BRPI0706996A2 - método para controlar o crescimento de pelo menos um microorganismo - Google Patents
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
- A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
- A01N37/46—N-acyl derivatives
Landscapes
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Abstract
MéTODO PARA CONTROLAR O CRESCIMENTO DE PELO MENOS UM MICROORGANISMO. é provido um método para exterminar, prevenir ou inibir o crescimento de microorganismos num sistema aquoso ou numsubstrato capaz de suportar um crescimento de microorganismos, provendo-se lisozima, seja isoladamente ou em combinação com um composto de amónio quaternário ao sistema aquoso ou substrato.
Description
"MÉTODO PARA CONTROLAR O CRESCIMENTO DE PELO MENOS UM MICROORGANISMO".
Campo da invenção
A presente invenção refere-se a composições e métodospara controlar o crescimento de microorganismos emsistemas aquosos. Mais especificamente, a presenteinvenção refere-se ao tratamento de sistemas aquosos comlisozima isoladamente ou em combinação com compostos deamônio quaternário.
Histórico da invenção
Uma variedade de materiais vem sendo usada para controlaralgas em diferentes ambientes, tais como, porém nãorestritos a: compostos à base de cloro/bromo, biguanidas,sais de cobre, compostos à base de prata, triazinas,compostos de amônio quaternário e compostos poliméricos.Cada um deles apresenta deficiências relacionadas comsensibilidade ao pH e/ou à temperatura, estabilidade e/oucompatibilidade química, eficácia limitada, bem comotoxicidade ambiental e/ou humana.
Por exemplo, o cloro é osanitizante/desinfetante/oxidante mais amplamenteutilizado por proprietários de piscinas. É muito eficazpara exterminar bactérias, algas e outros organismosvivos. O cloro é tipicamente adicionado a uma piscina naforma líquida ou de tablete ou é provido por um geradorde cloro, que é um dispositivo contendo células elétricasque geram cloro de um banco de sal adicionado à água dapiscina.
Porém, o cloro apresenta muitas desvantagens o que otorna pouco desejável para uso como desinfetanteexclusivo em piscinas e em outros sistemas aquáticosrecreativos. Por exemplo, o cloro pode se combinar comamônia para formar cloraminas, que são ineficazes comoagentes sanitizantes, desinfetantes ou oxidantes. Aamônia está geralmente presente em água de piscinas eprocede de fatores ambientais, formação de fertilizantesque são transportados pelo ventp e depositados naspiscinas, dejetos do nadador (perspiração, urina, salivae óleos corporais) ou até mesmo loçõesbronzeadoras/protetores solares. Conseqüentemente, ossupervisores de piscinas geralmente supercloram a piscina(> 3ppm) para compensar a transformação de cloro emcloraminas. A supercloração pode levar à absorçãoexcessiva de cloro e cloraminas pela pele ou à inalaçãode ar ou vapor aquoso contendo cloro e cloraminas.
Atletas que treinam por muitas horas numa picina,especialmente em ambientes fechados, podem ficarparticularmente suscetíveis à superexposição ao cloro eàs cloraminas, e podem apresentam sintomas dehipersensibilidade e condições respiratórias semelhantesà asma.
Além disso, o cloro é inadequado para ambientes deaquacultura contendo plantas e animais desejáveis quepodem ser prejudicados pelo cloro ou por seussubprodutos. Exemplos de tais ambientes incluem aquários,incubadoras de peixes, cativeiros de camarões, criadourosde camarões de água doce e similares.
A lisozima é conhecida como uma proteína antibacterianapotente, distribuída em diversos fluidos e tecidosbiológicos, incluindo ovos de aves, plantas, bactérias esecreções animais. Está também presente em lágrimas,saliva, leite, secreções respiratórias e cervicaishumanas, sendo 1 secretada por leucócitospolimorfonucleares. Por suas propriedadesantibacterianas, a lisozima vem sendo utilizada tanto nasindústrias farmacêuticas como nas alimentícias, sendoconsiderada muito segura para uso humano. De fato, alisozima é um dos ifatores antimicrobianos presentes noleite humano.
A patente americana No. 5.069.717 de Sherba et al.descreve composição!', microbicida para controlar misturasinérgica de um difeniléter contendo algas e lisozima.
Conseqüentemente, I desejável ter um método paraprevenir, exterminar e/ou inibir o crescimento demicroorganismos que seja barato e que utilize umingrediente eficaz à baixa concentração e facilmenteencontrado.
É também desejável ter um método para prevenir,exterminar, e/ou inibir o crescimento de microorganismosque não utilize cloro ou outros ingredientes indesejáveisdo ponto de vista ambiental.
Sumário da invenção
Recentemente, descobriu-se que uma composiçãoantimicrobiana potente para controlar o crescimento demicroorganismos, especialmente de algas, em sistemasaquosos pode ser obtida provendo-se lisozima, sejaisoladamente ou em combinação com pelo menos um compostoquaternário, ao sistema aquoso. A presente invenção podeser aplicada numa variedade de sistemas e processos defluidos industriais (ex: sistemas aquosos), inclusive,porém não restritos a, sistemas aquosos para fabricaçãode papel, pastas de polpa, água branca em processos defabricação de papel, sistemas de água de refrigeração(torres de resfriamento, água de refrigeração de admissãoe água de refrigeração de efluentes), sistemas de águasservidas, sistemas de água recirculante, banheiras dehidromassagem, piscinas, sistemas aquáticos recreativos,sistemas de processamento de alimentos, sistemas de águapotável, sistemas aquosos para processamento de couro,fluidos de usinagem e outros sistemas aquososindustriais.
