"PRODUTO ALIMENTÍCIO E USO"
Campo da Invenção
A presente invenção se refere a um produto alimentício quecompreende um ingrediente que possui um efeito de diminuição do colesterolsangüíneo, de preferência, em quantidades suficientes para obter um efeito dediminuição do colesterol sangüíneo caso o produto alimentício for utilizado deacordo com as necessidades usuais do consumidor.
Antecedentes da Invenção
A variação da concentração média de colesterol total no plasmaentre as populações está altamente correlacionada com a variação naquantidade de arteriosclerose e com a incidência de Doença CardíacaCoronária (CHD), que é uma das principais causas de morte na sociedadeOcidental. As populações com um baixo nível de colesterol (inferior a 180 mg/dl (4,7 mmol/ L)) foram descobertas como sendo menos sensíveis àarteriosclerose e às doenças cardíacas coronárias, enquanto que aquelas comníveis médio de colesterol acima de 220 mg/ dl (5,7 mmol/ L;hipercolesterolemia) possuem maiores incidências de morte devido ao CHD.
Portanto, há uma necessidade óbvia por um método pelo qual o nível decolesterol possa ser diminuído.
Os ésteres de esteróis e esterol foram propostos comoingredientes de diminuição do colesterol sangüíneo, por exemplo, no pedido depatente EP 619.952 (Amano), um aditivo alimentício é descrito, em que o nível decolesterol no alimento é diminuído ao tratar o alimento com o aditivo alimentício. Nautilização do aditivo (y- orizanol sendo mencionado), é formado um complexo com ocolesterol no alimento. O alimento contendo o aditivo não pode, portanto, seraplicado para diminuir o nível de colesterol sangüíneo em mamíferos.
No documento WO 92/19640 (Raison Margariini Oy) umasubstância de éster de ácido graxo de 3-sitostanol é descrita que pode serutilizada como tal ou adicionada ao alimento. É descrito que uma dieta comumcontém esteróis vegetais de 100 a 300 mg/dia, e que estes esteróis sãofracamente absorvidos pelos intestinos. No documento WO 92/19640, éportanto, discutido que a utilização dos esteróis vegetais não pode ser utilizadapara a redução dos níveis de colesterol do soro sangüíneo na dieta humana. Oefeito de diminuição do colesterol do esterol ou estanol vegetal ou seus ésteresfoi descrito como sendo principalmente por meio da inibição da incorporação docolesterol em micelas.
O documento EP 828.434 descreve que uma diminuição do nívelde colesterol sangüíneo é capaz de ser obtido pelo consumo regular deprodutos alimentícios com base em gordura que compreende pelo menos umcomposto do grupo que consiste em fitosteróis e orizanol, e suas misturas.
Outros ingredientes também foram sugeridos para a diminuiçãodo colesterol sangüíneo. Por exemplo, o documento WO 01/24789 descreve 3-peptídeos como substâncias ativas para a redução da ingestão de colesterol eingestão de lipídeo pelo intestino. De modo a agir como um precipitante, estespeptídeos precisam de pelo menos duas cargas positivas. Entretanto, autilização de β-peptídeos, algumas vezes não é desejável porque eles possuemuma estrutura química diferente para peptídeos de ocorrência natural.
O documento US 2001/0005714 descreve apo-proteínas naturaisou variáveis e outras proteínas e peptídeos que possuem uma a-héliceanfipática composta de pelo menos 15 aminoácidos. Estas moléculas inibem aingestão de colesterol e outros lipídeos pelo intestino.
O documento JP 2004/099447 descreve um peptídeo específicocom a seqüência de aminoácido Val-Ala-Trp-Trp-Met-Tyr, que ocorre naproteína da soja, que pode ser utilizado em produtos alimentícios para possuirum efeito de diminuição de colesterol.
O documento EP 1.046.396 descreve uma composição contendoproteína de soja e esteróis vegetais possuindo efeito sinérgico de diminuiçãodo colesterol. Entretanto, as frações (peptídeos) responsáveis pelo efeito dediminuição do colesterol da proteína da soja não foram descritas.
