BRPI0706949A2

BRPI0706949A2 - microesferas, método de preparação de microesferas que compreendem uma pluralidade de nanocápsulas acomodadas em um polìmero formador de gel, composição farmacêutica, método para aumentar a biodisponibilidade de um agente lipofìlico no corpo de um indivìduo humano e método de tratamento de um indìviduo para uma condição patólogica que requer um nìvel eficaz ao sangue de um agente ativo

Info

Publication number: BRPI0706949A2
Application number: BRPI0706949-9A
Authority: BR
Inventors: Shimon Benita; Alona Rom; Taher Nasser
Original assignee: Yissum Res Dev Co
Priority date: 2006-01-23
Filing date: 2007-01-23
Publication date: 2011-04-12
Also published as: CN101410098A; EP2026771A2; AU2007206582A1; EP2026771B1; JP2009523843A; CN101410098B; US9023386B2; KR20080108426A; CA2639921C; ATE446087T1; JP5403585B2; AU2007206582B2; WO2007083316A3; KR101411100B1; DE602007002905D1; CA2639921A1; WO2007083316A2; US20090011009A1

Abstract

MICROESFERAS, MéTODO DE PREPARAçAO DE MICROESFERAS QUE COMPREENDEM UMA PLURALIDADE DE NANOCáPSULAS ACOMODADAS EM UM POLìMERO FORMADOR DE GEL, COMPOSIçAO FARMACêUTICA, MéTODO PARA AUMENTAR A BIODISPONIBILIDADE DE UM AGENTE LIPOFILICO NO CORPO DE UM INDIVìDUO HUMANO E MéTODO DE TRATAMENTO DE UM INDIVìDUO PARA UMA CONDIçAO PATOLóGICA QUE REQUER UM NìVEL EFICAZ AO SANGUE DE UM AGENTE ATIVO A presente invenção apresenta microesferas que compreendem uma pluralidade de nanocápsulas acomodadas em um polímero formador de gel, em que a pluralidade denanocápsulas compreende um núcleo de óleo que contém um agente ativo não-hidrofílico e um envoltório de revestimento polimérico. A invenção também apresenta um método de preparação das microesferas da invenção, composições farmacêuticas que compreendem a mesma, bem como métodos de uso das microesferas, especificamente em aplicações terapêuticas cosméticas e de diagnóstico.

Description

MICROESFERAS, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE MICROESFERASQUE COMPREENDEM UMA PLURALIDADE DE NANOCÁPSULAS ACOMODADAS EMUM POLÍMERO FORMADOR DE GEL, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODOPARA AUMENTAR A BIODISPONIBILIDADE DE UM AGENTE LIPOFÍLICO NOCORPO DE UM INDIVÍDUO HUMANO E MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMINDIVÍDUO PARA UMA CONDIÇÃO PATOLÓGICA QUE REQUER UM NÍVELEFICAZ AO SANGUE DE UM AGENTE ATIVO

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a sistemas deaplicação para agentes ativos, preferivelmente para aingestão.

TÉCNICA ANTERIOR

O que segue é uma lista da técnica anterior que éconsiderada como pertinente para descrever o estado datécnica no campo da invenção. 0 reconhecimento destasreferências aqui será feito algumas vezes pela indicação deseu número dentro de parênteses da lista abaixo.

1. Holm R, Porter CJH, Edwards Ga, Mullertz A, KristensenHG and Charman WN. Examination of oral absorption andlymphatic transport of halofantrine in a triple-cannulatedcanine model after administration in self-.microemulsifyingdrug delivery system (SMEDDS) containing structuredtriglycerides. Eur. J. Phann.Sci. 20:91-97 (2003).

2. Driscoll CM. Lipid-based formulations for intestinallymphatic delivery. Eur J Pharm Sci.15:405-15. (2002).

3. Tamura S, Ohike A, Ibuki R, Amidon GL, Yamashita S.Tacrolimus is a class II low-solubility high-permeabilitydrug: the effect of P-glycoprotein efflux on regionalpermeability of tacrolimus in rats. J Pharm Sei. 91:719-29.(2002).

4. Hauss DJ, Fogal SE, Ficorilli JV, Price CA, Roy T,Jayaraj AA, Keirns JJ. Lipid-based delivery systems forimproving the bioavailability and lymphatic transport of apoorly water-soluble LTB4 inhibitor. J. Pharm. Sei. 87:164-9(1998) .

5. EP 480,729, Haibung L, Soonhong Y. Microencapsulationfor controlled oral drug delivery system.

6. U.S. 5,965,160, Benita S, et al. Self-emulsifiableformulation producing an oil-in-water emulsion.

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12. Uno T, Kazui T, Suzuki Y, Hashimoto H, Suzuki K,Muhammad BA. Pharmaeokinetie advantages of a newly developedtacrolimus oil-in-water-type emulsion via the enteral route.Lipids. 34: 249-54 (1999).

13. U.S. 6,884,433 , Yamashita K., et al. Sustained releaseformulation containing tacrolimus.

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15. Swartz Μ.Α. The physiology of the lymphatic system, Adv.Drug Deliv. Rev. 50 (2001) 3- 20.

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19. US 2003/0147965, Bassett M, Jacob J. and Enscore D.Methods and products useful in the formation and isolation ofmicroparticles.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os avanços recentes no projeto e na aplicação dedrogas conduziram ao desenvolvimento de um número crescentede moléculas de drogas altamente lipofílicas que podem sersubstratos para o transporte linfático intestinal. Noentanto, estas drogas exibem uma pobre biodisponibilidadeoral devido ao efluxo de P-glicoproteína de baixa dissoluçãoou ao metabolismo de CYP3A4 antes da absorção no tratogastrointestinal, limitando desse modo a sua disponibilidade.

A formulação farmacêutica adequada de tais drogascontinua sendo um desafio que ainda não foi solucionadocompletamente. É bem sabido que os lipídeos têm a capacidadede intensificar o transporte linfático de drogashidrofóbicas, reduzindo desse modo a depuração da drogaresultante do metabolismo de primeira passagem hepático. Istomelhora a absorção da droga, os perfis de biodisponibilidade,a atividade, e reduz a toxicidade. O sucesso comercial desistemas de aplicação de droga auto-emulsificantes (SEDDS)tais como Neoral® (ciclosporina A) , Norvir® (ritonavir) eFortovase® (saquinavir) aumentaram o interesse em taissistemas de aplicação baseados em emulsão promissores paramelhorar a biodisponibilidade oral de drogas lipofilicas (1).

Acredita-se que os SEDDS que se espalham como gotas finas deóleo no trato gastrointestinal intensificam a

biodisponibilidade ao promover o transporte linfático dasdrogas lipofilicas. Realmente, recentemente foi demonstradoque a extensão do transporte linfático através do dutotoráxico era 27,4% da dose de halofantrine para os animaisdosados com SMEDDS de triglicerideo estruturado (1) . Alémdisso, foi relatado recentemente que, sob determinadascircunstâncias, os elementos linfáticos podem prover a rotaprimária de absorção da droga e conduzir ã concentração dadroga na linfa por 5 a 10.000 vezes mais do que no plasmasistêmico (2) . Os avanços recentes no projeto e na aplicaçãoda droga também conduziram ao desenvolvimento de um númerocrescente de moléculas de drogas altamente lipofilicas quepodem ser substratos para o transporte linfático intestinal.

Há um aumento no interesse no papel dos elementos linfáticos

na determinação dos perfis de absorção e biodisponibilidadeda droga, atividade e toxicidade. Por exemplo, um corpocrescente de evidência mostrou que determinados lipideos têma capacidade de inibir o metabolismo pré-sistêmico da droga eo efluxo de droga mediado por p-glicoproteína (mediado por P-

gp pela parede do intestino (3).

0 pedido de patente EP 4 8 0.729 (4) descreve ummétodo de microencapsulação para a administração oral de umadroga dispersa em uma gota de óleo. A gota de óleo é

encapsulada ao utilizar um polissacarideo que tem a

capacidade de quelação de metal e um polímero solúvel emágua. A encapsulação impede que a droga seja liberada noestômago, enquanto propicia a liberação rápida no intestinodelgado. Uma vez que a droga na gota de óleo é absorvidapreferencialmente pela absorção linfática, ela é protegidacontra a degradação pelo metabolismo de primeira passagemhepático.

A patente norte-americana 5.965.160 (5) descreveuma formulação oleosa auto-emulsificante (SEOF) que podeconter uma droga hidrofóbica, que compreende um componente deóleo e um tensoativo. A SEOF é caracterizada pelo fato que ocomponente de óleo compreende um veículo oleoso e um lipídeocatiônico e, opcionalmente, um álcool graxo oleosolipofíIico. A emulsão do tipo óleo-em-água que é formada coma misturação da SEOF com uma solução aquosa tem gotas oleosasque são carregadas positivamente.

Cook, R.0., et al. (6) descrevem um processo para ageração de partículas de liberação sustentada para aaplicação de droga pulmonar. De acordo com este processo,nanopartícuias de sulfato de terbutalina de droga isonizadashidrofílicas são aprisionadas dentro de microesferashidrofóbicas ao utilizar uma abordagem de secagem poraspersão.

Khoo, SM, et al. (7) descrevem formulações à basede lipídeos dispersas para a aplicação oral de drogaslipofílicas tais como Halofantrine. Um sistema de aplicaçãode droga auto-emulsificante lipídica (SEDDS) e também umsistema de aplicação de droga auto-microemulsificante(SMEDDS) são descritos. Os sistemas compreendem umtriglicerídeo, um mono/diglicerídeo, um tensoativo não-iônico, uma fase hidrofíIica e a substância da droga. Asformulações otimizadas consistiam em SEEDS e SMEDDS detriglicerídeo de cadeia média (MCT), e SMEDDS detriglicerídeo de cadeia longa (LCT).

Holm, R, et al. (1) descrevem um SMEDDS que contémtriglicerídeos com combinações diferentes dos ácidos graxosde cadeia média e de cadeia longa, onde os ácidos graxosdiferentes na cadeia principal do glicerol exibem elementosmetabólicos diferentes.

Christensen, K.L., et al. (9) descrevem apreparação de emulsões secas estáveis que podem reformar aemulsão do tipo óleo-em-água original por meio dareconstituição na água. As emulsões secas continham umpolímero solúvel em água tal como a hidróxi propil metilcelulose (HPMC), a metil celulose ou a povidona, como veículosólido, e óleo de coco fracionado. As emulsões do tipo óleo-em-água líquidas foram secadas por aspersão em uma secadorade aspersão de laboratório. O tamanho das gotas da emulsãoreconstituída era de aproximadamente 1 pm. Tacrolimus(Prograf®) é um agente imunossupressor de macrolide (MW de804) que é derivado do fungo Streptomices tsukubaensis, e foidemonstrado que ele é eficaz na profilaxia da rejeição aenxerto e no controle da rejeição a transplante aguda eresistente a esteróides ou ciclosporina. O tracrolimus éconsiderado como uma alternativa à imunossupressão daciclosporina e foi demonstrado que ele é 10-100 vezes maispotente do que a ciclosporina. O tacrolimus foi aprovado peloFDA para a prevenção da rejeição a transplante do fígado emabril de 1994.

Tal como a ciclosporina, os parâmetrosfarmacocinéticos do tacrolimus mostram uma elevadavariabilidade inter- e intra-individual e ambas as drogas têmum índice estreito de elementos terapêuticos, necessitando domonitoramento da droga de elementos terapêuticos de sangueintegral para otimizar o tratamento. A absorção e abiodisponibilidade oral (10 - 25%) do tacrolimus são pobres,com taxa reduzida e extensão de absorção na presença dealimento. O tacrolimus é absorvido rapidamente, embora aindade maneira incompleta, no trato gastrointestinal. Aconcentração de pico de Tacrolimus (Cmax) de sangue integral éalcançada aproximadamente uma a duas horas após aadministração oral. Devido à baixa solubilidade aquosa, adistribuição de tecido do tacrolimus depois da terapia oralou parenteral é extensiva (10). O tacrolimus é principalmenterestringido à glicoproteina de albumina e alfal-ácido. Oseritrócitos ligam 75-80% da droga, resultando emconcentrações de sangue integral que são dez a trinta vezesmaiores do que as concentrações do plasma (10). O tacrolimusé metabolizado quase que completamente antes da eliminação. 0metabolismo é através das isoenzimas P450 (CYP)3A4 decitocromo no fígado e, até uma menor extensão, das isoenzimasCYP3A4 e P-glicoproteína na mucosa intestinal. A meia vida deeliminação do tacrolimus em pacientes de transplante defígado é de aproximadamente doze horas. Menos de 1% da dose éexcretado inalterado na urina. O efluxo de P-glicoproteína detacrolimus das células intestinais de volta ao lúmen dointestino permite o metabolismo de CYP3A4 antes da absorção,desse modo limitando a disponibilidade do tacrolimus (11) .Quando o tacrolimus é administrado com inibidores de CYP3A4 eP-glicoproteína (por exemplo, diltiazem, eritromicina, oucetoconazol), um aumento da biodisponibilidade oral éobservado. Há uma necessidade quanto a um aumento dabiodisponibilidade oral do tacrolimus pela aplicação dedroga.

Uno, T, et al. (12) descrevem uma emulsão do tipoóleo-em-água (o/w) da droga tacrolimus à base de ácidooléico. Os diâmetros médios das gotas da emulsão do tipoóleo-em-água eram de 0.47 μm. A formulação apresentada exibiabiodisponibilidade, vantagens farmacocinéticas e utilidadepotencial da emulsão como um veículo para a rota enteral dotacrolimus em comparação à formulação comercializada padrão.

A patente norte-americana 6.884.433 (13) descreveuma formulação de liberação sustentada que contém tacrolimusassim como outros compostos de macrolide. A formulação deliberação sustentada ali apresentada compreende uma dispersãosólida de tacrolimus ou de seus hidratos, em uma mistura quecompreende um polímero solúvel em água (tal como a hidróxipropil metil celulose) e um polímero insolúvel em água (talcomo a etil celulose) e um excipiente (tal como a lactose) .Na dispersão, o tamanho de partícula é igual ou menor do que25 0 μτη.

A fim de superar o metabolismo de primeira passageme desse modo a baixa biodisponibilidade oral de elementoslinfáticos intestinais, o transporte de drogas pode ser,portanto, explorado. Tal como acima mencionado, os compostosaltamente lipofílicos alcançam a circulação sistêmica atravésdos elementos linfáticos. Foi verificado que a maior partedos ácidos graxos, com comprimentos de cadeia iguais oumaiores do que 14, é recuperada na Iinfa toráxica (14).

Além disso, o tamanho é uma das determinantes maisimportantes da absorção linfática. Foi verificado que otamanho ideal para a absorção linfática fica compreendidoentre 10 e 100 nm (15) . No entanto, a absorção é maisseletiva e mais lenta porque o tamanho das partículasaumenta. As partículas maiores podem ser retidas por períodosmais longos nos emplastros de Peyer, ao passo que aspartícula menores são transportadas para o duto toráxico(16) . A administração oral de nano- e micropartículaspoliméricas que são absorvidas pelo sistema linfático atravésde células M de emplastros de Peyer do intestino foievidenciada e comprovada na literatura (17) . Asnanopartícuias revestidas com polímeros hidrofóbicos tendem aser capturadas facilmente por células linfáticas no corpo(18) .