Em uma concretização da presente invenção, a lisozimapode ser adicionada a um sistema de água salina, talcomo, porém não exclusivamente, a sistema aquosoutilizando um sistema de cloração salino. A lisozima podeopcionalmente atuar sinergicamente com cloreto de sódiopara prover uma composição para controlar o crescimentode microorganismos, especialmente, por exemplo, algas.
As características e vantagens adicionais da presenteinvenção serão estabelecidas em parte na descrição aseguir, e, em parte, serão evidentes com base nadescrição, ou podem ser aprendidas pela prática dapresente invenção. Os objetivos e outras vantagens dapresente invenção serão concretizados e atingidos pormeio dos elementos e combinações especialmente indicadosna descrição e nas reivindicações em anexo.
Fica entendido que tanto a descrição geral anteriormentecitada como a descrição detalhada a seguir são apenaspara fins de exemplo e não restritivas da presenteinvenção, conforme reivindicado. Todas as patentes,pedidos de patente, e publicações mencionados acima e emtodo o relatório da presente invenção são aquiincorporados, em sua totalidade, por referência.
Descrição detalhada da presente invenção
A presente invenção provê métodos e composições paracontrolar o crescimento de microorganismos em sistemasaquosos usando lizosima, isoladamente ou em combinaçãocom pelo menos um composto de amônio quaternário.De acordo com os métodos da presente invenção, controlarou inibir o crescimento de pelo menos um microorganismoinclui a redução e/ou a prevenção de tal crescimento.
Conforme aqui utilizado, o termo ,:sistema aquoso" incluisistemas aquáticos recreativos, especialmente sistemasaquáticos recirculantes tais como banheiras dehidromassagem, balneários e piscinas, bem como sistemasde fluidos industriais, inclusive, porém não restritos asistemas aquosos para fabricação de papel, pastas depolpa, água branca em processos de fabricação de papel,sistemas de água de refrigeração (torres de resfriamento,água de refrigeração de admissão e água de refrigeraçãode efluentes), sistemas de águas servidas, sistemas deprocessamento de alimentos, sistemas de água potável,sistemas aquosos para processamento de couro, fluidos deusinagem e outros sistemas aquosos industriais.
A presente invenção é especialmente apropriada parasistemas aquosos que entram em contato com organismossuperiores, que não são danificados pela lisozima devidoà sua baixa toxicidade. Portanto, a presente invençãopode ser usada, por exemplo, para controlarmicroorganismos, como por exemplo, algas, em piscinas,balneários e banheiras de hidromassagem e para controlaralgas em sistemas aquosos utilizados em aquacultura,inclusive incubadoras de peixes, fazendas criadoras depeixes, cativeiros de camarões, criadouros de camarões deágua doce, moluscos e similares.
Como exemplo, a lisozima pode ser adicionada a um sistemade água salina, tal como um sistema aquoso utilizando umsistema de cloração salino. Por exemplo, o sistema aquosopode conter de cerca de 2.000 ppm a cerca de 8.000 ppm,tal como de 2.80 0 ppm a 6.000 ppm de cloreto de sódio. Alisozima pode opcionalmente atuar sinergicamente comcloreto de sódio para prover uma composição que controleo crescimento de microorganismos, particularmente dealgas. Devido à atividade da lisozima no controle dealgas e/ou de outros microorganismos, pode haver umanecessidade reduzida de acionar o gerador de cloro em talsistema aquoso, reduzindo assim os gastos comeletricidade e a probabilidade de efeitos indesejáveisdecorrentes da supercloração.
A lisozima pode também ser adicionada para controlaralgas e outros microorganismos em sistemas aquosos queforam tratados para redução ou remoção de cloro. Porexemplo, os aquários podem conter espécies vegetais eanimais sensíveis ao cloro, mesmo nas quantidadespresentes nas fontes distribuidoras de água municipais,de forma que a ágaia neles utilizada deve ser filtrada outratada para a remoção do cloro. A lisozima pode entãosuprir pelo menos parte da atividade de controle demicroorganismos que se perde devido à redução ou remoçãode cloro.
Deve também ficai? entendido que ao " controlar" (ex:prevenir) o crescimento de pelo menos um microorganismo,o crescimento do microorganismo fica pelo menosparcialmente inibido. Em outras palavras, não hácrescimento ou essencialmente nenhum crescimento domicroorganismo. "Controlar" o crescimento de pelo menosum microorganismo mantém a população de microorganismosnum nível desejado, reduz a população até um níveldesejado (mesmo em limites indetectáveis) e/ou pelo menosparcialmente inibe o crescimento do microorganismo.
Assim, em uma concretização da presente invenção, osprodutos, material, ou meios suscetíveis a ataque de pelomenos um microorganismo são pelo menos parcialmentepreservados desse ataque e do estrago resultante, bemcomo de outros efeitos prejudiciais causados pelomicroorganismo. Além disso, deve também ficar entendidoque "controlar" o crescimento de pelo menos ummicroorganismo também inclui reduzir bioestaticamentee/ou manter um nível baixo de pelo menos ummicroorganismo, de forma que o ataque pelo microorganismoe qualquer estrago resultante ou outros efeitosprejudiciais sejam mitigados, ou seja, a taxa decrescimento ou de ataque do microorganismos é reduzidae/ou eliminada. As composições da presente invençãopossuem preferivelmente baixa toxicidade.
