BRPI0702901A2 - processos para regulação da produção de ácido metabólico e variantes do penicillium sp - Google Patents
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Abstract
PROCESSOS PARA REGULAçãO DA PRODUçAO DE áCIDO METABóLICO E VARIANTES DO PENICILLIUM SP. A presente invenção provê um método para preparar metabólitos ácidos, como o ácido micofenólico, e uma linhagem de Peniclilium sp. com o número de acesso CCM 8364 para uso no referido método, cujo método produz ácido micofenólico com maiores rendimentos.
Description
PROCESSOS PARA REGULAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ÁCIDO METABÓLICO EVARIANTES DO PENICILLIUM SP
O presente pedido reivindica o beneficio dos seguintesPedidos de Patente Provisória dos Estados Unidos: Nos.60/818.145, depositado em 29 de junho dè 2006 e 60/847.344,depositado em 25 de setembro de 2006. Os conteúdos dessespedidos ficam incorporados ao presente por referência.
Área da Invenção
A presente invenção refere-se a um método para regulara produção de ácido metabólito por uma célula de ummicroorganismo, por meio da regulação do nivel de saturaçãode oxigênio em um caldo de fermentação. Especificamente, ainvenção se refere a um método para regular a produção deácido micofenólico pela bactéria Penicillium por meio daregulação do nivel de saturação de oxigênio no meio decultura, e a uma linhagem de Penicillium recentementeisolada, que tem o número de acesso CCM 8364. , .
Antecedentes da Invenção
O ácido micofenólico (MPA - MicoPhenolic Acid) é ummetabólito produzido por várias espécies de Penicillium(Imperial Chemical Industries GB 1 15.8 387 (1967), Lilly &Co Elli GB 1 593 208 (1978)) ou por linhagens mutantesobtidas da Penicillium (Ájinimoto KK US 4 452 891 (1981)).0-MPA tem atividades biológicas e farmacológicas; porexemplo, como agente antimicrobiano, (Florey e outros,1946), agente antitumoral (Williams e outros, J. Antibiot.,21, 463 (1968) e como agente imunossupressor (Mitsui,Suzuki, 1969) . Em terapia, usa-se geralmente o micofenolatomofetil, um éster 2-morfolinoetil derivado do MPA.
A estrutura química do MPA é:Um dos métodos para produzir MPA é a fermentação" emcultura submersa, conforme descrição em EP 1 624 070 Al, emque se usa NaOH para regular o pH do meio de fermentação,mantendo-o entre 4 e 7.
0 MPA pode ser isolado do meio de fermentação por umavariedade de processos, inclusive os descritos em ImperialChemical Industries GB 1158 387 (1967); BIOCON, WO 01/64931Al (2001), e IVAX, WO 2006/031665 (2006), WO 01/21607 e WO2005/105768). 0 MPA isolado é então usado para a produçãode micofenolato mofetil (WO -2/10085).
Um nivel elevado de produção de MPA é desejável para aprodução eficiente e econômica de medicamentos baseados noingrediente farmacêutico ativo micofenolato mofetil. Apresente invenção provê um método para tanto.
Sumário da Invenção
Sob um aspecto, a presente^ invenção provê um métodopara regular a produção de um metabólito ácido produzidopor uma célula microbiana.! Em uma incorporaçãopreferencial, o método consiste em fornecer célulasmicrobianas que produzem metabólito ácido em um sistema decultura de fermentação submersa e produzir o metabólitoácido proveniente das qélulas microbianas na referidacultura, sendo que a saturação de oxigênio do meio decultura é regulada para controlar o pH do meio de cultura.
Preferivelmente, o metabólito ácido é o ácido micofenólico(MPA).
Sob um outro aspecto, a presente invenção provê ummétodo para preparar o micofenolato mofetil que consiste emconverter o ácido micofenólico em micofenolato mofetil,sendo que o ácido micofenólico é preparado regulando-se asaturação de oxigênio em um caldo de fermentação que contémuma célula microbiana produtora de ácido micofenólico.
Ainda sob outro aspecto, a, presente invenção provêtambém uma linhagem de Psnicillíuiü sp. depositada sob onúmero de acesso CCM 8364 na Coleção de MicroorganismosTcheca (CCM - Czech Collection of Microorganisms)/naUniversidade Masarik em Brno, na República Tcheca. Alinhagem de Penicillium sp. depositada sob número de acessoCCM 8364 produz ácido micofenólico em concentraçõeselevadas (acima de 1 g de MPA por litro de meio de cultura).
