BRPI0706947A2

BRPI0706947A2 - método de obtenção de uma composição à base de proteìna, composição e artigo de manufatura

Info

Publication number: BRPI0706947A2
Application number: BRPI0706947-2A
Authority: BR
Inventors: Michael P Malakhov; Fang Fang
Original assignee: Nexbio Inc
Priority date: 2006-01-24
Filing date: 2007-01-24
Publication date: 2011-04-12
Also published as: AU2007233349A1; CA2639925C; KR20170091184A; CA2932997A1; JP2013064010A; WO2007114881A1; KR101787939B1; BRPI0706947B1; KR102109867B1; BRPI0706947B8; IL193001A0; US20180071219A1; KR101501780B1; US20200197310A1; KR102180849B1; EP1981483A1; US20070190163A1; BRPI0706947A8; US20120116062A1; CA2932997C

Abstract

MéTODO DE OBTENçAO DE UMA COMPOSIçAO A BASE DE PROTEìNA, COMPOSIçAO E ARTIGO DE MANUFATURA As microesteras SãO produzidas ao entrar em contato com uma solução aquosa de uma proteína ou de outra macromolécula com um solvente orgânico e um contraion e resfriar a solução. As microesferas são úteis para preparar produtos farmacêuticos de dimensões definidas.

Description

MÉTODO DE OBTENÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO À BASEyDEPROTEÍNA, COMPOSIÇÃO E ARTIGO DE MANUFATURAPEDIDOS CORRELATOS

O benefício da prioridade é reivindicado peloPedido de Patente Provisório Norte-americano N°. 60/762.002,depositado em 24 de janeiro de 2006, intitulado "Technologyfor Preparation of Macromolecular Microspheres". Ondepermitido, este pedido é incorporado a título de referênciaem sua totalidade.

O presente pedido também é relacionado ao Pedido dePatente Norte-americano N0 de Série 11/657.812 (Documento doProcurador N°. 21865-004001/6504, depositado em 24 de janeirode 2007). Este pedido também é relacionado às PublicaçõesNorte-americanas N°. US20050004020 Al e US20050112751 Al.

Onde permitido, cada um destes pedidos é incorporado a títulode referência em sua totalidade.

FUNDAMENTOS

A administração de proteínas a animais, incluindoseres humanos, em suplementos nutritivos ou como terapêuticajá é conhecida há algum tempo. As proteínas para aadministração terapêutica ou nutritiva estão geralmentedisporiíveis como (1) concentrados ou pós que sãoadministrados diretamente ou são reconstituídos em um líquidode escolha antes da utilização; ou como (2) formulaçõeslíquidas.

A preparação e a aplicação de proteínasterapêuticas de interesse na forma de pó ou de partículas sãouma área de atividade de pesquisa e de desenvolvimentoconcentrada na indústria farmacêutica. Para a eficáciaterapêutica, é desejável ter uma formulação uniforme. Porexemplo, para a administração pulmonar, a proteína épreparada idealmente na forma de microesferas distintas, quesão partículas sólidas ou semi-sólidas que têm um diâmetroentre 0,5 e 5,0 micra. Também é desejável que as partículastenham um teor de proteína que seja tão elevado quantopossível e que mantenham sua atividade para a aplicaçãoconcentrada e a eficácia terapêutica.

Os métodos precedentes de produção de micropartículas ounanopartículas de proteína têm envolvido etapas complexas,tais como a mistura com polímeros orgânicos e/ou a formaçãode um arranjo de treliça com os polímeros; secagem poraspersão, secagem por aspersão congelada ou técnicasantissolventes fluidas supercríticas que utilizamequipamentos especializados e complexos; ou a liofilizaçãoseguida por aspersão ou moagem, que resulta freqüentemente empartículas não-uniformes que devem ser adicionalmenteclassificadas. Freqüentemente, os métodos precedentes deprodução de formulações de proteína sólidas envolvem asetapas de processamento, tais como o aquecimento, quedesnatura a proteína e compromete sua atividade. Além disso,alguns métodos não fornecem a recuperação elevada da soluçãona formulação sólida.

Conseqüentemente, há a necessidade de um métodopara a produção de proteínas e de outras micropartículasmacromoleculares que não requer equipamentos especializadosou complexos e que produz micropartículas dimensionadas demodo uniforme para a aplicação. Ainda existe a necessidade deum método para a produção de micropartículas que contenhaconcentrações de proteínas ou de macromoléculas elevadasrelativamente a outros componentes, que sejam estáveis emantenham sua atividade por períodos de tempo longos quandoarmazenadas à temperatura ambiente e que não contêm umaquantidade significativa de proteína desnaturada. Há tambémuma necessidade para um método para a produção demicropartículas das proteínas e outras macromoléculas em quesubstancialmente tudo da proteína ou de macromoléculas nomaterial de partida são recuperados na formulação demicropartícula, com a perda mínima. Há também a necessidadede micropartícuias de proteínas ou de outras macromoléculasque contêm estas propriedades para a administração, porexemplo, como um suplemento terapêutico ou nutritivo.

DESCRIÇÃO RESUMIDA

São providos na presente invenção os métodos para aprodução de proteínas e de outras micropartículasmacromoleculares que não requerem equipamentos especializadosou complexos e que produzem micropartículas dimensionadas demodo uniforme para a aplicação; os métodos para a produção demicropartículas que contêm concentrações de proteínas ou demacromoléculas elevadas relativamente a outros componentes,que são estáveis e mantêm sua atividade por períodos de tempolongos quando armazenadas à temperatura ambiente e que nãocontenham uma quantidade significativa de proteínadesnaturada. Também são providos os métodos para a produçãode micropartículas de proteínas e de outras macromoléculasonde substancialmente toda a proteína ou macromolécula nomaterial de partida seja recuperada na formulação demicropartículas, com perda mínima. Também são providas asmicropartículas de proteínas e de outras macromoléculas quecontêm estas propriedades para a administração, por exemplo,como um suplemento terapêutico ou nutritivo.

Os métodos de elaboração de uma composição com baseem proteínas, as próprias composições com base em proteínas,combinações e artigos de manufatura providos abaixo sãocaracterizados por uma variedade de ingredientes componentes,etapas de preparação e parâmetros biofísicos, físicos,bioquímicos e químicos. Conforme ficará evidente a umelemento versado na técnica, as composições e os métodosprovidos na presente invenção incluem qualquer uma e todas aspermutações e combinações de ingredientes, etapas e/ou deparâmetros descritos abaixo.

São providos na presente invenção os métodos deelaboração de uma composição com base em proteínas. O métodoprovido na presente invenção pode ser utilizado na elaboraçãode composições de outras macromoléculas além das proteínas,incluindo o DNA, o RNA, o PNA, os lipídeos, osoligossacarídeos e as combinações destes.

Os métodos providos na presente invenção podemincluir as etapas de:

a) adição de um contraíon a uma solução que contéma proteína em um solvente aquoso;

b) adição de um solvente orgânico à solução; e

c) resfriamento gradual da solução a umatemperatura abaixo de aproximadamente 25°C, por meio de queuma composição que contém as micropartículas que compreendema proteína é formada, em que as etapas a) , b) e c) sãoexecutadas simultaneamente, seqüencialmente,intermitentemente ou em qualquer ordem.

Em uma realização, as etapas a) , b) e então c) sãoseqüencialmente executadas. Em uma outra realização, o métodode elaboração de uma composição com base em proteínas incluia execução das etapas a) e b) simultaneamente ouseqüencialmente em qualquer ordem, seguida pela etapa c).

As micropartículas resultantes podem ser obtidaspor precipitação, separação de fase ou:por formação coloidal.Em alguns aspectos, os métodos providos na presente invençãocompreendem adicionalmente a separação das micropartículas dasolução para remover os componentes à exceção dasmicropartículas. Esta etapa de separação pode ser executadadepois da etapa c) acima mencionada. A separação pode serefetuada, por exemplo, por sedimentação, filtração e/ousecagem por congelamento.

Os métodos providos na presente invenção incluem aadição de um solvente orgânico a um solvente aquoso quecontém a proteína. Em determinadas realizações, o solventeorgânico é miscível ou parcialmente miscível com o solventeaquoso. Em realizações adicionais dos métodos providos napresente invenção, o solvente orgânico é selecionado entre osálcoois alifáticos, álcoois aromáticos, clorofórmio, cloretode dimetila, álcoois de açúcar poliídricos, hidrocarbonetosaromáticos, aldeídos, cetonas, ésteres, éteres, dioxanos,alcanos, alquenos, dienos conjugados, diclorometano,acetonitrilo, acetato de etila, polióis, poliimidas,poliésteres, polialdeídos e misturas destes. Por exemplo,onde o solvente orgânico é um álcool alifático, o solventeorgânico pode ser isopropanol. A quantidade de solventeorgânico adicionada pode variar nos métodos providos napresente invenção. Por exemplo, a quantidade de solventeorgânico adicionada pode ser de aproximadamente 0,1% ou de0,1% a aproximadamente 50% ou a 50% em volume/volume. Emoutras realizações, a quantidade de solvente orgânicoadicionada é de aproximadamente 1% ou de 1% a aproximadamente30% ou a 30% em volume/volume, de aproximadamente 5% ou de 5%a aproximadamente 30% ou a 30% em volume/volume, deaproximadamente 10% ou de 10% a aproximadamente 30% ou a 30%em volume/volume ou de aproximadamente 15% ou de 15% aaproximadamente 20% ou de 20% em volume/volume.

0 contraíon utilizado nos métodos providos napresente invenção pode ser um composto aniônico, um compostocatiônico e/ou um composto dipolar. Por exemplo, quando ocontraíon é um composto aniônico, o contraíon pode serglicina, citrato de sódio, sulfato de sódio, sulfato dezinco, sulfato de magnésio, sulfato de potássio ou sulfato decálcio. A concentração de solvente orgânico adicionada àsolução pode variar nos métodos providos na presenteinvenção. Por exemplo, a concentração de contraíon adicionadaà solução pode ser de aproximadamente 0,1 mM ou de 0,1 mM aaproximadamente 100 mM ou de 100 mM. Em outras realizações, aconcentração de contraíon adicionada à solução é deaproximadamente 0,2 mM ou de 0,2 mM a aproximadamente 50 mMou de 50 mM, de aproximadamente 0,3 mM ou de 0,3 mM aaproximadamente 3 0 mM ou de 3 0 mM, de aproximadamente 0,5 mMou de 0,5 mM a aproximadamente 20 mM ou de 2 0 mM ou deaproximadamente 1 mM ou de 1 mM a aproximadamente 10 mM ou de10 mM. Em uma realização particular, a concentração decontraíon adicionada à solução é aproximadamente 5 mM ou 5 mM.

Em um aspecto dos métodos providos na presenteinvenção, o pH da solução que contém a proteína está em ouabaixo do pH da proteína. Em alguns aspectos, o pH da soluçãoé de aproximadamente 4,0 ou de 4,0 a aproximadamente 9,0 oude 9,0. Em outros aspectos, o pH da solução é deaproximadamente 4,5 ou de 4,5 a aproximadamente 8,0 ou de8,0, de aproximadamente 4,5 ou de 4,5 a aproximadamente 6,5ou de 6,5 ou de aproximadamente 4,5 ou de 4,5 aaproximadamente 5,5 ou de 5,5.

A proteína que é utilizada nos métodos providos napresente invenção para a elaboração de uma composição combase em proteínas pode ser selecionada entre as sialidases,proteínas de fusão de sialidase, proteases, inibidores deprotease, citocinas, insulina, hormônio humano docrescimento, calcitonina, DNase humano recombinante,interferons e hormônio paratireóide. Em uma realização, ondea proteína é um inibidor de protease, a proteína é o inibidorde protease humano 8 (PI8). Em uma outra realização, aproteína é uma proteína de fusão de sialidase. Em algunsaspectos onde a proteína é uma proteína de fusão desialidase, a proteína de fusão de sialidase contém um domíniocatalítico de uma sialidase e um domínio de ancoragem, em queo domínio catalítico de sialidase é a única porção desialidase na proteína de fusão de sialidase. A sialidase podeser, por exemplo, uma sialidase de Actinomyces viscosus, umasialidase de Clostridium perfringens, uma sialidase deArthrobacter ureafaciens, uma sialidase de Micromonosporaviridifaciens, uma sialidase Neu2 humana ou uma sialidaseNeu4 humana.

Em um aspecto, onde a sialidase é uma sialidase deActinomyces viscosus, a seqüência de aminoácido do domíniocatalítico contém a seqüência dos resíduos de aminoácido quecomeçam em qualquer um dos aminoácidos do aminoácido 270 aoaminoácido 290 e que terminam em qualquer um dos aminoácidosdo aminoácido 665 ao aminoácido 901 da seqüência deaminoácido determinada na SEQ ID N0.: 1. Por exemplo, em umarealização, a seqüência do domínio catalítico de sialidasecontém a seqüência dos resíduos de aminoácido determinados naSEQ ID N0 . : 2. Em uma outra realização, a seqüência dodomínio catalítico compreende a seqüência dos resíduos deaminoácido que começam no aminoácido 274 e que terminam noaminoácido 681 da seqüência de aminoácido determinada na SEQID N0 . : 1. Em uma realização diferente, a seqüência dodomínio catalítico compreende a seqüência dos resíduos deaminoácido que começam no aminoácido 274 e que terminam noaminoácido 66 6 da seqüência de aminoácido determinada na SEQID N0 . : 1. Em uma outra realização, a seqüência do domíniocatalítico compreende a seqüência de aminoácido que começa noaminoácido 290 e que terminam no aminoácido 681 da seqüênciade aminoácido determinada na SEQ ID N0.: 1.

Em um aspecto, onde a proteína que é utilizada nosmétodos providos na presente invenção para a elaboração deuma composição com base em proteínas é uma proteína de fusãode sialidase que contém um domínio de ancoragem, o domínio deancoragem é um domínio de ligação de glicosaminoglicano(GAG). Em ura aspecto adicional, o domínio de ligação de GAG éselecionado entre o domínio de ligação de GAG do fator deplaquetas humano 4, domínio de ligação de GAG de interleucinahumana 8, domínio de ligação de GAG de antitrombina humanaIII, domínio de ligação de GAG de apoproteína humana E,domínio de ligação de GAG da proteína migratória angio-associada humana e domínio de ligação de GAG de anfirregulinahumana. Em realizações particulares, a seqüência deaminoácido do domínio de ligação de GAG contém a seqüênciados resíduos de aminoácido determinados na SEQ ID N0.: 3, naSEQ ID N0.: 4, na SEQ ID N0.: 5, na SEQ ID N0.: 6, na SEQ IDN0.: 7 ou na SEQ ID N°.: 8.

Em alguns aspectos onde a proteína que é utilizadanos métodos providos na presente invenção para a elaboraçãode uma composição com base em proteínas é uma proteína defusão de sialidase, a seqüência de aminoácido da proteína defusão de sialidase contém a seqüência dos resíduos deaminoácido determinados na SEQ ID N° . : 9, a seqüência dosresíduos de aminoácido determinados na SEQ ID N° . : 10, aseqüência dos resíduos de aminoácido determinados na SEQ IDN°.: 11, a seqüência dos resíduos de aminoácido determinadosna SEQ ID N° . : 12, a seqüência dos resíduos de aminoácidodeterminados na SEQ ID N0,: 13, a seqüência dos resíduos deaminoácido determinados na SEQ ID N0 . : 14 ou a seqüência dosresíduos de aminoácido determinados na SEQ ID N0.: 17.

Em um aspecto, a quantidade de proteína nasmicropartícuias produzidas pelos métodos providos na presenteinvenção, relativamente à quantidade total de proteína nasolução da etapa a) é de aproximadamente 80% ou de 80% a maisdo que aproximadamente 99% ou de 99%. Em um outro aspecto, acomposição de micropartículas resultante produzida pelosmétodos providos na presente invenção pode adicionalmentecompreender agentes de revestimento resistentes a ácido,agentes de revestimento resistentes a protease, agentes derevestimento entéricos, agentes de avolumação, excipientes,ingredientes inativos, intensificadores de estabilidade,modificadores de sabor e/ou de odor ou agentes de mascaração,vitaminas, agentes terapêuticos, antioxidantes,imunomoduladores, modificadores do transporte detransmembrana, agentes antiformação de torta, quitosanas ouintensificadores da capacidade de fluxo.

A solução e/ou a composição resultante dos métodosprovidos na presente invenção podem, em um aspecto,compreender adicionalmente um agente ativo. Em algumasrealizações, o agente ativo é selecionado entreantidiabéticos, anticonvulsivantes, analgésicos,antiparkinsonianos, antiinflamatórios, antagonistas decálcio, anestésicos, antimicrobianos, antimaláricos,antiparasíticos, anti-hipertensivos, anti-histaminicos,antipiréticos, agonistas alfa-adrenérgicos, alfa-bloqueadores, biocidas, bactericidas, dilatadores brônquicos,drogas de obstrução beta-adrenérgicas, contraceptivos, drogascardiovasculares, inibidores do canal de cálcio,antidepressivos, agentes de diagnóstico, diuréticos,eletrólitos, enzimas, hipnóticos, hormônios, hipoglicêmicos,hiperglicêmicos, constritores musculares, relaxantesmusculares, neoplásticos, glicoproteinas, nucleoproteínas,lipoproteínas, oftálmicos, energizantes psíquicos, sedativos,esteróides, simpatomiméticos, parassimpatomiméticos,tranqüilizantes, drogas do trato urinário, vacinas, drogasvaginais, vitaminas, sais minerais, drogas antiinflamatóriasnão-esteroidais, enzimas de conversão de angiotensina,polinucleotídeos, polipeptídeos e polissacarídeos. Em umaoutra realização, o agente ativo é um suplemento nutritivo.

Os métodos providos na presente invenção envolvem aresfriamento gradual da solução a uma temperatura abaixo deaproximadamente 25°C. Em uma realização, a temperatura estáentre aproximadamente 4 °C a aproximadamente -45°C. Em umaoutra realização, a temperatura está entre aproximadamente2°C a aproximadamente -20°C. Em uma realização adicional, atemperatura está entre aproximadamente 2°C a aproximadamente-15°C. Em uma outra realização, a temperatura está entreaproximadamente 0°C ou de 0°C a aproximadamente -2°C ou de -2°C a aproximadamente -15°C ou de -15°C a aproximadamente -20°C ou de -20°C. A resfriamento gradual pode ser executadaem uma variedade de taxas. Por exemplo, a resfriamento podeser efetuada em uma taxa de aproximadamente 0,01°C/min ou de0,01°C/min a aproximadamente 20°C/min ou de 20°C/min. Emoutras realizações, a resfriamento gradual está em uma taxade aproximadamente 0,05°C/min ou de aproximadamente 0,1°C/mina aproximadamente ou de 10°C/min ou de aproximadamente15°C/min, de aproximadamente ou a 0,2°C/min a aproximadamenteou a 5oC/min ou de aproximadamente 0,5°C/min aaproximadamente ou a 2°C/min. Em uma realização particular, aresfriamento gradual é executada em uma taxa deaproximadamente ou em 1°C/min.

Em um aspecto, o tamanho das micropartícuiasproduzidas pelos métodos providos na presente invenção é deaproximadamente 0,001 μπι ou de 0,001 μιτι a aproximadamente 50μπι ou de 50 μπκ Em outras realizações, o tamanho dasmicropartículas é de aproximadamente 0,3 μιτι ou de 0,3 μπι aaproximadamente 30 μπι ou de 30 μπι, de aproximadamente 0,5 μπιou de 0,5 μιη a aproximadamente 10 μπι ou de 10 μπι, deaproximadamente 0,5 μπι ou de 0,5 μπι a aproximadamente 5,0 μπιou de 5,0 μιη, de aproximadamente 1,0 μπι ou de 1,0 μπι aaproximadamente 5,0 μιη ou de 5,0 μη ou de aproximadamente 1,0μπι a aproximadamente 2,0, 3,0, 4,0 ou 5,0 μπι.

Em alguns aspectos dos métodos providos na presenteinvenção, a composição com base em proteínas resultante temuma vida útil de aproximadamente uma semana a aproximadamenteum mês, de aproximadamente um mês a aproximadamente seismeses, de aproximadamente seis meses a aproximadamente umano, de aproximadamente um ano a aproximadamente dois anos oude aproximadamente dois anos a aproximadamente cinco anos auma temperatura de aproximadamente 55°C, 50°C, 45°C, 44°C,42°C, 4o°Cf 39°C, 38°C, 37°C ou abaixo de 54°C. Em um outroaspecto, o teor de umidade das microparticulas é ajustado demodo que pelo menos aproximadamente 90% da atividade daproteína fique retido após a armazenagem por aproximadamenteseis meses a aproximadamente um ano a uma temperatura deaproximadamente 25°C. Em um outro aspecto, o teor de umidadedas microparticulas é ajustado de modo que pelo menosaproximadamente 90% das microparticulas não fiquem agregadasapós a armazenagem por aproximadamente seis meses aaproximadamente um ano a uma temperatura de aproximadamente 25°C.

Em um determinado aspecto dos métodos providos napresente invenção, a proteína é uma proteína de fusão quecontém um domínio catalítico de sialidase e um domínio deancoragem, em que o domínio catalítico de sialidase é a únicaporção de sialidase na proteína de fusão, o solvente orgânicoé adicionado em uma quantidade de aproximadamente 5% ou de 5%a aproximadamente 2 0% ou de 20% em volume/volume, o contraíoné adicionado em uma quantidade de aproximadamente 1 mM ou de1 mM a aproximadamente 5 mM ou de 5 mM e o pH da solução éajustado de aproximadamente 4,5 ou de 4,5 a aproximadamente5,5 ou 5,5. Em uma realização deste aspecto, o domíniocatalítico de sialidase é de Actinomyces viscosus e o domíniode ancoragem é o domínio de ligação de GAG de anfirregulinahumana. Além disso, o pH é de aproximadamente 5,0 e/ou ocontraíon é selecionado entre glicina, citrato de sódio,sulfato de sódio, sulfato de zinco, sulfato de magnésio,sulfato de potássio ou sulfato de cálcio. Em uma outrarealização deste aspecto, o solvente orgânico é isopropanol.

Em uma realização deste aspecto, a composição resultantecontém as micropartículas que contêm a proteína como o únicoingrediente ativo (isto é, consiste essencialmente em) . Emuma outra realização, o método inclui a separação dasmicropartículas da solução para remover os componentes àexceção das micropartículas, como por sedimentação, filtraçãoe/ou secagem por congelamento. Em algumas realizações desteaspecto, o teor de umidade das micropartículas é deaproximadamente 6% a aproximadamente 12% ou deaproximadamente 7% a aproximadamente 10,5%.

São providas na presente invenção as composiçõesque contêm micropartículas de uma sialidase ou de umaproteína de fusão de sialidase. Onde a proteína é umaproteína de fusão de sialidase, a proteína de fusão desialidase pode compreender um domínio catalítico de umasialidase e um domínio de ancoragem. Em alguns aspectos, asialidase na composição é uma sialidase de Actinomycesviscosus, uma sialidase de Clostridium perfringens, umasialidase de Arthrobacter ureafaciens, uma sialidase deMicromonospora viridifaciens, uma sialidase Neu2 humana ouuma sialidase Neu4 humana.

Em um aspecto, onde a sialidase da composição é umasialidase de Actinomyces viscosus, a seqüência de aminoácidodo domínio catalítico compreende a seqüência de aminoácidoque começa em qualquer um dos resíduos de aminoácido doaminoácido 270 ao aminoácido 290 e que termina em qualquer umdos resíduos de aminoácido do aminoácido 665 ao aminoácido901 da seqüência de aminoácido determinada na SEQ ID N0.: 1.

Por exemplo, a seqüência do domínio catalítico podecompreender a seqüência de aminoácido que começa noaminoácido 274 e que termina no aminoácido 681 da seqüênciade aminoácido determinada na SEQ ID N0.: 1, a seqüência deaminoácido que começa no aminoácido 290 e que termina noaminoácido 666 da seqüência de aminoácido determinada na SEQID N0 . : 1 ou da seqüência de aminoácido que começa noaminoácido 290 e que termina no aminoácido 681 da seqüênciade aminoácido determinada na SEQ ID N0 . : 1. Em uma outrarealização, a seqüência do domínio catalítico de sialidasecompreende a seqüência de aminoácido determinada na SEQ IDN0 . : 2.

Em um aspecto, onde a composição compreendemicropartícuias de uma proteína de fusão de sialidase, odomínio de ancoragem da proteína de fusão de sialidase é umdomínio de ligação de glicosaminoglicano (GAG). Em um aspectoadicional, o domínio de ligação de GAG é selecionado entre odomínio de ligação de GAG do fator de plaquetas humano 4,domínio de ligação de GAG de interleucina humana 8, domíniode ligação de GAG de antitrombina humana III, domínio deligação de GAG de apoproteína humano E, domínio de ligação deGAG da proteína migratória angio-associada humana e domíniode ligação de GAG de anfirregulina humana. Em realizaçõesparticulares, a seqüência de aminoácido do domínio de ligaçãode GAG contém a seqüência dos resíduos de aminoácidodeterminados na SEQ ID N0 . : 3, na SEQ ID N0.: 4, na SEQ IDN0.: 5, na SEQ ID N°.: 6, na SEQ ID N0.: 7 ou na SEQ ID N0.: 8.

As proteínas de fusão de sialidase das composiçõesprovidas na presente invenção podem conter, por exemplo, aseqüência dos resíduos de aminoácido determinados na SEQ IDN0.: 9, na SEQ ID N0.: 10, na SEQ ID N0.: 11, na SEQ ID N0.:12, na SEQ ID N0 . : 13, na SEQ ID N0.: 14 ou na SEQ ID N0.: 17.

A quantidade de proteína nas micropartículas dascomposições providas na presente invenção pode variar. Porexemplo, a quantidade de proteína nas micropartículas podeser de aproximadamente 60% a mais do que aproximadamente 99%em peso/peso. Em uma realização, a quantidade de proteína nasmicropartículas é de aproximadamente 65% a aproximadamente90% em peso/peso. Em uma outra realização, a quantidade deproteína nas micropartículas é de aproximadamente 70% aaproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90% em peso/peso.A quantidade de proteína nas micropartículas das composiçõesprovidas na presente invenção também pode ser deaproximadamente 90% a aproximadamente 99% em peso/peso.

As micropartículas nas composições providas napresente invenção podem conter adicionalmente agentes derevestimento resistentes a ácido, agentes de revestimentoresistentes a protease, agentes de revestimento entéricos,agentes de avolumação, excipientes, ingredientes inativos,intensificadores de estabilidade, modificadores de sabor e/oude odor ou agentes de mascaração, vitaminas, agentesterapêuticos, antioxidantes, imunomoduladores, modificadoresdo transporte de transmembrana, agentes antiformação detorta, quitosanas ou intensificadores da capacidade de fluxo.

Em um aspecto, as composições providas na presenteinvenção podem conter adicionalmente um agente ativo. Oagente ativo pode ser um suplemento nutritivo,antidiabéticos, anticonvulsivantes, analgésicos,antiparkinsonianos, antiinflamatórios, antagonistas decálcio, anestésicos, antimicrobianos, antimaláricos,antiparasíticos, anti-hipertensivos, anti-histamínicos,antipiréticos, agonistas alfa-adrenérgico, alfa-bloqueadores,biocidas, bactericidas, dilatadores brônquicos, drogas deobstrução beta-adrenérgicas, contraceptivos, drogascardiovasculares, inibidores do canal de cálcio,antidepressivos, agentes de diagnóstico, diuréticos,eletrólitos, enzimas, hipnóticos, hormônios, hipoglicêmicos,hiperglicêmicos, constritores musculares, relaxantesmusculares, neoplásticos, glicoproteínas, nucleoproteínas,lipoproteínas, oftálmicos, energizantes psíquicos, sedativos,esteróides, simpatomiméticos, parassimpatomiméticos,tranqüilizantes, drogas do trato urinário, vacinas, drogasvaginal, vitaminas, minerais, drogas antiinflamatórias não-esteroidais, enzimas de angiotensina, polinucleotídeos,polipeptídeos e polissacarídeos.

As composições providas na presente invenção podemter uma vida em armazenagem de comprimento variável. Em umaspecto, a vida útil é de aproximadamente uma semana aaproximadamente um mês, de aproximadamente um mês aaproximadamente seis meses, de aproximadamente seis meses aaproximadamente um ano, de aproximadamente um ano aaproximadamente dois anos ou de aproximadamente dois anos aaproximadamente cinco anos a uma temperatura deaproximadamente 55°C, 50°C, 45°C, 44°C, 42°C, 40°C, 39°C,38 °C, 3 7 ° C ou inferior. Em um determinado aspecto, o teor deumidade das micropartícuias é ajustado de modo que pelo menosaproximadamente 90% da atividade da proteína fique retidoapós a armazenagem por aproximadamente seis meses aaproximadamente um ano a uma temperatura de aproximadamente 25°C.

As micropartícuias nas composições providas napresente invenção podem conter adicionalmente um contraíon,como, por exemplo, um ânion, um cátion ou um íon dipolar. Emdeterminadas realizações, o contraíon é selecionado entreglicina, citrato de sódio, sulfato de sódio, sulfato dezinco, sulfato de magnésio, sulfato de potássio ou sulfato decálcio. A quantidade de contraíon em uma micropartícula podeser variada. Por exemplo, a quantidade de contraíon nasmicropartículas pode ser de aproximadamente 0,5% ou de 0,5% aaproximadamente 5% ou de 5% em peso/peso, de aproximadamente0,5% ou de 0,5% a aproximadamente 2% ou de 2% em peso/peso oude aproximadamente 1% ou de 1% a aproximadamente 2% ou de 2%em peso/peso.

Em algumas realizações, o teor de umidade dasmicropartícuias nas composições providas na presente invençãoé de aproximadamente 6% ou de 6% a aproximadamente 12% ou de12% ou de aproximadamente 7% ou de 7% a aproximadamente 10,5%ou de 10,5%.

As composições providas na presente invenção podemser formuladas para uma variedade de modos de administração.Por exemplo, as composições podem ser administradasoralmente, por exemplo, por ingestão, intravenosamente,intranasalmente, parenteralmente, subcutaneamente ouintramuscularmente. As composições também podem serformuladas para a administração pulmonar ou oftálmica. Em umdeterminado aspecto, a composição provida na presenteinvenção é para inalação.

As composições providas na presente invenção podemser formuladas como tabletes, caplets, géis, frascos,seringas preenchidas, inaladores, dispositivos eletrostáticose outros dispositivos para a aplicação. A dosagem daaplicação das composições pode ser entre aproximadamente 0,5mg de proteína por dose a aproximadamente 100 mg de proteínapor dose ou de aproximadamente 0,75 mg, 1 mg, 1,5 mg, 2 mg, 3mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 45 mg, 50 mg, 55mg ou 60 mg de proteína por dose. A freqüência deadministração de uma dose, por exemplo, para o tratamento oua profilaxia do influenza, pode ser de três ou mais vezes aodia, a duas vezes ao dia, uma vez ao dia, a duas vezes porsemana, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas oumenos freqüente do que uma vez a cada duas semanas. Para aprofilaxia, a administração pode ser geralmente da ordem deaproximadamente uma vez a cada duas semanas ou menosfreqüente, como uma vez a cada três semanas ou uma vez a cadaquatro semanas ou por mais tempo.

0 tamanho das micropartículas nas composiçõesprovidas na presente invenção pode variar. Por exemplo, otamanho das micropartículas pode ser de aproximadamente 0,001μπι ou de 0,001 μπι a aproximadamente 50 μπι ou 50 μπι. Emdeterminadas realizações, o tamanho das micropartículas é deaproximadamente 0,3 μπι ou de 0,3 μπι a aproximadamente 30 μπιou de 30 μπι, de aproximadamente 0,5 μπι ou de 0,5 μπι aaproximadamente 10 μπι ou de 10 μπι, de aproximadamente 0,5 μπιou de 0,5 μπι a aproximadamente 5,0 μπι ou de 5,0 μπι, deaproximadamente 1,0 μπι ou de 1,0 μπι a aproximadamente 5,0 μπιou de 5,0 μπι ou de aproximadamente 1,0 μπι a aproximadamente2,0, 3,0, 4,0 ou 5,0 μπι.

Também são providos na presente invenção os artigosde manufatura que contêm uma composição que contémmicropartículas de uma sialidase ou de uma proteína de fusãode sialidase, um material de acondicionamento para acomposição e uma etiqueta que indica que a composição é parauma indicação terapêutica. Em uma realização, a indicaçãoterapêutica é o influenza. O artigo de manufatura também podeconter um inalador para a administração pulmonar dacomposição. Em determinadas realizações, o inalador é uminalador em pó seco, um inalador com medidor de dose ou umdispositivo de aplicação eletrostático.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A. Definições

A menos que definidos de outra maneira, todos ostermos técnicos e científicos utilizados na presente invençãotêm o mesmo significado que é compreendido geralmente por umelemento versado na técnica à qual a(s) invenção(ões)pertence(m). Todas as patentes, pedidos de patente,publicações e pedidos publicados, seqüências no Genbank,sites na Web e outros materiais publicados referidos nestadescrição inteira, a menos que observado de outra maneira,são incorporados a título de referência em sua totalidade.

Caso haja uma pluralidade de definições para termos napresente invenção, aqueles nesta seção prevalecem. Onde areferência é feita a um URL ou outro identificador ouendereço, fica compreendido que tais identificadores podemmudar e as informações particulares na Internet podem vir eir, mas as informações equivalentes podem ser encontradaspela busca na Internet. A referência evidencia adisponibilidade e a disseminação pública de tais informações.

Conforme utilizado na presente invenção, o termo"macromolécula" é utilizado para significar uma moléculacomposta de duas ou mais subunidades monoméricas ou derivadosdestas, que são ligadas por uma ligação ou qualquermacromolécula que possa formar uma estrutura terciária. Umamacromolécula pode ser, por exemplo, um polinucleotídeo, umácido nucléico, moléculas incluindo o DNA, o RNA e o ácidonucléico do peptídeo (PNA), um polipeptídeo, uma proteína, umcarboidrato ou um lipídeo ou derivados ou combinações destes,por exemplo, uma molécula de ácido nucléico que contém umaporção de ácido nucléico do peptídeo ou uma glicoproteína,respectivamente. Os métodos, as composições, as combinações,os kits e os artigos de manufatura providos na presenteinvenção, embora descritos com referência às proteínas, podemser adaptados para a utilização com outras macromoléculas,tal como definido e provido na presente invenção.

0 termo "substancialmente" ou "substancial"conforme utilizado na presente invenção significa geralmentepelo menos aproximadamente 60% ou 6 0%, aproximadamente 70% ou70% ou aproximadamente ou em 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%,97%, 98%, 99% ou mais relativamente a uma referência talcomo, por exemplo, uma seqüência de ácido nucléico ou deproteína ou a composição original de uma entidade. Dessemodo, uma composição que contém micropartículas separadas de"substancialmente" todos contaminadores restantes e/ouingredientes incluindo contraíons, sais e solventes dasolução de coquetel significam que pelo menos aproximadamente60% ou 60%, aproximadamente 70% ou 70% ou de aproximadamenteou em 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ouquantidades mais elevadas de contaminadores e/ou de reagentesforam removidas da solução de coquetel em que asmicropartículas são formadas. O termo "substancialmenteidêntico" ou "substancialmente homólogo" ou similar varia como contexto, tal como compreendido pelos elementos versados natécnica relevante e significa geralmente pelo menosaproximadamente 6 0% ou 60%, aproximadamente 70% ou 70% ou deaproximadamente ou em 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,99% ou em uma identidade mais elevada.

O termo "consiste essencialmente em" ou "queconsiste essencialmente em" como utilizado na presenteinvenção refere-se a uma entidade a partir da qualsubstancialmente todos os componentes/ingredientes restantesque não são associados com a entidade ou suas propriedadesforam removidos ou separados da entidade. Desse modo, umacomposição "que consiste essencialmente em" micropartículassignifica que todos ingredientes restantes tais comocontaminadores e solventes foram removidos substancialmenteda solução/suspensão que contém as micropartículas.

O termo "micropartícula" como utilizado na presenteinvenção é permutável com "microesfera" e refere-se àspartículas na faixa de tamanho (comprimento, larguraou diâmetro médio) de aproximadamente ou em 0,001 mícron (μπι)a aproximadamente ou em 500 micras que contêm umamacromolécula e aplicam um agente de interesse, tal como umadroga ou um suplemento nutritivo, a um indivíduo. O agentepode sér a macromolécula, por exemplo, uma proteína, um ácidonucléico, um lipídeo ou um polissacarídeo ou a macromoléculaque forma a micropartícula pode ser um portador para o agenteativo, tal como uma droga ou um suplemento nutritivo. Asmicropartícuias também podem conter macromoléculas sintéticasincluindo polímeros, tais como o polietilenoglicol (PEG), oácido poliláctico (PLA), o ácido poliláctico-co-glicólico(PLGA) e polímeros naturais tais como albumina, gelatina,quitosana e dextrano. As "micropartícuias" como descritas napresente invenção podem conter e podem ser feitas de umamacromolécula natural ou sintética particular sozinha ou demais de um tipo da mesma macromolécula natural ou sintética(por exemplo, mais de um tipo de proteína) ou de combinaçõesde mais de um tipo diferente de macromolécula natural ousintética (por exemplo, uma proteína e um ácido nucléico ouuma proteína e um polímero sintético).

O termo "micropartícula" como utilizado na presenteinvenção também se refere geralmente a uma partícula que nãoseja uma forma sólida da solução inteira da qual é produzida,embora as partículas congeladas e/ou secas de uma solução quecontém macromoléculas também sejam contempladas na presenteinvenção. Em vez disso, a micropartícula como utilizada napresente invenção é geralmente um conjunto de uma fração decomponentes de uma solução, incluindo sais, contraíons,solventes e outros ingredientes, que é formado por umprocesso que inclui, mas não se limita à precipitação,sedimentação, separação de fase e formação de colóide.

O termo "precipitação" como utilizado na presenteinvenção refere-se a um processo por meio de que um soluto ouos solutos de interesse em uma solução, tais como oscomponentes de uma micropartícula, não permanecem mais nasolução e formam uma fase que é distinta do solvente ou dossolventes que foram utilizados para a formação da solução. Aprecipitação de uma microparticula e o controle do tamanho damicropartícula precipitada podem ser realizados por umavariedade de meios incluindo, mas não se limitando a ajusteda temperatura, resistência iônica, pH, constante dielétrica,concentração de contraíons, concentração de solventeorgânico, adição de polieletrólitos ou de polímeros,tensoativos, detergentes ou uma combinação destes.

O termo "separação de fase" como utilizado napresente invenção refere-se à transformação de uma única fasehomogênea, tal como uma solução, em duas ou mais fases, taiscomo uma suspensão de uma partícula sólida em um solvente ouem uma solução.

O termo "sedimentação" como utilizado na presenteinvenção refere-se ao movimento das partículas, tais como asmicropartícuias, que estão em uma suspensão em um líquido ouque são formadas em uma solução em resposta a uma forçaexterna tal como a gravidade, a força centrífuga ou a forçaelétrica.

O termo "solução" é utilizado permutavelmente com"solução de coquetel" na presente invenção e refere-se a umamistura homogênea de dois ou mais ingredientes em uma fasemonofásica, sólida, líquida ou gasosa, onde os ingredientesdistintos somente são reconehcíveis em nível molecular. Asolução pode ser um líquido em que um ou os mais solutos,tais como os sais, são dissolvidos em um solvente, tal como aágua ou o· álcool ou são dissolvidos em uma mistura desolventes miscíveis, tais como uma mistura de água e deálcool etílico. A solução também pode ser uma forma congeladade uma solução líquida.

O termo "miscível" como utilizado na presenteinvenção refere-se à capacidade de um ou mais componentes,tais como líquidos, sólidos e gases, de se misturar paraformar uma única fase homogênea. Desse modo, dois líquidossão miscíveis se puderem ser misturados para formar um únicolíquido homogêneo cujos componentes distintos sejamreconhecidos somente em nível molecular. Quando oscomponentes são "parcialmente miscíveis", significa que podemser misturados para formar uma única fase homogênea em algumafaixa de concentração, mas não em outras faixas deconcentração. Conforme utilizado na presente invenção, quandoum solvente é "parcialmente miscível" com um outro solvente,significa que é miscível a uma concentração deaproximadamente ou a 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%,10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou inferior emvolume/volume (v/v), quando misturado com o outro solvente.