O documento WO 01/37681 descreve uma composição contendoesteróis vegetais e uma proteína hidrossolúvel isolada, tal como a proteína dasoja ou o caseinato e, opcionalmente, também um emulsificante. A composiçãonão possui um efeito de diminuição do colesterol adicional comparado aosesteróis vegetais sozinhos. O documento US 6.113.972 descreve um complexode esteróis vegetais com proteína, onde o complexo aumenta abiodisponibilidade dos esteróis vegetais. Não é atribuído o efeito de diminuiçãodo colesterol à proteína.
O documento 790.060 descreve um complexo de proteína-hidrolisado-fosfolipídeo de soja para diminuir o colesterol do plasma.
O documento WO 03/055324 A1 descreve composições contendoesteróis vegetais e hidrolisados de produtos de proteína, preparados pelautilização da preparação da enzima aproteolítica, para diminuir o colesterol doplasma.
O FDA aprovou uma reivindicação à saúde com relação ao papel daproteína da soja na redução do risco de doenças cardiovasculares pela diminuiçãodo colesterol sangüíneo. De modo a se qualificar para esta reivindicação, umalimento deve conter pelo menos 6,25 gramas de proteína de soja por porção, aquantidade sendo um quarto do nível eficaz de 25 gramas por dia.
Ainda existe uma necessidade por produtos alimentíciosalternativos que compreendem um ingrediente que possui um efeito dediminuição do colesterol sangüíneo. Em particular, ainda existe umanecessidade por produtos alimentícios que compreendem ingredientes quepodem inibir a absorção do colesterol por meio de um mecanismo definido, porexemplo, pela interrupção da formação de micela de colesterol.Descrição Resumida da Invenção
É um objeto da presente invenção fornecer um produtoalimentício que compreende os peptídeos que são capazes de inibir a ingestãode colesterol por meio da interferência na formação de micelas. Foi descobertoque os peptídeos apropriados para a utilização nestes produtos alimentíciossatisfazem, de preferência, uma série de critérios. Acredita-se que se estespeptídeos forem utilizados nos produtos alimentícios em quantidadesespecíficas, eles contribuem para o controle dos níveis de colesterolsangüíneo. Embora os Depositantes não desejem de forma alguma estaremrestritos a qualquer teoria, acredita-se que os peptídeos que satisfazem ocritério indicado abaixo interrompem a formação das micelas de colesterol nointestino, evitando ou reduzindo assim a ingestão de colesterol através daparede intestinal.
Conseqüentemente, um primeiro aspecto da presente invençãose refere ao produto alimentício que compreende um peptídeo, dito peptídeosendo caracterizado por possuir um número de aminoácidos de 4 a 20, epossuindo uma carga positiva líquida de 1 ou maior conforme determinado pelasoma das cargas dos aminoácidos individuais do peptídeo em pH 6,5, com aressalva de que os peptídeos não são um β-peptídeo.
De preferência, o produto alimentício é selecionado a partir dogrupo que consiste em bebidas, produtos do tipo lácteo, produtos deconfeitaria congelados ou espalháveis/ margarinas. Da mesma maneira, aquantidade de peptídeos conforme definido acima no produto alimentício éde pelo menos 0,1 g/kg, de preferência, de 1 a 200 g/kg, de maiorpreferência, de 2 a 30 g/kg.
A presente invenção também se refere à utilização destesprodutos alimentícios na preparação de um produto nutricional apropriado paradiminuir os níveis de colesterol sanguineo.Descrição Detalhada da Invenção
Os peptídeos para a utilização nos produtos alimentícios deacordo com a presente invenção são caracterizados por possuírem um númerode aminoácidos de 4 a 20, e por possuírem uma carga positiva líquida de 1 oumais.
Os peptídeos para a utilização nos produtos alimentícios deacordo com a presente invenção não são β-peptídeos. De preferência, ospeptídeos contêm aminoácidos comumente presentes nos peptídeos deocorrência natural. De preferência, os peptídeos são a-peptídeos.
De preferência, o número de aminoácidos é de 4 a 12, de maiorpreferência, de 6 a 10 e, de maior preferência, de 6 a 8. De preferência, acarga positiva líquida do peptídeo é de 1 a 8, por exemplo, 1 ou 2, depreferência, de 3 a 8.
A Tabela 3 mostra o efeito dos peptídeos carregados naincorporação do colesterol em micelas misturadas para uma série deseqüências de aminoácidos conforme descrito nos Exemplos.