Breve Descrição dos Desenhos
Figura 1: Uma representação gráfica que mostra aregulação do pH do meio de cultura por meio da regulação donivel de saturação de oxigênio, para se obter um pH acimade pH 4,5.
Figura 2: Uma representação gráfica que mostra aregulação do pH do meio de cultura por meio da regulação donivel de saturação de oxigênio, para obter-se um pH abaixode pH 4,5.
Descrição Detalhada da Invenção
No presente documento, as expressões "níveis elevados"ou "concentrações elevadas", quando usadas com relação aoMPA, referem-se a um nível (ou concentração) acima de cercade 1 g de MPA por litro; preferivelmente, de cerca de 6 acerca de 10 g de MPA por ,.litro de caldo de fermentação(meio de cultura).
Vários fatores são importantes para a obtenção dealtas concentrações de MPA no meio de cultura defermentação submersa. Esses fatores incluem a composição domeio e as condições da cultivação. Especificamente, épreciso manter o pH do caldo de fermentação em um nívelótimo durante a fase de produção. Normalmente, usa-se aadição de NaOH para regular o pH do caldo de fermentação emantê-lo entre pH 4 e 7. NaOH também é usado para produzirum deslocamento do pH depois da fase Iog de crescimentoterminar. A presente invenção refere-se a um novo métodopara regular a produção de MPA regulando-se o pH docaldo/meio de cultura de fermentação por meio da-regulaçãodo nível de oxigênio, aem acrescentar uma substânciaquímica ao caldo/meio de cultura de fermentação. Assim.,sendo,' a presente invenção usa somente uma fonte natural-para regular o pH do caldo/meio de cultura de fermentação.
A saturação por oxigênio usando o ar é realizada poraeração controlada desse processo aeróbico, regulando dessemodo o pH do processo. Conseqüentemente, o presenteprocesso diminui o consumo de perigosos ácidos e/oucompostos alcalinos.
A presente invenção provê um método para regular aprodução de um metabólito ácido produzido por uma célulamicrobiana por meio da regulação da saturação de oxigêniodo caldo de fermentação. Mais especificamente, o métodoconsiste em prover uma célula microbiana em um sistema decultura de fermentação submersa, em que a saturação deoxigênio do meio de cultura da . cultura de fermentaçãosubmersa é regulado/controlado, para produzir um metabólitoácido. Regular ou controlar a saturação de oxigênio doreferido meio de cultura garante que o pH do meio decultura seja mantido entre pH 4 e pH 7, preferivelmenteentre pH 4 e pH 6 e, mais pref erivelmente, entre pH 4 e pH5,5. A referida regulação provê um método para produzir o'metabólito ácido que permite a obtenção de uma altaconcentração do metabólito ácido no caldo de fermentação(meio de cultura).
Preferivelmente, o metabólito ácido é selecionado nogrupo que consiste de ácido urônico, ácido paspálico,metil-carbinol-amino . de ácido lisérgico e ácidomicofenólico. Preferivelmente, o metabólito ácido é ácidomicofenólico.
Preferivelmente, a célula microbiana é selecionada nogrupo que consiste de uma célula fúngica e uma célulabacteriana. Preferivelmente, a célula microbiana é umacélula fúngica; mais preferivelmente, a célula microbiana éuma célula de Penicillium sp. para a produção de ácidomicofenólico, uma célula de Claviceps sp. para a produçãode ácido paspálico e metil-carbinol-amino, ou uma célula deKlebsiella pneumoniae para a produção de ácido urônico.
Preferivelmente, a célula de Penicillium sp. é uma linhagemúnica de Penicillium. Preferivelmente, a linhagem dePenicillium é.a linhagem que tem o número de acesso CCM8364.
No método da presente invenção, um meio de culturaadequado consiste de uma fonte básica e uma fonte complexade nitrogênio. A fonte básica de nitrogênio pode ser, porexemplo, moléculas inorgânicas simples, aminoácidos ououtros compostos orgânicos contendo nitrogênio, como porexemplo sais de amônia/amônio, qualquer aminoácidonaturalmente ocorrente. Uma fonte complexa de nitrogêniopreferencial é a caseina hidrolisada e/ou milho macerado. Omeio de cultura também contém uma fonte de carbono. Umafonte de carbono adequada para uso no meio de cultura podeser um carboidrato, preferivelmente um açúcar, maispreferivelmente um monossacarideo e, mais preferivelmenteainda, sacarose.