Exemplos desses microorganismos incluem fungos,bactérias, algas e suas misturas, tais como, porém nãorestritos a, por exemplo, Trichoderma viride, Aspergillusniger e Chlorella sp.Um outro exemplo é um microorganismogram-positivo, como a espécie Bacillus.
A lisozima é tipicamente designada na nomenclatura dasenzimas como "EC 3.2.1.17" ι sendo também comumentedenominada muramidase. A lisozima utilizada na presenteinvenção pode proceder de qualquer fonte conhecida delisozima, tal como de qualquer fonte vegetal ou animal,podendo ser obtida através í!de qualquer método deprodução, isolamento, ou purificação de enzima, incluindomeios recombinantes. A lisozima está disponível nomercado na forma purificada em escala industrial.
Tipicamente, a enzima purificada é apresentada na formade um sólido branco.
Como opção, a lisozima pode ser uma lisozima tratadatermicamente ou uma lisozima modificada termicamente. Alisozima pode ser um dímero de lisozima. A lisozima podeser termicamente modificada, por exemplo, aquecendo-se alisozima a uma temperatura elevada, tal como oaquecimento em banho maria. A temperatura pode serqualquer temperatura suficiente para modificar alisozima, por exemplo, para formar um dímero de lisozima.
Por exemplo, pode-se utilizar uma temperatura de cerca deO0C ou mais alta, tal como 70°C a 100°C, maisparticularmente, uma temperatura de 8O0C por cerca de 2 0minutos. Para fins da presente invenção, mais de um tipode lisozima pode estar presente. Por exemplo, umalisozima não modificada pode estar presente com umalisozima termicamente modificada. Além disso, o dímero delisozima pode ter outras lisozimas presentes. Porexemplo, a lisozima da presente invenção pode ter 5%3 dedímero de lisozima presente a 50% dímero de lisozimapresente ou mais. Por exemplo, o dímero de lisozima podeestar presente numa quantidade de 1% a 50% ou de 10% a35%. A lisozima termicamente tratada ou termicamentemodificada pode atuar como desnaturação térmica parcialou completa da lisozima. Conforme citado, qualquercombinação de lisozimas pode ser usada na presenteinvenção.
Conforme aqui descrito, a adição opcional ou a presençade pelo menos um composto de amônio quaternário tambémaumenta a atividade antimicrobicina quando utilizado com alisozima e particularmente intensifica a atividadeantialgal. Por exemplo, os compostos de amônioquaternário, tal como o cloretoJjde alquil dimetil benzilamônio estão disponíveis no merqàdo como algicidas. 0 usode um composto de amônio quaternário pode prover umespectro mais amplo de atividade antialgal ou podeproporcionar, aumento na eficácia contra algasproblemáticas. Em particular, acredita-se que a lisozimae um composto dé amônio quaternário atuam sinergicamentepara prover um sistema antim.i;crobiano especificamenteútil e econômico.
O composto de amônio quaternário que pode ser usado paraprover efeitos antimicrobianos sinérgicos adicionais deacordo com a presente invenção pode ser obtido dequalquer fonte de amônio. Por exemplo, o composto deamônio quaternário pode ser um composto com um únicogrupo amônio quaternário ou um composto de amôniopoliquaternário. Exemplos de compostos de amônioquaternário apropriados incluem, por exemplo, cloreto deN, N-dietil-N-dodecil-N-benzilamônio, cloreto de NfN-dimetil-N-octadecil-N-(dimetilbenzil)amônio, cloreto deN, N-dimetil-N,N-dodecilamônio, cloreto de N,N-dimetil-N, N-didodecilamônio, cloreto de Ν,N,N-trimetil-N-tetradecilamônio, cloreto de N-benzil-N,N-dimetil-N-(alquil Ci2-Ci8) amônio, cloreto de N- (diclorobenzil) -N, -N-dimetil-N-dodecilamônio, cloreto de N-hexadecilpiridínio, brometo de N-hexadecilpiridínio,brometo de N-hexadecil-N,N,N-trimetilamônio, cloreto deN-dodecilpiridínio, bissulfato de N-dodecilpirid£nio,cloreto de N-benzil-N-dodecil-N,N-bis(beta-hidroxi-etil)amônio, cloreto de N-dodecil-N-benzil-N,N-dimetilamônio, cloreto de N-benzil-N,N-dimetil-N-(alquilC12-Ci8) amônio, etilssulfato de N-dodecil-N,N-dimetil-N-etilamônio, cloreto de N-dodecil-N,N-dimetil-N-(1-naftilmetil)amônio, cloreto de N-hexadecil-N,N-dimetil-N-benzilamônio ou cloreto de N-dodecil-N,N-dimetil-N-benzilamônio. O composto de amônio quaternário podetambém ser um composto de amônio poliquaternário. Oscompostos de amônio quaternário antimicrobianos que podemser usados incluem os descritos nas patentes americanasNoOs. 3.874.870, 3.931.319, 4.027.020, 4.089.977,4.111.679, 4.506.081, 4.581.058, 4.778.813, 4.970.211,5.051.124, 5.093.078, 5.142.002 e 5.128.100, que são aquiincorporadas por referência. Um exemplo de um composto deamônio poliquaternário é o dicloreto de poli(oxietileno-(dimetilimínio)etileno (dimetilimínio)etileno) que écomercializado sob a marca WSCP da Buckman LaboratoriesInternational, Inc.
