BRPI0707249A2 - métodos para identificar pacientes com maior probabilidade de terem cáncer de ovário e composições para os mesmo - Google Patents

Abstract

METODOS PARA IDENTIFICAR PACIENTES COM MAIOR PROBABILIDADEDE TEREM CANCER DE OVARIO E COMPOSIçõES PARA OS MESMOS São fornecidos métodos de triagem paraidentificar pacientes com probabilidade aumentada de terem câncer de ovário. Os métodos de triagem envolvem a detecção de expressão de uma pluralidade de biomarcadores em uma amostra de corpo, em que a superexpressão dos biomarcadores é indicativa de probabilidade aumentada de ter câncer deovário. Os métodos de triagem podem compreender ainda uma análise de duas etapas. Biomarcadores de interesse incluem genes e proteínas que estão, por exemplo, envolvidos em defeitos em replicação de DNA/controle de ciclo de célula, crescimento e proliferação de células, escape de apoptose,angiogênese ou linfogênese, ou os mecanismos de motilidade e invasão de células de câncer. Em alguns aspectos da invenção, a expressão de um biomarcador é detectada no nível de proteína utilizando um anticorpo específico de biomarcador ou no nível de ácido nucléico utilizando técnicas de hibridização de ácido nucléico. Os métodos para detectar câncer de ovário em pacientes são adicionalmente revelados aqui. Kits para pór em prática os métodos da invenção são adicionalmente fornecidos.

Description

MÉTODOS PARA IDENTIFICAR PACIENTES COM MAIOR PROBABILIDADEDE TEREM CÂNCER DE OVÁRIO E COMPOSIÇÕES PARA OS MESMOS

Campo da invenção

A presente invenção refere-se a métodos e composiçõespara identificar mulheres com probabilidade aumentada deterem câncer de ovário.

Antecedentes da invenção

O câncer dè ovário representa um grupo heterogêneo dedoenças que afetam mulheres em uma base global. Há váriasformas de câncer de ovário que incluem câncer epitelial,câncer de linha germinativa dos ovários e câncer estromalde ovário. Câncer epitelial de ovário representa a formamais comum da doença. Aproximadamente 5-10% de câncerepitelial de ovário representa uma forma hereditária dadoença e três padrões comuns são reconhecidos: câncer deovário sozinho; câncer de mama e ovário ligado à ligaçãogenética BRACl e BRCA2 em cromossomos 17q21 e 13ql2respectivamente; e câncer de cólon e ovário. 0 fator derisco mais importante para câncer de ovário é um primeirograu relativo à doença (por exemplo, uma mãe, irmã ou filhacom câncer de ovário). Vide, por exemplo, Partridge eoutros (1999) CA-A Câncer Journal for Clinicians 49:297-320. Em 2005, houve uma estimativa de 22.000 novos casòs dediagnósticos de câncer de ovário e 16.000 óbitos de câncerde ovário. Vide genericamente o website da American CâncerSociety em www.cancer.org; website do National CâncerInstitute em www.cancer.gov. 0 câncer de ovário é umadoença 1 que afeta principalmente mulheres pós-menopausa coma idade mediana para diagnóstico em 63 anos de idade.

Entretanto, a doença pode afetar mulheres em todos osgrupos de idade. National Câncer Institute Surveillancè,Epidemiology and End Results (SEER) Program emwww.seer.câncer.gov.

A classificação de estágio de câncer de ovário sebaseia na extensão de localização versus difusão da doençaalém dos ovários. O câncer de ovário estágio 1 é confinadoa um ou ambos os ovários. A doença no estágio 2 envolve umtumor em um ou ambos os ovários com extensão pélvica. Nocâncer de ovário estágio 3, um tumor está presente em um ouambos os ovários com metástase peritoneal microscopicamenteconfirmada fora da pélvis e/ou metástase de linfonodoregional. O câncer de ovário estágio 4 é caracterizado pormetástase distante fora da cavidade peritoneal. O câncer deovário é genericamente diagnosticado em um estado avançadodá doença devido à ausência de sintomas clínicosespecíficos que indicariam a presença de tumores pequenos.

Para mulheres com menos de 5 0 anos de idade, menos de 4 0%dos cânceres de ovários são detectados quando os tumoresestão localizados em um ou ambos os ovários e quando oprognóstico da doença é melhor. Para mulheres acima daidade de 50, o número cai para menos de 15%.

Aproximadamente 68% de mulheres de todos os grupos de idadeafligidos com câncer de ovário não são diagnosticadas atéque metástase distante esteja presente. Vide genericamenteNational Câncer Institute Surveillance, Epidemiology andEnd Results (SEER) Program em www.seer.câncer.gov.

0 câncer de ovário se espalha através dedesprendimento local a partir do epitélio do ovário paradentro da cavidade peritoneal seguido por implantação noperitônio e invasão local do intestino e bexiga. A presençade envolvimento de linfonodo em câncer de ovário é evidenteem todos os estágios de câncer de ovário diagnosticado. Apercentagem de linfonodos positivos aumentasignificativamente com a progressão da doença (isto é,Estágio 1, 24%; estágio 2, 50%, estágio 3, 74%; estágio 4, 73%). Id.

A sobrevivência de pacientes com câncer de ovário éuma função do estágio no qual a doença é diagnosticada, coma sobrevivência de 5 anos diminuindo com doença avançada.

Mais de 90% de mulheres diagnosticadas com câncer de ováriono Estágio 1 sobrevivem por menos 5 anos após odiagnóstico. A taxa de sobrevivência de 5 anos cai paramenos de 3 0% quando a doença não é diagnosticada até oEstágio 4 (isto é, metástase distante). Id.

O câncer epitelial de ovário é a forma mais comum dadoença. Há quatro classes histológicas principaisreconhecidas de câncer epitelial de ovário e incluemsubtipòs|serosos, endometrióide, célula clara e com mucina.

A patogênese de câncer de ovário é pouco entendida, porém,acredita-se que se origine do epitélio de superfície deovário. Vide Bell (2005) Mod. Pathol. 18 (Suppl 2): S19-32.Fatores de vida que fornecem a maior redução em risco decâncer de ovário incluem multiparidade, uso decontraceptivos orais, e amamentação, todos os quais evitama ovulação. Como a ovulação resulta em dano epitelial,seguido por reparo e possíveis respostas inflamatórias, arepetição desse processo durante toda a vida reprodutiva damulher sem interrupção parece levar a dano de células eaumentar o risco de câncer de ovário. Vide, por exemplo,Ness e outros (1999) J. Natl. Câncer Inst. 91:1459-1467.Entretanto, não há progressão escalonada reconhecida decâncer de ovário através de lesões precursoras definidas,como aquelas reconhecidas tanto para carcinoma cervicalcomo câncer de cólon. Conseqüentemente, pesquisaconsiderável tem sido dirigida ã compreensão da baseWlecular para câncer de ovário e para entender asdiferenças básicas entre os vários subtipos histológicos decâncer de ovário. Esses estudos utilizaram análise deexpressão de gene para fornecer essa compreensão eidentificaram uma série de biomarcadores em potencial paraavaliação em aplicações diagnosticas. Vide, por exemplo,Ono e outros (2000) Gancer Res. 60:5007-11; Welsh e outros(2001) proc. Natl. Acad. Sci USA 98:1176-1181; Donninger eoutros (2004) Oncogene 23:8065-8077; e Lee e outros (2004)

Int. J. Oncol. 24 (4) :847 - 851.

O Câncer de ovário é freqüentemente detectado com aapresentação de sintomas clínicos evidentes, maisnotadamente a apresentação de dor abdominal, uma massaanexa, distensão abdominal e urgência urinária. Como tal, adetecção de câncer de ovário é freqüentemente detectada emum estágio avançado, quando o prognóstico e resultadoclínico são ruim. A detecção de câncer de ovário em umestágio inicial (isto é, Estágio 1) resulta em uma taxa decura de aproximadamente 90% utilizando cirurgia padrão equimioterapia; conseqüentemente há necessidade clínica dedetectar câncer de ovário em um estágio inicial onde otratamento será mais eficaz. Infelizmente, métodos detriagem atuais para detectar câncer de ovário no estágioinicial são insuficientes. A prática atual para triagem decâncer de ovário emprega o uso de CA125 e ultra-somtransvaginal (sonografia). Níveis de soro em elevação deCAl 25 são associados a câncer de ovário e utilizaçãosubseqüente de ultra-som transvaginal ajuda a detectar apresença de câncer de ovário. A confirmação de doença deovário se baseia em procedimentos invasivos comolaparotomia. Entretanto, o uso de CAl25 é ineficaz paratriagem de população geral devido a questões desensibilidade limitada, especificidade limitada, e um valorpredizível positivo ruim de <3%. Bast (2003) J. Clin.Oncol. 21 (10 Suppl):200-205. Como resultado, não háconsenso sobre as recomendações para triagem genericamenteem relação a câncer de ovário na população de pacientesassintomáticos. Vide o website do National Câncer Instituteem www.cancer.gov. Para pacientes de alto risco, osprocedimentos genericamente aceitos para a detecção decâncer de ovário incluem o uso de exames pélvicos, o uso deteste de soro CA125, e ultra-som transvaginal (sonografia).Partridge e outros (1999) CA-A Câncer Journal forClinicians 49:297-320.

CAl25 é um marcador de tumor bem caracterizadonormalmente expresso na superfície de células epiteliais eé freqüentemente detectado no soro de pacientes normais em35 U/ml. Níveis elevados de soro de CA125 (>35U/mL) sãofreqüentemente detectados em aproximadamente 83% depacientes com câncer do ovário; os 15% restantes depacientes com câncer de ovário têm níveis de soro normaisde CAS12 5. Além disso, CA125 é elevado somente em 50% depacientes com câncer de ovário estágio 1, desse modolimitando sua utilidade clínica na detecção prematura decâncer de ovário. Entretanto, níveis elevados de soro deCA125 são utilizados para a monitoração de recorrência dedoença após intervenção terapêutica e isso representa o usoatualmente aprovado para CA125 pela FDA. Além disso, níveiselevados de soro de CA125 são predizíveis de câncer deovário detectável no futuro.

As taxas baixas de prevalência de câncer de ovário napopulação em geral criam desafios significativos para odesenvolvimento de um teste de triagem que promoveriadetecção prematura da doença. Métodos de triagem paradoenças com baixas taxas de prevalência como câncer deovário resultam freqüentemente em uma razão elevada depositivos falsos para positivos verdadeiros que limita autilidade clínica de tais programas de triagem. Dados osriscos significativos associados à exploração cirúrgicapara possível câncer de ovário, um teste de triagemclinicamente útil deve encaminhar para cirurgia não mais doque 10 mulheres para toda mulher que tenha efetivamentecâncer de ovário (isto é, um valor predizível positivo(PPV) de pelo menos 10%) . Skates e outros (2004) J. Clin.Oncol. 22:4059-4066. PPV é altamente dependente das taxasde prevalência para uma doença ou condição específica emudará dramaticamente como resultado de diferenças emprevalência de doença. Portanto, com doenças com baixaprevalência, como câncer de ovário, os testes dediagnóstico de triagem com um PPV relativamente baixo têmainda utilidade clínica significativa. Programas de triagemde câncer de ovário em potencial devem ser ajustados para abaixa prevalência de câncer de ovário e avaliados paradesempenho de biomarcador e necessidade clínica. Vide, porexemplo, Skates e outros (2004) J. Clin. Oncol. 22:4059-4066; Bast e outros (2005) Int. J. Gynecol. Câncer 15:274-281; e Rosen e outros (2005) Gyn. Oncol. 99:267-277. Apesardos esforços para identificar um biomarcador ou painel debiomarcadores para a detecção, detecção particularmenteprematura, de câncer de ovário, não existe atualmentenenhum "teste de diagnóstico ou triagem adequado quesatisfaça as necessidades clínicas. Métodos atualmentedisponíveis, como detecção de CA125, apresentam taxas depositivos falsos, inaceitavelmente elevadas.

As recomendações atuais a partir do National CâncerInstitute declaram que "há evidência insuficiente paraestabelecer que triagem para câncer de ovário commarcadores de soro como CA12 5, ultra-som transvaginal ouexames pélvicos resultaria em uma diminuição em mortalidadea partir do câncer de ovário" (NCI Summary of Evidence(Levei 4, 5); datado de fevereiro de 2005). À luz do riscosério de positivos falsos com as técnicas de triagematualmente disponíveis, o NCI não apoiou a instituição deprocedimentos de triagem em geral para câncer de ovário.

Como tal, não existe nenhum teste de triagem padronizadopara câncer de ovário, apesar do fato de que o diagnósticoprematuro melhore significativamente as taxas desobrevivência de 5 anos.

Portanto, existe uma necessidade significativa natécnica por métodos e composições seguras que sejam capazesde identificar especificamente mulheres que têm câncer deovário. Em particular, são necessários métodos de triagempara identificar pacientes com probabilidade aumentar deter câncer de ovário. As mulheres identificadas como tendoprobabilidade aumentada de ter câncer de ovário poderiamser selecionadas para métodos de diagnóstico, maisagressivos, para determinar de forma definitiva se têmatualmente a doença. Além disso, tais métodos de triagempoderiam ser realizados na população de pacientes do sexofeminino em geral em uma base de rotina para facilitar adetecção de câncer de ovário nos estágios Iniciais dadoença quando prognóstico e resultado de doença são melhores.

