BRPI0706760A2 - sistemas e métodos para produção de biocombustìveis e materiais relacionados - Google Patents

Abstract

SISTEMAS E MéTODOS PARA PRODUçAO DE BIOCOMBUSTìVEIS E MATERIAIS RELACIONADOS. A presente invenção refere-se a células de Clostridium phyto-fermentans (American Type Cultura Collection 700394^T^ e todas as outras linhagens da espécie podem fermentar materiais tal como biomassa em produtos e co-produtos úteis, tal como etanol, hidrogênio e ácidos orgânicos. Composições que incluem Clostridium phytofermentans são também descritas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SISTEMAS EMÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS E MATERIAISRELACIONADOS".

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

O presente pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedidode Patente Provisório U.S. Nq 60/762.813 depositado em 27 de janeiro de2006, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência em sua totali-dade.

Declaração Tal para Pesquisa Federalmente Patrocinada

A presente invenção foi feita com apoio do Governo sob GrantNs DE-FG02-02ER15330, concedida pelo United States Department of E-nergy (DOE). O Governo tem certos direitos na invenção.

Campo da Técnica

A presente invenção refere-se a composições e a sistemas emétodos para produção de biocombustíveis, tal como etanol, e materiais re-lacionados.

Antecedentes

Há um interesse no desenvolvimento de métodos de produçãode energia útil a partir de recursos de biomassa renováveis e sustentáveis.Energia na forma de carboidratos pode ser encontrada em biomassa de re-fugo, e em culturas de energia dedicadas, tal como grãos (por exemplo, mi-lho ou trigo) ou capins (por exemplo, "switchgrass1). Materiais celulósicos elignocelulósicos são produzidos, processados e usados em grandes quanti-dades em várias aplicações.

Um desafio atual é desenvolver estratégias viáveis e econômi-cas para a conversão de carboidratos em formas de energia úteis. Estraté-gias para derivação de energia útil a partir de carboidratos incluem a produ-ção de etanol ("etanol celulósico") e outros álcoois (por exemplo, butanol),conversão de carboidratos em hidrogênio e conversão direta de carboidratosem energia elétrica através de células a combustível. Por exemplo, estraté-gias de etanol em biomassa são descritas por DiPardo, Journal of Outlookfor Biomass Ethanol Production and Demand (ElA Forecasts), 2002; Shee-han, Biotechnology Progress, 15:8179, 1999; Martin, Enzyme Microbes Te-chnology, 31:274, 2002; Greer, BioCycIe, 61-65, Abril 2005; Lynd, Microbiol-ogy and Molecular Biology Reviews, 66:3, 506-577, 2002; e Lynd e outrosem "Consolidated Bioprocessing of Cellulosic Biomass: AN Update", CurrentOpinioninBiotechnoIogy, 16:577-583, 2005.

Sumário

A invenção é baseada, em parte, na revelação de novas caracte-rísticas de uma bactéria aneróbica, Clostridium phytofermentans. Por exem-plo, uma linhagem isolada de Clostridium phytofermentans (ISDgT, AmericanType Culture Collection 700394T) foi depositada sob condições que assegu-ram que acesso às culturas estará disponível durante a pendência do pedidode patente a alguém determinado pela Commissioner of Patents and Trade-marks a ser intitulado sob 37 C.F.R. 1.14 e 35 U.S.C. 122. Os depósitos es-tão disponíveis conforme requerido pelas leis de patente estrangeiras empaíses onde vias do pedido objeto, ou sua progênie, são depositadas. Noentanto, deve ser compreendido que a disponibilidade de um depósito nãoconstitui uma licença para praticar a invenção objeto em derrogação de direi-tos de patente concedidos pela ação governamental. Ainda, os depósitos decultura-objeto serão armazenados e disponibilizados ao público de acordocom as condições do Tratado de Budapeste para o Depósito de Microorga-nismos, isto é, eles serão armazenados com todo o cuidado necessário paramantê-los viáveis e sem contaminação por um período de pelo menos cincoanos após a requisição mais recente para o fornecimento de uma amostrados depósitos, e, em qualquer caso, por um período de pelo menos 30 (trin-ta) anos após a data de depósito ou por toda a vida executável de qualquerpatente que possa emitir descrevendo as culturas mais cinco anos após aúltima requisição para uma amostra do depósito. O depositor reconhece odever de substituir os depósitos se por acaso o depositório for incapaz defornecer uma amostra quando requisitado, devido à condição dos depósitos.Todas as restrições sobre a disponibilidade ao público dos depósitos de cul-tura-objeto serão irrevogavelmente removidas quando da concessão de umapatente de sua descrição.Foi constatado que Clostridium phytofermentans, tal como a li-nhagem ISDgT, sozinha ou em combinação com um ou mais outros micró-bios (por exemplo, leveduras ou outras bactérias) pode fermentar um mate-rial que é ou inclui um carboidrato, ou uma mistura de carboidratos, em umcombustível que pode sofrer combustão, por exemplo, etanol, propanol e/ouhidrogênio, em uma grande escala. Por exemplo, Clostridium phytofermen-tans pode fermentar biomassa de refugo, tal como serragem, farinha de ma-deira, polpa de madeira, polpa de papel, vapor desprendido de polpa depapel, capins (por exemplo, "switchgrass"), plantas e culturas de biomassa(por exemplo, Crambe), algas, cascas de arroz, bagaços, juta, folhas, cortesde grama, resíduo de milho, sabugos de milho, grão de milho (trituração demilho), grãos de destiladores, e solutos de destiladores, em etanol, propanole hidrogênio. Ainda, outros produtos orgânicos úteis podem ser tambémproduzidos, tal como ácidos orgânicos (por exemplo, ácido fórmico, ácidoláctico e ácido acético) ou suas bases conjugadas (por exemplo, formiato,lactato ou acetato).

Em um aspecto, a invenção refere-se a métodos de fabricaçãode um combustível ou combustíveis a partir de um ou mais materiais de bi-omassa provendo um material de biomassa que inclui um carboidrato de altopeso molecular; hidrólise do material de biomassa para prover um materialde biomassa hidrolisado; combinação do material de biomassa hidrolisadocom células de Clostridium phytofermentans em um meio; e fermentação domaterial de biomassa hidrolisado sob condições e por um tempo suficientepara produzir um combustível ou uma mistura de combustíveis, por exemplo,etanol, propanol e/ou hidrogênio. Em adição a combustíveis, outros produtose/ou co-produtos podem ser produzidos (por exemplo, ácidos orgânicos e/ousuas bases conjugadas). Em algumas modalidades, uma concentração decarboidratos no meio é maior do que cerca de 20 nM. Em outras modalida-des, a concentração é maior do que cerca de 1 mM, por exemplo, maior doque 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16 ou maior do que cerca de 18 mM.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma instalação decombustível que inclui uma unidade de hidrólise configurada para hidrolisarum material de biomassa que inclui um carboidrato de alto peso molecular eum fermentador configurado para alojar um meio e contém células de Clos-tridium phytofermentans dispersas nele.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a métodos de fabricaçãode um combustível ou combustíveis que incluem.combinação de células deClostridium phytofermentans e um material lignocelulósico (e/ou outro mate-rial de biomassa) em um meio, e fermentação da material lignocelulósico sobcondições e por um tempo suficiente para produzir um combustível ou com-bustíveis, por exemplo, etanol, propanol e/ou hidrogênio.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a métodos de fabricaçãode um combustível ou combustíveis que incluem combinação de células deClostridium phytofermentans e um material que inclui um carboidrato em ummeio, e fermentação do material incluindo o carboidrato sob condições e porum tempo suficiente para produzir um combustível. Uma concentração docarboidrato no meio é maior do que 20 mM, por exemplo, maior do que 30mM, 40 mM, 50 mM, 75 mM ou até mesmo 100 mM ou mais.

Em qualquer um dos métodos descritos aqui, células de Clostri-dium phytofermentans podem ser utilizadas sozinhas ou em combinaçãocom um ou mais outros micróbios (por exemplo, leveduras ou outras bacté-rias) para produzir um combustível ou outro produto útil, tal como ácidos or-gânicos ou suas bases conjugadas, que pode ser isolado como sais (porexemplo, sais de sódio ou potássio). Um exemplo de outra bactéria é qual-quer linhagem de Zymomonas mobilis.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a métodos de fabricaçãode um combustível ou combustíveis a partir de um ou mais materiais de bi-omassa com Clostridium phytofermentans sozinha ou em co-cultura com umou mais outros micróbios, tal como uma linhagem de levedura ou uma linha-gem de Zymomonas mobilis. Em adição à fabricação de combustíveis, a co-cultura pode ser usada para fazer qualquer co-produto descrito aqui, tal co-mo um ácido orgânico ou uma base conjugada ou um sal dele.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a métodos de empregode Clostridium phytofermentans para produzir um ácido orgânico, ou umabase conjugada ou um sal dele, a partir de um ou mais materiais de biomas-sa, tal como qualquer um daqueles materiais descritos aqui. Por exemplo, osoutros produtos ou co-produtos úteis podem ser usados como matérias-primas para a indústria química ou farmacêutica. Exemplos de ácidos (basesconjugadas) que podem ser produzidos incluem ácido láctico (Iactato) e áci-do acético (acetato).

Em outro aspecto, a invenção refere-se a co-culturas que inclu-em Clostridium phytofermentans e um ou mais outros micróbios, por exem-plo, leveduras ou outras bactérias (por exemplo, Zymomonas mobilis).