Um outro método para a encapsulação das drogas emmicropartícuias foi descrito por Bassett et al. (19). Ométodo envolve a inversão da fase ao dissolver a droga e umprimeiro polímero em um solvente e ao adicionar à misturaformada dessa maneira um segundo polímero dissolvido em um11 não - solvente" que conduz à formação espontânea de micro ounanopartícuias revestidas com polímero.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃOUm objetivo da presente invenção consiste naapresentação de um sistema para a aplicação de vários agentesativos que são de caráter não-hidrofílico dentro de um corpo

vivo

Desse modo, em um aspecto da invenção, são providasmicroesferas que compreendem uma pluralidade de nanocápsulasacomodadas em um polímero formador de gel, em que asnanocápsulas compreendem um núcleo de óleo que contém umagente ativo não-hidrofílico e um envoltório de revestimentopolimérico.

A invenção também apresenta um método de preparação

de microesferas que compreendem uma pluralidade denanocápsulas acomodadas em um polímero formador de gel, emque as nanocápsulas compreendem um núcleo de óleo que contémum agente ativo não-hidrofílico e um envoltório de revestimento polimérico, e método compreende:

(a) a provisão de uma fase orgânica que compreendeóleo, um solvente orgânico miscível em água, um agente ativonão-hidrofílico dissolvido no solvente e um polímero ou umacombinação de polímeros para revestir o dito núcleo de óleo;

(b) a adição lenta de água à dita fase orgânica

para obter uma emulsão;

(c) a adição contínua de água à emulsão parainduzir a inversão da fase da dita emulsão, obtendo dessemodo uma emulsão do tipo óleo-em-água (o/w);

(d) a misturação da dita emulsão do tipo óleo-em-água com um polímero formador de gel ou uma combinação depolímeros formadores de gel;

(e) a remoção do dito solvente orgânico e da águapara obter as ditas microesferas.

A invenção também apresenta composiçõesfarmacêuticas que compreendem como componente ativomicroesferas que compreendem uma pluralidade de nanocápsulasacomodadas em um polímero formador de gel, em que asnanocápsulas compreendem um núcleo de óleo que contém umagente ativo não-hidrofíIico e um envoltório de revestimentopolimérico.

Além disso, a invenção apresenta um método paraaumentar a biodisponibilidade de um agente ativo no corpo deum indivíduo humano, sendo que o método compreende aadministração ao dito indivíduo de microesferas quecompreendem uma pluralidade de nanocápsulas acomodadas em umpolímero formador de gel, em que as nanocápsulas compreendemum núcleo de óleo que contém um agente ativo não-hidrofílicoe um envoltório de revestimento polimérico.

Adicionalmente, a invenção apresenta um método detratamento de um indivíduo para uma condição patológica querequer para o dito tratamento uma quantidade eficaz de umagente ativo com o sangue do indivíduo, sendo que o métodocompreende a administração ao dito indivíduo de microesferasque compreendem uma pluralidade de nanocápsulas acomodadas emum polímero formador de gel, em que as nanocápsulascompreendem um núcleo de óleo que contém um agente ativo não-hidrofílico e um envoltório de revestimento polimérico.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A fim de compreender a invenção e ver como ela podeser executada na prática, uma realização preferida serádescrita agora, apenas a título de exemplo não-limitador, comreferência aos desenhos em anexo, nos quais:

As Figuras 1A-1B são micrografias TEM da formulaçãode nanocápsulas número 2 9 antes de adicionar a solução dehidróxi propil metil celulose. A relação de volume entre asolução acetônica e a solução de água é de 100:75. A barrarepresenta 100 nm em tamanho. A Figura IB é uma ampliação daFigura IA.

Figuras 2A-2B são micrografias TEM da formulação denanocápsulas número 2 9 com solução de hidróxi propil metilcelulose. A relação de volume entre a solução acetônica e asolução de água é de 100:275. A barra representa 1.000 nm na(Figura 2A) e 100 nm na (Figura 2B).

As Figuras 3A-3B são micrografias TEM da formulaçãode nanocápsulas número 3 0 sem solução de hidróxi propil metilcelulose. A relação de volume entre a solução acetônica e asolução de água é de 100:75. A barra representa 1.000 nm,onde a Figura 3B é uma ampliação da Figura 3A.

A Figura 4 mostra a distribuição de tamanho departícula antes da secagem por aspersão da formulação número29.

As Figuras 5A-5B são micrografias SEM da formulaçãode nanocápsulas número 2 9 antes de adicionar a solução dehidróxi propil metil celulose (a barra representa 10,0 μιη naFigura 5A; 2,0 μπι na Figura 5B) .

As Figuras 6A-6B são micrografias SEM da formulaçãode nanocápsulas número 2 9 com a solução de hidróxi propilmetil celulose depois da secagem por aspersão (a barrarepresenta 20,0 μτη na Figura 6A; 10,0 μιη na Figura 6B) .

Figuras 7A-7B são micrografias SEM da formulação denanocápsulas número 2 9 depois de adicionar a solução dehidróxi propil metil celulose e após uma dissolução de trêshoras (a barra representa 20,0 pm na Figura 7A; 10,0 μπι naFigura 7B).

As Figuras 8A-8D são micrografias SEM da formulaçãode nanocápsulas número 3 0 depois de adicionar a solução dehidróxi propil metil celulose e após a secagem por aspersão(a barra representa 50,0 μτη na Figura 8A; 20,0 μπι na Figura8B; 10 μπι na Figura 8C; 5,0 μπι na Figura 8D) .

As Figuras 9A-9B são micrografias SEM da formulaçãode nanocápsulas número 3 0 depois de adicionar a solução dehidróxi propil metil celulose e após a secagem por aspersão euma dissolução de três horas (a barra representa 10,0 μπι naFigura 9A; 5,0 μπι na Figura 9B) .

A Figura 10 é um gráfico que mostra os perfis daliberação de DXPL de microesferas de metil celulose quecompreendem nanocápsulas com os revestimentos diferentes demistura de Eudragit.

A Figura 11 é um gráfico que mostra os perfis daliberação de DXPL de nanocápsulas de Eudragit carregadas comDXPL microencapsuladas e de óleo carregado com DXPLmicroencapsulado em emulsão de água.

A Figura 12 é um gráfico que mostra a concentraçãode tracolimus no sangue sistêmico depois da administraçãoP.O. de formulações diferentes a ratos (média ± SD, η = 6).

A Figura 13 é um gráfico que mostra a concentração25 de tracolimus no sangue sistêmico depois da administraçãoP.O. de formulações diferentes a ratos (média ± SD, η = 6) .A Figura 14 é um gráfico que mostra níveis detacrolimus no sangue depois da absorção oral de doses detacrolimus de 0,7 mg/kg em várias formulações (o tacrolimus

formulado como uma suspensão do produto comercial em cápsulaPrograf® (Prod. Com.), uma emulsão (Emuls.), uma emulsãoembutida nas microesferas sem Eudragit mas com hidróxi propilmetil celulose (Emuls. Seca), sem hidróxi propil metilcelulose mas com nanocápsulas de Eudragit e lactose como umagente de secagem por aspersão (Sem Metocel)).

A Figura 15 é um gráfico que mostra a concentraçãode tracolimus no sangue sistêmico depois da administraçãoP.O. de duas bateladas idênticas da formulação 2 9 a ratos(média ± SD, η = 6 para a Batelada I e η = 3 para a BateladaII), avaliação da reproducibilidade de batelada.

A Figura 16 é um gráfico que mostra os níveis detacrolimus no sangue depois da administração intravenosa deum concentrado comercial de Prograf® para a ampola de infusãoa uma dose de 160 pg/kg a ratos (média ± SD7 η = 5).

A Figura 17 é um gráfico que mostra níveis detacrolimus no sangue depois da absorção oral de doses detacrolimus de 0,7 mg/kg em várias formulações a ratos (média± SD, η = 3-6, ρ > 0,05) .

A Figura 18 é um micrografo fluorescente de seçãohistológica do duodenum de rato trinta minutos após a gavagemoral da formulação número 29, carregada com cumarina-6 comoum marcador.

As Figuras 19A-19D são fotomicrografias denanocápsulas vazias secas (Figura 19A) ou impregnadas(Figuras 19B-19D) preparadas com o revestimento denanocápsula de Eudragit L:RS (75:25) e revestimento de matrizde hidróxi propil metil celulose.

A Figura 20 é um gráfico que mostra os níveis detacrolimus no sangie depois da administração oral aminiporcos de doses de 1 mg de tacrolimus em uma formulaçãocomercial (Prograf) ou na formulação número 29 (média ± SD, η= 4) .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção é baseada na descoberta que aformação de microesferas que compreendem uma pluralidade deminúsculas gotas de óleo revestidas por uma mistura depolímero, em que a pluralidade de gotas de óleo revestidascom polímero ainda é acomodada em um polímero formador degel, aumentou significativamente os níveis no sangue dedrogas lipofílicas dissolvidas no núcleo de óleo. Estas"gotas de óleo revestidas duplas" conduziram à compreensãoque as microesferas que acomodam uma pluralidade denanocápsulas podem servir como um veículo de aplicação paravários agentes ativos que são de natureza não-hidrofílica.

Desse modo, de acordo com uma realização, sãoprovidas microesferas que compreendem uma pluralidade denanocápsulas acomodadas em um polímero formador de gel, emque as nanocápsulas compreendem um núcleo de óleo que contémum agente ativo não-hidrofílico e um envoltório derevestimento polimérico.

0 termo "microesferas", que pode ser empregadointercambiavelmente com os termos "micropartículas", defineamplamente as partículas na escala de micra ou submicra quesão compostas tipicamente de materiais sólidos ou semi-sólidos e podem conter e liberar uma droga ou qualquer outrananocápsula contendo agente ativo encerrada nas mesmas. Asmicroesferas de acordo com a invenção são mais ou menos deuma estrutura esférica que compreende agregados denanocápsulas que incorporam (por exemplo, encerram,encapsulam, aprisionam) o agente ativo. Tipicamente, odiâmetro médio das microesferas da invenção, que écompreendido como o diâmetro médio ponderai tal comodeterminado pela difração a laser, varia de aproximadamente10 μιη a aproximadamente 500 μτη. Mais pref erivelmente, odiâmetro médio das microesferas fica compreendido entreaproximadamente 10 μπι e aproximadamente 2 0 μπι.

O termo "nanocápsulas", tal como aqui empregado,denota estruturas na escala de nano ou subnano quecompreendem uma gota de óleo (gotas finas de óleo) revestidacom ura revestimento polimérico formado. O revestimentopolimérico forma um envoltório duro que envolve o núcleo deóleo. As nanocápsulas têm um diâmetro médio entreaproximadamente 100 nm e aproximadamente 1.000 nm,preferivelmente entre aproximadamente 100 nm a 900 nm, e maispreferivelmente entre aproximadamente 100-300 nm eaproximadamente 300-500 nm. Além disso, o tamanho dasnanocápsulas em um microesfera é essencialmente uniforme comaproximadamente 99% das gotas de óleo com um diâmetro abaixode 1 mícron. Conforme aqui empregado, a expressão"nanocápsulas" deve ser compreendido como um sinônimo paratodas as gotas de óleo com revestimento polimérico ou a gotasde óleo que têm um revestimento polimérico.

O termo "pluralidade de nanocápsulas", conformeaqui empregado, denota duas ou mais de tais nanocápsulasacomodadas no polímero formador de gel.

O agente ativo é encerrado dentro da nanocápsula.Em conseqüência disto, não há nenhum contato direto entre oagente ativo e o polímero formador de gel que formam asmicroesferas. De fato, com o umedecimento e o intumescimento,as microesferas liberam no trato gastrointestinal ananocápsula apenas e não o agente ativo "nu", o que eqüivaledizer, uma forma particulada do próprio agente ativo (porexemplo, droga) ou o agente em seu nível molecular.

Conforme aqui empregado, a expressão "agente ativonão-hidrofílico" denota o composto que é considerado, pelomenos até alguma extensão, como repelente de água. Em outraspalavras, qualquer agente que exibe uma capacidadehidrofóbica ou hidrofílica baixa, média ou alta deve serconsiderado como um agente não-hidrofílico. Um agente não-hidrofílico pode ser definido pelos parâmetros quecaracterizam o coeficiente de divisão/distribuição do agente(como um soluto) entre duas fases, por exemplo, um solventeorgânico e água (o sistema mais comumente utilizado éoctanol-água). Tipicamente, um coeficiente de divisão (IogP)descreve a capacidade hidrofóbica de compostos neutros, aopasso que o coeficiente de distribuição (logD, que é umacombinação de pKa e IogP) é uma medida da capacidadehidrofóbica dependente do pH do agente. Um agente ativo não-hidrofíIico de acordo com a invenção é qualquer composto que

tem um IogP > 1,5.

O núcleo de óleo das nanocápsulas pode compreender

um único tipo de óleo ou uma combinação de óleos e pode serselecionado de uma ampla gama de óleos normalmenteutilizáveis, de óleos polares a óleos não-polares, contantoque eles não se misturem com a fase de água e sejam umlíquido como um todo. De acordo com uma realização, as gotasde óleo compreendem um óleo selecionado entre óleos vegetaisde cadeia longa, óleos de ésteres, álcoois líquidossuperiores, ácidos graxos líquidos superiores, gorduras eóleos naturais, e óleos de silicone. De acordo com umarealização preferida, o núcleo de óleo compreende um óleonatural tal como o óleo de milho, o óleo de amendoim, o óleode coco, o óleo de rícino, o óleo de gergelim, o óleo desoja, o óleo de perila, o óleo de girasol, o óleo de argan e

o óleo de nozes.

Cada uma das gotas de óleo é encerrada dentro de um

revestimento polimérico para formar nanocápsulas quecompreendem o núcleo de óleo e um envoltório polimérico quecircunda o núcleo de óleo. 0 revestimento polimérico formauma estrutura de envoltório que circunda o núcleo de óleo.

0 termo "envoltório" no contexto da presenteinvenção denota qualquer estrutura polimérica sólida ousemisólida que inclui uma gota de óleo. 0 envoltório podecompreender um único polímero ou uma combinação ou umamistura de dois ou mais polímeros tal como será discutidomais adiante. Quando o revestimento polimérico compreende umamistura de polímeros, é preferível que pelo menos um dospolímeros seja solúvel a um pH acima de 5,0, ou que pelomenos um dos polímeros seja solúvel em água (independente do pH).

De acordo com uma realização, a combinação de pelomenos dois polímeros compreende uma mistura de polímeros quecompreende um primeiro polímero ou polímeros (grupo depolímeros) que é solúvel em água (independente do pH) ousolúvel a um pH acima de 5,0 e um segundo polímero oupolímeros (segundo grupo de polímeros) que é um polímeroinsolúvel em água.