Como método para exterminar, prevenir ou inibir ocrescimento de microorganismos, a lisozima e,opcionalmente, o composto de amônio quaternário, podemser providos ao sistema aquoso sob condições em que alisozima e o composto de amônio quaternário atuem paraprover um agente antimicrobiano que extermine, previna ouiniba o crescimento de microorganismos no sistema aquoso.
Um habilitado na técnica poderá imediatamente determinara quantidade eficaz de lisozima e de composto de amônioquaternário opcional útil para uma aplicação específica,simplesmente testando diversas concentrações antes dotratamento de um sistema afetado completo. Por exemplo,num sistema aquoso a ser tratado, a concentração delisozima pode ser qualquer quantidade eficaz, tal decerca de 0,01 ppm a 5.000 ppm, e no tratamento de algas,uma faixa preferida é de cerca de 0,01 ppm a cerca de2.000 ppm, sendo preferivelmente numa faixa de cerca de0,1 a cerca de 500 ppm.
O composto de amônio quaternário pode estar presente nosistema aquoso em qualquer quantidade eficaz, tal comonuma faixa de 0,01 ppm a cerca de 1.0 00 ppm epref erivelmente na faixa de cerca de 0,1 ppm a cerca de10 0 ppm.
As concentrações de lisozima e de composto de amônioquaternário, conforme acima descrito ou conforme descritoem outro lugar do presente pedido, podem ser asconcentrações iniciais dos componentes no momento em queos componentes são combinados ou adicionados a um sistemaaquoso e/ou podem ser as concentrações dos componentes aqualquer momento após os componentes terem interagido como sistema aquoso.
Se tanto a lisozima como pelo menos um composto de amônioquaternário forem utilizados no método da presenteinvenção, os ingredientes podem ser adicionadosseparadamente a um sistema aquoso ou podem ser combinadospara formar uma composição que é adicionada ao sistemaaquoso. Se forem adicionados separadamente, a ordem deadição de componente não é crítica, podendo ser usadaqualquer ordem.
O método da presente invenção pode ser praticado emqualquer pH, tal como uma faixa de pH de cerca de 2 acerca de 11, com uma faixa de pH preferida de cerca de 5a cerca de 9. Para um sistema aquoso que entrará emcontato com organismos superiores, tais como humanos oupeixes, o pH deve ser neutro (em torno de 7). O pH dosistema aquoso pode ser ajustado adicionando-se umácido(s) ou uma base(s) conforme é conhecido no estado datécnica. 0 ácido ou base adicionado deve ser selecionadopara não reagir com nenhum dos componentes do sistema.Porém, é preferível adicionar a lisozima e o composto deamônio quaternário opcional à água sem ajuste de pH.
O método da presente invenção pode ser usado em quaisquersistemas aquosos industriais ou recreativos que demandemcontrole de microorganismos. Tais sistemas aquososincluem, porém não se restringem a fluidos de usinagem,sistemas de água de refrigeração (torres de resfriamento,água de refrigeração de admissão e água de refrigeraçãode efluentes), sistemas de águas servidas, inclusiveáguas residuárias ou sistemas de saneamento submetidos aotratamento de resíduos presentes na água, como porexemplo, tratamento de esgotos, sistemas de águarecirculante, piscinas, banheiras de hidromassagem,sistemas de processamento de alimentos, sistemas de águapotável, sistemas aquosos para processamento de couro,sistemas de água branca, pastas de polpa, e outrossistemas aquosos para processamento e fabricação depapel. Em geral, qualquer sistema aquoso industrial ourecreativo pode-se beneficiar da presente invenção. Ométodo da presente invenção pode também ser usado notratamento de água de admissão para diversos processosindustriais ou instalações recreativas. A água deadmissão pode ser primeiramente tratada através do métododa presente invenção, para que o crescimento microbianoseja inibido antes que a água de admissão ingresse noprocesso industrial ou na instalação recreativa.
A presente invenção será também esclarecida pelosexemplos a seguir, que pretendem ilustrar a presenteinvenção.
EXEMPLOS
Procedimentos Gerais
A. Avaliação de Atividade Algicida
Esse método de teste prove uma técnica para testarcompostos quanto à sua eficácia para inibir (reprimir) ocrescimento de algas. Os valores MIC representam aConcentração Inibitória Mínima, definida como o nívelmais baixo de composto necessário para inibircompletamente (reprimir) o crescimento de um dadoorganismo.
Aparelho:
Tubos de ensaio, 18 - 150 mm. São necessários tubos deensaio esterilizados.
Incubadora, capaz de uma temperatura constante (± 2°C) eregulagem de luz.
Reagentes e Materiais:
KNO3
K2HPO4
MgSO4 . 7H20
Citrato de ferro amoniacal (solução a 1%).
Soluções concentradas:
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Inóculo.
Suspensão de células de uma cultura crescida em meioAllen modificado por 14 dias ou conforme necessário paraobter um massa celular desejada de Chlorella sp. (ATCC7516) ou Phormidium faveolarum (UTEX 427). O inóculo écalibrado a uma transmitância de 82% medida a umcomprimento de onda de 590 nanômetros antes dainoculação.
