tensoativo para preve-nir a formação de partículas visíveis na presença de silicone.

Os Exemplos V e Vlll descrevem o efeito de tensoativos, taiscomo Polisorbato 80 e Poloxamer 188, sobre a estabilidade de solução dosprodutos de fármaco belatacept e abatacept, respectivamente, e descobriu-se que tensoativos não têm um efeito sobre a estabilidade da molécula deCTLA4lg em uma formulação SC. Diferentes níveis de Poloxamer 188 foramavaliados e descobriu-se que a concentração de 4 mg/ml a 8 mg/ml, de pre-ferência 8 mg/ml, era adequada para prevenir a formação de partículas rela-cionadas ao silicone na formulação.

Uma composição típica de produto de fármaco SC abataceptSC, 125 mg/ml (100 mg/frasco) é proporcionada na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3

Composição de produto de fármaco SC belatacept, 125 mg/ml (100mg/frasco)

<table>table see original document page 38</column></row><table>

Inclui um excesso de 40% para perdas no frasco, agulha, seringaUma composição típica de produto de fármaco SC abataceptSC, 125 mg/ml (125 mg/frasco) é proporcionada na Tabela 4 abaixo.Tabela 4

<table>table see original document page 38</column></row><table>

Inclui um excesso de 40% para perdas no frasco, agulha, seringa

Uma composição típica de produto de fármaco SC abataceptSC, 125 mg/ml enchido em uma seringa é proporcionada na Tabela 5 abai-xo.Tabela 5

Composição de produto de fármaco SC abatacept, 125 mg/ml (125mg/seringa)

<table>table see original document page 39</column></row><table>

A condição de armazenamento recomendada para a formulaçãoSC é de 2-8 0C com uma vida útil recomendada de pelo menos 12 meses.

A densidade do produto de fármaco SC de abatacept e do pla-cebo equivalente foi determinada em temperatura ambiente usando o densi-tômetro Mettler-Toledo. As medições foram realizadas usando amostras de 5mL em triplicatas. Descobriu-se que a densidade da formulação SC de aba-tacept era de 1,1 g/cc e aquela do produto de placebo era de 1,065 g/cc.Tipicamente, a densidade de uma formulação SC de CTLA4lg é cerca de 1,0g/cc a cerca de 1,2 g/cc, de preferência cerca de 1,0 g/cc a cerca de 1,15g/cc, mais preferivelmente cerca de 1,095 g/cc a cerca de 1,105 g/cc.

A viscosidade da formulação SC de abatacept foi determinadausando o reômetro de Brookfield em temperatura ambiente. Um padrão dereferência de 9,3 cps foi usado para as medições. Descobriu-se que a visco-sidade do produto de fármaco SC em uma concentração de abatacept de125 mg/mL era de 13 ± 2 cps. Tipicamente, a viscosidade de uma formula-ção SC de CTLA4lg a 125 mg/mL é cerca de 9 a cerca de 20 cps, de prefe-rência cerca de 9 a cerca de 15 cps, mais preferivelmente 12 a cerca de 15cps.

A osmolaridade do produto de fármaco SC abatacept e formula-ção de placebo foi medida usando um método de pressão de vapor. Os da-dos mostram que em concentrações de 125 mg/mL, a osmolaridade da for-mulação SC de abatacept SC é de 770 ± 25 m0sm/kgH20. Tipicamente, aosmolaridade da formulação SC de CTLA4lg a 125 mg/mL é cerca de 250 acerca de 800 m0sm/kgH20, de preferência cerca de 700 a cerca de 800m0sm/kgH20, mais preferível mente cerca de 750 a cerca de 800m0sm/kgH20.

Preparação da Formulação SC

O processo de fabricação desenvolvido para formulações SCenvolve, tipicamente, composição com açúcar e tensoativo, seguido por fil-tração estéril asséptica e enchimento em frascos ou seringas, opcionalmenteprecedido por diafiltração (troca de tampão) e concentração da substânciade fármaco usando uma unidade de ultrafiltração.

Os Exemplos I e Il descrevem a fabricação dos produtos de fár-maco SC belatacept e abatacept, respectivamente.

Aqueles habilitados na técnica estarão cientes da necessidadede encher o recipiente em excesso de modo a compensar perdas no frasco,agulha, seringa durante preparo e injeção. Por exemplo, um excesso de 40%de produto de fármaco é incorporado em cada frasco da fórmula líquida SCpara levar em conta perdas por extração e assegurar que 0,8 ml da soluçãocontendo 100 mg do produto de fármaco belatacept possam ser extraídos dofrasco.

Formulação Líquida

Formulações IV podem ser a via de administração preferida paracasos em particular, tal como quando o paciente está no hospital após otransplante, recebendo todos os fármacos através da via IV. Aqueles habili-tados na técnica reconhecerão as desvantagens e riscos de uma formulaçãoIiofilizada para o fabricante e o profissional de saúde, respectivamente. Osriscos e vantagens para o profissional de saúde associados à reconstituiçãopodem incluir contaminação, espumação e perda de produto, bem como otempo requerido do profissional de saúde para preparar a formulação IV.

Adicionalmente, os custos para o fabricante em equipamento e tempo dosempregados podem ser diminuídos através de remoção da etapa de Iiofiliza-ção de um processo de fabricação. Todas essas razões são motivação sufi-ciente para projetar uma formulação líquida para uso IV.

A formulação líquida preferida para desenvolver seria uma for-mulação que pudesse imitar o produto de fármaco Iiofilizado após a primeiraconstituição para uma concentração de proteína de cerca de 25 mg/ml. Aformulação líquida adquirida seria, então, diluída para as concentrações deproduto de fármaco desejadas entre 1 e 10 mg/ml com cloreto de sódio a0,9% para injeção, USP, por um profissional de saúde no momento de uso.O produto de fármaco diluído para injeção é isotônico e adequado para ad-ministração através de infusão intravenosa.

Conforme discutido acima, a estabilidade a longo prazo de for-mulações líquidas é um problema para produtos de fármaco de proteína. Demodo a confirmar a estabilidade a longo prazo de uma solução contra a for-mação de espécies de elevado peso molecular, estudos de desenvolvimentode formulação foram conduzidos para avaliar a estabilidade em estado desolução da formulação líquida da invenção.

A formulação líquida da invenção compreende a molécula deCTLA4lg em uma concentração de proteína de pelo menos 20 mg/ml emcombinação com um açúcar em níveis de estabilização, de preferência pelomenos 25 mg/ml em combinação com um açúcar em um nível de estabiliza-ção em um veículo aquoso. De preferência, o açúcar está em uma propor-ção em peso de proteína para açúcar de pelo menos 1:1. O açúcar é, depreferência, dissacarídeos, mais preferivelmente sacarose. A formulaçãolíquida também pode compreender um ou mais dos componentes seleciona-dos da lista consistindo de agentes de tamponamento, tensoativos e conser-va ntes.

A quantidade de sacarose útil para estabilização do produto defármaco líquido está em uma proporção em peso de proteína para sacarosede pelo menos 1:1, de preferência em uma proporção em peso de proteínapara sacarose de 1:2 a 1:10, mais preferivelmente em uma proporção empeso de proteína para sacarose de 1:2.

Se necessário, o pH da formulação é ajustado através da adiçãode um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável. O ácido farmaceutica-mente aceitável preferido é ácido clorídrico. A base preferida é hidróxido desódio.Durante o desenvolvimento da formulação, a estabilidade doproduto de fármaco líquido foi estudada em um pH alvo de 7,5. O ExemploVll descreve estudos de estabilidade com o produto de fármaco belataceptlíquido, em um pH de 7,5. O pH da formulação líquida foi ajustado para 7,5.

Amostras foram colocadas sobestabilidade e o produto de fármaco foi moni-torado com relação a um aumento nas espécies de elevado peso molecularem vários pontos de tempo usando um ensaio de cromatografia por exclusãode tamanho indicando estabilidade (SE-HPLC). Sob a condição de armaze-namento recomendada de 2-8°C, nenhuma alteração significativa na taxade formação de espécies de HMW foi observada.

Além disso, agregação, deamidação e fragmentação são varian-tes de produto de peptídeos e proteínas que podem ocorrer durante fermen-tação, coleta/clarificação de células, purificação, armazenamento de subs-tância de fármaco/produto de fármaco e durante análise de amostra. Estu-dos de estabilidade preliminares em escala de laboratório sugerem que adeamidação excederá os níveis de referência do método de teste de mape-amento de peptídeo (se elevará acima do máximo de 5% de T26a ou T26b(%T30)) e que a fragmentação excederá os níveis de referência para o mé-todo de teste por SDS-PAGE (cai abaixo do mínimo da principal banda de96%) em 24 meses usando o belatacept (20 mg/ml em um pH de 7,5) arma-zenado a 2°-8°C. Dados de formulações líquidas (veja dados de SC acima)mostram que a taxa de deamidação encontrada nas formulações da inven-ção diminui à medida que o pH das formulações é diminuído.

A faixa de pH aceitável para o produto de fármaco líquido é de 6a 8, de preferência 6 a 7,8, mais preferivelmente 6 a 7,2.

Em outro aspecto, os sais ou componentes do tampão podemser adicionados em uma quantidade de pelo menos cerca de 10 mM, de pre-ferência 10-200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitá-veis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos orgânicos)com metais ou aminas de "formação de base". Além de tampões de fosfato,podem ser usados tampões de glicinato, carbonato, citrato e semelhantes,caso no qual íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-íons.

O veículo aquoso de interesse aqui é um o qual é farmaceutica-mente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um ser humano)e é útil para o preparo de uma formulação líquida. Veículos ilustrativos inclu-em água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BW-Fl), uma solução com pH tamponado (por exemplo, solução salina tampona-da com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dex-trose.

Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formula- ções aqui para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode,por exemplo, facilitar a produção de uma formulação para múltiplo uso (múl-tiplas doses).

Conforme discutido com o produto de fármaco liofilizado, a mo-lécula de CTLA4lg é incompatível com o silicone encontrado em seringas padrões pelo fato de que ela interage com o silicone para formar partículasvisíveis, desse modo, limitando o profissional de saúde a utilizar seringassem silicone. A formulação líquida pode, opcionalmente, compreender umtensoativo para prevenir a formação de partículas visíveis na presença desilicone.

Uma composição típica de produto de fármaco líquido belata-cept, 20 mg/ml (250 mg/frasco), é proporcionada na Tabela 6 abaixo.

Tabela 6

Composição de produto de fármaco líquido belatacept, 20 mg/ml (250mg/frasco)

<table>table see original document page 43</column></row><table>a Inclui um excesso de 4% para perdas no frasco, agulha e seringa

A condição de armazenamento recomendada para a formulaçãolíquida é de 2-8 °C, com uma vida útil recomendada de pelo menos 12 me-ses.

Preparo da Formulação Líquida

O processo de fabricação de produto de fármaco líquido envol-ve, tipicamente, composição com anticorpo e opcionalmente tensoativo, se-guido por filtração asséptica e enchimento em frascos, vedação e tampar.

