BRPI0706935A2 - anticorpos anti-efrina b2 isolado, vetor, célula hospedeira, método de elaboração de anticorpo anti-efrina b2, método de elaboração de imunoconjugado anti-efrina b2, método de detecção de efrina b2, método de diagnóstico de disfunção, composição, método de inibição da angiogênese e uso de anticorpo anti-efrina b2 - Google Patents

anticorpos anti-efrina b2 isolado, vetor, célula hospedeira, método de elaboração de anticorpo anti-efrina b2, método de elaboração de imunoconjugado anti-efrina b2, método de detecção de efrina b2, método de diagnóstico de disfunção, composição, método de inibição da angiogênese e uso de anticorpo anti-efrina b2 Download PDF

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Abstract

ANTICORPOS ANTI-EFRINA B2 ISOLADO, VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA, MéTODO DE ELABORAçãO DE ANTICORPO ANTI-EFRINA B2, MéTODO DE ELABORAçãO DE IMUNOCONJUGADO ANTI-EFRINA B2, MéTODO DE DETECçãO DE EFRINA B2, METODO DE DIAGNóSTICO DE DISFUNçãO, COMPOSIçãO, MéTODO DE INIBIçãO DA ANGIOGENESE E USO DE ANTICORPO ANTI-EFRINA B2. A presente invenção fornece anticorpos anti-Efrina B2 terapêuticos, composições que os compreendem e métodos de uso desses anticorpos.

Description

"ANTICORPOS ANTI-EFRINA B2 ISOLADO, VETOR, CÉLULAHOSPEDEIRA, MÉTODO DE ELABORAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-EFRINAB2, MÉTODO DE ELABORAÇÃO DE IMUNOCONJUGADO ANTI-EFRINAB2, MÉTODO DE DETECÇÃO DE EFRINA B2, MÉTODO DE DIAGNÓSTICODE DISFUNÇÃO, COMPOSIÇÃO, MÉTODO DE INIBIÇÃO DAANGIOGÊNESE E USO DE ANTICORPO ANTI-EFRINA B2"
Referência Cruzada a Pedidos Relacionados
O presente pedido reivindica prioridade com base em 35 USC§119 para o Pedido Provisório Norte-Americano n° 60/760.891, depositado empIO vinte de janeiro de 2006, cujo teor é integralmente incorporado ao presentecomo referência.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se, de forma geral, aos campos debiologia molecular. Mais especificamente, a presente invenção refere-se aanticorpos anti-Efrina B2 e suas utilizações.
Antecedentes da Invenção
O desenvolvimento de fornecimento vascular é exigênciafundamental para muitos processos patológicos e fisiológicos. Tecidos emcrescimento ativo tais como embriões e tumores necessitam de fornecimentode sangue adequado. Eles satisfazem esta necessidade produzindo fatorespró-angiogênicos, que promovem a formação de novos vasos sangüíneos pormeio de processo denominado angiogênese. A formação de tubos vasculares éevento biológico complexo mas ordenado que envolve todas ou muitas dasetapas a seguir: a) as células endoteliais (ECs) proliferam-se a partir de ECsexistentes ou diferenciam-se de células progenitoras; b) ECs migram e reúnem-se para formar estruturas similares a cordas; c) as cordas vasculares sofremtubulogênese em seguida para formar vasos com lúmen central; d) as cordasou vasos existentes emitem brotos para formar vasos secundários; e) plexovascular primitivo sofre remodelagem e reformação adicional; e f) célulasperiendoteliais são recrutadas para englobar os tubos endoteliais, fornecendofunções de manutenção e moduladoras para os vasos; essas células incluempericitos para capilares pequenos, células de músculos moles para vasosmaiores e células do miocárdio no coração. Hanahan, Science 277: 48-50(1997); Hogan & Kolodziej1 Nat. Rev. Genet. 3: 513-23 (2002); Lubarsky &Krasnow, Ce//112: 19-28 (2003).
E agora bem estabelecido que a angiogênese está relacionadacom a patogênese de uma série de disfunções. Estas incluem tumores sólidose metástase, arteriosclerose, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamaçõescrônicas, doenças neovasculares intraoculares tais como retinopatiasproliferativas, como retinopatia diabética, degeneração macular relativa à idade(AMD), glaucoma neovascular, rejeição imunológica de tecido da córneatransplantado e outros tecidos, artrite reumatóide e psoríase. Folkman et al, J.Biol. Chem. 267: 10931-34 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-39 (1991); e Garner A., Vascular diseases, em: Pathobiology of OcularDisease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth G. K., eds., segundaedição (Mareei Dekker, Nova Iorque, Estados Unidos, 1994), págs. 1625-1710.
No caso de crescimento de tumores, angiogênese aparentementeé fundamental para a transição de hiperplasia para neoplasia e para fornecernutrição para o crescimento e metástase do tumor. Folkman et al, Nature 339:58 (1989). A neovascularização permite que as células tumorosas obtenhamvantagem de crescimento e autonomia proliferativa em comparação com ascélulas normais. Tumor normalmente se inicia na forma de uma única célulaaberrante que pode proliferar-se somente até o tamanho de alguns milímetroscúbicos devido à distância de leitos capilares disponíveis e pode permanecer"dormente" sem crescimento e disseminação adicional por longo período detempo. Algumas células de tumores alteram-se em seguida para o fenótipoangiogênico para ativar células endoteliais, que se proliferam e amadurecemem novos vasos sangüíneos capilares. Estes vasos sangüíneos recémformados não apenas permitem o crescimento contínuo do tumor primário, mastambém a disseminação e recolonização de células de tumores metastáticos.Conseqüentemente, observou-se correlação entre a densidade de microvasosem seções de tumores e a sobrevivência dos pacientes em câncer de mama,bem como em diversos outros tumores. Weidner et al, N. Engl. J. Med. 324: 1-6(1991); Horak et al, Lancet 340: 1120-1124 (1992); Macchiarini et al, Lancet340: 145-146 (1992). Os mecanismos precisos que controlam a alteraçãoangiogênica não são bem compreendidos, mas acredita-se que aneovascularização de massa de tumor resulte do equilíbrio líquido de uma sériede estimulantes e inibidores da angiogênese (Folkman, 1995, Nat. Med. 1 (1):27-31 (1995)).
O processo de desenvolvimento vascular é estritamente regulado.Até o momento, demonstrou-se que quantidade significativa de moléculas, amaior parte fatores segregados produzidos por células vizinhas, regula adiferenciação, proliferação, migração e reunião de EC em estruturas similares acordas. Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), por exemplo, foiidentificado como fator fundamental envolvido no estímulo da angiogênese e naindução da permeabilidade vascular. Ferrara et al, Endocr. Rev. 18: 4-25(1997). A descoberta de que a perda de mesmo um único alelo de VEGFresulta em Ietalidade embriônica aponta papel insubstituível desempenhado poreste fator no desenvolvimento e na diferenciação do sistema vascular. Alémdisso, demonstrou-se que VEGF é mediador fundamental daneovascularização associada a tumores e disfunções intraoculares. Ferrara etal, Endocr. Rev., acima. O mRNA de VEGF é sobreexpresso pela maior partedos tumores humanos examinados. Berkman et al, J. Clin. Invest. 91: 153-159(1993); Brown et al, Human PathoL 26: 86-91 (1995); Brown et al, CancerRes.53: 4727-4735 (1993); Mattern et al, Brit. J. Câncer 73: 931-934 (1996); Dvorak"et al, Am. J. Pathol. 146: 1029-39 (1995).
Além disso, os níveis de concentração de VEGF em fluidos dosolhos são altamente correlacionados com a presença de proliferação ativa devasos sangüíneos em pacientes com retinopatias diabética e outras relativas àisquemia. Aiello et al, N. Engl. J. Med. 331: 1480-1487 (1994). Além disso,estudos demonstraram a localização de VEGF em membranas neovascularescoroidais em pacientes afetados por AMD. Lopez et al, Invest. Ophthalmol. Vis.Sci. 37: 855-68 (1996).
Os anticorpos neutralizadores anti-VEGF suprimem o crescimentode uma série de linhagens de células de tumores humanos em camundongosbrutos (Kim et al, Nature 362: 841-44 (1993); Warren et al, J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgstrõm et al, CancerRes. 56: 4032-4039 (1996); Melnyket al, Câncer Res. 56: 921-924 (1996)) e também inibem a angiogêneseintraocular em modelos de disfunções da retina isquêmicas (Adamis et al, Arch.Ophthalmol. 114: 66-71 (1996). Portanto, os anticorpos monoclonais anti-VEGFou outros inibidores da ação de VEGF são candidatos promissores para otratamento de tumores e diversas disfunções neovasculares intraoculares.Esses anticorpos são descritos, por exemplo, em EP 817.648 publicada emquatorze de janeiro de 1998; e em WO 98/45331 e WO 98/45332, ambaspublicadas em quinze de outubro de 1998. Um anticorpo anti-VEGF,bevacizumab, foi aprovado pela FDA para uso em combinação com regime dequimioterapia para o tratamento de câncer colo-retal metastático (CRC).Bevacizumab está sendo investigado em muitos testes clínicos em andamentopara o tratamento de várias indicações de câncer.
O ligante Efrina B2 ("Efrina B2" ou "Efrina B2") é membro dafamília de Iigantes de efrina, que constitui grande família de receptores detirosino quinase no genoma humano (analisado em Dodelet, Oncogene, 19:5614-5619, 2000). O Iigante de efrina humano tirosino quinase é classificadopor identidade de seqüências em classe A e classe B com receptores de tipo Ae tipo B correspondentes indicados como receptores de Eph ou Ephs. Asinalização pode ocorrer de maneira frontal, em que o receptor tirosino quinaseé ativado pelo Iigante e, de forma reversa, em que os Iigantes de efrina Btransmembrana são ativados por meio de interação com receptores. Interaçõesentre ligantes receptores de Eph foram implicadas em ampla série de funçõesbiológicas que incluem orientação de axons, formação de fronteiras de tecidos,vasculogênese e mobilidade celular (Kullander et al, Nat. Rev. MoL Cell. Biol.,3: 475-486, 2002; Cheng et al, Cytokine Growth Factor Rev., 13: 75-85, 2002;Coulthard et al, Int. J. Dev. Bioi, 46: 375-384, 2002).
Fica evidente que permanece a necessidade de agentes quepossuam atributos clínicos que sejam ideais para desenvolvimento comoagentes terapêuticos. A invenção descrita no presente atende a estanecessidade e fornece outros benefícios.
Todas as referências mencionadas no presente, incluindo pedidosde patentes e publicações, são integralmente incorporadas como referência.
Descrição Resumida da Invenção
A presente invenção é baseada em parte na identificação de umasérie de agentes de união de Efrina B2 (tais como anticorpos e seusfragmentos). Efrina B2 apresenta-se como importante e vantajoso alvoterapêutico e a presente invenção fornece composições e métodos com basena união de Efrina B2. Agentes de união de Efrina B2 de acordo com apresente invenção, conforme descrito no presente, fornecem importantesagentes terapêuticos e de diagnóstico para uso no direcionamento decondições patológicas associadas a expressão e/ou atividade dos processosde Iigantes de Efrina B2. Conseqüentemente, a presente invenção fornecemétodos, composições, kits e artigos industrializados relativos à união de EfrinaΒ2.
A presente invenção fornece anticorpos que se unem (porexemplo, unem-se especificamente) a Efrina B2.
Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpo anti-EfrinaB2 isolado, em que forma de IgG de comprimento total do anticorpo uneespecificamente Efrina B2 humana com afinidade de união de 30 pm ou mais.Como é bem estabelecido na técnica, a afinidade de união de Iigante ao seureceptor pode ser determinada utilizando qualquer dentre uma série de testes eexpressa em termos de uma série de valores quantitativos.
Conseqüentemente, em uma realização, a afinidade de união é expressa naforma de valores Kd e reflete a afinidade de união intrínseca (tal como comefeitos de avidez minimizados). Geral e preferencialmente, a afinidade de uniãoé medida in vitro, seja em ambiente livre de células ou associado a células.Qualquer dentre uma série de testes conhecidos na técnica, que incluem osdescritos no presente, pode ser utilizado para a obtenção de medidas deafinidade de união, que incluem, por exemplo, Biacore, radioimunoteste (RIA) eELISA.
Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpo isoladoque une a região de união de receptor de Eph (tal como EphBI, EphB2 e/ouEphB3) de Efrina B2.
Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpo isoladoque une polipeptídeo que compreende, consiste ou consiste essencialmente dodomínio extracelular de Efrina B2.
Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpo anti-EfrinaB2 isolado que concorre com receptor de Eph (tal como EphBI, EphB2,EphB3) pela união de Efrina B2.
Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpo anti-EfrinaB2 isolado que inibe, reduz e/ou bloqueia a atividade de Efrina B2. Em algumasrealizações, a autofosforilação de Efrina B2 é inibida, reduzida e/ou bloqueada.
Em um aspecto, anticorpo anti-Efrina B2 de acordo com apresente invenção compreende:
(a) pelo menos uma, duas, três, quatro ou cinco seqüências deregiões hipervariáveis (HVR) selecionadas a partir do grupo que consiste de:
(i) HVR-L1 que compreende seqüência A1-A11, em que A1-A11 é RASQDVSTAVA (SEQ ID N0 6);
(ii) HVR-L2 que compreende seqüência B1-B7, em que B1-B7é SASFLYS (SEQ ID N0 8);
(iii) HVR-L3 que compreende seqüência C1-C9, em que C1-C9é EQTDSTPPT (SEQ ID N0 12);
(iv) HVR-H1 que compreende seqüência D1-D10, em que D1-D10 é GFTVSSGWIH (SEQ ID N0 2);
(v) HVR-H2 que compreende seqüência E1-E18, em que E1-E18 é AVIFHNKGGTDYADSVKG (SEQ ID N0 4); e
(vi) HVR-H3 que compreende seqüência F1-F14, em que F1-F14 é ARTSAWAQLGAMDY (SEQ ID N0 5); e
(b) pelo menos uma variante HVR, em que a seqüênciavariante de HVR compreende modificação de pelo menos um resíduo daseqüência ilustrada em SEQ ID N0 1 a 12.
Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpo quecompreende uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs, em que cada HVRcompreende, consiste ou consiste essencialmente de seqüência selecionada apartir do grupo que consiste de SEQ ID N0 1 a 12, em que SEQ ID N0 6 ou 7corresponde a HVR-L1, SEQ ID N0 8 ou 9 corresponde a HVR-L2, SEQ ID N010, 11 ou 12 corresponde a HVR-L3, SEQ ID N0 1 ou 2 corresponde a HVR-H1,SEQ ID N0 3 ou 4 corresponde a HVR-H2 e SEQ ID N0 5 corresponde a HVR-H3.Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invençãocompreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em quecada um, nesta ordem, compreende SEQ ID N0 6, 8, 10, 1, 3 e 5.
Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invençãocompreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em quecada um, nesta ordem, compreende SEQ ID N0 7, 9, 11, 1, 3 e 5.
Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invençãocompreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em quecada um, nesta ordem, compreende SEQ ID N0 6, 8, 12, 2, 4 e 5.
HVRs variantes em anticorpo de acordo com a presente invençãopodem conter modificações de um ou mais (tais como dois, três, quatro, cincoou mais) resíduos na HVR.
Em uma realização, variante de HVR-L1 compreende de uma aquatro (uma, duas, três ou quatro) substituições em qualquer combinação dasposições a seguir: A7 (S ou D); A8 (T ou S); A9 (A ou S); e A10 (Vou L).
Em uma realização, variante de HVR-L2 compreende de uma atrês (uma, duas ou três) substituições em qualquer combinação das posições aseguir: B1 (S ou A); B4 (F ou N); e B6 (Y ou E).
Em uma realização, variante de HVR-L3 compreende de uma aseis (uma, duas, três, quatro, cinco ou seis) substituições em qualquercombinação das posições a seguir: C1 (Q ou E); C3 (S ou T); C4 (Y ou D); C5(T, D ou S); C6 (T ou N); e C8 (P ou F).
Em uma realização, variante de HVR-H1 compreende de uma aquatro (uma, duas, três ou quatro) substituições em qualquer combinação dasposições a seguir: D4 (I ou V); D5 (T ou S); D6 (G ou S); e D7 (S ou G).
Em uma realização, variante de HVR-H2 compreende de uma aquatro (uma, duas, três ou quatro) substituições em qualquer combinação dasposições a seguir: E4 (Y ou F); E5 (P ou H); E7 (N ou K); e E9 (A ou G).Em uma realização, variante de HVR-H3 compreende de uma aquatorze substituições nas posições a seguir: F1 (A); F2 (R); F3 (T); F4 (S); F5(A); F6 (W); F7 (A); F8 (Q); F9 (L); F10 (G); F11 (A); F12 (M); F13 (D) e F14 (Y).
A(s) letra(s) entre parênteses após cada posição indica(m)ilustração de aminoácido substituto (ou seja, de substituição); como seriaevidente para os técnicos no assunto, adequação de outros aminoácidos comoaminoácidos de substituição no contexto descrito no presente podem serdeterminados rotineiramente utilizando métodos conhecidos na técnica e/oudescritos no presente.
Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpo quecompreende região de HVR-H1 que compreende a seqüência de SEQ ID N°1ou 2. Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpo que compreenderegião de HVR-H2 que compreende a seqüência de SEQ ID N°3 ou 4. Em umaspecto, a presente invenção fornece anticorpo que compreende região deHVR-H3 que compreende a seqüência de SEQ ID N0 5. Em uma realização, apresente invenção fornece anticorpo que compreende região de HVR-L1 quecompreende a seqüência de SEQ ID N°6 ou 7. Em uma realização, a presenteinvenção fornece anticorpo que compreende região de HVR-L2 quecompreende a seqüência de SEQ ID N0 8 ou 9. Em uma realização, a presenteinvenção fornece anticorpo que compreende região de HVR-L3 quecompreende a seqüência de SEQ ID N0 10, 11 ou 12.
Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpo quecompreende pelo menos um, pelo menos dois ou todos os três dos seguintes:
(i) seqüência de HVR-H1 que compreende a seqüência deSEQ ID N0 2;
(ii) seqüência de HVR-H2 que compreende a seqüência deSEQ ID N0 4;(iii) seqüência de HVR-H3 que compreende a seqüência deSEQ ID N0 5.
Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpo quecompreende pelo menos um, pelo menos dois ou todos os três dos seguintes:
(i) seqüência de HVR-L1 que compreende a seqüência deSEQ ID N0 6;
(ii) seqüência de HVR-L2 que compreende a seqüência deSEQ ID N0 8;
(iii) seqüência de HVR-L3 que compreende a seqüência deSEQ ID N0 12.
As seqüências de aminoácidos de SEQ ID N0 1 a 12 sãonumeradas com relação a HVR individual (ou seja, H1, H2 ou H3) conformeindicado na Figura 1, em que a numeração é consistente com o sistema denumeração de Kabat conforme descrito abaixo.
Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpos quecompreendem seqüências de HVR de cadeia pesada conforme ilustrado naFigura 1.
Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpos quecompreendem seqüências de HVR de cadeia leve conforme ilustrado na Figura1.
Algumas realizações de anticorpos de acordo com a presenteinvenção compreendem domínio variável de cadeia leve de anticorpo 4D5humanizado (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South SanFrancisco CA, Estados Unidos) (também indicado na Patente Norte-Americanan° 6.407.213 and Lee et al, J. Mol. Bioi (2004), 340 (5): 1073-93) conformeilustrado em SEQ ID N0 13 abaixo.
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arq Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala TrpTyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe LeuTvr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr LeuThr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His TvrThr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID N013) (os resíduos de HVR encontram-se sublinhados).
Em uma realização, a seqüência de domínio variável de cadeialeve huMAb4D5-8 é modificada em uma ou mais das posições 30, 66 e 91(Asn, Arg e His conforme indicado em negrito/itálico acima, respectivamente).
Em uma realização, a seqüência de huMAb4D5-8 modificada compreende Serna posição 30, Gly na posição 66 e/ou Ser na posição 91. Conseqüentemente,em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreendedomínio variável de cadeia leve que compreende a seqüência ilustrada emSEQ ID N0 14 abaixo:
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arq Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala TrpTyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe LeuTyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr LeuThr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser TvrThr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID N014) (os resíduos de HVR encontram-se sublinhados).
Resíduos substitutos com relação a huMAb4D5-8 são indicadosem negrito/itálico acima.
Os anticorpos de acordo com a presente invenção compreendemqualquer seqüência de domínio variável com estrutura apropriada, desde que aatividade de união a Efrina B2 seja substancialmente retida. Em algumasrealizações, por exemplo, os anticorpos de acordo com a presente invençãocompreendem seqüência de consenso de estrutura de cadeia pesada desubgrupo Ill humano. Em uma realização desses anticorpos, a seqüência deconsenso de estrutura compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Emalgumas realizações destes anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A.Em uma realização, estes anticorpos compreendem seqüências de estrutura dedomínio variável de cadeia pesada de huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®,Genentech1 Inc., South San Francisco CA, Estados Unidos) (também indicadonas Patentes Norte-Americanas n° 6.407.213 e 5.821.337 e Lee et al, J. Mol.Biol. (2004), 340 (5): 1073-93). Em uma realização, estes anticorposcompreendem adicionalmente seqüência de consenso de estrutura de cadeialeve β1 humana. Em uma realização, estes anticorpos compreendemseqüências de HVR de cadeia leve de huMAb4D5-8, conforme descrito nasPatentes Norte-Americanas n° 6.407.213 e 5.821.337). Em uma realização,estes anticorpos compreendem seqüências de domínio variável de cadeia levede huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA,Estados Unidos) (também indicadas nas Patentes Norte-Americanas n°6.407.213 e 5.821.337 e Lee et al, J. Mol. Biol. (2004), 340 (5): 1073-93).
Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invençãocompreende domínio variável de cadeia pesada, em que a seqüência deestrutura compreende a seqüência de SEQ ID N0 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, e/ou 37 e seqüências de HVR H1, H2 eH3 são SEQ ID N0 2, 4 e/ou 5, respectivamente. Em uma realização, anticorpode acordo com a presente invenção compreende domínio variável de cadeialeve, em que a seqüência de estrutura compreende a seqüência de SEQ ID N038, 39, 40 e/ou 41 e as seqüências de HVR L1, L2 e L3 são SEQ ID N0 6, 8e/ou 12, respectivamente.
Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invençãocompreende domínio variável de cadeia pesada, em que a seqüência deestrutura compreende a seqüência de SEQ ID N0 42, 43, 44 e/ou 45 e asseqüências de HVR H1, H2 e H3 são SEQ ID N0 1, 3 e/ou 5, respectivamente.Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreendedomínio variável de cadeia leve, em que a seqüência de estrutura compreendea seqüência de SEQ ID N0 15, 16, 17 e/ou 18 e as seqüências de HVR L1, L2 eL3 são SEQ ID N0 6, 8 e/ou 10, respectivamente.
Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invençãocompreende domínio variável de cadeia pesada, em que a seqüência deestrutura compreende as seqüências de SEQ ID N0 42, 43, 47 e/ou 45 e asseqüências de HVR H1, H2 e H3 são SEQ ID N0 1, 3 e/ou 5, respectivamente.Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreendedomínio variável de cadeia leve, em que a seqüência de estrutura compreendeas seqüências de SEQ ID N0 15, 16, 47 e/ou 18 e as seqüências de HVR L1,L2 e L3 são SEQ ID N0 7, 9 e/ou 11, respectivamente.
Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invençãoé amadurecido por afinidade para obter a afinidade de união de alvo desejada.Em um exemplo, anticorpo amadurecido por afinidade de acordo com apresente invenção compreende substituição em uma ou mais das posições deaminoácidos H29, H30, H31, H32, H52, H52a, H54, H56, L30, L31, L32, L33,L50, L53, L55, L89, L91, L92, L93, L94 e L96. Em um exemplo, anticorpoamadurecido por afinidade de acordo com a presente invenção compreendeuma ou mais das substituições a seguir: (a) na cadeia pesada, V29I, S30T,S31G, G32S, F52Y, H52aP, K54N e G56A, ou (b) na cadeia leve, S30D, T31S,A32S, V33L, S50A, F53N, Y55E, E89Q, T91S, D92Y, S93D ou Τ, T94N eP96F.
Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invençãocompreende domínio variável de cadeia pesada que compreende a seqüênciade SEQ ID N°49. Em uma realização, anticorpo de acordo com a presenteinvenção compreende domínio variável de cadeia leve que compreende aseqüência de SEQ ID N°48. Em uma realização, anticorpo de acordo com apresente invenção compreende domínio variável de cadeia pesada quecompreende a seqüência de SEQ ID N0 49 e domínio variável de cadeia leveque compreende a seqüência de SEQ ID N0 48.
Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invençãocompreende domínio variável de cadeia pesada que compreende a seqüênciade SEQ ID N°51. Em uma realização, anticorpo de acordo com a presenteinvenção compreende domínio variável de cadeia leve que compreende aseqüência de SEQ ID N°50. Em uma realização, anticorpo de acordo com apresente invenção compreende domínio variável de cadeia pesada quecompreende a seqüência de SEQ ID N0 51 e domínio variável de cadeia leveque compreende a seqüência de SEQ ID N0 50.
Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invençãocompreende domínio variável de cadeia pesada que compreende a seqüênciade SEQ ID N°53. Em uma realização, anticorpo de acordo com a presenteinvenção compreende domínio variável de cadeia leve que compreende aseqüência de SEQ ID N°52. Em uma realização, anticorpo de acordo com apresente invenção compreende domínio variável de cadeia pesada quecompreende a seqüência de SEQ ID N0 53 e domínio variável de cadeia leveque compreende a seqüência de SEQ ID N0 52.
Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpo queconcorre com qualquer dos anticorpos mencionados acima para união a EfrinaB2. Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpo que se une aepítopo idêntico ou similar sobre Efrina 2 de qualquer dos anticorposmencionados acima.
Como é conhecido na técnica e conforme descrito em maisdetalhes abaixo, a fronteira/posição de aminoácido que delineia regiãohipervariável de anticorpo pode variar, dependendo do contexto e das diversasdefinições conhecidas na técnica (conforme descrito abaixo). Algumasposições dentro de domínio variável podem ser observadas como posiçõeshipervariáveis híbridas, pelo fato de que estas posições podem serconsideradas como estando dentro de região hipervariável sob um conjunto decritérios enquanto são consideradas fora de região hipervariável sob conjuntode critérios diferente. Uma ou mais destas posições podem também serencontradas em regiões hipervariáveis estendidas (conforme definidoadicionalmente abaixo).
Em algumas realizações, o anticorpo é anticorpo monoclonal. Emalgumas realizações, o anticorpo é anticorpo policlonal. Em algumasrealizações, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste deanticorpo quimérico, anticorpo amadurecido por afinidade, anticorpohumanizado e anticorpo humano. Em algumas realizações, o anticorpo éfragmento de anticorpo. Em algumas realizações, o anticorpo é Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 ou scFv.
Em uma realização, o anticorpo é anticorpo quimérico, tal comoanticorpo que compreende seqüências de união de antígenos de doador nãohumano enxertadas a uma seqüência não humana, humana ou humanizadaheteróloga (por exemplo, seqüências de domínio constante e/ou estrutura). Emuma realização, o doador não humano é camundongo. Em uma realização,uma seqüência de união de antígenos é sintética, obtida, por exemplo, pormeio de mutagênese (tal como seleção de exibição de fagos etc.). Em umarealização, anticorpo quimérico de acordo com a presente invenção contémregiões V murinas e região C humana. Em uma realização, a região V decadeia leve murina é fundida a cadeia leve capa humana. Em uma realização,a região V de cadeia pesada murina é fundida a região IgGI C humana.
Anticorpos humanizados de acordo com a presente invençãoincluem aqueles que contêm substituições de aminoácidos na FR e variantesde amadurecimento por afinidade com alterações nas CDRs enxertadas. Osaminoácidos substituídos na CDR ou FR não se limitam aos presentes noanticorpo receptor ou doador. Em outras realizações, os anticorpos de acordocom a presente invenção compreendem adicionalmente mudanças emresíduos de aminoácidos na região Fc que geram função efetora aprimorada,incluindo maior função CDC e/ou ADCC e morte de células B. Outrosanticorpos de acordo com a presente invenção incluem aqueles que possuemmudanças específicas que aumentam a estabilidade. Em outras realizações, osanticorpos de acordo com a presente invenção compreendem alterações emresíduos de aminoácidos na região Fc que geram redução da função efetora,tal como redução da função CDC e/ou ADCC e/ou redução da morte de célulasB. Em algumas realizações, os anticorpos de acordo com a presente invençãosão carcterizados por redução da união (tal como ausência de união) a fator decomplemento humano C1q e/ou receptor Fc humano em células matadorasnaturais (NK). Em algumas realizações, os anticorpos de acordo com apresente invenção são carcterizados por redução da união (tal como ausênciade união) a FcyRI1 FcyRIIA e/ou FcyRIIIA. Em algumas realizações, osanticorpos de acordo com a presente invenção são da classe IgG (tal comoIgGI ou lgG4) e compreendem pelo menos uma mutação em E233, L234,G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 e/ou P329(numeração de acordo com o índice EU). Em algumas realizações, osanticorpos compreendem a mutação L234A/L235A ou D265A/N297A.
Em um aspecto, a presente invenção fornece polipeptídeos anti-Efrina B2 que compreendem qualquer das seqüências de união de antígenosfornecidas no presente, em que os polipeptídeos anti-Efrina B2 unem-seespecificamente a Efrina B2.
Os anticorpos de acordo bom a presente invenção unem (porexemplo, unem especificamente) Efrina B2 e, em algumas realizações, podemmodular um ou mais aspectos de efeitos associados a Efrina B2, que incluem,mas sem limitar-se a ativação de Efrina B2, sinalização molecular abaixo nofluxo de Efrina B2, ativação de receptor de Eph de união a Efrina B2 (tal comoEphBI, EphB2 e/ou EphB3), sinalização molecular abaixo no fluxo de receptorde Eph de união a Efrina B2 (tal como EphBI1 EphB2 e/ou EphB3), ruptura dereceptor de Eph de união a Efrina B2 (tal como EphBI, EphB2 e/ou EphB3)que se une a Efrina B2, fosforilação de Efrina B2 e/ou multimerização de EfrinaB2 e/ou fosforilação de receptores de Eph de união a Efrina B2 e/ou ruptura dequalquer processo biológico de receptor de Eph de união a Efrina B2 e/ouEfrina B2 (tal como EphBI1 EphB2 e/ou EphB3) biologicamente relevante e/outratamento e/ou prevenção de tumor, disfunção proliferativa celular ou câncere/ou tratamento ou prevenção de disfunção associada à atividade e/ouexpressão de Efrina B2 (tal como aumento da atividade e/ou expressão deEfrina B2). Em algumas realizações, o anticorpo de acordo com a presenteinvenção une-se especificamente a Efrina B2. Em algumas realizações, oanticorpo une-se especificamente ao domínio extracelular (ECD) de Efrina B2.Em algumas realizações, o anticorpo une-se especificamente a polipeptídeoque consiste ou consiste essencialmente de domínio extracelular de Efrina B2.Em algumas realizações, o anticorpo une especificamente Efrina B2 com Kd de30 pm ou mais. Em algumas realizações, o anticorpo de acordo com a presenteinvenção reduz, inibe e/ou bloqueia a atividade de Efrina B2 in vivo e/ou invitro. Em algumas realizações, o anticorpo reduz, inibe é/ou bloqueia aautofosforilação de Efrina B2. Em algumas realizações, o anticorpo concorrepor união (reduz e/ou bloqueia) com receptor de Eph de união a Efrina B2 (talcomo EphBI, EphB2 e/ou EphB3).
Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de anticorpode acordo com a presente invenção na preparação de medicamento para otratamento terapêutico e/ou profilático de disfunção, tal como câncer, tumore/ou disfunção proliferativa celular. Em algumas realizações, a disfunção éneuropatia ou doença neurodegenerativa.
Em um aspecto, a presente invenção fornece composições quecompreendem um ou mais anticorpos de acordo com a presente invenção e umveículo. Em uma realização, o veículo é farmaceuticamente aceitável.
Em um aspecto, a presente invenção fornece ácidos nucleicosque codificam anticorpo anti-Efrina B2 de acordo com a presente invenção.
Em um aspecto, a presente invenção fornece vetores quecompreendem ácido nucleico de acordo com a presente invenção.
Em um aspecto, a presente invenção fornece composições quecompreendem um ou mais ácidos nucleicos de acordo com a presenteinvenção e um veículo. Em uma realização, o veículo é farmaceuticamenteaceitável.
Em um aspecto, a presente invenção fornece células hospedeirasque compreendem ácido nucleico ou vetor de acordo com a presente invenção.
Vetor pode ser de qualquer tipo, tal como vetor recombinante, como vetor deexpressão. Pode-se utilizar qualquer dentre uma série de células hospedeiras.
Em uma realização, célula hospedeira é célula procariótica, tal como E. coli.
Em uma realização, uma célula hospedeira é célula eucariótica, tal como célulade mamífero como célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO).
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos deelaboração de anticorpo de acordo com a presente invenção. A presenteinvenção fornece, por exemplo, método de elaboração de anticorpo anti-EfrinaB2 (que, conforme definido no presente, inclui comprimento total e seusfragmentos), em que o mencionado método compreende a expressão emcélula hospedeira apropriada de vetor recombinante de acordo com a presenteinvenção que codifica o mencionado anticorpo (ou seu fragmento) erecuperação do mencionado anticorpo.
Em um aspecto, a presente invenção fornece artigosindustrializados que compreendem recipiente e composição contida no interiordo recipiente, em que a composição compreende um ou mais anticorpos anti-Efrina B2 de acordo com a presente invenção. Em uma realização, acomposição compreende ácido nucleico de acordo com a presente invenção.Em uma realização, composição que compreende anticorpo compreende aindaveículo que, em algumas realizações, é farmaceuticamente aceitável. Em umarealização, artigo industrializado de acordo com a presente invençãocompreende adicionalmente instruções de administração da composição (talcomo para o anticorpo) a paciente (tais como instruções para quaisquer dosmétodos descritos no presente).
Em um aspecto, a presente invenção fornece kit que compreendeprimeiro recipiente que compreende composição que compreende um ou maisanticorpos anti-Efrina B2 de acordo com a presente invenção; e segundorecipiente que compreende tampão. Em uma realização, o tampão éfarmaceuticamente aceitável. Em uma realização, composição quecompreende anticorpo compreende ainda veículo que, em algumasrealizações, é farmaceuticamente aceitável. Em uma realização, kitcompreende adicionalmente instruções de administração da composição (talcomo o anticorpo) a paciente.
Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de anticorpoanti-Efrina B2 de acordo com a presente invenção na preparação demedicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de disfunção, talcomo câncer, tumor e/ou disfunção proliferativa celular. Em algumasrealizações, a disfunção é neuropatia ou doença neurodegenerativa. Emrealização preferida, a disfunção é condição patológica associada àangiogênese.
Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de anticorpode acordo com a presente invenção na preparação de medicamento parainibição da angiogênese.
Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de ácidonucleico de acordo com a presente invenção na preparação de medicamentopara o tratamento terapêutico e/ou profilático de disfunção, tal como câncer,tumor e/ou disfunção proliferativa celular. Em algumas realizações, a disfunçãoé neuropatia ou doença neurodegenerativa. Em realização preferida, adisfunção é condição patológica associada à angiogênese.
Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de vetor deexpressão de acordo com a presente invenção na preparação de medicamentopara o tratamento terapêutico e/ou profilático de disfunção, tal como câncer,tumor e/ou disfunção proliferativa celular. Em algumas realizações, a disfunçãoé neuropatia ou doença neurodegenerativa. Em realização preferida, adisfunção é condição patológica associada à angiogênese.
Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de célulahospedeira de acordo com a presente invenção na preparação demedicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de disfunção, talcomo câncer, tumor e/ou disfunção proliferativa celular. Em algumasrealizações, a disfunção é neuropatia ou doença neurodegenerativa. Emrealização preferida, a disfunção é condição patológica associada àangiogênese.
Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de artigoindustrializado de acordo com a presente invenção na preparação demedicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de disfunção, talcomo câncer, tumor e/ou disfunção proliferativa celular. Em algumasrealizações, a disfunção é neuropatia ou doença neurodegenerativa.
Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de kit deacordo com a presente invenção na preparação de medicamento para otratamento terapêutico e/ou profilático de disfunção, tal como câncer, tumore/ou disfunção proliferativa celular. Em algumas realizações, a disfunção éneuropatia ou doença neurodegenerativa. Em realização preferida, a disfunçãoé condição patológica associada à angiogênese.
A presente invenção fornece métodos e composições úteis para amodulação de estados doentios associados à expressão e/ou atividade deEfrina B2, tais como aumento ou redução da expressão e/ou atividade ouexpressão e/ou atividade indesejada.
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos detratamento ou prevenção de tumor, câncer e/ou doença proliferativa celularassociada ao aumento da expressão e/ou atividade de Efrina B2, em que osmétodos compreendem a administração de quantidade eficaz de anticorpo anti-Efrina B2 a paciente necessitado desse tratamento.
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para matarcélula (tal como célula de câncer ou tumor), em que os métodos compreendema administração de quantidade eficaz de anticorpo anti-Efrina B2 a pacientenecessitado desse tratamento.
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos deredução, inibição, bloqueio ou prevenção do crescimento de tumor ou câncer,em que os métodos compreendem a administração de quantidade eficaz deanticorpo anti-Efrina B2 a paciente necessitado desse tratamento.
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos detratamento ou prevenção de neuropatia ou doença neurodegenerativa, oureparo de célula nervosa Iesionada1 em que os métodos compreendem aadministração de quantidade eficaz de anticorpo anti-Efrina B2 a pacientenecessitado desse tratamento.
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos depromoção do desenvolvimento, proliferação, manutenção ou regeneração deneurônios, em que os métodos compreendem a administração de quantidadeeficaz de anticorpo anti-Efrina B2 a paciente necessitado desse tratamento.
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de inibiçãoda angiogênese que compreendem a administração de quantidade eficaz deanticorpo anti-Efrina B2 a paciente necessitado desse tratamento. Em algumasrealizações, o local da angiogênese é tumor ou câncer.
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos detratamento de condição patológica associada à angiogênese quecompreendem a administração de quantidade eficaz de anticorpo anti-Efrina B2a paciente necessitado desse tratamento. Em algumas realizações, a condiçãopatológica associada à angiogênese é tumor, câncer e/ou disfunçãoproliferativa celular. Em algumas realizações, a condição patológica associadaà angiogênese é doença neovascular intraocular.
Os métodos de acordo com a presente invenção podem serutilizados para afetar qualquer estado patológico apropriado. Exemplos dedisfunções são descritos no presente e incluem câncer selecionado a partir dogrupo que consiste de câncer do pulmão de células pequenas,neuroblastomas, melanoma, carcinoma dos seios, câncer gástrico, câncer colo-retal (CRC) e carcinoma hepatocelular.
Em uma realização, uma célula que é direcionada em método deacordo com a presente invenção é célula cancerosa. Célula cancerosa podeser, por exemplo, selecionada a partir do grupo que consiste de célula decâncer de mama, célula de câncer colo-retal, célula de câncer do pulmão,célula de carcinoma papilar, célula de câncer do cólon, célula de câncerpancreático, célula de câncer do ovário, célula de câncer da cervical, célula decâncer do sistema nervoso central, célula de sarcoma osteogênico, célula decarcinoma renal, célula de carcinoma hepatocelular, célula de câncer dabexiga, célula de carcinoma gástrico, célula de carcinoma escamoso da cabeçae do pescoço, célula de melanoma, célula de leucemia e célula de adenoma docólon. Em uma realização, célula alvo em método de acordo com a presenteinvenção é célula hiperproliferativa e/ou hiperplástica. Em uma realização,célula alvo em método de acordo com a presente invenção é célula displástica.
Em ainda outra realização, célula alvo em método de acordo com a presenteinvenção é célula metastática.
Os métodos de acordo com a presente invenção podem tambémcompreender etapas de tratamento adicionais. Em uma realização, porexemplo, método compreende adicionalmente uma etapa em que célula e/outecido direcionado (tal como célula cancerosa) é exposto a tratamento porradiação ou agente quimioterapêutico.
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos quecompreendem a administração de quantidade eficaz de anticorpo anti-Efrina B2em combinação com quantidade eficaz de outro agente terapêutico (tal comoagente antiangiogênese). Anticorpo(s) anti-Efrina B2 é (são) utilizado(s), porexemplo, em combinações com agente anticancerígeno ou agenteantiangiogênico para o tratamento de diversas condições neoplásticas e nãoneoplásticas. Em uma realização, a condição neoplástica ou não neoplástica écondição patológica associada a angiogênese. Em algumas realizações, ooutro agente terapêutico é agente antiangiogênico, agente antineoplástico e/ouagente quimioterapêutico.
O anticorpo anti-Efrina B2 pode ser administrado em série ou èmcombinação com o outro agente terapêutico que é eficaz para estes propósitos,seja na mesma composição ou na forma de composições separadas. Aadministração do anticorpo anti-Efrina B2 e do outro agente terapêutico (talcomo agente anticancerígeno, agente antiangiogênico) pode ser realizadasimultaneamente, tal como na forma de composição isolada ou como duas oumais composições distintas, utilizando a mesma via de administração oudiferentes. Alternativa ou adicionalmente, a administração pode ser realizadaseqüencialmente, em qualquer ordem. Alternativa ou adicionalmente, as etapaspodem ser realizadas na forma de combinação de ambos, seqüencial esimultaneamente, em qualquer ordem. Em certas realizações, intervalos quevariam de minutos até dias, semanas ou meses, podem estar presentes entreas administrações das duas ou mais composições. O agente anticancerígenopode ser administrado, por exemplo, em primeiro lugar, seguido pelo anticorpoanti-Efrina B2. Entretanto, a administração simultânea ou a administração doanticorpo anti-Efrina B2 em primeiro lugar também é contemplada.Conseqüentemente, em um aspecto, a presente invenção fornece métodos quecompreendem a administração de quantidade eficaz de anticorpo anti-EfrinaB2, seguida pela administração de agente antiangiogênico (tal como anticorpoanti-VEGF, como bevacizumab). Em certas realizações, intervalos que variamde minutos até dias, semanas ou meses pode m estar presentes entre asadministrações das duas ou mais composições.
