BRPI0706432A2 - método para triar uma população de plantas pela presença de indivìduos que mostram uma suscetibilidade reduzida a etileno e distúrbios fisiológicos, planta, progênie, parte de uma planta, semente, e, produto de hortaliça - Google Patents

Abstract

METODO PARA TRIAR UMA POPULAçãO DE PLANTAS PELA PRESENçA DE INDIVìDUOS QUE MOSTRAM UMA SUSCETIBILIDADE REDUZIDA A ETILENO E DISTURBIOS FISIOLóGICOS, PLANTA, PROGêNIE, PARTE DE UMA PLANTA, SEMENTE, E, PRODUTO DE HORTALIçA A invenção refere-se a um método para triar uma população de plantas pela presença de indivíduos que apresentam uma susceptibilidade reduzida a etileno e distúrbios fisiológicos, em particular, manchamento e amarelecimento de Russet, em comparação com uma planta de controle, onde uma população de sementes é germinada no escuro e na presença de etileno para se obter sementes que, quando têm um hipocotiledóneo mais longo em comparação com o controle original sensível a etileno, sob etileno, são selecionadas como plantas mostrando uma susceptibilidade reduzida a etileno e distúrbios fisiológicos, em particular, manchamento e amarelecimento de Russet. A invenção também se refere a plantas assim selecionadas.

Description

"MÉTODO PARA TRIAR UMA POPULAÇÃO DE PLANTAS PELAPRESENÇA DE INDIVÍDUOS QUE MOSTRAM UMASUSCETIBILIDADE REDUZIDA A ETILENO E DISTÚRBIOSFISIOLÓGICOS, PLANTA, PROGÊNIE, PARTE DE UMA PLANTA5SEMENTE, E, PRODUTO DE HORTALIÇA"

Campo técnico

A invenção refere-se a um método para separar uma pop pelapresença de indivíduos que estejam alterados em relação a seu modo deresposta a etileno. A invenção refere-se ainda a plantas e partes de plantas, emparticular a hortaliças folhosas, assim identificadas. Mais em particular, estainvenção refere-se a alface (Lactuca sativa L.) que apresenta uma respostaalterada a etileno que leva a uma suscetibilidade reduzida desta espécie deplantação a lesões fisiológicas, como manchamento e amarelecimento deRusset. A invenção refere-se também a sementes e progênie destas plantas epartes de plantas.

Fundamentos da invenção

A geração de hortaliças folhosas, como alface, objetiva aprodução de variedades comerciais otimamente adaptadas a produzir produtoscomercializáveis. Muitas características precisam ser consideradas durante aseleção referentes tanto a feições de entrada como de saída. Uma das maisimportantes feições a este respeito refere-se à qualidade pós-colheita, emparticular à vida útil. A rejeição de lesões fisiológicas e, mais em particular amanchamento e amarelecimento de Russet são elementos importantes quepodem prolongar a vida útil de uma colheita de alface ou de suas partes.

Etileno é um hormônio de plantas geralmente conhecido comoestimulante de processos fisiológicos relacionados à senescência. Em alfaces,este estímulo se torna aparente através da formação de sintomas, comomanchamento e amarelecimento de Russet.

A lesão por manchamento de Russet é caracterizada pelaaparência de pontos marrons ao longo da lateral da nervura central das folhas,enquanto amarelecimento é a descoloração geral de folhas que ocorre durantea senescência, em conseqüência de um colapso de clorofila.

Embora cabeças maduras de alface sejam conhecidas comoprodutoras de apenas diminutas quantidades de etileno, as plantas sãoaltamente sensíveis à este hormônio vegetal. Por conseguinte, lesõesfisiológicas associadas à sensibilidade ao etileno que reduzem a qualidadepós-colheita de alface são principalmente causadas por fontes externas deetileno. Exposição a tais fontes externas pode ocorrer durante a colheita,processamento e armazenamento do produto.

Por exemplo, quando a alface é transportada ou armazenadanas proximidades de frutas produtoras de etileno, como maçãs, pêras oupêssegos, severa deterioração pode ocorrer. Além disso, quando a alface éprocessada e usada em misturas recém-cortadas acondicionadas, pode haverlimitações com respeito aos ingredientes que podem ser usados devido aoetileno liberado por um ou mais dos ingredientes,

O manchamento de Russet é uma lesão fisiológica,manifestada pelo surgimento de numerosos pontos marrons ao longo danervura central da folha. Os sintomas de acastanha mento podem se espalharpor toda a folha durante estágios progressivos da lesão. Manchamento deRusset é sabido ocorrer especialmente quando cabeças de alface maduras sãoarmazenadas a temperaturas mais baixas (5°C) na presença de baixasconcentrações (níveis em PPM) de etileno.

A formação do sintoma pode ser combatida pela aplicação dehormônio vegetal auxina ou cálcio. Além disso, atmosferas modificadascontendo baixos níveis de oxigênio reduzem a velocidade dodesenvolvimento dos sintomas.

Ao nível bioquímico, o manchamento de Russet parece sedesenvolver como uma conseqüência de um estímulo local de biossíntese delignina, que causa lignificação e espessamento de parede celular ao redor daárea da folha onde os sintomas visuais surgirão.

A descoloração marrom é causada pelo estímulo demetabolismo fenólico. A enzima fenilalanina amônia liase (PAL), que temsido observada ser induzida pelo etileno, catalisa a primeira etapacompromissada da série de reações de fenilpropanóide. Compostos fenólicosformados incluem, principalmente, derivados de ácido cafeico, bem como, umnúmero de flavonóides, como catequina(+) e epicatequina(-). A oxidaçãosubseqüente destes compostos pelo polifenol oxidase (PPO) leva àdescoloração marrom tipicamente observada no manchamento de Russet.Finalmente, os sintomas podem se tornar mais severos devido ao colapso detecido e morte celular.

Senescência é um processo de ocorrência natural dedesenvolvimento ao final de um ciclo de vida de uma planta ou organismovegetal durante o qual o metabolismo é reprogramado para remobilizarrecursos para estruturas reprodutoras, como sementes. Embora a senescênciaseja um processo de desenvolvimento causado por fatores endógenos, comoidade fisiológica, há muitos fatores exógenos que podem modular a senescência.

O amarelecimento de folhas ser o sintoma mais visível desenescência é uma conseqüência de colapso de clorofila durante um estágiorelativamente tardio de senescência que pode ser realçado pelo etileno, umavez que a folha seja receptiva. Outros fatores estimulantes bem-conhecidossão ferimentos, escuridão e deficiência de nutriente. Embora etileno seja ohormônio vegetal mais importante conhecido como estimulante desenescência, outros hormônios, como jasminatos, também podem contribuirpara este processo.