Em outro aspecto, a invenção refere-se a composições que in-cluem Ciostridium phytofermentans e um ou mais outros micróbios, por e-xemplo, leveduras ou outras bactérias (por exemplo, Zymomonas mobilis). Acomposição pode estar, por exemplo, na forma de uma mistura sólida (porexemplo, uma mistura seca por congelamento) ou uma dispersão líquida dosmicróbios, por exemplo, uma co-cultura.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a métodos de fabricaçãode um produto útil, tal como um biocombustível, que inclui seleção de umabiomassa ou uma mistura de materiais de biomassa; combinação da bio-massa com um meio que inclui Clostridium phytofermentans; fermentação dabiomassa por um primeiro período de tempo para prover um segundo mate-rial de biomassa; combinação do segundo material de biomassa (com ousem o Clostridium phytofermentans) com outro micróbio ou uma mistura demicróbios diferentes de Clostridium phytofermentans-, e então fermentaçãoda segunda biomassa por um segundo período de tempo para produzir ummaterial útil, tal como um combustível ou um ácido orgânico.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a fermentadores queincluem um meio que inclui Clostridium phytofermentans dispersa nele. Jun-to com Clostridium phytofermentans, o meio pode incluir um ou mais dequalquer um dos outros micróbios descritos aqui.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a fermentadores queincluem Clostridium phytofermentans em co-cultura com um ou mais dequalquer um dos outros micróbios descritos aqui.Em outro aspecto, a invenção refere-se a fermentadores queincluem um meio que inclui Clostridium phytofermentans dispersa nele. Osfermentadores são configurados para remover continuamente um produto defermentação, tal como etanol. Em algumas modalidades, a concentração doproduto permanece substancialmente constante, ou dentro de cerca de vintee cinco por cento de uma concentração média. Em algumas modalidades,qualquer biomassa descrita aqui é continuamente alimentada ao fermenta-dor.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a produtos feitos atravésde qualquer um dos processos descritos aqui.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a estojos, por exemplo,para semear um fermentador, que incluem Clostridium phytofermentans. Osestojos podem ainda incluir qualquer um ou mais de qualquer um dos outrosmicróbios descritos aqui. Por exemplo, os micróbios nos estojos podem sercombinados em um único recipiente ou recipientes múltiplos. Os micróbiosnos estojos podem ser dispersos em um meio ou eles podem ser secos porcongelamento. Os estojos podem ainda incluir materiais de partida, tal comonutrientes.

Clostridium phytofermentans (American Type Culture Collection700394T) é definida com base nas características fenotípicas e genotípicasde uma linhagem culturada, ISDgT (Warnick e outros, International Journal ofSystematic and Evolutionary Microbiology, 52:1155-60, 2002). A invençãorefere-se em geral a sistemas e métodos, e composições para produção decombustíveis e/ou outros produtos orgânicos úteis envolvendo linhagemISDgT e/ou qualquer outra linhagem da espécie Clostridium phytofermen-tans, que pode ser derivada de ISDgT ou separadamente isolada. A espécieé definida usando considerações taxonômicas-padrão (Stackebrandt e Goe-bel, International Journal of Systematic Bacteriology, 44:846-9, 1994): Linha-gens com valores de homologia de seqüência de rRNA 16S de 97% e maiorconforme comparado com a linhagem do tipo (iSDgT) são consideradas li-nhagens de Clostridium phytofermentans, a menos que elas sejam mostra-das ter valores de reassociação de DNA de menos de 70%. Existe evidênciaconsiderável para indicar que micróbios que têm valores de reassociação deDNA de 70% ou mais também têm pelo menos 96% de identidade de se-qüência de DNA e compartilham traços fenotípicos definindo uma espécie.Análises da seqüência do genoma de linhagem ISDgT de Clostridium phyto-fermentans indicam a presença de grandes números de genes e Ioci genéti-cos que são prováveis estar envolvidos em mecanismos e cursos para fer-mentação de polissacarídeo em planta, dando origem às propriedades defermentação incomuns deste micróbio. Com base nas considerações taxo-nômicas mencionadas acima, todas as linhagens da espécie Clostridiumphytofermentans também possuiriam todas, ou quase todas, essas proprie-dades de fermentação. Linhagens de Clostridium phytofermentans podemser isolados naturais ou linhagens geneticamente modificadas.

Vantagens dos novos sistemas e métodos incluem qualquer umadas, ou combinações das, que seguem. Clostridium phytofermentans podefermentar um amplo espectro de materiais em combustíveis com alta efici-ência. Vantajosamente, produtos de refugo, por exemplo, lactose, papéis derefugo, folhas, cortes de grama e/ou serragem, podem ser usados para fazercombustíveis. Clostridium phytofermentans permanece ativa mesmo em al-tas concentrações de carboidratos. Freqüentemente materiais que incluemcarboidratos podem ser usados brutos, sem pré-tratamento. Por exemplo,em alguns casos, não é necessário pré-tratar o material celulósico com umácido, uma base ou uma enzima para liberar os açúcares de peso molecularmais baixo que fazem parte do material celulósico antes da fermentação.Pelo contrário, Clostridium phytofermentans pode fermentar o material celu-lósico bruto em um combustível diretamente. Em alguns casos, materiaislignocelulósicos, por exemplo, serragem ou "switchgrass", podem ser usadossem remoção de lignina e/ou hemiceluloses. Células de Clostridium phyto-fermentans crescem e fermentam sob uma ampla faixa de temperaturas efaixas de pH. O pH do meio de fermentação pode não precisar ser ajustadodurante a fermentação. Em alguns casos, células de Clostridium phytofer-mentans podem ser usadas em combinação com um ou mais outros micró-bios para aumentar o rendimento de um produto desejado, por exemplo, e-tanol. Ainda, Clostridium phytofermentans pode fermentar altas concentra-ções de açúcares de 5-carbonos, ou polímeros que incluem "unidades derepetição de açúcar de 5-carbonos, em combustíveis que podem sofrercombustão. Açúcares de cinco carbonos, tal como xilose, ou polímeros queincluem unidades de repetição de 5-carbonos, tal ,como xilano e outros com-ponentes da fração de "hemicelulose" de paredes de célula de planta, sãohidrolisados e fermentados por Clostridium phytofermentans concomitante-mente com outros componentes poliméricos de materiais lignocelulósicosdando produtos tal como etanol e hidrogênio. Os açúcares de 5 carbonos, oupolímeros que incluem unidades de repetição de açúcar de 5 carbonos, nãoparecem desviar recursos metabólicos de Clostridium phytofermentans. Ain-da, Clostridium phytofermentans fermenta concentrações de celulose maisaltas, por exemplo, maiores do que 40 mM (equivalentes de glicose), comrendimento de etanol alto. Outros micróbios de fermentação de celulose nãofermentam concentrações mais altas de celulose, acima de cerca de 20 mM(equivalentes de glicose), e produção de etanol diminui em concentraçõesde celulose mais altas (Desvaux e outros, AppL Environ. Microbiology, 66,2461-2470,2000).

Carboidratos podem ser poliméricos, oligoméricos, diméricos,triméricos ou monoméricos. Quando os carboidratos são formados de maisde uma unidade de repetição única, cada unidade de repetição pode ser i-gual ou diferente. Exemplos de carboidratos poliméricos incluem celulose,xilano, pectina e amido, enquanto celobiose e Iactose são exemplos de car-boidratos diméricos. Exemplos de um carboidrato monomérico incluem gli-cose e xilose. O termo "carboidrato de peso molecular baixo" conforme aquiusado é qualquer carboidrato com um peso molecular ou um peso molecularnumérico médio de menos do que cerca de 1.000, conforme determinadousando uma curva de calibragem universal. Em geral, o termo "carboidratode peso molecular alto" é qualquer carboidrato tendo um peso molecularmaior do que 1.000, por exemplo, maior do que 5.000, maior do que 10.000,maior do que 25.000, maior do que 50.000, maior do que 100.000, maior doque 150.000 ou maior do que 250.000.Para carboidratos tendo uma estrutura única definida com umpeso molecular definido e computável, por exemplo, carboidratos monoméri-cos ou diméricos (por exemplo, arabinose e celobiose, respectivamente),concentrações são calculadas usando o peso molecular do carboidrato. Paracarboidratos não tendo uma estrutura única definida, por exemplo, carboidra-tos poliméricos (por exemplo, celulose), concentrações são calculadas su-pondo que a massa total do carboidrato polimérico possa ser hidrolisada pa-ra a unidade de carboidrato monomérico da qual o carboidrato polimérico éformado. O peso molecular da unidade de carboidrato monomérico é então1CV aplicado para calcular a concentração em unidades equivalentes de monô-mero. Por exemplo, celulose pura é formada inteiramente de unidades derepetição de glicose. 10 gramas de celulose dariam 10 gramas de glicose,supondo que a massa inteira da celulose seja hidrolisada para glicose. Gli-cose (C6Hi2O6) tem um peso molecular de 180,16 amu. 10 gramas de glico-se são 0,056 mol de glicose. Se esta quantidade de glicose estiver em 1L desolução, a concentração seria 0,056 M ou 56 mM. Se o polímero tiver maisde uma unidade de repetição, a concentração seria calculada como umaconcentração de carboidrato média total supondo que a massa inteira docarboidrato polimérico possa ser hidrolisada para as unidades de carboidratomonomérico das quais o carboidrato polimérico é formado. Por exemplo, seo carboidrato polimérico for feito totalmente das duas unidades de repetição,hidrólise de X gramas de carboidrato polimérico dá X gramas de carboidra-tos monoméricos. Um peso molecular compósito é a soma do produto dafração em mol do primeiro carboidrato monomérico e seu peso molecular e oproduto da fração em mol do segundo carboidrato monomérico e seu pesomolecular. O número médio de mois de carboidratos é então X gramas divi-dido pelo peso molecular do composto. A concentração de carboidrato mé-dia é encontrada dividindo o número médio de mois pela quantidade de so-lução onde eles residem.