Em certos aspectos, a presente invenção fornece método detratamento de disfunção (tal como tumor, câncer e/ou disfunção proliferativacelular) por meio da administração de quantidades eficazes de anticorpo anti-Efrina B2 e/ou inibidor(es) da angiogênese e um ou mais agentesquimioterapêuticos. Uma série de agentes quimioterapêuticos pode serutilizada nos métodos de tratamento combinados de acordo com a presenteinvenção. Exemplo e lista não limitadora de agentes quimioterapêuticoscontemplados são fornecidos no presente em "Definições". A administração doanticorpo anti-Efrina B2 e do outro agente terapêutico pode ser realizadasimultaneamente, tal como na forma de composição isolada ou como duas oumais composições distintas, utilizando a mesma via de administração oudiferentes. Alternativa ou adicionalmente, a administração pode ser realizadaseqüencialmente, em qualquer ordem. Alternativa ou adicionalmente, as etapaspodem ser realizadas na forma de combinação de ambos, seqüencial esimultaneamente, em qualquer ordem. Em certas realizações, intervalos quevariam de minutos até dias, semanas ou meses podem estar presentes entreas administrações das duas ou mais composições. O agente quimioterapêuticopode ser administrado, por exemplo, em primeiro lugar, seguido pelo anticorpoanti-Efrina B2. Entretanto, a administração simultânea ou a administração doanticorpo anti-Efrina B2 em primeiro lugar também é contemplada.
Conseqüentemente, em um aspecto, a presente invenção fornece métodos quecompreendem a administração de anticorpo anti-Efrina B2, seguida pelaadministração de agente quimioterapêutico. Em certas realizações, intervalosque variam de minutos até dias, semanas ou meses podem estar presentesentre as administrações das duas ou mais composições.
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos deaumento da eficácia de agente antiangiogênico em paciente que possuicondição patológica associada à angiogênese, que compreende aadministração ao paciente de quantidade eficaz de anticorpo anti-Efrina B2 emcombinação com o agente antiangiogênico, de forma a aumentar a atividadeinibidora do mencionado agente antiangiogênico.
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos ecomposições para inibição ou prevenção de reincidência do crescimento detumores ou reincidência do crescimento de células cancerosas. Reincidênciado crescimento de tumores ou reincidência do crescimento de célulascancerosas é utilizada para descrever condição em que os pacientes quesofrem ou são tratados com uma ou mais terapias atualmente disponíveis (taiscomo terapias contra o câncer, como quimioterapia, terapia de radiação,cirurgia, terapia hormonal e/ou terapia biológica/imunoterapia, terapia comanticorpos anti-VEGF, particularmente regime terapêutico padrão para o câncerespecífico) não é clinicamente adequada para o tratamento dos pacientes ouos pacientes não estão mais recebendo nenhum efeito benéfico da terapia, deforma que essees pacientes necessitam de terapia eficaz adicional.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos dedetecção de Efrina B2, em que os métodos compreendem a detecção decomplexo de anticorpo anti-Efrina B2 e Efrina B2 na amostra. O termo"detecção", da forma utilizada no presente, inclui detecção qualitativa e/ouquantitativa (níveis de medição) com ou sem referência a controle.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos dediagnóstico de disfunção associada à expressão e/ou atividade de Efrina B2,em que os métodos compreendem a detecção de complexo de anticorpo anti-Efrina B2 e Efrina B2 em amostra biológica de paciente que possui ou ésuspeito de possuir a disfunção. Em algumas realizações, a expressão deEfrina B2 é o aumento da expressão ou expressão anormal. Em algumasrealizações, a disfunção é tumor, câncer e/ou disfunção proliferativa celular.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece qualquer dosanticorpos anti-Efrina B2 descritos no presente, em que o anticorpo anti-EfrinaB2 compreende marca detectável.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece complexo dequalquer dos anticorpos anti-Efrina B2 descritos no presente e Efrina B2. Emalgumas realizações, o complexo encontra-se in vivo ou in vitro. Em algumasrealizações, o complexo compreende célula de câncer. Em algumasrealizações, o anticorpo anti-Efrina B2 é marcado de forma detectável.
Breve Descrição das Figuras
FIGURA 1: seqüências de circuito de HVR de cadeia leve ecadeia pesada de anticorpos anti-Efrina B2. A Figura exibe as seqüências deHVR de cadeia pesada, H1, H2 e H3, e seqüências de HVR de cadeia leve, L1,L2 e L3. A numeração das seqüências é a seguinte: clone 31.19 (HVR-H1 éSEQ ID N0 1; HVR-H2 é SEQ ID N0 3; HVR-H3 é SEQ ID N0 5; HVR-L1 é SEQID N0 6; HVR-L2 é SEQ ID N0 8; HVR-L3 é SEQ ID N0 10); clone 31.19.1D8(HVR-H1 é SEQ ID N0 1; HVR-H2 é SEQ ID N0 3; HVR-H3 é SEQ ID N0 5;HVR-L1 é SEQ ID N0 7; HVR-L2 é SEQ ID N0 9; HVR-L3 é SEQ ID N0 11); eclone 31.19.2D3 (HVR-H1 é SEQ ID N0 2; HVR-H2 é SEQ ID N0 4; HVR-H3 éSEQ ID N0 5; HVR-L1 é SEQ ID N0 6; HVR-L2 é SEQ ID N0 8; HVR-L3 é SEQIDN0 12).
As posições de aminoácidos são numeradas de acordo com osistema de numeração de Kabat1 conforme descrito abaixo.
As Figuras 2A, 2B e 3 ilustram exemplos de seqüências deestrutura de consenso humana receptoras para uso na prática da presenteinvenção com identificadores de seqüências conforme segue:
Estruturas de consenso pesado variável (VH) (Fiq. 2A, B)Estrutura de consenso de subgrupo I VH humano menos CDRsde Kabat (SEQ ID N0 19)
Estrutura de consenso de subgrupo I VH humano menos regiõeshipervariáveis estendidas (SEQ ID N0 20 a 22)
Estrutura de consenso de subgrupo Il VH humano menos CDRsde Kabat (SEQ ID N0 23)
Estrutura de consenso de subgrupo Il VH humano menos regiõeshipervariáveis estendidas (SEQ ID N0 24 a 26)
Estrutura de consenso de subgrupo Il VH humano menosestendida
Estrutura de consenso de subgrupo Ill VH humano menos CDRsde Kabat (SEQ ID N0 27)
Estrutura de consenso de subgrupo Ill VH humano menos regiõeshipervariáveis estendidas (SEQ ID N0 28 a 30)
Estrutura receptora de VH humano menos CDRs de Kabat (SEQID N0 31)
Estrutura receptora de VH humano menos regiões hipervariáveisestendidas (SEQ ID N0 32 e 33)
Estrutura 2 receptora de VH humano menos CDRs de Kabat(SEQ ID N0 34)
Estrutura 2 receptora de VH humano menos regiõeshipervariáveis estendidas (SEQ ID N0 35 a 37)
Estruturas de consenso leve variável (VL) (Fiq. 3)
Estrutura de consenso de subgrupo I capa VL humano (SEQ ID
Estrutura de consenso de subgrupo Il capa VL humano (SEQ ID
Estrutura de consenso de subgrupo Ill capa VL humano (SEQ ID
Estrutura de consenso de subgrupo IV capa VL humano (SEQ IDN0 41)
A FIGURA 4 ilustra seqüências de região de estrutura de cadeiasleve e pesada de huMAb4D5-8. Os números sublinhados/em negrito indicamposições de aminoácidos de acordo com Kabat.
A FIGURA 5 ilustra seqüências de região de estruturavariantes/modificadas de cadeias leve e pesada de huMAb4D5-8. Os númerossublinhados/em negrito indicam posições de aminoácidos de acordo comKabat.
A FIGURA 6 ilustra a região variável de cadeia leve (SEQ ID N048) e região variável de cadeia pesada (SEQ ID N0 49) de clone de anticorpomonoclonal anti-Efrina B2 31.19, a região variável de cadeia leve (SEQ ID N050) e região variável de cadeia pesada (SEQ ID N0 51) de clone de anticorpomonoclonal anti-Efrina B2 31.19.1D8 e a região variável de cadeia leve (SEQID N0 52) e a região variável de cadeia pesada (SEQ ID N0 53) de clone deanticorpo monoclonal anti-Efrina B2 31.19.2D.FIGURA 7: ilustra que o tratamento com anticorpo monoclonalanti-Efrina B2 bloqueou o a sinalização de Iigante de Efrina B2 receptor deEphB4 em teste com base em células.
FIGURA 8: ilustra que o tratamento com anticorpo monoclonalanti-Efrina B2 reduziu a angiogênese no teste de câmara de bolsa dorsal emratos.
FIGURA 9: ilustra que o tratamento com anticorpo anti-Efrina B2inibiu o crescimento de tumor in vivo.
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção fornece anticorpos anti-Efrina B2 que sãoúteis, por exemplo, para o tratamento ou prevenção de estados doentiosassociados à expressão e/ou atividade de Efrina B2, tais como o aumento daexpressão e/ou atividade ou expressão e/ou atividade indesejada. Em algumasrealizações, os anticorpos de acordo com a presente invenção são utilizadospara o tratamento de tumor, câncer e/ou disfunção proliferativa celular.
Em outro aspecto, os anticorpos anti-Efrina B2 de acordo com apresente invenção encontram utilidade como reagentes para detecção e/ouisolamento de Efrina B2, tal como detecção de Efrina B2 em vários tecidos etipos de célula.
A presente invenção fornece ainda métodos de elaboração deanticorpos anti-Efrina B2 e polinucleotídeos que codificam anticorpos anti-Efrina B2.
Métodos Gerais
Os métodos e procedimentos descritos ou indicados no presentegeralmente são bem compreendidos e comumente empregados utilizandometodologia convencional pelos técnicos no assunto, tais como asmetodologias de clonagem molecular amplamente utilizadas e descritas emSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, terceira edição(2001), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY. CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al, eds., (2003)); asérie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: APRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames e G. R. Taylor, eds.(1995)), Harlow e Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUALe ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)).
Definições
Anticorpo "isolado" é aquele que tenha sido identificado, separadoe/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Oscomponentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais queinterfeririam com utilizações em diagnóstico ou terapêuticas para o anticorpo epodem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou nãoproteináceos. Em realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) atémais de 95% em peso de anticorpo, conforme determinado por meio do métodode Lowry, e, de maior preferência, mais de 99% em peso; (2) até grausuficiente para a obtenção de pelo menos quinze resíduos de seqüência deaminoácidos interna ou N-terminal, utilizando seqüenciador de xícara decentrifugação; ou (3) até a homogeneidade, por meio de SDS-PAGE, sobcondições redutoras ou não redutoras, utilizando azul de Coomassie ou,preferencialmente, manchas de prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo insitu em células recombinantes, desde que pelo menos um componente doambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, entretanto, oanticorpo isolado será preparado por meio de pelo menos uma etapa depurificação.
Molécula de ácido nucleico "isolada" é molécula de ácido nucleicoque é identificada e separada a partir de pelo menos uma molécula de ácidonucleico contaminante com a qual é normalmente associada na fonte naturaldo ácido nucleico do anticorpo. Molécula de ácido nucleico isolada é diferenteda forma ou ambiente em que é encontrada na natureza. As moléculas deácido nucleico isoladas são diferenciadas, portanto, da molécula de ácidonucleico que existe em células naturais. Entretanto, molécula de ácido nucleicoisolada inclui molécula de ácido nucleico contida em células que normalmenteexpressam o anticorpo em que, por exemplo, a molécula de ácido nucleicoencontra-se em local cromossômico diferente daquele de células naturais.
A expressão "numeração de resíduos de domínio variável comoem Kabat" ou "numeração de posição de aminoácidos como em Kabat" e suasvariações designa o sistema de numeração utilizado para domínios variáveisde cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação deanticorpos em Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest,quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD(1991). Utilizando este sistema de numeração, a seqüência de aminoácidoslinear real pode conter menos aminoácidos ou adicionais correspondentes àredução ou inserção em FR ou CDR do domínio variável. Domínio variável decadeia pesada pode incluir, por exemplo, um único inserto de aminoácido(resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduosinseridos (tais como resíduos 82a, 82b, 82c etc. de acordo com Kabat) após oresíduo de FR de cadeia pesada 82. A numeração de resíduos de Kabat podeser determinada para um dado anticorpo por meio de alinhamento em regiõesde homologia da seqüência do anticorpo com seqüência numerada de Kabat"padrão".
A expressão "substancialmente similar" ou "substancialmenteidêntico", da forma utilizada no presente, indica grau suficientemente alto desimilaridade entre dois valores numéricos (geralmente um associado aanticorpo de acordo com a presente invenção e o outro associado a anticorpode referência/comparativo), de tal forma que os técnicos no assuntoconsiderariam a diferença entre os dois valores como sendo de pouco ounenhum significado biológico e/ou estatístico dentro do contexto dacaracterística biológica medida pelos mencionados valores (tais como valoresKd). A diferença entre os mencionados dois valores é preferencialmente demenos de cerca de 50%, preferencialmente menos de cerca de 40%,preferencialmente menos de cerca de 30%, preferencialmente menos de cercade 20%, preferencialmente menos de cerca de 10% em função do valor para oanticorpo comparativo/de referência.
"Afinidade de união" geralmente designa a resistência da somatotal de interações não covalentes entre um único local de união de molécula(tal como anticorpo) e seu parceiro de união (tal como antígeno). A menos queindicado em contrário, da forma utilizada no presente, "afinidade de união"designa afinidade de união intrínseca que reflete interação 1:1 entre membrosde par de união (tais como anticorpo e antígeno). A afinidade de uma moléculaX para o seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante dedissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por meio de métodosconhecidos na técnica, que incluem os descritos no presente. Anticorpos debaixa afinidade geralmente unem antígeno lentamente e tendem a dissociar-serapidamente, enquanto anticorpos de alta afinidade geralmente unem antígenomais rapidamente e tendem a permanecer unidos por mais tempo. Uma sériede métodos de medição da afinidade de união é conhecida na técnica,qualquer dos quais pode ser utilizado para os propósitos da presente invenção.Realizações ilustrativas específicas são descritas a seguir.
Em uma realização, "Kd" ou "valor Kd" de acordo com a presenteinvenção é medido por meio de teste de união de antígenos radiomarcados(RIA) realizado com a versão Fab de anticorpo de interesse e o seu antígenoconforme descrito por meio do teste a seguir, que mede a afinidade de uniãode solução de Fabs para antígeno por meio de equilíbrio de Fab comconcentração mínima de antígeno marcado com 125I na presença de série detitulação de antígeno não marcado e captura em seguida de antígeno unidocom placa revestida com anticorpo anti-Fab (Chen et al (1999), J. Mol. Biol.293: 865-881). Para estabelecer condições para o teste, placas de microtítulos(Dynex) são revestidas por uma noite com 5 μg/ml de anticorpo anti-Fab decaptura (Cappel Labs) em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6) e bloqueadasem seguida com albumina de soro bovino a 2% (p/v) em PBS por duas a cincohoras à temperatura ambiente (cerca de 23 0C). Em placa não adsorvente(Nunc n° 269620), 100 pM ou 26 pM de [125l]-antígeno são misturados comdiluições em série de Fab de interesse (tal como consistente com adeterminação de anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et al (1997), CâncerRes. 57: 4593-4599). O Fab de interesse é incubado em seguida por umanoite; entretanto, a incubação pode prosseguir por período mais longo (talcomo 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja atingido. Em seguida, asmisturas são transferidas para a placa de captura para incubação àtemperatura ambiente (tal como por uma hora). A solução é removida emseguida e a placa é lavada por oito vezes com 0,1% Tween 20 em PBS. Após asecagem das placas, adiciona-se 150 μΙ/cavidade de cintilante (MicroScint-20;Packard) e as placas são contadas em contador gama Topcount (Packard) pordez minutos. Concentrações de cada Fab que geram 20% ou menos de uniãomáxima são selecionadas para uso em testes de união competitiva. De acordocom outra realização, o Kd ou valor Kd é medido utilizando testes deressonância de plasma de superfície utilizando BlAcore® 2000 ou BlAcore®3000 (BlAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 0C com lascas de antígeno CM5imobilizado a cerca de dez unidades de resposta (RU). Resumidamente, lascasde biossensores de dextran carboximetilado (CM5, BlAcore Inc.) são ativadascom cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor.
Antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, em 5 μg/ml (cercade 0,2 μΜ) antes da injeção em velocidade de fluxo de 5 μΙ/minuto para atingircerca de dez unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeçãode antígeno, 1 M de etanolamina é injetado para bloquear grupos não reagidos.Para medições cinéticas, diluições seriais em duas vezes de Fab (0,78 nM a500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) a 25 0C sobvelocidade de fluxo de cerca de 25 μΙ/min. Taxas de associação (kon) e taxasde dissociação (k0ff) são calculadas utilizando modelo de união Langmuir um aum simples (Software de Avaliação BIAcore versão 3.2) por meio deconfiguração simultânea do sensograma de associação e dissociação. Aconstante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como razão k0ff/kon·Vide, por exemplo, Chen, Y. et al (1999), J. MoL Biol. 293: 865-881. Caso ataxa de associação exceda 106 M"1 S"1 por meio do teste de ressonância deplasma de superfície acima, a taxa de associação pode ser determinada emseguida utilizando método de resfriamento fluorescente que mede o aumentoou a redução da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm;emissão = 340 nm, passagem de faixa de 16 nm) a 25 0C de 20 nM deanticorpo anti-antígeno (forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença deconcentrações crescentes de antígeno conforme medido em espectrômetro, talcomo espectrômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ouespectrofotômetro SLM-Aminco série 800 (ThermoSpectronic) com cubetavermelha de agitação.
"Taxa de associação", "taxa ligado" ou "kon" de acordo com apresente invenção pode também ser determinada com o mesmo método deressonância de plasma de superfície descrito acima utilizando BlAcore® 2000ou BlAcore® 3000 (BlAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 0C com lascas deantígeno CM5 imobilizado a cerca de dez unidades de resposta (RU).Resumidamente, lascas de biossensores de dextran carboximetilado (CM5,BlAcore Inc.) são ativadas com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) deacordo com as instruções do fornecedor. Antígeno é diluído com 10 mM deacetato de sódio, pH 4,8, em 5 μς/ιτιΙ (cerca de 0,2 μΜ) antes da injeção emvelocidade de fluxo de 5 μΙ/minuto para atingir cerca de dez unidades deresposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de antígeno, 1 M deetanolamina é injetado para bloquear grupos não reagidos. Para mediçõescinéticas, diluições seriais em duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) sãoinjetadas em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) a 25 0C sob velocidade defluxo de cerca de 25 μΙ/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação(k0ff) são calculadas utilizando modelo de união Langmuir um a um simples(Software de Avaliação BIAcore versão 3.2) por meio de configuraçãosimultânea do sensograma de associação e dissociação. A constante dedissociação de equilíbrio (Kd) foi calculada como razão k0ff/k0n· Vide, porexemplo, Chen, Y. et al (1999), J. Mol. Biol. 293: 865-881. Caso a taxa deassociação exceda 106 M1 S1 por meio do teste de ressonância de plasma desuperfície acima, a taxa de associação pode ser determinada em seguidautilizando método de resfriamento fluorescente que mede o aumento ou aredução da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm;emissão = 340 nm, passagem de faixa de 16 nm) a 25 0C de 20 nM deanticorpo anti-antígeno (forma de Fab) em PBS1 pH 7,2, na presença deconcentrações crescentes de antígeno conforme medido em espectrômetro, talcomo espectrômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ouespectrofotômetro SLM-Aminco série 800 (ThermoSpectronic) com cubetaagitada.
O termo "vetor", da forma utilizada no presente, destina-se adesignar molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleicoao qual tenha se ligado. Um tipo de vetor é "plasmídeo", que designa circuitode DNA de fita dupla circular no qual podem ser ligados segmentos de DNAadicionais. Outro tipo de vetor é vetor de fago. Outro tipo de vetor é vetor viral,em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral.
Certos vetores são capazes de reprodução autônoma em célula hospedeira naqual são introduzidos (tais como vetores bacterianos que possuem origembacteriana de reprodução e vetores de mamíferos epissomais). Outros vetores(tais como vetores de mamíferos não epissomais) podem ser integrados aogenoma de célula hospedeira mediante introdução na célula hospedeira e,portanto, são reproduzidos junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certosvetores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais são ligadosoperativamente. Esses vetores são denominados no presente "vetores deexpressão recombinante" (ou simplesmente "vetores recombinantes"). Deforma geral, os vetores de expressão úteis em métodos de DNA recombinantesencontram-se freqüentemente na forma de plasmídeos. No presente relatóriodescritivo, "plasmídeo" e "vetor" podem ser utilizados de forma intercambiável,pois o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente utilizada.
"Polinucleotídeo" ou "ácido nucleico", utilizados de formaintercambiável no presente, designam polímeros de nucleotídeos de qualquercomprimento e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem serdesoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificadase/ou seus análogos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado apolímero por DNA ou RNA polimerase, ou por reação sintética. Polinucleotídeopode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metiladose seus análogos. Caso presente, modificação da estrutura de nucleotídeospode ser proporcionada antes ou depois da montagem do polímero. Aseqüência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não denucleotídeos. Polinucleotídeo pode ser modificado adicionalmente após asíntese, tal como por meio de conjugação com marca. Outros tipos demodificações incluem, por exemplo, "tampas", substituição de um ou mais dosnucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificaçõesinternucleotídeos tais como aquelas com ligações não carregadas (porexemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos etc.)e com ligações carregadas (tais como fosforotioatos, fosforoditioatos etc.), asque contêm porções pendentes, tais como proteínas (por exemplo, nucleases,toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, pli-L-lisina etc.), aquelas comintercaladores (tais como acridina, psoralen etc.), as que contêm quelantes(tais como metais, metais radioativos, boro, metais oxidantes etc.), as quecontêm alquilantes, as com ligações modificadas (tais como ácidos nucleicosalfa anoméricos etc.), bem como formas não modificadas do(s)polinucleotídeo(s). Além disso, qualquer dos grupos hidroxila normalmentepresentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por gruposfosfonato, grupos fosfato, protegido por grupos protetores padrão ou ativadopara preparar ligações adicionais a nucleotídeos adicionais, ou pode serconjugado a suportes sólidos ou semi-sólidos. O OH 5' e 3' terminal pode serfosforilado ou substituído com aminas ou porções de grupo de tampa orgânicade um a vinte átomos de carbono. Outros hidroxilas podem também serderivados em grupos protetores padrão. Polinucleotídeos podem tambémconter formas análogas de açúcares de ribose ou desoxirribose que sãoconhecidos de forma geral na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-0-metil, 2'-0-alil, 2'-fluoro ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares alfa-anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose, xiloses ou lixoses,açúcares de piranose, açúcares de furanose, sedoheptuloses, análogosacíclicos e análogos de nucleotídeos abásicos tais como metil ribosídeo. Umaou mais ligações de fosfodiéster podem ser substituídas por grupos Iigantesalternativos. Estes grupos Iigantes alternativos incluem, mas sem limitar-se arealizações em que fosfato é substituído por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"),(O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO ou CH2 ("formacetal"), em que cada Rou R' é independentemente H ou alquila substituído ou não substituído (1 a 200C), que contém opcionalmente uma ligação éter (-0-), arila, alquenila,cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todas as ligações em umpolinucleotídeo necessitam ser idênticas. A descrição acima aplica-se a todosos polinucleotídeos indicados no presente, incluindo RNA e DNA.
"Oligonucleotídeo", da forma utilizada no presente, designa deforma geral polinucleotídeos curtos, geralmente de fita única, geralmentesintéticos, que possuem geralmente, mas não necessariamente, menos decerca de duzentos nucleotídeos de comprimento. Os termos "oligonucleotídeo"e "polinucleotídeo" não são mutuamente exclusivos. A descrição depolinucleotídeos acima é igual e totalmente aplicável a oligonucleotídeos.
"Percentual (%) de identidade de seqüência de aminoácidos", comrelação à seqüência de peptídeos ou polipeptídeos, é definido como opercentual de resíduos de aminoácidos em possível seqüência que sãoidênticos aos resíduos de aminoácidos na seqüência de peptídeo oupolipeptídeo específica, após o alinhamento das seqüências e introdução deintervalos, se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade deseqüências, sem considerar nenhuma substituição conservadora como parteda identidade de seqüências. O alinhamento para propósitos de determinaçãodo percentual de identidade de seqüências de aminoácidos pode ser atingidode várias formas que se encontram dentro do conhecimento da técnica,utilizando, por exemplo, software de computador disponível ao público, talcomo software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicosno assunto podem determinar parâmetros apropriados para medir oalinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir oalinhamento máximo ao longo do comprimento total das seqüências sendocomparadas. Para os propósitos do presente, entretanto, valores percentuaisde identidade de seqüência de aminoácidos são gerados utilizando o programade computador de comparação de seqüências ALIGN-2, em que o código fontecompleto para o programa ALIGN-2 é fornecido na Tabela A abaixo. Oprograma de computador de comparação de seqüências ALIGN-2 foi elaboradopela Genentech1 Inc. e o código fonte exibido na Tabela A abaixo foidepositado com documentação de usuário no Escritório Norte-Americano deDireitos Autorais, Washington DC 20559, Estados Unidos, onde foi registradocom o n° de Registro de Direitos Autorais Norte-Americano TXU510087. Oprograma ALIGN-2 é disponível ao público por meio da Genentech, Inc., SouthSan Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código fontefornecido na Tabela A abaixo. O programa ALIGN-2 deverá ser compilado parauso em sistema operativo UNIX, preferencialmente UNIX digital V4.0D. Todosos parâmetros de comparação de seqüências são estabelecidos pelo programaALIGN-2 e não variam.
Tabela A
<table>table see original document page 40</column></row><table>/* D 7 { 0, 3,-5, 4, 3,-6, 1, 1,-2, 0, 0,-4,-3, 2,_Μ,-1, 2,-1, 0, 0, 0,-2,-7, 0,-4, 2},
/* E 7 { 0, 2,-5, 3, 4,-5, 0, 1,-2, 0, 0,-3,-2, 1,_Μ,-1, 2,-1, 0, 0, 0,-2,-7, 0,-4, 3},
/* F 7 {-4,-5,-4,-6,-5, 9,-5,-2, 1, 0,-5, 2, 0,-4,_Μ,-5,-5,-4,-3,-3, 0,-1, 0, 0, 7,-5},
/* G 7 { 1, 0,-3, 1, 0,-5, 5,-2,-3, 0,-2,-4,-3, 0,_Μ,-1,-1,-3, 1, 0, 0,-1,-7, 0,-5, 0},
/* H 7 {-1, 1,-3, 1, 1,-2,-2, 6,-2, 0, 0,-2,-2, 2,_Μ, 0, 3, 2,-1,-1, 0,-2,-3, 0, 0, 2},
Γ I 7 {-1 ,-2,-2,-2,-2, 1 ,-3,-2, 5, 0,-2, 2, 2,-2,_Μ,-2,-2,-2,-1, 0, 0, 4,-5, 0,-1 ,-2},
/* J 7 { 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_Μ, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0},
/* K 7 {-1, 0,-5, 0, 0,-5,-2, 0,-2, 0, 5,-3, 0, 1,_Μ,-1, 1, 3, 0, 0, 0,-2,-3, 0,-4, 0},
/* L 7 {-2,-3,-6,-4,-3, 2,-4,-2, 2, 0,-3, 6, 4,-3,_Μ,-3,-2,-3,-3,-1, 0, 2,-2, 0,-1,-2},
10 /* M 7 {-1,-2,-5,-3,-2, 0,-3,-2, 2, 0, 0, 4, 6,-2,_Μ,-2,-1, 0,-2,-1, 0, 2,-4, 0,-2,-1},
/* N 7 { 0, 2,-4, 2, 1,-4, 0, 2,-2, 0, 1,-3,-2, 2,_Μ,-1, 1, 0, 1, 0, 0,-2,-4, 0,-2, 1},
/* O 7 {_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,0 ,_Μ ,_Μ, _Μ ,_Μ ,_Μ,_Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ},
/* P 7 {1 ,-1 ,-3,-1 ,-1 ,-5,-1, 0,-2, 0,-1 ,-3,-2,-1 ,_Μ, 6, 0, 0, 1, 0, 0,-1 ,-6, 0,-5, 0},
15 /* Q 7 { 0, 1 ,-5, 2, 2,-5,-1, 3,-2, 0, 1 ,-2,-1, 1 ,_Μ, 0, 4, 1 ,-1 ,-1, 0,-2,-5, 0,-4, 3},
/* R 7 {-2, 0,-4,-1,-1,-4,-3, 2,-2, 0, 3,-3, 0, 0,_Μ, 0, 1, 6, 0,-1, 0,-2, 2, 0,-4, 0},
/* S 7 {1,0,0, 0, 0,-3, 1 ,-1 ,-1, 0, 0,-3,-2, 1 ,_Μ, 1 ,-1,0,2,1, 0,-1 ,-2, 0,-3, 0},
/* T 7 { 1, 0,-2, 0, 0,-3, 0,-1, 0, 0, 0,-1 ,-1, 0,_Μ, 0,-1 ,-1,1, 3, 0, 0,-5, 0,-3, 0},
/* U 7 { 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_Μ, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0},
20 /* V 7 { 0,-2,-2,-2,-2,-1 ,-1 ,-2, 4, 0,-2, 2, 2,-2,_Μ,-1 ,-2,-2,-1, 0, 0, 4,-6, 0,-2,-2},
/tWV {-6,-5,-8,-7,-7, 0,-7,-3,-5, 0,-3,-2,-4,-4,_Μ,-6,-5, 2,-2,-5, 0,-6,17, 0, 0,-6},
/* X 7 { 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_Μ, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0},
Γ Y 7 {-3,-3, 0,-4,-4, 7,-5, 0,-1, 0,-4,-1 ,-2,-2,_Μ,-5,-4,-4,-3,-3, 0,-2, 0, 0,10,-4},
Γ Z 7 {0,1 ,-5, 2, 3,-5, 0, 2,-2, 0, 0,-2,-1, 1 ,_Μ, 0, 3, 0, 0, 0, 0,-2,-6, 0,-4, 4}25 };
/*7#include <stdio.h>#include <ctype.h>
#define#definethis 7#define#definejmp 7
MAXJMP 16 /* max jumps in a diag 7
MAXGAP 24 Γ don't continue to penalize gaps Iarger than
JMPS 1024 /* max jmps in an path 7
MX 4 /* save ifthere's at Ieast MX-1 bases since Iast
#define DMAT 3 /* value of matching bases 7#define DMIS 0 /* penalty for mismatched bases 7#define DINSO 8 /* penalty for a gap 7#define DINS1 1 /* penalty per base 7#define PINSO 8 /* penalty for a gap 7#define PINS1 4 /* penalty per residue 7
struct jmp {
short n[MAXJMP]; /* size of jmp (neg for dely) 7
unsigned short x[MAXJMP]; Γ base no. of jmp in seq χ 7}; /* Iimits seq to 2Λ16-1 7
struct diag {
int score;
Iong offset;
short ijmp;
struct jmp jp;
/* score at Iast jmp 7/* offset of prev block 7/* current jmp index 7/* Iist of jmps 7struct path {
int spc; /* number of leading spaces 7
short n[JMPS]; /* size of jmp (gap) 7
int x[JMPS]; /* Ioc of jmp (last elem before gap) 7
char *ofile; /* output file name 7 char *namex[2]; Γ seq names: getseqs() 7 char *prog; /* prog name for err msgs 7 char *seqx[2]; /* seqs: getseqs() 7 int dmax; /* best diag: nw() 7 int dmaxO; /* final diag 7 int dna; Γ set if dna: main() */ int endgaps; /* set if penalizing end int gapx, gapy; Γ total gaps in seqs */ int IenO1 Ien 1; /* seq Iens */ int ngapx, ngapy; Γ total size of gaps 7 int smax; /* max score: nw() 7 int *xbm; Γ bitmap for matching 7 Iong offset; /* current offset in jmp file 7 structdiag *dx; Γ holds diagonais 7 structpath PP[2]; /* holds path for seqs 7
char *calloc(), *malloc(), *index(), *strcpy();
char *getseq(), *g_calloc();/* Needleman-Wunsch alignment program
*
* usage: progs filei file2
* where filei and file2 are two dna or two protein sequences.
* The sequences can be in upper- or lower-case an may contain ambiguity
* Any Iines beginning with ';','>' or '<' are ignored
* Max file Iength is 65535 (limited by unsigned short χ in the jmp struct)
* A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA
* Output is in the file "align.out"
*
* The program may create a tmp file in /tmp to hold info about traceback.
* Original version developed under BSD 4.3 on a vax 8650*/
#include "nw.h"#include "day.h"
static _dbval[26] = {
1,14,2,13,0,0,4,11,0,0,12,0,3,15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0,10,0
};
static _pbval[26] = {
1, 2|(1 «('D'-'A'))|(1 <<('N'-'A')), 4, 8, 16, 32, 64,128, 256, OxFFFFFFF, 1«10, 1«11, 1«12, 1«13, 1«14,1 <<15, 1«16, 1«17, 1«18, 1«19, 1«20, 1«21, 1«22,1 <<23, 1 «24, 1 «25|(1 «(Έ'-Ά'))|(1 «(Ό'-'Α'))};
main(ac, av) main
int ac;
char *av[];
{
prog = av[0];
if (ac != 3) {
fprintf(stderr,"usage: %s filei file2\n", prog);fprintf(stderr,"where filei and file2 are two dna or two proteinsequencesAn");
fprintf(stderr,"The sequences can be in upper- or lower-case\n");fprintf(stderr,"Any Iines beginning with ';' or '<' are ignored\n");fprintf(stderr,"Output is in the file Valign.outVXn");exit(1);
namex[0] = av[1];namex[1] = av[2];
seqx[0] = getseq(namex[0], &lenO);seqx[1] = getseq(namex[1], &len1);xbm = (dna)? dbval: pbval;
endgaps = 0; /* 1 to penalize endgaps */ofile = "align.out"; /* output file */nw(); /* fill in the matrix, get the possible jmps */readjmps(); /* get the actual jmps */printQ; /* print stats, alignment */cleanup(O); /* unlink any tmp files */
}
/* do the alignment, return best score: main()
* dna: values in Fitch and Smith1 PNAS1 80, 1382-1386, 1983
* pro: PAM 250 values
* When scores are equal, we prefer mismatches to any gap, prefer
* a new gap to extending an ongoing gap, and prefer a gap in seqx
* to a gap in seq y.