Sumário da invenção

São fornecidos métodos de triagem para identificarpacientes còm probabilidade aumentada de terem câncer deovário. Os métodos da invenção compreendem genericamentedetectar em uma amostra de corpo de paciente a expressão deuma pluralidade de biomarcadores que são seletivamentesuperexpressos em câncer de ovário. Superexpressão dosbiomarcadores é indicativo de uma probabilidade aumentada,de que a paciente tenha câncer de ovário. Os métodos dainvenção podem compreender, por exemplo, uma análise em"duas etapas", onde uma primeira etapa de ensaio éexecutada para detectar a expressão de um primeirobiomarcador ou painel de biomarcadores. Se o primeirobiomarcador ou painel de biomarcadores for superexpresso,uma segunda etapa de ensaio é executada pârâ detectar aexpressão de um segundo biomarcador ou painel debiomarcadores. A superexpressão do primeiro e segundobiomarcador, ou painéis de biomarcadores, é indicativo deuma maior probabilidade de que a paciente tenha câncer deovário. A primeira etapa de ensaio pode ser projetada paraenriquecer a população de pacientes em exame por eliminaruma grande percentagem de mulheres que são "negativosverdadeiros". A segunda etapa de ensaio é destinadatipicamente a eliminar aquelas pacientes na populaçãoenriquecida que não apresentem câncer de ovário poreliminar pacientes negativos verdadeiros adicionais apartir da população enriquecida. Essas etapas de ensaiopodem ser executadas como um teste único que abrange asduas etapas de ensaio ou como dois testes distintos, em quecada teste compreende uma das etapas de ensaio. Um únicobiomarcador ou painel de biomarcadores pode ser utilizadoem cada etapa de análise para obter os valores desejadospara sensibilidade, especificidade, valor predizivelnegativo (NPV), e valor predizivel positivo (PPV).Algoritmos podem ser desenvolvidos para combinarbiomarcadores específicos nas etapas de ensaio diferentespara obter a sensibilidade, especificidade, NPV ou PPVdesej ados.

Em outros aspectos da invenção, um método de triagempara identificar pacientes com probabilidade aumentar deterem câncer de ovário compreende executar um ensaio de"etapa única" ou "uma etapa" no qual a superexpressão deuma pluralidade de biomarcadores que são seletivamentesuperexpressos em câncer de ovário é determinada em umaamostra de corpo de paciente. A superexpressão dessesbiomarcadores é indicativa de uma probabilidade aumentadada paciente ter câncer de ovário. Ao contrário do método detriagem de duas etapas descrito acima, o ensaio de triagemde etapa única não requer a execução de uma primeira etapade ensaio para detectar superexpressão de umbiomarcador(es) específico seguida por uma segunda etapa deensaio para determinar se um segundo biomarcador(es) tambémé superexpresso para identificar uma paciente comprobabilidade aumentada de ter câncer de ovário.

Uma paciente que é identificada pelos métodos detriagem da invenção como tendo probabilidade aumentada deter câncer de ovário pode ser submetida a testes dediagnóstico adicionais para determinar definitivamente se apaciente tem câncer de ovário. As pacientes que sãoclassificadas como tendo probabilidade aumentada de tercâncer de ovário de acordo com os métodos revelados aqui,porém que são determinadas como não tendo atualmente adoença, são genericamente monitoradas em uma base regularpara o desenvolvimento de câncer de ovário. Além disso, ospresentes métodos podem ser utilizados para fazer triagemda população de pacientes do sexo feminino em geral emrelação a câncer de ovário em uma base de rotina. Dessemodo, os métodos de triagem da invenção podem permitir odiagnóstico de câncer de ovário em estágios iniciais dadoença quando o prognóstico é significativamente melhor.Kits para pôr em prática os métodos de triagem da invençãotambém são fornecidos.

A expressão de biomarcador pode ser determinada nonível ' de proteína ou ácido nucléico. Em algumasmodalidades, a expressão de biomarcador é detectada nonível de proteína utilizando anticorpos específicos debiomarcador. A expressão dos biomarcadores da invençãotambém pode ser detectada pelas técnicas baseadas em ácidonucléico, incluindo, por exemplo, hibridização e RT-PCR. Aexpressão de biomarcador pode ser determinada em umavariedade de amostras de corpo, incluindo, porém, nãolimitadas a: sangue (por exemplo, sangue integral; soro desangue; sangue tendo plaquetas removidas, etc.); linfa;fluidos aseiticos; urina; fluidos ginecológicos (porexemplo; secreção de ovário; falópio; e uterina;menstruação, etc.); biópsias; e fluidos obtidos durantelaparoscopia.

Os métodos para diagnóstico de câncer de ovário emuma paciente também são abrangidos pela presente invenção.

Os métodos de diagnóstico compreendem, genericamente,detectar em uma amostra de corpo a expressão de umapluralidade de biomarcadores que são seletivamentesupèrexpressos em câncer de ovário. A superexpressão dapluralidade de biomarcadores é indicativa da presença decâncer de ovário. Kits para pôr em prática os métodos dediagnóstico da invenção são também fornecidos.

Os métodos para determinar a eficácia de uma terapiaespecifica para câncer de ovário em uma paciente são tambémrevelados aqui. A invenção é adicionalmente dirigida a ummétodo para monitorar a regressão ou progressão de câncerde ovário em uma paciente.

Breve descrição dos desenhos

A figura 1 provê uma representação esquemática de umteste de triagem de "duas etapas" exemplar para identificarpacientes com probabilidade aumentada de terem câncer deovário. Os 8 milhões de pacientes mulheres classificadasnesse exemplo representam ã população de pacientes dos EUA,assintomáticas, de alto risco, como definido abaixo. Naprimeira etapa de ensaio, um número significativo denegativos verdadeiros é eliminado a partir de testeadicional, desse modo deixando uma população enriquecidapara análise adicional na segunda etapa de ensaio. Asegunda etapa de ensaio elimina adicionalmente pacientesadicionais que são negativos verdadeiros para identificaraquelas mulheres com o risco mais elevado de terem câncerde ovário. Detalhes adicionais em relação ao método detriagem de duas etapas são fornecidos no texto.

A figura 2 provê os gráficos de Característicaoperacional de Receptor (ROC) para HE4 obtido com amostrasa partir de pacientes acima da idade de 55 (A) e com todasas amostras de pacientes. Detalhes experimentais adicionaissão fornecidos no Exemplo 2.

A figura 3 provê os gráficos ROC para inibina A (INH)obtida com amostras a partir de pacientes acima de 55 (A) ecom todas as amostras de pacientes. Detalhes experimentaisadicionais são fornecidos no Exemplo 2.

A figura 4 provê o gráfico de ROV para prolactinaobtido com todas as amostras de pacientes. Detalhesexperimentais adicionais são fornecidos no Exemplo 2.

A figura 5 provê o gráfico ROC para PLAU-R obtido comtodas as amostras de pacientes. Detalhes experimentaisadicionais são fornecidos no Exemplo 2.

A figura 6 provê os gráficos ROC para glicodelina(GLY) obtido com amostras a partir de pacientes acima daidade de 55 (A) e com todas as amostras de pacientes.

Detalhes experimentais adicionais são fornecidos no Exemplo2 .

A figura 7 provê o gráfico ROC para SLPI obtido comtodas as amostras de pacientes. Detalhes experimentaisadicionais são fornecidos no Exemplo 2.

A figura 8 provê o gráfico ROC para CTHRCl obtido comtodas as amostras de pacientes. Detalhes experimentaisadicionais são fornecidos no Exemplo 2.

A figura 9 provê o gráfico ROC para PAI-I obtido comtodas as amostras de pacientes. Detalhes experimentaisadicionais são fornecidos no Exemplo 2.

A figura 10 provê o gráfico ROC para KLK-IO obtidocom todas as amostras de pacientes. Detalhes experimentaisadicionais são fornecidos no Exemplo 2.

A figura 11 provê os gráficos ROC para CA125 obtidocom amostras a partir de pacientes acima da idade de 55 (A)e com todas as amostras de pacientes. Detalhesexperimentais adicionais são fornecidos no Exemplo 2.

A figura 12 provê o gráfico ROC para KLK-6 obtido comtodas as amostras de pacientes. Detalhes experimentaisadicionais são fornecidos no Exemplo 2.

A figura 13 provê o gráfico ROC para Muc-I (MU)obtido com todas as amostras de pacientes. Detalhesexperimentais adicionais são fornecidos no Exemplo 2.

A figura 14 provê o gráfico ROC para MMP-7 (MM)obtido com todas as amostras de pacientes. Detalhesexperimentais adicionais são fornecidos no Exemplo 2.

Descrição detalhada da invenção

A presente invenção provê métodos de triagem ecomposições para identificar pacientes com câncer deovário. Os métodos de triagem compreendem, genericamente,detectar a expressão de uma pluralidade de biomarcadores emuma amostra de corpo, particularmente uma amostra desangue, mais particularmente uma amostra de soro, a partirda paciente. A superexpressão dos biomarcadores utilizadosna prática da invenção é indicativa de uma probabilidadeaumentada da presença de câncer de ovário. Em métodos detriagegi específicos da invenção, uma análise de duas etapasé utilizada para identificar pacientes com probabilidadeaumentada de terem câncer de ovário. A primeira etapa deensaio é executada para detectar a expressão de um primeirobiomarcador ou painel de biomarcadores em uma amostra decorpo de paciente. Se o primeiro biomarcador ou painel debiomarcadores for determinado como sendo superexpresso naamostra, uma segunda etapa de ensaio é executada paradetectar a expressão de um segundo biomarcador ou painel debiomarcadores. A superexpressão dos primeiro e segundobiomarcadores ou painel de biomarcadores é indicativo deuma probabilidade aumentada de que a paciente tem câncer deovário. Em certas modalidades, anticorpos são utilizadospara detectar expressão de proteína de biomarcador. Emoutros aspectos da invenção, quando a expressão de umpainel de biomarcadores é detectada, a superexpressão desomente um subconjunto dos biomarcadores analisado pode sersuficiente para ser indicativo de maior probabilidade de apaciente ter câncer de ovário.

Embora a invenção não seja limitada a um mecanismoespecífico, a primeira etapa de ensaio é genericamenteprojetada para enriquecer a população de pacientespositivos-verdadeiros (isto é, em uma base de percentagem)por eliminar um grande número de negativos verdadeiros apartir de teste adicional. A primeira etapa de ensaio podeempregar uma sensibilidade e valor predizível negativo(NPV) mais elevados para obter o enriquecimento desejado dapopulação de pacientes positivos-verdadeiros. A segundaetapa de ensaio é tipicamente destinada a eliminar aquelaspacientes na população enriquecida que não têm atualmentecâncer de ovário, isto é, eliminar negativos verdadeirosadicionais a partir da população enriquecida. A segundaetapa de ensaio pode empregar um valor predizível positivo(PPV) e especificidade mais elevados, enquanto mantém umasensibilidade razoável, para eliminar adicionalmentenegativos verdadeiros a partir da população enriquecida depacientes positivos verdadeiros. Uma representaçãoesquemática do teste de triagem de duas etapas e osresultados que podem ser obtidos com esse método sãofornecidos na figura 1.

Uma pessoa com conhecimentos na técnica reconheceráque essas etapas de ensaio podem ser executadas como umteste de triagem único abrangendo as duas etapas de ensaioou como dois testes distintos, onde cada teste abrange umadas etapas de ensaio. Um biomarcador único óu painel debiornarcàdores pode ser utilizado em cada etapa de ensaiopara obter os valores desejados para sensibilidade,especificidade, NPV e PPV. Algoritmos podem serdesenvolvidos para selecionar biomarcadores específicos oucombinações de biomarcadores para obter a sensibilidade,especificidade, NPV e PPV desejados para cada etapa deensaio e o teste de triagem combinado compreendendo as duasetapas de ensaio.

Além da análise de duas etapas descrita acima, ummétodo de triagem para identificar pacientes comprobabilidade aumentada de terem câncer de ováriocompreende executar um método de triagem ou ensaio de«etapa única" ou "uma etapa" no qual a expressão de umapluralidade de biomarcadores que são seletivamentesuperexpressos em câncer de ovário é determinada em umaamostra de corpo de paciente. A superexpressão de pelomenos ,,um biomarcador (es) é indicativa de uma probabilidadeaumentada da paciente ter câncer de ovário. Em aspectosespecíficos da invenção, o método de triagem de etapa únicaou uma etapa compreende detectar expressão de umapluralidade de biomarcadores, incluindo, por exemplo, HE4,CAl25, glicodelina, MMP-7, Muc-1, PAI-I, CTHRCl, inibina A,PLAU-4, prolactina, KLK-10, KLK-6, SLPI, e alfa-1antitripsina, em uma amostra de corpo, onde asuperexpressão de pelo merios um, particularmente dois, maisparticularmente três, dos biomarcadores é indicativa deprobabilidade aumentada de ter câncer de ovário. Emmodalidades específicas do método de triagem de etapa únicada invenção, expressão de glicodelina, HE4, e CA125 édeterminada e superexpressão de pelo menos um, dois ou trêsdos biomarcadores é indicativa de uma probabilidadeaumentada de ter câncer de ovário. Vide, por exemplo, aTabela 54 e Exemplo experimental 4. Uma pessoa versada natécnica reconhecerá que ao contrário do método de triagemde duas etapas descrito acima, o ensaio dê triagem de etapaúnica não requer desempenho de uma primeira etapa de ensaiopara detectar superexpressão de um biomarcador específicoou painel de biomarcadores seguido por uma segunda etapa deensaio para determinar se um segundo biomarcador ou painelde biomarcadores também é superexpresso para identificaruma paciente com probabilidade aumentada de ter câncer deovário. Como tal, uma primeira etapa de ensaio paraenriquecer a população para pacientes "positivas-verdadeiras" e uma segunda etapa de ensaio para eliminaraquelas pacientes da população enriquecida que não têmefetivamente câncer de ovário ("positivas salas") não éexigido no método de triagem de etapa única descrito aqui.