A expressão "polímero solúvel em água" denotaqualquer polímero que, quando introduzido em uma fase aquosaa 25°C, a uma concentração de massa igual a 1%, tornapossível a obtenção de uma solução macroscopicamentehomogênea e transparente, isto é, uma solução que tem umvalor de transmissão de luz mínimo, a um comprimento de ondaigual a 500 nm, através de uma amostra de 0,1 cm deespessura, de pelo menos 80% e preferivelmente de pelo menos 90%.

A expressão "polímero solúvel a um pH acima de 5,0"denota qualquer polímero que, a um pH abaixo de 5,0 e a 25°C,não perde mais de 10% de seu peso seco no meio peladissolução, ao passo que na mesma temperatura, em um meioaquoso que tem um pH acima de 5,0, ele forma um hidrogel ou édissolvido para formar uma solução macroscopicamentehomogênea e transparente. Tais polímeros são indicadosalgumas vezes pela expressão "polímeros entéricos".

Muitos polímeros solúveis em água são conhecidos noestado da técnica. Os polímeros apropriados no contexto dapresente invenção compreendem e incluem, mas não ficam a eleslimitados, polióis e policarboidratos. Os polímeros solúveisera água exemplificadores incluem celuloses hidroxiladas taiscomo, por exemplo, hidróxi propil metil celulose e hidróximetil celulose. Outros polímeros solúveis em água apropriadosincluem o polietileno glicol. As combinações de dois ou maispolímeros solúveis em água também são contempladas.

Além disso, muitos polímeros que são solúveissomente a um pH acima de 5,0 são conhecidos no estado datécnica. Os exemplos não-limitadores de polímeros entéricosaplicáveis com respeito à invenção incluem: ftalato dehidróxi propil metil celulose (HP55), ftalato de acetato decelulose, ftalato de carbóxi metil celulose, e qualquer outroderivado de ftalato de celulose, shellac, Eudragit L100-55,zeína.

Um polímero entérico preferido é Eudragit L100-55.

A expressão "polímero insolúvel em água" denotaqualauer polímero que não perde mais de 10% de seu peso secoem um meio aquoso pela dissolução, independentemente do pH domeio. Os exemplos não-limitadores de polímeros insolúveis emágua incluem ésteres de celulose tais como di- e triacilatosincluindo ésteres mistos tais como, por exemplo, acetato decelulose, diacetato de celulose, triacetato de celulose,propionato de celulose, butirato de acetato de celulose,propionato de acetato de celulose, tripropionato de celulose;éteres de celulose tais como etil celulose; náilons;policarbonatos; poli(dialquilsiloxanos); poli(ésteres deácido metacrílico); poli(ésteres de ácido acrílico); poli(óxidos de fenileno); poli(álcoois de vinila); polímerosaromáticos contendo nitrogênio; epóxidos poliméricos;celulose regenerada; materiais formadores de membranaapropriados para o uso na aplicação de osmose reversa oudiálise; acetato de ágar; triacetato de amilose; acetato debeta glucano; acetaldeido acetato de dimetila; carbamato demetila - acetato de celulose; succinato de acetato decelulose; acetato de dimetilamino - acetato de celulose;carbonato de etila - acetato de celulose; cloroacetato deacetato de celulose; oxalato de etila - acetato de celulose;propionato de acetato de celulose; copolímeros de poli(étervinilmetílico); sulfonato de butila - acetato de celulose;octato de acetato de celulose; laurato de acetato decelulose; sulfonato de p-tolueno - acetato de celulose;triacetato de goma de alfarroba; etileno hidroxilado-acetatode vinila; butirato de acetato de celulose; cera ousubstâncias do tipo cera; álcoois graxos; óleos vegetaishidrogenados; poliésteres, homo e copolímeros, tal como oácido poliláctico ou PLAGA e outros ainda, e as combinaçõesdestes.

Os polímeros insolúveis em água preferidos deacordo com a invenção são Eudrgit RS ou Eudragit RL, ou umacombinação dos mesmos.

Quando as nanocápsulas compreendem pelo menos doispolímeros, o primeiro polímero é um polímero insolúvel emágua e o segundo polímero é solúvel a um pH acima deaproximadamente 5,0.

De acordo com uma realização preferida, a relaçãode peso/peso entre o(s) primeiro(s) polímero(s), isto é, opolímero ou grupo de polímeros insolúveis em água e opolímero ou segundo grupo de polímeros, isto é, o(s)polímero (s) a um pH acima de aproximadamente 5,0 ou grupo detais polímeros, fica compreendida preferivelmente na faixaentre 5:95 e 50:50. ^

Sem ficar limitado pela teoria, acredita-se que arelação entre o polímero insolúvel em água e o polímerosolúvel a um pH acima de aproximadamente 5,0 (o polímero"não-insolúvel") é crítica para controlar a liberação doagente ativo das nanocápsulas. A provisão de um primeiropolímero que seja insolúvel em água e um segundo polímero queseja solúvel em água ou solúvel em água a um pH acima de 5,0,depois da exposição das nanocápsulas à água ou a um meioaquoso que tem pH acima de 5,0, permite a dissolução lenta dopolímero, enquanto o arranjo geral do polímero insolúvel éessencialmente mantido. Em outras palavras, a dissoluçãolenta do polímero "não-insolúvel" resulta na formação depassagens parecidas com canais no "esqueleto" de um polímeroformado a partir do polímero insolúvel em água, através doqual o agente ativo pode escapar da nanocápsula. A fim defacilitar a liberação do controle do agente ativo dasnanocápsulas, foi previsto que uma relação preferida entre oprimeiro polímero, isto é, o polímero insolúvel em água, e ochamado polímero "não-insolúvel" é que é a favor do polímerosolúvel a um pH acima de aproximadamente 5,0 (por exemplo,uma relação de peso:peso de 75:25 a favor do polímero não-insolúvel em água).

De acordo com uma realização, a combinaçãopolimérica compreende uma mistura de um primeiro polímero ougrupo de polímeros (o polímero insolúvel) selecionados entreEudragit RL ou Eudragit RS ou uma combinação dos mesmos, e umsegundo polímero ou grupo de polímeros (o polímero solúvel emágua ou solúvel a um pH acima de 5,0) selecionados entreEudragit L100-55 e ftalato de hidróxi propil metil celulose(HPMPC) ou uma combinação dos mesmos. Uma seleção específicada combinação de polímeros de acordo com a invençãocompreende Eudragit RS e Eudragit L100-55 a uma relação depeso/peso de aproximadamente 25:75 a aproximadamente 50:50.

A pluralidade de nanocápsulas é acomodada dentro deum polímero formador de gel.

Conforme aqui empregado, a expressão "polímeroformador de gel" denota qualquer polímero hidrofílico que,quando umedecido, forma uma rede de polímeros que intumesceou forma géis. 0 polímero formador de gel também é indicado,algumas vezes, como polímero formador de hideogel. 0 polímeroformador de gel pode ser uma proteína natural ou um polímerosintético. De acordo com uma realização preferida dainvenção, o polímero formador do gel é aquele que, quandoumedecido, fica "pegajoso", isto é, com a capacidade deintensificar a aderência de microesferas e nanocápsulasumedecidas nele contidas ao epitelium intestinal.

Conforme aqui empregado, a expressão "acomodadas"denota incluir, revestir, encerrar, circundar, confinar,aprisionar ou qualquer outra maneira de incorporar asnanocápsulas pelo(s) polímero(s) formador(es) de gel de modoa obter um arranjo acondicionado de uma pluralidade denanocápsulas que compreendem o agente ativo com um segundo

elemento de proteção. Os exemplos não-limitadores de polímeros formadores

de gel naturais incluem proteínas, tais como gelatina oucolágeno, e polissacarídeos tais como ágar, carragenina,glucomanana, escleroglucano, esquizofilano, goma de gelana,ácido algínico, curdlano, pectina, ácido hialurônico, ou gomade guar.

Os exemplos não-limitadores de polímeros formadoresde gel sintéticos incluem o ácido poliacrílico, celulosemodificada, metil celulose, metil propil celulose, carbóximetil celulose, celulose cationizada; hidróxi propil metilcelulose, hidróxi etil celulose, polímero de carbóxi vinila,polivinil pirrolidona, acetato de polivinilacetaldietilamino,álcool polivinílico, carbóxi metil celulose sódica, 2-metil-5-vinil piridina, carbômeros, e outros ainda.

Um aspecto da invenção refere-se ao uso dasmicroesferas como um sistema da aplicação do agente ativoatravés do trato gastrointestinal, isto é, para aadministração oral. Uma realização preferida de acordo comeste aspecto da invenção refere-se à aplicação de agentesativos que são substratos da bomba de effluxo de P-gp.

Alternativamente, as microesferas podem serprojetadas para a administração por injeção.

A expressão "substrato de bomba de efluxo de P-gp",que pode ser empregada intercambivelmente com a expressão"substrato de P-gp", tal como aqui empregado, denota qualquersubstância ativa (para finalidades terapêuticas, cosméticasou de diagnóstico) que é sujeita ao transporte ativo, "eflui"para fora das células através do transportador ligado amembrana de P-gp. A P-gp é expressa ao longo de todo ocomprimento do intestino e também no fígado, nos rins, nabarreira sangue-cérebro e na placenta. Neste contexto, apresente invenção refere-se a substâncias medicinaissujeitadas ao transporte ativo pela P-gp intestinal que ficalocalizada nas membranas apicais das células epiteliais.Utilizando a energia que é gerada pela hidrólise de ATP, a P-gp dirige o efluxo de vários substratos contra um gradientede concentração e reduz desse modo a sua concentraçãointracelular e, no caso de substâncias ativas, a suabiodisponibilidade oral.

Desse modo, de acordo com uma realização preferidada presente invenção, o agente ativo é qualquer substânciamedicinal, cosmética ou de diagnóstico que, depois daadministração oral, a sua biodisponibilidade no sangue édiminuída ou inibida em conseqüência do mecanismo de efluxode P-gp. Os substratos de P-gp podem ser classificados deacordo com a sua solubilidade e nível de metabolismo. Umalista não-limitadora de substratos do P-gp de acordo com estaclassificação inclui:

alta solubilidade e metabolismo extensivo:amitriptilina, cochicina, dexametasona, diltiazem, etinilestradiol;

baixa solubilidade e metabolismo extensivo:atorvastatina, azitromicina, carbamazepina, ciclosporina,gliburide, haloperidol, itraconazol, tacrolimus sirolimus,ritonavir, sanquinavir, lovastatina;

alta solubilidade e metabolismo pobre: amiloide,amoxicilina, cloroquina, ciprofloxacina, dicloxacilina,eritromicina, fexofenadina, levodopa, midazolaina, morfina,nifedipina, primaquina, promazina, prometazina, quinidina,quinino; e

baixa solubilidade e metabolismo pobre:ciprofloxacina e talinolol.

No contexto da presente invenção, o agente ativonão-hidrofíIico é um composto lipofilico ou anfipático oucomplexos ou misturas que contêm tais compostos. O agenteativo não-hidrofílico também inclui os compostos hidrofilicosque foram modificados, por exemplo, pela fixação de umaporção lipofíIica, para aumentar a capacidade lipofilica doagente. Estes compostos modificados são aqui indicados,algumas vezes, pelo termo "pró-droga".

O agente ativo pode estar na forma de ácido livre,de base livre ou de sal, e misturas de agentes ativos podemser empregadas.

De acordo com uma realização, o agente ativo é umagente lipofilico.

A expressão "agente lipofilico" é aqui empregadapara denotar o composto que tem um Iog P (octanol/água) >2,0-3,0 e uma solubilidade de triglicerídeo (TG), tal comomedido, por exemplo, pela solubilidade no óleo de soja ousimilar, acima de 10 mg/ml. Esta definição inclui as drogasde meio lipofilico, isto é, aquelas que têm um IogP entre 3,0e 6, bem como as drogas altamente lipofilicas, que têm umIogP > 6.

Os exemplos do meio para agentes ativos lipofilicosterapeuticamente ativos que podem ser apropriados para oaprisionamento nas nanocápsulas de acordo com a presenteinvenção incluem os seguintes:

Analgésicos e agentes anti-inflamatórios:aloxiprin, auranofin, azapropazone, benorilate, diflunisal,etodolac, fenbufen, fenoprofen calcim, flurbiprofen,ibuprofen, indometacin, ketoprofen, ácido meclofenâmico,ácido mefenâmico, nabumetone, naproxen, oxifenbutazona,fenilbutazona, piroxicain, sulindac.

Anti-helmínticos: albendazol, hidróxi naftoato debefênio, cambendazol, diclorofen, ivenectina, mebendazol,oxamniquina, oxfendazol, embonato de oxantel, praziquantel,embonato de pirantel, tiabendazol.

Agentes anti-arrítmicos: amiodarone, disopiramida,acetato de flecainida, sulfato de quinidina.

Agentes anti-bacterianos: benetamina penicilina,cinoxacina, ciprofloxacina, claritromicina, clofazimina,cloxacilina, demeclociclina, doxiciclina, eritromicina,etionamida, imipenem, ácido nalidíxico, nitrofurantoina,rifampicina, espiramicina, sulfabenzamida, sulfadoxina,sulfamerazina, sulfacetamida, sulfadiazine, sulfafurazol,sulfametoxazol, sulfapiridina, tetraciclina, trimetoprim.

Anti-coagulantes: dicoumarol, dipiridamol,nicoumalona, fenindiona.

Antidepressivos: amoxapine, maprotiline, mianserin,nortriptiline, trazodona, maleato de triinipramine.

Anti-diabéticos: acetohexamida, clorpropamida,glibenclamida, gliclazida, glipizida, tolazamida,tolbutamida.

Anti-epilépticos: beclamida, carbarnazepina,clonazepam, etotoina, metoina, metsuximida,meti1fenobarbi tona, oxcarbazepina, parametadiona,fenacernida, fenobarbitona, feniloina, fensuximida,primidona, sultiame, ácido valpróico.Agentes anti-fúngicos: anfotericina, nitrato debutoconazol, clotrimazol, nitrato de econazol, fluconazol,flucitosine, griseofulvin, itraconazol, cetoconazol,miconazol, natarnicina, nistatina, nitrato de sulconazol,terbinafine, terconazol, tioconazol, ácido undecenóico.

Agentes aanti-gota: alopurinol, probenecid, sulfin-pirazona.

Agentes anti-hipertensivos: amlodipine, benidipine,darodipine, dilitazem, diazoxide, felodipine, acetato deguanabenzo, isradipine, minoxidil, nicardipine, nifedipine,nirnodipine, fenoxibenzamina, prazosin, reserpina, terazosin.

Antimaláricos: arnodiaquina, cloroquina,clorproguanil, halofantrine, mefloquina, proguanil,pirimetamina, sulfato de quinino.

Agentes anti-enxaqueca: mesilato dediidroergotamina, tartrato de ergotamina, maleato demetisergide, maleato de pizotifeno, succinate desuraatriptano.

Agentes anti-muscarínicos: atropina, benzexol,biperiden, etopropazine, hiosciarnine, brometo demepenzolate, oxifencilcimine, tropicamide.