Conforme utilizado na presente invenção,"imiscível" significa que quando dois ou mais componentes,tais como líquidos, sólidos ou gases são misturados, elesformam mais de uma fase. Por exemplo, quando um solventeorgânico é imiscível com um solvente aquoso (por exemplo,hexano e água), o solvente orgânico é visível como uma camadadistinta que não se mistura com a camada de solvente aquoso.

Conforme utilizado na presente invenção, o termo"polipeptídeo" significa pelo menos dois aminoácidos ouderivados de aminoácido, incluindo os aminoácidos com a massamodificada e análogos de aminoácido, que são ligados por umaligação de peptídeo, a qual pode ser uma ligação de peptídeomodificada. Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína"são utilizados essencialmente sinonimamente na presenteinvenção, embora o elemento versado na técnica reconheça queos peptídeos contêm geralmente menos do que aproximadamentecinqüenta a aproximadamente cem resíduos de aminoácido e queas proteínas freqüentemente são obtidas de uma fonte naturale podem conter, por exemplo, modificações pós-translacionais.

Um polipeptídeo ou uma proteína pode ser traduzidaa partir de um polinucleotídeo, que pode incluir pelo menosuma porção de uma seqüência de codificação ou de uma porçãode uma seqüência de nucleotídeo que não é naturalmentetraduzida devido ao fato de, por exemplo, estar localizada emuma estrutura de leitura diferente de uma estrutura decodificação, ou ao fato de ser uma seqüência de intron, umaseqüência não-traduzida 3- ou 5·, uma seqüência regulatóriatal como um promotor ou outros ainda. Um polipeptídeo tambémpode ser quimicamente sintetizado e pode ser modificado pormétodos químicos ou enzimáticos depois da síntese de traduçãoou química. Um polipeptídeo pode ser modificado pós-translacionalmente por meio de fosforilação (fosfoproteínas),glicosilação (glicoproteínas, proteoglicanos) e outros ainda,que podem ser executadas em uma célula ou em uma reação invitro.

Conforme utilizado na presente invenção, o termo"proteína de fusão" refere-se a uma proteína que é umconjugado de domínios obtidos de mais de uma proteína oupolipeptídeo. Um domínio pode ser um Tag do polipeptídeo, talcomo um Tag de His6. Os conjugados podem ser preparados aoligar os domínios por meio de conjugação química, tecnologiade DNA recombinante ou pelas combinações da expressãorecombinante e da conjugação química.

Uma variedade de ligantes químicos é conhecidapelos elementos versados na técnica e inclui, mas não élimitada a enlaces de aminoácido e de peptídeo, tipicamentecontendo entre um e aproximadamente 60 aminoácidos, maisgeralmente entre aproximadamente 10 e 3 0 aminoácidos,reticuladores divisíveis heterobifuncionais, incluindo masnão se limitando a N-succinimidil (4-iodoacetil)-aminobenzoato, sulfosuccinimidil (4-iodoacetil)-aminobenzoato, 4-succinimidil-oxicarbonil-(2-piridilditio)tolueno, hexanoato de sulfosuccinimidil-6-[a-metil-a-(piridilditiol)-toluamido], hexanoato de N-succinimidil-3-(-2-piridilditio)-propionato, succiniraidil6[3(-(-2-piridilditio)-propionamido], hexanoato desulfosuccinimidil 6[3(-(-2-piridilditio)-propionamido],hidrazida de 3-(2-piridilditio)-propionila, reagente deEllman, ácido diclorotriazínico e S-(2-tiopiridil)-L-cisteína.

O termo "proteína de fusão de sialidase" comoutilizado na presente invenção refere-se a uma proteína defusão em que um ou mais domínios são uma sialidase ou umaporção desta que retém pelo menos aproximadamente 60% ou 60%,aproximadamente 70% ou 7 0% ou aproximadamente ou em 75%, 8 0%,85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de sua atividadecatalítica. Uma proteína de fusão de sialidase como utilizadana presente invenção também pode se referir a uma proteína defusão que contém uma proteína ou um polipeptídeo que sejasubstancialmente homólogo a uma sialidase e possua aatividade enzimática de uma sialidase.

O termo "domínio catalítico" de uma proteína comoutilizado na presente invenção refere-se a uma proteína ou umpolipeptídeo em que a única porção da seqüência que ésubstancialmente homóloga a uma sialidase é uma seqüência deresíduos de aminoácido que inclui o domínio responsável pelaatividade catalítica da proteína (por exemplo, os resíduos274-666 da SEQ XD N° . : 1 são identificados como o domíniocatalítico de sialidase de Actinomyces viscosus) ou defragmentos cataliticamente ativos destes. 0 domíniocatalítico ou o fragmento cataliticamente ativo destes retémpelo menos aproximadamente 60% ou 6 0%, aproximadamente 70% ou70% ou aproximadamente ou em 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%,97%, 98%, 99% ou mais da atividade catalítica da proteína.

Conforme utilizado na presente invenção, do termo"capacidade de fluxo característica" refere-se a umapropriedade que resulta na capacidade de "fluir", onde o"fluxo" é uma propriedade que pode permitir que umasubstância seja derramada e assuma o formato de um recipienteem que foi derramada, sem impedimento devido a, por exemplo,agregação. Os líquidos têm geralmente a propriedade de"fluir", que geralmente os torna deformáveis, isto é, podemmudar seu formato. 0 termo "fluido" como utilizado napresente invenção abrange os colóides que contêm líquidos,incluindo, emulsões, aerossóis e gases. Os líquidos, osaerossóis e os gases com suspensões de partículas sólidas,tais como micropartículas, também são considerados "fluidos",conforme definido na presente invenção.

Conforme utilizado na presente invenção, umaemulsão é definida como um colóide de dois líquidosimiscíveis, de um primeiro líquido e de um segundo líquido,onde o primeiro líquido é disperso no segundo líquido.

Conforme utilizado na presente invenção, ostensoativos (ou os "agentes de superfície ativos") são asentidades químicas ou naturais que, quando dissolvidas em umasolução aquosa, reduzem a tensão de superfície da solução oua tensão interfacial entre duas ou mais fases na solução. Asmoléculas de tensoativos geralmente são anfifílicas e contêmgrupos principais hidrofílicos e caudas hidrofóbicas. Asmoléculas de tensoativos podem agir como estabilizantes e/ouaprimorar as características da capacidade de fluxo dasmicropartículas providas na presente invenção.

Conforme utilizado na presente invenção, umacombinação refere-se a qualquer associação entre dois ouentre mais artigos para uma finalidade. Por exemplo, umacombinação de micropartículas e de um inalador pode serutilizada para a aplicação pulmonar de um agente terapêutico.

Conforme utilizado na presente invenção, umacomposição refere-se a qualquer mistura. Pode ser umasolução, suspensão, líquido, pó, pasta, uma solução aquosa,não-aquosa ou qualquer combinação destes.

Conforme utilizado na presente invenção, um kitrefere-se a uma combinação em que os componentes sãoacondicionados opcionalmente com instruções para a utilizaçãoe/ou os reagentes e o aparelho para a utilização com acombinação.

Conforme utilizado na presente invenção, o termo"enzima" significa uma proteína que catalisa uma reaçãoquímica ou um processo biológico. As enzimas geralmentefacilitam e/ou aceleram tais reações e processos. Além disso,as enzimas são geralmente específicas para uma reação ou umprocesso particular, convertendo um conjunto específico dereagentes em produtos específicos.

Conforme utilizado na presente invenção, o termo"colóide" refere-se a uma dispersão de partículas sólidas,tais como micropartículas, em um líquido, tal como a soluçãoem que as micropartículas são formadas. 0 termo "estabilidadecoloidal" refere-se a um colóide em que as partículas não sãoagregadas substancialmente. Por exemplo, um colóide estável éum em que aproximadamente 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%,3%, 2%, 1%, 0,5% ou menos das partículas sólidas, tais comomicropartículas, formaram agregados.

O termo "aglomerados" refere-se à associação de umaou mais partículas, tais como as microesferas, mantidasfrouxamente juntas pelas forças van der Waals ou pela tensãode superfície ou eletrostática ou por combinações destas. Emalguns exemplos, as associações mantidas por forçaseletrostáticas podem ser definidas como "floculados". Para asfinalidades da presente invenção, os "aglomerados" abrangemtambém os "floculados". Os aglomerados podem ser geralmentefacilmente rompidos pelas forças de cisalhamento no ar ou emlíquido. O termo "dispersão" ou "dispersividade" refere-se àcapacidade de as partículas "fluírem", isto é, a extensão emque o movimento não é impedido pela presença, por exemplo, deagregados.

O termo "agregados" refere-se à associação de umaou mais partículas, tais como microesferas, precipitadosamorfos, partículas similares a cristal ou vidro oucombinações destes. Os agregados não são geralmentefacilmente rompidos, o que inibe sua capacidade de sedispersar ou formar suspensões homogêneas ou de formaraerossóis com propriedades desejáveis.

O termo "não-desnaturado" como utilizado napresente invenção refere-se às proteínas e significa umaconformação de uma proteína, isto é, sua estruturasecundária, estrutura terciária, estrutura quaternária oucombinações destas, que é essencialmente inalterada daproteína em seu estado natural. Os termos "não-desnaturado" e"nativo" são utilizados permutavelmente na presente invençãoe significam uma proteína que retém tudo ou pelo menosaproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de seu comprimento e/ouconformação natural. Os termos "não-desnaturado" ou "nativo"como utilizados permutavelmente incluem na presente invençãoo estado natural de uma proteína em uma célula, tal como seucomprimento e conformação incluindo estruturas secundárias,terciárias e quaternárias. Conforme definido na presenteinvenção, as proteínas "não-desnaturadas" ou "nativasincluindo aquelas nas composições providas na presenteinvenção retêm geralmente tudo ou pelo menos aproximadamente50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,97%, 98% ou 99% da atividade ou função normal das proteínasem seu estado natural, por exemplo, como um nutriente paraprover blocos de construção de aminoácido, um antioxidante,uma enzima, um anticorpo, um regulador da expressão de genes,uma estrutura de suporte, etc.Conforme utilizado na presente invenção, os termos"atividade" ou "função" são permutáveis com "atividadebiológica" e referem-se às atividades in vivo de um composto,tais como uma proteína, uma vitamina, um mineral ou uma drogaou as respostas fisiológicas que resulta da administração invivo de um composto, composição ou de outra mistura. Aatividade, desse modo, abrange efeitos terapêuticos e aatividade farmacêutica dos compostos, das composições e dasmisturas. As atividades biológicas também podem serobservadas nos sistemas in vitro projetados para teste ouutilização de tais atividades.

Conforme utilizado na presente invenção, a"atividade funcional" também é permutável com "atividade","atividade biológica" ou "função" e refere-se a umpolipeptídeo ou a uma porção deste que indica uma ou maisatividades associadas com a proteína nativa ou não-desnaturada. As atividades funcionais incluem, mas não sãolimitadas à atividade biológica, atividade catalítica ouenzimática, antigenicidade (capacidade de se ligar a competircom um polipeptídeo para se ligar a um anticorpo deantipolipeptídeo), imunogenicidade, a capacidade de formarmultímeros e a capacidade de se ligar especificamente a umreceptor ou a um ligando para o polipeptídeo.

O termo "desnaturado" como utilizado na presenteinvenção refere-se a uma proteína que é alterada em suaconformação nativa ou não-desnaturada, isto é, em suasestruturas ou combinações secundárias, terciárias ouquaternárias. A conformação alterada ocorre geralmente pelasetapas de processamento que incluem a pasteurização, aradiação, o calor, os produtos químicos, a ação das enzimas,a exposição aos ácidos ou alcalóides e pela troca de íons epor todas as combinações destes. A desnaturação de umaproteína resulta geralmente em diminuir todas ou algumas,geralmente mais de 50% e pelo menos aproximadamente 70%, 80%,85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% daspropriedades originais incluindo a atividade e a função daproteína em seu estado nativo ou não-desnaturado.

Conforme utilizado na presente invenção, o termo"suplemento nutritivo" significa uma substância ou umacomposição que provê nutrientes, incluindo vitaminas,minerais, ácidos graxos, aminoácidos, carboidratos, enzimas,proteínas, bioquímicos e seus metabólitos, ervas e plantas, aum hospedeiro, tal como um animal, incluindo o ser humano. Osnutrientes que são providos ao hospedeiro através desuplementos nutritivos podem incluir os nutrientes essenciaispara a sobrevivência, uma boa saúde, a cura de doenças oupara impedir doenças que estão faltando ou deficientes nadieta de um hospedeiro, e os nutrientes que são consideradospara aumentar a boa saúde, para impedir . doenças ou curardoenças, mas não são considerados essenciais para asobrevivência ou a boa saúde.

Conforme utilizado na presente invenção,"hidrofóbico" refere-se a uma substância que não é carregadanem polarizada por carga ou suficientemente não é carregadanem polarizada pro carga para se ligar com a água ou outrossolventes polares. Os ligandos hidrofóbicos podem se associarentre si ou com outras moléculas ou solventes não-polares napresença de água ou de um solvente polar, através deinterações hidrofóbicas. Um ligando hidrofóbico também égeralmente mais solúvel em solventes não-polares do que emsolventes polares. Os exemplos de solventes não-polar incluemos alcanos tais como o hexano, éteres de alquila tais como oéter de dietila, hidrocarbonetos aromáticos tais como haletosde benzeno e de alquila tais como o cloreto de metileno e otetracloreto de carbono, mono-, di- e triglicerídeos, ácidosgraxos, tais como o ácido oléico, linoléico, palmítico,esteárico, formas conjugadas destes e seus ésteres.

Conforme utilizado na presente invenção, o termo"agente terapêutico" significa um agente que, quando daadministração a um hospedeiro, incluindo os seres humanos,eficazmente aprimora ou elimina os sintomas ou asmanifestações de uma doença herdada ou adquirida ou que curaesta dita doença.

Conforme utilizado na presente invenção, "a vidaútil" ou a "estabilidade" referem-se ao tempo depois dapreparação da composição de microparticula que a composiçãoretém pelo menos aproximadamente ou 70%, 80%, 85%, 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da atividade inicialda proteína que está presente na composição e outrascaracterísticas físicas gerais das microesferas tais como otamanho, o formato e a distribuição de tamanho aerodinâmicada partícula. Desse modo, por exemplo, uma composição que éestável para ou tem uma vida útil de 3 0 dias à temperaturaambiente, definida na presente invenção como uma faixa entreaproximadamente 18 0C a aproximadamente 25°C, 26 °C, 270C ou28 °C, teria pelo menos aproximadamente 70%, 80%, 85%, 90%91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da quantidadeinicial da atividade da proteína presente na composição emtrinta dias após a armazenagem de 18 °C a aproximadamente25°c, 26°C, 27 °C ou 28°C. A vida útil das composições demicroparticula providas na presente invenção é geralmentepelo menos aproximadamente dez dias a 55 °C, pelo menosaproximadamente 2-3 semanas a 42 0C e pelo menosaproximadamente oito meses ou mais a 25°C, no entanto, ascomposições de microparticula de qualquer comprimento de vidaútil em qualquer temperatura que são produzidas pelos métodosprovidos na presente invenção são contempladas na presenteinvenção.

Conforme utilizado na presente invenção, um "agentebiologicamente ativo", um "agente ativo", um "agentebiológico" ou "um agente" "é qualquer substância que, quandointroduzida no corpo, causa uma resposta biológica desejada,tal como a alteração da função do corpo em nível celular,tissular ou orgânico e/ou a alteração da aparência cosmética,tal como o peso corpóreo e a forma física. Tal substânciapode ser qualquer elemento ou composto sintético ou natural,proteína, célula ou tecido incluindo um produto farmacêutico,uma droga, um suplemento terapêutico, nutritivo, uma erva, umhormônio ou outros ainda, ou quaisquer combinações destes. Ostermos também abrangem derivados farmaceuticamenteaceitáveis, derivados farmacologicamente ativos dessesagentes ativos mencionados especificamente na presenteinvenção, incluindo, mas não se limitando aos sais, ésteres,amidas, pró-drogas, metabólitos ativos, isômeros, fragmentos,análogos e outros ainda. Quando o termo "agentebiologicamente ativo", "agente biológico" e "agente" éutilizado ou quando um agente ativo particular éespecificamente identificado, pretende-se incluir o agenteativo em si bem como os sais farmaceuticamente aceitáveis,farmacologicamente ativos, ésteres, amidas, pró-drogas,metabólitos ativos, isômeros, fragmentos e análogos.

Conforme utilizado na presente invenção, um"indivíduo" é definido como um animal, incluindo um mamífero,tipicamente um ser humano.

Conforme utilizado na presente invenção, uma"quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a umaquantidade de agente ativo para uma terapêutica desejada,profilática ou outro efeito ou resposta biológica quando umacomposição é administrada a um indivíduo em uma única formade dosagem. A quantidade particular de agente ativo em umadosage variará extensamente de acordo com condições tais comoa natureza do agente ativo, a natureza da doença que estásendo tratada, a idade e o tamanho do indivíduo.

Conforme utilizados na presente invenção, os"derivados farmaceuticamente aceitáveis" de um compostoincluem sais, ésteres, éteres de enol, ésteres de enol,ácidos, bases, solvatos, hidratos ou pró-drogas destes. Taisderivados podem ser facilmente preparados pelos elementosversados na técnica utilizando métodos conhecidos para talderivatização. Os compostos produzidos podem seradministrados aos animais ou aos seres humanos sem efeitostóxicos substanciais e são farmaceuticamente ativos ou sãopró-drogas. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, masnão são limitados a sais de amina, como mas não limitados aN,N'-dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, colina, amônia,dietanolamina e outras hidroxialquilaminas, etilenodiamina,N-metilglucamina, procaína, N-benzilfenetilamina, 1-para-clorobenzil-2-pirrolidin-l1-ilmetilbenzimidazol, dietilaminae outras alquilaminas, piperazina e tris(hidroximetil)aminometano; sais de metais alcalinos, como mas não limitadoao lítio, ao potássio e ao sódio; sais de metais alcalinosterrosos, como mas não limitados ao bário, ao cálcio e aomagnésio; sais de metais de transição, como mas não limitadosao zinco; e outros sais de metal, como mas não limitado aofosfato do hidrogênio de sódio e ao fosfato dissódico; etambém incluindo, mas não se limitando a sais de ácidosminerais, como mas não limitados aos cloridretos e aossulfatos; e sais de ácidos orgânicos, como mas não limitadosaos acetatos, lactatos, maleatos, tartaratos, citratos,ascorbatos, succinatos, butiratos, valeratos e fumaratos. Osésteres farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não sãolimitados aos ésteres de alquila, alquenila, alquinila,arila, heteroarila, aralquila, heteroaralquila, cicloalquilae heterociclila de grupos ácidos, incluindo, mas não selimitando aos ácidos carboxilicos, ácidos fosfóricos, ácidosfosfínicos, ácidos sulfônicos, ácidos sulfínicos e ácidosborônicos.

Conforme utilizado na presente invenção, o"tratamento" significa qualquer maneira em que um ou mais dossintomas de um quadro clinico, de um distúrbio ou de umadoença são aprimorados ou beneficamente alterados de outramaneira. O tratamento também abrange qualquer utilizaçãofarmacêutica das composições na presente invenção, como autilização para tratar o influenza.

Conforme utilizado na presente invenção, o"solvente orgânico" refere-se a um solvente que é um compostoorgânico, que é qualquer elemento de uma grande classe decompostos químicos cujas moléculas contêm carbono ehidrogênio. Tais solventes podem incluir, por exemplo,compostos das seguintes classes: álcoois alifáticos ouaromáticos, polióis, aldeídos, alcanos, alquenos, alquinos,amidas, aminas, compostos aromáticos, compostos azo, ácidoscarboxílicos, ésteres, dioxanos, éteres, haloalcanos, iminas,imidas, cetonas, nitritos, fenóis e tióis.

Conforme utilizado na presente invenção, um"solvente aquoso" refere-se à água ou a uma mistura desolventes que contém pelo menos aproximadamente 50% ou 50%,pelo menos aproximadamente 60% ou 60%, pelo menosaproximadamente 7 0% ou 7 0% ou de aproximadamente ou em 75%,80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou quantidades maiselevadas de água. 0 termo "solvente aquoso" conformeutilizado na presente invenção também se refere às soluçõesque contêm água como um solvente, tal como tampões, soluçõessalinas, soluções que contêm contraíons e outros solutos quesão solúveis em água.

Conforme utilizado na presente invenção, o termo"pi" ou "ponto isoelétrico" refere-se ao pH em que não hánenhuma carga líquida em uma proteína ou em um polipeptídeo.Conforme utilizado na presente invenção, o termo"contraíon" refere-se a uma molécula carregada ou polarizávelpor carga que pode iniciar a formação de uma micropartícula apartir de uma macromolécula, tal como uma proteína, um ácidonucléico, um lipídeo ou um oligossacarídeo. Por exemplo, nocaso da proteína de fusão DAS181 (ID SEQ N0.: 17), o sulfatode sódio é um contraíon porque pode iniciar a formação demicropartículas nos métodos providos na presente invenção,visto que a glicina, o cloreto de sódio ou o acetato de sódionão são geralmente apropriados como contraíons para DAS181.Se uma molécula carregada é um contraíon, pode serdeterminada empiricamente com base em parâmetros incluindo,mas não se limitando ao tipo de proteína, pH, resistênciaiônica, tipo de solvente orgânico utilizado e a presença desais e de ingredientes adicionais tais como os agentesativos. Conforme provido e descrito na presente invenção, oscontraíons podem ser aniônicos ou ter uma carga negativalíquida ou grupo(s) polarizável(is) por carga, catiônicos outer uma carga positiva líquida ou gropo(s) polarizável(is)por carga ou switeriônicos e ter grupos carregados positiva enegativamentee e grupoa polarizáveis por carga.

Conforme utilizado na presente invenção, o termo"resfriamento" refere-se à diminuição da temperatura a umatemperatura desejada para a obtenção de micropartículas ou,uma vez que as micropartículas são obtidas, diminuição datemperatura adicional a uma temperatura desejada para aobtenção de preparações de micropartículas a seco aovolatilizar os solventes (por exemplo, para secagem porcongelamento). Os termos "resfriamento gradual" ou"refrigerar gradualmente" ou "gradualmente refrigerado"conforme utilizados na presente invenção significam que adiminuição da temperatura a uma temperatura desejada a partirda temperatura ambiente (de aproximadamente ou de 18 0C aaproximadamente 30°C) para a formação de micropartícuiasocorre em uma taxa ou por uma quantidade de tempo que éapropriada para gerar micropartículas em uma solução antesque a solução se torne congelada. Desse modo, a resfriamentogradual é diferente, por exemplo, do congelamento brusco,secagem por aspersão ou secagem por aspersão congelada, pormeio de que a solução inteira é convertida em uma formasólida sem a geração de micropartículas distintas.

A taxa de resfriamento gradual é determinadaempiricamente com base no tipo de macromolécula, desolventes, de contraíons e de outros ingredientes bem como ométodo de resfriamento (por exemplo, um trocador de calor, umrefrigerador ou um freezer ou um secador por congelamento) epode variar, por exemplo, para uma quantia de tempo para aformação de micropartículas entre aproximadamente ou em 1minuto, 2 minutos, 3 minutos, 5 minutos, 7 minutos, 10minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 1 h,2h, 5h ou 10 h a aproximadamente ou 1,5 minuto, 2 minutos, 3minutos, 5 minutos, 7 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 2 0minutos, 25 minutos, 30 minutos, 1 h, 2 h, 5 h, 10 h ou 15 h.

Conforme utilizado na presente invenção, o termo"resfriamento" refere-se à diminuição da temperatura a umatemperatura desejada para a obtenção de micropartículas ou,uma vez que as micropartículas de dimensões desejadas sãoobtidas, diminuição adicional da temperatura a umatemperatura desejada para a obtenção de preparações demicropartículas a seco ao volatizar os solventes (porexemplo, para secagem por congelamento). Os termos"resfriamento gradual" ou "refrigerar gradualmente" ou"refrigerado gradualmente" conforme utilizados na presenteinvenção significam a diminuição da temperatura a umatemperatura desejada a partir da temperatura ambiente em quea solução de coquetel foi formada (de aproximadamente ou a -15°C a aproximadamente ou a 50°C, geralmente deaproximadamente ou a 18 °C a aproximadamente ou a 30°C) paraque a formação de micropartículas ocorra a uma taxa ou poruma quantia de tempo que é apropriada para gerarmicropartículas de dimensões desejadas em uma solução antesque a solução se torne congelada. Desse modo, a resfriamentogradual é diferente, por exemplo, do congelamento brusco,secagem por aspersão ou secagem por aspersão congelada, pormeio de que a solução inteira é convertida em uma formasólida sem a geração de micropartículas distintas.

A taxa de resfriamento gradual é empiricamentedeterminada com base no tipo de macromolécula, solventes,contraíons e de outros ingredientes bem como o método deresfriamento (por exemplo, um trocador de calor, umrefrigerador ou um freezer ou um secador por congelamento) epode variar, por exemplo, por uma quantia de tempo para aformação de micropartículas entre aproximadamente ou em 0,1segundo, 0,2 segundo, 0,5 segundo, 1 segundo, 10 segundos, 20segundos, 3 0 segundos, 4 0 segundos, 50 segundos, 1 minuto, 2minutos, 3 minutos, 5 minutos, 7 minutos, 10 minutos, 15minutos, 20 minutos, 25 minutos, 3 0 minutos,1 h, 2 h, 5 h ou10 h a aproximadamente ou em 1,5 minuto, 2 minutos, 3minutos, 5 minutos, 7 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20minutos, 25 minutos, 30 minutos, 1 h, 2 h, 5 h, 10 h ou 15 h.

Micropartículas de tamanho desejado também podemser formadas, por exemplo, ao rapidamente esfriar o coquetel(utilizando, por exemplo, um trocador de calor) e permitindoque a suspensão de micropartículas seja mantida por umdeterminado período de tempo sem mudanças de temperaturasignificativas, e então ao congelar bruscamente o coquetel.

A temperatura em que as micropartículas sãoformadas também é determinada empiricamente com base no tipode macromolécula, solventes, contraíons e de outrosingredientes bem como o método e uniformidade de resfriamentoe pode variar de aproximadamente ou a 15°C, IO0C7 8°C, 5°C,3 ° C, 2 ° C, 1°C, -2 ° C, -5 ° C, -I1B0C1 -IO0C1 -15°C, -20°C, -25 ° C, - 3 0 ° C, -35 °C, -40°C ou -45°C.

Conforme utilizado na presente invenção, o termo"secagem por pulverizador" refere-se a um processo em que umasolução que contém uma macromolécula, tal como uma proteína,é transformada em uma forma particulada seca atomizanda em ummeio de secagem a quente, geralmente por um período deaproximadamente alguns milissegundos a 1-2 segundos a algumasdezenas de segundos. O termo "secagem por aspersão congelada"como utilizado na presente invenção refere-se a um processoem que uma solução que contém uma macromolécula, tal como umaproteína, é atomizado em um meio criogênico, tal como emnitrogênio líquido, para obter as gotas congeladas da soluçãoque podem então ser secadas por Iiofilização. 0 termo"congelamento brusco" ou "congelamento rápido" ou "congelarrapidamente" como utilizado permutavelmente na presenteinvenção refere-se ao congelamento de um solvente ou de umasolução, incluindo as soluções que contêm macromoléculas,tais como proteínas, ao imergir o recipiente com boaspropriedades de transferência de calor (por exemplo, vidro deparede fina ou tubo de teste de metal) mantendo o solvente oua solução em nitrogênio líquido ou derramando a soluçãodiretamente em nitrogênio líquido. 0 "congelamento brusco" eo "congelamento rápido" ocorrem geralmente dentro de umperíodo de aproximadamente alguns milissegundos a 1-2segundos a algumas dezenas de segundos.

O termo "liofilizar" ou "Iiofilização" comoutilizado na presente invenção é sinônimo com a "secagem porcongelamento" e refere-se a um processo em que uma solução,incluindo uma emulsão, colóide ou suspensão, é congelada e ossolventes são volatilizados diretamente em estado de vapor,deixando para trás os componentes sólidos.

B. Métodos para a Preparação de MicropartículasMacromoleculares

Composições

São providos na presente invenção os métodos deelaboração de microesferas que têm um teor elevado de umamacromolécula, tal como uma proteína. As microesferasprovidas na presente invenção são preparadas por precipitaçãocontrolada na presença de um contraíon e de um solventeorgânico. As microesferas são apropriados para preparar ascomposições farmacêuticas que podem ser aplicadas a umpaciente por vias de aplicação que incluem as vias deadministração pulmonar, parenteral e oral. 0 método tambémpode ser executado em um grupo ou em um modo contínuo, para aeficiência e a produção aumentadas.

As microesferas obtidas pelos métodos providos napresente invenção são úteis como agentes profiláticos,terapêuticos ou agentes de diagnóstico para tratar oudiagnosticar estados de doenças em um indivíduo in vivo ou invitro. Os tamanhos das microesferas obtidas pelos métodosprovidos na presente invenção podem ser controlados aoajustar os parâmetros incluindo o tipo e a concentração desolvente orgânico, a concentração de proteínas ou demacromoléculas, a resistência iônica, o tipo e a concentraçãode contraíons, a taxa e o período de resfriamento, paraprover microesferas em uma ampla faixa de tamanhos, de 0,001mícron a 50 micras ou mais, que podem aplicar agentesterapêuticos através de uma via desejada que incluía viapulmonar (por exemplo, partículas de 1 micra a 5 micras paraa aplicação à garganta, à traquéia e aos brônquios para otratamento do influenza e de outras infecções respiratórias),subcutânea, intramuscular, intravenosa e outras (por exemplo,utilizando partículas com dezenas de micras de tamanho)resultam em componentes ativos de remédios inaláveis paraindivíduos humanos.

As etapas do método provido na presente invençãoincluem: a combinação de uma solução que contém amacromolécula com um contraíon e um solvente orgânico e aresfriamento gradual da solução resultante a uma temperaturapor meio de que as micropartículas são formadas. Em umarealização, as etapas podem ser descritas como segue:

1) A uma solução que contém uma macromolécula, talcomo uma proteína, um ácido nucléico, um oligossacarídeo ouum lipídeo, adicionar um contraíon e um solvente orgânico aconcentrações que não causem a precipitação de macromoléculasà temperatura ambiente;

2) Precipitação: resfriamento do coquetel demacromolécula/solvente para iniciar a formação demicroesferas; e

3) Desidratação: congelamento da suspensão eremoção do solvente orgânico e da água por sublimação(secagem por congelamento, por exemplo, a uma temperatura deaproximadamente -20°C a aproximadamente -80°C ou deaproximadamente -30°C a aproximadamente -80°C ou deaproximadamente -40°C a aproximadamente -80°C ou deaproximadamente -45°C a aproximadamente -80°C ou deaproximadamente -450C a aproximadamente -75°C).

As etapas do método acima podem ser executadasseqüencialmente, intermitentemente ou simultaneamente emqualquer ordem. Em uma realização, o contraíon e o solventeorgânico são adicionados simultaneamente ou seqüencialmenteem qualquer ordem à solução que contém a macromolécula,seguido pelo resfriamento. Em outras realizações, a soluçãoque contém a macromolécula pode ser pré-resfriada a umatemperatura apropriada para a formação de microesferas, antesde adicionar o contraíon e o solvente orgânico. Por exemplo,uma solução aquosa pré-resfriada de uma macromolécula, talcomo uma proteína, pode ser combinada com o sulfato e oacetonitrilo de amônio para a formação de microesferas.

A suspensão de micropartículas resultante pode serconvertida em um pó seco para a resfriamento adicional a umatemperatura abaixo do ponto de congelamento e a remoçãosubseqüente dos voláteis (água, solvente orgânico e ondepossível o contraíon) por meio de, por exemplo, sublimação,utilizando um secador por congelamento padrão.

Em uma realização, as microesferas formadas aoentrar em contato com a macromolécula com um contraíon e osolvente orgânico e expostas à baixa temperatura sãoseparadas da suspensão por métodos que incluem as técnicas desedimentação ou de filtração. Depois da separação da misturade precipitação original, as microesferas podem ser lavadase/ou combinadas com outros materiais que aprimoram e/oumodificam as características das macromoléculas e dasmicroesferas.

Em uma outra realização, as microesferas preparadaspelos métodos providos na presente invenção não têm um efeitoterapêutico direto, mas servem como microveículos para o(s)outro(s) agente(s) terapêutico(s) ou o(s) agente(s) ativo(s)incluindo os suplementos nutritivos. Os agentes terapêuticospodem ser adicionados quando da precipitação ou podem seradicionados à suspensão de microesferas formada antes daliofilização. Alternativamente, os agentes terapêuticos podemser misturados em um pó seco que consiste em microesferas.

Sem ser limitado por qualquer teoria, em umaspecto, os métodos providos na presente invenção podempermitir a formação de microesferas por meio de: (1)neutralização das cargas na superfície das macromoléculaspelo contraíon e (2) solubilidade diminuída dasmacromoléculas causada pelos efeitos combinados do solventeorgânico adicionado e da resfriamento gradual.

Ao escolher um pH apropriado na faixa deaproximadamente ou ao pH 2,0 a aproximadamente ou ao pH 10,5ou mais, dependendo da macromolécula, do contraíon e dosolvente orgânico, na presença de uma quantidade apropriadade contraíon, um número substancial de grupos carregados, emalguma realização todos os grupos carregados, na superfícieda macromolécula pode se tornar neutralizado. Uma diminuiçãona polaridade da solução pela adição de um solvente orgânicoapropriado pode iniciar então a formação de microesferas porprecipitação, separação de fase, formação de colóide ou poroutro método.

Alternativamente, sem ser limitado por qualquer15 teoria, em algumas realizações, o. fenômeno de precipitaçãodas microesferas observado também pode ser explicado peloefeito cosmotrópico (formação de estrutura) dos contraíons edos solventes orgânicos devido às interações com as moléculasde água da solução aquosa que contém a macromolécula embaixas temperaturas. Não obstante o mecanismo subjacente,nos métodos providos na presente invenção, a adição dequantidades relativamente pequenas de solvente orgânico e decontraíon a uma solução aquosa ou outra solução hidrofílicaque contém uma macromolécula e a resfriamento da soluçãoresultam na produção de composições que contêm microesferasde macromoléculas(s).

Em uma realização, a resfriamento gradual dasolução de coquetel pode ser executada ao passar a solução decoquetel através de um trocador de calor. A temperatura dotrocador de calor e a taxa de fluxo do coquetel através dotrocador de calor podem ser ajustadas de modo que o coquetelseja pré-resfriado antes da formação de microesferas ou sejaresfriado a uma temperatura por meio de que as microesferassão formadas.

Em uma outra realização, as microesferas formadaspelos métodos providos na presente invenção são concentradasou separadas da suspensão por métodos tais como técnicas desedimentação ou de filtração. Quando da formação demicroesferas, seu crescimento (tamanho) pode ser controladopelo ajuste da resistência iônica, polaridade, pH ou outrosparâmetros da suspensão. A separação das microesferas da faselíquida da solução de coquetel pode ser executada por meio decentrifugação, filtração (fibra oca, fluxo tangencial, etc.)ou outras técnicas. As microesferas resultantes ou assuspensões concentradas destas podem ser liofilizadas ousecadas no ar.

Em algumas realizações, as microesferas separadasda mistura de precipitação original ou as microesferassecadas podem ser reconstituídas antes da administração comoum agente terapêutico ou um portador ou podem ser suspensasnas soluções que contêm os agentes que modificam ascaracterísticas das microesferas. Os agentes de modificaçãopodem incluir mas não se limitam aos agentes de avolumação,excipientes, ingredientes inativos, intensificadores deestabilidade, modificadores de sabor e/ou de odor ou agentesde mascaração, vitaminas, agentes terapêuticos,antioxidantes, imunomoduladores, modificadores do transportede transmembrana, agentes antiformação de torta, agentes derevestimento entéricos, agentes que conferem resistênciaácida, tal como contra os ácidos do sistema digestivo, osagentes que conferem resistência à protease, quitosanas,polímeros e intensificadores da capacidade de fluxo.

A formação e as características das microesferasproduzidas pelos métodos providos na presente invenção podemser empiricamente determinadas ao variar os parâmetros,incluindo: natureza e concentração de macromoléculas, pH dasolução de coquetel, natureza e concentração de contraíon,natureza e concentração de solvente orgânico, resistênciaiônica e taxa de resfriamento pela qual a resfriamentogradual é efetuada. As etapas dos métodos providos napresente invenção resultam no método tratável pela varredurade efluência elevada, tal como em um formato de microplaca,para determinar combinações de macromoléculas apropriadas, osolvente orgânico, o contraíon, o pH, a resistência iônica ea rampa de resfriamento para a geração de microesferas.

Macromoléculas

As macromoléculas que podem ser utilizadas para aformação de microesferas de acordo com os métodos providos napresente invenção incluem uma variedade de agentesterapêuticos, agentes de diagnóstico, agentes nutritivos eoutros agentes ativos. Os agentes terapêuticos incluemantibióticos, vacinas, hematopoiéticos, agentesantiinfectivos, agentes antiúlcera, agentes antialérgicos,antipiréticos, analgésicos, agentes antiinflamatórios,agentes antidemência, agentes antivirais, agentesantitumorais, antidepressivos, agentes psicotrópicos,cardiotônicos, agentes antiarrítmicos, vasodilatadores,agentes anti-hipertensivos, agentes anti-diabéticos,anticoagulantes e agentes para a diminuição do colesterol.Outros exemplos de macromoléculas apropriadas incluemproteínas, peptídeos, ácidos nucléicos, carboidratos,conjugados de proteínas, vírus, partículas de vírus emisturas destes.

As macromoléculas podem ser caracterizadas por suacapacidade de interagir com o contraíon e o solventeorgânico, tal como o citrato (contraíon) e o isopropanol(solvente), para formar microesferas distintas e intactas quecontêm um teor elevado de macromoléculas. 0 teor demacromoléculas nas microesferas pode variar deaproximadamente ou em 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%,75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,99% ou em um peso/peso maior de microesferas. Em algumasrealizações, o teor de macromoléculas da microesfera ésubstancialmente o mesmo que a quantidade de macromoléculainicialmente na solução, antes da formação de microesferas.

As macromoléculas utilziadas para prepararmicroesferas pelos métodos providos na presente invençãopodem incluir peptideos, incluindo polipeptídeos e proteínas,carboidratos, incluindo os polissacarídeos e os ácidosnucléicos (DNA, RNA ou PNA) . Em algumas realizações, asmacromoléculas são proteínas, incluindo proteínasterapêuticas tais como DAS181 (a proteína de fusão desialidase que tem a seqüência dos resíduos de aminoácidodeterminados na SEQ ID N0.: 17), alfal-antitripsina, PI8,eglina c, Ecotin, aprotinina, DNase humano recombinante,insulina, interferons, dNAse humano recombinante (rhDNAse,útil, por exemplo, no tratamento da fibrose cística como umainalação terapêutica (Genentech); vide também Shak et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 87: 9188-9192 (1990)), albuminado soro humana, hormônio humano do crescimento, hormônioparatireóide e calcitonina. Em algumas realizações, aproteína é DAS181, o contraíon é sulfato de sódio ou citratode sódio e o solvente orgânico é isopropanol.

Os métodos providos na presente invenção podemevitar a utilização de condições tais como o aquecimento, quepode desnaturar a proteína e reduzir sua atividade. Asmicroesferas apresentadas de acordo com os métodos providosna presente invenção podem, portanto, ser utilizadas parapreparar vacinas ou outras medicações terapêuticas querequerem que as proteínas ou os peptideos estejam presentesem sua conformação nativa.

