ES2643899T3 - Resistencia a trastornos fisiológicos en la lechuga - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Resistencia a trastornos fisiologicos en la lechuga Campo de la invencion

La invencion se refiere a una planta de lechuga (Lactuca sativa L.) que presenta una respuesta alterada al etileno que conduce a una menor susceptibilidad de esta especie de cultivo al punteado pardo. La invencion tambien se refiere a las semillas y a la progenie de estas plantas.

Antecedentes de la invencion

El cultivo de verduras de hoja ancha, tales como la lechuga, esta dirigida a la produccion de variedades comerciales optimamente adaptadas para producir productos comercializables. Deben tomarse en cuenta muchas caractensticas durante la seleccion que se relacionan con rasgos de entrada y de salida. Uno de los rasgos mas importantes a este respecto se refiere a la calidad tras la recoleccion, en particular a la caducidad. El poder evitar trastornos fisiologicos y, mas en concreto, el punteado pardo y el amarilleo, son elementos importantes que pueden extender la caducidad de un cultivo de lechuga o de sus partes.

El etileno es una hormona vegetal que, en general, se sabe que estimula procesos fisiologicos relacionados con la senescencia. En la lechuga, esta estimulacion se evidencia a traves de la formacion de smtomas, tales como el punteado pardo y el amarilleo.

El trastorno del punteado pardo se caracteriza por la aparicion de manchas marrones a lo largo de la nervadura central de las hojas, mientras que el amarilleo es la decoloracion general de las hojas que aparece durante la senescencia como consecuencia de la degradacion de la clorofila.

Aunque se sabe que las lechugas maduras producen solo cantidades muy pequenas de etileno, las plantas son muy sensibles a esta hormona vegetal. Por tanto, los trastornos fisiologicos asociados con la sensibilidad al etilo que reducen la calidad tras la recoleccion de la lechuga estan provocados principalmente por fuentes externas de etileno. La exposicion a dichas fuentes externas puede producirse durante la recoleccion, el procesamiento y la conservacion del producto.

Por ejemplo, cuando la lechuga se transporta o se conserva cerca de frutas que producen etileno, tales como manzanas, peras o melocotones, puede producirse un deterioro grave. Ademas, cuando la lechuga se procesa y se emplea en mezclas recien cortadas envasadas, pueden existir limitaciones con respecto a los ingredientes que pueden utilizarse debido a la liberacion de etileno por uno o mas de los ingredientes.

El punteado pardo es un trastorno fisiologico que se manifiesta por la aparicion de numerosas manchas marrones a lo largo de la nervadura central de la hoja. Los smtomas de manchas marrones pueden extenderse a traves de la hoja durante las etapas progresivas del trastorno. Se sabe que el punteado pardo aparece, en especial, cuando las lechugas maduras se conservan a temperaturas bajas (5 °C) en presencia de concentraciones bajas (niveles de ppm) de etileno.

La formacion de los smtomas puede antagonizarse aplicando la hormona vegetal auxina o calcio. Ademas, las atmosferas modificadas que contienen bajos niveles de oxfgeno reducen la velocidad a la cual se desarrollan los smtomas.

A nivel bioqmmico, el punteado pardo parece desarrollarse como consecuencia de una estimulacion local de la biosmtesis de lignina, que provoca la lignificacion y el espesamiento de la pared celular alrededor del area de la hoja en que apareceran los smtomas visuales.

La decoloracion marron esta provocada por la estimulacion del metabolismo fenolico. La enzima fenilalanina amoniaco liasa (PAL), que se ha demostrado que es inducida por el etileno, cataliza la primera etapa comprometida de la via de fenilpropanoides. Los compuestos fenolicos que se forman principalmente incluyen derivados del acido cafeico, asf como una serie de flavonoides, tales como la (+)catequina y la (-)epicatequina. La posterior oxidacion de estos compuestos por la polifenol oxidasa (PPO) conduce a la decoloracion marron que se observa generalmente en el punteado pardo. Por ultimo, los smtomas pueden agravarse debido al colapso del tejido y a la muerte celular.

La senescencia es un proceso natural del desarrollo al final del ciclo de vida de la una planta o de un organo de una planta durante el cual el metabolismo se reprograma para movilizar recursos hacia estructuras reproductivas, tales como semillas. Aunque la senescencia es un proceso del desarrollo provocado por factores endogenos, tales como la edad fisiologica, existen muchos factores exogenos que pueden modular la senescencia.

El amarilleo de las hojas, el smtoma mas visible de la senescencia, es una consecuencia de la degradacion de la clorofila durante una etapa relativamente tardfa de la senescencia, que puede ser potenciada por el etileno en cuanto una hoja sea receptiva. Otros factores estimuladores de la senescencia muy conocidos son las heridas, la oscuridad y la deficiencia de nutrientes. Aunque el etileno es la hormona vegetal mas importante que se sabe que estimula la senescencia, es posible que otras hormonas, tales como el jasmonato, tambien contribuyan a este

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proceso.

Desde el momento de la recoleccion del cultivo de lechuga hasta el momento del consumo, el producto puede verse expuesto a los diferentes factores exogenos que contribuyen a la senescencia. Estos pueden ser la produccion de heridas durante la recoleccion y el procesamiento, la oscuridad y la deficiencia en nutrientes durante la conservacion, y el etileno durante el procesamiento y la conservacion. Estos factores estimulan notablemente los trastornos que aparecen tras la recoleccion, que pueden resultar evidentes, tales como el punteado pardo y el amarilleo. Aunque estos efectos son fundamentalmente cosmeticos, el producto tiene un aspecto mucho menos atractivo y, por tanto, no se puede comercializar.

Para contrarrestar estos efectos de deterioro pueden tomarse muchas medidas tras la recoleccion que reducen estos efectos. Por ejemplo, se pueden conservar las lechugas recolectada a temperaturas bajas para retrasar la senescencia. Aunque esto puede reducir la velocidad de aparicion del amarilleo, tambien puede potenciar el punteado pardo. Ademas, pueden establecerse medidas logfsticas que reduzcan el tiempo de transporte necesario desde el campo hasta el consumidor, o que eviten que la lechuga se conserve cerca de una fuente de etileno. Ademas, pueden aplicarse tratamientos qmmicos que eviten el deterioro tras la recoleccion, aunque la seguridad alimentaria y la aceptacion por el consumidor obviamente seran un problema.