nw() nw{
char
px, *py;
Γ seqs and ptrs 7
int
*ndely, *dely;/* keep track of dely 7ndelx, delx; /* keep track of delx 7
int
int
*tmp; /* for swapping rowO, rowl 7
int
int
mis; /* score for each type */
insO, ins1; /* insertion penalties 7
mis;
registerregisterregisterregister
*col0, *col1; /* score for curr, Iast row 7xx, yy; Γ index into seqs 7
id;
U;
/* diagonal index *//* jmp index */
dx = (struct diag *)g_calloc("to get diags", Ien0+len1+1, sizeof(struct
diag));ndely = (int *)g_calloc("to get ndely", Ien1+1, sizeof(int));dely = (int *)g_calloc("to get dely", Ien1+1, sizeof(int));colO = (int *)g_calloc("to get colO", Ien1+1, sizeof(int));col 1 = (int *)g_calloc("to get col1", Ien1+1, sizeof(int));insO = (dna)? DINSO : PINSO;ins1 = (dna)? DINS1 : PINS1;
smax = -10000;if (endgaps) {
for (col0[0] = dely[0] = -insO, yy = 1; yy <= Ien 1; yy++) {colOfyy] = dely[yy] = col0[yy-1] - ins1;ndely[yy] = yy;
}
col0[0] = 0; /* Waterman Bull Math Biol 84 */
}
else
for (yy = 1; yy <= Ien 1; yy++)dely[yy] = -insO;
/* fill in match matrix7
for (px = seqx[0], xx = 1; xx <= IenO; px++, xx++) {/* initialize first entry in col7
if (endgaps) {
if (xx == 1)
col1[0] = delx = -(ins0+ins1);else
col1[0] = delx = col0[0] - ins1;ndelx = xx;
}
else {
col 1[0] = 0;delx = -insO;ndelx = 0;
>
for (py = seqx[1], yy = 1; yy <= Ien 1; py++, yy++) {mis = col0[yy-1];if (dna)
mis += (xbm[*px-7V]&xbm[*py-'A'])? DMAT
else
mis += _day[*px-7V][*py-7V];
/* update penalty for dei in χ seq;
* favor new dei over ongong dei
* ignore MAXGAP if weighting endgaps7
If (endgaps || ndely[yy] < MAXGAP) {if (colO[yy] - insO >= dely[yy]) {
dely[yy] = colO[yy] - (ins0+ins1);ndely[yy] = 1;} else {dely[yy] -= ins1;ndely[yy]++;
>
} else {
if (colO[yy] - (insO+ins1) >= dely[yy]) {dely[yy] = colO[yy] - (insO+ins1);ndely[yy] = 1;
} else
ndelyfyy]++;
/* update penalty for dei in y seq;* favor new dei over ongong dei*/
if (endgaps || ndelx < MAXGAP) {if (col1[yy-1] - insO >= delx) {
delx = col1 [yy-1 ] - (ins0+ins1);ndelx = 1;} else {
delx -= ins1;ndelx++;
>
} else {
if (col1 [yy-1] - (ins0+ins1) >= delx) {delx = col1[yy-1] - (ins0+ins1);ndelx = 1;
} else
ndelx++;}
Γ pick the maximum score; we're favoring* mis over any dei and delx over dely*/
...nw
id = xx - yy + Ienl -1;
if (mis >= delx && mis >= dely[yy])
col1[yy] = mis;else if (delx >= dely[yy]) {col1[yy] = delx;ij = dx[id].ijmp;
if (dx[id].jp.n[0] && (!dna || (ndelx >= MAXJMP&& xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis
dx[id].score+DINSO)) {
dx[id].ijmp++;if (++ij >= MAXJMP) {writejmps(id);ij = dx[id].ijmp = 0;dx[id].offset = offset;offset += sizeof(struct jmp)sizeof(offset);
10
>
dx[id].jp.n[ij] = ndelx;dx[id].jp.x[ij] = xx;dx[id].score = delx;
}
else {
col 1 [yy] = dely[yy];ij = dx[id].ijmp;jf (dx[id].jp.n[0] && (!dna || (ndely[yy] >= MAXJMP
&& xx > dx[id].jp.x[ij]+MX)
Il mis >
dx[id].score+DINSO)) {
15
dx[id].ijmp++;if (++ij >= MAXJMP) {writejmps(id);ij = dx[id].ijmp = 0;dx[id].offset = offset;offset += sizeof(struct jmp)
20 sizeof(offset);
25
}
dx[id].jp.n[ij] = -ndely[yy];dx[id].jp.x[ij] = xx;dx[id].score = dely[yy];
}
if (XX == IenO && yy < Ien 1) {/* Iast colif (endgaps)
col1[yy] -= insO+ins1*(len1-yy);if (col1[yy] > smax) {smax = col1[yy];dmax = id;
}
>
}
if (endgaps && xx < IenO)
col1[yy-1] -= insO+ins1*(lenO-xx);if (col1[yy-1] > smax) {smax = col1[yy-1];dmax = id;
>
tmp = colO; colO = col1; col1 = tmp;
>
(void) free((char *)ndely);
(void) free((char *)dely);
(void) free((char *)colO);
(void) free((char *)col1); }
print() -- only routine visible outside this modulestatic:
getmatQ -- trace back best path, count matches: print()* pr_align() - print alignment of described in array p[]: print()
* dumpblock() - dump a block of Iines with numbers, stars: pr_align()
* nums() -- put out a number line: dumpblock()
* putline() - put out a Iine (name, [num], seq, [num]): dumpblock()
* stars() - -put a Iine of stars: dumpblock()
* stripnameO -- strip any path and prefix from a seqname*/
#include "nw.h"
#define SPC3
#define P_LINE 256 /* maximum output Iine */
#define P_SPC 3 /* space between name or num and seq */
extern _day[26][26];
int olen; Γ set output Iine Iength */
FILE *fx; /* output file */
print() print
{
int Ix1 Iy1 firstgap, lastgap; /* overlap */
if ((fx = fopen(ofile, "w")) == 0) {
fprintf(stderr,"%s: can't write %s\n", prog, ofile);
cleanup(1);
}
fprintf(fx, "<first sequence: %s (length = %d)\n", namex[0], IenO);fprintf(fx, "<second sequence: %s (length = %d)\n", namex[1], Ien1);olen = 60;Ix = IenO;Iy = Ien1;
firstgap = Iastgap = 0;
if (dmax < Ienl -1) { /* Ieading gap in χ */pp[0].spc = firstgap = Ienl - dmax -1;Iy -= pp[0].spc;
}
else if (dmax > Ienl -1) { /* Ieading gap in y */pp[1].spc = firstgap = dmax - (Ien1 -1);Ix -= pp[1].spc;
}
if (dmaxO < IenO - 1) { /* trailing gap in χ 7Iastgap = IenO - dmaxO -1;Ix -= lastgap;
}
else if (dmaxO > IenO -1) { /* trailing gap inlastgap = dmaxO - (IenO -1);Iy -= lastgap;
>
getmat(lx, Iy1 firstgap, lastgap);pr_align();* trace back the best path, count matches*/
static
getmat(lx, Iy1 firstgap, lastgap) getmat
int Ix1 ly; /* "core" (minus endgaps) */
int firstgap, lastgap; /* Ieading trailing overlap */
{
int nm, iO, i1, sizO, sizl;
char outx[32];
double pct;
register nO, n1;
register char *p0, *p1;
Γ get total matches, score*/
iO = i1 = sizO = sizl = 0;pO = seqx[0] + pp[1].spc;p1 = seqx[1] + pp[0].spc;nO = pp[1].spc + 1;n1 = pp[0].spc + 1;
nm = 0;
while ( *p0 && *p1 ) {if (sizO) {
p1++;n1++;sizO-;
}else if (sizl) {pO++;nO++;sizl--;
>
else {
if (xbm[*pO-'A,]&xbm[*p 1-1A'])
nm++;if (nO++ == pp[0].x[i0])
sizO = pp[0].n[i0++];if (n1++ == pp[1].x[i1])
sizl = pp[1].n[i1++];
pO++;p1++;
}
}
Γ pct homology:
* if penalizing endgaps, base is the shorter seq
* else, knock off overhangs and take shorter core7
if (endgaps)
Ix = (IenO < lenl)? IenO : Ien1;
else
Ix = (Ix < ly)? Ix : ly;pct = 100.*(double)nm/(double)lx;fprintf(fx, "\n");
fprintf(fx, "<%d match%s in an overlap of %d: %.2f percent similarity\n",nm, (nm == 1)? "": "es", Ix1 pct);
fprintf(fx, "<gaps in first sequence: %d", gapx); ...getmatif (gapx) {
(void) sprintf(outx," (%d %s%s)n,
ngapx, (dna)? "base":"residue", (ngapx == 1)? "":"s"); fprintf(fx,"%s", outx);
fprintf(fx,", gaps in second sequence: %d", gapy);
if (gapy) {
(void) sprintf(outx," (%d %s%s)",
ngapy, (dna)? "base":"residue", (ngapy == 1)? ,M,:"sM);fprintf(fx,"%s", outx);
}
if (dna)
fprintf(fx,
"\n<score: %d (match = %d, mismatch = %d, gap penalty = %d +%d per base)\n",
smax, DMAT, DMIS1 DINSO1 DINS1);
else
fprintf(fx,
"\n<score: %d (Dayhoff PAM 250 matrix, gap penalty = %d + %d
per residue)\n",
smax, PINSO1 PINS1);if (endgaps)%s%s\n",
else
fprintf(fx,
"<endgaps penalized. Ieft endgap: %d %s%s, right endgap: %d
firstgap, (dna)? "base": "residue", (firstgap == 1)? "": "s",lastgap, (dna)? "base": "residue", (lastgap == 1)? "": "s");
fprintf(fx, "<endgaps not penalized\n");
static nm; /* matches in core -- for checking */static Imax; /* Iengths of stripped file names */static Ü[2]; /* jmp index for a path */static nc[2]; /* number at start of current Iine */static ni[2]; /* current elem number - for gapping */static siz[2]; static char *ps[2]; /* ptr to current element */
static char *po[2];static charstatic char
out[2][P_LINE];star[P_LINE];
/* ptr to next output char slot *//* output Iine *//* set by stars() */
* print alignment of described in struct path pp[]*/
static
pr_align() pr_align{
int nn; /* char count */
int more;register i;
for (i = O1 Imax = 0; i < 2; i++) {nn = stripname(namex[i]);if (nn > Imax)
Imax = nn;
nc[i] = 1;
ni[i] = 1;
sizfi] = ij[i] = 0;
ps[i] = seqx[i];
po[i] = out[i]; }
for (nn = nm = 0, more = 1; more;) { ...pr_alignfor (i = more = 0; i < 2; i++) {/*
* do we have more of this sequence?*/
if (!*ps[i])
continue;
more++;
if (pp[i].spc) { /* Ieading space 7*po[i]++ = '';pp[i].spc~;
}else if (siz[i]) { /* in a gap */*po[i]++ =siz[i]--;
>
else { /* we're putting a seq element
*po[i] = *ps[i];if (islower(*ps[i]))
*ps[i] = toupper(*ps[i]);po[i]++;ps[i]++;
Γ
* are we at next gap for this seq?Ί
if (ni[i] == pp[i].x[ij[i]]) {/*
* we need to merge ali gaps
* at this Iocation7
siz[i] = pp[i]n[ij[i]++];while (ni[i] == pp[i].x[ij[i]])
siz[i] += pp[i].n[ij[i]++];
>
ni[i]++;
}
}
if (++nn == olen || !more && nn) {dumpblock();for (i = 0; i < 2; i++)po[i] = out[i];
nn = 0;
}
}
}
/*
* dump a block of lines, including numbers, stars: pr_align()*/
static
dumpblockQ dumpblock
{
register i;
for (i = 0; i < 2; i++)
*p0[j]~ = '\0';
...dumpblock
(void) putc('\n', fx);for (i = 0; i < 2; i++) {
if (*out[i] && (*out[i] !=·'|| *(po[i]) != 1')) {if (i == 0)
nums(i);
if (i == 0 && *out[1])stars();}
}
}
/*
* put out a number line: dumpblockQΊ
static
nums(ix) nums
int ix; Γ index in out[] holding seq Iine 7
{
char nline[P_LINE];
register i, j;
register char *pn, *px, *py;
for (pn = nline, i = 0; i < lmax+P_SPC; i++, pn++)*pn = '';
for (i = nc[ix], py = out[ix]; *py; py++, pn++) {if (*py == " II *py == ·-')*pn = '';
else {
if (i%10 == 0 Il (i == 1 && nc[ix] != 1)) {j = (i < 0)? -i : i;
putline(i);
if (i == 0 && *out[1])fprintf(fx, star);if(i ==1)
nums(i);for (px = pn; j; j /= 10, px~)
*px = j%10 + Ό';if (i < 0)
*px = ·-·;
}
else
*pn ='
i++;
}
}
*pn = '\0';nc[ix] = i;
for (pn = nline; *pn; pn++)(void) putc(*pn, fx);(void) putc('\n\ fx);
}
* put out a Iine (name, [num], seq, [num]): dumpblock()*/
static
putline(ix) putline
int ix; {
.putline
int i;
register char
*px;for (px = namex[ix], i = 0; *px && *px != ':'; px++, i++)
(void) putc(*px, fx);for (; i < lmax+P_SPC; i++)(void) putcC fx);
/* these count from 1:
* ni[] is current element (from 1)
* nc[] is number at start of current Iine*/
for (px = out[ix]; *px; px++)
(void) putc(*px&0x7F, fx);(void) putc('\n', fx);
}
* put a Iine of stars (seqs always in out[0], out[1]): dumpblock()*/
static
stars() stars{
int i;
register char *p0, *p1, cx, *px;
if (!*out[0] Il (*out[0] =="&& *(po[0]) == '') II!*out[1] Il (*out[1] == '' && *(po[1]) == ''))return;ρχ = sta γ;
for (i = lmax+P_SPC; i; i--)*px++ = '';
for (pO = out[0], p1 = out[1]; *p0 && *p1; pO++, p1++) {if (isalphafpO) && isalpha(*p1)) {
if (xbmrpO-WJ&xbmrpl-W]) {cx = '*■;nm++;
}
else if (!dna && _day[*pO-'A,][*p1-,A'] > 0)cx = '.';
else
cx = ";
}
else
cx = '*px++ = cx;
}
*px++ = '\n';*px = ·\0·;* strip path or prefix from pn, return len: pr_align()*/
static
stripname(pn) stripname
char *pn; /* file name (may be path) 7
{
register char *px, *py;py = 0;
for (px = pn; *px; px++)
jf (*ρχ == ·/·)
py = px + 1;
if (PY)
(void) strcpy(pn, py);return(strlen(pn));
}
/*
* cleanupO — cleanup any tmp file
* getseq() -- read in seq, set dna, Ien1 maxlen
* g_calloc() - calloc() with error checkin
* readjmps() -- get the good jmps, from tmp file if necessary
* writejmps() - write a filled array of jmps to a tmp file: nw()Ί#include "nw.h"
#include <sys/file.h>
char *jname = "/tmp/homgXXXXXX"; /* tmp file for jmps */
FILE *fj;
int cleanupO; /* cleanup tmp file */
long Iseek();
/*
* remove any tmp file if we blow*/
cleanup(i) cleanupint i;
{
if(fj)
(void) unlink(jname);
exit(i);
}
/*
* read, return ptr to seq, set dna, len, maxlen
* skip Iines starting with ';', *<*, or '>'
* seq in upper or Iower case
*/
char *
getseq(file, len) getseq
char *file; /* file name */int *len; /* seq Ien 7
{
char line[1024], *pseq;
register char *px, *py;int natgc, tlen;
FILE *fp;
if ((fp = fopen(file,"r")) == 0) {
fprintf(stderr,"%s: can't read %s\n", prog, file);exit(1);
>
tlen = natgc = 0;
while (fgets(line, 1024, fp)) {
if (*|jne == || *line == '<' || *line == '>')
continue;for (px = line; *px != VT; px++)
if (isupper(*px) || islower(*px))tlen++;
}
if ((pseq = malloc((unsigned)(tlen+6))) == 0) {
fprintf(stderr,M%s: malloc() failed to get %d bytes for %s\n",
tlen+6, file);
exit(1);
}
pseq[0] = pseq[1] = pseq[2] = pseq[3] = '\0';...getseq
py = pseq + 4;*len = tlen;rewind(fp);
while (fgets(line, 1024, fp)) {
if (*|jne == || *line == '<' || *line == '>')
continue;for (px = line; *px != '\n'; px++) {if (isupper(*px))
*py++ = *px;
else if (islower(*px))
*py++ = toupper(*px);if (index("ATGCU",*(py-1)))natgc++;
}
}
*py++ = '\0';*py = '\0';(void) fclose(fp);dna = natgc > (tlen/3);return(pseq+4);
}
char *
g_calloc(msg, nx, sz) g calloc
char *msg; Γ program, calling routine */
int nx, sz; /* number and size of elements */{
char *px, *calloc();
if ((px = calloc((unsigned)nx, (unsigned)sz)) == 0) {if (*msg) {
fprintf(stderr, "%s: g_calloc() failed %s (n=%d, sz
prog, msg, nx, sz);
exit(1);
}
}
return(px);
}
/*
* get final jmps from dx[] or tmp file, set pp[], reset dmax: main()7
readjmps() readjmps{
int fd = -1;
int siz, iO, i1;
register i, j, xx;
if (fj) {
(void) fclose(fj);
if ((fd = open(jname, ORDONLY, 0)) < 0) {
fprintf(stderr, "%s: can't open() %s\n", prog, jname);cleanup(1);
}}
for (i = iO = i1 = 0, dmaxO = dmax, xx = IenO; ; i++) {while (1) {
for (j = dx[dmax].ijmp; j >= 0 && dx[dmax].jp.x[j] >= xx; j~)
...readjmps
if G < 0 && dx[dmax],offset && fj) {
(void) lseek(fd, dx[dmax].offset, 0);
(void) read(fd, (char *)&dx[dmax].jp, sizeof(struct
jmp));
(void) read(fd, (char *)&dx[dmax],offset,
sizeof(dx[dmax],offset));
dx[dmax].ijmp = MAXJMP-1;
}
else
break;
}
if (i >= JMPS) {
fprintf(stderr, "%s: too many gaps in alignmenttn", prog);cleanup(1);
>
•f(j>= 0){
siz = dx[dmax].jp.n[j];xx = dx[dmax].jp.x[j];dmax += siz;
if (siz < 0) { Γ gap in second seq */
pp[1].n[i1] = -siz;χχ += siz;
/* id = χχ - yy + Ienl -1*/
pp[1].x[i1] = xx - dmax + Ienl -1;gapy++;ngapy -= siz;/* ignore MAXGAP when doing endgaps */
siz = (-siz < MAXGAP || endgaps)? -siz : MAXGAPi1++;
>
else if (siz > 0) { Γ gap in first seq 7pp[0].n[i0] = siz;pp[0].x[i0] = xx;gapx++;ngapx += siz;/* ignore MAXGAP when doing endgaps 7
siz = (siz < MAXGAP || endgaps)? siz : MAXGAP;i0++;
}
>
else
break;
}
Γ reverse the order of jmps7
for (j = 0, i0~; j < iO; j++, Í0-) {
i = pp[0].n[j]; PP[0].n[j] = pp[0].n[i0]; pp[0].n[i0] = i;i = pp[0].x[j]; pp[0].x[j] = pp[0].x[i0]; pp[0].x[i0] = i;
}
for O = O, i1-; j < i1; j++, i1-){
i = pp[1].n[j]; pp[1].n[j] = pp[1].n[i1]; pp[1].n[i1] = i;i = pp[1].x[j]; pp[1] x[j] = PP[1].X[í1]; pp[1].x[í1] = i;
}
if (fd >= 0)
(void) close(fd);
if ffi) {
(void) unlink(jname);
fj = 0;
offset = 0;> }
/*
* write a filled jmp struct offset of the prev one (if any): nw()7
writejmps(ix) writejmps
int ix;
{
char *mktemp();
if(!f)){
if (mktemp(jname) < 0) {
fprintf(stderr, "%s: can't mktemp() %s\n", prog, jname);cleanup(1);
}if CCTJ = fopen(jname, "w")) == 0) {
fprintf(stderr, "%s: can't write %s\n", prog, jname);exit(1);
}
}
(void) fwrite((char *)&dx[ix].jp, sizeof(struct jmp), 1,1j);
(void) fwrite((char *)&dx[ix].offset, sizeof(dx[ix].offset), 1, fj);
Em situações em que ALIGN-2 é empregado para comparaçõesde seqüências de aminoácidos, o percentual de identidade de seqüências deaminoácidos de uma dada seqüência de aminoácidos A para, com ou contrauma dada seqüência de aminoácidos B (que pode ser alternativamenteexpressa como dada seqüência de aminoácidos A que possui ou compreendecerto percentual de identidade de seqüências de aminoácidos para, com oucontra uma dada seqüência de aminoácidos B) é calculado conforme segue:
100 vezes a fração X/Y
em que X é a quantidade de resíduos de aminoácidos avaliadoscomo coincidências idênticas pelo programa de alinhamento de seqüênciasALIGN-2 no alinhamento de A e B naquele programa e em que Y é aquantidade total de resíduos de aminoácidos em B. Apreciar-se-á que, quandoo comprimento da seqüência de aminoácidos A não for igual ao comprimentoda seqüência de aminoácidos Β, o percentual de identidade de seqüências deaminoácidos entre AeB não será igual ao percentual de identidade deseqüências de aminoácidos entre BeA.
A menos que especificado especificamente em contrário, todos osvalores percentuais de identidade de seqüências de aminoácidos utilizados nopresente são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamente anterior,utilizando o programa de computador ALIGN-2.
A expressão "Efrina B2" (denominada de forma intercambiável"ligante de Efrina B2"), da forma utilizada no presente, indica, a menos queindicado específica ou contextualmente em contrário, qualquer polipeptídeo deEfrina B2 nativo ou variante (seja nativo ou sintético). A expressão "seqüêncianativa" engloba especificamente formas segregadas ou truncadas deocorrência natural (tais como uma seqüência de domínio extracelular), formasvariantes de ocorrência natural (tais como formas alternativamente divididas) evariantes alélicas de ocorrência natural. A expressão "Efrina B2 do tiposelvagem" indica geralmente polipeptídeo que compreende a seqüência deaminoácidos de proteína Efrina B2 de ocorrência natural. A expressão"seqüência de Efrina B2 do tipo selvagem" designa geralmente seqüência deaminoácidos encontrada em Efrina B2 de ocorrência natural.
A expressão "receptor de Eph" (tal como receptor de EphB1 comoEphBI, EphB2 e/ou EphB3), da forma utilizada no presente, indica, a menosque indicado específica ou contextualmente em contrário, qualquerpolipeptídeo receptor de EpH nativo ou variante (seja nativo ou sintético). Aexpressão "seqüência nativa" engloba especificamente formas segregadas outruncadas de ocorrência natural (tais como seqüência de domínio extracelular),formas variantes de ocorrência natural (tais como formas alternativamentedivididas) e variantes alélicas de ocorrência natural. A expressão "receptor deEph do tipo selvagem" indica geralmente polipeptídeo que compreende aseqüência de aminoácidos de proteína receptora de Eph de ocorrência natural.A expressão "seqüência receptora de Eph do tipo selvagem" designageralmente seqüência de aminoácidos encontrada em receptor de Eph d eocorrência natural.
Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são utilizados de formaintercambiável no sentido mais amplo e incluem anticorpos monoclonais (taiscomo anticorpos monoclonais intactos ou de comprimento total), anticorpospoliclonais, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (tais comoanticorpos biespecíficos, desde que exibam a atividade biológica desejada) epodem também incluir certos fragmentos de anticorpos (conforme descrito commais detalhes no presente). Anticorpo pode ser humano, humanizado e/ouamadurecido por afinidade.
O termo "variável" indica o fato de que certas partes dos domíniosvariáveis diferem extensamente de seqüência entre os anticorpos e sãoutilizadas na união e especificidade de cada anticorpo específico para o seuantígeno específico. A capacidade de variação não é, entretanto, distribuídaregularmente ao longo de todos os domínios variáveis de anticorpos. Ela éconcentrada em três segmentos denominados regiões determinantes decomplementaridade (CDRs) ou regiões hipervariáveis, tanto nos domíniosvariáveis de cadeia leve como de cadeia pesada. As porções mais altamenteconservadas dos domínios variáveis são denominadas estruturas (FR). Cadaum dos domínios variáveis de cadeia leve e pesada nativos compreende quatroregiões FR1 que adotam em grande parte configuração de folha β, conectadaspor três CDRs1 que formam laços que conectam e, em alguns casos, fazemparte da estrutura de folha β. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas emboa proximidade pelas regiões FR e, com as CDRs da outra cadeia,contribuem para a formação do local de união de antígenos de anticorpos (videKabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutesof Health, Bethesda MD (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidosdiretamente na união de anticorpo a antígeno, mas exibem várias funçõesefetoras, tais como a participação do anticorpo em toxicidade celulardependente de anticorpos.
A digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos deunião de antígenos idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada qual comum único local de união de antígenos, e um fragmento "Fc" residual, cujo nomereflete a sua capacidade de rápida cristalização. O tratamento com pepsinagera fragmento de F(ab')2 que contém dois locais de combinação de antígenose ainda é capaz de reticular antígeno.
"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém local dereconhecimento e de união de antígenos completo. Em espécie de Fv de duascadeias, esta região consiste de um dímero de domínio variável de cadeiapesada e um de cadeia leve em associação firme e não covalente. Em espéciede Fv de cadeia única, um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeialeve podem ser ligados covalentemente por Iigante de peptídeos flexível, de talforma que as cadeias leve e pesada possam associar-se em estrutura"dimérica" análoga à de espécie de Fv de duas cadeias. É nesta configuraçãoque as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um local deunião de antígenos sobre a superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seisCDRs conferem especificidade de união de antígenos ao anticorpo. Entretanto,mesmo um domínio variável isolado (ou metade de um Fv que compreendeapenas três CDRs específicas para um antígeno) possui a capacidade dereconhecer e unir antígeno, embora em afinidade menor que todo o local deunião.
O fragmento de Fab também contém o domínio constante dacadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Osfragmentos de Fab' diferem de fragmentos de Fab pela adição de algunsresíduos no terminal carbóxi do domínio CH1 de cadeia pesada, que inclui umaou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab'-SH é adesignação do presente para Fab' em que o(s) resíduo(s) de cisteína dosdomínios constantes apresenta(m) um grupo tiol livre. Os fragmentos deanticorpos F(ab')2 foram originalmente produzidos na forma de pares defragmentos de Fab' que contêm cisteínas de articulação entre eles. Outrosacoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.
As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquerespécie de vertebrado podem ser atribuídas a um dentre dois tipos claramentedistintos, denominados capa (κ) e Iambda (λ), com base nas seqüências deaminoácidos dos seus domínios constantes.
Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constantedas suas cadeias pesadas, imunoglobulinas podem ser atribuídas a classesdiferentes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA1 IgD, IgE,IgG e IgM, e várias delas podem ser adicionalmente divididas em subclasses(isotipos), tais como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domíniosconstantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes deimunoglobulinas são denominados α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As estruturasde subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes deimunoglobulinas são bem conhecidas.
"Fragmentos de anticorpos" compreendem somente uma parte deanticorpo intacto, em que a parte preferencialmente retém pelo menos uma,preferencialmente a maior parte ou todas as funções normalmente associadasàquela parte quando presente em anticorpo intacto. Exemplos de fragmentosde anticorpos incluem fragmentos de Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos;anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de fita única; e anticorposmultiespecíficos formados com fragmentos de anticorpos. Em uma realização,fragmento de anticorpo compreende local de união de antígenos do anticorpointacto e, desta forma, retém a capacidade de união de antígeno. Em outrarealização, fragmento de anticorpo, tal como o que compreende a região Fc,retém pelo menos uma das funções biológicas normalmente associadas àregião Fc quando presente em anticorpo intacto, tal como união de FcRn1modulação da meia vida de anticorpos, função de ADCC e união decomplemento. Em uma realização, fragmento de anticorpo é anticorpomonovalente que possui meia vida in vivo substancialmente similar a anticorpointacto. Esse fragmento de anticorpo pode compreender, por exemplo, braçode união de antígenos ligado a seqüência de Fc capaz de conferir estabilidadein vivo ao fragmento.
A expressão "região hipervariável", "HVR" ou "HV", da formautilizada no presente, indica as regiões de domínio variável de anticorpo quesão de seqüência hipervariável e/ou de circuitos definidos estruturalmente.
Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis; três emVH (H1, H2 e H3) e três em VL (L1, L2, L3). Uma série de delineações deregiões hipervariáveis encontra-se em uso e é englobada no presente. AsRegiões de Determinação de Complementaridade (CDRs) de Kabat baseiam-se na variabilidade de seqüências e são as mais comumente utilizadas (Kabatet al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)). Chothiarefere-se, por sua vez, ao local dos circuitos estruturais (Chothia e Lesk, J. MoiBiol. 196: 901-917 (1987)). As regiões hipervariáveis de AbM representamcompromisso entre CDRs de Kabat e circuitos estruturais de Chothia e sãoutilizadas pelo software de modelagem de anticorpos AbM da OxfordMolecular. As regiões hipervariáveis de "contato" baseiam-se em análise dasestruturas de cristais complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma destasregiões hipervariáveis são indicados abaixo.
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As regiões hipervariáveis podem compreender "regiõeshipervariáveis estendidas" conforme segue: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 49-56 ou 50-56 ou 52-56 (L2) e 89-97 (L3) no VL e 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65(H2) e 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3) no VH. Os resíduos de domíniosvariáveis são numerados de acordo com Kabat et al, acima, para cada umadessas definições.
Resíduos de "estrutura" ou "FR" são os resíduos de domíniosvariáveis diferentes dos resíduos de região hipervariável conforme definido nopresente.
As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (porexemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínimaderivada de imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorposhumanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nas quais osresíduos de região hipervariável do paciente são substituídos por resíduos deregião hipervariável de espécie não humana (anticorpo doador) tal comocamundongo, rato, coelho ou primata não humano que possui a especificidade,afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos de região deestrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos nãohumanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podemcompreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem noanticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais odesempenho do anticorpo. Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderásubstancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois domíniosvariáveis, em que todos ou substancialmente todos os laços hipervariáveiscorrespondem aos de imunoglobulina não humana e todas ousubstancialmente todas as FRs são as de seqüência de imunoglobulinahumana. O anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelomenos uma parte de região constante de imunoglobulina (Fc)1 tipicamente a deimunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, vide Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr.Op. Struct. Bioi 2: 593-596 (1992). Vide também os artigos de análise a seguire as referências neles mencionadas: Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma& Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soe. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994).
Os anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) possuem uma parteda cadeia leve e/ou pesada idêntica ou homóloga a seqüênciascorrespondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica oupertencentes a uma classe ou subclasse específica, enquanto o restante da(s)cadeia(s) é idêntico ou homólogo a seqüências correspondentes de anticorposderivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse deanticorpos, bem como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam aatividade biológica desejada (Patente Norte-Americana n° 4.816.567; eMorrison et al, Proc. NatL Acad. Sei. U. S. A. 81: 6851-6855 (1984)). Oanticorpo humanizado, da forma utilizada no presente, é subconjunto deanticorpos quiméricos.
Fragmentos de anticorpos "Fv de fita única" ou "scFv"compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que esses domíniosestão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Geralmente, opolipeptídeo de scFv compreende adicionalmente um Iigante de polipeptídeoentre os domínios VH e VL, o que permite que o scFv forme a estruturadesejada para união de antígenos. Para análise de scFv, vide Pluckthun, ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds.,Springer-Verlag1 Nova Iorque, págs. 269-315 (1994).
"Antígeno" é antígeno previamente determinado ao qual podei unir-se seletivamente um anticorpo. O antígeno alvo pode ser polipeptídeo,carboidrato, ácido nucleico, lipídio, hapteno ou outro composto sintético ou deocorrência natural. Preferencialmente, o antígeno alvo é polipeptídeo.
O termo "diacorpos" designa pequenos fragmentos de anticorposcom dois locais de união de antígenos, que compreendem um domínio variávelde cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL)na mesma cadeia de polipeptídeo (VH - VL). Utilizando Iigante que é curtodemais para permitir o emparelhamento entre os dois domínios sobre a mesmacadeia, os domínios são forçados a emparelhar-se com os domínioscomplementares de outra cadeia e criar dois locais de união de antígenos. Osdiacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, em EP 404.097,WO 93/11161 e Hollinger et al, Proc. NatL Acad. Sei. U. S. A., 90: 6444-6448(1993).
"Anticorpo humano" é aquele que possui seqüência deaminoácidos que corresponde à de anticorpo produzido por ser humano e/oufoi fabricado utilizando qualquer das técnicas de fabricação de anticorposhumanos descritas no presente. Esta definição de anticorpo humano excluiespecificamente anticorpo humanizado que compreende resíduos de união deantígenos não humanos.
Anticorpo "amadurecido por afinidade" é aquele com uma ou maisalterações em uma ou mais de suas CDRs, o que resulta em aumento daafinidade do anticorpo para o antígeno, em comparação com anticorpo parentalque não possui essa(s) alteração(ões). Os anticorpos amadurecidos porafinidade preferidos possuirão afinidades nanomolares ou até picomolares parao antígeno alvo. Os anticorpos amadurecidos por afinidade são produzidos pormeio de procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al, Bio/Technology, 10:779-783 (1992) descrevem amadurecimento por afinidade por meio de troca dedomínios VH e VL. A mutagênese aleatória de resíduos de cadeia principale/ou CDR é descrita por: Barbas et al, Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A. 91: 3809-3813 (1994); Schier et al, Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al, J. Immunol.155: 1994-2004 (1995); Jackson et al, J. Immunol. 154 (7): 3310-9 (1995); eHawkins et al, J. Moi Biol. 226: 889-896 (1992).
As "funções efetoras" de anticorpos designam as atividadesbiológicas atribuíveis à região Fc (região Fc de seqüência nativa ou região Fccom variação de seqüência de aminoácidos) de anticorpo e variam de acordocom o isotipo do anticorpo. Exemplos das funções efetoras de anticorposincluem: citotoxicidade dependente de complemento e união de C1q; união dereceptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos(ADCC); fagocitose; regulagem para baixo de receptores da superfície celular(tais como receptor de células B); e ativação de células B.
"Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos"ou "ADCC" designa uma forma de citotoxicidade, em que Ig segregado e unidoa receptores de Fc (FcRs) presentes sobre certas células citotóxicas (porexemplo, Células Matadoras Naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) permitemque essas células efetoras citotóxicas unam-se especificamente a uma céluladesejada que apresente antígenos e subseqüentemente matem a céluladesejada com citotoxinas. Os anticorpos "armam" as células citotóxicas e sãoabsolutamente necessários para essa matança. As células primárias para amediação de ADCC, células NK, expressam unicamente FcyRIII, enquantomonócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR sobrecélulas hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 da página 464 de Ravetch eKinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Para determinar a atividade deADCC de molécula de interesse, pode-se realizar teste de ADCC in vitro, talcomo descrito na Patente Norte-Americana n° 5.500.362 ou 5.821.337 ouPresta, Patente Norte-Americana n° 6.737.056. Células efetoras úteis paraesses testes incluem células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMC) ecélulas Matadoras Naturais (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade deADCC da molécula de interesse pode ser determinada in vivo, tal como emmodelo animal como o descrito em Clynes et al, PNAS (U. S. A.) 95: 652-656(1998).
"Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um oumais FcRs e realizam funções efetoras. Preferencialmente, as célulasexpressam pelo menos FcyRIII e realizam função efetora de ADCC. Exemplosde leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononuclearessangüíneas periféricas (PBMC), células matadoras naturais (NK), monócitos,células T citotóxicas e neutrófilos; em que PBMCs e células NK são preferidas.As células efetoras podem ser isoladas a partir de uma fonte nativa, tal comosangue.
"Receptor de Fc" ou "FcR" descreve receptor que se une à regiãoFc de anticorpo. O FcR preferido é FcR humano de seqüência nativa. Alémdisso, FcR preferido é aquele que une anticorpo de IgG (receptor gama) e incluireceptores das subclasses de FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantesalélicas e, alternativamente, formas divididas desses receptores. Os receptoresde FcyRII incluem FcyRIIA ("receptor de ativação") e FcyRIIB ("receptor deinibição"), que possuem seqüências de aminoácidos similares que diferemprincipalmente nos seus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativaçãoFcyRIIA contém um motivo de ativação com base em tirosina imunorreceptora(ITAM) em seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FcyRIIB contémum motivo de inibição com base em tirosina imunorreceptora (ITIM) no seudomínio citoplasmático. (vide análise M. em Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs são analisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev.Immunol. 9: 457-92 (1991); Capei et al, Immunomethods 4: 25-34 (1994); e deHaas et al, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Outros FcRs1 incluindoaqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo "FcR" nopresente. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn1 que é responsávelpela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al, J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al, J. Immunol. 24: 249 (1994)) e regula a homeostase deimunoglobulinas.
WO 00/42072 (Presta) descreve variantes de anticorpos commaior ou menor união a FcRs. O teor daquela publicação de patente éincorporado especificamente ao presente como referência. Vide tambémShields et al, J. Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001).
São conhecidos métodos de medição da união a FcRn (vide,porexemplo, Ghetie 1997, Hinton 2004). A união a FcRn humano in vivo e ameia vida em soro de polipeptídeos de união com alta afinidade para FcRnhumano podem ser testadas, por exemplo, em camundongos transgênicos oulinhagens de células humanas transfectadas que expressam FcRn humano, ouem primatas que recebem administração de polipeptídeos variantes de Fc.
"Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" designa alise de célula alvo na presença de complemento. A ativação do processoclássico de complemento é iniciada pela união do primeiro componente dosistema de complemento (C1q) a anticorpos (da subclasse apropriada) que sãounidos ao seu antígeno cognato. Para determinar a ativação do complemento,pode ser realizado teste de CDC, conforme descrito, por exemplo, emGazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
Variantes de polipeptídeos com seqüências de aminoácidos comregião Fc alterada e maior ou menor capacidade de união de C1q são descritasna Patente Norte-Americana n° 6.194.551 B1 e WO 99/51642. O teor destaspublicações de patentes é incorporado especificamente ao presente comoreferência. Vide também Idusogie et al, J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
A expressão "polipeptídeo que compreende região Fc" designapolipeptídeo, tal como anticorpo ou imunoadesina (vide definições abaixo), quecompreende região Fe. A Iisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com osistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo,durante a purificação do polipeptídeo ou por meio de elaboração recombinantedo ácido nucleico que codifica o polipeptídeo. Conseqüentemente, composiçãoque compreende polipeptídeo que contém região Fc de acordo com a presenteinvenção pode compreender polipeptídeos com K447, com todo o K447removido, ou uma mistura de polipeptídeos com e sem o resíduo K447.
Anticorpo "bloqueador" ou anticorpo "antagonista" é aquele queinibe ou reduz a atividade biológica do antígeno que une. Anticorpos debloqueio ou anticorpos antagonistas preferidos inibem substancial oucompletamente a atividade biológica do antígeno.
"Anticorpo agonista", da forma utilizada no presente, é anticorpoque imita pelo menos uma das atividades funcionais de polipeptídeo deinteresse.
"Estrutura humana receptora" para os propósitos do presente éestrutura que compreende a seqüência de aminoácidos de estrutura VL ou VHderivada de estrutura de imunoglobulina humana, ou de estrutura de consensohumano. Estrutura humana receptora "derivada de" estrutura de imunoglobulinahumana ou estrutura de consenso humano pode compreender a sua mesmaseqüência de aminoácidos ou pode conter alterações de seqüência deaminoácidos previamente existentes. Quando alterações de aminoácidospreviamente existentes estiverem presentes, preferencialmente não mais decinco e preferencialmente quatro ou menos, ou três ou menos alterações deaminoácidos previamente existentes estão presentes. Quando alterações deaminoácidos previamente existentes estiverem presentes em VH1 estasalterações encontram-se preferencialmente em apenas três, duas ou uma dasposições 71 Η, 73H e 78H; os resíduos de aminoácidos nestas posições podemser, por exemplo, 71A, 73T e/ou 78A. Em uma realização, a estrutura humanareceptora VL possui seqüência idêntica à seqüência de estrutura deimunoglobulina humana VL ou seqüência de estrutura de consenso humano.
"Estrutura de consenso humano" é estrutura que representa oresíduo de aminoácido de ocorrência mais comum em seleção de seqüênciasde estrutura VL ou VH de imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção deseqüências VL ou VH de imunoglobulina humana é de subgrupo de seqüênciasde domínio variável. Geralmente, o subgrupo de seqüências é subgrupo comoem Kabat et al. Em uma realização, para o VL, o subgrupo é subgrupo capa Icomo em Kabat et al. Em uma realização, para o VH, o subgrupo é subgrupo Illcomo em Kabat et al.
"Estrutura de consenso de subgrupo Ill VH" compreende aseqüência de consenso obtida a partir das seqüências de aminoácidos emsubgrupo Ill pesado variável de Kabat et al. Em uma realização, a seqüênciade aminoácidos de estrutura de consenso de subgrupo Ill VH compreende pelomenos uma parte ou todas as seqüências a seguir:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID N0 42)-H1-WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID N0 43)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID N0 44)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID N0 45).
"Estrutura de consenso de subgrupo I VL" compreende aseqüência de consenso obtida a partir das seqüências de aminoácidos emsubgrupo I capa leve variável de Kabat et al. Em uma realização, a seqüênciade aminoácidos de estrutura de consenso de subgrupo I VH compreende pelomenos uma parte ou todas as seqüências a seguir:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID N0 15)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID N0 16)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID N0 17)-L3-FGQGTKVEIK (SEQ ID N0 18).
"Disfunção" ou "doença" é qualquer condição que se beneficiariado tratamento com substância/molécula ou método de acordo com a presenteinvenção. Isso inclui doenças ou disfunções agudas e crônicas que incluem ascondições patológicas que predispõem o mamífero à disfunção em questão.Exemplos não limitadores de disfunções a serem tratadas no presente incluemtumores benignos e malignos; carcinoma, blastoma e sarcoma.
As expressões "disfunção proliferativa celular" e "disfunçãoproliferativa" designam disfunções que são associadas a algum grau deproliferação celular anormal. Em uma realização, a disfunção proliferativacelular é câncer.
"Tumor", da forma utilizada no presente, indica toda proliferação ecrescimento de células neoplásticas, sejam malignas ou benignas, e todas ascélulas e tecidos pré-cancerosos e cancerosos. As expressões "câncer","canceroso", "disfunção proliferativa celular", "disfunção proliferativa" e "tumor"não são mutuamente exclusivas conforme indicado no presente.
Os termos "câncer" e "canceroso" designam ou descrevem acondição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelaproliferação/crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem,mas sem limitar-se a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia.Exemplos mais específicos desses cânceres incluem carcinoma de célulasescamosas, câncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão não decélulas pequenas, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso dopulmão, câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal,câncer pancreático, glioblastoma, câncer da cervical, câncer do ovário, câncerdo fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon,câncer colo-retal, carcinoma endométrico ou uterino, carcinoma das glândulassalivares, câncer dos rins, câncer do fígado, câncer da próstata, câncer davulva, câncer da tireóide, carcinoma hepático, câncer gástrico, melanoma evários tipos de câncer da cabeça e do pescoço. A desregulagem deangiogênese pode gerar muitas disfunções que podem ser tratadas por meiode composições e métodos de acordo com a presente invenção. Estasdisfunções incluem condições neoplásticas e não neoplásticas. As neoplásticasincluem, mas sem limitar-se às descritas abaixo. Disfunções não neoplásticasincluem, mas sem limitar-se a hipertrofia indesejada ou aberrante, artrite, artritereumatóide (RA), psoríase, placas psoriáticas, sarcoidose, arteriosclerose,placas arterioscleróticas, retinopatias diabéticas e outras proliferativas queincluem retinopatia de prematuros, fibroplasia retrolenta, glaucomaneovascular, degeneração macular relativa à idade, edema macular diabético,neovascularização da córnea, neovascularização de enxerto da córnea,rejeição de enxerto da cornea, neovascularização da retina/coroidal,neovascularização do ângulo (rubeose), doença neovascular ocular, restenosevascular, más formações arteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma,angiofibroma, hiperplasias da tireóide (incluindo mal de Grave), transplante dacórnea e outros tecidos, inflamação crônica, inflamação dos pulmões, lesõesagudas dos pulmões/ARDS, sepsia, hipertensão pulmonar primária, efusõespulmonares malignas, edema cerebral (tal como associado a apoplexiaaguda/lesão fechada da cabeça/trauma), inflamação sinovial, formação depanus em RA, miosite ossificante, formação de ossos hipertrófica, osteoartrite(AO), ascite refratária, doença do ovário policístico, endometriose, terceiroespaçamento de doenças dos fluidos (pancreatite, síndrome decompartimentos, queimações, doença intestinal), fibróide uterina, trabalhoprematuro, inflamações crônicas tais como IBD (mal de Crohn e coliteulcerativa), rejeição de aloenxertos renais, doença intestinal inflamatória,síndrome nefrótica, crescimento indesejado ou aberrante da massa de tecidos(não cancerígeno), juntas hemofílicas, cicatrizes hipertróficas, inibição docrescimento capilar, síndrome de Osler-Weber, fibroplasias retrolentas dei granuloma piogênico, escleroderma, tracoma, adesões vasculares, sinovite,dermatite, preeclâmpsia, ascite, efusão do pericárdio (tal como associada apericardite) e efusão plêurica.
As expressões "doença neurodegenerativa" e "disfunçãoneurodegenerativa" são utilizadas no sentido mais amplo para incluir todas asdisfunções cuja patologia envolva a degeneração e/ou disfunção neuronal,incluindo, sem limitação, neuropatias periféricas; disfunções dos neurôniosmotores, tais como esclerose lateral amiotrófica (ALS, mal de Lou Gehrig),paralisia de Bell e várias condições que envolvem a paralisia ou atrofiamuscular espinhal; e outras doenças neurodegenerativas humanas, tais comomal de Alzheimer, mal de Parkinson, epilepsia, esclerose múltipla, coréia deHuntington, síndrome de Down, surdez nervosa e mal de Meniere.
"Neuropatia periférica" é disfunção neurodegenerativa que afetaos nervos periféricos, mais freqüentemente manifestada como uma ou umacombinação de disfunções motoras, sensoriais, sensorimotoras ou autônomas.Neuropatias periféricas podem ser, por exemplo, geneticamente adquiridas,podem resultar de doença sistêmica ou podem ser induzidas por agente tóxico,tal como droga neurotóxica, como agente antineoplástico ou poluente industrialou ambiental. "Neuropatia sensorial periférica" é caracterizada peladegeneração de neurônios sensoriais periféricos, que podem ser idiopáticos epodem ocorrer, por exemplo, em conseqüência de diabete (neuropatiadiabética), terapia com drogas citostáticas em câncer (tal como tratamento comagentes quimioterapêuticos como vincristina, cisplatina, metotrexato, 3'-azido-3'-desoxitimidina ou taxanos, tais como paclitaxel (TAXOL®, Bristol-MyersSquibb Oncology1 Princeton NJ) e doxetaxel (TAXOTERE®, Rhône-PoulencRorer, Antony1 França)), alcoolismo, síndrome da imunodeficiência adquirida(AIDS) ou predisposição genética. Neuropatias periféricas geneticamenteadquiridas incluem, por exemplo, mal de Refsum, mal de Krabbe, Ieucodistrofiametacromática, mal de Fabry1 síndrome de Dejerine-Sottas,abetalipoproteinemia e mal de Charcot-Marie-Tooth (CMT) (também conhecidocomo atrofia muscular proneal ou neuropatia sensorial motora hereditária(HMSN)). A maior parte da neuropatia periférica desenvolve-se lentamente, aolongo de vários meses ou anos. Na prática clínica, essas neuropatias sãodenominadas crônicas. Às vezes, neuropatia periférica desenvolve-serapidamente, ao longo de alguns dias, e é denominada aguda. Neuropatiaperiférica normalmente afeta os nervos motores e sensoriais juntos, de forma acausar neuropatia motora e sensorial mista, mas neuropatia sensorial pura emotora pura também são conhecidas.
