BRPI0706368A2

BRPI0706368A2 - composição, vetor, método para fornecer resistência ao cisto nematódeo a uma planta, proteìna de fusão, método para inibir atividade biológica, ácido nucléico isolado

Info

Publication number: BRPI0706368A2
Application number: BRPI0706368-7A
Authority: BR
Inventors: Richard S Hussey; Eric L Davis; Thomas J Baum
Original assignee: Univ Georgia; Univ North Carolina State; Univ Iowa State Res Found Inc
Priority date: 2006-01-06
Filing date: 2007-01-05
Publication date: 2011-03-22
Also published as: CA2636070A1; WO2007087153A2; EP2330202A2; EP2330202A3; EP1974041A2; WO2007087153A3; US20090012029A1

Abstract

COMPOSIçãO, VETOR, MéTODO PARA FORNECER RESISTêNCIA AO CISTO NEMATóDEO A UMA PLANTA, PROTEìNA DE FUSãO, MéTODO PARA INIBIR ATIVIDADE BIOLóGICA, áCIDO NUCLéICO ISOLADO. Composições e métodos para fornecer resistência a cisto nematádeo são fornecidos. Um aspecto fornece células ou plantas transgênicas compreendendo um inibidor de ácidos nucléicos específicos para um ou mais polipeptideos das células das glândulas esofágicas de cisto nematódeo. Outros aspectos fornecem células ou plantas transgênicas resistentes a pelo menos duas espécies diferentes de cisto nematódeo.

Description

COMPOSIÇÃO, VETOR, MÉTODO PARA FORNECER RESISTÊNCIA AO CISTONEMATÓDEO A UMA PLANTA, PROTEÍNA DE FUSÃO, MÉTODO PARA INIBIRATIVIDADE BIOLÓGICA, ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADOCAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se de forma geral acomposições para o controle de parasitas nas plantas, maisparticularmente para composições de ácidos nucléicos paracontrolar doença por nematódeos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Nematódeos é um grande grupo de animais invertebradosgeralmente referidos como lombriga, vermes, anguilulla ounema. Alguns nematódeos são parasitas de plantas e podemalimentar-se de caules, brotos, folhas, e, particularmenteraizes. Os Cisto nematódeos (principalmente Heterodera eGlobodera spp.) · são pragas em grandes colheitas. Os Cistonematódeos são conhecidos por infectar tabaco, cereais,beterraba, batata, arroz, milho, soja e muitas outrasculturas. Heterodera schachtii ataca principalmente abeterraba e Heterodera avenae tem os cereais comohospedeiros. Heterodera zeae alimenta-se de milho e Globoderapallida e G. rostochiensis alimentam-se de batatas. A sojacom cisto nematódeo (Heterodera glycines) infesta todos osprodutores de soja nos Estados Unidos com perda total dorendimento de soja em estimativas aproximadamente US$ 1bilhão por ano.

A soja com cisto nematódeo (SCN) é uma planta comnematódeo parasita no qual vai mudando sua forma através doseu ciclo de vida. Na sua forma juvenil, SCN penetra asraizes da sojas. Na raiz, tornam-se machos ou fêmeas jovens.Os Machos retornam a forma original parecido com um verme edeixe as raizes à procura de fêmeas. Aqueles que se tornamfêmeas perdem a capacidade de locomoção, alargando-se em umaforma de limão "fêmea branca", no qual rompe a superfície daraiz, produz ovos após serem fertilizados pelos machos,morrem e se transforma em um cisto ou ovo, conforme o caso.Um único cisto nematódeo pode conter várias centenas de ovos.A maioria dos ovos permanece dentro do cisto, onde eles sãoprotegidos da dessecação do solo e depredação. Pode havermais de uma geração de SCN durante um único períodovegetativo, o que leva a múltiplas infestações da raiz.

0 número de jovens que entra na raiz da planta logo apósflorescimento da planta pode ter um efeito dramático nocrescimento e desenvolvimento das plantas. Os danos na plantaocorrem da alimentação juvenil no qual elimina materiaiscelulares e interrompe o tecido vascular. Em suma, a infecçãopor SCN inibe o crescimento e do funcionamento do sistemaradicular da soja, interferindo com a absorção de água enutrientes. A infecção por SCN também pode suprimir aformação do nódulo pelas bactérias de fixação de nitrogênio epode aumentar danos vegetais quando outros agentespatogênicos estão presentes no solo.

Os métodos existentes para tratar ou prevenir doençaspor nematódeo incluem: a utilização de produtos químicos,pesticidas e fumegantes. A utilização de fumegantes no soloem pré-vegetais é altamente eficaz no controle de cistonematódeos e de outros nematódeos parasitas de plantas. Noentanto, a maioria dos nematicidas tipo-fumigantes não estãomais disponível e também são caros e difíceis da corretaaplicação sob as condições prevalecentes.

A rotação das culturas também foi usada para controlar a25 doença por nematódeo. Plantas hospedeiras não-rotativas podemser eficazes no controle da doença por nematódeo.Infelizmente, estas culturas são muitas vezes menos valiosas.

A cobertura do crescimento das culturas entre as principaisculturas pode fornecer uma alternativa estratégia de gestão.

0 grão de centeio, cevada, aveia, erva do Sudão, festuca altae azevém anual têm sido demonstrado que são pobres ou semhospedeiros nematódeos. Usando culturas cobertas, no entanto,pode ser dispendiosa, porque para cobrir as culturas requerum espaço que poderia ser.utilizado para. crescimento de maisculturas valiosas.

Organismos de controle biológico também têm sido usadospara tentar controlar a doença de nematódeo em culturas.Preparações comercialmente disponíveis de organismos decontrole biológico são limitadas na sua utilização para asregiões que podem suportar o crescimento do organismo decontrole. Além disso, o resultado da utilização de um outroorganismo de controle é imprevisível e sujeito a umavariedade de fatores, tais como, tempo e clima.

Embora vários exemplos de genes de resistência ahospedeiros em diversas culturas já existem, adisponibilidade de resistência do hospedeiro às plantas ésubstancialmente limitada com lócus adequado de resistênciaque falta para a maioria das nossas culturas (Roberts, PA1992. Journal of Nematology 24:213-227). Outra limitação degenes de resistência natural é a durabilidade da resistência,visto que, uma quebra na resistência das populações de SCNpode desenvolver após a exposição contínua de cultivaresresistentes. 0 SCN é adaptável e podem acumular-sepreviamente sobre cultivares resistentes.

Os SCN jovens em ovos podem sobreviver no solo emcondições adversas dentro de cistos por longos períodos detempo tornando-se SCN difícil de controlar. . Além._ -disso-,- -osolo é um meio difícil de manipular, por exemplo, paraeficazmente um tratamento com nematicidas.

Assim, há necessidade de composições e métodos paracontrolar, prevenir, reduzir doenças por cisto nematódeo nasplantas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Aspectos da presente divulgação de forma geral fornecemplantas ou células transgênicas, material de plantastransgênicas, constructos de ácidos nucléicos que inibem asíntese e a atividade de proteínas celulares da glândulaesofágica secretadas pelos cistos nematódeos, em particularHeterodera glycines, também referido como SCN. Em algunsaspectos, a inibição de proteínas secretoras modula aexpressão gênica da planta hospedeira ou célula vegetalhospedeira, formação de um sincício na planta hospedeira,migração do nematódeo através de tecidos da raiz da plantahospedeira, metabolismo celular da planta hospedeira,transdução de sinal na célula vegetal hospedeira ou aformação de um tubo de alimentação que permite ao nematódeopara alimentar a partir de um sincicio formado na plantahospedeira. Outros aspectos fornecem células ou plantastransgênicas expressando ou contendo um ou mais inibidores deácidos nucléicos, por exemplo, inibição de RNA de filamentosimples ou duplo que inibem ou reduzem a síntese de proteínascelulares pelas glândulas esofágicas secretadas por cistonematódeo, por exemplo, SCN.

Outro aspecto fornece uma planta transgênica ou materialde plantas transgênicas que compreende um RNA inibitório queestabelece a regulação em um alvo de transcrição gênica deparasitismo por cisto nematódeo em 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais deHeterodera spp. Assim, a presente descrição fornece plantastransgênicas que são resistentes à doença causada por váriasespécies de cisto nematódeo.

Representantes de proteínas celulares da glândulaesofágica de cisto nematódeos são alvejados pela divulgaçãode inibidores de ácidos nucléicos incluir em uma ou mais dasproteínas codificadas pelas SEQ ID NOs. 1-63 e 113-116. Emcertos aspectos, um ou mais inibidores de ácidos nucléicossão introduzidos a um cisto nematódeo quando o nematódeoentra na planta transgênica ou nas células da plantatransgênica, alimentando-se das plantas transgênicas oucélulas das plantas transgênicas ou entrando em contatofísico com as plantas transgênicas ou células de plantastransgênicas. Uma vez que o inibidor de ácidos nucléicos éinternalizado pelo cisto nematódeo, o inibidor de ácidonucléico interfere, reduz ou inibe a síntese de uma proteínada célula glandular esofágica alvo, por exemplo, porinterferência direta ou indireta, reduzindo ou inibindo atradução de uma ou mais mRNAs de codificação de uma ou maisdas proteínas das células da glândula esofágica.Ainda em outro aspecto, fornece uma célula vegetaltransfectada com ácido nucléico heterólogos codificando uminibidor de ácidos nucléicos específicos para uma ou maisproteínas celulares da glândula esofágica de cisto nematódeo,onde os ácidos nucléicos heterólogos são expressos em umaquantidade suficiente para reduzir ou evitar a doença porcisto nematódeo. Em um aspecto, as plantas transgênicasexpressam o inibidor de ácidos nucléicos e o inibidor deácidos nucléicos é introduzido na alimentação do cistonematódeo ou uma tentativa para alimentação sobre a plantatransgênica. Geralmente, o inibidor de ácidos nucléicos éinternalizado pelo nematódeo. Exemplos de métodos deinternalização do inibidor de ácidos nucléicos podem incluira ingestão de ácidos nucléicos ou absorção de ácidosnucléicos.

Ainda outro aspecto proporciona uma planta transgênicacompreendendo um inibidor de ácidos nucléicos específicospara um ou mais polipept ídeos de parasitismo de cistonematódeo, onde o inibidor de ácidos nucléicos ofereceresistência para duas ou mais espécies de cistos nematódeos,por exemplo, dois ou mais Heterodera ou Globodera spp.

Os detalhes de uma ou mais incorporações estãoestabelecidos no acompanhamento de desenhos e na descriçãoabaixo. Outras características, objetos e vantagens dadivulgação serão melhor compreendidas a partir da descrição edesenhos, e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura IA mostra um alinhamento de seqüêncianucleotídica de comprimento total do gene de parasitismo doc DNA 4E02 entre H. schachtii (BCN) (SEQ NO ID: 113) e H.glycines (SCN) (ID SEQ NO: 8) . Note-se que os genes são 99%idênticos entre estas duas espécies.

Figura IB mostra um alinhamento de seqüêncianucleotídica do comprimento total do gene de parasitismo doc DNA SYV46 entre H. schachtii (BCN) (SEQ NO ID: 114) e H.glycines (SCN) (ID SEQ NO: 61) . Note-se que os genes são 93%idênticos entre estas duas espécies

Figura IC mostra um alinhamento de seqüêncianucleotidica do comprimento total do gene de parasitismo docDNA 4 FOl entre H. schachtii (BCN) (SEQ NO ID: 115) e H.glycines (SCN) (ID SEQ NO: 9). Note-se que os genes são 97%idênticos entre estas duas espécies.

Figura ID mostra um alinhamento da seqüêncianucleotidica do comprimento total do gene de parasitismo docDNA 5 DO 8 entre H. schachtii (BCN) (SEQ NO ID: 116) e H.glycines (SCN) (ID SEQ NO: 14). Note-se que os genes são 98%idênticos entre estas duas espécies.

A Figura 2 mostra um gráfico de barras das taxas degerminação de Arabidopsis do tipo selvagem, annAt mutante deArabidopsis mutante e annAt mutante expressando 4F01 deArabidopsis. Note que a expressão do gene 4F01 parcialmenteresgata a tolerância das plantas mutante annAt aos meioscondicionado com 75 mM de NaCL.

A Figura 3 mostra uma tabela mostrando dobra relativadiminuição da transcrição acumulação (coluna d) em comparaçãocom actina gene controla como medido por PCR em tempo real,depois de imersão pré-parasitica de segunda fase juvenil (J2)de H. glycines em 5,0 mg/ml ou 2,5 mg/ml filamento duplo deRNA. Nucleotideos 161-445 e 569-835 do HG-pell cDNA foramutilizados como modelo para produzir dsRNA de 285 (ds285) e-267 (ds267) nucleotideos, respectivamente. Efeitos da imersãoH. glycines J2 em dsRNA da proteína verde fluorescente (GFP)são incluídos como um controle negativo.

A Figura 4 mostra um gráfico de barras demonstrando onúmero médio de H. schachtii fêmeas do tipo selvagens e dequatro linhagens independentes segregantes transgênicas deArabidopsis expressando parcialmente (170 pb) SYV4 6 dsRNA.Ntcel7-SYV4 6-L8 (Ti) e Ntcel7-SYV46-L10 (Tx) mostrando umadiminuição significativa (p <0,007) o (*) em fêmeas porplantas comparadas ao controle de plantas do tipo selvagens.

A Figura 5 mostra um gráfico de barras demonstrando onúmero de fêmeas por sistema de raiz em plantas Tlindividuais em duas linhagens independentes de Arabidopsisthaliana de RNAi vegetal para o gene SYV4 6 do cisto nematódeoem comparação com o número de fêmeas produzidos em raízes deplantas individuais do tipo selvagens.

A Figura 6 mostra um gráfico de barras demonstrando onúmero médio de fêmeas de H. schachtii em 3 linhagens desegregação independentes transgênicas de Arabidopsisexpressando o comprimento total 4F01 dsRNA. Ntcel7-4F01-4-l eL4-2 (T2) e Ntcel7-4F01-L5 e L5-1-2 (T2) mostram umadiminuição significativa (p <_0.03), (*) Em fêmeas porplanta, em comparação com infecção de H. Schachtii de raízesde plantas selvagens.

A Figura 7 mostra um gráfico de barras demonstrando onúmero de fêmeas por H. schachtii por sistema de raizindividual em plantas T2 individuais em duas linhagens deArabidopsis thaliana independente de RNAi vegetal para o gene4 FOl de cisto nematódeo comparado ao número de fêmeasproduzidos nas raízes de plantas do tipo selvagens.

Figuras 8A-B mostram um gráfico de barras demonstrando onúmero de fêmeas de H. schachtii (infecções) produzidos emraízes do tipo selvagem (WT) e transformantes primáriosindividuais (T0) de Arabidopsis contendo construções deGmubi-2OEO3-RNAi (A) e Gmubi - 23G12-RNAÍ (B).

A figura 9 mostra um gráfico de barras demonstrando o25 número médio de fêmeas de H. schachtii em quatro linhagenstransgênicas de Arabidopsis expressando dsRNA parcial. Cadalinhagem foi replicada duas vezes no experimento. Todas aslinhagens, mas nem todas as repetições, mostram umadiminuição significativa (*) de fêmeas em comparação com ocontrole de plantas do tipo selvagens.

DESCRIÇÃO DETALHADA

1.Definições

Antes de explicar as várias definições incorporadas dadivulgação, é para ser entendido que a invenção não se limitana sua aplicação para os detalhes de construção e ao arranjodos conjuntos de componentes de descrição seguinte. Outrasincorporações podem ser praticadas ou realizadas de váriasformas. Além disso, é para ser entendido que a fraseologia eterminologia empregada aqui são para efeitos de descrição enão deve ser considerada como uma limitação.

Durante toda esta revelação, várias especificações apublicações, patentes e pedidos de patentes são referidos.Sempre que permitido, as divulgações dessas especificações aspublicações, patentes e pedidos de patentes são incorporadospor referência em sua totalidade dentro da presente descriçãopara melhor descrever o estado da técnica. Salvo indicação emcontrário, a divulgação engloba técnicas convencionais demelhoramento de plantas, imunologia, biologia molecular,microbiologia, biologia celular e de DNA recombinante, noqual estão dentro do estado da técnica. Ver, por exemplo,Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd edition (2001); Current Protocols In Molecular Biology[(F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)]; Plant Breeding:Principies and Prospects (Plant Breeding, Vol.l) M. D.Hayward, N. O. Bosemark, I. Romagosa; Chapman & Hall, (1993);Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher and Wingfeld, eds. (1995)CURRENT Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons,Inc.); the series Methods in Enzymology (Academic Press,Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D.Hames and G. R. Taylor eds. (1995)], Harlow and Lane, eds.(1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal CellCulture [R. I. Freshney, ed. (1987)].

Salvo disposição em contrário, os termos técnicos sãoutilizados de acordo com o uso convencional. Definições determos comuns em biologia molecular podem ser encontradas emLewin, Genes VII, published by Oxford University Press, 2000;Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology,published by Wiley-Interscience., 1999; and Robert A. Meyers(ed.), Molecular Biology and Biotechnology, a ComprehensiveDesk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995;Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing; Sambrook and Russell. (2001) MolecularCloning: A Laboratory Manual 3rd edition.

A fim de facilitar a compreensão da divulgação, estãoprevistas as seguintes definições:

Para "modificação" a expressão de um gene-alvo em umaplanta ou célula de nematódeo significa que o nivel deexpressão do gene na célula-alvo após a aplicação de ummétodo de apresentar a invenção é diferente da sua expressãona célula antes da aplicação do método. A modificação daexpressão gênica preferivelmente significa que a expressão dogene alvo na planta ou nematódeo é reduzido, preferentementefortemente reduzido, mais preferentemente a expressão do genenão é detectável. A modificação da expressão de um geneessencial pode resultar em um impressionante fenótipo mutanteem plantas ou células de nematódeos ou plantas ou plantas ounematódeos derivados destes. Alternativamente, a expressãomodificada pode incluir uma super-regulação de expressão degenes de plantas ou nematódeos.

"RNA Ant i-sentido" é uma vertente do RNA tendo umaseqüência complementar a um gene de mRNA alvo, e para induziro RNAi pela ligação ao gene de mRNA alvo. 0 "RNA sentido" temuma seqüência complementar ao RNA anti-sentido, e temperado asua complementaridade de RNA anti-sentido para levar àprodução de siRNA. Estes RNAs anti-sentido e sentido têm sidoconvencionalmente sintetizados com um sintetizador de RNA. Napresente invenção, estes RNAs são intracelularmenteexpressados de DNAs codificados para RNAs anti-sentido esentido (códons de' DNAs anti-sentido e sentido)),respectivamente conduzindo a acumulação intracelular de dsRNAe siRNA.

Como usado aqui, "tampão" refere-se a uma soluçãotamponada que resista a mudanças de pH, através da ação dosseus componentes conjugado ácido-base.

Quando se referindo à expressão, "seqüências controle",significa seqüências de DNA necessárias para a expressão deuma seqüência de codificação operativamente ligada a umdeterminado organismo hospedeiro. As seqüências de controleque são adequadas para procariotos, por exemplo, incluem umpromotor, opcionalmente uma seqüência operadora, um local deligação ao ribossomo e similares. As células eucarióticas sãoconhecidas por utilizar promotores, sinais de poliadenilaçãoe intensificadores.

O termo "célula" refere-se a uma unidade biológicalimitada por membrana capaz de replicação ou de divisão.

O termo "constructo" refere-se a uma recombinaçãogenética molécula compreendendo um ou mais seqüênciaspolinucleotidicas isoladas da invenção.

Constructo genético utilizado para uma expressãotransgênica no organismo hospedeiro compreende o sentido 5' -3', uma seqüência promotora; uma seqüência codificando uminibidor de ácidos nucléicos revelado aqui e uma seqüência determinação. A estrutura de leitura aberta pode ser orientadaem ambos os sentidos sentido ou anti-sentido. O constructopode ainda compreender selecionavelmente um gene marcador eoutros elementos regulatórios para a expressão.

Tal como usado aqui, o termo "elemento controle" ou"elemento regulatório" é utilizado indiferentemente aqui parasignificar seqüências posicionadas dentro ou adjacente a umaseqüência promotora, de modo a influenciar a atividade dopromotor. Os elementos de controle podem ser elementos decontrole positivo ou negativo. Os elementos de controlepositivo necessitam de uma ligação de um elemento regulatóriopara o inicio de transcrição. Muitos desses elementos decontrole positivo e negativo são conhecidos. Quando elementosde controle heterólogos são adicionados aos promotores paraalterar a atividade promotora como descrito aqui, eles estãoposicionados dentro ou adjacente à seqüência promotora demodo a ajudar a atividade regularizada pelo promotor naexpressão de uma seqüência de polinucleotideosoperacionalmente ligada.

O termo "cisto nematódeo" refere-se a um membro doHeterodera ou Globodera spp. e inclui, mas não se limita aHeterodera glycines e Heterodera schachtii. Adicionaisespécies de Heterodera incluem, mas não estão limitados a H.avenue, H. bífenestra, H. cajani. H. carotae, H. ciceri, H.cruciferae, H. cynodontis, H. cyperi, H. daverti, H.elachista, H. fiei, H. galeopsidis, H. goettingiana, H.

graminis, H. hordecalis, H. humuli, H. iri, H. Iatipons, H.lespedeza, H. leucilyma, H. Iongicaudata, H. mani, H. maydis,H. medicaginis, H. oryzae, H. oryzicola, H. sacchari, H.salixophila, H. sorghii, H. thfolii, H. urticae, H. vigna, H.zeae. Representative Globodera species include but are notlimited to G. achilleae, G. técnicamisiae, G. hypolysi, G.Ieptonepia, G. mali, G. pallida, G. rostochiensis, G. tabacume G. zefandica.

0 termo "heterólogo" refere-se aos elementos que ocorremquando estes não são normalmente encontrados. Por exemplo, umpromotor pode estar associado a uma seqüência de ácidosnucléicos heterólogos, por exemplo, uma seqüência que não énormalmente encontrada ligada operacionalmente ao promotor.Quando aqui utilizadas para descrever um elemento promotor,heterólogo significa um elemento promotor que difere do quenormalmente encontrado em promotores nativos, ambas asseqüência, espécie ou número. Por exemplo, um elemento decontrole heterólogo de uma seqüência promotora pode ser umelemento de regulação/controle de um promotor diferenteacrescentado para reforçar o controle do promotor ou umelemento adicional de controle do mesmo promotor.

Como usado aqui, o termo "homólogos" é genérico a"ortólogos" e "paralogos".

O termo "planta hospedeira" refere-se a uma plantasujeita à doença por nematódeo.

Como usado aqui, a frase "expressão induzida" significaaumentar a quantidade ou a taxa de transcrição e/ou atradução de genes específicos pela exposição das células quecontenham tais genes de um reagente efetor ou condição doindutor.

Um "indutor" é um agente químico ou físico, que, quandoaplicado a uma população de células, irá aumentar aquantidade de transcrição de genes específicos. Estes sãogeralmente pequenas moléculas, cujos efeitos são específicospara determinadas operons ou grupos de genes, e pode incluiraçúcares, fosfato, álcool, íons metálicos, hormônios, calor,frio e similares. Por exemplo, tiogalatopiranoside (beta)-Disopropílico (IPTG) e lactose são indutores do promotor taclle L-arabinose é um indutor adequado para o promotor dearabinose.

O termo "isolado", quando utilizado para descrever asvárias composições reveladas aqui, significa uma substânciaque tenha sido identificada e separada e/ou recuperada de umcomponente do seu ambiente natural. Por exemplo, umpolipeptídeo isolado ou polinucleotídeo está livre daassociação com, pelo menos, um componente com o qual énaturalmente associado. Componentes contaminantes do seuambiente natural são materiais que poderia normalmenteinterferir com diagnóstico ou terapêutico utilizados para opolipeptídeo ou polinucleotídios e podem incluir enzimas, eoutros solutos proteináceos ou não-proteináceos. Umasubstância isolada inclui a substância in situ dentro decélula recombinante. Normalmente, porém, uma substânciaisolada será preparada, pelo menos, por uma etapa depurificação.

Uma molécula de ácido nucléico ou polinucleotídio"isolada" é uma molécula de ácido nucléico que é identificadae separada de pelo menos uma molécula de ácido nucléicocontaminante com a qual é comumentemente associada em umafonte natural. O ácido nucléico isolado pode estar, porexemplo, livre de associação com todos os componentes com oqual está naturalmente associado. Uma molécula de ácidonucléico isolado é diferente, sob a forma ou a configuraçãoem que é encontrada na natureza.

"IPTG" é o composto" tiogalactopiranosideo (beta)-Disopropílico", e é usado aqui como um indutor do operon lac.IPTG liga a um repressor lac efetuando uma mudançaconf ormacional no repressor lac, no qual resulta em umadissociação do repressor lac do operador lac. Com o repressorlac não ligado, um promotor ligado operativamente é ativado egenes abaixo são transcritos.

O termo "operador lac" refere-se a uma seqüência deácidos nucléicos que pode ser vinculada por um repressor lac,lacl, tal como descrito, por exemplo, por Jacob, 1961, J.Moi. Biol., 3: 318-356. O promotor não é ativado quando orepressor lac está ligado ao operador lac. Quando o repressorlac é induzido a dissociar a partir do operador, o promotorestá ativado.

O termo "seqüência líder" refere-se a uma seqüência deácidos nucléicos posicionada acima de uma seqüência decodificação de interesse. Seqüências líderes descritas aquicontêm seqüências específicas conhecidas para ligar de formaeficiente aos ribossomos, proporcionando assim uma maioreficiência dos serviços de iniciação da tradução de algunspolinucleotídeos.

O termo "glândulas esofágicas do nematódeo ou células daglândula esofágica do nematódeo" refere-se aos trêsconjuntos, células da glândula ativa transcripcionalmente,uma dorsal e duas subventrais, localizadas no esôfago de umnematódeo e que são as principais fontes de secreções(proteínas parasitárias) envolvidas na infecção e parasitismode plantas por plantas parasitas de nematódeos nas ordensTylenchida e Aphelenchida.

A seqüência de ácidos nucléicos ou polinucleotídios é"operacionalmente ligada", quando é colocada em uma relaçãofuncional com outra seqüência de ácidos nucléicos. Porexemplo, DNA para uma pré-seqüência DNA ou líder secretóriaoperacionalmente ligada ao DNA para um polipeptídeo se estefor expresso como uma pré-proteína que participa na secreçãodo polipeptídeo; um promotor ou intensificador éoperacionalmente ligado a uma seqüência de codificação se elaafeta a transcrição da seqüência ou um local de ligação aoribossomo é operacionalmente ligado para uma seqüência decodificação se ele está posicionado de forma a facilitar atradução. Geralmente, "operacionalmente ligado" significa queas seqüências de DNA sendo ligadas são continuas, e, no casode um lider secretor, continuo e na leitura da estrutura. Aligação pode ser obtida pela ligação em locais de restriçãoconvenientes. Se não existirem tais locais, adaptadores deoligonucleótidios sintéticos ou ligados são usados de acordocom práticas convencionais.

0 termo "ortólogos" refere-se a ocorrências distintas domesmo gene em várias espécies. As ocorrências distintas têmsimilaridades, embora não idênticas, as seqüências deaminoácidos, o grau de semelhança de seqüência dependendo, emtécnica, da distância evolutiva das espécies a partir de umancestral comum com o mesmo gene.