Além disso, o meio de cultura contém um suplemento deaminóácido especifico em acréscimo à fonte complexa denitrogênio, ou quando a fonte básica de nitrogênio é umaminoácido simples. Preferivelmente, o suplemento deaminoácido inclui uma ou mais das seguintes: glicina,metionina e asparagina. Preferivelmente, a metionina é D,L-metionina. Preferivelmente, a asparagina é L-asparagina.
O aminoácido no suplemento de aminoácido é geralmenteusado em uma concentração de cerca dè 1 a cerca de 30g porlitro, preferivelmente em uma concentração de cerca de 5 acerca de Bg/litro. A glicina é geralmente usada em umaconcentração de cerca de 1 a cerca de 30g/litro,preferivelmente em uma concentração de cerca de 2 a. cerca:de 20 g/litro; mais preferivelmente, a glicina é usada em,uma concentração de cerca de 3 a cerca de 15 g/litro e,mais preferivelmente ainda, a concentração de glicina é decerca de 5 a cerca de 8 g/litro.
A D,L-metionina é geralmente usada em uma concentraçãode cerca de 0,01 a cerca de 10 g/litro; maispreferivelmente, a D,L-metionina é usada em umaconcentração de cerca de 0,1 a cerca.de 1 g/litro.
A L-asparagina é geralmente usada em uma concentraçãode cerca de 1 a cerca de 30 g/litro; mais preferivelmente,a L-asparagina é usada em uma concentração de cerca de 2 a20 g/litro; ainda mais preferivelmente, a L-asparagina éusada em uma concentração de cerca de 3 a cerca de 15g/litro, e o mais preferível é que seja usada em umaconcentração de cerca de 5 a cerca de .8 g/litro.
A regulação da produção de MPA ocorre quandopenicillium sp. é cultivada em uma cultura de fermentaçãosubmersa que tem um nível definido de saturação de.oxigênio. Nessa cultura de fermentação submersa o nível desaturação de oxigênio no meio de cultura é controladodurante pelo menos uma ,parte da fase de produção.Alternativamente, o nível de saturação de oxigênio écontrolado durante toda a fase de produção. Assim sendo, onível de saturação de oxigênio no meio de cultura pode sercontrolado durante o período de tempo desde 0a24 horas,ou durante o período de tempo desde 0 a 48 horas, ou desde24 a 48 horas ou desde 48 horas. Preferivelmente, o nívielde saturação de oxigênio é controlado até que o pH subadevido ao esgotamento da fonte de carbono no final da fasede produção.
A produção de MPA em fermentação submersa pode;; seraumentada controlando-se o nível de saturação de oxigêniono meio de cultura. Preferivelmente, o nível de saturaçãode oxigênio está na faixa de 5 a 4 0%; mais prefetivèlíriénté,o nível de saturação de oxigênio está na faixa de 5 a 35%e, ainda mais preferivelmente, o nível de saturação deoxigênio está na faixa de 5 a 30%. A porcentagem desaturação de oxigênio refere-se ao p02, conforme medido poreletrodo p02, de acordo com o qual uma saturação deoxigênio de 100% está correlacionada com a aeração máximado meio de cultura, sem a cultura de células microbianas.
Em uma incorporação preferencial, a Penicillium sp écrescida em um meio de cultura diferente nas etapas deinoculação e produção da cultura. A primeira etapa (etapade inoculação) começa em T=O horas; uma segunda etapa podecomeçar em T=24 horas e a terceira etapa (etapa deprodução) pode ter início em T=48 horas.
Preferivelmente, o processo consiste ainda em crescercélulas microbianas em um meio de inoculação e em inocularo meio de produção com um inoculado de, no mínimo, 20% e,pref erivelmente, no mínimo 25% do volume do meio deprodução.
No método da presente invenção, o- pH do meio decultura é mantido em um pH acima de pH 4, pref erivelmenteentre pH 4 e pH 7. Preferivelmente, o pH é mantidoregulando-se o nível de saturação de oxigênio no meio decultúra. O nível de saturação de oxigênio no meio decultura é regulado pelo monitoramento contínuo do nível deoxigênio usando-se um eletrodo p02 e ajustando-se o nívelde oxigênio quando necessário, por meio do ajuste davelocidade da agitação e do volume.de ar adicionado. Assim,o pH do meio de cultura pode ser mantido em um pH acima depH 4 durante a etapa de produção da cultura, que é operíodo em que o metabólito ácido é ativamente produzido nosistema de cultura de fermentação. Esse período podecomeçar após um inoculado com a célula microbiana ter sidotransferido para o sistema de cultura de fermentação.Preferivelmente, o pH é acima de pH 4,5 durante a etapa deprodução da cultura; mais preferivelmente, o pH :é -entrecerca de pH 4,5 e cerca de pH 5,5 durante a etapa deprodução da cultura.