Da forma utilizada no presente, "tratamento" indica intervençãoclínica em tentativa de alterar o curso natural do indivíduo ou da célula sendotratada e pode ser realizado para profilaxia ou durante o transcurso depatologia clínica. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem a prevenção daocorrência ou reincidência da doença, alívio dos sintomas, redução dequaisquer conseqüências patológicas diretas ou indiretas da doença,prevenção de metástase, redução da velocidade de progresso da doença,melhoria ou redução do estado doentio e remissão ou melhor prognóstico. Emalgumas realizações, os anticorpos de acordo com a presente invenção sãoutilizados para retardar o desenvolvimento de doença ou disfunção.
"Indivíduo" é vertebrado, preferencialmente mamífero, de maiorpreferência ser humano. Mamíferos incluem, mas sem limitar-se a animais defazenda (tais como vacas), animais esportivos, animais de estimação (taiscomo gatos, cães e cavalos), primatas, camundongos e ratos."Mamífero", para os propósitos de tratamento, designa qualqueranimal classificado como mamífero, incluindo seres humanos, animaisdomésticos e de criação e animais de zoológico, esportivos ou de estimação,tais como cães, cavalos, gatos, vacas etc. Preferencialmente, o mamífero é serhumano.
"Quantidade eficaz" designa quantidade eficaz, em dosagens epor períodos de tempo necessários, para atingir o resultado terapêutico ouprofilático desejado.
"Quantidade terapeuticamente eficaz" de substância/molécula deacordo com a presente invenção, agonista ou antagonista pode variar deacordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo e peso doindivíduo, bem como a capacidade da substância/molécula, agonista ouantagonista de permitir reação desejada no indivíduo. Quantidadeterapeuticamente eficaz também é aquela em que qualquer efeito tóxico ouprejudicial da substância/molécula, agonista ou antagonista é superado pelosefeitos terapeuticamente benéficos. "Quantidade profilaticamente eficaz"designa quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários,para atingir o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas nãonecessariamente, como a dose profilática é utilizada em pacientes antes ou emestado inicial da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor que aquantidade terapeuticamente eficaz.
A expressão "agente citotóxico", da forma utilizada no presente,indica substância que inibe ou evita o funcionamento das células e/ou causadestruição das células. A expressão destina-se a incluir isótopos radioativos(tais como At211, I1311 I125, Y901 Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótoposradioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos, tais como metotrexato,adriamicina, vinca alcalóides (vincristina, vinblastina, etoposida), doxorubicina,melfalan, mitomicina C, clorambucila, daunorubicina ou outros agentesintercalantes, enzimas e seus fragmentos, tais como enzimas nucleolíticas,antibióticos e toxinas, tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinasenzimaticamente ativas de origem animal, vegetal, fúngica ou bacteriana,incluindo seus fragmentos e/ou variantes, e os diversos agentes antitumores ouanticancerígenos descritos abaixo. Outros agentes citotóxicos são descritosabaixo. Agente tumoricida causa a destruição de células tumorosas.
"Agente quimioterapêutico" é composto químico útil no tratamentode câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentesalquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamida CYTOXAN®; sulfonatos ciealquila, tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas, tais comobenzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas emetilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina,trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina;acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); delta-9-tetraidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol;colchicinas; ácido betulínico; camptotecina (incluindo o análogo sintéticotopotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®),acetilcamptotecina, escopolectina e 9-aminocamptotecina); briostatina;calistatina; CC-1065 (incluindo os seus análogos sintéticos adozelesina,carzelesina e bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida;criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina;duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1);eleuterobina; pancratistatina; sarcodictiina; espongistatina; mostardas denitrogênio tais como clorambucil, clornazafina, colofosfamida, estramustina,ifosfamida, mecloretamina, cloridrato oxido de mecloretamina, melfalan,novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil;nitrosuréias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina,nimustina e ranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos de enediina (porexemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama 11 ecaliqueamicina ômega 11 (vide, por exemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engi 33:183-186 (1994); dinemicina, incluindo dinemicina A; esperamicina; bem comoneocarzinostatina cromoforo e cromoforos antibióticos de enediinacromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina,azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina,cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina ADRIAMYCIN® (incluindo morfolino-doxorubicina,cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina e desoxidoxorubicina),epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tais comomitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicin.apotfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina,estreptozocina, tubercidina ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabólitos,tais como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, taiscomo denopterina metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina,tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos depirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina,dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tais comocalusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano,testolactona; anti-adrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano;reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona;aldofosfamido glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina;bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona;elfornitina; acetato de eliptínio; epotilona; etoglucídeo; nitrato de gálio;hidroxiuréia; lentinan; lonidainina; maitansinóides, tais como maitansina eansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitaerina; pentostatin;fenamet; pirarubicin; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etil hidrazida;procarbazina; complexo de polissacarídeos PSK® (JHS Natural Products,Eugene OR); razoxano; rizoxin; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico;triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2,verracurin A1 roridin A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®,FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman;gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, tais comopaclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology1 Princeton NJ),ABRAXANE® livre de Cremophor, formulação de nanopartículas de paclitaxelelaborada com albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg,Illinois) e doxetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony1 França);clorambucil; gemcitabina GEMZAR®; 6-tioguanina; mercaptopurina;metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina(VELBAN®); platina; etoposida (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina(ONCOVIN®); oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®);novantrona; teniposida; edatrexato; daunomicin; aminopterin; xeloda;ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina(DMFO); retinóides, tais como ácido retinóico; capecitabina (XELODA®); sais,ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima;bem como combinações de dois ou mais dos acima, tais como CHOP,abreviação de terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina eprednisolona, e FOLFOX, abreviação de regime de tratamento com oxaliplatina(ELOXATIN®) combinada com 5-FU e leucovovina.
Também são incluídos nesta definição agentes anti-hormonaisque agem para regular, reduzir, bloquear ou inibir os efeitos de hormônios quepodem promover o crescimento do câncer e apresentam-se freqüentemente naforma de tratamento sistêmico ou do corpo todo. Eles podem ser os próprioshormônios. Exemplos incluem anti-estrógenos e moduladores de receptores deestrógenos seletivos (SERMs), incluindo, por exemplo , tamoxifen (incluindotamoxifen NOLVADEX®), raloxifeno EVISTA®, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifen,trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno FARESTON®; anti-progesteronas; reguladores de receptores de estrógenos (ERDs); agentes quefuncionam para suprimir ou desconectar os ovários, tais como agonistas dehormônios Iiberadores de hormônios Ieutinizantes (LHRH) tais como acetato deleuprolida LUPRON® e ELIGARD®, acetato de goserelin, acetato de busereline tripterelin; outros anti-andrógenos, tais como flutamida, nilutamida ebicalutamida; e inibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, queregula a produção de estrógenos nas glândulas adrenais, tais como 4 (5)-imidazóis, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestanoAROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, Ietrozol FEMARA® eanastrozol ARIMIDEX®. Além disso, essa definição de agentesquimioterapêuticos inclui bifosfonatos tais como clodronato (por exemplo,BONEFOS® ou O STAC®), etidronato DIDROCAL®, NE-58095,zoledronato/ácido zoledrônico ZOMETA®, alendronato FOSAMAX®,pamidronato AREDIA®, tiludronato SKELID® ou risedronato ACTONEL®; bemcomo troxacitabina (análogo de 1,3-dioxolano nucleosídeo citosina);oligonucleotídeos sem sentido, particularmente aqueles que inibem aexpressão de genes em processos de sinalização implicados em proliferaçãode células aberrantes, tais como PKC-alfa, Raf, H-Ras e receptor de fator decrescimento epidérmico (EGF-R); vacinas tais como vacina THERATOPE® evacinas de terapia genética, tais como vacina ALLOVECTIN®, vacinaLEUVECTIN® e vacina VAXID®; inibidor da topoisomerase 1 LURTOTECAN®;rmRH ABARELIX®; ditosilato de lapatinib (inibidor de moléculas pequenastirosino quinase duplo EGFR e ErbB-2 também conhecido como GW572016); esais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dosacima.
"Agente inibidor do crescimento", da forma utilizada no presente,designa composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula (talcomo célula que expressa Efrina B2), seja in vitro ou in vivo. Desta forma, oagente inibidor do crescimento pode ser aquele que reduz significativamente opercentual de células (tais como células que expressam Efrina B2) em fase S.Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes quebloqueiam o progresso do ciclo celular (em local diferente da fase S), tais comoagentes que induzem a suspensão de G1 e a suspensão da fase M.Bloqueadores clássicos de fase M incluem as vincas (vincristina e vinblastina),taxanos e inibidores da topoisomerase II, tais como doxorubicina, epirubicina,daunorubicina, etoposida e bleomicina. Os agentes que prendem G1 tambéminvadem a prisão da fase S, por exemplo, agentes alquilantes de DNA, taiscomo tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina,metotrexato, 5-fluorouracil e ara-C. Informações adicionais podem serencontradas em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e Israel, eds.,Capítulo 1, intitulado Cell Cycle Regulation, Oncogenes and AntineoplasticDrugs de Murakami et al (WB Saunders: Filadélfia, 1995), especialmente pág.13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são drogas anticancerígenas, ambasderivadas da árvore de teixo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer),derivado do teixo europeu, é análogo semi-sintético de paclitaxel (TAXOL®,Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel e docetaxel promovem a reunião demicrotúbulos a partir de dímeros de tubulina e estabilizam microtúbulos aoevitarem a despolimerização, o que resulta na inibição de mitose em células.
"Doxorubicina" é antibiótico de antraciclina. O nome químicocompleto de doxorubicina é (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideóxi-a-L-lixo-hexapiranosil)óxi]-7,8,9,10-tetraidro-6,8,11 -tri-hidróxi-8-(hidroxiacetil)-1 -metóxi-5,12-naftacenodiona.
A expressão "composição antineoplástica" designa composiçãoútil no tratamento de câncer que compreende pelo menos um agenteterapêutico ativo, tal como "agente anticancerígeno". Exemplos de agentesterapêuticos (agentes anticancerígenos, também denominados "agentesantineoplásticos" no presente) incluem, mas sem limitar-se, por exemplo, aagentes quimioterapêuticos, agentes inibidores do crescimento, agentescitotóxicos, agentes utilizados em terapia de radiação, agentesantiangiogênese, agentes apoptóticos, agentes antitubulina, toxinas e outrosagentes para o tratamento de câncer, tais como anticorpo neutralizador anti-VEGF, antagonista de VEGF, anti-HER-2, anti-CD20, antagonista receptor defator de crescimento epidérmico (EGFR) (tal como inibidor de tirosino quinase),inibidor de HER1/EGFR, erlotinib, inibidor de COX-2 (tal como celecoxib),interferonas, citoquinas, antagonistas (tais como anticorpos neutralizantes) quese unem a um ou mais dos receptores de ErbB2, ErbB3, ErbB4 ou VEGF,inibidores de tirosino quinases receptoras para fator de crescimento derivadode plaquetas (PGDF) e/ou fator de células haste (SCF) (tais como mesilato deimatinib (Gleevec® da Novartis)), TRAIL/Apo2, outros agentes químicosorgânicos e bioativos etc.
O termo "pró-droga", da forma utilizada no presente pedido,designa forma precursora ou derivada de substância farmaceuticamente ativaque é menos citotóxica para células tumorosas em comparação com a drogaparental e é capaz de ser ativada de forma enzimática ou convertida na formaparental mais ativa. Vide, por exemplo, Wilman, Prodrugs in CâncerChemotherapy, Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375-382, 615aReunião de Belfast (1986) e Stella et al, Prodrugs: A Chemical Approach toTargeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery, Borchardt et al, (ed.), págs.247-267, Humana Press (1985). As pró-drogas de acordo com a presenteinvenção incluem, mas não se limitam a pró-drogas que contêm fosfato, pró-drogas que contêm tiofosfato, pró-drogas que contêm sulfato, pró-drogas quecontêm peptídeos, pró-drogas modificadas com D-aminoácidos, pró-drogasglicosiladas, pró-drogas que contêm beta-lactama, pró-drogas que contêmfenoxiacetamida opcionalmente substituída ou pró-drogas que contêmfenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorocitosina e outras pró-drogasde 5-fluorouridina que podem ser convertidas na droga livre citotóxica maisativa. Exemplos de drogas citotóxicas que podem ser derivadas em forma depró-droga para uso na presente invenção incluem, mas sem limitar-se aosagentes quimioterapêuticos descritos acima.
"Agente antiangiogênese" ou "inibidor da angiogênese" indicasubstância com baixo peso molecular, polinucleotídeo, polipeptídeo, proteínaisolada, proteína recombinante, anticorpo ou seus conjugados ou proteínas defusão, que inibe a angiogênese, vasculogênese ou permeabilidade vascularindesejável, seja direta ou indiretamente. Agente antiangiogênese, porexemplo, é anticorpo ou outro antagonista para agente angiogênico conformedefinido acima, taiscomo anticorpos para VEGF, anticorpos para receptores deVEGF, moléculas pequenas que bloqueiam a sinalização de receptores deVEGF (tais como PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT/SU11248 (malato desunitinib), AMG706). Agents antiangiogênese também incluem inibidores daangiogênese antivos, tais como angiostatina, endostatina etc. Vide, porexemplo, Klagsbrun e D1Amore, Annu. Rev. Physiol., 53: 217-39 (1991); Streit eDetmar, Oncogene, 22: 3172-3179 (2003) (por exemplo, a Tabela 3, querelaciona terapia antiangiogênica em melanoma maligno); Ferrara e Alitalo1Nature Medicine 5 (12): 1359-1364 (1999); Tonini et al, Oncogene, 22: 6549-6556 (2003) (por exemplo, a Tabela 2, que relaciona fatores antiangiogênicos;e Sato, Int. J. Clin. Oncol., 8: 200-206 (2003) (por exemplo, a Tabela 1, querelaciona agentes antiangiogênicos utilizados em testes clínicos).
Composições de acordo com a presente invenção ε métodos de suafabricação
A presente invenção engloba composições, que incluemcomposições farmacêuticas, que compreendem anticorpo anti-Efrina B2; epolinucleotídeos que compreendem seqüências que codificam anticorpo anti-Efrina B2. Da forma utilizada no presente, composições compreendem um oumais anticorpos que se unem a Efrina B2 e/ou um ou mais polinucleotídeos quecompreendem seqüências que codificam um ou mais anticorpos que se unem aEfrina B2. Estas composições podem compreender adicionalmente veículosapropriados, tais como excipientes farmaceuticamente aceitáveis que incluemtampões, que são bem conhecidos na técnica.
A presente invenção também engloba realizações depolinucleotídeos e anticorpos isolados. A presente invenção também englobarealizações de polinucleotídeos e anticorpos substancialmente puros.
Os anticorpos anti-Efrina B2 de acordo com a presente invençãosão preferencialmente monoclonais. Também são englobados no escopo dapresente invenção fragmentos de Fab, Fab', Fab1-SH e F(ab')2 dos anticorposanti-Efrina B2 fornecidos no presente. Estes fragmentos de anticorpos podemser criados por meios tradicionais, tais como digestão enzimática, ou podemser gerados por meio de métodos recombinantes. Esses fragmentos deanticorpos podem ser quiméricos ou humanizados. Esses fragmentos são úteispara os propósitos terapêuticos e de diagnóstico descritos abaixo.
Os anticorpos monoclonais são obtidos a partir de população deanticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuaisque compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutaçõesde ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores.Desta forma, o adjetivo "monoclonal" indica a característica do anticorpo comonão sendo mistura de anticorpos discretos.
Os anticorpos monoclonais anti-Efrina B2 de acordo com apresente invenção podem ser elaborados utilizando o método de hibridomadescrito pela primeira vez por Kohler et al, Nature 256: 495 (256:495) oupodem ser elaborados por meio de métodos de DNA recombinantes (PatenteNorte-Americana n0 4.816.567).
No método de hibridoma, um camundongo ou outro animalhospedeiro apropriado, tal como hamster, é imunizado para gerar linfócitos queproduzem ou são capazes de produzir anticorpos que se unemespecificamente à proteína utilizada para imunização. Os anticorpos paraEfrina B2 são geralmente elevados em animais por meio de diversas injeçõessubcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) de Efrina B2 e um adjuvante. Efrina B2pode ser preparada utilizando métodos bem conhecidos na técnica, alguns dosquais são descritos adicionalmente no presente. A produção recombinante deEfrina B2, por exemplo, é descrita abaixo. Em uma realização, os animais sãoimunizados com derivado de Efrina B2 que contém o domínio extracelular(ECD) de Efrina B2 fundido à parte Fc de cadeia pesada de imunoglobulina.
Em realização preferida, os animais são imunizados com proteína de fusão deEfrina B2-lgG1. Os animais são normalmente imunizados contra conjugadosimunogênicos ou derivados de Efrina B2 com monofosforil lipídio A(MPL)/dicrinomicolato de trehalose (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc.,Hamilton MT) e a solução é injetada por via intradérmica em vários locais. Duassemanas mais tarde, os animais são incentivados. Sete a quatorze dias maistarde, os animais são sangrados e o soro é testado para titulagem de anti-Efrina b2. Os animais são incentivados até a estabilização do título.
Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Oslinfócitos são fundidos em seguida a células de mieloma, utilizando agente defusão apropriado, tal como polietileno glicol, para formar célula de hibridoma(Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, págs. 59-103(Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma preparadas desta forma são semeadas ecultivadas em meio de cultivo apropriado que contém preferencialmente umaou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das célulasde mieloma parentais não fundidas. Caso as células de mieloma parentais nãocontenham a enzima hipoxantino guanina fosforibosil transferase (HGPRT ouHPRT), por exemplo, o meio de cultivo para os hibridomas incluirá tipicamentehipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam ocrescimento de células com deficiência de HGPRT.
Células de mieloma preferidas são aquelas que se fundemeficientemente, apoiam a produção estável em alto nível de anticorpos pelascélulas produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a meio tal comomeio HAT. Dentre estas, as linhagens celulares de mieloma preferidas sãolinhagens de mieloma murino, tais como as derivadas de tumores decamundongos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis por meio do Salk Institute CellDistribution Center, San Diego, Califórnia, Estados Unidos, e células SP-2 ouX63-Ag8-653 disponíveis por meio da Coleção Norte-Americana de Cultivos deTipos, Rockville, Maryland, Estados Unidos. Linhagens celulares de mielomahumano e heteromieloma humano-de camundongos também foram descritaspara a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol.,133: 3001 (1984); e Brodeuret al, Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications, págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)).
O meio de cultivo em que são cultivadas células de hibridoma étestado para determinar a produção de anticorpos monoclonais dirigidos aEfrina B2. Preferencialmente, a especificidade de união de anticorposmonoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por meio deimunoprecipitação ou de ensaio de união in vitro, tais como radioimunoensaio(RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado por enzimas (ELISA).
A afinidade de união do anticorpo monoclonal pode serdeterminada, por exemplo, por meio da análise Scatchard de Munson et al,Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
Após a identificação de células de hibridoma que produzemanticorpos com a especificidade, afinidade e/ou atividade desejada, os clonespodem ser subclonados por meio de limitação de procedimentos de diluição ecultivados por meio de métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies:Principies and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). Os meios decultivo apropriados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ouRPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivona forma de tumores de ascite em animal.
Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones sãoadequadamente separados do meio de cultivo, fluido de ascite ou soro pormeio de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina, taiscomo proteína A Sepharose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese degel, diálise ou cromatografia de afinidade.
Os anticorpos anti-Efrina B2 de acordo com a presente invençãopodem ser elaborados utilizando bibliotecas convencionais para selecionarclones de anticorpos sintéticos com a(s) atividade(s) desejada(s). Em princípio,clones de anticorpos sintéticos são selecionados por meio de escolha debibliotecas de fagos que contêm fagos que exibem vários fragmentos de regiãovariável de anticorpos (Fv) fundidos à proteína de revestimento de fagos. Essasbibliotecas de fagos são combinadas por meio de cromatografia de afinidadecontra o antígeno desejado. Clones que expressam fragmentos de Fv capazesde unir-se ao antígeno desejado são adsorvidos ao antígeno e, desta forma,separados dos clones não de união na biblioteca. Os clones de união sãoeluídos em seguida do antígeno e podem ser adicionalmente enriquecidos porciclos adicionais de adsorção e eluição de antígenos. Qualquer dos anticorposanti-Efrina B2 de acordo com a presente invenção pode ser obtido projetando-se procedimento de seleção de antígenos apropriado para selecionar o clonede fago de interesse, seguido pela construção de clone de anticorpo anti-EfrinaB2 de comprimento total utilizando as seqüências de Fv do clone de fago deinteresse e seqüências de região constante (Fc) apropriadas descritas emKabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição,Publicação NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.
O domínio de união de antígenos de anticorpo é formado a partirde duas regiões variáveis (V) de cerca de 110 aminoácidos, uma de cada umadas cadeias leve (VL) e pesada (VH)1 em que ambas apresentam três circuitoshipervariáveis ou regiões de determinação de complementaridade (CDRs).Domínios variáveis podem ser exibidos funcionalmente sobre fago, seja naforma de fragmentos de Fv de cadeia única (scFv), nos quais VH e VL sãoligados covalentemnte por meio de peptídeo flexível curto, ou como fragmentosde Fab, em que cada um é fundido a domínio constante e interage de formanão covalente, conforme descrito em Winteret al, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Da forma utilizada no presente, clones de fagos que codificam scFve clones de fagos que codificam Fab são denominados coletivamente "clonesde fagos Fv" ou "clones Fv".
Repertórios de genes VH e VL podem ser clonadosseparadamente por meio de reação em cadeia de polimerase (PCR) enovamente combinados aleatoriamente em bibliotecas de fagos, que podemser pesquisadas em seguida em busca de clones de união de antígenosconforme descrito em Winter et al, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994).Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos com alta afinidade para oimunogene sem a necessidade de construção de hibridomas. Alternativamente,o repertório nativo pode ser clonado para fornecer uma única fonte deanticorpos humanos para ampla variedade de antígenos próprios e nãopróprios sem nenhuma imunização, conforme descrito por Griffiths et al,,EMBO J., 12: 725-734 (1993). Por fim, bibliotecas nativas podem também serelaboradas sinteticamente por meio de clonagem dos segmentos de genes Vnão redispostos de células haste, utilizando primers de PCR que contêmseqüência aleatória para codificar as regiões de CDR3 altamente variáveis erealizar redisposição in vitro conforme descrito por Hoogenboom e Winter, J.Mo/. Biol., 227: 381-388 (1992).
Fago filamentoso é utilizado para exibir fragmentos de anticorpospor meio de fusão para a proteína de revestimento menor plll. Os fragmentosde anticorpos podem ser exibidos na forma de fragmentos de Fv de fita única,em que os domínios VH e VL são conectados sobre a mesma cadeia depolipeptídeos por espaçador de polipeptídeos flexível, tal como conformedescrito por Marks et al, J. Moi Biol., 222: 581-597 (1991), ou na forma defragmentos de Fab, em que uma cadeia é fundida a plll e a outra é secretadapara o periplasma da célula hospedeira bacteriana, onde ocorre a montagemde estrutura de proteína de revestimento de Fab que é exibida sobre asuperfície de fago por meio de deslocamento de algumas das proteínas derevestimento do tipo selvagem, tal como conforme descrito em Hoogenboom etal, Nuci Acids Res., 19: 4133-4137 (1991).
De forma geral, fragmentos de genes de anticorpos que codificamácidos nucleicos são obtidos de células imunes colhidas de seres humanos ouanimais. Caso se deseje biblioteca orientada em favor de clones anti-Efrina B2,o paciente é imunizado com Efrina B2 para gerar resposta de anticorpos ecélulas do baço e/ou células B em circulação diferentes de linfócitos do sangueperiférico (PBLs) são recuperadas para construção de bibliotecas. Emrealização preferida, biblioteca de fragmentos de genes de anticorpos humanosorientada em favor de clones anti-Efrina B2 é obtida por meio da geração deresposta de anticorpo anti-Efrina B2 em camundongos transgênicos queconduzem conjunto de genes de imunoglobulina humana funcional (e que nãopossuem sistema de produção de anticorpos endógenos funcionais), de formaque a imunização de Efrina B2 gere células B que produzem anticorposhumanos contra Efrina B2. A geração de camundongos transgênicosprodutores de anticorpos humanos é descrita abaixo.
Enriquecimento adicional para populações de células reativasanti-Efrina B2 pode ser obtido utilizando procedimento de seleção apropriadopara isolar células B que expressam anticorpo unido a membrana específica deEfrina B2, tal como por meio de separação celular com cromatografia deafinidade de Efrina B2 ou adsorção de células a Efrina B2 marcada comfluorocromo seguida por seleção de células ativada por fluxo (FACS).
Alternativamente, o uso de células do baço e/ou células B ououtros PBLs de doador não imunizado fornece melhor representação dopossível repertório de anticorpos e também permite a construção de bibliotecade anticorpos utilizando qualquer espécie animal (humana ou não humana) naqual Efrina B2 não seja antigênica. Para bibliotecas que incorporam construçãode genes de anticorpos in vitro, células haste são colhidas do paciente parafornecer ácidos nucleicos que codificam segmentos de genes de anticorposnão redispostos. As células imunes de interesse podem ser obtidas a partir deuma série de espécies animais, tais como seres humanos, camundongos,ratos, lagomorfos, luprinos, caninos, felinos, suínos, bovinos, eqüinos, aves etc.
Segmentos genéticos variáveis de anticorpos que codificamácidos nucleicos (incluindo segmentos VH e VL) são recuperados das célulasde interesse e amplificados. No caso de bibliotecas de genes VH e VLredispostos, o DNA desejado pode ser obtido por meio de isolamento de mRNAou DNA genômico de linfócitos, seguido por reação em cadeia de polimerase(PCR) com primers coincidentes com as extremidades 5' e 3' de genes VH eVL redispostos conforme descrito em Orlandi et al, Proc. Natl. Acad. Sei. (U. S.A.), 86: 3833-3837 (1989), de forma a elaborar diversos repertórios de genes Vpara expressão. Os genes V podem ser amplificados a partir de cDNA e DNAgenômico, com primers traseiros na extremidade 5' do exon que codifica odomínio V maduro e primers frontais com base no segmento J conformeA descrito em Orlandi et al (1989) e em Ward et al, Nature, 341: 544-546 (1989).Para amplificação a partir de cDNA, entretanto, primers traseiros podemtambém basear-se no exon líder conforme descrito em Jones et al, Biotechnol.,9: 88-89 (1991) e primers frontais no interior da região constante, conformedescrito em Sastry et al, Proc. Natl. Acad. Sei. (U. S. A.), 86: 5728-5732 (1989).Para maximizar a complementaridade, a degeneração pode ser incorporadaaos primers conforme descrito em Orlandi et al (1989) ou Sastry et al (1989).Preferencialmente, a diversidade da biblioteca é maximizada utilizando primersde PCR dirigidos a cada família de gene V, a fim de amplificar todas asdisposições de VH e VL disponíveis presentes na amostra de ácido nucleico dacélula imune, tal como conforme descrito no método de Marks et al, J. MoiBiol., 222: 581-597 (1991) ou conforme descrito no método de Orum et al,,Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Para clonagem do DNA amplificadoem vetores de expressão, locais de restrição raros podem ser introduzidos noprimer de PCR na forma de marca em uma extremidade conforme descrito emOrlandi et al (1989), ou por meio de amplificação por PCR adicional com primermarcado conforme descrito em Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991).
Repertórios de genes V redispostos sinteticamente podem serderivados in vitro a partir de segmentos de genes V. A maior parte dossegmentos de genes VH humanos foi clonada e seqüenciada (relatada emTomlinson et al, J. Moi Bioi, 227: 776-798 (1992)) e mapeada (relatada emMatsuda et al, Nature Genet., 3 : 88-94 (1993); estes segmentos clonados(incluindo todas as principais conformações do circuito H1 e H2) podem serutilizados para gerar diversos repertórios de genes VH com primers de PCRque codificam circuitos H3 de comprimento e seqüência diversa conformedescrito em Hoogenboom e Winter, J. Moi Biol., 227: 381-388 (1992).Repertórios de VH podem também ser elaborados com toda a diversidade deseqüências concentrada em circuito H3 longo de comprimento único conforme, descrito em Barbas et al, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A., 89:4457-4461 (1992).Segmentos Vk e νλ humanos foram clonados e seqüenciados (relatados emWilliams e Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) e podem serutilizados para elaborar repertórios de cadeia leve sintéticos. Repertórios degenes V sintéticos, com base em uma série de dobras VH e VL1 ecomprimentos L3 e H3 codificarão anticorpos com diversidade estruturalconsiderável. Após a amplificação de DNAs que codificam genes V, segmentosde genes V de linha de gérmens podem ser redispostos in vitro de acordo comos métodos de Hoogenboom e Winter, J. Moi Biol., 227: 381-388 (1992).
Repertórios de fragmentos de anticorpos podem ser elaboradospor meio de combinação de repertórios de genes VH e VL entre si de diversasformas. Cada repertório pode ser criado em diferentes vetores e os vetoresrecombinados in vitro, tal como conforme descrito em Hogrefe et al, Gene, 128:119-126 (1993), ou in vivo por meio de infecção combinatória, tal como osistema IoxP descrito em Waterhouse et al, Nuci Acids Res., 21: 2265-2266(1993). A abordagem de recombinação in vivo explora a natureza de duascadeias de fragmentos de Fab para superar o limite de tamanho de bibliotecasimposto pela eficiência de transformação de E. coli. Repertórios de VH e VLnativos são clonados separadamente, um em fagomídeo e o outro em reator defago. As duas bibliotecas são combinadas em seguida por meio de infecção defago de bactérias que contêm fagomídeos, de forma que cada célula contenhacombinação diferente e o tamanho da biblioteca seja limitado somente pelonúmero de células presentes (cerca de 1012 clones). Os dois vetores contêmsinais de recombinação in vivo, de forma que os genes VH e VL sejamrecombinados em uma única réplica e sejam coembalados em viriões de fagos.Estas enormes bibliotecas fornecem grandes quantidades de anticorposdiversos com boa afinidade (Kd"1 de cerca de 10"8 M).
Alternativamente, os repertórios podem ser clonadosfc seqüencialmente no mesmo vetor, tal como conforme descrito em Barbas et al,Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A., 88: 7978-7982 (1991), ou montados juntos pormeio de PCR e clonados em seguida, tal como conforme descrito em Clacksonet al, Nature, 352: 624-628 (1991). A montagem de PCR pode também serutilizada para unir DNAs de VH e VL com DNA que codifica espaçador depeptídeo flexível para formar repertórios de Fv de fita única (scFv). Em aindaoutro método, "montagem por PCR em célula" é utilizada para combinar genesVH e VL em linfócitos por meio de PCR e, em seguida, repertórios de clones degenes ligados conforme descrito em Embleton et al, Nuci Acids Res., 20: 3831-3837(1992).
Os anticorpos produzidos por bibliotecas nativas (sejam elasnaturais ou sintéticas) podem possuir afinidade moderada (Kd"1 de cerca de 106a 107 M"1), mas amadurecimento por afinidade pode também ser imitado in vitropor meio da construção e nova seleção de bibliotecas secundárias conformedescrito em Winter et al (1994), acima. Mutação pode ser introduzida, porexemplo, aleatoriamente in vitro utilizando polimerase à prova de erros(relatada em Leung et al, Technique, 1: 11-15 (1989)) no método de Hawkins etal, J. Moi Bioi, 226: 889-896 (1992) ou no método de Gram et al, Proc. Natl.Acad. Sei. U. S. A., 89: 3576-3580 (1992). Além disso, amadurecimento porafinidade pode ser realizado por meio de mutação aleatória de um ou maisCDRs, tal como utilizando PCR com primers que conduzem varrimento deseqüências aleatórias do CDR de interesse, em clones Fv individuaisselecionados e seleção em busca de clones com afinidade mais alta. WO96/07754 (publicada em 14 de março de 1996) descreveu método de induçãoda mutagênese em região de determinação da complementaridade de cadeialeve de imunoglobulina para criar biblioteca de genes de cadeia leve. Outraabordagem eficaz é a recombinação dos domínios VH ou VL selecionados pormeio de exibição de fagos com repertórios de variantes de domínio V dec ocorrência natural obtidas de doadores não imunizados e seleção em busca deafinidade mais alta em várias rodadas de redisposição de cadeias, conformedescrito em Marks et al, Biotechnol. 10: 779-783 (1992). Este método permite aprodução de anticorpos e fragmentos de anticorpos com afinidades na faixa deIO-9M.
Seqüências de aminoácidos e ácidos nucleicos de Efrina B2 sãoconhecidas na técnica. Seqüência de ácido nucleica que codifica Efrina B2pode ser projetada utilizando a seqüência de aminoácidos da região desejadade Efrina B2. Alternativamente, a seqüência de cDNA (ou seus fragmentos) deAcesso GenBank n° NM_004093, pode ser utilizada. Ácidos nucleicos quecodificam Efrina B2 podem ser preparados por meio de uma série de métodosconhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas sem limitar-se a síntesequímica por meio de qualquer dos métodos descritos em Engels et al, Agnew.Chem. Int Ed. Engl., 28: 716-734 (1989), tais como os métodos de triésteres,fosfito, fosforamidita e H-fosfonato. Em uma realização, os códons preferidospela célula hospedeira de expressão são utilizados no projeto do DNA quecodifica Efrina B2. Alternativametne, DNA que codifica a Efrina B2 pode serisolado a partir de biblioteca genômica ou de cDNA.
Após a construção da molécula de DNA que codifica a Efrina B2,a molécula de DNA é ligada operativamente a seqüência de controle deexpressão em vetor de expressão, tal como plasmídeo, em que a seqüência decontrole é reconhecida por célula hospedeira transformada com o vetor.Geralmente, vetores de plasmídeos contêm seqüências de reprodução e decontrole que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira.
O vetor normalmente conduz um local de reprodução, bem como seqüênciasque codificam proteínas que são capazes de fornecer seleção fenotípica emcélulas transformadas. Os vetores apropriados para expressão em célulashospedeiras procarióticas e eucarióticas são conhecidas na técnica e algumasc, são adicionalmente descritas no presente. Organismos eucarióticos, tais comoleveduras, ou células derivadas de organismos multicelulares, tais comomamíferos, podem ser utilizadas.
Opcionalmente, o DNA que codifica a Efrina B2 é ligadooperativamente a seqüência líder de secreção, resultando em secreção doproduto de expressão pela célula hospedeira para o meio de cultivo. Exemplosde seqüências líderes de secreção incluem stll, ecotina, IamB1 GD herpes, Ipp,fosfatase alcalina, invertase e fator alfa. Também é apropriada para uso nopresente a seqüência líder de 36 aminoácidos de proteína A (Abrahmsen et al,EMBO J., 4: 3901 (1985)).
As células hospedeiras são transfectadas e preferencialmentetransformadas com os vetores de expressão ou clonagem de acordo com apresente invenção descritos acima e cultivadas em meios nutrientesconvencionais modificados conforme apropriado para a indução de promotores,seleção de transformadores ou amplificação dos genes que codificam asseqüências desejadas.
Transfecção designa a tomada de vetor de expressão por célulahospedeira, sejam ou não de fato expressas quaisquer seqüências decodificação. São conhecidos numerosos métodos de transfecção pelostécnicos comuns no assunto, tais como precipitação de CaPO4 e eletroporação.A transfecção bem sucedida geralmente é reconhecida quando qualquerindicação da operação deste vetor ocorre no interior da célula hospedeira. Osmétodos de transfecção são bem conhecidos na técnica e alguns deles sãoadicionalmente descritos no presente.
Transformação indica a introdução de DNA em um organismo, detal forma que o DNA seja reproduzível, seja na forma de elementoextracromossômico ou por integrante cromossômico. Dependendo da célulahospedeira utilizada, a transformação é realizada utilizando métodos padrãoapropriados para essas células. Os métodos de transformação são bemconhecidos na técnica e alguns deles são adicionalmente descritos nopresente.
As células hospedeiras procarióticas utilizadas para a produçãode Efrina B2 podem ser cultivadas conforme descrito de forma geral emSambrook et al, acima.
As células hospedeiras de mamíferos utilizadas para produzirEfrina B2 podem ser cultivadas em uma série de meios, o que é bemconhecido na técnica e alguns deles são descritos no presente.
As células hospedeiras indicadas no presente relatório descritivoenglobam células em cultivo in vitro, bem como células que se encontramdentro de animal hospedeiro.
A purificação de Efrina B2 pode ser realizada utilizando métodosreconhecidos na técnica, alguns dos quais são descritos no presente.
A Efrina B2 purificada pode ser ligada a matriz apropriada, talcomo esferas de agarose, esferas de acrilamida, esferas de vidro, celulose,vários copolímeros acrílicos, géis de metacrilto de hidroxila, copolímerospoliacrílicos e polimetacrílicos, nylon, veículos neutros e iônicos e similares,para uso na separação cromatográfica por afinidade de clones de exibição defagos. A ligação da proteína Efrina B2 à matriz pode ser realizada por meio dosmétodos descritos em Methods in Enzymology, vol. 44 (1976). Métodocomumente empregado para ligar Iigantes de proteína a matrizes depolissacarídeos, tais como agarose, dextran ou celulose, envolve a ativação doveículo com haletos de cianogênio e subseqüente acoplamento das aminasalifáticas ou aromáticas primárias do Iigante de peptídeo à matriz ativada.
Alternativamente, Efrina B2 pode ser utilizada para revestir ascavidades de placas de adsorção, expressas sobre células hospedeirasafixadas a placas de adsorção ou utilizadas em seleção celular, ou conjugadasa biotina para captura com esferas revestidas com estreptavidina, ou utilizadasem qualquer outro método conhecido na técnica para combinação debibliotecas de exibição de fagos.
As amostras de bibliotecas de fagos são colocadas em contatocom Efrina B2 imobilizada sob condições apropriadas para união de pelomenos uma parte das partículas de fago com o adsorvente. Normalmente, ascondições, incluindo pH, resistência iônica, temperatura e similares sãoselecionadas para imitar condições fisiológicas. Os fagos unidos à fase sólidasão lavados e eluídos em seguida por ácido, tal como conforme descrito emBarbas et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 88: 7978-7982 (1991), ou porálcali, conforme descrito, por exemplo, em Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), ou por meio de competição de antígeno Efrina B2, tal como emprocedimento similar ao método de competição de antígenos de Clackson et al,Nature, 352: 624-628 (1991). Os fagos podem ser enriquecidos vinte a milvezes em uma única rodada de seleção. Além disso, os fagos enriquecidospodem ser cultivados em cultivo bacteriano e submetidos a rodadas de seleçãoadicionais.
A eficiência da seleção depende de muitos fatores, que incluem acinética de dissociação durante a lavagem e se diversos fragmentos deanticorpos em um único fago podem encaixar-se simultaneamente comantígeno. Anticorpos com rápida cinética de dissociação (e afinidade de uniãofraca) podem ser retidos pelo uso de pequenas lavagens, exibição de fagosmultivalentes e alta densidade de revestimento de antígeno em fase sólida. Aalta densidade não apenas estabiliza o fago por meio de interaçõesmultivalentes, mas favorece a reunião de fago que se dissociou. A seleção deanticorpos com cinética de dissociação lenta (e boas afinidades de união) podeser promovida pelo uso de longas lavagens e exibição de fagos monovalentesconforme descrito em Bass et al, Proteins, 8: 309-314 (1990) e em WO92/09690 e baixa densidade de revestimento de antígeno conforme descrito emMarks et al, Biotechnol., 10: 779-783 (1992).
É possível selecionar entre anticorpos de fagos com afinidadesdiferentes, mesmo com afinidades que diferem levemente, para Efrina B2. Amutação aleatória de anticorpo selecionado (tal como conforme realizado emalguns dos métodos de amadurecimento por afinidade descritos acima) épropensa a gerar muitos mutantes, a maior parte deles unindo-se a antígeno, epoucos com afinidade mais alta. Limitando-se a Efrina B2, raros fagos com altaafinidade poderão ser completados. Para reter todos os mutantes comafinidade mais alta, fagos podem ser incubados com excesso de Efrina B2biotinilada, mas com a Efrina B2 biotinilada sob concentração com molaridademais baixa que a constante de afinidade molar alvo para Efrina B2. Os fagos deunião com alta afinidade podem ser capturados em seguida por esferasparamagnéticas revestidas com estreptavidina. Essa "captura de equilíbrio"permite que os anticorpos sejam selecionados de acordo com as suasafinidades de união, com sensibilidade que permite o isolamento de clonesmutantes com afinidade até duas vezes mais alta a partir de grande excesso defagos com afinidade mais baixa. As condições empregadas em fagos delavagem unidos a fase sólida podem também ser manipuladas paradiscriminação com base na cinética de dissociação.
Clones anti-Efrina B2 podem ser selecionados ativamente. Emuma realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-Efrina B2 quebloqueiam a união entre receptor de EphB (tal como EphBI, EphB2 e/ouEphB3) e Efrina B2, mas não bloqueiam a união entre receptor de EphB esegunda proteína (tal como Efrina B1 e/ou Efrina B3). Clones Fvcorrespondentes a esses anticorpos anti-Efrina B2 podem ser selecionados pormeio de (1) isolamento de clones anti-Efrina B2 de biblioteca de fagosconforme descrito acima e amplificação opcional da população isolada de-clones de fagos por meio de cultivo da população em hospedeiro bacterianoapropriado; (2) seleção de Efrina B2 e segunda proteína contra a qual sedeseja atividade de bloqueio e ausência de bloqueio, respectivamente; (3)adsorção dos clones de fagos anti-Efrina B2 a Efrina B2 imobilizada; (4)utilizando excesso da segunda proteína para eluir quaisquer clonesindesjeados que reconheçam determinantes de união a Efrina B2 que sesobrepõem ou são compartilhados com os determinantes de união da segundaproteína; e (5) eluição dos clones que permanecem adsorvidos após a etapa(4). Opcionalmente, clones com as propriedades de bloqueio e não bloqueiodesejadas podem ser adicionalmente enriquecidos por meio de repetição dosprocedimentos de seleção descritos no presente uma ou mais vezes.