A concentração de macromoléculas na solução,utilizada durante a precipitação das microesferas, pode estarentre aproximadamente ou em 0,1 mg/ml a aproximadamente ou em0,2, 0,5, 0,8, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 12,0, 15,0, 20,0, 25,0,30,0, 35,0, 40,0, 45,0, 50,0, 60,0, 70,0, 80,0, 90,0, 100 OU200 mg/ml. Em algumas realizações, a concentração está entreaproximadamente ou em 1 mg/ml e de aproximadamente ou em 20mg/ml. Dependendo das características das macromoléculas (pl,hidrofobicidade, solubilidade, estabilidade, etc. ) e outrosparâmetros do processo, a concentração de macromoléculas podeser empiricamente determinada para conseguir a formação demicroesferas de um tamanho desejado. Em geral, asmacromoléculas com solubilidade mais baixa no solvente(geralmente, solvente aquoso) antes de adicionar o contraíone o solvente orgânico podem ser utilizadas a concentraçõesmais baixas (em 0,1 - 5 mg/ml) para formar as microesferas deacordo com os métodos na presente invenção, sendo que asmacromoléculas com solubilidade mais elevada podem serutilizadas a 1 - 20 mg/ml ou mais. Se a formação de agregadosamorfos ou de microesferas agregadas for observada, aconcentração de macromoléculas geralmente deve ser diminuídapara reduzir ou impedir tal agregação.

Natureza e concentração do contraíonQ contraíon pode ser qualquer composto capaz deneutralizar um ou mais grupos carregados opostamente namacromolécula ao pH em que o método é executado. Dependendodas características das macromoléculas (pK, pl, natureza equantidade de grupos carregados, distribuição de grupos decarga na superfície, solubilidade e estabilidade estruturalsob condições de pH diferentes) , o pH pode ser empiricamentedeterminado para a formação de microesferas. Em geral, se aprecipitação for executada a um pH abaixo do pK dasmacromoléculas, os contraíons aniônicos podem ser utilizados.Em geral, se a precipitação for executada em um pH acima dopK das macromoléculas, os contraíons catiônicos podem serutilizados. O contraíon pode ser empiricamente selecionadocom base em sua adequabilidade para iniciar a formação demicroesferas. Em algumas realizações, o contraíon pode ter umpeso molecular de 60 Da ou mais ou aproximadamente 75 Da oumais.

Os contraíons podem ser aniônicos, catiônicos ouswiteriônicos. Os contraíons aniônicos podem ser inorgânicos(fosfato, sulfato, tiocianato, tiossulfato, hipoclorato,nitrato, bromo, iodo, etc.) ou compostos orgânicos quecarregam grupos polarizáveis por carga incluindo enol,hidróxi, -SH, carboxílico, carboximetila, sulfopropila,sulfônico e fosfórico. Os compostos orgânicos que carregamoutros grupos aniônicos ou que têm carga negativa devido aoutras características moleculares também podem serutilizados. Os compostos que podem ser utilizados comocontraíons aniônicos também incluem, mas não são limitados aoseguinte: oxaloacetato, malato, maleato, oxalato, piruvato,citrato, succinato, fumarato, cetoglutarato, ácidobutanotricarboxílico, ácido hidromucônico, ácidociclobutanodicarboxílico, maleato de dimetila, ácidodeoxirribonucléico, ácido poliglutâmico, ácido fólico, ácidoláctico, ácido ascórbico, ácido carmínico, ácido sórbico,ácido malônico, EDTA, MOPS, TES, MES, PIPES, piridina,tricina, glicina, glicilglicina, betaína, ácido sulfúrico,ácido tiossulfúrico, ácido fosfórico, trifosfato deadenosina, ácido nítrico, ácido itacônico, ácido piválico,ácido dimetilmalônico e ácido perclórico. Em algumasrealizações, os ácidos itacônico, piválico, dimetilmalônico esuccínico são utilizados como contraíons nos métodos proveramha presente invenção.

Os contraíons catiônicos podem ser inorgânicos(amônio, fosfônio, sulfônio, césio, rubídio, etc.) oucompostos orgânicos que carregam os grupos conhecidos comoamina, amida, imina, imida, guanidina, imidazol, dioxano,anilina. Os compostos orgânicos que carregam outros gruposcatiônicos ou que têm a capacidade de polarização de cargapositiva devido a outras características moleculares tambémpodem ser utilizados. Os compostos que podem ser utilizadoscomo contraíons catiônicos também incluem, mas não sãolimitados ao seguinte: Tris, Bis-Tris, Bis-Tris propano,diaminopropano, piperazina, piperadina, pentilamina,diaminobutano, propilamina, trimetilamina, trietilamina,espermina, espermidina, putrescina, cadaverina, etanolamina,dietanolamina, trietanolamina, imidazol, tetrametilamônio,trimetilamônio, amônio, césio, rubídio, imidazol,polietileneimina, DEAE, TEAE, QAE.

Os contraíons switeriônicos que têm todos os gruposcarregados em qualquer combinação também podem serutilizados. Os compostos que podem ser utilizados comocontraíons switeriônicos incluem, mas não são limitados aoseguinte: HEPES, BICINE, glicina, glicilglicina, ácido 6-aminohexanóico, ácido piperídico, aminoácidos naturais e não-naturais (por exemplo, histidina, glutamina, arginina,lisina).

Os contraíons podem ser utilizados como ácidos (porexemplo, ácido sulfúrico) ou bases (por exemplo, imidazol) ouseus sais (por exemplo, sulfato de sódio ou imidazol-HCI). oscontraíons que podem ser utilizados nos métodos providos napresente invenção incluem aqueles relacionados pelo NationalFormulary, pela United States Pharmacopeia, pela JapanesePharmacopeia ou pela European Pharmacopeia, cuja segurançaclínica foi demonstrada (ácido cítrico, ácido málico,aminoácidos, sulfato, etc.). Em algumas realizações, oscontraíons utilizados nos métodos providos na presenteinvenção incluem aqueles para os quais a segurança foiestabelecida ou que se encaixam na categoria de GRAS(geralmente considerados como seguros). Os contraxons (ouseus sais) podem ser sólidos à temperatura ambiente (cerca de25°C) ou na temperatura de utilização e de armazenagempretendida. As combinações de dois ou mais contraíons tambémpodem ser utilizadas. Os contraxons voláteis e lxquidostambém podem ser utilizados nos métodos providos na presenteinvenção.

A concentração de contraxon é mantida geralmenteentre aproximadamente 0,1 mM e aproximadamente 0,2, 0,5, 0,8,1,0, 2,0, 3,0, 5,0, 7,0, 10,0, 15,0, 20,0, 30,0, 40,0, 50,0,60,0, 70,0, 80,0, 90,0 e 100,0 mM. Em algumas realizações, aconcentração de contraxon está entre aproximadamente ou em0,5 mM e de aproximadamente ou em 20 mM. Dependendo dascaracterísticas das macromoléculas (pl, hidrofobicidade,solubilidade, estabilidade, etc.) e outros parâmetros doprocesso, a concentração de contraxon pode ser empiricamentedeterminada utilizando, por exemplo, um formato de efluênciaelevada como provido na presente invenção. No geral, aformação de microesferas superdimensionadas, agregadosamorfos ou microesferas agregadas indica que a concentraçãode contraxon deve ser diminuída, quando falha em formarmicroesferas (cristais ou flocos similares a vidro quebrados)ou a formação de microesferas abaixo do tamanho desejadoindica que a concentração de contraxon deve ser aumentada.

Natureza e concentração do solvente orgânico

Um solvente orgânico adicionado ao coquetel nosmétodos providos na presente invenção geralmente pode sermiscível em água e selecionado entre os álcoois (metanol,etanol, 1-propanol, isopropanol, butanol, álcoolterbutílico), clorofórmio, cloreto de dimetila, álcoois deaçúcar poliídricos (glicerina, eritritol, arabitol, xilitol,sorbitol, manitol), hidrocarbonetos aromáticos, aldexdos,cetonas, ésteres, éteres (éter dietílico), alcanos (hexano,ciclohexano, éter de petróleo) , alquenos, dienos conjugados,tolueno, diclorometano, acetonitrilo, acetato de etila,polióis, poliimidas, poliésteres, polialdeídos e misturasdestes. Era algumas realizações, o solvente orgânico pode servolátil. Em outras realizações, quando a incorporação dosolvente orgânico nas microesferas é desejada, solventesorgânicos não-voláteis podem ser utilizados os quais provêm,por exemplo, novas características às microesferas (porexemplo, liberação prolongada ou resistência mecânicaadicionada). A concentração de solvente orgânico pode sergeralmente mantida entre aproximadamente ou era 0,1%, aaproximadamente ou era 0,5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%,30%, 40% ou 50% era volume/volume (v/v) . Em algumasrealizações, a concentração de solvente orgânico está entreaproximadamente ou em 1% a aproximadamente ou em 3 0%, v/v. Oscompostos orgânicos que são parcialmente miscíveis oucompletamente imiscíveis em água também podem ser utilizados.

Os solventes orgânicos que podem ser utilizados nosmétodos providos na presente invenção incluem os álcoois eoutros relacionados como solventes dos Tipos 3 e 2 naInternational Conference on Harmonisation (ICH) HarmonisedTripartite Guideline (Impurities: Guideline for ResidualSolvents), cuja manipulação segura foi estabelecida nasindústrias farmacêuticas e alimentícias.

Dependendo das características das macromoléculas(hidrofobicidade, solubilidade, estabilidade, etc. ) e outrosparâmetros do processo, a escolha e a concentração desolvente orgânico podem ser otimizadas, por exemplo,utilizando a varredura de efluência elevada em placas demicrotitulação ou em microplaquetas similares ou em outrodispositivo. Em geral, a precipitação descontrolada antes ^dainiciação do resfriamento, a formação de microesferassuperdimensionadas, os agregados amorfos, as microesferasagregadas ou os agregados pegajosos indicara que aconcentração de solvente orgânico deve ser diminuída, quandofalha em formar microesferas (cristais ou flocos similares avidro quebrados) ou a formação de microesferas abaixo dotamanho desejado indica que a concentração de solventeorgânico deve ser aumentada.

pH

Além de iniciar a formação de microesferas, ocontraion também pode servir como um tampão.Alternativamente, em algumas realizações, um composto detamponamento pode ser utilizado para obter o pH desejado. Emalgumas realizações, o composto de tamponamento é de 60 Da oumais. Dependendo das características das macromoléculas (pl,hidrofobicidade, solubilidade e estabilidade em um pHespecífico, etc.) e outros parâmetros do processo, o pH maisfavorável pode ser empiricamente ajustado para conseguir aformação de microesferas de dimensões desejadas e parapreservar a atividade das macromoléculas. Em geral, a falhaem formar microesferas (cristais ou flocos similares a vidroquebrados) indica que a proteína pode ser solúvel demais sobas condições utilizadas. A formação de agregados amorfos podeindicar que a precipitação não é bem controlada e a proteínapode não ser estável ou solúvel ao pH utilizado.

Quando a macromolécula é uma proteína, observou-seque determinadas combinações de proteína/contraíon podemcausar a precipitação imediata e descontrolada emdeterminados valores de pH. Os métodos de varredura deefluência elevada providos na presente invenção podem serutilizados para determinar empiricamente a combinação deproteína, do pH e do contraion apropriada para formarmicroesferas de dimensões desejadas. Isto é facilmentesolucionado ao alterar o pH do coquetel, utilizando umcontraíon diferente ou diminuindo a concentração de proteínano coquetel. Em geral, para formar microesferas com base emproteínas, um valor de pH que esteja abaixo do pl da proteínaprovê a formação mais favorável da microesfera.

Resistência iônica

A resistência iônica da solução de coquetel podeser modulada pela concentração de contraíon ou por outrossais tais como cloretos ou acetatos. Em algumas realizações,nenhum sal adicional é requerido para produzir microesferas.

Em determinadas realizações, a resistência iônica pode serajustada para preservar a integridade e a atividadeestruturais de macromoléculas. Exemplos de outras aplicaçõesonde a presença de sais específicos pode ser benéfica incluiformulações de drogas parenterais e de outras drogas ou dealimentos onde a capacidade específica de tonicidade ou detamponamento pode ser requerida quando da reconstituição dasmicroesferas.

Rampa de resfriamento

O coquetel que contém uma macromolécula, umcontraíon e um solvente orgânico é preparado inicialmente,antes da resfriamento, a uma temperatura em que amacromolécula é solúvel, geralmente aproximadamente -150C aaproximadamente 30°C. Em algumas realizações, a temperaturainicial, antes da resfriamento está à temperatura ambiente(18-25°C). As microesferas são formadas por um processo talcomo a precipitação, a separação de fase ou a formação decolóide quando da resfriamento gradual a uma temperaturaabaixo da temperatura em que a macromolécula é dissolvida nasolução. A taxa em que a resfriamento é executada podecontrolar a formação e outras características tais como otamanho das microesferas. Em geral, quando a macromolécula éuma proteína, o congelamento por evaporação em nitrogêniolíquido não gera microesferas.A taxa em que a resfriamento e o congelamento docoquetel (rampa de resfriamento) são executados podedeterminar o tamanho final das microesferas. Em geral, umarampa de resfriamento mais rápida resulta em microesferasmenores visto que uma rampa de resfriamento mais lentaresulta em microesferas maiores. Sem ser limitado porqualquer teoria, a taxa de resfriamento pode determinar ataxa de: (1) nucleação que produz microesferas menoresiniciais e (2) um processo de fusão em que as microesferasiniciais coalescem (são agregadas) e são recozidas emmicroesferas maiores. A fusão de partículas menores emmaiores é um processo dependente de tempo que pode serdeterminado, por exemplo, pela duração para a qual asuspensão líquida das microesferas existe antes de secongelar. Devido à natureza reversível das ligações entredeterminadas macromoléculas, tais como algumas proteínas, nascomposições de microesfera providas na presente invenção, asmicroesferas menores que são recozidas em partículas maiorespodem gerar microesferas com superfícies lisas. Dependendo dotamanho das micropartículas desejado, a taxa de resfriamentopode ser de aproximadamente 0,01°C/min ou de 0,01°C/min aaproximadamente 20°C/min ou a 20°C/min; de aproximadamente ouem 0,05°C/min ou de aproximadamente 0,1°C/min aaproximadamente ou a 10°C/min ou de aproximadamente 15°C/min,de aproximadamente ou a 0,2°C/min a aproximadamente ou a5°C/min, de aproximadamente ou a 0,5°C/min a aproximadamenteou a 2 o C/min ou de aproximadamente Io C/min. Em algumasrealizações, a rampa de resfriamento pode estar entre 0,1°Cpor minuto e aproximadamente 40oC por minuto. Em outrasrealizações, uma rampa de resfriamento pode estar entreaproximadamente 0,50C por minuto e 150C por minuto.

Dependendo das necessidades específicas, em algumasrealizações pode ser desejável adaptar o processo de produçãoao equipamento específico. Em algumas realizações, umliofilizador com prateleiras com a temperatura controladapode ser utilizado para refrigerar. Se as microesferasproduzidas forem maiores do que o desejado, outros parâmetrosdo processo incluindo a concentração de macromoléculas, osolvente orgânico, o contraíon, a resistência iônica e/ou opH podem ser modificados para conseguir a redução desejada notamanho das microesferas.

Para uma rampa de resfriamento mais rápida (tamanhomenor de partícula), a solução de coquetel pode ser passadaatravés de um trocador de calor, tal como aquele utilizado emum modo contínuo. Se o tamanho das microesferas necessitarser aumentado, as concentrações aumentadas de um dosingredientes do coquetel (macromolécula, solvente orgânico,contraíon) podem prover o aumento desejado no tamanho dasmicroesferas.

Em geral, a resfriamento deve ser executadauniformemente e a uma taxa constante para impedir a formaçãode agregados e de cristais. Dependendo da concentração desolvente orgânico, a precipitação de macromoléculas emmicroesferas pode ocorrer em diversas maneiras. Nasconcentrações mais elevadas do solvente orgânico(aproximadamente 5% - 4 0%, dependendo dos componentes reaisutilizados) as microesferas podem geralmente se formar quandoa solução de coquetel estiver ainda na forma líquida. Aconcentrações mais baixas do solvente orgânico (2 - 25%,dependendo dos componentes reais utilizados) , os cristais degelo podem se formar primeiramente, depois do que asmacromoléculas são expelidas e o solvente orgânico podealcançar uma concentração local crítica e se precipitar. Umadiminuição adicional da temperatura na próxima camadainferior da bandeja do liofilizador pode conduzir ao términoda solidificação da suspensão líquida e promover a expulsãodo solvente orgânico na camada superior. Um excesso desolvente orgânico na camada superior pode causar aprecipitação descontrolada de macromoléculas e a agregaçãodas microesferas. Este efeito geralmente pode ser aliviado aoselecionar relações apropriadas dos componentesmacromolécula, contraion, solvente orgânico, sais, etc. nocoquetel. Além disso, manter uma camada fina de coquetel nabandeja de liofilização ou misturar o coquetel ao resfriarpode impedir a formação de agregados e de cristais e resultarem microesferas uniformes. Por exemplo, se uma concentraçãorelativamente baixa de isopropanol (por exemplo, 2-6%) forutilizada e uma camada fina de coquetel (10-20 mM) forpreenchida na bandeja e a bandeja for colocada em umaprateleira pré-resfriada (-30 -75°C), microesferas uniformespoderão ser obtidas.

Os métodos providos na presente invenção podemconduzir à incorporação de substancialmente todas ou dequalquer proteína ou outra macromolécula da solução emmicroesferas.

Varredura de efluência elevada das condições deformação de micropartículas e otimização da formação departículas

Dependendo das características das macromoléculas,a composição da solução de coquetel utilizada para prepararas microesferas de acordo com os métodos providos na presenteinvenção pode ser otimizada.

A otimização pode ser rapidamente executada em um meio ou emum formato de efluência elevada utilizando, por exemplo, umaplaca de microtitulação ou microplaquetas onde dezenas acentenas a milhares a dezenas de milhares de coquetéis podemser selecionados simultaneamente. Em algumas realizações, umnúmero de valores de pH conjuntamente com contraíonscatiônicos, aniônicos ou switeriônicos e solventes orgânicosem várias concentrações pode ser selecionado. Por exemplo, aseleção pode ser executada utilizando diversas placas demicrotitulação idênticas, sendo que para cada uma delas amacromolécula de interesse é adicionada em váriasconcentrações. Cada conjunto de condições de teste pode serselecionado em duplicata. Em algumas realizações, asmicroplacas com cavidades de fundo liso podem ser utilizadascom a saia da placa de microtitulação partida para permitiruma boa transferência de calor entre a prateleira doliofilizador e os fundos das cavidades. As microplacas podemser colocadas nas prateleiras do liofilizador e serrefrigeradas para formar microesferas e subseqüentementesolidificar as suspensões. Quando do congelamento do conteúdodas cavidades, o vácuo pode ser aplicado. No fim daliofilização, uma das placas duplicadas pode serreconstituída com água ou um tampão de escolha para observarse determinadas condições tornaram a macromolécula insolúvelou reduziram sua atividade. As condições que resultaram nomaterial que pode ser facilmente ressolubilizado ou provermicroesferas com as características desejáveis podem sersubmetidas a uma análise adicional por meio de ensaiosespectroscópicos, cromatográficos, enzimáticos ou outros paraconfirmar que a estrutura e a atividade nativas estãopreservadas. O material liofilizado em uma placa duplicadapode ser utilizado para a microscopia para determinar se asmicroesferas estão formadas. As condições que produzirammicroesferas podem ser adicionalmente modificadas e ajustadasfinamente para produzir microesferas com tamanho ecaracterísticas desejáveis.

Os kits para a execução de varreduras de efluênciaelevada podem ser providos e podem conter todos osingredientes utilizados nos métodos providos na presenteinvenção incluindo uma ou mais de uma macromolécula, tal comouma proteína, tampões, coquetel pré-dispensado da composiçãoconhecida (solvente orgânico, contraíon) e/ou sais. Os kitspodem conter 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100 ou mais(tipicamente 96 ou mais) tampões com pH predeterminado,contraíon, resistência iônica e o solvente orgânico em cadaplaca de microtitulação. A placa de microtitulação providacom o kit pode ser modificada de modo que os fundos dascavidades estejam em contato direto com a prateleira doliofilizador.

C. Composições de Micropartículas Macromoleculares

As macromoléculas contidas nas composições demicropartícula obtidas pelos métodos providos na presenteinvenção são substancialmente estrutural e quimicamenteinalteradas pelos métodos. Por exemplo, quando amacromolécula é a Proteína Fluorescente Verde ou a ProteínaFluorescente Vermelha, sua fluorescência e conformação e aatividade nativa das proteínas é retida nas micropartículas.

As microesferas secas, obtidas ao volatilizarsubstancialmente todos os solventes e/ou umidade à exceção dosolvente e outros componentes associados com as microesferas,podem ser armazenados e sua atividade pode sersubstancialmente recuperada quando da reconstituição. 0 teorde umidade relativamente baixo das micropartículas providasna presente invenção, por exemplo, entre aproximadamente ouem 0,1% a aproximadamente ou em 0,2%, 0,3%, 0,5%, 1,0%, 2,0%,3,0%, 4,0%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5%, 8,0%, 8,5%,9,0%, 9,5%, 10,0%, 10,5%, 11,0%, 11,5%, 12,0%, 12,5%, 14%,15%, 16%, 17%, 18% 19% ou 20%, pode prover a estabilidadeaprimorada. As microesferas obtidas pelos métodos providos napresente invenção também são homogêneas no tamanho e noformato e podem ser obtidas de modo reprodutível com ascaracterísticas desejadas. Outras técnicas utilizadastradicionalmente para a preparação de formulações a seco(precipitação de sal, precipitação de álcool ou de acetona,liofilização, por exemplo) podem resultar na desnaturaçãocompleta ou parcial das macromoléculas, tais como asproteínas. Além disso, as microesferas preparadas pelosmétodos providos na presente invenção evitam a necessidade desecagem por pulverizador complexa ou especializada, secagempor pulverizador congelada, processos com base em anti-solvente de fluido supercríticos ou processos de moagem(vide, por exemplo, Laube BL. The expanding role of aerosolsin systemic drug delivery, gene therapy, and vaccination.Respir Care 2005; 50 (9) :1161-1176; Taylor G, Gumbleton M.Aerosols for Macromolecule Delivery: Design Challenges andSolutions. American Journal of Drug Delivery 2004; 2(3):143-155; Smyth HDC, Hickey AJ. Carriers in Drug Powder Delivery.Implications for Inhalation System Design. American Journalof Drug Delivery 2005; 3 (2) :117-132; Cryan SA. Carrier-basedstrategies for targeting protein and peptide drugs to thelungs. AAPS J 2005; 7(1):E20-E41; LiCalsi C, Maniaci MJ,Christensen T, Phillips E, Ward GH, Witham C. A powderformulation of measles vaccine for aerosol delivery. Vaccine2001; 19 (17-19) :2629-2636; Maa YF, Prestrelski SJ.Biopharmaceutical powders: particle formation and formulationconsiderations. Curr Pharm Biotechnol 2000; 1 (3) :283-302; MaaYF, Nguyen PA, Hsu SW. Spray-drying of air-liquid interfacesensitive recombinant human growth hormone. J Pharm Sci 1998;87 (2) : 152-159; Vanbever R, Mintzes JD, Wang J et al.Formulation and physical characterization of large porousparticles for inhalation. Pharm Res 1999; 16(11):1735-1742;Bot Al, Tarara TE, Smith DJ, Bot SR, Woods CM, Weers JG.Novel lipid-based hollow-porous microparticles as a platformfor immunoglobulin delivery to the respiratory tract. PharmRes 2000; 17 (3) :275-283; Maa YF, Nguyen PA, Sweeney T, ShireSJ, Hsu CC. Protein inhalation powders: spray drying vs sprayfreeze drying. Pharm Res 1999; 16(2):249-254; Sellers SP,Clark GS, Sievers RE, Carpenter JF. Dry powders of stableprotein formulations from aqueous solutions prepared usingsupercritical CO(2)-assisted aerosolization. J Pharm Sci2001; 90 (6) :785-797; Garcia-Contreras L, Morcol T, Bell SJ,Hickey AJ. Evaluation of novel particles as pulmonarydelivery systems for insulin in rats. AAPS Pharm Sci 2003;5(2):E9; Pfutzner A, Flaeke F, Pohl R et al. Pilot study withtechnosphere/PTH(1-34)-a new approach for effective pulmonarydelivery of parathyroid hormone (1-34). Horm Metab Res 2003;35(5) :319-323; Alcock R, Blair JA( 0'Mahony DJ, Raoof A,Quirk AV. Modifying the release of leuprolide from spraydried OED microparticles. J Control Release 2002; 82(2-3) :429-440 ; Grenha A, Seijo B, Remunan-Lopez C.Microencapsulated chitosan nanoparticles for Iung proteindelivery. Eur J Pharm Sei 2005; 25(4-5):427-437; Edwards DA,Hanes J, Caponetti G et al. Large porous particles forpulmonary drug delivery. Science 1997; 276(5320):1868-1871;McKenna BJ, Birkedal H, Bartl MH, Deming TJ, Stucky GD.Micrometer-sized spherical assemblies of polypeptides andsmall molecules by acid-base chemistry. Angew Chem Int EdEngl 2004; 43(42) :5652-5655; Oh M, Mirkin CA. Chemicallytailorable colloidal particles from infinite coordinationpolymers. Nature 2005; 438(7068): 651-654; Patente Norte-americana N°. 5.981.719; Patente Norte-americana N°.5.849.884 e Patente Norte-americana N°. 6.090.925; Pedido dePatente Norte-americano N°. 20050234114; Patente Norte-americana N° . 6.051.256).

As micropartícuias obtidas pelos métodos providosna presente invenção podem ser de qualquer formato e podemter tamanhos (largura ou diâmetros médios) na faixa deaproximadamente ou em 0,001 mícron a aproximadamente ou em0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5,1,0, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0,7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 35,0,40,0, 45,0 ou 50,0 micra ou mais. Para a administraçãopulmonar aos alvéolos, o tamanho pode ser de aproximadamente0,1 mícron ou menos a aproximadamente 0,5 mícron. Para aadministração pulmonar à garganta, à traquéia e aosbrônquios, o tamanho pode estar de aproximadamente ou em 0,5micron a aproximadamente ou em 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5,4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 ou 6,5 micra ou, em algumasrealizações, de aproximadamente ou em 1,0 mícron aaproximadamente ou em 2,0 micra. Em algumas realizações, asmicropartícuias são de formato substancialmente esférico.

As macromoléculas que podem ser utilizadas paraformar micropartículas de acordo com os métodos providos napresente invenção podem incluir agentes terapêuticos eagentes de diagnóstico, alimentos processados, suplementosdietéticos e polímeros. Em algumas realizações, os agentes dereticulação, os sais ou outros compostos podem ser incluídosno coquetel da formulação para modificar a solubilidade dasmicroesferas e/ou para intensificar sua força mecânica. Emalgumas realizações, as microesferas que são insolúveis namaioria dos solventes aquosos ou orgânicos podem serutilizadas para manufaturar partículas tais como resinascromatográficas e abrasivos dispersíveis. Em outrasrealizações, as microesferas com solubilidade parcial nossolventes tais como veículos farmacêuticos para a aplicaçãopodem ser úteis na manufatura do agente ativo de liberaçãoprolongada ou formulações terapêuticas.

Em algumas realizações, as micropartículas providas napresente invenção podem ser utilizadas em combinação com umdispositivo de inalador para aplicar uma dose terapêutica demicroesferas macromoleculares às vias respiratórias e aospulmões de um indivíduo. Por exemplo, quando a macromoléculaé a proteína DAS181 (seqüência determinada na SEQ ID N0.:17), as microesferas de aproximadamente 0,5 mícron aaproximadamente 8 micra ou de aproximadamente 1 mícron aaproximadamente 5 micra podem ser obtidas pelos métodosprovidos na presente invenção, utilizando o sulfato de sódiocomo o contraíon e o isopropanol como o solvente orgânico.Para as microesferas DAS181, que são administradas paraimpedir ou tratar as infecções virais que iniciam no tratorespiratório, tal como o influenza, pode ser desejáveldepositar as microesferas na garganta, na traquéia ou nosbrônquios. A proteína de fusão DAS181 formulada comomicroesferas pode agir ao degradar os ácidos siálicos doreceptor na garganta/traquéia/brônquios, desse modo impedindoa ligação viral e a infecção nestes sítios. Para a aplicaçãomais favorável das microesferas DAS181 aos sítios onde ainfecção viral respiratória pode ser iniciada, isto é, nagarganta, na traquéia ou nos brônquios, as microesferas nãodevem ser (a) tão grandes que fiquem presas na extremidadeanterior na boca (isto é, as microesferas são grandes demais,com aproximadamente 8 micra ou mais); ou (b) tão pequenas quesejam absorvidas profundamente nos pulmões e sejamsistemicamente absorvidas na corrente sangüínea através dosalvéolos onde não são ativas e/ou podem ser tóxicas (isto é,0,5 mícron ou menos). Para a aplicação das microesferasDAS 181 à garganta, à traquéia e aos brônquios, uma faixa detamanho de aproximadamente 1 mícron a aproximadamente 5,5-6micra geralmente pode ser apropriada.

O inalador pode ser utilizado para tratar qualquercondição médica em que a proteína ou outra macromoléculapossa ser administrada pela terapia de inalação. Osdispositivos de inalador típicos podem incluir inaladores empó secos, inaladores com medidor de dose e dispositivos deaplicação eletrostática. As aplicações típicas do aparelho deaplicação incluem a aplicação profunda nos pulmões deinsulina e de outras proteínas terapêuticas.

Em algumas realizações, as microesferas obtidaspelos métodos providos na presente invenção também podem seraplicadas por meio de ingestão oral, intranasalmente,intravenosamente, intramuscularmente, subcutaneamente e poroutros métodos de aplicação apropriados para a aplicação demoléculas terapêuticas. As formulações de microesfera para aaplicação pulmonar podem estar geralmente em uma faixa detamanho de aproximadamente 0,5 mícron a aproximadamente 5-6micra, sendo que aquelas projetadas para outros tipos deaplicação, tais como a aplicação subcutânea, aplicaçãoparenteral ou aplicação intramuscular podem estar em umafaixa de aproximadamente ou em 10 micra a aproximadamente ouem 30, 40 ou 50 micra.

Em algumas realizações, as microesferas providas napresente invenção não têm nenhum efeito terapêutico direto,mas podem servir como microportadores para outro(s) agente(s)terapêutico(s). Os exemplos de macromoléculas úteis para apreparação de tais microesferas incluem, mas não se limitamaos polissacarídeos, glicanos, proteínas, peptídeos,polímeros ou combinações destes. Os agentes terapêuticos ououtros agentes ativos podem ser adicionados quando daformação de microesfera ou ser adicionados à suspensão demicroesferas formada. Alternativamente, os agentesterapêuticos podem ser misturados com as composições demicroesfera secas por meio das técnicas de mistura, lavagemem tambor ou outras técnicas praticadas nas indústriasfarmacêuticas e alimentícias.

Em algumas realizações, os agentes de reticulação,as substâncias lipof ílicas, os sais tais como aqueles comsolubilidade fraca em solventes aquosos ou as combinaçõesdestes ou outros compostos podem ser incluídos na solução decoquetel da formulação para modificar a solubilidade dasmicroesferas e/ou para intensificar sua força mecânica. Adissolução lenta das microesferas pode ser útil na liberaçãoprolongada da terapêutica aplicada por meio de ingestão oral,inalação, intranasalmente, intravenosamente,intramuscularmente, subcutaneamente e por outros métodos deaplicação apropriados para a aplicação de moléculasterapêuticas. Em algumas realizações, as microesferas podemser aplicadas por meio de ingestão oral em uma forma de umapílula ou uma cápsula com um revestimento entérico,endocitosado a partir do duodeno, e a macromolécula éliberada na corrente sangüínea ou outro sítio de ação.

Em algumas realizações, as microesferas podem sertornadas insolúveis pela desnaturação parcial damacromolécula, que quando da aplicação se torna novamentenaturada e biodisponível.

Em outras realizações, as microesferas sãosubstancialmente esféricas no formato e podem ter diâmetrosmédios dentro da faixa de aproximadamente 0,1 mícron a 3 0,0micra. Contudo, em outras realizações, o diâmetro médio dasmicroesferas pode estar dentro da faixa de aproximadamente0.5 mícron a 5,0 micra ou de aproximadamente 1,0 mícron a 2,0micra.

Contudo, em um outro aspecto, são providos napresente invenção os dispositivos e os métodos para aplicaras microesferas a um indivíduo, tal como um paciente animalou humano com necessidade de tratamento médico. As viasapropriadas de aplicação podem incluir a via parenteral, como1.m., i.v. e s.c. e não-parenteral, como oral, bucal,intratecal, nasal, pulmonar, transdermal, transmucosal eoutros vias de aplicação similares. Os dispositivos deaplicação podem incluir seringas, com e sem agulha, einaladores.Os dispositivos de aplicação podem conter uma únicadose de microesferas para tratar uma condição que sejatratável pela liberação rápida ou prolongada da macromoléculain vivo. O número das microesferas presentes na dose única édependente do tipo e da atividade da macromolécula. A doseúnica pode ser selecionada para conseguir a liberaçãoprolongada durante um período de tempo que foi otimizado parao tratamento da condição médica particular. Por exemplo,quando a macromolécula é a proteína de fusão DAS181 (SEQ IDN0.: 17), a dosagem de aplicação das composições demicroesfera que contêm DAS181 pode ser entre aproximadamente0,5 mg de proteína por dose a aproximadamente 100 mg deproteína por dose ou aproximadamente 0,75 mg, 1 mg, 1,5 mg, 2mg, 3 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 45 mg, 50mg, 55 mg ou 60 mg de proteína por dose.

O componente da macromolécula da microesfera podeser qualquer molécula capaz de formar microesferas de acordocom os métodos providos na presente invenção. Em algumasrealizações, a macromolécula é uma proteína, incluindoenzimas e proteínas recombinantes, peptídeos, carboidratos,polissacarídeos, conjugados de proteína-carboidrato ou depolissacarídeo-proteína, ácidos nucléicos, vírus, partículasde vírus, conjugados de moléculas pequenas (tais como umhapteno) e de proteínas ou misturas destes. Uma droga oucomposto orgânico ou inorgânico farmacêutico natural ousintético pode ser incorporado nas microesferas ao unir adroga a uma macromolécula, tal como uma proteína e entãoformar as microesferas a partir do complexo ou do conjugadode macromolécula-droga. Será compreendido pelos elementosversados na técnica que um composto incapaz de ter umaestrutura terciária e quaternária pode ser formado em ummicroesfera pela incorporação ou acoplamento do composto emuma molécula do portador que tenha uma estrutura terciária equaternária. Será compreendido adicionalmente pelos elementosversados na técnica que a macromolécula pode ser uma porçãode uma molécula como, por exemplo, um peptídeo, um segmentode cordão único de uma molécula de cordão duplo do ácidonucléico ou uma partícula de vírus ou outra macromolécula quetem uma estrutura terciária e quaternária.

O termo "macromolécula" também pode incluir umapluralidade de macromoléculas e inclui combinações demacromoléculas diferentes tais como uma combinação de umcomposto farmacêutico e de uma molécula de afinidade paraalvejar o composto farmacêutico a um tecido, um órgão ou umtumor que requer tratamento. Uma molécula de afinidade podeser, por exemplo, um ligando ou um receptor. Os exemplos deligandos podem incluir vírus, bactérias, polissacarídeos outoxinas que podem agir como antígenos para gerar uma respostaimune quando administrados a um animal e causar a produção deanticorpos.

Em algumas realizações, a macromolécula é umaproteína terapêutica incluindo, mas não se limitando a umasialidase, uma proteína de fusão de sialidase, uma proteínade fusão que contém um domínio catalítico de sialidasefundido a um domínio de ligação de GAG, uma protease, uminibidor de protease, uma insulina, interferons, hormônio docrescimento humano, calcitonina, rhDNase ou hormônio daparatireóide e o teor de proteína das microesferas pode estarde aproximadamente ou em 50% a aproximadamente ou em 60%,65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oumais. Para a administração pulmonar, as microesferas podemter um tamanho médio na faixa de aproximadamente ou em 0,5mícron a aproximadamente ou em 5,0 micra e em algumasrealizações, entre aproximadamente ou em 1 mícron eaproximadamente ou em 2 micra.

Outras proteínas que podem ser utilizadas paraformar microesferas pelos métodos providos na presenteinvenção podem incluir, mas não se limitam a proteínasterapêuticas incluindo DAS181 (DAS181; SEQ ID N0.: 17), al-antitripsina, Ecotin, eglina c, serpina, Pulmozyme (rhDNase) ,betaxolol™, diclofenac™, doxorubicina, acetil cisteína,rifampin™, acetato de leuprolide, hormônio de liberação dohormônio luteinizante (LHRH), (D-Tryp6)-LHRH, acetato denafarelina, insulina, insulina de sódio, insulina de zinco,protamina, lisozima, alfa-lactalbumina, fator básico docrescimento de fibroblastos (bFGF), beta-lactoglobulina,tripsina, calcitonina, hormônio da paratireóide, anidrasecarbônica, ovalbumina, albumina de soro bovino (BSA),albumina de soro humano (HSA), fosforilase b, fosfatasealcalina, beta-galactosidase, IgG, fibrinogênio, poli-L-lisina, IgM, DNA, acetato de desmopressina, fator deliberação do hormônio do crescimento (GHRF), somatostatina,antide, fator VIII, G-CSF/GM-CSF, hormônio humano docrescimento (hGH), beta interferon, antitrombina III, alfainterferon, alfa interferon 2b.

Um dispositivo de inalador pode ser utilizado paraaplicar uma proteína terapêutica tal como aquelasrelacionadas acima ou outras microesferas com base emmacromolécula às vias respiratórias e aos pulmões de umindivíduo. As microesferas de proteína podem ser preparadas,por exemplo, ao colocar em contato uma solução aquosa daproteína com um ácido carboxílico tal como o citrato ou osulfato ou outro contraíon e um solvente orgânico tal como oisopropanol e refrigerar a solução para formar asmicroesferas. A proteína pode ser uma proteína, tal como umasialidase, um inibidor terapêutico de protease, uma insulina,hormônio humano do crescimento, calcitonina, rhDNase ou dohormônio da paratireóide, e o teor de proteína dasmicroesferas pode estar em aproximadamente ou em 70% aaproximadamente ou em 90% ou mais, 95% ou mais ou pelo menosaproximadamente 99% ou mais. Para a administração pulmonar,as microesferas, por exemplo, as microesferas DAS181, podemser feitas sob medida para ter um diâmetro médio na faixa deaproximadamente 0,5 mícron a 5,0 micra ou entreaproximadamente 1 micron a aproximadamente 2 micra.

As condições de incubação para formar asmicroesferas podem ser otimizadas para incorporar pelo menosaproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais da quantidade total demacromolécula presente na solução antes da formação dasmicroesferas, ajustando parâmetros incluindo o pH, atemperatura, a concentração da macromolécula ou a duração dareação ou a incubação.

Em algumas realizações, uma molécula ou compostoque não produza microesferas de características desejáveispode ser incorporado nas microesferas que têm característicasdesejáveis, por exemplo, de tamanho, perfil de aplicação,força mecânica, pela incorporação ou acoplamento do compostocom uma molécula do portador que possa formar microesferascom características desejáveis. Em algumas realizações, amacromolécula do portador é uma proteína, e a molécula ou ocomposto é ligado dentro e/ou na superfície da microesfera.Em algumas realizações, a molécula ou composto também podeservir como o contraíon e iniciar e/ou facilitar a formaçãodas microesferas.

Ao preparar as microesferas que contêm umaproteína, um estabilizador da proteína tal como o glicerol,os ácidos graxos, os açúcares tais como a sacarose, os íonstais como o zinco, o cloreto de sódio ou todos os outrosestabilizadores de proteína conhecidos pelos elementosversados na técnica podem ser adicionados antes de refrigeraro coquetel durante a formação de microesfera para minimizar adesnaturação da proteína.