A temperatura da cultura submersa regulada dessamaneira é mantida entre cerca de 20°C e cerca de 30°C, porum período de tempo suficiente para produzir MPA.
Preferivelmente, a temperatura da cultura submersa noprocesso da presente invenção é mantida entre cerca de 24°Ce cerca de 26°C, por um período de cerca de 240 horas acerca de 300 horas.
A regulação da produção de ; MPA, de acordo com oprocesso para regular o nível de saturação de oxigênio nomeio de cultura da presente invenção, produz umaconcentração final de MPA (gramas/litro de meio de cultura)que é acima de 1 g/litro; mais preferivelmente, acima de 2g/litro ou acima de 3 g/litro e, ainda maispreferivelmente, acima de 4 g/litro e, mais preferivelmenteque tudo, acima de 5 g/litro, acima de 6 g/litro, ou acimade 8 g/litro.
A presente invenção também provê uma nova linhagem dePenicillium sp. (depositada com o número de acesso CCM8364) que produz altos níveis de MPA, como, por exemplo,acima' de 1 g/litro. Essa linhagem produz níveis mais altosde MPA em comparação com uma linhagem de Penicillium sp dotipo selvagem, a partir da qual foi produzida a linhagemCCM 8364. A referida linhagem selvagem de Penicillium spproduz MPA com um rendimento médio de cerca de 600 mg/litroquando crescida em cultura submersa.
A presente invenção também provê uma cultura dareferida . linhagem, preferivelmente uma culturabiologicamente pura; por exemplo, uma cultura que consisteapenas no crescimento de células dá linhagem fúngica com onúmero de depósito CCM 8364. Tal cultura contém,preferivelmente, pelo· menos cerca de 90% dessa linhagem"fúngica. Essa linhagem em cultura pode ser' na forma decélulas individuais, agregados celulares, hifas, filamentose seus agregados em qualquer ou sobre qualquer superfícieou ambiente.
A linhagem de Penicillium sp que tem o número deacesso CCM 8364 é capaz dé. produzir uma concentração finalde MPA (gramas/litro de meio de cultura) acima de 1g/litro, preferivelmente acima de 2 g/litro ou acima de 3g/litro, mais preferivelmente acima de 4 g/litro e, aindamis preferivelmente, acima de 5 g/litro, acima de 6 g/litroou acima de 8 g/litro.
A linhagem de Penicillium sp CCM 8364 é produzidausando-se um sistema de métodos químicos e físicos paraproduzir; mutações, combinados com meios de seleçãopositiva.
A presente invenção também provê .um processo parapreparar micofenolato mofetil por meio da preparação deácido micofenólico de acordo com o processo da presenteinvenção e a sua subseqüente conversão em micofenolatomofetil. 0 ácido micofenólico pode ser convertido emmicofenolato mofetil, por exemplo, de acordo com o processodescrito em W0-02/100855;
A invenção tendo sido descrita com referência aincorporações preferenciais específicas e exemplosilustrativos, os profissionais com experiência nessa artepoderão reconhecer modificações da invenção conformedescrita e ilustrada que não ultrapassam o espírito eabrangência da invenção conforme foi descrita naespecificação. As descrições das referências citadas nestepedido de patente ficam incorporadas ao presente porreferência. Além disso, os seguintes exemplos destinam-se ailustrar adicionalmente certas incorporações preferenciaisda invenção e não são limitantes por natureza.Exemplos
Exemplo 1; Características do Crescimento da LinhagemCCM 8364 de Penicillium
Morfologia Macroscópica
Durante o crescimento saprofitico em meio malteespessado com agar -MEA- (35 g de extrato de malte, 5 gde peptona, 13 g de agar, .1000 ml de H2O), a linhagem CCM8364 forma colônias de micélios aéreos ^sphacelus" com umdiâmetro de 1,1 cm, após 7 dias de cultivação. A textura dasuperfície é aveludada, centralmente umbonada e tem margensbrancas. 0 nível de conidiogênese é moderado, as colôniastêm uma coloração próxima do marrom com presença .deexudado, amarelo-marrom, com reverso amarelo-marrom.
Durante o crescimento saprofitico em meio de levedurade Czapek espessado com agar, a linhagem CCM 8364 formacolônias de micélios aéreos "sphacelus" com um diâmetro de2,3 cm, após 7 dias de cultivação. A textura da superfícieé aveludada, é sulcada radialmente e centralmente umbonada,com margens brancas. 0 nível de conidiogênese é moderado,as colônias têm coloração próxima do marrom, com presençade exudado marrom avermelhado, com reverso cor de canela.