Como usado aqui, o termo "paralogos" indica ocorrênciasdistintas de um gene de uma espécie. As ocorrências distintastêm semelhantes, embora não idênticas, as seqüências deaminoácidos, o grau de semelhança da seqüência depende, emtécnica, da distância evolutiva a partir do gene deduplicação do evento que deu origem às ocorrências distintas.

O termo "proteínas de parasitismo, polipeptideos deparasitismo, polipeptideos esofágicos, ou polipeptídeosecretor da célula glandular esofágica do nematódeo" refere-se às principais moléculas envolvidas no parasitismo deplantas por nematódeo, produtos de genes de parasitismoexpressos nas células da glândula esofágica de nematódeoparasita de plantas injetado através de seus estiletes dentrode tecidos hospedeiros para mediar o parasitismo de plantas.

"Percentual (%) de identidade de seqüências de ácidosnucléicos" é definido como a percentagem de seqüência denucleotídeos de uma seqüência candidato que são idênticas comos nucleotídeos, em uma referência a seqüência de ácidosnucléicos após o alinhamento das seqüências e introduzindolacunas, se necessário, para alcançar a porcentagem máxima deSeqüência de identidade. O alinhamento para efeitos dedeterminação de seqüência de identidade de ácidos nucléicosidentidade pode ser alcançada de várias formas que estãodentro do estado da técnica, por exemplo, usando software decomputador publicamente disponível, tais como BLAST, BLAST-2,ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Parâmetros adequadospara medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmosnecessários para atingir o alinhamento máximo sobrecomprimento completo das seqüências sendo comparados podemser determinados por métodos conhecidos.

Para fins aqui, a % de seqüência de identidade de ácidosnucléicos de uma determinada seqüência de ácidos nucléicos C,com, ou contra uma determinada seqüência de ácidos nucléicosD (que pode ser redigida como uma alternativa de umadeterminada seqüência de ácidos nucléicos C que tem oucompreende certa % de seqüência de identidade de ácidosnucléicos, com, ou contra uma determinada seqüência de ácidosnucléicos D) é calculada do seguinte modo:

100 vezes a fração W/Z,

onde W é o número de nucleotídeos pontuados como ascorrespondências idênticas pelo programa de alinhamento deseqüências com a seqüência em que o programa de alinhamentodo programa C, D, e onde Z é o número total de nucleotídeosde D. Será apreciado que onde o comprimento da seqüência C deácidos nucléicos não for igual ao comprimento da seqüência Dde ácidos nucléicos, a % de seqüências identidade de C a D deácidos nucléicos não será igual a % de seqüência identidadede D a C de ácidos nucléicos.

O termo "planta" é utilizado no sentido mais amplo. Eleinclui, mas não se limitando, a quaisquer espécies lenhosas,ornamentais ou decorativas, cultura ou cereais, frutas ouvegetais, algas verdes e de fotossíntese (por exemplo,Chlamydomonas reinhardtii). Também se refere a umapluralidade de células vegetais que são em grande partediferenciadas em uma estrutura que está presente em qualquerfase de uma planta em desenvolvimento. Essas estruturasincluem, mas não se limitando a, uma fruta, ramo, caule,folhas, flores pétala, etc. O termo "tecido vegetal" incluitecido de plantas diferenciado e indiferenciado, incluindoaqueles presentes nas raízes, brotos, folhas, pólen, sementese de tumores, assim como células em cultura (por exemplo,células simples, protoplastos, embriões, calos, etc.) Tecidosvegetais podem ser na planta, nos órgãos de cultura, culturade tecidos, células ou cultura. 0 termo "técnica vegetal",como aqui utilizado refere-se à estrutura de uma planta, umórgão da planta, ou tecidos vegetais.

Uma ocorrência da planta de forma não natural refere-sea uma planta que não ocorre na natureza sem uma intervençãohumana. Plantas de ocorrência não natural incluem plantastransgênicas e plantas produzidas por meios não-transgênicos,tais como, melhoramento vegetal.

O termo "célula vegetal" refere-se a uma unidadeestrutural e fisiológica de uma planta, composto por umprotoplasto e uma parede celular. Δ célula vegetal pode serna forma de uma única célula isolada ou de uma cultura decélulas ou como parte de uma unidade organizada maior, como,por exemplo, uma unidade de tecido, um órgão vegetal ou umaplanta inteira.

O termo "cultura de células vegetais" refere-se aunidades de culturas de plantas, como, por exemplo,protoplastos, células de cultura celular, células de tecidosvegetais, pólen, tubos de pólen, óvulos, sacos embrionários,zigotos e embriões em diferentes estádios de desenvolvimento.

O termo "material vegetal" se refere às folhas, caules eraízes, flores ou partes da flor, frutos, pólen, célulassomáticas, zigotos, sementes, estacas, culturas de células outecidos ou de qualquer outra parte ou produto de uma planta.

A "unidade orgânica" se refere a uma distinta e visívelestruturada e diferenciada da parte de uma planta como umaraiz, caule, folhas, flores broto, ou embrião.

"Tecido vegetal" refere-se a um grupo de célulasvegetais organizados em uma unidade estrutural e funcional.Qualquer tecido de uma planta se estiver na planta ou nacultura, está incluído. Este termo inclui, mas não se limita,a todos vegetais, órgãos vegetais, plantas, sementes equalquer tecido de cultura de células vegetais e gruposorganizados em estruturais e/ou unidades funcionais. Autilização deste termo em conjunto com, ou na ausência dequalquer tipo especifico de tecidos vegetais como listadoacima ou de outra forma adotada por esta definição não sedestina a ser exclusiva de qualquer outro tipo de tecidovegetal.

"Plasmídeos" são designados por uma letra minúscula "p"precedida e/ou seguida por letras maiúsculas e/ou números. 0plasmideo inicial aqui está comercialmente disponível,acessível ao público em uma base irrestrita ou pode serconstruído a partir de plasmídeos disponíveis em acordo comos procedimentos publicados. Além disso, plasmídeosequivalentes àqueles descritos são conhecidos no estado datécnica e será evidente para um técnico do assuntoqualificado.

Tal como utilizado aqui, "polipeptídeo" refere-segeralmente a peptídeos e proteínas com mais de cerca de dezaminoácidos. Os polipeptídeos podem ser "exógenos",significando que eles são "heterólogos", ou seja, estranhospara a célula hospedeira sendo utilizada, tais como,polipeptídeo humano produzido por uma célula bacteriana.

0 termo "promotor" refere-se a uma seqüência de ácidosnucléicos regulatória, normalmente localizada acima (5') deum gene ou seqüência codificando uma proteína que, emconjunto com vários elementos, é responsável pela regulaçãoda expressão do gene que codifica proteínas ou seqüência. Ospromotores adequados para utilização no constructo destadivulgação são funcionais nas plantas e nos organismoshospedeiros utilizados para expressar os polinucleotídiosinventivos. Muitos promotores de plantas são publicamenteconhecidos. Estes incluem promotores constitutivos,promotoresindutíveis, promotores específicos de tecidos e células epromotores de desenvolvimento regulados. Os exemplos depromotores e promotoras de fusão são descritos, por exemplo,na patente US N0 6.717.034, na qual é aqui incorporada pelasua referência em sua totalidade.

"Purificação", significa aumento do grau de pureza deuma substância em uma composição através da remoção (total ouparcialmente) de pelo menos um contaminante da composição.

Uma "etapa de purificação" pode ser parte de um processo depurificação global, resultando em uma composição"essencialmente pura". Uma composição essencialmente puracontém pelo menos, cerca de 90% em peso da substância deinteresse, com base no peso total da composição e podeincluir, pelo menos, cerca de 95% em peso.

O termo "elemento regulador" ou" elemento controlador"refere-se a seqüências de DNA para controlar o inicio datranscrição. Exemplos de elementos de controle ou regulaçãoincluem, mas não se limitam a, TATA Box, operadores,intensificador e similares. Os elementos reguladores oucontroladores incluem elementos de controle negativo eelementos de controle positivo. Um elemento de controlenegativo é aquele que é removido pela ativação. Muitoselementos de controle negativo são conhecidos, por exemplo,sistemas operador/repressor. Por exemplo, para a ligação doIPTG para o repressor Iac dissociado do operador para ativare permitir transcrição. Outros elementos negativos incluem atrp E. Coli e sistemas lambda. Um controle positivo é umelemento que é acrescentado para a ativação. Muitos desseselementos de controle positivo são conhecidos.

Promotores naturalmente contendo tanto elementosreguladores positivos como negativos são raros. O promotormetE é um exemplo. Ver, por exemplo, Neidhardt, Ed. De 1996,Escherishia coli e Salmonella, Segunda Ed., Páginas 1300-1309. Descrições de conhecidos elementos de controle positivoe negativo podem ser encontrados, por exemplo, nesta presentereferência. 0 posicionamento de um elemento de controlepositivo ou negativo dentro ou adjacente ao promotor pararealizar a regulação do promotor é conhecido, e é descrito,por exemplo, na Escherishia coli and Salmonella (Supra) naspáginas 1232-1245."Pequenas moléculas de RNA" referem-se a moléculas deRNA de filamento simples ou filamento duplo, geralmente menosdo que 200 nucleotideos de comprimento. Essas moléculas sãogeralmente menos de 100 nucleotideos e normalmente varia de10 a 100 nucleotideos de comprimento. Em um formatopreferido, pequenas moléculas RNA têm 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30nucleotideos. Pequenos RNAs incluem microRNAs (miRNA) epequenos RNAs interferentes (siRNAs). MiRNAs são produzidospela clivagem do pequenos precursores por enzimas semelhantesà Dicer, enquanto, os siRNAs são produzidos pela clivagem demoléculas de filamento duplo de RNA. Os MiRNAs são filamentossimples, enquanto siRNAs são filamentos duplos.

O termo "siRNA", significa uma pequeno RNA interferenteque é um RNA de filamento duplo de pequeno comprimento quenão é tóxico. Geralmente, não há qualquer limitação emparticular a duração de siRNA enquanto não mostra toxicidade.Os "siRNAs" podem ser, por exemplo, 15 a 49 pb, depreferência de 15 a 35 pb, e de preferência mais de 21 a 30pb de comprimento. Alternativamente, a porção de RNA defilamento duplo de um produto de transcrição final de siRNApode ser expressa, por exemplo, 15 a 49 pb, de preferência de15 a 35 pb, e de preferência mais 21 a 30 pb de comprimento.As porções de RNA de filamento duplo de siRNAs no qual doispares de filamento de RNA não estão limitados acompletamentariedade de emparelhamento e pode conter porçõesnão pareadas devido à falta de combinação (o nucleotideoscorrespondentes não são complementares),a saliência (a faltados nucleotideos complementares correspondentes nofilamento), e similares. As porções não-pareadas podem sercontidos na medida em que estas não interfiram com a formaçãosiRNA. A "saliência" utilizada aqui preferencialmentecompreende 1 a 2 nucleotideos não pareados e região de RNA defilamento duplo de siRNAs no qual dois pares de filamento deRNA contêm de preferência 1 a 7, mais de preferência de 1 a 5saliências. Além disso, a "não combinação" usada aqui écontida na região do RNA de filamento duplo do siRNAs no qualdois pares de filamentos de RNA, de preferência de 1 a 7,mais de preferência de 1 a 5, em número. Em uma nãocombinação preferível, um dos nucleotídeos é a guanina, e aoutra é uracila. De tal modo que a combinação é devido a umamutação de C para T, G para A ou misturas destas, no DNAcodificando um RNA sentido, mas não particularmente limitadoa estes. Além disso, no presente invenção, a região defilamento duplo de RNA de siRNAs no qual dois pares defilamento de RNA podem conter tanto saliências e nãocombinações, nos quais somam até, de preferência de 1 a 7,mais de preferência em número de 1 a 5.

A estrutura terminal siRNA pode sem corte ou coesa(ressaltada), enquanto os siRNA pode silenciar, reduzir ouinibir a sua expressão genética alveja devido a seu efeito deRNAi. A coesão (ressaltada) da estrutura final não se limitaapenas às 3' ressaltado e a estrutura ressaltada 5' podem serincluídas, desde que seja capaz de induzir o efeito RNAi.Além disso, o número de nucleotídeos ressaltados não selimita ao já mencionado 2 ou 3, mas pode ser qualquer número,desde que o deslocamento seja capaz de induzir o efeito RNAi.Por exemplo, o deslocamento consiste de 1 a 8, de preferência2 a 4 nucleotídeos. Aqui, o comprimento total de siRNA tendoestrutura coesa final é expresso como a soma do comprimentodo da porção de filamento duplo emparelhado e que compreendeextremidades de filamentos simples ressaltadas. Por exemplo,no caso de porção de RNA de filamento duplo de 19 com 4nucleotídeos ressaltados em ambas as extremidades, ocomprimento total é expresso em 23 pb. Além disso, uma vezque esta seqüência seja ressaltada tem baixa especificidadeque um gene-alvo, não é necessariamente complementar (anti-sentido) ou idêntica (sentido) para a seqüência genéticaalvo. Além disso, enquanto siRNA é capaz de manter o seuefeito de silenciamento sobre o gene no gene-alvo, siRNA podeconter um baixo peso molecular de RNA (que pode ser umamolécula RNA natural como tRNA, rRNA ou RNA viral, ou umamolécula artificial de RNA), Por exemplo, em uma porçãoressaltada na sua extremidade.

Além disso, a estrutura terminal "siRNA" não énecessariamente a estrutura-corte em ambas as extremidades,como descrito acima, e pode ter uma estrutura ciclo no qualas extremidades de um lado de filamento duplo de RNA estãoligadas por um RNA ligador. 0 comprimento da região defilamento duplo de RNA (porção da haste de ciclo) pode ser,por exemplo, 15 a 49 pb, de preferência de 15 a 35 pb, e depreferência mais 21 a 30 pb de comprimento. Alternativamente,o comprimento da região de filamento duplo de RNA, no qual éum produto final de transcrição siRNAs a ser expressas, porexemplo, é de 15 a 49 pb, de preferência de 15 a 35 pb, e depreferência mais 21 a 30 pb de comprimento. Além disso, nãohá nenhuma limitação em particular ao comprimento do ligadorenquanto tiver um comprimento de modo a não prejudicar oemparelhamento da porção da haste. Por exemplo, para oemparelhamento estável porção da haste e supressão darecombinação entre codificação de DNAs para a porção, aporção ligadora pode ter uma estrutura de trevo folha detRNA. Apesar de o ligador tem um comprimento que dificulta oemparelhamento da porção da haste, é possível, por exemplo,construir a porção ligadora para incluir íntrons, de modo queos íntrons são excisados durante o processamento do RNAprecursor em RNA maduro, permitindo assim que oemparelhamento da porção haste. No caso de uma haste de ciclosiRNA, quer finais (cabeça ou cauda) do RNA sem qualquerestrutura de ciclo, pode ter um baixo peso molecular RNA.

Como descrito acima, este baixo peso molecular RNA pode seruma molécula de RNA natural, como tRNA, rRNA ou RNA viral, ouuma molécula de RNA artificial.

"Peptídeo sinal" refere-se a uma cadeia peptídica aminoterminal curta (15-60 aminoácidos ao longo) que se direcionaa um posto translacional de transporte de proteínas;normalmente direciona o peptídeo para a rota secretora dacélula."Soja de cisto nematódeo ou SCN" refere-se a umnematódeo pertencente à Heterodera glycines. "Beterraba decisto nematódeo" refere-se a um nematódeo pertencente àHeterodera schachtii

"Transformado", "transgênicos", "transfectada" e"recombinante" referem-se a um organismo hospedeiro como umabactéria ou uma planta em que uma molécula de ácidosnucléicos heterólogo foi introduzido. As moléculas de ácidosnucléicos estável pode ser integrado no genoma do hospedeiroou os moléculas de ácidos nucléicos pode também estarpresente como uma molécula extra-cromossômica. Tais moléculasde extra-cromossômicas pode ser auto-reprodutivas. Célulastransformadas, tecidos ou plantas são entendidas no sentidode abranger não só o produto final de um processo detransformação, mas também a descendência transgênica deste.Um hospedeiro "não-transformado", "não-transgênicos", ou"não-recombinante" refere-se a um organismo de tipo selvagem,por exemplo, uma bactéria ou vegetal, que não contémmoléculas de ácidos nucléicos heterólogos.

A "célula transformada" refere-se a uma célula em quefoi introduzida uma molécula de ácidos nucléicos, porexemplo, por técnicas de biologia molecular. Tal como aquiutilizadas, o termo engloba qualquer técnica pela qual osácidos nucléicos poderá ser introduzido dentro de tal célula,célula vegetal ou animal, incluindo transfecção com vetoresvirais, transformação por Agrobacteriumf com vetoresplasmideos e de introdução de DNA livre por eletroporação,Lipofecção e aceleração de partículas alvos e incluitransformantes de transição, bem como, estáveis.

O termo "plantas transgênicas" refere-se a uma planta ouárvore que contém material genético recombinante quenormalmente não se encontram em plantas ou árvores destetipo, e que foi introduzido na planta em questão (ou emprogenitores da planta) pela manipulação humana. Assim, umaplanta que é cultivada a partir de uma célula vegetal, noqual o DNA recombinante é introduzido por transformação é umaplanta transgênica, como todos os descendentes da plantas quecontêm o que transgene introduzido (quer sejam produzidossexualmente ou assexualmente). Entende-se que o conceito deplantas transgênicas engloba toda a planta ou árvore e partesda planta ou árvore, por exemplo, grãos, sementes, flores,folhas, raízes, frutos, pólen, hastes, etc.

0 termo "seqüência intensificadora de iniciação datradução", conforme usado neste relatório, refere-se a umaseqüência de ácidos nucléicos que pode determinar um local eeficiência do início de tradução de um gene (Ver, porexemplo, McCarthy et al., 1990, Trends in Genetics, 6: 78-85). Uma seqüência intensificadora de iniciação da traduçãopode estender-se para incluir seqüências 5' e 3 'para o localvinculado ao ribossomo. 0 local vinculativo ao ribossorao édefinido para incluir, de forma mínima, a região Shine-Dalgarno e o códon iniciador, como também, quaisquer bases nomeio. Além disso, seqüência intensificadora de iniciação datradução pode incluir uma líder qué não foi traduzido ou aparte final de um intron, e, portanto, um códon de parada datradução. Ver, por exemplo, na patente US No. 5.840.523.

0 termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácidosnucléicos que é usado para introduzir uma seqüênciapolinucleotídicas em uma célula hospedeira, produzindo assimuma célula hospedeira transformada. Um "vetor" pode contermaterial genético, além do constructo genético acimadescrito, por exemplo, uma ou mais seqüências de ácidosnucléicos que permitam a uma ou mais células hospedeiras dese replicarem, tais como, a origem de replicação, genesmarcadores selecionáveis e outros elementos genéticosconhecidos no estado da técnica (por exemplo, seqüências paraintegração do material genético no genoma da célulahospedeira, e assim por diante).

2. INCORPORAÇÕES EXEMPLARES

2.1 Plantas -transgênicas ou material de plantastransgênicas resistente a nematódeos.

Foi descoberto que a interrupção do ciclo de alimentaçãode cisto nematódeos pela regulação de um ou mais genes deparasitismos de cisto nematódeo é um método eficaz parareduzir, prevenir ou tratar doenças de cisto nematódeo nasplantas. Os genes de parasitismo de cisto Nematódeo se referea genes expressos nas células da glândula esofágicacodificadas por proteínas secretoras exportados a partir dacélula da glândula célula para ser liberado através doestilete do nematódeo dentro do tecido hospedeiro. Emparticular, foi descoberto que a interferência com aexpressão das proteínas secretadas pelo cisto nematódeosrelacionados com a formação de células de alimentaçãoespecializada em plantas hospedeiras é um método eficaz parareduzir, tratar ou prevenir doenças de nematódeo em plantas.Representante de genes de parasitismo codificando proteínassecretadas que podem ser alvejados, por exemplo, com inibidorde RNA incluem, mas não estão limitados a esses geneslistados na Tabela 1, SEQ ID NOS: 1-63 e 113-116, isoformas,homólogos ou um fragmento. 0 inibidor de RNA pode também tervariações que ocorrem naturalmente em genes do parasitismo,exemplos de genes ou proteínas tendo substituiçõesconservativas na seqüência de aminoácidos ou na seqüência deácidos nucléicos.

O SCN é um parasita altamente especializados em forçar atransformação de células vegetais dentro dos tecidosvasculares e cortical da raiz da soja suscetível dentro de umlocal alimentação elaborado, chamado de um sincício no qual énecessário para o crescimento e reprodução do parasita. Aformação do sincício representa um dos mais complexosrespostas produzidas pelo tecido vegetal por qualquerparasita ou agente patogênico. As Secreções orais do SCNlança a partir (estilete) regulação, direta ou indiretamente,genes hospedeiros específicos que afetam metabolismo celularvegetal, a síntese protéica, a endo-reduplicação do DNA, adiferenciação celular, síntese da parede celular edegradação. A dissolução coordenada de divisões celularesadjacentes da raiz produz um local de alimentaçãomultinuclear, onde os vacúolos centrais de célulasparasitadas diminui no tamanho, o citoplasma aumenta emvolume e densidade, e as paredes celulares tornam-se maisespessas para elaborar um crescimento interno, dando osincicio o fenótipo de células de transferências modificadas.Certas incorporações fornecem plantas transgênicas oumaterial de plantas transgênicas compreendendo de inibidor deácidos nucléicos que inibem a formação do sincicio pelosnematódeos. Os inibidores de ácidos nucléicos podem serexpressos através da planta ou podem ser parte de umacomposição aplicada à planta.

O desenvolvimento pós embrionário do SCN é dependente doparasitismo vegetal para a sua conclusão e é delimitado pelasmudas através de quatro fases jovens sucessivas para chegar àmaturidade reprodutiva. A segunda fase jovem pré-parasitária(J2) do SCN, incubação dos ovos no solo para se tornar oestádio infeccioso. Estes J2 penetra nas raizes da soja portrás da membrana da raiz, migra intracelularmente para a raizdo tecido vascular e deve induzir um sincicio para aalimentação de progresso do crescimento, sedentariamente noestagio de vida adulta reprodutiva. As J2 inseri seu estileteem protuberância em uma célula selecionada do parênquimavascular e libera secreções que transforma uma célula da raizem uma célula inicial sincicial que em última análise,desenvolve o sincicio total.

O SCN é bem adaptado para parasitismo de plantas, porpossuir, além do estilete, três grandes e complexas célulasda glândula esofágica, um dorsal (DG) e dois subventrais(SVG), que são as principais fontes de secreções envolvidasna infecção e parasitismo na soja. Cada glândula esofágica éuma única grande célula secretora transcripcionalmente ativa.As duas células SVG são as principais glândulas esofágicasativas na infecção de J2 do SCN enquanto a célula glânduladorsal única passa a predominar a fonte de secreçõesliberadas através do estilete em estágios parasitáriasposteriores.Os dados coletivos fornecidos, pelo menos, nos exemplos-2-3 demonstram que existem genes de parasitismo homólogosentre H. glycines e H. schachtii, que esses genes deparasitismo homólogo são expressos no mesmo padrão entre as5 duas espécies de cisto nematódeo o. Os dados indicam que H.schachtii usa genes de parasitismo semelhantes para infectarplantas hospedeiras e sugerem que a planta hospedeira,Arabidopsis thaliana, pode ser utilizada para avaliar tantogenes de parasitismo de H. glycines e H. schachtii como ummodelo de planta hospedeira. A forte identidade entre genesde parasitismo de H. glycines e H. schachtii indica queoutras espécies de cisto nematódeo contem significativamentegenes de parasitismo semelhantes. Assim sendo, um técnico noassunto irá reconhecer que a resistência de nematódeos emplantas obtidas através da inibição da expressão e atividadede proteínas secretoras das células glandulares esofágicassecretadas por H. schachtii como mostrado aqui, pode tambémser obtida através da inibição da expressão de proteínasemelhante em H. Glycines.

Uma incorporação fornece uma planta ou célulascompreendendo um ou mais inibidores de RNAs específicos parauma ou mais mRNAs de um ou mais genes de parasitismo de cistonematódeo. Inibidor de RNAs específicos para um ou mais mRNAssignifica que o inibidor de RNA regula a expressão de um mRNAespecífico. 0 inibidor de RNA pode ser de filamento duplo ousimples ou uma combinação dos dois. Por exemplo, a presentedescrição fornece plantas transgênicas que expressam um oumais inibidores de RNAs que regulam a expressão gênica doparasitismo de cisto nematódeo quando um ou mais inibidoresde RNAs são ingeridos ou absorvidas por um cisto nematódeo.As plantas transgênicas podem ser projetadas para expressarinibidores de RNA que regula a transcrição do gene deparasitismo alvo, pelo menos,em duas diferentes espécies decisto nematódeo, por exemplo, Heterodera e Globodera spp. , ouuma combinação dos dois. Outra incorporação proporciona umaplanta transgênica que compreende inibidor de RNA que regulaa transcrição de genes-alvo de parasitismo em 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou maisespécies de cisto nematódeo. Assim, a presente descriçãofornece plantas transgênicas e materiais de plantastransgênicas que sejam resistentes à doença causada porvárias espécies de cisto nematódeo.

Outra incorporação fornece plantas transgênicas oucélulas transgênicas contendo ou expressando um ou maisinibidores de ácidos nucléicos específicos para pelo menosuma porção de ácidos nucléicos que codifica um ou maispolipeptídeos secretores das células da glândula esofágica deum cisto nematódeo, por exemplo, um cisto nematódeo J2suficiente para regular a expressão dos ácidos nucléicoscodificando um ou mais polipeptideos secretores das célulasda glândula esofágica. O inibidor de ácidos nucléicos étipicamente um pequeno inibidor de RNA ou MicroRNA que éespecífico para um mRNA codificando uma proteína das célulasda glândula esofágica do cisto nematódeo. Vai ser apreciadopor um técnico do assunto que o inibidor de ácidos nucléicospode ser um RNA, DNA ou uma combinação dos dois. Além disso,os inibidores de ácidos nucléicos podem ser de filamentosimples ou filamento duplo e podem ser anti-sentido ouenzimático. Em uma incorporação, o inibidor de ácidosnucléicos interfere, inibe ou reduz a tradução de um mRNAalvo. Por exemplo, o inibidor de ácidos nucléicos pode ligar-se a um mRNA alvo e induzir ou promover a degradação do mRNAalvo ou fisicamente impedir o mecanismo translacional celularde traduzir o mRNA alvo em uma proteína funcional. A inibiçãodo polipeptídeo secretório pode ser comparada aos controles,por exemplo, plantas ou células que não contenham oumanifestam o inibidor de ácidos nucléicos. Um "controle" serefere a uma amostra de material usado para produzir omaterial transgênico e difere-se do material transgênico emque o material controle não contém ou expressa o inibidor deácidos nucléicos.