Muchas de las medidas tras la recoleccion tienen exito hasta cierto punto, pero ciertamente se pueden mejorar. Ademas, los costes implicados pueden ser sustanciales, lo cual constituye otra razon para explorar alternativas que reduzcan la necesidad de aplicar tratamientos tras la recoleccion. Preferiblemente, se ha encontrado una solucion genetica que reduce o elimina la necesidad de tomar las caras medidas preventivas que se emplean en la actualidad para mantener la calidad tras la recoleccion a un nivel elevado.

Un objeto de la presente invencion es proporcionar plantas insensibles al etileno que muestran resistencia al punteado pardo. Este objeto se logra segun la invencion mediante una planta de lechuga insensible al etileno que muestra resistencia al punteado pardo, comparada con una planta control, y dicha planta posee informacion genetica en su genoma que es responsable de la resistencia, y dicha informacion genetica es como la que esta presente en el genoma de una planta que se ha depositado con el numero de registro NCIMB 41449, NCIMB 41450, NcIMB 41448, NCIMB 41451, NCIMB 41452 o NCIMB 41453, y puede obtenerse a partir de una planta cultivada a partir de las semillas depositadas mediante el cruzamiento de una planta con una planta cultivada a partir de las semillas depositadas, y la seleccion de las plantas resultantes del cruzamiento para la resistencia al punteado pardo mediante la conservacion de las lechugas maduras recolectadas de las plantas en un recipiente cerrado a una temperatura de 8 °C en la oscuridad y su exposicion a gas etileno a una concentracion de entre 6 y 7 volumenes en partes por millon, y la evaluacion de la presencia de smtomas del punteado pardo despues de 7 dfas.

En la presente tambien se describe un metodo para seleccionar una poblacion de plantas para determinar la presencia en ella de individuos que muestren una susceptibilidad reducida al etileno y a trastornos fisiologicos, en particular el punteado pardo, comparado con una planta control, comprendiendo dicho metodo:

a) proporcionar una poblacion de semillas;

b) hacer germinar las semillas en la oscuridad y en presencia de etileno para obtener plantulas;

c) seleccionar las plantulas que muestran unos hipocotilos mas largos que los hipocotilos de un control sensible al etileno;

d) autofecundar las plantulas seleccionadas para producir semillas;

e) hacer germinar una parte de las semillas producidas de cada plantula seleccionada en la oscuridad y en presencia de etileno y otra parte de las semillas de cada plantula seleccionadas en la oscuridad al aire ambiental; y

f) medir el crecimiento relativo de los hipocotilos de las plantulas germinadas en etileno frente al crecimiento de los hipocotilos de las plantulas germinadas al aire ambiental para distinguir las plantas que tienen un hipocotilo mas largo, comparado con el control sensible al etileno original, germinado en etileno y al aire ambiental, de las plantas que tienen un hipocotilo mas largo, comparado con el control sensible al etileno original germinado solo en etileno,

en el que las plantas que tienen un hipocotilo mas largo, comparado con el control sensible al etileno original germinado solo en etileno, se identifican como plantas que muestran una menor susceptibilidad al etileno y a trastornos fisiologicos, en particular el punteado pardo.

La invencion se basa en la hipotesis de que las plantas insensibles al etileno, en particular, la lechuga, seran resistencias a trastornos fisiologicos tras la recoleccion, tales como el punteado pardo.

El metodo, tal como se describe en la presente, comprende la etapa adicional de ensayar las plantas que se han identificado, en las etapas previas, como que muestran una menor susceptibilidad al etileno, para determinar su resistencia al punteado pardo.

La longitud del hipocotilo y la longitud de la rafz pueden observarse en comparacion con el patron, y puntuarse como 1, que significa igual a la variedad patron sensible al etileno germinada en etileno, hasta 3, que significa igual a la

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variedad patron sensible al etileno germinada al aire ambiental. Si se desea, pueden realizarse mediciones en miKmetros. Empleando una de estas mediciones, puede realizarse un analisis estad^stico simple, tal como un ensayo de la t, muy conocido por los expertos en la tecnica, para determinar si una planta o un grupo de plantas es significativamente menos sensible al etileno que el patron sensible al etileno, como, por ejemplo, cv. “Troubadour” (Rijk Zwaan, De Lier, Pafses Bajos). El nivel de significancia aplicado de un ensayo unilateral es de 0,001.

Para los mutantes, la comparacion estadfstica se realiza preferiblemente entre las longitudes de los hipocotilos y, opcionalmente, las longitudes de las rafces de la variedad original que se empleo para el tratamiento de mutagenesis, que es el mejor patron disponible, y las longitudes del hipocotilo y de las rafces de los mutantes individuales y/o su descendencia.

Para descubrir plantas insensibles al etileno en un material vegetal existente, se seleccionan una o mas muestras representativas de variedades, lmeas de reproduccion y/o numeros de registro de bancos de genes. Despues se realiza una comparacion estadfstica de modo apropiado entre las longitudes de los hipocotilos y de las rafces del numero de registro individual que se esta investigando y el resto de la poblacion. Cuando se ensayan individuos estadfsticamente para descubrir hipocotilos y/o rafces significativamente mas largos, pueden ser necesarios ensayos de comparacion multiple para mantener los niveles de significancia globales apropiados, por ejemplo, un ensayo de comparacion multiple de Dunnett con un patron (Dunnett, C.W., J. Amer. Statist. Assoc., 50:1096-1121 (1955)).

Las plantas que se van a seleccionar son plantas que pertenecen a la especie Lactuca sativa.

La poblacion de plantas preferiblemente es una poblacion de plantas mutantes, porque las probabilidades de encontrar una planta insensible al etileno en dicha poblacion variante son mayores. Sin embargo, mediante el metodo puede seleccionarse cualquier otra poblacion de plantas que difieran en su constitucion genetica.

La poblacion de plantas mutantes se obtiene preferiblemente mediante un tratamiento de mutagenesis empleando productos qmmicos y/o irradiacion. Los tratamientos de mutagenesis son muy conocidos y se describiran con mas detalle a continuacion.

La concentracion de etileno en la etapa b) es de al menos 10 pg/litro, preferiblemente entre 11 y 25 pg/litro. La concentracion de etileno en la etapa d) es de aproximadamente 4 a 5 pg/litro.

La etapa de seleccion en el metodo de seleccion, tal como se describe en la presente, se basa en el alargamiento de los hipocotilos. La exposicion de las plantulas germinadas en la oscuridad al etileno provoca el hinchamiento radial del hipocotilo y la inhibicion del crecimiento de las rafces y del hipocotilo. Este fenomeno se denomina en general la respuesta triple (vease, por ejemplo, Guzman, P. y Ecker, J., Plant Cell, 2:513-523 (1990)). La reproducibilidad de esta respuesta permite seleccionar mutantes que muestran una respuesta triple alterada en presencia o en ausencia de etileno. Ademas o en lugar de medir el alargamiento de los hipocotilos, la seleccion segun la invencion puede basarse en uno o mas de los otros elementos del ensayo de la respuesta triple.