Durante o crescimento ..,saprofitico em meio de produçãoG25N espessado com agar, a linhagem CCM 8364 forma colôniasde micélios aéreos "sphacelus" com um diâmetro de 0,3 cm,após 7 dias de cultivação. A textura da superfície éaveludada. 0 nível de conidiogênese é de leve a moderado,as colônias são centralmente planas ou elevadas com margensbrancas, e têm coloração cinzenta enfumaçada - cinzentaazulada com um toque esverdeado, ausência de exudado,reverso pálido.
Morfoloqia Microscópica
O micélio consiste de estipes de 300-600 χ 4-6 μιη, asuperfície é lisa, penicilos variáveis, triverticilados eirregulares, com mais pontos de ramificação ocorrendo em umpadrão não uniforme, ramos em verticilos de 2 a 3, metulasem verticilos, 12 a 20 χ 4 a 4,5 μπι, fiálides ampuliformes-acerosas, medindo 13 a 16 χ 2,5 a 3 μm, conidios em cadeiascurtas, esferóides de 3,5 a 5,5 μτη e elipsóides de 4 a 6 χa 4 μm com disjuntores, paredes distintamente ásperas.
Exemplo 2: Ensaio de MPA
Cada isolado foi avaliado quanto à produção de MPA.Este ensaio consiste de duas etapas. - inoculação eprodução. 0 meio de inoculação (IM - Inoculation Médium)contém fontes de carbono (por exemplo, sacarose), fontes denitrogênio (as fontes adequadas incluem caseina hidrolisadae milho macerado) e sais inorgânicos (como KH2PO4) . 50 mlde IM foram esterilizados a 120°C por 20 minutos, em umfrasco de Erlenmeyer de 250 ml. Os esporos do isolado foramlavados para fora de uma cultura em agar, com 20 ml de águaesterilizada. 5 ml dessa suspensão de esporos foram usadoscomo inoculado para o IM e, então, cultivados por 3 a 5dias a uma temperatura de 24 a 28°C, com uma taxa de 280rotações por minuto, durante agitação. 0 IM resultante foiusado para inoculação do meio de produção (PM - ProductionMédium) por adição de 10% do volume total.
0 PM utilizado na presente invenção para o ensaio deMPA .contém fontes de carbono (por exemplo, sacarose),fontes de nitrogênio (as fontes adequadas incluem caseina eaminoácidos como glicina, asparagina, metionina) e saisinorgânicos (por exemplo, K3PO4, MgSO4) . 50 ml de PM foramesterilizados a 120°C por 20 minutos, em um frasco deErlenmeyer de 250 ml. Uma cultivação para teste foi entãoconduzida sob condições aeróbicas, a uma temperatura de 24a 28°C, com agitação, por 10 a 14 dias. A taxa de agitaçãofoi de 280 rotações por minuto. O pH do meio foi medidoantes da inoculação (pH de 4,9 a 5,1) e duas ou três vezesantes do final do experimento, usando-se um medidor de pHconforme descrição acima. 0 nível;de saturação de oxigêniofoi medido continuamente em fermentadores de laboratório ouindustriais. As alíquotas contendo MPA foram analisadasusando-se cromatografia HPLC, de acordo com técnicaspadronizadas conhecidas pelas pessoas experientes nessaarte, para determinar o seu conteúdo de MPA em comparaçãocom um padrão (padrão interno IVAX para MPA de acordo com orelatório de pesquisa RR/RD/CH024/01-A, retesteRR/RD/AN061/05-A). A coluna usada foi uma Chromolith speedRODr RPl8e, 50 χ 4,6 mm (fabricada pela MERCK); fase móvel:40% de acetonitrilo, 60% de água contendo 680 μΐ de H3PO4por litro de H2O, fluxo de 5 a 6,5 ml/minuto e temperaturade 300C.
Exemplo 3: Processo de Mutação e Seleção
1. Seleção
Na primeira etapa do procedimento a cultura esporuladade Penicillium sp do tipo selvagem foi suspensa em água elivrada de fragmentos de micélios. A suspensão foi entãodiluída para 100 esporos/ml e espalhada em placas Petricontendo;MEA. As placas foram então incubadas à temperaturade 24 a 27°C, por sete dias. As colônias que cresceram naplaca de agar foram colhidas e mantidas no mesmo meionutriente de agar, em um frasco de Blacke. Após 16 dias decultivação, isolados de monocolônias foram testados notesté de produção. O isolado com a melhor produção (1,2 gMPA por litro de caldo de fermentação) sofreu mutação naetapa subseqüente.