O termo "Proteínas ou polipeptídeos da célula daglândula esofágica" refere-se a polipeptídeos secretorescodificado por um gene de parasitismo nematódeo cisto. Em umaincorporação, as proteínas ou polipeptídeos da célula daglândula esofágica para serem geralmente regulados é umaproteína secretada que modula a expressão de pelo menos umgene da planta hospedeira. Exemplos de polipeptídeos denematódeos que são regulados nas composições e nos métodosdivulgados incluem, mas não estão limitados a polipeptídeosou fragmentos destes codificados pela SEQ ID NOS: 1-63 e 113-116 ou fragmentos destes. O polipeptídeo secretor podeaumentar ou diminuir a expressão de genes de plantashospedeiras, direta ou indiretamente. Por exemplo, amodulação direta pode ocorrer quando a célula da glândulaesofágica se liga à proteína ou polipeptídeo em um ácidonucléico de uma planta hospedeira, incluindo DNA genômico,RNA, e mRNA. Modulação indireta pode ocorrer, por exemplo,quando o polipeptídeo liga-se com uma ou mais proteínas ououtros fatores de modo a formar um complexo. O complexo pode,então, se ligar a ácidos nucléicos de uma planta hospedeiraque, então, promover ou reprimir a transcrição ou tradução.

A regulação das proteínas secretoras modera ou reduzpelo menos um sintoma associado com doença de cistonematódeo. Exemplos de sintomas de doença por cisto nematódeoincluem, mas não estão limitados à formação de sincício,lesões, nanismo, deficiências nutricionais e de água, doençavírica e do número de nematódeos para infectar uma planta.Níveis de redução ou inibição da doença de nematódeo emplantas ou células transgênicas podem ser comparados aosníveis de doença de nematódeo em plantas ou células controle.Em uma incorporação, o inibidor de ácidos nucléicos reduz,inibe, modera, trata ou previne doenças de cisto nematódeo.

Em outra incorporação, proteínas ou polipeptídeos dacélula da glândula esofágica para serem regulados sãocodificados por um gene de parasitismo de cisto nematódeoenvolvido na formação de um sincício. Ainda em outrasincorporações, o gene de parasitismo de cisto nematódeoalvejado codifica um polipeptideo ou ácido nucléico envolvidona migração do cisto nematódeo através do tecido da raiz,modificando o metabolismo celular, extraindo o sinal detransdução do receptor celular ou forma um tubo dealimentação que permite ao cisto nematódeo para alimentar-sea partir do sincicio. Além disso, as proteínas oupolipeptídeos da célula da glândula esofágica podem causaralterações na parede celular e potencialmente interagir com osinal de transdução dos receptores no espaço extracelular,influenciando o metabolismo celular, ciclo celular, proteínasde degradação seletiva localizadas na defesa de resposta e naregulação da atividade dentro do núcleo de células vegetais.

Exemplos de genes de plantas que são modulados pelasproteínas ou polipeptídeos da célula da glândula esofágicaincluem, mas não estão limitadas a genes envolvidos naformação de células especializadas na alimentação denematódeo, também conhecido como sincicio. Representantes degenes de plantas que podem ser modulados por polipeptídeos dacélula da glândula esofágica de cisto nematódeos, incluem,mas não estão limitados a WUNl, POX, CAT, GST, Mia-I, Mia-2,Mia-3, Mia-4, CHS1-CHS3, LOX , Chitinase, inibidor detripsina, Miraculin, HMGR, TSW12, LEAl4, LEMMI9, C6-19, C27--45, TASU, UBC DB # 103, RPE, JSDGh, IPPP, LPPL, mUCp,proteínas de endomembranas, 20s proteossoma, DAPdescarboxilase, GRP, ENOD40, ATAOl ou suas combinações(Gheysen, G. e Fenoll, C. 2002. Annual Review ofPhytopathology 40:191, no qual, quando permitida, seráincorporada pela referência na sua totalidade). Geralmente,os genes de plantas estão direta ou indiretamente envolvidosno crescimento celular da raiz, divisão celular da raiz ou aprodução de determinados nutrientes ingeridos pelo nematódeoparasitário. 0 gene pode ser expresso em uma célula da raizou qualquer outra célula da planta.

Em uma incorporação, a expressão de proteínas secretorasalvos de cisto nematódeo é reduzida, inibida ou bloqueada, secomparado a um controle, quando o inibidor de ácidosnucléicos é introduzido ao cisto nematódeo. A introdução doinibidor de ácidos nucléicos pode ser alcançada, por exemplo,quando o cisto nematódeo entra em contacto com o inibidor deácidos nucléicos quando o cisto nematódeo alimenta-se deplantas ou células transgênicas. O cisto nematódeo podeingerir o inibidor de ácidos nucléicos durante a alimentação,ou os ácidos nucléicos podem ser transportados através de umamembrana celular do nematódeo pelo transporte ativo ou pordifusão passiva, será apreciado que o inibidor de ácidosnucléicos pode ser introduzido ao cisto nematódeo emcombinação ou alteração com um agente que induz ou favorece aabsorção de inibidor de ácidos nucléicos pelo nematódeo. Umexemplo de agente indutor inclui, mas não se limita aoctopamina.

Em outra incorporação, as plantas transgênicas oucélulas transgênicas expressam o inibidor de ácidos nucléicosem uma quantidade eficaz para modular a expressão de umpolipeptideo ou proteína da célula da glândula esofágica deum cisto nematódeo quando o inibidor de ácidos nucléicos éintroduzido ao nematódeo. Níveis de Expressão podem serdiminuídos em cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90%em relação a um controle. Níveis de expressão do inibidor deácidos nucléicos em uma planta ou célula transgênica podemser controlados por meio de métodos conhecidos no estado datécnica, por exemplo, utilizando vetores com fortespromotores ou promotores com constitutivos ativos, elevadonúmero de cópias de vetores, etc. A Planta ou célula podeestar transfectada estável ou transitoriamente. Outraincorporação fornece uma semente transgênica ou compostocapaz de expressar um inibidor de ácidos nucléicosespecíficos para um polipeptideo secretor da célula daglândula esofágica de um cisto nematódeo.

Um exemplo de cisto nematódeo inclui, mas não é limitadoaos membros da Heterodera spp. Representantes das espéciesincluem, mas não são limitados a Heterodera glycines, tambémreferido como soja com cisto nematódeo e Heteroderaschachtii, também referido como a beterraba com cistonematódeo.

Representantes de plantas hospedeiras que podem sertransfectados com um inibidor de ácidos nucléicos, de acordocom a presente divulgação incluem, mas não estão limitados amonocotiledôneas, Dicotiledôneas, tabaco, cereais, beterraba,batata, arroz, milho e soja. Outras plantas hospedeirasfilogênicas incluem membros da família Leguminosae,Chenopodiaceaer Cruciferae e Solanaceae.

Outra incorporação fornece uma célula que contém umácido nucléico codificando um inibidor de ácidos nucléicosespecíficos para um mRNA ou fragmento deste, onde o mRNAcodifica um polipeptídeo ou proteína da célula da glândulaesofágica de um cisto nematódeo que modula direta ouindiretamente a expressão do gene da raiz, formação dosincício, migração do nematódeo através dos tecidos da raiz,metabolismo celular, sinal de transdução ou está envolvido naformação de um tubo de alimentação que permite ao nematódeo aalimentar-se a partir de sincício. O polipeptídeo ou proteínaou polipeptídico esofágico da célula da glândula esofágica deum cisto nematódeo pode causar alterações na parede celular epotencialmente interagir com o sinal de transdução dereceptores no espaço extracelular, influenciar o metabolismocelular, ciclo celular, proteínas de degradação seletiva,localizada para resposta de defesa e atividade reguladoradentro do núcleo de células vegetais. A célula pode serprocariótica ou eucarióticas, e geralmente é uma célulavegetal, especialmente uma célula da raiz.

Ainda existe outra incorporação que fornece plantastransgênicas ou células vegetais contendo um inibidor deácidos nucléicos, por exemplo, siRNA ou MicroRNA, que regulaproteína da célula da . glândula esofágica de um cistonematódeo quando introduzidos a uma alimentação do nematódeona planta ou células vegetais. 0 RNA interferente é conhecidado estado da técnica. Ver, por exemplo, Kreutzer et al.,International PCT Publication N0 WO 00/44895; Zernicka- Goetzet al, International PCT Publication N0 WO 01/36646; Fire,International PCT Publication N0 WO 99/32619; Plaetinck etal., International PCT Publieation N0WO 00/01846; Mello andFire, International PCT Publieation N0 WO 01/29058;

Desehamps-Depaillette, International PCT Publieation N0 WO99/07409; Li et al., International PCT Publieation N0 WO00/44914; e Triek et al., US20040098761.

Em uma incorporação, o nematódeo não é um membro daMeloidogyne spp., Por exemplo, Meloidogyne incógnita tambémconhecida como um nematódeo do nó da raiz.

Em outra incorporação, o inibidor de ácidos nucléicosnão é diretamente letal para nematódeos embriões ou adultosou não está envolvido na fertilidade do nematódeo, mas, aoinvés disso inibe a habilidade do nematódeo para alimentar-seou obter os nutrientes de plantas transgênicas ou de célulasvegetais transgênicas ou de produzir tubos de alimentação oucélulas vegetais modificadas para a alimentação.

Em alguns incorporações, o inibidor RNA de filamentoduplo (dsRNA) é obtido a partir de um "modelo exógeno". Essemodelo pode ser total ou parcial de uma planta ou de umaseqüência nucleotidica do nematódeo, que pode ser umaseqüência de DNA ou um gene cDNA produzidos a partir de ummRNA isolado de um nematódeo parasita, por exemplo, atravésda transcriptase reversa. Quando o modelo é em todo ou partede uma seqüência de gene de DNA, é preferível ser de uma oumais ou toda de genes éxons. Enquanto o dsRNA é obtido apartir de um modelo endógeno ou exógeno, não existe qualquerlimitação quanto à maneira pela qual ele pode sersintetizado. Por exemplo, o siRNA pode ser, por síntesequímica, produzida pela transcrição in vitro; produzida pordigestão de dsRNA por uma família de enzimas RNase III (porexemplo, Dicer, RNase III); expressadas em células de umplasmídeo de expressão ou vetor viral expressão de siRNA ouexpressadas em células de cassete de expressão derivadas dePCR siRNA.

O SiRNA preparado in vitro é, então, introduzidodiretamente em células por transfecção, eletroporação ou poroutro método. Alternativamente, a transfecção de vetoresbaseados em DNA e cassetes que expressam siRNAs no interiordas células podem ser utilizadas. 0 RNAi pode ser sintetizadoin vitro ou in vivo, utilizando procedimentos manuais e/ouprocedimentos automatizados. In vitro podem ser por síntesequímica ou enzimática, por exemplo, utilizando clones de RNApolimerase (por exemplo, T3, T7, SP6) para a transcrição domodelo de DNA endógeno (ou cDNA), ou uma mistura dos dois.

In vivo, o dsRNA pode ser sintetizado utilizando partesrecombinantes bem conhecidas no estado da técnica (ver porexemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning; A LaboratoryManual, Third Edition (2001). Por exemplo, célulasbacterianas podem ser transformadas em um vetor de expressãono qual compreende o modelo de DNA a partir do qual o dsRNA éderivado. Alternativamente, as células de uma planta, porexemplo, na qual a inibição da expressão gênica do nematódeoé exigida, podem ser transformadas em um vetor de expressãoou por outros meios. A transcrição Bidirecional de uma oumais cópias do modelo pode ser pela RNA polimerase endógenade células transformadas ou pela RNA polimerase clonada (porexemplo, T3, T7, SP6) codificado para um vetor de expressãoou de um vetor de expressão diferente. 0 uso e a produção deum constructo de expressão são conhecidos no estado datécnica (ver W098/32016; patentes US números 5.593.874,-5.698.425, 5.712.135, 5.789.214, 5.804.693). A inibição dogene de expressão do nematódeo pode ser orientada pelatranscrição específica em um órgão, tecidos ou tipo celular;uma condição ambiental (por exemplo, temperatura, química);e/ou de engenharia de transcrição em uma fase dedesenvolvimento ou idade, especialmente quando o dsRNA ésintetizado in vivo em células vegetais, por exemplo. OsdsRNA também podem ser introduzidos a tecidos específicos outipo celulares utilizando conhecidos sistemas de liberação degenes. Componentes destes sistemas incluem promotor delectina específico da semente a promotor específico da florde APETALA3. Estes vetores são listadas apenas a título deilustração e são comercialmente disponíveis e são vetores bemconhecidos que estão disponíveis para um técnico do assunto.

Se sintetizado no exterior da célula, o RNA pode serpurificado antes de sua introdução na célula. A purificaçãopode ser por extração com um solvente (tal como ofenol/clorofórmio) ou resina, precipitação (por exemplo, emetanol), eletroforese, cromatografia ou uma combinaçãodesses. No entanto, a purificação pode resultar em perda dedsRNA e podem por isso ser mínima ou não efetuadas. 0 RNApode ser seco para o armazenamento ou dissolvido em umasolução aquosa, que pode conter sais ou tampões para promoveranelamento e/ou a estabilização dos filamentos do RNA.

dsRNA adequados também pode conter uma ou mais basesmodificadas ou ter uma espinha dorsal modificada paraaumentar a estabilidade ou por outras razões. Por exemplo, asligações fosfodiéster do RNA natural pode ser modificado paraincluir pelo menos uma de um heteroátomo de nitrogênio ouenxofre. Além disso, os dsRNA compreendendo bases incomuns,tais como inosina ou bases modificadas, tais com, basestritilatadas, para citar apenas dois exemplos, podem serutilizados. Será apreciada uma grande variedade demodificações que podem ser feitas para o RNA que servem paraserem utilizados para esses propósitos que são conhecidos deum técnico do assunto. 0 termo dsRNA como é empregado aquiadota formas de dsRNA modificadas quimicamente,enzimaticamente ou metabolicamente, desde que seja derivadode um modelo endógeno.

A estrutura de filamento duplo pode ser formada por umaúnico filamento próprio complementar de RNA ou doisfilamentos separados complementares do RNA. A formação do RNAduplex pode ser iniciada dentro ou fora da célula vegetal.

A seqüência de pelo menos, um filamento do dsRNA contémuma região complementar para, pelo menos, uma parte do mRNAalvo suficiente para o dsRNA especificamente hibridizar omRNA alvo. Em uma incorporação, o siRNA é substancialmenteidêntico à pelo menos uma porção do mRNA alvo. A"Identidade", como são conhecidas no estado da técnica, é arelação entre duas ou mais seqüências de polinucleotideos (oupolipeptideo), como determinado por comparação dasseqüências. No estado da técnica, identidade significa tambémo grau de parentesco das seqüências entre as seqüênciaspolinucleotidicas, como determinado pela correspondênciaentre os filamentos dessas seqüências. A identidade pode serfacilmente calculado (Computational Molecular Biology, Lesk,A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988;Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.,ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis ofSequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G.,eds., Humana Press, N. J., 1994; Sequence Analysis inMolecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; andSequence Analysis Primers, Gribskov, M. and Devereux, J.,eds., M Stockton Press, New York, 1991) . Até que existe umasérie de métodos para medir a identidade entre as duasseqüências polinucleotidicas, o termo é bem conhecido por umtécnico do assunto (Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence AnalysisPrimers, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M StocktonPress, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAMJ. Applied Math., 48: 1073 (1988). Métodos comumenteempregados para determinar a identidade entre seqüênciasincluem, mas não se limitam aos divulgados por Carillo, H.,and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988). Osmétodos preferidos para determinar a identidade sãoconcebidos para permitir a maior correspondência entre asseqüências testadas. Métodos para determinar a identidade sãocodificadas em programas de computador. Métodos de programasde computador para determinar a identidade entre as duasseqüências incluem, mas não se limitaa a, ao programa pacoteGCG (Devereux, J., et al. , Nucleic Acids Research 12(1): 387(1984)), BLASTP, BLASTN1 and FASTA (Atschul, S. F. et al., J.Molec. Biol. 215: 403 (1990)). Outros pacote de software bemconhecidos no estado da técnica para a realização desteprocedimento é o programa CLUSTAL. Ele compara as seqüênciasde dois polinucleotideos e encontra o melhor alinhamentoatravés da inserção em espaços em ambas as seqüência conformeo caso. A identidade de um melhor alinhamento também pode sercalculado utilizando um pacote de software, tais como BLASTx.Este programa alinha o maior trecho de seqüência semelhante eatribui um valor para o encaixe. Para qualquer padrão decomparação várias regiões de semelhança podem ser encontrado,tendo cada um, uma pontuação diferente. Um técnico do assuntoirá apreciar que dois polinucleotideos de comprimentosdiferentes podem ser comparados ao longo de todo o fragmentode comprimento mais longo. Alternativamente pequenas regiõespodem ser comparadas. Normalmente seqüências do mesmocomprimento são comparados a uma comparação útil para serfeita.

Em uma incorporação, a seqüência do inibidor de ácidosnucléicos tem 100% de identidade com pelo menos uma parte domRNA alvo. No entanto, inibidor de ácidos nucléicos tendo70%, 80% ou mais de 90% ou 95% de seqüência de identidadepodem ser utilizados. Assim variações de seqüência podem seresperadas devido à mutação genética, polimorfismo da cepa oudivergência evolutiva pode ser tolerado.

A região duplex do RNA pode ter uma seqüência denucleotideos que é capaz de hidridizar com uma porção do genede transcrição alvo (por exemplo, 400 mM NaCl, 40 mM PIPE pH6,4, EDTA 1 mM a 50°C ou 70°C para uma hibridação de 12-16horas, seguido de lavagem).

Embora a melhor duração do dsRNA possa variar em funçãodo gene-alvo e as condições experimentais, a região duplex doRNA pode ser, pelo menos, 19, 20, 21-23, 25, 50, 100, 200,300, 400 ou mais bases ao longo.

Os genes alvos são genes de cisto de nematódeocodificando proteínas da célula da glândula esofágicasecretada, em especial proteínas secretadas que modulam: aexpressão genética das plantas ou células, formação de umsincício, migração do nematódeo através dos tecidos da raizda planta, o metabolismo da célula vegetal, extração do sinalde transdução na célula vegetal ou forma um tubo dealimentação no qual permite que o nematódeo alimente-se apartir do sincicio formado na planta. Tipicamente, os dsRNAou inibidor de ácidos nucléicos é substancialmente idênticoao conjunto do gene-alvo, ou seja, a porção codificante dogene. No entanto, o dsRNA ou inibidor de ácidos nucléicospodem ser substancialmente idêntico a uma parte do gene-alvo.O tamanho desta parte depende do gene-alvo especifico e podeser determinada por um técnico do assunto, variando o tamanhodo dsRNA e observando se a expressão do gene foi inibida.

Ainda outra incorporação, o inibidor de ácidos nucléicospode ser um ácidos nucléico anti-sentido especifico para mRNAcodificando uma proteina codificada por uma ou mais das SEQID NOS: 1-63 e 113-116.

Outra incorporação fornece ácidos nucléicos isoladosselecionados a partir do grupo, constituido pelas SEQ ID NOS:113, 114, 115 e 116 ou um vetor compreendendo as SEQ ID NOS:113, 114, 115 e 116.

Ainda há outra incorporação que fornece uma célulahospedeira isolada compreendendo o vetor composto das SEQ IDNOS: 113, 114, 115 e 116. A célula hospedeira pode sereucariótica ou procariótica, de preferência uma célulavegetal. O inibidor de ácidos nucléicos pode inibirespecificamente a expressão ou uma atividade ou ácidosnucléicos selecionados a partir do grupo, constituido pelasSEQ ID NOS: 113, 114, 115 e 116.

O inibidor de ácidos nucléicos pode ser divulgado aquipodem estar em sementes e produtos de sementes derivados deplantas transgênicas descrito acima.

2.2 Composições de Material de Plantas Transgênicas

A divulgação de. plantas transgênicas e materiais deplantas transgênicas podem ser usados como um componente namatéria-prima. As matérias-primas podem ser sob a forma depéletes, grânulos, flocos e similares e podem ser usadas paraalimentar animais domésticos como bovinos, ovinos, caprinos,suinos e animais de estimação como cães e gatos. Seráapreciado que o material de plantas transgênicas e plantastransgênicas revelado também pode ser usado para produziralimentos para o consumo humano.

Outra incorporação fornece uma composição com uminibidor de ácidos nucléicos especificos para um mRNA oufragmento deste codificando um polipeptideo codificado poruma ou mais das SEQ ID NOS: 1-63 ou um fragmento ou homólogosdestes, em uma quantidade suficiente para inibir a expressãodo polipeptideo codificado por uma ou mais das SEQ ID NOS: 1-63 ou homólogos destes quando introduzidos em um cistonematódeo, como por exemplo, quando o nematódeo está sendoalimentado na planta ou célula expressado ou revestido com oinibidor de ácidos nucléicos. A composição pode conter um oumais nematicidas, pesticidas, fungicidas ou suas combinações.

Representantes de nematicidas incluem, mas não se limitada acloropicrina, metil brometo, 1,3-dicloropropeno,ditiocarbamato de sódio metil, tetratiocarbonato de sódio;carbomatos, tais como, 2-metil-2-(metiltio)propionaldeido 0-metilcarbamoiloxima (aldicarbo), 2,3- Dihidro-2,2-dimetil-7-benzofuranol metilcarbamato (carbofuran), metil2(dimetilamino)-N-[[(metilamino)carbonil]oxi]-2-oxoetanimidotioato(oxamil), 2-metil-2-(metilsulfonil)propanal0-[(metilamina)carbonil]oxima (aldoxicarb), 0,0-dietil O-[4-(metilsulfinil)fenil] fosforotioato (fensulfotiom), O-EtilSiS- dipropilfosforoditioato (etoprop) e Etil-3-metil-4-(metiltio)fenil(1-metiletil)fosforamidato (fenamifos). Acomposição pode ser formulado para ser revestido com umaplanta, parte de uma planta ou sementes. Em certos aspectos oinibidor de ácido nucléico é combinado com um ou maisexcipientes, agentes tamponizantes, transportadores, etc. Osexcipientes, agentes tamponizantes e os transportadores sãobem conhecidos no estado da técnica.

Excipientes padrões incluiem gelatina, caseina,lecitina, goma acácia, colesterol, tragacante, ácidoesteárico, benzalconium cloreto, estearato de cálcio,monoestearato de gliceril, alccol cetoestearil, cera deemulsificação cetomacrogol, esteres de sorbitan, eters alquilpolioxietileno, derivados de óleo polioxiethileno, ésteres deácidos graxos de polioxietileno sorbitan, polietileno glicol,estearato de polioxietileno, dióxido de silicone coloidal,fosfatos, dodecilsulfato de sódio, carboximetilcelulose decalciuo, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose,hidroxietilcelulose, hidroxipropilcelulose, fitalato dehidroxipropiImeticelulose, celulose não cristalina, silicatode magnésio aluminuo, trietanolamina, álcool polivinil,polivinilpirrolidona, açúcares e amidos.

O revestimento pode ser formulado como um spray ouimersão, de modo que o inibidor de ácidos nucléicos permaneçano material vegetal e continue sendo capaz de inibir aexpressão da proteina secretora da célula da glândulaesofágica do nematódeo no cisto nematódeo como planta madurae desenvolvida. Por exemplo, as sementes de uma planta podemser revestida com uma composição que inclua uma quantidade deum ou mais do inibidor de ácidos nucléicos para inibir oureduzir a doença de nematódeo na planta, em combinação com umexcipiente. Outra incorporação fornece uma composição na qualinclua um inibidor de polipeptideo codificado pela SEQ IDNOs: 1-63 e 113-116 ou uma combinação destas. 0 inibidor podeser uma pequena molécula, tais como base de carbono,incluindo compostos ciclicos, heterociclicos, e compostosalifáticos. Esses compostos podem ser identificados usandoensaios padrão de filtração. 0 inibidor também podem ser umorientador especifico para uma SEQ ID NOS: 1-63 e 113-116 ouum metabólito secundário, incluindo, mas não limitado apolicetideos, alcalóides, hormônios e oligossacarideos quesão produtos de rotas de enzimas especializadas (multigene)nas células. Metabólitos secundários geralmente não regulam a"expressão" de polipeptideos, per se, mas eles são conhecidospara ligar-se e para regular (inibir) a "atividade" dopolipeptideo alvo (especifico) nas células.2.3 Métodos de Utilização do inibidor de ÁcidosNucléicos divulgado.

Uma incorporação fornece um método de fornecimento deresistência ao cisto nematódeo em uma planta pelo contato daplanta ou expressando na planta um ou mais inibidores deácidos nucléicos específicos para uma ou mais proteínassecretoras das células da glândula esofágica do cistonematódeo em uma quantidade suficiente para reduzir a doençapor cisto nematódeo. As proteínas secretoras das células daglândula esofágica do cisto nematódeo podem modular:expressão genética da planta ou células, formação de umsincicio, nemátodo da migração através de tecidos da raiz daplanta, o metabolismo da célula vegetal, inibição do sinal natransdução de células vegetais ou formando um tubo dealimentação no qual permite que o nemátodo alimente-se apartir do sinsicio formado na planta. A inibição de uma oumais das proteínas da célula da glândula alvejadas, porexemplo, aquelas codificadas pela SEQ ID NO: 1-63 podefornecer a célula vegetal com cisto nematódeo resistência,por exemplo, pela regulação de uma ou mais proteínassecretoras das células da glândula esofágica do cistonematódeo envolvidas na formação do sincicio na planta. Umaspecto fornece um inibidor de ácidos nucléicos específicospara proteínas das células da glândula esofágica do cistonematódeo secretadas pelos nemátodeos, em especial SCN. Oinibidor de ácidos nucléicos pode ser pulverizado sobre aplanta ou de outra forma distribuído a planta, de modo a queo inibidor de ácidos nucléicos entre em contato com um cistonematódeoo.

Outra incorporação fornece um método para inibir aformação do sincicio de cisto nematódeoo em uma plantaexpressando na planta um inibidor de ácidos nucléicos em umaquantidade eficaz para inibir a expressão pelo cistonematódeoo de um polipeptideo codificado por um ou mais dasSEQ ID NO: 1-63 ou uma homóloga desta.

Ainda outra incorporação fornece um método para inibir aatividade biológica de um produto de gene de parasitismo denematódeoo expressando um inibidor de peptideo, inibidor depolipeptideo, inibidor de ácidos nucléicos ou uma combinaçãodestes, em uma planta, onde o inibidor de peptideo,o inibidorde polipeptideo ou inibidor de ácidos nucléicosespecificamente inibe a atividade biológica ou expressão doproduto de gene do parasitismo. Representantes parasitáriosdos nematódeos incluem, mas não são limitados a Heteroderaspp. e Globorela spp. 0 inibidor de peptideos ou inibidor depolipeptideos pode associar-se especificamente com ospolipeptideos codificados pela SEQ ID NOS: 1-63 e 113-116, emuma seqüência especifica ou podem ser conformacionalmentecomplementares, tal que os dois polipeptideos venham ainteragir fisicamente. Um exemplo de inibidor de peptideo ouinibidor de polipeptideo inclui, mas não se limita a umanticorpo ou fragmento anticorpo especifico que se liga àprodoto de gene parasitários de nemátodo. A geração deanticorpos é conhecida no estado da técnica. Com base nasseqüências de ácidos nucléicos fornecida aqui, um técnico doassunto poderá facilmente produzir anticorpos para ospolipeptideos codificados pelas SEQ ID NOS: 1-63 e 113-116.Os anticorpos poderiam então ser clonados e um ou mais dosanticorpos ou antigenios ligados a fragmentos de anticorpopodem ser expressos em uma planta ou em células vegetais, demodo a que o anticorpo liga-se ao polipeptideo codificado poruma ou mais das SEQ ID NOS: 1-63 e 113-116. A ligação doproduto de gene parasitário de nemátodo pelo anticorpo ouantigeno ligado ao fragmento de anticorpo pode inibir aatividade do produto de gene parasitário de nematódeo e,assim, fornecer a planta expressar o anticorpo ou antigenoligado a fragmento de anticorpo com resistência ao nematódeooparasitário.