Agentes anti-neoplásticos e imunossupressores:aminoglutetimida, amsacrine, azatioprine, busulfan,clorambuci1, ciclosporina, dacarbazine, estramustine,etoposide, lomustine, melfalan, mercaptopurine, metotrexate,mitomicina, mitotane, mitozantrona, procarbazine, citrato detamoxifeno, testolactona, tacrolimus, sirolimus.

Agantes antiprotozoários: benzidazol, clioquinol,decoquinate, diiodo hidróxi quinolina, furoato de diloxanide,dinitolmide, furzolidone, metronidazol, nimorazol,nitrofurazone, ornidazol, tinidazol.

Agentes anti-tireóide: carbimazol, propiltiouracil.

Alixiolíticos, sedativos, hipnóticos eneurolépticos: alprazolam, ainilobarbitone, barbitone,bentazepain, broinazepam, bromperidol, brotizolam,

butobarbitone, carbromal, clordiazepoxide, clormetiazol,clorpromazine, clobazam, clotiazepam, clozapine, diazepam,droperidol, etinamate, flunanisone, flunitrazepar,

fluopromazine, decanoato de flupentixol, decanoato deflufenazine, flurazepam, baloperidol, lorazepam,

lormetazepam, medazepam, meprobamate, metaqualone, midazolam,nitrazepam, oxazepam, pentobarbitone, perfenazine pimozide,proclorperazine, sulpiride, temazepam, tioridazine,

triazolain, zopiclone.

Beta-bloqueadores: acebutolol, alprenolol,

atenolol, labetalol, metoprolol, nadolol, oxprenolol,

pindolol, propranolol. Agentes inotrópicos cardíacos: amrinone, digitoxin,

digoxin, enoximone, lanatoside C, medigoxin.

Corticoesteróides: beclometasona, betametasona,budesonide, acetato de cortisona, desoximetasona,

dexametasona, acetato de fludrocortisona, flunisolide,flucortolone, propionato de fluticasona, hidrocortisona,metilprednisolone, prednisolone, prednisone, triaincinolone.

Diuréticos: acetazolamida, amiloride,

bendrofluazide, bumetanide, clorotiazide, clortalidona, ácidoetacrínico, fruseinide, metolazona, espironolactona,

triamterene.

Agentes anti-parkinsonianos: mesilato de

bromocriptina, maleato de lisuride.

Agentes gastro-intestinais: bisacodil, cimetidine,cisapride, difenoxilate, doinperidone, famotidine,

loperamide, mesalazine, nizatidine, oineprazol, ondansetron,

ranitidine, sulfasalazine.

Antagonistas de Receptores de Histamina H:acrivastina, astemizol, cinarizine, ciclizine,ciproheptadine, dimenhidrinate, fIunarizine, Ioratadine,meclozine, oxatomide, terfenadine.

Agentes reguladores de lipídeos: bezafibrate,clofibrate, fenofibrate, gemfibrozil, probucol.

Nitratos e outros agentes anti-angina: nitrato de

amila, trinitrato de glicerila, dinitrato de isosorbide,mononitrato de isosorbide, tetranitrato de pentaeritritol.

Agentes nutritivos: betacaroteno, vitamina A,vitamina B sub. 2, vitamina D, vitamina E, vitamina K.

Inibidores de protease de HIV: Nelfinavir.

Analgésicos opióides: codeína, dextropropioxifeno,diamorfina, diidrocodeina, meptazinol, metadona, morfina,

nalbufine, pentazocine.

Hormônios sexuais: citrato de clomifene, danazol,etinil estradiol, acetato de medroxiprogesterona, mestranol,metiltestosterona, noretisterona, norgestrel, estradiol,estrogênios conjugados, progesterona, estanozolol,estibestrol, testosterona, tibolone.

Estimulantes: amfetamina, dexamfetamina,dexfenfluramina, fenfluramina, mazindol.

Sem ficar a elas limitados, as drogas preferidas deacordo com a invenção incluem tacrolimus, sirolimushalofantrine, ritonavir, loprinavir, amprenavir, saquinavir,calcitrol, dronabinol, isotretinoin, tretinoin, base derisperidona, ácido valpróico, ao passo que as pró-drogaspreferidas incluem o palmitato de dexametasona, o palmitatode paclitaxel, o palmitato de docetaxel.

Alguns exemplos não-limitadores das drogaslipofílicas que podem ser incorporadas no sistema deaplicação da presente invenção e de suas aplicações médicassão descritos por Robert G. Strickley [Strickley R.G.Pharmaceutical Research, 21 (2):201-230;(2004)] e por KoppararManjunat, et al. [Manjunat K. et al. , Journal of ControlledRelease 107:215-228; (2005)].

De acordo com uma outra realização, o agente ativoé um agente anfipático. A expressão "agente anfipático" éaqui empregada para denotar o composto que tem um valor delog P entre 1,5 e 2,5 e uma solubilidade de triglicerídeo(TG), tal como medida, por exemplo, pela solubilidade em óleoda soja ou similar, acima de 10 mg/ml.

Os exemplos dos agentes ativos anfipáticos quepodem ser aplicados pelo sistema da invenção incluem, semficar a eles limitados, salicilato de pisostigmina,clorpromazine, flufenazine, trifluoperazine, e lidocaina,bupivacaina, anfotericina B, etoposide, teniposide eequinocandinas e azóis fungicidas, tais como clotrimazol eitaconazol.

Um outro exemplo de um agente ativoterapeuticamente não-hidrofílico apropriado para seraprisionado nas nanocápsulas de acordo com a invenção inclui,sem ficar a ela limitado, a clozapine. A clozapine é umadroga antipsicótica atípica eficaz aplicada no tratamento daesquizofrenia resistente. A clozapine é rapidamente absorvidaoralmente com ums biodisponibilidade de 27%. A clozapine émetabolizada extensivamente pelas enzimas microssomaishepáticas (CYP1A2 e CYP3A4) e forma metabólitos de N-demetilae N-óxido. Desse modo, a clozapina é um bom candidato para aaplicação pelo sistema da presente invenção.

A invenção também apresenta um método de preparaçãodas microesferas que acomodam uma pluralidade de nanocápsulasde acordo com a presente invenção, sendo que o métodocompreende:

(a) a provisão de uma fase orgânica que compreendeóleo, um solvente orgânico miscível em água, um agente ativonão-hidrofílico dissolvido no solvente e um polímero oucombinações de polímeros para revestir o núcleo de óleo;(b) a acição lenta de água à dita fase orgânicapara obter uma emulsão do tipo água-em-óleo;

(c) a adição contínua, preferivelmente porgotejamento, de água à emulsão do tipo água-em-óleo parainduzir a inversão da fase da emulsão, obtendo desse modo umaemulsão do tipo óleo-em-água (o/w);

(d) a misturação da emulsão do tipo óleo-em-águacom um polímero formador de gel ou uma combinação depolímeros formadores de gel;

(e) a remoção do solvente orgânico e da água paraobter microesferas que acomodam uma pluralidade denanocápsulas. É essencial observar que as nanocápsulascompreendem um núcleo de óleo em que o agente ativo édissolvido ou disperso e que este núcleo de óleo é encerradopor um envoltório polimérico. A pluralidade de núcleosrevestidos de envoltório de óleo é acomodada no polímeroformador de gel, de uma maneira tal que não há nenhum contatodireto entre o agente e o polímero formador de gel.

0 solvente orgânico utilizado no método da invençãopode ser qualquer solvente orgânico miscível com água quetenha um ponto de ebulição próximo ou abaixo do ponto deebulição da água. Uma lista não-limitadora de tais solventesorgânicos inclui o etanol, o metanol, a acetona, o acetato deetila, o isopropanol (ponto de ebulição de 108°C, emboraseja, considerado como volátil no contexto da presenteinvenção).

0 uso de uma combinação de óleo e do solventeorgânico permite a encapsulação dentro das nanocápsulas devários agentes que são essencialmente de natureza não-hidrofílica. 0 núcleo de óleo também pode incluir um ou maisexcipientes não-hidrofílicos (por exemplo, excipienteslipofílicos). Para esta finalidade, o método da invençãotambém pode incluir a adição de um ou mais excipientes nafase orgânica. O excipiente é preferivelmente qualquerexcipiente que tenha uma solubilidade de pelo menos 1% em umafase de óleo. De acordo com um exemplo, o excipiente é umtensoativo lipofilico, tal como labrafil M CS 1944,polisorbate 80, e polisorbate 20.

À fase orgânica que contém óleo, a água éadicionada lentamente, essencialmente por gotejamento. Nocomeço, uma emulsão do tipo óleo-em-água é formada, isto é,gotas de água são dispersas na fase orgânica. No entanto, aadição lenta contínua de água ao meio resulta eventualmenteem um fenômeno inverso, onde contínua e não-contínua são'alternadas' de maneira tal que as gotas de óleo revestidascom o revestimento de polímero são dispersas na água.

0 termo "emulsão" aqui empregado denota um sistemaque tem pelo menos duas fases líquidas, uma das quais édispersa na outra. A fase dispersa também é indicada comofase interna, fase descontínua, fase incoerente (as gotasdispersas), ao passo que a fase externa também pode serindicada como fase coerente ou contínua. As emulsões podemcompreender mais de duas fases. Por exemplo, elas podemcompreender três fases líquidas (isto é, emulsões triplas),ou duas fases líquidas e uma fase contínua. A todas asemulsões, o ponto comum é que a sua fase externa ,se encontraem um estado líquido. Se uma terceira fase estiver presente,como uma fase líquida ou contínua, esta é geralmente dispersana fase dispersa que é dispersa na fase externa. Um agenteemulsificante pode ou não também estar presente.

Os tipos diferentes de emulsões podem ser definidospela referência ao tipo de líquido que forma a fase externaversus o tipo de líquido que forma a fase dispersa. A esterespeito, quando uma fase de óleo é dispersa em uma fase deágua, a emulsão é denominada "emulsão do tipo óleo-em-água"ou "emulsão normal". No entanto, também possível formar uma"emulsão inversa ou do tipo água-em-óleo (w/o)11. Em umaemulsão inversa, as gotas de água são dispersas em uma fase

contínua de óleo.

Quando são formadas as nanocápsulas, inicialmente aemulsão do tipo água-em-óleo é formada, e essa emulsão dotipo água-em-óleo é convertida em um emulsão do tipo óleo-em-água pela adição de água à fase de óleo/orgânica. Sem ficarlimitado pela teoria, acredita-se que em conseqüência distoos polímeros no sistema são depositados na interface entre oóleo e a água, aprisionando todas as gotas internas de óleo eisolando as mesmas da fase aquosa contínua. A emulsãoresultante que compreende as gotas de óleo revestidas como(s) polímero(s) de revestimento é misturada então com asolução de polímero formador de gel. Uma vez que a emulsão dotipo óleo-em-água é formada e o polímero formador de gel éadicionado, o solvente (ou a mistura de solventes) e a águasão essencialmente removidos.

Há diversas técnicas disponíveis para remover umsolvente (ou a combinação de solventes) de uma emulsão, comoé sabido pelos elementos versados na técnica, incluindo oaquecimento e a evaporação do solvente, a evaporação dosolvente volátil seguida pela Iiofilização, etc. De acordocom a invenção, o solvente é preferivelmente removido pormeio de secagem por aspersão, uma vez que os agentes ativosnão são sensíveis ao calor. No caso em que os agentes ativossão sensíveis ao calor, outros métodos para remover osolvente de uma emulsão podem ser utilizados, tal como ésabido e apreciado pelos elementos versados na técnica.

A secagem por aspersão é um método demicroencapsulação mecânica desenvolvido nos anos trinta.Consequentemente, a emulsão é atomizada em uma aspersão degotas mediante o bombeamento da pasta através de um discorotativo ao compartimento aquecido de uma secadora deaspersão. Ali, o solvente, bem como a água na emulsão, sãoevaporado para obter as microesferas secos.

As microesferas secas resultantes podem serformuladas de acordo com qualquer aplicação desejada. Háaplicações quase ilimitadas para tal materialmicroencapsulado. Dependendo, entre outros, do agente ativo,as microesferas podem ser aplicáveis na agricultura, emprodutos farmacêuticas, em alimentos, em cosméticos e emfragrâncias, têxteis, papel, tintas, revestimentos eadesivos, aplicações de impressão, e muitas outrasindústrias.

De acordo com uma realização preferida, asmicroesferas são para o uso na medicina, nos cosméticos ou emdiagnósticos.

Mais preferivelmente, as microesferas secas sãoformuladas como uma composição farmacêutica, preferivelmentepara a administração oral. Para esta finalidade, asmicroesferas secas podem ser encerradas em um veiculoentérico, tal como uma cápsula entérica. Os exemplos não-limitadores de cápsulas entéricas incluem cápsulas entero-revestidas moles ou duras tal como é sabido no estado datécnica.

Deve ser observado que, quando as microesferassecos são protegidas dos fluidos gástricos pelo uso de talveículo entérico, as gotas de óleo (nas nanocápsulas) nãoprecisam ser revestidas com um polímero que seja solúvel a umpH acima de 5,0. Em outras palavras, uma combinação de umpolímero solúvel em água e de um polímero insolúvel em água éaplicável.

Por outro lado, ao utilizar uma mistura depolímeros que compreende um polímero que seja solúvel somentea um pH acima de 5,0, outras formas de aplicação dasmicroesferas são possíveis, tal como na forma de sachês.Desse modo, deve ficar compreendido que, dependendodo tipo específico de formulação, um farmacêutico ou qualqueroutro formulator podem determinar a combinação específica dospolímeros a serem utilizados de acordo com a invenção.

Para comprimidos de aplicação oral, pílulas, pós,losangos, sachês, cachês, elixires, suspensões, aerossóis(como um sólido ou em um meio líquido) , e pós acondicionadosestéreis, bem como outras formas de aplicação, podem serutilizados.

Foi demonstrado que as microesferas da invençãoconferem níveis elevados no sangue dos agentes ativosexemplificados em comparação aos produtos comerciais ou a umaformulação de emulsão (denominada óleo na seção Resultados).

De acordo com uma realização, as microcápsulas dainvenção propiciam a liberação controlada do agente ativo.Conforme aqui empregado, "liberação controlada" refere-se aqualquer tipo de liberação que não seja a liberação imediata.

Por exemplo, a liberação controlada pode ser projetada comoliberação modificada, estendida, sustentada, retardada,prolongada ou constante (isto é, da ordem zero). Em teoria,um dos perfis mais úteis da liberação é a liberação constantepor um período de tempo predeterminado. É contemplado que aliberação controlada do agente é obtida pelo revestimentoaplicado às gotas e que o perfil da liberação do agente ativopode ser ditado por variações na composição dos polímeros queformam o envoltório. O revestimento de polímero de controlada taxa também pode ser obtido pela aplicaão de umapluralidade de revestimentos de misturas de polímeros sobre agota do núcleo tal como é sabido no estado da técnica.