Procedimento:
Preparação do Meio:
Meio de Allen Modificado (Allen, A.A., 1968)
<table>table see original document page 13</column></row><table>
Esterilizar o meio na autoclave durante 20 minutos a umapressão de 15 libras (121°C). Após autoclavagem, resfriaro meio até 45-50°C e dispensar 5 ml de meio por tubo deensaio, e então adicionar o composto e o inóculo.Incorporação de Composto:
Preparar uma solução concentrada em água do composto aser testado. A concentração da solução concentrada édependente da maior dosagem desejada a ser testada.Diluir a solução concentrada para obter dosagens menoresdo que as selecionadas para a solução concentrada. Umaquantidade máxima de 100 microlitros de soluçãoconcentrada ou a diluição correspondente deve seradicionada por tubo de ensaio.
Inoculação:
Adicionar 100 microlitros de inóculo por tubo de ensaio,por tipo de meio e por tipo de inoculação.
Incubação:
Colocar os tubos de ensaio contendo os tratamentos numaincubadora ajustada para 24°C. A luz é fornecida atravésde lâmpadas fluorescentes para o cultivo de plantasajustadas para fornecer 16 horas de luz e 8 horas depenumbra.
Classificação dos Tubos:
Os tubos de ensaio contendo os tratamentos sãoclassificados como positivos ou negativos:
Positivos (contaminados) quando o meio presente nostubos mostrar crescimento de algas (depósito verde nofundo).
. Negativos (não contaminados) quando o meio presente nostubos permanecer incolor.
O controle é sempre positivo. A concentração inibitóriamínima (MIC) do composto é a menor dosagem mostrando ocrescimento negativo de algas.
Avaliação de Sinergia:
A sinergia foi medida através de diluições segundo ométodo "checkerboard" (hibridização de DNA) (Yan eHancock, 2001) no qual um domposto é diluído ao longo dascarreiras de tubos de ensaio e o outro é diluído ao longodas colunas. Esse método ê focado sobre a busca por umaredução no MIC de cada complonente na presença do outro. 0resultado é expressado :como índice de Concentração
Inibitória Fracionada (FIC);, calculado conforme segue:
FIC = [A]/MICa + [B]/MICb, cnde
MICa e MICb = MICs dos compostos AeB isoladamente
[A] e [B} = MICS dos compostos A e B em combinação
Um índice FIC < 1 indica]5 sinergia; um índice de 0,5representa o equivalente de| uma redução quádrupla no MICde cada composto em combinação. Um índice FIC de 1,0representa atividade aditiva (uma redução dupla no MIC decada composto em combinação) e um índice > 1 indicaantagonismo; um índice > 4 representa o antagonismo real.
B. Avaliação de Atividade Bactericida
Esse método é apropriado para uso na avaliação daspropriedades antibacterianas de agentes químicos, atravésda determinação de seu valor MIC. 0 valor MIC representaa Concentração Inibitória Mínima definida como o nívelmais baixo de composto necessário para se obter > 90%extermínio de um dado organismo.
Equipamento:
Tubos de ensaio, tubos para cultura descartáveis18xl50mm - estéreis
2. Pipetas estéreis de 1 ml e de 10 ml
3. Incubadora capaz de manter uma temperatura de 3 7°C±1°C
4. Autoclave
5. Aparelho medidor de pH
6. Pontas para micropipeta 1-200 ul
7. Micropipeta Eppendorf
8. McFarland Padrão #1
9. Placas de Petri: placas de Petri plásticas,descartáveis, tamanho: 100 χ 15 mm
3. Preparação dos Meios
1. Placa com Ágar Padrão para Contagem Difco: reidratar oágar suspendendo 23,5 g em I-L de água deionizada eaquecer até o ponto de fervura para dissolver. Dispensarconforme desejado e esterilizar numa autoclave a vaporpor 15 minutos a 121°C.
2. Substrato de Sais Basais, pH 7:Trizma® (Tris) HCl............ . 3,9 gTrizma® (Tris) Base........... 0,05 g
(Nota: Obter o pH apropriado antes da adição do compostoseguinte. Ajustar com mais de qualquer um dos tampõesTrizma® apropriado).
Glicose........................ 0,02 grama
Peptona . . . ..........................0,01 grama
Nitrato de amônio............... 1,0 grama
Sulfato magnésio, heptahidrato. 0,25 gramaCloreto de cálcio.............. 0,25 grama
Autoclave a 121°C por 15 min... 0,25 grama
C. Inóculo
Suspensão de células de uma cultura bacteriana de 18 a 24h de Staphylococcus aureus (ATCC 653 8) ou de Bacillussubtilis (ATCC 6633) ou de Enterobacter aerogenes (ATCC13048) para se obter uma concentração desejada decélulas. Utilizando um padrão de sulfato de bário emnefelômetro McFarland ou algum outro método apropriado,ajustar a concentração da suspensão bacteriana de forma ase obter uma concentração final de entre 1 χ 10^4 e 1 χ10^5 células por ml, quando 100 μl do inóculo sãoadicionados a 5 ml do substrato de sais basais.