Um "material fermentável" é um que Qostridium phytofermen-tans (por exemplo, ISDgT) pode, pelo menos em parte, converter em umcombustível, por exemplo, etanol, propanol ou hidrogênio e/ou outro produtoútil, por exemplo, um ácido orgânico).

Biomassa é um material não-fossilizado, orgânico, que são, ou éderivado de, organismos biológicos (por exemplo, plantas ou animais), mor-tos ou vivos. Biomassa exclui massa que foi transformada por processosgeológicos em substâncias tal como carvão ou petróleo, mas inclui materiaisque são derivados de organismos vivos ou mortos, por exemplo, tratandoquimicamente tais organismos ou remanescentes de tais organismos. E-xemplos de biomassa incluem madeira, materiais relacionados com madeira(por exemplo, tábua compacta), papel, capins (por exemplo, "switchgrass",Miscanthus), cascas de arroz, bagaço, algodão, juta, cânhamo, linho, bam-bu, sisal, abacá, palha, folhas, cortes de grama, resíduos de milho, sabugosde milho, grãos de destiladores, leguminosas, sorgo e plantações de bio-massa (por exemplo, Crambe).

A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos ecientíficos usados aqui têm os mesmos significados conforme geralmentecompreendido por um versado na técnica à qual a presente invenção per-tence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles des-critos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, mé-todos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações,pedidos de patente, patentes e outras referências aqui mencionados sãoincorporados a título de referência em sua totalidade. No caso de conflito, opresente relatório descritivo, incluindo definições, vai controlar. Ainda, osmateriais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não pretendem serlimitantes.

Outras características e vantagens da invenção serão aparentesa partir da descrição detalhada que segue e a partir das reivindicações.

Descrição dos Desenhos

A figura 1 é uma vista em seção transversal esquemática de umrecipiente de fermentação contendo um meio tendo células de Clostridiumphytofermentans dispersas nele.

A figura 2 é uma vista em seção transversal esquemática de umcortador giratório usado para fibrilar biomassa.A figura 3A é uma fotografia de material celulósico cortado nocortador giratório da figura 2.

A figura 3B é uma fotomicrografia muito ampliada do materialmostrado na figura 3A.

A figura 4 é um diagrama em bloco que mostra um processo pa-ra produção de etanol e hidrogênio a partir de biomassa usando pré-tratamento de hidrólise ácida.

A figura 5A é um diagrama em blocos que mostra um processopara produção de etanol e hidrogênio a partir de biomassa, usando pré-tratamento de hidrólise enzimática.

A figura 5B é um diagrama em bloco que mostra um processopara produção de etanol e hidrogênio a partir de biomassa usando biomassaque não foi enzimaticamente tratada.

A figura 5C é um diagrama em bloco que mostra um processopara produção de etanol e hidrogênio a partir de biomassa usando biomassaque não foi quimicamente ou enzimaticamente pré-tratada, mas é opcional-mente tratada com vapor.

A figura 6 é um diagrama de barras que mostra produtos princi-pais e concentrações dos produtos obtidos da fermentação de várias con-centrações de celulose iniciais (em equivalentes de glicose) junto com Clos-tridium phytofermentans.

Descrição Detalhada

A figura 1 mostra um recipiente de fermentação 10 que contémum meio 12 tendo um material fermentável dissolvido ou disperso nele. Omaterial fermentável é ou inclui um carboidrato, por exemplo, glicose, celobi-ose ou celulose. O meio 12 também tem uma pluralidade de células de Clos-tridium phytofermentans 14 dispersas nele, tal como células ISDgT. As célu-las de Clostridium phytofermentans 14 fermentam o material fermentávelpara produzir combustível que pode sofrer combustão, por exemplo, etanole/ou hidrogênio. Outros produtos e co-produtos úteis podem ser tambémproduzidos. Outros produtos podem incluir ácidos orgânicos (por exemplo,ácido fórmico, ácido láctico e ácido acético) ou sua base conjugada (por e-xemplo, íons de formiato, Iactato e acetato).

Células de Clostridium phytofermentans 14 (American Type CuI-ture Collection 700394T) foram isoladas de sedimento úmido no leito de umacorrente intermitente em um sítio florestado próximo ao Quabbin Reservoirno estado de Massachusetts (USA). Geralmente, células de ISDg7 14 sãobastões longos, finos, retos e móveis (0,5 a 0,8 a 3,0 a 15,0 μηι) que formamesporos terminais, redondos (0,9 a 1,5 pm de diâmetro). Características adi-cionais de células de Clostridium phytofermentan,s são descritas em Warnicke outros, Int. J. Systematic and Evoi Microbiology, 52, 1155-1160 (2002).

Células de Clostridium phytofermentans 14 são culturadas emum ambiente anaeróbico, que é conseguido e/ou mantido borbulhando umgás substancialmente livre de oxigênio através do borbulhador 16 que incluisaídas de gás 18 que são submersas abaixo da superfície 19 do meio 12.Gás e efluente em excesso das reações no meio 12 enchem o "headspace"22, e são eventualmente expelidos através de uma abertura de saída de gás21 formada na parede do recipiente 30. Gases que podem ser usados paramanter condições anaeróbicas incluem N2, N2ZCO2 (80:20), N2/CO2/H2(83:10:7) e gases nobres, por exemplo, hélio e argônio. Em algumas imple-mentações, para atingir e/ou manter homogeneidade, meio 12 é agitado(conforme indicado pela seta 40). Homogeneidade pode ser também manti-da agitando ou vibrando o recipiente 10.

Em alguns casos, a concentração de células de Clostridium phy-tofermentans 14 suspensas no meio 12 é de a partir de cerca de 106 a cercade 109 células/mL, por exemplo, de a partir de cerca de 107 a cerca de 108células/mL. Em algumas implementações, a concentração no início da fer-mentação é cerca de 107 células/mL.

Foi constatado que células de Clostridium phytofermentans 14podem fermentar ambas as concentrações baixas, por exemplo, 0,01 mM acerca de 5 mM, e alta de carboidrato, e são geralmente não inibidas em suaação em concentrações relativamente altas de carboidratos, que teria efeitosadversos sobre outros organismos. Por exemplo, a concentração do carboi-drato no meio pode ser maior do que 20 mM, por exemplo, maior do que 25mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 75 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM,250 mM, 300 mM ou ainda maior do quê 500 mM ou mais. Em qualquer umadessas modalidades, a concentração do carboidrato é geralmente menos doque 2.000 mM.

O material fermentável pode ser, ou pode incluir, um ou maiscarboidratos de peso molecular baixo. O carboidrato de peso molecular bai-xo pode ser, por exemplo, um monossacarídeo, um dissacarídeo, um oligos-sacarídeo ou misturas desses. O monossacarídeo pode ser, por exemplo,uma triose, uma tetrose, uma pentose, uma hexose, uma heptose, uma no-nose ou misturas desses. Por exemplo, o monossacarídeo pode ser arabi-nose, gliceraldeído, diidroxiacetona, eritrose, ribose, ribulose, xilose, glicose,galactose, manose, fucose, frutose, sedoeptulose, ácido neuramínico oumisturas desses. O dissacarídeo pode ser, por exemplo, sacarose, lactose,maltose, gentiobiose ou misturas desses.

Em algumas modalidades, o carboidrato de peso molecular bai-xo é gerado através de quebra de um polissacarídeo de peso molecular alto(por exemplo, celulose, xilano ou outros componentes de hemicelulose, pec-tina e/ou amido). Esta técnica pode ser vantajosamente e diretamente apli-cada a correntes de refugo, por exemplo, papel de refugo (por exemplo, jor-nal de refugo e caixas de papelão de refugo). Em alguns casos, a quebra éfeita como um processo separado, e então o carboidrato de peso molecularbaixo é utilizado. Em outros casos, o carboidrato de peso molecular alto éadicionado diretamente ao meio, e é quebrado no carboidrato de peso mole-cular baixo in situ. Em algumas implementações, isto é feito quimicamente,por exemplo, através de oxidação, hidrólise de base e/ou hidrólise ácida.Hidrólise química foi descrita por Bjerre, Biotechnol. Bioeng., 49:568, 1996 eKim e outros, Biotechnol. Prog., 18:489, 2002.

Em algumas implementações, o carboidrato de peso molecularbaixo é gerado através de quebra de um polissacarídeo usando uma enzimaou enzimas, por exemplo, endoglucanases, exoglucanases ou celobioidroia-ses (CBH). Essas enzimas podem ser adicionadas à fonte de polissacarídeocomo preparações de enzima ou elas podem ser produzidas in situ por umorganismo, por exemplo, Aspergillus Niger BKMF 1305 e Trichoderma reeseiRUT C30. Quebra enzimática foi discutida por T. Juhasz, Food Tech. Biote-chnol. (2003), 41, 49.

Em uma implementação específica, Iactose é usada como o car-boidrato. Lactose é produzida em grandes quantidades pela indústria dequeijo. Por exemplo, foi estimado por Elliot, Proceedings of the 38th AnnualMarschall Cheese Seminar (2001), que cerca de 470 milhões de libras delactose por ano são produzidos pela indústria de,queijo dos Estados Unidos,e outros 726 milhões de libras são produzidos na Europa. A Iactose pode serusada em um fermentador, por exemplo, um fermentador de semente quealimenta um fermentador principal, como um substrato de crescimento paracélulas de Clostridium phytofermentans sozinhas ou junto com outros subs-tratos de crescimento. Lactose pode ser adicionada a recipientes de fermen-tação para aumentar a fermentação de cárboidratos de peso molecular baixoe/ou acelerar a decomposição e fermentação de celulose ou outros carboi-dratos de peso molecular alto.

O material fermentável pode sertambém, ou pode incluir, um oumais carboidratos de peso molecular alto. Carboidratos de peso molecularalto incluem, por exemplo, ácido poligalacturônico, celulose, celulose micro-cristalina, pectina, amido, xilano, outros polímeros hemicelulósicos ou mistu-ras desses. Celulose microcristalina e celuloses microcristalinas modificadasestão comercialmente disponíveis da FMC Biopolymer sob a marca registra-da AVICEL®.