2. Mutação com N-metil-N'-nitro-N-nitroso-guanidina (NG)
Uma cultura esporulada foi suspensa em água e livradade fragmentos de micélios. As populações de conídios foramentão expostas à solução de 0,2 M NG em salmoura por 8horas. Nesse tratamento de mutação, aproximadamente 99,9%dos esporos foram mortos. Os esporos tratados foram entãolavados e livrados de mutagenes e espalhados em placasPetri contendo MEA. As placas foram incubadas a umatemperatura de 24 a 27 °C, por sete dias. As colônias quecresceram na placa de agar foram colhidas e mantidas emculturas do mesmo meio nutriente de agar, em um frasco deBlacke. Após 16 dias de cultivação, isolados demonocolônias foram testados no teste de produção. O isoladocom a melhor produção (2,4 g de MPA/litro de caldo defermentação) sofreu mutação na etapa subseqüente.
3 - Mutação com etil-metano-sulfonato
Uma cultura esporulada foi suspensa em água e livradade fragmentos de micélios. As populações de conidios foramexpostas à solução de 0,2M EMS em salmoura, por 16 horas.Nesse tratamento de mutação aproximadamente 99,9% dosesporos foram mortos. Os esporos foram então lavados elivrados de mutagenes e inoculados em placas de Petricontendo MEA. As placas foram incubadas à temperatura de 24a 27°C por 7 dias, até se formarem colônias nas placas. Ascolônias foram colhidas e mantidas em culturas do mesmomeio agar nutriente, em um frasco de Blacke. Após 16 diasde cultivação, isolados de monocolônias foram testados noteste de produção. 0 isolado com a melhor produção (5,6 gde MPA por litro de caldo de fermentação) sofreu mutação naetapa subseqüente.
4 - Mutação com irradiação ultravioleta
Uma cultura esporulada foi suspensa em água e livradade fragmentos de micélios. A suspensão foi diluída para 1 χIO5 esporos/ml e espalhada sobre placas de Petri contendoMEA. As placas foram expostas à radiação ultravioleta,sendo a dose de radiação de cerca de 15 Jm -2 S-1, por cercade 500 segundos. Nesse tratamento de mutaçãoaproximadamente 99,9% dos esporos foram mortos. As placasde Petri foram então incubadas à temperatura de 24 a 27°C,por sete dias. As colônias que cresceram na placa de agarforam colhidas e mantidas em culturas do mesmo meio agarnutriente, em um frasco de Blacke. Após 16 dias de cultivo,isolados de monocolônias foram testados no teste deprodução. 0 isolado com a melhor produção (6,0 MPA/litro decaldo de fermentação) sofreu mutação na etapa subseqüente.
5. Mutação com radiação Gamma
Uma cultura esporulada foi suspensa em água e livrada,de fragmentos de micélios. A suspensão foi diluída para Ixesporos/ml e exposta à radiação Gamma, com a dose deradiação sendo de 1500 Gy. Os isolados irradiados foramespalhados sobre placas de Petri contendo MEA. As placas dePetri foram então incubadas à temperatura de 24 a 270C porsete dias, até se formarem colônias sobre as placas. Ascolônias foram colhidas e mantidas em culturas do mesmomeio agar nutriente, em um frasco Blacke. Após 16 dias decultivo, isolados de monocolônia foram testados no teste deprodução. O isolado com a melhor produção (10 g de MPA porlitro de caldo de fermentação), foi passado duas vezessobre meio agar em um frasco de Blacke. O teste de produçãofoi realizado após cada passagem, para se verificar acontinuidade da elevada produção de MPA.
A recém-produzida linhagem foi depositada conforme oTratado de Budapeste na Coleção Tcheca de Microorganismos(CCM) na Universidade Masaryk, Tverdého 14, Brno, República
Tcheca, sob número CCM 8364.
0 sistema de procedimentos de mutação, quandocombinado com os procedimentos de seleção positiva,resultou em um aumento do conteúdo médio de MPA, de 600 mgde MPA por litro de caldo de fermentação para a linhagemoriginal, para 10 g de MPA . por litro de caldo defermentação para a linhagem CCM 8364, de acordo com oensaio de MPA.