A partir do momento da colheita dos pés de alface até omomento do consumo, o produto pode ficar exposto aos diferentes fatoresexógenos que contribuem para a senescência. Estes podem ser danos físicosdurante a colheita e processamento, escuridão e deficiência de nutrientedurante armazenamento e etileno durante o processamento e armazenamento.Estes fatores estimulam fortemente as lesões pós-colheita que podem se tornaraparentes como manchamento e amarelecimento de Russet. Embora estesefeitos sejam grandemente cosméticos, o produto se torna muito menosatrativo e, desse modo, não-comercializável.

De modo a combater os efeitos de deterioração, muitasprovidências pós-colheita podem ser tomadas, as quais reduzem estes efeitos.Por exemplo, podemos armazenar a alface colhida a baixas temperaturas pararetardar a senescência. Embora isto possa reduzir a taxa de amarelecimento, omanchamento de Russet pode ser realçado. Adicionalmente, providênciaslogísticas podem ser implementadas, as quais reduzem o tempo de transportenecessário entre o campo e o consumidor, ou que impeça que a alface sejaarmazenada nas vizinhanças de uma fonte de etileno. Além disso, tratamentosquímicos podem ser aplicados, os quais impedem a deterioração pós-colheita,embora a segurança alimentar e aceitação por consumidor se tornem,obviamente, um problema.

Muitas das providências pós-colheita são bem-sucedidas poralguma extensão, mas, certamente, há espaço para aperfeiçoamento. Alémdisso, custos envolvidos podem ser substanciais, o que é outra razão paraexplorar alternativas que reduzam a necessidade de aplicação de tratamentospós-colheita. De preferência, uma solução genética é encontrada, que reduzaou elimine a necessidade de tomar providências preventivas dispendiosas quesão correntemente usadas para manter a qualidade pós-colheita em um alto nível.

É o objetivo da presente invenção prover um método deseparação que permita identificar plantas insensíveis a etileno. E outroobjetivo da invenção prover plantas que possam ser obtidas pelo método.Este objetivo é atingido de acordo com a invenção por umétodo para separar a população de plantas pela presença de indivíduos queapresentem uma suscetibilidade reduzida a etileno e lesões fisiológicas, emparticular, manchamento e amarelecimento de Russet, em comparação comuma planta de controle, cujo método compreende:

a) prover uma população de sementes;

b) germinar as sementes na escuridão e na presença de etilenopara obter mudas;

c) selecionar mudas que mostrem hipocotiledôneos maiores doque os de um controle sensível a etileno;

d) cruzar mudas selecionadas para produzir sementes;

e) germinar uma parte das sementes produzidas de cada mudaselecionada na escuridão e na presença de etileno e outra parte das sementesde cada muda selecionada na escuridão no ar; e

f) medir o crescimento relativo do hipocotiledôneo das mudasgerminadas sob etileno versus o crescimento do hipocotiledôneo das mudasgerminadas no ar para distinguir plantas que tenham um hipocotiledôneo maislongo em comparação com o controle original sensível a etileno tanto emetileno como no ar de plantas que tenham um maior hipocotiledôneo emcomparação o controle original sensível a etileno apenas sob etileno,

onde plantas que tenham um hipocotiledôneo maior emcomparação com o controle original sensível a etileno apenas sob etilenosejam identificadas como plantas mostrando uma menor susceptibilidade aetileno e lesões fisiológicas, em particular a manchamento ou amarelecimentode Russet.

A invenção é baseada na hipótese de que, plantas insensíveis aetileno, em particular alface, seriam resistentes a lesões fisiológicas pós-colheita, como manchamento e amarelecimento de Russet.

Em um modo de realização preferido, o método da invençãocompreende a etapa adicional de testar plantas que tenham sido identificadasnas etapas precedentes como apresentando uma suscetibilidade reduzida aetileno por sua resistência a manchamento e/ou amarelecimento de Russet, O

A extensão de hipocotiledôneo e de raiz podem ser observadas pelacomparação ao valor 1 padrão e de classificação, o que significa igual àvariedade padrão sensível a etileno sob etileno, a 3, que significa igual àvariedade padrão sensível a etileno sob ar. Caso desejado, medidas emmilímetros podem ser feitas. Usando uma dessas medições, análisesestatísticas simples, como um teste-t, bem conhecido por alguém experientena técnica, podem ser feitas para estabelecer se uma planta ou grupo deplantas é significativamente menos sensível a etileno do que o padrão sensívela etileno, variedade de cultivar "Troubador" (Rijk Zwann, De Lier, NL). Onível de significância aplicado de um teste de um lado é 0,001.

Para as mutantes, a comparação estatística é, de preferência,feita entre as extensões de hipocotiledôneo e, opcionalmente, as extensões deraiz da variedade original usada para o tratamento de mutação genética, que éo melhor padrão disponível, e as extensões de hipocotiledôneo de raiz dasmutantes individuais e/ou de seus brotos.

Para encontrar plantas sensíveis a etileno no material vegetalexistente, uma ou mais amostras representativas de variedades, linhas dereprodução e/ou acessos a banco genético são selecionadas. A comparaçãoestatística é, então, feita adequadamente entre as extensões dehipocotiledôneo e de raiz do acesso individual sob investigação e o resto dapopulação. Ao testar estatisticamente indivíduos quanto a hipocotiledôneose/ou raízes significativamente mais longas, testes comparativos podem sernecessários para manter níveis apropriados de significado global, porexemplo, teste comparativo múltiplo de Dunnett com um padrão (Dunnett,CW5 J. Amer. Statist. Assoc. 50:1096-1121 (1955).

As plantas a serem separadas são, normalmente, plantashortenses folhosas, em particular, plantas pertencentes ao gênero Lactucae,em particular, à espécie Lactuca sativa.

A população de plantas é, de preferência, uma população deplantas mutantes, devido às possibilidades serem maiores para encontrar umaplanta da invenção em tal população variante. Entretanto, qualquer outrapopulação de plantas que diferem em sua constituição genética pode serseparada de acordo com a invenção.

A população de plantas mutantes é, de preferência, obtida porum tratamento de mutação genética usando produtos químicos e/ouirradiação. Tratamentos de mutação genética são bem-conhecidos e serãomelhor descritos adiante.

A concentração de etileno na etapa b) é de pelo menoslC^g/litro, de preferência, e,tubo de rolo de espiga 11 e 25μg/litro. Aconcentração de etileno na etapa d) é de cerca de 4 a 5μg/litro.