Las plantas que muestran una menor susceptibilidad al etileno y a trastornos fisiologicos, en particular el punteado pardo, comparadas con una planta control, pueden obtenerse sometiendo una poblacion de semillas de plantas a un metodo de seleccion, tal como se describe en la presente, y seleccionando las plantas de la poblacion que muestran hipocotilos mas largos, en comparacion con un control sensible al etileno, como plantas que muestran una menor susceptibilidad al etileno y a trastornos fisiologicos, en particular el punteado pardo.

La planta de la invencion es una planta que pertenece a la especie Lactuca sativa.

Con el metodo de seleccion descrito en la presente se identificaron y seleccionaron mutantes insensibles al etileno. Las semillas de estos mutantes se depositaron en NCIMB Ltd., Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Reino Unido, el 3 de enero de 2007, y se les asignaron los numeros de registro listados en la tabla 1. Los detalles acerca de la descendencia de semillas de los depositos se indican en el ejemplo 3 y en el ejemplo 4. Estos depositos se realizaron porque poseen la caractenstica espedfica individual de una susceptibilidad significativamente menor al etileno. No se ensayaron para el criterio de DUS para el registro de variedades, es decir, la distinguibilidad, la uniformidad, la estabilidad en todas las caractensticas de registro, y no esta previsto que cumplan estos criterios de ninguna forma.

Tabla 1

Planta n.°

Referencia interna (= referencia NCIMB) n.° de registro NCIMB

00D.7856

07D.826509 41449

00D.6876

07D.826514 41450

00D.7871

07D.826502 41448

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00D.6883

07D.826522 41451

00D.6896

07D.826540 41452

00D.7845

07D.826542 41453

Las plantas que muestran una menor susceptibilidad al etileno y a trastornos fisiologicos, en particular el punteado pardo, pueden obtenerse cruzando una planta de la invencion con otra planta de la misma especie. Por tanto, la caractenstica de "menor susceptibilidad al etileno y a trastornos fisiologicos, en particular el punteado pardo" puede introducirse en otras plantas que originariamente no presentan esa caractenstica. El hecho de que las plantas que surgen de dicho cruzamiento sean, en efecto, plantas de la presente invencion, puede ensayarse sometiendo estas plantas al metodo de seleccion descrito en la presente.

La invencion se refiere ademas a la progenie de una planta progenitora de la invencion que presenta una menor susceptibilidad al etileno y a trastornos fisiologicos, en particular el punteado pardo. Esta progenie puede estar alejada en muchas generaciones del progenitor. Con la condicion de que la caractenstica de "menor susceptibilidad al etileno y a trastornos fisiologicos, en particular el punteado pardo" este presente, la planta de la progenie es una planta de la invencion.

En la presente tambien se describen partes de las plantas de la invencion. Las partes de las plantas son, por ejemplo, lechugas completas u hojas, tales como las hojas jovenes, las lechugas procesadas o las hojas cortadas.

Las partes de las plantas pueden emplearse en un cultivo de tejido para regenerar plantas que presentan la menor susceptibilidad al etileno y a trastornos fisiologicos, en particular el punteado pardo, tal como se encuentra en la planta de la cual se origina el tejido para el cultivo de tejido. Estas plantas regeneradas tambien son parte de esta invencion.

La invencion se refiere ademas a las semillas de una planta de la invencion, en las que la planta que puede cultivarse a partir de la semilla presenta resistencia al punteado pardo. El hecho de que las semillas y, por tanto, las plantas cultivadas a partir de ellas, conserven o no esa caractenstica puede ensayarse con el metodo de seleccion descrito en la presente. La invencion tambien se refiere a la posterior generacion de semillas que conservan la menor susceptibilidad al etileno y a trastornos fisiologicos, en particular el punteado pardo, tal como se encuentra en las semillas originales.

Debe advertirse que el metodo de seleccion descrito en la presente es un metodo relativamente sencillo. Las plantas de la invencion que presentan una menor susceptibilidad al etileno y a trastornos fisiologicos, en particular el punteado pardo, pueden identificarse en cualquier poblacion variante que sea suficientemente grande. No es necesario realizar experimentos indebidos para reproducir la invencion y, por tanto, no debe considerarse que las plantas de la invencion esten limitadas a las que se han depositado.

Como resultado de su insensibilidad al etileno, el material de plantas de lechuga y las semillas derivadas de estas de la invencion muestran un notable aumento con respecto a su cualidad tras la recoleccion que esta especialmente relacionada con fenomenos asociados con la senescencia, tales como el punteado pardo.

Descripcion detallada de la invencion

Puesto que el etileno es la hormona vegetal mas importante que estimula la senescencia, y puesto que el punteado pardo esta asociado con la senescencia, se desarrollo una estrategia genetica en la que se produjeron variantes geneticos y se seleccionaron para su insensibilidad al etileno. Se descubrio que esto conduce indirectamente a la identificacion de mutantes en los que su senescencia tras la recoleccion se ve afectada.

Estudios detallados que emplean especies modelo vegetales, tales como Arabidopsis thaliana, asf como especies cultivables, han proporcionado informacion acerca de las vfas bioqmmicas implicadas en la biosmtesis y la percepcion del etileno. Se han caracterizado muchas formas alelicas de genes por su papel a este respecto, y han proporcionado un retrato intrincado de la funcion del etileno en plantas. El etileno, al igual que otras hormonas vegetales, desempena un papel importante en muchos procesos fisiologicos que forman parte de complejas redes reguladoras interactivas.

La actividad espacial y temporal de la hormona se determina, de entre otras formas, a nivel de la expresion genica subyacente a la biosmtesis de etileno, la percepcion de la hormona, la transduccion de senales y la activacion de protemas efectoras corriente abajo.

Los variantes alelicos de los genes implicados a diferentes niveles pueden determinar la potencia de la respuesta, asf como el nivel de dialogo con otras vfas de senalizacion. Puesto que la biosmtesis y la percepcion del etileno no estan bien caracterizadas en la lechuga, y para permitir la identificacion de diferentes potencias de respuesta y sus variantes alelicos subyacentes, se penso que una estrategia no sesgada podna tener mas exito a este respecto,

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comparada con una estrategia de modificacion dirigida de genes.