D. Incorporação de Composto
Preparar uma solução concentrada em água do composto aser testado. A concentração da solução concentrada édependente da maior dosagem desejada a ser testada.Diluir a solução concentrada para se obter dosagensmenores do que as selecionadas para a soluçãoconcentrada. Uma quantidade máxima de 100 μΐ de soluçãoconcentrada ou a diluição correspondente deve seradicionada por tubo de ensaio.
E. Inoculação e Incubação
Adicionar 100 μΐ de inóculo por tubo de ensaio por tipode meio e tipo de inóculo, e incubar a 37°C por 18 horas.
F. Classificação dos tubos através do método de contagemde placas.
O ágar para Contagem Padrão em Placas/Plaqueamento paraincorporação em , ágar ("Pour Plate") foi preparadoconforme descrito em Standard Methods (American PublicHealth Association; 1995). Um milímetro da amostra foicolocado no centro de uma placa de Petri estéril(diâmetro de 100 mm) utilizando uma pipeta estéril. Oágar para contagem padrão em placas derretido (44 a 46°C)e estéril foi adicionado e misturado com a amostragirando-se a placa. As amostras forem deixadas esfriar àtemperatura ambiente até se tornarem sólidas e entãoforam invertidas e incubadas a 35 ± 0,5°C durante 48 ±2h. As colônias formadas no ou sobre o meio de contagemde placa no prazo de 4 8 ± 2h foram contadas conformedescrito em Standard Methods, e os resultados foramrelatados como CFU/milímetro. Quando aplicável, essevalor foi multiplicado pelo fator de diluição para seobter o CFU/milímetro corrigido.
Nesse teste, o MIC do composto é a concentração queproduziu 90% de extermínio. Foi calculado utilizando aseguinte equação:
CFU médio/ml em controles - CFU médio/ml no tratamento χ 100
CFU médio/ml em controles
G. Avaliação da Sinergia
A sinergia foi medida através de diluições segundo ométodo "checkerboard" (hibridização de DNA) . (Yan eHancock, 2 001) no qual um composto é diluído ao longo dascarreiras de tubos de ensaio e o outro é diluído ao longodas colunas. Esse método é focado sobre a busca por umaredução no MIC de cada componente na presença do outro. 0resultado é expressado como índice de ConcentraçãoInibitória Fracionada (FIC)„ calculado conforme segue:FIC = [A]/MICa + [B]/MICb, onde
MICa e MICb = MICs dos compostos AeB isoladamente[A] e [B} = MICS dos compostjos AeB quando em combinação
Um índice FIC < 1 indica sinergia; um índice de 0,5representa o equivalente de uma redução quádrupla no MICde cada composto em combinação. Um índice FIC de 1,0representa atividade aditiva (uma redução dupla no MIC decada composto em combinação) e um índice > 1 indicaantagonismo; um índice > 4 representa o antagonismo real.
Este é um sistema puramente enzimático para controlaralgas. Lisozima é preferivelmente usada por si só comoingrediente ativo nesta invpnção.
. Lisozima (Sigma) , Cloreto de Lysozima (NutriScience) ,Cloreto de Lisozima (MP , Biomedicals) foram testadoscontra Chlorella sp. (ATCC 7516) . 0 período de incubaçãofoi de 14 dias a 24°C sob 16 horas de luz e 8 horas depenumbra
<table>table see original document page 18</column></row><table>
A lisozima pode também ser aplicada em combinação comcompostos de amônio quaternário coraumente utilizados nosistemas de tratamento de água e sistemas aquáticosrecreativos (ex:produto BUSAN 77™) para controlar asalgas.
EXEMPLO 1
Combinações de cloreto de lisozima (MP Biomedicals) comcloreto de benzalcônio. 0 organismo testado foi Chlorellasp. (ATCC 7516). 0 período de incubação foi de 18 dias a24°C sob 16 horas de luz e 8 horas de penumbra.
<table>table see original document page 18</column></row><table>
mica = MIC de cloreto de lisozima isoladamente = 2,00 mgproduto/l
MICb = MIC de cloreto de benzalcônio isoladamente = 2,00mg produto/1
[A] = MIC de cloreto de lisozima em combinação comcloreto de benzalcônio (mg produto/l)
[B] = MIC de cloreto de benzalcônio em combinação comcloreto de lisozima (mg a.i./l)
* = Valor < 1 denota atividade sinérgica de amboscomponentes utilizados simultaneamente
EXEMPLO 2
Combinações de cloreto de lisozima (MP Biomedicals) comcloreto de benzalcônio. O organismo testado foi oPhormidium faveolarum (UTEX 427). O período de incubaçãofoi de 18 dias a 24°C sob 16 horas de luz e 8 horas depenumbra.<table>table see original document page 19</column></row><table>
mica = MIC de cloreto de lisozima isoladamente = 1,00 mgproduto/l
MICb = MIC de cloreto de benzalcônio isoladamente = 2,00mg produto/1
[A] = MIC de cloreto de lisozima em combinação comcloreto de benzalcônio (mg produto/l)
[B] = MIC de cloreto de benzalcônio em combinação comcloreto de lisozima (mg a.i./l)
Valor < 1 denota atividade sinérgica de amboscomponentes utilizados simultaneamente'
EXEMPLO 3
Combinações de cloreto de lisozima (MP Biomedicals) comproduto BUSAN 77™·. O organismo testado foi Chlorella sp.(ATCC 7516) . O período de incubação foi de 18 dias a 24°Csòb 16 horas de luz e 8 horas de penumbra.