A solução bruta formulada é, tipicamente, colocada em umaconcentração fixa de proteína, de modo que o volume de enchimento dese-jado do frasco possa ser mantido constante. Durante a adição de açúcar àsubstância de fármaco, a velocidade do misturador é controlada a 250 ± 50rpm de modo a minimizar a espumação na solução de formação de lote eassegurar dissolução completa do açúcar dentro de 10 a 20 minutos. A solu-ção bruta formulada pode ser armazenada sob 2-8 0C ou temperatura ambi-ente luz ambiente durante pelo menos 24 horas antes de enchimento.

A solução bruta não é terminalmente esterilizada em virtude dasensibilidade ao calor da molécula de CTLA4lg. A solução bruta pode seresterilizada usando dois filtros de grau para esterilização Millipore Millipak®de 0,22 μm em série antes de enchimento em frascos.

Aqueles habilitados na técnica estarão cientes da necessidadede encher o recipiente em excesso de modo a compensar perdas no frasco,agulha, seringa durante preparo e injeção. Por exemplo, cada frasco de pro-duto de fármaco belatacept, 20 mg/mL (250 mg/frasco), contém um excessode 4% do produto de fármaco para levar em conta perdas quando de recons-tituição e extração.Artigos de Manufatura Em outra modalidade d antígeno, um artigo de manufatura éproporcionado o qual contém o produto de fármaco e, de preferência, pro-porciona instruções para seu uso. O artigo de manufatura compreende umrecipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos,seringas e tubos de ensaio. O recipiente pode ser formado de uma varieda-de de materiais, tais como vidro, plástico ou metais.

O recipiente contém as formulações Iiofilizadas ou líquidas. Orótulo sobre ou associado ao recipiente pode indicar orientações para re-constituição e/ou uso. Por exemplo, o rótulo pode indicar que 25 mg/ml deproduto de fármaco belatacept têm de ser diluídos para as concentrações deproteína, conforme descrito acima. O rótulo pode ainda indicar que a formu-lação SC é útil ou destinada à administração subcutânea. O recipiente quecontém a formulação pode ser um frasco de uso múltiplo, o qual permiteadministrações repetidas (por exemplo, de 2-6 administrações), por exem-pio, da formulação subcutânea. Alternativamente, o recipiente pode ser umaseringa pré-enchida contendo, por exemplo, a formulação subcutânea.

O artigo de manufatura pode ainda compreender um segundorecipiente compreendendo, por exemplo, um veículo adequado para a for-mulação liofilizada.

O artigo de manufatura pode ainda incluir outros materiais dese-jáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões,diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas de embalagem com instruçõespara uso.

Seringas sem silicone são, de preferência, utilizadas para umproduto de fármaco sem tensoativo, tal como quando de reconstituição doproduto de fármaco Iiofilizado e/ou transferência das soluções do frasco aosaco intravenoso e podem ser co-embaladas com o frasco com produto defármaco.

Métodos de Uso

A presente invenção ainda proporciona métodos para tratamentode doenças do sistema imune ou indução de tolerância compreendendo ad-ministração de uma quantidade eficaz das formulações de molécula de C-TLA4lg da invenção. Em modalidades particulares, as doenças do sistemaimune são mediadas por interações de células CD28- e/ou CTLA4-positivascom células CD80/CD86-positivas. Em uma outra modalidade, interações decélulas T são inibidas. Doenças do sistema imune incluem, mas não estãolimitadas a, doenças autoimunes, doenças imunoproliferativas e distúrbiosenxerto-relacionados. Esses métodos compreendem administração, a umindivíduo, as formulações de molécula de CTLA4lg da invenção para regularinterações de células T com as células CD80- e/ou CD86-positivas. Exem-plos de doenças enxerto-relacionadas incluem doença enxerto versus hos-pedeiro (GVHD) (por exemplo, tal como pode resultar de transplante de me-dula óssea ou na indução de tolerância), distúrbios imunes associados à re-jeição a transplante de enxerto, rejeição crônica e alo- ou xenoenxertos decélulas ou tecido, incluindo órgãos sólidos, pele, ilhotas, músculos, hepatóci-tos, neurônios. Exemplos de doenças imunoproliferativas incluem, mas nãoestão limitados a, psoríase; Iinfoma de células T; leucemia linfoblástica agu-da de células T; Iinfoma de células T angiocêntrica testicular; angiíte linfocíti-ca benigna; e doenças autoimunes, tais como Iupus (por exemplo, Iupus eri-tematoso, nefrite por lupus), tiroidite de Hashimoto, mixedema primário, do-ença de Grave, anemia perniciosa, gastrite atrófica autoimune, doença deAddison, diabetes (por exemplo, diabetes mellitus dependente de insulina,diabetes mellitus do tipo I), síndrome de Good Pasture, miastenia gravis,pênfigo, doença de Crohn, oftalmia simpatética, uveíte autoimune, esclerosemúltipla, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia idiopática, cirrosebiliar primária, hepatite de ação crônica, colite ulcerativa, síndrome de Sjo-gren, doenças reumáticas (por exemplo, artrite reumatóide), polimiosite, es-cleroderma e doenças mistas do tecido conectivo.

A presente invenção ainda proporciona um método para inibiçãode rejeições a transplante de tecido e/ou órgão sólido por um indivíduo, oindivíduo sendo um recipiente de um tecido transplantado. Tipicamente, emtransplantes dè tecido, rejeição do enxerto é iniciada através de seu reco-nhecimento como estranho por células T1 seguido por uma resposta imuneque destrói o enxerto. As formulações de molécula de CTLA4lg da presenteinvenção, através de inibição da proliferação de linfócitos T e/ou secreção decitocina, podem resultar em destruição tecidual reduzida e indução de nãoresponsividade de células T antígeno-específicas pode resultar em aceitaçãodo enxerto a longo prazo sem a necessidade de imunossupressão generali-zada. Além disso, as formulações de molécula de CTLA4lg da invenção po-dem ser administradas com outros produtos farmacêuticos incluindo, masnão limitado a, corticosteróides, ciclosporina, rapamicina, micofenolato mofe-til, azatioprina, tacrolismus, basiliximab e/ou outros produtos biológicos.

A presente invenção também proporciona métodos para inibiçãode doença enxerto versus hospedeiro em um indivíduo. Esse método com-preende administração, ao indivíduo, das formulações da invenção, sozinhasou junto com outros Iigantes adicionais, reativas com IL-2, IL-4 ou γ-interferon. Por exemplo, a formulação SC de molécula de CTLA4lg da pre-sente invenção pode ser administrada a um recipiente de transplante de me-dula óssea para inibir a alo-reatividade de células T do doador. Alternativa-mente, células T do doador dentro do enxerto de medula óssea podem sertornadas tolerantes aos alo-antígenos do hospedeiro ex vivo antes de trans-plante.

Inibição de respostas de células T pelas formulações de molécu-la de CTLA4lg da invenção pode ser útil para o tratamento de distúrbios au-toimunes. Muitos distúrbios autoimunes resultam de ativação inapropriadade células T que são reativas contra auto-antígenos e as quais promovem aprodução de citocinas e auto-anticorpos que estão envolvidos na patologiada doença. A administração da formulação de-molécula de CTLA4lg em umindivíduo sofrendo de ou suscetível a um distúrbio autoimune pode prevenira ativação de células T auto-reativas e pode reduzir ou eliminar sintomas dadoença. Esse método pode também compreender administração, ao indiví-duo, de uma formulação da invenção, sozinha ou junto com outros Iigantesadicionais, reativos com IL-2, IL-4 ou γ-interferon.

O modo de administração e regime de dosagem mais eficazespara as formulações da invenção dependem da gravidade e curso da doen-ça, da saúde do paciente e resposta ao tratamento e do julgamento do mé-dico que faz o tratamento. De acordo com a prática da invenção, uma quan-tidade eficaz para tratamento de um indivíduo pode estar entre cerca de 0,1e cerca de 10 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Também, a quantidadeeficaz pode ser uma quantidade entre cerca de 1 e cerca de 10 mg/kg depeso corporal do indivíduo.As formulações de molécula de CTLA4lg da invenção podem seradministradas a um indivíduo em uma quantidade e durante um tempo (porexemplo, extensão de tempo e/ou múltiplas vezes) suficientes para impedirque moléculas de B7 endógenas (por exemplo, CD80 e/ou CD86) se liguema seus respectivos Iigantes no indivíduo, bloqueio da ligação de B7 endóge-na/ligante, desse modo, inibe as interações entre células B7-positivas (porexemplo, células CD80- e/ou CD86-positivas) com células CD28- e/ou C-TLA4-positivas. A dosagem da molécula de CTLA4lg é dependente de mui-tos fatores incluindo, mas não limitado a, o tipo de tecido afetado, o tipo dadoença que está sendo tratada, a gravidade da doença, a saúde do indiví-duo e a resposta do indivíduo ao tratamento com os agentes. Conseqüente-mente, as dosagens dos agentes podem variar dependendo do indivíduo edo modo de administração. A Publicação pedido de patente US Número US2003/0083246 e Publicação de pedido de patente US Número US2004/0022787 ensinam a dosagem e esquemas de administração para C-TLA4lg tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 2 paratratamento de doenças reumáticas, tal como artrite reumatóide. Todas sãoincorporadas aqui por referência.

Uma quantidade eficaz de molécula de CTLA4lg pode ser admi-nistrada a um indivíduo diariamente, semanalmente, mensalmente e/ou anu-almente, em uma única ou múltiplas vezes por hora/dia/semana/mês/ano,dependendo da necessidade. Por exemplo, em uma modalidade, uma quan-tidade eficaz da molécula de CTLA4lg pode ser inicialmente administradauma vez a cada duas semanas durante um mês e, então, uma vez por mêsdepois.

Uma quantidade eficaz de molécula de CTLA4lg é uma quanti-dade de cerca de 0,1 a 100 mg/kg de peso de um indivíduo. Em outra moda-lidade, a quantidade eficaz é uma quantidade de cerca de 0,1 a 20 mg/kg depeso de um indivíduo. Em uma modalidade específica, a quantidade eficazde CTLA4lg é cerca de 2 mg/kg de peso de um indivíduo. Em outra modali-dade específica, a quantidade eficaz de CTLA4lg é cerca de 10 mg/kg depeso de um indivíduo. Em outra modalidade específica, uma quantidade efi-caz de CTLA4lg é 500 mg para um indivíduo pesando menos de 60 kg, 750mg para um indivíduo pesando entre 60-100 kg e 1000 mg para um indivíduopesando mais de 100 kg.

O pedido de patente US número de série 60/668.774, deposita-"do em 6 de Abril de 2005 e o pedido de patente US número de série11/399.666, depositado em 6 de Abril de 2006, ensinam a dosagem e es-quema de administração para LEA29Ylg tendo a seqüência de aminoácidomostrada em SEQ ID NO: 4 para tratamento de distúrbios imunes associa-dos a transplante de enxerto. Todos são incorporados aqui por referência.