A Tabela 4 mostra o efeito do comprimento de peptídeoscarregados na incorporação de colesterol em micelas misturadas para umasérie de seqüências de aminoácidos conforme descrito nos Exemplos.
A carga líquida de um peptídeo pode ser determinada pelasomatória das cargas dos aminoácidos individuais do peptídeo em pH 6,5.
Os aminoácidos que possuem uma carga de +1 em pH 6,5 são aIisina (K), arginina (R) e histidina (H). Os aminoácidos que possuem uma cargade -1 em um pH 6,5 são o ácido aspártico (D) e o ácido glutâmico (E). Osaminoácidos naturais remanescentes possuem uma carga de 0 em pH 6,5 esão a alanina (A)1 valina (V), Ieucina (L), isoleucina (I), prolina (P), triptofano(W)1 fenilalanina (F), metionina (M), glicina (G)1 serina (S)1 treonina (T)1 tirosina(Y), cisteína (C), glutamina (Q) e aspargina (N).De preferência, os peptídeos para a utilização nos produtosalimentícios da presente invenção compreendem por molécula pelo menos 1,de maior preferência, pelo menos 2 e de maior preferência, de 3 a 8aminoácidos selecionados a partir do grupo de K1 R e H.
De preferência, os peptídeos para a utilização no produtoalimentício da presente invenção não compreendem quaisquer aminoácidoscarregados negativamente, tal como DeE.
Os exemplos dos peptídeos preferidos são hexapeptídeospositivamente carregados em que de 1 a 6 aminoácidos são selecionado apartir do grupo que consiste em K, R e H e os aminoácidos restantes sãoselecionados individualmente a partir do grupo de A, V, L1 I, P, W, F, M, G, S,Τ, Y, C, Q, N. Também são preferidos os octa-peptídeos positivamentecarregados, em que de 1 a 8 aminoácidos são selecionados a partir do grupode K, R e H e os aminoácidos restantes são selecionados individualmente apartir do grupo de A, V, L, I, P, W, F, M, G, S, Τ, Y, C, Q, N.
Os exemplos específicos de peptídeos apropriados sãoapresentados na Tabela 1 e nos Exemplos.
Tabela 1
<table>table see original document page 7</column></row><table><table>table see original document page 8</column></row><table>
Os peptídeos podem ser obtidos ou fabricados por qualquer métodoconhecido no estado da técnica, incluindo a síntese de peptídeos puros.
Os produtos alimentícios de acordo com a presente invenção são,de preferência, selecionados a partir do grupo que consiste em bebidas,produtos do tipo lácteo, produtos de confeitaria congelados ou espalháveis/margarina. A quantidade de peptídeos no produto alimentício é, de preferência,pelo menos 0,1 g/kg, de maior preferência, de 1 a 200 g/ kg, de maiorpreferência, de 2 a 30 g/kg. Estes tipos preferidos de produtos alimentícios sãodescritos com alguns detalhes abaixo.
De preferência, a quantidade de peptídeos destes produtosalimentícios é selecionada tal que, por porção, uma quantidade de 0,1 a 10gramas de peptídeos está presente. Os tamanhos de porção apropriados estãoindicados na Tabela 2.
Tabela 2
<table>table see original document page 8</column></row><table>Produtos de Suco de Fruta
Os exemplos de produtos de suco de fruta de acordo com apresente invenção são sucos derivados de frutas cítricas como laranja e toronja(grapefruit), frutas tropicais, banana, pêssego, pêra, morango, às quais ospeptídeos e, opcionalmente, um ou mais ingredientes saudáveis ao coraçãosão adicionados.
Produtos do Tipo Lácteos
Os exemplos de produtos do tipo lácteo de acordo com apresente invenção são o leite, espalháveis lácteos, cream cheese, bebidas dotipo Láctea e iogurte, para os quais os peptídeos e, opcionalmente, um ou maisingredientes saudáveis para o coração são adicionados.
O produto alimentício pode ser utilizado como tal como umabebida do tipo láctea. Alternativamente, o sabor ou outros aditivos podem serutilizados. Um produto do tipo lácteo também pode ser produzido pela adiçãodos peptídeos na água ou a um produto lácteo.