Ó nível de expressão de um biomarcador específico queé suficiente para constituir "superexpressão" variarádependendo do biomarcador específico utilizado. Emmodalidades específicas da invenção, um "nível limite" deexpressão é estabelecido para um biomarcador específico,onde níveis de expressão acima desse valor são consideradossuperexpressão. Uma variedade de métodos estatísticos ematemáticos para estabelecer o nível de limite de expressãoé conhecida na técnica. Um nível de expressão de limitepara um biomarcador específico pode ser selecionado, porexemplo, com base em dados a partir dos gráficos deCaracterística operacional de Receptor (ROC), como descritonos Exemplos 2 e 3, ou em compilações de dados a partir deamostras de pacientes normais (isto é, uma população depacientes normais) . Por exemplo, o nível de expressão delimite pode ser estabelecido no nível de expressão médiomais duas vezes o desvio padrão, com base em análise deamostras a partir de pacientes normais não afligidas comcâncer de ovário. Uma pessoa versada na técnica reconheceráque esses níveis de expressão de limite podem variar, porexemplo, movendo ao longo do gráfico ROC para umbiomarcador específico, para obter valores diferentes parasensibilidade, especificidade, valor predizível positivo(PPV),' e valor predizível negativo (NPV), desse modoafetando o desempenho geral do ensaio.

Uma paciente que é identificada como tendoprobabilidade aumentada de ter câncer de ovário, de acordocom os métodos revelados, pode ser submetida ao teste dediagnóstico adicional para determinar, definitivamente, sea paciente tem câncer de ovário. "Teste de diagnósticoadicional" inclui, porém não é limitado a exame pélvico,ultra-som transvaginal, varredura CT, MRI, laparotomia,laparoscopia e biópsia. Tais métodos de diagnóstico são bemconhecidos na técnica. Além disso, pacientes classificadascomo tendo probabilidade aumentada de terem câncer deovário que são determinadas por teste de diagnósticoadicional não têm atualmente câncer de ovário podem serestreitamente monitoradas em uma base regular para odesenvolvimento de câncer de ovário. A monitoração de taispacientes pode incluir, porém não é limitada a, examepélvico periódico, ultra-som transvaginal, varredura CT eMRI. Um médico com conhecimentos comuns na técnicareconhecerá técnicas apropriadas para monitorar pacientesem relação ao desenvolvimento de câncer de ovário. Poridentificar e monitorar pacientes com probabilidadeaumentada de ter câncer de ovário, os métodos de triagem dainvenção podem permitir a detecção de câncer de ovário emum estágio inicial da doença, particularmente Estágio 1 ouEstágio 2, quando prognóstico e resultado da doença sãomuito aperfeiçoados.

Em modalidades específicas, anticorpos são utilizadospara detectar expressão de biomarcador no nível deproteína. Em outros aspectos da invenção, a expressão debiomarcador é detectada no nível de ácido nucléico. Kitspara pôr em prática os métodos de triagem da invenção,incluindo o método de triagem de duas etapas, sãoadicionalmente fornecidos.

Por "câncer de ovário" se quer dizer aquelascondições classificadas por laparotomia pós-exploratóriacomo patologia pré-maligna, patologia maligna, e câncer(FIGO estágios 1-4). Apresentação e classificação de câncerde ovário são descritas em detalhe acima. "Câncer de ovárioem estágio inicial" se refere àqueles estados da doençaclassificados como carcinoma estágio 1 ou estágio 2. Adetecção prematura de câncer de ovário aumentasignificativamente as taxas de sobrevivência de 5 anos. 0termo "método de triagem" se refere a estratégias paraidentificar pacientes que têm probabilidade aumentada deterem câncer de ovário de modo que tais pacientes podem serselecionadas para métodos de diagnóstico, mais agressivos,para determinar definitivamente se as pacientes têm câncerde ovário. Os "métodos de triagem" ou "métodos de triagemde diagnóstico" da invenção não são genericamentedestinados a diagnosticar definitivamente uma paciente comotendo ou não câncer de ovário. Em vez disso, tais métodossão destinados a identificar mulheres tendo probabilidadeaumentada de terem câncer de ovário de modo que essasmulheres podem ser definitivamente diagnosticadasutilizando outros métodos (por exemplo, exame pélvico,ultra-som transvaginal, varredura CT, MRI, laparotomia,laparoscopia, e biópsia de amostras de tecido). Os regimestambém podem ser instituídos para monitorar pacientesidentificadas como tendo probabilidade aumentada de teremcâncer de ovário pelos presentes métodos, porém, que sãodeterminadas como não tendo atualmente a doença.

Os métodos de triagem da invenção podem serexecutados em uma base de caso a caso ou como um teste detriagem de rotina periódica para a população do sexofeminino em geral. Em algumas modalidades, os métodos detriagem para identificar pacientes com probabilidadeaumentada de terem câncer de ovário podem ser vistos comocomparáveis com esfregaços Pap para a identificação depacienteis' com probabilidade aumentada de terem câncercervicãl. Como utilizado aqui, "identificar pacientes comprobabilidade aumentada de terem câncer de ovário" sãométodos pretendidos para detectar aquelas mulheres que sãomais prováveis de terem câncer de ovário. Uma"probabilidade aumentada de ter câncer de ovário" pretendesignificar aquelas pacientes que são determinadas de acordocom os presentes métodos a apresentar superexpressão debiomarcadores específicos são mais prováveis de teremcâncer de ovário do que aquelas pacientes que nãoapresentam.

"Diagnosticar câncer de ovário" pretende incluir, porexemplo, diagnosticar ou detectar a presença de câncer deovário, monitorar a progressão da doença, e identificar oudetectar células ou amostras que são indicativas de câncerde ovário. Os termos diagnosticar, detectar e identificarcâncer de ovário são utilizados de forma intercambiávelaqui. 0 diagnóstico definitivo de câncer de ováriocompreenderá genericamente executar uma biópsia em umaamostra de tecido a partir da paciente.

Os métodos da presente invenção permitem determinaçãosuperior da probabilidade de se ter câncer de ovário quandocomparado com métodos de triagem propostos atualmenteconhecidos na técnica (por exemplo, medição de níveisCAl25)! Como utilizado aqui, "especificidade" se refere aonível no qual um método da invenção pode identificarprecisamente amostras que foram confirmadas como nãomalignas por laparotomia exploratória (isto é, negativosverdadeiros). Isto é, especificidade é a proporção denegativos da doença que são negativos em teste. Em umestudo clinico, a especificidade é calculada por dividir onúmero de negativos verdadeiros pela soma de negativosverdadeiros e positivos falsos. Por "sensibilidade" se querdizer o nível no qual um método da invenção podeidentificar precisamente amostras que foram confirmadas porlaparotomia como positivas para câncer de ovário (isto é,positivos verdadeiros). Desse modo, a sensibilidade é aproporção de positivos da doença que são positivos emteste. A sensibilidade é calculada em um estudo clínicodividindo o número de positivos verdadeiros pela soma depositivos verdadeiros e negativos falsos. A sensibilidadedos métodos revelados para a detecção de câncer de ovário épelo menos aproximadamente 70%, particularmente pelo menosaproximadamente 80%, mais particularmente pelo menosaproximadamente 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% oumais. Além disso, a especificidade dos presentes métodos épelo menos aproximadamente 70%, particularmente pelo menosaproximadamente 80%, mais particularmente pelo menosaproximadamente 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% oumais.

O termo "valor predizível positivo" ou "PPV" serefere à percentagem de pacientes com um resultado de testepositivo nos métodos da invenção que têm efetivamentecâncer- de ovário. PPV é calculado em um estudo clínicodividindo o número de positivos verdadeiros pela soma depositivos verdadeiros e positivos falsos. PPV é altamentedependente das taxas de prevalência para uma doença oucondição específica e mudará acentuadamente como resultadode diferenças em prevalência de doença. Portanto, comdoenças de baixa prevalência, como câncer de ovário, testesde triagem com PPV relativamente baixo têm ainda utilidadeclínica significativa. Ao contrário, uma doença com taxasde prevalência elevada exigiria um PPV mais elevado paraser clinicamente útil. Vide, por exemplo, Skates e outros(2004) J. Clin. Oncol. 22:4059-4066; Bast e outros (2005)Int. J. Gynecol. Câncer 15:274-281; Rosen e outros (2005)Gyn. Oncol. 99:267-277; e Pepe (2004) The Statisticalevaluation of Medicai testes for Classification andPrediction (Oxford University Press), todos os quais sãoaqui incorporados a título de referência na íntegra. 0 PPVpara os presentes métodos de identificar pacientes comprobabilidade aumentada de terem câncer de ovário égenericamente pelo menos aproximadamente 7, 8, 9, 10, 15,20, 25, 30% ou mais. Em algumas modalidades, o PPV de ummétodo da invenção é pelo menos aproximadamente 10%. Um PPVde pelo menos aproximadamente 10% para um método de triagemde diagnóstico é considerado na técnica como sendo deutilidade clínica. Vide Skates, e outros, acima. 0 "valorpredizível negativo" ou "NPV" de um teste é a percentagemde pacientes com um resultado de teste negativo que narealidade não têm câncer de ovário. NPV é calculado em umestudo clínico dividindo o número de negativos verdadeirospela soma de negativos verdadeiros e negativos falsos. 0NPV para os presentes métodos de identificar pacientes comprobabilidade aumentada de terem câncer de ovário égenericamente pelo menos aproximadamente 80%,mais

particularmente pelo menos aproximadamente 90%,particularmente pelo menos aproximadamente 90, 91, 92, 93,94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6,99,7, 99,8, 99,9% ou mais. Em algumas modalidades, o NPV deum método da invenção é pelo menos aproximadamente 99%. Umapessoa-versada na técnica reconhecerá que os valores de PPVe NPV para os métodos da invenção se baseiam em umapopulação ajustada em prevalência e refletem as taxas deprevalência de câncer de ovário na população feminina dos

EUA.

Um "biomarcador" é qualquer gene ou proteína cujonível de expressão em um tecido ou célula seja alterado emcomparação com aquele de uma célula ou tecido normal ousaudável. Biomarcadores da invenção são seletivos paracâncer de ovário. Por "seletivamente superexpresso emcâncer de ovário" se quer dizer que o biomarcador deinteresse é superexpresso em câncer de ovário porém não ésuperexpresso em condições classificadas como não malignas,benignas e outras condições que não são consideradas comosendo doença clínica. Desse modo, a detecção dosbiomarcadores da invenção permite a diferenciação deamostras indicativas de uma probabilidade aumentada de tercâncer de ovário ou a presença de câncer de ovário a partirde amostras normais (isto é, amostras a partir de pacientesque não têm câncer de ovário) e amostras que sãoindicativas de proliferação benigna e não maligna.Biomarcadores da invenção podem ser mencionados aqui deforma intercambiável como "biomarcadores de câncer deovário," "marcadores" ou "marcadores de câncer de ovário."

Os biomarcadores da invenção incluem genes eproteínas. Tais biomarcadores incluem DNA que compreende aseqüência total ou parcial da seqüência de ácido nucléicocodificando o biomarcador, ou o complemento de talseqüência. Os ácidos nucléicos de biomarcador tambémincluem RNA que compreende a seqüência inteira ou parcialde qualquer uma das seqüências de ácido nucléico deinteresse. Uma proteína de biomarcador é uma proteínacodificada por ou correspondendo a um biomarcador de DNA dainvenção. Uma proteína de biomarcador compreende aseqüência de aminoácido total ou parcial de qualquer umadas proteínas ou polipeptídeos de biomarcador. Fragmentos evariantes de genes e proteínas de biomarcador também sãoabrangidos pela presente invenção. Por «fragmento» se querdizer uma porção do polinucleotídeo ou uma porção daseqüência de aminoácido e conseqüentemente proteínacodificada desse modo. Polinucleotídeos que são fragmentosde uma seqüência de nucleotídeo de biomarcador compreendemgenericamente pelo menos 10, 15, 20, 50, 75, 100, 150, 200,250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900,1,000, 1,100, 1,200, 1,300 ou 1,400 nucleotídeos contínuos,ou até o número de nucleotídeos presentes em umpolinucleotídeo de biomarcador de comprimento totalrevelado aqui. Um fragmento ou um polinucleotídeo debiomarcador codificará genericamente pelo menos 15, 25, 30,50, 100, 150, 200 ou 250 aminoácidos contínuos, ou até onúmero total de aminoácidos presentes em uma proteína debiomarcador de comprimento total da invenção. "Variante"pretende significar seqüências substancialmente similares.Genericamente, variantes de um biomarcador específico dainvenção terão pelo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%,55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de seqüênciacom aquele biomarcador como determinado por programas dealinhamento de seqüência.