Esta estrategia no sesgada incluye preferiblemente un procedimiento de mutagenesis aleatoria qmmica o ffsica combinado con un procedimiento de seleccion fenotfpica eficaz basado en la respuesta de plantulas etioladas al etileno. Este sistema de seleccion basado en plantulas es mucho mas eficaz en terminos del numero de plantas que pueden ensayarse por hora trabajada, comparado con el uso de lechugas maduras. Ademas, el tiempo empleado en producir un material vegetal para la seleccion obviamente es mucho menor en el caso de las plantulas, comparado con las lechugas maduras.

Otra ventaja de esta estrategia es el uso de condiciones de seleccion en la etapa de plantula como marcadores fenotfpicos predictivos para el rasgo tras la recoleccion en generaciones consecutivas tras haber identificado un acontecimiento favorable. Existe un riesgo evidente por el hecho de que la seleccion en la etapa de plantula puede no conducir a variantes geneticos que expresen el rasgo seleccionado a nivel maduro tras la recoleccion. Ademas, se sabe que las hormonas vegetales, tales como el etileno, estan implicadas en muchos procesos fisiologicos que pueden conducir a efectos pleiotropicos. Estos pueden ser positivos o negativos, dependiendo del cultivo y de sus condiciones de crecimiento. Por tanto, la estrategia adoptada comprende preferiblemente las siguientes etapas:

1. Generacion de una poblacion mutante mediante el tratamiento de semillas o de tejidos de la planta con agentes mutagenicos, tal como el etanmetilsulfonato (ems) o irradiacion con rayos gamma.

2. Establecimiento de una seleccion fenotfpica eficaz, en la que la seleccion se basa en la respuesta de plantulas etioladas de las plantas, en particular la lechuga, al etileno, que se caracteriza por una notable reduccion en el alargamiento del hipocotilo, una rafz mas corta y gruesa, y una exagerada curvatura apical en forma de gancho. Esta respuesta se denomina la respuesta triple, que es tfpica de plantulas etioladas y que se ha descubierto que aparece a diversos grados en muchas especies vegetales cuando se exponen a atmosferas que contienen etileno (vease, por ejemplo, Ecker J., Science, 268(5211):667-675 (1995)).

3. Caracterizacion de los mutantes modificados en al menos un ensayo de su respuesta triple con respecto al deterioro tras la recoleccion, que comprende el punteado pardo y, opcionalmente, la determinacion de los efectos pleiotropicos de la modificacion para excluir los efectos pleiotropicos negativos que afectanan al valor de las plantas.

En el metodo de seleccion descrito en la presente, la poblacion de semillas de las plantas que se va a ensayar es, por tanto, preferiblemente, una poblacion de semillas mutantes que puede obtenerse mediante un metodo que comprende:

a) tratar semillas M0 de una especie vegetal que se va a modificar, con un agente mutagenico para obtener semillas M1;

b) cultivar plantas a partir de las semillas M1 obtenidas de esta forma para obtener plantas M1;

c) producir semillas M2 mediante autofecundacion de la planta M1; y

d) opcionalmente, repetir la etapa b) y c) n veces para obtener las semillas M1+n.

Las semillas M1+n obtenidas de esta manera despues se germinan en la oscuridad y en presencia de una alta concentracion de etileno para obtener plantulas. Despues, se seleccionan las plantulas que no presentan una respuesta al etileno. La respuesta que se mide es el desarrollo de hipocotilos que estan alargados, comparados con los hipocotilos de una plantula sensible al etileno.

Despues, la progenie de cada planta seleccionada se divide y se cultiva en la oscuridad: la mitad de la progenie con etileno y la mitad de la progenie al aire ambiental. Se mide el crecimiento relativo del hipocotilo en etileno frente al aire ambiental para cada progenie bajo ambas condiciones. Estas observaciones se emplean para distinguir a las progenies que presentan un hipocotilo mas largo que el control sensible al etileno original en etileno, pero tambien al aire ambiental, y que, por tanto, puede concluirse que son sensibles al etileno y no son deseables, de las progenies que verdaderamente presentan una menor susceptibilidad al etileno.

Un ejemplo de un mutageno muy conocido es ems. El ems alquila principalmente restos G de una hebra de ADN que, durante la replicacion, provocan un apareamiento con T en lugar de C. Por tanto, las pares de bases GC cambian a AT a una frecuencia que se determina mediante la dosis eficaz de ems y la actividad del sistema de reparacion de desapareamientos de la planta. La dosis eficaz de ems depende de la concentracion utilizada, el tamano de la semilla y otras propiedades ffsicas, y del tiempo de incubacion de las semillas en la disolucion de ems. Las semillas que han sido tratadas con ems generalmente se denominan semillas M1. Como consecuencia del tratamiento, los tejidos de las semillas M1 contiene mutaciones puntuales aleatorias en los genomas de sus celulas, y las que estan presentes en la subpoblacion de celulas que formara el tejido de la lmea germinal (celulas germinales) se trasladaran a la siguiente generacion, que se denomina M2. Las mutaciones o sus combinaciones que son haploinsuficientes y, por tanto, provocan esterilidad, o que inducen letalidad en el embrion, no se trasladaran a la generacion M2.

Se aplica un procedimiento similar al descrito anteriormente para el uso de ems para otros agentes mutagenicos. La

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poblacion M2 puede emplearse en procedimientos de seleccion dirigidos a una respuesta triple menor de plantulas etioladas.

Otros agentes mutagenicos, en particular agentes mutagenicos alquilantes, son el sulfato de dietilo (des), la etilenimina (ei), la propano sultona, el N-metil-N-nitrosouretano (mnu), la N-nitroso-N-metilurea (NMU), la N-etil-N- nitrosourea (enu), y la azida de sodio.

Como alternativa, las mutaciones se inducen por medio de irradiacion, que se selecciona, por ejemplo, de rayos X, neutrones rapidos, irradiacion con UV.

Las mutaciones tambien pueden inducirse por medio de ingeniena genetica, tal como mediante el uso de oligonucleotidos quimericos, recombinacion homologa, introduccion de genes diana modificados que compiten con el producto endogeno, infrarregulacion a traves de interferencias con el ARN, etc.