Um exemplo de uma composição para um produto do tipo iogurteé de cerca de 50 a 80% em peso de água, de 1 a 10% em peso de peptídeose, opcionalmente, um ou mais ingredientes saudáveis para o coração, de 0 a15% em peso de pó de soro lácteo, de 0 a 15% em peso de açúcar (porexemplo, sacarose), de 0,01 a 1% em peso de cultura de iogurte, de 0 a 20%em peso de fruta, de 0,05 a 5% em peso de vitaminas e minerais, de 0 a 2%em peso de sabor, de 0 a 5% em peso de estabilizante (espessante ou agentegelificante). Para o iogurte, pode ser adicionada a fruta.
Um tamanho de porção típico para um produto do tipo iogurtepoderia ser de 50 a 250 g, em geral de 80 a 200 g.
Produtos de Confeitaria Congelados
Para o propósito da presente invenção, o termo produto deconfeitaria congelado inclui confeitos congelados contendo leite, tais comosorvetes, iogurtes congelados, sherbet, sorbet, sorvete de água e creme deovos congelado, geladinhos, granitas e purês de fruta congelados.
De preferência, o nível de sólidos no confeito congelado (porexemplo, açúcar, gordura, flavorizante, etc) é de mais de 3% em peso, demaior preferência, de 10 a 70% em peso, por exemplo, de 40 a 70% em peso.
O sorvete irá compreende tipicamente de 0 a 20% em peso degordura, de 1 a 10% em peso de peptídeos e, opcionalmente, um ou maisingredientes saudáveis ao coração, adoçantes, de 0 a 10% em peso decomponentes do leite não gordurosos e componentes opcionais, tais comoemulsificantes, estabilizantes, conservantes, ingredientes flavorizantes,vitaminas, minerais, etc, sendo o balanço de água. Tipicamente, o sorvete seráaerado, por exemplo, a uma expansão de 20 a 400%, mais específico de 40 a200% e congelado a uma temperatura de -2 a -200° C, mais específico de -10a -30° C. O sorvete compreende normalmente cálcio em um nível de cerca de0,1% em peso.
Emulsões Contendo Óleo ε Água
Vantajosamente, o produto alimentício é uma emulsão contendoóleo e água, por exemplo, um espalhável ou uma margarina. A emulsão óleo eágua é definida no presente como uma emulsão compreendendo óleo e água einclui emulsões óleo-em-água (o/w) e água-em-óleo (w/o) e emulsões maiscomplexas, por exemplo, emulsões água-em-óleo-em-água (w/o/w/o/w). O óleoé definido no presente como incluindo gordura.
De preferência, um espalhável de acordo com a presenteinvenção compreende de 30 a 90% em peso de óleo vegetal, de 1 a 5% empeso de peptídeos e, opcionalmente, um ou mais ingredientes saudáveis aocoração adicionais em quantidades apropriadas. Vantajosamente, umespalhável possui um pH de 4,2 a 6,0.
Um exemplo de uma composição de um espalhável é 37,45% empeso de uma mistura de gordura, 52,8% em peso de água, 0,15% em peso delecitina, 0,2% em peso de monoglicerídeo, 0,1% em peso de sabor, 0,5% empeso de cloreto de sódio, 0,1% em peso de sorbato de potássio, 0,1% em pesode pó de soro do leite doce, 6% em peso de amido, 2,5% em peso depeptídeos.
Outros Produtos Alimentícios
Outros produtos alimentícios de acordo com a presente invençãopodem ser preparados por um técnico no assunto, com base no conhecimentocomum geral, os peptídeos e, opcionalmente, um ou mais ingredientessaudáveis para o coração em quantidades apropriadas. Os exemplos de taisprodutos alimentícios são assados, lanches, molhos, barras, etc.
Os produtos alimentícios da presente invenção contêm, depreferência, ainda, ingredientes saudáveis ao coração, particularmentepreferida é a utilização de esteróis, tais como, por exemplo, fitosteróis oufitostanóis, nos produtos alimentícios da presente invenção. Os esteróispreferidos para a utilização nos produtos alimentícios da presente invenção sãodescritos com mais detalhes abaixo. Para o propósito da presente invenção, otermo esteróis se refere aos esteróis, estanóis, seus análogos e seus ésteres.