Os biomarcadores da invenção incluem qualquer gene ouproteína que é seletivamente superexpresso em câncer deovário., como definido acima, e podem compreenderbiomarcadores conhecidos bem como aqueles atualmentedesconhecidos na técnica. Em modalidades específicasbiomarcadores são proteínas secretadas ou proteínas que sãopreditas como codificando proteínas membranosas comsegmentos de transmembrana e domínios extracelulares.Biomarcadores de interesse incluem HE4, CA125, glicodelina,MMP-7, Muc-1, PAI-1, CTHRC1, inibina A, PLAU-4, prolactina,KLK-10, KLK-6, e SLPI, alfa-1 antitripsina (AAT), Imp-2,FLJ10546, FLJ2 34 99, MGC13057, SP0N1, S100A1, SLC39A4,TACSTD2, MBG2, HETKL27 (MAL2), Cox-1, proteína cinase C-iota, caderina-6, ADPRT, matriptase, receptor de folato,claudina 4, mesotelina, aquáporina 5, cofilina 1,gelsolina, clusterina, alfa tetranectina, vitronectina,proteína de plasma associada à gravidez-A (PAPP-A), efolistatina. Biomarcadores de interesse específico incluem,porém não são limitados a HE4, CA125, glicodelina, MMP-7,Muc-1, PAI-1, CTHRCl, inibina A, PLAU-4, prolactina, KLK-10, KLK-6, SLPI, e alfa-1 antitripsina (AAT). Biomarcadoresde maior interesse específico incluem HE4, glicodelina,MMP-7, SLPI, PLAU-R, Muc-1, inibina A e PAI-I.

HE4 é uma proteína que foi primeiramente observada emtecido epidídimo humano, e o nome "HE4" é uma abreviaturade «Proteína Epidídima humana 4". Estudos subseqüentesmostraram que a proteína HE4 também está presente no tratoreprodutivo feminino e outros tecidos epiteliais. 0 geneHE4 reside em cromossomo humano 20ql2-13,l, verificou-seque a região de cromossomo 2 0ql2 é freqüentementeamplificada em carcinomas de ovário. Os estudos mostraramque HE4 é expresso por células de carcinoma de ovário. Aproteína é N-glicosilada e é secretada extracelularmente.Vide, por exemplo, Drapin e outros (2005) Câncer Research65(6): 2162-9; Hellstrom e outros (2003) Câncer Research63; 3695-3700; e Bingle e outros (2002) Oncogene 21: 2768-2773.

CA-125 é uma glicoproteína de superfície de célulacom elevado peso molecular detectada no soro de uma grandeproporção de pacientes com câncer epitelial de ovário(OEC). Entretanto, embora a percentagem seja elevada (75-90%) em estágios avançados dessa doença, é somente elevadoem 50% dos pacientes com a doença no Estágio 1.0 uso de CA-125 como marcador para OEC é problemático porque a moléculatambém é expressa em um número de condições normais epatológicas incluindo menstruação, gravidez, endometriose,doenças inflamatórias e outros tipos de câncer. Asensibilidade e especificidade aperfeiçoadas para OEC foramreportadas entre mulheres pós-menopausa. Vide, porexemplo,Bast e outros (1998) Infl J- Biological Markers,13:170-187; e Moss e outros (2005) J. Clin. Pathol. 58:308-312.

Glicodelina é um membro da superfamília de lipocalinacom várias ações distintas em reconhecimento ediferenciação de células principalmente no eixoreprodutivo. Anteriormente, essa glicoproteína foidenominada proteína endometrial associada à progesterona(PAEP) e proteína placentária 14 (PP-14). A mudança de nomefoi em parte iniciada porque glicodelina não é sintetizadapelo endométrio ou placenta. Glicodelina foi purificada apartir de fluido amniótico como molécula 28kDa em géis SDSe reportada como sendo sintetizada pelo ovário normal e portumores malignos de ovário. Sua presença foi reportada emsoro. Vide, genericamente, Seppala e outros (2002)Endocrine Reviews 23:401-430; Pala e outros (1997) J.Chromatography B 704:25-34; Meerit Kamarainen e outros(1996) Amer. J. Pathology 148: 1435-1443.

As proteínas da família de metaloproteinase de matriz(MMP) estão envolvidas na ruptura de matriz extracelular emprocessos fisiológicos normais, como desenvolvimentoembriônico, reprodução, e remodelagem de tecido, bem comoem processos de doença, como artrite e metástase. A maioriadas MMPs é secretada como proproteínas inativas que sãoativadas quando clivadas por proteinases extracelulares. Aenzima codificada pelo gene MMP-7 (matrilisina) degradaproteoglicanos, fibronectina, elastina e caseína e difereda maioria dos membros da família de MMP em que não tem umdomínio de proteína terminal-C conservado. A enzima estáenvolvida em cicatrização de ferimento, e estudos emcamundongos sugerem que regula a atividade de defensinas emmucosa intestinal. 0 gene MMP-7 faz parte de um cluster degenes de MMP que se localizam no cromossomo llq22,3. MMP-7é expresso em células epiteliais de tecido normal e doente.É conhecido como sendo expresso em tumores da mama, cólon epróstata, entre outros. É abundante em células de carcinomade ovário, porém não detectável por IHC em tecido epitelialde ovário normal.

Muc-I (mucinl, EMA, PEM, epsialin) é umaglicoproteína de mucina de superfície de célula grandeexpressa pela maioria das células epiteliais glandular e deduto e algumas linhagens de células hematopoiéticas.Funcionalmente, acredita-se que Muc-I esteja envolvido comproteção e lubrificação de células, e possa desempenhar umpapel em aderência de células, e/ou sinalização de células.O gene Muc-I contém sete éxons e produz diversas variantesalternativamente fixadas, diferentes. A principal formaexpressão de Muc-I utiliza todos os sete éxons e é umaproteína de transmembrana do tipo 1 com um grande domíniode repetição tandem extracelular. O domínio de repetiçãotandem é altamente O-glicosilado e alterações emglicosilação foram mostradas em células epiteliais decâncer. Verificou-se que muc-1 é elevado em muitos tipos decâncer, mais notadamente com câncer avançado de mama. Serindependente como um marcador baseado em soro, teria poucaespecificidade, porém poderia ser utilizado como meioauxiliar de prognóstico, em combinação com outros

marcadores mais específicos.

PAI-I (isto é inibidor ativador de plasminogênio tipo1) é um inibidor de proteinase de serina ou cisteína. OmRNA de PAI-I tem 2 876 bp de comprimento, e a proteínacodificada tem 402 aminoácidos de comprimento. O pesomolecular calculado é 42,769 Da, ao passo que a proteínapurificada por afinidade é reportada como sendoaproximadamente 50,000 Da, como determinado poreletroforèse de gel SDS. PAI-I desempenha um papel nainibição de degradação de matriz extracelular por PLAU e éum gene alvo c-Myc não regulado putativo. PAI-I tambémdesempenha um papel chave no controle de coagulação eremõdelagem de tecido. PAI-I limita a produção de plasminae serve para manter fibrinólise em verificação. Algumasfunções fisiológicas envolvendo a inibição de plasmina porPAI-I incluem ovulação, migração de células e diferenciaçãode células epiteliais. Níveis elevados de PAI-I em câncerindicam prognóstico ruim para sobrevivência de muitoscânceres humanos, incluindo cânceres de mama e pulmão.Pappot e ι outros (29 de novembro de 2005) Lung Câncer [Epubantes da impressão]; Chazaud e outros (2002) AmericanJournal of Pathology 160:237-246.

Repetição hélice tripla de colágeno contendo 1(CTHRCl) foi identificada em uma triagem para seqüênciasdiferencialmente expressas em artérias com lesão por balãoversus normais. Em estudos por Pyagay e outros, a expressãode CTHRCl não foi detectável em artérias normais.Entretanto, em lesão foi expressa de forma transiente porfibroblastos da adventícia de remõdelagem e por células demúsculo liso da neoíntima. Foi encontrada também na matrizde placas ateroscleróticas humanas em calcificação. CTHRClé uma proteína de 28 kDa secretada que é glicosilada ealtamente conservada a partir de cordados inferiores paramamíferos. Um motivo de colágeno curto com 12 repetições deGly-X-Y parece ser responsável por trimerização da proteínae isso torna a molécula suscetível à clivagem porcolidadenase. Níveis de expressão de mRNA Cthrcl sãoaumentados em resposta à transformação do fator decrescimento-beta e proteína morfogenética de osso-4.Ensaios de migração de células executados com fibroblastosde superexpressão de CTHRCl e células de músculo lisodemonstram que níveis aumentados de CTHRCl são associados àcapacidade migratória aumentada. Adicionalmente, asuperexpressão de CTHRCl causou uma redução dramática emníveis de proteína e mRNA de colágeno tipo I. Os dados deFyagay e outros indicam que CTHRCl de molécula novo éexpresso de forma transiente na parede arterial em respostaã lesão onde pode contribuir para remodelagem vascularlimitando o depósito de matriz de colágeno e a promoção demigração de células. Pyagay e outros (2005) Circ. Res.96(2): 261-8.

Inibinas são hormônios de proteína que pertencem àsuperfamília de fator de crescimento β em transformação esão heterodímeros consistindo em subunidades α e β unidaspor ligações de dissulfeto. As 2 formas de inibinas (istoé, AeB) diferem no tipo de subunidade β (isto é, βΑ ouβΒ) ligada à subunidade a. Em mulheres na idadereprodutiva, inibinas são conhecidas por serem secretadaspor células granulosa do ovário e circulam no sangue,inibinas variam em concentração através do ciclo menstruale durante gravidez, e causam impacto na produção de FSHpituitária, gametogênese e eventos gestacionais. Emmulheres pós-menopausa inibinas caem a níveis muito baixos.Publicações recentes indicam que inibinas são marcadores dediagnóstico para câncer de ovário. Vide, por exemplo,Robertson e outros (2002) Mol. Cell Endocrinol. 191:97-103;El-Shalakany e outros (2004) J. Obstet. Gynaecol. Res. 30:155-161.

Receptor de urocinase ativador de plasminogênio(PLAU-R OU UPAR) é uma glicoproteína de superfície decélula com um peso molecular de aproximadamente 6 0 kDa queé ligado por sua extremidade terminal-carbóxi à membrana decélula por ligação de GPI. PLAU-R serve como um receptorespecífico para o ativador de plasminogênio de urocinaseprotease serina (uPA) que está envolvimento em remodelagemde matriz extracelular/membrana de base em processos tantonormais quanto patológicos. PLAU-R solúvel, liberado apartir da superfície da célula foi reportado como estandoem concentrações elevadas em soro em vários tipos de câncerhumano incluindo câncer colo-retal, de mama e de ovário.Vide, por exemplo, Sier e outros, (1998), Câncer res58:1843-1849; e Begum e outros (2004) Anticancer Research24:1981-1986.

Prolactina é um hormônio de proteína de 23 kDa de 198aminoácidos secretado em quantidades significativas pelaglândula pituitária anterior. Em combinação com estrógeno,prolactina desempenha um papel importante na iniciação decrescimento de glândula mamaria e em lactação. Além disso,considera-se que prolactina tenha um papel significativo emcrescimento de células e função imune. Um relatório recenteutilizando um kit ELISA comercialmente disponível reportouque níveis de prolactina em soro foram significativamenteelevados em câncer de ovário. Vide, genericamente, Mor eoutros (2005) Proc. Natl. Acad. Sei. 1Õ2: 7677-7682.

Calicreinas constituem um subgrupo de protease deserina tendo funções fisiológicas diversas. São agrupadoscomo um grupo em cromossomo 19ql3. Evidência crescentesugere que muitas calicreínas estão envolvidas emcarcinogênese e algumas têm potencial com novosbiomarcadores de câncer e outras doenças.KLK-6 é um dos quinze membros da subfamília decalicreína localizados em um cluster no cromossomo 19. Aenzima codificada é regulada por hormônios de esteróide. Emcultura de tecido, verificou-se que a enzima gerafragmentos amiloidogênicos a partir da proteína precursorade amilóide, sugerindo um potencial para envolvimento emdoença de Alzheimer. KLK-6 foi verificada como uma proteínasecretada, e descoberta como estando elevada em pacientescom câncer de ovário. Desse modo, foi levantada a hipótesecomo tendo valor como um marcador sorológico para essadoença.

O gene de calicreína 10 humano (KLKlO, tambémconhecido como gene 1 específico de célula epitelial normal(NES-D) é um membro da família de gene de calicreína. Oproduto de gene é uma protease de serina secretada cujaconcentração em vários fluidos biológicos é conhecida comosendo alterada em alguns estados de doença. Em particular,KLKlO é expresso em células epiteliais do ovário e essaexpressão foi reportada como sendo elevada em soro depacientes com câncer de ovário. Desse modo, KLKlO podeservir como um biomarcador de soro para câncer de ovário.Vide, por exemplo, Liu-Ying e outros (2003) Câncer Res.63:807-811; Yousef e Diamandis (2.003) Thromb Haemost. 90:7-16 .

Inibidor de Protease de leucócito secretor (SLPI) éuma proteína que foi primeiramente isolada em secreções deglândula parótida humana. Estudos subseqüentes mostraramque a proteína SLPI também está presente em saliva enumerosas superfícies de mucosa como aquelas do pulmão,passagens nasais, cérvix e vesículas seminais.Acredita-se que SLPI atue como uma defesa contradoenças crônicas do pulmão porque é um inibidor potente deelastase de neutrófilo, cuja presença é aumentada emdoenças inflamatórias crônicas do pulmão e que podemdestruir muitos dos componentes do tecido do pulmão. SLPItambém inibe a liberação de histamina a partir demastócitos, de modo que também é ativo na respostaalérgica. Também se pensa que a proteção de membranasfetais e tecido cervical seja uma função de SLPI.

Verificou-se que o gene que codifica a proteína deSLPI é supra-regulada em câncer do ovário, e uma diferençasignificativa foi encontrada entre os níveis elevados deSLPI no soro de pacientes com câncer maligno do ovário aocontrário dos níveis encontrados em pacientes com cistosbenignos do ovário ou pacientes normais. A proteína de SLPItem uma massa de 12 kDa, é não glicosilado, hidrofóbico ecatiônico. Vide genericamente Hollander e outros (2003)Câncer Cell International 3:14, Helmig e outros (1995) Eur.J. Obstet. Gynecol. Reprod. Bio. 59 (1) : 95-101; Hough eoutros (2001) Câncer Research 61: 3869-3876; e Tsukishiro eoutros (2005) Gynecologic Oncology 96: 516-519.