O material fermentável pode ser também, ou pode incluir, um oumais materiais de biomassa, por exemplo, materiais celulósicos ou Iignocelu-lósicos. Materiais celulósicos são aqueles materiais que incluem celulose,mas substancialmente não lignina, por exemplo, menos do que 0,5 por centoem peso. Os materiais celulósicos podem ser naturais, semi-sintéticos oucompletamente sintéticos. Por exemplo, algodão é um material celulósiconatural. Materiais celulósicos semi-sintéticos incluem, por exemplo, rayon(celulose regenerada) e têxteis que incluem fibras de algodão, por exemplo,obtidos de materiais têxteis de retalho virgem (por exemplo, restos), ou refu-gó pós-consumidor, por exemplo, trápos. Outros materiais celulósicos semi-sintéticos incluem grãos de destiladores (por exemplo, da indústria de etanolde milho), papel e produtos tal como papel poIirrevestido e papel Kraft. Opapel ou produtos de papel podem ser materiais virgens ou eles podem sermateriais de refugo pós-consumidor.

Materiais de Iignocelulose incluem celulose e uma porcentagemde Iignina1 por exemplo, pelo menos cerca de 0,5 por cento em peso a cercade 60 por cento em peso ou mais de lignina. Lignina pode ser pensada comoum material polifenólico. Algumas Iigninas podem ser representadas pelaEstrutura (I) abaixo:

Ligninas podem ser altamente ramificadas e podem ser parcial-mente reticuladas. Ligninas podem ter variação estrutural significante quedepende, pelo menos em parte, de sua fonte, por exemplo se ela é derivadade uma madeira mole ou uma madeira dura.

Materiais lignocelulósicos incluem, por exemplo; sedimento defabricação de papel; madeira e materiais relacionados com madeira, por e-xemplo, serragem, tábuas compactas ou folhas; e fontes de fibra naturais,por exemplo, árvores tal como árvores choupo, capins tal como "switch-grass", folhas, cortes de grama, cascas de arroz, bagaço, juta, cânhamo,linho, bambu, sisal, abacá, palha, sabugos de milho, resíduos de milho, pa-lha de trigo, cascas de arroz e fibra de coco.

Em implementações particulares, o material lignocelulósico éobtido de árvores, tal como árvores Coníferas, por exemplo, Pinheiro Cana-dense (Eastern Hemlock (Tsuga canadensis)), árvore avenca (MaidenhairTree (Ginkgo biiboa), Sabina de Costa (Pencii Cedar (Juniperus virgineanà),Pinheiro da Montanha (Moutain Pine (Pinus mugo), Cedro-do-Himalaia (De-odar {Cedrus deodara)), Cedro Vermelho (Western Red Cedar (Thuja piica-ía)), Teixo (Common Yew (Taxus baccata)), Abeto do Colorado (ColoradoSpruce (Picea pungens)) ou árvores decíduas, por exemplo, Sorveira (Moun-tain Ash (Sorbus), Eucalipto-cidra (Gum (Eucalyptus gunnii)), Bétula (Birch(Betula platyphylla)) ou Bordo da Noruega (Norway Maple (Acer plantanoi-des)), podem ser utilizadas. Choupo (ρορΙβή, Faia {Beech), Ácer de açúcar{Sugar Mapte) e Carvalhos (Oak tree) podem ser também utilizados.

Em alguns casos, células de Clostridium phytofermentans po-dem fermentar materiais lignocelulósicos diretamente sem a necessidade deremover lignina.

No entanto, em certas modalidades, é útil remover pelo menosum pouco da lignina dos materiais lignocelulósicos antes da fermentação.Por exemplo, remoção da lignina dos materiais lignocelulósicos pode tornaro material celulósico restante mais poroso e maior em área de superfície,que pode, por exemplo, aumentar a taxa de fermentação e rendimento deetanol. A lignina pode ser removida de materiais lignocelulósicos, por exem-plo, através de processos de sulfito, processos alcalinos ou através de pro-cessos Kraft. Tais processos e outros são, descritos em Meister, PatenteU.S. Nq 5.138.007 e Knauf e outros, International Sugar Journal, 106:1263,147-150 (2004). O teor de lignina da "switchgrass" é cerca de 17,6% (por-centagem em peso seco), que é mais ou menos o mesmo que resíduos demilho. O teor de lignina do papel de escrita varia de a partir de cerca de zeropor cento de lignina a cerca de 12 por cento de lignina. Alguns papéis deescritório têm um teor de lignina que está na faixa de cerca de 11-12 porcento de lignina. Mosier e outros, Bioresource Technology 96:673, 2005, dis-cutem o teor de lignina de alguns materiais e também algumas estratégiasde pré-tratamento para sua remoção. Se lignina for removida, ela pode serusada como uma fonte de energia nos processos, por exemplo, para aque-cer uma caldeira através de queima da lignina.

Materiais celulósicos podem ser obtidos de materiais Iignocelu-lósicos através de tratamento químico do material lignocelulósico para solu-bilizar a lignina para um grau que permita que o material celulósico seja se-parado da lignina, por exemplo, na forma de fibras. Quando o material Iigno-célulósico é de árvores, a Iignina dissolvida geralmente constitui entre cercade 25 a 45% do material.

Materiais podem ser reduzidos em tamanho, por exemplo, atra-vés de cisalhamento do material em um cortador giratório ou através de pul-verização do material em moinho de bola. Quando um cortador giratório éusado para reduzir o tamanho do material, por exemplo, um material céluló-sico ou lignocelulósico, tipicamente o material resultante é de natureza fibro-sa, tendo uma razão de comprimento-para-diâmetro substancial, por exem-plo, maior do que 5/1, maior do que 10/1, maior do que 15/1, maior do que20/1 ou ainda maior do que 25/1. Quando um moinho de bola é usado, tipi-camente o material resultante está na forma de farinha, tipicamente tendopartículas substancialmente esféricas, por exemplo, tendo um diâmetro demenos do que 5 mícrons, por exemplo, menos do que 4, menos do que 2,5,menos do que 1 mícron.

A figura 2 mostra um cortador giratório 100 que inclui uma tre-monha 101 que pode ser carregada com um material célulósico ou lignocelu-lósico 102, por exemplo, na forma de lascas. O material célulósico ou ligno-celulósico é puxado para uma zona de cisalhamento 103 e é cisalhado entrelâminas estacionárias 104 e lâminas giratórias 106. Uma tela 105 previne omaterial célulósico ou lignocelulósico de deixar a zona de cisalhamento 103até que o material seja dimensionado pequeno suficiente para passar poraberturas definidas na tela. Uma vez o material célulósico ou lignocelulósicotendo passado pelas aberturas na tela, ele é capturado no compartimento110. Para auxiliar na coleta do material célulósico ou lignocelulósico fibrosocisalhado, o compartimento 110 pode ser mantido em uma pressão abaixoda pressão atmosférica nominal. O material célulósico ou lignocelulósico fi-broso coletado no compartimento tem uma densidade aparente relativamen-te baixa, por exemplo, menos do que 0,5 grama por centímetro cúbico, porexemplo, menos do que 0,3 grama por centímetro cúbico, ou ainda menosdo que 0,2 grama por centímetro cúbico e tem uma aparência "fofa", confor-me mostrado nas figuras 3A e 3B.

Em algumas implementações, pode ser desejável usar um mate-rial fibroso que tem uma área de superfície relativamente alta e/ou uma po-rosidade relativamente alta. Por exemplo, um material fibroso desejável podeter uma área de superfície maior do que 0,5 m2/g, por exemplo, maior do que1,0 m2/g, 1,5 m2/g, 1,75 m2/g, 5 m2/g ou ainda maior do que 10 m2/g, con-forme medido usando medições de área de superfície BET Brunauer EmmettTeller); e/ou uma porosidade maior do que 70 por cento, por exemplo, maiordo que 80 por cento, 87,5 por cento, 90 por cento ou ainda maior do que 95por cento, como determinado por porosimetria dç mercúrio. Áreas de super-fície altas e/ou porosidades altas podem aumentar a taxa de hidrólise e/outaxa de fermentação.

Misturas de qualquer um dos materiais acima podem ser usa-das, por exemplo, misturas de materiais obtidos de fontes de papel, e mate-riais obtidos de algodão.

Em algumas modalidades, férmentadores que incluem um meioque inclui Clostridium phytofermentans dispersa nele são configurados pararemover continuamente um produto de fermentação, tal como etanol. Emalgumas modalidades, a concentração do, produto desejado permanecesubstancialmente constante, ou dentro de cerca de vinte e cinco por centode uma concentração média, por exemplo, medida após 2, 3, 4, 5, 6 ou 10horas de fermentação em uma concentração inicial de a partir de cerca de10 mM a cerca de 25 mM. Em algumas modalidades, qualquer material debiomassa ou mistura descrito aqui é continuamente alimentado aos fermen-tadores.

O meio para Clostridium phytofermentans pode incluir constituin-tes adicionais, tal como tampões, por exemplo, NaHCC>3, NH4CI,NaH2PO4eH2O, K2HPO4 e KH2PO4; eletrólitos, por exemplo, KCI, e NaCI;fatores de crescimento; tensoativos; e agentes de quelação. Fatores decrescimento incluem, por exemplo, biotina, ácido fólico, piridoxina*HCI, ribo-flavina, uréia, extratos de levedura, timina, triptona, adenina, citosina, gua-nosina, uracila, ácido nicotínico, ácido pantotênico, Bl 2 (Cianocobalamina),ácido p-aminobenzóico e ácido tióctico. Minerais incluem, por exemplo, Mg-SO4, MnSO4eH2O, FeS04*7H20, CaCI2'2H20, CoCI2e6H20, ZnCI2, Cu-S04*5H20, AIK(SO4)2eI 2H20, H3BO3, Na2MoO4, NiCI2*6H20 e Na-W04"2H20. Agentes de quelação incluem, por exemplo, ácido nitrilotriacéti-co. Tensoativos incluem, por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropilenoglicol (PPG), copolímeros de PEG e PPG e polivinilálcool.