Fitosteróis. Fitostanóis. Análogos ε DerivadosTipicamente, os fitosteróis, fitostanóis e seus análogos ederivados podem ser selecionados a partir de um ou mais fitosteróis,fitostanóis, análogos sintéticos de fitosteróis e fitostanóis e derivadosesterificados de qualquer um dos anteriores, e a misturas dos mesmos. Aquantidade total de tais substâncias em um produto alimentício é, depreferência, de 0,01% a 20%, de maior preferência, de 0,1% a 15%, de maiorpreferência, ainda, de 0,2% a 8% e, de maior preferência, ainda, de 0,3% a 8%em peso da composição do produto alimentício.
De preferência, a ingestão por porção de tal componente do tipoesterol da combinação é de 0,1 g a 3 g, de maior preferência, de 1,5 g a 2,5 g,em especial, de 2 g a 2,25 g por porção.
Os fitosteróis, também conhecidos como esteróis vegetais ouesteróis de plantas podem ser classificados em três grupos, 4-desmetilsteróis,4-monometilesteróis e 4,4'-dimetilesteróis. Nos óleos eles existemprincipalmente como esteróis livres e ésteres de esteróis de ácidos graxosembora os glicosídeos de esterol e os glicosídeos de esterol acilados tambémestejam presentes. Há três fitosteróis principais denominados β-sitosterol,stigmasterol e campesterol. Os fitostanóis são os respectivos derivadoso saturados de 5a- de fitosteróis, tais como o sitostanol, campestanol e seusderivados.
Os análogos sintéticos de quaisquer dos fitosteróis ou fitostanóis(que incluem os fitosteróis ou fitostanóis naturais quimicamente modificados)podem ser utilizados.
De preferência, o fitosterol ou fitostanol é selecionado a partir dogrupo que consiste em éster de ácido graxo de β-sitosterol, β-sitostanol,campesterol, campestanol, stigmasterol, stigmastanol e suas misturas.
Os materiais de fitosterol ou fitostanol opcionais citados acimapodem ser opcionalmente fornecidos na forma de um ou mais de seus ésteresde ácido graxo. As misturas de materiais esterificados e não esterificadostambém pode ser utilizada.
Portanto, qualquer um dos esteróis, por exemplo, fitosteróis oufitostanóis e seus análogos sintéticos utilizados na presente invenção são, depreferência, esterificados com um ácido graxo. De preferência, eles sãoesterificados com um ou mais ácidos graxos C2-C22- Para o propósito dapresente invenção, o termo ácido graxo C2-C22 se refere a qualquer moléculaque compreende uma cadeia principal C2-C22 e pelo menos um grupo ácido.
Embora não preferido dentro do presente contexto, a cadeia principal C2-C22pode conter de 1 a 6 ligações duplas, ser parcialmente substituída ou podeestar presente cadeias laterais. Entretanto,de preferência, os ácidos graxos C2-C22 são moléculas lineares que compreendem um ou dois grupo(s) ácido(s)como grupo(s) final(is). Os ácidos graxos C8-C22 lineares de maior preferênciapodem ocorrer nos óleos líquidos naturais.
De preferência, os produtos alimentícios da presente invençãocompreendem uma combinação de peptídeos conforme descrito acima eesteróis, em que a proporção em peso de peptídeos para esteróis é de 100: 1para 1: 50, de maior preferência, de 50: 1 para 1: 30, de maior preferência,ainda, de 5: 1 para 1: 15.
A presente invenção será ainda ilustrada nos exemplos seguintes.
Exemplos
Exemplo 1
Método para a Preparação de Peptídeos
Peptídeos sintéticos.
Os peptídeos sintéticos de acordo com a presente invençãopodem ser fabricados por qualquer método sintéticos conhecido no estado datécnica.
Avaliação do efeito dos peptídeos na solubilidade do colesterolem micelas misturadas.
O colesterol é um composto hidrofóbico, que é insolúvel em águae forma cristais em um ambiente aquoso. Esta propriedade torna difícil para ocolesterol se mover do lúmen em direção à membrana de borda em escova nointestino, onde o colesterol é ingerido pelos enterócitos. No lúmen intestinal,moléculas anfifílicas, tais como os monoacilgliceróis (MAG), os ácidos graxoslivres (FFA) e os lisofosfolipídeos (LPL), são geradas por meio da hidróliseenzimática dos alimentos. Os ácidos biliares, fosfolipídeos (PL) e o colesterollivre são secretados no duodeno a partir da vesícula biliar. Estes compostos(ácidos biliares, FFA1 MAG, PL1 LPL e colesterol) podem formar uma estruturadenominada micelas alimentares misturadas. As micelas alimentaresmisturadas podem dissolver o colesterol hidrofóbico para evitar a cristalizaçãoem um ambiente aquoso.