Tipicamente, doses da formulação de molécula de CTLA4lg dainvenção são baseadas no peso corporal e regimes de administração podemser orientados pelos perfis séricos alvo. Tipicamente, uma concentração sé-rica alvo de moléculas de LEA29Ylg da invenção de entre cerca de 3 μg/mLe cerca de 30 μg/mL durante os primeiros 3 a 6 meses pós-transplante serásuficiente para manter a função do aloenxerto, de preferência entre cerca de5 μg/mL e cerca de 20 μg/mL. Tipicamente, a concentração sérica alvo demoléculas de LEA29Ylg da invenção durante a fase de manutenção estáentre cerca de 0,2 μg/mL e cerca de 3 μg/mL, de preferência entre cerca de0,25 μg/mL e cerca de 2,5 μg/mL.

As moléculas de LEA29Ylg da invenção podem ser administra-

das em uma quantidade entre cerca de 0,1 a cerca de 20,0 mg/kg de pesodo paciente, tipicamente entre cerca de 1,0 a cerca de 15,0 mg/kg. Por e-xemplo, L104EA29Ylg pode ser administrada a 10 mg/kg de peso do pacien-te durante a fase inicial, o período de alto risco que segue ao transplante, ediminuída para 5 mg/kg de peso do paciente para uma dosagem de manu-tenção.

A administração das moléculas de CTLA4Ig da invenção podeser via uma infusão intravenosa de 30 minutos a uma ou mais horas. Alter-nativamente, uma única ou múltiplas injeções subcutâneas podem distribuira dosagem requerida. Tipicamente, uma infusão intravenosa de 30 minutosé a via de administração utilizada durante a fase inicial de tratamento, en-quanto o paciente está no hospital e/ou fazendo visitas esquematizadas aoprofissional de saúde para monitoramento. A injeção subcutânea é o modode administração típico utilizado durante a fase de manutenção, desse mo-do, permitindo que o paciente retorne ao seu esquema normal diminuindo asvisitas ao profissional de saúde para infusões intravenosas.

O Exemplo 10 descreve a farmacocinética da formulação IV Iiofi-lizada de CTLA4lg em indivíduos saudáveis e pacientes com artrite reuma-tóide (RA). A farmacocinética de abatacept em pacientes com RA e indiví-duos saudáveis parecia ser comparável. Em pacientes com RA1 após múlti-plas infusões intravenosas, a farmacocinética do abatacept mostrou aumen-tos proporcionais de Cmax e AUC sobre a faixa de dose de 2 mg/kg a 10mg/kg. A 10 mg/kg, a concentração no soro pareceu atingir um estado uni-forme em torno do dia 60, com uma concentração sérica média (faixa) de 24mcg/mL (de cerca de 1 a cerca de 66 mcg/mL). Nenhum acúmulo de abata-cept ocorreu quando de tratamento repetido contínuo com 10 mg/kg em in-tervalos mensais em pacientes com RA.

A invenção será mais completamente compreendida através dereferência aos exemplos a seguir. Eles não deverão, contudo, ser construí-dos como limitando o escopo da invenção. Todas as citações no decorrer dadivulgação são aqui-expressamente incorporadas por referência.

Exemplo I

Produto de fármaco belatacept SC, 125 mg/ml (100 mg/frasco) éformulado em uma solução estéril, não pirogênica, pronta para uso adequa-da para administração subcutânea.

O produto de fármaco SC belatacept, 125 mg/ml (100 mg/frasco)é fabricado em uma escala de 2,2 kg (1500 frascos). A fórmula de lote é for-necida na Tabela 7 abaixo.Tabela 7

Fórmula de lote representativa

<table>table see original document page 50</column></row><table><table>table see original document page 51</column></row><table>

a Tamanho total do lote de 2,2 kg (2-L). A densidade da solução é de 1,10g/ml (a 20°-25°C).

b Substância de fármaco belatacept: concentração de proteína de 25 mg/ml,fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 10 mM, pH de 7,5, <5% de es-pécies de HMW

O processo de fabricação para produto de fármaco SC belatacept,125 mg/ml (100 mg/frasco) envolve troca de tampão da substância de fárma-co bruta de tampão de fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 10 mMem um pH de 7,5 para tampão de fosfato de sódio a 10 mM, pH de 7,5, segui-do por concentração da proteína de ~25 mg/ml para -150 mg/ml através deremoção do tampão. A troca de tampão é realizada através de diafiltraçãocinco vezes da substância de fármaco bruta contra o novo tampão de fosfatode sódio a 10 mM, pH de 7,5, seguido por concentração de proteína para~150 mg/ml através de remoção do tampão. Um contentor de mini filtro Pelli-con de aço inoxidável (MiIIipore) é equipado com calibradores de pressão deaço inoxidável e válvulas com membrana sobre os orifícios de alimentação,retentado e permeados. Dois cassetes de filtração usados com o mini móduloPellicon são adaptados com uma membrana de poliéter sulfona Biomax comárea de 0,1 m2 com um limite de corte de peso molecular nominal de 30 kDa.Os cassetes de filtração são instalados de acordo com as recomendações dofabricante. O recipiente de alimentação para a substância de fármaco é umrecipiente de vidro de 4 litros com barra de agitação magnética. Tubulação desilicone de alto desempenho MasterFIex é usada para conectar o recipientede alimentação ao contentor de filtro e para a tubulação de permeado. O fluxode alimentação é proporcionado através de uma bomba peristáltica instaladana tubulação de alimentação. Sacarose e Poloxamer 188 são, então, dissolvi-dos na solução de proteína concentrada e o peso do lote final é ajustado comtampão de fosfato de sódio a 10 mM, pH de 7,5. A solução bruta é filtrada a-través de um filtro de esterilização de 0,22 mícrons e enchida em frascos devidro de sílex do Tipo I de 5 cc despirogenados e esterilizados, tampada comrolhas de borracha de 20 mm e vedada com vedações flip-off de alumínio de20 mm. A composição de produto de fármaco SC belatacept, 125 mg/ml (100mg/frasco) é proporcionada na Tabela 8 abaixo.

Tabela 8

Composição de produto de fármaco SC belatacept, 125 mg/ml (100mg/frasco)

<table>table see original document page 52</column></row><table>

Inclui excesso de 40% para perda no frasco, agulha e seringa

Exemplo II

Produto de fármaco abatacept SC, 125 mg/ml (125 mg/frasco) éformulado como uma solução estéril, não pirogênica pronta para uso ade-quada para administração subcutânea. Um lote de produto de fármaco aba-tacept SC, 125 mg/ml (125 mg/frasco) é fabricado em uma escala de 5-L(3.500 frascos). A fórmula do lote é descrita na Tabela 9 abaixo.Tabela 9

Fórmula de lote

<table>table see original document page 52</column></row><table>a Substância de fármaco abatacept: concentração de proteína de 50 mg/ml,fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 50 mM, pH de 7,5, <5% de es-pécies de HMW

conforme descrito acima no Exemplo I, o processo de fabricaçãopara do produto de fármaco abatacept SC, 125 mg/ml (125 mg/frasco) en-volve troca de tampão da substância de fármaco bruta de fosfato de sódio a25 mM, cloreto de sódio a 50 mM em um pH de 7,5 para tampão de fosfatode sódio a 10 mM, pH de 7,8, seguido por concentração de proteína de -50mg/ml para -150 mg/ml através de remoção do tampão. Sacarose e Polo-xamer 188 são, então, dissolvidos na solução de proteína concentrada e opeso final do lote é ajustado com tampão de fosfato de sódio a 10 mM, pHde 7,8. A solução bruta é filtrada através de um filtro de esterilização a 0,22mícrons e enchida em frascos de vidro de sílex do Tipo I de 5 cc esterilizadoe despirogenado, tampada com rolhas de borracha de 20 mm e vedada comvedações flip-off de alumínio de 20 mm.

A composição do produto de fármaco abatacept, 125 mg/ml (125mg/frasco) é proporcionada na Tabela 10 abaixo.

Tabela 10Composição de produto de fármaco abatacept SC, 125 mg/ml (125mg/frasco)

<table>table see original document page 53</column></row><table>

d Inclui um excesso de 40% para perda no frasco, agulha, seringa

Exemplo Ill

Produto de fármaco abatacept, Iiofilizado (250 mg/frasco) é umIiofilizado estéril não pirogênico adequado para administração intravenosa(IV). Cada frasco de uso único contém 250 mg de abatacept, o qual é re-constituído com água estéril para injeção, USP e ainda diluída com cloretode sódio a 0,9% para injeção,USP1 no momento de uso.

A fórmula de lote para um tamanho de lote de 115 litros é descri-ta na Tabela 11 abaixo.

Tabela 11

Fórmula de lote

<table>table see original document page 54</column></row><table>

a Substância de fármaco abatacept: concentração de proteína de 50 mg/ml,fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 50 mM, pH de 7,5, <5% de es-pécies de HMW

b Densidade da solução bruta formulada = aprox. 1,04 g/ml

A quantidade requerida de substância de fármaco abatacept éadicionada a um vaso de composição de aço inoxidável esterilizado e limpoequipado com um misturador. A solução de substância de fármaco é mistu-rada a 250 ± 50 rpm enquanto se mantém a temperatura da solução entre 5-25°C.

A quantidade requerida de pó de monohidrato de maltose é adi-cionada ao vaso de composição. A solução é misturada durante um mínimode 10 minutos a 15-25°C.

O pH da solução é ajustado para 7,3-7,7, se necessário usandoa solução de hidróxido de sódio a 1N previamente preparada ou solução deácido clorídrico a 1 Ν. O lote é levado para o peso final de lote (q.s. final) u-sando água para injeção, USP e misturado durante um mínimo de 8 minutos.A solução de formulação bruta é coletada para pH.

A solução bruta formulada após o filtro de 0,45 μιη é coletada para bio-cargae endotoxina bacteriana (BET).A solução bruta formulada pré-filtrada é filtrada estéril com doisfiltros de 0,22 μιτι em série antes de enchimento.

A solução bruta formulada filtrada estéril é enchida e parcialmen-te tampada com uma rolha de butila cinza Daikyo de 20 nm através de umamáquina de tampar/enchimento totalmente automática. Os frascos de vidrocom tubulação de sílex do Tipo I de 15 cc são lavados e esteriliza-dos/despirogenados.

Os frascos com produto de fármaco enchidos e parcialmentetampados são liofilizados. Um resumo do ciclo de secagem por congelamen-to usado durante liofilização do produto de fármaco abatacept é proporcio-nado na Tabela 12 abaixo.

Tabela 12

Ciclo de secagem por congelamento para produto de fármaco abatacept Iiofi-lizado

<table>table see original document page 55</column></row><table>

Ao final do ciclo de liofilização, a pressão da câmara é elevadapara 500 mícrons usando nitrogênio filtrado estéril e fechamento do frasco érealizado sob vácuo. Os frascos tampados permanecem dentro do Iiofilizadordurante pelo menos 4 horas. Os frascos Iiofilizados e tampados são vedadoscom uma vedação fíip-off branca de alumínio de 20 mm sob ar filtrado emHEPA pela máquina de tampar. Os frascos vedados são enxaguados comágua desionizada por um lavador de frasco exterior. Os frascos com produtode fármaco lavados são armazenados a 2 a 8 0C.