Em algumas implementações, condições de fermentação inclu-em manutenção do meio em uma temperatura de menos do que cerca de459 C, por exemplo, menos do que cerca de 42Q C (por exemplo, entre cercade 34s C e 389 C, ou cerca de 37e C). Em qualquer uma dessas implementa-ções, geralmente, o meio é mantido em uma temperatura acima de cerca de5S C1 por exemplo, acima de cerca de 15e C.

Em algumas implementações, condições de fermentação inclu-em manutenção do meio em um pH abaixo de cerca de 9,5, por exemplo,entre cerca de 6,0 e 9,0 ou entre cerca de 8 e 8,5. Em geral, durante a fer-mentação, o pH do meio tipicamente não muda em mais do que 1,5 unidadede pH. Por exemplo, se a fermentação começa em um pH de cerca de 7,5,ela tipicamente não vai a menos do que 6,0 no final da fermentação, queestá dentro da faixa de crescimento das células.

Células de Clostridium phytofermentans se adaptam a concen-trações relativamente altas de etanol, por exemplo, 7 por cento em peso oumais, por exemplo, 12,5 por cento em peso. Células de Clostridium phyto-fermentans podem ser cultivadas em ambiente rico em etanol antes da fer-mentação, por exemplo, 7 por cento de etanol, para adaptar as células aconcentrações ainda maiores de etanol, por exemplo, 20 por cento. Em al-gumas modalidades, Clostridium phytofermentans é adaptada em concen-trações sucessivamente maiores de etanol, por exemplo, começando com 2por cento de etanol, então 5 por cento de etanol e então 10 por cento de e-tanol.

Produtos em adição a ou outro que não etanol podem ser produ-zidos. Mais geralmente, produtos de fermentação incluem combustíveis, talcomo álcoois (por exemplo, etanol, n-propanol, isopropanoi, n-butanol oumisturas desses) e hidrogênio. Outros produtos incluem ácidos orgânicos(por exemplo, ácido fórmico, ácido láctico, ácido acético e misturas desses)ou suas bases conjugadas (por exemplo, íons de formiato, Iactato ou aceta-to) ou seus sais.

Clostridium phytofermentans, tal como a linhagem ISDgT, podeser usada sozinha ou em combinação com um ou mais outros micróbios, talcomo leveduras ou fungos (por exemplo, Sacharomyces cerevisiae, Pichiastipitis, espécie Trichoderma,espécie Aspergillus) ou outras bactérias (porexemplo, Zymomonas mobiiis, KiebsieIIa oxytoca, Escherichia coli, Clostridi-um acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium papyrosoívens, Clos-tridium cellulolyticum, Clostridium josui, Clostridium termitidis, Clostridiumcellulosi, Clostridium celerecrescens, Clostridium populeti, Clostridium cellu-lovorans). Por exemplo, quando um clostrídio celulolítico (linhagem C7) foicultivado em co-cultura com Zymomonas mobiiis em um meio contendo celu-lose como o substrato de crescimento, rendimentos de etanol foram 2,5 ve-zes maiores do que em culturas com clostrídio sozinho (Leschine e Canale-Parola, CurrentMicrobioIogyfM^SASGi 1984). Misturas de micróbios po-dem ser providas como misturas sólidas (por exemplo, misturas secas porcongelamento) ou como dispersões líquidas, dos micróbios, e cultivadas emco-cultura com Clostridium phytofermentans, ou micróbios podem ser adicio-nados seqüencialmente ao meio de cultura, por exemplo, adicionando outrosmicróbios antes ou após adição de Clostridium phytofermentans.

Ainda, qualquer um dos materiais de biómassa descritos aqui oumisturas de qualquer um dos materiais de biomassa descritos aqui podemser tratados com um ou mais micróbios descritos aqui de uma maneira se-qüencial ou concomitante. Por exemplo, a biomassa (ou mistura de biomas-sa) pode ser tratada concomitantemente com uma mistura de micróbios, porexemplo, uma co-cultura, ou a biomassa (ou mistura de biomassa) pode serinicialmente tratada com um primeiro micróbio ou uma primeira mistura demicróbios (por exemplo, uma ou mais leveduras, fungos ou outras bactérias)e então a biomassa resultante pode ser tratada com uma ou mais linhagensde Clostridium phytofermentans. Em outras modalidades, o material de bio-massa (ou mistura de biomassa) é inicialmente tratado com uma ou maislinhagens de Clostridium phytofermentans e então a biomassa resultante étratada com um ou mais outros micróbios (qualquer um de ou misturas demicróbios descritos aqui).

Produção de Etanol em Grande Escala a Partir de Biomassa

Em geral, existem duas abordagens básicas para produção deetanol de grau de combustível a partir de biomassa em uma grande escalautilizando células de Clostridium phytofermentans. No primeiro método, umapessoa primeiro hidrolisa um material de biomassa que inclui carboidratos depeso molecular alto para carboidratos de peso molecular menor, e entãofermenta os carboidratos de peso molecular menor utilizando células deClostridium phytofermentans para produzir etanol. No segundo método, umapessoa fermenta o próprio material de biomassa sem pré-tratamento químicoe/ou enzimático. No primeiro método, hidrólise pode ser realizada usandoácidos, por exemplo, ácidos Brónsted (por exemplo, ácido sulfúrico ou ácidoclorídrico), bases, por exemplo, hidróxido de sódio, processos hidrotérmicos,processos de explosão de fibra com amônia ("EFEX"), processos de cal, en-zimas ou combinações desses. Hidrogênio e outros produtos da fermenta-ção podem ser capturados e purificados se desejado, ou descartados, porexemplo, através de queima. Por exemplo, o gás de hidrogênio pode serqueimado, ou usado como uma fonte de energia no processo, por exemplo,para acionar uma caldeira de vapor, por exemplo, através de queima. Hidró-lise e/ou tratamento com vapor da biomassa pode, por exemplo, aumentar aporosidade e/ou áreas de superfície da biomassa, freqüentemente deixandoo material celulósico mais exposto a células de Clostridium phytofermentans,que pode aumentar a taxa de fermentação e rendimento. Remoção de Iigni-na pode, por exemplo, prover um combustível que pode sofrer combustãopara acionamento de uma caldeira, e pode também, por exemplo, aumentara porosidade e/ou área de superfície da biomassa, freqüentemente aumen-tando a taxa de fermentação e rendimento. Em geral, em qualquer uma dasmodalidades descritas abaixo, a concentração inicial dos carboidratos nomeio é maior do que 20 mM, por exemplo, maior do que 30 rnM, 50 rnM, 75mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM ou até mesmo maior do que 500 mM.Produção de Etanol a Partir de Biomassa Utilizando Pré-tratamento de Hi-drólise Ácida

A figura 4 ilustra um processo 158 para produção de etanol apartir de biomassa primeiro tratando a biomassa (por exemplo, entre cercade 10 e cerca de 60 por cento em peso) suspensa em água com um ácidoem uma unidade de acidificação 160. A biomasça pode ser, por exemplo,lascas de madeira, serragem, resíduos agriculturais moídos ou culturas debiomassa (por exemplo, resíduos de milho ou "switchgrass"), resíduo de re-finamento de milho, produtos de papel cortado tal como aqueles mostradosnas figuras 3A e 3B ou misturas desses e outros materiais celulósicos e/oulignocelulósicos; A biomassa pode ser acidif içada borbulhando dióxido deenxofre gasoso através da biomassa que é suspensa na água, ou através daadição de um ácido forte, por exemplo, ácido sulfúrico, clorídrico ou nítrico.Durante a acidificação, o pH é mantido abaixo de cerca de 3, por exemplo,abaixo de cerca de 2,5 ou abaixo de cerca de 1,5. Em adição ao ácido já naunidade de acidificação, opcionalmente, um sal de metal tal como sulfatoferroso, sulfato férrico, cloreto férrico, sulfato de alumínio, cloreto de alumí-nio, sulfato de magnésio ou misturas desses pode ser adicionado para auxi-liar na hidrólise da biomassa. A biomassa é mantida na unidade de acidifica-ção 160, por exemplo, entre cerca de 1 e 6 horas, em uma temperatura de,por exemplo, entre cerca de 409 C e cerca de 809 C.

Após a acidificação na unidade de acidificação 160, a biomassatem água retirada na unidade de retirada de água 164, por exemplo, espre-mendo ou através de centrifugação, para remover a maior parte da águaacidif içada. Se desejado, a água acidif içada pode ser reutilizada na unidadede acidificação 160.

A biomassa impregnada com ácido é alimentada a uma unidadede hidrólise 166, por exemplo, através de um alimentador por gravidade oualimentador de válvula giratória que, em alguns casos, não densifica subs-tancialmente a biomassa. Vapor é injetado na unidade de hidrólise 166 paradiretamente contatar e aquecer a biomassa para a temperatura desejada. Atemperatura do vapor está, por exemplo, entre cerca de 130-C e cerca de220-C, e a injeção de vapor é continuada por um tempo, por exemplo, entrecerca de 10 minutos e cerca de 120 minutos. O hidrolisado é então descar-regado no "flask tank" 170 operando em uma temperatura de, por exemplo,entre cerca de 1005 C e cerca de 1902 C, e é mantido no tanque 170 por umperíodo de tempo, por exemplo, entre cerca de 1 hora e cerca de 6 horas,para hidrolisar mais a biomassa, por exemplo, em oligossacarídeos solúveise açúcares monoméricos.