Em algumas realizações, as microesferas podem seradicionalmente revestidas na superfície com moléculasapropriadas e/ou agentes de revestimento, tais como aquelasque emprestam a resistência aos ácidos, tais como os ácidosdigestivos ou as proteases. Em outras realizações, asmicroesferas podem ser revestidas de modo não-covalente comos compostos tais como os ácidos graxos ou lipídeos. Orevestimento pode ser aplicado às microesferas pela imersãona substância de revestimento solubilizada, pulverizandoentão as microesferas com a substância ou utilizando outrosmétodos conhecidos pelos elementos versados na técnica. Emalgumas realizações, os ácidos graxos ou os lipídeos sãoadicionados diretamente à solução de coquetel de formação demicroesfera.

A formação das microesferas ao diminuir atemperatura pode ser executada por uma variedade de métodosconvencionais em batelada ou em modos contínuos. A formaçãode microesfera pode ser adicionalmente provocada por outrosmétodos incluindo, mas não se limitando à modulação dapressão atmosférica, expansão da força G ou da superfície,incluindo a semeadura. A formação de microesfera pode ocorrerimediatamente quando da exposição a estas condições ou poderequerer um período de tempo prolongado como provido napresente invenção.

Proteínas

As proteínas exemplificadoras que podem serutilizadas para formar micropartículas pelos métodos providosna presente invenção são descritas abaixo.

Sialidases

Sialidases, também denominada como neuraminidases eN-acilneuraminosilglicoidrolases, são as exoglicosidases deuma família que catalisa a remoção de resíduos de ácidosiálico terminais de sialo-glicoconjugados. Os ácidossiálicos são uma família de ácidos α-ceto com as cadeiasprincipais de 9 carbonos que são encontradas geralmente nasposições mais externas das cadeias de oligossacarídeo unidasàs glicoproteínas e aos glicolipídeos. Estas moléculas sãoenvolvidas em uma variedade de funções e processosbiológicos, tais como a regulação da imunidade inata, aaderência celular e a interação entre as células e as célulasalvo, possivelmente mediados através da ligação de váriaslectinas (Varki et al. (1992) Curr Opin Cell Biol. 4:257-266). Os ácidos siálicos são também excelentes fontes decarbono, nitrogênio, energia e os precursores da biossínteseda parede celular. Além disso, os ácidos siálicos nas célulaseucarióticas podem ser utilizados como os receptores ou osco-receptores para microorganismos patogênicos, incluindo,mas não se limitando ao vírus influenza, vírus parainfluenza,alguns coronavírus e rotavírus, Haemophilus influenzae,Streptococcus pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Moraxellacatarrhalis, Helicobacter pylori e Pseudomonas aeruginosa. Oelemento mais proeminente da família do ácido siálico é oácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac), que é o precursorbiossintético para a maioria dos outros tipos. Dois enlacesprincipais entre NeuSAc e os penúltimos resíduos de galactosedas cadeias laterais do carboidrato são encontrados nanatureza, Neu5Ac a(2,3)-Gal e Neu5Ac a(2,6)-Gal. Ambas asmoléculas Neu5Ac α(2,3)-Gal e Neu5Ac α(2,6)-Gal podem serreconhecidas pelo vírus influenza e ser utilizadas como oreceptor através do qual o vírus se liga e inicia a infecção.Os vírus humanos do influenza, no entanto, parecem preferir oNeu5Ac α (2,6)-Gal, sendo que os vírus aviários e eqüinos doinfluenza reconhecem predominantemente o Neu5Ac α (2,3)-Gal(Xto et al. (2000) Microbiol Immunol 44:423-730). 0 epitéliorespiratório humano expressa ambas as formas de ácidossiálicos, mas o ácido siálico ligado a α(2,6) é maisabundante do que o ácido siálico ligado a α(2,3). A baixaabundância de ácido siálico ligado a α(2,3) é maisprovavelmente a base para a barreira da espécie para o vírusaviário e indica que a redução do nível de um ácido siálicodo receptor expresso no epitélio das vias respiratóriasreduziria provavelmente a infectividade de um vírusinfluenza. Desse modo, as sialidases, que removem os resíduosde ácido siálico terminais dos sialo-glicoconjugados,apresentam-se como os agentes terapêuticos do vírus influenzapotenciais que funcionam para reduzir os níveis de ácidossiálicos do receptor. As sialidases também podem agir comoagentes terapêuticos para todos os outros patógenos queutilizam ácidos siálicos no processo da infecção incluindo,mas não se limitando a M. pneumoniae, M. catarrhalis, H.pylori, H. influenzae, S. pneumoniae, P. aeruginosa, vírusparainfluenza e alguns coronavírus e rotavírus.

As sialidases tendem a ser substratos altamenteespecíficos. Podem alvejar tipos particulares de moléculascomplexas, tais como glicoproteínas ou glicolipídeos; enlacesde açúcar específicos (por exemplo, 2-3, 2-6 ou 2-8); oupodem ser sensíveis à natureza do próprio enlace do açúcar(por exemplo, D-galactose, N-acetil-D-galactosamina). Asmoléculas do substrato incluem, mas não são limitadas aoligossacarídeos, polissacarídeos, glicoproteínas,gangliosídeos e moléculas sintéticas. Por exemplo, umasialidase pode clivar as ligações que têm enlaces α(2,3)-Gal,oí (2, 6) -Gal ou α (2, 8)-Gal entre um resíduo de ácido siálico eo restante de uma molécula do substrato. Uma sialidase tambémpode clivar alguns ou todos os enlaces entre o resíduo deácido siálico e o restante da molécula do substrato. Muitasproteínas de sialidase foram purificadas a partir dosmicróbios e eucariotas superiores e destes, diversos forammostrados para catalisar a remoção de resíduos ácidossiálicos terminais que podem servir como os receptores paramicroorganismos patogênicos. Por exemplo, entre as sialidasesbacterianas grandes estão aquelas que podem degradar osácidos siálicos do receptor do influenza Neu5Ac α (2,6)-Gal eNeu5Ac α(2,3)-Gal, incluindo as sialidases Clostridiumperfringens, Actinomyces viscosus, Arthrobacter ureafaciens,e Micromonospora viridifaciens. Outras sialidases que podemservir como os agentes terapêuticos incluem as sialidaseshumanas, tais como aquelas codificadas pelos genes NEU2 eNEU4.

Proteínas de fusão de GAG-Sialidase

As proteínas de fusão de GAG-sialidase são asproteínas que são compostas de uma proteína de sialidase ouporção cataliticamente ativa desta, fundidas a uma seqüênciade ligação de GAG ao glicosaminoglicano. Como tais, estasproteínas contêm eficazmente um domínio de ancoragem (aseqüência de ligação de GAG) e um domínio terapêutico (aproteína de sialidase ou a porção cataliticamente ativadesta). As proteínas de fusão de GAG-sialidase são projetadaspara se ligar ao epitélio e remover os ácidos siálicoscircunvizinhos e podem, portanto, ser utilizadas como umagente terapêutico contra os patógenos que utilizam ácidossiálicos no processo da infecção. A capacidade de a proteínade fusão se ligar ao epitélio aumenta sua retenção quando aproteína de fusão é administrada, por exemplo, como uminalante para tratar a infecção por influenza. A seqüência deligação de GAG age como um domínio de ancoragem do epitélioque amarra a sialidase ao epitélio respiratório e aumenta suaretenção e potência.

O sulfato de heparana, intimamente relacionado àheparina, é um tipo de glicosaminoglicano (GAG) que estáubiquamente presente nas membranas da célula, incluindo asuperfície do epitélio respiratório. Muitas proteínas seligam especificamente ao sulfato de heparina/heparana e asseqüências de ligação de GAG nestas proteínas foramidentificadas. Por exemplo, foi mostrado que as seqüências deligação de GAG do fator de plaquetas humanas 4 (PF4) (SEQ IDN0.: 3), interleucina humana 8 (IL8) (SEQ ID N0.: 4),antitrombina humana III (AT III) (SEQ ID N°.: 5), apoproteínahumana E (ApoE) (SEQ ID N°.: 6), proteína de célulamigratória angio-associada humana (AAMP) (SEQ ID N0.: 7) ouanfirregulina humana (SEQ ID N0.: 8) exibem afinidade elevadapara a heparina (Lee et at. (1991) PNAS 88:2768-2772; Gogeret al.. (2002) Biochem. 41:1640-1646; Witt et at. (1994) CurrBio 4:394-400; Weisgraber et at. (1986) J Bio Chem 261:2068-2076) . As seqüências de ligação de GAG destas proteínas sãodistintas de suas seqüências de ligação ao receptor, entãonão induzem as atividades biológicas associadas com asproteínas de comprimento cheio ou os domínios de ligação aoreceptor. Estas seqüências ou outras seqüências que podem seligar ao sulfato de heparina/heparana podem ser utilizadascomo domínios de ancoragem do epitélio nas proteínas de fusãode GAG-sialidase.

No contexto de uma proteína de fusão de GAG-sialidase, a sialidase pode incluir a proteína de sialidaseinteira ou uma porção cataliticamente ativa desta. Porexemplo, a proteína de fusão de GAG-sialidase pode conter aproteína de sialidase do aminoácido 901 de A. viscosusdeterminada na SEQ ID N0 . : 1. Em um outro exemplo, proteínade fusão de GAG-sialidase pode conter as 3 94 porçõescataliticamente ativas do aminoácido de uma proteína desialidase de A. viscosus determinada na SEQ ID N0.: 2. Aseqüência de ligação de GAG pode ser ligada à sialidase pormétodos recombinantes. Em alguns exemplos, a proteína defusão pode incluir um ligante do aminoácido, tal como quatroresíduos de glicina. Além disso, o enlace pode se dar atravésdo N- ou C-término da seqüência de ligação de GAG ou o N- ouC-térraino da sialidase. Os exemplos exemplificadores deproteínas de fusão de GAG-sialidase incluem aquelespolipeptídeos determinados nas SEQ ID N0.: 9-13 e 17. Em umexemplo adicional, a sialidase e os componentes de ligação deGAG da seqüência podem ser ligados utilizando ligantesquímicos ou do peptídeo, por meio de qualquer métodoconhecido no estado da técnica.

Inibidor de proteinase

O inibidor de proteinase 8 (PI8), também conhecidocomo Serpina B8, é um inibidor de protease de serina(serpina). As serpinas são uma grande superfamília deproteínas estruturalmente relacionadas que são expressas nosvírus, nos insetos, nas plantas e em organismos superiores,mas não nas bactérias ou leveduras. As serpinas regulam aatividade das proteases envolvidas em vários processosbiológicos, incluindo a coagulação, a fibrinólise, ainflamação, a migração de células e a tumorigênese. Contêm umlaço de sítio reativo exposto na superfície (RSL) , que agecomo uma "isca" para as proteases ao simular uma seqüência dosubstrato da protease. Na ligação da protease alvo à serpina,o RSL é clivado, depois do que a protease é ligada de modocovalente à serpina. A protease no complexo deserpina/protease recém-formado é inativa (Huntington et al(2000) Nature 4 07:923-926).

O PI8 é um elemento de uma subfamília de serpinasdas quais a ovalbumina da galinha é o arquétipo. Como outrasserpinas que pertencem a esta família, o PI8 não tem umaseqüência de sinal de N-terminal clivável típica, tendo porresultado uma proteína do aminoácido 374 (SEQ ID N0.: 14) quereside principalmente intracelularmente. Outros elementosdesta subfamília similar a ovalbumina humana incluem oinibidor do ativador de plasminogênio do tipo 2 (PAI-2),inibidor da elastase de neutrófilo de raonócito (MNEI),antigeno do carcinoma celular escamoso (SCCA)-I, leupina(SCCA)-2, maspina (PI5), inibidor de protease 6 (PI6),inibidor de protease (PI9) e bomapina (PIlO). Dentro destafamília, as serpinas PI6, PI8 e PI9 mostram a homologiaestrutural mais elevada (identidade do aminoácido de até 68%)(Sprecher et al. (1995) J Biol Chem 270:29854-29861). Foimostrado que o PI-8 inibe a tripsina, a trombina, o fator Xa,a subtilisina A, a furina e também a quimiotripsina in vitro.É liberado pelas plaquetas e parece estar envolvido naregulação da atividade da furina e, portanto, na agregaçãoplaquetária (LeBlond et al. (2006) Thromb Haemost 95:243-252).

Além de seu papel na regulação de processosbiológicos endógenos, tais como a coagulação, os inibidoresde protease de serina também podem funcionar para inibir asatividades biológicas de microorganismos exógenos. Porexemplo, foi mostrado que um número de inibidores de proteasede serina reduz a ativação do vírus influenza em célulascultivadas, embriões de galinha e nos pulmões de ratosinfectados. As serpinas se ligam às moléculas dehemaglutinina (HA) na superfície do vírus influenza e inibemsua atividade, reduzindo desse modo a infectividade do vírus.Por exemplo, inibidores de tripsina, como: aprotinina(Zhimov et al. (2002) J Virol 76:8682-8689), leupeptina(Zhimov et al. (2002) J Virol 76:8682-8689; Tashiro et al.(1987) J Gen Virol 68:2039-2043), inibidor da protease dasoja (Barbey-Morel et al. (1987) J Infect Dis 155:667-672),ácido e-aminocapróico (Zhimov et al.. 1982. Arch Virol73:263-272) e n-p-tosil-L-lisina clorometilcetona (TLCK)(Barbey-Morei et al. (1987) J Infect Dis 155:667-672), sendoque todos estas inibiram a infecção pelo vírus influenza esão agentes terapêuticos candidatos para a utilização notratamento da infecção pelo virus influenza. Desse modo, comoum inibidor relacionado à tripsina, o PI8 também pode serutilizado como um agente terapêutico no tratamento dainfecção pelo vírus influenza.

Agentes Ativos de Superfície

As composições providas na presente invenção podemconter um ou mais agentes ativos de superfície que sãoadicionados em uma quantidade suficiente para formar umaemulsão estável. A quantidade de agente ativo de superfícieapropriada é uma função da proteína não-desnaturada,opcionalmente agentes ativos adicionais para a aplicação eoutros componentes presentes na emulsão, uma vez que algunsagentes podem ter propriedades auto-emulsificantes e outrosagentes e componentes afetam a tensão de superfície.

Os agentes ativos de superfície para a utilizaçãona presente invenção são as substâncias que, quandodissolvidas em uma solução aquosa, reduzem a tensão desuperfície da solução ou a tensão interfacial entre a faseaquosa e a fase de óleo, para formar um óleo estável em águaou emulsão de água em óleo. As moléculas de tensoativo sãoanfifílicas e contêm grupos principais hidrofílicos e caudashidrofóbicas. As moléculas de tensoativo formam váriasestruturas macromoleculares em uma emulsão, tal como micelas,micelas inversas, bicamadas de lipídeo (Iipossomos) ecubossomos. A estrutura macromolecular exata que é formadadepende dos tamanhos relativos das regiões hidrofílicas ehidrofóbicas da molécula ativa de superfície. Em determinadasrealizações, o agente ativo de superfície é selecionado entreo lauril sulfato de sódio; laurato de sorbitano, palmitato desorbitano, estearato de sorbitano (disponível sob o nomecomercial Span® 20-40-60 etc.); polissorbatos tais como omonolaurato de sorbitano de polioxietileno (20) ,monopalmitato de sorbitano de polioxietileno (20) ,monoestearato de sorbitano de polioxietileno (20) (disponívelsob o nome comercial TWEENS® 20-40-60 etc.); cloreto debenzalcônio, fosfolipídeos de cadeia mista, lipídeoscatiônicos, oligolipídeos, fosfolipídeos, carnitinas,esfingosinas, esfingomielinas, ceramidas, glicolipídeos,lipoproteínas, apoproteínas, proteínas anfifílicas, peptídeosanfifílicos, polímeros sintéticos anfifílicos e combinaçõesdestes. Outros agentes ativos de superfície exemplificadorespara a utilização na presente invenção incluem, mas não sãolimitados a

i) Lipídeos naturais, isto é, Colesterol,Esfingosina e Derivados, Gangliosídeos, derivados deEsfingosina (soja), Fitoesfingosina e derivados (Leveduras) ,Colina (fosfatidilcolina) , etanolamina(Fosfatidiletanolamina), Glicerol (Fosfatidil-DL-glicerol),Inositol (Fosfatidilinositol), Serina (Fosfatidilserina (Salde Sódio)), Cardiolipina, Ácido Fosfatídico, Derivado de Ovo,Derivados de Liso (Mono Acila) (Lisofosfatídeos) ,Fosfolipídeos Hidrogenados, Extratos de Tecido de Lipídeo,

ii) Lipídeos sintéticos, isto é, Ácido GraxoAssimétrico, Ácido Graxo Simétrico - Série Saturada, ÁcidoGraxo Simétrico - Série lnsaturada, Acil Coenzima A (AcetoilCoenzima A, Butanoil Coenzima A, Crotanoil Coenzima A,Hexanoil Coenzima A, Octanoil Coenzima A, Decanoil CoenzimaA, Lauroil Coenzima A, Miristoil Coenzima A, PalmitoilCoenzima A, Estearoil Coenzima A, Oleoil Coenzima A,Araquidoil Coenzima A, Araquidonoil Coenzima A, BeenoilCoenzima A, Tricosanoil Coenzima A, Lignoceroil Coenzima A,Nervonoil Coenzima A, Hexacosanoil Coenzima A,

iii) Esfingolipídeos, isto é, Derivados de D-eritro(C-18) (Esfingosina, como: Esfingosina de D-eritro(sintética), Esfingosina-l-Fosfato, N,N-Dimetilesfingosina,Ν,Ν,Ν-Trimetilesfingosina, Esfingosilfosforilcolina,

Esfingomielina e Esfingosina Glicosilada), Derivados deceramida (Ceramidas, D-eritro Ceramida-I-Fosfato, CeramidasGlicosiladas), Esfinganina (Diidroesfingosina) (Esfinganina-I-Fosfato, Esfinganina (C20), D-eritro Esfinganina, N-Acil-Esfinganina C2, N-Acil-Esfinganina C8, N-acil-EsfinganinaC16, N-Acil-Esfinganina C18, N-Acil-Esfinganina C24, N-Aeil-Esfinganina C24:l), Esfingosina (C18) e Derivados deFosfolipidio (Glicosilados - Esfingosina) (Esfingosina, β D-Glucosil, Esfingosina, β D-Glucosil, Esfingosina, β D-Lactosil), Glicosilados - Ceramida (D-Glucosil- Sl-I1Ceramida (C8), D-Galactosil- Sl-I1 Ceramida (C8), D-Glucosil-Sl-I1 Ceramida (C12), D-Galactosil- Sl-I1 Ceramida (C12), D-Laetosil- Sl-I1 Ceramida (C12)), GlicosiladosFosfatidiletanolamina (1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-

Fosfoetanolamina-N-Lactose), Derivados de D-eritro (C17) (D-eritro Esfingosina, D-eritro Esfingosina-l-fosfato),Derivados de D-eritro (C20) (D-eritro Esfingosina), Derivadosde L-treo (C18) (L-treo Esfingosina, Safingol (L-treoDiidroesfingosina)), Derivados de Esfingosina (Ovo, Cérebro &Leite) (D-eritro-Esfingosina, Esfingomielina, Ceramidas,Cerebrosídeos, Sulfatídeos Cerebrais), Gangliosídeos(Estruturas de Gangliosídeos, Gangliosídeos - Cérebro Ovino,Gangliosídeos Glicosilados - Cérebro Suíno), Derivados deEsfingosina (Soja)(Glucosilceramida), Derivados deFitoesfingosina (Leveduras) (Fitoesfingosina, D-ribo-Fitoesfingosina-l-Fosfato, N-Acil Fitoesfingosina C2, N-AcilFitoesfingosina C8, N-Acil Fitoesfingosina C18,

iv) Acil Coenzima A, isto é, Acetoil Coenzima A(Sal de Amônio), Butanoil Coenzima A (Sal de Amônio),Crotanoil Coenzima A (Sal de Amônio), Hexanoil Coenzima A(Sal de Amônio), Octanoil Coenzima A (Sal de Amônio),Decanoil Coenzima A (Sal de Amônio), Lauroil Coenzima A (Salde Amônio), Miristoil Coenzima A (Sal de Amônio), PalmitoilCoenzima A (Sal de Amônio), Estearoil Coenzima A (Sal deAmônio), Oleoil Coenzima A (Sal de Amônio), AraquidoilCoenzima A (Sal de Amônio), Araquidonoil Coenzima A (Sal deAmônio), Beenoil Coenzima A (Sal de Amônio), TricosanoilCoenzima A (Sal de Amônio), Lignoceroil Coenzima A (Sal deAmônio), Nervonoil Coenzima A (Sal de Amônio), HexacosanoilCoenzima A (Sal de Amônio), Docosahexaenoil Coenzima A (Salde Amônio),

v) Lipxdeos oxidados, isto é, l-Palmitoil-2-Azelaoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina, 1-O-Hexadeeil-2-Azelaoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina, 1-Palmitoil-2-Glutaroil-sn-Glicero-3-Fosfocolina (PGPC), l-Palmitoil-2-(9'-oxo-Nonanoi1)-sn-Glieero-3-Fosfocolina, l-Palmitoil-2-(5'-oxo-Valeroil) -sn-Glicero-3-Fosfocolina,

vi) Lipideos de éter, isto é: Lipideos de Diéter(Dialquil Fosfatidilcolina, Lipídeos de Difitanil Éter),Alquil Fosfocolina (Dodecilfosfocolina), O-AlquilDiaeilfosfatidiIeolínio (1,2-Diacil-sn-Glicero-3-Etilfosfocolina), PAF Sintético & Derivados (l-Alquil-2-Acil-Glicero-3-Fosfocolina & Derivados),

vii) Lipídeos fluorescentes, isto é: com Base emGlicerol (Fosfatidilcolina (NBD), Ácido Fosfatidico (NBD),Fosfatidiletanolamina (NBD), Fosfatidilglicerol (NBD),Fosfatidilserina (NBD)), com Base em Esfingosina (Ceramida(NBD), Esfingomielina (NBD), Fitoesfingosina (NBD),Cerebrosideo de Galactosila (NBD)), Lipídeos Etiquetados doGrupo Principal (com Base em Glicerol) (Fosfatidiletanolamina(NBD), Fosfatidiletanolamina (Rodamina de Lissamina Β),Dioleoil Fosfatidiletanolamina (Dansila, Pirena,Fluoresceína), Fosfatidilserina (NBD), Fosfatidilserina(Dansila)), 25-NBD-Colesterol,

viii) Outros lipídeos incluindo, mas não selimitando à lecitina, Ultralec-P (ADM), Soja em pó,

ix) Tensoativos incluindo, mas não se limitando apolietileno glicol 4 00; Iauril sulfato de sódio; laurato desorbitano, palmitato de sorbitano, estearato de sorbitano(disponível sob o nome comercial Span® 20-40-60 etc.);polissorbatos tais como o monolaurato de sorbitano depolioxietileno (20), monopalmitato de sorbitano depolioxietileno (20), monoestearato de sorbitano depolioxietileno (20) (disponível sob o nome comercial TWEENS®20-40-60 etc.); cloreto de benzalcônio.

Em determinadas realizações, os fosfolipídeos paraa utilização são fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas,fosfatidilserinas, fosfatidilgliceróis, fosfatidilinositóis,ácidos fosfatídicos, fosfolipídeos de cadeia mista,lisofosfolipídeos, fosfolipídeos hidrogenados, fosfolipídeosparcialmente hidrogenados e misturas destes.

Em determinadas realizações, o agente ativo desuperfície é selecionado entre polissorbato-80, lecitina efosfatidilcolina. Os agentes ativos de superfície estãopresentes em uma quantidade suficiente para formar umaemulsão estável.

A quantidade do agente ativo de superfície pode serempiricamente determinada e é uma função do agenteselecionado e da forma desejada da composição resultante. Aquantidade incluída pode ser de menos de 0,1% em peso até 35%ou mais. Em determinadas realizações, o agente ativo desuperfície está presente a uma concentração deaproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%,20%, 25% em peso até aproximadamente 30% em peso do pesototal da composição. Em determinadas realizações, o agenteativo de superfície está presente a uma concentração deaproximadamente 1% em peso até aproximadamente 20% em peso dopeso total da composição. Em determinadas realizações, oagente ativo de superfície está presente a uma concentraçãode aproximadamente 1% em peso até aproximadamente 15% em pesodo peso total da composição. Em outras realizações, o agenteativo de superfície está presente a uma concentração deaproximadamente 1% em peso até aproximadamente 10% em peso dopeso total da composição. Em outras realizações, o agenteativo de superfície está presente a uma concentração deaproximadamente 1% em peso até aproximadamente 8% em peso dopeso total da composição. Em outras realizações, o agenteativo de superfície está presente a uma concentração deaproximadamente 1% em peso até aproximadamente 6% em peso dopeso total da composição. Em outras realizações, o agenteativo de superfície está presente a uma concentração deaproximadamente 1% em peso até aproximadamente 4% em peso dopeso total da composição. Em outras realizações, o agenteativo de superfície está presente a uma concentração deaproximadamente 2 0% em peso do peso total da composição. Emoutras realizações, o agente ativo de superfície estápresente a uma concentração de aproximadamente 15% em peso dopeso total da composição. Em outras realizações, o agenteativo de superfície está presente a uma concentração deaproximadamente 13% em peso do peso total da composição. Emoutras realizações, o agente ativo de superfície estápresente a uma concentração de aproximadamente 11% em peso dopeso total da composição. Em outras realizações, o agenteativo de superfície está presente a uma concentração deaproximadamente 8% em peso do peso total da composição. Emoutras realizações, o agente ativo de superfície estápresente a uma concentração de aproximadamente 6% em peso dopeso total da composição. Em outras realizações, o agenteativo de superfície está presente a uma concentração deaproximadamente 4% em peso do peso total da composição. Emoutras realizações, o agente ativo de superfície estápresente a uma concentração de aproximadamente 2% em peso dopeso total da composição. Em outras realizações, o agenteativo de superfície está presente a uma concentração deaproximadamente 1% em peso do peso total da composição.

As emulsões estáveis providas na presente invençãopodem conter um ou mais veículos de aplicação selecionadosentre micelas, lipossomos e cubossomos e misturas destes ouos conjuntos macromoleculares de proteínas não-desnaturadastais como tubos, hélices, esferas e outros ainda, que podemencapsular nutrientes adicionais ou agentes ativos. Osveículos de aplicação que encapsulam o agente ativo são entãoabsorvidos no epitélio onde as proteínas não-desnaturadase/ou os agentes ativos/nutrientes adicionais são aplicados.

Agentes adicionais opcionais

As composições providas na presente invenção podemopcionalmente conter, além das proteínas não-desnaturadas, umou mais agentes farmacêuticos ou nutracêuticos ou outros taisagentes para a ingestão por um indivíduo. Geralmente, osagentes são aqueles que têm uma função em um hospedeiro, porexemplo, regulação imune, regulação de processos bioquímicosou atividade enzimática. Qualquer agente que pode serformulado como descrito na presente invenção pode seradministrado nas composições providas na presente invenção.Onde o agente é terapêutico, as composições contêm umaquantidade terapeuticamente eficaz de um agente a seraplicado. A quantidade particular de agente ativo em umadosagem irá variar extensamente de acordo com a natureza doagente ativo, a natureza da condição que está sendo tratada,a idade e o tamanho do indivíduo e outros parâmetros.

Geralmente, a quantidade de agente ativo ou denutriente adicional além das proteínas não-desnaturadas nacomposição irá variar menos do que aproximadamente 0,01% empeso a aproximadamente 20% em peso da composição ou mais eserá formulada tipicamente para uma administração de dosagemúnica. Uma dosagem única pode variar de aproximadamente 0,01yg a 10 mg de um agente por quilograma de peso corpóreo dohospedeiro, sendo que dosagens de aproximadamente 0,1 ug a 1mg/kg são geralmente empregadas. Estas concentrações, noentanto, são somente diretrizes gerais e quantidades edosagens particulares podem ser selecionadas com base noagente ativo que está sendo administrado, na condição a sertratada, e o regime de tratamento que é empregado significauma quantidade de uma droga ou de um agente ativo que ésuficiente para prover o efeito desejado e o desempenho localou sistêmico em uma relação razoável de riso/benefício a umindivíduo que passa por qualquer tratamento médico.

Os agentes podem ser selecionados a partir dasdrogas inorgânicas e orgânicas incluindo, mas não selimitando às drogas que agem nos nervos periféricos,receptores adrenérgicos, receptores colinérgicos, sistemanervoso, músculos esqueletais, sistema cardiovascular,músculos lisos, sistema circulatório do sangue, sítiossinápticos, sítios juncionais neuroefetores, sistemaendócrino, sistemas hormonais, sistema imunológico, sistemareprodutor, sistema esqueletal, sistemas autocóides, sistemasdigestório e excretório, sistemas histamínicos e outrosainda. Os agentes ativos que podem ser aplicados utilizandoas composições providas na presente invenção incluem, mas nãosão limitados a anticonvulsivantes, analgésicos,antiparkinsonianos, antiinflamatórios, antagonistas decálcio, anestésicos, antimicrobianos, antimaláricos,antiparasíticos, anti-hipertensivos, anti-histamínicos,antipiréticos, agonistas alfa-adrenérgicos, alfa-bloqueadores, biocidas, bactericidas, dilatadores brônquicos,drogas de obstrução beta-adrenérgica, contraceptivos, drogascardiovasculares, inibidores do canal de cálcio,antidepressivos, agentes de diagnóstico, diuréticos,eletrólitos, enzimas, hipnóticos, hormônios, hipoglicêmicos,hiperglicêmicos, constritores musculares, relaxantesmusculares, neoplásticos, glicoproteínas, nucleoproteínas,lipoproteínas, oftálmicos, energizantes psíquicos, sedativos,esteróides, simpatomiméticos, parassimpatomiméticos,tranqüilizantes, drogas do trato urinário, vacinas, drogasvaginais, vitaminas, minerais, drpgas antiinflamatórias não-esteroidais, enzimas de conversão de angiotensina,polinucleotídeos, polipeptídeos, polissacarídeos esuplementos nutritivos incluindo os suplementos herbais.

O nível do agente a ser aplicado é

% até aproximadamente 50%,até aproximadamente

aproximadamente 0,01

aproximadamente 0,1%

aproximadamente 0,1%aproximadamente

até aproximadamente

40%30%20%10%9%8%7%6%5%4%3%

dededededededededededededededa

2 %

0,1% até aproximadamente 1% em pesocomposição. O agente a ser aplicado pode ser solúvel em água,ligeiramente solúvel em água ou solúvel em óleo. Emdeterminadas realizações, o agente a ser aplicado éselecionado entre os anticonvulsivantes, analgésicos,antiparkinsonianos, antiinflamatórios, antagonistas decálcio, anestésicos, antimicrobianos, antimaláricos,antiparasíticos, anti-hipertensivos, anti-histamínicos,antipiréticos, agonistas alfa-adrenérgicos, alfa-bloqueadores, biocidas, bactericidas, dilatadores brônquicos,drogas de obstrução beta-adrenérgica, contraceptivos, drogascardiovasculares, inibidores do canal de cálcio,antidepressivos, agentes de diagnóstico, diuréticos,eletrólitos, enzimas, hipnóticos, hormônios, hipoglicêmicos,hiperglicêmicos, constritores musculares, relaxantesmusculares, neoplásticos, glicoproteinas, nucleoproteínas,lipoproteinas, proteína do soro de leite não-desnaturada,oftálmicos, energizantes psíquicos, sedativos, esteróides,simpatomiméticos, parassimpatomiméticos, tranqüilizantes,drogas do trato urinário, vacinas, drogas vaginais,vitaminas, minerais, drogas antiinflamatórias não-esteroidais, enzimas de conversão de angiotensina,polinucleotídeos, polipeptídeos, polissacarídeos esuplementos nutritivos incluindo os suplementos herbais.

Em determinadas realizações, o agente ativo éselecionado como segue:

Agonistas α-adrenérgicos tais como Adrafinil,Adrenolone, Amidephrine, Apraclonidine, Budralazine,Clonidine, Cyclopentamine, Detomidine, Dimetofrine,Dipivefrin, Ephedrine, Epinephrine, Fenoxazoline, Guanabenz,Guanfacine, Hydroxyamphetamine, Ibopamine, Indanazoline,Isometheptene, Mephentermine, Metaraminol, MethoxamineHydrochloride, Methylhexaneamine, Metizolene, Midodrine,Naphazoline, Norepinephrine, Norfenefrine, Octodrine,Octopamine, Oxymetazoline, Phenylephrine Hydrochloride,Phenylpropanolamine Hydrochloride, Phenylpropylmethylamine,Pholedrine, Propylhexedrine, Pseudoephedrine, Rilmenidine,Synephrine, Tetrahydrozoline, Tiamenidine, Tramazoline,Tuaminoheptane, Tymazoline, Tyramine e Xylometazoline;Agonistas β-adrenérgicos tais como Albuterol,Bambuterol, Bitolterol, Carbuterol, Clenbuterol,Clorprenaline, Denopamine, Dioxethedrine, DopexamineiEphedrine, Epinephrine, Etafedrine, Ethylnorepinephrine,Fenoterol, Formoterol, Hexoprenaline, Ibopamine, Isoetharine,Isoproterenal, Mabuterol, Metaproterenol, Methoxyphenamine,Oxyfedrine, Pirbuterol, Prenalterol, Procaterol, Protokylol,Reproterol, Rimiterol, Ritodrine, Soterenol, Terbuterol eXamoterol;

α-bloqueadores adrenérgicos tais como Amosulalol,Arotinolol, Dapiprazole, Doxazosin, Ergoloid Mesylates,Fenspiride, Indoramin, Labetalol, Nicergoline, Prazosin,Terazosin, Tolazoline, Trimazosin e Yohimbine;

Bloqueadores β-adrenérgicos tais como Acebutolol,Alprenolol, Amosulalol, Arotinolol, Atenolol, Befunolol,Betaxolol, Bevantolol, Bisoprolol, Bopindolol, Bucumolol,Befetolol, Bufuralol, Bunitrolol, Bupranolol, hydrochloridede Butidrine, Butofilolol, carazolol, Carteolol, Carvedilol,Celiprolol, Cetamolol, Cloranolol, Dilevalol, Epanolol,Esmolol, Indenolol, Labetalol, Levobunolol, Mepindolol,Metipranalol, Metoprolol, Moprolol, Nadoxolol, Nifenalol,Nipradilol, Oxprenolol, Penbutolol, Pindolol, practolol,Pronethalol, propranolol, Sotalol, Sulfinalol, Talinolol,Tertatolol, timolol, Toliprolol e Xibenolol;

Impedidores de álcool tais como Calcium CyanamideCitrated, Disulfiram, Nadide e Nitrefazole;

Inibidores da reductase de aldose tais comoEpalrestat, Ponalrestat, Sorbinil e Tolrestat;

Anabólicos tais como Androisoxazole,Androstenediol, Bolandiol, Bolasterone, Clostebol,

Ethylestrenol; Formyldienolone, 4-Hydroxy-19-nortestosterone,Methandriol, Methenolone, Methyltrienolone, Nandrolone,

Nandrolone Decanoate, Nandrolone ρ-Hexyloxyphenylpropionate,Nandrolone Phenpropionate, Norbolethone, Oxymesterone,Pizotyline, Quinbolone, Stenbolone e Trenbolone;Analgésicos (dentais) como Chiorobutanol, cravo-da-índia e eugenol;

Analgésicos (narcóticos) tais como Alfentanil,Allylprodine, Alphaprodine, Anileridine, Benzylmorphine,Bezitramide, Buprenorphine, Butorphanol, Clonitazene,Codeine, Codeine Methyl Bromide, Codeine Phosphate, CodeineSulfate, Desomorphine, Dextromoramide, Dezocine, Diampromide,Dihydrocodeine, Dihydrocodeinone Enol Acetate,

Dihydromorphine, Dimenoxadol, Dimepheptanol,Dimethyithiambutene, Dioxaphetyl Butyrate, Dipipanone,Eptazocine, Ethoheptazine, Ethylmethlythiambutene,

Ethylmorphine, Etonitazene, Fentanyl, Hydrocodone,

Hydrocodone Bitartrate, Hydromorphone, Hydroxypethidine,Isomethadone, Ketobemidone, Levorphanol, Lofentanil,Meperidine, Meptazinol, Metazocine, Methadone Hydrochloride,Metopon, Morphine, Morphine Derivatives, Myrophine,Nalbuphine, Narceine, Nicomorphine, Norlevorphanol,

Normethadone, Normorphine, Norpipanone, Opium, Oxycodone,Oxymorphone, Papaveretum, Pentazocine, Phenadoxone,

Phenazocine, Pheoperidine, Piminodine, Piritramide,

Proheptazine, Promedol, Properidine, Propirarn, Propoxyphene,

Sufentanil e Tilidine;

Analgésicos (não-narcóticos) tais como

Acetaminophen, Acetaminosalol, Acetanilide,

Acetylsalicylsalicylic Acid, Alclofenac, Alminoprofen,Aloxiprin, Aluminum

Bis(acetylsalicylate),Aminochlorthenoxazin,2-Amino-4-picoline, Aminopropylon, Aminopyrine, Ammonium Salicylate,Antipyrine, Antipyrine Salicylate, Antrafenine, Apazone,Aspirin, Benorylate, Benoxaprofen, Benzpiperylon,Benzydamine, p-Bromoacetanilide, 5-Bromosalicylic AcidAcetate, Bucetin, Bufexamac, Bumadizon, Butacetin, CalciumAcetylsalicylate, Carbamazepine7 Carbetidine, Carbiphene,Carsalam, Chloralantipyrine, Chlorthenoxazin(e), CholineSalicylate, Cinchophen, Ciramadol, Clometacin, Cropropamide,Crotethamide, Dexoxadrol, Difenamizole, Diflunisal,

Dihydroxyaluminum Acetylsalicylate, Dipyroeetyl, Dipyrone,Emorfazone, Enfenamie Aeid, Epirizole, Etersalate,Ethenzamide, Ethoxazene, Etodolae, Felbinae, Fenoprofen,Floetafenine, Flufenamie Aeid, Fluoresone, Flupirtine,Fluproquazone, Flurbiprofen, Fosfosal, Gentisie Aeid,Glafenine,. Ibufenae, Imidazole Salicylate, Indomethaein,Indoprofen, Isofezolac, Isoladol, Isonixin, Ketoprofen,Ketorolae, p-Lactophenetide, Lefetamine, Loxoprofen, LysineAcetylsalicylate, Magnesium Acetylsalicylate,Methotrimeprazine, Metofoline, Miroprofen, Morazone,Morpholine Salicylate, Naproxen, Nefopam, Nifenazone, 5'Nitro-21 propoxyacetanilide, Parsalmide, Perisoxal,Phenacetin, Phenazopyridine Hydrochloride, Phenocoll,Phenopyrazone, Phenyl Acetylsalicylate, Phenyl Salicylate,Phenyramidol, Pipebuzone, Piperylone, Prodilidine,Propacetamol, Propyphenazone, Proxazole, Quinine Salicylate,Ramifenazone, Rimazolium Metilsulfate, Salacetamide, Salicin,Salicylamide, Salicylamide O-Acetic Aeid, SalicylsulfuricAeid, Salsalte, Salverine, Simetride, Sodium Salicylate,Sulfamipyrine, Suprofen, Talniflumate, Tenoxicam,Terofenamate, Tetradrine, Tinoridine, Tolfenamic Aeid,Tolpronine, Tramadol, Viminol, Xenbucin e Zomepirac;Androgênios tais como Androsterone, Boldenone,Dehydroepiandrosterone, Fluoxymesterone, Mestanolone,Mesterolone, Methandrostenolone, 17-Methyltestosterone, 17a-Methyltestosterone 3-Cyclopentyl Enol Ether, Norethandrolone,Norrnethandrone, Oxandrolone, Oxymesterone, Oxymetholone,Prasterone, Stanlolone, Stanozolol, Testosterone,Testosterone 17-Chloral Hemiacetal, Testosterone17β-Cypionate, Testosterone Enanthate, TestosteroneNicotinate, Testosterone Pheynylacetate, TestosteronePropionate e Tiomesterone;