O DNA codificador dos anticorpos monoclonais derivados dehibridoma ou clones Fv de exibição de fagos de acordo com a presenteinvenção é facilmente isolado e seqüenciado utilizando procedimentosconvencionais (empregando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeosprojetadas para amplificar especificamente as regiões de codificação de cadeialeve e pesada de interesse de modelo de DNA de fago ou hibridoma). Uma vezisolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que sãotransfectados em seguida para células hospedeiras, tais como células de E.coli, células COS de símios, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) oucélulas de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína deimunoglobulina, para obter a síntese dos anticorpos monoclonais nas célulashospedeiras recombinantes. Os artigos de análise sobre a expressãorecombinante em bactérias de DNA que codifica o anticorpo incluem Skerra etal, Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) e Plückthun, Immunol. Revs., 130:151 (1992).
DNA que codifica os clones Fv de acordo com á presenteinvenção pode ser combinado com seqüências de DNA conhecidas quecodificam regiões constantes de cadeia pesada e/ou cadeia leve (asseqüências de DNA apropriadas podem ser obtidas, por exemplo, a partir deKabat et al, acima) para formar clones que codificam cadeias leves e/oupesadas com comprimento total ou parcial. Apreciar-se-á que regiõesconstantes de qualquer isotipo podem ser utilizadas com este propósito,incluindo regiões constantes de IgG1 IgM1 IgA1 IgD e IgE1 e que essas regiõesconstantes podem ser obtidas a partir de qualquer espécie humana ou animal.Clone de Fv derivado do DNA de domínio variável de uma espécie animal (talcomo humana) e fundido em seguida a DNA de região constante de outraespécie animal para formar seqüência(s) de codificação para "híbrido", cadeialeve e/ou cadeia pesada de comprimento total é incluída na definição deanticorpo "quimérico" e "híbrido" conforme utilizado no presente. Em realizaçãopreferida, clone de Fv derivado de DNA variável humano é fundido a DNA deregião constante humana para formar seqüência(s) de codificação para todasas cadeias leves e/ou pesadas com comprimento total ou parcial humanas.
O DNA que codifica anticorpo anti-Efrina B2 derivado dehibridoma de acordo com a presente invenção pode também ser modificado,por exemplo, por meio da substituição da seqüência de codificação pordomínios constantes de cadeia leve e pesada humanos no lugar dasseqüências murinas homólogas derivadas do clone de hibridoma (tal como deacordo com o método de Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 81:6851-6855 (1984)). DNA que codifica hibridoma ou anticorpo derivado de cloneFv ou fragmento pode ser adicionalmente modificado por meio de uniãocovalente da seqüência de codificação de imunoglobulina com a seqüência decodificação para polipeptídeo não de imunoglobulina, no todo ou em parte.Desta forma, são preparados anticorpos "quiméricos" ou "híbridos" quepossuem a especificidade de união do clone Fv ou anticorpos derivados declone de hibridoma de acordo com a presente invenção.Fragmentos de anticorpos
A presente invenção engloba fragmentos de anticorpos. Emcertas circunstâncias, existem vantagens na utilização de fragmentos deanticorpos e não anticorpos inteiros. O menor tamanho dos fragmentos permiteliberação rápida e pode gerar maior acesso a tumores sólidos.
Foram desenvolvidas diversas técnicas de produção defragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivadospor meio de digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide por exemplo,Morimoto et al, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117(1992); e Brennan et al, Science 229: 81 (1985)). Entretanto, esses fragmentospodem ser agora produzidos diretamente por células hospedeirasrecombinantes. Fragmentos de anticorpos Fab, Fv e ScFv podem todos serexpressos em E. coli e dele secretados, de forma a permitir a produção fluentede grandes quantidades desses fragmentos. Os fragmentos de anticorpospodem ser isolados a partir das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidasacima. Alternativamente, fragmentos de Fab1-SH podem ser recuperadosdiretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos deF(ab')2 (Carter et al, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com outraabordagem, fragmentos de F(ab')2 podem ser isolados diretamente a partir decultivo de células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de Fab e F(ab')2com maior meia-vida in vivo que compreendem resíduos de epítopos de uniãode receptores de recuperação são descritos na Patente Norte-Americana n°5.869.046. Outras técnicas de produção de fragmentos de anticorpos serãoevidentes para os técnicos no assunto. Em outras realizações, o anticorposelecionado é fragmento de Fv de fita única (scFv). Vide WO 93/16185;Patentes Norte-Americanas n° 5.571.894 e 5.587.458. Fv e sFv são as únicasespécies com locais de combinação intactos que são desprovidos de regiõesconstantes; por isso, elas são apropriadas para reduzida união não específicadurante a utilização in vivo. Proteínas de fusão de sFv podem ser contruídaspara gerar a fusão de proteína efetora no terminal amino ou carbóxi de sFv.Vide Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, acima. O fragmento de anticorpopode também ser "anticorpo linear", conforme descrito, por exemplo, naPatente Norte-Americana n° 5.641.870. Esses fragmentos de anticorposlineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.
Anticorpos Humanizados
A presente invenção engloba anticorpos humanizados. Váriosmétodos de humanização de anticorpos não humanos são conhecidos natécnica. Um anticorpo humanizado pode conter, por exemplo, um ou maisresíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de fonte que não é humana.Estes resíduos de aminoácidos não humanos são freqüentementedenominados resíduos "importados", que são tomados tipicamente a partir dedomínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmenterealizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et al, (1986)Nature 321: 522-525; Riechmann et al (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyenet al (1988), Science 239: 1534-1536), por meio da substituição de seqüênciasde regiões hipervariáveis pelas seqüências correspondentes de anticorpohumano. Conseqüentemente, esses anticorpos "humanizados" são anticorposquiméricos (Patente Norte-Americana n° 4.816.567), em que substancialmentemenos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüênciacorrespondente de espécie não humana. Na prática, os anticorposhumanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduosde regiões hipervariáveis e possivelmente alguns resíduos de FR sãosubstituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores.
A seleção de domínios variáveis humanos, tanto leves quantopesados, a serem utilizados na fabricação dos anticorpos humanizados é muitoimportante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado métodode "melhor adequação", a seqüência do domínio variável de anticorpo deroedor é selecionada em comparação com toda a biblioteca de seqüências dedomínio variável humanas conhecidas. A seqüência humana que é maispróxima da do roedor é aceita como a região de estrutura humana para oanticorpo humanizado (Sims et al (1993) J. Immunol. 151: 2296; Chothia et al(1987), J. MoL Biol. 196: 901. Outro método utiliza estrutura específica derivadada seqüência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupoespecífico de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizadapara vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al (1992), Proc. Natl.Acad. Sei. U. S. A, 89: 4285 (1992); Presta et al (1993), J. Immunol., 151:2623.
É adicionalmente importante que os anticorpos sejamhumanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outraspropriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo comum método, anticorpos humanizados são preparados por meio de processo deanálise das seqüências parentais e diversos produtos humanizadosconceituais, utilizando modelos tridimensionais das seqüências parental ehumanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumentedisponíveis e familiares para os técnicos no assunto. São disponíveisprogramas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionaistridimensionais prováveis de possíveis seqüências de imunoglobulinaselecionadas. A inspeção destas exibições permite a análise do papel prováveldos resíduos no funcionamento da possível seqüência de imunoglobulina, ouseja, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da possívelimunoglobulina de unir o seu antígeno. Desta forma, os resíduos de FR podemser selecionados e combinados a partir das seqüências receptora e importadapara atingir a característica de anticorpo desejada, tal como maior afinidadepara o(s) antígeno(s) alvo. Geralmente, os resíduos da região hipervariável sãodireta e mais substancialmente envolvidos na influência da união de antígenos.
Anticorpos humanos
Anticorpos anti-Efrina B2 humanos de acordo com a presenteinvenção podem ser elaborados por meio de combinação de seqüência(s) dedomínio variável de clone Fv selecionada(s) a partir de bibliotecas de exibiçãode fagos derivadas de seres humanos com seqüência(s) de domínio constantehumano conhecidas conforme descrito acima. Alternativamente, os anticorposanti-Efrina B2 monoclonais humanos de acordo com a presente invençãopodem ser elaborados por meio do método de hibridoma. Linhagens celularesde mieloma humano e heteromieloma humano/de camundongos para aprodução de anticorpos monoclonais humanos foram descritas, por exemplo,por Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (3001); e Brodeur et al, MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Mareei Dekker,Inc., Nova Iorque, 1987); e Boerner et al, J. Immunol., 147: 86 (1991).
É agora possível produzir animais transgênicos (por exemplo,camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir repertóriocompleto de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulinaendógena. Descreveu-se, por exemplo, que a exclusão homozigótica do geneda região de união de cadeia pesada de anticorpos (JH) em camundongosquiméricos e mutantes de linhagem de gérmens resulta na inibição completa daprodução de anticorpos endógenos. A transferência do conjunto de genes deimunoglobulina da linhagem de gérmen humano nesses camundongos commutação da linhagem de gérmens resultará na produção de anticorposhumanos mediante desafio com antígenos. Vide, por exemplo, Jakobovits et al,Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A. 90: 2551 (1993); Jakobovits et al, Nature 362:255 (1993); Bruggermann et al, Yearin Immuno., 7: 33 (1993).
A alteração de genes pode também ser utilizada para derivaranticorpos humanos a partir de anticorpos não humanos, tais como deroedores, em que o anticorpo humano possui afinidades e especificidadessimilares ao anticorpo não humano inicial. De acordo com este método, quetambém é denominado "impressão de epítopos", a região variável de cadeialeve ou pesada de fragmento de anticorpo não humano obtido por meio demétodos de exibição de fagos descritos acima é substituído com um repertóriode genes de domínio V humanos, criando população de quimeras de Fab ouscFv de cadeia humana/cadeia não humana. A seleção com antígeno resultano isolamento de Fab ou scFv quimérico de cadeia humana/cadeia nãohumana em que a cadeia humana restaura o local de união de antígenosdestruído mediante remoção da cadeia não humana correspondente no clonede exibição de fagos primário, ou seja, o epítopo rege (imprime) a seleção doparceiro de cadeia humana. Quando o processo for repetido, a fim de substituira cadeia não humana remanescente, é obtido anticorpo humano (vide PCT n°WO 93/06213, publicado em primeiro de abril de 1993). Ao contrário dahumanização tradicional de anticorpos não humanos por meio de enxerto deCDR, esta técnica fornece anticorpos completamente humanos, que nãocontêm resíduos de CDR ou FR de origem não humana.
Anticorpos biespecíficos
Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais,preferencialmente humanos ou humanizados, que possuem especificidades deunião para pelo menos dois antígenos diferentes. No caso presente, uma dasespecificidades de união é para Efrina B2 e a outra é para qualquer outroantígeno. Exemplos de anticorpos biespecíficos podem unir-se a dois epítoposdiferentes da proteína Efrina B2. Anticorpos biespecíficos podem também serutilizados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam EfrinaB2. Esses anticorpos possuem um braço de união de Efrina B2 e um braço quese une ao agente citotóxico (tal como saporina, anti-interferona-α, vincaalcalóide, cadeia A rícina, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo).Anticorpos biespecíficos podem ser preparados na forma de anticorpos decomprimento total ou fragmentos de anticorpos (tais como anticorposbiespecíficos F(ab')2).
Métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos sãoconhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante deanticorpos biespecíficos é baseada na coexpressão de dois pares de cadeialeve e cadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias pesadaspossuem especificidades diferentes (Milstein e Cuello, Nature, 305: 537(1983)). Devido à seleção aleatória de cadeias leve e pesada deimunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem mistura potencial dedez moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma possui aestrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, quenormalmente é realizada por meio de etapas de cromatografia de afinidade, éum tanto problemática e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentossimilares são descritos em WO 93/08829, publicada em treze de maio de 1993,e em Trauneckeret al, EMBO J., 10: 3655 (1991).
De acordo com abordagem diferente e de maior preferência,domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de unição desejadas(locais de combinação de antígeno e anticorpo) são fundidos a seqüências dedomínios constantes de imunoglobulina. A fusão ocorre preferencialmente comum domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreendepelo menos parte das regiões de articulação, CH2 e CH3. Prefere-se ter aprimeira região constante de cadeia pesada (CH1) que contém o localnecessário para união de cadeia leve presente em pelo menos uma dasfusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulinae, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores deexpressão separados e são cotransfectados em organismo hospedeiroapropriado. Isso proporciona grande flexibilidade no ajuste das proporçõesmútuas dos três fragmentos de polipeptídeos em realizações quando razõesdesiguais das três cadeias de polipeptídeos utilizadas na construçãofornecerem os rendimentos ideais. É possível, entretanto, inserir as seqüênciasde codificação para duas ou todas as três cadeias de polipeptídeos em umvetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias depolipeptídeos em razões iguais resultar em altos rendimentos ou quando asrazões não forem de significação específica.
Em realização preferida desta abordagem, os anticorposbiespecíficos são compostos de cadeia pesada de imunoglobulina híbrida comprimeira especificidade de união em um braço e um par de cadeia leve ecadeia pesada de imunoglobulina híbrida (que fornece segunda especificidadede união) no outro braço. Concluiu-se que esta estrutura assimétrica possibilitaa separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia deimunoglobulina indesejadas, pois a presença de cadeia leve de imunoglobulinaem apenas uma metade da molécula biespecífica proporciona forma fácil deseparação. Esta abordagem é descrita em WO 94/04690. Para detalhesadicionais de geração de anticorpos biespecíficos, consulte, por exemplo,Suresh et al, Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
Segundo outra abordagem, a interface entre um par de moléculasde anticorpos pode ser construída de forma a maximizar o percentual deheterodímeros que é recuperado do cultivo de células recombinantes. Ainterface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 dedomínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias lateraisde aminoácidos pequenos da interface da primeira molécula de anticorpo sãosubstituídas com cadeias laterais maiores (tais como tirosina ou triptofano)."Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s)lateral(is) grande(s) são criadas sobre a interface da segunda molécula deanticorpo, por meio da substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidoscom cadeias menores (tais como alanina ou treonina). Isso proporcionamecanismo de aumento do rendimento do heterodímero sobre outros produtosfinais indesejados, tais como homodímeros.
Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou"heteroconjugados". Um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado,por exemplo, a avidina e o outro a biotina. Esses anticorpos foram propostos,por exemplo, para dirigir células do sistema imunológico a células indesejadas(Patente Norte-Americana n° 4.676.980) e para o tratamento de infecções porHIV (WO 91/00360, WO 92/00373 e EP 03089). Anticorpos heteroconjugadospodem ser fabricados utilizando qualquer método reticulante conveniente.
Agentes reticulantes apropriados são bem conhecidos na técnica e sãodescritos na Patente Norte-Americana n° 4.676.980, juntamente com uma sériede técnicas reticulantes.
As técnicas de geração de anticorpos biespecíficos a partir defragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Anticorposbiespecíficos podem ser preparados, por exemplo, utilizando ligaçõesquímicas. Brennan et ai, Science, 229: 81 (1985) descrevem procedimento emque anticorpos intactos são divididos proteoliticamente para gerar fragmentosde F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente formador decomplexo de ditiol arsenito de sódio para estabilizar ditióis vizinhos e evitar aformação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos de Fab' gerados sãoconvertidos em seguida em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dosderivados de Fab'-TNB é então novamente convertido no Fab'-tiol por meio deredução com mercaptoetilamina e é misturado com quantidade eqüimolar dooutro derivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorposbiespecíficos produzidos podem ser utilizados como agentes para aimobilização seletiva de enzimas.
Progressos recentes possibilitaram a recuperação direta defragmentos de Fab'-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamentepara formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al, J. Exp. Med., 175: 217-225(1992) descrevem a produção de uma molécula F(ab')2 de anticorpobiespecífico totalmente humanizado. Cada fragmento de Fab' foi secretadoseparadamente de E. coli e submetido a acoplamento químico dirigido in vitropara formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foicapaz de unir-se a células que sobreexpressam o receptor de HER2 e célulasT humanas normais, bem como acionar a atividade lítica de linfócitoscitotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humanos.
Diversas técnicas de fabricação e isolamento de fragmentos deanticorpos biespecíficos diretamente a partir de cultivo celular recombinantetambém foram descritas. Anticorpos biespecíficos foram produzidos, porexemplo, utilizando fechos de leucina. Kostelny et al, J. Immunol., 148 (5):1547-1553 (1992). Os peptídeos de fecho de leucina das proteínas Fos e Junforam ligados às partes Fab' de dois anticorpos diferentes por meio de fusãogenética. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região dearticulação para formar monômeros e, em seguida, novamente oxidados paraformar os heterodímeros de anticorpos. Este método pode também ser utilizadopara a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia de "diacorpos"descrita por Hollinger et al, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A., 90: 6444-6448(1993) forneceu mecanismo alternativo de fabricação de fragmentos deanticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável decadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) porligante que é curto demais para permitir o emparelhamento entre os doisdomínios sobre a mesma cadeia. Conseqüentemente, os domínios VH e VL deum fragmento são forçados a emparelhar-se com os domínios VL e VHcomplementares de outro fragmento, de maneira a formar dois locais de uniãode antígenos. Outra estratégia de fabricação de fragmentos de anticorposbiespecíficos utilizando dímeros Fv de fita única (sFv) também foi relatada.Vide Gruber et al, J. Immunol., 152: 5368 (1994).
São contemplados anticorpos com mais de duas valências.Podem ser preparados, por exemplo, anticorpos triespecíficos. Tutt et al, J.Immunol. 147: 60 (1991).
Anticorpos multivalentes
Anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado)mais rapidamente que anticorpo bivalente por célula que expresse antígeno aoqual se unem os anticorpos. Os anticorpos de acordo com a presente invençãopodem ser anticorpos multivalentes (que são diferentes da classe IgM) comtrês ou mais locais de união de antígenos (por exemplo, anticorpostetravalentes) que podem ser facilmente produzidos por meio de expressãorecombinante de ácido nucleico que codifica as cadeias de polipeptídeos doanticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender domínio de dimerizaçãoe três ou mais locais de união de antígenos. O domínio de dimerizaçãopreferido compreende (ou consiste de) região Fc ou região de articulação.Neste cenário, o anticorpo compreenderá uma região Fc e três ou mais locaisde união de antígenos amino-terminais para a região Fe. O anticorpomultivalente preferido do presente compreende (ou consiste de) três a cerca deoito, mas preferencialmente quatro locais de união de antígenos. O anticorpomultivalente compreende pelo menos uma cadeia de polipeptídeo (e,preferencialmente, duas cadeias de polipeptídeos), em que a(s) cadeia(s) depolipeptídeo(s) compreende(m) dois ou mais domínios variáveis. A(s) cadeia(s)de polipeptídeo(s) pode(m) compreender, por exemplo, VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, em que VD1 é primeiro domínio variável, VD2 é segundo domínio variável,Fc é uma cadeia de polipeptídeos de região Fc1 X1 e X2 representam umaminoácido ou polipeptídeo e η é 0 ou 1. A(s) cadeia(s) de polipeptídeo(s)pode(m) compreender, por exemplo: cadeia de VH-CHI-Iigante flexível-VH-CH1-região Fe; ou cadeia de VH-CH1-VH-CH1-região Fe. O anticorpomultivalente do presente compreende ainda, preferencialmente, pelo menosdois (preferencialmente quatro) polipeptídeos de domínio variável de cadeialeve. O anticorpo multivalente do presente pode compreender, por exemplo,cerca de dois a cerca de oito polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve.Os polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve contemplados no presentecompreendem um domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente,compreendem ainda um domínio CL.
Variantes de Anticorpos
Em algumas realizações, é (são) contemplada(s)modificação(ões) de seqüência de aminoácidos dos anticorpos descritos nopresente. Pode ser desejável, por exemplo, aprimorar a afinidade de união e/ououtras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes de seqüências deaminoácidos do anticorpo são preparadas por meio da introdução de mudançasde nucleotídeos apropriadas no ácido nucleico do anticorpo, ou por meio dasíntese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, exclusõese/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas seqüências de aminoácidosdo anticorpo. Qualquer combinação de exclusão, inserção e substituição é feitapara chegar à construção final, desde que a construção final possua ascaracterísticas desejadas. As alterações de aminoácidos podem serintroduzidas na seqüência de aminoácidos de anticorpo em referência nomomento em que aquela seqüência é feita.
Método útil de identificação de certos resíduos ou regiões doanticorpo que são locais preferidos para mutagênese é denominado"mutagênese de varrimento de alanina", conforme descrito por Cunningham eWells (1989), Science, 244: 1081-1085. Aqui, um resíduo ou grupo de resíduosdesejados é identificado (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg,asp, his, Iys e glu) e substituído por aminoácido neutro ou negativamentecarregado (de maior preferência alanina ou polialanina) para afetar a interaçãodos aminoácidos com o antígeno. Esses locais de aminoácidos quedemonstram sensibilidade funcional às substituições são refinados em seguidapor meio da introdução de outras variantes ou adicionais nos locais desubstituição ou para estes. Desta forma, embora o local para introdução devariação de seqüência de aminoácidos seja previamente determinado, anatureza intrínseca da mutação não necessita ser previamente determinada.Para analisar o desempenho de mutação em um dado local, por exemplo,varrimento de ala ou mutagênese aleatória é conduzida no códon ou regiãodesejada e as imunoglobulinas expressas são selecionadas em busca daatividade desejada.
As inserções de seqüências de aminoácidos incluem fusões determinais carboxila e/ou amino que variam de comprimento de um resíduo atépolipeptídeos que contêm cem ou mais resíduos, bem como inserções intra-seqüenciais de resíduos de aminoácidos isolados ou múltiplos. Exemplos deinserções terminais incluem anticorpo com resíduo de metionila N-terminal ou oanticorpo fundido a polipeptídeo citotóxico. Outras variantes de inserção damolécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo a umaenzima (por exemplo, para ADEPT) ou polipeptídeo que aumente a meia vidado anticorpo em soro.
A glicosilação de polipeptídeos é tipicamente N-Iigada ou O-ligada. N-Iigado designa a ligação da porção de carboidrato à cadeia lateral deresíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeos asparagino-X-serina easparagino-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido, com exceção deprolina, são as seqüências de reconhecimento para a ligação enzimática daporção carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Desta forma, a presença dequalquer dessas seqüências de tripeptídeos em polipeptídeo cria potenciallocal de glicosilação. Glicosilação O-Iigada designa a ligação de um dosaçúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a ácido hidroxiamino, maiscomumente serina ou treonina, embora também possam ser utilizadas 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina.
A adição de locais de glicosilação ao anticorpo éconvenientemente conseguida por meio de alteração da seqüência deaminoácidos, de forma que contenha uma ou mais das seqüências detripeptídeos descritas acima (para locais de glicosilação N-ligados). A alteraçãopode também ser feita por meio da adição de um ou mais resíduos de serinaou treonina à seqüência do anticorpo original, ou substituição por ele (paralocais de glicosilação O-ligados).
Quando o anticorpo compreender região Fc1 o carboidrato a ele ligadopode ser alterado. Anticorpos com estrutura de carboidrato madura que não contémfucose ligada a região Fc do anticorpo, por exemplo, são descritos no Pedido dePatente Norte-Americano n0 US 2003/0157108 A1 (Presta, L.). Vide também US2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.). Anticorpos com N-acetilglucosamina(GIcNAc) bisseccionada no carboidrato ligado a uma região Fc do anticorpo sãoindicados em WO 2003/011878, Jean-Mairet et al, e na Patente Norte-Americana n°6.602.684, Umana et al. Anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose nooligossacarídeo ligado a uma região Fc do anticorpo são relatados em WO1 997/30087, Patel et al. Vide também WO 1998/58964 (Raju, S.) e WO 1999/22764(Raju, S.) referentes a anticorpos com carboidrato alterado ligado à sua região Fc.Vide também US 2005/0123546 (Umana et al) sobre moléculas de união aantígenos com glicosilação modificada.
A variante de glicosilação preferida do presente compreenderegião Fc, em que estrutura de carboidrato ligada à região Fc não contémfucose. Essas variantes possuem função ADCC aprimorada. Opcionalmente, aregião Fc compreende ainda uma ou mais substituições de aminoácidos queaumentam ainda mais ADCC1 tais como substituições nas posições 298, 333e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos Eu). Exemplos de publicaçõesrelativas a anticorpos "desfucosilados" ou "com deficiência de fucose" incluem:US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; Okazaki et al, J. Mol. Biol.336: 1239-1249 (2004); e Yamane-Ohnuki et al, Biotech. Bioeng. 87: 614(2004). Exemplos de linhagens celulares que produzem anticorposdefucosilados incluem células CHO de Lecl 3 com deficiência na fucosilação deproteínas (Ripka et al, Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); Pedido dePatente Norte-Americano n0 US 2003/0157108 A1, Presta, L.; e WO2004/056312 A1, Adams et al, especialmente no Exemplo 11) e linhagens decélulas knockout, tais como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, célulasCHO knockout (Yamane-Ohnuki et al, Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)).
Outro tipo de variante é variante de substituição de aminoácidos.Estas variantes contêm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula deanticorpo substituída por resíduo diferente. Os locais de maior interesse paramutagênese de substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas tambémsão contempladas alterações de FR. Substituições conservadoras são exibidasna Tabela 1 sob o título "substituições preferidas". Caso essas substituiçõesresultem em mudança da atividade biológica, mudanças mais substanciais,denominadas "exemplos de substituições" na Tabela 1 ou conforme descritoadicionalmente abaixo com referência a classes de aminoácidos, podem serintroduzidas e os produtos são selecionados.
Tabela 1
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Modificações substanciais das propriedades biológicas doanticorpo são atingidas por meio da seleção de substituições que difiramsignificativamente de efeito sobre a manutenção (a) da estrutura da cadeiaprincipal de polipeptídeo na área da substituição, tal como na forma de folha ouem conformação helicoidal; (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula nolocal desejado; ou (c) do volume da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrêncianatural são divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeialateral:
(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;
(2) hidrofílicos neutros: Cys1 Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: asp, glu;
(4) básicos: his, lys, arg;
(5) resíduos que influenciam a orientação de cadeias: gly, pro;
e
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Substituições não conservadoras causarão a substituição de ummembro de uma dessas classes por outra classe.
Um tipo de variante de substituição envolve a substituição de umou mais resíduos da região hipervariável de anticorpo parental (por exemplo,anticorpo humano ou humanizado). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s)selecionada(s) para desenvolvimento adicional terá(ão) propriedades biológicasaprimoradas com relação ao anticorpo parental do qual é (são) gerada(s). Umaforma conveniente de geração dessas variantes de substituição envolve amaturação de afinidade utilizando exibição de fagos. Resumidamente, diversoslocais de regiões hipervariáveis (por exemplo, seis a sete locais) sofremmutações para gerar todas as substituições de aminoácidos possíveis em cadalocal. Os anticorpos gerados desta forma são exibidos a partir de partículas defagos filamentosos na forma de fusões para o produto de gene Ill de M13embalado em cada partícula. As variantes exibidas por fago são entãoselecionadas de acordo com a sua atividade biológica (por exemplo, afinidadede união), da forma descrita no presente. A fim de identificar possíveis locaisde regiões hipervariáveis para modificação, mutagênese de varrimento dealanina pode ser realizada para identificar resíduos de regiões hipervariáveisque contribuem significativamente para a união de antígenos. Alternativa ouadicionalmente, pode ser benéfico analisar estrutura de cristal do complexo deantígeno e anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e oantígeno. Esses resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos parasubstituição de acordo com as técnicas elaboradas no presente. Após ageração dessas variantes, o quadro de variantes é submetido a seleçãoconforme descrito no presente e os anticorpos com propriedades superioresem um ou mais testes relevantes podem ser selecionados paradesenvolvimento adicional.
Moléculas de ácidos nucleicos que codificam variantes daseqüência de aminoácidos do anticorpo são preparadas por meio de uma sériede métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas sem limitar-seao isolamento a partir de fonte natural (no caso de variantes de seqüências deaminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por meio de mutagênesemediada por oligonucleotídeo (ou dirigida para local), mutagênese de PCR emutagênese de conjunto de variante preparada anteriormente ou versão nãovariante do anticorpo.
Pode ser desejável introduzir uma ou mais modificações deaminoácidos em região Fc dos polipeptídeos de imunoglobulina de acordo coma presente invenção, de forma a gerar variante de região Fe. A variante deregião Fc pode compreender seqüência de região Fc humana (tal como regiãoFc de IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4 humana) que compreende modificação deaminoácidos (tal como substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos,incluindo a de cisteína de articulação. Segundo o presente relatório descritivo eos ensinamentos da técnica, contempla-se que, em algumas realizações, umanticorpo utilizado em métodos de acordo com a presente invenção podecompreender uma ou mais alterações em comparação com o anticorpoparceiro do tipo selvagem, por exemplo, na região Fc. Estes anticorpos,entretanto, reteriam substancialmente as mesmas características necessáriaspara utilidade terapêutica em comparação com o seu parceiro do tiposelvagem. Acredita-se, por exemplo, que podem ser realizadas certasalterações na região Fc que resultariam em união de C1q alterada (ou seja,aumentada ou reduzida) e/ou Citotoxicidade Dependente de Complemento(CDC), conforme descrito, por exemplo, em WO 99/51642. Vide tambémDuncan e Winter, Nature 322: 738-40 (1988); Patente Norte-Americana n°5.648.260; Patente Norte-Americana n° 5.624.821; e WO 94/29351 comreferência a outros exemplos de variantes de região Fe. WO 00/42072 (Presta)e WO 2004/056312 (Lowman) descrevem variantes de anticorpos com maiorou menor união a FcRs. O teor dessas publicações de patente é incorporadoespecificamente ao presente como referência. Vide também Shields et al, J.Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001). Anticorpos com maiores meias vidas eunião aprimorada ao receptor Fc neonatal (FeRn)1 que é responsável pelatransferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al, J. Immunol. 117: 587(1976) e Kim et al, J. Immunol. 24: 249 (1994)), são descritos em US2005/0014934A1 (Hinton et al). Estes anticorpos compreendem região Fc comuma ou mais substituições que aumentam a união da região Fc a FcRn.Variantes de polipeptídeos com seqüências de aminoácidos com região Fcalterada e maior ou menor capacidade de união de C1q são descritas naPatente Norte-Americana n° 6.194.551 B1 e WO 99/51642. O teor destaspublicações de patentes é incorporado especificamente ao presente comoreferência. Vide também Idusogie et al, J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
Derivados de anticorpos
Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem seradicionalmente modificados para que contenham porções não proteináceasadicionais que são conhecidas na técnica e facilmente disponíveis.Preferencialmente, as porções apropriadas para derivação do anticorpo sãopolímeros hidrossolúveis. Exemplos não limitadores de polímeroshidrossolúveis incluem, mas sem limitar-se a polietileno glicol (PEG),copolímeros de etileno glicol e propileno glicol, carboximetilcelulose, dextran,álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1, 3, 6-trioxano,copolímero de etileno e anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros oucopolímeros aleatórios) e dextran ou poli(n-vinil pirrolidona) polietileno glicol,homopolímeros de propropileno glicol, copolímeros de óxido de polipropileno eóxido de etileno, polióis polioxietilados (tais como glicerol), álcool polivinílico esuas misturas. Propionaldeído de polietileno glicol pode apresentar vantagensde fabricação devido à sua estabilidade em água. O polímero pode ser dequalquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. Aquantidade de polímeros ligados ao anticorpo pode variar e, caso mais de umpolímero seja ligado, eles podem ser moléculas idênticas ou diferentes.Geralmente, a quantidade e/ou o tipo de polímeros utilizados para derivaçãopodem ser determinados com base em considerações que incluem, mas semlimitar-se às propriedades ou funções específicas do anticorpo a seraprimorado, se o derivado de anticorpo será utilizado em terapia sob condiçõesdefinidas etc.
Seleção de anticorpos com as propriedades desejadas
Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem sercaracterizados pelas suas propriedades físico-químicas e funções biológicaspor meio de vários testes conhecidos na técnica. Em algumas realizações,anticorpos são caracterizados por qualquer um ou mais dentre redução oubloqueio da ativação de Efrina B2, redução ou bloqueio da sinalizaçãomolecular abaixo no fluxo de Efrina B2, redução ou bloqueio da ativação dereceptor de Eph de união de Efrina B2 (tal como EphBI, EphB2 e/ou EphB3),redução ou bloqueio da sinalização molecular abaixo no fluxo de receptor deEph de união de Efrina B2 (tal como EphBI1 EphB2 e/ou EphB3) a Efrina B2,rompimento ou bloqueio da união de receptor de Eph de união de Efrina B2 (talcomo EphBI1 EphB2 e/ou EphB3) a Efrina B2, fosforilação de Efrina B2 e/oumultimerização de Efrina B2 e/ou fosforilação de receptor de Eph de união deEfrina B2 (tal como EphBI1 EphB2 e/ou EphB3) e/ou tratamento e/ouprevenção de tumor, disfunção proliferativa celular ou câncer; e/ou redução,bloqueio ou inibição de angiogênese; e/ou tratamento ou prevenção dedisfunção associada à expressão e/ou atividade de Efrina B2 (tal comoaumento da expressão e/ou atividade de Efrina B2).
Os anticorpos purificados podem ser adicionalmentecaracterizados por uma série de testes que incluem, mas sem limitar-se aseqüenciamento N-terminal, análise de aminoácidos, cromatografia de líquidossob alta pressão de exclusão de tamanho não desnaturante (HPLC),espectrometria de massa, cromatografia de troca de íons e digestão depapaína.
Em certas realizações da presente invenção, os anticorposproduzidos no presente são analisados para determinar a sua atividadebiológica. Em algumas realizações, os anticorpos de acordo com a presenteinvenção são testados para determinar a sua atividade de união de antígenos.
Os testes de união de antígenos que são conhecidos na técnica e podem serutilizados no presente incluem, sem limitação, quaisquer testes de união diretaou competitiva utilizando métodos tais como Western Blot, radioimunotestes,ELISA (teste imunoabsorvente ligado por enzimas), imunotestes de"sanduíche", testes de imunoprecipitação, imunotestes fluorescentes eimunotestes de proteína A. Um teste de união de antígenos ilustrativo éfornecido abaixo no capítulo de Exemplos.
Em ainda outra realização, a presente invenção forneceanticorpos monoclonais anti-Efrina B2 que concorrem comanticorpo 31.19,anticorpo 31.19.1D8 e/ou anticorpo 31.19.2D3 pela união a Efrina B2. Estesanticorpos concorrentes incluem anticorpos que reconhecem epítopo de EfrinaB2 que é idêntico ou sobrepõe-se ao epítopo de Efrina B2 reconhecido peloanticorpo 31.19, anticorpo 31.19.1D8 e/ou 31.19.2D3. Estes anticorposconcorrentes podem ser obtidos por meio de seleção de sobrenadantes dehibridoma anti-Efrina B2 pela união a Efrina B2 imobilizada em competiçãocomanticorpo 31.19 marcado, anticorpo 31.19.1D8 e/ou anticorpo 31.19.2D3.Sobrenadante de hibridoma que contém anticorpo concorrente reduzirá aquantidade de anticorpo marcado unido detectado na mistura de uniãoconcorrente objeto em comparação com a quantidade de anticorpo marcadounido detectada em mistura de união de controle que contém anticorpoirrelevante (ou nenhum). Qualquer dos testes de união de competição descritosno presente é apropriado para uso no procedimento acima.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece anticorpomonoclonal anti-Efrina B2 que compreende um ou mais (tais como dois, três,quatro, cinco e/ou seis) HVRs do anticorpo 31.19, anticorpo 31.19.1D8 e/ouanticorpo 31.19.2D3. Anticorpo monoclonal anti-Efrina B2 que compreende umou mais HVR(s) de anticorpo 31.19, anticorpo 31.19.1D8 e/ou 31.19.2D3 podeser construído por meio de enxerto de um ou mais HVR(s) de anticorpo 31.19,anticorpo 31.19.1D8 e/ou 31.19.2D3 sobre seqüência de modelos deanticorpos, tal como seqüência de anticorpo humano que é a mais próxima daseqüência murina correspondente do anticorpo parental ou seqüência deconsenso de todos os anticorpos humanos no subgrupo específico da cadeialeve ou pesada de anticorpo parental e expressão da(s) seqüência(s) de regiãovariável de cadeia leve e/ou pesada quimérica(s) resultante(s), com ou semseqüência(s) de região constante acompanhante(s), em células hospedeirasrecombinantes conforme descrito no presente.Os anticorpos anti-Efrina B2 de acordo com a presente invençãoque possuem as propriedades exclusivas descritas no presente podem serobtidos por meio de seleção de clones de hibridoma anti-Efrina B2 para aspropriedades desejadas por meio de qualquer método conveniente. Caso sedeseje, por exemplo, anticorpo monoclonal anti-Efrina B2 que bloqueie ou nãobloqueie a união de parceiros de união de Efrina B2 (tal como receptor deEphB) a Efrina B2, o possível anticorpo pode ser testado em teste decompetição de união, tal como ELISA de união competitivo, em que cavidadesde placas são revestidas com Efrina B2, solução de anticorpo em excesso doparceiro de união de Efrina B2 de interesse é colocada em camadas sobre asplacas revestidas e anticorpo unido é detectado enzimaticamente, tal como pormeio de contato do anticorpo unido com anticorpo anti-lg conjugado a HRP ouanticorpo anti-lg biotinilado e desenvolvimento da reação de coloração de HRP,tal como por meio do desenvolvimento de placas com estreptavidina-HRP e/ouperóxido de hidrogênio e detecção da reação de coloração de HRP por meio deespectrofotometria a 490 nm com leitor de placas ELISA.
Caso se deseje anticorpo anti-Efrina B2 que iniba a ativação deEfrina B2, o possível anticorpo pode ser testado utilizando teste de fosforilaçãode Efrina B2. Estes testes são conhecidos na técnica e um deles é descrito nocapítulo de Exemplos.
Caso se deseje anticorpo anti-Efrina B2 que iniba o crescimentocelular, o possível anticorpo pode ser testado em testes in vitro e/ou in vivo quemedem a inibição do crescimento celular. Estes testes são conhecidos natécnica e adicionalmente descritos e exemplificados no presente.
Em uma realização, a presente invenção contempla anticorpoalterado que possui algumas mas não todas as funções efetoras, o que o tornacandidato desejado para muitas aplicações nas quais a meia vida do anticorpoin vivo é importante, mas certas funções efetoras (tais como complemento eADCC) são desnecessárias ou prejudiciais. Em certas realizações, asatividades de Fc da imunoglobulina produzida são medidas para garantir quesomente as propriedades desejadas sejam mantidas. Testes de citotoxicidadein vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar aredução/esgotamento das atividades de CDC e/ou ADCC. Testes de união dereceptores Fc (FcR)1 por exemplo, podem ser conduzidos para garantir que oanticorpo não apresente união de FcyR (portanto, propenso a não apresentaratividade de ADCC), mas retenha a capacidade de união de FcRn. As célulasprimárias para a mediação de ADCC, células NK1 expressam unicamenteFcyRIII1 enquanto monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressãode FcR sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 da página 464de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Um exemplo deteste in vitro para determinar a atividade de ADCC de molécula de interesse édescrito na Patente Norte-Americana n° 5.500.362 ou 5.821.337. Célulasefetoras úteis para esses testes incluem células mononucleares sangüíneasperiféricas (PBMC) e células Matadoras Naturais (NK). Alternativa ouadicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode serdeterminada in vivo, tal como em modelo animal como o descrito em Clynes etal, PNAS (U. S. A.) 95: 652-656 (1998). Testes de união de C1q podemtambém ser conduzidos para confirmar que o anticorpo é incapaz de unir C1qe, desta forma, não apresenta atividade de CDC. Para determinar a ativação docomplemento, pode ser realizado teste de CDC, conforme descrito, porexemplo, em Gazzano-Santoro et al, J. immunol. Methods 202: 163 (1996).
Determinações da união de FcRn e meia vida/liberação in vivo podem tambémser realizadas utilizando métodos conhecidos na técnica, tais como osdescritos no capítulo de Exemplos.
Vetores, Células Hospedeiras ε Métodos Recombinantes
Para a produção recombinante de anticorpo de acordo com apresente invenção, o ácido nucleico que o codifica é isolado e inserido em vetorreproduzível para clonagem adicional (amplificação do DNA) ou paraexpressão. O DNA codificador do anticorpo é facilmente isolado e seqüenciadoutilizando procedimentos convencionais (por meio, por exemplo, do uso desondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de unir-se especificamente agenes codificadores das cadeias pesada e leve do anticorpo). Diversos vetoressão disponíveis. O vetor selecionado depende em parte da célula hospedeira aser utilizada. Geralmente, as células hospedeiras preferidas são de origemprocariótica ou eucariótica (geralmente mamíferos). Apreciar-se-á que regiõesconstantes de qualquer isotipo podem ser utilizadas com este propósito,incluindo regiões constantes de IgG, IgM, IgA1 IgD e IgE1 e que essas regiõesconstantes podem ser obtidas a partir de qualquer espécie humana ou animal.