<table>table see original document page 19</column></row><table>
mica = MIC de cloreto de lisozima isoladamente = 2,00 mgproduto/1
Mic3 = MIC de produto BUSAN 77™ isoladamente = 0,7 mgproduto/1
[A] = MIC de cloreto de lisozima em combinação comproduto BUSAN 77™ (mg produto/1)
[B] = MIC de produto BUSAN 77™ em combinação com cloretode lisozima(mg a.i./l)
* = Valor < 1 denota atividade sinérgica de amboscomponentes utilizados simultaneamente.
EXEMPLO 4
Combinações de cloreto de lisozima (MP Biomedicals) comproduto BUSAN 77™. 0 organismo testado foi Phormidiumfaveolarum (UTEX 427) . 0 período de incubação foi de 18dias a 24°C sob 16 horas de luz e 8 horas de penumbra.
<table>table see original document page 20</column></row><table>
mica = MIC de cloreto de lisozima isoladamente = 1,00 mgproduto/l
MICb = MIC de produto BUSAN 77™ isoladamente = 2,00 mgproduto/1
[A] = MIC de cloreto de lisozima em combinação comproduto BUSAN 77™ (mg produto/l) :
[B] = MIC de produto BUSAN 77™ em combinação com cloretode lisozima(mg a.i./l)
* = Valor < 1 denota atividade sinérgica de amboscomponentes utilizados simultaneamente.
EXEMPLO 5
Combinações de cloreto de lisozima (MP Biomedicals) comproduto BUSAN 77™. O organismo testado foi Chlorella sp.(ATCC 7516). O período de incubação foi de 34 dias a 24°Csob 16 horas de luz e 8 horas; de penumbra.
<table>table see original document page 20</column></row><table><table>table see original document page 21</column></row><table>
mica = MIC de cloreto de lisozima isoladamente = 2,00 mgproduto/1
MICb = MIC de produto BUSAN 77™ isoladamente = 2,00 mgproduto/l
[A] = MIC de cloreto de lisozima em combinação comproduto BUSAN 77™ (mg produto/l)
[B] = MIC de produto BUSAN 77™ em combinação com cloretode lisozima(mg a.i./l)
* = Valor < 1 denota atividade sinérgica de amboscomponentes utilizados simultaneamente.
EXEMPLO 6
Combinações de cloreto de lisozima (MP Biomedicals) comproduto BUSAN 77™. O organismo testado foi Phormidiumfaveolarum (UTEX 427). 0 período de incubação foi de 34dias a 24°C sob 16 horas de luz e 8 horas de penumbra.
<table>table see original document page 21</column></row><table>
mica = MIC de cloreto de lisozima isoladamente = 2,00 mgproduto/l
MICe = MIC de produto BUSAN 77™ isoladamente = 2,00 mgproduto/l
[A] = MIC de cloreto de lisozima em combinação comproduto BUSAN 77™ (mg produto/1)
[B] = MIC de produto BUSAN 77™ em combinação com cloretode lisozima(mg a.i./l)
* = Valor < 1 denota atividade sinérgica de amboscomponentes utilizados simultaneamente.
EXEMPLO 7Combinações de cloreto de lisozima (MP Biomedicals) comcom produto BUSAN 77™. 0 organismo testado foiStaphylococcus aureus (ATCC 653 8). 0 período de incubaçãofoi de 18 horas a 37°C.
<table>table see original document page 22</column></row><table>
MICa = MIC de cloreto de lisozima isoladamente = 500,0 mgproduto/l
MICb = MIC de produto BUSAN 77™ isoladamente = 0,8 mgproduto/1
[A] = MIC de cloreto de lisozima em combinação comproduto BUSAN 7 7™ (mg produto/l)
[B] = MIC de produto BUSAN 77™ em combinação com cloretode lisozima(mg produto/l)
* = Valor < 1 denota atividade sinérgica de amboscomponentes utilizados simultaneamente.
EXEMPLO 8
Combinações de cloreto de lisozima (MP .Biomedicals) comproduto BUSAN 77™. 0 organismo testado foi Bacillussubtilis (ATCC 6633) . 0 período de incubação foi de 18horas a 3 7°C.
<table>table see original document page 22</column></row><table>
Micft = MIC de cloreto de Iisozimal isoladamente = 500,0 mgproduto/1
MICb = MIC de produto BUSAN 77™ isoladamente = 2,0 mgproduto/1
[A] = MIC de cloreto de lisozima em combinação comproduto BUSAN 77™ (mg produto/l)
[B] = MIC de produto BUSAN 77™ em combinação com cloretode lisozima(mg produto/l)
* = Valor < 1 denota atividade sinérgica de amboscomponentes utilizados simultaneamente.
EXEMPLO 9
Combinações de cloreto de lisozima (MP Biomedicals) comproduto BUSAN 77™. O organismo testado foi Enterobacteraerogenes (ATCC 13 048). O período de incubação foi de 18horas a 3 7°C.
<table>table see original document page 23</column></row><table>
MICa = MIC de cloreto de lisozima isoladamente = 1000,0mg produto/1
Nota: O MIC do cloreto de lisozima contra E.aerogenes nãofoi determinado dentro da faixa de concentração mostrada,porém, para demonstrar que o sinergia realmente existe, oMIC foi mostrado maior que 1000 mg produto/l, que foi aconcentração testada mais alta.