O inibidor de ácidos nucléicos expressos na planta ou emcélulas vegetais podem ser RNA de filamento duplo, DNA anti-sentido, MicroRNA, siRNA, um orientador ou uma combinaçãodestes. 0 inibidor de ácidos nucléicos pode ser especificopara mRNA codificado pela SEQ ID NOS: 1-63 e 113-116. Alémdisso, o inibidor podem ser metabólito secundário, incluindo,mas não limitado a, policetidas, alcalóides, hormônios eoligossacarideos que são produtos de rotas de enzimasespecializadas (multigene) nas células.

2.4 Métodos de Identificação de Inibidores de Produtosdo Gene de Parasitismo de Nematódeos.

Métodos para a identificação de inibidores dos produtoscodificados pela SEQ ID NOS: 1-63, 113-116 ou suascombinações são também fornecidas. Como usado aqui, o termo"compostos teste" ou "inibidor" refere-se a qualquer moléculaque pode potencialmente inibir a função biológica de umproduto de gene de parasitismo de cisto nematódeo, emespecial, os produtos codificados pelas SEQ ID NOS: 1-63,113-116. 0 composto teste ou modulador pode ser uma proteínaou fragmento, uma pequena molécula ou até mesmo uma moléculade ácidos nucléicos. Alguns compostos testes podem sercompostos que estão estruturalmente relacionados com osprodutos codificados pela SEQ ID NOS: 1-63 e 113-116.

Uma incorporação fornece um método para a identificaçãode inibidores de produtos de gene de parasitismo de cistonematódeo analisando a atividade de um produto de gene deparasitismo de cisto nematódeo, um homólogo ou fragmentodeste, na presença de um composto teste e selecionando ocomposto teste que reduz ou inibe a doença do cisto nematódeoem plantas, em comparação com um composto controle.

Em outra incorporação, biblioteca de pequenas moléculasbibliotecas que são capazes de satisfazer os critériosbásicos para a utilidade do inibidor de produtos de gene deparasitismo de cisto nematódeo pode ser utilizada paraidentificar compostos usados. A exibição de tais bibliotecas,incluindo bibliotecas combinatoriamente gerada (por exemplo,bibliotecas de expressão), é uma maneira rápida e eficaz paraexibir grande número de conexões (e de não conexões) doscompostos por atividade. A abordagem combinatória também seprestam para a rápida evolução do potencial de drogas atravésda criação de segunda, terceira e quarta geração de compostosde modelagem ativos, mas de outra forma, compostosindesejável.

Composto teste pode incluir fragmentos ou partes decompostos de ocorrência natural, ou pode ser encontrado comoativo de combinações de compostos conhecidos, os quais são deoutra forma inativa. Compostos isolados a partir de fontesnaturais, tais como, animais, bactérias, fungos, fontesvegetais, incluindo folhas e cascas e de amostras marinhaspodem ser analisados como candidatos para a presença deagentes farmacêuticos potencialmente úteis. Deve serentendido que os agentes para serem exibidos também poderiamser sintetizados a partir de derivados ou de composiçõesquímicas ou compostos feitos pelo homem. Assim, entende-seque o composto teste identificado por incorporação dapresente divulgação pode ser um peptideo, polipeptideo,polinucleotidio, inibidores de molécula pequena, indutores depequena molécula, orgânico ou inorgânico, ou quaisquer outroscompostos que podem ser concebido com base em inibidores ouestimuladores conhecidos.

Outros inibidores adequado podem incluir moléculas deácidos nucléicos anti-sentido como catalisador de ribozimas eanticorpos (incluindo os anticorpos de cadeia única), cada umdos quais seria especifica para um produto de gene deparasitismo de cisto nematódeo, em especial especifico paraas SEQ ID NOS: 1-63 , 113-116 ou produtos codificados porsuas combinações. Por exemplo, uma molécula anti-sentido quese liga a locais de inicio da translação ou transcrição oujunções de combinações, encontram-se no escopo de um compostoteste.

Além disso, para os compostos inibidores inicialmenteidentificados, estericamente outros compostos semelhantespodem ser formuladas para imitar as principais partes daestrutura dos moduladores. Esses compostos, nos quais podemincluir imitadores de peptideo de moduladores de peptideo,pode ser usado da mesma forma que os primeiros moduladores.Um inibidor, de acordo com a presente descrição pode serum no qual exerça o seu efeito inibitório, acima, abaixo,diretamente ou indiretamente, em um gene de parasitsimo decisto nematódeo ou produto de gene.

Em algumas incorporações, os ensaios podem incluirexames aleatórios de grandes bibliotecas de composto teste.Alternativamente, os ensaios podem ser utilizados para seconcentrar em determinadas classes de compostos suspeitos demodular à função ou expressão de occludina em célulasepiteliais ou endoteliais, tecidos, órgãos ou sistemas.

Os ensaios podem incluir determinações da espressão dogene de parasitismo do cisto nematódeo, proteinas deexpressão, atividade de proteinas ou atividade de ligação.Outros ensaios podem incluir determinações transcrição outradução de ácidos nucléicos, por exemplo, niveis de mRNA,estabilidade do mRNA, degradação do mRNA, taxas detranscrição, taxas de tradução, particularmente depolipeptideos envolvidos na doença de cisto nematódeo nasplantas.

Ensaio ou parâmetros de interações específicos que podemser medidos na incorporação divulgados aqui incluem, mas nãose limitando a, análise para doença por nemátodo nas plantasdepois da entrada em contato com o cisto nematódeo com uminibidor de um ou mais dos produtos da SEQ ID NOs: 1-63, 113-116 ou uma combinação destas. Estes parâmetros podem seranalisados naa dosagem padrão usando métodos divulgados nosexemplos ou utilizando testes convencionais, por exemplo,FACS, FACE, ELISA, Northern blotting e/ou Western blotting.

Outros métodos incluem triagem usando marcados comoprodutos codificados pelas SEQ ID NOS: 1-63, 113-116 ou umacombinação ou fragmentos biologicamente ativos destes paraidentificar um composto teste. A ocludina pode ser marcadacomo padrão utilizando procedimentos de marcação padrão, nosquais são bem conhecidas e utilizadas no estado da técnica.Os marcadores incluem, mas não se limita a, radioativos,fluorescentes, biológicas e ligação enzimáticás.Outra incorporação fornece ensaios in vitro para aidentificação de inibidores de produtos codificados pela SEQID NOS: 1-63, 113-116 ou uma combinação destas. Tais ensaiosgeralmente utilizam moléculas isoladas, pode ser executadorapidamente e em grande número, aumentando assim a quantidadede informação obtida em um curto periodo de tempo. Umavariedade de matérias podem ser utilizados para executar osensaios, incluindo tubos de ensaio, placas, recipientes eoutras superfícies, como espumas ou bastões.

Um exemplo de uma célula de ensaio livre é um ensio deligação. Embora não abordando diretamente a função, acapacidade de um composto teste de ligar-se a uma molécula-alvo, por exemplo, SEQ ID NOS: 1-63, 113-116 ou umpolipeptideo codificado pela SEQ ID NOS: 1-63, 113-166, noâmbito de uma maneira determinada é uma forte evidência deefeitos biológicos relacionados. Essa molécula pode se ligara um produto de gene parasitário de cisto nematódeo, porexemplo, para inibir ou reduzir a formação do sincicio docisto nematodeo em uma planta ou células vegetais. A ligaçãode uma molécula a seu alvo pode, ela própria, ser inibitória,devido a intereções de troca a troca, estérica, alosterica oupode regular ou inativar o produto de gene parasitário decisto nematódeo. O alvo pode estar livre na solução, fixoadoa um suporte, expresso na superfície de uma célula. Ambos, oalvo ou o composto pode ser marcado, de forma para permitir adeterminação da ligação. Normalmente, o alvo será a espéciemarcada, diminuindo a chance de que a marcação venha ainterferir com o melhoramento da ligação. 0 formato deligação competitiva pode ser realizado, na qual um dosagentes é marcado e um deve medir a quantidade de marcadorlivre versus marcador ligado para determinar os efeitos sobrea ligação.

Uma técnica de alto rendimento de compostos é descritano WO 84/03564. Um grande número de pequenos peptideos decompostos teste são sintetizados em um substrato sólido, comopinos de plástico ou alguma outra superfície. A ligação destepolipeptídeo é detectada por vários métodos.

3. Tecnologia de transformação Vegetal

Moléculas de DNA e moléculas de RNA da presentedivulgação são incorporadas na planta ou células bacterianasconvencionais usando tecnologia de DNA recombinante.Geralmente, uma molécula de DNA ou RNA da presente divulgaçãoé composta de um vetor de transformação. Um grande número detais sistemas de vetores é conhecido no estado da técnica epode ser utilizado, tal como, plasmideos. Os componentes dosistema de expressão são também modificados, por exemplo,para aumentar a expressão dos fragmentos de RNA introduzidos.Por exemplo, seqüências truncadas, substituições denucleotideos ou outras modificações podem ser empregadas.Sistemas de Expressão são conhecidos na tecnologia e pode serusado para transformar praticamente qualquer célula vegetalem condições adequadas. Um transgene compreendendo umamolécula de DNA da presente invenção é preferivelmentetransformada de forma estável e integrada ao genoma dascélulas hospedeiras. As células transformadas sãopreferencialmente regeneradas em qualquer planta. Asdescrições detalhadas das técnicas de transformações estãodentro dos conhecimentos das pessoas qualificadas no assunto,na técnica.

Genes repórteres ou marcadores genéticos selecionadospodem ser incluídos no cassete de expressão. Exemplos degenes repórteres adequados conhecido no estado da técnicapodem ser encontrados em, por exemplo, Jefferson et al.(1391) in Plant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin et al.(Kluwer Academic Publishers), pp. 1-33; DeWet et al. (1987)Mol. Cell. Biol. 7:725-737; Goff et al. (1990) EMBO J.9:2517-2522; Kain et al. (1995) Bio Techniques 19:650-655;and Chiu et al. (1996) Current Biology 6:325- 330.

Marcadores genéticos selecionados para a seleção detransformação de células ou tecidos pode incluir genes queconferem resistência a antibióticos ou a resistência aosherbicidas. Exemplos de marcadores genéticos adequadosselecionáveis incluem, mas não se limitando a, genes quecodifica a resistência à cloranfenicol, (Herrera Estrella etal. (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrellaet al. .(1983) Nature 303:209-213; Meijer et al. (1991) PlantMol. Biol. 16:807-820); higromicina (Waldron et al. (1985)Plant MoI. Biol. 5:103-108; Zhijian et al. (1995) PlantScience 108:219-227); estreptomicina (Jones et al. (1987)Mol. Gen. Genet 210:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnardet al. (1996) Transgenic Res. 5:131-137); bleomicina (HiIIeet al. (1990) Plant MoI. Biol 7:171-176); sulfonamida(Guerineau et al. 1990) Plant MoI. Biol. 15:127-136);bromoxinil (Stalker et al. (1988) Science 242:41 9423);glifosato (Shaw et al. (1986) Science 233:478481);fosfinotricina (DeBIock et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518).

Outros genes que poderiam servir para a utilização narecuperação de eventos transgênicos, mas poderá não serexigida no produto final pode incluir, mas não estãolimitados a, como exemplos GUS (b-glucoronidase; Jefferson(1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387), GFP (green florescenceprotein; Chalfie et al. (1994) Science 263:802), luciferase(Riggs et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15(19):8115 andLuehrsen et al. (1992) Methods Enzymol. 216:397-414) and themaize genes encoding for anthocyanin production (Ludwig etal. (1990) Science 247:449).

O cassete de expressão que compreende uma seqüênciapromotora operacionalmente ligada a uma seqüência interessede nucleótidos heterologos pode ser usado para transformarqualquer planta. Desta forma, as plantas geneticamentemodificadas, células vegetais, tecidos de plantas, sementes,e similares podem ser obtidos. Protocolos de transformação,bem como protocolos para a introdução de seqüências denucleótidos em plantas podem variar, dependendo do tipo deplanta ou de células vegetais, ou seja, monocotiledônias oudicotiledôneas, orientadas para a transformação. Os métodosde introdução de seqüências de nucleótidos em célulasvegetais e posterior inserção no genoma vegetal incluemmicroinjecção, (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad.Sei. USA 83:5602-5606, Transformação mediada porAgrobacterium (Townsend et al., U.S. Pat. No. 5,563,055; Zhaoet al. WO US98/01268), transferência gênica direta(Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722) e aceleraçãode partículas balísticas (ver, por exemplo, Sanford et al.,U.S. Pat. N0 4, 945, 050; Tomes et al. (1995) "Direct DNATransfer into Intact Plant Cells via MicroprojectileBombardment, " in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture:Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); and McCabe et al. (1988) Biotechnology6:923-926). Also see Weissinger et al. (1988) Ann. Rev.Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Scienceand Technology 5:27-37 (onion); Christou et al. (1988) PlantPhysiol. 87:671-674 (soybean); McCabe et al. (1988)Bio/Technology 6:923-926 (soybean); Finer and McMullen (1991)In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soybean); Singh et al.(1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soybean); Dafta et al.(1990) Biotechnology 8:736-740 (rice); Klein et al. (1988)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:4305-4309 (maize); Klein et al.(1988) Biotechnology 6:559-563 (maize); Tomes, U.S. Pat. No.5,240,855; Buising et al., U.S. Pat. Nos. 5, 322, 783 and5,324,646; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer intoIntact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in PlantCell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed.Gamborg (Springer- Verlag, Berlin) (maize); Klein et al.(1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maize); Fromm et al. (1990)Biotechnology 8:833-839 (maize);Hooykaas-Van Slogteren et al.30 (1984) Nature (London) 311 :763-764; Bowen et al., U.S. Pat.No. 5,736,369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed.Chapman et al. (Longman, N.Y.), pp. 197-209 (pollen);Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 andKaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566(whisker-mediated transformation); D1Halluin et al. (1992)Plant Cell 4:1495-1505 (electroporation); Li et al. (1993)Plant Cell Reports 12:250-255 and Christou and Ford (1995)Annals of Botany 75:407-413 (rice); Osjoda et al. (1996)NatureBiotechnology 14:745-750 (maize via Agrobacteriumtumefaciens); onde todos são incorporados neste relatório emsua totalidade.

As células que foram transformadas em plantas podem sercultivadas de acordo com as técnicas convencionais. Ver, porexemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84.

Essas plantas podem ser cultivadas e em seguida, polinizadas,com a mesma cepa transformada ou cepas diferentes, e osresultantes hibridos tendo a característica da expressãoconstitutiva fenotipica desejada identificada. Dois ou maisgerações podem ser cultivadas a fim de garantir que acaracterística da expressão constituiva fenotipica desejadaseja mantida estável e hereditária e, em seguida, as sementescolhidas a fim de garantir que a característica da expressãoconstituiva fenotipica desejada seja alcançada.

Promotores quimico-regulados podem ser usados paramodular a expressão de um gene em uma planta através daaplicação de um regulador químico exógeno. Dependendo doobjetivo, o promotor pode ser um promotor quimico-indutivel,sempre que a aplicação de produtos químicos induza aexpressão genética, ou um promotor quimico-repressivel, ondea aplicação de produtos químicos reprime a expressãogenética. Promotores quimico-induziveis são conhecidos noestado da técnica e incluem, mas não estão limitados a,promotor do milho ln2-2, que é ativado por asseguradores deherbicida de benzenossulfonamida, promotor do milho GST, queé ativado por compostos hidrofóbicos electrofilicos que sãoutilizados como herbicidas pré-emergentes e promotor dotabaco PR-1, que é ativado pelo ácido salicilico. Outrospromotores quimico-reguladores de interesse incluempromotores de resposta-esteróide (ver, por exemplo, theglucocorticoid-inducible promoter in Schena et al. (1991)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10421-10425 and McNellis et al.(1998) Plant J. 14 (2):247-257) and tetracycline-inducible andtetracycline-repressible promoters (ver, por exemplo, Gatz etal. (199.1) MoI. Gen. Genet. 227:229-237, and U.S. Pat. Nos.5,814,618 e 5,789,156, onde são incorporados aqui pelareferência em sua totalidade.

Promotores Constitutivos incluem, por exemplo, o núcleodo promotor Rsyn7 e de outros promotores constitutivosdivulgado na WO 99/43838 and U.S. Pat. N0 6,072,050; the coreCAMV 35S promoter (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812);rice actin (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171 );ubiquitin (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 and Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81 :581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); ALSpromoter (Patente U.S. N0 5,659,026), and the like. Otherconstitutive promoters include, for example, Patente U.S.Números 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597;5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142.

Onde o nivel de expressão baixo é desejado, promotoresfracos podem ser usados. Geralmente, um "promotor fraco"destina-se a um promotor que comanda a expressão de umaseqüência de codificação de um nivel baixo. Para o baixonivel é intendido os niveis 1/1000 transcrições a cerca de1/100000 transcrições para cerca de 1/500000 transcrições.Alternativamente, reconhece-se que um promotor fraco tambémenvolve promotores que são expressos em apenas algumascélulas e não em outros para dar um total de baixo nivel deexpressão. Sempre que um promotor é expresso em niveisinaceitavelmente elevado, porções da seqüência do promotorpodem ser suprimidas ou modificadas para diminuir os niveisde expressão.

Tais promotores constitutivos fracos incluem, porexemplo, o núcleo promotor do promotor Rsyn7 (WO 99/43838 andPatente U.S. N0 6,072,050), o núcleo do promotor 35S CaMV, esimilares. Outros promotores constitutivos incluem, porexemplo, Patente U.S. Números 5,608,149; 5,608,144;5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; and5,608,142.

Promotores de "Tecido-preferido" podem ser usados parasegmentar uma expressão gênica dentro de um tecido especial.Promotores para tecidos-preferidos incluem, Yamamoto et al.(1997) Plant J. 12(2)255-2 65; Kawamata et al. (1997) PlantCelt Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al (1997) MoI. Gen.Genet. 254 (3) :337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res.6 (2) : 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol.112 (3) :1331-1341; Van Camp et al (1996) Plant Physiol.112 (2) :525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol.112 (2) :513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol.35 (5) : 773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant MoI. Biol. 23(6):1129- 1138;Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sei. USA 90 (20):9586-9590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4 (3) : 4 95-505.Tais promotores podem ser modificados, se necessário, para afraca expressão.

Promotores "preferidos para Sementes" incluem tantopromotores de "sementes especificas" (os promotores ativosdurante o desenvolvimento de sementes, tais como promotoresde armazenamento das proteínas das sementes), bem como,promotores de "sementes de germinação" (os promotores ativosdurante a germinação). Ver Thompson et al. (1989) ByEssays10:108, incorporados neste documento por referência. Taispromotores preferidos de sementes incluem, mas não se limitama, Ciml (citocinina induzida por mensagem); cZ19Bl (milho 19kDa zein); milps (Myo-inositol-l-fosfato-sintase); e celA(celulose sintase). A Gama-zeina é um promotor preferidoespecifico para endosperma. A Glob-I é um promotor preferidoespecifico para embrião. Para Dicotiledóneas, promotores parasementes especificas incluem, mas não se limitando a,bean.beta .- phaseolin, napin,. Beta.-conglycinin, lectina desoja, cruciferin, e similares. Para monocotiledôneas,promotores de sementes especificas incluem, mas não estãolimitados a, milho 15 kDa zein, 22 kDa zein, 27 kDa zein, g-zein, waxy, shrunken 1, shrunken 2, 1 globulina, etc.

Promotores "especificas de folhas" são conhecidos doestado da técnica, por exemplo, Yamamoto et al. (1997) PlantJ. 12 (2) :255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778;Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993)Plant MoI. Biol. 23 (6) :1129-1138; and Matsuoka et al. (1993)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (20) :9586-9590.

Promoteres "específicos de raiz" são conhecidos e podemser selecionados dentre os muitos disponíveis a partir daliteratura ou isolados de novos a partir de várias espéciescompatíveis. Ver, por exemplo, Hire et al. (1992) Plant MolBiol. 20(2): 207-218 (soybean root-specific glutaminesynthetase gene); Keller and Baumgartner (1991) Plant Cell3(10):1051-1061 (root-specific control element in the GRP 1.8gene of French' bean); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol.14 (3) :433-443 (root-specific promoter of the mannopinesynthase (MAS) gene of Agrobacterium tumefaciens); and Miaoet al. (1991) Plant Cell 3(1) 11-22 (comprimento total doclone de cDNA codificando a citosolica glutamina sintetase(GS) i, no qual e expressado em raizes e nódulos da raiz dasoja). Ver também, Patentes U.S. Números 5,837,876;5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732 e5,023,179.

Seqüências alvos em Cloroplasto são conhecidas no estadoda técnica e incluir pequena subunidade da ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase do coroplasto, (Rubisco) (de CastroSilva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780;Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335- 3342); 5-(enolpyruvyl) shikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) (Archeret al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810);tryptophan synthase (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem.270 (11) :6081- 6087); piastocyanin (Lawrence et al. (1997) J.Biol. Chem. 272 ( 33):20357-20363); chorismate synthase(Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268 (36) :27447-27457) ;and the light harvesting chlorophyll a/b binding protein(LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999).See also Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep.9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965- 968;Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; and Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

Métodos de transformação em cloroplastos são bemconhecidos do estado da técina. Ver, por exemplo, Svab et al.(1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:8526-8530; Svab andMaliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:913-917; Svab andMaliga (1993) EMBO J. 12:601-606. 0 método baseia-se empartícula entrege de DNA contendo um marcador selecionável ealvejado do DNA para o genoma Plastidico através derecombinação homóloga. Adicionalmente, a transformaçãoPlastidica pode ser obtida por transativação de um transgenenascido de um plasmideo em tecido-preferido de expressão deum nuclear-codifiçado e Plastidio-dirigido a RNA polimerase.Tal sistema tem sido relatado por McBride et al. (1994) Proc.Natl. Acad. Sei. E.U.A. 91:7301-7305.

Os ácidos nucléicos de interesses a ser alvejados para ocloroplasto podem ser otimizados para a sua expressão nocloroplasto a contar para diferenças no códon usado entre onúcleo da planta e esta organela. Desta forma, os ácidosnucléicos de interesse podem ser sintetizados utilizandocódons-cloroplasto preferidos. Ver, por exemplo, Patente U.S.N0 5.380.831, incorporados neste documento por referência.

As plantas transformadas de acordo com a presenteexposição pode ser monocotiledôneas ou. dicotiledôneas eincluem, mas não limitado a, qualquer nematódeo de plantahospedeira.

3.1 Construção de Vetores de Expressão Vegetais

Seqüências de ácidos nucléicos destinados à expressão emplantas transgênicas são montadas primeiramente em cassetesde expressão atrás de um promotor adequado expressivel emplantas. 0 cassete de expressão pode igualmente contemplarquaisquer outras seqüências exigidas ou seleccionados para aexpressão do transgene. Tais seqüências incluem, mas nãoestão, limitadas a, transcrição de terminatores, seqüênciasextrenas para a de intensificadores tais como, introns,seqüências vitais e seqüências intendidas para o alvo doproduto de gene para organelas especificas e compartimentoscelulares. Estes cassetes de expressão podem então serfacilmente transferidos para vetores de transformaçãovegetais descritos inicialmente.

A seguir encontra-se uma descrição de diversoscomponentes de um tipico cassete de expressão.

3.1.1 Promotores

A seleção do promotor utilizado em cassete de expressãopara determinar o padrão de expresao espacial e temporal dotransgene nas plantas transgênicas. Os promotores deexpressão selecionados de transgenes em tipos de célulasespecificas (como as células epidérmicas das folhas, célulasmesofilicas células, células do córtex da raiz) ou emdeterminados tecidos ou órgãos (raizes, folhas e flores, porexemplo) e a selecção reflete o local desejado de acumulaçãodo produto de gene. Alternativamente, o promotor selecionadodireciona a expressão do gene sobre várias condições deindução.

Os promotores variam na sua resistência, ou seja, acapacidade de promover a transcrição. Dependendo sobre osistema de célula hospedeira utilizado, qualquer númeroadequado de promotores conhecidos no estado da técnica podeser utilizado. Por exemplo, para a expressão constitutiva, opromotor CaMV 35S, promotor da actina do arroz ou o promotorubiquitina podem ser utilizados. Por exemplo, para aregulação da expressão, o promotor PR-I indutivelquimicamente do tabaco ou Arabidopsis pode ser utilizado(ver, por exemplo, Patente U.S. N0 5,689,044).

Uma categoria adequada dos promotores é que a qual ecoberta por indução. Numerosos promotores têm sido descritosque são expressos em locais de revestimentos. Promotorespreferidos deste tipo incluirão os mesmos descritos porStanford et al. Mol. Gen. Genet. 215: 200-208 (1989), Xu etal. Plant Molec. Biol. 22: 573-588 (1993), Logemann et al.Plant Cell 1: 151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec.Biol. 22: 783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993), and Warner et al. Plant J. 3: 191-201 (1993).

Padrões de expressão específicos de tecidos adequadosincluem o tecido verde especifico, específicos da raiz,específicos do caule e específicos das flores. Promotoresadequados para a expressão em tecido verde incluem muitos queregulam genes envolvidos na fotossintese, e muitos destesforam clonados a partir de ambos as espécies demonocotiledônias e dicotiledônias. Um promotor adequado é opromotor PEPC do milho do gene do fosfenol carboxilase(Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12: 579-589 (1989)). Umpromotor adequado para a expressão da raiz especifica que édescrito por Framond (FEBS 290: 103-106 (1991); EP 0452 269 eum promotor não especifico da raiz é do gene T-I. Um promotoradequado especifico do caule que é descrito na patente US No.5625136 e que orienta a expressão do gene do milho trpA.

3.1.2 Terminadores Transcricionais

Uma variedade de terminadores transcricionais estádisponível para uso em um cassete de expressão. Estes são osresponsáveis pela terminação de transcrição além do transgenee a sua correcta poliadenilação. Terminadores transcricionaisadequados são aqueles que são conhecidos por funcionar emplantas e incluem o terminador CaMV 35S, o terminador tml, oterminador nopalina sintase e o terminador da ervilha rbcSE9. Estes são utilizados em ambos as plantas,monocotiledôneas e dicotiledôneas.

3.1.3 Seqüências para o melhoramento ou regulação daExpressão

Inúmeras seqüências foram encontradas para aumentar aexpressão de genes dentro da unidade transcricional e essasseqüências podem ser utilizadas em conjunto com os genes paraaumentar a sua expressão em plantas transgênicas. Porexemplo, várias seqüências introns, tais como, o gene domilho Adhl tem sido mostrado para reforçar a expressão, emparticular em células monocotiledoneas. Além disso, uma sériede seqüências lider não-traduzido derivados de virus tambémsão conhecidos para melhorar a expressão, e estes sãoparticularmente eficazes em células de dicotiledôneas.

3.1.4 Otimização da Seqüência de Codificação

A Seqüência de codificação de genes selecionados podeser geneticamente modificada, alterando a seqüência decodificação para melhorar a expressão para o cultivo deespécies de interesse. Métodos de modificação de seqüênciasde codificação para conseguir a melhor expressão de umadeterminada espécie vegetal são bem conhecidos.