A. Geração de anticorpos utilizando células hospedeiras procarióticas
I. Construção de Vetores
As seqüências de polinucleotídeos que codificam componentes depolipeptídeos do anticorpo de acordo com a presente invenção podem serobtidas utilizando métodos recombinantes padrão. As seqüências depolinucleotídeos desejadas podem ser isoladas e seqüenciadas a partir decélulas produtoras de anticorpos, tais como células de hibridoma.Alternativamente, polinucleotídeos podem ser sintetizados utilizandosintetizador de nucleotídeos ou técnicas de PCR. Uma vez obtidas, asseqüências que codificam os polipeptídeos são inseridas em vetorrecombinante capaz de reproduzir e expressar polinucleotídeos heterólogos emhospedeiros procarióticos. Muitos vetores que são disponíveis e conhecidos natécnica podem ser utilizados para os propósitos da presente invenção. Aseleção de vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho dos ácidosnucleicos a serem inseridos no vetor e da célula hospedeira específica a sertransformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes,dependendo da sua função (amplificação ou expressão de polinucleotídeoheterólogo, ou ambos) e sua compatibilidade com a célula hospedeiraespecífica na qual reside. Os componentes do vetor geralmente incluem, massem limitar-se a: origem de reprodução, gene marcador de seleção, promotor,local de união de ribossomos (RBS), seqüência de sinais, inserto de ácidonucleico heterólogo e seqüência de término de transcrição.
Geralmente, os vetores de plasmídeos que contêm seqüências decontrole e réplica que são derivados de espécies compatíveis com a célulahospedeira são utilizados com relação a esses hospedeiros. O vetornormalmente conduz um local de reprodução, bem como seqüências demarcação que são capazes de fornecer seleção fenotípica em célulastransformadas. E. coli, por exemplo, é tipicamente transformado utilizandopBR322, plasmídeo derivado de espécie de E. coli. pBR322 contém genes quecodificam resistência à ampicilina (Amp) e tetraciclina (Tet) e, desta fornecemeios fáceis de identificação de células transformadas. pBR322, seusderivados ou outros plasmídeos microbianos ou bacteriófago podem tambémconter ou ser modificados para que contenham promotores que podem serutilizados pelo organismo microbiano para a expressão de proteínasendógenas. Exemplos de derivados de pBR322 utilizados para a expressão deanticorpos específicos são descritos em detalhes em Carter et al, PatenteNorte-Americana n° 5.648.237.
Além disso, vetores de fagos que contêm seqüências de controlee de réplica que são compatíveis com o microorganismo hospedeiro podem serutilizados como vetores de transformação com relação a esses hospedeiros.Bacteriófago tal como 1GEM.TM.-11, por exemplo, pode ser utilizado nafabricação de vetor recombinante que pode ser utilizado para transformarcélulas hospedeiras suscetíveis tais como E. coli LE392.
O vetor de expressão de acordo com a presente invenção podecompreender dois ou mais pares de promotor e cistron, que codificam cada umdos componentes de polipeptídeos. Promotor é uma seqüência reguladora nãotraduzida localizada acima no fluxo (5') para um cistron que modula a suaexpressão. Promotores procarióticos enquadram-se tipicamente em duasclasses, indutível e constitutivo. O promotor indutível é promotor que inicianíveis mais altos de transcrição do cistron sob o seu controle em resposta aalterações das condições de cultivo, tais como a presença ou ausência denutriente ou mudança de temperatura.
É bem conhecida grande quantidade de promotores reconhecidospor uma série de células hospedeiras potenciais. O promotor selecionado podeser ligado operativamente a DNA de cistron que codifica a cadeia leve oupesada por meio de remoção do promotor do DNA fonte por meio de digestãode enzimas de restrição e inserção da seqüência promotora isolada no vetor deacordo com a presente invenção. Tanto a seqüência promotora nativa quantomuitos promotores heterólogos podem ser utilizados para dirigir a amplificaçãoe/ou a expressão dos genes alvo. Em algumas realizações, são utilizadospromotores heterólogos, pois eles geralmente permitem maior transcrição erendimentos mais altos de gene alvo expresso em comparação com o promotorde polipeptídeo alvo nativo.
Os promotores apropriados para uso com hospedeirosprocarióticos incluem o promotor PhoA1 sistemas promotores de Iactose e β-galactamase, sistema promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos, taiscomo o promotor tac ou trc. Entretanto, outros promotores que são funcionaisem bactérias (tais como outros promotores de fagos ou bacterianosconhecidos) também são apropriados. Suas seqüências de nucleotídeos forampublicadas, de forma a permitir que os técnicos no assunto as liguemoperativamente a cistrons que codificam as cadeias leve e pesada alvo(Siebenlist et al, (1980) Cell 20: 269), utilizando Iigantes ou adaptadores parafornecer qualquer local de restrição necessário.
Em um aspecto da presente invenção, cada cistron dentro dovetor recombinante compreende um componente de seqüência de sinal desecreção que dirige a translocação dos polipeptídeos expressos através deuma membrana. De forma geral, a seqüência de sinal pode ser componente dovetor ou pode ser uma parte do DNA de polipeptídeo alvo que é inserido novetor. A seqüência de sinal selecionada para os propósitos da presenteinvenção deverá ser uma que seja reconhecida e processada (ou seja, divididapor peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeirasprocarióticas que não reconhecem e processam as seqüências de sinal nativaspara os polipeptídeos heterólogos, a seqüência de sinal é substituída por umaseqüência de sinal procariótico selecionada, por exemplo, a partir do grupo queconsiste de fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou líderes de enterotoxina Ilestáveis ao calor (STII), LamB, PhoE, PeIB, OmpA e MBP. Em uma realizaçãoda presente invenção, as seqüências de sinais utilizadas nos dois cistrons dosistema de expressão são seqüências de sinais de STII ou suas variantes.
Em outro aspecto, a produção das imunoglobulinas de acordocom a presente invenção pode ocorrer no citoplasma da célula hospedeira e,portanto, não necessita da presença de seqüências de sinal de secreção emcada cistron. Neste particular, cadeias leve e pesada de imunoglobulina sãoexpressas, dobradas e montadas para formar imunoglobulinas funcionaisdentro do citoplasma. Certas linhagens hospedeiras (tais como as linhagens E.coli trxB-) fornecem condições de citoplasma que são favoráveis para aformação de uniões de dissulfeto, de forma a permitir dobra e montagemadequadas das subunidades de proteínas expressas. Proba e Pluckthun,Gene, 159: 203 (1995).
As células hospedeiras procarióticas apropriadas para aexpressão de anticorpos de acordo com a presente invenção incluemArcaebactérias e Eubactérias, tais como organismos grama-negativos ougrama-positivos. Exemplos de bactérias úteis incluem Escherichia (tal como E.coli), Bacilli (tal como B. subtilis), Enterobacteria1 espécies de Pseudomonas(tais como P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serrada marcescans,Klebisella, Proteus, Shigella, Rhizobial Vitreoscilla ou Paracoccus. Em umarealização, são utilizadas células grama-negativas. Em uma realização, célulasde E. coli são utilizadas como hospedeiros para a presente invenção. Exemplosde linhagens de E. coli incluem linhagem W3110 (Bachmann, Cellular andMolecular Biology, vol. 2 (Washington DC: Sociedade Norte-Americana deMicrobiologia, 1987), págs. 1190-1219; Depósito ATCC n° 27.325) e seusderivados, incluindo linhagem 33D3 que possui genótipo W3110 AfhuA (AtonA)ptr3 Iac Iq lacL8 AompTA (nmpc-fepE) degP41 kanR (Patente Norte-Americanan° 5.639.635). Outras linhagens e seus derivados, tais como E. coli 294 (ATCC31.446), E. coli Β, E. coli λ 1776 (ATCC 31.537) e E. coli RV308 (ATCC 31.608)também são apropriadas. Estes exemplos são ilustrativos e não limitadores.Métodos de construção de derivados de quaisquer das bactérias mencionadasacima que possuem genótipos definidos são conhecidos na técnica e descritos,por exemplo, em Bass et al, Proteins, 8: 309-314 (1990). Geralmente énecessário selecionar a bactéria apropriada considerando a capacidade dereprodução da réplica nas células de bactéria. Espécies de E. coli, Serratia ouSalmonella, por exemplo, podem ser adequadamente utilizadas comohospedeiro quando plasmídeos bem conhecidos, tais como pBR322, pBR325,pACYC177 ou pKN410, são utilizados para fornecer a réplica. Tipicamente, acélula hospedeira deverá secretar quantidades mínimas de enzimasproteolíticas e inibidores de protease adicionais podem ser desejavelmenteincorporados ao cultivo celular.
ii. Produção de Anticorpos
As células hospedeiras são transformadas com os vetores deexpressão descritos acima e cultivadas em meios nutrientes convencionaismodificados conforme apropriado para a indução de promotores, seleção detransformadores ou amplificação dos genes que codificam as seqüênciasdesejadas.
Transformação indica a introdução de DNA no hospedeiroprocariótico, de tal forma que o DNA seja reproduzível, seja na forma deelemento extracromossômico ou por integrante cromossômico. Dependendo dacélula hospedeira utilizada, a transformação é realizada utilizando técnicaspadrão apropriadas para essas células. O tratamento com cálcio empregandocloreto de cálcio é geralmente utilizado para células bacterianas que contêmbarreiras de parede celular substanciais. Outro método de transformaçãoemprega polietileno glicol/DMSO. Ainda outro método utilizado é aeletroporação.
As células procarióticas utilizadas para produzir os polipeptídeosde acordo com a presente invenção são cultivadas em meios conhecidos natécnica e apropriados para cultivo das células hospedeiras selecionadas.Exemplos de meios apropriados incluem caldo Iuria (LB) mais os suplementosnutrientes necessários. Em algumas realizações, os meios também contêm umagente de seleção, selecionado com base na construção do vetor deexpressão, para permitir seletivamente o crescimento de células procarióticasque contenham o vetor de expressão. Ampicilina é adicionada aos meios, porexemplo, para crescimento de células que expressem o gene resistente àampicilina.
Quaisquer suplementos necessários além de fontes de carbono,nitrogênio e fosfato inorgânico podem também ser incluídos em concentraçõesapropriadas introduzidas isoladamente ou na forma de mistura com outrosuplemento ou meio, tal como fonte de nitrogênio complexa. Opcionalmente, omeio de cultivo pode conter um ou mais agentes redutores selecionados apartir do grupo que consiste de glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato,ditioeritritol e ditiotreitol.
As células hospedeiras procarióticas são cultivadas sobtemperaturas apropriadas. Para crescimento de E. coli, por exemplo, atemperatura preferida varia de cerca de 20°C a cerca de 39°C, de maiorpreferência cerca de 25°C a cerca de 37 °C, de preferência ainda maior cercade 30°C. O pH do meio pode ser qualquer pH que varie de cerca de 5 a cercade 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Para E. coli, o pHé preferencialmente de cerca de 6,8 a cerca de 7,4, de maior preferência cercade 7.0.
Caso seja utilizado promotor indutível no vetor de expressão deacordo com a presente invenção, a expressão de proteínas é induzida sobcondições apropriadas para a ativação do promotor. Em um aspecto dapresente invenção, promotores de PhoA são utillizados para o controle datranscrição dos polipeptídeos. Conseqüentemente, as células hospedeirastransformadas são cultivadas em meio limitador de fosfato para indução.Preferencialmente, o meio limitador de fosfato é o meio C. R. A. P. (vide, porexemplo, Simmons et al, J. Immunol. Methods (2002), 263: 133-147). Umasérie de outros indutores pode ser utilizada, de acordo com a construção devetor empregada, como é conhecido na técnica.
Em uma realização, os polipeptídeos expressos de acordo com apresente invenção são secretados e recuperados do periplasma das célulashospedeiras. A recuperação de proteína envolve tipicamente o rompimento domicroorganismo, geralmente por meios tais como choque osmótico, sonicaçãoou lise. Após o rompimento das células, fragmentos celulares ou célulasinteiras podem ser removidas por meio de centrifugação ou filtragem. Asproteínas podem ser adicionalmente purificadas, por exemplo, porcromatografia de resina de afinidade. Alternativamente, as proteínas podem sertransportadas para o meio de cultivo e nele isoladas. As células podem serremovidas do cultivo e o sobrenadante de cultivo filtrado e concentrado parapurificação adicional das proteínas produzidas. Os polipeptídeos expressospodem ser adicionalmente isolados e identificados utilizando métodoscomumente conhecidos, tais como eletroforese de gel de poliacrilamida(PAGE) e teste Western Blot.
Em um aspecto da presente invenção, a produção de anticorpos éconduzida em grande quantidade por meio de processo de fermentação. Váriosprocedimentos de fermentação de alimentação de bateladas em larga escalasão disponíveis para a produção de proteínas recombinantes. As fermentaçõesem larga escala possuem capacidade de pelo menos mil litros,preferencialmente cerca de 1000 a 100.000 litros de capacidade. Estesfermentadores utilizam impulsionadores agitadores para distribuir oxigênio enutrientes, especialmente glicose (a fonte de carbono e energia preferida).Fermentação em pequena escala refere-se geralmente a fermentação emfermentador que possui capacidade volumétrica de não mais de cerca de cemlitros e pode variar de cerca de um litro a cerca de cem litros.
Em processo de fermentação, a indução da expressão deproteína é tipicamente iniciada após o cultivo das células sob condiçõesapropriadas até densidade desejada, tal como OD550 de cerca de 180 a 220,estágio em que as células encontram-se na fase estacionária inicial. Uma sériede indutores pode ser utilizada, de acordo com a construção de vetorempregada, como é conhecido na técnica e descrito acima. As células podemser cultivadas por períodos mais curtos antes da indução. As células sãonormalmente induzidas por cerca de doze a cinqüenta horas, embora possa serutilizado tempo de indução mais longo ou mais curto.
Para aumentar o rendimento de produção e a qualidade dospolipeptídeos de acordo com a presente invenção, várias condições defermentação podem ser modificadas. Para melhorar a reunião adequada edobra dos polipeptídeos de anticorpos secretados, por exemplo, vetoresadicionais que sobreexpressam proteínas chaperone, tais como proteínas Dsb(DsbA1 DsbB1 DsbC1 DsbD e/ou DsbG) ou FkpA (peptidilprolil eis, trans-isomerase com atividade de chaperone), podem ser utilizados paracotransformar as células procarióticas hospedeiras. Demonstrou-se que asproteínas de chaperone facilitam a dobra e solubilidade adequadas deproteínas heterólogas produzidas em células hospedeiras bacterianas. Chen etal (1999), J. Bio. Chem. 274: 19601-19605; Georgiou et al, Patente Norte-Americana n° 6.083.715; Georgiou et al, Patente Norte-Americana n°6.027.888; Bothmann e Pluckthun (2000), J. Biol. Chem. 275: 17100-17105;Ramm e Pluckthun (2000), J. Biol. Chem. 275: 17106-17113; Arie et al (2001),Mol. Microbiol. 39: 199-210.
Para minimizar a proteólise de proteínas heterólogas expressas(especialmente as que são proteoliticamente sensíveis), certas linhagenshospedeiras com deficiência para enzimas proteolíticas podem ser utilizadaspara a presente invenção. Linhagens de células hospedeiras podem sermodificadas, por exemplo, para efetuar mutação(ões) genética(s) nos genesque codificam proteases bacterianas conhecidas, tais como Protease III,OmpT, DegP, Tsp, Protease I, Protease Mi, Protease V1 Protease Vl e suascombinações. Algumas linhagens com deficiência de protease de E. coli sãodisponíveis e descritas, por exemplo, em Joly et al (1998), acima; Georgiou etal, Patente Norte-Americana n° 5.264.365; Georgiou et al, Patente Norte-Americana n° 5.508.192; Hara et al, Microbial Drug Resistance, 2: 63-72(1996).
Em uma realização, linhagens de E. coli com deficiência deenzimas proteolíticas e transformadas com plasmídeos que sobreexpressamuma ou mais proteínas chaperone são utilizadas como células hospedeiras nosistema de expressão de acordo com a presente invenção.
III. Purificação de Anticorpos
Podem ser empregados métodos de purificação de proteínaspadrão conhecidos na técnica. Os procedimentos a seguir são exemplos deprocedimentos de purificação apropriados: fracionamento sobre imunoafinidadeou colunas de troca de íons; precipitação em etanol; HPLC de fase reversa;cromatografia sobre sílica ou sobre resina de troca de cátions, tal como DEAE;cromatoconcentração; SDS-PAGE, precipitação de sulfato de amônio efiltragem de gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75.
Em um aspecto, Proteína A imobilizada sobre fase sólida éutilizada para purificação de imunoafinidade dos produtos de anticorpos decomprimento total de acordo com a presente invenção. Proteína A é proteínade parede celular de 41 kD de Staphylococcus aureas que se une com altaafinidade à região Fc de anticorpos. Lindmark et al (1983), J. Immunol. Meth.62: 1-13. A fase sólida à qual a Proteína A é imobilizada é preferencialmenteuma coluna que compreende superfície de vidro ou sílica, de maior preferênciacoluna de vidro com poros controlados ou coluna de ácido silícico. Em algumasaplicações, a coluna foi revestida com reagente, tal como glicerol, em tentativade evitar a aderência não específica de contaminantes.
Como primeira etapa da purificação, a preparação derivada docultivo celular conforme descrito acima é aplicada sobre a fase sólidaimobilizada com Proteína A para permitir a união específica do anticorpo deinteresse à Proteína A. A fase sólida é lavada em seguida para removercontaminantes unidos não especificamente à fase sólida. Por fim, o anticorpode interesse é recuperado da fase sólida por meio de eluição.
b. Geração de anticorpos utilizando células hospedeiras eucarióticas
Os componentes do vetor incluem geralmente, mas sem limitar-sea um ou mais dos seguintes: seqüência de sinal, origem de reprodução, um oumais genes marcadores, elemento amplificador, promotor e seqüência detérmino de transcrição.
(I) Componente de seqüência de sinal
Vetor para uso em célula hospedeira eucariótica pode tambémconter seqüência de sinal ou outro polipeptídeo que possui local de divisãoespecífico no terminal N da proteína madura ou polipeptídeo de interesse. Aseqüência de sinal heterólogo preferencialmente selecionada é uma que éreconhecida e processada (ou seja, dividida por peptidase de sinal) pela célulahospedeira. Em expressão de células de mamíferos, seqüências de sinal demamíferos, bem como líderes de secreção viral, tais como o sinal simplex gDda herpes, são disponíveis.
O DNA para essa região precursora é ligado na estrutura deleitura a DNA que codifica o anticorpo.
(II) Origem de Reprodução
Geralmente, um componente de origem de reprodução não énecessário para vetores de expressão de mamíferos. A origem SV40, porexemplo, pode ser tipicamente utilizada somente porque contém o promotorinicial.
(iii) Componente de gene de seleção
Os vetores de clonagem e de expressão podem conter gene deseleção, também denominado marcador selecionável. Os genes de seleçãotípicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outrastoxinas, tais como ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina; (b)complementam deficiências auxotróficas, quando relevantes; ou (c) fornecemnutrientes fundamentais não disponíveis a partir de meios complexos.
Um exemplo de esquema de seleção utiliza droga parainterromper o crescimento de célula hospedeira. As células que sãotransformadas com sucesso com gene heterólogo produzem proteína queconfere resistência a drogas e, desta forma, sobrevivem ao regime de seleção.
Exemplos dessa seleção dominante utilizam as drogas neomicina, ácidomicofenólico e higromicina.
Outro exemplo de marcadores selecionáveis apropriados paracélulas de mamíferos são aqueles que permitem a identificação de célulascompetentes para absorver o ácido nucleico de anticorpo, tais como DHFR1timidino quinase, metalotioneína I e II, preferencialmente genes demetalotioneína de primatas, adenosino deaminase, ornitino decarboxilase etc.
Células transformadas com o gene de seleção de DHFR, porexemplo, são identificadas em primeiro lugar por meio do cultivo de todos ostransformadores em meio de cultivo que contém metotrexato (Mtx), antagonistaconcorrente de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada, ao empregar-seDHFR do tipo selvagem, é a linhagem de células de ovário de hamster chinês(CHO) com deficiência da atividade de DHFR (por exemplo, ATCC CRL-9096).
Alternativamente, as células hospedeiras (particularmentehospedeiros do tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas oucotransformadas com seqüências de DNA que codificam um anticorpo,proteína DHFR do tipo selvagem e outro marcador selecionável tal comoaminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas por meiode crescimento celular em meio que contém agente de seleção para omarcador selecionável tal como antibiótico aminoglicosídico, por exemplocanamicina, neomicina ou G418. Vide a Patente Norte-Americana n°4.965.199.
íiv) Componente promotor
Os vetores de clonagem e de expressão normalmente contêmpromotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é ligadooperativamente ao ácido nucleico do polipeptídeo de anticorpo. Sãoconhecidas seqüências promotoras para eucariotes. Virtualmente, os genesaleucarióticos contêm região rica em AT localizada a cerca de 25 a 30 basesacima do local em que se inicia a transcrição. Outra seqüência encontrada a 70até 80 bases acima do início da transcrição de muitos genes é uma regiãoCNCAAT1 em que N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' damaior parte dos genes eucarióticos, encontra-se seqüência AATAAA que podeser o sinal para adição da extremidade póli A à extremidade 3' da seqüência decodificação. Todas essas seqüências são inseridas adequadamente emvetores de expressão eucarióticos.
A transcrição de polipeptídeos de anticorpos a partir de vetoresem células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, porpromotores obtidos a partir dos genomas de vírus tais como vírus de polioma,vírus da catapora, adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus de papilomabovino, vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatiteB e Vírus Símio 40 (SV40), de promotores de mamíferos heterólogos, taiscomo o promotor de actina ou promotor de imunoglobulina, de promotores dechoque de calor, desde que esses promotores sejam compatíveis com ossistemas de células hospedeiras.
Os promotores inicial e posterior do vírus SV40 sãoconvenientemente obtidos na forma de fragmento de restrição de SV40 quetambém contém a origem viral de reprodução de SV40. O promotor inicial imediatodo citomegalovírus humano é obtido convenientemente na forma de fragmento derestrição Hindlll E. Um sistema de expressão de DNA em hospedeiros mamíferos,utilizando o vírus de papiloma bovino como vetor, é descrito na Patente Norte-Americana n° 4.419.446. Uma modificação deste sistema é descrita na PatenteNorte-Americana n° 4.601.978. Alternativamente pode-se utilizar a repetição determinal longo do Vírus Sarcoma de Rous como promotor.
(v) Componente elemento amplificador
A transcrição de DNA codificador do polipeptídeo de anticorpo deacordo com a presente invenção por eucariotes superiores é freqüentementeaumentada por meio da inserção de seqüência amplificadora no vetor. Muitasseqüências amplificadoras são agora conhecidas a partir de genes demamíferos (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente,entretanto, utilizar-se-á amplificador de vírus de célula eucariótica. Exemplosincluem o amplificador SV40 do lado posterior da origem de reprodução (bp100-270), o amplificador promotor precoce de citomegalovírus, o amplificadorde polioma do lado posterior da origem de reprodução e amplificadores deadenovírus. Vide também Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) sobre elementosamplificadores para a ativação de promotores eucarióticos. O amplificador podetambém ser dividido no vetor em posição 5' ou 3' para a seqüência codificadorade polipeptídeos de anticorpos, mas encontra-se localizado preferencialmenteem local a 5' do promotor.
(vi) Componente de término de transcrição
Vetores de expressão utilizados em células hospedeiraseucarióticas também conterão tipicamente seqüências necessárias para otérmino de transcrição e para a estabilização do mRNA. Essas seqüências sãonormalmente disponíveis a partir das regiões não traduzidas 5' e,ocasionalmente, 3' dos DNAs ou cDNAs virais ou eucarióticos. Essas regiõescontêm segmentos de nucleotídeos transcritos na forma de fragmentospoliadenilados na parte não traduzida do mRNA codificador de anticorpo. Umcomponente de término de transcrição útil é a região de poliadenilação dohormônio de crescimento bovino. Vide WO 94/11026 e o vetor de expressãonela descrito.
(vil) Seleção ε transformação de células hospedeiras
Células hospedeiras apropriadas para clonagem ou expressão doDNA nos vetores do presente incluem as células eucarióticas superioresdescritas no presente, incluindo células hospedeiras de vertebrados. Apropagação de células de vertebrados em cultivo (cultivo de tecidos) tornou-seprocedimento rotineiro. Exemplos de linhagens celulares de hospedeirosmamíferos úteis são linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40(COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico humano (células 293ou 293 subclonadas para crescimento em cultivo em suspensão, Graham et al,J. Geri. Virol. 36: 59 (1977)); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCCCCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al, Proc.Nati Acad. Sei. U. S. A. 77: 4216 (1980)); células sertoli de camundongo (TM4,Mather1 Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCCCRL-1587); células de carcinoma da cervical humano (HELA, ATCC CCL 2),células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo(BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário decamundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al, AnnalsΝ. Y. Acad. Sei. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e linhagem dehepatoma humano (Hep G2).
As células hospedeiras são transformadas com os vetores declonagem ou de expressão descritos acima para a produção de anticorpos ecultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conformeapropriado para a indução de promotores, seleção de transformadores ouamplificação dos genes que codificam as seqüências desejadas.
(viii) Cultivo das células hospedeiras
As células hospedeiras utilizadas para a produção de anticorpo deacordo com a presente invenção podem ser cultivadas em uma série de meios.Meios disponíveis comercialmente, tais como F10 de Ham (Sigma), MeioEssencial Mínimo (MEM1 Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio de EagleModificado da Dulbecco (DMEM, Sigma) são apropriados para o cultivo dascélulas hospedeiras. Além disso, qualquer dos meios descritos em Ham et al,Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al, Anal. Biochem. 102: 255 (1980),Patentes Norte-Americanas n° 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655 ou5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou Patente Norte-Americana Ref.
30.985, podem ser utilizados como meios de cultivo para as célulashospedeiras. Qualquer desses meios pode ser suplementado conforme onecessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais comoinsulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais comocloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES),nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como drogaGENTAMYCIN®), elementos de traço (definidos como compostos inorgânicosnormalmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar) e glicoseou fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplemento necessário podetambém ser incluído em concentrações apropriadas que seriam conhecidasdos técnicos no assunto. As condições de cultivo, tais como temperatura, pH esimilares, são as utilizadas anteriormente com a célula hospedeira selecionadapara expressão e serão evidentes para os técnicos comuns no assunto.
(ix) Purificação de anticorpo
Ao utilizar-se técnicas recombinantes, o anticorpo pode serproduzido de forma intracelular ou segregado diretamente para o meio. Caso oanticorpo seja produzido de forma intracelular, como primeira etapa, osfragmentos particulados, sejam eles células hospedeiras ou fragmentoslisados, são removidos, por exemplo, por meio de centrifugação ouultrafiltragem. Quando o anticorpo for secretado para o meio, sobrenadantesdesses sistemas de expressão são geralmente concentrados em primeiro lugarutilizando filtro de concentração de proteínas disponível comercialmente, talcomo unidade de ultrafiltragem Amicon ou Millipore Pellicon. Inibidor deprotease, tal como PMSF, pode ser incluído em qualquer das etapas acimapara inibir a proteólise e podem ser incluídos antibióticos para evitar ocrescimento de contaminantes imprevistos.
A composição de anticorpo preparada a partir das células podeser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia de hidroxilapatita,eletroforese de gel, diálise e cromatografia de afinidade, em que cromatografiade afinidade é a técnica de purificação preferida. A adequação da proteína Acomo Iigante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquerdomínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A Proteína Apode ser utilizada para purificar anticorpos que se baseiem em cadeiaspesadas γ1, γ2 ou γ4 humanas (Lindmark et al, J. Immunol. Meth. 62: 1-13(1983)). Recomenda-se Proteína G para todos os isotipos de camundongos epara γ3 humano (Guss et al, EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). A matriz à qual éligado o Iigante de afinidade é mais freqüentemente agarose, mas outrasmatrizes são disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro deporos controlados ou póli(estirenodivinil)benzeno, permitem velocidades defluxo mais altas e tempos de processamento mais curtos que o que pode seratingido com agarose. Quando o anticorpo compreender um domínio CH3, aresina Bakerbond ABX® (J. T. Baker, Phillipsburg NJ) é útil para purificação.
Outras técnicas de purificação de proteínas, tais como o fracionamento sobrecoluna de troca de íons, precipitação em etanol, HPLC de Fase Reversa,cromatografia sobre sílica, cromatografia sobre heparina SEPHAROSE®,cromatografia sobre resina de intercâmbio de ânions ou cátions (tal comocoluna de ácido poliaspártico), cromatoconcentração, SDS-PAGE eprecipitação de sulfato de amônia, também são disponíveis, dependendo doanticorpo a ser recuperado.
Após qual(is)quer etapa(s) de purificação preliminar(es), a misturaque compreende o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetidaa cromatografia de interação hidrofóbica de baixo pH, utilizando tampão deeluição sob pH de cerca de 2,5 a 4,5, preferencialmente realizada sob baixasconcentrações de sais (por exemplo, cerca de 0 a 0,25 M de sal).
Imunoconjugados
A presente invenção também fornece imunoconjugados(denominados de forma intercambiável "conjugados de droga e anticorpo" ou"ADC"), que compreendem qualquer dos anticorpos anti-Efrina B2 descritos nopresente conjugado a um agente citotóxico tal como agente quimioterapêutico,droga, agente inibidor do crescimento, toxina (tal como toxina enzimaticamenteativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos) ouisótopo radioativo (ou seja, radioconjugado).
O uso de conjugados de droga e anticorpo para fornecimentolocal de agentes citotóxicos ou citostáticos, ou seja, drogas para matar ou inibircélulas tumorosas no tratamento de câncer (Syrigos e Epenetos (1999),Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997), Adv.Drg Del. Rev. 26: 151-172; Patente Norte-Americana n° 4.975.278)teoricamente permite o fornecimento dirigido da porção de droga a tumores eseu acúmulo intracelular, em que a administração sistêmica desses agentes dedrogas não conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade paracélulas normais, bem como para as células tumorosas que se busca eliminar(Baldwin et al (1986), Lancet, págs. (quinze de março de 1986): 603-05; Thorpe(1985), Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Câncer Therapy: A Review emMonoclonal Antibodies '84: Biological and Clinicai Applications, A. Pinchera etal (eds.), págs. 475-506). Busca-se por este intermédio eficácia máxima comtoxicidade mínima. Tanto anticorpos policlonais quanto anticorpos monoclonaisforam relatados como sendo úteis nestas estratégias (Rowland et al (1986),Câncer Immunol. Immunother. 21: 183-87). As drogas utilizadas nestesmétodos incluem daunomicina, doxorubicina, metotrexato e vindesina (Rowlandet al (1986), acima). As toxinas utilizadas em conjugados de anticorpo e toxinaincluem toxinas bacterianas tais como toxina de difteria, toxinas vegetais taiscomo rícino, toxinas de moléculas pequenas tais como geldanamicina (Mandleret al (2000), Jour. of the Nat. Câncer Inst. 92 (19): 1573-1581; Mandler et al(2000), Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al (2002),Bioconjugate Chem. 13: 786-791), maitansinóides (EP 1391213; Liu et al(1996), Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A. 93: 8618-8623) e caliqueamicina (Lode etal (1998), Câncer Res. 58: 2928; Hinman et al (1993), Câncer Res. 53: 3336-3342). As toxinas podem exercer seus efeitos citotóxicos e citostáticos pormeio de mecanismos que incluem união de tubulina, união de DNA ou inibiçãoda topoisomerase. Algumas drogas citotóxicas tendem a ser inativas ou menosativas quando conjugadas a anticorpos grandes ou Iigantes de receptores deproteínas.
ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/ldec) é conjugado deanticorpo e radioisótopo composto de anticorpo monoclonal capa IgGI murinodirigido contra o antígeno CD20 encontrado sobre a superfície de linfócitos Bnormais e malignos e radioisótopo 111In ou 90Y unido por quelante-ligante detioruéia (Wiseman et al (2000), Eur. Jour. Nucl. Med. 27 (7): 766-77; Wisemanet al (2002), Blood 99 (12): 4336-42; Witzig et al (2002), J. Ciin. Oncoi 20 (10):2453-63; Witzig et al (2002), J. Ciin. Oncoi 20 (15): 3262-69). EmboraZEVALIN apresente atividade contra Linfoma não de Hodgkin (NHL) de célulasB, a administração resulta em citopenias severas e prolongadas na maior partedos pacientes. MYLOTARG® (gemtuzumab ozogamicina, WyethPharmaceuticals), conjugado de droga e anticorpo composto de anticorpoCD33 hu ligado a caliqueamicina, foi aprovado em 2000 para o tratamento deleucemia mielóide aguda por meio de injeção (Drugs of the Future (2000) 25(7): 686; Patentes Norte-Americanas n° 4.970.198, 5.079.233, 5.585.089,5.606.040, 5.693.762, 5.739.116, 5.767.285 e 5.773.001). Cantuzumabmertansina (Immunogen, Inc.), conjugado de droga e anticorpo composto doanticorpo huC242 ligado por meio do Iigante de dissulfeto SPP à porção dedroga maitansenóide, DM1, está avançando para testes de Fase II para otratamento de cânceres que expressam CanAg1 tais como cólon, pancreático,gástrico e outros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, ImmunogenInc.), conjugado de droga e anticorpo composto do anticorpo monoclonal deantígeno de membrana específico anti-próstata (PSMA) ligado à porção dedroga maitansinóide, DM1, encontra-se em desenvolvimento para o tratamentopotencial de tumores da próstata. Os peptídeos de auristatina, auristatina E(AE) e monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina, foramconjugados a anticorpos monoclonais quiméricos cBR96 (específicos paraLewis Y sobre carcinomas) e cAC10 (específicos para CD30 sobremalignidades hematológicas) (Doronina et al (2003), Nature Biotechnology 21(7): 778-784) e estão sob desenvolvimento terapêutico.
Os agentes quimioterapêuticos úteis na geração deimunoconjugados são descritos no presente (tal como acima). Toxinasenzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluemcadeia de difteria A, fragmentos ativos não de união da toxina de difteria,cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia rícina A, cadeiade abrina A, cadeia de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii,proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor Sapaonariaofficinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e ostricotecenos. Vide, por exemplo, WO 93/21232 publicada em 28 de outubro de1993. Uma série de radionucleotídeos é disponível para a produção deanticorpos rádio-conjugados. Exemplos incluem 212Bi, 131I1 131In, 90Y e 186Re. Osconjugados do anticorpo e agente citotóxico são fabricados utilizando umasérie de agentes acopladores de proteínas bifuncionais, tais como propionatode N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivadosbifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCI), ésteresativos (tais como suberato de di-succinimidila), aldeídos (tais comoglutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) ecompostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno).Imunotoxina rícina pode ser preparada, por exemplo, conforme descrito emVitetta et al, Science 238: 1098 (1098). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é umexemplo de agente quelante para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo.Vide WO 94/11026.
Os conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas demoléculas pequenas, tais como caliqueamicina, maitansinóides, dolastatinas,aurostatinas, tricoteceno e CC1065 e os derivados dessas toxinas queapresentam atividade de toxina também são contemplados no presente.
i. Maitansina ε maitansinóides
Em algumas realizações, o imunoconjugado compreende umanticorpo (comprimento total ou fragmentos) de acordo com a presenteinvenção conjugado a uma ou mais moléculas de maitansinóide.
Maitansinóides são inibidores mitotóticos que agem inibindo apolimerização de tubulina. Maitansina foi isolada pela primeira vez a partir doarbusto do leste africano Maytenus serrata (Patente Norte-Americana n°3.896.111). Descobriu-se em seguida que certos micróbios também produzemmaitansinóides, tais como maitansinol e C-3 maitansinol ésteres (PatenteNorte-Americana n° 4.151.042). Maitansinol sintético, seus derivados eanálogos são descritos, por exemplo, nas Patentes Norte-Americanas n°4.137.230, 4.248.870, 4.256.746, 4.260.608, 4.265.814, 4.294.757, 4.307.016,4.308.268, 4.308.269, 4.309.428, 4.313.946, 4.315.929, 4.317.821, 4.322.348,4.331.598, 4.361.650, 4.364.866, 4.424.219, 4.450.254, 4.362.663 e 4.371.533.
Porções de drogas maitansinóides são porções de drogasatrativas em conjugados de droga e anticorpo porque são: (i) relativamenteacessíveis para preparação por meio de fermentação ou modificação química,derivação de produtos de fermentação, (ii) propensas à derivação com gruposfuncionais apropriados para conjugação por meio dos Iigantes não de dissulfetoa anticorpos, (iii) estáveis em plasma e (iv) eficazes contra uma série delinhagens de células de tumores.
Imunoconjugados contendo maitansinóides, métodos de suaelaboração e sua utilização terapêutica são descritos, por exemplo, nasPatentes Norte-Americanas n° 5.208.020, 5.416.064 e Patente Européia n0 EP0.425.235 B1, cujos relatórios descritivos são expressamente incorporados aopresente como referência. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 93: 8618-8623 (1993) descreveram imunoconjugados que compreendem maitansinóidedenominado DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 dirigido a câncer colo-retal humano. Concluiu-se que o conjugado é altamente citotóxico com relaçãoa células cancerosas do cólon cultivadas e exibiu atividade antitumorosa emteste de crescimento tumoroso in vivo. Chari et al, Câncer Research 52: 127-131 (1992) descrevem imunoconjugados em que um maitansinóide foiconjugado, por meio de ligação de dissulfeto, ao anticorpo A7 murino que seune a um antígeno sobre linhagens de células de câncer do cólon humano ou aoutro anticorpo monoclonal murino TA.1 que une o oncogene HER-2/neu. Acitotoxicidade do conjugado de TA.1 e maitansinóide foi testada in vitro sobre alinhagem de células de câncer de mama humano SK-BR-3, que expressa 3 χ105 antígenos de superfície HER-2 por célula. O conjugado de drogas atingiugrau de citotoxicidade similar à droga de maitansinóide livre, que poderá seraumentada por meio do aumento da quantidade de moléculas de maitansinóidepor molécula de anticorpo. O conjugado de A7 e maitansinóide exibiu baixacitotoxicidade sistêmica em camundongos.
Os conjugados de maitansinóide e anticorpo são preparados pormeio da ligação química de anticorpo a molécula de maitansinóide sem reduzirsignificativamente a atividade biológica do anticorpo nem da molécula demaitansinóide. Vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 5.208.020(cujo relatório descritivo é incorporado ao presente como referência). Emmédia, três a quatro moléculas de maitansinóide conjugadas por molécula deanticorpo exibiram eficácia no aumento da citotoxicidade de células alvo semprejudicar função ou solubilidade do anticorpo, embora se esperasse que atéuma molécula de toxina/anticorpo aumentasse a citotoxicidade sobre o uso deanticorpo bruto. Maitansinóides são bem conhecidos na técnica e podem sersintetizados por meio de técnicas conhecidas ou isolados a partir de fontesnaturais. Maitansinóides apropriados são descritos, por exemplo, na PatenteNorte-Americana n° 5.208.020 e nas outras patentes e publicações nãopatenteadas descritas acima. Os maitansinóides preferidos são maitansinol eanálogos de maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posiçõesda molécula de maitansinol, tais como diversos ésteres de maitansinol.
Existem vários grupos de ligação conhecidos na técnica para afabricação de conjugados de anticorpo e maitansinóide, que incluem, porexemplo, os descritos na Patente Norte-Americana n° 5.208.020 ou Patente EP0.425.235 B1, Chari et al, Câncer Research 52: 127-131 (1992) e Pedido dePatente Norte-Americano n° 10/960.602, depositado em oito de outubro de2004, cujos relatórios descritivos são expressamente incorporados ao presentecomo referência. Conjugados de anticorpo e maitansinóide que compreendemo componente Iigante SMCC podem ser preparados conforme descrito noPedido de Patente Norte-Americano n° 10/960.602, depositado em oito deoutubro de 2004. Os grupos de ligação incluem grupos dissulfeto, grupostioéter, grupos instáveis em ácido, grupos fotoinstáveis, grupos instáveis em- peptidase ou grupos instáveis em esterase, conforme descrito nas patentesidentificadas acima, em que grupos de dissulfeto e tioéter são preferidos.Grupos de ligação adicionais são descritos e exemplificados no presente.
Os conjugados do anticorpo e maitansinóide podem serfabricados utilizando uma série de agentes acopladores de proteínasbifuncionais, tais como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidila (SPDP),ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila), iminotiolano(IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetilaHCI), ésteres ativos (tais como suberato de di-succinimidila), aldeídos (taiscomo glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) ecompostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Osagentes acopladores particularmente preferidos incluem propionato de N-succinimidil-3-(2-piridiltio) (SPDP) (Carlsson et al, Biochem. J. 173: 723-737(1978)) e N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para fornecer ligaçãode dissulfeto.
O ligante pode ser ligado à molécula de maitansinóide emdiversas posições, dependendo do tipo da ligação. Ligação éster pode serformada, por exemplo, por meio de reação com grupo hidroxila, utilizandotécnicas convencionais de acoplamento. A reação pode ocorrer na posição C-3que contém um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetila,na posição C-15 modificada com grupo hidroxila e na posição C-20 que contémgrupo hidroxila. Em realização preferida, a ligação é formada na posição C-3 demaitansinol ou análogo de maitansinol.
ii. Auristatinas ε dolastatinas
Em algumas realizações, o imunoconjugado compreendeanticorpo de acordo com a presente invenção conjugado a dolastatinas ouderivados e análogos peptídicos de dolostatina, as auristatinas (PatentesNorte-Americanas n° 5.635.483 e 5.780.588). Demonstrou-se que dolastatinase auristatinas interferem com dinâmicas de microtúbulos, hidrólise de GTP edivisão nuclear e celular (Woyke et al (2001), Antimicrob. Agents andChemother. 45 (12): 3580-3584) e possuem atividade anticâncer (US5.663.149) e antifúngica (Pettit et al (1998), Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). A porção de droga dolastatina ou auristatina pode ser ligada aoanticorpo por meio do terminal N (amino) ou do terminal C (carboxila) daporção de droga peptídica (WO 02/088172).