Alfa-I antitripsina (AAT) é uma proteína de faseaguda sintetizada pelo fígado e o inibidor de soroprincipal de enzimas proteolíticas como tripsina,quimotripsina, plasmina e trombina. Em uma reaçãoinflamatória a concentração de soro de AAT pode ser elevadaem tanto quanto 3-4 vezes. A molécula existe como um númerode variantes genéticas com um peso molecular de monômero de40-50 kDa. A concentração de soro normal média (mg/ml) foireportada como sendo 2,21 í 0,35 e 2,14 + 0,37. 0 interesseem AAT como biomarcador de câncer de ovário resultou apartir de um estudo spec. De massa/eletroforese de gel 2Dinterno que indicou que AAT era elevado no soro depacientes com câncer de ovário. Vide, por exemplo, Song eoutros (1994) J. Affect. Disorders 30:283-288; Ledue eoutros (1993) Clin. Chim.Acta. 223: 73-28.

Embora os biomarcadores acima tenham sido discutidosem detalhe, qualquer biomarcador cuja superexpressão sejaseletiva para câncer de ovário pode ser utilizado para pôrem prática a invenção, incluindo biomarcadores conhecidosna técnica e aqueles não identificados acima. Taisbiomarcadores incluem genes e proteínas que são, porexemplo, envolvidos em defeitos em controle de ciclo decélula/replicação de DNA, crescimento e proliferação decélulas, escapamento de apoptose, angiogênese oulinfogênese, ou os mecanismos de motilidade e invasão decélulas de câncer.

De interesse específico são biomarcadores que sãoseletivamente superexpressos em câncer de ovário no estágioinicial. Por "seletivamente superexpresso em câncer deovário no estágio inicial" se quer dizer que o biomarcadorde interesse é superexpresso em estados de câncer de ovárioestágio 1 ou estágio 2 porém não é superexpresso emamostras normais ou em condições classificadas como nãomalignas, benignas e outras condições que não devem serconsideradas como sendo doença clínica. Uma pessoa versadana técnica reconhecerá que biomarcadores de câncer deovário no estágio inicial incluem aqueles genes e proteínasespecíficos para câncer de ovário que são inicialmentesuperexpressos em estágio 1 ou estágio 2 e cujasuperexpressão persiste durante todos os estágios avançadosda doença, bem como biomarcadores que são somentesuperexpressos em câncer de ovário estágio 1 ou estágio 2.A detecção de expressão de biomarcadores que sãoseletivamente superexpressos em câncer de ovário no estágioinicial pode permitir a detecção e diagnóstico mais cedo decâncer de ovário e, por conseguinte, melhorar õ prognósticodo paciente.

Os métodos da invenção compreendem detectar aexpressão de uma pluralidade de biomarcadores. Comoutilizado aqui, uma "pluralidade" de biomarcadores serefere a2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais biomarcadores.Em particular, quando o método de triagem de duas etapas dainvenção é utilizado para identificar pacientes comprobabilidade aumentada de terem câncer de ovário, umapluralidade de biomarcadores pode se referir à detecção depelo menos um biòmarcador durante ã primeira etapa deensaio e pelo menos um biomarcador adicional durante asegunda etapa de ensaio. Uma pessoa versada na técnicatambém reconhecerá que um painel de biomarcadores pode serutilizado para identificar pacientes com probabilidadeaumentada de terem câncer de ovário de acordo com ospresentes métodos. Um painel de biomarcadores podecompreender qualquer número ou combinação de biomarcadoresde interesse. Em algumas modalidades, um painelcompreendendo uma pluralidade de biomarcadores selecionadosa partir do grupo que consiste em HE4, CA125, glicodelina,MMP-7, Muc-1, PAI-I, CTHRCl, inibina, PLAU-R, prolactina,KLK-10, KLK-6, e SLPI, alfa-1 antitripsina (AAT). Em outrasmodalidades, é fornecido um painel de biomarcadoresselecionado do subconjunto de biomarcadores compreendendoCA12 5, HE4, glicodelina, MMP-7, SLPI, PLAU-R, Muc-1,inibina A, e PAI-I.

Qualquer paciente mulher ou população de pacientespode ser avaliada utilizando os métodos de triagem ediagnóstico da invenção. Por exemplo, os métodos reveladosaqui podem ser executados na população de pacientesmulheres em geral, bem como na população mais estreita demulheres pós-menopausa. 0 termo "pós-menopausa" é entendidopor aqueles versados na técnica. Em modalidadesespecificas, pós-menopausa se refere genericamente a, porexemplo, mulheres acima de 55 anos de idade. Em modalidadesparticulares, os métodos de triagem são executadosrotineiramente (por exemplo, anualmente, a cada dois anos,etc.) na população feminina em geral. A triagem regular depacientes pode iniciar, por exemplo, no inicio damenstruação, na idade de 30, ou no inicio da ménopausa. Atriagem da população de pacientes de alto risco, comodefinido abaixo, será tipicamente executada em uma base derotina independente da idade da paciente. Pacientes que sãotanto assintomáticas como sintomáticas (isto é,apresentando sintomas característicos de câncer de ovário,como dor ou inchaço abdominal ou pélvico) podem seravaliados em relação a uma probabilidade aumentada de teremcâncer do ovário utilizando os métodos de triagem ediagnóstico da invenção. Mulheres que estão com baixo riscode desenvolverem câncer do ovário e aquelas que sãoconsideradas de alto risco com base em fatores de risco dehistórico familiar e clínico também pode ser avaliadasutilizando os presentes métodos. Pacientes consideradas de"alto risco" com base em tais fatores de risco histórico defamília e clínico incluem, porém não são limitadas apacientes vivendo com câncer de mama, câncer de cólon, ousíndrome de ovário/mama, mulheres com um parente deprimeiro grau com câncer de ovário (por exemplo, mãe, filhaou irmã), pacientes positivos para pelo menos um gene decâncer de mama (BRCA 1 ou 2) , e mulheres que sofrem deHNPCC (isto é, câncer colo-retal não polipose Hereditário) .

Em um aspecto da invenção, a população alvo para osmétodos de triagem e diagnóstico é o grupo de pacientesassintomáticos, classificado como alto risco com base, porexemplo, nos fatores de risco familiares e clínicos acimareferenciados. Essa população assintomática de alto riscorepresenta mais de 8 milhões de mulheres nos EstadosUnidos. É reconhecido que os métodos, composições e kits dainvenção serão de utilidade específica para pacientes tendorisco aumentado de desenvolver cânceres de ovário e paraseus médicos. Pacientes reconhecidas na técnica como tendorisco aumentado de desenvolver cânceres de ovário incluem,por exemplo, pacientes com histórico familiar de câncer deovário e pacientes de idade em avanço (por exemplo,mulheres com mais de 55 anos de idade).

Um número de condições ou características clínicasnão diretamente relacionadas a câncer de ovário podeexistir nas populações de pacientes testadas de acordo comos métodos da invenção, desse modo interferindo nosresultados dos métodos de triagem e diagnóstico reveladosaqui. Tais condições e características clínicas sãomencionadas aqui como "patologias e substânciasinterferentes" e incluem, porém não sao limitadas a,gravidez (primeiro trimestre), câncer de mama, hepatitecrônica, câncer de cólon, terapia com contraceptivo oral,doença das artérias coronárias, trombose de veia profunda,diabetes, endometriose, terapia de reposição hormonal,menstruação, mieloma múltiplo, doença policistica/cisto noovário, polimialgina, polimiosite, câncer retal, artritereumatóide, eritematoso de lúpus sistêmico (SLE) etratamento com warfarin. Patologias interferentesexemplares, adicionais incluem condições uterinas (porexemplo, miomas, adenomiose e câncer endometrial) ,condições dos ovários (por exemplo, crescimentos benignoscomo cistos funcionais, cistos teca-luteína, luteoma degravidez, ovários esclerocisticos, cistadenoma seroso,cistadenoma que contém mucina, teratoma cística, fibroma,tecomá? e tumor de Brenner; neoplasmas; e condições malignascomo cistadenocarcinoma e adenocarcinoma) , condições detuba de Falópio (por exemplo, abscesso tubo-ovariano,hidrosaplinx, cisto parovariano, gravidez ectópica e câncerdas tubas de Falópio), condições do intestino (por exemplo,distensão com gás e/ou fezes, diverticulite, ileite,apendicite e câncer de cólon) e outros condições diversas(por exemplo, bexiga distendida, rim pélvico, cisto uracal,hematoma de parede abdominal, abscesso de parede abdominale neoplasmas retroperitoneais, como Iinfoma, sarcoma eteratoma. Em modalidades específicas, os biomarcadores,níveis de expressão limite, e modelos matemáticosutilizados nos métodos de diagnóstico e triagem descritosaqui, serão selecionados de modo a minimizar os efeitos desubstâncias e patologias interferentes sobre o desempenho(isto é, a especificidade, sensibilidade, PPV e NPV) dosmétodos reivindicados.

Por "amostra do corpo" se quer dizer qualqueramostragem de células, tecidos ou fluidos corpóreos apartir de uma paciente na qual a expressão de umbiomarcador possa ser detectada. Os exemplos de taisamostras do corpo incluem, porém não são limitadas aosangue (por exemplo, sangue integral, soro de sangue,sangue tendo plaquetas removidas, etc.), linfa, fluidosasciticos, urina, fluidos ginecológicos (por exemplo,secreção de ovário, falópio, e uterina, menstruação, etc.),biópsias, e fluidos obtidos durante laparoscopia. Asamostras do corpo podem ser obtidas a partir de um pacientepor uma variedade de técnicas incluindo, por exemplo, porvenopuntura, por raspagem ou aplicação em uma área, ou pelouso de uma agulha para aspirar fluidos corpóreos outecidos. Os métodos para coletar várias amostras de corposão bem conhecidos na técnica. Em modalidades específicas,a amostra do corpo compreende sangue ou soro. Os presentesinventores reconheceram que os métodos para a coleta earmazenagem de amostras de sangue, mais particularmenteamostras de soro, afetam o desempenho dos métodos reveladosaqui. Vários estudos indicam que a amostra do corpo,particularmente amostra de soro, métodos de coleta earmazenagem são críticos para obter desempenho aceitável deensaio. Vide, por exemplo, Diamandis (2004) J. Natl. CâncerInstitute 95:353-356 e Thavasu e outros (1992) J. Immunol.Meth. 153: 115-124, que é aqui incorporado a título dereferência na íntegra. Um método exemplar para coleta earmazenagem de soro é fornecido no Exemplo 1.

Quaisquer métodos disponíveis na técnica para adetecção de expressão de biomarcador podem ser utilizadosna prática da invenção. A expressão de um biomarcador dainvenção pode ser detectada em um nível de ácido nucléicoou um nível de proteína. Para determinar superexpressão, aamostra do corpo a ser examinada pode ser comparada com umaamostra de corpo correspondente que se origina de umapessoa saudável. Isto é, o nível "normal" de expressão é onível de expressão do biomarcador em uma amostra de corpo apartir de uma paciente que não é afligida com câncer deovário. Tal amostra pode estar presente em formapadronizada. Em algumas modalidades, a determinação dasuperexpressão de biomarcador não requer comparação entre aamostra do corpo e uma amostra do corpo correspondente quesé origina de uma pessoa normal.

Qualquer biomarcador ou combinação de biomarcadoresdã invenção, bem como quaisquer biomarcadores de câncer deovário conhecidos, podem ser utilizados nos métodos,composições e kits da presente invenção. Em geral, épreferível utilizar biomarcadores para os quais a diferençaentre o nível de expressão do biomarcador em uma amostra docorpo a partir de uma paciente afligida com câncer deovário e o nível de expressão do mesmo biomarcador em umaamostra de sangue "normal" (isto é, a partir de umapaciente livre de câncer no ovário) é tão grande quantopossível. Embora essa diferença possa ser tão pequenaquanto o limite de detecção do método para determinar aexpressão do biomarcador, prefere-se que a diferença sejapelo menos maior do que o erro padrão do método deavaliação, e de forma ótima uma diferença de pelo menos 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 vezes ou maior do que onível de expressão do mesmo biomarcador em uma amostra decorpo normal. O nível de expressão "normal" de umbiomarcador da invenção pode ser determinado por avaliarexpressão do biomarcador em uma amostra do corpo obtida apartir de uma paciente não afligida com câncer de ovário.Alternativamente, e particularmente à medida queinformações adicionais se tornam disponíveis, comoresultado do desempenho de rotina dos métodos descritosaqui, valores médios para níveis de expressão debiomarcador podem ser utilizados.