Anestésicos tais como Acetamidoeugenol, AlfadoloneAeetate, Alfaxalone, Amueaine, Amolanone, AmyloeaineHydroehloride7 Benoxinate, Benzoeaine, Betoxyeaine,Biphenamine, Bupivaeaine, Butaeaine, Butaben, Butanilieaine,Burethamine, Buthalital Sodium, Butoxyeaine, Cartieaine, 2-Chloroprocaine Hydroehloride, Coeaethylene, Coeaine,Cyelomethyeaine, Dibueaine Hydroehloride, Dimethisoquin,Dimethocaine, Diperadon Hydroehloride, Dyelonine, Eegonidine,Eegonine, Ethyl Aminobenzoate, Ethyl Chloride, Etidoeaine,Etoxadrol, β-Eueaine, Euproein, Fenalcomine, Fomoeaine7Hexobarbital, Hexyleaine Hydroehloride, Hydroxydione Sodium,Hydroxyproeaine, Hydroxytetraeaine, Isobutyl p-Aminobenzoate,Kentamine, Leueinoeaine Mesylate, Levoxadrol, Lidoeaine,Mepivaeaine, Mepryleaine Hydroehloride, MetabutoxyeaineHydroehloride, Methohexital Sodium, Methyl Chloride,Midazolam, Myrteeaine, Naepaine, Octaeaine, Orthoeaine,Oxethazaine, Parethoxyeaine, Phenaeaine Hydroehloride,Pheneyelidine, Phenol, Piperoeaine, Piridoeaine, Polidocanol,Pramoxine7 Priloeaine7 Proeaine7 Propanidid7 Propanoeaine7Proparaeaine7 Propipocaine7 Propofol7 Propoxyeaine

Hydroehloride, Pseudococaine, Pyrroeaine, Quinine UreaHydoehloride7 Risoeaine7 Salieyl Aleohol, TetraeaineHydroehloride, Thialbarbital, Thimylal, Thiobutabarbital,Thiopental Sodium, Tolyeaine, Trimeeaine e Zolamine;

Antianoréxicos tais como Aminorex, Ampheeloral,Amphetamine, Benzaphetamine, Chlorphentermine, Clobenzorex,Cloforex, Clortermine, Cyclexedrine, DestroamphetamineSulfate, Diethylpropion, Diphemethoxidine, N-

Ethylamphetamine, Fenbutrazate, Fenfluramine, Fenproporex,Furfurylmethylamphetamine, Levophacetoperate, Mazindol,

Mefenorex, Metamfeproamone, Methamphetamine,Norpseudoephedrine, Phendimetrazine, Phendimetrazine

Tartrate, Phenmetrazine, Phenpentermine, Phenylpropanolamine

Hydrochloride e Picilorex;

Anti-helmínticos (Cestódeos) tais como Arecoline,Aspidin, Aspidinol, Dichlorophen(e) , Embelin, Kosin,Napthalene, Nielosamide, Pellertierine, Pellertierine Tannatee Quinaerine;

Anti-helmintieos (Nematódeos) tais comoAlantolactone, Amoscanate, Asearidole, Bephenium,Bitoseanate, Carbon Tetrachloride, Carvacrol, Cyclobendazole,Diethylcarbamazine, Diphenane, Dithiazanine Iodide,

Dymanthine, Gentian Violet, 4-Hexylresorcinol, Kainic Acid,Mebendazole, 2-Napthol, Oxantel, Papain, Piperazine,Piperazine Adipate, Piperazine Citrate, Piperazine EdetateCalcium, Piperazine Tartrate, Pyrantel, Pyrvinium Pamoate, a-Santonin, Stilbazium Iodide, Tetraehloroethylene,

Tetramisole, thiabendazole, Thymol, Thymyl N-Isoamylcarbamate, Triclofenol Piperazine e Urea Stibamine;Anti-helmínticos (Onchocerea) como Ivermectin eSuramin Sodium;

Anti-helmínticos (Schistosoma) como Amoscanate,Amphotalide, Antimony Potassium Tartrate, Antimony SodiumGluconate, Antimony Sodium Tartrate, Antimony SodiumThioglycollate, Antimony Thioglycollamide, Beeanthone,Hycanthone, Lucanthone Hydrochloride, Niridazole,Oxamniquine, Praziquantel, Stibocaptate, Stibophen e UreaStibamine;

Anti-helmínticos (Trematódeos) tais como

Anthiolimine e Tetrach loroethylene;Drogas antiacne tais como Adapelene, AlgestoneAcetophenide, Azelaic Acid, Benzoyl Peroxide, Cyoctol,Cyproterone, Motretinide, Resorcinol, Retinoic Acid,Tetroquinone e Tretinonine;Antialérgicos tais como Amlexanox, Astemizole,

Azelastine, Cromolyn, Fenpiprane, Histamine, Ibudilast,Nedocromil, Oxatomide, Pentigetide, Poison Ivy Extract,

Poison Oak Extract, Poison Sumac Extraet, Repirinast,Tranilast, Traxanox e Urushiol;

Antiamébicos tais como Arsthinol, Bialamicol,Carbarsone, Cephaeline, Chlorbetamide, Chloroquine,Chlorphenoxamide, Chlortetracycline, Dehydroemetine,

Dibromopropamidine, Diloxanide, Dephetarsone, Emetine,Fumagillin, Glaucarubin, Glycobiarsol, 8-Hydroxy-7-iodo-5-quinolinesulfonic Acid, lodochlorhydroxyquin, lodoquinol,Paromomycin, Phanquinone, Phearsone Sulfoxylate7

Polybenzarsol, Propamidine, Quinfamide, Secnidazole,Sulfarside, Teclozan, Tetracycline, Thioearbamizine,Thiocarbarsone e Tinidazole;

Antiandrogênios tais como Bifluranol, Cyoctol,Cyproterone, Delmadinone Aeetate, Flutimide, Nilutamide eOxendolone;

Antianginais tais como Acebutolol, Alprenolol,Amiodarone, Amlodipine, Arotinolol, Atenolol, Bepridil,Bevantolol, Bucumolol, Bufetolol, Bufuralol, Bunitrolol,Bupranolol, Carozolol, Carteolol, Carvedilol, Celiprolol,Cinepazet Maleate, Diltiazem, Epanolol, Felodipine,Gallopamil, Imolamine, Indenolol, Isosorbide Dinitrate,Isradipine, Limaprost, Mepindolol, Metoprolol, Molsidomine,Nadolol, Nieardipine, Nifedipine, Nifenalol, Nilvadipine,Nipradilol, Nisoldipine, Nitroglycerin, Oxprenolol,

Oxyfedrine, Ozagrel, Penbutolol7 PentaerythritolTetranitrate, Pindolol, Pronethalol, Propranolol, Sotalol,Terodiline, Timolol, Toliprolol e Verapamil;

Antiarrítmicos tais como Acebutol, Acecaine,Adenosine, Ajmaline, Alprenolol, Amiodarone, Amoproxan,Aprindine, Arotinolol, Atenolol, Bevantolol, BretyliumTosylate, Bubumolol, Bufetolol, Bunaftine, Bunitrolol,Bupranolol, Butidrine Hydrochloride, Butobendine, CapobenicAcid, Carazolol, Carteolol, Cifenline, CloranololiDisopyramide, Encainide, Esmolol, Flecainide, Gallopamil,Hydroquinidine, Indeeainide, Indenolol, Ipratropium Bromide,Lidoeaine7 Lorajmine, Loreainide, Meobentine, Metipranolol,Mexiletine, Morieizine, Nadoxolol, Nifenalol, Oxprenolol,Penbutolol, Pindolol, Pirmenol, Praetolol, Prajmaline,Proeainamide Hydrochloride, Pronethalol, Propafenone,Propranolol, Pyrinoline, Quinidine Sulfate, Quinidine,Sotalol, Talinolol, Tirnolol, Toeainide, Verapamil, Viquidile Xibenolol;

Antiarterioscleróticos tais como PyridinolCarbamate;

Antiartríticos/Anti-reumáticos tais comoAllocupreide Sodium, Auranofin, Aurothioglucose,

Aurothioglycanide, Azathioprine, Calcium 3-Aurothio-2-propanoi-1-suifonate, Celecoxib, Chloroquine, Clobuzarit,Cuproxoline, Diacerein, Glucosamine, Gold Sodium Thiomalate,Gold Sodium Thiosulfate, Hydroxychloroquine, Kebuzone,Lobenzarit, Melittin, Methotrexate, Myoral e Penicillamine;

Drogas (antibióticas) anti-bacterianas incluindo:Aminoglicosídeos tais como Amikacin, Apramycin, Arbekacin,Bambermycins, Butirosin, Dibekacin, Dihdrostreptomycin,Fortimicin(s), Gentamicin, Ispamicin, Kanamycin,

Micronomicin, Neomycin, Neomycin Undecylenate, Netilmicin,Paromomycin, Ribostamycin, Sisomicin, Spectinomycin,

Streptomycin, Streptonicozid e Tobramycin;Anfenicóis tais como Azidamfenicol,

Chloramphenicol, Chloramphenicol Palmitate, ChloramphenicolPantothenate, Florfenicol e Thiamphenicol;

Ansamicinas tais como Rifamide, Rifampin, Rifamycine Rifaximin;β-lactamas, incluindo: Carbapenemas tais comoImipenem;

Cefalosporinas tais como Cefactor, Cefadroxil,Cefamandole, Cefatrizine, Cefazedone, Cefazolin, Cefixime,Cefmenoxime, Cefodizime, Cefonicid, Cefoperazone, Ceforanide,Cefotaxime, Cefotiam, Cefpimizole,

Cefpirimide, Cefpodoxime Proxetil, Cefroxadine, Cefsulodin,Ceftazidime, Cefteram, Ceftezole, Ceftibuten, Ceftizoxime,Ceftriaxone, Cefuroximef Cefuzonam, Cephacetrile Sodium,Cephalexin, Cephaloglycin, Cephaloridine, Cephalosporin,Cephalothin, Cephapirin Sodium, Cephradine e Pivcefalexin;

Cefamicinas tais como Cefbuperazone, Cefmetazole,

Cefminox, Cefetan e Cefoxitin;

Monobactamas tais como Aztreonam, Carumonam eTigemonam;

Oxacefemas tais como Flomoxef e Moxolaetam;Penicilinas tais como Amidinocillin, AmdinocillinPivoxil, Amoxicillin, Ampicillan, Apalcillin, Aspoxicillin,Azidocillan, Azlocillan, Bacampicillin, BenzylpenicillinicAcid, Benzylpenicillin Sodium, Carbenicillin, CarfecillinSodium, Carindacillin, Clometocill in, Cloxacill in,Cyclacillin, Dicloxacillin, Diphenicillin Sodium, Epicillin,Fenbenieillin, Floxicillin, Hetacillin, Lenampicillin,Metampicillin, Methicillin Sodium, Mezlocillin, NafcillinSodium, Oxacillin, Penamecillin, Penethamate Hydriodide,Penicillin G Benethamine, Penicillin G Benzathine, PenieillinG Benzhydrylamine, Penicillin G Calcium, Penicillin GHydrabamine, Penicillin G Potassium, Penicillin G Procaine,Penicillen N, Penicillin O, Penicillin V, Penicillin VBenzathine, Penicillin V Hydrabamine, Penimepicycline,Phenethicillin Potassium, Piperacillin, Pivapicillin,Propicillin, Quinacillin, Sulbenicillin, Talampicillin,Temocillin e Ticarcillin;Lincosamidas tais como Clindamycin e Lincomycin7-Maerolídeos tais como Azithroimycinf Carbomycin,Clarithromycin, Erythromycin, Erythromycin Acistrate,Erythromycin Estolate, Erythromycin Glucoheptonate,Erythromycin Lactobionate, Erythromycin Propionate,Erythromycin Stearate, Josamycin, Leucomycins, Midecamycins,Miokamycinf Oleandomycin, Primycin, Rokitamycin, Rosaramicin,Roxithromycin, Spiramycin e Troleandornycin7-

Polipeptídeos tais como Amphomycin, BacitracinfCapreomycin, Colistin, Enduracidin, Enviomycin, Fusafungine7Gramicidin(s), Gramicidin S, Mikamycin, Polymyxin, PolymyxinB-Methanesulfonic Acid, Pristinamycin, Ristocetinf

Teicoplanin, Thiostrepton, Tuberactinomycin7 TyrocidinefTyrothricin7 Vancomycin7 Viomyein7 Viomyein Pantothenate7Virginiamycin e Zine Bacitracin7-Tetraeielinas tais como Apicycline7

Chlortetracycline7 Clomocycline7 Demeclocycline, Doxycycline7Guamecyeline7 Lymeeyeline7 Meclocycline7 Methacyeline7Minocyeline7 Oxytetracyeline7 Penimepieycline7 Pipacyeline7Rolitetracycline7 Saneyeline7 Senoeielin e Tetraeycline7- eoutros antibióticos tais como Cycloserine7Mupirocin e Tuberin;

Drogas anti-bacterianas (sintéticas), incluindo:

2,4-Diaminopirimidinas tais como Brodimoprim, Tetroxoprim eTrimethoprim ,

Nitrofuranos tais como Furaltadone, Furazolium Chloride,Nifuradene7 Nifuratel7 Nifurfoline7 Nifurpirinol7

Nifurprazine7 Nifurtoinol e Nitrofurantoin7-

Quinolonas e Análogos tais como Amifloxacin7

Cinoxacin7 CiprofIoxacin7 Difloxacin7 Enoxacin7 Fleroxacin7Flumequine7 Lomefloxacin7 Miloxacin7 Nalidixic Acid7Norfloxacin7 Ofloxacin7 Oxolinic Acid7 Pefloxacin7 PipemidicAcidf Piromidic Acid7 Rosoxacin7 Temafloxacin e Tosufloxacin;Sulfonamidas tais como Acetyl Sulfamethoxypyrazine,Acetyl Sulfisoxazole, Azosulfamide, Benzylsulfamide,Chloramine-B, Chloramine-T, Dichloramine T,

Formosulfathiazole, N2 Formylsulfisomidine, N2 -β-D-Glucosylsulfanilamide, Mafenide, 4 -

(Methylsulfamoyl)sulfanilanilide, p-Nitrosulfathiazole,

Noprylsulfamide, Phthalylsulfacetamide,

Phthalylsulfathiazole, Salazosulfadimidine,

Succinylsulfathiazole, Sulfabenzamide, Sulfacetamide,

Sulfachlorpyridazine, Sulfaehrysoidine, Sulfaeytine,

Sulfadiazine, Sulfadieramide, Sulfadimethoxine, Sulfadoxine,Sulfaethidole, Sulfaguanidine, Sulfaguanol, Sulfalene,Sulfaloxic Aeid, Sulfamerazine, Sulfameter, Sulfamethazine,Sulfamethizole, Sulfamethomidine, Sulfamethoxazole,Sulfamethoxypyridazine, Sulfametrole, Sulfamidochrysoidine,Sulfamoxole, Sulfanilamide, Sulfanilamidomethanesulfonic Aeid

Triethanolamine Salt, 4-Sulfanilamidosalicylic Acid, N-Sulfanilylsulfanilamide, Sulfanilylurea, N-Sulfanilyl-3,4-xylamide, Sulfanitran, Sulfaperine, Sulfaphenazole,

Sulfaproxyline, Sulfapyrazine, Sulfapyridine, Sulfasomizole,

Sulfasymazine, Sulfathiazole, Sulfathiourea, Sulfatolamide,

Sulfisomidine e Sulfisoxazole;

Sulfonas tais como Acedapsone7 Acediasulfone7Acetosulfone Sodium7 Dapsone7 Diathymosulfone7 GlucosulfoneSodium7 Solasulfone, Succisulfone, Sulfanilic Acid7 p-Sulfanilylbenzylamine, ρ,ρ'-Sulfonyldianiline-

N7N1digalactoside, Sulfoxone Sodium e Thiazolsulfone; eoutros, tais como Clofoctol7 Hexedine7 Methenamine7Methenamine Anhydromethylene-citrate, Methenamine Hippurate7

Methenamine Mandelate7 Methenamine Sulfosalicylate,Nitroxoline e Xibornol;

Anticolinérgicos tais como AdiphenineHydrochloride7 Alverine7 Ambutonomium Bromide7Aminopentamide, Amixetrine, Amprotropine Phosphate,

Anisotropine Methylbromide, Apoatropine, Atropine, AtropineN-Oxide, Benactyzine, Benapryzine, Benzetimide, BenziloniumBromide, Benztropine Mesylate, Bevonium Methyl Sulfate,Biperiden, Butropium Bromide, N-Butylscopolammonium Bromide,Buzepide, Camylofine, Caramiphen Hydrochloride,

Chlorbenzoxamine, Chiorphenoxamine, Cimetropium Bromide,Clidinium Bromide, Cyelodrine, Cyelonium Iodide, CyerimineHydroehloride, Deptropine, Dexetimide , Dibutoline Sulfate,Dicyelomine Hydroehloride, Diethazine, Difemerine,

Dihexyverine, DiphemanilMethylsulfate, N-(1,2-Diphenylethyl)nicotinamide, Dipiproverine, Diponium Bromide, EmeproniumBromide, Endobenzyline Bromide, Ethopropazine,

Ethybenztropine, Ethylbenzhydramine, Etomidoline,

Eueatropine, Fenpiverinium Bromide, Fentonium Bromide,Flutropium Bromide, Glyeopyrrolate, Heteronium Bromide,Hexoeyelium Methyl Sulfate, Homatropine, Hyoseyamine,Ipratropium Bromide, Isopropamide, Levomepate, Meeloxamine,Mepenzolate Bromide, Metcaraphen, Methantheline Bromide,Methixene, Methscopolamine Bromide, Oetamylamine, OxybutyninChloride, Oxyphencyelimine, Oxyphenonium Bromide,

Pentapiperide, Penthienate Bromide, Phenearbamide,

Phenglutarimide, Pipenzolate Bromide, Piperidolate,

Piperilate, Poldine Methysulfate, Pridinol, PrifiniumBromide, Procyelidine, Propantheline Bromide, Propenzolate,Propyromazine, Seopolamine, Seopolamine N-Oxide, StiloniumIodide, Stramonium, Sultroponium, Thihexinol, Thiphenamil,Tiemonium Iodide, Timepidium Bromide, Tiquizium Bromide,Tridihexethyl Iodide, Trihexyphenidyl Hydroehloride,

Tropaeine, Tropenzile, Tropieamide, Trospium Chloride,Valethamate Bromide e Xenytropium Bromide;

Anticonvulsivantes tais como Aeetylpheneturide,Albutoin, Aloxidone, Aminoglutethimide, 4-Amino-3-hydroxybutyric Acid, Atrolactamide, Beelamide, Buramate,Calcium Bromide, Carbamazepine, Cinromide, Clomethiazole,Clonazepam, Deeimemide, Diethadione, Dimethadione,

Doxenitoin, Eterobarb, Ethadione, Ethosuximide, Ethotoin,Fluoresone7 Garbapentin, 5-Hydroxytryptophan, Lamotrigine,Lomaetil, Magnesium Bromide, Magnesium Sulfate, Mephenytoin,Mephobarbital, Metharbital, Methetoin, Methsuximide, 5-Methyl-5-(3-phenanthryl)hydantoin, 3-Methyl-5-phenylhydantoin, Nareobarbital, Nimetazepam, Nitrazepam,Paramethadione, Phenaeemide, Phenetharbital, Pheneturide,Phenobarbital, Phenobarbital Sodium, Phensuximide,

Phenylmethylbarbiturie Acid, Phenytoin, Phethenylate Sodium,Potassium Bromide, Pregabatin, Primidonef Progabide, SodiumBromide, Sodium Valproate, Solanum, Strontium Bromide,Suelofenide, Sulthiame, Tetrantoin, Tiagabine, Trimethadione,Valproie Acid, Valpromide, Vigabatrin e Zonisamide;

Antidepressivos, incluindo: Bicíclicos tais comoBinedaline, Caroxazone, Citalopram7 Dimethazan, Indalpine,Fencamine, Fluvoxamine Maleate, Indeloxazine Hydrochcloride,Nefopam, Nomifensine, Oxitriptan, Oxypertine, Paroxetine,Sertraline, Thiazesim, Trazodone, Venlafaxine e Zometapine;

Hidrazidas/Hidrazinas tais como Benmoxine,Iproclozide, Iproniazid, Isocarboxazid, Nialamide, Octamoxine Phenelzine;

Pirrolidonas tais como Cotinine, Rolicyprine eRolipram;

Tetracíclicos tais como Maprotiline, Metralindole,

Mianserin e Oxaprotiline;

Tricíclicos tais como Adinazolam, Amitriptyline,Amitriptylinoxide, Amoxapine, Butriptyline, Clomipramine,Demexiptiline, Desipramine, Dibenzepin, Dimetracrine,Dothiepin7 Doxepin, Fluacizine, Imipramine7 Imipramine N-Oxide7 Iprindole7 Lofepramine, Melitracen, Metapramine,Nortriptyline, Noxiptilin, Opipramol, Pizotyline,Propizepine, Protriptyline, Quinupramine, Tianeptine eTrimipramine; e

outros, tais como Adrafinil, Benactyzine,Bupropion, Butacetin, Deanol, Deanol Aceglumate, DeanolAcetamidobenzoate, Dioxadrol, Etoperidone7 Febarbamate,Femoxetine, Fenpentadiol, Fluoxetine, Fluvoxamine,

Hematoporphyrin, Hypereinin, Levophacetoperane, Medifoxamine,Minaprine, Moelobemide, Oxaflozane, Piberaline, Prolintane,Pyrisuccideanol, Rubidium Chloride, Sulpiride, Sultopride;Teniloxazine, Thozalinone, Tofenacin, Toloxatone,

Tranyleypromine, L-Tryptophan, Viloxazine e Zimeldine;

Antidiabéticos, incluindo: Biguanidas tais comoBuformin, Metformin e Phenformin;

Hormônios tais como Glucagon, Insulin, InsulinInjectionf Insulin Zinc Suspension, Isophane InsulinSuspension, Protamine Zinc Insulin Suspension e Zinc InsulinCrystals;

Derivados de Sulfoniluréia tais como Acetohexamide,I-Butyl-3-metanilylurea, Carbutamide, Chlorpropamide,Glibornuride, Gliclazide, Glipizide, Gliquidone, Glisoxepid,Glyburide, Glybuthiazol(e), Glybuzole, Glyhexamide,

Glymidine, Glypinamide, Phenbutamide, Tolazamide, Tolbutamidee Tolcyelamide; e

outros, tais como Acarbose, Calcium Mesoxalate eMiglitol;

Drogas antidiarréicas tais como Acetyltannic Acid,Albumin Tannate, Alkofanone, Aluminum Salicylates-Basic,Catechin, Difenoxin, Diphenoxylate, Lidamidine, Loperamide,Mebiquine, Trillium e Uzarin;

Antidiuréticos tais como Desmopressin, Felypressin,Lypressin, Ornipressin, Oxycinchopheη, Pituitary-Posterior,Terlipressin e Vasopressin;Antiestrogênios tais como Delmadinone Acetate,Ethamoxytriphetol, Tamoxifen e Toremifene;

Drogas antifúngicas (antibióticos), incluindo:Polienos tais como Amphotericin-B, Candicidin, Dermostatin,Filipin, Fungichromin, Hachimycin, Hamycin, Lucensomycin,Mepartricin, Natamycin, Nystatin, Pecilocin e Perimycin; eoutros, tais como Azaserine, Griseofulvin, Oligomycins,Neomycin Undecylenate, Pyrrolnitrin7 Siccanin, Tubercidin eViridin;

Drogas antifúngicas (sintéticas), incluindo:Alilaminas tais como Naftifine e Terbinafine;

Imidazóis tais como Bifonazole, Butoconazole,Chlordantoin, Chlormidazole, Cloconazole, Clotrimazole,Econazole, Enilconazole, Fenticonazolef Ioconazole,Ketoconazole, Miconazole, Omoconazole, Oxiconazole, Nitrate,Sulconazole e Tioconazole;

Triazóis tais como Fluconazole, Itraconazole eTerconazole; e

outros, tais como Acrisorcin, Amorolfine,Biphenamine, Bromosalicylchloranilide, Buclosamide, CalciumPropionate, Chlophenesin, Ciclopirox, Cloxyquin,Coparaffinate, Diamthazole, Dihydrochloride, Exalamide,Flucytosine, Halethazole, Hexetidine, Loflucarban, Nifuratel,Potassium Iodide, Propionic Acid, Pyrithione, Salicylanilide,Sodium Propionate, Sulbentine, Tenonitrozole, Tolciclate,Tolindate, Tolnaftate, Tricetin, Ujothion, Undecylenic Acid eZinc Propionate;

Drogas antiglaucoma tais como Acetazolamide,Befunolol, Betaxolol, Bupranolol, Carteolol, Dapiprazoke,Dichlorphenamide, Dipivefrin, Epinephrine, Levobunolol,Methazolamide, Metipranolol, Pilocarpine, Pindolol e Timolol;

Antigonadotropinas tais como Danazol, Gestrinone eParoxypropione;Drogas antigota tais como Allopurinol, Carprofen,Colchicine, Probenecid e Sulfinpyrazone;

Anti-histamínicos, incluindo: Derivados dealquilamina tais como Acrivastine, Bamipine, Brompheniramine,Chlorpheniramine, Dimethindene, Metron S, Pheniramine,Pyrrobutamine, Thenaldine, Tolpropamine e Triprolidine;

Éteres de aminoalquila tais como Bietanautine,Bromodiphenhydraminef Carbinoxamine, Clemastine,Diphenlypyraline, Doxylamine, Embrammine, Medrylamine,Mephenphydramine, ρ-Methyldiphenhydramine, Orphenadrine,Phenyltoloxamine, Piprinhydrinate e Setasine;

Derivados de etilenodiamina tais como Alloclamide,p-Bromtripelennamine, Chloropyramine, Chlorothen,Histapyrrodine, Methafurylene, Methaphenilene, Methapyrilene,Phenbenzamine, Pyrilamine, Talastine, Thenyldiamine,Thonzylamine Hydrochloride, Tripelennamine e Zolamine;

Piperazinas tais como Cetirizine, Chiorcyclizine,Cinnarizine, Clocinizine e Hydroxyzine;

Tricxclicos, incluindo: Fenotiazinas tais comoAhistan, Etymemazine, Fenethazine, N-HydroxyethylpromethazineChloride, Isopromethazine, Mequitazine, Promethazine,Pyrathiazine e Thiazinamium Methyl Sulfate;

Outros, tais como Azatadine, Clobenzepam,Cyproheptadine, Deptropine, Isothipendyl, Loratadine eProthipendyl; e

Outros anti-histaminicos tais como Antazoline,Astemizole, Azelastine, Cetoxime, Clemizole, Clobenztropine,Diphenazoline, Diphenhydramine, Fluticasone Propionate,Mebhydroline, Phenindamine, Terfenadine e Tritoqualine;

Anti-hiperlipoproteinêmicos, incluindo: Derivadosde ácido ariloxialcanóico tais como Beclorbrate, Bazafibrate,Binifibrate, Ciprofibrate, Clinofibrate, Clofibrate,Clofibric Acid, Etonfibrate, Fenofibrate, Gemfibrozil,Nicofibrate, Pirifibrate, Ronifibrate, Simfibrate eTheofibrate;

Seqüestrantes do ácido da bile tais comoCholestyramine Resin, Colestipol e Polidexide;

Inibidores da reductase da CoA de HMG tais comoFluvastatin, Lovastatin, Pravastatin Sodium e Simvastatin;

Derivados de ácido nicotínico tais como AluminumNicotinate, Acipimox, Niceritrol, Nieoclonate, Nieomol eOxiniacic Acid;

Hormônios da tiróide e análogos tais comoEtiroxate, Thyropropic Acid e Thyroxine; e

outros, tais como Acifran, Azacosterol, Benfluorex,β-Benzalbutyramide, Carnitine, Chondroitin Sulfate,Clomestone, Detaxtran, Dextran Sulfate Sodium, 5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic Acid, Eritadenine, Furazbol, Meglutol,Melinamide, Mytatrienediol, Ornithinef γ-Oryzanol,Pantethine, Penataerythritol Tetraacetate, a-Phenylbutyramide, Pirozadil, Probucol, α-Sitosterol,Sultosilic Acid, Piperazine Salt, Tiadenol, Triparanol eXenbucin;

Drogas anti-hipertensivas, incluindo: derivados deariletanolamina tais como Amosulalol, Bufuralol, Dilevalol,Labetalol, Pronethalol, Sotalol e Sulfinalol;

Derivados de ariloxipropanolamina tais comoAcebutolol, Alprenolol, Arotinolol, Atenolol, Betaxolol,Bevantolol, Bisoprolol, Bopindolol, Bunitrolol, Bupranolol,Butofilolol, Carazolol, Cartezolol, Carvedilol, Celiprolol,Cetamolol, Epanolol, Indenolol, Mepindolol, Metipranolol,Metoprolol, Moprolol, Nadolol, Nipradilol, Oxprenolol,Penbutolol, Pindolol, Propranolol, Talinolol, Tetraolol,Timolol e Toliprolol;

Derivados de benzotiadiazina tais como Althiazide,Bendroflumethiazide, Benzthiazide, Benzylhydrochlorothiazide,Buthiazide, Chlorothiazide, Chlorthalidone, Cyclopenthiazide,Cyclothiazide, Diazoxide, Epithiazide, Ethiazide, Fenquizone,Hydrochlorothiazide, Hydroflumethiazide, Methyelothiazide,Metierane, Metolazone, Paraflutizide, Polythiazide,Tetraehlormethiazide e Trichlormethiazide;

Derivados de N-carboxialquila (peptídeo/lactama)tais como Alaeepril, Captopril, Cilazapril, Delapril,Enalapril, Enalaprilat, Fosinopril7 Lisinopril, Moveltipril,Perindopril, Quinapril e Ramipril;

Derivados de diidropiridina tais como Amlodipine,Felodipine, Isradipine, Nicardipine, Nifedipine, Nilvadipine,Nisoldipine e Nitrendipirne;

Derivados de guanidina tais como Amlodipine,Felodipine, Isradipine, Nicardipine, Nifedipine, Nilvadipine,Nisoldipine e Nitrendipirne;

Derivados de guanidina tais como Bethanidine,Debrisoquin, Guanabenz, Guanacline, Guanadrel, Guanazodine,Guanethidine, Guanfacine, Guanochlor, Guanoxabenz e Guanoxan;

Hidrazinas e ftalazinas tais como Budralazine,Cadralazine, Dihydralazine, Endralazine, Hydracarbazine7Hydralazine, Pheniprazine, Pildralazine e Todralazine7-

Derivados de imidazol tais como Clonidine,Lofexidine, Phentolamine7 Phentolamine Mesylate, Tiamenidinee Tolonidine;

Compostos de amônio quaternário tais comoAzamethonium Bromide, Chlorisondamine Chloride,Hexamethonium, Pentacynium Bis(methyl sulfate),Pentamethonium Bromide, Pentolinium Tartate, PhenactopiniumChloride e Trimethidiunum Methosulfate;

Derivados de quinazolina tais como Alfuzosin,Bunazosin, Doxazosin, Prasosin, Terazosin e Trimazosin;

Derivados de reserpina tais como Bietaserpine,Deserpidine7 Rescinnamine, Reserpine e Syrosingopine;Derivados de sulfonamida tais como Ambuside,Clopamide7 Furosemide, Indapamide, Quinethazone, Tripamide eXipamide; e

outros, tais como Ajmaline, γ-Aminobutyric Acid,Bufeniode, Candesartan, Chlorthalidone, Cicletaine,Ciclosidomine, Cryptenamine Tannates7 Eprosartan, Fenoldopam7Flosequinan7 Indoramin7 Irbesartan7 Ketanserin7 Losartan7Metbutamate7 Mecamylamine7 Methyldopa7 Methyl 4-PyridylKetone Thiosemicarbarzone7 Metolazone7 Minoxidil7 Muzolimine7Pargyline7 Pempidine7 Pinaeidil7 Piperoxan7 Primaperone7Protoveratrines7 Raubasine7 Reseimetol7 Rilmenidene7Saralasin7 Sodium Nitroprusside7 Tierynafen7 TrimethaphanCamsylate7 Tyrosinase7 Urapidil e Valsartan7-

Anti-hipertiróidicos tais como 2-Amino-4-methylthiazole, 2-Aminothiazole7 Carbimazole7 3,5-Dibromo-L-tyrosine, 3,5-Diiodotyrosine7 Hinderin7 Iodine7 Iothiouracil7Methimazole7 Methylthiouracil7 Propylthiouracil, SodiumPerehlorate7 Thibenzazoline7 Thiobarbital e 2-Thiouracil;

Drogas anti-hipotensivas tais como Amezinium MethylSulfate, Angiotensin Amide7 Dimetofrine7 Dopamine7 Etifelmin7Etilefrin7 Gepefrine7 Metaraminol7 Midodrine7 Norepinephrine7Pholedrinead e Synephrine;

Drogas anti-hipotiróidicas tais como LevothyroxineSodium7 Liothyronine7 Thyroid7 Thyroidin7 Thyroxine7Tiratricol e TSH;

Drogas antiinflamatórias (não-esteroidais),incluindo: Derivados de ácido aminoarilcarboxílico tais comoEnfenamic Acid7 Etofenamate7 Flufenamic Acid7 Isonixin7Meclofenamic Acid7 Mefanamic Acid7 Niflumic Acid7Talniflumate7 Terofenamate e Tolfenamic Acid7-

Derivados de ácido arilacético tais comoAcemetacin7 Alclofenac7 Amfenac7 Bufexamac7 Cinmetacin7Clopirac7 Diclofenac Sodium7 Etodolac7 Felbinac7 Fenclofenac7Fenclorac, Fenclozic Acid, Fentiazae, Glueametaeinf Ibufenac,Indomethaein, Isofezolae, Isoxepae, Lonazolac, MetiazinieAcid, Oxametaeine, Proglumetaein, Sulindae, Tiaramide,Tolmetin e Zomepirac;

Derivados de ácido arilbutírico tais comoBumadizon, Butibufen, Fenbufen e Xenbucin;

Ácidos arillcarboxílicos tais como Clidanac,Ketorolac e Tinoridine;

Derivados de ácido arilpropiônico tais comoAlminoprofen, Benoxaprofen, Bucloxic Acid, Carprofen,Fenoprofen, Flunoxaprofen, Flurbiprofen, Ibuprofen,Ibuproxam, Indoprofen, Ketoprofen, Loxoprofen, Miroprofen,Naproxen, Oxaprozin, Piketoprofen, Pirprofen, Pranoprofen,Protizinic Acid, Suprofen e Tiaprofenic Acid;

Pirazóis tais como Difenamizole e Epirizole;Pirazolonas tais como Apazone, Benzpiperylon,Feprazone, Mofebutazone, Morazone, Oxyphenbutazone,Phenybutazone, Pipebuzone, propyphenazone, Ramifenazone,Suxibuzone e Thiazolinobutazone;

Derivados de ácido salicílico tais comoAcetaminosalol, Aspirin, Benorylate, Bromosaligenin, CalciumAcetylsalicylate, Diflunisal, Etersalate, Fendosal, GentisicAcid, Glycol Salicylate, Imidazole Salicylate, LysineAcetylsalicylate, Mesalamine, Morpholine Salicylate, 1-Narhthyl Salicylate, Olsalazine, Parsalmide, PhenylAcetylsalicylate, Phenyl Salicylate, Salacetamide,Salicylamine O-Acetic Acid, Salicylsulfuric Acid, Salsalate eSulfasalazine;

Tiazinacarboxamidas tais como Droxicam, Isoxicam,Piroxicam e Tenoxicam; e

outros, tais como ε-Acetamidocaproic Acid, S-Adenosylmethionine, 3-Amino-4-hydroxybutyric Acid,Amixetrine, Bendazac, Benzydamine, Bucolome, Difenpiramide,Ditazol, Emorfazone, Guaiazulene, Nabumetone, Nimesulide,Orgotein, Oxaceprol, Paranyline, Perisoxal, Pifoxime,Proquazone, Proxazole e Tenidap;

Drogas antimalária tais como Acedapsone,Amodiaquin, Arteether, Artemether, Artemisinin, Artesunate,Bebeerine, Berberine, Chirata, Chlorguanide, Chloroquine,Chlorproguanil, Cinchona, Cinchonidine, Cinehonine,Cyeloguanili Gentiopierin, Halofantrine, Hydroxychloroquine,Mefloquine Hydroehloride, 3-Methylarsaeetin, Pamaquine,Plasmocid, Primaquine, Pyrimethamine, Quinaerine, Quinine,Quinine Bisulfate, Quinine Carbonate, Quinine Dihydrobromide,Quinine Dihydroehloride, Quinine Ethylearbonate, QuinineFormate, Quinine Glueonate, Quinine Hydriodide, QuinineHydroehloride, Quinine Salieylate, Quinine Sulfate, QuinineTannate, Quinine Urea Hydroehloride, Quinoeide, Quinoline eSodium Arsenate Diabasic;

Drogas antienxaqueca tais como Alpiropride,Dihydroergotamine, Eletriptan, Ergocornine, Ergocorninine,Ergocryptine, Ergot, Ergotamine, Flumedroxone acetate,Fonazine', Lisuride, Methysergid (e), Naratriptan, Oxetorone,Pizotyline, Rizatriptan e Sumatriptan;

Drogas antináusea tais como AcetylleucineMonoethanolamine, Alizapride, Benzquinamide, Bietanautine,Bromopride, Buclizine, Chlorpromazine, Clebopride, Cyelizine,Dimenhydrinate, Dipheniodol, Domperidone, Granisetron,Meclizine, Methalltal, Metoclopramide, Metopimazine,Nabilone, Ondansteron, Oxypendyl, Pipamazine,Piprinhydrinate, Prochlorperazine, Scopolamine,Tetrahydrocannabinols, Thiethylperazine, Thioproperzaine eTrimethobenzamide;

Drogas antineoplásticas, incluindo: Agentesalquilantes, tais como Sulfonatos de alquila tais comoBusulfan, Improsulfan e Piposulfan;Aziridinas tais como Benzodepa, Carboquone,Meturedepa e Uredepa;

Etileniminas e metilmelaminas tais comoAltretamine, Triethylenemelamine, Triethylenephosphoramide,Triethylenethiophosphoramide e Trimethylolomelamine;

Mostardas de nitrogênio tais como Chlorambucil,Chlornaphazine, Chclophosphamide, Estramustine, Ifosfamide,Mechlorethamine, Mechlorethamine Oxide Hydrochloride,Melphalan, Novembichin, Phenesterine, Prednimustine,Trofosfamide e Uracil Mustard7-Nitrosouréias tais como Carmustine, Chlorozotocin,Fotemustine, Lomustine, Nimustine e Ranimustine; e

Outros, tais como Camptothecin, Dacarbazine,Mannomustine, Mitobronitol, Mitolactol e Pipobroman7-Antibióticos tais como Aclacinomycins, ActinomycinF1, Anthramycin, Azaserine, Bleomycins, Cactinomycin,Carubicin, Carzinophilin, Chromomycins, Dactinomycin,Daunorubicin, 6-Diazo-5-oxo-L-norleucine, Doxorubicin,

Epirubicin, Mitomycins7 Mycophenolic Acid, Nogalamycin,Olivomycins, Peplomycin, Plicamycin, Porfiromycin, Puromycin,Streptonigrin7 Streptozocin, Tubercidin, Ubenimex, Zinostatine Zorubicin;

Antimetabólitos, incluindo: Análogos de ácidofólico tais como Denopterin7 Methotrexate, Pteropterin eTrimetrexate;

Análogos de purina tais como Fludarabine, 6-Mercaptopurine, Thiamiprine e Thioguanaine7- eAnálogos de pirimidina tais como Ancitabine7Azacitidine7 6-Azauridine, Carmofur7 Cytarabine7Doxifluridine7 Enocitabine7 Floxuridine Fluroouracil eTegafur;