Deve ser observado que, através do método dainvenção, as microesferas são construídas de maneira tal quenão há nenhum contato direto entre o agente ativo e opolímero formador de gel (que pode ser uma mistura depolímeros formadores de gel) . Além disso, deve ser observadoque o método da invenção permite qualquer excesso depolímeros formadores de envoltório seja misturado com opolímero formador de gel, isto é, que faz parte dorevestimento de microesferas sobre as nanocápsulas. Dessemodo, com o contato do produto final com um ambiente aquoso,o polímero formador de gel se transforma em uma geléia eintumesce, enquanto o excesso de polímero(s) solúvel(is) emágua ou polímero (s) solúvel (is) a um pH acima de 5,0 queforam misturados com o polímero formador de gel é dissolvido.Sem ficar limitado pela teoria, acredita-se que por meiodesta combinação do polímero formador de gel e do excesso dooutro polímero (utilizado na construção da parede dananocápsula) na estrutura de microesferaa, as nanocápsulasintactas que compreendem o agente ativo são liberadas damicroesfera (premusivelmente através das aberturas formadasna microesfera em conseqüência da dissolução dos polímerossolúveis) e não a droga em sua forma livre. Acredita-se,outra vez, sem ficar limitado pela teoria, que a liberaçãodas nanocápsulas do gel e não a droga em sua forma livre,permite o escape do agente de efluxo de P-gp e desse modo asua absorção pelos vasos linfáticos.

A invenção também apresenta um método para aumentara biodisponibilidade de um agente ativo no corpo de umindivíduo humano, sendo que o método compreende a provisão aodito indivíduo das microesferas da invenção. Os resultadosaqui apresentados mostram que, através do uso dasmicroesferas de acordo com a invenção, a biodisponibilidadeda invenção dos agentes ativos testados no sangue podeaumentar, pelo menos por um fator de 1,3, preferivelmente porum fator de 2, e mais pref erivelmente por um fator de 3, comrespeito às drogas de controle utilizadas (vide, por exemplo,a Figura 12).A invenção também apresenta um método de tratamentode um indivíduo para uma condição patológica que requer parao dito tratamento uma quantidade eficaz de um agente ativodentro do sistema sangüíneo do indivíduo, sendo que o métodocompreende a provisão ao dito indivíduo das microesferas dainvenção.

A expressão "condição patológica" aqui empregadadenota qualquer condição que requer a melhora do bem estar doindivíduo na aplicação de um agente ativo que é uma droga ouuma pró-droga ou um agente de diagnóstico, tais como aqueleslistados acima. Quando o agente ativo é uma entidade não-hidrofílica, tal como, sem fica limitado à teoria, um agentelipofíIico ou um agente anfipático, ou qualquer derivadolipofílico/anfipático de um agente ativo, a aplicação doagente ativo de acordo com a invenção é preferivelmente feitaatravés do transporte linfático. A lista não-limitadora dascondições inclui, entre outras, a inflamação e distúrbiosautoimunes, parasitismo (por exemplo, malária), infecçãobacteriana, viral ou fúngica, distúrbios cardíacos (porexemplo, arritmia), distúrbios de coagulação, depressão,diabetes, epilepsia, enxaqueca, câncer, distúrbiosimunológicos, distúrbios hormonais, condições psiquiátricas,distúrbios do trato gastrointestinal, distúrbis nutritivos, emuitos outros, tal como é sabido no estado da técnica.

A quantidade eficaz de agente ativo na composiçãofarmacêutica e na forma de dosagem unitária da mesma pode servariada ou ajustada amplamente, dependendo da aplicaçãoparticular, da maneira ou da introdução, da potência doagente ativo particular, do carregamento do agente nananocápsula, e da concentração desejada. A quantidade eficazé determinada tipicamente em experimentações clínicasapropriadamente projetadas (estudos de faixa de dosagem) e oelemento versado na técnica irá saber realizar corretamentetais experimentações a fim de determinar a quantidade eficaz.Conforme é geralmente sabido, uma quantidade eficaz dependede uma variedade de fatores incluindo a capacidadehidrofóbica do agente ativo e, quando relevante, dacapacidade lipofílica/anfipática, da seleção dos polímerosque formam a nanocápsula (o revestimento da gota de óleo)e/ou do envelope formador de gel externo, do perfil dedistribuição do agente ativo dentro do corpo depois de serliberado da nanocápsula, uma variedade de parâmetrosfarmacológicos, tal como a meia vida no corpo, de efeitoscolaterais indesejados, se existirem, e de fatores tais comoa idade e o gênero, etc.

A expressão "forma de dosagem unitária" refere-se aunidades fisicamente distintas apropriadas como dosagensunitárias para indivíduos humanos e outros mamíferos, em quecada unidade contém uma quantidade predeterminada do agenteativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado,em associação com excipientes farmacêuticos apropriados. Aconcentração do agente terapeuticamente ativo pode variar.

A composição da invenção pode ser administrada porum período de tempo prolongado em uma única dose diária, emdiversos doses ao dia, como uma única dose e em diversosdias, etc. 0 período de tratamento terá geralmente umaextensão proporcional à extensão do processo da doença e daeficácia da microesfera específica (por exemplo, aplicaçãoeficaz através do sistema linfático, eficácia do agente,etc.) e a espécie do paciente que está sendo tratado.

Conforme apreciado, embora a invenção seja descritana seguinte descrição detalhada com referência a microesferase aos métodos para a sua preparação, deve ficar compreendidoque dentro da presente invenção também são englobadas ascomposições farmacêuticas que compreendem as mesmas e osmétodos terapêuticos que empregam as mesmas, bem comoqualquer outro uso das microesferas.

Conforme empregado no relatório descritivo e nasreivindicações, as forma "um", "uma" e "o/a" incluem oreferências no singular bem como no plural, a menos que ocontexto dite claramente de alguma outra maneira. Porexemplo, a expressão "um polímero" inclui um ou maispolímeros e a expressão "óleo" inclui um ou mais óleos.

Além disso, tal como aqui empregado, a expressão"que compreende" presta-se a indicar que as microesferasincluem os elementos recitados, mas não excluem outros. Aexpressão "que consiste essencialmente em" é empregada paradefinir as microesferas que incluem os elementos recitadosmas excluem outros elementos que podem ter um significadoessencial na biodisponibilidade do agente lipofílico dentrodo corpo de um indivíduo. Por exemplo, as microesferas queconsistem essencialmente em gotas de óleo revestidas por umpolímero solúvel em água (independente do pH) não irãoincluir nem incluem somente quantidades insignificantes(quantidades que terão um efeito insignificante na liberaçãodo agente não-hidrofílico da microesfera) de polímeros quesão dependentes do pH com respeito à sua solubilidade, taiscomo polímeros entéricos. "Que consiste em" deverá significardesse modo a exclusão de mais do que elementos de traço deoutros elementos. As realizações definidas por cada um destestermos de transição estão dentro do âmbito da presenteinvenção.

Além disso, todos os valores numéricos, porexemplo, quando se referm às quantidades ou faixas doselementos que constituem as microesferas, são aproximaçõesque são variadas ( + ) ou (-) por até 20%, algumas vezes poraté 10% dos valores indicados. Deve ficar compreendido, mesmoque nem sempre esteja indicado explicitamente, que todas asreferências numéricas são precedidas pelo termo"aproximadamente".

DESCRIÇÃO DE ALGUMAS REALIZAÇÕES NÃO-LIMITADORASExemplo 1: Nanocápsulas acomodadas em microesferas

Materiais e Métodos

Materiais

Poli(arilato de etila, metacrilato de metila,cloreto de metacrilato de trimetilamonioetila 1:2:0,2(Eudragit RL), poli(acrilato de etila, metacrilato de metila,cloreto de metacrilato de trimetilamonioetila 1:2:0,1Eudragit RS PO) e poli(ácido metacrílico, acrilato de etila)1:1 (Eudragit L100-55) foram adquiridos junto à Rohm(Dramstadt, GmbH, Alemanha), ftalato de hidróxi propil metilcelulose (HPMCP 55 NF) foi obtido junto à Eastman (Rochester,EUA) . A hidróxi propil metil celulose (Methocel E4M Premium)foi adquirda junto à Dow Chemical Company (Midland, MI, EUA),a metil celulose (Metolose 90SH 100.000) foi obtida junto àShin-Etsu (Tóquio, Japão), o óleo do argan foi adquiridojunto à Alban-Muller (Vincenny, França), os glicerídeosoléicos polioxietoxilados (Labrafil M 1944 CS) foramgentilmente doados pela Gattefosse (St. Priest, França), opalmitato de dexametasona (DXPL) foi sintetizado tal comodescrito em 2.1, o tacrolimus (como monoidrato) foi adquiridojunto à Concord Biotech Limited (Ahmedabad, índia), aanfotericina B pode ser adquirida junto à Alfarma (LoteΝ:A1960561). Outros produtos químicos e solventes eram degrau de reagente analítico e água duplamente destilada foiutilizada por todo o estudo.

Métodos

Preparação das Nanocápsulas

Várias formulações preliminares foram preparadastal como descrito nas Tabelas 1 e 2.

Duas abordagens de adição de solvente diferentesforam utilizadas no presente estudo para a preparação dasnanocápsulas. A primeira abordagem é baseada no método bemestabelecido de Fessi et al. [Fessi H, et al. Nanocapsuleformation by interfacial polymer deposition following solventdisplacement. Int. J. Pharm, 1989 55:R1-R4 (1989)] aoutilizar a deposição interfacial de um polímero derevestimento depois do deslocamento de um sistema decosolvente semi-polar (acetona:etanol; 19:1) miscível comágua de uma fase de óleo/orgânica. A solução de acetona quecompreende a fase de óleo, o tensoativo lipofílico, ospolímeros de revestimento (polímeros formadores dos envelopesdas nanocápsulas) e a respectiva droga é despejada em umasolução aquosa que compreende eventualmente um estabilizanteda emulsão. A fase aquosa fica imediatamente leitosa com umaopalescência azulada em conseqüência da formação dasnanocápsulas (Tabela 1) . Ao passo que, nas formulações denanocápsulas apresentadas na Tabela 2, a fase de água éadicionada lentamente à fase de acetona:etanol/orgânica,conduzindo primeiramente à formação de uma microemulsão dotipo água-em-óleo que, com a adição contínua da água, resultaem uma emulsão inversa do tipo óleo-em-água, resultando naformação de nanocápsulas depois do deslocamento dos solventesdipolares.

Tabela 1: Composição de formulações de nanocápsulaspreparadas pela difusão do deslocamento de acetona25 interfacial de acordo com o método de Fessi et al. (24=26)

<table>table see original document page 40</column></row><table><table>table see original document page 41</column></row><table>

* A fase de óleo compreendia: óleo de argan: Labrafil M 1944CS; 5:1 e DXPL a uma concentração constante de 5% comrespeito ao volume de óleo de argan.

Tabela 2: Composição de formulações de nanocápsulaspreparadas pela nanodeposição interfacial de polímero aoutilizar o processo de extração de solvente depois dainversão de fase da emulsão (a fase aquosa é despejada nafase acetônica)

<table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table>

*A fase de óleo compreendia: óleo de argan: Labrafil M 1944CS; 5:1 e DXPL a uma concentração constante de 5% comrespeito ao volume do óleo de argan ou Tacrolimus a umaconcentração constante de 4% com respeito ao volume de óleode argan.

Deve ser enfatizado que o tacrolimus é uma drogamuito cara e tóxica que precisa ser processadacuidadosamente. Portanto, foi decidido realizar experiênciaspreliminares com um palmitato de dexametasona (DXPL), umadroga lipofílica que serviu como uma droga modeloparticularmente para a avaliação das experiências cinéticasde liberação in vitro.

Síntese do palmitato de dexametasona

Dexametasona (1 equivalente) foi dissolvida empiridina secada recentemente (2,5 ml de piridina para cadagrama de dexametasona). A solução resultante foi diluída 1 a5 com diclorometano e resfriada até 40C em um banho de gelo(solução A). Cloreto de palmitoila (1,2 equivalente, Aldrich)foi dissolvido em diclorometano (15 ml de diclorometano paracada grama de cloreto de palmitoila) e também resfriado atéO0C (solução Β). A solução B foi transferida para um funil deequalização de pressão e adicionada por gotejamento à soluçãoA agitada vigorosamente e resfriada. Depois de completada aadição (trinta minutos para 5 g de dexametasona) , a misturade reação foi purgada com nitrogênio, tampada e colocada paraagitar durante toda a noite no banho de gelo. Uma amostra foitirada na manhã seguinte para a avaliação do progresso dareação através de cromatografia de camada fina, eluida poracetato de etila:hexano (3:1 em volume). Três picosprincipais foram normalmente obtidos: o primeiro representa adexametasone, o segundo é o cloreto de palmitoila e oterceiro representa o produto palmitato de dexametasona. Nocaso de a reação não ser completada, a mistura é colocadapara agitar por mais doze horas. Ao final deste período, osolvente orgânico é removido sob pressão reduzida (nãoaquecido até mais de 60°C) . Ao resíduo, são adicionados 100ml de uma mistura 2:1 de acetato de etila:hexano. A suspensãoresultante é agitada vigorosamente e filtrada através de umfunil Buckner. O semisólido é lavado com acetato de etila e omaterial filtrado resultante é separado. A camada orgânica élavada duas vezes com 100 ml de uma solução fria de hidróxidode sódio a 5%, duas vezes com água e uma vez com uma soluçãosaturada de cloreto de sódio. A camada orgânica é filtradasobre sulfato de sódio anidro e evaporada até secar. Oresíduo é dissolvido em um volume mínimo de clorofórmio eaplicado a uma coluna de sílica (40 cm de comprimento) para acromatografia de vaporização. A coluna é eluída comclorofórmio:hexano (1:1) e as frações ricas em palmitato dedexametasona são combinadas, evaporadas até secar, e a purezado produto é verificado através de HPLC. O rendimento érealmente de 60%.

Preparação de nanocápsulas de Tacrolimus

Eudragit RS, Eudragit L100 55, Labrafil 1944 CS,óleo de argan e tacrolimus nas concentrações indicadas naTabela 3 foram dissolvidos em 100 ml de uma solução deacetona: etanol (90:10) (fase de óleo). 75 ml de água foramadicionados (dentro de dois minutos) à fase de óleo paraformar uma dispersão. À solução dispersa, 200 ml de umasolução de metil celulose a 0,5% foram adicionados antes doprocedimento de secagem por aspersão. A metil celulose e aúltima porção de água são adicionadas somente após a formaçãodas nanocápsulas. A menos que esteja indicado de alguma outramaneira, a metil celulose refere-se a Methocel E4M.

Três formulações são aqui exemplificadas:Formulações números 29 e 30, em que os seus conteúdos estãodescritos nas Tabelas 3, 4. Estas formulações diferem pelassuas proporções de polímeros: Eudragit RS:Eudragit L100-5525:75 ou 75:25, respectivamente. Uma outra formulação é aformulação número 32 que tem conteúdos similares aos daformulação número 29, no entanto, sem Eudragit RS e EudragitL100-55.