MICb = MIC de produto BUSAN 77™ isoladamente = 0,8 mgproduto/1
[A] = MIC de cloreto de lisozima em combinação comproduto BUSAN 77™ (mg produtp/1)
[B] = MIC de produto BUSAN 77™ em combinação com cloretode lisozima(mg produto/l)
* = Valor < 1 denota atividade sinérgica de amboscomponentes utilizados simultaneamente.
EXEMPLO 10
Combinações de cloreto de lisozima (NutriScience) comcloreto de sódio. 0 organismo testado foi Chlorella sp.(ATCC 7516). O período de incubação foi de 14 dias a 24°Csob 16 horas de luz e 8 horas de penumbra.<table>table see original document page 24</column></row><table>
mica = MIC de cloreto de lisozima isoladamente = 2,00 mgproduto/l
micb = MIC de cloreto de sódio isoladamente = 30,000 mgproduto/1
[A] = MIC de cloreto de lisozima em combinação comcloreto de sódio (mg produto/l)
[B] = MIC de cloreto de sódio em combinação com cloretode lisozima(mg a.i./l)
* = Valor < 1 denota atividade sinérgica de amboscomponentes utilizados simultaneamente.
EXEMPLO 11
Combinações de cloreto de lisozima (NutriScience) comcloreto de ,sódio. O organismo testado foi Phormidiumfaveolarum (UTEX 427). O período de incubação foi de 14di as a 240C sob 16 horas de luz e 8 horas de penumbra.
<table>table see original document page 24</column></row><table>
MICa = MIC de cloreto de lisozima isoladamente = 2,00 mgproduto/l
Mice = MIC de cloreto de sódio isoladamente = 20,000 mgproduto/1
[A] = MIC de cloreto de lisozima em combinação comcloreto de sódio (mg produto/1)
[B] = MIC de cloreto de sódio em combinação com cloretode lisozima(mg a.i./l)* = Valor < 1 denota atividade sinérgica de amboscomponentes utilizados simultaneamente.
Os depositantes especificamente incorporam os conteúdoscompletos de todas as referências citadas nesterelatório. Além disso, quando uma quantidade,concentração, ou outro valor ou parâmetro é dado comofaixa, faixa preferida, ou lista de valores superiores einferiores preferidos, isso deve ser entendido comoespecificamente descrevendo todas as faixas formadas apartir de qualquer par de qualquer limite de faixa ouvalor preferido superior e qualquer limite de faixa ouvalor preferido inferior, independentemente se as faixassão ou não descritas separadamente. Quando uma faixa devalores numéricos é aqui citada, salvo se estabelecido deoutra forma, a faixa pretende incluir os pontos finais damesma, e todos os números inteiros e frações dentro dafaixa. O escopo da invenção não tem a pretensão de ficarrestrito aos valores especificados, citados ao se definiruma faixa.
Outras concretizações da presente invenção serãoevidentes aos habilitados na técnica, com base naconsideração do presente relatório e da prática dapresente invenção aqui descrita. O presente relatório eexemplos pretendem ser considerados como representativosapenas, com o real escopo e espírito da invenção sendoindicado pelas reivindicações a seguir e seusequivalentes.
Claims (14)
1. Método para controlar o crescimento de pelo menos ummicroorganismo, num sistema aquoso, caracterizado pelofato de compreender:prover uma composição consistindo essencialmente delisozima ao sistema aquoso.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de controlar o crescimento de algas no sistemaaquoso.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de dita lisozima ser uma lisozima tratadatermicamente ou modificada termicamente.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de dita lisozima ser um dímero de lisozima.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de a lisozima ser adicionada ao sistema aquosopara prover uma concentração de lisozima de cerca de 0,01a cerca de 100 ppm, preferivelmente, de cerca de 0,1 acerca de 10 ppm.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de o sistema aquoso ser uma piscina, banheirasde hidromassagem ou balneário.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de o sistema aquoso ser um sistema de águarecirculada contendo um gerador de cloro e sendo que osistema de água recirculada contém de cerca de 2.000 acerca de 6.000 ppm de cloreto de sódio.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de o sistema aquoso ser um meio paraaquacultura.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de o sistema aquoso ser um sistema de águarecirculada do qual o cloro foi removido.
10. Método para controlar o crescimento de pelo menos ummicroorganismo, num sistema aquoso, caracterizado pelofato de compreender:prover uma composição compreendendo uma combinação depelo menos uma lisozima e de pelo menos um composto deamônio quaternário.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de a lisozima ser adicionada aosistema aquoso para prover uma concentração de lisozimade cerca de 0,01 a cerca de 5.000 ppm, preferivelmente,de cerca de 0,1 a cerca de 50 0 ppm.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de o composto de amônioquaternário ser adicionado ao sistema aquoso para proveruma concentração do composto de amônio quaternário decerca de 0,01 a cerca de 1.000 ppm, pref erivelmente, decerca de 0,1 a cerca de 100 ppm.
13. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de a lisozima e o composto deamônio quaternário serem adicionados ao sistema aquosopara prover uma concentração de lisozima de cerca de 0,1a cerca de 500 ppm e uma concentração do composto deamônio quaternário de cerca de 0,1 a cerca de 10 0 ppm.
14. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de controlar o crescimento, dealgas num sistema aquoso.
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