Exemplo 4: Produção de MPA durante Fermentação em Culturade Alta Saturação de Oxigênio
A linhagem CCM 8364 foi usada para fermentação em umfermentador submerso, com volume total de cerca de 14metros cúbicos. 0 meio de produção continha sacarose como,fonte de carbono e caseina hidrolisada, glicina, asparaginae metionina como fontes de nitrogênio e minerais, inclusiveΚ, P e Mg, com um pH inicial de 5,0. O meio de produção foiinoculado pelo inoculado da terceira etapa (aproximadamente26% do peso). A temperatura de cultivo foi de 24 a.26°C, eo tempo da fermentação de produção foi de 285 horas. O pHdo meio de cultivação foi controlado saturando-se comoxigênio até um nivel acima de 30%. Os valores do oxigêniodissolvido, pH durante a cultivação e concentração de MPAno final da etapa de produção estão resumidos na tabelaseguinte. Devido à saturação de oxigênio dó., meio deprodução o pH caiu abaixo de pH 4 e o nivel final deprodução de MPA alcançou 5,7 g de MPA por litro.
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Exemplo 5: Produção de MPA durante Fermentação em Culturade Baixa Saturação de Oxigênio
A linhagem 8364 foi usada para fermentação em umfermentador submerso com volume total de cerca de 14 metroscúbicos. O meio.de produção continha sacarose como fonte decarbono e caseina hidrolisada, glicina, asparagina emetionina como fontes de nitrogênio e minerais inclusive K,P e Mg, còm um pH inicial de 5,0. A linhagem de produção,Penicillium sp CCM 8364 foi usada para fermentação. 0 meiode produção foi inoculado pelo inoculado da terceira etapa(aproximadamente 26% do peso). A temperatura de cultivaçãofoi de 24 a 260C e o tempo de fermentação da produção foide 278 horas. O pH do meio de cultivação foi controlado pormeio da saturação com oxigênio. Os valores do oxigêniodissolvido, pH do meio de cultura durante a cultivação econcentração de MPA no final da etapa de produção estão natabela seguinte.
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Exemplo 6: Produção de MPA durante Fermentação em Culturade Baixa Concentração de Oxigênio
A linhagem CCM 8364 foi usada para fermentação em umfermentador submerso com volume total de cerca de 14 metroscúbicos. O meio de produção continha sacarose como fonte decarbono e caseina hidrolisada, glicina, asparagina emetionina como fontes de nitrogênio e minerais, inclusiveΚ, P e Mg, com um pH inicial de 5,0. O meio de produção foiinoculado pelo inoculado da terceira etapa (aproximadamente26% do peso). A temperatura do cultivo foi de 24 a 26°C. Ocaldo de fermentação foi alimentado por um meio com umafonte de carbono (1 χ 10% do peso) às 143 horas e afermentação da produção terminou às 257 horas. 0 pH do meiode cultivação foi controlado por meio da saturação comoxigênio. Os valores do oxigênio dissolvido, pH do meio decultura durante o cultivo e concentração de MPA no final daetapa de produção estão na tabela abaixo.
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Exemplo 7: Produção de Micofenolato Mofetil de ÁcidoMicofenólico, de Acordo com WO 02/100855100 g de ácido micofenólico bruto, preparado-de acordo-com o exemplo 5, foram colocados em um frasco de reação comum refrigerador de refluxo, juntamente com .200 ml dedibutil éter. Sob agitação continua, a mistura foi aquecidaaté a temperatura de 50 a 60 0C e, então, foramacrescentados 40 ml de 2-morfolino-etanol. A mistura dereação foi aquecida até fervura sob separação azeotrópicada água. Após 48 horas, a mistura foi resfriada até 23°C e200 ml de diclorometano foram adicionados. A solução foiextraída duas vezes com 100 ml de K2CO3 aquoso 0,5M e umavez com 100 ml de água. Então, o diclorometano foidestilado a vácuo e a suspensão foi resfriada até umatemperatura de 10 a 15°C. Nessa matéria, o micofenolatomofetil cristalino sintetizado foi recristalizado doacetato etílico. Após a secagem dos cristais, foram obtidos110 gramas de micofenolato mofetil, com uma pureza acima de99,0% (HPLC).
Claims (32)
1. Um processo para regular a produção de um ácido metabólicoproduzido por uma célula microbiológica, caracterizado por compreendera regulação da saturação de oxigênio de um meio de cultura quecompreende a dita célula microbiológica.
2. O processo de acordo com a reivindicação 1, compreendendo aprovisão de ácido metabólico produtor de células microbiológicas em umsistema de cultura e fermentação submersa e do dito ácido metabólico apartir das ditas células microbiológicas na dita cultura, caracterizado pora dita saturação de oxigênio de um meio de cultura ser regulado paracontrolar o pH do meio de cultura.