Outra incorporação fornece uma molécula RNA diretamentetransformada dentro do genoma do Plastideo. A tecnologia detransformação em plastidio é amplamente descrito nas patentesUS. Nos 5451, 513, 5545817, 5545818 e, em no pedido de PCT.WO 95/16783, e, McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei.USA. 91, 7301-7305. A base da técnica para a transformaçãoenvolve introdução de regiões de DNA plastidios clonadosacompanhada com um marcador selecionável junto com o gene deinteresse em um tecido alvo adequado, por exemplo, utilizandobiolisticos ou transformação de protoplastos (por exemplo,cloreto de cálcio ou transformação mediada por PEG) . Asregiões marcadas 1 a 1,5 kb, seqüências alvos de terminação,facilitam a recombinação homóloga com o genoma do plastidioe, assim, permitem a substituição ou modificação de diversasregiões especificas do plastoma. Inicialmente, as mutaçõespontuais no cloroplasto 16S rRNA e genes rpsl2 que conferemresistência a espectinomicina e/ou estreptomicina sãoutilizadas como marcadores selecionáveis para atransformação, (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., and Maliga, P.(1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87,8526-8530; Staub, J. M.,e Maliga, P. (1992) Plant Cell 4,39-45). A presença de locaisde clonagem entre estes marcadores permiti a criação de umvector alvo para plastidio para a introdução de moléculas deDNA externo (Staub, JM, e Maliga, P. (1993) EMBO J. 12601-606) . Aumentos substanciais na freqüência da transformaçãosão obtidos por substituição do rRNA recessivo ou genes deresistência aos antibióticos proteina-r com um marcadorselecionável dominante, o gene aadA da bactéria codifica aenzima-espectinomicina desintoxicante aminoglicosideo-3'-adeniltransferase (Svab, Z., e Maliga, P. (1993) Proc. Natl.Acad. Sei. E.U.A. 90913-917). Anteriormente, este marcadortinha sido utilizado com sucesso para a transformação emalta-frequência do genoma do Plastideo da alga verdeChlamydomonas reinhardtii (Goldschmidt-Clermont, M. (1991)Nucl. Acids Res. 19: 4083-4089). Outros marcadoresselecionáveis utilizados para transformação de Plastideo sãoconhecidos no estado da técnica e estão englobados no escopoda invenção.

3.2 Construção de vetores de transformação vegetaisNumerosos vetores de transformação estão disponíveispara a transformação de plantas e são conhecidas por umtécnico do assunto em transformação vegetal, e os genespertinente para esta divulgação pode ser usados em conjunçãocom qualquer desses vetores. A escolha depende dda técnica detransformação selecionadas as das espécies-alvo para atransformação. Para certas espécies-alvo, diferentes seleçõesde marcadores de antibióticos ou herbicidas são preferidos. Aseleção de marcadores utilizados rotineiramente nastransformações inclui o gene nptll, que confere resistência acanamicina e antibióticos afins (Messing & Vierra. Gene 19:259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983)), ogene bar, no qual confere resistência ao herbicidafosfinotricina (White et al., Nucl. Acids Res 18: 1062(1990), Spencer et al. Theor. Appl. Genet 79: 625-631(1990)), o gene hph, no qual confere resistência aoantibiótico higromicina (Blochinger & Diggelmann, Mol. CellBiol 4: 2929-2931), o gene manA, no qual permite selaçãopositiva na presença de manose (Miles and Guest (1984) Gene,32: 41-48; Patente U.S. N0 5,767,378) e o gene dhfr, no qualconfere resistência a metotrexate (Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)), e o gene EPSPS, no qual confereresistência ao glifosato (Patentes U.S. Números 4,940,935 e5,188,642.

Muitos vetores estão disponíveis para a transformaçãousando Agrobacterium tumefaciens. Estes tipicamente realizam,pelo menos, uma seqüência de delimitação T-DNA e incluemvectores como pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984).Vectores tipicos adequados para a transformação emAgrobacterium inclui vetores binários pCIB200 e pCIB2001, bemcomo, o vector binário pCIB 10 e seus derivados da seleção dehigromicina. (Ver, por exemplo, patente US. N0 5.639.949).

A transformação sem a utilização de Agrobacteriumtumefaciens contorna a exigência de uma seqüência T-DNA naescolha do vetor de transformação e, consequentemente, estesvectores perdendo estas seqüências são utilizados, além devetores, tais como descritos acima, no qual contêm seqüênciasde T-DNA. As técnicas de transformação que não dependem deAgrobacterium incluir transformação via bombardeamento departículas, absorção de protoplasto (por exemplo,PEG eeletroporação) e microinjeção. A escolha do vetor depende emgrande medida da seleção preferida para a espécie a sertransformada. Vetores tipicos adequados para transformaçãosem Agrobacterium incluir pCIB3064, pSOG 19 e pSOG35. (Ver,por exemplo, patente U.S. N0 5.639.949).

3.3 Técnicas de Transformação.

Assim que a seqüência de DNA de interesse é clonada emum sistema de expressão, esta é transformada em uma célulavegetal. Métodos de transformação e regeneração de plantassão bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, vetoresplasmideo Ti têm sido utilizados para a introdução de DNAexterno, bem como a captação direta de DNA, lipossomas,eletroporação, microinjecção e microprojeção. Além disso, asbactérias do gênero Agrobaeterium pode ser utilizadas paratransformação de células vegetais.

As técnicas de transformação para dicotiledôneas são bemconhecidas no estado da técnica e incluem técnicas baseadasem Agrobacterium e técnicas que não exigem Agrobacterium. Astécnicas sem Agrobacterium envolvem a absorção de materialgenético exógeno diretamente por protoplastos ou células.

Isso é realizado por PEG ou captação mediada poreletroporação, introdução . de partículas mediada porbombardeamento ou microinjecção. Em cada caso, as célulastrasnformadas podem ser regeneradas em qualquer planta usandotécnicas padrões conhecidas no estado da técnica.

A transformação da maioria das espécies demonocotiledôneas tem sido agora algo rotineiro. Técnicaspreferidas incluem a transferência de genes diretamente emprotoplastos utilizando PEG ou técnicas de eletroporação,bombardeamento de particulas dentro do tecido de calo ouestruturas organizadas, bem como Agrobacterium mediada portransformação.

Plantas do evento de transformação são cultivadas,propagadas e criadas para produzir descendentes com acaracterística desejada, e as sementes são obtidos com acaracterística desejada, utilizando processos bem conhecidosno estado da técnica. Os métodos podem resultar em célulasvegetais compreendendo os fragmentos de RNA da presenteinvenção, onde a expressão do dito gene-alvo na referidacelular vegetal é alterado pelos referidos fragmentos de RNA,uma planta e os descendentes destas derivadas das célulasvegetais, sementes derivados da planta.

O inibidor de ácidos nucléicos ou polipeptideos secretorde células da glândula esofágica de CNN divulgados pode serusado isoladamente ou como componente de um kit que tenhapelo menos um dos reagentes necessários para executar invitro ou in vivo a introdução de RNA ao objetivo. Componentesadequados são o dsRNA e um veiculo que promove a introduçãodo dsRNA. Esse kit pode também incluir instruções parapermitir que o usuário do kit realize o invento.

Outra incorporação fornece um método de fornecimento deresistência à doença por nematódeo pela introdução em umacélula vegetal hospedeira um RNA compreendendo uma estruturade filamento duplo tendo uma seqüência de nucleotidios, noqual é complementar para, pelo menos, uma parte do mRNA alvo,e opcionalmente verificar a inibição da expressão do mRNAalvo.

Uma incorporação fornece um método para tratar ouprevenir doença por nemátodo em uma planta pelo contato comum parasita nematódeo sobre a planta com um dsRNA tendo umaseqüência que é complementar a pelo menos uma parte de ummRNA que codifica uma proteina secretora do nematódeo, porexemplo, proteínas celulares da glândula esofágica; onde asproteinas secretoras modulam a expressão genética da planta.

Ainda outra incorporação fornece uma célula vegetal, porexemplo, contendo um constructo de expressão, o constructocodificando um RNA no qual forma uma estrutura de filamentoduplo tendo uma seqüência de nucleotidios que é complementara pelo menos, uma parte de um mRNA alvo que codifica umaproteina secretora de nematódeo, por exemplo, uma proteinacelular da glândula esofágica, bem como uma plantatransgênica contendo tal célula.

Em outra incorporação, fragmentos de RNA são compostospor duas diferentes moléculas de RNA. Neste caso, osfragmentos de RNA são misturados antes de serem introduzidosna referida célula, por exemplo, em condições que lhespermita formar uma molécula de RNA de filamento duplo. Emoutra incorporaçãoo, os fragmentos de RNA são introduzidosseqüêncialmente na referida célula. Preferencialmente, ointervalo de tempo entre a introdução de cada molécula do RNAé curto, de preferência menos de uma hora.

Ainda outra incorporação, os fragmentos de RNA sãocompostos em uma molécula RNA. Ao utilizar uma única moléculade RNA, os dois fragmentos de RNA são complementares estandomais próximos de tal pareamento e a formação filamento duploé favorecida. Nesse caso, a molécula de RNA é capazpreferencialmente de dobrar-se tal que os fragmentos de RNAcompreendidos destes formam uma região de filamento duplo.Neste caso, as partes complementares dos fragmentos de RNAreconhecem uma à outra, parenado umas com as outras e formara molécula de RNA de filamento duplo. Em outra incorporação,os fragmentos de RNA são incubados em condições que lhespermita formar uma molécula de RNA de filamento duplo, antesda introdução na célula. Em mais uma incorporação, a moléculade RNA compreende um ligador entre o fragmento de RNA sentidoe fragmento de RNA anti-sentido. 0 ligador compreendepreferencialmente uma seqüência de RNA codificada por umcassete de expressão contendo um gene funcional, por exemplo,um gene de marcador selecionável. Em outra incorporação, oligador compreende uma seqüência de RNA codificada porseqüências reguladoras, por exemplo, no qual compreendesinais de processamento de introns.

Outra incorporação fornece a construição de dsRNA tendoum promotor operacionalmente ligado ao referido dsRNA etalvez ainda compreendea a referida molécula de dsRNA. Opromotor pode ser um promotor heterólogo, por exemplo, umpromotor de tecido especifico, um promotor de desenvolvimentoregulado, um promotor constitutivo ou um promotor de induçãoou divergente. 0 sinal de terminação opcionalmente também sãoincluídos nas moléculas de DNA.

A molécula única de RNA ou as duas distintas moléculasde RNA são preferencialmente capazes de formar uma região defilamento duplo, na qual os elementos complementares dosfragmentos de RNA reconhecer uma a outra, paream-se umas comas outras e formam a molécula de RNA de filamento duplo.

4. Proteínas de fusão ou quiméricasUma incorporação também fornece proteínas de fusão ouquiméricas contendo as divulgadas proteinas celulares daglândula esofágica do nematódeo ou fragmentos. Tal como aquiutilizado, uma "proteina quimérica" ou "proteina de fusão"inclui proteinas celulares da glândula esofágica do nematódeoou fragmentos deste ligados a um. p.olipeptideo externo ouheterólogo. Um "polipeptideo externo" é um polipeptideo quenão é substancialmente homólogo de uma proteina celular daglândula esofágica do nematódeo ou fragmento desta. Ospolipeptideos externos podem ser fundidos com o N-terminal ouC-terminal das proteínas celulares da glândula esofágica donematódeo ou fragmentos destas. A fusão de proteínas pode ser5 útil para monitorar ou analisar a atividade de siRNA, porexemplo, a padronização da atividade de inibição.

A proteína de fusão pode incluir um grupamento que temuma alta afinidade por um ligante. Por exemplo, a proteina defusão pode ser uma proteina de fusão GST no qual a proteinacelular da glândula esofágica do nematódeo ou fragmento destaé fundida com o C-terminal de GST. Tais proteinas de fusãopodem facilitar a purificação do polipeptideo.Alternativamente, a proteina de fusão pode conter umaseqüência de sinal heteróloga na sua terminação-N. Em certascélulas hospedeiras, expressão, secreção ou transporte de umaproteina pode ser aumentada através da utilização de umaseqüência de sinal heteróloga. Por exemplo, em uma célulavegetal, o polipeptideo da invenção pode ser fundido com umpeptideo transitório de cloroplásto. O peptideo transitóriode cloroplástico permite que o polipeptideo seja transportadoa partir do citoplasma das células vegetais para ocloroplásto. Vetores de expressão já são comercialmentedisponíveis para codificar uma fusão de grupamento (porexemplo, um polipeptideo GST). Os ácidos nucléicoscofificando proteinas celulares da glândula esofágica donematódeo ou fragmentos destas podem ser clonados em um vetorde expressão de modo que a fusão do grupamento seja ligada aestrutura-interna do polipeptideo.

A seguir, são apenas exemplos explicativosr. Deve-seentender que a invenção não se limita a esses exemplos.Outras importantes aplicações da divulgação podem serfacilmente reconhecida por um técnico do assunto. Outros usosque são potencialmente reconhecíveis por um técnico doassunto também são parte da divulgação.

As referências aqui mencionados são incorporadas em suatotalidade os elementos dentro dos limites permitidos pelalegislação aplicável.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Genes Representativos do Parasitismo peloCisto Nematódeo

As seguintes seqüências de ácidos nucléicos são exemplosde genes de parasitismo por cisto nematódeo que podem seralvejadas com um inibidor de ácidos nucléicos. A produção deinibidor de ácidos nucléicos definida com base em seqüênciasgenéticas é conhecida no estado da técnica. As plantastransgênicas aqui descrita podem compreender uma ou maisinibidor específicos de ácidos nucléicos para um ou mais dosseguintes ácidos nucléicos.

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6EÜ7 - Pioneer

gtgccgccatagtcggtgatgctcgactgaagagcatcaatgaaAAAATTTATAGTTGCTAATTTTTGTATATTi I i AmGTAAAAATAGTTTTTTATTAATAAATATAACTCTTACAATTATCTCATTTATAATrTTGCTGAAGTAAAACAACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ id NO: 15)

6F06 - cellulase

CCAACTAATTTTCTCCCAATCTAAAAAAGTCTCTCTAATTAATACTAATTAGTACAAACTGCTGTTGATTTGATCACAGAATGTTGGTTCAACTCGTCCTCCTTGCCATCA1TGGCATTTCCTTTGTCGGTG

ctgccgçgccgccgtacggqcaattgtccgtqtgqggcaccaa

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TGAACTATTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAA (SEQ ID NO: 16)

7E05 - Pioneer

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8h07 - skp1

AGAATTTAAAAATCATAAAAATTCAAACTCATCAAATTCACTCAACATCATCACCAACCGTGAACATTATGCTGAGGATTGCTCTACTCATCTC C ATTTTGGCACTGTTTG GTG ATTG CATG G AC ATG G GAAAAAGAAAATTAGGAGGAATCAGTATTAATGAGCCAAGTGAATATGGAACCAAAGAAAAAGAAGCCATCGCAACAAAAGAAAATGGACAAACATCAAAGGACCCGCCGACATCGGCG6GTGGTCAAAATGAAGCAATCCCTTCACCAAAAAAGCCAAGCCCCAAGGGGAAGTTGAAAAGCGATTTTGGCCTAAACTTAGCCAAGGCTTTTCCACGGCCGGTTCCGAAAGGCAGAAGGGGCAAAGAAAAAGTCGGCGAAAAAATAAG C GTTATGAACACAGCTG AAC GC ATTGAAAAAATG G AC ATTG C CCAAGACAAAGCTAAAAT6GAAATAGACAATATAGACACCAATGCCAAAC C CAAAC AAAATG AGGATAAAGCTCC AAC CATATTCCCC AAA

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CCAAACCAAATAATGAAAAGCGTCTCGTCTTTCCAAGCTGGGAT

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GGAAATTCGCAAGGGATÍCGGCGTCGAAGAGCCGTACCCGCCG

GGACATCCGGAATGGGCACGAGTTGAGAAGGAGAACGAGTGGG

AAGAATCGGACGAGGAACGTGAGGCACGCCATGCAAAGGAACG

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GGTGAAGAACTGGAACACGATGAAGTTATGCATGATGTGGAGGA

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GGATGAGGAGGATGTAAAATGATGTGGTGATTAGTGATTTTGAT

gaaccgatgattcacttttcttggatcctgttgcataaaacttgt

TGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ JD NO; 18)

10A06 -ZSncfinger

GAGAATTTAAAAATCATAAAAATTCAAACTCATCAAATTCACTCAAC ATCATC AC C AACCGTGAAC ATTATG CTG AGG ATTG CTCTACTCATCTCCATTTTGGCACTGTTTGGTGATTGCATGGACAAGGGAAAAAGAAAATTAGGAGGAATCAGTATTAATGAGCCAAGTGAATATGGAACCAAAGAAAAAGAAGCCATCGCAACAAAAGAAAATGCTCTAAC ATCAAAG G AC CCG C C G AC ATC GG CGG GTG GTC AAAATG AAGCAATCCCTTCACCAAAAAAGCCAAGCCCCAAGGGGAAGTTGAA

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GAAAATGCACAGAÇCTCAAAGGTCCCGACATCGATG GAAAGG CA

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ArrTTTAAGGTTTCGGCATANCAATAAATATTTAATCAAAAAAAAA

AAA (SEQ !D NO:19)

10AO? - Pioneer

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caccattctcttcatagccatggtttgcttggtgatggctgtcct

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aaaaaci i attttccaaaattttgaaacatttggattttaatattcccgttaaaaáactaaatttttttttacccagcctctaattttgtaaa

aaaaaaaaaaaaaa (seq id n0:20)10c02 - Pioneer

ttttggatttttagtctttttttctttttgggttttttttggtaaatattttctttagttattaaaaattgtttggtctaattatgccattggaaaaaatgtatttgttttttacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(seq

ID NO:21)11A06 - Pioneer

GG AT AAACTAATT (SEQ ID NO:22)12H04 - Pioneer

ATGGCCCTCTGTGCCCTTCTGCTTCTTCTCCCCCTQCTTCTCAATGTTCAAAATATCCCAGATGAGTCAGTCCAATCGGATATGAAGGCTGTTTATTCGGCTATTTCATCGCCGGAACAATGGAAGAACTCACAAAATTCATTGGCTTCACTCGAATCACAACTGACAGAGCCCCAAAGAGCACTGGCAAAAATGCATTGGGAATTGGAGACCATCCAAAAGGAAAAGCCGGAGGCACCGCCAGAATTCGACTTGGGACTTTTCTC G GAAGCTTTG G AAGTGATGGTCGAAATGGACGAAGAAGCGAAAGAAGTGAAGCTGAGGAAGGACAAACTGATCCGAATGGGCAGGAGGAGAGGAAGCAAAAAAAAATTGAAGGAAAAGATGACGGAGG AGG AC AC AGTG CC G G AAGTG AG GGTG AACG AGAATGGT AAGG

ttgaagtgaaggacgggggcggaggggaaggacggttggaagtTGGACAACCAAGTGGATCGAGGCATTAGÂAAATCGGGTGGCGGgagtcaaaoccgaattggcacagcaattqttattctccaaaacgg

GATCAGCTGCTTACCAGGAGCTGAAGGAAGAGGTGGACAAATGCGAGGCGAAGTTGGCCAAACTAAAGGAATGGATCGGCGACTCTTTC AAGTG AAAATG GAAG AAACG GCTCTTAG AGGTGTATTTTTCTGA {SEQ ID NO:23)

13a06 - Pioneer

TTCCCTTATGGCCATGGTTTGCTTGGTGATGGCTGTCCTAATGG AAATGG C AAATTC AAAAG CAGTC AAAAAAG AC AATAAAAAAggagcagtggcggcatcaccagcaaaaggaaaagcatcgccaa

AAG G AG G QAAAAG COQAGC AAAAG GAAAAGCGGCAAAAGTTAGT

AAAAAAGATAACAAATTGAAAGCAAAGAAAGAAACCAAAGGCATT

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CAAAATTTATAGTTGGTAATTTTTGTATATTTTTATTTGTAAAAATAGTTTTTTATTAATAAATATAACTCTTACAATTATCTCATTTATAATTTTGCTGAAGTAAAACAACGAAAAAAAAAA (SEQ ID NO:24)

13C08 - celliílase

ATTTTATTTTATCTACAACTCAATAAAAAATGTCCGCTTGGATTTGTCCTGGGTTTTTGCTGTTTTTTGTGCTCATTCTGATCACTGATCACTGTCCGATGACCCAAGCTGTCACTCAACCGCCCTATGGTCAATTGGCTGTCAGTGGAAAAAATCTAGTACAAAAAAGTACGAAAAAAGCCGTGGCATTGCACGGCCTGTCAATGTACTGGAGCCAATGG

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ATCGAAAATGTATTCAAAAGTTAAATATTCAAAAAAGTTTACTAAC

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TAAAAACGAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO:25)

16B09 - Pioneer

ATCCTCTAAGAATTCAAATCCTCTCAGAAAATGGCTTCATCTTTCTGCTCTTCACTCATTTCCATCGTCGCAATTGTCTGTTTGCTG

tgcaaatgctgcttttcagcaccccatccatgctgtcctggcag

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G C ATGACTCTG AG AGTGTG CTTAGTAACC CTGG C ACCAGGGG GTCTCACAAGCGCATTTAAGTGCATTGCGACGATTCCGATGATGTCATCATTTGTrGATTGATATGCTATAGAAATTATTTTATTAGATAAAAAATGAATCGTTGCT {SEQ ID NO:26)

17C07 - pectate tyase

GATTAAAAAAGAATTTCTTCAACTAAAATCACAAACACATACAATAAGAAAATGATTCTTTTCATTCTATTGGTCATAACTTTTGTCC AAATTG GTCAACTG AGTG CTGGCATATGC AAATTTGCAAATCC GTCAAAAAGTG TTACGGICCAATCGATGATGACTGTTTCATCÔAÃTACCGACTATAAGAACACTTTGTTTGTCGGCGGTTCCGGCATTTTGAACGGCGCGTGTGATGTGAACAATGGCAAACTGAAATATTTGATGACATTGAAGAATGGCGTGACCATCAAAAATGCCATTCTCGACACGCCC GGTTTGGGGATTTACTGCGAGGGGAATTGTGTG GTGGAAAATATTTACTACAAGCGATTGTGTTACCATGCTACTGGGTTCGGGTATAAGAGCACCAGCACTTCATACACTTACCAAGTGATTGGCGGTG CTGG CCAAG GTTCACCG GAC AAATATTTC ACCC AATCG GG CAAAGGCACAACCATCATCAAGAATTTCTGCGCAGAAGGCAAATACGGC AAATTGTG GTGTTC ATG CGG G AATTGTGGTTTCG AAACG GCG

cgtaccgtacaaatttcaaacaccgtccttaaggggcccggact

TTC G GTTGTCTCG CTTAATTCC AACTAC GGTG AC AAAATG TCACTTTCGGGACTGACTTTGCATGGCCAAÁAATCATCGAGCACAAAAACTAATTAC ATTTG C CAAGAGTAC AAAG G C CTCACTC ACATGG CCGCCATGAGTCCTGAAGCGMTTATGAGCCAACCAAATCGGGCAGTG GC ACATGCGCGTAC AG TGCCTC GG CAGTTAAAATTGCGAGCTAATTTGGAGAAATAAATGAATAAATAATGGAGGGTTGAGTGATGAAAGTAAATTTAGAAATTAAATGATGTTAATACAACCTGTTAATTGTCGGACGAATATAAATAAAGATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:27)19B10 - Pioneer

TATTTTATTAAAAATGCATTTAAAAATATTTTTATTAATTTTATTTGTG AC AATTTG CTC G GTTTGG TC ACTTTC ACCC AAAATC C ACCACAACTACCACCAACAGCAGCAACAGCACAACATTAAGAATAAATTGCCACCAAAAAATATTGGGACAAAACATTTGAAAACGGAAATTAATGGGCACAACAAACACAAGCACAACCCGGCGAGCAGACACGGGCATGCTTTGCTTCAAAAAGTGAAAGACCAATTGAATAATGATGGATGGGCCAGTGAAGATGCAAACAAAACATCGGTATTGCTCTCTTCACTGTTGGCCATCGAATGCCATATGAAAAAATTGGACAAGAAAAGGACCAACGACTCGGCCGAGATCAAACATTTGACGGAGCAAATCTGTG CCGCCG AG AAC AAAGAAC AAATTG G C ATTCATAAACTG ATAAATGAAGTTGCGAAAACATTTGAAAAAGATGGAAAGAAAATGGggccaaagaagcgatg (seq id no:29)

19Q07 - Pioneer

atgg 6gtttttaaaaactatcgctttcctttcg cttttgg cacttttttg cgcaacaattgctg aag aaaatgg g gcg ac ag aaggcacagaagcggaggcgacgacagtgccaacactcaccgcagcggcogagggaggcaaagggggcgaagaggaagtgaccacggcgaagccgacgüagacgagcgaaacggcacgggaggagggggag g agaagcac aaggcg aacgag gggaaagcg actgag g gaagtg g aaccag atcgttgtgg c aaaaagtc acct gtatgttgttcggcmiiicccatttcgcgccggctgtccgggcaaaaacgatataaaagcggggtcatcatgacatgtgagcagcacaattatgataattgag g aaaaag ag g ac agcg aatcg g acg aac aaatgg ac g gcgcc ggag gg g acgagg ag aaac g g g g agg agag aac ggcagc gaagcgcagggcggcaaaggcgccgcaagggacaacgaaatggaagacgaagaattgaaagtgaaagccgtggtggaagagacgac

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tcatttttctctctttgtgtccctctctttcttttctttccgctttt

ggcttataaattcctttttctc (séq id n0:30)20Ε03 - Pioneer

tgatccgctaattattattttgaattgagatttattaaaacctaattaattttttttctactcgaatttcttttatggcatttgccatt

tcaagtttaagcgcttraatttcgctcgctttattggcagcagca

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ID NO:3t)

20G04 - Pioneer

aaaatgcgcaccattctcttatagccatggtttgcttggtgatggctgtcctaatggaaatggcaaattcaaaggctgtcaaaaaatacaacaaaaaaggaggagtggcggcatcaccaggaaaaggaaaagcatcgccaaaaggaggcaaaagcccagcaaaaggaaaagcggcaaaaaaattgaaacctaaaaaggatgctaaaggcattaaagctaaaaaagcaaagccagcaaagaaaagcaaagcggcaaaagcagtaaagggagggcctaagacagtcaaaaaactcgcatttgccaaaacagcagcgcaagtgaaagaaatãaagtgaccagccaagcgaatggttctaaaagcagtgccgccccaccaaatgcatttaatgaatg

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QTCTAATTTTGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO;32)21E12 - Pioneer

cgaggaggagaagaaggctggcagcaagggcgacaagcacaagaagaaggacaagaagggcgaaggcgcagcagcagcaccagcg gc gg agaaaaagg ag g agaag cgg aag g agaaag ag aaatcgaaggagtcggggaagagcgacgacagcaaagcgggcaagaag

gacaagcacgggaagaaggacaagaaggggaagaagaaggacaccg ccgatg catc c accgtggacg aagggctggg ag aac agagcacagcggagacgagccaagcagaggaatag (seq id no:33)

22C12 - Pioneer

atgg cttc atctttc cgctc ctc aatcatttccatcgtcgcaattgtctgtttgctgtgcaaatgctgcttttcggcaccccatccatgctgtcctggcagccaacatgtcgtttcgatgatgaaagatcTTCCCATGCCGGTGCCAACGCCGATTTGGCTGTCCAG TTCCGAG