A composição do produto de fármaco abatacept Iiofilizado (250mg/frasco) é listada na Tabela 13 abaixo.

Tabela 13

Composição de produto de fármaco abatacept Iiofilizado (250 mg/frasco)

<table>table see original document page 56</column></row><table>

aInclui um excesso de 5% para perda no frasco, agulha e seringabEsses componentes estão presentes na solução de substância de fármacoabatacept

Exemplo IV

Produto de fármaco belatacept, Iiofilizado (100 mg/frasco), é umIiofilizado não pirogênico estéril adequado para administração intravenosa(IV). Cada frasco para uso único contém 100 mg de belatacept constituídocom 4,2 ml de água estéril para injeção, USP para proporcionar uma con-centração de 25 mg/ml. Ela pode ser ainda diluída para uma concentraçãotão baixa quanto 1 mg/ml com Dextrose a 5% para injeção, USP ou cloretode sódio a 0,9% para injeção, USP no momento de uso.

O tamanho de lote para fabricação do produto de fármaco podevariar de 20 litros a 120 litro. Uma fórmula de lote representativa para umtamanho de lote de 66 litros (12.000 frascos) é proporcionada na Tabela 14abaixo.Tabela 14

Fórmula do lote para um tamanho de lote de 66 litros (12.000 frascos)

<table>table see original document page 57</column></row><table>

a Substância de fármaco belatacept: concentração de proteína de 25 mg/ml,fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 10 mM, pH de 7,5, <5% de es-pécies de HMW

O produto de fármaco Iiofilizado belatacept é fabricado conformedescrito no Exemplo Ill acima.

A composição do produto de fármaco belatacept liofilizado, 100mg/frasco, é listada na Tabela 15 abaixo.Tabela 15

Composição de produto de fármaco belatacept liofilizado a 100 mg/frasco<table>table see original document page 57</column></row><table>a Cada frasco contém um excesso de 10% para contenção em frasco, agulhae seringa da solução reconstituídaExemplo V

Estudos de estabilidade da formulação líquida SC de produto defármaco belatacept foram conduzidos colocando as formulações sob estabi-lidade em diferentes temperaturas e durante vários períodos de tempo.Efeito de SacaroseEstudos de desenvolvimento de formulação foram conduzidospara avaliar o efeito de vários níveis de sacarose sobre a estabilidade desolução do produto de fármaco belatacept. As amostras foram colocadassob estabilidade em condições de -70 0C, 8 0C e 25 °C/umidade de 60% e monitoradas em vários pontos de tempo. As proporções de proteína parasacarose avaliadas foram de 1:1, 1:1,7 e 1:1,75. A formação de espécies deelevado peso molecular (HMW) de belatacept foi utilizada para determinar aestabilidade de proteína em solução. Os resultados são mostrados na Tabe-la 16 abaixo.

Tabela 16

Efeito de vários níveis de sacarose sobre o produto de fármaco belatacept a100 mg/ml

<table>table see original document page 58</column></row><table>

a Produto de fármaco belatacept em tampão de fosfato de sódio a 10mM,100 mg/ml, pH de 7,5

Os resultados dos estudos mostraram que aumento da propor-ção de sacarose para proteína melhorou a estabilidade da proteína. Umaproporção de proteína para sacarose de 1:1,36 (peso/peso) foi escolhidapara o desenvolvimento da solução SC porque ela proporciona estabilidadeótima sem resultar em produto de fármaco com hipertonicidade excessiva.Efeito de tensoativos

O efeito de vários tensoativos em produtos comercializados, taiscomo Polisorbato 80 e Poloxamer 188, sobre a estabilidade de solução doproduto de fármaco belatacept foi avaliado. Poloxamer 188 foi avaliado emníveis de 4, 6 e 8 mg/ml e Polisorbato 80 foi avaliado a 1 e 2 mg/ml de con-centração final da formulação. As amostras foram colocadas sob estabilida-de em condições de -70°C , 8°C e 25°C/umidade de 60% e monitoradas emvários pontos de tempo. Os resultados são mostrados na Tabela 17 abaixo.

Tabela 17

Efeito de vários níveis e tipos de tensoativo sobre o produto de fármaco be-latacept (100 mg/ml)

<table>table see original document page 59</column></row><table>

a proteína:sacarose (1:1,7), 100 mg/ml, pH de 7,5

Os resultados do efeito de tensoativos sugeriram que o tensoati-vo não tem um efeito significativo sobre a estabilidade da solução de produtode fármaco belatacept. Dentre os níveis de Poloxamer 188 avaliados, des-cobriu-se que a concentração de 8 mg/ml era adequada para prevenir a for-mação de partículas relacionadas ao silicone na formulação.Efeito do pH

A estabilidade do produto de fármaco Belatacept SC1 (125mg/ml, proteína:sacarose a 1:1,36, 8 mg/ml de Pluronic F68) foi avaliadacomo uma função do pH. O pH da solução foi ajustado para entre 7 a 8,2com hidróxido de sódio a 1N ou ácido clorídrico a 1N. As amostras foramcolocadas sob condições de estabilidade a 2-8 0C e 25 °C/RH de 60% e mo-nitoradas em vários pontos de tempo. Testagem analítica incluía pH e SE-HPLC para monitorar o aumento nas espécies de elevado peso molecular(HMW). Esses resultados são resumidos na Tabela 18 abaixo.

Tabela 18

Efeito do pH sobre o produto de fármaco SC belatacept*

<table>table see original document page 60</column></row><table>

* Proteína:sacarose (1:1,36), 125 mg/ml, + 8 mg/ml de Pluronic F68

Nenhuma alteração significativa na taxa de formação de espé-cies de HMW foi observada sob a condição de armazenamento recomenda-da de 2-8 °C. Adicionalmente, os dados de estabilidade de solução mostra-ram que o pH para estabilidade máxima estava entre 7 e 8. Baseado nisso,uma faixa de pH de 7-8 com um pH alvo de 7,5 foi selecionada para essaformulação.Osmolaridade

A osmolaridade das soluções de produto de fármaco em váriostampões, em diferentes concentrações de proteína e das etapas distintas doprocesso de formulação foi medida usando um método de pressão de vapor.Esses resultados são resumidos na Tabela 19 abaixo.

Tabela 19

Determinação de osmolaridade da solução de produto de fármaco belataceptem vários tampões e concentrações

<table>table see original document page 61</column></row><table>

Efeito de Agitação

O efeito de agitação sobre a estabilidade de solução do produtode fármaco SC belatacept em uma concentração de 100 mg/ml e 125 mg/mlfoi determinado. Alíquotas da solução contendo aproximadamente 1 ml emfrascos com tubulação de 5 cc foram agitadas na velocidade 3 de um agita-dor com braço biônico a 2-8 °C. A temperatura do agitador foi mantida a 2-8°C colocando o agitador na sala fria. As amostras foram extraídas em inter-valos de tempo aproximados e ensaiados com relação ao pH e aparênciavisual e, ao mesmo tempo, as amostras também foram avaliadas com rela-ção à bioatividade após 30 dias de agitação.

As amostras agitadas em uma concentração de 100 mg/ml e 125mg/ml durante até 30 dias não mostram alteração no nível de espécies deHMW1 em perfil de SDS-PAGE, mapeamento de planta, ensaio B7 Binding1pH, aparência ou concentração de proteína quando agitadas a 2-8 0C.Efeito de múltiplos conqelamentos/desconqelamentos

O efeito de múltiplos congelamentos e descongelamentos daformulação de produto do substituição SC belatacept foi investigado em a-mostras com pH oscilando de 7,0 a 8,2. Alíquotas de aproximadamente 10 μΙde formulação de produto de fármaco SC belatacept (125 mg/ml) em um pHde 7,0, 7,4, 7,8 e 8,2 foram distribuídas em recipientes de PETG Nalgene de30 ml. Múltiplos congelamentos e descongelamentos foram realizados atra-vés de armazenamento em frascos a -70 0C, seguido por descongelamentoem temperatura ambiente (25 0C) durante 10 minutos. Esse ciclo foi repetidodurante 5 dias. Os conteúdos dos frascos foram analisados com relação aopH, % de espécies de HMW e aparência após cada ciclo de congelamen-to/descongelamento.

Nenhuma alteração no pH, aparência ou teor % de espécies deelevado peso molecular foi observada em amostras durante cinco ciclos decongelamento/descongelamento.

Condições de armazenamento recomendada

A condição de armazenamento recomendada para o produto defármaco SC belatacept, 100 mg/frasco (125 mg/ml) é 2-8 0C com uma vidaútil recomendada de 12 meses.

Estudo de capacidade de fluxo em seringa

Estudo de capacidade de fluxo em seringa realizados com pro-duto de fármaco SC belatacept (125 mg/ml) em condições de 2-8 0C. Váriostamanhos de agulha com seringas de 1 ml e 0,5 mL foram avaliados. O tem-po de enchimento da seringa e força de distribuição são registrados na Ta-bela 20 abaixo.

Tabela 20

Estudo de capacidade de fluxo em uma seringa do produto de fármaco SCbelatacept, 125 mg/ml a 2°-8°C<table>table see original document page 63</column></row><table>

Baseado nos resultados do estudo de capacidade de fluxo emseringa mostrados na Tabela 20, uma agulha hipodérmica estéril de 21 gau-ge χ 1/4 polegada é recomendada pãra extração desse produto do frasco euma agulha de 27 gauge χ 1 1/2 polegada para subseqüente dosagem.

Exemplo Vl

Estudos de estabilidade da fórmula liofilizada de produto de fár-maco abatacept foram conduzidos colocando as formulações sob estabilida-de em diferentes temperaturas e durante vários períodos de tempo.

Efeito de Maltose

Estudos de desenvolvimento de formulação foram conduzidospara avaliar o efeito de vários níveis de maltose sobre a estabilidade do pro-duto de fármaco abatacept. As amostras foram colocadas sob estabilidade a50 °C e monitorada em vários pontos de tempo. As proporções de proteínapara maltose avaliadas foram de 1:1, 1:2 e 1:5. A formação de espécies deelevado peso molecular (HMW) de abatacept foi utilizada para determinar aestabilidade de proteína em estado sólido. Os resultados são mostrados naTabela 21 abaixo.

Tabela 21

Efeito de maltose sobre a estabilidade em estado sólido liofilizado do produtode fármaco abatacept a 50 °C<table>table see original document page 64</column></row><table>

a Estabilidade de produto de fármaco com uma proporção em peso de 1:5 defármaco para maltose foi avaliada durante desenvolvimento anterior comresistência de 50 mg/frasco. O lote de substância de fármaco usado nesseestudo era diferente daquele usado para os outros resultados nessa tabela.Essa é a razão para os diferentes níveis iniciais de espécies de elevado pe-so molecular nessas amostras.