O hidrolisado é então alimentado ao extrator 172, por exemplo,um extrator de contracorrente, um extrator de parafuso-transportador (screw-conveyor extractoi) ou um extrator de correia a vácuo (vacuum belt extrac-tor). No extrator 172, o hidrolisado é lavado com água quente em uma tem-peratura de, por exemplo, entre cerca de 409 C a cerca de 909 C. Por exem-plo, o hidrolisado é lavado com uma quantidade de água maior do que seupróprio peso, por exemplo, mais de duas vezes seu próprio peso, por exem-plo, três vezes, quatro vezes, oito vezes ou até mesmo mais do que dez ve-zes seu próprio peso.

Álcali, por exemplo, na forma de cal ou amônia, é adicionado aoextrato na unidade de ajuste de pH e filtragem 180 para ajustar o pH do ex-trato para entre cerca de 7 e cerca de 8. Quaisquer precipitados durante aadição do álcali são removidos e o filtrado é seguido para um fermentador182, que mantém um meio que tem células de Clostridium phytofermentansdispersas nele. A concentração inicial dos carboidratos no meio está entrecerca de 20 mM e cerca de 100 mM. A concentração de células de Clostridi-um phytofermentans suspensas no meio é, por exemplo, de a partir de cercade 107 a cerca de 109 células/mL. Em uma implementação, o meio (referidocomo GS-2) contém (cada um expresso em g/L) extrato de levedura, 6,0;uréia, 2,1; K2HPO4, 1,5; MOPS; 10,0; diidrato de citrato trissódico, 3,0; clori-drato de cisteína, 2,0. Em outras implementações, componentes podem seradicionados a, ou substituir os componentes no meio GS-2, incluindo: Trip-tona, 2,0; adenina, 0,02; citosina, 0,05; guanosina, 0,02; timina, 0,05; uracila,0,04; e uma quantidade de uma solução de vitamina, por exemplo. 10 g/mL,preparada conforme descrito em Wolin e outros, Bacteriology, 87:993, 1964.O extrato da unidade de pH e filtragem 180 é ajustado de modo que a con-centração inicial de carboidratos no meio é, por exemplo, entre cerca de pH7,0 e pH 7,5.

Se desejado, no início da fermentação, em adição ao hidrolisa-do, um carboidrato de peso molecular menor, por exemplo, lactose, pode seradicionado para uma concentração inicial de, ppr exemplo, entre cerca de1,0 g/L e 5 g/L. Isto pode ajudar a aumentar rapidamente o número de célu-las de Clostridiurri phytofermentans e formar enzimas dentro do fermentador.Fermentação é permitida prosseguir enquanto borbulhando gás nitrogênioatravés do meio por um período de tempo, por exemplo, entre cerca de 8horas e cerca de 72 horas, enquanto mantendo uma temperatura de, porexemplo, entre cerca de 15õ C e 40e C. Gás hidrogênio produzido durante afermentação é arrastado do fermentador 182 pelo gás nitrogênio, e é ou co-letado ou queimado.

Os sólidos extraídos do extrâtor 172 têm água retirada e entãoalimentados para segunda unidade de acidificação 190. Os sólidos do extrâ-tor são embebidos em uma solução aquosa de um ácido e, opcionalmente,um sal de metal. Durante a acidificação, o p,H é mantido abaixo de cerca de3, por exemplo, abaixo de cerca de 2,5 ou abaixo de cerca de 1,5. A bio-massa é mantida na segunda unidade de acidificação 190, por exemplo, en-tre cerca de 1 e 6 horas, em uma temperatura de, por exemplo, entre cercade 40° C e cerca de 80e C.

Após acidificação na unidade de acidificação 190, a biomassatem água retirada na unidade de retirada .de água 200, por exemplo, espre-mendo ou através de centrifugação, para remover muito da água acidificada.Se desejado, a água acidificada pode ser reutilizada na unidade de acidifica-ção 160 e/ou unidade de acidificação 190.

A biomassa impregnada com ácido é alimentada à segunda uni-dade de hidrólise 202. Vapor é injetado na segunda unidade de hidrólise 202para diretamente contatar e aquecer a biomassa para uma temperatura de-sejada. A temperatura do vapor e o tempo de tratamento são geralmente osmesmos usados na primeira unidade de hidrólise 166. O hidrolisado é entãodescarregado em um "flask tank" 204 operando em uma temperatura de, porexemplo, entre cerca de 1409 C e cerca de 190s C, e é mantido no tanque204 por um período de tempo, por exemplo, entre cerca de 0,5 e cerca de 12horas para hidrolisar mais a biomassa.

Álcali é adicionado ao extrato na unidade de ajuste de pH e "FiI—tragem 210 para ajustar o pH do extrato para entre cerca de 7 e cerca de 8.Quaisquer precipitados durante a adição do álcali são removidos, e o filtradoé combinado corn os conteúdos do fermentador 182, e então seguido para ofermentador 212. Fermentação é deixada prosseguir enquanto borbulhandogás nitrogênio através do meio por um período de tempo, por exemplo, entrecerca de 15 horas e 100 horas, enquanto mantendo uma temperatura de,por exemplo, entre cerca de 25s C e 35s C. Gás hidrogênio produzido duran-te a fermentação é carregado do fermentador 212 pelo gás nitrogênio, e é oucoletado ou queimado.

Após fermentação, o conteúdo total do fermentador 212 é trans-ferido para unidade de destilação 220 e 96 por cento de etanol/4 por centode água (em volume) são destilados e coletados. Etanol de grau combustível(99-100 por cento de etanol) pode ser obtido através de destilação azeotró-pica dos 96 por cento de etanol, por exemplo, através da adição de benzenoe então redestilação da mistura, ou passando os 96 por cento de etanol porpeneiras moleculares para remover a água.

Produção de Etanol a Partir de Biomassa Utilizando Pré-tratamento de Hi-drólise de Enzima

A figura 5A ilustra um processo 228 para produção de etanol apartir de biomassa primeiro tratando a biomassa (entre 10 e 60 por cento empeso), por exemplo, suspensa em água, com uma enzima ou mistura de en-zimas, por exemplo, endoglucanases, exoglucanases, celobioidrolases (C-BH), beta-glicosidases, glicosídeo hidrolases, glicosiltransferases, Iiases eesterases ativas contra componentes de hemicelulose, pectina e amido, emuma unidade de hidrólise 230. Durante a hidrólise, o pH é mantido entre cer-ca de 6,0 e cerca de 7,5 através da adição de hidróxido de sódio. A biomas-sa é mantida na unidade de hidrólise 230, por exemplo, entre cerca de 6 e120 horas, em uma temperatura de, por exemplo, entre cerca de 25Q C ecerca de 40-C, e sob nitrogênio.

Após hidrólise, álcali, por exemplo, na forma de cal ou amônia,e/ou ácido, por exemplo, na forma de uma solução aquosa de ácido sulfúri-co, é adicionado aos conteúdos da unidade de hidrólise 230 através da uni-dade de ajuste de pH 234 para ajustar o pH do conteúdo para entre cerca de7 e cerca de 8. Após o pH ser ajustado, todo o conteúdo da unidade de hi-drólise 230 é transferido para o fermentador 240, que mantém um meio quetem células de Clostridium phytofermentans dispersas nele. A concentraçãoinicial dos carboidratos no meio está entre 20 mM e cerca de 100 mM. Aconcentração de Ciostridium phytofermentans suspensa no meio é, por e-xemplo, de a partir de cerca de 107 a cerca de 109 células/mL. Em uma im-plementação, o meio contém (cada um expresso em g/L) extrato de levedu-ra, 6,0; uréia, 2,1; K2HPO4, 3,9; KH2PO4, 1,5; MOPS; 10,0; diidrato de citratotrissódico, 3,0; cloridrato de cisteína. O efluente da unidade de hidrólise 230é ajustado de modo que a concentração inicial de carboidratos no meio seja,por exemplo, entre cerca de 50 e 200 mM. Se desejado, no início da fermen-tação, celobiose pode ser adicionada para uma concentração inicial de, porexemplo, entre cerca de 1,0 g/L e 5 g/L, ou Iactose pode ser adicionada paraacelerar a fermentação ou hidrólise. Fermentação é deixada prosseguir en-quanto borbulhando gás nitrogênio através do meio por um período de tem-po, por exemplo, entre cerca de 8 horas e 72 horas, enquanto mantendouma temperatura de, por exemplo, entre cerca de 15- C e 409 C. Gás hidro-gênio produzido durante a fermentação é carregado do fermentador 240 pelogás nitrogênio, e é ou coletado ou queimado.

Após fermentação, todo o conteúdo do fermentador 240 é trans-ferido para a unidade de destilação 242, e etanol de grau combustível podeser obtido conforme acima discutido.

Produção de Etanol a Partir de Biomassa Sem Pré-tratamento com Ácido ouEnzima

A figura 5B ilustra um processo 250 para produção de etanol apartir de biomassa primeiro carregando um recipiente 252 com biomassa,por exemplo, entre 10 e 60 por cento em peso, suspensa em água. A bio-massa pode ser deixada absorver por um tempo, entre cerca de 1 hora e 36horas em uma temperatura de, por exempio, entre cerca de 25-C e cerca de90-C se adicionada sob pressão atmosférica normal, ou entre cerca de 100a cerca de 175 se sob pressões mais altas do que pressão atmosférica nor-mal, por exemplo, entre cerca de 0,152 MPa (1,5 atmosfera) e cerca de1,013 MPa (10 atmosferas). Álcali, por exemplo, na forma de cal ou amônia,e/ou ácido, por exemplo, na forma dé uma solução aquosa de ácido sulfúri-co, é adicionado ao conteúdo do recipiente 252 após o tempo de absorçãoatravés de uma unidade de ajuste de pH 260 para ajustar o pH.do conteúdopara entre cerca de 7 e cerca de 8. Após o pH ser ajustado, o conteúdo tododo recipiente 252 é transferido para o fermentador 262, que mantém ummeio que tem células de Clostridium phytofermentans dispersas nele. A con-centração inicial dos carboidratos no meio está entre 20 mM e cerca de 100mM. Fermentação acontece em recipiente de fermentação 262 sob condi-ções que foram descritas acima. Etanol de grau de combustível é destiladoem unidade de destilação 270, também conforme acima descrito.