GCGGGTCTCACAAGCGCTTTTAA (SEQ ID NQ:34)23G12 - Pionççr

TCTCTCTACTAACTGTTGCACATCCCAATTTTACTTTCTTCCTTAGTAAGTAGGGCTTGGTGCACAATGCGCACTTTTCTGTTCATAGCCGTAGTCGGGTTGATGTTGGCCGTCATCTTGGAGAATGTAAAT GCGAC AG G G AAAAATTC G GGG ACAAAGG AACTTATAC ATG AG CAAGGTAACCTACAGAACCATGCTACCGQACAATCGCCGCCAGACAGTCCAAACCATAAAAATGACCATGAAAACGAGATTAGTAACCTACAGAACCGTGCTACCGGAGAATCGCCGCCAGACAGTACAAAACGGGAAACAGAACATAAAATTGAGAAAGGAAAACCGTCGCCAGACAGTCCAAAGTATGATGAGCAAGCCTTAAAATGGTGAAGAAACTGTGTGGAACGATGATGCCAACCATGAACAAACCCAAAGCTGTTGTAG TAGATGTAGAAAAAAACTGTG GTATCATCACGCTATTATTGTTGTGTAAAAAACGATCCGTTTTTACCTCTTtTCGGGAAAAAAAACTGGAAAAAATTCACAAAAAAAAAAATCTCACATTGTGCAGATTTTATTGAAATTAGCCAATTAAAAAAAACAGTGACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ IDNO:35)24Α12 - Pioneer

GA (SEQ ID NO:36}25A01 - Pioneer

AATTATTTTTTTTAATAATAATi I I I IACAAAATGAG CAACTTTATATTTGTCGCCTTTTTAACTGCAGCGTTTTTTAGCTCAAGCC í CGCTCTACCGGCTCCTTATGATGCTGAATCGGTGGTATCTTCTGAATTAAATGTTCC ACTACTTTC AG CTGACG CAAATGTTCAAGGAGCT

gaaaatgttgagatacaaattccatcaattccagcaccaattgaa

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cgcgcggcggcccgtgtgtacgggtggcttccggaagaoaagcagcctaaggcgatctatgacgcggcggagaaggcaaagaacacgcccaaaccgccgggcgactacgacgtggagcgcgtggcgcaaaaggcggcacggctcgtctacggtgtgctgcccatcggcatgcagcccagcttcgccggccctagcactgacaagagcaatgtcGACGACTCGGAGAAACCTTCTG CTG CTGC G6CTGGTG ATGATG ATGAAGTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO:37)

25G01 - eng-1

aattcgctttcatcgttcaaatgtgccgactccaagcaact

catctgctcgctcgactctttctgcttottgcgctttgcactgct

CTCGTTAGCTCTCTCACTGCTGTTGCCCCGCCATTCGGCCAATTGTCCGTTTCC G G C AC C AATTTGGTCGGCG CCAACG G AC AACCCGTACAGCTGATCGGCAACTCACTGTTCTGGCACCAATGGTACCC

gcagttttggaacgctgacacagtgaaggcactcaaatgcaatt

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G C G G CTATCTGAG TGAC GC G AACACGGCTTAC AATCTGÀTGGTG

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gtccagctcgggttcgggatccgccagcatctctgtagtcccatTAG (SEQ ID NO*38)26D05 - ceIiulaseGCACCGATCGGCTGACCAAATCGGGCAAATTTGTGCACGACCACCTCATCGGTGTAAACCAGAAGCCGGATGGCTQTTAAACATCAGAAAATGG CAAATGATCGGAATCG CGCG CTCTTTT T S ITACTTTTCTGGGTCATTTCATCTTTAGCATTAAACCTAATAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ JD NO:39)

27D09 - Pioneer

ATTAATAATTCTTCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

(SEQ ID N0:40)

28B03 - PconeerG AAAAAGTCG G CG AAAAAATAAGCGTTATGAAC ACAGCTG AACG

cattgaaaaaatggaccttgcccaagacaaagctaaaatggatat

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ATGAACATAAAAAAGCTCCAGTTTTTGTGTTCMGTGtAAAGACA

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CCAAGGAGTTGTCAAATATGCTTGAAGATACTGCCGACGAAGGA

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tgattcaçttttcttggatcctgttgcataaaacttgttgcaaaaa

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID N0:41)29D09 - Pioneer

atgtcttctctgctgqtqtgcatcttcccaattgtgttttt

ggtctgttgcaatgcaatgccaaatttcccgtgctgcccgggcagtcagcaagtggttgctgtgatgtccatttacattgacactttctcttctgctgctgacgagtctacagtatgctttttcgctaaaagtactgtggatggaataaaaaatgaactgtcctctcgcggcggatgccaaaacggaggagaagcacaaattgtggatgaaatcgatcgaca

GCTGAAGAAIAiTGCAAAAATGGAGATCAATTATGAGGAClGAGT

gcccgtacaatttgggctttgcccgtgccatgttcgacttggcc

GCTGCTGCTGCTGGCCATGCGGGCAACGGCACAGAATGGCAAT

acatgaaagtacaatttgagcaggaaagcgaagcaatcaaagca

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GAGCCATGTGATTGCCAATCCTGGCCAACACAGTTCGGTTGGGCCAAGGAAAGAAAGAAGAACCGTTGTCATCGGACTTCGATTTTTGAG G AC AAAC AAATCAGG AG G AAATAGAATAG AAAACC ATTTTGTTGACATGTCGAACArrTATTTAMGTAATAAATATTTGGTAATAAGGAAAAA (SEQ m NQ;42)

30C02 - Pioneer

ATGAGGAAACTTCCATTCTTGCTCTTATTTTCTGCTTGTTGCTACTTGCAACGGAAGGAAGTATATTTCGCCGAAAAAACAGAAA

gaaaaattcatcgagcagcgaacaaaaaacacaaagaagaaacc

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tatggccaatcgaatggattttcaaatggccgatttggcggctc

cagtgtctattcaaatagcggccggtcgaatagctttccaaatgCACTTTnTAA (SEQ ID NO:43)30D08 - Pioneer

30E03 - Pionesr

ATCCTCTAAGAATTCACATCCTCTCAGAAAATGGCTTCATCTTTCTGCTCCTCAATCATTTCCATCGTCGCAATTGTCTGTTTGCTGTGCAAATGCTGCTTTTCGGCACCCCATCCATGCTGTCCTGGCAGCCAACATGTTGTTTCGATGATGAAAGATCACACCGGCACATTCTCTCACAAGCGCATTTAAGTGCATTGCGACGATTCCGATGATGTCATCA1TTGWGATTGATATGCTATAGAAATTATTTTATTAGAAATGAATGATTACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ IDN 0:45}

30G12 - Pioneer

TTTATATTgagcaátgtcgacgactcggagaaaccttctgctgctgcggct

G GTGATG ATG ATG ATG AAGTCG AAAAAGAG AAG AAG G AATAAG CAAAAAACAATGTGAATrTATTATAGGAAAAAAAGAAAAATG gaagcttagaaatttaatattrtcatttttgaacatttataaaatttcaaaATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO:46)

32E03 - Pioneer

GG GTTGG ACCTGAGG CGGTCGAC G ACTTGG GG GCG GAAGAGTCGGAC TTTGACCAATTGGCAGAGGACGAACTGCTCGAGGACGACGCCATGGGCGGCGAGGCGGACGAATGGGAAGGCATGGGGGAGGAGACGGÁGATGGACAGCCAAATGGCACTTTGATGGCCAACTAATTGGACAAATTACAAACGGAACAAAACGGGACAAATGACACAAAATATTATTTATCA1 11 I IGGCATATCATTGAAAATAAATAGAATTTATTTTGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ JDNO:47)

33AO 9 - Pioneer

ATGAATTTGATTTTTGAAATATTCGCCTTTGGAATGGACAATTTCTCATCGGAAAAAAATGTTTCTCTTCTTCGTCTTTTCTTATTCTTTTTCTCGACCGTAGTATTATTTGGAAGCÔCACACCCTATGGTAAacaaattatgcgaagacctagataaacctgaaggttggcaattattgaaaaagttaacaatcgaaaagtgccggatoagtataatgtggaattcc c c aaatggaaag acagctacaaaag c attaaaaagtttataa (seq id no:48)

33E05 - Pioneer

caaaçctçggccatctgçtcctggttcacaccttgtgccaccaacaccagggaacagccctactgcgcatgacagtcgctga (seqid no;49)

34B08 - Pioneer

ctgcacattccccaattttatttcttccttagtaagtagtattggtgcacaatgcgcacttttctgttcatagccgtagtcgggttgatgttggccgtcatcttggagaatgtaaatgcgactgggaaaaattcgccgacaaagggacaatcgccgccaggcagtccaaaacat

qaaaaagaccgtaaaaatgagcatggtaaccaacagaacgatgcaatgtcacνταααααααααααααααααααααααα (seq id norso)

45D07 - Chorismate mutase

ggcaatt aattgtgcaattaagcggatgaattcgtccgtc

gtttcattttcgctgttactttttgggttattcacaattcgcactg

caaaatcgcaatgcgagaaacattgcactaaaagcaaaccgatg

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aatcgatgattttgaacgggaaaagcaagtgttggaaagtgtttc

ggcgcagggacaaaaagccggcattggggacaattatggagaaTCCTTTC GTTC CG ATTTTG ATTCTTTG ATCAGTG AAAGTGCGGTATTGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO:51)

SYS91 (AF273734)

GAAGGCGTGTCCAAGTTGATCAACGGTATTCCAGTGGCTGAGACCGTGGTTTACCCAGCCATCGGCGAGACCAAGACTCATATC

TTAGGG (SEQ ID NO:52)SYS16 (AF273730)

GGGC (SEQ ID NO:53)SYS86 (AF373733)

(SEQ ID NO:54)

SYS79 (AF273732)

CGTNTCAGTTNGAGTTTCATTGAAAACTCAAAAAATGACAACAGTCAAATTGCTATGCCTAATTGCCCTATTTGCGGTAGTGCAACTTQGTTTTGCATTTGCTATGATGAATCAAAACAACCAACAAGTGAGCCAAAACAACAGCTCTGACGAAGGAGAAGATGATGATGATGCTGGTAACGGCGGGCAATATGACACGGTTGCTCCATTGCGTAGCGACAGCACTAGTTTCGTTAGCAGCGGCACCTTACCGCCGCAGGGC AGC ACCG G TTTC AGCG GGGTCG GC ATGATG CCGCCG CATGCCC AAAAG ATGGG AGC AATGGGCATG GGGATGG GC AATACCAG TTTCGGCAATTTGCAACAACCCACTATGCAAATGCAATATCAAAACCAGCAAATGATGCAAACCCCGCAAATGATGCAAAACCAGCAAATGCCGTTTAACCAGAGTGGCAGTTTCAGTGGGGTTGGCATGATGCCTATG C AGCACC AAAACATGGGAGC AATGGGC ATG ATG AATGTTG GCAGTACCAGTTTTGGCAATTTGCAACAATCCAATATGCAAATGCAACATCAAAACCAGCAAATGATGCAAAACCCGC (SEQ ID NO:55>

SYVSO (AF273736)

CTGCGCCCGTCTACAGCT (SEQ ID NO:56)

SYS56 (AF273731)AGCGAATGCTGTCATGGTGAACACCAAGACGGATTCTGCCAACCCCGAGCGGGACACCAATACCGACGCCGTCATGGTGAACACCAAGACAAATGTTAACCCGGAGCGGTACACCAAGATTG (SEQ IDN 0:57)

SYV84 (AF273737)

CAACAGGCACACCCGGACCATNAACACCAGNAC (SEQ ID NO:58)

SYV42 (AF273735)

TGTCGACAGATTTCAAACTTGATACTTGTTGTTGTTGAACATATTTCTATACCTCACAGrrCGTCCACATTTTGACTTTCGGACAAAAACAAAAGAGAAAAAACGGTGGCAATGATCTCGAGGAGGGCAATTATTATTTGGGCCNTTGCTTTGTTGGCATTAGCAGCGATTTCGCCCAACTTTTCCACCGCTGAOAAAGGAGTTGACGCTGTCGATGCGGNGGACGAAATCATTGACGACCCAAAAGTGGAGGTGCCGAAGAACGGCGTTGGCAAAGGCACCGATGACCAAACAGTGCAGTGGGAGGAGGAGGCGATCAAACTGGAGGGAGTATCAGTGGCCGAGTTCAagcagctcagggagagtgcggagaagcatcaattccaagccga

ggtcaaccggatggtgaagctgatcatcaattcattgtaccgga

acaag g ag attttcctc cg tgag ctcatctccaacgcgtg ggatgccctgnacaaaattcggctcatttcgctgacaaattcgacagcacttgcggccaccgaagaattgtccatcaaaattaaggcggacanagaaaatcacatttt (seq id no:59)

sy20 (âf273729)

id n0:80)

syv46/2b10 (af?73728) c lavata3

aatatt aaaag atccg aaaaaatg cc aaac attttcaaaatccttctgattgtgcttttggccgtcgtctcattccgtctctcggcttctactggtgacaaaaaaactgctaatgatgggagtggaaacaactcatcagctgggattggtacgaagatcaaaagaattgtcaccgctggactgctcttcacttccctggcgacgggtggggcggaagtg attg ggcg aag caatgctc agg g agg aaatg ccgc cgg attggtgccatcgcatgtgaccaatcgctcaatggctccaccacctcctcctgtgcaatttgaaatgggggcaaatcgattagaaaaaatgagggcacacctacgcg (seq id no:61)

sys7 (af159590)

CTCAGAGGGACGCTTCAGATTGGAGGGQTACAQGGAQGAAATC

accaccatcgaccccaaaattaacatttatcacgactgcaacgac

gggctgaagccatgccagcgcaaaatctcaattatgatcccgga

caaatacatcgcctcgggcgaacatcgcaatacgtattacgacg

cgggcacagtcgaattggagggcaaattcagtggcgagacaag

GGACTGTCTGCACTAATTGGATTGGAACTGATCATTTGGGAGTTT

ctgatgagttgggactgaccaattggaactctgtgcactôatca

ctttcccatttttgtttctgttttgtcaccgattttccccaaagtc

ttacac c ac cc aatgtg aatttg c ataaatttgtc cg c aaaaaaa

aaaaaaaa (sêg id no:62)

syv55 (af159591)

aacaaaacaaaacgaacatttgccagcagttggctaggacaacggcccaaagagaagtgaagtgaattgcctctgctctgaacactgatgatgatggttcgttcttcctcctcttccttttcccttccg

tcgtacttcctttctctcctccccctccttctcctccttttctcccaatgttcccaaatttcttttgcttgccaatgccaatgggccccgccaaaggacaattattgttcctccgattgggttgcccacgtgcaggtgatcaaacgacaggagggcgtgcgaatgccggcggggatcaAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO:63)

Um resumo dos genes de parasitismo de nematódeo (SEQ IDNO 1-54) alvejada para inibição é fornecida na Tabela 1. Osnúmeros de acesso ao GENBANK de cada gene alvejado estáincluído na tabela, bem como a sua localização de expressão.<table>table see original document page 108</column></row><table><table>table see original document page 109</column></row><table><table>table see original document page 110</column></row><table><table>table see original document page 111</column></row><table><table>table see original document page 112</column></row><table>aClones com um asterisco codificam proteínas secretorascom sinais de localização nuclear previstos.

bTamanho do comprimento integral do clone com previatamanho da estrutira de leitura aberta (ORF); * indica semcomprimento

cHibridização in situ de sondas de cDNA paraespecificamente mRNA dentro da célula dorsal única daglândula esofágica (DG) ou de duas células subventral daglândula esofágica (SVG), em segunda estágio juvenil pré-parasítico (Pre-J2), parasitíco J2 (Par-J2) ou parasítico J3,J4ou estágios de adultos jovens (J3-A) de Heteroderaglycines.

dNova transcrito sem homologia a qualquer genes dopúblico em bases de dados.

eNão detectado

fPercentual de identidade de resíduos de aminoácidoproteína prevista.

Exemplo 2: genes de parasitismo de Heterodera glycines tendohomólogos em outros cistos nematódeos

Este exemplo fornece dado, que o cisto nematódeo da soja(SCN), H. glycines, genes do parasitismo apresentado nesterelatório têm homólogos no cisto nematódeo da beterraba(BCN), Heterodera schachtii, como evidência da existência dehomologos dos genes de parasitsimo da H. glycines emmúltiplas espécies de cisto nematódeos.

Materiais e Métodos:

Cultura de Nematódeo

Heterodera schachtii foram propagadas em raízes derepolho em estufa. Os ovos foram coletados 'como descritoanteriormente (Goellner et al. (2000) J. Nematology. 32:154-165). Para a coleta do segundo estagio parasitário pré-jovem(pré-J2s), os ovos foram incubados sobre água a 28°C em tubode Baermann. Diferentes estágios parasitários de H. schachtiiforam coletados pela combinação e peneiramento da raiz (Dinget al. (1998) Moi. Plant Mircrobe interação. 11 :952-959) dasplantas infetadas.

Extração de KNA

Péletes de H. schachtii congelados de estágiosparasitários misturados foram triturados com Lysis Matrix Dbeads (Q-Biogene, Irvine, Califórnia, E.U.A.) e nitrogênioliquido injetado em uma mini batedeira (Biospec Products Inc.Bartlesville, OK) . O RNA total foi extraído utilizando osistema de purificação de RNA Micro-Midi Total (Invitrogen,Carlsbard, CA, E.U.A.) seguido as instruções do fabricante,incluindo a digestão de DNAse com DNAsel.

Isolamento de clones cDNA de parasitismo de H. schachtiiClones de cDNA SYV46 (AF273728), 4E02 (AF473826), 5D08(AF473828) e 4F01 (AF469059) foram inicialmente isolados apartir de seqüência expressão tags (ESTs) análises de umabiblioteca de cDNA construídas a partir de mRNA derivado decélulas da glândula esofágica da mistura dos estágiosparasitários de H. glycines (Gao et al. (2003) MolecularPlant-Microbe Interactions. 16:270-276; Wang et al. (2001)Molecular Plant-Microbe Interactions. 14:536-544). Para obtero comprimento total dos clones de cDNA homólogos de SYV4 6 emH. schachtii, extremidades de cDNA 3 'e 5' foram amplificadasdo RNA total utilizando kit GeneRacer (Invitrogen, Carlsbard,CA, E.U.A.). 0 RACE de 5' foi realizada utilizando uminiciador 5' GeneRacer e um SYY46 SPG correspondente (Tabela2), com ponto-RACE no modelo do primeiro filamento de cDNA. 0RACE 3' foi realizada utilizando um iniciador 3'Gene Racer(oligo dT) e SYV46 SPG correspondente. Os produtos da RACEforam clonados dentro de um vetor pCR4-T0P0 (Invitrogen,Carlsbard, CA, E.U.A.) para a seqüenciamento.

Clones de cDNA 4E02, 5D08 e 4F01 de comprimento total,foram obtidos pelo sistema RACE 3' . A síntese do primeirofilamento do cDNA foi iniciada na cauda poli (A) do mRNAutilizando o adaptador. de iniciador (AP) (Invitrogen,Carlsbard, CA, E.U.A.). A amplificação do comprimento do cDNAfoi realizado utilizando 5'SPG correspondente (Tabela 2) e oiniciador de amplificação universal resumido (AUAP)(Invitrogen, Carlsbard, CA, E.U.A.) a um homólogo para aseqüência adaptadora usada pelo iniciador na síntese doprimeiro filamento de cDNA. Os produtos da RACE foramclonados dentro do vetor pCR4-T0P0 (Invitrogen, Carlsbard,CA, E.U.A.) para o seqüenciamento.

Tabela 2: Iniciadores utilizados na amplificação de cDNAde genes de parasitismos de H. scftachtii

Nome Seqüência 5' a 3'

HgSYV46-1 CATTTCCTCCCTGAGCATTGCTTA(SEQID NO: 64)

HgSYV46-2 TTGTCACCGCTGGACTGCTCTTCACTT (SEQ IDNO: 65)

Hg4E02 ATGTCCCTTTTCCGTCC (SEQ IDNO: 66)

Hg4F01 ATGCTCCAAAACGGCCTTAC (SEQ IDNO: 67)

Hg5D08_ATGTTCAGCTC TTCCAATTTG ( SEQ IDNO: 68)_

Análise e alinhamento da seqüência

Comparação de seqüência com homólogos em Heteroderaglycines foi realizado utilizando um programa de alinhamentode local de seqüência NCBIwww.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cqi (Tatusova eMadden (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250). APorcentagem de identidades de nucleotídios e aminoácidosentre as duas seqüências foram comparadas.

A comparação de seqüências de proteínas de produtos degens de parasitismo de H. schachtii com outros na base dedados foram realizados utilizando servidor NCBI Blastphttp://www.ncbi.nlm.nih.aov/BLAST/.

Resultados:

O isolamento de cDNA de H. schachtii homólogos do genesde parasitismo de H. glycines mostraram uma elevadaidentidade de nucleotídios (> 93-99%) (Tabela 3, Figuras IA-D) com o gene de parasitismo do cisto nematódeo de sojacorrespondente (SCN). Os clones cDNA de H. schachtii tambémapresentaram uma grande identidade protéica com o SCNhomólogos e proteínas similares pela similaridade utilizandoBLASTP. Os dados sugerem que o BCN possue genes deparasitismo semelhantes aos do SCN e pode, portanto, serutilizado como um modelo de sistema para determinar funçõesconhecidas desses genes em Arabidopsis thaliana, que é umhospedeiro para a H. schachtii.

Tabela 3 - Comparação dos genes de parasitismo homólogosde BCN (H. schachtii) . Identidades de grau de nucleotideos eaminoácidos com os genes de parasitismo de SCN (H. glycines)foram observados

<table>table see original document page 116</column></row><table>

Exemplo 3 - Localização da transcrição de genes deparasitismos e produtos dentro de nematódeos Heteroderaschachtii

Este exemplo fornece dados sobre a localização daexpressão dos genes de parasitismo e dos seus produtos em H.schachtii, no qual fornece também evidência de homologia degenes de parasitismo entre os cistos nematódeos.

Materiais e Métodos:

Hibridização in situ

Hibridizações in situ foram realizadas em estágiosparasitários misturados de H. schachtii (De Boer et al.(1998) J. Nematology. 30 ( 3) :309-312) . Iniciadoresespecíficos frente e reverso para cada clone de cDNA foramusados para sintetizar a sonda sentido e anti-sentido marcadacom digoxigenina pela assimetria em PCR (Wang et al. (2001)Molecular Plant-Microbe Interations.14:536-544). AHibridização in situ foi realizada com estágios parasitáriosmisturados de H. schachtii como descrito por De Boer et al.,(1998). Após a hibridização, os espécimes foram observadossobre a luz do microscópio para revelar as sondas de cDNA quehibriziram dentro das células da glândula esofágica donematódeo (Wang et al., 2001, De Boer et al., 1998).

Tabela 4 - Iniciadores usado para fazer as sondas decDNA marcadas com DIG.

<table>table see original document page 117</column></row><table>

Imunolocalização

Anti-soros policlonais selecionados para os produtos degens de parasitismo de H. glycines foram produzidos porcoelhos imunizados com dois peptideos sintéticos daEurogentec. Anticorpos policlonais purificados foramutilizados para localizar produtos de gens de parasitismotraduzido dentro de estágios pasitários pré-fixadosmisturados de H. schachtii (Wang et al. (2005) MolecularesPlant Pathology. 6:187-191). Imunodetecção de espécimes denematódeo foram observados pela microscopia deimunofluorescência indireta utilizando isotiocianato defluoresceina (FITC)-conjugados com segundo anticorpo anti-coelho.

Tabela 5: Seqüências de peptideo sintético de seqüênciasde gene de parasitismo de cisto nematódeo utilizadas paraproduzir anticorpos policlonais.

<table>table see original document page 117</column></row><table>

Resultados:A localização do tecido e o desenvolvimento de padrõesde expressão em genes de parasitismo de H. schachtíi foramanalisados em diversos estágios de vida de H. schachtíi pelahibridização in situ. Sondas cDNA anti-sentido marcada comdigoxigenina selecionadas de genes de parasitismoespecificamente hibridizados com transcrições dentro decélulas da glândula esofágica de estágios parasitários de H.schachtíi. As sondas SYV46, 5D08 e 4F01 foram hibridizadascom estágios parasitários das células da glândula dorsal(Parasitárias-J2, J3, J4), enquanto a sonda 4E02 DIGespecificamente ligada a células glândula subventral de ambosos parasitas e estágios pré-parasitários de H. schachtíi.

Nenhum sinal de hibridização foi detectado com a sondasentido de cDNA controle de cada gene de parasitismo. Anti-soros policlonais aumentados para os produtos de genes deparasitismo SYV46, 5D08, e 4F01 de H.glycines (proteínas)foram mostrados apenas para ligar os grânulos secretórios dasglândulas esofágicas de estágios parasitários de H.schachtíi.

A coleção de dados demonstra que gene de parasitismohomólogo existe entre H. glycines e H. schachtíi e que sãoexpressos no mesmo padrão entre as duas espécies de cistonematódeo. Os dados indicam que H. schachtíi usa genes deparasitismo semelhante para infectar plantas hospedeiras esugerem que a planta hospedeira, Arabidopsis thaliana, podeser utilizada para avaliar os genes de parasitismo tanto deH. glycines e H. schachtíi, como um modelo de plantahospedeira. A forte identidade entre os gens de parasitismode H. glycines e H. schachtíi indica que outras espécies decisto nematódeo contem significativamente semelhantes genesde parasitismo.

Exemplo 4: Expressão do gene de parasitismo 23G12 do cistonematódeo de Heterodexa glycines no cabelo das raízes da sojaafetando o crescimento da raiz.

Os efeitos dos produtos de gene de parasitismo de cistonematódeo secretados dentro de células vegetais podem seravaliados pela expressão de cada gene de parasitismotransformados nos tecidos vegetais. Tanto as raízes com pêlosda soja (Cho et al. (2000) Planta. 210:195-204); Doyle &Lambert (2003) Mol. Plant-microbe Interact. 16:123-131) etodas as plantas Arabídopsis thaliana (Wang et al. (2005)Patologia Molecular Plant. 6:187-191) podem ser transformadasem construções destinadas a expressar genes de parasitismo denematódeos individuais constitutivamente com promotores comoCaMV 35S (Benfey e Chua (1990) Science. 250:949-966) oupromotor Glycine max ubiquitina (Gmubi)(Finer (2006), InProceedings of the International Symposium of PlantBiotechnology, Instituto of Biotechnology, YeunghamUniversity, Coréia, p. 17-22). Os resultados apresentados porWang et al. (2005) indicam que a expressão constitutiva deHG-SYV46 em plantas Arabídopsis thaliana do tipo selvagemresulta no consumo da imposição de meristemas apicais paraformar um fenótipo WUSCHEL que é idêntico ao resultado obtidopela expressão constitutiva do pepitídio CLV3 da planta. Osgenes de parasitismo homólogos de cisto nematódeos conhecidosdas plantas também pode ser expressos como descrito aqui, nadisposição de plantas mutantes para genes homólogos pararesgatar o fenótipo mutante como uma demonstração da funçãodo gene de parasitismo em plantas (Wang et al. (2005)) . Osresultados apresentados por Wang et al. (2005) indicam que aexpressão constitutiva de HG-SYV46 em Arabídopsis mutanteCLV-3 resgata o fenótipo aberrante floral de plantas mutantesCLV-3 para produzir o fenótipo floral de Arabídopsis tiposelvagens também indicando que o HG-SYV4 6 tem uma função nasplantas similar ao pepitídio CLV3 peptídeo na planta.