Os resultados demonstram que a estabilidade do produto defármaco abatacept em uma forma em estado sólido Iiofilizado é intensificadana presença de maltose. Adicionalmente, a quantidade mínima de maltoseútil para estabilização de abatacept foi determinada como sendo uma pro-porção em peso de proteína para maltose de 1:2.

Efeito do pH

A estabilidade do produto de fármaco abatacept Iiofilizado (250mg/frasco, proteína:maltose a 1:2) foi avaliada como uma função do pH. OpH da solução foi ajustado entre 6 e 8 com hidróxido de sódio a 1N ou ácidoclorídrico a 1N. As amostras foram colocadas sob estabilidade em condiçõesde 2-8 0C e monitoradas em vários pontos de tempo. Testagem analítica in-cluía pH e SE-HPLC para monitorar o aumento nas espécies de elevado pe-so molecular (HMW). Esses resultados são resumidos na Tabela 22 abaixo.

Tabela 22

Efeito do pH sobre a taxa de formação de espécies de elevado peso molecu-lar (HMW)<table>table see original document page 65</column></row><table>

a O lote de substância de fármaco usado para amostras com pH de 6,0 e 6,5era diferente daquele usado para amostras com pH 7,0, 7,5 e 8,0. Essa é arazão para os diferentes níveis iniciais de espécies de elevado peso molecu-lar nessas amostras.

Sob a condição de armazenamento recomendada de 2-8 0C,nenhuma alteração significativa na taxa de formação de espécies HWM foiobservada. Adicionalmente, dados de estabilidade em estado de soluçãogerados durante um desenvolvimento anterior mostrou que o pH para estabi-lidade máxima estava entre 7 e 8.

Exemplo Vll

Estudos de estabilidade da fórmula líquida de produto de fárma-co belatacept (20 mg/ml) foram conduzidos colocando as formulações sobestabilidade em diferentes temperaturas e durante vários períodos de tempo.Efeito de Sacarose

Estudos de desenvolvimento de formulação foram feitos paraavaliar o efeito de vários níveis de sacarose sobre a estabilidade de soluçãodo produto de fármaco líquido de belatacept a 20 mg/ml. As amostras foramcolocadas sob estabilidade em condições de 8 °C/25 °C/umidade de 60% e30 °C/umidade de 60% e monitoradas em vários pontos de tempo. As pro-

porções de proteína para sacarose avaliadas foram uma proporção de prote-ína:sacarose de 1:1, 1:2, 1:5 e 1:10 com 20 mg/mL de belatacept. A forma-ção de espécies de elevado peso molecular (HMW) de belatacept foi utiliza-da para determinar a estabilidade de proteína em solução. Os resultadosdesse estudo são resumidos e mostrados na Tabela 23 abaixo.Tabela 23

Efeito de vários níveis de sacarose sobre o produto de fármaco belataceptlíquido, 20 mg/ml

<table>table see original document page 66</column></row><table>

* Amostras não disponíveis para análise em virtude de evaporação

Os resultados dos estudos mostraram que aumento da propor-ção de sacarose para proteína melhorou a estabilidade de proteína. Umaproporção de proteína para sacarose de 1:2 (peso:peso) foi escolhida para odesenvolvimento da solução líquida porque ela proporcionou estabilidadeótima sem resultar em um produto de fármaco com hipertonicidade excessi-va.

Estudo de Estabilidade

Três lotes líquidos de belatacept foram preparados e colocadossob estabilidade em condições de 2-8 0C e 25 °C/RH de 60% e monitoradosem vários pontos de tempo, a proporção em peso de proteína para sacarosefoi de 1:2. A formação de espécies de elevado peso molecular (HMW) debelatacept foi utilizada para determinar a estabilidade de proteína emformulação líquida. Dados de estabilidade são resumidos na Tabela 24abaixo.

Tabela 24

Estabilidade de produto de fármaco líquido de belatacept

<table>table see original document page 67</column></row><table>

Os dados indicam um aumento de apenas 0,1% nas espécies deelevado peso molecular na formulação líquida comparado com um aumentode 0,2% na substância de fármaco belatacept sem sacarose em 12 meses a2-8 0C. Esses resultados também indicam que a adição de sacarose ajudana redução da formação de espécies de elevado peso molecular.

Exemplo Vlll

Estudos de estabilidade da formulação SC de produto de fárma-co abatacept foram conduzidos colocando formulações sob estabilidade emdiferentes temperaturas e durante vários períodos de tempo.Efeito da resistência do tampão

A estabilidade do produto de fármaco abatacept SC (100 mg/ml)foi avaliada como uma função da resistência do tampão. O sistema de tam-pão foi tampão de fosfato de sódio a 5 ou 10 mM. As amostras foram colo-cadas em estabilidade sob várias condições de 2-8 0C e 30 °C/RH de 60% emonitoradas em vários pontos de tempo. Testagem analítica incluía pH eSE-HPLC para monitorar o aumento nas espécies de elevado peso molecu-lar (HMW). Esses resultados são resumidos na Tabela 25 abaixo.Tabela 25

Efeito da resistência do tampão sobre o produto de fármaco abatacept (100mg/ml, pH de 7,5)

<table>table see original document page 68</column></row><table>

A estabilidade do produto de fármaco abatacept SC foi melhorno tampão de fosfato a 10 mM comparado com tampão de fosfato a 5 mMem um pH de 7,5 em uma concentração de 100 mg/mL de abatacept. Alémdisso, a maior capacidade de tamponamento do tampão de fosfato a 10 mMofereceu melhor controle de pH da formulação comparado com tampão a 5mM. Baseado nesses dados, tampão de fosfato a 10 mM foi selecionadopara desenvolvimento de formulação.Efeito de Açúcares

Estudos de desenvolvimento de formulação foram conduzidospara avaliar o efeito de vários açúcares sobre a estabilidade de solução doproduto de fármaco abatacept SC. As amostras foram colocadas sob condi-ções de estabilidade de 2-8 °C e 30 °C/umidade de 60% e monitoradas emvários pontos de tempo. Os açúcares avaliados foram sacarose, trealose emanitol. A formação de espécies de elevado peso molecular (HMW) de aba-tacept foi utilizada para determinar a estabilidade de proteína em solução.

Os resultados são mostrados na Tabela 26 abaixo.

Tabela 26

<table>table see original document page 69</column></row><table>

a Produto de fármaco abatacept em tampão de fosfato de sódio a 10 mM,100 mg/ml, pH de 7,5.

b Formulação de manitol em um pH de 7,8

Os resultados dos estudos mostraram que todos os três açúca-res, sacarose, trealose e manitol, ofereceram melhor estabilização ao abata-cept comparado com o controle sem anticorpo. Os resultados dos estudossob condições aceleradas de 30 0C mostraram que o manitol ofereceu me-lhor estabilização ao abatacept comparado com sacarose e trealose. Saca-rose foi ligeiramente melhor do que trealose. Sob refrigeração, a estabiliza-ção por todos os três açúcares não foi significativamente diferente. Sacarosefoi escolhido como o açúcar de escolha, uma vez que a formulação de mani-tol tinha duas vezes a tonicidade da formulação de sacarose. Escolher saca-rose para estabilização permite a adição de duas vezes tanto sacarose paraobter a mesma tonicidade que o manitol na mesma proporção, mas estabili-zação muito maior contra agregação. Uma proporção de proteína:sacarosede 1:1,36 (peso:peso) foi escolhida para o divulga do produto de fármaco SCporque ela proporciona estabilidade ótima sem resultar em um produto defármaco com hipertonicidade excessiva.

Efeito de Sacarose

Estudos de desenvolvimento de formulação foram conduzidospara avaliar o efeito de vários níveis de sacarose sobre a estabilidade desolução do produto de fármaco abatacept SC. As amostras foram colocadassob condições de estabilidade de 2-8 0C e 30 °C/umidade de 60% e monito-radas em vários pontos de tempo. As proporções de proteína para sacaroseavaliadas foram 1:1 e 1:2. A formação de espécies de elevado peso molecu-lar (HMW) de abatacept foi utilizada para determinar a estabilidade de prote-ína em solução. Os resultados são mostrados na Tabela 27 abaixo.

Tabela 27

Efeito de vários níveis de sacarose sobre o produto de fármaco abataceptSC a 100 mg/ml, pH de 7,5

<table>table see original document page 70</column></row><table>

a Produto de fármaco abatacept em tampão de fosfato de sódio a 10 mM,100 mg/ml, pH de 7,5

Os resultados dos estudos mostraram que aumento da propor-ção de sacarose para proteína melhorou a estabilidade da proteína. Umaproporção de proteína:sacarose de 1:1,36 (peso:peso) foi escolhida para odesenvolvimento da solução de RTU porque ela proporcionou estabilidadeótima em resultar no produto de fármaco com hipertonicidade excessiva.

Efeito de Tensoativos

O efeito de vários tensoativos em produtos comercializados, taiscomo Polisorbato 80 (Tween® 80) e Poloxamer 188 (Pluronic® F68), sobre aestabilidade de solução do produto de fármaco abatacept SC foi avaliado.Poloxamer 188 foi avaliado em níveis de 4 e 8 mg/ml e Polisorbato 80 foi avaliado a 1 e 2 mg/ml de concentração final da formulação. As amostrasforam colocadas sob condições de estabilidade de -2-8 0C e 25 °C/umidadede 60% e monitoradas em vários pontos de tempo. Os resultados são mos-trados na Tabela 28 abaixo.Tabela 28

Efeito de vários níveis e tipos de tensoativo sobre o produto de fármaco aba-tacept SC a 125 mg/ml

<table>table see original document page 71</column></row><table>

a proteína:sacarose (1:1),125 mg/ml, pH de 7,8

Os resultados do efeito de tensoativos sugeriram que o tensoati-vo não tem um efeito negativo significativo sobre a estabilidade do produtode fármaco abatacept SC. Dentre os níveis de Poloxamer 188 avaliados,descobriu-se que a concentração de 8 mg/ml era adequada para prevenir aformação de partículas relacionadas ao silicone na formulação.

Osmolaridade

A osmolaridade do abatacept em vários tampões, em diferentesconcentrações de proteína e de etapas distintas do processo de formulaçãofoi medida usando um método de pressão de vapor. Esses resultados sãoresumidos na Tabela 29 abaixo.

Tabela 29

Determinação de osmolaridade de solução SC de abatacept em vários tam-pões e concentração

<table>table see original document page 72</column></row><table>

Efeito de Agitação

O efeito da agitação sobre a estabilidade de solução de produtode fármaco abatacept SC em uma concentração de 100 mg/ml e 125 mg/mlfoi determinado. Alíquotas da solução contendo aproximadamente 1 ml emfrascos com tubulação de 5 cc foram agitadas na velocidade 3 do agitaçãocom braço biônico a 2-8 0C. A temperatura do agitador foi mantida a 2-8 0Ccolocando o agitador na sala fria. As amostras foram extraídas em intervalosde tempo apropriados e ensaiadas com relação ao pH e aparência visual e,ao mesmo tempo, as amostras também foram avaliadas com relação à bioa-tividade após 30 dias de agitação.