Exemplos de realizações de auristatina incluem as porções dedrogas monometilauristatina ligadas por terminal N DE e DF1 descritas emMonomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands, Número deSérie Norte-Americano n° 10/983.340, depositado em cinco de novembro de2004, cujo relatório descritivo é expressamente incorporado integralmentecomo referência.
Tipicamente, porções de drogas com base em peptídeo podemser preparadas por meio da formação de união de peptídeo entre dois ou maisaminoácidos e/ou fragmentos de peptídeos. Estas uniões de peptídeos podemser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de faseslíquidas (vide E. Schrõder e K. Lübke, The Peptides, volume 1, págs. 76-136,1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo de química depeptídeos. As porções de droga auristatina/dolastatina podem ser preparadasde acordo com os métodos de: US 5.635.483; US 5.780.588; Pettit et al (1989),J. Am. Chem. Soe. 111: 5463-5465; Pettit et al (1998), Anti-Cancer DrugDesign 13: 243-277; Pettit, G. R. et al, Synthesis, 1996, 719-725; e Pettit et al(1996), J. Chem. Soe. Perkin Trans. 1 5: 859-863. Vide também Doronina(2003), Λ/aí. Biotechnol. 21 (7): 778-784; Monomethylvaline CompoundsCapable of Conjugation to Ligands, Número de Série Norte-Americano n°10/983.340, depositado em cinco de novembro de 2004, integralmenteincorporado ao presente como referência (que descreve, por exemplo, Iigantese métodos de preparação de compostos de monometilvalina tais como MMAEe MMAF conjugados a ligantes).
iii. Caliqueamicina
Em outras realizações, o imunoconjugado compreende anticorpode acordo com a presente invenção conjugado a uma ou mais moléculas decaliqueamicina. A família caliqueamicina de antibióticos é capaz de produzirrupturas de DNA de fita dupla em concentrações subpicomolares. Para apreparação de conjugados da família de caliqueamicina, vide as PatentesNorte-Americanas n° 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701,5.770.710, 5.773.001 e 5.877.296 (todas da American Cyanamid Company).Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser utilizados incluem, massem limitar-se a γ/, a.2, az, N-acetil-γ-ι1, PSAG e θ'ι (Hinman et al, CâncerResearch, 53: 3336-3342 (1993), Lode et al, Câncer Research, 58: 2925-2928(1998) e as Patentes Norte-Americanas da American Cyanamid mencionadasacima). Outra droga antitumorosa à qual o anticorpo pode ser conjugado éQFA, que é antifolato. Tanto caliqueamicina quanto QFA contêm locaisintracelulares de ação e não cruzam facilmente a membrana de plasma.Portanto, a absorção celular desses agentes por meio de internalizaçãomediada por anticorpos aumenta grandemente os seus efeitos citotóxicos.
iv. Outros agentes citotóxicos
Outros agentes anti-tumores que podem ser conjugados aosanticorpos de acordo com a presente invenção incluem BCNU, estreptozoicina,vincristina e 5-fluorouracil, família de agentes conhecida coletivamente comocomplexo LL-E33288, descrito nas Patentes Norte-Americanas n° 5.053.394 e5.770.710, bem como esperamicinas (Patente Norte-Americana n° 5.877.296).
Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podemser utilizados incluem cadeia de difteria A, fragmentos ativos não de união detoxina de difteria, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeiarícina A, cadeia de abrina A, cadeia modeccina A, alfa-sarcina, proteínas deAleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI,PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor deSapaonaria officinaiis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicinae os tricotecenos. Vide, por exemplo, WO 93/21232, publicada em 28 deoutubro de 1993.
A presente invenção contempla ainda imunoconjugado formadoentre anticorpo e composto com atividade nucleolítica (por exemplo,ribonuclease ou endonuclease de DNA, tal como desoxirribonuclease; DNase).
Para destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode compreenderum átomo altamente radioativo. Uma série de isótopos radioativos é disponívelpara a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem At211, I1311I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu.Quando o conjugado for utilizado para detecção, ele pode compreender umátomo radioativo para estudos cintigráficos, tal como tc99m ou I123, ou marca decentrifugação para formação de imagens por meio de ressonância magnéticanuclear (NMR) (também conhecida como formação de imagens porressonância magnética, MRI), tal como novamente iodo 123, iodo 131, índio111, flúor 19, carbono 13, nitrogênio 15, oxigênio 17, gadolínio, manganês ouferro.
As rádio-marcas ou outras podem ser incorporadas ao conjugadode formas conhecidas. O peptídeo pode ser, por exemplo, biossintetizado oupode ser sintetizado por meio de síntese química de aminoácidos, utilizandoprecursores de aminoácidos apropriados, envolvendo, por exemplo, flúor 19 nolugar de hidrogênio. Marcas tais como tc99m, I123, Re186, Re188 e In111 podem serligadas através de um resíduo de cisteína no peptídeo. ítrio 90 pode ser ligadopor meio de resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al (1978),Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 pode ser utilizado para incorporariodo 123. Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy (Chatal, CRC Press,1989) descreve outros métodos em detalhes.
Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem serfabricados utilizando uma série de agentes acopladores de proteínasbifuncionais, tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP)1ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila), iminotiolano(IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetilaHCI), ésteres ativos (tais como suberato de di-succinimidila), aldeídos (taiscomo glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) ecompostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno).
Imunotoxina rícina pode ser preparada, por exemplo, conforme descrito emVitetta et al, Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) éexemplo de agente quelante para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo.Vide WO 94/11026. O Iigante pode ser "ligante divisível" que possibilita aliberação da droga citotóxica na célula. Pode-se utilizar, por exemplo, liganteinstável ácido, ligante sensível a peptidase, ligante fotoinstável, ligante dedimetila ou ligante que contém dissulfeto (Chari et al, Câncer Research 52:127-131 (1992); Patente Norte-Americana n° 5.208.020).
Os compostos de acordo com a presente invenção contemplamexpressamente, mas sem limitar-se a ADC preparado com reagentesreticulantes: BMPS1 EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP,SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS,sulfo-MBS, suIfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB e SVSB (benzoato desuccinimidil-(4-vinilsulfona)) que são disponíveis comercialmente (tal como pormeio da Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, E. U. A.). Vide páginas 467 a498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.
v. Preparação de conjugados de anticorpo ε droga
Nos conjugados de anticorpo e droga (ADC) de acordo com apresente invenção, anticorpo (Ab) é conjugado a uma ou mais porções dedroga (D), tal como cerca de uma a cerca de vinte moléculas de droga poranticorpo, por meio de Iigante (L). O ADC da Fórmula I pode ser preparado porvários caminhos, empregando reações de química orgânica, condições ereagentes conhecidos dos técnicos no assunto, que incluem: (1) reação degrupo nucleofílico de anticorpo com reagente de Iigante bivalente, para formarAb-L, por meio de união covalente, seguida por reação com porção de droga D;e (2) reação de grupo nucleofílico de uma porção de droga com reagenteligante bivalente, para formar D-L, por meio de união covalente, seguida porreação com o grupo nucleofílico de anticorpo. Métodos adicionais depreparação de ADC são descritos no presente.
Ab-(L-D)p I
O ligante pode ser composto de um ou mais componentesligantes. Exemplos de componentes Iigantes incluem 6-maleimidocaproíla("MC"), maleimidopropanoíla ("MP"), valina-citrulina ("val-cit"),alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenziloxicarbonila ("PAB"), 4-(2-piridiltio) pentanoato de N-succinimidila ("SPP"), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1 carboxilato de N-succinimidla ("SMCC") e (4-iodo-acetil)aminobenzoato de N-succinimidila ("SIAB"). Componentes ligantes adicionaissão conhecidos na técnica e alguns são descritos no presente. Vide tambémMonomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands, Número deSérie Norte-Americano n° 10/983.340, depositado em cinco de novembro de2004, cujo teor é integralmente incorporado ao presente como referência.Em algumas realizações, o Iigante pode compreender resíduos deaminoácidos. Exemplos de componentes Iigantes de aminoácidos incluemdipeptídeo, tripeptídeo, tetrapeptídeo ou pentapeptídeo. Exemplos dedipeptídeos incluem: valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ouala-phe). Exemplos de tripeptídeos incluem: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) eglicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Resíduos de aminoácidos que compreendemcomponente Iigante de aminoácido incluem os de ocorrência natural, bemcomo aminoácidos menores e análogos de aminoácidos não de ocorrêncianatural, tais como citrulina. Componentes Iigantes de aminoácidos podem serprojetados e otimizados em sua seletividade para divisão enzimática porenzimas específicas, tais como protease associada a tumor, catepsina B, C e Dou protease de plasmina.
Os grupos nucleofílicos sobre anticorpos incluem, mas semlimitar-se a: (i) grupos amina N-terminais, (ii) grupos amina de cadeia lateral,tais como Iisina1 (iii) grupos tiol de cadeia lateral, tais como cisteína, e (iv)grupos amino ou hidroxil açúcar em que o anticorpo é glicosilado. Amina, tiol egrupos hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir para formar uniõescovalentes com grupos eletrofílicos sobre porções Iigantes e reagentesligantes, que incluem: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt,haloformatos e haletos ácidos; (ii) haletos de alquila e benzila tais comohaloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxila e grupos maleimida. Certosanticorpos possuem dissulfetos intercadeias redutíveis, ou seja, pontes decisteína. Os anticorpos podem ser tornados reativos para conjugação comreagentes ligantes por meio de tratamento com agente redutor tal como DTT(ditiotreitol). Cada ponte de cisteína formará, portanto, teoricamente, doisnucleófilos de tiol reativos. Grupos nucleofílicos adicionais podem serintroduzidos em anticorpos por meio da reação de Iisinas com 2-iminotiolano(reagente de Traut), resultando em conversão de amina em tiol. Grupos tiolreativos podem ser introduzidos no anticorpo (ou seu fragmento) por meio daintrodução de um, dois, três, quatro ou mais resíduos de cisteína (tal comopreparando anticorpos mutantes que compreendem um ou mais resíduos deaminoácidos de cisteína não nativos).
Os conjugados de drogas e anticorpos de acordo com a presenteinvenção podem também ser produzidos por meio de modificação do anticorpopara introduzir porções eletrofílicas, que podem reagir com substituintesnucleofílicos sobre o reagente Iigante ou droga. Os açúcares de anticorposglicosilados podem ser oxidados, por exemplo, com reagentes oxidantes deperiodato, para formar grupos cetona ou aldeído que podem reagir com o grupoamina de reagentes Iigantes ou porções de drogas. Os grupos base Schiffimina resultantes podem formar ligação estável ou podem ser reduzidos, porexemplo, por reagentes de boroidreto para formar ligações de amina estáveis.
Em uma realização, a reação da porção carboidrato de anticorpo glicosiladocom galactose oxidase ou metaperiodato de sódio pode gerar grupos carbonila(aldeído e cetona) na proteína que podem reagir com grupos apropriados sobrea droga (Hermanson, Bioconjugate Techniques). Em outra realização, asproteínas que contêm resíduos de serina ou treonina N-terminais podem reagircom metaperiodato de sódio, resultando na produção de aldeído no lugar doprimeiro aminoácido (Geoghegan e Stroh (1992), Bioconjugate Chem. 3: 138-146; US 5.362.852). Esse aldeído pode ser reagido com porção de droga ounucleófilo ligante.
De forma similar, os grupos nucleofílicos sobre uma porção dedroga incluem, mas sem limitar-se a: amina, tiol, hidroxila, hidrazida, oxima,hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina e grupos aril hidrazidacapazes de reagir para formar uniões covalentes com grupos eletrofílicos sobreporções Iigantes e reagentes ligantes, que incluem: (i) ésteres ativos tais comoésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos e haletos ácidos; (ii) haletos dealquila e benzila tais como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxila egrupos maleimida.
Alternativamente, pode ser fabricada proteína de fusão quecompreende o anticorpo e agente citotóxico, por exemplo, por meio de técnicasrecombinantes ou síntese de peptídeos. O comprimento de DNA podecompreender regiões correspondentes codificadoras das duas partes doconjugado, sejam elas adjacentes entre si ou separadas por região codificadorade peptídeo Iigante que não destrua as propriedades desejadas do conjugado.
Em ainda outra realização, o anticorpo pode ser conjugado a"receptor" (tal como estreptavidina) para uso em direcionamento prévio detumores, em que o conjugado de anticorpo e receptor é administrado aopaciente, seguido pela remoção de conjugado não unido da circulação,utilizando agente Iimpante e, em seguida, administração de "ligante" (tal comoavidina) que é conjugado a agente citotóxico (tal como radionucleotídeo).
Formulações Farmacêuticas
Formulações terapêuticas que compreendem anticorpo de acordocom a presente invenção são preparadas para armazenagem por meio demistura do anticorpo que possui o grau desejado de pureza com veículos,excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis opcionais (Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 20a edição (2000)), na forma desoluções aquosas, formulações Iiofilizadas ou outras secas. Veículos,excipientes ou estabilizantes aceitáveis são atóxicos para pacientes nasdosagens e concentrações empregadas e incluem tampões tais como fosfato,citrato, histidina e outros ácidos orgânicos; antioxidantes que incluem ácidoascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto deoctadecildimetilbenzil amônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio,cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabéns taiscomo metil ou propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol e m-- cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de dezresíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas;polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais comoglicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos,dissacarídeos e outros carboidratos, que incluem glicose, manose ou dextrinas;agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol,trehalose ou sorbitol; contraíons formadores de sais, tais como sódio;complexos metálicos (tais como complexos de Zn e proteína); e/ou tensoativosnão iônicos, tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG).
A formulação do presente pode também conter mais de umcomposto ativo conforme o necessário para a indicação específica sendotratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não seprejudiquem entre si. Essas moléculas encontram-se adequadamentepresentes em combinação, em quantidades que são eficazes para o propósitopretendido.
Os ingredientes ativos podem também ser capturados emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, por meio de técnicas de aglutinaçãoou por polimerização interfacial, tais como hidroximetilcelulose oumicrocápsulas de gelatina e microcápsulas de póli-(metilmetacrilato),respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (tais comolipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas enanocápsulas), ou em macroemulsões. Estes métodos são descritos emRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edição (2000).
As formulações a serem utilizadas para administração in vivodevem ser estéreis. Isso é facilmente obtido por meio de filtragem através demembranas de filtragem estéreis.
Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada.
Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluemmatrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm aimunoglobulina de acordo com a presente invenção, matrizes estas que seencontram na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas.Exemplos de matrizes com liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis(tais como póli(2-hidroxietilmetacrilato) ou álcool (poli)vinílico, polilactidas(Patente Norte-Americana n° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γetil-L-glutamato, etileno-vinil acetato não degradável, copolímeros de ácidoláctico e ácido glicólico degradáveis tais como o LUPRON DEPOT®(microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico e ácidoglicólico e acetato de leuprolida) e ácido póli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Emborapolímeros tais como etileno-vinil acetato e ácido láctico-ácido glicólico permitama liberação de moléculas por mais de cem dias, certos hidrogéis liberamproteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando imunoglobulinasencapsuladas permanecem no corpo por longo período, elas podemdesnaturar-se ou agregar-se como resultado da exposição à umidade a 37 °C,o que resulta em perda da atividade biológica e possíveis mudanças deimunogenicidade. Estratégias racionais podem ser idealizadas paraestabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Caso se descubra, porexemplo, que o mecanismo de agregação é a formação de união S-Sintermolecular por meio de intercâmbio de tio-dissulfeto, pode-se atingir aestabilização por meio da modificação de resíduos sulfidrila, liofilização a partirde soluções ácidas, controle do teor de umidade, uso de aditivos apropriados edesenvolvimento de composições de matriz de polímeros específicas.
Usos
Anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser utilizado,por exemplo, em métodos terapêuticos in vitro, ex vivo e in vivo.
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos detratamento ou prevenção de tumor, câncer e/ou doença proliferativa celularassociada ao aumento da expressão e/ou atividade de Efrina B2, em que osmétodos compreendem a administração de quantidade eficaz de anticorpo anti-Efrina B2 a paciente necessitado desse tratamento.
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos deredução, inibição, bloqueio ou prevenção do crescimento de tumor ou câncer,em que os métodos compreendem a administração de quantidade eficaz deanticorpo anti-Efrina B2 a paciente necessitado desse tratamento.
Os anticorpos de acordo com a presente invenção também sãoúteis para a inibição da angiogênese. Em algumas realizações, o local daangiogênese é tumor ou câncer.
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de inibiçãoda angiogênese que compreendem a administração de quantidade eficaz deanticorpo anti-Efrina B2 a paciente necessitado desse tratamento.
Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos detratamento de condição patológica associada à angiogênese quecompreendem a administração de quantidade eficaz de anticorpo anti-Efrina B2a paciente necessitado desse tratamento. Em algumas realizações, a condiçãopatológica associada à angiogênese é tumor, câncer e/ou disfunçãoproliferativa celular. Em algumas realizações, a condição patológica associadaà angiogênese é doença neovascular intraocular.
Além disso, pelo menos alguns dos anticorpos de acordo com apresente invenção podem unir antígenos de outras espécies.Conseqüentemente, os anticorpos de acordo com a presente invenção podemser utilizados para unir atividade de antígenos específica, tal como em cultivocelular que contém o antígeno, em pacientes humanos ou em outros pacientesmamíferos que possuem o antígeno com o qual um anticorpo de acordo com apresente invenção realiza reação cruzada (por exemplo, chimpanzé, babuíno,sagüi, cynomolgus e rhesus, porco ou camundongo). Em uma realização, oanticorpo de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para inibiratividades de antígenos por meio de contato do anticorpo com o antígeno, detal forma que a atividade de antígeno seja inibida. Preferencialmente, oantígeno é molécula de proteína humana.
Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invençãopode ser utilizado em método para unir antígeno em paciente que sofre dedisfunção associada ao aumento da expressão e/ou atividade de antígeno, quecompreende a administração ao paciente de anticorpo de acordo com apresente invenção, de tal forma que o antígeno no paciente seja unido.Preferencialmente, o antígeno é molécula de proteína humana e o paciente épaciente humano. Alternativamente, o paciente pode ser mamífero queexpressa o antígeno ao qual se une o anticorpo de acordo com a presenteinvenção. Ainda adicionalmente, o paciente pode ser mamífero ao qual oantígeno tenha sido introduzido (por meio, por exemplo, da administração doantígeno ou por meio de expressão de transgene de antígeno). Anticorpo deacordo com a presente invenção pode ser administrado a paciente humanopara propósitos terapêuticos. Além disso, anticorpo de acordo com a presenteinvenção pode ser administrado a mamífero não humano que expressaantígeno com o qual a imunoglobulina realiza reação cruzada (tal comoprimata, porco ou camundongo) para fins veterinários ou como modelo animalde doença humana. Com relação a este último, esses modelos animais podemser úteis para avaliar a eficácia terapêutica de anticorpos de acordo com apresente invenção (tal como teste de dosagens e períodos de administração).
Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem serutilizados para tratar, inibir, retardar o progresso, evitar/retardar a reincidência,melhorar ou prevenir doenças, disfunções ou condições associads à expressãoe/ou atividade de uma ou mais moléculas de antígenos.
Exemplos de disfunções incluem, mas sem limitar-se a carcinoma,linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidades linfóides. Exemplosmais específicos desses cânceres incluem câncer de células escamosas (porexemplo, câncer de células escamosas epiteliais), câncer do pulmão, incluindocâncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão não de célulaspequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão,câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou estomacal,incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer dacervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, câncer do tratourinário, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon, câncer retal, câncercolo-retal, carcinoma uterino ou endométrico, carcinoma das glândulassalivares, câncer renal ou dos rins, câncer da próstata, câncer da vulva, câncerda tireóide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano,melanoma, mieloma múltiplo e linfoma de células B, câncer do cérebro, bemcomo da cabeça e do pescoço, e metástases associadas. Em algumasrealizações, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste de câncerdo pulmão de células pequenas, neuroblastomas, melanoma, carcinoma dosseios, câncer gástrico, câncer colo-retal (CRC) e carcinoma hepatocelular.
Os anticorpos de acordo com a presente invenção também sãoúteis no tratamento (incluindo prevenção) de disfunções cuja patologia envolvaa degeneração ou disfunção celular, tal como o tratamento de diversasdisfunções neurodegenerativas (crônicas) e lesões agudas das célulasnervosas. Essas disfunções neurodegenerativas incluem, sem limitação,neuropatias periféricas; disfunções dos neurônios motores, tais como escleroselateral amilotrófica (ALS, mal de Lou Gehrig), paralisia de Bell e váriascondições que envolvem a paralisia ou atrofia muscular espinhal; e outrasdoenças neurodegenerativas humanas, tais como mal de Alzheimer1 mal deParkinson, epilepsia, esclerose múltipla, coréia de Huntington, síndrome deDown, surdez nervosa e mal de Meniere, e lesões agudas das célulasnervosas, tais como devido a traumas ou lesões da medula espinhal.
Em certas realizações, um imunoconjugado que compreendeanticorpo conjugado a um ou mais agentes citotóxicos é administrado aopaciente. Em algumas realizações, o imunoconjugado e/ou antígeno ao qual éunido é (são) internalizado(s) pela célula, o que resulta em maior eficáciaterapêutica do imunoconjugado para matar a célula alvo à qual se une. Emuma realização, o agente citotóxico dirige-se ou interfere com o ácido nucleicona célula alvo. Em uma realização, o agente citotóxico dirige-se àpolimerização de microtúbulos ou com ela interfere. Exemplos desses agentescitotóxicos incluem quaisquer dos agentes quimioterapêuticos indicados nopresente (tais como maitansinóide, auristatina, dolastatina ou caliqueamicina),isótopo radioativo, ribonuclease ou endonuclease de DNA.
Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem serutilizados isoladamente ou em combinação com outras composições emterapia. Anticorpo de acordo com a presente invenção pode sercoadministrado, por exemplo, com outro anticorpo, agente(s)quimioterapêutico(s) (incluindo coquetéis de agentes quimioterapêuticos),outro(s) agente(s) citotóxico(s), agente(s) antiangiogênico(s), citoquinas e/ouagente(s) inibidor(es) do crescimento. Quando um anticorpo de acordo com apresente invenção inibir o crescimento de tumores, pode ser particularmentedesejável combiná-lo com um ou mais agentes terapêuticos diferentes quetambém inibam o crescimento de tumores. Alternativa ou adicionalmente, opaciente pode receber terapia de radiação combinada (tal como irradiação defeixes externos ou terapia com agente marcado radioativo, tal como anticorpo).
Essas terapias combinadas indicadas acima incluem administração combinada(em que os dois ou mais agentes são incluídos na mesma formulação ou emformulações separadas) e administração separada, caso em que aadministração do anticorpo de acordo com a presente invenção pode ocorrerantes e/ou depois da administração da(s) terapia(s) adjunta(s).
Terapias de combinação
Conforme indicado acima, a presente invenção fornece terapiascombinadas nas quais anticorpo anti-Efrina B2 é administrado com outraterapia. Anticorpos anti-Efrina B2 são utilizados, por exemplo, em combinaçõescom produtos terapêuticos anticancerígenos ou terapêuticosantineovascularização para o tratamento de diversas condições neoplásticasou não neoplásticas. Em uma realização, a condição neoplástica ou nãoneoplástica é caracterizada por disfunção patológica associada a angiogêneseaberrante ou indesejada. O anticorpo anti-Efrina B2 pode ser administrado emsérie ou em combinação com outro agente terapêutico que é eficaz para estespropósitos, seja na mesma composição ou na forma de composiçõesseparadas. Alternativa ou adicionalmente, podem ser administrados diversosinibidores de Efrina B2.
A administração do anticorpo anti-Efrina B2 pode ser realizadasimultaneamente, tal como na forma de composição isolada ou como d,uas oumais composições distintas, utilizando a mesma via de administração oudiferentes. Alternativa ou adicionalmente, a administração pode ser realizadaseqüencialmente, em qualquer ordem. Em certas realizações, intervalos quevariam de minutos até dias, semanas ou meses podem estar presentes entreas administrações das duas ou mais composições. O agente anticancerígenopode ser administrado, por exemplo, em primeiro lugar, seguido pelo inibidor deEfrina B2. Entretanto, a administração simultânea ou a administração doanticorpo anti-Efrina B2 em primeiro lugar também é contemplada.
As quantidades eficazes dos agentes terapêuticos administradosem combinação com anticorpo anti-Efrina B2 estará a critério do médico ouveterinário. A administração e o ajuste da dosagem são realizados para atingiradministração máxima das condições a serem tratadas. A dose dependeráadicionalmente de fatores tais como o tipo do agente terapêutico a ser utilizadoe o paciente específico sendo tratado. Dosagens apropriadas para o agenteanticancerígeno são as utilizadas atualmente e podem ser reduzidas devido àação combinada (sinergia) do agente anticancerígeno e do anticorpo anti-EfrinaB2. Em certas realizações, a combinação dos inibidores potencializa a eficáciade inibidor isolado. O termo "potencializar" designa aumento da eficácia deagente terapêutico na sua dose comum ou aprovada.
Tipicamente, os anticorpos anti-Efrina B2 e agentesanticancerígenos são apropriados para a mesma doença ou similares parabloquear ou reduzir disfunção patológica tal como crescimento de tumores oucrescimento de célula de câncer. Em uma realização, o agente anticancerígenoé agente antiangiogênese.
Terapia antiangiogênica com relação a câncer é estratégia detratamento de câncer destinada à inibição do desenvolvimento de vasossangüíneos de tumores necessários para fornecer nutrientes para sustentar ocrescimento do tumor. Como a angiogênese está envolvida no crescimento detumores primários e metástase, o tratamento antiangiogênico fornecido pelapresente invenção é capaz de inibir o crescimento neoplástico de tumores nolocal primário, bem como evitar a metástase de tumores nos locaissecundários, de forma a permitir ataque dos tumores por outros produtosterapêuticos.
Muitos agentes antiangiogênicos foram identificados e sãoconhecidos na técnica, incluindo os relacionados no presente, tais como osrelacionados em Definições, e, por exemplo, por Carmeliet e Jain, Nature 407:249-257 (2000); Ferrara et al, Nature Reviews: Drug Discovery, 3: 391-400(2004); e Sato, Int. J. Clin. Oncol., 8: 200-206 (2003). Vide também o Pedido dePatente Norte-Americano n° US 2003/0055006. Em uma realização, anticorpoanti-Efrina B2 é utilizado em combinação com anticorpo neutralizante anti-VEGF (ou fragmento) e/ou outro antagonista de VEGF ou antagonista receptorde VEGF que inclui, mas sem limitar-se, por exemplo, a fragmentos de receptorde VEGF solúvel (tal como VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, neurofilinas (taiscomo NRP1, NRP2)), aptâmeros capazes de bloquear VEGF ou VEGFR,anticorpos anti-VEGFR neutralizantes, inibidores de baixo peso molecular detirosino quinases de VEGFR (RTK), estratégias sem sentido para VEGF,ribozimas contra VEGF ou receptores de VEGF, variantes antagonistas deVEGF e quaisquer de suas combinações. Alternativa ou adicionalmente, doisou mais inibidores da angiogênese podem ser opcionalmente coadministradosao paciente além de antagonista de VEGF e outro agente. Em certa realização,um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tais como agentesanticancerígenos, podem ser administrados em combinação com anticorpoanti-Efrina B2, o antagonista de VEGF e agente antiangiogênese.
Em certos aspectos da presente invenção, outros agentesterapêuticos úteis para terapia de tumores de combinação com anticorpo anti-Efrina B2 incluem outras terapias contra o câncer (tais como cirurgia,tratamentos radiológicos (que envolvem, por exemplo, irradiação ouadministração de substâncias radioativas), quimioterapia, tratamento comagentes anticancerígenos relacionados no presente e conhecidos na técnica ousuas combinações). Alternativa ou adicionalmente, dois ou mais anticorpos queunem o mesmo ou dois ou mais antígenos diferentes descritos no presentepodem ser coadministrados ao paciente. Às vezes, pode ser benéfico tambémadministrar uma ou mais citoquinas ao paciente.
Agentes quimioterapéuticos
Em certos aspectos, a presente invenção fornece método debloqueio ou redução do crescimento de tumores ou crescimento de célulascancerosas, por meio de administração de quantidades eficazes de antagonistade Efrina B2 e/ou inibidor(es) da angiogênese e um ou mais agentesquimioterapêuticos a paciente suscetível a câncer ou com ele diagnosticado.
Uma série de agentes quimioterapêuticos pode ser utilizada nos métodos detratamento combinados de acordo com a presente invenção. Exemplo e listanão limitadora de agentes quimioterapêuticos contemplados são fornecidos nopresente em "Definições".
Como será compreendido pelos técnicos comuns no assunto, asdoses apropriadas de agentes quimioterapêuticos estarão geralmente entre asjá empregadas em terapias clínicas, em que os produtos quimioterapêuticossão administrados isoladamente ou em combinação com outros produtosquimioterapêuticos. A variação da dosagem provavelmente ocorrerádependendo da condição sendo tratada. O médico que administra o tratamentoserá capaz de determinar a dose apropriada para o paciente individual.
Reincidência do crescimento de tumores
A presente invenção também fornece métodos e composiçõespara inibição ou prevenção de reincidência do crescimento de tumores oureincidência do crescimento de células cancerosas. A reincidência docrescimento de tumores ou reincidência do crescimento de células cancerosasé utilizada para descrever condição em que os pacientes sofrem ou sãotratados com uma ou mais terapias atualmente disponíveis (tais como terapiascontra o câncer, como quimioterapia, terapia de radiação, cirurgia, terapiahormonal e/ou terapia biológica/imunoterapia, terapia com anticorpos anti-VEGF, particularmente regime terapêutico padrão para o câncer específico)não é clinicamente adequada para o tratamento dos pacientes ou os pacientesnão estão mais recebendo nenhum efeito benéfico da terapia, de forma queessees pacientes necessitam de terapia eficaz adicional. Da forma utilizada nopresente, a expressão pode também indicar condição do paciente"refratário/sem reação", que descreve, por exemplo, pacientes que reagem aterapia mas ainda sofrem efeitos colaterais, desenvolvem resistência, nãoreagem à terapia, não reagem satisfatoriamente à terapia etc. Em váriasrealizações, câncer é reincidência do crescimento de tumor ou reincidência docrescimento de células cancerosas em que a quantidade de células cancerosasnão foi significativamente reduzida ou aumentou, ou o tamanho do tumor nãofoi significativamente reduzido, aumentou, ou não apresenta nenhuma reduçãoadicional de tamanho ou de quantidade de células cancerosas. A determinaçãode se as células cancerosas são reincidência do crescimento de tumor oureincidência do crescimento de células cancerosas pode ser realizada in vivoou in vitro por meio de qualquer método conhecido na técnica para determinara eficácia do tratamento de células cancerosas, utilizando os significadosaceitos na técnica de "retardado", "refratário" ou "sem reação" nesse contexto.Tumor resistente a tratamento anti-VEGF é exemplo de reincidência docrescimento de tumor.
A presente invenção fornece métodos de bloqueio ou redução dareincidência do crescimento de tumor ou reincidência do crescimento decélulas cancerosas em pacientes por meio da administração de um ou maisanticorpos anti-Efrina B2 para bloquear ou reduzir a reincidência docrescimento de tumores ou reincidência do crescimento de células cancerosasem pacientes. Em certas realizações, o antagonista pode ser administradosubseqüentemente ao produto terapêutico para o câncer. Em certasrealizações, o anticorpo anti-Efrina B2 é administrado simultaneamente com aterapia do câncer. Alternativa ou adicionalmente, a terapia com anticorpo anti-Efrina B2 é alternada com outra terapia do câncer, que pode ser realizada emqualquer ordem. A presente invenção também engloba métodos deadministração de um ou mais anticorpos inibidores para evitar o início oureincidência de câncer em pacientes pré-dispostos a ter câncer. Geralmente, opaciente foi ou está passando simultaneamente por terapia de câncer. Em umarealização, a terapia de câncer é tratamento com agente antiangiogênese, tal- como antagonista de VEGF. O agente antiangiogênese inclui os conhecidos natécnica e os encontrados em Definições no presente. Em uma realização, oagente antiangiogênese é anticorpo neutralizante anti-VEGF ou seu fragmento(tal como A4.6.1 humanizado, AVASTIN® (Genentech, South San FranciscoCA), Y0317, M4, G6, B20, 2C3 etc.). Vide, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas n° 6.582.959, 6.884.879, 6.703.020; WO 98/45332; WO 96/30046;WO 94/10202; EP 0666868B1; Pedidos de Patente Norte-Americanos n°20030206899, 20030190317, 20030203409 e 20050112126; Popkov et al,Journal of Immunological Methods 288: 149-164 (2004); e WO 2005012359.Agentes adicionais podem ser administrados em combinação com antagonistade VEGF e anticorpo anti-Efrina B2 para bloquear ou reduzir a reincidência docrescimento de tumores ou reincidência do crescimento de câncer; vide, porexemplo, o capítulo intitulado Terapias de Combinação no presente.
O anticorpo de acordo com a presente invenção (e agenteterapêutico adjunto) é (são) administrado(s) por qualquer meio apropriado, queinclui parenteral, subcutâneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal e, sedesejado para tratamento local, administração intralesional. As infusõesparenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intraarterial,intraperitoneal ou subcutânea. Além disso, o anticorpo é administradoadequadamente por meio de infusão de pulsos, particularmente com dosesdecrescentes do anticorpo. A dosagem pode ser fornecida por qualquer viaapropriada, tal como por meio de injeções, tais como injeções intravenosas ousubcutâneas, dependendo, em parte, de se a administração é rápida oucrônica.
A composição de anticorpo de acordo com a presente invençãoserá formulada, dosada e administrada de forma consistente com a boa práticamédica. Fatores para consideração neste contexto incluem a disfunçãoespecífica sendo tratada, o mamífero específico sendo tratado, a condição- clínica do paciente individual, a causa da disfunção, o local de fornecimento doagente, o método de administração, o cronograma de administração e outrosfatores conhecidos dos praticantes da medicina. O anticorpo não necessita ser,mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente utilizadospara evitar ou tratar a disfunção em questão. A quantidade eficaz dessesoutros agentes depende da quantidade de anticorpos de acordo com apresente invenção presentes na formulação, do tipo de disfunção ou tratamentoe de outros fatores discutidos acima. Estes são geralmente empregados nasmesmas dosagens e com vias de administração conforme utilizado acima oucerca de 1 a 99% das dosagens empregadas até aqui.
Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagemapropriada de anticorpo de acordo com a presente invenção (quando utilizadoisoladamente ou em combinação com outros agentes tais como agentesquimioterapêuticos) dependerá do tipo de doença a ser tratado, do tipo deanticorpo, da severidade e do curso da doença, se o anticorpo é administradopara propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínicodo paciente e reação ao anticorpo e do critério do médico atendente. Oanticorpo é administrado adequadamente ao paciente em uma vez ou ao longode uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença,cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg (tal como 0,1 mg/kg a 10 mg/kg) de anticorpo épossível dose inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, pormeio de uma ou mais administrações separadas ou por meio de infusãocontínua. Dosagem diária típica poderá variar de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kgou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administraçõesrepetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, otratamento é mantido até que ocorra supressão desejada de sintomas dadoença. Um exemplo de dosagem do anticorpo estaria na faixa de cerca de0^05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Desta forma, uma ou mais doses de cerca de- 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer de suascombinações) podem ser administradas ao paciente. Essas doses podem seradministradas intermitentemente, tal como semanalmente ou a cada trêssemanas (por exemplo, de tal forma que o paciente receba cerca de duas acerca de vinte, tal como cerca de seis doses do anticorpo). Dose decarregamento mais alta inicial, seguida por uma ou mais doses mais baixas,pode ser administrada. Exemplo de regime de dosagem compreende aadministração de dose de carregamento inicial de cerca de 4 mg/kg, seguidapor dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo.Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O andamento destaterapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e testes convencionais.
Os anticorpos anti-Efrina B2 de acordo com a presente invençãosão úteis em testes que detectam a expressão de Efrina B2 (tais como testesde diagnóstico ou prognóstico) em células ou tecidos específicos, em que osanticorpos são marcados conforme descrito abaixo e/ou são imobilizados sobrematriz insolúvel.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos dedetecção de Efrina B2, em que os métodos compreendem a detecção decomplexo de anticorpo anti-Efrina B2 e Efrina B2 na amostra. O termo"detecção", da forma utilizada no presente, inclui detecção qualitativa e/ouquantitativa (níveis de medição) com ou sem referência a controle.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos dediagnóstico de disfunção associada à expressão e/ou atividade de Efrina B2,em que os métodos compreendem a detecção de complexo de anticorpo anti-Efrina B2 e Efrina B2 em amostra biológica de paciente que possui ou ésuspeito de possuir a disfunção. Em algumas realizações, a expressão deEfrina B2 é o aumento da expressão ou expressão anormal (indesejada). Emalgumas realizações, a disfunção é tumor, câncer e/ou disfunção proliferativacelular.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece qualquer dosanticorpos anti-Efrina B2 descritos no presente, em que o anticorpo anti-EfrinaB2 compreende marca detectável.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece complexo dequalquer dos anticorpos anti-Efrina B2 descritos no presente e Efrina B2. Emalgumas realizações, o complexo encontra-se in vivo ou in vitro. Em algumasrealizações, o complexo compreende célula de câncer. Em algumasrealizações, o anticorpo anti-Efrina B2 é marcado de forma detectável.
Anticorpos anti-Efrina B2 podem ser utilizados para a detecção deEfrina B2 em qualquer dentre uma série de métodos de teste de detecção bemconhecidos. Amostra biológica pode ser testada para Efrina B2, por exemplo,por meio da obtenção da amostra de fonte desejada, mistura da amostra comanticorpo anti-Efrina B2 para permitir que o anticorpo forme complexo deanticorpo e Efrina B2 com qualquer Efrina B2 presente na mistura e detecçãode qualquer complexo de anticorpo e Efrina B2 presente na mistura. A amostrabiológica pode ser preparada para teste por meio de métodos conhecidos natécnica que sejam apropriados para a amostra específica. Os métodos demistura da amostra com anticorpos e os métodos de detecção de complexo deanticorpo e Efrina B2 são selecionados de acordo com o tipo de teste utilizado.Esses testes incluem imunohistoquímica, testes competitivos e em sanduíche etestes de inibição estérica.
Todos os métodos analíticos para Efrina B2 utilizam um ou maisdos reagentes a seguir: análogo de Efrina B2 marcado, análogo de Efrina B2imobilizado, anticorpo anti-Efrina B2 marcado, anticorpo anti-Efrina B2imobilizado e conjugados estéricos. Os reagentes marcados também sãodenominados "rastreadores".
A marca utilizada é qualquer funcionalidade detectável que nãointerfira com a união de Efrina B2 e anticorpo anti-Efrina B2. Diversas marcassão conhecidas para uso em imunotestes e exemplos incluem porções quepodem ser detectadas diretamente, tais como fluorocromo, marcasquimioluminescentes e radioativas, bem como porções, tais como enzimas, quedevem ser reagidas ou derivadas para ser detectadas. Exemplos dessasmarcas incluem:
A marca utilizada é qualquer funcionalidade detectável que nãointerfira com a união de Efrina B2 e anticorpo anti-Efrina B2. Diversas marcassão conhecidas para uso em imunotestes e exemplos incluem porções quepodem ser detectadas diretamente, tais como fluorocromo, marcasquimioluminescentes e radioativas, bem como porções, tais como enzimas, quedevem ser reagidas ou derivadas para ser detectadas. Exemplos dessasmarcas incluem os radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H e 131I1 fluoroforos tais comoquelatos de terra rara ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seusderivados, dansil, umbeliferona, luceriferases, tais como Iuciferase de vaga-Iume e Iuciferase bacteriana (Patente Norte-Americana n° 4.737.456),luciferina, 2,3-di-hidroftalazinodionas, peroxidase de rabanete silvestre (HRP),fosfatase alcalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacarídeo oxidases,tais como glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfatodesidrogenase, oxidases heterocíclicas tais como uricase e xantino oxidase,acopladas a uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio para oxidarprecursor de tintura tal como HRP, Iactoperoxidase ou microperoxidase,biotina/avidina, marcas de centrifugação, marcas de bacteriófagos, radicaislivres estáveis e similares.
Métodos convencionais são disponíveis para unir estas marcascovalentemente a proteínas ou polipeptídeos. Agentes acopladores tais comodialdeídos, carbodiimidas, dimaleimidas, bis-imidatos, benzidina bis-diazotizadae similares podem ser utilizados, por exemplo, para marcar os anticorpos comas marcas enzimáticas, quimioluminescentes e fluorescentes descritas acima.Vide, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas n° 3.940.475 (fluorimetria) e3.645.090 (enzimas); Hunter et al, Nature, 144: 945 (1962); David et al,Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain et al, J. Immunol. Methods, 40: 219-230 (1981); e Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982).Marcas preferidas no presente são enzimas tais como peroxidase de rabanetesilvestre e fosfatase alcalina. A conjugação dessa marca, incluindo as enzimas,ao anticorpo é procedimento de manipulação padrão para os técnicos comunsno assunto de imunoteste. Vide, por exemplo, 0'Sullivan et al, Methods for thePrefDaration of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay,em Methods in Enzymology, ed. J. J. Langone e H. Van Vunakis1 Vol. 73(Academic Press, Nova Iorque NY1 1981), págs. 147-166.