As raízes com cabelos da soja tenham sido demonstradacomo um sistema bem sucedido para expressar genes deparasitismo nematódeo e obter um fenótipo observável que podeindicar a influência do produto de gene de parasitismo denematódeo do parasitismo gene .produto nas células vegetaishospedeiras (Doyle e Lambert (2003) Mol. Plant-microbeInteract 16:123-131). Este sistema de pêlos da raiz da soja éaplicável aos genes de parasitismo de nematódeos comhomólogos identificáveis e para genes de parasitismo denematódeos como HG-23G12 (Gao et al. , (2003) Mol. Plant-microbe Interact. 16:270-276) que não têm nenhuma homólogoidentificável em bases de dados de genes públicos.

Materiais e métodos:

Constructo do gene 23G12 do cabelo da raiz

Amplificação por PCR do gene de parasitismo 23G12 de H.glycines (AF500033) foi realizada para gerar lacunas delocais de restrições para as enzimas BamHI(5'underlined) eSstI (31underlined) utilizando os seguintes iniciadores:

a) 51-AAGGATCCATGCGCACTTTTCTGTTC-3 (SEQ ID NO:83) e

b) 5'-AAGAGCTCTCACCATTTTAAGGCTTGC-S' (SEQ ID NO:84).

As reações foram realizadas por 30 ciclos e consistiu naseguinte seqüência: 94°C por 2 min, 56°C durante 1 min e 72°Cpor 1 min. Os ciclos foram precedidos por uma desnaturação deem 94°C pelo período de 4 min, e seguido por 72°C num períodode extensão final de 7 min. Um produto de PCR de 0,3 kb foidigerido com BamHI e SstI e subclonado dentro de pBI121contendo o promotor 35S. Esse vetor contém a seqüência deextremidade apropriada para ajuda na transferência do T-DNAdentro do genoma vegetal e marcadores selecionáveis comresistência a canamicina para permitir a selecção detransgênicos dos cabelos das raízes. A análise restrição eidentificação e fidelidade da cosntrução do gene foramconfirmadas pelo seqüenciamento de DNA.

Geração e análise da expressão do 23G12 nos cabelosdas raizes da soja.

0 vetor binário pBI121 contendo o gene 35S:23G12 foiintroduzido dentro da cepa de Agrobacterium rhi zogenes K599cucumopine utilizando eletroporação (Savka et al. (1990)Phytopathology. 80:503-508). A inoculação da planta foiconduzida de acordo com Cho and associates (2000), comalgumas modificações. Duas semanas após o aparecimento daraiz, 1 a 2 cm da extremidade da raiz foram transferidas eforam liberadas de bactérias pela passagem do meio MXB (MS(Murashige, Τ. e Skoog. (1962) Physiol. Plant. 15:473-497)sais nutricionais básicos, B5 (Gamborg et al. (1968) Exp.Cell Res. 50:151-158) vitaminas e 3% de sacarose (pH 5.7)),solidificada com 3 g de fitagel por litro. Carbenicilina(500pg/l) foi adicionado para inibir o crescimento de A.rhizogenes e canmicina (50 \iq/l) foi adicionado paraselecionar as raizes transformadas. Para identificaraproximadamente os cabelos das raizes transformados, o DNAtotal foi extraído como descrito por Edward et al. (1991)Nucleic Acids Res. 19:1349. O PCR foi realizado utilizando osseguintes iniciadores internos: frente: 5'-AAGAATTCACAGGGAAAAATTCGTGAC-3' (SEQ ID NO:85) e reverso: 5'-AAGGATCCTTCACCATTTTAAGGCTTGC-3' (SEQ ID NO:86) e o programade PCR descrito acima. O produto de PCR foi eletroforesado emum gel de agarose usando técnicas padrões. Para avaliar aexpressão tranngênica, o RNA total foi extraído com um RNeasyMini kit (QIAgen, Valência, CA) , de acordo com as instruçõesdo fabricante. O RNA extraído foi tratado com DNAse I, deacordo com as instruções do fabricante para rigorosamente RNAcontaminados (DNA-free, Ambion Inc., Austin, TX, E.U.A.). ORNA (Iyg) foi, então, transcrito-reversamente usando oSistema de síntese de primeiro filamento superescrito paraRT-PCR (Invitrogen Life Technologies), de acordo com asinstruções do fabricante para preparação de oligo (dT) . OcDNA resultante foi então usado como modelo para PCR de 23G12usando iniciador interno e o programa de PCR descrito acima.

Resultados

O PCR do DNA total do cabelo das raizes de sojatransformada usando iniciadores específicos para o gene 23G12foi usado para confirmar a presença deste gene nas raízesseleciondas com canamicina. A Expressão do gene 23G12 doscabelos das raízes transformada foi conformada pela analisede extração de RNA pelo RT-PCR. Os cabelos das raízes da sojaque expressaram o gene de parasitismo 23G12 mostraram umadrástica diminuição na formação de raízes laterais, emcomparação com o controle de cabelos das raízes de soja quenão expressam o gene 23G12 (dados não apresentados).

Exemplo 5: Expressão de cDNA 4F01 de H. schachtii em mutantesde Arabidopsis selecionados

A família do gene anexina em Arabidopsis é composta poroito membros, Atannl-Atann8 (Cantero et al. (2006) PlantPhysiol. Biochem. 44:13-24) e os clones cDNA 4F01 denematódeos apresenta uma alta seqüência nucleotídicasemelhanças com Atannl. Anexina é uma família multigene queno qual são Ca2+ dependente ligando proteínas de ligação amembrana. Diversas funções têm sido responsabilizadas para aanexina vegetal, incluindo secreção mediada por Golgi damembrana plasmática e material da parede em células vegetais(Clark e Roux (1995) Plant Physiol. 12 6:1072-108 4). Alémdisso, anexina estão podem estar envolvidas na canalizaçãoCa2+ e em atividades enzimáticas do nucleotídiofosfodiesterase e peroxidase (McClung et al. (1994) Biochem.J. 303:709-712). Recentemente o isolamento e a caracterizaçãode diversos AnnAt mutantes têm mostrado que é possível AnnAtlestar envolvidas na resposta osmótica do estresse. 0 annAtl eatann4 mutantes mostraram hipersensibilidade a ABA eestresses osmóticos induzidos pelo NaCl a 75mM, enquantoannAt2 não indicou associação com o estresse osmótico edefecção de germinação (Lee et al. , (2004) Plant Cell.16:1378-1391). A fim de determinar se a anexina 4F01 donematódeo é semelhante na função de uma anexina vegetal emArabidopsis, uma complementação de ensaios foi conduzido.

Materiais e Métodos:

Linhas de inserção de T-DNA

Mutantes annAH (SALK_015426), annAt2-l (SALK_054223) eannAt4-3 (SALK_073121) de inserção de T-DNA foram obtidos apartir do Arabidopsis Biological Resource Center (Ohio StateUniversity, Columbus, 0H). Todos os mutantes e plantas tiposelvagens utilizadas foram executados em Arabidopsis COI-O.

Complementação do mutante annAtl de inserção T-DNAO vetor binário, pB121 (Clontech, Palo Alto,Califórnia), contendo os genes β-glucuronidase foisubstituído pela região de codificação 4F01 do nematódeo. Oconstructo foi transformado dentro de Agrobacteriumtumefaciens da cepa GV3101 usando o método dip floral(Martinez-Trujillo et al. (2004) Plant Molecular BiologyRepórter. 22:63-70). As plantas transgênicas foramselecionadas em placas MS que contêm canamicina (50 yg/ml). 0PCR com DNA genômico de linhas Tl segregantes foi usado paraconfirmar a presença do gene em transformantes conhecidos. 0PCR foi realizado utilizando iniciadores internos de 4F01(frente: S^GTTGGACAGAAGGCATCAGCACS1 (SEQ ID NO:87) ereverso: 5'AGAAGCGTTGCGGACATATTTGA 3')(SEQ ID NO:88) paraamplificação ~400 pb de produto de PCR.

Teste de germinação

Sementes foram esterilizadas colocadas em MS sacarose(2%) meio ágar suplementado com ou sem NaCl (75 mM) . Taxas degerminação (%) das plantas foram pontuadas 8 dias após aincubação.

Resultados:

A amplificação de um produto de PCR esperado 4F01 peloPCR indicaram que a transformação do gene 4F01 em annAtmutante de Arabidopsis foi bem sucedida. A transformação como gene 4F01 parcialmente complementada a tolerância demutantes de plantas annAtl ao meio condicionado com 75mM deNaCl (Figura 2).

Os resultados coletivos da expressão dos genes deparasitismo do cisto nematódeo em tecidos vegetais indicamque a função dos produtos dos genes do cisto nematódeo cistoem células vegetais altera a manutenção e o crescimento decélulas vegetais. Os resultados são indicativos da função decada produto de gene de parasitismo por cisto nematódeosecretado, uma vez que iria afetar a modificação de célulasvegetais durante a infecção de raízes de plantas por cistonematódeos.Exemplo 6: RNA interferente de um gene de parasitismo de H.glycines in vitro por absorção em dsBNA.

Evidencia de que o RNAi para um alvo de gene nematódeopoderia ser induzida por "absorção" in vitro de nematódeos emdsRNA de seqüências complementar a do gene-alvo foidemonstrado primeiramente em nematódeo de alimentaçãobacteriana, C. efegans (Timmons e Fire (1998) Nature.395:854). Um sistema de absorção in vitro para induzir aingestão de dsRNA a nematódeos parasitas de plantas in vitrofoi subseqüentemente demonstrado para induzir o RNAi de genesalvos no tubo digestivo e germinal de nematódeo (Bakhetia etal. (2005) Mol. Plant-microbe Interact. 15:099 -1106; Urwinet al. (2002) Mol. Plant-microbe Interact. 15:747 - 752).

Este sistema in vitro de RNAi foi adaptado para demonstrarque RNAi de genes de parasitismo dentro das células daglândula esofágica do nematódeo do nó da raiz (Huang et al.(2006) Proc. Natl. Acad. Sei. 103:14302 - 14306; Rosso et al.(2005) Mol. Plant-microbe Interact. 18:615-620) e batata decisto nematódeos (Chen et al. (2005) Mol. Plant-microbeInteract. 18:621-625) poderá ser induzida pela absorção invitro no segundo estagio jovem pré-parasítico (pré-J2) decada espécie de nematódeo dsRNA para ingestão. Evidencia éfornecida aqui que a ingestão de dsRNA de um gene-alvo deparasitismo nas células da glândula esofágica de H. glycinespode induzir o RNAi do gene-alvo como resultado in vitro daimersão de pré-J2 de H. glycines em dsRNA.

0 fortalecimento do conceito de que a ingestão de dsRNApor H. glycines poderia causar uma interferência especificado RNA de um gene de parasitismo de H. glycines expressadonas células da glândula do esôfago de nematódeos foirealizado. 0 gene HG-pell pectate liase de H. glycines(DeBoer et al. (2002) J. Nematology. 30 (3) 309-312) foiescolhida como gene de parasitismo alvo para RNAi porque ogene para HG-pell é expresso exclusivamente no interior dasglândulas subventral do esôfago de H. glycines no estágiojuvenil. Isto permitiu que a absorção in vitro incubada em H.glycines em J2 pré-parasítico em uma solução aumentada parafacilitar a ingestão de HG-pell dsRNA e análises do RNAiatingindo J2 tratados após a ingestão de HG-pell dsRNA.

Materiais e Métodos:

Coleção e Cultura de nematódeo.

Linhagem natural OP50 de Heterodera glycines foipropagada na raiz em estufas de soja (Glycine max) plantas(Goverse et al. (1994) J. Nematology. 26:251-259). No segundoestágio juvenil pré-parasitário (J2) os ovos foram incubadose extraído como descrito anteriormente (Goellner et al.(2000) J. Nematology. 32:154-165). Resumidamente, para isolaros ovos de H. glycines, os cistos foram gentilmente esmagadonum homogenizador de vidro e os ovos foram lavados com águasobre uma peneira de 25 μπι. Os ovos de nematódeo foramagitado com uma solução de 0,02% de azida de sódio durante 30minutos, lavado com água a peneira de 25 pm e, em seguida,incubados com água e raiz de soja a 28 0C em um tubo deBaermann. Depois de dois dias, o segundo estágio juvenilincubado (J2) foram recolhidos e lavados com água em umapeneira de 25 ym e foram resuspenso em 100 μΐ de água.

Síntese de dsRNA HG-pell

Plasmideo contendo um clone inteiro de cDNA de um genede parasitismo de H. glycines codificado pela pectate liase(DeBoer et al. (2002) J. Nematology. 34:9-11), HG-pell(AY026357), foi usada como modelo para síntese de RNA. 0 DNAplasmidial foi isolado usando o sistema de purificação de DNAWizard Plus miniprep (Promega, MD, E.U.A.), e usado comomodelo para as reções de PCR utilizando os iniciadoresmostrados abaixo. Os iniciadores de PCR (imediatamenteabaixo) foram concebidos para nucleótidos 161 -445 e 569-835do cDNA HG-pell para produzir produtos de síntese de dsRNA de285 (ds285) e 267 (ds267) nucleotídios, respectivamente. AProteína verde fluorescente (GFP) foi utilizado como controlenegativo para as experiências de imersão de dsRNA, uma vezque não está presente em H. glycines. Este vetor GFP depP114.108 (L3522) é concebido a partir de uma versãomelhorada de C. elegans do Dr. Andrew Fire, CarnegieInstitute of. Washington. O PCR foi realizado como descritoanteriormente (Wang et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:40174-40179) utilizando o seguinte perfil de ciclo: 94°C por 2 min,seguido de 35 ciclos de 94°C de 1 min, 69°C por 40 seg, 72°Cpor 1 min, e uma etapa final a 72°C por 10 min. Os produtosda PCR foram purificados utilizando um kit de purificação dePCR Qiagen e à qualidade e o rendimento da reação foiverificada por eletroforese em gel de agarose. RNAs sendo eanti-sentido foram sintetizados em uma única reação in vitroutilizando o kit MEGAscript RNAi (Ambion, TX, E.U.A.), deacordo com as instruções do fabricante, com exceção de que asreações foram incubadas durante 16 hs para aumentar aprodutividade do RNA. A quantidade e a qualidade dos dsRNAgerados foram estimados pela coloração do brometo de etidio ee gel de agarose seguida de eletroforese padrão equantificação por espectrofotometria. Os produtos de dsRNAforam precipitados em etanol e ressuspendidos em água livrede nuclease a uma concentração de 10-15 μg/μl.

Tratamentos de Absorção de dsRNA Hg-pell

O protocolo de absorção de dsRNA de Urwin et al. (2002)Mol. Plant-microbe Interact. 15:747-752) foi utilizado comalgumas modificações. Alíquotas de dez-microlitros dasuspensão de nematódeo contendo 1000 J2 foram saturadas emsolução de dsRNA HG-pell ds285, HG-pell ds269 ou GFP ds269numa concentração final de 2,5 e 5,0 mg dsRNA/ml, 50mM deconcentração final de Octopamina (Q - 0250, Sigma), 0,2 mg/mlisómero I FITC (F-7250, Sigma), 0,05% gelatina, ImMespermidina (S-2626, Sigma) suficiente para fazer um tampãode absorção de 30 μΐ de volume final de absorçãoo. Osnematódeos foram absorvidos em solução de dsRNA durante 24horas a 28°C para permitir a ingestão de dsRNA e subsequentesefeitos do RNAi efeitos.

Extração do RNA, transcrição reversa (RT-PCR) eAmplificação por PCRApós o tratamento com dsRNA, os nematódeos foramcuidadosamente lavados cinco vezes com água livre de Nucleasepor centrifugação utilizando procedimentos padrões. 0 RNAtotal de 1000 J2 pré-parasitários foi isolado usando o kit deRneasy mini Qiagen (Valência, CA, E.U.A.) de acordo com asinstruções do fabricante. Vestígios de DNA genômico foramremovidos usando DNAase livre de RNase do Qiagen (Valencia,CA, E.U.A.) e usado em kit Turbo livre de DNA (Ambion, TX,E.U.A.) e usada em um único oligo-dT carregado para reação detranscriptase reversa utilizando o kit de arquivo de altacapacidade de cDNA (Applied biosystems, Foster City,Califórnia, E.U.A.) Para garantir que a amplificação do RT-PCR originado a partir do mRNA e não resultando decontaminação do DNA, reações de controle foram incluídas, naqual a transcriptase reversa foi omitida (TSN ). O resultanteda reação de 60 μΐ de cDNA foi armazenado a -80°C antes daanálise.

Experimentos com PCR em tempo real e Análise deProdutos

Níveis endógenos de mRNA foram medidos em duas fases emtempo real na detecção de baseado em analise de PCR com osistema de detecção de seqüências ABI Prism 7000 (Appliedbiosystems, Foster City, Califórnia, E.U.A.), utilizando okit de PCR SYBR green, de acordo com as instruções dofabricante. Iniciadores qPCR para detectar HG-pell foramdesenhados usando o software Primer Express (ABI). Os ensaiosde PCR foram dirigido contra os segmentos do mRNA alvoexterno para o segmento alvejado pelos dsRNA. A posteriorreação de PCR em tempo real continha 3 μΐ do cDNA em umvolume total de 25 μΐ, consistindo de um Ix mix de SYBR Greene 0,5U de AmpErase Uracila N-glicosilato (Applied biosystems,Foster City, Califórnia, E.U.A.), 100 nM iniciador frente, e100 nM de iniciador reverso e água a 25 μΐ. As reacções foramrealizados em placas de 96-poços MicroAmp com Microcampoptical caps Perkin-Elmer (Applied biosystems, Foster City,Califórnia). A reacção da PCR foi realizada utilizando oseguinte programa: 50°C por 2 min, 95°C durante 10 minutosseguidos de 40 ciclos de (95°C durante 15 segundos, 60°C por1 min). As curvas de dissociação foram realizadas no final decada corrida para a detecção de produtos inespecificos nareação de amplificação. Para cada tratamento, amostrasidênticas foram executadas em triplicata. A quantificação donivel de transcrição também foi padronizada para a expressãodo gene da actina em H. glicina (número de acesso AF318603).Este gene doméstico é constitutivamente expressado em muitostecidos e tem sido relatada a ser um instrumento útil decontrole interno em outros organismos. As seguintes reaçõesde controle foram incluídas: Controle negativo de PCR semmolde de cDNA (NTC) para confirmar que não havia qualquersinal de inespecificidade dos produtos de PCR, e um controlesem RT (TSN) , como descrito anteriormente. Os valores sãoobtidos a partir de três experimentos de tratamentosindependentes. A fim de evitar a variação dos ensaios deinteresse, amostras com o mesmo conjunto de iniciador sempreforam amplificadas dentro da mesma corrida. Cada tratamentoexperimental foi executado em duplicata. A análise dos dados,tal como a determinação do ciclo inicial (TC) que representao ponto de partida da fase exponencial do PCR e apresentaçãográfica foi realizada com o software de Seqüência Detecçãov.1.07 (Applied Biosystems). A quantidade do gene-alvorelativo ao controle endógeno de actina β foi determinadoutilizando o método ΔΔ Ct (Livak e Schmittgen, (2001)Methodo. 25:402-408) e expressados em porcentagem de níveisde controle de transcrição.

Resultados:

A ingestão de dextran marcado com FITC por H. glycinespré-parasítico J2 foi confirmada em J2 que foram incubadas nasolução de absorção de dsRNA contendo 50 mM de octopamina.Uma redução maior do que 220 dobras nos níveis de transcriçãode Hg-pell foi detectado por PCR em tempo real a partir deRNA extraído de H. glycines em J2 após 24 horas de incubaçãoem 5,0 mg/ml para ingerir dsRNA (PEI-267-2) paracomplementariedade dos nucleotídios 569-835 de cDNA Hg-pell(Figura 3). Uma redução de 73 dobras na transcrição de HG-pell foi igualmente observada pela absorção em J2 em 2,5mg/ml dsRNA267 (PEM-267-2.5) que foi indicativo de umaredução quantitativa no efeito do RNAi com niveis reduzidosde dsRNA para a ingestão por H. glycines em J2. Osnucleotídios alvejados 161-445 em cDNA Hg-pell pelo RNAi porabsorção na H. glycines em dsRNA285 quer em 5,0 ou 2,5 mg/ml(Pell-285-5 e PEI1-285-2,5, respectivamente), no entanto, nãoproduziu nenhum efeito detectável sobre níveis de transcriçãoHg-pell e nem de absorção em J2 dsGFP (Figura 3).

A ingestão de dsRNA induzida por absorção em H. glycinesJ2 in vitro em soluções contendo 50 mM de octopamina induzidapor RNAi específicos na transcrição de HG-pell alvejados. 0efeito do RNAi foi dependente da região alvejada dacomplementariedade da transcrição de HG-pell ao dsRNA e àconcentração do dsRNA na solução de absorção de ser ingeridopelo nematódeos.

Exemplo 7: Efeitos da expressão indutível por nematódeoem BNAi vegetal para genes de parasitismo de cisto nematódeoem infecção por cisto nematódeo de raizes de plantastransformadas.

A expressão do RNAi "na planta" (também conhecido porgenes silenciadores hospedeiro-derivado) a genes-alvo podeser desenvolvido usando vetores projetados para produzir umgrampo de intron-unidos de dsRNA em tecidos de plantastransformadas (Wesley et al. (2001) Plant J. 27 (6 ): 581 -90). O potencial para interromper o ciclo de vida da planta-parasitárias por nematódeos por RNAi vegetal para um genealvo de nematódeo existe, mas a escolha dos genes-alvo écrítico para obter um efeito significativo sobre o nemátodo.A expressão de dsRNA para um gene alvo de nematódeo pode serconduzido constitutivamente na planta por promotores comoCaMV 35S (Finer (2006) In Proceedings of the InternationalSymposium of Plant Biotechnology, Institute of Biotechnology,Yeungham University, Korea, pp 17-22), ou maisespecificamente, nos locais de alimentação do nematódeo pelaingestão do nematódeo usando genes promotores como NtCel7(Goellner et al. (2001) Plant Cell. 13:2241-2255) que são emsuper-regulados nos locais de alimentção do nematódeonematódeo. Os genes de nematódeo genes que codificamprocessos biológicos necessários para o seu metabolismo,viabilidade e reprodução representam um grupo de alvospotenciais para o RNAi na planta, e tem sido alcançado algumsucesso (Steeves et al. (2006) Functional Plant Biology.33:991-999); Yadav et al. (2006) MoI. Biochem. Parasitol.148:219-222). Um novo método para alnacçar RNAi vegetaiscontra nemátodos não-alvo dos genes subjacentes dometabolismo básico do nemátodo, mas sim, interrompe secreçõesessenciais essenciais do nematódeo para sustentar a suainteração parasitária obrigatória com o hospedeiro pelo RNAivegetal do gene de parasitismo que codifica essas secreçõesessenciais. Na RNAi vegetal para um gene de parasitismo do nóda raiz tem sido demonstrado com êxito para fornecer deplantas resistentes a nematódeos do nó d raiz (Huang et al.,2006). Dados, que a raiz de nó por nematódeos e poucos cistonematódeos relativamente pouco comuns em seqüências de genesde parasitismo (Davis et al. (2004) Trends in Parasitology.20 (3) : 134-141) , e que a maioria dos genes de parasitismo decisto nematódeo não têm homólogo conhecido (genes deparasitismo), é provável que, no RNAi vegetal genes deparasitismo de cisto nematódeo representa um único meio paradesenvolver resistência de plantas especificas para cistonematódeos. Apresentamos a seguir prova que, no RNAi vegetala vários genes de parasitismos diferentes exclusivo paracisto nematódeos fornecidos a resistência a plantas paracisto nematódeos.

No RNAi vegetal para quatro genes de parasitismo decisto nematódeos (Gao et al. , 2003; Wang et al., 2001), SYV46(AF273728), 4F01 (AF469059), 20E03 (AF490251), e 23G12(AF500033) foi expressado em plantas de Arabidopsis thalianatransformadas para análises dos efeitos sobre a infecção doRNAi vegetal nas raízes de H. schachtii. Expressãoconstitutiva de dsRNA para 20E03 e 23G12 dos genes deparasitismo em planta foi realizado com o promotor Gmubi(Finer (2006) In Proceedings of the International Symposiumof Plant Biotechnology, Institute of Biotechnology, YeunghamUniversity, Korea, pp 17-22), e expressão indutível aonematódeo de genes de parasitismo SYV46 e 4F01 na planta foirealizado com o promotor NtCel7 (Patente US 6906241).

Materiais e Métodos:

Construção de um vetor RNAi

O promotor CaMV 35S de pHannibal (Wesley et al. (2001)Plant J. 27 (6) : 581-90) foi substituído nos locais derestrição Sacl e Xhol com o promotor NtCel7 (patente US6906241 e, onde admissível , é incorporado aqui em suatotalidade) que é super-regulado em locais de alimentação donó da raiz por cisto nematódeos. Sequenias de cDNA sentido eanti-sentido de SYV46 (170 pb) e 4F01 (1023 pb) foramamplificadas de clone interiros de cDNA. Iniciadores de Gene-específicos com produtos amplificados de locais de restriçãoXhol e Kpnl para a orientação sentido e iniciadores de genesespecíficos com de locais de restrição Bam HI e Hindlll paraamplificar os produtos em orientação anti-sentido (pHannibal-Ntcel7-SYV46p; pHannibal-Ntcel7-SYV46p). A vetor resultantefoi confirmado por seqüências. Os constructos pHannibal foramsubclonados nos locais Notl em um vetor binário pART27(pART27-Ntcel7-SYV46p; pART27-Ntcel7-4F01fl).

Transformação de constructos de RNAI em Arabidoposis

Vetores pART27 contendo o grampo intron de RNAi foielectroporatado em Agrobacterium de cepas GV3101.Arabidopsis-O COI foi transformada com vetores desilenciamento utilizando o método dip floral (Martinez-Trujillo et al. (2004) Plant Molecular Biology Repórter.22:63-70). Linhagens segregantes foram selecionadas comcanamicina (50 pg/ml) e transferida, para o solo para aprodução das sementes de recolher linhagens homozigótica. 0PCR foi realizado com DNA genômico de linhagens transgênicaspara confirmar a presença dos genes. Linhagens segregantes(Ti para SYV46 e T2 para 4FOI) foram utilizados na seleçãoinicial para o RNAi vegetal nos ensaios de infecção pornematódeo.

Extração de RNA

Linhagens segregantes Ti expressando SYV4 6p dsRNA foramcultivadas com Lysis Matrix D beads (Q-Biogene, Irvine,Califórnia, E.U.A.) e nitrogênio liquido, colocando em umamini batedeira (Biospec Products Inc. Bartlesville, OK). 0RNA total foi extraído utilizando o RNeasy Plant Mini Kti(Qiagen, Velencia, CA, E.U.A.) seguindo as instruções dofabricante, incluindo a digestão DNAse com DNAsel.