As amostras agitadas em uma concentração de 100 mg/ml e 125mg/ml durante até 30 dias não mostram alteração no nível de espécies deHMW1 no perfil de SDS-PAGE, mapeamento de peptídeo, ensaio B7 Bin-ding, pH, aparência ou concentração de proteína quando agitadas a 2-8 °C.Condições de armazenamento recomendadas

A condição de armazenamento recomendada para o produto defármaco belatacept SC1 15 mg/seringa (125 mg/ml) é 2-8 °C com uma vidaútil recomendada de pelo menos 12 meses.

Exemplo IX

Deamidação e agregação são duas vias de degradação obser-vadas de moléculas de CTLA4lg. Esse protocolo esboça a estudo de estabi-lidade de pH em escala de laboratório projetado para avaliar a formulação deproduto de fármaco SC na faixa de pH de 6,3-7,2, especificamente um pH de6,3, 6,6, 6,9, 7,2. A finalidade desse estudo é identificar a formulação ótimacom menor pH que obterá uma vida útil mínima de 18 meses para as formu-lações SC de CTLA4lg com relação à deamidação e formação de espécies-de elevado peso molecular. A formulação de produto de fármaco SC utiliza-da nesse estudo é descrita na Tabela 30 abaixo.

Tabela 30

Composição de formulação de produto de fármaco SC em um pH de 6,9

<table>table see original document page 73</column></row><table>

O produto de fármaco abatacept SC será formulado em um pHde 6,3, 6,6, 6,9, 7,2. O produto de fármaco será formulado com sacarose epoloxamer 188 conforme descrito acima e a concentração final do lote seráajustada com tampão de fosfato a 10 mM (pH de 6,9). O pH deverá ser titu-lado para 6,3 e 6,6, respectivamente, usando HCI a 1N. Alternativamente, opH será titulado para até 6,9, 7,2 e 7,65 com NaOH a 1N. O produto de fár-maco será enchido seringas Physiolis™ com capacidade de 1 mL (volumede enchimento de 1,0 ml) e colocado sobre estações de estabilidade a 2-8°C, 15°C, 25°C em umidade de 60% e 35°C. As amostras deverão ser pro-tegidas da Iuzem a todo momento cobrindo ou inserindo as mesmas em sa-cos protetores de luz marrons.

Produto de fármaco armazenado a 2-8°C será coletado a 0, 2, 4,6, 12 18, 24 meses e opcionalmente 9 meses. Produto de fármaco armaze-nado a 15°C será coletado a 1, 2, 4, 6 meses e opcionalmente 9 meses.Produto de fármaco armazenado a 25°C e umidade de 60% será coletado a1, 2, 4 e 6 meses. Produto de fármaco armazenado a 35°C será coletado a1, 2 e 4 meses. Amostras armazenadas a 2-8°C serão testadas com relaçãoà aparência (amostras inicial e final apenas), pH (amostras inicial, 4 meses efinal apenas), A280 (amostras inicial, 4 meses e final apenas), HPLC porexclusão de tamanho, SDS-PAGE, mapeamento de peptídeo por digestãotríptica (TPM), Biacore B7 Binding (amostras inicial, 4 meses e final apenasou conforme necessário) e focalização isoelétrica (IEF) (amostras inicial efinal apenas). Amostras armazenadas a 15°C e 25°C e umidade de 60% se-rão testadas com relação à A280 (amostras inicial, 4 meses e última ape-nas), HPLC por exclusão de tamanho, SDS-PAGE e mapeamento de peptí-deo por digestão tríptica (TPM). Amostras armazenadas a 35°C serão testa-das com relação à HPLC por exclusão de tamanho, SDA-PAGE e mapea-mento de peptídeo por digestão tríptica (TPM).

Métodos de testagem não rotineiros deverão ser usados paracaracterizar adicionalmente amostras para estabilidade no ponto de tempoinicial, 4 meses, 12 meses e ao final do estudo. Alguns desses métodostambém podem ser usados para testar amostras específicas se uma tendên-cia ou um resultado inesperado é observado. Os métodos não rotineiros in-cluem: cromatografia por exclusão de tamanho empregando dispersão deluz em múltiplos ângulos (SEC-MALS), ligação cinética (SPR), Espectrome-tria de Massa, CD1 AUC, Calorimetria por Exploração Diferencial (DSC),FFF, FTIR, HPLC por exclusão de tamanho (desnaturada) e SDS-PAGE (co-loração com prata).Exemplo X

Um estudo de PK foi incorporado em um estudo na fase 2B, mul-ti-centro, aleatório, duplamente cego, placebo-controlado para avaliar a se-gurança e eficácia clínica de duas doses diferentes de abatacept administra-das intravenosamente a indivíduos com artrite reumatóide, enquanto recebi-am metotrexato. Nesse estudo com design em paralelo, os indivíduos rece-beram abatacept em 2 doses diferentes (2 e 10 mg/kg) ou placebo em com-binação com MTX. Abatacept foi fabricado conforme descrito no pedido depatente US co-pendente No. de Série 60/752.267, depositado em 20 de De-zembro de 2005, o qual ensina processos para a produção de proteínas dainvenção, especificamente produtos de glicoproteína recombinantes, atravésde culturas de células de animal ou mamífero, e fornecidos na forma Iiofiliza-da, conforme descrito aqui, em frascos individuais contendo 200 mg de aba-tacept. Abatacept foi administrado IV a indivíduos nos Dias 1, 15 e 30 e acada 30 dias depois durante um ano. PK para múltiplas doses derivada dedados da concentração no soro vs. tempo obtidos durante o intervalo de do-sagem entre os Dias 60 e 90 de indivíduos que foram arrolados em um sub-estudo de PK local-específico. Para os indivíduos no sub-estudo de PK, a-mostras de sangue foram coletadas antes de dosagem no Dia 60 e para umperfil de PK começando no Dia 60 a 30 minutos (correspondendo ao final dainfusão de abatacept), a 4 horas após o início de infusão e semanalmentedepois até o Dia 90. Um total de 90 indivíduos foi arrolado para participar nosub-estudo de PK. Contudo, perfis de PK completos entre o intervalo de do-sagem dos Dias 60 a 90 foram obtidos de 29 indivíduos (15 indivíduos dosa-dos a 2 mg/kg; 14 indivíduos dosados a 10 mg/kg).

Um sumário dos parâmetros de PK é apresentado na Tabela 31.Os resultados do estudo mostraram que a Cmax e AUC (TAU), onde TAU =30 dias, aumentaram de uma maneira dose-proporcional. Para doses nomi-nais aumentando na proporção de 1:5, as médias geométricas da Cmax au-mentaram na proporção de 1:5,2, enquanto que a média geométrica paraAUC (TAU) aumentou na proporção de 1:5,0. Além disso, os valores de T-HALF, CLT e Vss pareciam ser independentes da dose. Nesses indivíduoscom RA1 os valores médios de T-HALF, CLT e Vss estavam em torno de 13dias, 0,2 mL/h/kg e ~ 0,07 L/kg, respectivamente. O pequeno Vss indica queo abatacept está confinado primariamente ao volume de fluido extracelular.Baseado no esquema de dosagem a 2 e 4 semanas após a primeira infusão,então, uma vez por mês depois, condições em estado uniforme para abata-cept foram atingidas pela terceira dose mensal. Também, como um resulta- do do esquema de dosagem, as concentrações no soro estavam acima dasconcentrações em estado uniforme durante os primeiros 2 meses de trata-mento. Comparação dos valores séricos (Cmin) nos Dias 60, 90 e 180 indi-cou que o abatacept não parece se acumular após dosagem mensal. Osvalores médios de Cmin em estado uniforme para todos os indivíduos quereceberam doses IV mensais de 2 e 10 mg/kg de abatacept oscilavam entre4,4 a 6,7 mcg/mL e 22,0 a 28,7 mcg/mL, respectivamente.

Tabela 31

Sumário de múltiplos estudos de PK em indivíduos com artrite reumatóide(1a parte)

<table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table>

A farmacocinética do abatacept foi estudada em indivíduos adul-

tos saudáveis após uma única infusão intravenosa de 10 mg/kg e em pacien-tes com RA após múltiplas infusões intravenosas de 10 mg/kg (veja Tabela32).

Tabela 32

Parâmetros farmacocinéticos (média, faixa) em indivíduos saudáveis e paci-entes com RA após infusão intravenosa de 10 mg/kg (s)

<table>table see original document page 77</column></row><table>

aMúltiplas infusões intravenosas foram administradas nos dias 1, 15, 30 emensalmente depois.

A farmacocinética do abatacept em pacientes com RA e indiví-duos saudáveis parecia ser comparável. Em pacientes com RA, após múlti-plas infusões intravenosas, a farmacocinética do abatacept mostrou aumen-tos proporcionais de Cmax e AUC sobre a faixa de dose de 2 mg/kg a 10mg/kg. A 10 mg/kg, a concentração no soro pareceu atingir um estado uni-forme no dia 60, com uma concentração sérica média (faixa) de 24 (1-66)mcg/mL. Nenhum acúmulo sistêmico de abatacept ocorreu quando de trata-mento repetido contínuo com 10 mg/kg em intervalos mensais em pacientescom RA.

Análises de farmacocinética na população de pacientes com RArevelou que havia uma tendência em maior clearance de abatacept com au-mento do peso corporal. A idade e sexo (quando corrigidos para o peso cor-poral) não afetam a clearance. Metotrexato (MTX), fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs), corticosteróides e agentes de blo-queio de TNF concomitantes não influenciam a clearance de abatacept.

Ensaio no soro para Abatacept

Amostras de soro foram analisadas com relação ao abataceptatravés de um ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (ELISA) em um totalde 25 operações analíticas. Todos os resultados analíticos foram de encon-tro aos critérios de aceitação estabelecidos antes de análise de amostra,indicando que o método ELISA era preciso e apurado para a quantificaçãode abatacept nas amostras de estudo. Um sumário dos parâmetros de curvapadrão e dados de QC médios para abatacept no soro são apresentados naTabela 33. A variabilidade entre e dentro da operação das QCs analíticaspara abatacept foram CV de 4,5% e 3,5%, respectivamente. As concentra-ções médias observadas das amostras de QC analítica desviaram em me-nos de

8,9% dos valores nominais (Tabela 33).Tabela 33

Sumário de dados de controle de qualidade para o ensaio de abatacept emsoro humano

<table>table see original document page 79</column></row><table>

Exemplo XI

Os objetivos desse estudo são avaliar a PK de belatacept apósuma única dose SC na faixa de 50 a 150 mg em indivíduos saudáveis; avali-ar os efeitos do volume de injeção e concentração da solução injetada sobrea PK de belatacept subcutaneamente injetado; avaliar a segurança e tolera-bilidacl¥~(fiicluindcra avaliação do local de injeção) de uma ünica dose SC debelatacept; avaliar a imunogenicidade de belatacept subcutaneamente ad-ministrado.