La tecnologfa que permite modificar dianas genicas que residen en el genoma de una planta de una manera espedfica es conocida por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, los oligonucleotidos quimericos han demostrado ser mutagenos eficaces con un modo de accion espedfico. Otra estrategia consiste en modificar dianas genicas por medio de la recombinacion homologa o el transporte dirigido a genes. Empleando esta estrategia, un fragmento de un gen es reemplazado por un fragmento de ADN introducido que contiene una modificacion deseada. Tambien son factibles estrategias transgenicas en las que se introducen genes diana modificados que compiten con el producto endogeno. Esto puede conducir a efectos negativos dominantes. Ademas, es factible una infrarregulacion espedfica de la expresion de genes por medio de interferencias con el ARN.

En el caso de emplear oligonucleotidos mutagenicos, transporte dirigido a genes o estrategias transgenicas para modificar un factor genetico implicado en la funcion del etileno, obviamente debe conocerse la estructura primaria de los genes pertinentes. Sin embargo, en la actualidad, el conocimiento de dichos genes en la lechuga es limitado.

Pueden piramidarse alelos de menor susceptibilidad al etileno.

La produccion de semillas M1 y M1+n se realiza de modo adecuado por medio de autopolinizacion.

Por tanto, la invencion se refiere a plantas, que presentan en su genoma una informacion genetica que es responsable de la menor susceptibilidad hacia trastornos fisiologicos, tales como el punteado pardo, y que se encuentra en el genoma de una planta de lechuga, tal como se lista en la tabla 1.

La progenie de las plantas, tal como se reivindica, tambien es parte de esta invencion. La “progenie”, tal como se emplea en la presente, pretende incluir todas las plantas que presentan la misma menor susceptibilidad, o similar, frente al etileno y a los trastornos fisiologicos, en particular el punteado pardo, que las plantas originales descritas en la presente y que se derivan de estas de cualquier forma, tal como mediante reproduccion sexual, tal como autofecundacion o fecundacion cruzada con otra planta del mismo genero, o reproduccion vegetativa, tal como cortado, cultivo de tejidos, cultivo de haploides, cultivo de protoplastos, fusion de protoplastos u otras tecnicas. Asf, esta progenie es la primera generacion de plantas identificadas segun la invencion, asf como la primera generacion de plantas obtenidas por medio de una o mas de estas tecnicas, pero tambien cada generacion posterior de plantas obtenidas por medio de una o mas de estas tecnicas, con la condicion de que las plantas obtenidas tengan menor susceptibilidad.

Para determinar la respuesta de las plantulas de lechuga etioladas hacia el etileno, se emplearon recipientes de plastico especialmente disenados en los que se cultivaron las plantulas de lechuga sobre papeles de filtro en una atmosfera en la que pueden variarse los niveles de etileno. En efecto, se descubrio que las plantulas de lechuga respondfan a la presencia de etileno mediante un menor alargamiento del hipocotilo que, en principio, permitina seleccionar los mutantes insensibles al etileno en el caso de que dichos mutantes se encuentren en la poblacion disponible y en el caso en que la insensibilidad se exprese fenotfpicamente a nivel de plantula en las condiciones experimentales que se aplican.

Mediante el cultivo de un gran numero de plantulas de lechuga etioladas a partir de una poblacion que contiene mutaciones introducidas de modo aleatorio, se descubrio que pueden obtenerse y seleccionarse plantulas que muestran una menor sensibilidad al etileno, comparada con la sensibilidad al etileno de la poblacion de origen. Las plantulas seleccionadas mostraban un alargamiento del hipocotilo hasta un grado comparable a la situacion en que la atmosfera esta compuesta por aire ambiental sin etileno. Las plantulas identificadas de esta manera se calificaron como insensibles al etileno.

Para confirmar que los mutantes insensibles al etileno son resistentes al punteado pardo, los mutantes identificados en la seleccion se ensayaron para su resistencia al punteado pardo.

Un ensayo de punteado pardo comprende, de modo adecuado, la conservacion de las lechugas maduras recolectadas en un recipiente cerrado a una temperatura de 8 °C en la oscuridad, y su exposicion a gas etileno a una concentracion de entre 6 y 7 vpm (volumenes en partes por millon) y la evaluacion de la presencia de smtomas del punteado pardo despues de 7 dfas, preferiblemente despues de 9 dfas. De modo adecuado, se incuba una

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lechuga control sensible al etileno junto con las plantas que se van a ensayar, y el punteado pardo de las plantas que se van a ensayar se compara con esta.

Tal como se ilustra en los ejemplos, por primera vez se ha demostrado que la insensibilidad al etileno conduce a una resistencia al punteado pardo.

De modo sorprendente, las plantulas que mostraron una menor respuesta de alargamiento, comparada con las condiciones control, pero que sf mostraron un alargamiento mayor comparado con los controles sensibles, tambien se consideraron insensibles al etileno, aunque de forma parcial.

Los niveles variables de insensibilidad al etileno que se observaron pueden reflejar la presencia de diferentes loci mutantes o de diferentes formas alelicas de loci identicos que afectan a este rasgo en la poblacion original.

En el caso de una mutacion recesiva, estas dos posibilidades pueden distinguirse con facilidad realizando ensayos de alelismo, que comprenden el cruzamiento de los dos acontecimientos mutantes y la determinacion del fenotipo del hnbrido. En el caso de alelismo de las mutaciones, la insensibilidad al etileno aparecera en F1, mientras que este no sera el caso cuando el fenotipo en los mutantes se produzca por diferentes loci recesivos.

Puesto que se aplico una mutagenesis aleatoria como medio preferido para generar la poblacion de origen, las mutaciones en el trasfondo genetico tambien contribuyen a la variacion en el fenotipo de las plantulas bajo las condiciones experimentales. Para discriminar entre mutaciones puntuales de diferente potencia y un efecto combinado de las mutaciones en el trasfondo genetico, deben realizarse retrocruzamientos para crear trasfondos geneticos uniformes para los diferentes acontecimientos de insensibilidad al etileno. Este procedimiento tambien resulta pertinente para determinar si las mutaciones en loci espedficos implicadas en la sensibilidad al etileno muestran efectos pleiotropicos.

Las plantas M2 seleccionadas de esta manera basandose en una menor respuesta al etileno se emplearon para cultivar semillas M3. En algunos casos, las plantas M3 cultivadas a partir de las semillas M3 se seleccionaron por su menor sensibilidad al etileno en un ensayo de respuesta triple y se autofecundaron para producir semillas M4. Esto se repitio hasta M5 en algunos casos.