A etapa de seleção no método de separação da invenção ébaseada no alongamento do hipocotiledôneo. Exposição de mudas germinadascom crescimento no escuro a etileno causa inchação radial do hipocotiledôneoe inibição de crescimento de raiz e hipocotiledôneo. Este fenômeno égeralmente referido como uma resposta tripla (ver, por exemplo, Guzman, P& Ecker, J. Plant Cell 2: 513-523 (1990). A reprodutibilidade desta respostapermite separar mutantes que apresentam uma resposta tripla alterada napresença ou ausência de etileno. Alternativa ou adicionalmente a medir oalongamento do hipocotiledôneo, a seleção de acordo com a invenção podeser baseada em um ou mais dos outros elementos do teste de resposta tripla.

De acordo com outro aspecto, a invenção provê plantasapresentando uma suscetibilidade reduzida a etileno e lesões fisiológicas, emparticular a manchamento e amarelecimento de Russet, em comparação comuma planta de controle, cujas plantas podem ser obtidas pela sujeição de umapopulação de sementes de plantas a um método de separação da invenção eselecionar plantas da população que apresentem maior hipocotiledôneo emcomparação com um controle sensível a etileno como plantas apresentandouma suscetibilidade reduzida a etileno e lesões fisiológicas , em particular amanchamento e amarelecimento de Russet.

A planta da invenção é, de preferência, uma planta hortensefolhosa, em particular, uma planta que pertence ao gênero Lactuca e,particularmente, à espécie Lactuca sativa.

Com o método de separação da invenção, mutantes insensíveisa etileno são identificadas e selecionadas. Sementes dessas mutantes foramdepositadas com NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate,Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA UK, em 3 de janeiro de 2007, tendorecebido os números de acessão como listado na Tabela 1. Detalhes sobredescendência de sementes dos depósitos são fornecidos no Exemplo 3 e noExemplo 4. Estes depósitos são feitos devido a elas terem a característicaúnica específica de significativamente reduzida susceptibilidade a etileno.Elas não foram testadas por critérios-DUS para registro de variedade, ou seja,distinguibilidade, uniformidade, estabilidade sobre todas as características deregistro, e não são esperadas satisfazer estes critérios de modo algum.

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A invenção refere-se adicionalmente a plantas que apresentamuma susceptibilidade reduzida a etileno e lesões fisiológicas, em particular, amanchamento ou amarelecimento de Russet, e que são obtidas cruzando-seuma planta da invenção com outra planta da mesma espécie. A característica"susceptibilidade reduzida a etileno e lesões fisiológicas, em particular, amanchamento ou amarelecimento de Russet" pode, assim, ser levada paraoutras plantas que originalmente não têm esta característica. O saber se asplantas resultantes deste cruzamento são realmente plantas da invenção podeser testado submetendo-se estas plantas ao método de separação da invenção.

A invenção refere-se adicionalmente à progênie de umaplanta-pai da invenção que apresenta susceptibilidade reduzida a etileno elesões fisiológicas, em particular, a manchamento e amarelecimento deRusset. Esta progênie pode ter muitas gerações retiradas do pai. Desde que acaracterística "susceptibilidade reduzida a etileno e lesões fisiológicas, emparticular, a manchamento ou amarelecimento de Russet" esteja presente, aplanta da progênie é uma planta da invenção.

A invenção refere-se adicionalmente a partes de plantas dainvenção. As partes de planta são, por exemplo, cabeças ou folhas da alface,tais como folhas novas, cabeças processadas ou folhas cortadas.

Partes de planta da invenção podem ser usadas na cultura detecido para regenerar as plantas que têm a susceptibilidade reduzida a etilenoe lesões fisiológicas, em particular, a manchamento ou amarelecimento deRusset, como encontradas na planta da qual o tecido para a cultura de tecido éderivado. Estas plantas regeneradas são igualmente parte desta invenção.

A invenção refere-se adicionalmente à semente de uma plantada invenção. Das sementes, podem ser cultivadas plantas que têm igualmentea característica "susceptibilidade reduzida a etileno e lesões fisiológicas, emparticular, a manchamento ou amarelecimento de Russet". Se, ou não, assementes e, por conseguinte, as plantas delas cultivadas retiveram acaracterística pode ser testado no método de separação da invenção. Ainvenção refere-se igualmente a sementes de geração posterior que retenham asusceptibilidade reduzida a etileno e lesões fisiológicas, em particular, amanchamento ou amarelecimento de Russet como encontradas nas sementesoriginais.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção refere-se aum produto hortense, compreendendo uma planta da invenção, ou uma partedela. Preferivelmente, o vegetal é uma hortaliça folhosa, mais em particular, ahortaliça é alface.

Quando selecionado pelo método da invenção, o produtohortense apresenta susceptibilidade reduzida a etileno e lesões fisiológicas,em particular, a pontillhamento e amarelecimento de Russet

Deve-se notar que o método de separação da invenção é ummétodo relativamente simples. Plantas da invenção que têm umasusceptibilidade reduzida a etileno e lesões fisiológicas, em particular, amanchamento e amarelecimento de Russet podem ser identificadas emqualquer população variante que seja suficientemente grande. Isto não exigeexperimentação exagerada para reproduzir a invenção e as plantas dainvenção não devem, conseqüentemente, ser interpretadas como limitadasàquelas que foram depositadas.

Como resultado de sua insensibilidade ao etileno, o material daplanta da alface e da semente dela derivada, da invenção, apresentam umaumento forte em relação a sua qualidade pós-colheita especialmenterelacionada aos fenômenos associados à senescência tais como manchamentoe amarelecimento de Russet.

Descrição detalhada da invenção

Uma vez que etileno é o hormônio mais importante da plantana estimulação da senescência e como o manchamento e amarelecimento deRusset estão associados à senescência, foi realizada uma abordagem genéticana qual as variações genéticas foram produzidas e selecionadas parainsensibilidade ao etileno. Descobriu-se que isto leva, indiretamente, àidentificação de mutantes que são afetados em sua resposta à senescência pós-colheita.

Estudos detalhados usando-se espécies de modelos de plantastais como a Arabidopsis thaliana, bem como, espécies de colheita proveraminformação sobre a série de reações bioquímicas envolvidas na biosíntese e napercepção do etileno. Muitas formas alélicas de genes foram caracterizadaspor seu papel em relação a isto provendo um retrato intricado da função doetileno nas plantas. O etileno, como outros hormônios de planta, desempenhaum papel importante em muitos processos fisiológicos incorporado em redesreguladoras interativas complicadas.