RT-PCR

Iniciadores Oligo dT foram utilizados para a síntese doprimeiro filamento de cDNA do RNA total utilizando atranscriptase reversa Superscript II (Invitrogen, Carlsbard,CAl E.U.A.) de acordo com as instruções do fabricante. Aamplificação do cDNA SYV46 foi realizada com iniciadores degene específico utilizados para amplificar a orientaçãosentido no vetor RNAi de construção pHannibal-Ntcel7-SYV46p.

A amplificação do ciclo da estrutura de filamento duplo foirealizada utilizando iniciadores plntron-15'GACGAAGAAGATAAAAGTTGAGAG 3' (SEQ ID NO:89) e plntron-25'TTGATAAATTACAAGCAGATTGGA 3' (SEQ ID NO:90) designadosdentro da região intron da contrução de RNAi. Amplificação daactina foi usado como um controle positivo e PCR realizadacom RNA como o modelo serviu como um controle negativo.

Material vegetal

As sementes de espécies do tipo selvagens e (Ti paraSYV46 e T2 para 4 FOI) e linhagens de silenciamento de RNAisegregantes RNAi foram esterilizadas com 10% de hipocloritode sódio e de 0,01% entre 20 para 3 min e 1 min com 70% deetanol. As sementes foram lavadas 3 vezes com água destiladaestéril para remover soluções residuais de esterilização. Assementes selvagem tipo CoI-O e as transgénicas RNAi foramcolocadas emmeio de crescimento MS suplementado comcanamicina (50 μς/ml), respectivamente. Cinco dias após agerminação as mudas foram transferidas assepticamente - umaplanta por poço dentro de 12 placas de poços (Costar,Corning, NY), contendo 2 ml de meio Knops modificado(Sijmonset al. (1991) Plant J. 1:245-254) solidificado com 0,8%Daishin ágar (Brunschwig Chemie BV, Amsterdam, Holanda). Asplacas foram cobertas com parafilme e permitido a crescer emuma câmara de crescimento com 15 horas ao claro/9 horas aoescuro. As mudas foram inoculadas 10 dias após a germinação.

Inoculação e avaliação do nemátodo da infecção

Heterodera schachtíí foram propagadas nas raizes decouve em estufa e ovos de H. schachtii foram recolhidos, comodescrito anteriormente para H. glycines (Goverse et al.(1994) J. Nematology. 26:251-259). Os ovos foramesterilizados com 0,02% de azida de sódio por 30 min antes dacolocação em tubos de Baermann modificado para incubação a28°C. A fase J2s fora esterilizada por 10 min em cloreto demercúrico a 0,004%, 0,004% de azida de sódio e 0,002% deTriton X e lavado 3 vezes com água destilada esterilizada. OsNematódeos foram suspensos em 1,5% de agarose de baixo pontode fusão até mesmo para permitir a distribuição de nematódeosem cada planta e para facilitar a penetração dos J2 no meiode crescimento sólido. Cerca de 175 J2 foram inoculados porplanta. Aos 26 dias, após a inoculação, as plantas foramobservadas usando um microscópio de luz invertida paraobservar a susceptibilidade do nemátódeo. As fêmeas porsistema de raiz da planta foram contados e usados como umamedida de susceptibilidade ao nemátódeo. Raizes e brotos deplantas transgenia RNAi também foram comparados visualmentecom o tipo selvagem para observar qualquer diferençafenotipica que podem indirectamente modificar a infecção denematódeos. Os valores médios do nemátodo do sexo feminino/planta foram gerados a partir de um mínimo de sete repetiçõespor linhagem de Arabidopsis e analisados por meio de análisede variância (ANOVA) e teste-t pareado.

Resultados:A presença do constructo de gene NtCel7-4F01 RNAi eNtCel7-SYV46 RNAi e expressão do constructo de gene NtCel7-SYV4 6 RNAi foi confirmada em plantas de Arabidopsis thalianatransformada (Ti para SYV46 e T2 para 4F01) por PCR e RT-PCRlrespectivamente. A linhagem Ntcel7-SYV46-L8 e Ntcel7-SYV46-LlO Ti tiveram uma significativa redução média (p = 0.0004 e0.0070, respectivamente) de infecção por H. schachtiicomparada à infecção de raízes de plantas do tipo selvagensde Arabidopsis (Figura 4). 0 número de fêmeas H. schachtiiproduzidos em raízes de linhagem de segregação individualNtcel7-SYV46-L8 andNtcel7-SYV46-L10 Ti foi tão baixo como umaúnica linhagem por fêmeas ou zero, respectivamente (Figura 5).

As linhagens Ntcel7-4F01-L4-1, Ntcel7-4F01-L4-2, Ntcel7-4 F01-L5-1, e Ntcel7-4F01-L5-2 linhas T2 tiveram umasignificativa redução média (p = 0,028, 0,003, 0,002, e0.0004, respectivamente) de infecção por H. schachtiicomparada à infecção de raízes de plantas tipo selvagens deArabidopsis (Figura 6). 0 número de fêmeas H. schachtiiproduzidos em raízes de linhagem de segregação individualNtcel7-4F01-L4-1 e Ntcel7-4F01-L5-2 linhas T2 foi tão baixacomo femeas nulo ou única por linhagem, respectivamente(Figura 7).

Exemplo 8: Efeitos da expressão constitutiva de um RNAivegetal ao gene de parasitismo do cisto de nematódeo nainfecção de cisto nematódeo das raízes de plantastransformadas.

Materiais e Métodos:

Geração de constructos de genes

0 promotor 35S presente em pHannibal foi removido pordigestão com SstI-XhoI e substituído com promotor Gmubi(Finer (2006) In Proceedings of the International Symposiumof Plant Biotechnologv, Institute of Biotechnology, YeunghamUniversity, Korea, pp 17-22). 0 promotor Gmubi foi fornecidopelo Dr. John Finer (Iowa State University, IA) em vetorpNSNGmubiX-GFP e foi isolado por digestão com Sstl-XhoI.Vetores pGEM-T contendo 20E03 e 23G12 foramprimeiramente digerido com EcoRI. Os fragmentos sentidoresultantes foram, então, extraído em gel e subcloned dentrode EcoRI digerida pHannibal para gerar plasmídeos pHannibal-20E03 e phannibal-23G12, respectivamente. Para clonar ofilamento anti-sentido do gene 20E03, amplificação por PCR degene anti-sentido 20E03 foi realizada utilizando os seguintesiniciadores 20E03-F: 5'-TATCTAGAGGCATTTGCCATTTCAAG-S' (SEQ IDNO: 91 ) e 20E03-R: 5'-TAGGATCCTCATGTAGAAAAGGGCC-S (SEQ IDNO:92). Estes iniciadores gerados em locais de restrição XbaIe BamHI (sublinhado), respectivamente. 0 produto resultantedo PCR foi digerido com Xba Ie BamHI e, em seguida,subclonado dentro de XbaI e BamHI digerida pHannibal-20E03.Para clonar o filamento anti-sentido do gene 23G12, PCR foirealizada utilizando os seguintes iniciadores 23G12-F: 5'-TATCTAGAGCGCACTTTTCTGTTCATAGC-3' (SEQ ID NO.93) e 2 3G12-R: 5-ATAAGCTTTCACCATTTTAAGGCTTGCTC- 3' (SEQ ID NO:94). Estesiniciadores gerados por locais de restrições XbaI e HindIII(sublinhado), respectivamente. 0 produto resultante do PCRfoi digerido com XbaI e HindIII e, em seguida, subclonadosdentro de XbaI e HindIII e digeridas pHannibal-23G12. Acondições do PCR foram as acima descrita e da identidade dosgenes foi confirmada por seqüenciamento.

Transformação Vegetal

As construções feitas em pHannibal foram subclonadoscomo fragmentos NotI em um vetor binário pART27 para produzircontruções de silenciamento de RNA "grampos" contendo intronaltamente eficaz [pART(20E03) e pART27(23G12)] . As contruçõesderivadas de pART27 foram introduzidos em Agrobacteriumtumefaciens GV3101 por eletroporação e transformada dentro deplantas A. thalrana tipo selvagem pelo método dip floral(Martinez-Trujillo et al., 2004). Para identificarpresumidamente a planta Arabidopsis transformada, o DNA totalfoi extraído a partir de folhas de plantas transgênicas eplantas não transformadas, como descrito por Edward et al.(1991). O PCR foi realizado utilizando iniciadoresespecíficos 23G12 e 20E03 descritos acima. Para avaliar aexpressão do transgene, o RNA total foi extraído com RNeasyMini kit (QIAgen, Valência, CA) , de acordo com as instruçõesdo fabricante. 0 RNA extraído foi tratado com DNaseI, deacordo com as instruções do fabricante para severa RNAcontaminados (DNA-free, Ambion Inc., Austin, TX, E.U.A.). ORNA (Iyg) foi, então, transcrito inversamente usando oSuperscript First Strand Synthesis System para RT-PCR(Invitrogen Life Technologies), de acordo com as instruçõesdo fabricante utilizando o seguinte iniciador: PDK-R: 5'-T T GATAAAT TACAAG CAGATTGGA- 3' (SEQ ID NO: 95). 0 cDNAresultante foi então usado como modelo para a amplificaçãopor PCR do íntrom PDK utilizando PDK-R e o seguinteiniciador: PDK-F: 5'-GACGAAGAAGATAAAAGTTGAGAG-3' (SEQ IDNO:96). 0 Programa de PCR foi descrito acima.

Material Vegetal

As sementes de linhagens de silenciamento de RNAi TO etipo selvagens (por Gmubi-20E03 e Gmubi-23G12) foramesterilizadas com 10% de hipoclorito de sódio e 0,01% entre20 para 3 min e 1 min com 70% de etanol. As sementes foramlavadas por 3 vezes com água destilada estéril para removersolução residual de esterilização. Sementes tipo selvagemCoI-O e as sementes transgénicas RNAi foram introduzidas emmeio de crescimento MS e meio MS suplementado com canamicina(50 yg/ml), respectivamente. Cinco dias após a germinação asmudas foram transferidas assepticamente- uma planta por poçodentro de placas de cultura com 12 poços (Costar, Corning,NY), contendo 2 ml de meio Knops modificado (Sijmons et al.,1991) solidificado com 0,8% de Daishin ágar (BrunschwigChemie BV, Amsterdam, Holanda). As placas foram cobertas comparafilme e colocadas para crescimento em câmara com 15 horasclaro/9 horas escuro. As mudas foram inoculadas 10 dias apósa germinação.

Inoculação e avaliação de infecção por nematódeo

Heterodera schachtii foram propagadas em raízes de couveem estufa e os ovos de H. schachtii foram recolhidos, comodescrito anteriormente para H. glycines (Goverse et al.(1994) J. Nematology. 26:251-259). Os ovos foramesterilizados com 0,02% de azida de sódio por 30min antes dacolocação em um tubo de Baermann modificado para incubação a28°C. A fase J2s foi esterilizada por IOmin com cloreto demercúrico a 0,004%, 0,004% de azida de sódio e de 0,002%Triton X e lavada por 3 vezes com água destiladaesterilizada. Os Nematódeos foram suspensos em 1,5% deagarose de baixo ponto de fusão até mesmo para permitir adistribuição de nematódeos em cada planta e para facilitar apenetração dos J2 em um meio de crescimento sólido. Cerca de175 J2 foram inoculados por planta. Aos 26 dias, após ainoculação, as plantas foram observadas usando um microscópiode luz invertida para observar a susceptibilidade dosnematódeos. As fêmeas por sistema de raiz de planta foramcontados e usados como uma medida de susceptibilidade anematódeos. As raízes e os brotos das plantas trangênicas deRNAi também foram comparados visualmente com o tipo selvagempara observar quaisquer diferenças fenotípicas que podemindiretamente modificar a infecção dos nematodeos.

Resultados:

A presença e a expressão do constructo de gene Gmubi-20E03 RNAi e Gmubi-23G12 RNAi foram confirmadas emtransformantes primários (T0) de plantas Arabidopsis thalianapor PCR e RT-PCR, respectivamente. O número de fêmeas H.schachtii produzidos em raízes de cada indivíduotransformante primário de Gmubi-20E03 RNAi ou Gmubi-23G12RNAi foi diminuído em pelo menos cinco vezes ou mais quandocomparados com o número de H. schachtii produzidos em raízesde fêmeas do tipo selvagens de Arabidopsis (figuras 8A-B).

A infecção de raízes de plantas por cisto nematódeosdiminuiu significativamente nas plantas transformadas paraexpressar a filamento duplo de RNA dos genes de parasitismoSYV46 e 4F01 de cisto nematódeo impulsionada pelo promotornemátodo-indutível NtCel7 em comparação com o tipo de plantasselvagens. Plantas individuais dentro de linahgenssegregantes SYV4 β-RNAi (TI) e 4F0 I-RNAi (Τ2) tinham quasenenhuma infecção por cisto nematódeos, o que indica que aslinhagens de plantas com forte resistência aos cistonematódeos derivados dessas SYV4 6-RNA e 4F01-RNAÍ podem serobtidos quando induzidos a homozigosidade. Do mesmo modo,indivíduos transformantes primários da 20E03-RNAÍ (T0) e23G12-RNAÍ (T0) , dirigidos pelo promotor constitutivo Gmubitinham quase nenhuma infecção por cisto nematódeos, queindica que as linhagens de plantas com forte resistência aoscisto nematódeos derivados dessas plantas 20E03-RNAÍ e 23G12-RNAi podem ser obtidos quando induzidos a homozigosidade.

Exemplo 9: Efeitos da expressão de KNAi vegetal em genes4G06, 8H07 e IOAO6 de parasitismo de cisto nematódeo sobreinfecção por cisto nematódeo de raizes de plantastransformadas.

Materiais e Métodos:

Vetores de Contrução para experimentos de regulação dede RNAi.

O vetor RNAi pHannibal (Wesley et al. (2001) Plant J. 27(6):581-90) foi usado para construir a contrução do RNAi.Seqüências sentidoe anti-sentido de cDNA de três genes deparasitismo de cisto nematódeo de soja (Gao et al (2001) Moi.Plant-microbe Interact. 16:270-276 viz. 10A06 (AF502391),4G06 (AF469060) e 8H07 (AF500024) foram amplificados comclones cDNA e colocado sob o controle do promotor 35S deexpressão cosntitutiva em pHannibal. 0 fragmento sentido foiamplificado usando iniciadores de gene-especifico tendolocais de restrição Xhol (Próximo iniciador) e . EcoRI(Iniciador reverso) e inserido como Xhol-EcoRI dentro dofragmento pHannibal. 0 fragmento anti-sentido foi amplificadousando iniciadores de gene-especifico tendo locais derestrição Xbal (Próximo iniciador) e Hindlll (Iniciadorreverso), e inserindo-o como um fragmento reverso comoHindlll-Xbal dentro do pHannibal. Todas as construções deRNAi foram feitas usando a mesma estratégia, exceto o gene4G06 onde o local de restrição ClaI foi utilizado noiniciador reverso anti-sentido para amplificação. Os vetorespHannibal foram subclonados em locais Notl dentro de um vetorbinário pART27.

As regiões do gene foram seleccionados com base em umadas únicas regiões (UR) para que determinado gene ou regiõesconservadas (CR) em todo as famílias de gene. As regiões e osiniciadores utilizados para amplificação destas regiões sãomostradas na tabela abaixo. Os locais de restrição usados nosiniciadores para facilitar a clonagem de produto da PCRdentro do vetor pHannibal são mostrados em negrito (Xhol:ctcgag, EcoRI: gaattc, Xbal: tctaga, Hindlll: aagctt, CIaI:atcgat).

Tabela 6: Gene 10a06, região conservada (CR), pares debase (656 a 758)

<table>table see original document page 139</column></row><table> Tabela 7: Gene 4G06, região única (UR) bases de pares(404 a 556)

<table>table see original document page 139</column></row><table>

Tabela 8: Gene 8H07, Região Unica (UR), pares de bases(1079 a 1160)<table>table see original document page 140</column></row><table> Tabela 9: Gene 8H07, região conservada (CR), bases depares (515 a 852)

<table>table see original document page 140</column></row><table>

A região do gene alvo foi amplificado usando sistema depesquisa MJ PTC-100 (149 Grove St., Water Town, MA 02172) porciclo térmico. As condições de PCR iniciais incluíramtemperatura de fusão 94°C durante 2 minutos seguidos de 35ciclos de 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 45 segundose 72°C por um minuto. Este foi seguido por uma extensão finalde 7 minutos a 72°C. A composição da reação de PCR incluída a0,025 unidades/μΐ de Taq polimerase (New England Biolabs) eInvitrogen (1600 Faraday Av. Prof., Caixa Postal 6482,Carlsbad, CA 92008) os reagentes incluindo 1.5mM MgCl2, 200μΜ de cada nucleotídio dATP, dTTP, dGTP, dCTP. A concentraçãodo modelo de DNA plasmidial foi de 1 a 10 ng/ΐμΐ

O DNA foi digerido usando enzimas de restrição da NewEngland Biolabs and Invitrogen usando o protocolo sugeridopelo fabricante. Do mesmo modo, a ligação de moléculas de DNAfoi feito essencialmente como descrito pelo fabricanteInvitrogen usando a T4 DNA ligase. A minipreparação do DNAplasmidial foi feito usando Qiagen kits (QIAgen, Valência,CA), seguindo as instruções descritas pelos fabricantes.Todas as construções foram confirmadas por seqüenciamento deDNA na Iowa State University DNA sequencing facility.

Transformação de construções de RNAi em Arabidopsis

O vetor binário foi mobilizada em competente químico emAgrobacterium cepa (C58) usando o método padrão de choquetérmico e colocados com meio LB tendo canamicina (50 pg/ml).Plantas Arabidopsis foram transformadas usando o métodofloral por absorção de acordo com o método descrito porClough e Bent (1998) Plant J. 16:735-43.

Análise de segregação e obtenção de plantashomozigóticas

Depois das sementes de cada planta foram coletadas, assementes de 10 plantas individuais foram selecionadas de cadaconstrução. As sementes foram plantadas a partir de plantasindividuais sobre meio de seleção (MS (Murashige e Skoog(1962) Physiol. Plant. 15:473-497)) complementado com500mg/LMES2 (Nmorfolinoetano. Ácido sulfônico), 0,1% desacarose [pH 5,7], Solidificado com 8 gm/L de fitoágar(Investigação Products International Corp cat. 9002-18-0 N0410 N. Dr. Business Center, Mt. Prospect, IL 60056).canamicina (50 mg/L) foi adicionado ao meio para selecionaras progêniesde plantas resistentes a canamicina. 300 a 500sementes de plantas individuais foram colocadas sobre meio deseleção contendo 150 mm de petridish e cultivadas a 25°C em16/8 de ciclo claro/escuro. As plantas canamicina-resistentecrescidas no meio de seleção foram cuidadosamente removida eplantadas em vasos contendo mistura de solo e transferidospara um quarto de crescimento também para crescer até àmaturidade. As sementes foram coletadas de plantasindividuais - estas foram as nossas sementes Ti. As sementesTl foram ainda colocadas em meio de seleção para analiseadicional de segregação ao fenótipo resistente. As sementeresistentes a canamicina T2 foram colhidas de famílias nãosegregantes e também colocadas para confirmar o fenótiporesistentes. A linhagem homozigótica T3 foram utilizados emtodos os ensaios.

Material vegetal

As sementes do tipo selvagens e linhagens desilenciamento RNAl T3 foram esterilizadas com 10% dehipoclorito de sódio e 0,01% de Twen 20 por 3 min e 1 min com70% de etanol. As sementes foram lavado por 3 vezes com águadestilada estéril para remover resíduos da soloção deesterilização. Sementes RNAi trangenica e C24-tipo selvagemforam transferidos assepticamente, uma planta por poço, emplaca de cultura de tecido de 12 poços (Costar, Corning, NY),contendo 1,5 ml de meio Knops modificado (Sijmons et al.(1991) J. Plant 1:245-254) solidificado com 0,8% Daishin ágar(Brunschwig Chemie BV, Amsterdam, Holanda). As placas foramcobertas com parafilme e colocadas para crescimento em câmaracom 16 horas no claro/8 horas escuro. As mudas foraminoculadas 10 dias após a germinação. 0 delineamentoexperimental para estas experiências foi criado, de modo aque cada linhagem testada foi replicada pelo menos 15 vezespor experimento com cada replica constituída por uma únicaplanta. Os experimentos foram instaurados en seqüência de ummodelo de bloco aleatório com todos os tratamentospadronizados dentro da placa de 12 poços.

Inoculações e avaliações de infeção por nemátodo

Heterodera schachtii foram propagadas em raízes decanola em cultivadoas em estufa e os ovos de H. schachtiiforam recolhidos pela ruptura de cistos abretos e recolhidosos ovos em uma peneira, constituído de # 60/# 200/#500. Osovos foram então tratados com um gradiente de sacarose a 35%.

Os ovos foram colocados em um tubo de Baermann modificado(câmara de incubação), com 3,14 mm de ZnSO4 para incubação a26°C. A superfície J2s foi esterilizada durante 1 hora, em0,001% hibitane e 7 minutos, a 0,001% de cloreto mercúrico elavados por 3 vezes com água destilada esterilizada. OsNematódeos foram suspensos em 1,5% de agarose de baixo pontode fusão até mesmo para permitir a distribuição de nematódeosem cada planta e para facilitar a penetração dos J2 em meiode crescimento sólido. Cerca de 250 de J2 foram inoculadospor planta. Em 14 dias após a inoculação as plantas foramobservadas através de um estereomicroscópio Zeiss STEMI 2000.

As fêmeas por sistema de raiz da planta foram contadas eusados como uma medida de susceptibilidade aos nematódeos.Raizes e brotos de plantas transgênicas RNAi também foramcomparados visualmente com tipo selvagens para observarquaisquer diferenças fenotipicas que podem indiretamentemodificar a infecção de nematódeos. Os valores médios donematódeo do sexo feminino/planta foram gerados a partir deum mínimo de quinze repetições por linhagem de Arabidopsis epor três experiências independentes. Cada experimento foianalisado individualmente por um teste-t modificados usandoum software estatístico SAS. 0 SAS usado, nós geramos amédia, valor de ρ e erro padrão para cada experimento.

Resultados:

Linhagens de RNAi 10A06 [conservadas], 4G06 [único],8H07 [conservadas] e 8H07 [única] foram testados contra umalinhagem de controle tipo selvagem. Dentro deste experimento,todas as linhagens foram testadas duas vezes (Figura 9) . Paraa linhagem 10A06 [conservada] um dos testes teve um reduçãomédia significativa (p= 0.0151) do sexo femininodesenvolvidas por H. schachtií comparado ao a plantasArabidopsis do tipo selvagem. Esta foi uma redução de 35%, emmédia, por planta. Para a linhagem 4G06 [única], ambos ostestes tiveram redução média significativa (p= 0.0061 e0.0066) em femeas desenvolvidas por H. schachtii comparado aode plantas Arabidopsis do tipo selvagem. Esta foi uma reduçãode 46%, em média, por planta, para ambas as linhagens. Para alinhagem 8H07 [conservada] , ambos os testes tiveram reduçãomédia significativa (p= 0,005 e 0.0011) em fêmeasdesevolvidas por H. schachtii comparado ao de plantasArabidopsis do tipo selvagem. Esta foi uma redução de 46% e62%, respectivamente. Para a linhagem 8H07 [única] um dostestes tive uma redução média significativa (p = 0,013) emfêmeas desenvolvidas por H. schachtii comparado ao de plantasde Arabidopsis do tipo selvagem. Esta foi uma redução de 38%em fêmeas, em média, por planta.

Claims

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreendeum inibidor de ácido nucléico especifico para um mRNA oufragmento deste codificando um polipeptidico que é codificadopor uma ou mais das SEQ ID NOS: 1-63 e 113-116 ou um fragmentohomólogo deste, em uma quantidade suficiente para inibir aexpressão do polipeptideo codificado por uma ou mais das SEQID NOS: 1-63 e 113-116 ou homólogo deste ou quando fornecidoa um nematódeo.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o polipeptideo ou fragmentodeste codificado por uma ou mais das SEQ ID NOS: 1-63 e 113--116 e modula: expressão genética de plantas ou células,formação de um sincicio, migração do nematódeo através detecidos da raiz da planta, metabolismo da célula vegetal,transdução do sinal celular vegetal ou formação de um tubo dealimentação que permite ao nematódeo alimentar a partir dosincicio formado na planta.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que a expressão genética da plantaou célula é modulada pelo polipeptideo.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de que a modulação da expressãogenética ocorre em uma célula da raiz.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que o nematódeo é um membro daHeterodera spp ou Globodera spp.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que a planta ou célula transgênicaé uma monocotiledônea ou dicotiledônea.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que a planta ou célula é um membroda Leguminosae.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que a planta ou célula é uma soja.

9. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende umpromotor operacionalmente ligado a um ácido nucléicocodificando um inibidor de ácido nucléico especifico para ummRNA codificando um polipeptideo celular da glândulaesofágica do cisto nematódeo que diminui formação de umsincicio, a migração do nematódeo através dos tecidos da raizda planta ou formação de um tubo de alimentação que permiteque o nematódeo alimente-se a partir do sincicio formado naplanta.

10. Vetor, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que a proteína celular da glândulado esôfago do nematódeo é codificada por uma ou mais das SEQID NOS:1-63 e 113-116 ou homólogos destas.

11. Método para fornecer resistência ao cisto nematódeoa uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende aexpressão na planta de um inibidor de ácido nucléicoespecífico para um proteína celular da glândula esofágica docisto nematódeo.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que o nematódeo é um membro daHeterodera spp ou Globodera spp.

13. Método para fornecer resistência ao cisto nematódeoa uma planta, caracterizado pelo fato de que compreendecontactar a planta com um ou mais inibidores de ácidosnucléicos específicos para uma ou mais proteínas celulares daglândula esofágica do cisto nematódeo em uma quantidadesuficiente para reduzir a doença de cisto nematódeo.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que uma ou mais proteínascelulares da glândula esofágica do cisto nematódeo modulam:expressão genética das plantas ou células, formação de umsincicio, migração do nematódeo através de tecidos da raiz daplanta, o metabolismo da célula vegetal, transdução de sinalcelular vegetal, ou formação de um tubo de alimentação quepermite que o nematódeo alimente-se a partir do sincicioformado na planta.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o nematódeo é um membro daHeterodera spp ou Globodera spp.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que a planta é resistente à doençapor nematódeo, pelo menos, por duas diferentes espécies decisto nematódeo.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que a planta é resistente à doençacausada por nematódeo Heterodera glycines ou Heteroderaschachtii.

18. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de quecompreende um polipeptídeo codificado pelas SEQ ID NOS: 1-63e 113-116 ou fragmentos destes ou polipeptídeo heterólogo.

19. Método para inibir atividade biológica, de umproduto do gene de parasitismo nematódeo, caracterizado pelofato de que inclui expressão de um peptídeo inibitório,polipeptídeo ou metabólito secundário intracelular em umaplanta, onde o peptídeo inibitório, polipeptídeo ou ometabólito secundário intracelular especificamente inibe aatividade biológica ou a expressão do produto gênico doparasitismo nematódeo.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que o parasita nematódeo é umcisto nematódeo.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que a molécula inibitória é umpeptídeo.

22. Método, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que a molécula inibitória é umpolipeptídeo.

23. Método, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que a molécula inibitória é ummetabólito secundário intracelular.

24. Ácido nucléico isolado,, caracterizado pelo fato deque é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 113,- 114, 115 e 116.

25. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende oácido nucléico, como definido na reivindicação 24.