En un caso, una planta M3 cultivada a partir de una semilla M3 se selecciono por su menor sensibilidad al etileno en un ensayo de respuesta triple, y se cruzo con un progenitor sensible al etileno y sensible al punteado pardo para obtener una semilla F1. Una planta F1 cultivada a partir de la semilla F1 se autofecundo para producir semillas F2. Una planta F2 cultivada a partir de estas semillas f2 se selecciono por su menor sensibilidad al etileno en un ensayo de respuesta triple, y se autofecundo para producir semillas F3. Esta lmea F3 se anadio al conjunto de lmeas endogamicas m3 y M4. Despues, las lmeas endogamicas descendientes de los acontecimientos de insensibilidad al etileno se reevaluaron para su respuesta al etileno. El nivel de insensibilidad de cada lmea endogamica se puntuo basandose en el crecimiento relativo de la plantula en una atmosfera que contiene etileno frente al aire ambiental. Basandose en este criterio, 12/54 lmeas que antes se habfan puntuado como insensibles al etileno ahora se clasificaron como sensibles. Estos falsos positivos durante la seleccion inicial al nivel M2 pueden eliminarse con facilidad durante la reevaluacion de los acontecimientos en la siguiente generacion.

Las lmeas endogamicas que mostraron una insensibilidad al etileno confirmada y significativa en el ensayo del etileno se volvieron a sembrar y se cultivaron en un invernadero en condiciones normales de produccion de lechugas para producir lechugas maduras que se evaluaron para el punteado pardo y el amarilleo (veanse tambien los ejemplos).

Como controles negativos se cultivaron plantas sensibles al etileno que procedfan de la poblacion que se empleo para seleccionar los acontecimientos de insensibilidad al etileno. De modo sorprendente, las semillas de todos los mutantes insensibles al etileno germinaron con normalidad, es decir, fueron comparables a las semillas de una planta control sensible al etileno casi isogenica cuando se planta en tierra para macetas.

Esto contrasta notablemente con la situacion en otras especies vegetales, tales como Arabidopsis thaliana, que muestran una fuerte reduccion en la capacidad de germinacion cuando se plantan en tierra para macetas (Harpham, N.J.V. et al. (1991), Annals of Botany, 68, 55-61). Aparentemente, en el caso de la lechuga es posible cultivar mutantes insensibles al etileno segun la practica normal de cultivo que, en muchos casos, incluye sembrar en bloques de tierra para macetas o lechos cortos de tierra para macetas.

Despues del cultivo, las lechugas maduras se recolectaron y se expusieron a etileno. Una semana de incubacion tras la recoleccion de las lechugas a 8 °C en una atmosfera que contiene etileno produjo una potente induccion de punteado pardo en las lechugas de las plantas control sensibles al etileno. Sin embargo, 29 de los 37 acontecimientos de insensibilidad al etileno evaluados no mostraron senales de punteado pardo en absoluto, lo cual demuestra, de forma sorprendente, que la resistencia al etileno que se selecciono a nivel de plantula puede reducir los trastornos fisiologicos a nivel de planta madura, incluso en la etapa tras la recoleccion.

La resistencia al amarilleo puede demostrarse para una serie de acontecimientos de insensibilidad al etileno en condiciones de conservacion sin etileno a una temperatura suboptima. Esto resulta sorprendente porque, hasta la

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45

fecha, la resistencia al amarilleo solo se ha indicado en presencia de etileno (Saltveit et al., Postharvest Biology and Technology, 27:277-283 (2003)).

La presente invencion se ilustrara con los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar la invencion de ninguna forma. Mas en concreto, los experimented en los ejemplos se realizan con lechugas, pero la invencion puede aplicarse de modo mas amplio a otras especies vegetales que presenten unas dificultades tras la recoleccion similares cuando se ponen en contacto con etileno.

En los ejemplos se remite a la siguiente figura.

Figura: Fenotipo de lechugas maduras despues de la exposicion a etileno a 8 °C en la oscuridad durante 9 dfas. El panel izquierdo muestra una muestra representativa de lechugas resistentes al etileno (Etileno R) y un control sensible al etileno (- control) de la variedad Troubadour. El panel derecho muestra una fotograffa similar de los mutantes derivados de la variedad Apache.

Ejemplos

Ejemplo 1: Modificacion genetica de lechugas mediante metansulfonato de etilo (ems)

Semillas de las variedades de lechuga Troubadour, Apache y Yorvik (las tres de Rijk Zwaan, De Lier, Pafses Bajos) se trataron con ems mediante inmersion de aproximadamente 2000 semillas por variedad en una disolucion aireada

de ems al 0,05% (en p/v) o al 0,07% (en p/v) durante 24 horas a temperatura ambiente.

Germinaron aproximadamente 1500 de semillas tratadas por variedad por dosis de ems, y las plantas resultantes se cultivaron en un invernadero en los Pafses Bajos desde mayo a septiembre para producir semillas.

Despues de la maduracion, las semillas M2 se recolectaron y se reunieron en un unico agrupamiento por variedad por tratamiento. Los 6 agrupamientos resultantes de semillas M2 se emplearon como material de partida para

identificar las plantas M2 individuales que conteman los alelos de la menor susceptibilidad.

La eficacia del procedimiento de modificacion genetica se evaluo determinando la aparicion de plantas decoloradas, lo cual indica una perdida de clorofila debida a modificaciones en los genes implicados directa o indirectamente en la formacion o la acumulacion de clorofila. En los 6 agrupamientos de semillas M2 se observaron plantas individuales decoloradas, lo cual demuestra que los tratamientos aplicados producen modificaciones geneticas.

Ejemplo 2: Identificacion de plantas de lechuga que han obtenido alelos de menor susceptibilidad al etileno

Se germinaron semillas de lechuga M2 sobre papel en un recipiente de plastico pequeno con una concentracion de etileno de 10 20 vpm (volumenes en partes por millon) a 16 °C en la oscuridad. Un vpm contiene 0,41 pmol/litro o 1,14 pg/litro. Los mutantes insensibles al etileno se compararon con los controles sensibles al etileno y se seleccionaron basandose en un hipocotilo y/o rafz alargados (es decir, el ensayo de la respuesta triple). Estos mutantes insensibles al etileno se cultivaron para producir lmeas M3 mediante autofecundacion. Estas lmeas M3 se reensayaron con el ensayo de la respuesta triple para confirmar la insensibilidad al etileno.

Cuando una lmea se segrega para la insensibilidad al etileno, se seleccionan las plantas y despues se realizan uno o dos ciclos adicionales de cruzamiento endogamico y un ensayo de respuesta triple final para seleccionar las lmeas insensibles al etileno homocigoticas, si es posible.