A imobilização de reagentes é necessária para certos métodos deteste. A imobilização indica a separação do anticorpo anti-Efrina B2 dequalquer Efrina B2 que permaneça livre em solução. Esta é convencionalmenteobtida por meio de insolubilização do anticorpo anti-Efrina B2 ou análogo deEfrina B2 antes do procedimento de teste, tal como por meio de adsorção asuperfície ou matriz insolúvel em água (Bennich et al, Patente Norte-Americanan° 3.720.760), por meio de acoplamento covalente (utilizando, por exemplo,retícula de glutaraldeído), ou por meio de insolubilização do anticorpo anti-Efrina B2 ou análogo de Efrina B2 em seguida, tal como por meio deimunoprecipitação.
A expressão de proteínas em amostra pode ser examinadautilizando protocolos de manchas e imunohistoquímica. Demonstrou-se quemanchas imunohistoquímicas de seções de tecido são método confiável dedeterminação ou detecção da presença de proteínas em amostra/Técnicas deimunohistoquímica ("IHC") utilizam anticorpo para sondar e visualizar antígenoscelulares in situ, geralmente por meio de métodos cromogênicos ou- fluorescentes. Para a preparação de amostras, pode-se utilizar amostra decélulas ou tecido de mamífero (tipicamente paciente humano). Exemplos deamostras incluem, mas sem limitar-se a células cancerosas tais como célulasde câncer do cólon, mama, próstata, ovário, pulmão, estômago, pâncreas,linfoma e leucemia. A amostra pode ser obtida por meio de uma série deprocedimentos conhecidos na técnica que incluem, mas sem limitar-se aexcisão cirúrgia, aspiração ou biópsia. O tecido pode ser fresco ou congelado.Em uma realização, a amostra é fixa e embutida em parafina ou similar. Aamostra de tecido pode ser fixada (ou seja, preservada) por meio demetodologia convencional. Os técnicos comuns no assunto apreciarão que aescolha de fixador é determinada pelo propósito para o qual a amostra deveser histologicamente manchada ou analisada de outra forma. Os técnicoscomuns no assunto apreciarão que o comprimento de fixação depende dotamanho da amostra de tecido e do fixador utilizado.
IHC pode ser realizado em combinação com métodos adicionais,tais como manchas morfológicas e/ou hibridização in situ por fluorescência.São disponíveis dois métodos gerais de IHC: testes diretos e indiretos.Segundo o primeiro teste, a união de antígeno ao antígeno alvo (tal comoEfrina B2) é determinada diretamente. Este teste direto utiliza reagentemarcado, tal como marca de fluorescência ou anticorpo primário marcado porenzima, que pode ser visualizado sem interação de anticorpos adicional. Emteste indireto típico, anticorpo primário não conjugado une-se ao antígeno e,em seguida, anticorpo secundário marcado une-se ao anticorpo primário.Quando o anticorpo secundário for conjugado a marca enzimática, substratocromogênico ou fluorogênico é adicionado para fornecer visualização doantígeno. A amplificação do sinal ocorre porque diversos anticorpossecundários podem reagir com diferentes epítopos sobre o anticorpo primário.
O anticorpo primário e/ou secundário utilizado paraimunohistoquímica será tipicamente marcado com porção detectável. Sãodisponíveis numerosas marcas que podem ser agrupadas de forma geral nascategorias a seguir:
Além dos procedimentos de preparação de amostra discutidos acima,tratamento adicional da seção de tecido antes, durante ou depois do IHC pode serdesejado. Métodos de recuperação de epítopos, tais como aquecimento da amostrade tecido em tampão de citrato, por exemplo, podem ser conduzidos (vide, porexemplo, Leong et al, Appl. Immunohistochem. 4(3): 201 (1996)).
Após etapa opcional de bloqueio, a seção de tecido é exposta aanticorpo primário por período de tempo suficiente e sob condiçõesapropriadas, de tal forma que o anticorpo primário una-se ao antígeno deproteína alvo na amostra de tecido. Condições apropriadas para atingir issopodem ser determinadas por meio de experimentação de rotina. A extensão daunião de anticorpo à amostra é determinada utilizando qualquer das marcasdetectáveis discutidas acima. Preferencialmente, a marca é marca enzimática(tal como HRPO), que catalisa alteração química do substrato cromogênico talcomo cromogene 3,3'-diaminobenzidina. Preferencialmente, a marcaenzimática é conjugada a anticorpo que se une especificamente ao anticorpoprimário (o anticorpo primário, por exemplo, é anticorpo policlonal de coelho e oanticorpo secundário é anticorpo anti-coelho de cabra).
As amostras preparadas desta forma podem ser montadas ecobertas. Determina-se em seguida a avaliação da lâmina, utilizando, porexemplo, microscópio e podem ser empregados critérios de intensidade demanchas, rotineiramente utilizados na técnica. Critérios de intensidade demanchas podem ser avaliados conforme segue:
Tabela 2
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Tipicamente, avaliação de padrão de manchas de cerca de 2+ ousuperior em teste de IHC é diagnóstico e/ou prognóstico. Em algumasrealizações, avaliação de padrão de manchas de cerca de 1+ ou superior édiagnóstico e/ou prognóstico. Em algumas realizações, avaliação de padrão demanchas de cerca de 3 ou superior é diagnóstico e/ou prognóstico.Compreende-se que, quando as células e/ou o tecido de adenoma do cólon outumor são examinados utilizando IHC, as manchas são geralmentedeterminadas em células e/ou tecido de tumor (ao contrário de tecido estromalou vizinho que pode estar presente na amostra).
Outros métodos de teste, conhecidos como testes competitivos oude sanduíche, são bem estabelecidos e amplamente utilizados na indústria dediagnóstico comercial.
Testes competitivos dependem da capacidade de análogo deEfrina B2 rastreador de competir com a amostra de teste Efrina B2 porquantidade limitada de locais de união de antígenos de anticorpos anti-EfrinaB2. O anticorpo anti-Efrina B2 geralmente é insolubilizado antes ou depois dacompetição e, em seguida, o rastreador e Efrina B2 unidos ao anticorpo anti-Efrina B2 são separados do rastreador não unido e Efrina B2. Esta separação éobtida por meio de decantação (em que o parceiro de união era previamenteinsolubilizado) ou de centrifugação (em que o parceiro de união era precipitadoapós a reação competitiva). A quantidade de amostra de teste de Efrina B2 éinversamente proporcional à quantidade de rastreador unido conforme medidopela quantidade de substância marcadora. Curvas de reação à dosagem comquantidades conhecidas de Efrina B2 são preparadas e comparadas com osresultados de teste para determinar quantitativamente a quantidade de EfrinaB2 presente na amostra de teste. Estes testes são denominados sistemasELISA quando as enzimas forem utilizadas como marcadores detectáveis.
Outra espécie de teste competitivo, denominado teste"homogêneo", não necessita de separação de fases. Aqui, um conjugado deenzima com Efrina B2 é preparado e utilizado de tal forma que, quandoanticorpo anti-Efrina B2 unir-se à Efrina B2, a presença do anticorpo anti-EfrinaB2 modifica a atividade enzimática. Neste caso, a Efrina B2 ou seusfragmentos imunologicamente ativos são conjugados com ponte orgânicabifuncional a enzima tal como peroxidase. Conjugados são selecionados parauso com anticorpo anti-Efrina B2, de forma que a união do anticorpo anti-EfrinaB2 iniba ou potencialize a atividade enzimática da marca. Este métodointrinsecamente é amplamente praticado com o nome EMIT.
Conjugados estéricos são utilizados em métodos de obstruçãoestérica para testes homogêneos. Estes conjugados são sintetizados por meiode ligação covalente de hapteno com baixo peso molecular a fragmento deEfrina B2 pequeno, de forma que o anticorpo para hapteno sejasubstancialmente incapaz de unir o conjugado ao mesmo tempo que oanticorpo anti-Efrina B2. Com base neste procedimento de teste, a Efrina B2presente na amostra de teste unirá anticorpo anti-Efrina B2, de forma a permitirque anti-hapteno una-se ao conjugado, resultando em alteração do caráter dohapteno conjugado, tal como alteração de fluorescência quando o hapteno forfluoroforo.
Testes de sanduíche são particularmente úteis para a- determinação de Efrina B2 ou anticorpos anti-Efrina B2. Em testes desanduíche seqüenciais, anticorpo anti-Efrina B2 imobilizado é utilizado paraadsorver amostra de teste de Efrina B2, a amostra de teste é removida pormeio de lavagem, a Efrina B2 unida é utilizada para adsorver segundoanticorpo anti-Efrina B2 marcado e material unido é separado de rastreadorresidual em seguida. A quantidade de rastreador unido é diretamenteproporcional à amostra de teste Efrina B2. Em testes sanduíche "simultâneos",a amostra de teste não é separada antes da adição da anti-Efrina B2 marcada.Teste sanduíche seqüencial utilizando anticorpo monoclonal anti-Efrina B2como um anticorpo e anticorpo anti-Efrina B2 policlonal como o outro é útil emtestes de amostras para determinar Efrina B2.
A seguir encontram-se meros exemplos de testes de detecçãopara Efrina B2. Outros métodos desenvolvidos agora ou a seguir queutilizam anticorpo anti-Efrina B2 para determinação de Efrina B2 sãoincluídos dentro do escopo do presente, incluindo os biotestes aquidescritos.
Artigos Industrializados
Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido artigoindustrializado que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/oudiagnóstico das disfunções descritas acima. O artigo industrializadocompreende um recipiente e um rótulo ou bula sobre o recipiente ou a eleassociado. Os recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas,ampolas, seringas etc. Os recipientes podem ser formados com uma série demateriais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composiçãoque, por si própria ou quando combinada com outras composições, é eficazpara o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e pode ter umaporta de acesso estéril (o recipiente pode ser, por exemplo, um saco desolução intravenosa ou uma ampola que contém tampa perfurável por uma- agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo da composição éanticorpo de acordo com a presente invenção. O rótulo ou bula indica quea composição é utilizada para o tratamento da condição específica, talcomo câncer. Além disso, o artigo industrializado pode compreender (a)primeiro recipiente com composição nele contida, em que a composiçãocompreende um anticorpo de acordo com a presente invenção; e (b)segundo recipiente com composição nele contida, em que a composiçãocompreende agente citotóxico adicional. O artigo industrializado destarealização da presente invenção pode compreender adicionalmente umabula que indica que as primeira e segunda composições de anticorpospodem ser utilizadas para o tratamento de condição específica, tal comocâncer. Alternativa ou adicionalmente, o artigo industrializado podecompreender adicionalmente segundo (ou terceiro) recipiente quecompreende tampão farmaceuticamente aceitável, tal como águabacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato,solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode ainda incluir outrosmateriais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, que incluemoutros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
A seguir encontram-se exemplos dos métodos e composições deacordo com a presente invenção. Compreende-se que várias outrasrealizações podem ser praticadas, dado o relatório descritivo geral fornecidoacima.
Exemplos
Exemplo 1
Geração de Anticorpos anti-Efrina B2
É conhecida uma série de métodos na técnica para gerarbibliotecas de exibição de fagos a partir dos quais pode ser obtidoanticorpo de interesse. Bibliotecas de anticorpos de fagos sintéticos foram- elaboradas em estrutura única (anticorpo anti-ErbB2 humanizado, 4D5) pormeio da introdução de diversidade nas regiões de determinação decomplementaridade (CDRs) de cadeias leves e pesadas (Lee, C. V. et al, J.Moi Biol. 340, 1073-93 (2004); Liang, W. C. et al, J. Biol. Chem. 281, 951-61 (2006)). A mistura de placas com bibliotecas nativas foi realizada contraEfrina B2 humana marcada com His imobilizada sobre imunoplacasmaxisorp. Após quatro rodadas de enriquecimento, clones foram retiradosaleatoriamente e aglutinantes específicos foram identificados utilizandoELISA de fago. Os clones de união de hEfrina B2 resultantes foramadicionalmente selecionados com proteína Efrina B2 murina marcada comHis para identificar clones de espécies cruzadas. O clone 19 apresentoudesempenho favorável nestes testes e foi selecionado para caracterizaçãoadicional. Para cada clone de fago positivo, regiões variáveis de cadeiasleve e pesada foram subclonadas em vetores de expressão de pRK queforam elaborados para expressar cadeias de IgG de comprimento total.Construções de cadeia leve e de cadeia pesada foram cotransfectadas emcélulas 293 ou de CHO e os anticorpos expressos foram purificados a partirde meio livre de soro utilizando coluna de afinidade de proteína A.Anticorpos purificados foram testados por meio de ELISA para determinar obloqueio da interação entre Efrina B2 e receptores de EphB e por meio deFACS para determinar a união a linhagens de células estáveis queexpressam Efrina B2 humana ou Efrina B2 murina com comprimento total.Para amadurecimento por afinidade, bibliotecas de fagos com trêscombinações diferentes de circuitos de CDR (CDR-L3, H1 e H2) derivadasdo clone de interesse inicial foram construídas por meio de estratégia dealeatorização mole, de forma que cada posição selecionada sofressemutação para resíduo de tipo não selvagem ou fosse mantida na forma detipo selvagem em freqüência de cerca de 50:50 (Liang et al, 2006, acima).Clones de alta afinidade foram identificados em seguida ao longo de quatrorodadas de combinação de fase de solução contra proteínas Efrina B2marcadas com His humanas e murinas com estringência progressivamentemaior. Clones selecionados foram analisados por meio de ELISA de fagose expressos em seguida na forma de proteína Fab e sua atividade édeterminada utilizando Biacore. As seqüências das regiões HVR do cloneparental 19 e clones amadurecidos por afinidade são exibidas na Figura 1.
Exemplo 2
Caracterização de Anticorpos anti-Efrina B2
Para determinar a afinidade de união de Mabs anti-Efrina B2de camundongo, utilizou-se medição de ressonância de plasma dasuperfície (SRP) com BlAcore® 3000 (BlAcore, Inc., Piscataway1 NJ).Resumidamente, lascas de biossensores de dextran carboximetilado (CM5,BlAcore Inc.) foram ativadas com cloridrato de A/-etil-A/'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e A/-hidroxissuccinimida (NHS) deacordo com as instruções do fornecedor. Anticorpo anti-Efrina B2 foi diluídocom 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, em 5 μg/ml antes da injeção emvelocidade de fluxo de 5 μΙ/minuto para atingir cerca de quinhentasunidades de resposta (RU) de anticorpo acoplado. Em seguida, injetou-se1 M de etanolamina para bloquear grupos não reagidos. Para mediçõescinéticas, diluições seriais em duas vezes de moléculas de Efrina B2-Hishumanas ou murinas (0,7 nM a 500 nM) foram injetadas em PBS com0,05% Tween 20 a 25 0C sob velocidade de fluxo de 25 μΙ/min. Taxas deassociação (kon) e taxas de dissociação (k0ff) foram calculadas utilizandomodelo de união Langmuir um a um simples (Software de AvaliaçãoBlAcore versão 3.2). A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) foicalculada como a razão k0ff/kon· Os resultados deste experimento sãoexibidos na Tabela 3. "NA" significa que a medição não foi realizada.Tabela 3
Afinidade de União ε Cinética de União de Anticorpos anti-Efrina B2 aEfrina B2 Humana ε de Camundongos
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Exemplo 3
Tratamento com Anticorpo anti-Efrina B2 Bloqueou a Sinalização deEphB4 em Teste com Base em Células
A fim de demonstrar a capacidade de anticorpos anti-Efrina B2 debloquear a interação de EphB4 e Efrina B2 unida por membrana, realizamosteste com base em células no qual EphB4 e Efrina B2 foram apresentados pordiferentes tipos celulares. Célula 3T3 que sobreexpressam Efrina B2 humanaforam utilizadas para estimular células HUVEC que expressam alto nível deEphB4 mas baixo nível de Efrina B2 e foi testada a capacidade de anticorpoanti-EphB4 de inibir a ativação de EphB4.
Células 3Τ3 que sobreexpressam Efrina B2 humana forampreparadas conforme segue: Efrina B2 de comprimento total humano foiclonada em vetor pcDNA5/FRT (Invitrogen) e utilizada em seguida para gerarlinhagem de células estáveis com células 3T3.Flp (Invitrogen) de acordo com omanual do fabricante.
Células 3T3 que sobreexpressam Efrina B2 humana foramsobrepostas sobre células HUVEC por quinze ou trinta minutos, na presençaou ausência de anticorpo anti-EphB4. A ativação do receptor de EphB4 foideterminada por meio de imunoprecipitação de proteína EphB4 e detecção em- seguida da presença ou ausência de fosforilação de tirosina receptora deEphB4 utilizando anticorpo anti-fosfotirosina (anticorpo 4G10; Upstate)utilizando manchas Western. Resumidamente, as células foram lisadas comtampão RIPA. Lisatos celulares foram clarificados por meio de centrifugação eanticorpo anti-EphB4 35.2D8 foi adicionado a 5 μg/amostra. Após incubação a4°C por duas horas, o imunocomplexo foi puxado para baixo utilizandoagarose de Proteína A. Fosforilação de EphB4 foi analisada por meio deWestern Blot utilizando anticorpo antifosfotirosina 4G10 (Upstate) sobconcentração de 1 μg/ml.
Os resultados deste experimento são exibidos na Figura 7. Asobreposição de células 3T3 sobre células HUVEC causou dramáticafosforilação de tirosina de EphB4 (linha 2). Incubação prévia por trinta minutosde HUVECs com anticorpo anti-EphB4 (clone 19.2D3 a 5 μg/ml) aboliuefetivamente a fosforilação de tirosina EphB4 induzida pela sobreposição decélulas 3T3 de Efrina B2 (linha 3). Por outro lado, células HUVEC não tratadasnão demonstraram ativação de EphB4 (linha 1) e células 3T3 de Efrina B2 nãotratadas não demonstraram ativação de EphB4 (linha 4). Estes resultadosestabeleceram que tratamento com anticorpo anti-Efrina B2 bloqueou ainteração entre Iigante Efrina B2 e receptor de EphB4 no contexto de contatodireto entre as células.
Exemplo 4
Tratamento com Anticorpo Anti-Efrina B2 Inibiu a Angiogênese no Teste deBolsa da Córnea de Ratos
A antiatividade de anticorpo anti-Efrina B2 monoclonal foi testadano teste de bolsa da córnea de ratos. Resumidamente, ratos Harlan Sprague-Dawley foram anestesiados utilizando isoflurano e baixa dosagem de anestesiainjetável. Os olhos sofreram suave proptoma e foram mantidos no lugarutilizando fórceps não traumático. Com lâmina número 15, foi realizada incisão- de 1,5 mm perto do centro da córnea. Utilizando microespátula, a incisão foicuidadosamente dissecada de forma obtusa através do estroma em direção aocanto externo do olho. Pelota revestida com hidron que contém fator decrescimento (200 ng de VEGF), metilcelulose e sucralfato de alumínio (100 μς)foi inserida na base da bolsa. O clone de anticorpo anti-Efrina B2 19.2D3 (10μ9/ρεΙοί3), se adicionado, foi incluído na pelota. Após a cirurgia, os olhos foramrevestidos com ungüento de gentamicina. No dia 6, os animais receberaminjeção de isotiocianato de fluoresceína-dextran com alto peso molecular esofreram eutanásia para permitir a visualização da vasculatura. Montagensinteiras da córnea foram feitas com os olhos enucleados e foram conduzidasmedições da área neovascular utilizando análise de imagens assistida porcomputador (Image-Pro Plus).
Os resultados deste experimento são exibidos na Figura 8.Tratamento com anticorpo anti-Efrina B2 reduziu significativamente aneovascularização induzida por VEGF, o que demonstra que o anticorpo anti-efrina B2 apresentou atividade antiangiogênica neste modelo. Tratamentocontrole (sem VEGF) exibiu neovascularização limitada, enquanto o controlepositivo tratado com VEGF exibiu neovascularização significativa.
Exemplo 5
Tratamento com Anticorpo Anti-Efrina B2 Inibiu a Angiogênese em Teste deCâmara Dorsal em Camundongos
A atividade antiangiogênica de anticorpo anti-Efrina B2monoclonal foi testada no teste de câmara dorsal de camundongos. Oprocedimento e o método utilizados no teste de câmara de janela dorsal foramrealizados essencialmente conforme descrito em Papernfuss, D., Microvascs.Res., 18: 311-318, 1979 e Shan, S., Clinicai Câncer Research, 7: 2590-2596,2001. Resumidamente, a linha intermediária anatômica foi marcada ao longodas costas e clipe C foi suturado na posição com suturas de seda 4-0. Modelo- equivalente ao diâmetro externo do colar de câmara foi utilizado commarcador esterilizado para traçar círculo em volta da incisão. Corte circularfoi realizado traçando o perímetro da linha externa seguida por bisturi derisco com esforço para seguir a hipoderme superior à aponeurose. A área foiaparada em seguida e sofreu manicure com um par de fórceps finos etesoura de íris. Todas exceto duas das camadas de aponevroses foramremovidas de um lado da dobra da pele: estas camads mantiveram avasculatura intacta. O clipe C foi removido em seguida. Câmara com quadrode janela no centro foi inserida na dobra de pele e fixada no lugar comsuturas de seda 4-0. As células de tumores foram injetadas na aponeVrosena janela. A janela foi vedada com tampa de cobertura de vidro. Camadafina de tratamento com antibiótico neosporina foi espalhada sobre a linha desutura e feridas de incisão para evitar infecções. O animal foi observado sobestereomicroscópio de dissecação para confirmar a circulação no interior dacâmara. Permitiu-se a recuperação dos animais sobre cobertor deaquecimento em circulação até que se recuperassem completamente daanestesia e, por fim, retornassem ao seu quarto nas suas caixasmicroisolantes. Anticorpos (anticorpo anti-Efrina B2 clone 19.2D3 e anticorpoanti-VEGF de camundongo G6) receberam duas doses a 10 mg/kg, umadose administrada por via intravenosa no momento das injeções celulares ea segunda dose administrada por meio de injeção direta na câmara no dia 3.A área de tumor e a vasculatura do tumor foram calculadas utilizando ImagePro.
Anticorpo anti-Efrina B2 reduziu significativamente aneovascularização, o que demonstra que a anti-Efrina B2 possui atividadeantiangiogênica neste modelo. Tratamento com o anticorpo anti-VEGF decamundongo controle positivo exibiu neovascularização significativamentereduzida, conforme esperado. Por outro lado, o controle não tratado exibiu extensa- neovascularização.
Exemplo 6
Tratamento com Anticorpo anti-Efrina B2 Inibiu Crescimento de Tumor inVivo
Para determinar a capacidade de anticorpos anti-Efrina B2 deinibir o crescimento de tumores in vivo, anticorpos anti-Efrina B2 foram testadosem modelo de xenógrafo de tumores conforme segue. Resumidamente,camundongos brutos bege (Charles River Laboratories, Hollister CA) forammantidos de acordo com o guia de cuidado e uso de animais de laboratório.Células de rabdomiossarcoma humano A673 foram suspensas em meio livrede soro e misturadas com volume igual de matrigel. Para estabelecerxenoenxertos de tumores subcutâneos, 5 χ 106 células foram injetadas noflanco direito de fêmeas de camundongos com seis a oito semanas de idade.Vinte e quatro horas após a inoculação celular, animais receberam dosagem de0,2 ml de anticorpo por via intraperitoneal em dosagem de 10 mg/kg de pesodo corpo duas vezes por semana. O crescimento do tumor foi quantificado pormeio de medições de calibre. O volume de tumor (mm3) foi determinadomedindo-se o comprimento (I) e a largura (w) e calculando-se o volume (V =lw2/2). Dez animais em cada grupo receberam PBS, 10 mg/kg de peso docorpo de clone 19.2D3 de anticorpo anti-Efrina B2 ou 10 mg/kg de peso docorpo de anti-VEGF de camundongo (B6) duas vezes por semana (indicadocom setas na Figura 9).
Os resultados deste experimento são exibidos na Figura 9.Tratamento com anticorpo anti-Efrina B2 reduziu o volume médio do tumor, oque demonstra que tratamento com anticorpo anti-Efrina B2 inibiu ocrescimento de tumores in vivo. São apresentados volumes médios de tumorcom desvios padrão.
Embora a presente invenção tenha sido descrita em algunsdetalhes como forma de ilustração e exemplo para fins de clareza decompreensão, as descrições e os exemplos não deverão ser interpretadoscomo limitadores do escopo da presente invenção.Listagem de seqüência
<110> Minhong Yan e Yan Wu
<120> ANTICORPOS ANTI-EPHRINB2 E MÉTODOS QUE OS UTILIZAM
<1B0> P2299R1
<150> US 60/760,891<151> 20-01-2006
<160> 53
<210> 1<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-Hl<400> 1
Gly Phe Thr Ile Thr Gly Ser Trp Ile His
5 10
<210> 2<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-Hl<400> 2
Gly Phe Thr Val Ser Ser Gly Trp Ile His
5 10
<210> 3<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-H2<400> 3
Ala Val Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 4<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-H2<400> 4
Ala Val Ile Phe His Asn Lys Gly Gly Thr Asp Tyr Ala Asp Ser1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 5<211> 14<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-H3<400> 5
Ala Arg Thr Ser Ala Trp Ala Gln Leu Gly Ala Met Asp Tyr
5 10
<210> 6<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-Ll<400> 6
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
5 10
<210> 7<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-Ll<400> 7
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asp Ser Ser Leu Ala
5 10
<210> 8<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-L2<400> 8
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
5<210> 9<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-L2<400> 9
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
<210> 10<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-L3<400> 10
Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
<210> 11<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-L3<400> 11
Gln Gln Ser Asp Asp Asn Pro Phe Thr
<210> 12<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-L3<400> 12
Glu Gln Thr Asp Ser Thr Pro Pro Thr
<210> 13<211> 107<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Dominio variável da cadeia leve do huMab4D5-8
<400> 13Asp Ile Cln Met Thr Cln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Cln Asp Val Asn
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Cly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Cln Gln
80 85 90
His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Cly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys
<210> 14<211> 107<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 14
Asp Ile Cln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Cly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys<210> 15<211> 23<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Cln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1 5 10 15
Cly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys20
<210> 16<211> 15<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 16
Trp Tyr Cln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr15 10 15
<210> 17<211> 32<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada
<400> 17Gly Val Pro Ser1
Thr Leu Thr Ile
Tyr Cys
<210> 18<211> 10<212> PRT<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 18
Phe Cly Cln Gly Thr Lys Val Clu Ile Lys
5 10
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe
5 10 15
Ser Ser Leu Cln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
20 25 30<210> 19<211> 87<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 19
Cln Val Gln Leu Val Cln Ser Cly Ala Clu Val Lys Lys Pro Cly1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30
Trp Val Arg Gln Ala Pro Cly Cln Cly Leu Glu Trp Met Gly Arg35 40 45
Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu50 55 60
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala65 70 75
Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser80 85
<210> 20<211> 81<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Clu Val Lys Lys Pro Cly15 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Cln Ala20 25 30
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp35 40 45
Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr65 70 75
Leu Val Thr Val Ser Ser80
<210> 21<211> 80<212> PRT<213> Seqüência artificial<220>
<223>Sequência é sintetizada<400> 21
Gln Val Cln Leu Val Cln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala20 25 30
Pro Cly Gln Cly Leu Clu Trp Met Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp35 40 45
Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu65 70 75
Val Thr Val Ser Ser80
<210> 22<211> 79<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly15 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala20 25 30
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp35 40 45
Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Cly Gln Gly Thr Leu Val65 70 75
Thr Val Ser Ser
<210> 23<211> 87<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220><223> Seqüência é sintetizada<400> 23Gln Val Gln1
Gln Thr Leu
Trp Ile Arg
Val Thr Ile
Leu Ser Ser
Arg Trp Gly
<210> 24<211> 81<212> PRT<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser1 5 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Arg Val Thr Ile Ser Val Asp35 40 45
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala50 55 60
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr65 70 75
Leu Val Thr Val Ser Ser80
<210> 25<211> 80<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 2 5
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser5 10 15
Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser20 25 30
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg35 40 45
Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys50 55 60
Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala65 70 75
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser80 851 5 10 15
Cln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Arg Val Thr Ile Ser Val Asp35 40 45
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala50 55 60
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu65 70 75
Val Thr Val Ser Ser80
<210> 26<211> 79<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 26
Cln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Cly Leu Val Lys Pro Ser15 10 15
Cln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Cln Pro20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Arg Val Thr Ile Ser Val Asp35 40 45
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala50 55 60
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val65 70 75
Thr Val Ser Ser
<210> 27<211> 87<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 27
Clu Val Gln Leu Val Glu Ser Cly Cly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Cly Phe Thr Phe Ser20 25 30Trp Val Arg Gln Ala Pro Cly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg35 40 45
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln50 55 60
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala65 70 75
Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser80 85
<210> 28<211> 81<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp35 40 45
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr65 70 75
Leu Val Thr Val Ser Ser80
<210> 29<211> 80<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp35 40 45Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu65 70 75
Val Thr Val Ser Ser80
<210> 30<211> 79<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp35 40 45
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val65 70 75
Thr Val Ser Ser
<210> 31<211> 87<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys20 25 30
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg35 40 45
Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln50 55 60Met Asn Ser Leu Arg Ala Clu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser65 70 75
Arg Trp Cly Cln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser80 85
<210> 32<211> 81<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 32
Clu Val Cln Leu Val Glu Ser Cly Cly Cly Leu Val Cln Pro Gly15 10 15
Cly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala20 25 30
Pro Cly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp35 40 45
Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Cln Met Asn Ser Leu Arg Ala50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gln Gly Thr65 70 75
Leu Val Thr Val Ser Ser80
<210> 33<211> 80<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Cly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala20 25 30
Pro Cly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp35 40 45
Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gl η Met Asn Ser Leu Arg Ala50 55 60
Clu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Trp Cly Gln Gly Thr Leu65 70 75Val Thr Val Ser Ser80
<210> 34<211> 87<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 34
Glu Val Cln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys20 25 30
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg35 40 45
Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln50 55 60
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala65 70 75
Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser80 85
<210> 35<211> 81<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp35 40 45
Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr65 70 75
Leu Val Thr Val Ser Ser80<210> 36<211> 80<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp35 40 45
Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu65 70 75
Val Thr Val Ser Ser80
<210> 37<211> 79<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp35 40 45
Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val65 70 75
Thr Val Ser Ser
<210> 38<211> 80<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly20 25 30
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu50 55 60
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr65 70 75
Lys Val Glu Ile Lys80
<210> 39<211> 80<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 39
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro15 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly20 25 30
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val50 55 60
Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr65 70 75
Lys Val Glu Ile Lys80
<210> 40<211> 80<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 40
Glu Ile Val Leu Thr Cln Ser Pro Cly Thr Leu Ser Leu Ser Pro1 5 10 15
Cly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Trp Tyr Cln Cln Lys Pro Gly20 25 30
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser35 40 45
Cly Ser Gly Ser Cly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu50 55 60
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr65 70 75
Lys Val Glu Ile Lys80
<210> 41<211> 80<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<22B> Seqüência é sintetizada<400> 41
Asp Ile Val Met Thr Cln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu15 10 15
Gly Clu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Trp Tyr Cln Gln Lys Pro Gly20 25 30
Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser35 40 45
Cly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu50 55 60
Cln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr65 70 75
Lys Val Glu Ile Lys80
<210> 42<211> 25<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 42
Clu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser20 25
<210> 43<211> 13<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 43
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
5 10
<210> 44<211> 30<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 44
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu15 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30
<210> 45<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 45
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 46<211> 32<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 46
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe15 10 15Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr20 25 30
Tyr Cys
<210> 47<211> 30<212> PRT<213> Seqüência artificial
<220><223> Seqüência é sintetizada
<400> 47Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu15 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys20 25 30
<210> 48<211> 108<212> PRT<213> Seqüência artificial
<220><223> Seqüência é sintetizada
<400> 48Asp Ile Gln Met1
Gly Asp Arg Val
Thr Ala Val Ala
Leu Leu Ile Tyr
Arg Phe Ser Gly
Ser Ser Leu Gln
Ser Tyr Thr Thr
Ile Lys Arg
<210> 49
<211> 118<212> PRT<213> Seqüência artificial
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val5 10 15
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys35 40 45
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln80 85 90
Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu95 100 105<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr
20 25 30
Gly Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ala Val Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Ala Thr Asp Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Ser Ala Trp Ala Gln Leu
95 100 105
Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
110 115
<210> 50<211> 108<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asp
20 25 30
Ser Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Ser Asp Asp Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys Arg<210> 51<211> 118<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 51
Glu Val Cln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr20 25 30
Gly Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45
Glu Trp Val Ala Val Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Ala Thr Asp Tyr50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Cly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser65 70 75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Cln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Ser Ala Trp Ala Gln Leu95 100 105
Cly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr110 115
<210> 52<211> 108<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Cln Asp Val Ser20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Glu Gln
80 85 90
Thr Asp Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys Arg
<210> 53<211> 118<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser
20 25 30
Ser Gly Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ala Val Ile Phe His Asn Lys Gly Gly Thr Asp Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Ser Ala Trp Ala Gln Leu
95 100 105
Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
110 115

Claims (48)

1. ANTICORPO ANTI-EFRINA B2 ISOLADO, quecompreende:(a) pelo menos uma, duas, três, quatro ou cinco seqüências deregiões hipervariáveis (HVR) selecionadas a partir do grupo que consiste de:(i) HVR-L1 que compreende seqüência A1-A11, em que A1-A11 é RASQDVSTAVA (SEQ ID N0 6);(ii) HVR-L2 que compreende seqüência B1-B7, em que B1-B7é SASFLYS (SEQ ID N0 8);(iii) HVR-L3 que compreende seqüência C1-C9, em que C1-C9é EQTDSTPPT (SEQ ID N0 12);(iv) HVR-H1 que compreende seqüência D1-D10, em que D1-D10 é GFTVSSGWIH (SEQ ID N0 2);(v) HVR-H2 que compreende seqüência E1-E18, em que E1-E18 é AVIFHNKGGTDYADSVKG (SEQ ID N0 4); e(vi) HVR-H3 que compreende seqüência F1-F14, em que F1-F14 é ARTSAWAQLGAMDY (SEQ ID N0 5); e(b) pelo menos uma variante HVR, em que a seqüênciavariante de HVR compreende modificação de pelo menos um resíduo daseqüência ilustrada em SEQ ID N0 1 a 12.
2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, em quevariante de HVR-L1 compreende de uma a quatro (uma, duas, três ou quatro)substituições em qualquer combinação das posições a seguir: A7 (S ou D); A8(T ou S); A9 (A ou S); e A10 (V ou L).
3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, em queariante de HVR-L2 compreende de uma a três (uma, duas ou três)substituições em qualquer combinação das posições a seguir: B1 (S ou A); B4(F ou N); e B6 (Y ou E).
4. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, em quevariante de HVR-L3 compreende de uma a seis (uma, duas, três, quatro, cincoou seis) substituições em qualquer combinação das posições a seguir: C1 (Qou E); C3 (S ou T); C4 (Y ou D); C5 (T, D ou S); C6 (T ou N); e C8 (P ou F).
5. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, em quevariante de HVR-H1 compreende de uma a quatro (uma, duas, três ou quatro)substituições em qualquer combinação das posições a seguir: D4 (I ou V); D5(T ou S); D6 (G ou S); e D7 (S ou G).
6. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, em quevariante de HVR-H2 compreende de uma a quatro (uma, duas, três ou quatro)substituições em qualquer combinação das posições a seguir: E4 (Y ou F); E5(P ou H); E7 (N ou K); e E9 (A ou G).
7. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, em quevariante de HVR-H3 compreende de uma a quatorze substituições nasposições a seguir: F1 (A); F2 (R); F3 (T); F4 (S); F5 (A); F6 (W); F7 (A); F8 (Q);F9 (L); F10 (G); F11 (A); F12 (M); F13 (D) e F14 (Y).
8. ANTICORPO ANTI-EFRINA B2 ISOLADO, quecompreende uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs, em que cada HVRcompreende, consiste ou consiste essencialmente de seqüência selecionada apartir do grupo que consiste de SEQ ID N0 1 a 12, em que SEQ ID N0 6 ou 7corresponde a HVR-L1, SEQ ID N0 8 ou 9 corresponde a HVR-L2, SEQ ID N0-10, 11 ou 12 corresponde a HVR-L3, SEQ ID N0 1 ou 2 corresponde a HVR-H1,SEQ ID N0 3 ou 4 corresponde a HVR-H2 e SEQ ID N0 5 corresponde a HVR-H3.
9. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, em que oanticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada um, nesta ordem, compreende SEQ ID N0 6, 8, 10, 1, 3, 5.
10. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, em que oanticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada um, nesta ordem, compreende SEQ ID N0 7, 9, 11, 1,3, 5.
11. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, em que oanticorpo compreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada um, nesta ordem, compreende SEQ ID N0 6, 8, 12, 2, 4, 5.
12. ANTICORPO, de acordo com qualquer das reivindicações-1 a 11, em que pelo menos uma parte da seqüência de estrutura é seqüênciade estrutura de consenso humano.
13. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, em que amodificação é substituição, inserção ou exclusão.
14. ANTICORPO, de acordo com qualquer das reivindicações-1 a 13, em que o anticorpo compreende seqüência de estrutura de consensode subgrupo κ humano.
15. ANTICORPO, de acordo com qualquer das reivindicações-1 a 13, em que o anticorpo compreende seqüência de estrutura de consensode subgrupo Ill humano de cadeia pesada.
16. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 15, em que oanticorpo compreende substituição em uma ou mais das posições 73, 73 ou 78.
17. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 16, em que asubstituição é uma ou mais dentre R71A, N73T ou N78A.
18. POLINUCLEOTÍDEO, que codifica anticorpo de acordocom qualquer das reivindicações 1 a 17.
19. VETOR, que compreende o polinucleotídeo de acordo coma reivindicação 18.
20. VETOR, de acordo com a reivindicação 19, em que o vetoré vetor de expressão.
21. CÉLULA HOSPEDEIRA, que compreende vetor de acordocom qualquer das reivindicações 19 ou 20.
22. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 21,em que a célula hospedeira é procariótica.
23. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 21,em que a célula hospedeira é eucariótica.
24. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 23,em que a célula hospedeira é de mamífero.
25. MÉTODO DE ELABORAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-EFRINA B2, em que o mencionado método compreende (a) expressão de vetorde acordo com a reivindicação 20 em célula hospedeira apropriada; e (b)recuperação do anticorpo.
26. MÉTODO DE ELABORAÇÃO DE IMUNOCONJUGADOANTI-EFRINA B2, em que o mencionado método compreende (a) expressãode vetor de acordo com a reivindicação 20 em célula hospedeira apropriada; e(b) recuperação do anticorpo.
27. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 25ou 26, em que a célula hospedeira é procariótica.
28. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 25ou 26, em que a célula hospedeira é eucariótica.
29. MÉTODO DE DETECÇÃO DE EFRINA B2, em que ométodo compreende a detecção de complexo de Efrina B2 e anticorpo anti-Efrina B2 em amostra biológica.
30. MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE DISFUNÇÃO, associadaà expressão de Efrina B2, em que o método compreende a detecção decomplexo de anticorpo anti-Efrina B2 e Efrina B2 em amostra biológica depaciente que possui ou é suspeito de possuir a disfunção.
31. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 29ou 30, em que o anticorpo anti-Efrina B2 é marcado de forma detectável.
32. COMPOSIÇÃO, que compreende anticorpo anti-efrina B2,de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 17.
33. COMPOSIÇÃO, que compreende polinucleotídeo de acordocom qualquer das reivindicações 18 a 20.
34. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer dasreivindicações 32 ou 33, em que a composição compreende adicionalmenteveículo.
35. MÉTODO DE INIBIÇÃO DA ANGIOGÊNESE, quecompreende a administração de anticorpo anti-Efrina B2 de acordo comqualquer das reivindicações 1 a 17 a paciente necessitado desse tratamento.
36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 35, quecompreende adicionalmente a administração ao paciente de quantidade eficazde agente antiangiogênico.
37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36, em que oagente antiangiogênico é administrado antes ou depois da administração doanticorpo anti-Efrina B2.
38. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36, em que oagente antiangiogênico é administrado simultaneamente com o antagonista deanti-Efrina B2.
39. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 36 a 38, em que o agente antiangiogênico é antagonista de fator de crescimentocelular endotelial vascular (VEGF).
40. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 39, em que oantagonista de VEGF é anticorpo anti-VEGF.
41. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, em que oanticorpo anti-VEGF é bevacizumab.
42. MÉTODO, conforme qualquer das reivindicações 35 a 41,que compreende adicionalmente a administração de quantidade eficaz deagente quimioterapêutico.
43. USO DE ANTICORPO ANTI-EFRINA B2, de acordo comqualquer das reivindicações 1 a 17 na preparação de medicamento para otratamento terapêutico e/ou profilático de disfunção.
44. USO, de acordo com a reivindicação 43, em que adisfunção é câncer, tumor e/ou disfunção proliferativa celular.
45. USO, de acordo com a reivindicação 43, em que adisfunção é neuropatia ou doença neurodegenerativa.
46. USO, de acordo com a reivindicação 43, em que adisfunção é condição patológica associada a angiogênese.
47. USO, de acordo com a reivindicação 46, em que acondição patológica associada à angiogênese é tumor, câncer e/ou disfunçãoproliferativa celular.
48. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 46, em que acondição patológica associada à angiogênese é doença neovascularintraocular.
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