Como descrito acima, em alguns aspectos da invenção,um nível limite de expressão de um biomarcador específico,acima do qual o biomarcador é considerado como sendosuperexpresso em uma amostra de paciente, pode serestabelecido. Os métodos para selecionar o valor limiteincluem, porém nao são limitados ã análise do gráfico ROCpara o biomarcador ou análise do nível de expressão debiomarcador para uma população de pacientes normais. Osvalores de "corte" ou limite exemplares incluem (1) o nívelde expressão média mais duas vezes o desvio padrão, comodeterminado a partir de uma população de amostras depacientes normais e (2) níveis de expressão selecionados apartir da curva ROC que representam o valor mais elevado desensibilidade mais especificidade. 0 nível de expressãolimite para um biomarcador específico pode ser determinadoem relação ao nível de expressão em uma população depacientes normais. Pessoas versadas na técnica reconhecerãoque outros métodos para selecionar valores de expressãolimite apropriados podem ser utilizados para pôr em práticaa invenção.Os métodos para detectar biomarcadores da invençãocompreendem quaisquer métodos que determinam a quantidadeou a presença dos biomarcadores no nível de ácido nucléicoou de proteína. Tais métodos são bem conhecidos na técnicae incluem, porém não são limitados a western blots,northern blots, southern blots, ELISA, imunoprecipitação,imunofluorescência, citometria de fluxo, imunocitoquímica,imunoensaios baseados em conta multiplex, técnicas dehibridização de ácido nucléico, métodos de transcriçãoinversa de ácido nucléico e métodos de amplificação deácido nucléico. Em modalidades específicas, asuperexpressão de um biomarcador é detectada em um nível deproteína utilizando, por exemplo, anticorpos que sãodirigidos contra proteínas de biomarcador específicas.

Esses anticorpos podem ser utilizados em vários métodoscomo Western blot, ELISA, imunoensaio baseado em contamultiplex, imunoprecipitação, ou técnicas deimunocitoquímica. Os ensaios baseados em conta multiplexutilizados para pôr em prática a presente invenção incluem,porém não são limitados a, tecnologia Luminex descrita naspatentes US números 6,599,331, 6,592,822 e 6,268,222, todasas quais são incorporadas aqui a título de referência naíntegra. Em modalidades específicas, o sistema LabMAP®Luminex é utilizado, como descrito na publicaçãointernacional número WO 2005/016126, que é incorporada aquia título de referência na íntegra.

Em algumas modalidades da invenção, anticorposespecíficos para proteínas de biomarcador são utilizadospara detectar a expressão de uma pluralidade de proteínasde biomarcador em uma amostra de corpo para identificarpacientes com probabilidade aumentada de terem câncer deovário. 0 método compreende obter uma amostra de corpo apartir de uma paciente, particularmente uma amostra desoro, contatar a amostra de corpo com anticorpos dirigidosa uma pluralidade de biomarcadores que são seletivamentesuperexpressos em câncer de ovário, e detectar ligação deanticorpo para determinar se os biomarcadores sãosuperexpressos na amostra da paciente. Nos métodos detriagem da invenção, superexpressão dos biomarcadores éindicativo de uma probabilidade aumentada de ter câncer deovário. Pacientes classificadas pelos presentes métodos detriagem como tendo probabilidade aumentada de terem câncerde ovário são submetidas a teste de diagnóstico adicionalpara detectar a presença de câncer de ovário. Pacientes dosexo feminino, identificadas pelos presentes métodos detriagem para câncer de ovário quê são determinadas como nãosofrendo atualmente de câncer de ovário são regularmentemonitoradas para detectar potencialmente câncer de ovárioem um estágio mais cedo.

Como descrito acima, em aspectos . específicos dainvenção, os métodos de triagem para identificar pacientescom probabilidade aumentada de terem câncer de ovário podemcompreender uma análise de duas etapas. Isto é, o métodocompreende executar uma primeira etapa de ensaiocompreendendo detectar a expressão de um primeirobiomarcador ou um primeiro painel de biomarcadores em umaamostra de corpo e determinar se o primeiro biomarcador oupainel de biomarcadores é supèrexpresso. Se um resultadopositivo for obtido na primeira etapa de ensaio (isto é, oprimeiro biomarcador ou painel de biomarcadores ésuperexpresso na amostra do corpo) o método compreendeainda executar uma segunda etapa de ensaio compreendendodetectar a expressão de um segundo biomarcador ou umsegundo painel de biomarcadores e determinar se o segundobiomarcador ou painel de biomarcadores é superexpresso. Asuperexpressão tanto do primeiro quanto segundo biomarcadorou painéis de biomarcadores (isto é, um resultado positivonas duas etapas de ensaio) é indicativa de umaprobabilidade aumentada de ter câncer de ovário. Emmodalidades específicas, a detecção de expressão dosbiomarcadores nas primeira e segunda etapas de ensaio, éexecutada no nível de proteína e compreende contatar aamostra do corpo, mais particularmente uma amostra de soro,com anticorpos específicos para os biomarcadoresespecíficos de interesse e detectar ligação de anticorpo.Em certos métodos, a expressão de proteína de biomarcador édetectada utilizando uma ELISA ou formato de imunoensaiobaseado em conta multiplex.

Nos?métodos de triagem de "duas etapas" da invenção,o biomarcador ou painel de biomarcadores utilizado naprimeira etapa pode ser empregado para maximizarsensibilidade e NPV. Isto é, a primeira etapa da triagempode ser projetada para maximizar o número de negativosverdadeiros classificados como negativos pelos métodos dainvenção, desse modo eliminando uma percentagemsignificativa de negativos verdadeiros a partir da análiseadicional. Portanto, a população de pacientes classificadacomo positiva pela primeira etapa de ensaio seráenriquecida em pacientes positivos verdadeiros. A segundaetapa de triagem nos métodos de duas etapas pode serprojetada para maximizar PPV e especificidade, enquantomantém uma sensibilidade razoável, para identificarmulheres com probabilidade mais elevada de terem câncer deovário. Especificidade, sensibilidade, valores de PPV e NPVpodem ser determinados para cada etapa individual de ensaiono método, como descrito acima. Quando um método de triagemde duas etapas é utilizado, sensibilidade, especificidade,valores de PPV e NPV combinados podem ser determinados parao método como um todo. Em modalidades especificas, o métodode duas etapas para identificar pacientes com probabilidadeaumentada de terem câncer de ovário terá uma sensibilidadecombinada de pelo menos 90%, uma especificidade combinadade pelo menos 98%, um PPV combinado de pelo menos 10%, e umNPV combinado de pelo menos 99,9%. Uma pessoa versada natécnica reconhecerá ainda que embora os métodos de triagemde duas etapas tenham sido descritos em detalhe, métodos detriagem similares compreendendo 3, 4, 5 ou mais etapas deensaio também são abrangidos pela presente invenção. Taisetapas de ensaio seguintes podem descartar outras doenças,como condições cardiovasculares, da presença de câncer deováirio.

Em algumas modalidades da invenção, algoritmos oumodelos matemáticos podem ser aplicados para desenvolver"regras de teste" para determinar quando uma amostra depaciente é «positiva" (isto é, indicativa de probabilidadeaumentada de ter câncer de ovário). Por exemplo, quando aexpressão de HE4, CA125, PLAU-R, glicodelina, Muc-I e PAI-Ié detectada, o teste de triagem é considerado positivo se(1) quaisquer três de HE4, CA125, glicodelina, PAI-I ePLAU-R forem positivos (isto é, superexpressos) ou se (2)ΗΕ4 e CAl25 forem ambos superexpressos; de outro modo, oteste é considerado negativo. Em um exemplo adicional, oteste é considerado positivo se (1) quaisquer três entreHE4, CAl2 5, glicodelina, MMP-7 e PLAU-R forem positivos(isto é, superexpressos) ou se (2) HE4 for superexpresso etambém qualquer um entre CA125, glicodelina, MMP-7 ou PLAU-R for positivo; de outro modo, o teste é consideradonegativo. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá quevárias das tais regras de teste podem ser desenvolvidas eaplicadas nos presentes métodos para identificar pacientescom probabilidade aumentada de terem câncer de ovário comoregressão logística. Outros modelos matemáticos que podemser aplicados são descritos em Zhou e outros (2002)Statistical Methods in Diagnostic Medicine (Wiley, NovaYork), que é aqui incorporado a título de referência naíntegra.

Em outros aspectos da invenção, os métodos paradiagnosticar câncer de ovário em uma paciente compreendemobter uma amostra de corpo a partir de uma paciente,contatar a amostra do corpo com anticorpos dirigidos a umapluralidade de biomarcadores que são seletivamentesuperexpressos em câncer de ovário, e detectar ligação deanticorpos para determinar se os biomarcadores sãosuperexpressos na amostra da paciente. Nos métodos dediagnóstico da invenção, a superexpressão dos biomarcadoresé indicativa da presença de câncer de ovário.

Ainda em outras modalidades da invenção, sãofornecidos métodos para avaliar a eficácia de uma terapiapara tratar câncer de ovário em uma paciente. Tais métodoscompreendem, tipicamente, comparar o nível de expressão deuma pluralidade de biomarcadores da invenção em umaprimeira amostra de corpo de paciente obtida antes dainiciação de terapia com aquela a partir de uma segundaamostra obtida após administração de pelo menos uma porçãoda terapia. Um nivel de expressão significativamente maisbaixo dos biomarcadores na segunda amostra da paciente emrelação àquele da primeira amostra obtida antes dainiciação da terapia é uma indicação positiva da eficáciada terapia para tratar câncer de ovário na paciente, aopasso que um nível de expressão significativamente maiselevado dos biomarcadores na segunda amostra é umaindicação negativa da eficácia da terapia. Como utilizadoaqui, uma "indicação positiva da eficácia da terapia"significa que a terapia está produzindo resultadosbenéficos no tratamento de câncer de ovário (por exemplo,regressão de tumor, etc.). Uma "indicação negativa daeficácia da terapia" pretende significar que a terapia nãoestá tendo efeitos benéficos com relação ao tratamento decâncer de ovário. Uma indicação negativa da eficácia dotratamento específico pode ser relacionada, por exemplo, àdosagem. Em dosagens mais elevadas, a terapia pode sereficaz.

Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que nessesmétodos o termo "terapia" inclui qualquer terapia paratratar câncer de ovário, incluindo, porém, não limitado aquimioterapia, terapia de radiação, remoção cirúrgica dotecido do tumor, terapia de gene e terapia biológica. Osmétodos da invenção podem ser utilizados para avaliar umapaciente antes, durante e após terapia para avaliar, porexemplo, uma redução em carga do tumor.A invenção provê adicionalmente um método demonitoração para avaliar a regressão ou progressão decâncer de ovário em uma paciente compreendendo detectar emuma primeira amostra de paciente em um primeiro ponto detempo o nível de expressão de uma pluralidade debiomarcadores da invenção, repetir essa análise com umasegunda amostra de paciente obtida em um ponto de tempoposterior, e comparar o nível de expressão dosbiomarcadores nos dois pontos de tempo. Um nível deexpressão significativamente mais elevado dos biomarcadoresna amostra do corpo da paciente no ponto de tempo posteriorindica que o câncer de ovário progrediu, ao passo que umnível de expressão significativamente mais baixo é umaindicação de que o câncer de ovário regrediu. Comoutilizado aqui, «regressão de câncer de ovário" pretendesignificar que a condição da paciente com relação ao câncerde ovário melhorou, como caracterizado, por exemplo, pelotamanho diminuído do tumor. "Progressão do câncer deovário" significa que a condição da paciente com relação aocâncer de ovário piorou, como caracterizado, por exemplo,por tamanho aumentado de tumor, metástase, etc. Ossignificados dos termos "regressão" e "progressão" comrelação aos estados de doença serão entendidos por aquelesversados na técnica.

Em certos aspectos da invenção, a expressão debiomarcador é detectada no nível de proteína utilizandoanticorpos. Os termos "anticorpo" e "anticorpos" abrangem,em termos amplos, formas de ocorrência natural deanticorpos e anticorpos recombinantes como anticorpos decadeia única, anticorpos quiméricos e humanizados eanticorpos multi-específicos bem como fragmentos ederivados de tudo acima, cujos fragmentos e derivados têmpelo menos um sítio de ligação antigênico. Derivados deanticorpo podem compreender uma proteína ou fração químicaconjugada com o anticorpo.

"Anticorpos" e "imunoglobulinas" (Igs) sãoglicoproteínas tendo as mesmas características estruturais.Embora anticorpos apresentam especificidade de ligação a umantígeno, imunoglobulinas incluem tanto anticorpos comooutras moléculas semelhantes a anticorpo que não têmespecificidade de antígeno. Polipeptídeos do tipomencionado por último são, por exemplo, produzidos emníveis baixos pelo sistema de linfa e em níveis aumentadospor mielomas.

O termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amploe abrange anticorpos totalmente montados, fragmentos deanticorpo que podem ligar antígeno (por exemplo, Fab',F' (ab)2 / Fv, anticorpos de cadeia única, diacorpos), epeptídeos recombinantes compreendendo o acima.

O termo "anticorpo monoclonal", como utilizado aqui,se refere a um anticorpo obtido a partir de uma populaçãode anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, osanticorpos individuais compreendendo a população sãoidênticos exceto por mutações de ocorrência natural,possíveis que podem estar presentes em quantidades menores.

"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção deum anticorpo intacto, preferivelmente a região variável oude ligação de antígeno do anticorpo intacto. Os exemplos defragmentos de anticorpo incluem Fab, Fab', F(ab')2, efragmentos Fv; diacorpos; anticorpos lineares (Zapata eoutros (1995) Protein Eng. 8 (10): 1057-1062); moléculas deanticorpo de cadeia única; e anticorpos multi-específicosformados a partir de fragmentos de anticorpo. Digestão depapaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação deantígeno idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada comum sítio de ligação de antígeno único, e um fragmento "Fc"residual, cujo nome reflete sua capacidade de cristalizar35 prontamente. 0 tratamento com pepsina fornece umfragmento F(ab')2 que tem dois sítios de combinação deantígeno e é ainda capaz de reticular antígeno.