En un caso, una planta M3 cultivada a partir de una semilla M3 se selecciono por su menor sensibilidad al etileno en un ensayo de respuesta triple, y se cruzo con un progenitor Troubadour sensible al etileno y sensible al punteado pardo para obtener una semilla F1. Una planta F1 cultivada a partir de la semilla F1 se autofecundo para producir semillas F2. Una planta F2 cultivada a partir de estas semillas F2 se selecciono por su menor sensibilidad al etileno en un ensayo de respuesta triple, y se autofecundo para producir semillas F3. La lmea F3 resultante se anadio al conjunto de 53 lmeas endogamicas M3, M3 y M5. En este caso, la lmea F3 era el unico representante de la planta mutante M2 original, porque no quedaron semillas autofecundadas de esta planta.

Este conjunto de 54 lmeas M3 y M4 del ejemplo 1 se germinaron en bloques de turba en un recipiente cerrado con una concentracion de etileno de entre 4 y 4,5 vpm en la oscuridad. Se identificaron los mutantes insensibles al etileno por sus hipocotilos mas largos en comparacion con las variedades control sensibles (Troubadour, Apache, Yorvik, Sensai). Los resultados se presentan en la tabla 1. Cuarenta y dos de las 54 lmeas que se identificaron mediante el ensayo de la respuesta triple parecieron ser al menos parcialmente insensibles al etileno en el ensayo del etileno. Estas lmeas representan 40 plantas M2, porque dos plantas M2 estan representadas dos veces.

La tabla 2 muestra los resultados.

Respuesta al etileno de lmeas mutantes en un ensayo en recipiente cerrado y un ensayo de respuesta triple (trt). Las observaciones sobre el hipocotilo y la ra^z se indican por separado, cuando no se muestra una respuesta coherente. La respuesta intermedia se indica como parcial. R = insensible al etileno; S = sensible al etileno; R/S = segregante; T = Troubadour; A = Apache; Y = Yorvik; hipo = hipocotilo

parcela

semilla n.° origen etileno trt parcela semilla n.° origen etileno trt

1

YORVIK S S

2

TROUBADOUR S S 32 01D.85755 T R/S R/S

3

APACHE S S 33 01D.85762 A R parcial R hipo; S rafz

4

00D.88531 Y S R/S hipo; R rafz 34 03D.90452 A R R

5

000.88539 Y S S 35 01D.85764 A R/S parcial R hipo; S rafz

6

01D.85717 Y S R 36 02D.90070 A R R

7

01D.85720 Y S R 37 03D.90457 A R R

8

01D.85732 Y S S 38 01D.85768 A R R

9

000.88533 Y S S 39 02D.90128 A R R

10

000.88538 Y S R 40 02D.90129 A R R

11

03D.74008 Y R S 41 02D.90130 A R R

12

02D.90749 Y S S 42 03D.90462 A R R

13

00D.88550 Y S S 43 03D.90464 A R R

14

01D.85739 Y S S 44 02D.90133 A R R

15

00D.88565 T R R 45 02D.90134 A R R

16

02D.91445 T R R 46 00D.88600 A R/S R

17

00D.88577 T R/S R hipo; S rafz 47 02D.91479+ A R R

18

02D.91446 T R R 48 01D.85772 A R S hipo;

R rafz

19

02D.91447 T R R 49 04D.800957 A R S hipo; R rafz

20

01D.85754 T S? R/S 50 02D.90091 A R R

21

02D.90047 T R R 51 04D.800960 A R S hipo; R rafz

22

01D.85758 T R R 52 04D.800963 A R R

23

00D.88564 T S S 53 01 D.85780 A R R

24

02D.91442 T R R 54 01D.85756 T R R

25

00D.88569 T R R 55 02D.90036 T R parcial S hipo; R rafz

26

00D.88573 T R R 56 04D.801660 Y R parcial R/S hipo; S rafz

27

00D.88578 T R R 58 04D.800900 T R S hipo; R rafz

28

00D.88582 T R R 59 03D.90323 T R R

29

01D.85748 T R/S R/S 60 Sensai S S

30

01D.85750 T S R

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Ejemplo 3: Identificacion de plantas de lechuga que han obtenido alelos de menor susceptibilidad al etileno para el punteado pardo

Se sembraron 37 lmeas insensibles al etileno de las 42 lmeas encontradas en el ejemplo 2 en un invernadero para producir lechugas maduras en condiciones normales de produccion de lechugas (localizacion: Maasdijk, Pa^ses Bajos; siembra: 10/01/2005; transplante: 17/02/2005; recoleccion: 18/04/2005). Las lechugas maduras recolectadas se conservaron en un recipiente cerrado a una temperatura de 8 °C en la oscuridad. Se expusieron a gas etileno a una concentracion de entre 6 y 7 vpm (volumenes en partes por millon). Un vpm contiene 0,41 pmol/litro o 1,14 pg/litro. Despues de 9 dfas, las plantas que mostraban punteado pardo se identificaron. Todas las plantas control, excepto Yorvik, mostraron punteado pardo. Veintinueve de las 37 lmeas ensayadas no mostraron punteado pardo o mostraron un punteado pardo menor comparado con la variedad original (tabla 3).

Se eligieron seis lmeas para la multiplicacion y se depositaron en NCIMB Ltd., Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, Reino Unido. La primera lmea se numera como 02D.91445. Es una lmea M4 que desciende de la planta M2 Troubadour insensible al etileno 00D.7856. Una planta M4 insensible al etileno se selecciono de 02D.91445 en el ensayo del recipiente cerrado del ejemplo 2 y se autofecundo para producir semillas M5. Se cultivaron 16 plantas M5 a partir de estas semillas para producir un conjunto de semillas M6 mediante autofecundacion. Este conjunto de semillas se numera como 07D.826509 y se deposita con el numero NCIMB 41449 (primera lmea).

La segunda lmea se numera como 02D.90047. Es una lmea M4 que desciende de la planta M2 Troubadour insensible al etileno 00D.6876. Una planta M4 insensible al etileno se selecciono de 02D.90047 en el ensayo del recipiente cerrado del ejemplo 2 y se autofecundo para producir semillas M5. Se cultivaron 16 plantas M5 a partir de estas semillas para producir un conjunto de semillas M6 mediante autofecundacion. Este conjunto de semillas se numera como 07D.826514 y se deposita con el numero NCIMB 41450 (segunda lmea). Se establecio la ausencia de punteado pardo para este origen mediante el ensayo de la lmea M5 03D.90323, que desciende de una planta M4 de 02D.90047.