Tabela 3: Composição da formulação de nanocápsulas número 29*A formulação 32 é idêntica no conteúdo à formulação 29 semEudragit RS e Eudragit L100-55.

<table>table see original document page 44</column></row><table><table>table see original document page 45</column></row><table>Preparação das nanocápsulas de anfotericina B

Eudragit RS, Eudragit LlOO 55, Labrafil 1944 CS,óleo de argan e (anfotericina solubilizada com ácido acético)nas concentrações indicadas na Tabela 3 foram dissolvidos em100 ml de uma solução de acetona: etanol (90:10) (a "faseorgânica") . 75 ml de água foram adicionados (dentro de doisminutos) à fase orgânica, resultando na formação de umadispersão. À solução dispersa, 200 ml de uma solução dehidróxi propil metil celulose a 0,5% foram adicionados antes do procedimento de secagem por aspersão. A hidróxi propilmetil celulose e a última porção de água são adicionadassomente após a formação das nanocápsulas, e a hidróxi propilmetil celulose refere-se a Methocel E4M. A formulação dasnanocápsulas é apresentada na Tabela 5.Tabela 5: Composição da formulação de nanocápsulas de

anfotericina A

<table>table see original document page 45</tableMicroencapsulação de nanocápsulas de

anfotericina B pelo método de secagem por aspersão

A suspensão foi secada por aspersão com um aparelhominisecador por aspersão B-190 Buchi (Flawil, Suíça) sob asseguintes condições: temperatura de entrada 180°C;temperatura de saída 113°C; aspiração 50%; a taxa dealimentação da suspensão era de 2,5 ml/min. onde o pó foicoletado no separador de ciclone e o rendimento da saída foicalculado.

Caracterização físico-química das nanocápsulas de tacrolimuse das microcápsulas subseqüentes

Conteúdo da droga

A quantidade total de tacrolimus no pó foianalisada ao dissolver a amostra em 5 ml de PBS. Depois que opolímero foi dissolvido, 1 ml de acetonitrilo (ACN) foiadicionado e a mistura foi agitada (100 rpm) por uma hora. Emseguida, 3 ml de acetato de etila foram adicionados e amistura foi agitada vigorosamente e centrifugada a 4.000 rpmpor cinco minutos.

A extração do tacrolimus pelo acetato de etila foirepetida três vezes para assegurar a remoção total da drogada mistura. As camadas diferentes de acetato de etila (camadasuperior) foram transferidas a um tubo limpo e evaporadas sobo ar até secar. Os resíduos combinados foram dissolvidos em 1ml de ACN, e 50 μΐ foram injetados na HPLC sob as seguintescondições: Fase móvel - Acetonitrilo a 100%, Vazão - 0,5ml/min, comprimento de onda 213 nm, coluna - LiChrosfer® 100RP -18 (5 μπι), 4/120 mm. Uma curva de calibração construída apartir de concentrações de tacrolimus que variam entre 5 e250 pg/ml resultou em uma correlação linear. Foi verificadoque o limite de detecção de tacrolimus é de 3,9 pg/ml.

O rendimento da incorporação de tacrolimus foicalculado pela seguinte equação:

<formula>formula see original document page 46</formula>

A quantidade total de anfotericina B no pó foianalisada ao dissolver a amostra em 5 ml de sulfóxido dedimetila (DMSO). Depois que o polímero foi dissolvido, amistura foi agitada (100 rpm) por uma hora. Em seguida, aconcentração de anfotericina B foi detectada peloespectrofotômetro ao comprimento de onda de 4 07 nm. Uma curvade calibração construída a partir das concentrações deanfotericina B que variam de 0,781 a 100 pg/ml resultou emuma correlação linear (com R2 = 0,999). Foi verificado que oteor de anfotericina B do pó secado pos aspersão é de 0,85%em peso/peso.Teor de DXPL

A quantidade total da droga no pó foi analisada aodissolver a amostra em 5 ml de PBS. Depois que o polímero foidissolvido, 5 ml de metanol foram adicionados e a mistura foiagitada (100 rpm) por uma hora. Em seguida, 3 ml dediclorometano foram adicionados e a mistura foi agitadavigorosamente e centrifugada a 4.000 rpm por cinco minutos. Aextração de DXPL por diclorometano foi repetida três vezespara assegurar a remoção total da droga da mistura. Ascamadas diferentes de diclorometano (camada inferior) foramtransferidas a um tubo limpo e evaporadas sob ar até secar.Os resíduos combinados foram dissolvidos em 100 μΐ demetanol, e 50 μΐ foram injetados na HPLC sob as seguintescondições: Fase móvel - metanol a 100%, Vazão - 0,7 ml/min,comprimento de onda - 242 nm, coluna - LiChrosfer® 100 RP-18(5 μπι) , 4/120 mm.

Uma curva de calibração construída a partir dasconcentrações de DXPL que variam entre 0,01 e 5 ng/mlresultou em uma correlação linear.

Foi verificado que o limite de detecção de DXPL éde 9,8 ng/ml.

0 rendimento da incorporação de DXPL foi calculadopela seguinte equação:

<formula>formula see original document page 47</formula>Avaliação da cinética de liberação in vitro de DXPL dasmicropartícuias

Devido às limitações do limite de deteção detacrolilnus quando as condição de dissipação prevalecem, asexperiências cinéticas in vitro foram realizadas com DXPL aoutilizar a técnica de ultrafiltração sem nenhuma pressão[Magenhiem B, et al. A new in vitro technique for theevaluation of drug release profile from colloidal carriers-ultrafiltration technique at Iow pressure. Int. J. Pharm.94:115-123 (1993)] .

0 dispositivo de célula de ultrafiltração Amicon(Amicon Corp, Danvers, Mass, EUA), foi utilizado. 0 filtroutilizado era TEPT ISOPORE™ de 8,0 μπι (Millipore, Bedford,MA, EUA). Neste estudo, as condições de dissipação daliberação foram combinadas. Uma amostra de micropartícula (5mg) foi colocada em 100 ml do meio de liberação (acetonitriloa 10% em tampão de fosfato a um pH 7,4 que não alterou aestabilidade física das nanocápsulas). A determinadosintervalos de tempo, a amostra de 0,5 ml do meio de liberaçãofoi coletada através do filtro de 8,0 μπι, o que permitiu queas nanocápsulas se difundissem através de tal filtro. Então,0,5 ml de metanol foi adicionado e turbilhonado parasolubilizar as nanocápsulas. Em seguida, 3 ml dediclorometano foram adicionados e a mistura foi turbilhonadavigorosamente, e em seguida centrifugada a 4.000 rpm porcinco minutos. Após a centrifugação, a camada dediclorometano (camada inferior) foi transferida a um tubolimpo e evaporada sob ar até secar. O resíduo foi dissolvidoem 2 00 μΐ de metanol, e 50 μΐ foram injetados à HPLC sob ascondições descritas anteriormente.

Determinação do tamanho de partícula das nanocápsulaspreliminares e das microesferas secundárias

As medições dos tamanhos das nanocápsulas foramfeita ao utilizar um Dimensionador de Partpiculas de AltoDesempenho de Retro-Varredura Não-Invasivo ALV (ALV-NIBSHPPS; Langenf Alemanha) a 25°C e ao utilizar a água comosolvente. Um feixe laser a um comprimento de onda de 632 nmfoi utilizado. A faixa de sensibilidade era de 0,5 nm a 5 μιτι.As micropartícuias secadas por aspersão foram avaliadasqualitativamente através de microscopia eletrônica devarredura.

Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) A avaliação morfológica das nanocãpsulas e das

microesferas secadas por aspersão foi efetuada ao utilizar amicroscopia eletrônica de varredura (modelo: Quanta 200, FEI,Alemanha) . As amostras foram fixadas em um topo SEM aoutilizar fita adesiva de frente e verso e então se tornarameletricamente condutoras seguindo o revestimento padrão porsalpicamento de ouro (pilaron E5100) sob vácuo.Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)

A avaliação morfológica das nanocápsulas foiefetuada ao utilizar a análise TEM. A amostra foi colocada em

uma grade de cobre revestida com colódio estabilizada com

carbono por um minuto, e manchada com ácido fosfotúngstico a1% (PTA) . As amostras foram secadas e examinadas por TEM(Phillips CM-12; Philips, Eindhoven, Holanda).Estudos de absorção em ratos 0 estudo foi aprovado pelo comitê ético local de

cuidados com animais de laboratório de acordo com as regras ediretrizes relacionadas com o cuidado e o uso de animais delaboratório MD 104.01-3. Ratos Sprague Dawley pesando 300-325g foram utilizados neste estudo. Os animais foram abrigados

em condições de SPF, e jejuaram por 24 horas antes da

experiência. Na manhã seguinte, os animais foram dosadosatravés de gavagem oral, no estado em jejum, com 0,2 mg/ratode tacrolimus formulado como uma suspensão de conteúdo decápsula de Prograf® (lote - 5C5129B exp. - 06/2007, FujisawaLtd. Reino Unido) (CAPS), uma emulsão do tipo óleo-em-água(ÓLEO) , ou como a nova DDS (formulações números 29 e 30) ouformulação 32.

As amostras de sangue (100-150 μΐ) foram tiradas dacauda dos ratos em 0, 3 0 minutos eeml, 2, 3, 4, 6e24horas após a administração da dosagem. As amostras de sangueforam coletadas em tubos contendo heparina. As amostras foramcongeladas imediatamente a -20°C e analisadas quanto aosníveis de tacrolimus ao utilizar o kit PRO-Trac™ II ELISA(DiaSorin, EUA) ao seguir o protocolo sugerido pela empresa.Este método ELISA é bem aceito na prática clínica e podedetectar com precisão níveis de tacrolimus de 0,3 a 30 ng/mlde tacrolimus no sangue.Cálculos da biodisponibilidade

Cada rato foi dosado com 160 pg/kg de tacrolimuspor I.V. de bolus ao utilizar o concentrado original dePrograf® para a ampola de infusão de 5 mg/ml (lote: À3098Hexp: 11/06, Fujisawa Ltd. Reino Unido). As amostras de sangue(100-150 μΐ) foram tiradas da cauda do animal em 5, 30minutos eeml, 2, 3, 4, 6e24 horas. As amostras foramtratadas e analisadas tal como descrito acima. Os parâmetrosfarmacocinéticos das formulações diferentes foram calculadosao utilizar o software WinNonlin (versão 4.0.1), utilizando aregra do trapezóide para o cálculo de AUC.

A biodisponibilidade absoluta das formulações oraisdiferentes foi calculada ao utilizar a seguinte equação:

<formula>formula see original document page 50</formula>

A biodisponibilidade relativa de qualquerformulação oral comparada à formulação comercializada padrão(CAPS) foi calculada ao utilizar a seguinte equação:

<formula>formula see original document page 50</formula>Avaliação da estabilidade do núcleo de óleo em condiçõesexperimentais diferentes

A estabilidade química do tacrolimus em óleo deargan/labrafil em uma armazenagem de longa duração a 370C emcondições experimentais diferentes foi avaliada depois dadissolução de 5 mg de tacrolimus em 300 μΐ de uma solução 5:1de óleo de argan:Labrafil (AL SOL). Vários excipientesantioxidantes também foram dissolvidos na formulação de óleotal como descrito na Tabela 6. Algumas das formulaçõesarmazenadas em frascos de vidro bem fechados foram purgadascom nitrogênio para assegurar condições atmosféricas inertes.

Tabela 6: Composição da formulação de óleo de 1,66% detacrolimus

Estudos de absorção em miniporcos

Miniporcos pesando 18-21 kg foram utilizados nesteestudo. Os estudos de absorção foram realizados ao utilizaruma administração oral de 1 mg de tacrolimus para cadaanimal, formulado como um produto comercial de cápsula degelatin de Prograf® (Prod. Com.), e a nova cápsula degelatina de DDS ao utilizar uma mistura diferente de Eudragit(Nov. DDS = formulação 29).

Procedimentos Cirúrgicos: Todos os procedimentos cirúrgicos eexperimentais foram revistos e aprovados pelo Animal Care andUse Committee of the Hebrew University (MD 117.04-3). Porcospequenos pesando 18-21 kg foram utilizados para todos osestudos. Os animais jejuaram durante toda a noite; o acessolivre a uma água potável foi permitido durante todo o estudo.

Na manhã seguinte, os animais foram anestesiados porisofloran (máscara) por um período curto (dez minutos).Durante este período, os animais foram:

(1) dosados oralmente, no estado em jejum, com 1 mg poranimal de tacrolimus formulado como produto comercial decápsula de Prograf® como Nov. DDS;

(2) um cateter foi introduzido na veia jugular para aamostragem do sangue e foi fixado no dorso do porco. Asamostras de sangue (1 ml) foram tiradas em O, 15 minutos, 3 0minutos e em 1, 1,5, 2, 3, 4, 8, 12 e 24 horas e coletadas emtubos contendo heparina (o animal estava consciente durante aexperiência).

As amostras foram congeladas imediatamente a -200C,e analisadas quanto aos níveis de tacrolimus ao utilizar okit PRO-Trac™ II ELISA (DiaSorin, EUA) .

Resultados e Discussão

Análise morfológica

Surpreendentemente, quando a fase de água foiadicionada lentamente à fase orgânica (Tabela 2);primeiramente, a água dispersa na fase de óleo, e então, apósa adição de um volume de água estimado como igual a 15 ml deágua em 100 ml da solução acetônica, uma emulsão do tipoóleo-em-água foi formada tal como evidenciado pela formaçãorápida de opalescência no meio de dispersão. Neste estágio, adifusão rápida da fase interna de acetona/etanol para a faseaquosa externa ocorreu, resultando na deposição de polímeroshidrofóbico na interface do tipo óleo-em-água e na formaçãode nanocápsulas que consistem em um núcleo de óleo revestidopela mistura de polímeros de Eudragit tal como ilustrado naFigura 1, onde a relação final entre a solução de acetona e aágua era de 100:75 em volume/volume. Deve ser enfatizado quesob uma concentração idêntica da mistura de Eudragit, mas naausência de óleo, os fenômenos de separação de fase deEudragit e opalescência que refletiram a separação dospolímeros da solução acetônica, ocorreram após a adição de 45e 35 ml de água nas formulações números 2 9 e 30,respectivamente. Esta diferença pode ser devida à relaçãodiferente entre Eudragit RS e Eudragit L100-55 na misturaentre as formulações 29 e 30. Aparentemente, quando a água éadicionada lentamente à fase de acetona:etanol/óleo quecompreende o tensoativo labrafil que exibe um valor baixo deHLB igual a 4, uma micro-emulsão do tipo água-em-óleotransparente é formada e nenhuma separação de fase éobservada. Com a adição progressiva e contínua da água, a umadeterminada relação de volume hidrofíIico:lipofíIico, umaemulsão inversa do tipo óleo-em-água é formadaespontaneamente, seguida imediatamente pelo deslocamento(difusão) da acetona e do etanol para a fase aquosa externa,conduzindo à deposição da mistura de polímero de Eudragithidrofóbico na interface do tipo óleo-em-água das gotas deóleo, resultando na formação do envelope de nanocápsula emtorno do núcleo de óleo de argan onde a droga e o tensoativosão dissolvidos. Neste estágio onde somente 75 ml de águaforam adicionados, a película da mistura de Eudragit em tornodas nanocápsulas ainda se encontra parcialmente hidratada efina, tal como observado nas Figuras IA e IB. Com uma adiçãoadicional de 200 ml de uma solução de metil celulose a 0,5%,ocorreu uma extração completa da acetona e do etanol dasnanocápsulas, e uma película mais rígida de Eudragit éformada, tal como pode ser deduzido dos dados apresentadosnas Figuras 2A e 2B. Grandes agregados deo nanocápsulas sãoformados devido à presença da metil celulose e à elevadaconcentração das nanocápsulas na dispersão. A película rígidado polímero em torno das gotas de óleo é distinta e pode serfacilmente identificada em comparação à película finaobasevada nas nanocápsulas visualizadas nas Figuras IA e IB.