"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém umsítio de ligação e reconhecimento de antígeno completo. Emuma espécie Fv de duas cadeias, essa região consiste em umdímero de um domínio variável de uma cadeia pesada e umaleve em associação não covalente justa. Em uma espécie Fvde cadeia única, um domínio variável de cadeia pesada e umde cadeia leve podem ser covalentemente ligados por ligadorde peptídeo flexível de tal modo que as cadeias, leve epesada, possam associar em uma estrutura "dimérica" análogaàquela em uma espécie Fv de duas cadeias. É nessaconfiguração que os três CDRs de cada domínio variávelinteragem para definir um sítio de ligação de antígeno nasuperfície do dímero Vh-Vl. Coletivamente, os seis CDRsconferem especificidade de ligação de antígeno aoanticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável único (oumetade de um Fv compreendendo somente três CDRs específicospara um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligarantígeno, embora em uma afinidade mais baixa do que o sítiode ligação inteiro.

0 fragmento Fab também contém o domínio constante dacadeia leve e o primeiro domínio constante (ChI) da cadeiapesada. Fragmentos Fab diferem de fragmentos Fab' pelaadição de alguns resíduos no terminal carbóxi do domínioCh1 de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas apartir da região de articulação de anticorpo. Fabi-SH é adesignação aqui para Fab' na qual o(s) resíduo (s) decisteína dos domínios constantes contém um grupo de tiollivre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 eram originalmenteproduzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínasde articulação entre os mesmos.

Anticorpos policlonais podem ser preparados porimunização de um sujeito apropriado (por exemplo, coelho,cabra, camundongo ou outro mamífero) com um imunógeno deproteína de biomarcador. 0 título de anticorpo no sujeitoimunizado pode ser monitorado com o passar do tempo portécnicas padrão, como com um ensaio imunossorvente ligadopor enzima (ELISA) utilizando proteína de biomarcadorimobilizado. Em um momento apropriado após imunização, porexemplo, quando os títulos de anticorpo são mais elevados,células produtoras de anticorpo podem ser obtidas a partirdo sujeito e utilizadas para preparar anticorposmonoclónais por técnicas padrão, como a técnica dehibridòma originalmente descrita por Kohler e Milstein(1975) Nature 256:495-497, a técnica de hibridòma de célulaB humana (Kozbor e outros (1983) Immunol. Today 4:72), atécnica de hibridoma-EBV (Cole e outros (1985) emMonoclonal Antibodies and Câncer Therapy, ed. Reisfeld eSell (Alan R. Liss, Inc., Nova York, NY), páginas 77-96) outécnicas de tiroma. A tecnologia para produzir hibridomas ébem conhecida (vide genericamente Coligan e outros, eds.(1994) Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons,Inc., Nova York, NY); Galfre e outros (1977) Nature266:550-52; Kenneth (1980) em Monoclonal Antibodies: a newdimension in Biological analyses (Plenum Publishing Corp.,NY); e Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402).

Uma alternativa para preparar hibridomas de secretaranticorpo monoclonal, um anticorpo monoclonal pode seridentificado e isolado por triagem de uma biblioteca deimunoglobulinas combinatória recombinante (por exemplo, umabiblioteca de exibição de fagos de anticorpo) com umaproteína de biomarcador para, desse modo, isolar membros dabiblioteca de imunoglobulina que ligam a proteína debiomarcador. Os kits para gerar e fazer triagem debibliotecas de exibição de fago são comercialmentedisponíveis (por exemplo, a Pharmacia Recombinant PhageAntibody System, número do catálogo 27-9400-01; e aStratagene SurfZAP9 Phage Display kit, número do catálogo240612). Adicionalmente, os exemplos de métodos e reagentesparticularmente favoráveis para uso na geração e triagem debiblioteca de exibição de anticorpo podem ser encontrados,por exemplo, na patente US número 5,223,409; publicação dePCT números WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO92/15679; 93/01288; WO 92/01047; 92/09690; e 90/02809;Fuchs e outros (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay eoutros (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse eoutros (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths e outros(1993) EMBO J. 12:725-734.

As composições da invenção compreendem, ainda,anticorpos monoclonais e variantes e fragmentos dos mesmosque se ligam especificamente a proteínas de biomarcador deinteresse. Os anticorpos monoclonais podem ser rotuladoscom uma substância detectável como descrito abaixo, parafacilitar a detecção de proteína de biomarcador na amostra.

Tais anticorpos encontram uso na prática dos métodos dainvenção. Anticorpos monoclonais tendo as característicasde ligação dos anticorpos revelados aqui são tambémabrangidos pela presente invenção. As composiçõescompreendem ainda variantes de ligação de antígeno efragmentos dos anticorpos monoclonais, linhagens de célulade hibridoma produzindo esses anticorpos, e moléculas deácido nucléico isoladas codificando as seqüências deáminoácido desses anticorpos monoclonais.

Anticorpos tendo as características de ligação de umanticorpo monoclonal da invenção são também fornecidos.«Características de ligação" ou «especificidade deligação", quando utilizados com referência a um anticorpo,significam que o anticorpo reconhece epítopo antigênicoigual ou similar como um anticorpo de comparação. Osexemplos de tais anticorpos incluem, por exemplo, umanticorpo que compete com Um anticorpo monoclonal dainvenção em um ensaio de ligação competitivo. Uma pessoaversada na técnica poderia determinar se um anticorpointerfere, de forma competitiva, em outro anticorpoutilizándõ métodos padrão.

Por "epítopo" se quer dizer a parte de uma moléculaantigênica na qual um anticorpo é produzido e a qual oanticorpo se ligará. Os epítopos podem compreender resíduosde áminoácido lineares (isto é, resíduos dentro do epítoposão dispostos seqüencialmente um após o outro em um modolinear), resíduos de áminoácido, não lineares (mencionadosaqui como "epítopos não lineares", esses epítopos não sãodispostos seqüencialmente), ou resíduos de aminoácido,tanto lineares como não lineares. Tipicamente, epítopos sãoseqüências de aminoácido curtas, por exemplo, comprimentode aproximadamente cinco aminoácidos. Técnicas sistemáticaspara identificar epítopos são conhecidas na arte e sãodescritas, por exemplo, na patente US número 4,708,871.Resumidamente, um conjunto de oligopeptídeos desobreposição derivados a partir do antígeno pode sersintetizado e ligado a um conjunto de fase sólida de pinos,com um oligopeptídeo exclusivo em cada pino. 0 conjunto depinos pode compreender uma placa de microtítulo de 96cavidades, permitindo que uma pessoa ensaie todos os 96oligopeptídeos simultaneamente, por exemplo, para ligar-sea um anticorpo monoclonal específico de biomarcador.Alternativamente, kits de biblioteca de peptídeo deexibição de fago (New England BioLabs) sao atualmentecomercialmente disponíveis para mapeamento de epítopos.Utilizando esses métodos, a afinidade de ligação para todosubconjunto possível de aminoácidos consecutivos pode serdeterminada para identificar o epítopo que um dadoanticorpo liga. Os epítopos podem ser identificados tambémpor inferência quando seqüências de peptídeo de comprimentode epíltòpo são utilizados para imunizar animais a partirdos quais anticorpos são obtidos. Epítopos podem serdefinidos também por cadeias laterais de carboidratopresentes como oligossacarídeos ligados por N ou ligadospor O, presentes em glicoproteínas.

Fragmentos de ligação de antígeno e variantes dosanticorpos monoclonais revelados aqui são adicionalmentefornecidos. Tais variantes reterão as propriedades deligação, "desejadas do anticorpo de origem. Os métodos parafazer fragmentos de anticorpo e variantes são genericamentedisponíveis na técnica. Por exemplo, variantes de seqüênciade aminoácidos de um anticorpo monoclonal descrito aqui,podem ser preparadas por mutações na seqüência de DNAclonada codificando o anticorpo de interesse. Os métodospara alterações de seqüência de nucleotídeo e mutãgênesesão bem conhecidos na arte. Vide, por exemplo, Walker eGaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology(MacMiIlan Publishing Company, Nova York); Kunkel (1985)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkel e outros(1987) Methods Enzymol. 154:367-382; Sambrook, e outros,(1989) Molecular Cloning: a laboratory Manual (Cold SpringHarbor, Nova York); patente US número 4,873,192; e asreferências citadas na mesma; aqui incorporados a título dereferência. Orientação com relação a substituiçõesapropriadas de aminoácidos que não afetem a atividadebiológica do polipeptídeo de interesse pode ser encontradano modelo de Dayhoff e outros (1978) em Atlas of ProteinSequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found.,Washington, D.G.) aqui incorporada a título de referência.Substituições conservativas, como permutar um aminoácidopor outro tendo propriedades similares, podem serpreferidas. Os exemplos de substituições conservativasincluem, porém não são limitadas a, Gly<=>Ala,Val<=>Ile<=>Leu, Asp<=>Glu, Lys<=>Arg, Asn<=>Gln, ePhe < = >Trp< = >Tyr.

Na construção de variantes do polipeptídeo deanticorpo de interesse, modificações são feitas de tal modoque variantes continuem a possuir a atividade desejada,isto é, afinidade de ligação similar ao biomarcador.Obviamente, quaisquer mutações feitas no DNA codificando opolipeptídeo variantes não devem colocar a seqüência forado quadro de leitura e preferivelmente não criarão regiõescomplementares que poderiam produzir estrutura de mRNAsecundária. Vide a publicação do pedido de patente EP no.75,444 .

Preferivelmente, variantes de um anticorpobiomarcador de referência têm seqüências de aminoácidos quetêm pelo menos 70% ou 75% de identidade de seqüência,pref erivelmente pelo menos 80% ou 85% de identidade deseqüência, mais preferivelmente pelo menos 90%, 91%, 92%,93%, 94% ou 95% de identidade de seqüência com a seqüênciade aminoácidos para a molécula de anticorpo de referência,ou para uma porção mais curta da molécula de anticorpo dereferência. Mais preferivelmente, as moléculas compartilhampelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência.Para fins da presente invenção, a percentagem de identidadede seqüência é determinada utilizando o algoritmo de buscade homologia Smith-Waterman utilizando uma busca de gapafim com uma penalidade de abertura de gap de 12 e umapenalidade de extensão de gap de 2, matriz BLOSUM de 62. 0algoritmo de busca de homologia Smith-Waterman é reveladoem Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489. Umavariante pode, por exemplo, diferir do anticorpo dereferência por tão pouco quanto 1 a 15 resíduos deaminoácidos, tão pouco quanto 1 a 10 resíduos deaminoácidos, como 6-10, tão pouco quanto 5, tão poucoquanto 4, 3, 2 ou mesmo 1 resíduo de aminoácido.Com relação ao alinhamento ótimo de duas seqüênciasde aminoácidos, o segmento contínuo da seqüência deaminoácido variante pode ter resíduos de aminoácidoadicionais ou resíduos de aminoácido deletados com relaçãoà seqüência de aminoácido de referência. O segmentocontínuo utilizado para comparação com a seqüência deaminoácidos de referência incluirá pelo menos 20 resíduosde aminoácidos contínuos, e pode ser 30, 40, 50 ou maisresíduos de aminoácidos. Correções para identidade deseqüência associada a substituições de resíduo conservativoou gaps podem ser feitas (vide o algoritmo de busca dehomologia Smith-Waterman).

Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que aotimização de reagentes e condições, por exemplo, título deanticorpo e parâmetros para detecção de ligação deanticorpo de antígeno, é necessária para maximizar a razãode sinal para ruído para um anticorpo específico.Concentrações de anticorpo que maximizam ligação específicaaos biomarcadores da invenção e minimizam ligação nãoespecífica (ou "de segundo plano") serão determinadas. Emmodalidades específicas, títulos de anticorpo apropriadossão determinados testando inicialmente várias diluições deanticorpo em amostras de soro de paciente. O projeto deensaios para otimizar condições de detecção e título deanticorpo é padrão e compreendido nas capacidades de rotinadaqueles versados na técnica. Alguns anticorpos exigemotimização adicional para reduzir segundo plano e/ouaumentar especificidade e sensibilidade.

Além disso, uma pessoa versada na técnica reconheceráque a concentração de um anticorpo específico utilizadopara pôr em prática os métodos da invenção variarádependendo de tais fatores como tempo para ligação, nívelde especificidade do anticorpo para a proteína debiomarcador, e método de preparação de amostra de corpo.

Além disso, quando múltiplos anticorpos são utilizados emuma única amostra, a concentração exigida pode ser afetadapela ordem na qual os anticorpos são aplicados à amostra,isto é, simultaneamente como um coquetel ou seqüencialmentecomo reagentes de anticorpo individuais. Além disso, aquímica de detecção utilizada para visualizar ligação deanticorpo a um biomarcador de interesse deve ser tambémotimizada para produzir a razão de sinal para ruído,desejada.

A detecção de ligação de anticorpo pode serfacilitada por acoplar o anticorpo a uma substânciadetectável. Os exemplos de substâncias detectáveis incluemvárias enzimas, grupos prostéticos, materiaisfluorescentes, materiais luminescentes, materiaisbioluminescentes, e materiais radioativos. Os exemplos deenzimas apropriadas incluem peroxidase da raiz forte,fosfatase alcalina, β-galactosidade, ou acetilcolinesterase; os exemplos de completos de gruposprostéticos apropriados incluem estreptavidina/biotina eavidina/biotina; os exemplos de materiais fluorescentesapropriados incluem umbeliferona, fluoresceína,isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína dediclorotriazinil amina, cloreto de dansila ou ficoeritrina;um exemplo de um material luminescente inclui luminol; osexemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase,luciferina, e aequorin; e exemplos de material radioativoapropriado incluem 125I, 131I, 35S ou 3H.