Enzimas tais como L-Asparaginase7- e

Outros7 tais como Aceglatone7 Amsacrine7Bestrabucil, Bisantrene, Bryostatin 1, Carboplatin,Cisplatin, Defofamide7 Demecolcine, Diaziquone, Elfornithine,Elliptinium Acetate, Etoglueid, Etoposide, Gallium Nitrate,Hydroxyurea, Interferon-α, Interferon-β, Interferon-γ,Interleukine-2, Lentinan, Letrozole, Lonidamine, Mitoguazone,Mitoxantrone, Mopidamol, Nitraerine, Pentostatin, Phenamet,Pirarubiein, Podophyllinicc Aeid, 2-Ethythydrazide,Polynitrocubanes, Proearbazine, PSK7, Razoxane, Sizofiran,Spirogermanium, Taxol, Teniposide, Tenuazonie Aeid,Triaziquone, 2.21.2"-Trichlorotriethylamine, Urethan,Vinblastine, Vineristine7 Vindesine e Vinorelbine;

Drogas antineoplásticas (hormonais), incluindo:Androgênios tais como Calusterone, Dromostanolone Propionate,Epitiostanol, Mepitiostane e Testolactone;

Antiadrenais tais como Aminoglutethimide, Mitotanee Trilostane;

Antiandrogênios tais como Flutamide e Nilutamide; e

Antiestrogênios tais como Tamoxifen e Toremifene;

Adjuntos antineoplásticos incluindo reabastecedoresde ácido fólico tais como Frolinic Acid;

Drogas antiparkinsonianas tais como Amantadine,Benserazide, Bietanautine, Biperiden, Bromocriptine,Budipine, Cabergoline, Carbidopa, Deprenyl (a/k/a L-deprenyl,L-deprenil, L-deprenaline e selegiline), Dexetimide,Diethazine, Diphenhydramine, Droxidopa, Ethopropazine,Ethylbenzhydramine, Levodopa, Naxagolide, Pergolide,Piroheptine, Pramipexole, Pridinol, Prodipine, Quinpirole,Remacemide, Ropinirole, Terguride, Tigloidine eTrihexyphenidyl Hydrochloride;

Drogas antifeocromocitoma tais como Metyrosine,Phenoxybenzamine e Phentolamine7-

Drogas antipneumocísticas tais como Effornithine,Pentamidine e Sulfamethoxazole;Drogas anti-hipertrofia prostática tais comoGestonorone Caproate, Mepartricin, Oxendolone e Proscar7;

Drogas antiprotozoários (Leshmania) tais comoAntimony Sodium Gluconate, Ethylstibamine,Hydroxystilbamidine, N-Methylglucamine, Pentamidine,Stilbamidine e Urea Stibamine;

Drogas antiprotozoários (Trichomonas) comoAcetarsone, Aminitrozole, Anisomycin, Azanidazole,Forminitrazole, Furazolidonef Hachimycin, Lauroguadine,Mepartricin, Metronidazole, Nifuratel, Nifuroxime,Nimorazole, Secnidazole, Silver Picrate, Tenonitrozole eTinidazole;

Drogas antiprotozoários (Trypanosoma) tais comoBenznidazole, Eflornithine, Melarsoprol, Nifurtimox,Oxophenarsine, Hydrochloride, Pentamidine, Propamidine7Puromycin, Quinapyramine, Stilbamidine, Suramin Sodium7Trypan Red e Tryparasmide;

Antipuriticos tais como Camphor, Cyproheptadine,Dichlorisone, Glycine, Halometasone, 3-Hydroxycamphor,Menthol, Mesulphen, Methdilazine, Phenol, Polidocanol,Risocainef Spirit of Camphor, Thenaldine, Tolpropamine eTrimeprazine;

Drogas antipsoriáticas tais como Acitretin,Ammonium Salicylate, Anthralin, 6-Azauridine, Bergapten(e),Chrysarobin, Etretinate e Pyrogallol;

Drogas antipsicóticas, incluindo: Butirofenonastais como Benperidol, Bromperidol, Droperidol, Fluanisone,Haloperidol, Melperone, Moperone, Pipamperone, Sniperone,Timiperone e Trifluperidol;

Fenotiazinas tais como Acetophenazine,Butaperazine, Carphenazine, Chlorproethazine, Chlorpromazine,Clospirazine, Cyamemazine, Dixyrazine, Fluphenazine,Imiclopazine, Mepazine, Mesoridazine, Methoxypromazine,Metofenazate, Oxaflumazine, Perazine, Pericyazine,Perimethazine, Perphenazine, Piperacetazine, Pipotiazine,Prochiorperazine, Promazine, Sulforidazine, Thiopropazate,Thioridazine, Trifluoperazine e TrifIupromazine;

Tioxantenos tais como Chlorprothixene,Clopenthixol, Flupentixol e Thiothixene;

Outros tricíclicos tais como Benzquinamide,Carpipramine, Clocapramine, Clomacran, Clothiapine,Clozapine, Opipramol, Prothipendyl, Tetrabenazine, eZotepine; e

Outros, tais como Alizapride, Amisulpride,Buramate, Fluspirilene, Molindone, Penfluridol, Pimozide,Spirilene e Sulpiride;

Antipiréticos tais como Acetaminophen,Acetaminosalol, Acetanilide, Aconine, Aconite, Aconitine,Alclofenac, Aluminum Bis(acetylsalicylate),

Aminochlorthenoxazin, Aminopyrine, Aspirin, Benorylate,Benzydamine, Berberine, p-Bromoacetanilide, Bufexamac,Bumadiζon, Calcium Acetysalieylate, Chlorthenoxazin(e),Choline Salieylate, Clidanae, DihydroxyaluminumAcetylsalicylate, Dipyrocetyl, Dipyrone, Epirizole,Etersalate, Imidazole Salicylate, Indomethacin, Isofezolac,ρ-Lactophenetide, Lysine Acetylsalicylate, MagnesiumAcetylsalicylate, Meclofenamic Acid, Morazone, MorpholineSalicylate, Naproxen,.. Nifenazone, 51-Nitro-2'-propoxyacetanilide, Phenacetin, Phenicarbazide, Phenocoll,Phenopyrazone, Phenyl Acetylsalicylate, Phenyl Salicylate,Pipebuzone, Propacetamol, Propyphenazone, Ramifenazone,Salacetamide, Salicylamide O-Acetic Acid, Sodium Salicylate,Sulfamipyrine, Tetrandrine e Tinoridine;

Drogas antiricketsianas tais como p-AminobenzoicAcid, Chloramphenicol, Chloramphenicol Palmitate,Chloramphenicol Pantothenate e Tetracycline;Drogas anti-seborréicas tais como Chloroxine, 3-0-Lauroylpyridoxol Diacetate, Piroctone, Pyrithione,Resorcinol, Selenium Sulfides e Tioxolone;

Antissépticos, incluindo: Guanidinas tais comoAlexidine, Ambazone, Chlorhexidine e Picloxydine;

Halogênios e compostos de halogênio tais comoBismuth Iodide Oxide, Bismuth Iodosubgallate, BismuthTribromophenate, Bornyl Chloride, Calcium Iodate, ChlorinatedLime, Cloflucarban, Flurosalan, Iodic Acid, Iodine, IodineMonochloride, Iodine Trichloride, Iodoform, MethenamineTetraiodine, Oxychlorosene, Povidone-Iodine, SodiumHypoehlorite, Sodium Iodate, Symclosene, Thymol Iodide,Triclocarban, Triclosan e Troclosene Potassium;

Compostos de mercúrio tais como Hydragaphen,Meralein Sodium, Merbromin, Mercuric Chloride, MereuricChloride, Ammoniated, Mercuric Sodium p-Phenolsulfonate,Mercuric Succinimide, Mercurie Sulfide, Red, Mercurophen,Mercurous Acetate, Mercurous Chloride, Mercurous Iodide,Nitromersol, Potassium Tetraiodomercurate(II), PotassiumTriiodomercurate(II) Solution, Thimerfonate Sodium eThimerosal;

Nitrofuranos tais como Furazolidone, 2-(Methoxymethyl)-5-nitrofuran, Nidroxyzone, Nifuroxime,Nifurzide e Nitrofurazone;

Fenóis tais como Acetomeroctol, Bithionol, CadmiumSalicylate, Carvacrol, Chloroxylenol, Clorophene, Cresote,Cresol(s), p-Cresol, Fenticlor, Hexachlorophene, I-NapthylSalicylate, 2-Napthyl Salicylate, 2,4,6-Tribromom-cresol, eS1-1fS1 -Trichlorosalicylanilide;

Quinolinas tais como Aminoquinuride, Benzoxiquine,Broxyquinoline, Chloroxine, Chlorquinaldol, Cloxyquin,Ethylhydrocupreine, Euprocin, Halquinol, Hydrastine, 8-Hydroxquinoline, 8-Hydroxquinoline Sulfate elodochlorhydroxyquin; e

Outros, tais como Aluminum Acetate Solution,Aluminum Subacetate Solution, Aluminum Sulfate, 3-Amino-4-hydroxybutyrie Acid, Borie Acid, Chlorhexidine, Chloroazodin,m-Cresyl Aeetate, Cuprie Sulfate, Dibromopropamidine,Iehthammol, Negatol7, Noxytiolin, Ornidazole,β-Propiolactone, α-Terpineol;

Drogas antiespasmódicas tais como Alibendol,Ambucetamide, Aminopromazine, Apoatropine, Bevonium MethylSulfate, Bietamiverine, Butaverine, Butropium Bromide, N-ButylscopolammoniumBromide, Caroverine, CimetropiumBromide,Cinnamedrine, Clebopride, Coniine Hydrobromide, ConiineHydrochloride, Cyclonium Iodide, Difemerine, Diisopromine,Dioxaphetyl Butyrate, Diponium Bromide, Drofenine, EmeproniumBromide, Ethaverine, Feelemine, Fenalamide, Fenoverine,Fenpiprane, Fenpiverinium Bromide, Fentonium Bromide,Flavoxate, Flopropione, Gluconie Aeid, Guaiaetamine,Hydramitrazine, Hymeeromone, Leiopyrrole, Mebeverine,Moxaverine, Nafiverine, Oetamylamine,. Octaverine,Pentapiperide, Phenamaeide Hydroehloride, Phloroglucinol,Pinaverium Bromide, Piperilate, Pipoxolan Hydroehloride,Pramiverin, Prifinium Bromide, Properidine, Propivane,Propyromazine, Prozapine, Raeefemine, Roeiverine,Spasmolytol, Stilonium Iodide, Sultroponium, TiemoniumIodide, Tiquizium Bromide, Tiropramide, Trepibutone,Trieromyl, Trifolium, Trimebutine, N,N-ITrimethyl-3 , 3-diphenyl-propylamine, Tropenzile, Trospium Chloride eXenytropium Bromide;

Drogas antitrombóticas tais como Anagrelide,Argatroban, Cilostazol, Chrysoptin, Daltroban, Defibrotide,Enoxaparin, FraxiparineV, Indobufen, Lamoparan, Ozagrel,Picotamide, Plafibride, Reviparin, Tedelparin, Tielopidine,Triflusal e Warfarin;Drogas antitussígenas tais como Allocaraide,Amicibone, Benproperine, Benzonatate, Bibenzonium Bromide,Bromoform, Butamirate, Butethamate, CaramiphenEthanedisulfonate, Carbetapentane, Chlophedianol, Clobutinol,Cloperastine, Codeine, Codeine Methyl Bromide, Codeine N-Oxide, Codeine Phosphate, Codeine Sulfate, Cyclexanone,Dextromethorphan, Dibunate Sodiumf Dihydroeodeine,Dihydroeodeinone Enol Aeetate, Dimemorfan, Dimethoxanate,α,α-Diphenyl-2-piperidinepropanol, Dropropizine, Drotebanol,Eprazinone, Ethyl Dibunate, Ethylmorphine, Fominoben,Guiaiapate, Hydroeodone, Isoarainile, Levopropoxyphene,Morelofone, Nareeine, Normethadone, Noseapine, Oxeladin,Oxolamine, Pholeodine, Pieoperine, Pipazethate, Piperidione,Prenoxdiazine Hydroehloride, Raeemethorphan, TaziprinoneHydroehloride, Tipepidine e Zipeprol;

Drogas antiulcerativas tais como AceglutamideAluminum Complex, ε-Acetamidocaproic Acid Zine Salt,Acetoxolonef Arbaprostil, Benexate Hydroehloride, BismuthSubeitrate Sol (Dried)7 Carbenoxolone, Cetraxate, Cimetidine,Enprostil, Esaprazole, Famotidine, Ftaxilide, Gefamate,Guaiazulene, Irsogladine, Misoprostol, Nizatidine,Omeprazole, Ornoprostil, γ-Oryzanol, Pifarnine, Pirenzepine,Plaunotolf Ranitidine, Rioprostil, Rosaprostol, Rotraxate,Roxatidine Aeetate, Sofaleone, Spizofurone, Sueralfate,Teprenone, Trimoprostil, Thrithiozine, Troxipide eZolimidine;

Drogas antiurolíticas tais como AcetohydroxamicAcid, Allopurinol, Potassium Citrate e Succinimide;

Drogas de antivenina tais como Lyovac7 Antivenin;

Drogas antivirais, incluindo: Purinas epirimidinonas tais como Acyclovir, Cytarabine,Dideoxyadenosine, Dideoxyeytidinef Dideoxyinosine, EdoxudinefFloxuridine, Ganciclovir, idoxuridine, inosine Pranobex,MADU, Penciclovir, Trifluridine, Vidrarbine e Zidovudiine; e

Outros, tais como Acetylleueine Monoethanolamine,Amantadine, Amidinomyein, Cosalane, CuminaldehydeThiosemiearbzone, Fosearnet Sodium, Imiquimod, Interferon-a,Interferon-β, Interferon-γ, Kethoxal, Lysozyme, Methisazone,Moroxydine, PodophylIotoxin, Ribavirin, Rimantadine,Stallimycin, Statolon, Tromantadine e Xenazoie Acid;

Drogas antiansiolitieas, incluindo: Arilpiperazinastais como Buspirone, Gepirone, Ipsapirone e Tondospirone;

Derivados de benzodiazepina tais como Alprazolam,Bromazepam, Camazepam, Chlordiazepoxide, Clobazam,Clorazepate, Chotiazepam7 Cloxazolam, Diazepam, EthylLoflazepate, Etizolam, Fluidazepam, Flutazolam,Flutoprazepam, Halazepam, Ketazolam, Lorazepam, Loxapine,Medazepam, Metaclazepam, Mexazolam, Nordazepam, Oxazepam,Oxazolam, Pinazepam, Prazepam e Tofisopam;

Carbamatos tais como. Cyclarbamate, Emylcamate,Hydroxyphenamate, Meprobamate, Phenprobamate e Tybamate; e

Outros, tais como Alpidem, Benzoctamine,Captodiamine, Chiormezanone, Etifoxine, Flesinoxan,Fluoresone, Glutamic Acid, Hydroxyzine, Lesopitron,Mecloralurea, Mephenoxalone, Mirtazepine, Oxanamide,Phenaglycodol, Suriclone e Zatosetron;

Antagonistas de benzodiazepina tais comoFlumazenil;

Broncodilatadores, incluindo: Derivados de efedrinatais como Albuterol, Bambuterol, Bitolterol, Carbuterol,Clenbuterol, Clorprenaline, Dioxethedrine, Ephedrine,Epiniphrine, Eprozinol, Etafedrine, Ethylnorepinephrine,Fenoterol, Hexoprenaline, Isoetharine, Isoproterenol,Mabuterol, Metaproterenol, N-Methylephedrine, Pirbuterol,Procaterol, Protokylol, Reproterol, Rimiterol, Salmeterol,Soterenol, Terbutaline e Tulobuterol;

Compostos de amônio quaternário tais como BevoniumMethyl Sulfate, Clutropium Bromide, Ipratropium Bromide eOxitropium Bromide;

Derivados de xantina tais como Acefylline,Acefylline Piperazine, Ambuphylline, Aminophylline,Bamifylline, choline Theophyllinate7 Doxofylline, Dyphylline,Enprofylline, Etamiphyllin, Etofylline, Guaithylline,ProxyphylIine, Theobromine, 1-Theobromineacetic Aeid eTheophylline; e

Outros, tais como Fenspiride, Medibazine,Montekulast, Methoxyphenanime, Tretoquinol e Zafirkulast;

Bloqueadores do canal de cálcio, incluindo:Arilalquilaminas tais como Bepridil, Ditiazem, Fendiline,Gallopanil, Prenylamine, Terodiline e Verapamil;

Derivados de diidropiridina tais como Felodipine,Isradipine, Nicardipine, Nifedipine, Nilvadipine, Nimodipine,Nisoldipine e Nitrendipine;

Derivados de piperazina tais como Cinnarizine,Flunarisine e Lidoflazine; e

Outros7 tais como Bencyclane, Etafenone ePerhexiline;

Reguladores de cálcio tais como Calcifediol,Calcitonin, Calcitriol, Clodronic Acid, Dihydrotachysterol,Elcatonin, Etidronic Acid, Ipriflavone, Pamidronic Acid,Parathyroid Hormone e Teriparatide Acetate;

Cardiotônicos tais como Acefylline,Acetyldigititoxins, 2-Amino-4-picoline, Amrinone, BenfurodilHemisuecinate, Buclasdesine, Cerberosidef Camphotamide,Convallatoxin, Cymarin, Denopamine, Deslanoside, Ditalin,Digitalis, Digitoxin, Digoxin, Dobutamine, Dopamine,Dopexamine, Enoximone, Erythrophleine, Fenalcomine, Gitalin,Gitoxin, Glycocyamine, Heptaminol, Hydrastinine, Iopamine,Lanotodises, Metamivam, Milrinone, Neriifolin, Oleandrin,Ouabain, Oxyfedrine, Prenalterol, Proscillaridin,Resibufogenin, Scillaren, Scillarenin, Strophanthin,Sulmazole, Theobromine e Xamoterol;

Agentes quelantes tais como Deferozmine, DitiocarbSodium, Edetate Calcium Disodiumf Edetate Disodium, EdeateSodium, Edetate Trisodium, Penieillamine, Pentetate CaleiumTrisodium, Penteetie Acid, Sueeimer e Trientine;

Antagonistas de colicistoquinina tais comoProglumide;

Agentes colelitolíticos tais como Chenodiol, Methyltert-Butyl Ether, Monooctanoin e Ursodiol;

Coleréticos tais como Alibendol, Anethole Trithion,Azintamide, Cholic Acid, Cicrotoic Acid, Clanobutin,Cyclobutyrol, Cyclovalone, Cynarin(e), Dehydrocholic Acid,Deoxycholic Acid7 Dimecrotic Acid, α-Ethylbenzyl Alcohol,Exiproben, Feguprol, Fencibutirol, Fenipentol, Florantyrone,Hymecromone, Menbutone, 3-(o-Methoxyphenyl)-2-phenylacrylicAcid, Metochalcone, Moquizone, Osalmid, Ox Bile Extract,4,4'-Oxydi-2-butanol, Piprozolin, Prozapine, 4-Salicyloylmorpholine, Sincalide, Taurocholic Acid, Timonacic,Toeamphyl, Trepibutone e Vanitiolide;

Agentes colinérgicos tais como Aceelidine,Acetylcholine Bromide, Acetylcholide Chloride, AclatoniumNapadisilate, Benzpyrinium Bromide, Bethanechol chloride,Carbachol, Carpronium chloride, Demecarium Bromide,Dexpanthenol, Diisopropyl Paraoxon, Echothiophate Iodide,Edrophomium chloride, Eseridine, Furtrethonium,Isoflurophate, Methacholine chloride, Muscarine, Neostigmine,Oxapropanium Iodide, Physostigmine e Pyridostigmine Bromide;

Inibidores de colinasterase tais como AmbenoniumChloride, Distigmine Bromide e Galanthamine;

Reativadores de colinesterase tais como ObidoximineChloride e Pralidoxime Chloride;

Estimulantes e agentes do sistema nervoso centraltais como Amineptine, Amphetimine, Amphetaminil, Bemegride,Benzphetamine, Brucine, Caffeinef Chlorphentermine,Clofenciclan, Clortermine, Coca, Demanyl Phosphate,Dexoxadrol, Dextroamphetamine Sulfate, Diethlpropion, N-Ethylamphetamine, Ethamivan, Etifelmin, Etryptamine,Fencamfamine, Fenethylline, Fenosolone, Flurothyl,Galanthamine, Hexacyclonate Sodium, Homocamfin, Mazindol,Megexamide, Methamphetamine, Methylphenidate, Nikethamide,Pemoline, Pentylenetetrazole, Phenidimetrazine,Phenmetrazine, Phentermine, Picrotoxin, Pipradrol, Prolintanee Pyrovalerone;

Descongestionantes tais como Amidephrine,Cafaminol, Cyclopentamine, Ephedrine, Epinephrine,Fenoxazoline, Indanazoline, Metizoline, Naphazoline,Nordefrin Hydroehloride, Octodrine, oxymetazoline,Phenylephrine Hydrochloride, PhenylpropanolamineHydroehloride, Phenylpropylmethylamine, Propylhexedrine,Pseudoephedrine, Tetrahydrozoline, Tymazoline eXylometazoline;

Agentes dentais, incluindo: Bifosfonatos (doençaanti-periodontal e reabsorção óssea) tais como Alendronate,Clodronate, Etidronate, Pamidronate e Tiludronate;

Profiláticos Carries tais como Arginine e Sodium Fluoride;Agentes dessensibilizantes tais como PotassiumNitrate e Citrate Oxalate;

Despigmentadores tais como Hydroquinine,Hydroquinone e Monobenzone;

Diuréticos, incluindo: Organomercurianos tais comoChlormerodrin, Meralluride, Mercamphamide, MercaptomerinSodium, Mercumallylic Acid, Mercumatilin Sodium, MercurousChloride e Mersalyl;Pteridinas tais como Furterene e Triamterene;Purinas tais como Acefylline, 7-

Morpholinomethyltheophylline, Pamabrom, Protheobromine eTheobromine;

Esteróides tais como Canrenone, Oleandrin eSpironolactone;

Derivados de sulfonamida tais como Acetazolmide,Ambuside, Azosemide, Bumetanide, Butazolamide,Chloraminophenamide, Clofenamide, Clopamide7 Clorexolene,Diphenylmethane-4,4'-disulfonamide, Disulfamide,Ethbxzolamide, Furosemide, Indapamide, Mefruside,Methazolamide, Piretanide, Quinethazonef Torasemide,Tripamide e Xipamide;

Uracilas tais como Aminometradine e Amisometradine;

Outros, tais como Amanozine, Amiloride, Arbutin,Chlorazanil, Ethacrynic Acid, Etozolin, Hydracarbazine,Isosorbide, Mannitol, Metochalcone, Muzolimine, Perhexiline,Ticrynafen e Urea;

Agonistas do receptor de dopamina tais comoBromocriptine, Dopexaminef Fenoldopamf Iopamine, Lisuride,Naxagolide e Pergolide;

Ectoparasiticidas tais como Amitraz, BenzylBenzoate, Carbarylf Crotamitonf DDTf Dixanthogenf IsobornylThiocyanoacetate-Technical, Lime Sulfurated SolutionfLIndanef Malathionf Mercuric Oleatef Mesulphen e Sulphur-Pharmaceutical;

Enzimas, incluindo: Enzimas digestivas tais como a-Amylase (Pâncreas de Suíno), Lipase, Pancrelipase, Pepsin eRennin;

Enzimas mucolíticas tais como Lysozyme;

Enzimas que desativam a penicilina tais comoPenicillinase; e

Enzimas proteolíticas tais como CollagenasefChymopapain, quimotripsinas, Papain e·Trypsin;

Indutores de enzimas (hepáticas) como Flumecinol;Estrogênios, incluindo: Estrogênios não-esteroidaistais como Benzestrol7 Broparoestrol, Chlorotrianisene,Dienestrol, Diethylstilbestrol, DiethylstilbestrolDiproprionate, Dimestrolf Fosfestrol, Hexestrol,Methallenestril e Methestrol; e

Estrogênios esteroidais tais como Colpormon,Conjugated Estrogenic Hormones, Equilenin, Equilin,Estradiol, Estradiol Benzoate, Estradiol 17β-Cypionate,Estriol, Estrone, Ethinyl Estradiol, Mestranol7 Moxestrol,Mytatrienediol, Quinestradiol e Quinestrol;

Inibidores da secreção gástrica tais comoEnterogastrone e Octreotide;

Glucocorticóides tais como 21-Acetoxyprefnenolone,Aalclometasone, Algestone, Amicinonide, Beclomethasone,Betamethasone, Budesonide, Chloroprednisone, Clobetasol,Blovetasone, Clocortolone, Cloprednol, Corticosterone,Cortisone, Cortivazol, Deflazacort, Desonide, Desoximetasone,Dexamethasone, Diflorasone, Diflucortolone, Difluprednate,Enoxolone, Fluazacort, Flucloronide, Flumehtasone,Flunisolide, Fluocinolone Acetonide, Fluocinonide, FluocortinButyl, Fluocortolone, Fluorometholone, Fluperolone Acetate,Fluprednidene Acetate, Fluprednisolone, Flurandrenolide,Formocortal, Halcinonide, Halometasone, Halopredone Acetate,Hydrocortamate, Hydrocortisone, Hydrocortisone Acetate,ydrocortisone Phosphate, Hydrocortisone 21-Sodium Succinate,Hydrocortisone Tebutate, Mazipredone, Medrysone,Meprednisone, Methyolprednisolone, Mometasone Furoate,Paramethasone7 Prednicarbate, Prednisolone, Prednisolone 21-Diethylaminoacetate, Prednisone Sodium Phosphate,Prednisolone Sodium Succinate, Prednisolone Sodium 21-m-Sulfobenzoate, Prednisolone 21-Stearoylglycolate,Prednisolone Tebutate, Prednisolone 21-Trimethylacetate,Prednisone, Prednival, Prednylidene, Prednylidene 21-Diethylaminoacetate, Tixocortal, Triameinolone, TriameinoloneAeetonide, Triameinolone Benetonide e TriameinoloneHexaeetonide;

Princípios estimulantes das gônadas tais comoBuserelin, Clomiphene, Cyclofenil, Epimestrol, FSH, HCG e LH-RH;

Hormônios gonadotrópicos tais como LH e PMSG;

Inibidores do hormônio do crescimento tais comoOctreotide e Somatostatin;

Fatores de liberação do hormônio do crescimentotais como Semorelin;

Estimulantes do crescimento tais como Somatotropin;

Agentes hemolíticos tais como Phenylhydrazine ePhenylhydrazine Hydrochloride;

Antagonistas de heparina tais como HexadimethrineBromide e Protamines;

Hepatoprotetores tais como S-Adenosylmethionine,Betaine, Catechin, Citolone, Malotilate, Orazamide,Phosphorylcholine, Protoporphyrin IX, Silymarin-Group,Thiotic Acid e Tiopronin;

Imunomoduladores tais como Amiprilose, Bucillamine,Ditiocarb Sodium, Inosine Pranobex, Interferon-γ,Interleukin-2, Lentinan, Muroctasin, Platonin, Procodazole,Tetramisole, Thymomodulin, Thymopentin e Ubenimex;

Imunossupressores tais como Azathioprine,Cyclosporins e Mizoribine;

Resinas de troca iônica tais como CarbacrylicResins, Cholestyramine Resin, Colestipol, Polidexide, Resodece Sodium Polystyrene Sulfonate;

Hormônio estimulante da lactação tais comoProlactin;Agonistas de LH-RH tais como Buserelin7 Goserelin7Leuprolide, Nafarelin, e Triptorelin7-

Agentes lipotrópicos tais como N-Acetylmethionine7Choline Chloride7 Choline Dehydrocholate7 Choline DihydrogenCitrate7 Inositol7 Lecithin e Methionine7-Supressores de lúpus eritematoso tais como BismuthSodium Triglycollamate7 Bismuth Subsalicylate7 Chloroquine eHydroxychloroquine;

Corticóides minerais tais como Aldosterone7Deoxycorticosterone, Deoxycorticosterone Acetate eFludrocortisone;

Drogas mióticas tais como Carbachol7 Physostigmine7Pilocarpine e Pilocarpus;

Inibidores da oxidase de monoamina tais comoDeprenyl7 Iproclozide, Iproniazid7 Isocarboxazid,Moclobemide7 Octomoxin7 Pargyline7 Phenelzine7Phenoxypropazine, Pivalylbenzhydrazine7 Prodipine7 Toloxatonee Tranylcypromine;

Agentes mucolíticos tais como Acetylcysteine7Bromhexine7 Carbocysteine7 Domiodol7 Letosteine7 Lysozyme7Mecysteine Hydrochloride7 Mesna7 Sobrerol7 Stepronin7Tiopronin e Tyloxapol;

Relaxantes musculares (esqueletais) tais comoAfloqualone7 Alcuronium7 Atracurium Besylate7 Baclofen7Benzoctamine7 Benzoquinonium Chloride7 C-Calebassine7Carisoprodol, Chlormezanone7 Chlorphenesin Carbamate7Chlorproethazine7 Chlozoxazone, Curare7 Cyclarbamate7Cyclobenzaprine7 Dantrolene7 Decamethonium Bromide7 Diazepam7Eperisone7 Fazadinium Bromide7 Flumetramide7 GallamineTriethiodide7 Hexacarbacholine Bromide7 HexafluoreniumBromide7 Idrocilamide7 Lauexium Methyl Sulfate,Leptodactyline7 Memantine7 Mephenesin7 Mephenoxalone7Metaxalone7 Methocarbamol7 Metocurine Iodide7 Nimetazepam7Orphenadrine, Pancuronium Bromide, Phenprobamate,Phenyramidol, Pipecurium Bromide, Promoxolane, QuinineSulfate, Styramate, Succinylcholine Bromide, SuccinylcholineChloride, Succinylcholine Iodine, Suxethonium Bromide,Tetrazepam, Thiocolchieoside, Tizanidine, Tolperisone,Tuboeurarine Chloride, Veeuronium Bromide e Zoxolamine;

Antagonistas narcóticos tais como Amiphenazole,Cyclazocine, Levallorphan, Nadide, Nalmfene, Nalorphine,Nalorphine Dinieotinate, Naloxone e Naltrexone;

Agentes neuroprotetores tais como Dizocilpine;

Agentes nootrópicos tais como Aceglutamide,Acetylcarnitine, Aniracetam, Bifematlane, Exifone, Fipexide,Idebenone, Indeloxazune Hydrochloride, Nizofenone,Oxiracetam, Piracetam, Propentofylline, Pyritinol e Tacrine;

Agentes oftálmicos tais como 15-ketoprostaglandins;

Hormônio ovariano tal como Relaxin;

Drogas oxitócicas tais como Carboprost, Cargutocin,Deaminooxytocin, Ergonovine, Gemeprost, Methylergonovine,Oxytocin, Pituitary (Posterior), Prostaglandin E2,Prostaglandin F2a e Sparteine;

Inibidores de pepsina tais como SodiumAmylosulfate;

Estimulantes peristálticos tais como Cisapride;

Progestogênios tais como Allylestrenol, Anagestone,Chlormadinone Acetate, Delmadinone Acetate, Demegestone,Desogestrel, Dimethisterone, Dydrogesterone, Ethisterone,Ethynodiol, Flurogestone Acetate, Gestodene, GestonoroneCaproate, Haloprogesterone, i7-Hydroxy-16-methylene--progesterone, 17a-Hydroxyprogesterone, 17a-HydroxygesteroneCaproate, Lynestrenol, Medrogestone, Medroxyprogesterone,Megestrol Acetate, Melengestrol, Norethindrone,Norethynodrel, Norgesterone, Norgestimate, Norgestrel,Norgestrienone, Norvinisterone, Pentagestrone, Progesterone,Promegestone7 Quingestrone e Trengestone7-Inibidores de prolactina tais como Metergoline7-Prostaglandinas e análogos de prostaglandina taiscomo Arbaprostil, Carboprost, Enprostil, Bemeprost,Limaprost, Misoprostol, Ornoprostil, Prostacyclin,Prostaglandin Ei, Prostaglandin E2, Prostagland in F2a,Rioprostil, Rosaprostol, Sulprostone e Trimoprostil;

Inibidores de protease tais como Aprotinin,Camostat, Gabexate e Nafamostat;

Estimulantes respiratórios tais como Almitrine,Bemegride, Carbon Dioxide, Cropropamide, Crotethamide,Dimefline, Dimorpholamine, Doxapram, Ethamivan, Fominoben,Lobeline, Mepixanox, Metamivam, Nikethamide, Picrotoxin,Pimeclone, Pyridofylline, Sodium Succinate e Tacrine;

Agentes antiesclerosantes tais como Ethanolamine,Ethylamine, 2-Hexyldecanoic Acid, Polidocanol, QuinineBisulfate, Quinine Urea Hydrochloride, Sodium Ricinoleate7Sodium Tetradecyl Sulfate e Tribenoside7-

Sedativos e hipnóticos, incluindo: Ureidasacíclicas tais como Acecarbromal, Apronalide, Bomisovalum,Capuride7 Carbromal e Ectylurea7-Álcoois tais como Chlorhexadol7 Ethchlorvynol,Meparfynol7 4-Methyl-5-thiazoleethanol, tert-Pentyl Alcohol e2,2,2-Trichloroethanol;

Amidas tais como Butoctamide7Diethylbromoacetamide7 Ibrotamide7 Isovaleryl Diethylamide,Niaprazine7 Trieetamide7 Trimetozine7 Zolpidem e Zopiclone;

Derivados de ácido barbitúrico tais comoAllobarbital7 Amobarbital7 Aprobarbital7 Barbital7Brallabarbital7 Butabarbital Sodium7 Butalbital7Butallylonal, Butethal7 Carbubarb7 Cyelobarbital7Cyclopentobarbital7 Enallylpropymal, 5-Ethyl-5-(1-piperidyl)barbituric Acid7 5-Furfuryl-5-isopropylbarbituric Acid7Heptabarbitalf Hexethal Sodium, Hexobarbital, Mephobarbital,Methitural, Narcobarbital, Nealbarbital, PentobarbitalSodium, Phenallymal, Phenobarbital, Phenobarbital Sodium,Phenylmethylbarbituric Acid, Probarbital, Propallylonal,Proxibarbal, Reposal, Seeobarbital Sodium, Talbutal,Tetrabarbital, Vinbarbital Sodium e Vinylbital;

Derivados de benzodiazepina tais como Brotizolam,Doxefazepam, Estazolam, Flunitrazepam, Flurazepam,Haloxazolam, Loprazolam, Lormetazepam, Nitrazepam, Quazepam,Temazepam e Triazolam;

Bromidas tais como Ammonium Bromide, CalciumBromide, Calcium Bromolactobionate, Lithium Bromide,Magnesium Bromide, Potassium Bromide e Sodium Bromide;

Carbamatos tais como Amyl Carbamate-Tertiary,Ethinamate, Hexaprpymate, Meparfynol Carbamate, Novonal eTricholorourethan;

Derivados de cloral tais como Carbocloral, ChloralBetaine, Chloral Formamide, Chloral Hydrate,Chloralantipyrine, Dichloralphenazone, PentaerythritolChloral e Triclofos;

Piperidinadionas tais como Glutehimide,Methyprylon, Piperidione, Pyrithyldione, Taglutimide eThalidomide;

Derivados de quinazolona tais como Etaqualone,Mecloqualone e Methaqualone; e

Outros, tais como Acetal, Acetophenone, Aldol,Ammonium Valerate, Amphenidone, d-Bornyl α-Bromoisovalerate,d-Bornyl Isovalerate, Bromoform, Calcium 2-Ethylbutanoate,Carfinate, α-Chlorolose, Clomethiazole, Cypripedium,Doxylamine, Etodroxizine, Etomidate, Fenadiazole,Homofenazine, Hydrobromic Acid, Mecloxamine, MenthylValerate, Opium, Paraldehyde, Perlapine, Propiomazine,Rilmazafone, Sodium Oxybate, Sulfonethylmethane eSulfonmethane;

Agentes trombolíticos tais como APSAC, Plasmin,Pro-Urokinase, Streptokinase, Tissue Plasminogen Activator eUrokinase;

Hormônios tirotrópicos tais como TRH e TSH;Uricosúricos tais como Benzbromarone, Ethebenecid,Orotic Acid, Oxycinchophen, Probenecid, Sulfinpyrazone,Ticrynafen e Zoxazolamine;

Vasodilatadores (cerebrais) tais como Bencyclane,Cinnarizine, Citicoline, Cyclandelate, Ciclonicate,Diisopropylamine Dichloractetate, Eburnamorine, Fenoxedil,Flunarizine, Ibudilast, Ifenprodil, Nafronyl, Nicametate,Nicergoline, Nimodipine, Papaverine, Pentifylline,

Tinofedrine, Vincamine, Vinpocetine e Viquidil;

Vasodilatadores (coronários) tais como Amotriphene,Bendazol, Benfurodil Hemisuccinate, Benziodarone,Chloacizine, Chromonar, Clobenfurol, Cionitrate, Dilazep,Dipyridamole, Droprenilamine, Efloxate, Erythritol,Erythrityl Tetranitrate, Etafenone, Fendiline, Floredil,Ganglefene, Hexestrol Bis(β-diethylaminoethyl ether),Hexobendine, Itramin Tosylate, Khellin, Lidoflazine, MannitolHexanitrate, Medibazine, Nicorandil, Nitroglycerin,Pentaerythritol Tetranitrate, Pentrinitrol, Perhexiline,Pimefylline, Prenylamine, Propatyl Nitrate7 Pyridofylline,Trapidil, Tricromyl, Trimetazidine, Trolnitrate Phosphate eVisnadine;

Vasodilatadores (periféricos) tais como AluminumNicotinate, Bamethan, Bencyclane, Betahistine, Bradykinin,Brovincamine, Bufoniode7 Buflomedil, Butalamine, Cetiedil,Ciclonicate, Cinepazide7 Cinnarizine7 Cyclandelate7Diisopropylamine Dichloracetate7 Eledoisin7 Fenoxidil7Flunarisine, Heronicate, Ifenprodil, Inositol Niacinate7Isoxsuprine7 Kallidin, Kallikrein, Moxisylyte7 Nafronyl7Nicametate, Nicergoline, Nicofuranose, Nicotinyl Aleohol,Nylidrin, Pentifylline, Pentoxifylline, Piribedil,Protaglandin E1, Suloetidil e Xanthinal Niacinate;

Vasoprotetores tais como Benzarone, BiofIavonoids,Chromocarb, Clobeoside, Diosmin, Dobesilate Calcium, Esein,Roleseutol, Leueoeyanidin, Meteseufylline, Quereetin7 Rutin eTroxerut in,-

Vitaminas, fontes de vitaminas e extratos devitaminas tais como Vitaminas A, B, C, D, E, eKe derivadosdestas, Calciferols, Glycyrrhiza e Mecobalamin;

Agentes vulneráveis tais como Acetileysteine,Allantoin, Asiaticoside, Cadexomer Iodine, Chitin,Dextranomer e Oxaceprol;

Anticoagulantes tais como a heparina;

Diversos como Erythropoietin (Hematínico),Filgrastim, Finasterlde (Hipertrofia Benigna da Próstata) eInterferon β l-α (Eselerose Múltipla).

Em determinadas realizações, o agente a seraplicado é uma ou mais proteínas, hormônios, vitaminas ouminerais. Em determinadas realizações, o agente a seraplicado é selecionado entre insulina, IGF-I, testosterona,vinpocetina, hexarelina, GHRP-6 ou cálcio. Em determinadasrealizações, as composições contêm dois ou mais agentes.

A lista acima de agentes ativos é com base nessascategorias e espécies de drogas determinadas nas páginasTHER-I a THER-28 do The Merck Index, 12th Edition, Merck &Co. Rahway, N. J. (1996) . Esta referência é incorporada atítulo de referência na presente invenção em sua totalidade.

D. Utilizações das composições

As aplicações terapêuticas e diagnosticas dasmicroesferas incluem a aplicação de drogas, vacinação,terapia de genes e geração de imagens de tecido ou de tumorin vivo. As vias de administração incluem a administraçãooral ou parenteral; administração mucosal; administraçãooftálmica; injeção intravenosa, subcutânea ou intra-articularou injeção intramuscular; administração por inalação; e

administração tópica.