Esse é um estudo com uma única dose, duplamente cego, alea-tório, placebo-controlado, com grupo paralelo em indivíduos saudáveis. Umtotal de 42 indivíduos será aleatoriamente distribuído a um de 6 grupos detratamento. Dentro de cada grupo de 7 indivíduos, os indivíduos serão alea-toriamente distribuídos em uma proporção de 5:2 no Dia 1 para receber umaúnica injeção SC de belatacept ou placebo. Será requerido que os indivíduostenham um peso <100 kg. Os 6 grupos de tratamento são descritos na Ta-bela 34.Tabela 34

Grupos de tratamento

<table>table see original document page 80</column></row><table>

Os indivíduos deverão sofrer avaliações de triagem para deter-minar a elegibilidade dentro de 28 dias de dosagem no Dia 1. Os indivíduosserão admitidos na unidade clínica no dia antes de dosagem (Dia 1) paraavaliações de linha de base, incluindo MLR. Os indivíduos deverão perma-necer na unidade clínica até término das avaliações pós-tratamento no Dia 5e retornar para a unidade clínica para cada visita de estudo depois, até libe-rados do estudo.

No Dia 1, os indivíduos serão aleatoriamente distribuídos ao tra-tamento e receberão uma única dose SC de belatacept ou placebo e passa-rão por uma amostra detalhada para PK e imunogenicidade. Todos os indi-víduos receberão injeções SC em na parte anterior de sua coxa. Após admi-nistração do fármaco de estudo, o Investigador avaliará o local de injeçãocom relação a sinais de irritação e inflamação local.

Exames físicos, medições de sinais vitais e avaliações clínicaslaboratoriais deverão ser realizados em momentos selecionados no decorrerdo estudo. Amostras de sangue deverão ser coletadas durante ate 56 diasapos a administração do fármaco de estudo para análise de PK e avaliaçãode imunogenicidade. Os indivíduos deverão ser monitorados com relação aAEs no decorrer do estudo. Aproximadamente 256 mL de sangue deverãoser coletados de cada indivíduo durante o estudo.

Dosagem e acompanhamento deverão ocorrer concorrentemen-te para todos os grupos de dose. Nenhum indivíduo deverá receber mais deuma única dose. Indivíduos que não completam o estudo (exceto aquelesque são excluídos por AEs) podem ser substituídos.

Esse é um estudo com uma única dose. Cada indivíduo deverápassar por um período de triagem o qual deverá ser no máximo de 28 diasantes do dia em que o fármaco de estudo é administrado. A última visita doúltimo indivíduo que passou pela triagem deverá ser considerado o final doestudo.

100 mg/frasco de belatacept (125 mg/ml), conforme descrito aquie fabricado conforme descrito no pedido de patente US No. de Série60/849543, depositado em 5 de Outubro de 2006, o qual ensina processospara a produção de proteínas da invenção, especificamente produtos de g11-coproteína recombinantes, através de culturas de células de animal ou ma-mífero, é um produto líquido pronto para uso proporcionado em um frasco devidro para extração e administração usando uma seringa e agulha conven-cionais de tamanho adequado para administração SC. Um excesso suficien-te de belatacept é incorporado em cada frasco para levar em conta perdasquando de extração, de modo que 0,8 mL da solução contendo 100 mg pos-sam ser extraídos para administração SC.

Injeção de belatacept, 100 mg/frasco (125 mg/mL) não é desti-nada auma infusão IV.

Indivíduos saudáveis, conforme determinado pela história médi-ca, exame físico, eletrocardiograma com 12-condutores e avaliações clínicaslaboratoriais serão elegíveis para participar do estudo. Esse estudo incluiráhomens e mulheres. Os indivíduos devem ter pelo menos 18 anos de idadee um peso < 100 kg no momento de distribuição aleatória. Mulheres não de-verão estar amamentando, grávidas e usando um método de contracepçãoaceitável durante pelo menos 1 mês antes de dosagem, durante o estudo edurante até 4 semanas após o final do estudo. Mulheres com potencial paraengravidar devem ter um teste de gravidez negativo no soro dentro de 24horas antes da dose de medicação de estudo. Os indivíduos deverão serorientados quanto aos riscos potenciais para uma gravidez. Homens devemestar usando um método adequado de contracepção durante o estudo e du-rante até 4 semanas após o final de estudo, de modo que o risco de gravidezpara sua parceira seja minimizado. Veja Seção 5 para uma lista detalhadados critérios de inclusão e exclusão.

Medicações tomadas dentro de 4 semanas antes de arrolamentodeverão ser registradas no CRF. Nenhuma medicação concomitante (pres-crição, de venda livre ou fitoterápica) deverá ser administrada durante o es-tudo, exceto quanto a contraceptivos orais, a menos que eles sejam prescri-tos pelo Investigador para tratamento de eventos clínicos específicos.Quaisquer terapias concomitantes deverão ser registradas no CRF.

A PK de belatacept após injeção SC deverá ser derivada dosdados de concentração no soro versus tempo. Os parâmetros de PK parauma única dose a serem avaliados incluem:

Cmax Concentração máxima observada no soro

Tmax Tempo de concentração máxima observada no soro

AUC (O-T) Área sob a curva de concentração no soro-tempo a partir dotempo zero até o momento da última concentração quantifi-cável

AUC (IFN) Área sob a curva de concentração no soro-tempo a partir dotempo zero extrapolada para o tempo infinito

Meia vida Meia-vida no soro

CLT/F Clearance aparente total no corpo

VSS/F Volume aparente de distribuição em estado uniforme

Os valores do parâmetro PK individuais serão derivados atravésde métodos não compartimentais através de um programa de análise de PKvalidado, o programa eToolbox Kinetica1 Innaphase Corp, Filadélfia, PA. AAUC dose-normalizada também será reportada.

Amostras de soro deverão ser coletadas durante o tempo e en-saiadas com relação à presença de titulações de anticorpo ao belataceptusando dois ensaios ELISA. Um ensaio avalia a resposta à molécula inteirae o outro à porção LEA29Y-T apenas.

Todos os indivíduos que recebem a medicação de estudo deve-rão ser incluídos nos conjuntos de dados de segurança e PD. Indivíduos querecebem placebo em qualquer painel deverão ser agrupados em um únicogrupo de tratamento com placebo para avaliações de PD e avaliações desegurança, exceto quanto à avaliações do local de injeção. Todos os dadosdisponíveis de indivíduos que receberam belatacept deverão ser incluídos noconjunto da dados de PK e incluídos na estatística resumida e análise esta-tística.

A linha de base é considerada o Dia 1. Distribuições de freqüên-cia de sexo e raça deverão ser inseridas na tabela por tratamento (volume edose de injeção). Estatística resumida para idade, peso corporal e altura de-verão ser inseridas na tabela por tratamento.

Todos os AEs registrados deverão ser listados e inseridos natabela pelo termo, classe de órgão de sistema e tratamento preferidos. Si-nais vitais e resultados de testes clínicos de laboratório deverão ser listadose resumidos por tratamento. Quaisquer achados quando de exame físico eresultados clínicos de laboratório significativos deverão ser listados. Avalia-ções do local de injeção (eritema, calor, inchaço, dor e prurido) deverão serinseridos na tabela por tratamento e grau de gravidade. Indivíduos com pla-cebo serão agrupados através dos grupos de dose e analisados indepen-dentemente, também, para a avaliação do local de injeção.

Estatística resumida deverá ser inserida na tabela para os parâ- metros de PK por tratamento. As médias geométricas e coeficientes de vari-ação deverão ser apresentados para Cmax, AUC (O-T) e AUC (INF). As me-dianas, mínima e máxima, deverão ser apresentadas para Tmax. Médias edesvios padrões serão fornecidos para outros parâmetros de PK. Para avali-ar a dependência da dose após administração SC, plotagens de dispersãode Cmax e AUC (INF) versus dose deverão ser proporcionadas. Plotagensde dispersão de AUC (IFN) e Cmax através dos volumes de injeção deverãoser construídas para avaliar esse efeito sobre a PK do belatacept. Também,plotagens de dispersão de Cmax e AUC (INF) versus dose para um volumefixo e Cmax e AUC (INF) versus volume dentro de doses serão proporciona-das onde aplicável.

Estatística resumida deverá ser inserida na tabela por tratamen-to e o dia de estudo para valores de anticorpo anti-belatacept e anti-LEA29Y-T e suas alterações a partir da linha de base (Dia 1 - O hora). Para explorarpossíveis associações entre a imunogenicidade e exposição, plotagens dealterações nas concentrações de anticorpos anti-belatacept e anti-LEA29Y-Tserão proporcionadas.

Os esquemas de amostragem de sangue para PK e imunogenicidadesão esboçados na Tabela 35.

Tabela 35

Esquema de amostragem de sangue para imunogenicidade e farmacocinética

<table>table see original document page 84</column></row><table>

a Amostra de imunogenicidade no Dia 1 (anticorpos anti-belatacept) deveráser coletada antes de administração de fármaco. Amostras nos Dias 28, 35,42 e 56 podem ser coletadas dentro de ± 2 dias.A Tabela 35 acima lista o esquema de amostragem a ser segui-do para avaliação de PK. Amostras de sangue (~3 ml_ por amostra) deverãoser coletadas em um tubo Vacutainer® pré-rotulado Red and Gray Top (SST)via venipunção direta ou de um Ioek de solução salina. Se um sistema de Ioek de solução salina é usado, aproximadamente 0,5 mL de sangue deve-rão ser coletados através do cateter residente e descartados antes de ob-tenção de cada amostra para PK. Uma vez que o espécime para PK tenhasido obtido, o sangue deverá ser deixado coagular no tubo Vacutainer® emtemperatura ambiente durante 15-30 minutos. Após coagulação, a amostra deverá ser centrifugada durante 15 minutos a 1500 χ g em uma centrífugarefrigerada (4 ºC). Quando a centrifugação está completa, pelo menos 0,5mL de soro de cada ponto de tempo de amostra para PK deverão ser remo-vidos através de uma pipeta e transferidos para um tubo de armazenamentoe envio para PK de polipropileno, com tampa de rosca, pré-rotulado. O tubo de polipropileno contendo a amostra de soro para PK deverá ser armazena-do congelado a -20 ºC ou mais frio durante um máximo de um mês e, então,a -70 ºC após isso. O tempo permitido a partir da coleta de amostra atécongelamento do soro é de 12 horas. Um método de imunoensaio enzimáti-co (EIA) sensível validado deverá ser usado para medir as concentrações de belatacept no soro.