Isto foi ainda confirmado quando a formulaçãonúmero 3 0 foi diluída com 75 ml de água sem a solução demetil celulose (isto é, 100:75, volume/volume). Uma deposiçãointerfacial mais pronunciada da mistura de Eudragit ocorreu euma película rígida de Eudragit cuja espessura foi estimadaqualitativamente como ingual a 30 nm foi formada tal comomostrado nas Figuras 3A e 3B. Certamente, a solubilidadedesta mistura específica é menor do que a solubilidade damistura de Eudragit na formulação 2 9 que se separou maistarde quando pelo menos 4 5 ml de água foram adicionados emvez de 35 ml para a formulação 30. Nenhuma fase de óleo ougota de óleo é detectadas ao empregar esta abordagem tal comodescrito na Tabela 2. A distribuição de tamanho da partículada formulação de dispersão de nanocápsula número 2 9selecionada exibiu uma faixa estreita com um diâmetro médiode 479 nm (Figura 4).

A análise SEM confirmou os resultados TEMprecedentes e revela nanocápsulas individuais formadas depoisda adição de 7 5 ml de água na formulação 29 (Figuras 5A e5B). No entanto, depois da adição da solução de metilcelulose e da secagem por aspersão, microesferas esféricos(que variam qualitativamente no tamanho de 2 a 5 μττι) queformam agregados pequenos (que variam qualitativamente notamanho de 10 a 3 0 pm) podem ser detectadas (Figuras 6A emorfologia estrutural regular depois da imersão do agregadosecado por aspersão no meio de liberação a um pH 7,4 por trêshoras (Figuras 7A e 7B) . Realmente, a mistura de películaformadora de Eudragit na formulação número 2 9 compreendiaEudragit L100 55:Eudragit RS 75:25. Eudragit L100-55 éimediatamente solúvel acima de um pH 5,5, ao passo queEudragit RS é insolúvel independentemente do pH. Desse modo,o revestimento primário de metil celulose e o revestimentosecundário da mistura de Eudragit da nanocápsula sãodissolvidos rapidamente e nenhuma estrutura definida pode seridentificada. No entanto, pode ser observado a partir daanálise SEM (Figuras 8A-8D) que a formulação número 30,depois da secagem por aspersão, resultou em menos agregados eestruturas mais esféricas que são esvaziadas em conseqüênciado vácuo. Além disso, nas Figuras 9A e 9B, numerosasnanocápsulas podem ser detectadas dentro dos núcleos vaziosde microesfera depois da imersão no meio de liberação portrês horas, o que evidencia as descobertas que o revestimentode nanocápsula da mistura de Eudragit que compreende EudragitRS: Eudragit LlOO 55, 75:25, é mais resistente ao meio deliberação aquoso e deve controlar a liberação da drogaencapsulada com o passar do tempo.Avaliação cinética de liberação in vitro

Os dados de liberação in vitro podem sugerir que a

liberação do agente dos microesferas pode ser controlada porvariações no revestimento de polímero aplicado em torno dasgotas de óleo. Conforme pode ser observado na Figura 10, operfil de liberação de DXPL é mais rápido com o EudragitL:RS, 75:25 do que com o RS:L, 75:25, indicando que oEudragit L é mais rapidamente permeável e resultou em taxasde liberação rápidas do que o Eudragit RS.

A Figura 11 mostra os resultados onde a emulsão desubmicra de DXPL sem revestimento de Eudragit foi secada poraspersão sob condições experimentais idênticas às daformulação número 29. Ambos os tipos de microesferasresultaram em perfis de liberação similares. Em vez de DXPLdissolvido e de liberação de nanocápsula carregada com DXPL,DXPL dissolvido e pequenas gotas de óleo carregadas com DXPLforam liberados, refletndo a mesma quantidade liberada totalde DXPL para ambas as experiências. Estas descobertas sugeremque as experiências cinéticas de liberação não podem sediferenciar entre DXPL dissolvido e DXPL incorporado em gotasde óleo ou nanocápsulas.

Avaliação da estabilidade do tacrolimus dissolvido no núcleode óleo da nanocápsula em condições experimentais diferentes

Pode ser deduzido a partir dos dados indicados naTabela 7 que o tacrolimus não é estável depois de um mês dearmazenagem a 37°C quando dissolvido em uma formulação deóleo mesmo sob a atmosfera de nitrogênio e na presença devários antioxidantes, a menos que seja formulado com BHT egaiato de propila e combinado com a atmosfera de nitrogênio.Avaliação da estabilidade de nanocápsulas de tacrolimusmicroencapsuladas armazenadas à temperatura ambiente

A formulação seca final de nanocápsulas detacrolimus microencapsuladas foi armazenada em recipientes deplástico bem fechados à temperatura ambiente. A formulaçãonúmero 2 9 foi analisada após três e quatro meses e foiverificado que o teor de tacrolimus foi determinado aoutilizar HPLC é de 99 e 95% do teor inicial, respectivamente.

A estabilidade do produto de extremidade à temperaturaambiente está sob monitoramento contínuo. A formulaçãoselecionada final será sujeitada aos testes de estabilidadeacelerada no futuro próximo.

Tabela 7: Avaliação do teor de tacrolimus no núcleo de óleocomo uma função dos parâmetros da formulação quandoarmazenado a 37°C.

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Estudos de absorção em ratos

Conforme mencionado anteriormente, o tacrolimus éassociado com uma biodisponibilidade é uma farmacocinéticamarcadamente variáveis depois da administração oral. Foisugerido que a permeabilidade jejunal intrínseca dotacrolimus é bastante elevada. A dependência regional dapermeabilidade do tacrolimus também foi examinada, e osestudos revelaram que a permeabilidade do tacrolimus diminuiudrasticamente no ileum e no cólon em comparação àquela nojejunum. Nesse caso, muito da variabilidade do tacrolimusparece resultar de outros fatores tais como o efeito dosmecanismos de efluxo de P-glicoproteína (PGP) ou do efeito dometabolismo de CYP3A que pode ser responsável peladependência regional observada (5) . Realmente, foi relatadoque os efeitos combinados de CYP3A e de P-gp na absorçãointestinal e no biodisponibilidade oral são grandes barreirasà aplicação oral da droga de tacrolimus [Kagayama A, et al. ,Oral absorption of FK506 in rats. Pharm. Res. 10:1446-50(1993)]. Foram feitas tentativas para melhorar a absorção detacrolimus ao transferir seletivamente a droga ao sistemalinfático por meio de uma emulsão de ácido oléico do tipoóleo-em-água (15). Os autores administraram oralmente aemulsão de tacrolimus aos ratos a doses de 2 e 1 mg/kg e acompararam ao produto comercial. Foi observado que a reduçãoda dose de 2 mg/kg para 1 mg/kg diminuiu significativamente oCmax no sangue dos ratos de 36,3 ± 18,3 para 8,5 1 ± 4,8 e de32,1 ± 9,6 para 6,0 ± 2,2 ng/ml para as formas de dosagemcomercial e de emulsão, respectivamente. Resultados similaresforam relatados com a administração oral de tacrolimus em umaforma de dosagem de dispersão aos ratos alimentados a dosesde 1, 3,2 e 10 mg/kg que resultou em valores de Cmax de 8,8 ±4,9, 11,6 ± 5,3 e 40,2 ± 19,4 ng/ml.

Os resultados atuais mostram que uma administraçãooral do produto comercial (CAPS) a uma dose de 0,7 mg/kgresultou em um Cmax de 1,1 ± 0,8 ng/ml, bem abaixo dos valoresrelatados, mostrando claramente uma influência significativada dose administrada sobre o valor de Cmax- Além disso, aemulsão resultou em um valor de Cmax de 2,2 ± 0,4 6 ng/ml, aopasso que a formulação número 2 9 resultou em valor de Cmax de11,1 ± 2,7 ng/ml tal como indicado na Tabela 8.

Além disso, o perfil de absorção acarretado pela

formulação 29 era significativamente melhor do que os perfisacarretados pela emulsão e pelo produto comercial (Figura12). No entanto, a Formulação 3 0 não resultou em um perfil deliberação aumentado em comparação à formulação 29 (Figura 13) .

Além disso, os níveis de tacrolimus no sanguedepois de uma absorção oral de 0,7 mg/kg de tacrolimusdosados em várias formulações aos ratos (média ± SD, η = 3-6,ρ > 0,05) foram determinados (Figura 14). Os estudos de absorção dos ratos foram realizados ao utilizar a gavagemoral, com 0,7 mg/kg (0,2 mg/rato) de tacrolimus formuladotanto como uma suspensão de produto comercial de cápsula dePrograf® (Prod. Com.), uma emulsão (Emuls.), uma emulsãoembutida nos microesferas sem Eudragits mas com metilcelulose (Emuls. Seca), sem metil celulose mas comnanocápsulas de Eudragit e lactose como um agente de secagempor aspersão (Sem Methocel).

Em vista do desempenho menor da formulação 30, foidecidido avaliar a reproducibilidade do processo de manufatura de nanocápsulas carregadas com tacrolimusmicroencapsuladas obtidas na formulação 29. Pode ser deduzidoa partir dos dados apresentados na Figura 15 que os perfis deabsorção acarretados pela Formulação 31 que é idêntica ãFormulação 2 9 são próximos dos perfis acarretados pela

Formulação 29.

Levando em consideração a variabilidade elevada daabsorção de tacrolimus, estas descobertas sugerem que osparâmetros do processo são bem controlados e reproduzxveis.Além disso, pode ser deduzido a partir dos dadosapresentados an Figura 16 que aparentemente a Formulaçãonúmero 2 9 pode ter contribuído para o desvio do fígado dotacrolimus e promover alguma absorção linfática do tacrolimusresultando em uma biodisponibilidade mais intensificada emcomparação ao produto comercial.

Para calcular a biodisponibilidade absoluta daformulação oral, um estudo farmacocinético intravenoso foirealizado, e os dados são apresentados na Figura 17. Abiodisponibilidade absoluta das formulações orais estavaabaixo de 12%, confirmando os dados já relatados sobre abiodisponibilidade do tacrolimus (Tabela 8). No entanto, osresultados obtidos com a Formulação número 29 mostram que abiodisponibilidade foi aumentada em 490% no que diz respeitoà formulação comercial de cápsula tal como mostrado na Tabela8 onde os valores de AUCCV24 e de Cmax são mostrados paratodas as formulações. Também deve ser lembrado que aformulação de emulsão aumentou a biodisponibilidade relativaem 210% em comparação ao produto comercial, mas resultou emsomente 42,8% da biodisponibilidade da Formulação 29 tal comorefletido dos respectivos valores de AUC0-24 mostrados naTabela 8. A maior absorção oral do tacrolimus pelasnanocápsulas microencapsuladas reais (as microesferas dainvenção) pode ser mediado pela absorção linfáticaintestinal. A absorção de micro- e nanopartículas peloepitelium gastrointestinal é agora um fenômeno extensamenteaceito e levou os pesquisadores a focalizar nesta rota deaplicação para moléculas lábeis ao utilizar carreadoresmicroparticulados (29).

Tabela 8: Parâmetros farmacocinéticos e cálculos dabiodisponibilidade

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Os resultados apresentados na Tabela 8 mostrara quea formação das nanocápsulas é importante para o desempenho dosistema de aplicação. Uma emulsão simples não pode reter otacrolimus dentro do núcleo de óleo, resultando em umadegradação do metabolismo pré-sistêmica marcante dotacrolimus refletida claramente pelos resultados acarretadospela formulação 32 que é idêntica no conteúdo à formulação 2 9mas sem a mistura de Eudragit que forma a parede derevestimento da nanocápsula.

Além disso, os preparados histopatológicos foramretirados do duodenum do rato, trinta minutos após umagavagem oral da formulação número 29. Os preparados foramexaminados pelo microscópio fluorescente e as nanocápsulasforam detectadas facilmente em várias regiões do tecido.Estas descobertas sugerem que as partículas também passampela endocitose em enterócitos normais.

Por outro lado, uma agregação pronunciada denanopartícuias foi encontrada em uma região do emplastro dePeyer (Figura 18) . A presença de um número grandesignificativo de nanocápsulas no emplastro de Peyer foisugerida desse modo como sendo indicativa de um escapepotencial do efluxo de P-gp e sua absorção pelos vasoslinfáticos, permitindo a liberação do conteúdo da cápsula nacirculação de sangue sistêmico que contorna o efeito deprimeira passagem do fígado.

Além disso, foram tiradas fotomicrografiasdiferentes do que segue (Figuras 19A-19D):

- nanocápsulas vazias microencapsuladas secas preparadas comrevestimento de nanocápsula de Eudragit L:RS (75:25) erevestimento de matriz de metil celulose (Figura 19A);

nanocápsulas vazias microencapsuladas impregnadaspreparadas com nanocápsula de Eudragit L:RS (75:25) revestidae revestimento de matriz de metil celulose depois de umaincubação por três minutos com tampão de fosfato (pH 7,4)(Figura 19B) ;

nanocápsulas vazias microencapsuladas impregnadaspreparadas com nanocápsula de Eudragit L:RS (75:25) revestidae revestimento de matriz de metil celulose depois de umaincubação por cinco minutos com tampão de fosfato (pH 4,8)(Figuras 19C e 19D, em que a Figura 19D é a ampliação de uma

seção da Figura 19C).

Os resultados indicados pelas micrografiasconduziram à sugestão que as matrizes de microesfera nãocompreendiam somente a metil celulose, mas também um excessode Eudragit RS e L que não participou da formação dorevestimento de nanocápsula. Desse modo, a um pH menor do que5, nenhum formação de geléia e intumescimento rápido dasmatrizes foram observados, ao passo que, a um pH de 7,4 oEudragit L se dissolveu rapidamente e contribuiu para aformação de geléia e o intumescimento rápido das matrizes e aliberação das nanocápsulas das microesferas.

Sem ficar limitados pela teoria, desse modo foisuposto que a absorção oral incrementada de um agente ativopelas nanocápsulas microencapsuladas é mediada pela absorçãolinfático intestinal das partículas.