As doenças e os distúrbios podem incluir, mas não

se limitam a distúrbios neurais, distúrbios respiratórios,distúrbios do sistema imunológico, distúrbios musculares,distúrbios reprodutores, distúrbios gastrintestinais,distúrbios pulmonares, distúrbios digestivos, distúrbiosmetabólicos, distúrbios cardiovasculares, distúrbios renais,distúrbios proliferativos, doenças cancerosas e inflamação.

As micropartículas providas na presente invençãopodem ser utilizadas para tratar doenças infecciosas, taiscomo infecções arbovirais, botulismo, brucelose, candidíase,campilobacteriose, catapora, clamídia, cólera, infecções porcoronavírus, infecções por staphylococcus, infecções porcoxsackievírus, doença de Creutzfeldt-Jakob,

criptosporidiose, infecção por ciclospora, infecções porcitomegalovírus, infecção pelo vírus de Epstein-Barr, febredo dengue, difteria, infecções do ouvido, encefalite,infecções pelo vírus influenza, infecções pelo vírusparainfluenza, giardíase, gonorréia, infecções porHaemophilus influenzae, infecções por hantavírus, hepatiteviral, infecções pelo vírus herpes simplex, HIV/AIDS,infecção por helicobacter, infecções por papilomavírus humano(HPV), mononucleose infecciosa, legionelose, lepra,leptospirose, listeriose, doença de Lyme, coriomeningiteIinfocítica, malária, sarampo, febre hemorrágica de Marburg,meningite, varíola símia, caxumba, infecção pormicobactérias, infecção por micoplasma, infecção pelo vírusde Norwalk, coqueluche, infecção por oxiúros, doençapneumocócica, infecção por Streptococcus pneumoniae, infecçãopor Mycoplasma pneumoniae, infecção por Moraxellacatarrhalis, infecção por Pseudomonas aeruginosa, infecçãopor rotavírus, psitacose, hidrofobia, infecção pelo vírussincitial respiratório (RSV), tinha, febre maculosa dasMontanhas Rochosas, rubéola, salmonelose, SARS, escabiose,doenças sexualmente transmissíveis, shigelose, herpes-zóster,esporotricose, infecções estreptocócicas, sífilis, tétano,triquinose, tuberculose, tularemia, febre tifóide, meningiteviral, meningite bacteriana, infecção pelo vírus do NiloOcidental, febre amarela, zoonoses por iersiniose e quaisqueroutras doenças infecciosas do trato respiratório, pulmonar,dermatológico, gastrointestinal e urinário.

Outras doenças e condições incluem artrite, asma,condições alérgicas, doença de Alzheimer, cânceres, doençacardiovascular, esclerose múltipla (EM), doença de Parkinson,fibrose cística (FC), diabetes, hepatite não-viral,hemofilia, distúrbios de coagulação, distúrbios sangüíneos,distúrbios genéticos, distúrbios hormonais, doenças renais,doenças hepáticas, distúrbios neurológicos, doençasmetabólicas, doenças de pele, doenças da tiróide,osteoporose, obesidade, acidente vascular cerebral, anemia,doenças inflamatórias e doenças autoimunes.

E. Combinações, Kits, Artigos de Manufatura

As combinações e os kits que contêm as combinaçõesprovidas na presente invenção incluindo as micropartículas ouingredientes para a formação de micropartículas tais como umaproteína ou outras macromoléculas, contraíons, solventes,tampões ou sais e incluindo opcionalmente instruções para aadministração são providos. As combinações incluem, porexemplo, as composições tal como provido na presente invençãoe os reagentes ou as soluções para a diluição das composiçõesa uma concentração desejada para a administração a umindivíduo hospedeiro, incluindo os seres humanos. Ascombinações também podem incluir as composições tal comoprovido na presente invenção e os agentes terapêuticos e/ounutritivos adicionais, incluindo as drogas, tal como providona presente invenção.

São providos adicionalmente na presente invenção oskits que contêm as combinações e opcionalmente as instruçõesdescritas acima para a administração pelas vias oral,subcutânea, transdermal, intravenosa, intramuscular,oftálmica ou outras, dependendo da proteína e do agenteadicional opcional a ser aplicado.

As composições providas na presente invenção podemser acondicionadas como artigos de manufatura que contêm omaterial de acondicionamento, uma composição provida napresente invenção e uma etiqueta que indique que acomposição, por exemplo, uma formulação DAS181, é formuladapara a aplicação oral, pulmonar ou outra.

Os artigos de manufatura providos na presenteinvenção podem conter materiais de acondicionamento. Osmateriais de acondicionamento para a utilização noacondicionamento de produtos farmacêuticos são bem conhecidospelos elementos versados na técnica. Vide, por exemplo, asPatentes Norte-americanas N°. 5.323.907, 5.052,558 e 5.033.252. Os exemplos de materiais de acondicionamentofarmacêuticos incluem, mas não são limitados a sacos debolhas, frascos, tubos, inaladores, bombas, sacolas, frascos,recipientes, garrafas e qualquer material de acondicionamentoapropriado para uma formulação selecionada e um modopretendido de administração e de tratamento.

Os seguintes exemplos são incluídos parafinalidades ilustrativas somente e não se prestam a limitar oâmbito da invenção.

EXEMPLO 1

Preparação de microesferas da proteína de fusão de sialidase,DAS181A. Purificação de DAS181

DASl81 é uma proteína de fusão que contém o domíniode ligação da heparina (glicosaminoglicano ou GAG) daanfirregulina humana fundida através de seu N-término ao C-término de um domínio catalítico de Actinomyces viscosus(seqüência de aminoácido determinada na SEQ ID N0.: 17). Aproteína DAS181 foi purificada como descrito em Malakhov etal., Antimicrob. Agents Chemother., 1470-1479, 2006, que éincorporado em sua totalidade a título de referência napresente invenção. Resumidamente7 a codificação do fragmentodo DNA para DASl81 foi clonada no vetor de plasmídeo pTrc99a(Pharmacia; SEQ ID N0.: 16) sob o controle de um IPTG(promotor de isopropil-S-D-tiogalactopiranosídeo indutível).0 construto resultante foi expressa na cepa BL21 deEscherichia coli (E. coli).

As células de E. coli que contêm o construtoexpresso foram lisadas pela sonicação em 50 mM de tampão defosfato, pH 8,0; 0,3 M de NaCl e 10% de glicerol. 0 lisatoclarificado foi passado através de uma coluna de SP-Sepharose. As proteínas foram eluídas a partir da coluna comtampão de Iise que continha 0,8 M de NaCl. A fração eluída deSP-Sepharose foi ajustada a 1,9 M de sulfato de amônio((NH4)2S04), clarificada por centrifugação e carregada em umacoluna de butil-Sepharose. A coluna foi lavada com doisvolumes de 1,3 M de (NH4)2S04 e a proteína de fusão DAS181foi eluída com 0,65 M de (NH4)2S04.

Para a etapa final, a cromatografia de exclusão detamanho foi executada em Sephacryl S-200 equilibrado comsolução salina tamponada por fosfato (PBS). A pureza daproteína foi determinada como sendo mais de 98%, comoavaliado pela eletroforese em gel de poliacrilamida dedodecil sulfato de sódio, pela cromatografia líquida de altapressão de fase reversa e pelo ensaio imunossorvente ligado aenzimas com os anticorpos gerados contra as proteínas dacélula de E. coli. A DAS181 purificada, peso molecular de44.800 Da, foi dializada contra 2 mM de tampão de acetato desódio, pH 5,0.

B. Atividade de DAS181

A atividade de sialidase de DAS181 foi medidautilizando o substrato fluorogênico 4-metilumbeliferil-N-acetil-a-D-ácido neuramínico (4-MU-NANA; Sigma) . Uma unidadede sialidase é definida como a quantidade de enzima quelibera 10 nmol de UM-NANA em 10 minutos a 370C (50 mM detampão de CH3COOH-NaOH, ao pH 5,5) em uma reação que contém20 nmol de 4 - UM - NANA em um volume de 0,2 ml (Potier etal., Anal. Biochem., 94:287-296, 1979). A atividadeespecífica de DAS181 foi determinada como sendo de 1.300 U/mgde proteína (0,77 de μς de proteína de DAS181 por unidade deatividade).

C. Preparação de microesferas utilizando DAS181purificada

DAS181 (10 mg/ml), purificada e preparada tal comodescrito sob a Seção A acima, foi utilizada par formarcoquetéis de 200 μΐ tal como mostrado abaixo. Os coquetéiscontinham glicina ou citrato como contraíons e isopropanolcomo o solvente orgânico, como segue:

1) DAS181 + 5 mM de glicina, pH 5,0;

2) DAS 181 + 5 mM de glicina, pH 5,0 + 10% deisopropanol;

3) DAS181 + 5 mM de citrato de sódio, pH 5,0;

4) DAS181 + 5 mM de citrato de sódio, pH 5,0 + 10%de isopropanol;

Tubos de microcentrífuga plásticos contendo oscoquetéis com ingredientes tal como descrito acima em 1) - 4)foram refrigerados gradualmente:

(a) da temperatura ambiente (de aproximadamente25 °C) a 4 0C ao colocar os coquetéis em um refrigerador,seguido por:

(b) resfriamento a -20°C ao colocar o coquetelresultante de (a) em um freezer, seguido por:

(c)congelamento a -800C ao colocar o coquetelresultante de b) em um freezer.

Sob condições mais favoráveis, esperou-se que asmicroesferas se formassem entre aproximadamente 40C aaproximadamente -200C (geralmente na faixa de aproximadamente-2°C a aproximadamente -15°C). O congelamento a -80°C érealizado para remover os ingredientes do coquetel à exceçãodas microesferas (por exemplo, solvente, etc.) por meio desecagem por congelamento. O coquetel 4) foi preparado emtriplicata, duas alíquotas em tubos plásticos e uma em umtubo de vidro. Uma alíquota (em um tubo plástico) foirefrigerada como descrito acima, sendo que as duas outrasalíquotas (uma em um tubo plástico e uma em um tubo de vidro)foram submetidas ã resfriamento/congelamento rápidos aomergulhar os tubos em nitrogênio líquido.

Quando do congelamento, todos os tubos foramcolocados no liofilizador e os voláteis (água e isopropanol)foram removidos por sublimação, tornando as pelotas secas.

Resultados: As pelotas secas recuperadas doscoquetéis tratados como descrito acima foram testadas quantoà presença de microesferas. Das amostras acima, asmicroesferas com boas características de dispersividade, comaproximadamente 2 micra (μπι) de tamanho, foram observadassomente com o coquetel 4) que contém o contraíon do citrato eo isopropanol e foram submetidas ao resfriamento gradual. Aglicina do contraíon não se mostrou mais favorável para aproteína DAS181 (coquetel 2), mostrando uma mistura decristais similares a vidro e aglomerados com somente algumasmicroesferas. Quando nenhum solvente orgânico estavapresente, a massa similar a vidro da proteína liofilizada deDAS 181 foi obtida e nenhuma microesfera foi observada(coquetéis 1) e 3)). O congelamento rápido do coquetel 4 emum tubo de vidro produziu cristais similares a vidro enenhuma microesfera, sendo que o congelamento rápido docoquetel 4 em um tubo plástico (a taxa de resfriamento éligeiramente mais lenta devido a uma difusão mais lenta docalor através do plástico do que através do vidro) produziumicroesferas aglomeradas.

Este exemplo demonstra que as microesferas comdistribuição de tamanho estreita e boa dispersividade(aglomeração mínima) podem ser produzidas por uma combinaçãode proteína, contraíon, solvente orgânico apropriada e deresfriamento gradual, utilizando os métodos providos napresente invenção.

EXEMPLO 2

Tamanho das microesferas de DAS181 como uma função daconcentração de solvente orgânico

A DAS181 foi purificada e utilizada para prepararmicroesferas tal como descrito acima no Exemplo 1 (vide ocoquetel 4)), utilizando uma combinação de proteína DAS181(10 mg/ml), contraíon de citrato (citrato de sódio, 5 mM) esolvente orgânico de isopropanol (10%, 20% ou 30%) . Assoluções de coquetel resultantes foram refrigeradas datemperatura ambiente (de aproximadamente 25°C) a 4°C, seguidopor resfriamento a -20°C, seguido por congelamento a -80°C,tal como descrito no Exemplo 1. Quando do congelamento a -80°C, os tubos foram colocados em um liofilizador e osvoláteis (água e isopropanol) foram removidos por sublimação,deixando um pó seco que contém microesferas.

Resultados: A formação de microesfera foi observadacom todas as três concentrações: 10%, 20% ou 30% do solventeorgânico de isopropanol. As dimensões das microesferasvariaram, no entanto, dependendo da concentração do solventeorgânico. Os tamanhos das microesferas tal como determinadoem comparação às partículas a uma grade em um hemocitômetroforam estimados como sendo de 2 micra utilizando 10% deisopropanol, 4 micra utilizando 20% de isopropanol e 5-6micra utilizando 30% de isopropanol. Estes resultadosdemonstram que o tamanho das micropartículas pode serprojetado conforme desejado, utilizando uma concentração desolvente orgânico apropriada.

EXEMPLO 3

Tamanho das microesferas de DAS181 como uma função daconcentração de proteína

A DAS181 foi purificada e utilizada para prepararmicroesferas tal como descrito acima no Exemplo 1 (vide ocoquetel 4)), utilizando uma combinação de proteína DAS181 (5mg/ml ou 10 mg/ml), contraíon de citrato (citrato de sódio, 5TtiM) e isopropanol (5% ou 20%) . As soluções de coquetelresultantes foram refrigeradas da temperatura ambiente (deaproximadamente 25°C) a 4°C, seguido pela resfriamento a -20°C, seguido por congelamento a -80°C, tal como descrito no

Exemplo 1. Quando do congelamento a -80°C, os tubos foramcolocados em um liofilizador e os voláteis (água eisopropanol) foram removidos por sublimação, deixando um póseco que contém microesferas.

Resultados: A formação de microesfera foi observadacom ambas as concentrações de proteína (5 mg/ml e 10 mg/ml) eambas as concentrações de solvente orgânico (5% ou 20%) . Asdimensões das microesferas variaram, no entanto. Os coquetéisque contêm 5 mg/ml de proteína ou 10 mg/ml de proteína e 5%de isopropanol produziram microesferas estimadas como tendoaproximadamente 1,5 micra de tamanho. O coquetel que contém 5mg/ml de proteína e 20% de isopropanol produziu microesferasde um tamanho estimado de aproximadamente 3 micra, sendo queo coquetel que contém 10 mg/ml de proteína e 20% deisopropanol produziu microesferas com um tamanho estimado deaproximadamente 4 micra. Estes resultados demonstram que otamanho das micropartículas pode ser projetado conformedesejado, utilizando uma concentração de proteína apropriada,ou uma combinação da concentração de solvente orgânico econcentração de proteína apropriada.EXEMPLO 4

Tamanho das microesferas DAS181 como uma função da

concentração de contraíon

A DAS181 foi purificada e utilizada para prepararmicroesferas tal como descrito acima no Exemplo 1 (vide ocoquetel 4)), utilizando uma combinação de proteína DAS181(10 mg/ml), contraíon de citrato (citrato de sódio; 2 mM, 3mM ou 6 mM) e isopropanol (20%) . As soluções de coquetelforam misturadas em frascos de vidro e foram refrigeradas de+200C a -400C em uma rampa de congelamento de 1°C por minutoem um liofilizador Millrock Laboratório Series. Os voláteis(água e isopropanol) foram removidos por sublimação a 100 mTorr com a secagem primária a -300C por 12 horas e a secagemsecundária a 300C por 3 horas, deixando um pó seco que contémmicroesferas.

Resultados: A formação de microesfera foi observadaem todas as três concentrações de contraíon de citratotestadas. 0 tamanho das microesferas aumentou de 1 mícron em2 mM de citrato, a 3 micra em 3 mM de citrato, a 5 micra em 6mM de citrato. A adição de 1 mM de acetato do sódio ou de 1mM de cloreto de sódio ao coquetel que contém 2 mM de citratonão afetou a formação das microesferas provocada pelocontraíon de citrato. Estes resultados demonstram que otamanho das micropartículas pode ser projetado conformedesejado, utilizando uma concentração de contraíonapropriada.EXEMPLO 5

Microesferas DAS181 formadas na presença de tensoativos

A adição de tensoativos às microesferasmacromoleculares (por exemplo, de proteína) podefreqüentemente aprimorar as características das microesferas,tornando-as apropriadas para a administração a um indivíduo,tais como a capacidade de fluxo, a dispersividade e adisposição para uma via de administração particular, tal comoa inalação intranasal ou oral. Para testar se os tensoativospodem ser incorporados nos métodos de manufatura dasmicroesferas, tal como provido na presente invenção, aprodução das microesferas DAS181 foi empreendida tal comodescrito no Exemplo 1 acima, exceto que, adicionalmente, umtensoativo foi adicionado à solução.

A uma solução de coquetel que contém 5 mg/ml deDAS181, 5 mM de citrato de sódio e 20% de isopropanol, foramadicionados um tensoativo (3,5% em peso/peso de lecitina,0,7% em peso/peso de Span-85® [trioleato de sorbitano] ou3,5% em peso/peso de ácido oléico). As microesferas foramformadas pela resfriamento das soluções a 4°C, seguido pelaresfriamento a -20°C, seguido pelo congelamento a -80°C paraa Iiofilização, tal como descrito acima no Exemplo 1. Quandodo congelamento, os tubos foram colocados em um liofilizadore os voláteis (água e isopropanol) foram removidos porsublimação, deixando um pó seco que contém microesferas.

Resultados: As microesferas que resultam dotratamento de cada um dos coquetéis acima tal como descritoacima foram espalhadas em lâminas de vidro utilizandolamínulas friccionadas em um movimento circular. A formaçãoeficiente de microesfera foi observada em todos os casos.Quando as amostras que continham tensoativo foram comparadasà amostra que continha todos os ingredientes restantes, masnenhum tensoativo adicionado, observou-se que as microesferasformadas na presença de tensoativo tinham dispersividadeaprimorada (aglomeração ou agregação menor).

EXEMPLO 6

Preparação de microesferas de albumina de soro bovino (BSA)pela seleção de tipos e concentrações apropriados desolventes orgânicos e de contraíons

Conforme descrito na presente invenção, os métodosprovidos na presente invenção podem ser empiricamenteotimizados no formato de efluência elevada para obtermicroesferas que têm as características desejadas incluindo otamanho, a capacidade de fluxo e a dispersividade. Afinalidade desta experiência foi demonstrar que ao variar ostipos e as concentrações de solventes orgânicos e decontraíons, bem como o pH do coquetel, o tamanho e aqualidade das microesferas de uma proteína de interesse,neste caso, a albumina de soro bovino (BSA), podem serajustados.

As soluções de coquetel que contêm 5 mg/ml de BSA evários solventes orgânicos e contraíons no pH e nasconcentrações indicados (vide a Tabela 1) foram colocadas emuma placa de microtitulação (volume final por cavidade de 0,1ml) . Os coquetéis foram refrigerados de +200C a -400C em umarampa de congelamento de 1°C por minuto em um liofilizadorMillrock Laboratório Series. Os voláteis foram removidos porsublimação a 100 mTorr, com uma secagem primária a -30°C por12 horas e uma secagem secundária a 300C por 3 horas.

Resultados: Os resultados são mostrados na Tabela 1abaixo. Para a proteína de BSA, as combinações (de contraíone de solvente orgânico, respectivamente) que produziram asmicroesferas mais uniformes com cristalização ou agregaçãomínima incluem:

(1) citrato + isopropanol

(2) citrato + acetona(3) ácido itacônico + 1-propanol

(4) glicina + dioxano

(5) glicina + 1-propanol

(6) rubídio + 1-propanol

(7) perclorato + 1-propanol

Tabela 1: Seleção de rendimento elevado de microesferas deBSA formadas sob condições diferentes

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Estes resultados demonstram que, paraproteína, múltiplas formulações podem ser selecionadasimediatamente para a melhor formação de microesferas(dimensões desejadas, uniformidade, dispersividade, agregaçãomínima e formação de cristais, etc.) no formato de elevado-rendimento. As combinações dos reagentes e das condições(contraíon, solvente orgânico, pH, concentrações)selecionados da seleção inicial podem então ser ainda passarpor um ajuste fino tal como desejado.EXEMPLO 7Preparação de microesferas utilizando uma variedade deproteínas

Os métodos aqui apresentados podem ser utilizadospara preparar microesferas utilizando uma variedade deproteínas. Além da DAS181 e da BSA exemplificadas acima,foram utilizados métodos para preparar microesferas detripsina, hemoglobina, dNase I, lisozima, ovalbumina, rNAseA, inibidor de proteinase humana etiquetada com hexahistidina8 (PI8, que tem a seqüência de aminoácidos indicada na ID SEQN0.: 15), proteína fluorescente vermelha (RFP) e proteínafluorescente verde (GFP).

A dNase I, a tripsina e a hemoglobina foramcompradas junto à Worthington. A lisozima, a ovalbumina e arNAse A foram compradas junto à Sigma. A purificação de PI8etiquetada com 6xHis, GFP e RFP: PI8 etiquetada com 6xHis,GFP e RFP foram expressas e purificadas essencialmente talcomo descrito para DAS181 no Exemplo 1 acima, com asseguintes modificações:

Purificação de GFP etiquetada com 6xHis e RFP etiquetada com6xHis: Os construtos que codificam a proteína fluorescentevermelha e a proteína fluorescente verde com etiquetas His6de N-terminal foram expressas em E. coli como proteínasetiquetadas com 6xHis. A expressão da proteína fluorescentevermelha foi prosseguida durante toda a noite no meio LB com1 mM de IPTG. A proteína fluorescente verde foi induzida portrês 3 horas no meio TB com 1 mM de IPTG. Os lisatos decélulas de 4 litros de culturas induzidas foram clarificados

através de centrifugação e as proteínas foram purificadasatravés de pelo cromatografia de afinidade de quelato demetal em resina de quelação de fluxo rápido (GE Healthcare),carregada com níquel e acondicionada em colunas C-IO (GEHealthcare).

As proteínas ainda foram purificadas através de

cromatografia com filtração de gel em uma coluna Sefacryl 200de 0,5 cm χ 70 cm equilibrated com solução salina tamponadacom fosfato. As proteínas foram dializadas contra 2 mM detampão de acetato de sódio, pH 5,0, e concentradas em um

Centriprep (Amicon).

Purificação de PI8 etiquetada com 6xHis: Um construto quecodifica PI8 com uma etiqueta His6 de N-terminal foi expressoem E. coli como PI etiquetada com 6xHis. A purificação foiexecutada tal como descrito para 6xHis RFP e 6xHis GFP acima,com a exceção de que todos os tampões utilizados nas váriasetapas cromatográficas de purificação continham 1 mM de TCEP(cloridretp de Tris(2-carboxietil)fosfina).

Preparação das microesferas: Soluções de coquetel contendo 5mg/ml de proteína e vários contraíons, solventes orgânicos eum pH tal como listado abaixo foram preparadas em uma placade microtitulação tal como descrito acima no Exemplo 6.

Tabela 2: Combinações utilizadas para produzir microesferasde proteínas diferentes

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A placa de microtitulação foi resfriada de +20°C a-4OºC em uma rampa de congelamento de 1°C por minuto em umliofilizador Millrock Lab Series. Os componentes voláteis(água e isopropanol) foram removidos através de sublimação a100 mTorr com secagem primária a -30°C. por doze horas esecagem secundária a 30°C por três horas, restando o pó secoque contém as microesferas.

Os pós secos foram espalhados em lâminas de vidro eo microfotografia foi executada através de uma objetiva de32x ou então de lOOx. Todas as combinações listadas na Tabela2 acima produziram microesferas de boa qualidade(distribuição de tamanho uniforme, dispersividade, com poucosagregados e/ou cristais). As microesferas variaram no tamanhode aproximadamente 0,4 a 1 mi] ícron (rNAse A, dNAse I) aaproximadamente 2 a 5 micra (6xHis PI8, lisozima), dependendoda proteína. Este exemplo demonstra que os métodosaquiapresentados podem ser utilizados para produzir microesferasa partir de uma ampla variedade e proteínas.

EXEMPLO 8

Distribuição de tamanho de partícula aerodinâmica demicroesferas DAS181 para a inalação: uma comparação dosmétodos aqui apresentados com a secagem por aspersão

Tal como aqui descrito, os métodos aquiapresentados podem ser utilizados para produzir microesferasem qualquer faixa desejada de tamanho, incluindo uma faixa deaproximadamente 0,5 mícron a aproximadamente 6-8 micra para aaplicação através de inalação.

A. Preparação das microesferas

Para testar a distribuição de tamanho de partículaaerodinâmica de pó seco de DAS181 (microesferas) formuladopara a aplicação por inalação, microesferas de DAS181 forampreparadas utilizando dois métodos tal como segue:

(a) Uma solução aquosa de DAS181 que contém 14mg/ml de DAS181, 5 mM de citrato de sódio, pH 5,0, foi secadapor aspersão em uma corrente de ar a 55°C, para produzirmicroesferas.

(b) Alternativamente, microesferas de DAS181 foramproduzidas de acordo com os métodos aqui apresentados. A umasolução aquosa de DAS181 que contém 14 mg/ml de DAS181, 5 mMde citrato de sódio, pH 5,0, foi adicionado isopropanol a 5%como solvente orgânico. A solução resultante foi resfriada de+20°C a -40°C em uma rampa de congelamento de 1°C por minutoem um liofilizador Millrock Lab Series. Os componentesvoláteis (água e isopropanol) foram removidos através desublimação a 100 mTorr com secagem primária a -30°C por dozehoras e secagem secundária a 30°C por três horas, restando opó seco que contém microesferas.

B. Distribuição de tamanho de partícula aerodinâmica dasmicroesferas

As microesferas preparadas tal como descrito noExemplo 8A foram testadas por Impacto de Cascata Andersen. Adeposição de compostos farmacêuticos no trato respiratóriopode ser predita pelo comportamento aerodinâmico daspartículas (microesferas) nos estágios/placas de coleta doimpactador de cascata.

A experiência do impacto de cascata foi executadautilizando as microesferas de DAS181 preparadas por um dosdois métodos alternativos descritos na seção A acima, isto é,pela secagem por aspersão ou pelos métodos aqui apresentados.

As microesferas (10 mg) foram carregadas em cápsulas degelatina. As cápsulas de gelatina foram colocadas em uminalador de pó seco CycloHaler (FarmaChemie) e sujeitadas aoimpacto de cascata. Um impactador de cascata não-viável deoito estágios Andersen (Thermo Electron, Boston) modificadopara ser utilizado a 90 litros por minuto do fluxo de ar eequipado com uma garganta USP, cone de indução e nenhum pré-separador, foi utilizado. As placas de coleta do impactadorque representam várias áreas/estágios pós-inalação dedeposição (traquéia, brônquios principais e secundários,brônquios terminais, alvéolos, etc.) foram revestidas com umaaspersão de silício para impedir o rebote das microesferas.

As microesferas dos estágios e das placas de coleta foramrecuperadas em uma solução salina tamponada com fosfatocontendo 0,1% de Tween, e a quantidade de DAS181 depositadarecuperada de cada estágio e placa de coleta foirquantificada ao medir a absorbância a 280 nm.

Resultados: O tamanho geométrico das microesferasproduzidas pelos dois métodos foi avaliado através demicroscopia luminosa e foi verificado que eles sãoessencialmente idênticos (uma faix de 1,5 - 3,0 micra) paraambos os métodos. Conforme mostrado na Tabela 3 abaixo, noentanto, a distribuição de tamanho de partícula aerodinâmicados dois preparados difere significativamente entre os doismétodos. Para as microesferas produzidas de acordo com ummétodo tal como aqui apresentado (isto é, o método (b) talcomo indicado na seção A acima), menos de 25% permeneceupreso na boca (garganta/cone do conjunto do impactador), aopasso que mais de 70% das microesferas foram aplicados àtraquéia e aos pulmões (com mais de 4 0% nos brônquiosterminais e nos alvéolos) . Em comparação, menos de 50% dasmicroesferas de DAS181 formadas através de secagem poraspersão (método (a) tal como indicado na seção A acima) foiaplicado à traquéia e aos pulmões (menos de 2 0% nos brônquiosterminais e nos alvéolos). Os resultados demonstram que osmétodos aqui apresentados podem produzir microesferas para aapliacção em pulmões profundos, e que as microesferasproduzidas pelos métodos aqui apresentados têm propriedadessuperiores de desfazer aglomerações e de fluidez (propiciamuma dose de aplicação mais alta) em comparação àsmicroesferas produzidas por um método de secagem poraspersão.

Tabela 3: Resultados de análises de impacto de cascata dasmicroesferas de DAS181

<formula>formula see original document page 143</formula><table>table see original document page 144</column></row><table>

EXEMPLO 9

Manufatura em grande escala de microesferas

Este exemplo demonstra que os métodos aquiapresentados podem ser escalados para a manufatura de grandesquantidades de DAS181. 0 processo descontínuo aqui descrito éapropriado para a manufatura de microesferas de pó seco dealta qualidade em uma quantidade que varia, por exemplo, demiligramas a aproximadamente um quilograma, e é limitado pelacapacidade do tanque de misturação e/ou do espaço deprateleira do Iiofilizador. Um processo "contínuo"alternativo aqui descrito pode ser utilizado para manufaturarquantidades que variam, por exemplo, de ecentenas de gramas acem ou mais qui logramas (100 gramas a 100 qui logramas oumais). A vantagem adicional do processo contínuo é umcontrole melhor sobre o resfriamento do coquetel.

A manufatura em grande escala por um processodescontínuo ou por um processo contínuo pode seguir, porexemplo, uma ou mais das etapas descritas abaixo em qualquercombinação de etapas ou métodos alternativos específicos:

Precipitação da proteína em microesferas. Estaetapa pode ser executada em um modo descontínuo ao colocar asolução de coquetel que contém a concentração desejada daproteína, o solvente orgânico e o contraíon na(s) bandeja(s)de liofilização e ao colocar a(s) bandeja(s) em prateleirasdo Iiofilizador. Alternativamente, as bandejas podem seresfriadas e congeladas em uma plataforma esfriada ou um outrotipo de equipamento (por exemplo, um freezer) e armazenadaspor um período de tempo, congeladas e liofilizadasposteriormente. Alternativamente, as microesferas podem serformadas pela precipitação em um vaso com agitação, em que ovaso é colocado em uma superfície fria ou uma bobina deresfriamento imersa em líquido ou enquanto o coquetel érecirculado através de um trocador de calor utilizando umabomba peristáltica. Alternativamente, as microesferas podemser formadas através de precipitação em um modo contínuo, aopassar a solução de coquetel através de um trocador(es) decalor uma vez ao utilizar uma bomba peristáltica. Remoção do líquido a granel. A suspensão das

microesferas pode ser concentrada utilizando centrifugaçãopadrão, centrifugação de fluxo contínuo (por exemplo, CARRViaFuge Pilot), ou a filtração (por exemplo, em fibra devidro, vidro sinterizado, filtros de polímero, cartuchos ocosde fibra (por exemplo, aqueles manufaturados pela GEHealthcare) ou cassetes de filtração de fluxo tangential(cassetes TFF, tais como aqueles manufaturados pela Milliporeou Sartorius)). A remoção do líquido a granel (50% ou mais)pode resultar em um ciclo de secagem mais rápido e em uma eficiência e rendimento mais elevados.

Secagem das microesferas. As microesferasrecuperadas formadas por qualquer modo podem ser secadas pormeio de liofilização convencional. Alternativamente, asmicroesferas podem ser secadas sob temperatura ambiente e pressão atmosférica, eliminando o uso do Iiofilizador.

Resultados: A proteína DAS181 foi processada comsucesso como pó seco (microesferas) por um modo contínuo talcomo aqui descrito. 0 coquetel que contém 10 mg/ml de DAS181,isopropanol a 20% e 2 mM de sulfato de sódio foi passadoatravés do trocador de calor 35 SERIES (Exergy, Garden City,NY) acoplado com um criostato de circulação NESLAB utilizandouma bomba peristáltica de modo que, durante a passagem, ocoquetel foi resfriado de aproximadamente 250C aaproximadamente -12°C. A suspensão resultante dasmicroesferas que saem do trocador de calor foi bombeada emuma bandeja de liofilização previamente esfriada (-40°C),congelada e liofilizada ou, alternativamente, bombeadadiretamente em nitrogênio líquido e então liofilizada. Asmicroesferas resultantes, que foram analisadas através demicroscopia e impacto de cascata, revelaram ser microesferasuniformes com aggregação mínima e boa dispersividade, e eramsimilares nas dimensões e na distribuição de tamanho departícula aerodinâmica às microesferas produzidas pelo mododescontínuo. Quando a solução formulada do coquetel de DAS181não foi esfriada (não foi passada através do trocador decalor, desse modo nenhuma precipitação das microesferas foiinduzida) e despejada diretamente em nitrogênio líquido,nenhuma microesfera foi observada e, ao invés disto, cristaisparecidos com vidro foram observados após a liofilização.EXEMPLO 10Processo de modo descontínua e formulação de microesferasDAS181 para a apliacção a vias aéreas respiratórias superiore central

Este exemplo descreve a formulação e um processopara a manufatura de microesferas de DAS181. Os teores dasolução de coquetel de DAS181 e as suas quantidades relativassão mostrados na Tabela 4 abaixo.Tabela 4: Fórmula de manufatura descontínua para microesferasde DAS181

<table>table see original document page 146</column></row><table><table>table see original document page 147</column></row><table>

(1) Tamanho de batelada: volume final do coquetel de 5,38litros. Rendimento teórico de 74 g do pó seco de DAS181 agranel.

(2) Componentes da solução de partida da proteína DAS181(API).

A. Produção da substância da droga a granel

Os termos substância da droga, ingredientefarmacêutico ativo e API são utilizados intercambiavelmenteneste exemplo e se referem à proteína DAS181. A produção daproteína DAS181 a granel foi executada tal como segue.Primeiramente, quantidades volumosas de DAS181 foramexpressas em E. coli (cepa BL21) essencialmente tal comodescrito no Exemplo 1. As células de E. coli que expressam aproteína DAS181 foram lavadas através de diafiltração em umaetapa de lavagem de coleta de fermentação utilizando o tampãoToyopearl 1, o cartucho de fibra oco UFP-500-E55 (GEHealthcare) e uma bomba peristáltica Watson-Marlow.

A proteína DAS181 recombinante foi purificada agranel das células. As eEspecificações detalhadas doscomponentes e dos tampões utilizados na purificação a granelde DAS181 são fornecidas nas Tabelas 5 e 6 abaixo. As célulascolhidas e lavadas foram lisadas em uma etapa dehomogenização ao passar as células duas vezes ao utilizar odisruptor de células Niro-Soave Panda. 0 homogenato obtidodesse modo foi clarificado através de microfiltração aoutilizar o tampão Toyopearl 1, o cassete TFF Hydrosart de O,2mícron e uma bomba Watson Marlow. O homogenato clarificadofoi então concentrado, permitindo que o lisato fosserecirculado sem alimentação de tampão fresco. Em seguida, aproteína DAS181 foi capturada do homogenato clarificado emuma resina Toyopearl SP-55Oc que foi lavada em uma série detampões (vide a Tabela 5) antes que a proteína DAS181 fosseeluída da resina. A concentração de cloreto de sódio doeluato foi ajustada em 1,0 M em um tampão final de 50 mM defosfato a um pH 8,0. O eluato contendo DAS181 foi passadoentão através de uma resina Toyopearl Hexyl-650C para umapurificação adicional utilizando um tampão Toyopearl 4. Oeluato da resina que contém a proteína DAS181 foi entãotrocado com tampão em 5 mM de acetato de sódio em uma etapade diafiltração (vide a etapa 8 na Tabela 5). A proteínaconcentrada foi passada em seguida através de um filtroSartorius Q SingleSep remove a fim de remover o DNA em ummodo de fluso passante. Isopropanol foi adicionado aofiltrado de Q SingleSep até uma concentração final de 20% emvolume/volume. A proteína DAS181 no tampão foi passadaatravés de uma resina Amberchrome CG300M equilibrada com umtampão Amberchrom (vide a etapa 11 na Tabela 5). A proteínaDAS181 a granel purificada foi então trocada com tampão notampão da formulação e concentrada através de diafiltração(vide a etapa 12 da Tabela 5).

Tabela 5: Purificação da substância da droga de DAS181 agranel<table>table see original document page 149</column></row><table><table>table see original document page 150</column></row><table> * Volumes em litros, exceto pelo fato que 4 χ denota os

múltiplos do volume de reteentatoCV = Volumes de ColunaNR = Não Registrado5 NS = Não Especificado

Tabela 6: Tampões utilizados durante o processo de

purificação de DAS181<table>table see original document page 150</column></row><table>B. Processo de Manufatura Descontínuo

Os ingredientes indicados na Tabela 4 foramcombinados para form ar microesferas de DAS181 em um processodescontínuo de larga escala tal como descrito abaixo.Etapa I: Descongelamento da substância da droga a granel

0,2 μπι da substância da . droga filtrada a granelcongelada em frascos de plástico foi descongelado durantetoda a noite à temperatura ambiente (25 ± 3°C).

Etapa II: Pesagem dos excipients e preparação das soluções

35,51 g do pó anidro de sulfato de sódio forampesados e Q.S. até 500 ml com água para irrigação, e agitadosentão para obter uma solução transparente. 18,38 g de pódiidratado de cloreto de cálcio pó foram pesados e Q.S. até250 ml com água para irrigação, e então agitados para obteruma solução transparente.

Etapa III: Preparação da solução de coquetel de DAS181

A 3,3 litros da substância da droga concentrada(19,55 g/l), 1,79 litro de água para irrigação foi adicionadolentamente com agitação, seguido por 0,0215 litro da soluçãode sulfato de sódio, 0,0028 litro da solução de cloreto decálcio e 0,269 litro de isopropanol. A solução foi agitadapara assegurar a misturação completa dos componentes.

Etapa IV: Filtração da solução de coquetel formulada atravésde um filtro de 0,2 μπι

A solução de coquetel formulada da etapa III foifiltrada através de um filtro de 0,2 \im em sacos de meioestéril para controlar os particulados e a biocarga.

Etapa V: Enchimento em bandejas de liofilização

A solução filtrada formulada foi despejada embandejas de liofilização Lyoguard em autoclave. Paraassegurar um resfriamento uniforme da solução e a formação demicroesferas de alta qualidade, foram preenchidas seisbandejas, cada uma delas com 0,9 litro ou menos da solução decoquetel.

Etapa VI: Congelamento e liofilização

As bandejas foram colocadas nas prateleiras doliofilizador (Hull 120FSX200) previamente esfriadas até -45 ±50C e a solução foi colocada para esfriar e congelar. Aformação das microesferas ocorreu quando a solução estavacongelada. O congelamento foi prosseguido por uma a duashoras para assegurar a solidificação completa. A temperaturado produto foi verificada pela leitura dos termopares unidosa duas das seis bandejas.As etapas do ciclo de liofilização são tal comosegue:

a) Ajustar o vácuo a 160 micra e permitir aevacuação até 100 - 200 micra;

b) Elevar a temperatura da prateleira até +IO0C portrês horas;

c) Manter a temperatura da prateleira em +IO0C por36 horas (secagem primária);

d) Traços do termopar examinados para verificar sea fase de secagem primária está completada e a temperatura doproduto estabilizada em 10°C ± 5°C por quinza a trinta horas.

e) Elevar a temperatura da prateleira até +30°C poruma hora e manter por três a cinco horas (secagemsecundária).

Etapa VII: Transferência das microesferas de DAS181 a granelpara o recipiente e misturação

Uma seção na película de fundo de cada bandeja deliofilização Lyoguard foi limpa utlizando lenços de limpeza euma abertura de 3 χ 3 cm foi feita com um bisturi. Asmicroesferas secas foram transferidas a um frasco deplástico. O frasco foi tampado e tombado quarenta vezes,mudando as direções com cada inversão. 0 tombamento era paraassegurar a uniformidade do conteúdo do frasco. As amostraspara o teste analítico foram tiradas e o frasco foi recapeadoe lacrado em sacos de plástico para a armazenagem.