A figura 5C ilustra um processo 300 para produção de etanol apartir de biomassa. Biomassa (com ou sem Iignina removida), e, opcional-mente, vapor são carregados ao fermentador 302. Se Iignina for removida,ela pode ser usada em qualquer processo intensivo de energia tal como e-nergia para acionar uma unidade de destilação. Vapor pode ser vantajosopara esterilizar a biomassa, e também para soltar a biomassa e torná-la maisreativa. A biomassa é carregada ao fermentador 302 e água é adicionada(se necessário) de modo que, por exemplo, entre cerca de 10 e cerca de 60por cento em peso da massa total são biomassa suspensa. A biomassa po-de ser deixada absorver por um tempo, por exemplo, entre cerca de 1 hora e36 horas, em uma temperatura de, por exemplo, entre cerca de 25- C e cer-ca de 902 C se sob pressão atmosférica normal, ou entre cerca de 10Oe C acerca de 1759 C se sob pressões mais altas do que pressão atmosféricanormal, por exemplo, entre cerca de 0,152 MPa (1,5 atmosfera) e cerca de1,013 MPa (10 atmosferas). Álcali, por exemplo, na forma de cal ou amônia,e/ou ácido acético, por exemplo, na forma de uma solução aquosa de ácidosulfúrico, é adicionado ao conteúdo do fermentador 302 após o tempo deabsorção através da unidade de ajuste de pH 306 para ajustar o pH do con-teúdo para entre cerca de 7 e cerca de 8.

O fermentador de semente 304, que mantém um meio que temcélulas de Clostridium phytofermentans dispersas.nele, é usado para cultivaras células de Clostridium phytofermentans. A concentração de células deClostridium phytofermentans suspensas no meio é, por exemplo, cerca de107 no início do crescimento e cerca de 108célul,as/ml_ quando a mistura desemente está pronta para uso para fermentar carboidratos. A concentraçãoinicial dos carboidratos no meio está entre 20 mM e cerca de 100 mM. Emuma implementação, o meio contém (cada um expresso em g/L) extrato delevedura, 6,0, uréia, 2,1, K2HPO4, 2,9; KH2PO4, 1,5; MOPS, 10,0; diidrato decitrato trissódico, 3,0; e cloridrato de cisteína. Todo o conteúdo do fermenta-dor 304 é transferido para o fermentador 302 mantido por volta da tempera-tura ambiente e deixado fermentar sob condições que foram descritas acima.Etanol de grau combustível é destilado em unidade de destilação 270, tam-bém conforme acima descrito.

Produção de Etanol a Partir de Biomassa Utilizando uma Combinação dePré-tratamento de Hidrólise Ácido e Pré-tratamento de Hidrólise de Enzima

Etanol a partir de biomassa pode ser também produzido usandouma combinação de pré-tratamento de hidrólise ácida e pré-tratamento dehidrólise de enzima. Por exemplo, uma hidrólise inicial pode acontecer usan-do um ácido, por exemplo, através de tratamento da biomassa em uma uni-dade de acidificação, seguido por injeção de vapor (conforme mostrado nafigura 4) e então uma hidrólise final pode ser aplicada à biomassa inicialmen-te hidrolisada usando hidrólise de enzima (conforme mostrado na figura 5A).

Qualquer combinação dos métodos e/ou características de pro-dução de etanol pode ser utilizada para fazer um método de produção híbri-do. Em qualquer um dos métodos descritos aqui, Iignina pode ser removidaantes da fermentação. Ainda, produtos em adição a ou outros que não eta-nol podem ser produzidos através de qualquer um dos métodos descritosaqui. Mais geralmente, produtos de fermentação incluem combustíveis, talcomo álcoois e hidrogênio, e outros produtos, tal como ácidos orgânicos.Clostridium phytofermentans, tal como a linhagem ISDgT, pode ser usadasozinha, ou sinergisticamente em combinação com um ou mais de qualquerum dos outros micróbios (por exemplo, leveduras ou outras bactérias) des-critos aqui.

Exemplos

A descrição é descrita mais nos exemplos que seguem, que nãolimitam o escopo da invenção descrito nas reivindicações.

Em um experimento, Clostridium phytofermentans ,foi cultivadaem tubos de cultura em meio de celulose GS-2 em um pH inicial de 7,5 sobuma atmosfera de N2. A concentração de Clostridium phytofermentans inicialera cerca de 0,8-1,1 χ 107 células/mL e a temperatura de incubação era 309C.

A figura 6 mostra a concentração de etanol (E), acetato (A), for-miato (F) e Iactato (L) quando do término da decomposição de celulose co-mo uma função de concentração de celulose inicial (em equivalentes de gli-cose). Em uma concentração de celulose inicial de 37 mM, as concentraçõesde lactato (L), acetato (A) e etanol (E) foram 4 mM, 20 mM e 59 mM, respec-tivamente. Formiato (F) não era detectável nesta concentração inicial. Emuma concentração de celulose inicial de 74 nM, as concentrações de Iactato(L), formiato (F), acetato (A) e etanol (E) eram 7 mM, 10 mM, 20 mM e 123mM, respectivamente; e em uma concentração de 148 nM, as concentraçõesde lactato (L), formiato (F), acetato (A) e etanol (E) eram 10 mM, 17 mM, 20mM e 160 mM, respectivamente. A figura 6 mostra que altas concentraçõesde celulose não inibem a ação de Clostridium phytofermentans, uma vez queas concentrações de etanol (E) aumentam com concentrações iniciais altasde celulose.

Este resultado contrasta com os resultados obtidos usando ou-tros micróbios de fermentação de celulose que não fermentam concentra-ções maiores de celulose, por exemplo, acima de cerca de 40 mM (em equi-valentes de glicose), e produz quantidades menores de etanol em concen-trações de celulose maiores (vide Desvaux e outros, Appi. Environ. Microbio-logy, 66, 2461-2470, 2000). É também notável que quando usando Clostridi-um phytofermentans os níveis de acetato não aumentam significaniementecom concentração inicial alta de celulose, o que pode ser vantajoso porquemais da celulose vai para fabricação do etanol mais economicamente valio-so. Em geral, outras bactérias celulolíticas produzem menos etanol do queacetato (em uma base molar) e razões de etanol-para-acetato diminuemcom concentrações de celulose iniciais altas (por exemplo, vide Desvaux eoutros acima).

Em um segundo experimento, Clostridium phytofermentans foicultivada em tubos de cultura em meio GS-2 contendo celulose a 25 ou 50mM (equivalentes de glicose) ou xilano a 25 ou 50 nM (equivalentes de xilo-se), ou celulose mais xilano, cada um a 25 ou 50 mM, para uma concentra-ção de carboidrato total de 50 ou 100 mM (equivalentes de monossacarí-deo). O pH inicial do meio era 7,5 e a concentração de Clostridium phytofer-mentans inicial era 0,8-1,1 χ 107 células/mL. As culturas foram incubadassob uma atmosfera de N2 a 30s C. Degradação de carboidrato foi monitoradavisualmente.

Em culturas contendo ambos carboidratos, celulose e xilano fo-ram degradados simultaneamente. A taxa de decomposição de celulose ouxilano em culturas contendo ambos os carboidratos era igual à ou maior doque a taxa de decomposição em culturas contendo um único carboidrato.Este experimento demonstra que a fermentação de celulose por culturas deClostridium phytofermentans não é inibida por xilano, um polímero de açúcarde cinco carbonos e um componente importante de hemicelulose. Ainda,este experimento mostra que celulose e xilano são fermentados simultane-amente por culturas de Clostridium phytofermentans, que pode ser vantajosodado que a maioria dos recursos naturais de biomassa contém misturas decarboidratos, com celulose como o componente mais abundante e hemicelu-loses, tal como xilano, segundo em abundância apenas para celulose. Emcontraste, parece que outros micróbios não podem fermentar os açúcares de5 carbonos, ou polímeros que incluem unidades de repetição de açúcar de 5carbonos. Também, com outros micróbios, os açúcares de 5 carbonos, ouseus polímeros, podem realmente interferir com processos metabólicos dosmicróbios para reduzir a taxa de fermentação e rendimento de etanol.

Em um terceiro experimento, Clostridium phytofermentans foicultivada em tubos de cultura em meio GS-2 contendo amido (amido solúvelDifco) a 10, 20 ou 40 g/L. O pH inicial do meio era 7,5 e a concentração deCiostridium phytofermentans inicial era 0,8-1,1 χ 107 células/mL. As culturasforam incubadas sob uma atmosfera de N2 a 309 C. Fermentação de amidofoi indicada por produção de gás e um aumento na turbidez da cultura.Quando do término da fermentação, as concentrações de produtos de fer-mentação foram determinadas. Em uma concentração de amido inicial de 10g/L, as concentrações de lactato, formiato, acetato e etanol eram 1 mM, 2mM, 4 mM e 69 mM, respectivamente. Em uma concentração de amido ini-cial de 20 g/L, as concentrações de lactato, formiato, acetato e etanol eram 3mM, 4 mM, 5 mM e 127 mM, respectivamente. Em uma concentração deamido inicial de 40 g/L, as concentrações de lactato, acetato e etanol eram11 mM, 4 mM e 132 mM, respectivamente. Formiato não foi detectado nesteúltimo experimento. Esses experimentos indicam que concentrações maio-res de amido não inibem a ação de Clostridium phytofermentans, uma vezque as concentrações de etanol aumentam com concentrações iniciais altasde amido, um resultado análogo àquele descrito acima onde células foramculturadas com concentrações altas de celulose.