A atividade espacial e temporal do hormônio é, inter alia,determinada a nível da expressão de gene subjacente à biosíntese do etileno,da percepção do hormônio, da transdução e ativação do sinal de proteínasefetoras a jusante.

Variantes alélicas dos genes envolvidos em diferentes níveispodem determinar a força da resposta, bem como, o nível de interferência aoutros caminhos de sinalização. Como a biosíntese e a percepção do etilenosão mal caracterizadas na alface e a fim de permitir a identificação dediferentes forças da resposta e de suas variantes alélicas, subjacentesraciocinou-se que uma abordagem imparcial poderia ser mais bem sucedida aeste respeito em comparação a uma abordagem alvejada da modificação dogene.

Esta abordagem imparcial abrange preferivelmente umprocedimento mutação genética aleatória, química ou física, combinada comuma separação fenotípica eficiente e procedimento de seleção baseado emuma resposta de mudas estioladas pelo etileno. Este sistema de seleçãobaseado em mudas é, de longe, muito mais eficiente em termos de números deplantas que podem ser avaliadas por homem-hora em comparação ao uso decabeças de alface maduras. Além disso, o tempo para produzir material deplanta para separação é, obviamente, muito mais reduzido no caso de mudasem comparação às cabeças maduras.

Uma vantagem adicional desta abordagem é o uso decondições de seleção no estágio de muda como marcador fenotípico comcaráter de previsão para a feição pós-colheita em gerações consecutivas umavez que um evento bem sucedido foi identificado. Existe um risco claro nofato de que esta seleção no estágio de muda poder não levar às variaçõesgenéticas que expressem a feição selecionada a nível maduro, pós-colheita.Além disso, reconhece-se que hormônios de planta como o etileno estãoenvolvidos em muitos processos fisiológicos que podem levar a efeitospleitotrópicos. Estes podem ser positivos ou negativos, dependendo dacolheita e de suas condições de cultivo. A abordagem escolhida compreende,conseqüentemente, de preferência, as seguintes etapas:

1. Geração de uma população mutante pelo tratamento desementes ou tecidos de planta com agentes mutagênicos, como metilsulfonato(ems) ou irradiação gama (ems).

2. Estabelecimento de uma separação fenotípica eficiente naqual a seleção está baseada em uma resposta de mudas estioladas de plantas,em particular alface, ao etileno que, é caracterizada por uma redução forte doalongamento do hipocotiledôneo, uma raiz encurtada, espessada e umacurvatura exagerada do gancho apical. Esta resposta é chamada de respostatripla que é típica de mudas estioladas e ocorrendo em graus variados emmuitas espécies de planta quando expostas a atmosferas contendo etileno(ver, por exemplo, Ecker J, Science 268 (5211): 667-675 (1995)).

3. Caracterização de mutantes modificados pelo menos em umteste de sua resposta tripla em relação à deterioração pós-colheita quecompreende manchamento e amarelecimento de Russet. Opcionalmente, adeterminação de efeitos pleiotrópicos da modificação: para excluir os efeitospleiotrópicos negativos que afetariam o valor das plantas.

No método de separação da invenção> a população de sementesde planta a ser testada é, assim, preferivelmente uma população de sementesde mutantes que podem ser obtidas por um método compreendendo:

a) tratar sementes MO de uma espécie da planta a sermodificada com um agente mutagênico para obter sementes Ml;

b) cultivar plantas das sementes Ml assim obtidas para obterplantas Ml;

c) produzir sementes M2 por autofertilização de planta Ml; e

d) opcionalmente repetir as etapas b) e c) η vezes para obterMl+n sementes.

As sementes Ml+n, assim obtidas, são, então, germinados noescuro e na presença de concentração elevada de etileno para obter mudas.Subseqüentemente, as mudas que não apresentam uma resposta ao etileno sãoselecionadas. A resposta a ser mensurada é o desenvolvimento doshipocotiledôneos que são alongados em comparação aos hipocotiledôneos deum muda sensível ao etileno.

A seguir, a progênie de cada planta selecionada é dividida ecultivada no escuro: metade da progênie sob etileno, metade da progênie sobar. O crescimento relativo do hipocotiledôneo sob o etileno versus ar émedido para cada progênie sob ambas as circunstâncias. Estas observaçõessão usadas para distinguir progênies que têm um hipocotiledôneo mais longodo que o do controle original sensível ao etileno, sob o etileno, e também sobar e que, por isto, pode ser concluído serem sensíveis ao etileno e nãodesejados, das progênies que verdadeiramente têm uma susceptibilidadereduzida ao etileno.

Um exemplo de mutagene conhecido é o ems. Alquilatos deems primariamente resíduos G de uma trança de ADN, que durante aduplicação do ADN provocam o casamento com T em vez de C.Conseqüentemente, os pares-base GC mudam para pares-base AT a umafreqüência que é determinada pela dose efetiva de ems e pela atividade dosistema de reparação de má-combinação da planta. A dose efetiva de emsdepende da concentração usada, do tamanho da semente e de outraspropriedades físicas e do momento da incubação das sementes na solução deems. Sementes, que foram tratadas com ems são chamadas tipicamente desementes Ml. Como uma conseqüência do tratamento, os tecidos dassementes Ml contêm mutações de pontos aleatórios nos genomas de suascélulas e aqueles presentes na subpopulação das células, que formam o tecidoda linha germinativa (células germinais) serão transferidas para a geraçãoseguinte, que é chamada M2. Mutações ou combinações destas que são haplo-insuficientes, deste modo, provocando esterilidade ou que induzam àmortalidade do embrião não serão transferidas para a geração M2.

Um procedimento similar ao descrito acima para o uso de emsaplica-se, também, para outros agentes mutagênicos. A população de M2pode ser usada nos procedimentos de separação que visam uma resposta triplareduzida de mudas estioladas.

Outros agentes mutagênicos, em particular agentesmutagênicos alquilantes, são o sulfato dietil (DES), etileneimina (ei), propanosultona, N-metil-N-nitrosouretano (mnu), N-nitroso-metilureia (NMU), N-etil-N-nitrosoureia (enu), azida de sódio.

Alternativamente, as mutações são induzidas por meio deirradiação, que, por exemplo, é selecionada de raios X, nêutrons rápidos,irradiação UV.

Em outro modo de realização da invenção, as mutações sãoinduzidas por meio da engenharia genética, como por meio do uso deoligonucleotídeos quiméricos, recombinação homóloga introdução de genes-alvo modificados que competem com o produto endógeno, regulaçãodecrescente através de interferência de RNA, etc.