La tercera lmea se numera como 00D.88578. Es una lmea M3 que desciende de la planta M2 Troubadour insensible al etileno 00D.7871. Se cultivaron 16 plantas M3 a partir de 00D.88578 para producir un conjunto de semillas M4 mediante autofecundacion. Este conjunto de semillas se numera como 07D.826502 y se deposita con el numero NCIMB 41448 (tercera lmea).

La cuarta lmea se numera como 03D.90452. Es una lmea M5 que desciende de la planta M2 Apache insensible al etileno 00D.6883. Se selecciono una planta M5 insensible al etileno de 03D.90542 en el ensayo del recipiente cerrado del ejemplo 2 y se autofecundo para producir semillas M6. Se cultivaron 16 plantas M6 a partir de estas semillas para producir un conjunto de semillas M7 mediante autofecundacion. Este conjunto de semillas se numera como 07D.826522 y se deposita con el numero NCIMB 41451 (cuarta lmea).

La quinta lmea se numera como 01D.85780. Es una lmea M3 que desciende de la planta M2 Apache insensible al etileno 00D.6896. Se selecciono una planta M3 insensible al etileno de 01D.85780 en el ensayo del recipiente cerrado del ejemplo 2 y se autofecundo para producir semillas M4. Se cultivaron 16 plantas M4 a partir de estas semillas para producir un conjunto de semillas M5 mediante autofecundacion. Este conjunto de semillas se numera como 07D.826540 y se deposita con el numero NCIMB 41452 (quinta lmea).

La sexta lmea se numera como 04D.801660. Es una lmea F3 que desciende de un cruzamiento entre la planta M3 Yorvik insensible al etileno 02D.8484 y una planta de la variedad sensible al etileno Troubadour. La planta M3 02D.8484 desciende de la planta M2 Yorvik insensible al etileno 00D.7845. Se selecciono una planta F3 insensible al etileno de 04D.801660 en el ensayo del recipiente cerrado del ejemplo 2 y se autofecundo para producir semillas F4. Se cultivaron 16 plantas F4 a partir de estas semillas para producir un conjunto de semillas F5 mediante autofecundacion. Este conjunto de semillas se numera como 07D.826542 y se deposita con el numero NCIMB 41453 (sexta lmea).

La figura 1 muestra las plantas resistentes y control.

Ejemplo 4: Identificacion de plantas de lechuga que muestran menos amarilleo tras la recoleccion

Se recolectaron lmeas insensibles al etileno cultivadas en condiciones de invernadero segun se describio en el ejemplo 3 y se conservaron las lechugas maduras recortadas en una camara de conservacion sin etileno a 8 °C. Despues de dos semanas, las hojas basales de las variedades verdes control Yorvik y Troubadour comenzaron a ponerse amarillas. En ese momento e incluso una semana despues, tres lmeas parecieron tener menos hojas basales amarillas que sus variedades de origen, que fueron los controles utilizados en este ensayo. Estas lmeas fueron numeradas como 04D.800900, 03D.90323, 04D.801660.

Aunque se ha indicado una relacion entre el amarilleo de las hojas y la presencia de etileno (Saltveit et al. (2003), Postharvest Biology and Technology, 27:277 283), resulta sorprendente que incluso en condiciones sin etileno, algunas de las lmeas insensibles al etileno expresan un fenotipo de menor amarilleo.

Observaciones de punteado pardo en lechugas maduras despues de 9 d^as de conservacion en condiciones con etileno. 0 = ausencia de smtomas; 1 = smtomas debiles; 2 = smtomas fuertes; ND = no disponible

semilla n.°

Etileno trt punteado pardo semilla n.° etileno trt punteado pardo

01D.85762

R parcial R hipo; S rafz 2 000.88565 R R 0

03D.90452

R R 0 02D.91445 R R 0,5

01D.85764

R/S R parcial R hipo; S rafz 1 000.88577 R/S R hipo; S rafz 0

02D.90070

R R 0 02D.91446 R R 0

03D.90457

R R 0 02D.91447 R R 0

01D.85768

R R 0 01D.85754 S? R/S 0

02D.90128

R R 2 01D.85756 R R 0

02D.90129

R R 2 02D.90047 R R ND

02D.90130

R R 2 01D.85758 R R 0

03D.90462

R R 2 02D.91442 R R 0

Apache

S S 2 Troubadour S S 1

03D.90464

R R 0 00D.88569 R R 0

02D.90133

R R 2 000.88573 R R 0

02D.90134

R R 2 000.88578 R R 0

00D.88600

R/S R ND 000.88582 R R 0

02D.91479

R R 0 01D.85748 R/S R/S 0 1

01D.85772

R S hipo; R rafz 0

04D.800957

R S hipo; R rafz 0 02D.90036 R parcial S hipo; R rafz ND

02D.90091

R R 0 01D.85755 R/S R/S ND

04D.800960

R S hipo; R rafz 0 04D.800900 R S hipo; R rafz 0,5

04D.800963

R R 2 03D.90323 R R 0

01D.85780

R R 0 4D.801660 R parcial R/S hipo; S rafz 0 2

Apache

S S 2 Yorvik S S 0

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. - Una planta de lechuga insensible al etileno que muestra resistencia al punteado pardo, comparada con una planta control, en la que dicha planta posee informacion genetica en su genoma que comprende una mutacion inducida que es responsable de la resistencia, y dicha informacion genetica es como la que esta presente en el

   5 genoma de una planta cuya semilla se ha depositado en NCIMB con el numero de registro NCIMB 41449, NCIMB 41450, NCIMB 41448, NCIMB 41451, NCIMB 41452 o NCIMB 41453, y puede obtenerse a partir de una planta cultivada a partir de las semillas depositadas mediante el cruzamiento de una planta con una planta cultivada a partir de las semillas depositadas, y la seleccion de las plantas resultantes del cruzamiento para la resistencia al punteado pardo mediante la conservacion de las lechugas maduras recolectadas de las plantas en un recipiente cerrado a una 10 temperatura de 8 °C en la oscuridad y su exposicion a gas etileno a una concentracion de entre 6 y 7 volumenes en partes por millon, y la evaluacion de la presencia de smtomas del punteado pardo despues de 7 dfas.
2. 2. - La progenie de una planta segun la reivindicacion 1, que presenta resistencia al punteado pardo.
3. 3. - Una planta regenerada a partir de una parte de la planta segun la reivindicacion 1 o 2, que presenta la resistencia al punteado pardo que aparece en el progenitor.

   15 4.- La semilla de una planta segun una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3, en la que la planta que puede

   cultivarse a partir de la semilla presenta resistencia al punteado pardo.
4. 5.- La progenie cultivada a partir de una semilla segun la reivindicacion 4.