Isto também é evidente a partir dos resultadosobtidos quando formulações idênticas no conteúdo à Formulaçãonúmero 29, sem o revestimento de nanocápsula de polímero deEudragit, não acarretaram uma biodisponibilidade maior talcomo observado na Figura 17 (Emul. e Emuls Seca) e na Tabela8 acima.Além disso, sem ficar limitados pela teoria, foisugerido que o sistema de aplicação de acordo com a invençãopode não apenas somente promover a absorção linfática, mastambém escapar também da degradação pré-metabolismo e doefluxo de P-gp· A emulsão normal, embora com umabiodisponibilidade incrementada em comparação ao produtocomercial mas não até a mesma extensão que a formulação 29,provavelmente como uma conseqüência da divisão do tacrolimusnos fluidos GI (gastrointestinais) antes de sua absorçãopelos enterócitos.

Desse modo, o sistema da aplicação da invenção podeser preferivelmente aplicável para a aplicação de váriosagentes ativos que agem ou são considerados como substratos

do efluxo de P-gp. Além disso, as descobertas acima apresentadas

mostraram que a emulsão seca, que se assemelha à formulaçãonúmero 2 9 mas sem o revestimento de nanocápsula de polímerode Eudragit, não foi capaz de reter o tacrolimus no núcleo deóleo nos fluidos gastrointestinais, resultando em uma biodisponibilidade mais pobre do que o produto comercial.

Adicionalmente, as nanocápsulas de Eudragit semMethocel não resultaram em níveis marcantes do sangue,indicando que o revestimento de nanocápsula real não foicapaz de reter o tacrolimus sob as condições experimentaisatuais, e não pôde contribuir para a prevenção do efluxo detacrolimus.

Estas descobertas foram confirmadas por umaexperiência animal cruzada de quatro mini-porcos. Osresultados apresentados na Figura 19 e na Tabela 9 abaixomostram que o sistema de aplicação da invenção, tal comoexemplificado pela formulação 29, resultou em níveis de droga2,4 vezes maiores, contribuídos pelo desvio do fígado dotacrolimus, resultando em uma biodisponibilidade incrementadaem comparação ao produto comercial (Prograf®).

Tabela 9: Parâmetros farmacocinéticos e cálculos dabiodisponibilidade em mini-porcos (média ± SD, n = 4)

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Fica evidente a partir dos resultados apresentadosnos estudos de absorção nos mini-porcos que abioavailablilidade relativa alcançada pelo sistema deaplicação de droga da invenção era 2,4 vezes maior do que aformulação testada.

Na presente invenção, em vista dos resultadostotais apresentados, uma explanação mecanística plausível decomo o novo sistema de aplicação de droga incrementasignificativamente a absorção oral da droga pode desse modoenvolver, sem ficar limitado pela teoria, (a) uma absorçãoendocitótica - partículas absorvidas pelos enterócitosintestinais através da endocitose (tamanho de partícula < 500nm) ; (b) uma absorção linfática - partículas adsorvidas porcélulas M de emplastros Peyer (tamanho de partícula < 5 μm) e(c) uma aderência aumentada das microesferas e dasnanocápsulas ao epitelium intestinal acarretada pelorevestimento bioadesivo adequado de hidróxi propil metilcelulose, resultando globalmente em uma melhoria marcante daabsorção nas células intestinais devido à capacidade deescapar das proteínas da bomba de resistência de múltiplasdrogas.

Claims

1. MICROESFERAS, caracterizadas pelo fato decompreender uma pluralidade de nanocápsulas acomodadas em umpolímero formador de gel, em que a pluralidade denanocápsulas compreende um núcleo de óleo que contém umagente ativo não-hidrofílico e um envoltório de revestimentopolimérico.

2. MICROESFERAS, de acordo com a reivindicação 1,caracterizadas pelo fato de que o dito revestimentopolimérico compreende pelo menos um polímero que é insolúvelou solúvel em água a um pH acima de aproximadamente 5,0, ouuma combinação dos mesmos.

3. MICROESFERAS, de acordo com a reivindicação 2,caracterizadas pelo fato de que o· dito revestimentopolimérico compreende uma combinação de pelo menos doispolímeros.

4. MICROESFERAS, de acordo com a reivindicação 3,caracterizadas pelo fato de que a dita combinação de pelomenos dois polímeros compreende pelo menos um polímero que ésolúvel a um pH acima de aproximadamente 5,0 e pelo menos umpolímero que é insolúvel em água.

5. MICROESFERAS, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2 a 4, caracterizadas pelo fato de que o ditopolímero que é solúvel a um pH acima de aproximadamente 5,0 éselecionado entre ftalato de hidróxi propil metil celulose(HPMPC), ftalato de acetato de celulose, ftalato de carbóximetil celulose, shellac, Eudragit 1.100-55, e zeina.

6. MICROESFERAS, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2 a 5, caracterizadas pelo fato de que o ditopolímero que é insolúvel em água é selecionado entre etilcelulose, Eudragit RS, Eudragit RL, ácido poliláctico (PLA),ácido poliglicólico (PGA) e copolímeros de PLA e PGA (PLAGA),e etil celulose.

7. MICROESFERAS, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 3 a 6, caracterizadas pelo fato de que acombinação dos polímeros compreende pelo menos doispolímeros, um primeiro polímero que é insolúvel em água e umsegundo polímero que é solúvel a um pH acima deaproximadamente 5,0, e a relação entre o polímero insolúvelem água e o polímero solúvel a um pH acima de aproximadamente 5,0 fica compreendida na faixa entre 5:95 e 70:30.

8. MICROESFERAS, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 3 a 7, caracterizadas pelo fato de que a ditacombinação de pelo menos dois polímeros compreende umamistura de um primeiro polímero selecionado entre Eudragit RLou Eudragit RS e um segundo polímero selecionado entreEudragit Lloo-55 e ftalato de hidróxi propil metil celulose(HPMPC).

9. MICROESFERAS, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, caracterizadas pelo fato de que asditas nanocápsulas têm um diâmetro médio entreaproximadamente 100 nm e 900 nm.

10. MICROESFERAS, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 9, caracterizadas pelo fato de que o ditopolímero formador de gel é caracterizado por ser pelo menosum dos seguintes: um polímero solúvel em água; ou um polímeroque intumesce na presença de água.

11. MICROESFERAS, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 10, caracterizadas pelo fato de que o ditopolímero formador de gel é celulose modificada.

12. MICROESFERAS, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadas pelo fato de que a dita celulosemodificada é selecionada entre hidróxi etil celulose, hidróxipropil metil celulose, carbóxi metil celulose sódica, ftalatode nidróxi propil metil ou acetato, ftalato acetato decelulose, ftalato de metil celulose, e celulosemicrocristalina.

13. MICROESFERAS, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadas pelo fato de que o dito polímero solúvelem água é selecionado entre hidróxi propil metil celulose, metil celulose de pesos moleculares baixos, e polietilenoglicol de peso molecular acima de 5.000.

14. MICROESFERAS, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 13, caracterizadas pelo fato de que asditas microesferas têm um diâmetro médio entre aproximadamente 5 pm e aproximadamente 500 pm.

15. MICROESFERAS, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 14, caracterizadas pelo fato de que o ditoagente ativo é substrato de bomba de efluxo de P-gp.

16. MICROESFERAS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizadas pelo fato de que o ditoagente ativo é agente ativo lipofílico ou um agente ativoanfipático.

17. MICROESFERAS, de acordo com a reivindicação 16, caracterizadas pelo fato de que o dito agente ativo lipofílico é uma droga selecionada entre tacrolimus,sirolimus halofantrine, ritonavir, loprinavir, ainprenavir,saquinavir, calcitrol, dronabinol, isotretinoin, tretinoin,base de risperidona, e ácido valpróico.

18. MICROESFERAS, de acordo com a reivindicação 17, caracterizadas pelo fato de que o dito agente ativolipofílico é um pró-medicamento selecionado entre palmitatode dexametasona, palmitato de paclitaxel, e palmitato dedocetaxel.

19. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE MICROESFERAS QUE COMPREENDEM UMA PLURALIDADE DE NANOCÁPSULAS ACOMODADAS EM UMPOLÍMERO FORMADOR DE GEL, em que a pluralidade denanocápsulas compreende um núcleo de óleo que contém umagente ativo não-hidrofíIico e um envoltório de revestimentopolimérico, em que o método é caracterizado pelo fato decompreender:(a) a provisão de uma fase orgânica que compreendeóleo, um solvente orgânico miscível em água, um agente ativonão-hidrofilico dissolvido no solvente e um polímero ou umacombinação de polímeros para revestir o dito núcleo de óleo;(b) a adição lenta de água à dita fase orgânica,para obter uma emulsão de água em óleo (a/o);(c) a adição contínua de água à emulsão de a/o,para induzir a inversão da fase da emulsão, obtendo dessemodo uma emulsão de óleo em água (o/a);(d) a misturação da dita emulsão de o/a com umpolímero formador de gel ou uma combinação de polímerosformadores de gel;(e) a remoção do solvente orgânico e da água,obtendo desse modo as ditas microesferas.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que o dito solvente orgânico éselecionado entre etanol, metanol, acetona, acetato de etila,e isopropanol.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19 ou-20, caracterizado pelo fato de que o dito revestimentopolimérico compreende pelo menos um polímero que é insolúvelou solúvel em água a um pH acima de aproximadamente 5,0, ouuma combinação dos mesmos.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que o dito revestimento poliméricocompreende uma combinação de pelo menos dois polímeros.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que a dita combinação de pelomenos dois polímeros compreende pelo menos um polímero que ésolúvel a um pH acima de aproximadamente 5,0 e pelo menos umpolímero que é insolúvel em água.

24. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21 a 23, caracterizado pelo fato de que o ditopolímero que é solúvel a um pH acima de aproximadamente 5,0 éselecionado entre: ftalato de hidróxi propil metil celulose(HP55), ftalato de acetato de celulose, ftalato de carbóximetil celulose, shellac, Eudragit L100-55, e zeina.

25. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21 a 24, caracterizado pelo fato de que o ditopolímero que é insolúvel em água é selecionado entre etilcelulose, Eudragit RS, Eudragit RL, ácido poliláctico (PLA),ácido poliglicólico (PGA), copolímeros de PLA e PGA (PLAGA),e etil celulose.

26. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 19 a 25, caracterizado pelo fato de que a ditacombinação de polímeros compreende dois polímeros, umprimeiro polímero que é insolúvel em água e um segundopolímero que é solúvel a um pH acima de aproximadamente 5,0,e a relação entre o polímero insolúvel em água e o polímerosolúvel ao pH acima de aproximadamente 5,0 fica compreendidana faixa entre 5:95 e 70:30.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que a dita combinação de polímeroscompreende uma mistura de um primeiro polímero selecionadoentre Eudragit RL ou Eudragit RS e um segundo polímeroselecionado entre Eudragit L100-55 e ftalato de hidróxipropil metil celulose (HPMPC).

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que a dita combinação de polímeroscompreende Eudragit RS e Eudragit L100-55 a uma relação deaproximadamente 25:75.

29. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 19 a 28, caracterizado pelo fato de que a ditafase orgânica compreende excipientes lipofílicos.

30. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 19 a 29, caracterizado pelo fato de que a ditafase orgânica compreende um tensoativo lipofílico.

31. MICROESFERAS, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 19 a 31, caracterizadas pelo fato de que odito polímero formador de gel é caracterizado por ser pelomenos um dos seguintes: um polímero solúvel em água; ou umpolímero que intumesce na presença de água.

32. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 19 a 25, caracterizado pelo fato de que o ditopolímero formador de gel é celulose modificada.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que a dita celulose modificada éselecionada entre hidróxi etil celulose, hidróxi propil metilcelulose, carbóxi metil celulose sódica, e celulosemicrocristalina.

34. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 19 a 27, caracterizado pelo fato de que o ditoagente ativo é um substrato de bomba de efluxo de P-gp.

35. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 19 a 28, caracterizado pelo fato de que o ditoagente ativo é um agente ativo lipofíIico ou anfipático.

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de que o dito agente ativo lipofílicoé uma droga selecionada entre tacrolimus, sirolimushalofantrine, probucol, loprinavir, ritonavir, arnprenavir,saquinavir, calcitrol, dronabinol, isotretinoin, tretinoin,base de risperidona, e ácido valpróico.

37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de que o dito agente ativo lipofílicoé um pró-medicamento selecionado entre palmitato dedexametasona, palmitato de paclitaxel, e palmitato dedocetaxel.

38. MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 19 a 31, caracterizado pelo fato de que aremoção do dito solvente orgânico pode ser obtida através dasecagem por aspersão.

39. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelofato de compreender microesferas que compreendem umapluralidade de nanocápsulas acomodadas em um polímeroformador de gel e compreendem um núcleo de óleo que contém umagente ativo não-hidrofílico e um envoltório de revestimentopolimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18.

40. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelofato de compreender microesferas que compreendem umapluralidade de nanocápsulas acomodadas em um polímeroformador de gel e compreendem um núcleo de óleo que contém umagente ativo não-hidrofílico e um envoltório de revestimentopolimérico que podem ser obtidas pelo método de acordo comqualquer uma das reivindicações 19 a 34.

41. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com areivindicação 41, caracterizada pelo fato de estar em umaforma de dosagem para a administração oral.

42. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com areivindicação 34 ou 35, caracterizada pelo fato de ser umacomposição farmacêutica seca.

43. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo comqualquer uma das reivindicações 34 a 36, caracterizada pelofato de que as ditas microesferas compreendem um polímeroformador de gel que é solúvel em água, e as microesferas sãoencerradas dentro de um veículo revestido entérico.

44. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com areivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o ditoveículo revestido entérico é uma cápsula revestida entérica.

45. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo comqualquer uma das reivindicações 34 a 38, caracterizada pelofato de servir para a liberação controlada do dito agenteativo das ditas microesferas.

46. MÉTODO PARA AUMENTAR A BIODISPONIBILIDADE DEUM AGENTE LIPOFÍLICO NO CORPO DE UM INDIVÍDUO HUMANO, em queo método é caracterizado pelo fato de compreender aadministração, ao dito indivíduo, das ditas microesferas quecompreendem uma pluralidade de nanocápsulas acomodadas em umpolímero formador de gel, em que as nanocápsulas compreendemum núcleo de óleo que contém um agente lipofílico e umenvoltório de revestimento polimérico.

47. MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM INDIVÍDUO PARA UMACONDIÇÃO PATOLÓGICA QUE REQUER UM NÍVEL EFICAZ AO SANGUE DEUM AGENTE ATIVO, em que o método é caracterizado pelo fato decompreender a administração, ao dito indivíduo, demicroesferas que compreendem uma pluralidade de nanocápsulasacomodadas em um polímero formador de gel, em que asnanocápsulas compreendem um núcleo de óleo que contém umagente lipofílico e um envoltório de revestimento polimérico.

48. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40 ou 41, caracterizado pelo fato de que as ditas microesferas sãotal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18ou as ditas microesferas podem ser obtidas pelo método deacordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 32, e o método compreende a aplicação das ditas microesferas ao ditoindivíduo por os.