A tecnologia que permite modificar genes-alvo residentes nogenoma de uma planta de uma maneira específica é conhecida de alguémexperiente na técnica. Por exemplo, oligonucleotídeos quiméricosdemonstraram ser mutágenos efetivos com um modo específico de ação.

Outra abordagem é modificar genes-alvo via recombinação homóloga oualvejamento de gene. Usando-se esta abordagem, um fragmento de um gene étrocado por um fragmento introduzido do ADN contendo uma modificaçãodesejada. Abordagens transgênicas são igualmente praticáveis pelas quais osgenes modificados do alvo são introduzidos para competir com o produtoendógeno. Isto pode levar a efeitos negativos dominantes. Além disso, aregulação decrescente específica da expressão dos genes é praticável com ainterferência do RNA.

No caso dos oligonucleotídeos mutagênicos, o alvejamento dogene ou abordagens transgênicas são usados para modificar um fator genéticoenvolvido na função do etileno, obviamente, a estrutura primária dos genesrelevantes deveria ser conhecida. No entanto, atualmente, o conhecimentodestes genes para a alface, é limitado.

De preferência a invenção compreende, adicionalmente, alelospiramidais de susceptibilidade reduzida ao etileno.

A produção de sementes Ml e Ml+n é efetuada,apropriadamente, por meio de autopolinização.

A invenção, além disto, refere-se a plantas ou partes de planta,que têm em seu genoma informação genética que é responsável pelasusceptibilidade reduzida a lesões fisiológicas tais como manchamento eamarelecimento de Russet e é encontrada no genoma de uma planta da alfacecomo listado na Tabela 1.

As progênies das plantas como reivindicado são igualmenteparte desta invenção. "Progênie", como usado aqui, pretende abranger todasas plantas tendo a mesma, ou uma similar, susceptibilidade reduzida a etilenoe lesões fisiológicas, em particular, a manchamento e amarelecimento deRusset, que as plantas originais aqui descritas e delas derivadas por qualquermaneira, como por reprodução sexual, autofertilização ou fertilização cruzadacom outra planta do mesmo gênero, ou reprodução vegetativa como corte,cultura do tecido, cultura haplóide, cultura de protoplasto, fusão deprotoplasto ou outras técnicas. Esta progênie é, assim, a primeira geração deplantas identificada de acordo com a invenção, bem como, a primeira geraçãode plantas derivada por uma ou mais destas técnicas, e, também, toda equalquer geração posterior de plantas derivada de uma ou mais destastécnicas, desde que as plantas derivadas tenham susceptibilidade reduzida.

A fim determinar a resposta de mudas estioladas da alface aoetileno foram usados recipientes plásticos especialmente projetados nos quaisas mudas da alface foram cultivadas sobre papéis de filtro sob uma atmosferaem que os níveis de etileno podiam ser variados. Na verdade, descobriu-seque as mudas da alface responderam à presença de etileno por umalongamento reduzido do hipocotiledôneo o que, a princípio, permitiriaselecionar mutantes insensíveis ao etileno, residentes na população disponívele que, no caso, a insensibilidade foi expressa fenotipicamente a nível da mudasob as circunstâncias experimentais que foram aplicadas.

Cultivando-se um grande número de mudas de alfaceestioladas de uma população contendo mutações induzidas aleatoriamente sobuma atmosfera contendo etileno, descobriu-se que mudas apresentandosensibilidade reduzida a etileno em comparação à sensibilidade a etileno dapopulação inicial podiam ser obtidas e selecionadas. Foram selecionadasmudas que apresentaram alongamento do hipocotiledôneo comparável a umaextensão em uma situação em que, a atmosfera era composta de ar semetileno. As mudas identificadas desta maneira foram qualificadas como sendoinsensíveis a etileno.

De modo a confirmar que os mutantes insensíveis a etileno sãoresistentes ao manchamento e amarelecimento de Russet os mutantesidentificados na separação são testados para sua resistência ao manchamentoe/ou amarelecimento de Russet.

Um teste de manchamento de Russet compreendeapropriadamente a armazenagem de cabeças maduras colhidas em umrecipiente fechado em uma temperatura de 8°C no escuro, e a exposição delasao gás de etileno em uma concentração entre 6 e 7 vpm (parte por milhão emvolume) e a avaliando a presença de sintomas do manchamento de Russetapós 7 dias, preferivelmente após 9 dias. Uma cabeça de controle sensível aoetileno é incubada adequadamente junto com as plantas a ser testadas e omanchamento de Russet das plantas a ser testadas é comparada com a mesma.

Um teste do amarelecimento compreende a armazenagem decabeças maduras das plantas da alface a ser testadas em uma câmara dearmazenamento sem etileno a 8°C e avaliando o amarelecimento das folhas dabase após 10 dias, preferivelmente após 14 dias. Plantas resistentes aoamarelecimento são as plantas que não apresentam amarelecimento das folhasda base após 14 dias. Apropriadamente uma cabeça de controle sensível aoetileno é incubada junto com as plantas a ser testadas e a resposta aoamarelecimento das plantas a ser testadas é comparada com a mesma.

Como ilustrado nos Exemplos, foi demonstrado pela primeiravez que a insensibilidade a etileno leva à resistência ao manchamento deRusset e à resistência ao amarelecimento que não é induzido pelo etileno.

Surpreendentemente, mudas que apresentaram uma resposta dealongamento reduzido em comparação às condições de controle, mas queeram mais longas em comparação com controles sensíveis também foiverificado as quais foram consideradas como insensíveis, bem como,parcialmente sensíveis a etileno que foram igualmente consideradas comoinsensíveis ao etileno embora parcial.

Os níveis variáveis de insensibilidade a etileno que foramobservados podem refletir ou a presença de lócus diferentes do mutante, oudiferentes formas alélicas de lócus idênticos que afetam esta feição napopulação original.

No caso das mutações recessivas estas duas possibilidadespodem ser facilmente distinguidas pela execução de testes de alelismo, quecompreendem o cruzamento de dois eventos mutantes e a determinação dofenótipo do híbrido. No caso de alelismo das mutações, a insensibilidade aetileno será aparente em Fl enquanto que, caso do fenótipo nos mutantes édeterminada por lócus recessivo diferente o que não seria o caso.

Uma vez que mutagênese aleatória foi aplicada como um meiopreferido para gerar a população inicial, mutações no fundo genético podemigualmente contribuir para a variação do fenótipo de muda sob as condiçõesexperimentais. A fim de discriminar entre mutações exclusivas de resistênciasdiferentes e um efeito combinado de mutações no fundo genético,retrocruzamentos deveriam ser executados para criar fundos genéticosuniformes para eventos insensíveis a etileno diferentes. Este procedimento éainda mais relevante para determinar se mutações em lócus específicosenvolvidos na insensibilidade a etileno apresentam efeitos pleiotrópicos.