No processo de manufatura de microesferas de DAS181a granel tal como descrito acima, foi verificado que osulfato é uma substância segura para ser utilizado como umcontraíon, e produziu de maneira reproduzível microesferascom uma distribuição de tamanho estreita. Além disso, osolvente orgânico isopropanol era uma boa escolha de solventeporque (1) é um solvente da classe 3, (2) pode produzirmicroesferas em uma ampla faixa (2 - 30%, em volume/volume)de concentrações, e (3) tem um ponto de congelaamentorelativamente elevado de modo que os seus vapores podem serpresos eficientemente durante a Iiofilização.

A concentração da proteína na formulação finalpoderia ser variada (10 - 14 mg/ml) , tal como poderia aconcentração de contraíons (1-5 mM) e do isopropanol (2 -30% em volume/volume), sem causar um impacto substancial naspropriedades físicas das microesferas ou na atividade daproteína DAS181 nas microesferas. A concentrações maiselevadas de isopropanol (15 - 30%), as microesferas formaramenquanto o coquetel ainda estava totalmente líquido. Aconcentrações mais baixas (2 - 15%), os cristais de gelocomeçaram a se formar primeiramente, seguidos pelaprecipitação para formar as microesferas.

C. Rendimento de DAS181 nas microesferas

O rendimento teórico de DAS181 nas microesferassecos é calculado de acordo com a seguinte fórmula:Rendimento teórico = proteína DAS181, g - fração de proteínano pó seco (microesferas)

O valor da fração de proteína (0,866) foiestabelecido empiricamente pela análise de diversas bateladasmanufaturadas de microesferas de DAS181. O rendimento teóricopara as quantidades tal como indicado na Tabela 2 é de 64,56g * 0,866 = 74,55 g. Foi verificado que o rendimento real depó seco de DAS181 é de 64 g.

Resultados: A adequabilidade das microesferaspreparadas tal como descrito na seção B acima para aadministração através de inalação oral foi testada porImpacto de Cascata Andersen. Os resultados são resumidos naTabela 7 abaixo. A deposição de compostos farmacêuticos notrato respiratório pode ser predita pelo deposição daspartículas (microesferas) nos estágios/placas de coleta doimpactador de cascata. Para um composto farmacêutico, porexemplo, microesferas de DAS181, que é administrado para aprevenção ou o tratamento das infecções virais que surgem notrato respiratório, tal como influenza, é desejável depositaro composto farmacêutico na garganta, na traquéia e nosbrônquios (vias aéreas respiratórias superior e central). Aproteína de fusão DAS181 aplicada às vias aéreasrespiratórias superior e central cliva os ácidos siálicos doreceptor das membranas das mucosas, desse modo impedindo aligação viral e a infecção nestes locais. Para a aplicaçõaideal das microesferas de DAS181 aos locais onde a infecçãoviral respiratória pode ser iniciada, isto é, na garganta, natraquéia ou nos brônquios, as microesferas não devem ser (a)demasiadamente grandes que fiquem presas na extremidadedianteira na boca (isto é, as microesferas são demasiadamentegrandes, de aproximadamente 8 micra ou mais); ou (b)demasiadamente pequenas que são depositados nos pulmõesprofundos e absorvidas sistemicamente na corrente sangüínea(isto é, 0,5 mícron ou menos). Para a aplicação demicroesferas de DAS181 à garganta, à traquéia e aosbrônquios, uma faixa do tamanho de aproximadamente 1 mícron aaproximadamente 5,5-6 micra é geralmente apropriada.

As microesferas de DAS181 manufaturadas tal comodescrito acima foram caracterizadas pelo impacto de cascataAndersen e foi verificado que são apropriadas para aaplicação às vias aéreas respiratórias superior e central comuma porcentagem suficientemente baixa (< 5%) depositada nosalvéolos.

Tabela 7: Distribuição de tamanho de partícula aerodinâmicade pó seco de DAS181 a 60 litros por minuto

<table>table see original document page 154</column></row><table><table>table see original document page 155</column></row><table>

A cápsula de HPMC foi preenchida com 10 ± 1,0 mg de pó secode DAS181 (8,5 mg ± 10% de proteína DAS181).

A fração EACI (Emitido) é a soma de todo o materialrecuperado da garganta de USP, do cone de indução e dosestágios -1 a 6.

As microesferas de DAS181 foram aindacaracterizadas pela difração a laser, que demonstrou,consistente com os resultados do impacto de cascata, que amaior parte das microesferas produzidas pelo método descritoneste exemplo está dentro de uma faixa de tamanho entre 1mícron e 5 micra. A microscopia eletrônica de varredura(detector FEI Quanta 200 Scanning Electron Microscope,Everhart Thornley (ET)) das microesferas de DAS181 preparadasde acordo com o método descrito neste exemplo revelou que asmicroesferas estão presentes como aglomerados de centenas emilhares de partículas individuais com um tamanho deaproximadamente 0,5 - 3 micra. Os aglomerados são dissipados,no entanto, facilmente pela turbulência do ar produzidadurante o acionamento através do inalador de pó seco (talcomo demonstrado pelo Impacto de Cascata Andersen ou pordifração a laser). A microscopia luminosa das microesferasdispersas em um tensoativo líquido (por exemplo, Triton X-IOOou Tween 20) ou solvente não-polar (por exemplo, álcool,acetona ou acetonitrilo) que não dissolve as microesferas,confirmou que os agregados são dissipados facilmente comomicroesferas uniformes individuais.

EXEMPLO 11

Preparação das microesferas de DAS181 utilizando sulfatos comexceção de sal de sódio

Os estudos mostraram que em determinados casos, porexemplo, em alguns asmáticos, a presença do sódio nasformulações para a administração pulmonar poderia acarretarum risco de induzir hiper-responsividade das vias aéreas(Agrawal et al., Lung, 183:375-387 (2005)). Este exemplotestou, portanto, sais alternativos, tais como sais de outrosmetais tais como o potássio, o magnésio e o cálcio.

As microesferas de DAS181 foram manufaturadas talcomo descrito acima no Exemplo 1. As soluções de coquetel quecontêm 12 mg/ml de DAS181 e isopropanol a 5% (emvolume/volume) continham como contraíons os sulfatosindicados a 2 mM de concentração, pH 4,5 - 5,0. Asmicroesferas foram formadas ao resfriar as soluções de +25°Cpara -45°C. Com o congelamento, os componentes voláteis (águae isopropanol) foram removidos através de sublimação,restando o pó seco que contém microesferas.

A distribuição de tamanho de partícula aerodinâmicado pó seco foi avaliada por Impacto de Cascata Andersen, e aquantidade de DAS181 por estágio foi determinada pela mediçãoUV a 226 nm (A226). Os resultados são mostrados abaixo naTabela 8. Os resultados demonstram que os sais de sulfato comexceção do sal de sódio podem ser utilizados como contraíonpara obter as microesferas de DAS181 de uma faixa de tamanhotal que a maior parte é aplicada à garganta, à traquéia e aosbrônquios, em uma quantidade que é comparável à quantidadeaplicada quando o sulfate de sódio é utilizado comocontraíon.

Tabela 8: Distribuição de tamanho de partícula aerodinâmicadas microesferas de DAS181 formuladas com ou sem sódio

<table>table see original document page 157</column></row><table>

Os pós secos também foram incubados a +370C ou a+53 0C para uma duração tal como indicado na Tabela 9 etestados quanto à atividade de sialidase utilizando o ensaio4-UM-NANA tal como descrito no Exemplo 1 e aqui incorporado atítulo de referência. A atividade relativa comparada àsmicroesferas de DAS181 não-Iiofilizadas armazenadas a -80°C émostrada na Tabela 9. Os resultados mostram que aestabilidade das microesferas preparadas utilizando váriossulfatos de metal como contraíons era comparável àquela dosulfato de sódio, com retenção de quase toda ou de toda aatividade por aproximadamente dois meses a 370C e retenção dequase toda (sulfatos de sódio e de potássio) ouaproximadamente 85% (sulfatos de magnésio e de zinco) aatividade por aproximadamente dez dias a 53°C. Estaexperiência demonstra que vários contraíons que não contêmsóidio podem produzir microesferas com característicasdesejáveis.Tabela 9: Atividade de Sialidase de formulações demicroesferas de DAS181: estudos de estabilidade acelerada

<table>table see original document page 158</column></row><table> EXEMPLO 12

Estabilidade das microesferas de DAS181

A estabilidade da proteína DAS181 nas microesferasfoi avaliada ao medir a atividade da sialidase com o passardo tempo utilizando o ensaio de atividade 4-UM-NANA tal comodescrito acima no Exemplo 1 e aqui incorporado a tirulo dereferência. A produção das microesferas de DAS181 secas foiempreendida em uma solução de coquetel que contém 10 mg/ml deDAS 181, 2 mM de sulfato de sódio, e isopropanol a 5% emvolume/volume. Para algumas soluções, 0,01% em peso/volume deaçúcar (sorbitol, manitol, trehalose ou sacarose) foiadicionado. As microesferas foram formadas ao resfriar assoluções de +25°C para -45°C. Com o congelamento, oscomponentes voláteis (água e isopropanol) foram removidosatravés de sublimação, restando os pós secos que contêmmicroesferas.

A. Estabilidade das microesferas de DAS181 sem açúcares

As microesferas de pó seco de DAS181 formuladas semaçúcares foram armazenadas à temperatura ambiente (25°C) emum recipiente ao lado do dessecativo Drierite (HammondDrierite, Xenia, OH). O pó seco reteve a sua potênciaoriginal (tal como medido pela atividade da sialidaseutilizando 4-MU-NANA de acordo com o Exemplo 1 e aquiincorporado a título de referência; os resultados sãomostrados na Tabela 10) e a distribuição de tamanho departícula aerodinâmica (tal como medido pelo impacto decascata Andersen; Tabela 11) por pelo menos oito meses.Tabela 10: Atividade específica de pó seco de DAS181

<table>table see original document page 159</column></row><table>

Tabela 11: Distribuicao de tamanho de paricula aerodinamicade pó seco de DAS181

<table>table see original document page 159</column></row><table>

Tabela 11: A distribuição de partícula aerodinâmica foi

avaliada por Impacto de Cascata Andersen e expressa como % deproteína DAS181 total recuperada. As cápsulas forampreenchidas com 10 mg de pó seco de DAS181 e acionadasutilizando o inalador de pó seco Cyclohaler como dispositivode aplicação. A vazão do ar era de 60 litros por minuto. Osensaios foram realizados em triplicata, e os desvios médio epadrão são mostrados.

B. Estabilidade das microesferas de DAS181formuladss com açúcares

A atividade de sialidase de DAS181 nas formulaçõesde microesferas de pó seco que contêm açúcares e nasformulações de microesferas não-liofilizadas armazenadas a -80⁰C foi medida utilizando o substrato fluorescente 4-MU-NANAtal como descrito no Exemplo 1 e aqui incorporado a título dereferência. As formulações de pó seco que não contêm nenhumaçúcar ou vários açúcares tal como indicado abaixo na Tabela12 foram armazenadas a +420C por quatro semanas (degradaçãoforçada). Os resultados são mostrados na Tabela 12. Emrelação às formulações não-liofilizadas armazenadas a -80/C,a formulação que não contém nenhum açúcar reteve quase 80% desua atividade. A adição de vários açúcares aumenta aestabilidade de modo que aproximadamente 88-98% da atividadesão retidos, dependendo do açúcar.Tabela 12<table>table see original document page 160</column></row><table>Uma vez que modificações serão aparentes aobelementos versados nesta técnica, pretende-se que a presenteinvenção seja limitada somente pelo âmbito das reivindicaçõesanexas.

Claims

1. MÉTODO DE OBTENÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO À BASE DEPROTEÍNA, caracterizado pelo fato de compreender:a) a adição de um contraíon a uma solução quecontém a proteína em um solvente aquoso;b) a adição de um solvente orgânico ã solução; ec) o resfriamento gradual da solução até umatemperatura abaixo de aproximadamente 250C, por meio do queuma composição que contém micropartículas que compreendem aproteína é obtida, em que as etapas a) , b) e c) sãoexecutadas simultânea, seqüencial, intermitentemente, ou emqualquer ordem.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que as etapas a) e b) sãoexecutadas simultânea ou seqüencialmente em qualquer ordem,seguidas pela etapa c).

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que etapas a) , b) e c) sãoexecutadas seqüencialmente na ordem: a) , a seguir b) , e aseguir c) .

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico é miscívelou parcialmente miscível com o solvente aquoso.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente, após aetapa c), a separação das micropartículas da solução pararemover os componentes com exceção das micropartículas.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que a composição consisteessencialmente em micropartículas que compreendem a proteína.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que a separação é executadaatravés da sedimentação ou da filtração.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que a separação é executadaatravés de secagem por congelamento.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que osolvente orgânico é selecionado entre álcoois alifáticos,álcoois aromáticos, clorofórmio, cloreto de dimetila, álcooisde açúcar poliídricos, hidrocarbonetos aromáticos, aldeidos,cetonas, ésteres, éteres, dioxanos, alcanos, alcenos, dienosconjugados, diclorometano, acetonitrilo, acetato de etila,polióis, poliimidas, poliésteres, polialdeidos, e as misturasdestes.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico é umálcool alifático ou um álcool aromático.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico é umálcool alifático.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que o álcool alifático é oisopropanol.

13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que ocontraíon é selecionado entre de um composto aniônico, umcomposto catiônico e um composto dipolar.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que o contraíon é um compostoaniônico.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o composto aniônico éselecionado entre glicina, citrato de sódio, sulfato desódio, sulfato de zinco, sulfato de magnésio, sulfato depotássio e sulfato de cálcio.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que o composto aniônico é osulfato de sódio.

17. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que asmicropartícuias são obtidas por meio de precipitação, daseparação de fases ou da formação de colóide.

18. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o pH dasolução é igual ou abaixo do pH da proteína.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17 ou areivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o pH dasolução varia de aproximadamente 4,0 ou 4,0 a aproximadamente-9,0 ou 9,0.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17 ou dareivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o pH dasolução varia de aproximadamente 4,5 ou 4,5 a aproximadamente-8,0 ou 8,0.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17 ou dareivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o pH dasolução varia de aproximadamente 4,5 ou 4,5 a aproximadamente-6,5 ou 6,5.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17 ou dareivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o pH dasolução varia de aproximadamente 4,5 ou 4,5 a aproximadamente-5,5 ou 5,5.

23. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, 12, 15, 16 ou 22, caracterizado pelofato de que a proteína é selecionada entre sialidases,proteínas de fusão da sialidase, proteases, inibidores deprotease, citocinas, insulina, hormônio humano docrescimento, calcitonina, DNase humana recombinante,interferons e hormônio da paratireóide.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que a proteína é um inibidor daprotease.

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que o inibidor de protease é oinibidor de protease humana 8 (PI8).

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que a proteína é uma proteína defusão da sialidase.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão dasialidase contem um domínio catalítico de um sialidase e umdomínio de ancoragem, em que o domínio catalítico dasialidase é a única parte da sialidase na proteína de fusãoda sialidase.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26 ou dareivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a sialidaseé uma sialidase de Actinomyces viscosus, uma sialidase deClostridium perfringens, uma sialidase de Arthrobacterureafaciens, umasialidase de Micromonospora viridifaciens,uma sialidase Neu2 humana ou uma sialidase Neu4 humana.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de que a sialidase é uma sialidase deActinomyces viscosus.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos dodomínio catalítico contém a seqüência dos resíduos deaminoácidos que começam em qualquer um dos aminoácidos doaminoácido 270 ao aminoácido 290 e que terminam em qualquerum dos aminoácidos do aminoácido 665 ao aminoácido 901 daseqüência de aminoácidos indicada na ID SEQ N°.: 1.

31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado pelo fato de que a seqüência do domíniocatalítico da sialidase contém a seqüência de resíduos deaminoácidos indicada na ID SEQ №.: 2.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado pelo fato de que a seqüência do domíniocatalítico compreende a seqüência dos resíduos de aminoácidosque começam no aminoácido 274 e que terminam no aminoácido 681 da seqüência de aminoácidos indicada na ID SEQ №.: 1.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que a seqüência do domíniocatalítico compreende a seqüência dos resíduos de aminoácidosque começam no aminoácido 274 e que terminam no aminoácido 666 da seqüência de aminoácidos indicada na ID SEQ N°.: 1.

34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado pelo fato de que a seqüência do domíniocatalítico compreende a seqüência de aminoácidos que começano aminoácido 2 90 e que terminam no aminoácido 681 daseqüência de aminoácidos indicada na ID SEQ №.: 1.

35.MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 27 e 29 a 34, caracterizado pelo fato de que aproteína de fusão contém um domínio de ancoragem que é umdomínio de ligação de glicosaminoglicano (GAG).

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de GAG éselecionado entre o domínio de ligação de GAG do fator deplaquetas humanas 4, o domínio de ligação de GAG deinterleucina humana 8, o domínio de ligação de GAG deantitrombina humanoa III, o domínio de ligação de GAG deapoproteína humana Ε, o domínio de ligação de GAG de proteínamigratória angio-associada humana e o domínio de ligação deGAG de anfiregulina humana.

37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos dodomínio de ligação de GAG contem a seqüência de resíduos deaminoácidos indicada na ID SEQ N0.: 3, ID SEQ N0.: 4,·ID SEQN0.: 5, ID SEQ N0.: 6, ID.NO:7 SEQ OU ID SEQ N°.: 8.

38. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 37,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos dodomínio de ligação de GAG contém a seqüência de resíduos deaminoácidos indicada na ID SEQ N0.: 8.

39. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos daproteína de fusão de sialidase contém a seqüência de resíduosde aminoácidos indicada na ID SEQ N0.: 9.

40. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos daproteína de fusão de sialidase contém a seqüência de resíduosde aminoácidos indicada na ID SEQ N0.: 10.

41. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos daproteína de fusão de sialidase contém a seqüência de resíduosde aminoácidos indicada na ID SEQ N0 . : 11 ou na ID SEQ N0. : 12.

42. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos daproteína de fusão de sialidase contém a seqüência de resíduosde aminoácidos indicada na ID SEQ N0. : 13 ou na ID SEQ N0. : 14.

43. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos daproteína de fusão de sialidase contém a seqüência de resíduosde aminoácidos indicada na ID SEQ N0.: 17.

44. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, 26, 27, 29 a 34 e 36 a 44,caracterizado pelo fato de que a composição demicropartícuias resultante também compreende agentes derevestimento resistentes a ácidos, agentes de revestimentoresistentes à protease, agentes de revestimento entéricos,agentes aumentadores de volume, excipientes, ingredientesinativos, intensificadores da estabilidade, modificadores desabor e/ou odor ou agentes mascaradores, vitaminas, agentesterapêuticos, antioxidantes, immuno-moduladores,modificadores do transporte de trans-membrana, agentes anti-endurecimento, quitosanas ou intensificadores de fluidez.

45. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, 26, 27, 29 a 34 e 36 a 44,caracterizado pelo fato de que a quantidade de proteína nasmicropartícuias em relação à quantidade total de proteína nasolução da etapa a) é aproximadamente 80% ou 80% a mais deaproximadamente 99% ou 99%.

46. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, 26, 27, 29 a 34 e 36 a 44,caracterizado pelo fato de que a temperatura ficacompreendida entre aproximadamente 4 0C aproximadamente e -45 0C.

47. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 46,caracterizado pelo fato de que a temperatura ficacompreendida entre aproximadamente 2 0C aproximadamente e -20 0C.

48. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 47,caracterizado pelo fato de que a temperatura fica25 compreendida entre aproximadamente 2 0C aproximadamente e -15 0C.

49. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 48,caracterizado pelo fato de que a temperatura ficacompreendida entre aproximadamente 0°C ou O0C eaproximadamente -2°C ou -2°C e aproximadamente -15°C ou -15°Ce aproximadamente -20°C ou -20°C.

50. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, 26, 27, 29 a 34, 36 a 44 e 46 a 49,caracterizado pelo fato de que a composição à base deproteína resultante tem uma vida útil de aproximadamente umasemana a aproximadamente um mês, de aproximadamente um mês aaproximadamente seis meses, de aproximadamente seis meses aaproximadamente um ano, de aproximadamente um ano aaproximadamente dois anos, ou de aproximadamente dois anos aaproximadamente cinco anos, a uma temperatura deaproximadamente 55°C, 50°C, 45°C, 44°C, 42°C, 40°C, 39°C, 38°C, 37°C ou menos.

51. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que asolução e/ou a composição resultante também compreende umagente ativo.

52. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 51,caracterizado pelo fato de que o agente ativo é selecionadoentre antidiabéticos, anticonvulsionantes, analgésicos, anti-mnal de Parkinson, anti-inflamatórios, antagonistas decálcio, anestésicos, microbicidas, antimaláricos,antiparasíticos, antihipertensivos, antihistaminínicos,antipiréticos, agonistas alfa-adrenérgicos, alfa-bloqueadores, biocidas, bactericidas, dilatadores dosbrônquios, drogas bloqueadoras beta-adrenérgicas,contraceptivos, drogas cardiovasculares, inibidores de canaisde cálcio, antidepressivos, agentes de diagnóstico, diuréticos, eletrólitos, enzimas, hipnóticos, hormônios,hipoglicêmicos, hiperglicêmicos, constritores musculares,relaxantes musculares, neoplásticos, glicoproteínas,nucleoproteínas, lipoproteinas, oftálmicos, energizantespsíquicos, sedativos, esteróides, simpatomiméticos, parasimpatomiméticos, tranqüilizantes, drogas do tratourinário, vacinas, drogas vaginais, vitaminas, sais minerais,drogas anti-inflamatórias não-esteroidais, enzimas deconversão de angiotensina, polinucleotídeos, polipeptídeos epolissacarídeos.

53. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 51,caracterizado pelo fato de que o agente ativo é selecionadoentre antidiabéticos, enzimas, hormônios, vitaminas, saisminerais, e suplementos nutritivos.

54. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, 26, 27, 29 a 34, 36 a 44, 46 a 49, 52 e-53, caracterizado pelo fato de que o teor de umidade dasmicropartí cuias é ajustado, por meio do que pelo menosaproximadamente 90% da atividade da proteína são retidos apósuma armazenagem por aproximadamente seis meses aaproximadamente um ano a uma temperatura de aproximadamente 25'C.

55. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, 26, 27, 29 a 34, 36 a 44, 46 a 49, 52 e-53, caracterizado pelo fato de que o teor de umidade dasmicropartí cuias é ajustado, por meio do que pelo menosaproximadamente 90% das micropartículas não são agregadosapós a armazenagem por aproximadamente seis meses aaproximadamente um ano a uma temperatura de aproximadamente 25'C.

56. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que:a proteína é uma proteína de fusão que contém umdomínio catalítico da sialidase e um domínio de ancoragem, emque o domínio catalítico da sialidase é a única parte dasialidase na proteína de fusão;o solvente orgânico é adicionado em uma quantidadede aproximadamente 5% ou 5% a aproximadamente 20% ou 20% emvolume/volume;o contraíon é adicionado em uma quantidade deaproximadamente 1 mM ou 1 mM a aproximadamente 5 mM ou 5 mM;eo pH da solução é ajustado em aproximadamente 4,5ou 4,5 a aproximadamente 5,5 ou 5,5.

57. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 56,caracterizado pelo fato de que o domínio catalítico dasialidase é de Actinomyces viscosus e o domínio de ancoragemé o domínio de ligação de GAG de anfiregulina humana.

58. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 56 ou areivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o pH é deaproximadamente 5,0.

59. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 56 ou dareivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o contraíoné selecionado entre glicina, citrato de sódio, sulfato desódio, sulfato de zinco, sulfato de magnésio, sulfato depotássio e sulfato de cálcio.

60. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 59,caracterizado pelo fato de que o contraíon é o sulfato desódio.

61. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 56, dareivindicação 57 ou a reivindicação 60, caracterizado pelofato de que o solvente orgânico é o isopropanol.

62. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 56 ou dareivindicação 57, caracterizado pelo fato de compreenderadicionalmente a separação das micropartículas da soluçãopara remover os componentes com exceção das micropartículas.

63. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 62,caracterizado pelo fato de que a composição resultanteconsiste essencialmente em micropartículas que compreendem aproteína.

64. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 62,caracterizado pelo fato de que a separação é através dasedimentação ou da filtração.

65. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 62,caracterizado pelo fato de que a separação é através dasecagem por congelamento.

66. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 62,caracterizado pelo fato de que o teor de umidade dasmicroparticulas varia de aproximadamente 6% a aproximadamente 12%.

67. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 66,caracterizado pelo fato de que o teor de umidade dasmicroparticulas varia de aproximadamente 7% a aproximadamente 10,5%.

68. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato decompreender microparticulas de um sialidase ou de umaproteína de fusão da sialidase.

69. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 68,caracterizada pelo fato de que a proteína é uma proteína defusão da sialidase e a proteína de fusão da sialidasecompreende um domínio catalítico de uma sialidase e umdomínio de ancoragem.

70. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 68ou a reivindicação 69, caracterizada pelo fato de que asialidase é uma sialidase de Actinomyces viscosus, umasialidase de Clostridium perfringens, uma sialidase deArthrobacter ureafaciens, uma sialidase de Micromonosporaviridifaciens, uma sialidase Neu2 humana, ou um sialidaseNeu4 humana.

71. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 70,caracterizada pelo fato de que a sialidase é uma sialidase deActinomyces viscosus.

72. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 71,caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos dodomínio catalítico compreende a seqüência de aminoácidos quecomeça em qualquer um dos resíduos de aminoácidos doaminoácido 2 70 ao aminoácido 2 90 e que termina em qualquer umdos resíduos de aminoácidos do aminoácido 665 ao aminoácido-901 da seqüência de aminoácidos indicada na ID SEQ N0.: 1.

73. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 72,caracterizada pelo fato de que a seqüência do domíniocatalítico de sialidase compreende a seqüência de aminoácidosindicada na ID SEQ N0.: 2.

74. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 72,caracterizada pelo fato de que a seqüência do domíniocatalítico compreende a seqüência de aminoácidos que começano aminoácido 2 74 e que termina no aminoácido 681 da seqüência de aminoácidos indicada na ID SEQ N°.: 1.

75. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 72,caracterizada pelo fato de que a seqüência do domíniocatalítico compreende a seqüência de aminoácidos que começano aminoácido 2 90 e que termina no aminoácido 666 daseqüência de aminoácidos indicada na ID SEQ N0.: 1.

76. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 72,caracterizada pelo fato de que a seqüência do domíniocatalítico compreende a seqüência de aminoácidos que começano aminoácido 2 90 e que termina no aminoácido 681 daseqüência de aminoácidos indicada na ID SEQ N0.: 1.

77. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 6 9 a 76, caracterizada pelo fato de que odomínio de ancoragem é um domínio de ligação deglicosaminoglicano (GAG).

78. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 77,caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação de GAG éselecionado entre o domínio de ligação de GAG do fator deplaquetas humanas 4, o domínio de ligação de GAG deinterleucina humano 8, o domínio de ligação de GAG deantitrombina humana III, o domínio de ligação de GAG deapoproteínahumana Ε, o domínio de ligação de GAG da proteínamigratória anglo-associada humana e o domínio de ligação deGAG de anfiregulina humano.

79. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 78,caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos dodomínio de ligação de GAG compreende a seqüência deaminoácidos indicada na ID SEQ N0.: 3, ID SEQ N0.: 4, ID SEQN0.: 5, ID SEQ N0.: 6, ID SEQ N°.: 7 OU ID SEQ N°.: 8.

80. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 79,caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos dodomínio de ligação de GAG compreende a seqüência deaminoácidos indicada na ID SEQ N0.: 8.

81. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 69,caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos daproteína de fusão de sialidase compreende a seqüência deaminoácidos indicada na ID SEQ N°.: 9.

82. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 69,caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos daproteína de fusão de sialidase compreende a seqüência deaminoácidos indicada na ID SEQ N0.: 10.

83. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 69,caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos daproteína de fusão de sialidase compreende a seqüência deaminoácidos indicada na ID SEQ N0.: 11.

84. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 69,caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos daproteína de fusão de sialidase compreende a seqüência deaminoácidos indicada na ID SEQ N0.: 12.

85. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 69,caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos daproteína de fusão de sialidase compreende a seqüência deaminoácidos indicada na ID SEQ N0.: 13 ou em ID SEQ N0.: 14.

86. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 69,caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos daproteína de fusão de sialidase compreende a seqüência deaminoácidos indicada na ID SEQ N0.: 17.

87. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 68 a 86, caracterizada pelo fato de que aquantidade de proteína nas micropartículas varia deaproximadamente 6 0% a mais de aproximadamente 99% empeso/peso.

88. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 87,caracterizada pelo fato de que a quantidade de proteína nasmicropartículas varia de aproximadamente 65% aaproximadamente 90% em peso/peso.

89. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 88,caracterizada pelo fato de que a quantidade de proteína nasmicropartículas varia de aproximadamente 70% aaproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90% em peso/peso.

90. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 88,caracterizada pelo fato de que a quantidade de proteína nasmicropartículas varia de aproximadamente 90% aaproximadamente 99% em peso/peso.

91. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 68 a 90, caracterizada pelo fato de ter umavida útil de aproximadamente uma semana a aproximadamente ummês, de aproximadamente um mês a aproximadamente seis meses,de aproximadamente seis meses a aproximadamente um ano, deaproximadamente um ano a aproximadamente dois anos, ou deaproximadamente dois anos a aproximadamente cinco anos, a umatemperatura de aproximadamente 55°C, 50°C, 45°C, 44°C, 42°C,-40°C, 39°C, 38°C, 37°C ou menos.

92. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 68 a 91, caracterizada pelo fato de que asmicropartículas compreendem adicionalmente agentes derevestimento resistentes a ácidos, agentes de revestimentoresistentes à protease, agentes de revestimento entéricos,agentes aumentadores de volume, excipientes, ingredientesinativos, intensificadores da estabilidade, modificadores desabor e/ou odor ou agentes mascaradores, vitaminas, agentesterapêuticos, anti-oxidantes, imuno-moduladores,modificadores do transporte de trans-membrane, agentes anti-endurecimento, quitosanas ou intensificadores da fluidez.

93. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 68 a 92, caracterizada pelo fato decompreender adicionalmente um agente ativo.

94. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 93,caracterizada pelo fato de que o agente ativo é selecionadoque entre antidiabéticos, anticonvulsionantes, analgésicos,anti-mal de Parkinson, anti-inflamatórios, antagonistas decálcio, anestésicos, microbicidas, antimaláricos,antiparasíticos, antihipertensivos, antihistamínicos,antipiréticos, agonistas alfa-adrenérgicos, alfa-bloqueadores, biocidas, bactericidas, dilatadores dosbrônquios, drogas bloqueadoras beta-adrenérgicas,contraceptivos, drogas cardiovasculares, inibidores de canaisde cálcio, antidepressivos, agentes de diagnóstico,diuréticos, eletrólitos, enzimas, hipnóticos, hormônios,hipoglicêmicos, hiperglicêmicos, constritores muscularesrelaxantes musculares, neoplésticos, glicoproteínas,nucleoproteinas, lipoproteínas, oftálmicos, energizantespsíquicos, sedativos, esteroides, simpatomiméticos,parasimpatomiméticos, tranqüilizantes, drogas do tratourinário, vacinas, grogas vaginais, vitaminas, sais minerais,drogas anti-inflamatórias não-esteroidais, enzimas deconversão de angiotensina, polinucleotídeos, polipeptídeos epolissacarídeos.

95. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 93,caracterizada pelo fato de que o agente ativo é selecionadoentre antidiabéticos, enzimas, hormônios, vitaminas, saisminerais, e suplementos nutritivos.

96. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 68 a 95, caracterizada pelo fato de que o teorde umidade das micropartícuias é ajustado, por meio do quepelo menos aproximadamente 90% da atividade da proteína sãoretidos após uma armazenagem por aproximadamente seis meses aaproximadamente um ano a uma temperatura de aproximadamente 25°C.

97. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 68 a 96, caracterizada pelo fato de que asmicropartícuias compreendem adiconalmente um contraíon.

98. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 97,caracterizada pelo fato de que o contraíon é um ânion, umcátion, ou um íon dipolar.

99. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 97,caracterizada pelo fato de que o contraíon é selecionadoentre glicina, citrato de sódio, sulfato de sódio, sulfato dezinco, sulfato de magnésio, sulfato de potássio e sulfato decálcio.

100. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 99,caracterizada pelo fato de que o contraíon é o sulfato desódio.

101. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 68 a 100, caracterizada pelo fato de que aquantidade de contraíon nas micropartículas varia deaproximadamente 0,5% ou 0,5% a aproximadamente 5% ou 5% empeso/peso.

102. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 101,caracterizada pelo fato de que a quantidade de contraíon nasmicropartículas varia de aproximadamente 0,5% ou 0,5% aaproximadamente 2% ou 2% em peso/peso.

103. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 102,caracterizada pelo fato de que a quantidade de contraíon nasmicropartículas varia de aproximadamente 1% ou 1% aaproximadamente 2% ou 2% em peso/peso.

104. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 68-103, caracterizada pelo fato de que o teorde umidade das micropartículas varia de aproximadamente 6% ou6% a aproximadamente 12% ou 12%.

105. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 104,caracterizada pelo fato de que o teor de umidade dasmicropartículas varia de aproximadamente 7% ou 7% aaproximadamente 10,5% ou 10,5%.

106. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 68 a 105, caracterizada pelo fato de servirpara a administração oral.

107. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 106,caracterizada pelo fato de servir para a ingestão.

108. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 68 a 105, caracterizada pelo fato de servirpara a administração intravenosa, intranasal, parenteral,pulmonar, subcutânea, oftálmica ou intramuscular.

109. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 68 a 105, caracterizada pelo fato de servirpara a inalação.

110. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 68 a 110, caracterizada pelo fato de quetamanho das micropartículas varia de aproximadamente 0,001 μπιou 0,001 μπι a aproximadamente 50 μπι ou 50 μπ\.

111. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 110,caracterizada pelo fato de que o tamanho das micropartículasvaria de aproximadamente 0,3 μπι ou 0,3 μπι a aproximadamente30 μπι ou 30 μπι.

112. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 111,caracterizada pelo fato de que o tamanho das micropartículasvaria de aproximadamente 0,5 μπι ou 0,5 μπι a aproximadamente10 μπι ou 10 μπι.

113. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 112,caracterizada pelo fato de que o tamanho das micropartículasvaria de aproximadamente 0,5 pm ou 0,5 pm a aproximadamente-5,0 pm ou 5,0 pm.

114. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 113,caracterizada pelo fato de que o tamanho das micropartículasvaria de aproximadamente 1,0 pm ou 1,0 pm a aproximadamente-5,0 pm ou 5,0 pm.

115. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 114,caracterizada pelo fato de que o tamanho das micropartículasvaria de aproximadamente 1,0 pm a aproximadamente 2,0, 3,0,-4,0 ou 5,0 pm.

116. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações1 a 8, 56 ou 57, caracterizada pelo fato de quea quantidade de solvente orgânico adicionada varia deaproximadamente 0,1% ou 0,1% a aproximadamente 50% ou 50% emvolume/volume.

117. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 116,caracterizada pelo fato de que a quantidade de solventeorgânico adicionada varia de aproximadamente 1% ou 1% aaproximadamente 30% ou 30% em volume/volume.

118. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 117,caracterizada pelo fato de que a quantidade de solventeorgânico adicionada varia de aproximadamente 5% ou 5% aaproximadamente 30% ou 30% em volume/volume.

119. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 118,caracterizada pelo fato de que a quantidade de solventeorgânico adicionada varia de aproximadamente 10% ou 10% aaproximadamente 3 0% ou 3 0% em volume/volume.

120. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 119,caracterizada pelo fato de que a quantidade de solventeorgânico adicionada varia de aproximadamente 15% ou 15% aaproximadamente 20% ou 20% em volume/volume.

121. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicaçõesl a 8, 56 ou 57, caracterizada pelo fato de quea concentração do contraíon adicionada à solução varia deaproximadamente 0,1 mM ou 0,1 mM a aproximadamente 100 mM ou 100 mM.

122. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 121,caracterizada pelo fato de que a concentração do contraíonadicionada à solução varia de aproximadamente 0,2 mM ou 0,2mM a aproximadamente 50 mM ou 50 mM.

123. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 122,caracterizada pelo fato de que a concentração do contraíonadicionada à solução varia de aproximadamente 0,3 mM ou 0,3mM a aproximadamente 3 0 mM ou 3 0 mM.

124. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 123,caracterizada pelo fato de que a concentração do contraíonadicionada à solução varia de aproximadamente 0,5 mM ou 0,5mM a aproximadamente 20 mM ou 2 0 mM.

125. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 124,caracterizada pelo fato de que a concentração do contraíonadicionada à solução varia de aproximadamente 1 mM ou 1 mM aaproximadamente 10 mM ou 10 mM.

126. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 125,caracterizada pelo fato de que a concentração do contraíonadicionada à solução é de aproximadamente 5 mM ou 5 mM.

127. ARTIGO DE MANUFATURA, caracterizado pelo fatode compreender a composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 68 a 115, um material de acondicionamento paraa composição, e uma etiqueta que indica que a composição épara uma indicação terapêutica.

128. ARTIGO, de acordo com a reivindicação 127,caracterizado pelo fato de que a indicação terapêutica é ainfluenza.

129. ARTIGO, de acordo com a reivindicação 127 ou areivindicação 128, caracterizado pelo fato de compreenderadicionalmente um inalador para a administração pulmonar dacomposição.

130. ARTIGO, de acordo com a reivindicação 12 9,caracterizado pelo fato de que o inalador é um inalador de póseco, um inalador de dose medida ou um dispositivo deaplicação eletrostática.

131. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, 26, 27, 29 a 34, 36 a 44, 46 a 49, 52 e 53, caracterizado pelo fato de que o resfriamento gradual sedá a uma taxa de aproximadamente 0,0 °C/min ou 0,0 °C/min aaproximadamente 2 0°C/min ou 20°C/min.

132. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 131,caracterizado pelo fato de que o resfriamento gradual se dá auma taxa de aproximadamente 0,05°C/min ou aproximadamente- 0,05°C/min a aproximadamente 10°C/min ou aproximadamente- 15°C/min.

133. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 132,caracterizado pelo fato de que o resfriamento gradual se dá auma taxa de aproximadamente 0,2°C/min a aproximadamente ou- 5°C/min.

134. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 133,caracterizado pelo fato de que o resfriamento gradual se dá auma taxa de aproximadamente ou 0,5°C/min a aproximadamente ou- 2°C/min.

135. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 134,caracterizado pelo fato de que o resfriamento gradual se dá auma taxa de aproximadamente 1°C/min.

136. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, 26, 27, 29 a 34, 36 a 44, 46 a 49, 52 e- 53, caracterizado pelo fato de que o tamanho dasmicropartícuias varia de aproximadamente 0,001 μτα ou 0,001 μπιa aproximadamente 50 μπι ou 50 μιη.

137. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 136,caracterizado pelo fato de que o tamanho das micropartículasvaria de aproximadamente 0,3 pm ou 0,3 pm a aproximadamente 30 pm ou 30 pm.

138. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 137,caracterizado pelo fato de que o tamanho das micropartículasvaria de aproximadamente 0,5 pm ou 0,5 pm a aproximadamente 10 pm ou 10 pm.

139. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 138,caracterizado pelo fato de que o tamanho das micropartículasvaria de aproximadamente 0,5 pm ou 0,5 pm a aproximadamente 5,0 pm ou 5,0 pm.

140. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13 9,caracterizado pelo fato de que o tamanho das micropartículasvaria de aproximadamente 1,0 pm ou 1,0 pm a aproximadamente 5,0 pm ou 5,0 pm.

141. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 140,caracterizado pelo fato de que o tamanho das micropartículasvaria de aproximadamente 0,1 pm a aproximadamente 2,0, 3,0,4,0 ou 5,0 pm.