A Tabela 35 lista o esquema de amostragem a ser seguido paraa avaliação de imunogenicidade. Amostras de soro serão obtidas em visitasnos Dias 1, 14, 28, 35, 42 e 56. A amostra para imunogenicidade no Dia 1(anti-belatacept) deverá ser tomada antes de administração do fármaco deestudo. As amostras deverão ser ensaiadas com relação à presença de anti-corpos anti-belatacept e anti-LEA29Y-T. Para cada espécime, sangue (~ 3mL por amostra) deverá ser coletado em um tubo Vacutainer® pré-rotuladoRed and Gray Top (SST) via venipunção direta ou de um Iock de soluçãosalina (cateter residente). Se um sistema de Ioek de solução salina é usado para coleta de sangue, aproximadamente 0,5 mL de sangue deverão sercoletados através do cateter residente e ser descartados antes de obtençãode cada amostra para imunogenicidade. Uma vez que o espécime tenha si-do obtido, o sangue deverá ser deixado coagular no tubo Vacutainer® emtemperatura ambiente durante 15-30 minutos. Após coagulação, a amostradeverá ser centrifugada durante 15 minutos a 1500 χ g em uma centrífugarefrigerada (4 0C). Quando a centrifugação está completa, pelo menos 1 ml_de soro deverá ser removido através de uma pipeta e transferido para umtubo de armazenamento e envio de amostra de soro de polipropileno, comtampa de rosca, pré-rotulado. O tubo de polipropileno contendo a amostra desoro deverá ser armazenado congelado a -20 0C ou mais frio. Dois métodosde ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (ELISA) sensíveis validados de-verão ser usados para medir as titulações de anticorpo ao belatacept no so-ro. Um ensaio avalia a titulação de anticorpo à molécula inteira e o outro àporção LEA29Y-T apenas.

Exemplo Xll

Deamidação, fragmentação e agregação são vias de degrada-ção observadas de moléculas de LEA29Ylg. Esse protocolo esboça um es-tudo de estabilidade de pH em escala de laboratório adicional projetado paraavaliar a formulação de produto de fármaco SC belatacept na faixa de pH de6,3-7,5. A finalidade desse estudo é identificar a formulação com pH ótimoque obterá uma vida útil mínima de 18 meses para a formulação SC de bela-tacept.

Para esse estudo, produto belatacept SC será formulado em umpH de 6,3, 6,6, 6,9, 7,2 e 7,5. A substância de fármaco belatacept a -25mg/mL será primeiro concentrada para -100 mg/mL, então, diafiltrada emtampão de fosfato a 10 mM em um pH de 6,9, seguido por uma segundaconcentração para obter um intermediário de produto de fármaco (DPI) a>160 mg/mL. O DPI será formulado com sacarose e poloxamer 188 e a con-centração final do lote será ajustada com tampão de fosfato a 10 mM (pH de6,9). O bruto formulado deverá ser subdividido em cinco sub-lotes, conformeesboçado no design de estudo. O pH do sub-lotes será titulado para 6, e 6,6,respectivamente, usando HCI a 1N. O pH dos dois sub-lotes adicionais serátitulado para até 6,9, 7,2 e 7,5 com NaOH a 1N. Os lotes de produto serãoenchidos em Physiolis™ com capacidade de 1 mL. As amostras deverão serprotegidas da luz em a todo momento cobrindo ou inserindo as mesmas emsacos protetores de luz marrons. A formulação de produto de fármaco SCutilizada nesse estudo é descrita na Tabela 36 abaixo.Tabela 36

Composição de formulação de fármaco SC em um pH de 6,9

<table>table see original document page 87</column></row><table>

Produto de fármaco armazenado a 2-8 0C será coletado a 0, 2,4, 6, 12 18, 24 meses e opcionalmente 9 meses. Produto de fármaco arma-zenado a 15°C será coletado a 1, 2, 4, 6 meses e opcionalmente 9 meses.Produto de fármaco armazenado a 25°C e umidade de 60% será coletado a1, 2, 4 e 6 meses. Produto de fármaco armazenado a 35°C será coletado a1, 2 e 4 meses. Amostras armazenadas a 2-8°C serão testadas com relaçãoà aparência (amostras inicial e final apenas), pH (amostras inicial, 4 meses efinal apenas), A280 (amostras inicial, 4 meses e final apenas), HPLC porexclusão de tamanho, SDS-PAGE, mapeamento de peptídeo por digestãotríptica (TPM), Biacore B7 Binding (amostras inicial, 4 meses e final apenasou conforme necessário) e focalização isoelétrica (IEF) (amostras inicial efinal apenas). Amostras armazenadas a 15°C e 25°C com umidade de 60%serão testadas com relação à A280 (amostras inicial, 4 meses e última ape-nas), HPLC por exclusão de tamanho, SDS-PAGE e mapeamento de peptí-deo por digestão tríptica (TPM). Amostras armazenadas a 35°C serão testa-das através de HPLC por exclusão de tamanho, SDA-PAGE e mapeamentode peptídeo por digestão tríptica (TPM).

Métodos de testagem não rotineiros serão usados para caracte-rizar adicionalmente a estabilidade das amostras no ponto de tempo inicial, 4meses, 12 meses e no final do estudo. Alguns desses métodos podem tam-bém ser usados para testar amostras específicas se uma tendência ou umresultado inesperado é observado. Os métodos não rotineiros incluem: cro-matografia por exclusão de tamanho empregando dispersão de luz em múl-tiplos ângulos (SEC-MALS), ligação cinética (SPR), Espectrometria de Mas-sa, CD1 AUC1 Calorimetria por Exploração Diferencial (DSC), FFF, FTIR,HPLC por exclusão de tamanho (desnaturada) e SDS-PAGE (coloração comprata).Listagem de Seqüência

<110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY

DALI, MANISHA

DAHLHEIM, CHARLES E.

NARINGREKAR, VIJAY H.

GANDHI, RAJESH B.

NERURKAR, MANOJ

<120> FORMULAÇÕES DE PROTEÍNA ESTÁVEIS

<130> 10739 WO PCT

<140> PCT/US06/62297

<141> 2006-12-19

<150> 60/752,150

<151> 2005-12-20

<160> 4

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 1152

<212> DNA

<220>

<223> Iniciador-CTLA4Ig Sintético

<400> 1

atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60

agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120

ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg 180

acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240

gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300

gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360

gagctcatgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420

attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480

acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctgggtggat cgtcagtctt cctcttcccc 540ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc 720gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140ccgggtaaat ga 1152

<210> 2<211> 383<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptídeo-CTLA4Ig Sintético<400> 2

Met C-]y Vai Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro

20 25 30

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu

35 40 45

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg50 55 60

Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met65 70 75 80

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser

85 90 95

Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp100 105 110Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr

115 120 125

Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu130 135 1405 Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His145 150 155 160

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val

165 170 175

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 180 185 190

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

195 200 205

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys210 215 220

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser225 230 235 240

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

245 250 255

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 260 265 270

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

275 280 285

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu290 295 300

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn305 310 315 320

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

325 330 335

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 340 345 350

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu355 360 365His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

<210> 3<211> 1152<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador-LlO4EA29YIg Sintético<400> 3

atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60

agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120

ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aatatactga ggtccgggtg 180

acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240

gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300

gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360

gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420

attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480

acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 540

ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600

gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660

cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720

gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780

aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840

gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900

ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960

gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020

ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080

tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140

ccgggtaaat ga 1152

<210> 4

<211> 383<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Peptideo-LlO4EA29YIg Sintético<400> 4

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro

20 25 30

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu 35 40 45

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg

50 55 60

Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met65 70 75 80

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser85 90 95

Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp100 105 110

Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 120 125

Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu130 135 140

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His145 150 155 160

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val165 170 175

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr180 185 190

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 195 200 205

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys210 215 220Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser225 230 235 240

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

245 250 255

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

260 265 270

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

275 280 285

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

290 295 300

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn305 310 315 320

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

325 330 335

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

340 345 350

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

355 360 365

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys370 375 380

Claims (27)

1. Formulação estável adequada para administração subcutâ-nea, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 100 mg/ml demoléculas de CTLA4lg, um açúcar capaz de estabilização da referida formu-lação em uma concentração eficaz para tal, e um veículo aquoso farmaceu-ticamente aceitável.

2. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o açúcar é selecionado do grupo consistindo de sacarose,lactose, maltose, manitol e trealose e misturas dos mesmos.

3. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o açúcar é um dissacarídeo.

4. Formulação, de acordo com a reivindicação 3, caracterizadapelo fato de que o dissacarídeo é sacarose.

5. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que ainda compreende um tampão farmaceuticamente aceitá-vel.

6. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que apresenta uma faixa de pH de 6 a 8.

7. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a molécula de CTLA4lg tem a seqüência de aminoácidomostrada em SEQ ID NO: 2, começando na metionina na posição 27 ou ala-nina na posição 26 e terminando na Iisina na posição 383 ou glicina na posi-ção 382.

8. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a molécula de CTLA4lg é L104EA29Ylg tendo a seqüênciade aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 4 começando na metionina na po-sição 27 ou alanina na posição 28 e terminando na Iisina na posição 383 ouglicina na posição 382.

9. Formulação, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracteri-zada pelo fato de que o açúcar é selecionado do grupo consistindo de saca-rose, lactose, maltose, manitol e trealose e misturas dos mesmos.

10. Formulação, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracte-rizada pelo fato de que o açúcar é um dissacarídeo.

11. Formulação, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracte-rizada pelo fato de que o açúcar é sacarose.

12. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, 7 ou 8, carac-terizada pelo fato de que a proporção de proteína.açúcar é de pelo menos-1:1,3.

13. Formulação, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracte-rizada pelo fato de que ainda compreende um tampão farmaceuticamenteaceitável.

14. Formulação, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracte-rizada pelo fato de que apresenta uma faixa de pH de 6 a 8.

15. Formulação estável adequada para diluição antes de admi-nistração intravenosa, caracterizada pelo fato de que compreende pelo me-nos 20 mg/ml de moléculas de CTLA4lg, um açúcar capaz de estabilizar areferida formulação em uma concentração eficaz para tal e um veículo aquo-so farmaceuticamente aceitável.

16. Formulação, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza-da pelo fato de que o açúcar é selecionado do grupo consistindo de sacaro-se, lactose, maltose e trealose e misturas dos mesmos.

17. Formulação, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza-da pelo fato de que o açúcar é um dissacarídeo.

18. Formulação, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza-da pelo fato de que o dissacarídeo é sacarose.

19. Formulação, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza-da pelo fato de que ainda compreende um tampão farmaceuticamente acei-tável.

20. Formulação, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza-da pelo fato de que apresenta um pH na faixa de 6 a 8.

21. Formulação, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza-da pelo fato de que a molécula de CTLA4lg tem a seqüência de aminoácidomostrada em SEQ ID NO: 2 começando na metionina na posição 27 ou ala-nina na posição 26 e terminando na Iisina na posição 383 ou glicina na posi-ção 382.

22. Formulação, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza-da pelo fato de que a molécula de CTLA4lg é L104EA29Ylg tendo a seqüên-cia de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 4 começando na metionina naposição 27 ou alanina na posição 26 e terminando na Iisina na posição 383ou glicina na posição 382.

23. Formulação, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, carac-terizada pelo fato de que o açúcar é selecionado do grupo consistindo desacarose, lactose, maltose e trealose.

24. Formulação, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, carac-terizada pelo fato de que o açúcar é sacarose.

25. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 15, 21 e 22, caracterizada pelo fato de que a proporção de proteí-na:açúcar é de pelo menos 1:2.

26. Formulação, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, carac-terizada pelo fato de que ainda compreende um tampão farmaceuticamenteaceitável.

27. Formulação, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, carac-terizada pelo fato de que apresenta um pH na faixa de 6 a 8.