As plantas M2 assim selecionadas com base em uma respostareduzida ao etileno foram usadas para cultivar sementes M3. Em algunscasos, plantas M3 cultivadas de sementes M3 foram selecionadas pelasensibilidade reduzida a etileno em um teste da resposta tripla eautopolinizadas para produzir sementes M4. Isto foi igualmente repetido, em alguns casos, até M5.

Em um caso uma planta M3 cultivada de semente M3 foiselecionada pela sensibilidade reduzida a etileno em um teste da respostatripla, e cruzada com um pai sensível a etileno e sensível ao manchamento deRusset para obter semente Fl. Uma planta Fl cultivada de semente Fl foiautopolinizada para produzir sementes F2. Uma planta F2 cultivada destassementes F2 foi selecionada pela sensibilidade reduzida a etileno em um testeda resposta tripla, e autopolinizada para produzir sementes F3. Esta linha F3foi adicionada ao conjunto de linhas endogâmicas M3 e M4.Subseqüentemente, as linhas endogâmicas descendentes de eventosinsensíveis a etileno foram reavaliadas para suas respostas ao etileno. O nívelde insensibilidade de cada linha endogâmica foi classificado com base nocultivo relativo da muda sob uma atmosfera contendo etileno versus ar.Baseado neste critério 12/54 linhas que foram inicialmente classificadas comoinsensíveis a etileno foram classificadas, agora, como sendo sensíveis. Estesfalso-positivos, durante a separação inicial no nível M2, podem prontamenteser eliminados durante a reavaliação dos eventos na geração seguinte.

As linhas endogâmicas que apresentaram uma insensibilidadea etileno confirmada e significativa no teste do etileno eram semeadasnovamente e cultivadas em uma estufa sob condições regulares de produçãoda alface para produzir cabeças maduras que foram avaliadas paramanchamento e amarelecimento de Russet (ver igualmente os Exemplos).

Plantas sensíveis a etileno de controle negativo, foramcultivadas, originárias da população, as quais foram usadas para selecionar oseventos insensíveis a etileno. Surpreendentemente, as sementes de todos osmutantes insensíveis a etileno germinaram normalmente, isto é, comparáveisàs sementes de uma planta de controle sensível a etileno quase isogênicaquando plantada em solo de vaso.

Isto contrasta fortemente com a situação em outras espécies deplanta como a Arabidopsis thaliana que apresenta forte redução nacapacidade de germinação quando plantada em solo de vaso (Harpham,N.J.V. e outros (1991) Annals of Botany 68, 55-61). Aparentemente para aalface é possível cultivar mutantes insensíveis a etileno de acordo com umaprática de cultivo normal que inclui em muitos casos semeadura em blocos desolo de vaso ou em plugues de solo de vaso.

Após cultivo, cabeças maduras foram colhidas e expostas aoetileno. Uma semana de incubação pós-colheita das cabeças em 8°C sob umaatmosfera contendo etileno resultou em uma indução forte de manchamentode Russet das cabeças das plantas de controle sensível a etileno. Entretanto,29 de 37 eventos insensíveis a etileno que foram avaliados não mostraram, denenhum modo, qualquer sinal de manchamento de Russet o que demonstrasurpreendentemente que a resistência a etileno que foi selecionada a nível demuda pode reduzir lesões fisiológicas a nível da planta madura, mesmo noestágio pós-colheita.

A resistência a amarelecimento pôde ser demonstrada paranumerosos eventos insensíveis a etileno sob condições de armazenamentosem etileno em temperatura sub-ótima. Isto é surpreendente, porque, atéagora, a resistência a amarelecimento foi apenas registrada na presença deetileno (Saltveit e outros, Postharvest Biology and Thecnology 27: 277-283(2003)).

A presente invenção será ilustrada nos Exemplos a seguir eque se pretende que não a limitem de qualquer maneira. Mais em particular,as experiências dos exemplos são executadas com a alface, mas a invenção émais amplamente aplicável a outras espécies de plantas que encontramdificuldades pós-colheita similares quando contatadas com etileno.

Nos exemplos é feito referência à seguinte figura.

Figura: Fenótipo de cabeças de alfaces maduras apósexposição a etileno a 8°C no escuro durante 9 dias. O painel esquerdo mostrauma amostra representativa de cabeças resistentes a etileno (Etileno: R) esensíveis a etileno (- controle) da variedade Troubadour. O painel direitomostra uma foto similar dos mutantes derivados da variedade Apache.EXEMPLOS

EXEMPLO 1.

Modificação genética da alface pelo metano etil sulfonato (ems)

Sementes de variedades da alface Troubadour, Apache eYorvik (todos a três de Rijk Zwaan, De Lier5 os Países Baixos) foram tratadascom ems pela imersão de aproximadamente 2000 sementes por variedade emuma solução ventilada de 0,05% (w/v) ou 0,07% (w/v) de ems durante 24horas na temperatura ambiente.Aproximadamente 1500 sementes tratadas por variedade pordose de ems foram germinadas e as plantas resultantes foram cultivadas emuma estufa nos Países Baixos de maio a setembro para produzir sementes deproduto.

Após a maturação, sementes M2 foram colhidas e inchadas emuma associação por variedade por tratamento. As 6 associações resultantes desementes M2 foram usadas como material inicial para identificar as plantasM2 individuais contendo alelos de susceptibilidade reduzida.

A eficácia do procedimento de modificação genética foiavaliada determinando-se a ocorrência de plantas descoradas, que é indicativade perda de clorofila devido às modificações nos genes envolvidos direta ouindiretamente na formação ou acumulação de clorofila. Em todas as 6associações de sementes M2 foram observadas plantas individuais que estãodescoradas, o que demonstra que os tratamentos aplicados resultaram emmodificações genéticas.

EXEMPLO 2

Identificação de plantas da alface que obtiveram alelos de susceptibilidadereduzida para etileno

Sementes M2 da alface foram germinadas sobre papel em umpequeno recipiente plástico com uma concentração de etileno de 10, 20 vpm(parte por milhão em volume) a 16°C no escuro. 1 vpm contém0,4 Ιμιηοΐ/litro ou 1,14 μg/litro. Mutantes insensíveis a etileno foramcomparados com controles sensíveis a etileno, e selecionados na base dehipocotiledôneo alongado e/ou raiz (isto é teste de resposta tripla). Estesmutantes insensíveis a etileno foram cultivados para produzir linhas M3 porautofertilização. Estas linhas M3 foram testadas novamente com o teste daresposta tripla para confirmar a insensibilidade a etileno.