Portanto, as micelas de colesterol alimentares misturadasdesempenham um papel importante na absorção do colesterol, por meio daação como veículos que transportam colesterol em direção à parede intestinal.
Para formar micelas in vitro, 0,1 mM de lecitina, 0,05 mM demonooleína, 0,1 mM de ácido oléico e 80 μΜ de colesterol são misturados emum tubo teste e secos em uma corrente de N2. Após a secagem, uma misturade ácido biliar de 2 mM (mistura BA) em PBS pH 6,5 é adicionada a estamistura de lipídeo. O colesterol marcado fluorescente (NBD-colesterol) éutilizado para monitorar a incorporação de colesterol nas micelas misturadas.
Para teste, os peptídeos (1 mg/ ml) são adicionados à mistura BAe então misturados com misturas de lipídeos conforme descrito. Toda a misturaé agitada em vórtex por 15 segundos, seguido por um tratamento ultrassônicoem um banho de água por 30 minutos. Para esta mistura, uma amostra étomada como medida da concentração total de colesterol NBD. A solução demicela restante é centrifugada em uma ultra-centrífuga de mesa a 50.000 g por30 minutos à temperatura ambiente.
Após a centrifugação, as amostras do sobrenadante são tomadaspara a determinação de um colesterol NBD solubilizado, que indica aquantidade de colesterol incorporado nas micelas misturadas. O pelletcontendo colesterol cristalizado é descartado. O colesterol NBD é medido a375/ 465 nm utilizando um leitor de prato fluorescente.
As misturas de micela misturadas não contendo peptídeos sãoutilizadas como controle (100%). Para cada exemplo, a porcentagem decolesterol incorporado é calculada ao dividir a quantidade de colesterolincorporado na composição teste pela quantidade de colesterol incorporado naamostra controle.
Efeito da carga dos peptídeos na incorporação de colesterol emmicelas misturadas.
Para as seqüências de aminoácidos mostradas na Tabela 3, oefeito na incorporação de colesterol em micelas misturadas foi determinadoutilizando o método descrito acima.
Conforme pode ser observado na Tabela 3, os peptídeoscarregados positivamente são significativamente melhores na inibição daincorporação de colesterol em micelas misturadas, comparado aospeptídeos carregados negativamente. O número de aminoácidoscarregados por molécula de peptídeo/ proteína também é importante.Quanto mais aminoácidos carregados positivamente, melhor a inibição naincorporação de colesterol.
Tabela 3
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Exemplo 2
Efeito do comprimento dos peptídeos carregados na incorporaçãodo colesterol em micelas misturadas.
Para as seqüências de aminoácidos positivamente carregadosmostradas na Tabela 4, o efeito da incorporação do colesterol em micelasmisturadas foi determinado utilizando o método descrito acima.
Conforme pode ser observado na Tabela 4, para os peptídeoscarregados positivamente, os dipeptídeos não possuem efeito mensurável naincorporação do colesterol em micelas misturadas. Os peptídeos com 4aminoácidos ou mais, inibem de modo significativo a incorporação de colesterolem micelas misturadas.
Tabela 4
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Exemplo 3
Produtos alimentícios de acordo com a presente invenção.
Exemplo 3a: 0,3 g de hexa-peptídeo RRRRRR foi misturado emum iogurte de fruta disponível comercialmente de 125 gramas de porção.
Exemplo 3b: 0,5 g de octa-peptídeo RRRRRRRR e 3 g de umesterol éster (β-sitosterol esterificado com óleo de girassol) foi adicionado auma bebida de iogurte disponível comercialmente de 200 g de porção.
Exemplo 3c: 0,5 g de tetra-peptídeo KKKK e 3 g de um esteroléster (β-sitosterol esterificado com óleo de girassol) foi adicionado a um tubo deespalhável disponível comercialmente de 150 g (Flora, Reino Unido).