3. O processo de acordo com a reivindicação 1 ou com areivindicação 2, caracterizado por o ácido metabólico ser selecionado dogrupo consistindo de ácido unrônico, ácido paspálico, metilcarbinolaminade ácido lisérgico e ácido micofenólico.
4. O processo de acordo com a reivindicação 3, caractèrizado por oácido metabólico ser o ácido micofenólico (MPA).
5. O processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por oácido micofenólico ser produzido no meio de cultura para umaconcentração final de MPA (g/l de meio de cultura) que está em excessode 1 g/i.
6. O processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por aconcentração estar em excesso de 5 g/l.
7. O processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por aconcentração estar em excesso de 8 g/l.
8. O processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores,caracterizado por a célula microbiológica ser selecionada do grupoconsistindo de uma célula de fungo ou uma célula de bactéria.
9. O processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por acélula microbiológica ser uma célula Penicillium sp.
10. O processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por acélula Penicillium sp. ser uma variante simples da Penicillium que tem onumero de acesso CCM 8364
11. O processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores,caracterizado por o meio de cultura compreender uma fonte denitrogênio básico e uma fonte de nitrogênio complexo.
12. O processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por afonte de nitrogênio complexo ser selecionada de caseína hidrolizada,sabugo de milho ou mistura de ambos.
13. O processo de acordo com a reivindicação 11 ou com areivindicação 12, caracterizado por a fonte de nitrogênio básicocompreender um sumplementar amino ácido.
14. O processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por osuplementar amino ácido ser um ou mais dentre o glicínio, a metionina ea asparagina.
15. O processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores,caracterizado por o nível de saturação do oxigênio ser controlado nafaixa de 5 a 40%.
16. O processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores,caracterizado por o nível de saturação do oxigênio ser controladodurante toda a inteira fase de produção.
17. O processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por onível de saturação do oxigênio no meio de cultura ser controlado duranteum período de tempo selecionado entre 0 e 24 horas, ou entre 0 e 48horas, ou entre 24 e 48 horas, havendo 48 horas de inoculação.
18. O processo de acordo com a reivindicação 16 ou com areivindicação 17, caracterizado por o nível de saturação do oxigênio sercontrolado até que o pH se eleve devido à depleção da fonte de carbonoao final da fase de produção.
19. O processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores,caracterizado por o meio de cultura ser mantido a um pH maior que pH 4.
20. O processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por opH ser mantido pela regulaçãodo o nível de saturação do oxigênio sercontrolado no meio de cultura durante a fase de produção do ácidometabólico.
21. O processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por opH estar entre pH 4,5 e pH 5,5 aproximadamente durante a fase deprodução.
22. Um processo de acordo com qualquer das precedentesreivindicações caracterizado por o ácido metabólico ser ácidomicofenólico, que é convertido em mofetil micofenolato.
23. O processo de acordo com a reivindicação 22 caracterizado por oácido micofenólico ser convertido em mofetil micofenolato por reaçãocom o 2-morfolinoetanol.
24. Uma variante do Penicillium sp. Depositado como número deacesso CCM 8364 na Coleção Tcheca de Microorganismos (CCM) daUniversidade de Masaryk, Brno, República Tcheca.
25. A variante de acordo com a reivindicação 24 na forma de célulasindividuais, células agregadas, hifas, filamentos e seus agregados emsuperfícies ou ambientes.
26. A variante do Pencillium sp.de acordo com a reivindicação 24 oucom a reivindicação 25, caracterizado por a dita variante ser capaz deproduzir uma concentração final de MPA (g/l do meio de cultura) queestá em excesso de 1g/l.
27. A variante do Penicillium sp.de acordo com a reivindicação 26,caracterizado por a concentração estar em excesso de 5g/l.
28. A variante do Penicillium sp.de acordo com a reivindicação 27,caracterizado por a concentração estar em excesso de 8 g/l.
29. Um processo para produção de um ácido metabólicocompreendendo a fermentação de uma variante de quaisquer dasreivindicações 24 a 28.
30. O processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por oácido metabólico ser selecionado do grupo consistindo ácido unrônico,ácido paspálico, metilcarbinolamina de ácido lisérgico e ácidomicofenólico.
31. O processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por oácido metabólico ser o ácido micofenólico (MPA).
32. Uso de uma variante de acordo com quaisquer das reivindicações-24 a 28 em um processo de acordo com quaisquer das reivindicações 1a 23.
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