Quando uma linha estava segregando para insensibilidade aetileno, plantas foram selecionadas seguido por um ou dois ciclos adicionaisde consangüinidade, e um teste de resposta tripla final para selecionar linhasde homozigotos insensíveis a etileno, se possível.

Em um caso, uma planta M3 cultivada de semente M3 foiselecionada pela sensibilidade reduzida a etileno em um teste de respostatripla, e cruzada com um pai Troubadour sensível a etileno e sensível amanchamento de Russet para obter semente Fl. Uma planta Fl cultivada dasemente Fl foi autopolinizada para produzir sementes F2. Uma planta F2cultivadas destas sementes F2 foi selecionada pela sensibilidade reduzida aetileno em um teste de resposta tripla e autopolinizada para produzir sementesF3. A linha F3 resultante foi adicionada ao conjunto de 53 linhasendogâmicas M3, M4, e M5. Neste caso, a linha F3 foi o único representanteda planta mutante M2 original, porque não havia sobrado nenhuma sementeautopolinizada desta planta

Este conjunto de 54 linhas M3 e M4 do Exemplo 1 foigerminado em blocos de turfa em um recipiente fechado sob concentração deetileno entre 4 e 4,5 vpm no escuro. Mutantes insensíveis a etileno foramidentificados pelos seus hipocotiledôneos mais longos em comparação comvariedades de controle sensíveis (Troubadour, Apache, Yorvik, Sensal). Osresultados estão apresentados na Tabela 1. 42 de 54 linhas que foramidentificadas pelo teste de resposta tripla pareceram ser pelo menosparcialmente insensíveis a etileno parcial no teste do etileno. Estas linhasrepresentam 40 plantas M2, porque 2 plantas M2 foram representadas duasvezes.

A tabela 2 mostra os resultados.Tablea 2

Resposta a etileno de linhas de mutantes em um teste de recipiente fechado e um teste de reposta tripla (trt).Observacoes em hipocotiledoneo e raiz estao indicadas separadamente quando nenhuma resposta consistentee apresentada. Resposta intermediaria e indicada como parcial. R= insensivel a etileno; S= etileno sensivel; R/S=segregacao; T= Troubadour; A= Apache; Y= Yorvik; hipo= hipocotiledoneo.

<table>table see original document page 24</column></row><table><table>table see original document page 25</column></row><table>EXEMPLO 3

Identificação das plantas da alface que obtiveram alelos de suscetibilidadereduzida a manchamento de Russet

Trinta e sete linhas insensíveis a etileno de quarenta e duaslinhas encontradas no exemplo 2 foram semeadas em uma estufa paraproduzir as cabeças maduras sob condições de produção de a alface regulares(localização: Maasdijk, os Países Baixos; semeadura: 10 de janeiro;transplante: 17 de fevereiro; colheita: 18 de abril). As cabeças madurascolhidas foram armazenadas em um recipiente fechado em a temperatura de8°C no escuro. Foram expostas ao gás etileno em uma concentração entre 6 e7 vpm (parte por milhão em volume). 1 vpm contém 0,41 μηιοΐ/litro ou 1,14μ g/litro. Após 9 dias, as plantas que apresentaram manchamento de Russetforam identificadas. Todas as plantas de controle, a exceção da Yorvikapresentavam manchamento de Russet. 29 de 37 linhas testadas apresentaramausência de manchamento de Russet ou manchamento de Russet menor emcomparação à variedade original (Tabela 3).

Seis linhas foram escolhidas para multiplicação e depósito emNCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, AberdeenAB21 9YA, Reino Unido. A primeira linha é numerada 02D.91445. É umalinha M4 descendente da planta Troubadour-M2 insensível a etileno,00D.7856. Uma planta M4 insensível a etileno foi selecionada de 02D.91445no teste do recipiente fechado no exemplo 2 e autopolinizada para produzirsementes M5. Dezesseis plantas M5 foram cultivadas destas sementes paraproduzir um lote de sementes M6 por autopolinização. Este lote de sementesfoi numerado 07D.826509 e foi depositado como NCIMB número 41449(primeira linha).

A segunda linha foi numerada 02D.90047. E, uma linha M4descendente da planta Troubadour-M2 insensível a etileno 00D.6876. UmaM4 insensível a etileno foi selecionada de 020.90047 no teste do recipientefechado no exemplo 2 e autopolinizada para produzir semente M5. Dezesseisplantas M5 foram cultivadas destas sementes para produzir um lote desementes M6 por autopolinização. Este lote de sementes foi numerado07D.826514 e depositado como NCIMB número 41450 (segunda linha). Aausência de manchamento de Russet para esta origem foi determinadatestando-se a linha M5 03D.90323, descendente de uma planta M4 de02D.90047.

A terceira linha foi numerada 00D.88578. É uma linha M3descendente da planta Troubadour-M2 insensível a etileno 00D.7871.Dezesseis plantas M3 foram cultivadas de 00D.88578 para produzir um lotede sementes M4 por autopolinização. Este lote de sementes foi numerado07D.826502 e depositado como NCIMB número 41448 (terceira linha).

A quarta linha foi numerada 03D.90452. E um linha M5descendente da planta Apache-M2 00D.6883 insensível a etileno. Uma plantaM5 insensível a etileno foi selecionada de 03D.90542 no teste do recipientefechado no exemplo 2 e autopolinizada para produzir sementes M6. Dezesseisplantas M6 foram cultivadas destas sementes para produzir um lote desementes M7 por autopolinização. Este lote da semente foi numerado07D.826522 e depositado como NCIMB número 41451 (quarta linha).

A quinta linha foi numerada 01D.85780. E uma linha M3descendente da planta Apache-M2 insensível a etileno 00D.6896. Uma plantaM3 insensível a etileno foi selecionada de 01D.85780 no teste do recipientefechado no exemplo 2 e autopolinizada para produzir sementes M4. 16plantas M4 foram cultivadas destas sementes para produzir um lote desementes M5 por autopolinização. Este lote de sementes foi numerado07D.826540 e depositado como NCIMB número 41452 (quinta linha).