Em um quarto experimento, Clostridium phytofermentans foi cul-tivada em tubos de cultura em meio GS-2 contendo milho moído a 27 g/L ougrãos de destiladores úmidos a 10,5 g/L ou resíduo de milho picado a 20 g/L,ou "switchgrass" picada a 20 g/L. O pH inicial do meio era 7,5 e a concentra-ção de Clostridium phytofermentans inicial era 0,8-1,1 X 107 células/mL. Asculturas foram incubadas sob uma atmosfera de N2 a 309 C. Todos os subs-tratos foram fermentados, conforme indicado por produção de gás, e o pro-duto de fermentação primário em todas as culturas era etanol. Este experi-mento indica que Clostridium phytofermentans fermenta essas matérias-primas celulósicas para etanol sem pré-tratamento químico da matéria-primacelulósica e sem a adição de celulose ou outras enzimas.Em um exemplo final, análises da seqüência de genoma deClostridium phytofermentans apoiam a conclusão de que este micróbio pos-sui propriedades de fermentação incomuns, e é particularmente bem-adequado para decomposição de componentes múltiplos de biomassa deplanta e fermentação desses componentes para etanol. O genoma de Clos-tridium phytofermentans foi seqüenciado pelo Joint Genome Institute do USDepartment of Energy. Uma montagem de seqüência preliminar estava pri-meiro disponível em 8 de novembro de 2005 e fpi liberada ao público em 20de maio de 2006 (http://genome.ornl.gov/microbial/cphy/). Esta montagempreliminar continha 4,5 MB de seqüência de nucleotídeo divididos em 169regiões contíguas, das quais 3671 proteínas putativas foram derivadas. Emdezembro de 2006, as lacunas na seqüência foram fechadas e a seqüênciaterminada é esperada para o início de 2007.

Como uma indicação das propriedades de fermentação inco-muns de Clostridium phytofermentans e sua habilidade em decompor com-ponentes múltiplos de biomassa de planta, a requerente examinou a se-qüência do genoma quanto à evidência de mecanismos de absorção de car-boidrato. O genoma de Clostridium phytofermentans contém mais de 100sistemas de transporte do tipo ABC e 52 desses parecem ser dedicados aotransporte de carboidratos para células. Embora alguns desses sistemas detransporte sejam específicos para monossacarídeos tal como glicose, fucoseou xilose, outros estão indubitavelmente envolvidos no transporte de dissa-carídeos (por exemplo, celobiose), trissacarídeos e tetrassacarídeos. Estadiversidade excepcionalmente ampla de sistemas de transporte de carboi-drato é inédita entre micróbios, e indica que Clostridium phytofermentans éparticularmente bem-adequado para decomposição de biomassa celulósica.

Outras Modalidades

Deve ser compreendido que embora a invenção tenha sido des-crita em conjunto com a sua descrição detalhada, a descrição acima preten-de ilustrar e não limitar o escopo da invenção, que é definido pelo escopodas reivindicações apensas.

Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do es-copo das reivindicações que seguem.

Claims (39)

1. Método de fabricação de um combustível a partir de materiaide biomassa, o método compreendendo:provisão de um material de biomassa compreendendo um car-boidrato de peso molecular alto;hidrólise do material de biomassa para prover um material debiomassa hidrolisado;combinação do material de biomassa hidrolisado com células deClostridium phytofermentans em um meio, em que uma concentração decarboidratos no meio é maior do que 20 mM; efermentação do material de biomassa hidrolisado sob condiçõese por um tempo suficiente para produzir um combustível.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o combustí-vel compreende um álcool selecionado do grupo consistindo em etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol e misturas dos mesmos.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o materialde biomassa é hidrolisado através de tratamento com um ácido.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o materialde biomassa é hidrolisado através de tratamento com uma enzima ou umamistura de enzimas.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o materialde biomassa é hidrolisado através de tratamento com um ácido, seguido portratamento com uma enzima.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o materialde biomassa é reduzido em tamanho antes da hidrólise.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a etapa dehidrólise inclui pré-tratamento com ácido em uma unidade de acidificação,seguido por retirada de água.

8. Instalação de combustível compreendendo:uma unidade de hidrólise configurada para hidrolisar um materialde biomassa compreendendo um carboidrato de peso molecular alto; eum fermentador configurado para alojar um meio e compreen-dendo células de Clostridium phytofermentans dispersas nele.

9. Instalação de combustível de acordo com a reivindicação 8,em que o fermentador configurado para alojar o meio e compreendendoClostridium phytofermentans compreende ainda um ou mais outros micró-bios diferentes de Clostridium phytofermentans.

10. Instalação de combustível de acordo com a reivindicação 9,em que o um ou mais outros micróbios compreendem uma ou mais levedu-ras.

11. Instalação de combustível de acordo com a reivindicação 9,em que o um ou mais outros micróbios compreendem uma ou mais bacté-rias·

12. Instalação de combustível de acordo com a reivindicação 11,em que a uma ou mais bactérias compreendem qualquer uma ou mais li-nhagens de Zymomonas mobilis.

13. Método de fabricação de um combustível, o método compre-endendo:combinação de células de Clostridium phytofermentans e ummaterial lignocelulósico em um meio; efermentação do material lignocelulósico sob condições e por umtempo suficiente para produzir um combustível.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o materiallignocelulósico é selecionado do grupo consistindo em madeira, polpa demadeira, sedimento de fabricação de papel, correntes de refugo de polpa depapel, tábua compacta, capins, cascas de arroz, bagaço, algodão, juta, câ-nhamo, linho, bambu, sisal, abacá, palha, sabugos de milho, resíduo de mi-lho, grãos de destiladores, folhas, palha de trigo, fibra de coco, algas, "swit-chgrass", Miscanthus, leguminosas, sorgo, culturas de biomassa (Crambe) emisturas dos mesmos.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o meiotem dissolvido nele constituintes selecionados do grupo consistindo em fato-res de crescimento, minerais, tensoativos, agentes de quelação e misturasdos mesmos.

16. Método de acordo com a reivindicação 13, em que as condi-ções incluem manutenção do meio em uma temperatura de menos do quecerca de 45s C.

17. Método de acordo com a reivindicação 13, em que condiçõesincluem manutenção do pH do meio abaixo de cerca de 9,5.

18. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o com-bustível é etanol, e em que condições incluem manutenção de uma concen-tração do etanol menor do que çerca de 1 M.

19. Método de fabricação de um combustível, o método compre-endendo:combinação de células de Clostridium phytofermentans e ummaterial compreendendo um carboidrato em um meio, em que a concentra-ção do carboidrato no meio é maior do que 40 mM; efermentação do material compreendendo o carboidrato sob con-dições e por um tempo suficiente para produzir um combustível.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a concen-tração é maior do que 50 mM.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a concen-tração é maior do que 100 mM.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a concen-tração é menos do que 2000 mM.

23. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o materialcompreende um carboidrato de peso molecular baixo tendo um peso mole-cular de menos do que 1.000.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o carboi-drato de peso molecular baixo é selecionado do grupo consistindo em arabi-nose, celobiose, frutose, galactose, glicose, lactose, manose, ribose, xilose emisturas dos mesmos.

25. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o materialcompreende um carboidrato de peso molecular alto tendo um peso molecu-lar maior do que 1.000.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o carboi-drato de peso molecular alto é selecionado do grupo consistindo em celulo-se, celulose microcristalina, ácido poligalacturônico, pectina, amido, xilano emisturas dos mesmos.

27. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o materialé pulverizado de modo que ele tem um tamanho de partícula entre cerca de 5 mícrons e 50 mícrons.

28. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o materialcompreende uma mistura de dois ou mais carboidratos.

29. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o materialcompreende um material celulósico ou lignocelulósico.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o materialcelulósico ou lignocelulósico é selecionado do grupo consistindo em papelpolirrevestido, papel Kraft, sedimento de fabricação de papel, madeira, polpade madeira, grãos de destiladores, tábua compacta, folhas, capins, cortes degrama, cascas de arroz, bagaço, algodão, juta, cânhamo, linho, bambu, si-sal, abacá, palha, sabugos de milho, resíduo de milho, palha de trigo, fibrade coco, algas, "switchgrass", crambe, culturas de biomassa e mistura dosmesmos.

31. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o materialcompreende um carboidrato de peso molecular baixo formado através daquebra de um carboidrato de peso molecular alto.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que a quebrainclui uso de uma enzima.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, em que a enzimaé selecionada do grupo consistindo em endoglucanases, exoglucanases,celobioidrolases (CBH), β-glicosidase, glicosídeo hidrolases, glicosiltransfe-rases, Iiases e esterases ativas contra componentes de hemicelulose, pecti-na e amido, e misturas dos mesmos.

34. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o materialé substancialmente livre de lignina.

35. Método compreendendo:combinação de células de Clostridium phytofermentans, um se-gündo micróbio e um material compreendendo um carboidrato em um meio;efermentação do material compreendendo o carboidrato.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, em que a fermen-tação é realizada sob condições e por um tempo suficiente para produzir umcombustível.

37. Método de acordo com a reivindicação 35, em que o segun-do micróbio compreende uma levedura.

38. Método de acordo com a reivindicação 35, em que o segun-do micróbio compreende uma bactéria diferente de Clostridium phytofermen-tans.

39. Composição compreendendo Clostridium phytofermentans eum segundo micróbio.