A sexta linha foi numerada 04D.801660. E uma linha F3descendente de um cruzamento entre a planta Yorvik-M3 insensível a etileno02D.8484 e uma planta da variedade Troubadour sensível a etileno. A plantaΜ3 02D.8484 descendente da planta Yorvik-M2 insensível a etileno00D.7845. Uma planta F3 insensível a etileno foi selecionada de 04D.801660no teste do recipiente fechado no exemplo 2 e autopolinizada para produzirsementes F4. 16 plantas F4 foram cultivadas destas sementes para produzirum lote de sementes F5 por autopolinização. Este lote de sementes foinumerado 07D.826542 e depositado como NCIMB número 41453 (sextalinha).

Fig. 1 mostra plantas resistentes e de controle.

EXEMPLO 4

Identificação das plantas de alface que apresentam amarelecimento pós-colheita menor

Linhas insensíveis a etileno cultivadas sob condições de estufacomo descrito no Exemplo 3 foram colhidas e cabeças maduras aparadasforam armazenadas em uma câmara de armazenamento sem etileno a 8°C.

Após duas semanas folhas da base das variedades do controle verde Yorvik eTroubadour começaram a amarelar. Neste momento e, mesmo 1 semana maistarde três linhas pareceram ter menos folhas de base amarelas do que suasvariedades originais, que eram controles usados nesta tentativa. Estas linhasforam numeradas 04d.800900, 03D.90323, 04D.801660.

Embora um relacionamento seja relatado entre oamarelecimento da folha e a presença de etileno (Saltveit e outros (2003)Postharvest Biology and Technology 27:277-283), é surpreendente quemesmo em condições sem etileno, algumas das linhas insensíveis a etilenoestejam expressando um fenótipo menos amarelecido.Tabela 3

<table>table see original document page 29</column></row><table>

Claims (23)

1. Método para triar uma população de plantas pela presençade indivíduos que mostram uma suscetibilidade reduzida a etileno e distúrbiosfisiológicos, em particular, manchamento e amarelecimento de Russet, emcomparação com uma planta de controle, caracterizado pelo fato decompreender:a) prover uma população de sementes;b) germinar as sementes na escuridão e na presença de etilenopara obter mudas;c) selecionar mudas que mostrem hipocotiledôneos maiores doque os hipocotiledôneos de um controle sensível a etileno;d) cruzar mudas selecionadas para produzir sementes;e) germinar uma parte das sementes produzidas de cada mudaselecionada na escuridão e na presença de etileno e outra parte das sementesde cada muda selecionada na escuridão no ar; ef) medir o crescimento relativo do hipocotiledôneo das mudasgerminadas sob etileno versus o crescimento do hipocotiledôneo das mudasgerminadas no ar para distinguir plantas que tenham um hipocotiledôneo maislongo em comparação com o controle original sensível a etileno tanto emetileno como no ar de plantas que tenham um maior hipocotiledôneo emcomparação o controle original sensível a etileno apenas sob etileno,onde plantas que tenham um hipocotiledôneo maior emcomparação com o controle original sensível a etileno apenas sob etilenosejam identificadas como plantas mostrando uma menor susceptibilidade aetileno e distúrbios fisiológicos, em particular a manchamento ouamarelecimento de Russet.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de adicionalmente compreender a etapa de:g) testar as plantas identificadas como mostrando uma menorsusceptibilidade ao etileno por sua resistência a manchamento e/ouamarelecimento de Russet.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato das plantas serem plantas de hortaliças folhosas.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato das plantas pertencerem ao gênero Lactuca e, em particular, à espécieLactuca sativa.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--4, caracterizado pelo fato da população de plantas ser uma população deplantas mutantes, uma coleção de germoplasma ou uma população de plantastransgênicas.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato da população de plantas mutantes ser obtida por tratamento demutagênese usando produtos químicos e /ou irradiação.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-6, caracterizado pelo fato da concentração de etileno na etapa b) ser de pelomenos 1 (^g/litro, de preferência, entre lie 25μg/litro.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-6, caracterizado pelo fato da concentração de etileno na etapa d) ser de cercade 4 a 5μg/litro.

9. Planta, caracterizada pelo fato de mostrar umasuscetibilidade reduzida a etileno e distúrbios fisiológicos, em particular amanchamento e amarelecimento de Russet, em comparação a uma planta decontrole, cuja planta é obtida pela sujeição de uma população de sementes deplantas a um método de triagem como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 8 e selecionar plantas da população que mostremhipocotiledôneo maior em comparação com um controle sensível a etileno,como plantas mostrando uma reduzida susceptibilidade a etileno e distúrbiosfisiológicos, em particular, manchamento e amarelecimento de Russet.

10. Planta de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelofato da planta ser uma planta de hortaliça folhosa.

11. Planta de acordo com a reivindicação 10, caracterizadapelo fato de pertencer ao gênero Lactuca e, em particular, à espécie Lactucasativa.

12. Planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a-10, caracterizada pelo fato de semente desta planta ser depositada comNCIMB em 3 de janeiro de 2007 e recebido o número de acesso conformelistado na Tabela 1.

13. Planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a-11, caracterizada pelo fato da planta poder ser obtida pelo cruzamento de umaplanta como definido na reivindicação 12 com outra planta da mesma espécie.

14. Progênie de uma planta originária como definida emqualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizada pelo fato de ter asusceptibilidade reduzida a etileno e distúrbios fisiológicos, em particular amanchamento e amarelecimento de Russet.

15. Parte de uma planta, caracterizada pelo fato de ser daplanta como definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 14.

16. Parte de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelofato de ser selecionada de folhas, cabeças, folhas cortadas, cabeçasprocessadas, folhas novas.

17. Planta regenerada de uma parte de planta como definida nareivindicação 15 ou 16, caracterizada pelo fato de ter susceptibilidadereduzida a etileno e distúrbios fisiológicos, em particular a manchamento eamarelecimento de Russet como verificado na originária.

18. Semente, caracterizada pelo fato de ser de uma plantacomo definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 14 e 17.

19. Progênie de uma semente como definida na reivindicação-18, caracterizada pelo fato de apresentar a susceptibilidade reduzida a etilenoe distúrbios fisiológicos, em particular a manchamento e amarelecimento deRusset como verificado na originária.

20. Produto de hortaliça, caracterizado pelo fato ecompreender uma planta ou sua parte como definida em qualquer uma dasreivindicações 9 a 19.

21. Produto de hortaliça de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato da hortaliça ser uma hortaliça folhosa.

22. Produto de hortaliça de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato da hortaliça ser alface.

23. Produto de hortaliça de acordo com qualquer uma dasreivindicações 19 a 22, caracterizado pelo fato do produto de hortaliça quandotriado pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7mostrar reduzida susceptibilidade a etileno e distúrbios fisiológicos, emparticular manchamento e amarelecimento de Russet.