Os anticorpos utilizados para pôr em prática ainvenção são selecionados para ter elevada especificidadepara as proteínas de biomarcador de interesse. Os métodospara fazer anticorpos e para selecionar anticorposapropriados são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo,Celis, ed. (em impressão) Cell Biology & LaboratoryHandbook, 3a edição (Academic Press, Nova York), que é aquiincorporado na íntegra a título de referência. Em algumasmodalidades, anticorpos comerciais dirigidos a proteínas debiomarcador específicas podem ser utilizados para pôr emprática a invenção. Os anticorpos da invenção podem serselecionados com base em coloração desejável de amostrascitológicas, em vez de histológicas. Isto é, em modalidadesespecíficas os anticorpos são selecionados com o tipo deamostra final (isto é, amostras de soro) em mente e paraespecificidade de ligação.

Em outras modalidades, a expressão de um biomarcadorde interesse é detectada no nível de ácido nucléico.Técnicas baseadas em ácido nucléico para avaliar expressãosão bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo,determinar o nível de mRNA de biomarcador em uma amostra decorpo. Muitos métodos de detecção de expressão utilizam RNAisolado. Qualquer técnica de isolamento de RNA que nãoseleciona contra o isolamento de mRNA pode ser utilizadapara a purificação de RNA a partir de amostras de soro(vide, por exemplo, Ausubel e outros, ed. , (1987-1999)Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons,Nova York)). Adicionalmente, grandes números de amostras desangue, soro ou tecido podem ser prontamente processadasutilizando técnicas bem conhecidas por aqueles versados naarte, como, por exemplo, o processo de isolamento de RNA deetapa única de Chomoczynski (1989, patente US número-4,843,155) .

0 termo "sonda" se refere a qualquer molécula queseja capaz de seletivamente ligar-se a uma biomoléculaalvo, especificamente pretendida, por exemplo, umtranscrito de nucleotideo ou uma proteína codificada por oucorrespondendo a um biomarcador. Sondas podem sersintetizadas por uma pessoa versada na técnica, ouderivadas a partir de preparados biológicos apropriados.Sondas podem ser especificamente projetadas para seremrotuladas. Os exemplos de moléculas que podem serutilizadas como sondas incluem, porém não são limitadas a,RNA, DNA, proteínas, anticorpos e moléculas orgânicas.

0 mRNA isolado pode ser utilizado em ensaios dehibridização ou amplificação que incluem, porém não sãolimitados a, análises Southern ou Northern, análises dereação de cadeia de polimerase e conjuntos de sonda. Ummétodo para a detecção de níveis de mRNA envolve contatar omRNA isolado com uma molécula de ácido nucléico (sonda) quepode hibridizar com o mRNA codificado pelo gene sendodetectado. A sonda de ácido nucléico pode ser, por exemplo,um cDNA de comprimento total, ou uma porção da mesma, comoum oligonucleotídeo de pelo menos 7, 15, 30, 50, 100, 250ou 500 nucleotídeos em comprimento e suficiente paraespecificamente hibridizar sob condições rigorosas a ummRNA ou DNA genÔmico que codifica um biomarcador dapresente invenção. A hibridização de um mRNA com a sondaindica que o biomarcador em questão está sendo expresso.Em uma modalidade, o mRNA é imobilizado em umasuperfície sólida e contatado com uma sonda, por exemplo,passando o mRNA isolado em um gel agarose e transferindo omRNA a partir do gel para uma membrana, como nitrocelulose.

Em uma modalidade alternativa, a(s) sonda(s) sãoimobilizada(s) em uma superfície sólida e o mRNA écontatado com a(s) sonda(s), por exemplo, em um conjunto dechips de gene Affymetrix. Um técnico especializado podeprontamente adaptar métodos de detecção de mRNA conhecidospara uso na detecção do nível de mRNA codificado pelosbiomarcadores da presente invenção.

Um método alternativo para determinar o nível de mRNAde biomàrcador em uma amostra envolve o processo deamplificação de ácido nucléico, por exemplo, por RT-PCR (amodalidade experimental exposta em Mullis, 1987, patente USnúmero 4,683,202), reação de cadeia de ligase (Barany(1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:189-193), replicaçãode seqüência auto-sustentada (Guatelli e outros (1990)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:1874-1878), sistema deamplificação de transcrição (Kwoh e outros (1989) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 86: 1173-1177), Replicase Q-Beta(Lizardi e outros (1988) Bio/Technology 6:1197), replicaçãode círculo de rolagem (Lizardi e outros, patente US número5,854,033) ou qualquer outro método de amplificação deácido nucléico, seguido pela detecção das moléculasamplificadas utilizando técnicas bem conhecidas por aquelesversados na arte. Esses esquemas de detecção sãoespecialmente úteis para a detecção de moléculas de ácidonucléico se tais moléculas estiverem presentes em númerosmuito baixos. Em aspectos específicos da invenção, aexpressão de biomarcador é avaliada por RT-PCR fluorogênicoquantitativo (isto é, o Sistema TaqMan®) . Tais métodosutilizam, tipicamente, pares de iniciadores deoligonucleotídeo que são específicos para o biomarcador deinteresse. Os métodos para projetar iniciadores deoligonucleotídeo específicos para uma seqüência conhecidasão bem conhecidos na arte.

Níveis de expressão de biomarcador de RNA podem sermonitorados utilizando um blot de membrana (como utilizadoem análise de hibridização como Northern, Southern, depontos, e similar) ou microcavidades, tubos de amostra,géis, contas ou fibras (ou qualquer suporte sólidocompreendendo ácidos nucléicos ligados). Vide as patentesUS números 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 e5,445,934, que são incorporadas aqui a título dereferência. A detecção de expressão de biomarcador tambémpode compreender o uso de sondas de ácido nucléico emsolução.

Em uma modalidade da invenção, microconjuntos sãoutilizados para detectar expressão de biomarcador.Microconjuntos são particularmente bem adequados para essafinalidade devido à capacidade de reprodução entrediferentes experimentos. Microconjuntos de DNA fornecem ummétodo para a medição simultânea dos níveis de expressão degrandes números de genes. Cada conjunto consiste em umpadrão reproduzível de sondas de captura ligadas a umsuporte sólido. DNA ou RNA rotulado é hibridizado comsondas complementares no conjunto e, então, detectado porvarredura laser. Intensidades de hibridização para cadasonda no conjunto são determinadas e convertidas em umvalor quantitativo que representa níveis de expressão degene relativos. Vide as patentes US números 6,040,138,5,800,992 e 6,020,135, 6,033,860 e 6,344,316, que sãoincorporadas aqui a título de referência. Conjuntos deoligonucleotídeo de alta densidade são particularmenteúteis para determinar o perfil de expressão de gene para umgrande número de RNA's em uma amostra.

Técnicas para a síntese desses conjuntos utilizandométodos de síntese mecânica são descritas, por exemplo, napatente US número 5,384,261, incorporada aqui a título dereferência na íntegra para todas as finalidades. Embora umasuperfície de conjunto plana seja preferida, o conjuntopode ser fabricado em uma superfície virtualmente dequalquer formato ou mesmo uma multiplicidade desuperfícies. Os conjuntos podem ser peptídeos ou ácidosnucléicos em contas, géis, superfícies poliméricas, fibrascomo fibra ótica, vidro ou qualquer outro substratoapropriado, vide as patentes US números 5,77 0,358,5,789,162, 5,708,153, 6,040,193 e 5,800,992, cada uma dasquais é incorporada pelo presente na íntegra para todas asfinalidades. Os conjuntos podem ser embalados de tal modo apermitir diagnóstico ou outra manipulação de um dispositivototalmente incluso. Vide, por exemplo, as patentes USnúmeros 5,856,174 e 5,992,591, aqui incorporadas a títulode referência.

Em uma abordagem, mRNA total isolado a partir da

amostra é convertido em cRNA rotulado e então hibridizadocom um conjunto de oligonucleotídeos. Cada amostra éhibridizada com um conjunto separado. Níveis de transcritorelativos podem ser calculados por referência a controlesapropriados presentes no conjunto e na amostra.

Kits para pôr em prática os métodos de triagem ediagnóstico da invenção são adicionalmente fornecidos. Por"kit" se quer dizer qualquer fabricação (por exemplo, umaembalagem ou um recipiente) compreendendo pelo menos umreagente, por exemplo, um anticorpo, uma sonda de ácidonucléico, etc., para detectar especificamente a expressãode um biomarcador da invenção. 0 kit pode ser promovido,distribuído ou vendido como uma unidade para executar osmétodos da presente invenção. Adicionalmente, os kits podemconter uma inserção de embalagem descrevendo o kit emétodos para seu uso.

Em modalidades específicas, kits para uso em métodosde triagem para identificar pacientes com probabilidadeaumentada de terem câncer de ovário compreendem umapluralidade de anticorpos dirigidos a proteínas debiomarcador de interesse, particularmente onde osbiomarcadores são selecionados a partir do grupo queconsiste em HE4, CA125, glicodelina, MMP-7, Muc-1, PAI-1,CTHRCl, inibina A, PLAU-R, prolactina, KLK-10, KLK-6, SLPI,e alfa-1 antitripsina. Produtos químicos para a detecção deligação de anticorpo ao biomarcador também podem serincluídos no kit. Outros reagentes para detectar expressãode biomarcadores utilizando anticorpos em uma ELISA ouformato de imunoensaio baseado em conta multíplex podem seradicionalmente incluídos em um kit da invenção. Em outrasmodalidades, kits para uso nos métodos de triagem reveladosaqui compreendem sondas de ácido nucléico para a detecçãode expressão de uma pluralidade de biomarcadores deinteresse em uma amostra de corpo, particularmente onde osbiomarcadores são selecionados a partir do grupo queconsiste em HE4, CA125, glicodelina, MMP-7, Muc-1, PAI-1,GTHRCl, inibina A, PLAU-R, prolactina, KLK-10, KLK-6, SLPI,e alfa-1 antitripsina.

Em certos aspectos da invenção, são fornecidos kitspara executar o método de triagem de duas etapas paraidentificar pacientes com probabilidade aumentada de teremcâncer de ovário. Kits podem ser projetados para executar ométodo de triagem de duas etapas como dois testesseparados. Tais kits incluem reagentes para executar umaúnica etapa de ensaio (isto é, a primeira ou segunda etapade ensaio). Em outras modalidades, os kits compreendemreagentes de modo que o método de duas etapas pode serexecutado como um teste único (isto é, incluem reagentestanto para a primeira como segunda etapa de ensaio) . Alémdisso, kits abrangidos pela invenção encontram uso em pôrem prática o método de triagem de etapa única descritoacima. Os kits podem compreender ainda descrições dealgoritmos ou modelos matemáticos a serem aplicados com osmétodos dè triagem de uma etapa ou duas etapas, bem comoplataformas automatizadas que implementam osalgoritmos/modelos matemáticos com pouca ou nenhumaintervenção humana. Os kits podem ser adicionalmentefornecidos de tal modo que cada etapa no método de duasetapas seja executada em um modo automatizado, semi-automatizadò ou manual.

Kits para diagnosticar câncer de ovário também sãofornecidos. Tais kits podem incluir anticorpos ou sondas deácido nucléico que são específicos para detecção de umapluralidade de biomarcadores que são seletivamentesuperexpressos em câncer de ovário, mais particularmenteHE4, CAl2 5, glicodelina, MMP-7, Muc-1, PAI-1, CTHRCl,inibina A, PLAU-R, prolactina, KLK-10, KLK-6, SLPI, e alfa-1 antitripsina.

Uma pessoa versada na técnica reconhecerá ainda quequalquer uma ou todas as etapas nos métodos de triagem ediagnóstico da invenção poderia ser implementada porpessoal ou alternativamente, executada em um modoautomatizado. Isto é, os métodos podem ser executados em ummodo automatizado, semi-automatizado ou manual. Além disso,os métodos revelados aqui podem ser também combinados comoutros métodos conhecidos ou posteriormente desenvolvidospara permitir uma identificação mais precisa de pacientescom probabilidade aumentada de terem câncer de ovário ou umdiagnóstico mais seguro de câncer de ovário.

O artigo "um" e "uma" é aqui utilizado para sereferir a um ou mais de um (isto é, pelo menos um) doobjeto gramatical do artigo. Como exemplo, "um elemento"significa um ou mais elementos.

Em todo relatório descritivo a palavra"compreendendo" ou variações como "compreende" ou "quecompreende" serão entendidas como envolvendo a inclusão deum elemento mencionado, número inteiro ou etapa, ou grupode elementos, números inteiros ou etapas, porém não aexclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ouetapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas.

Os seguintes exemplos são oferecidos como ilustraçãoe nao como limitação:

EXPERIMENTAL

Exemplo 1: Método exemplar para coleta de sangue,processamento de sangue em soro, condições de armazenagemde soro e condições de transporte de soro

Coleta de sangue

Uma quantidade suficiente de sangue foi tirada porvenopuntura em tubos de coleta com topo vermelho Vacutainerda Becton Dickinson não contendo aditivo (número docatálogo 366430) . 0 número de lote do tubo de coleta desangue]foi registrado. Sangue integral não foi refrigeradoou congelado. 0 processamento do sangue integral em sorocomeçou imediatamente após coleta do sangue.

Procedimento dé preparação de soro

Tubos de coleta de sangue foram colocadosverticalmente em uma prateleira e armazenados emtemperatura ambiente. 0 sangue foi deixado coagular por umperíodo mínimo de 60 minutos e máximo de 90 minutos apartir do momento de coleta. Sangue foi totalmentecoagulado antes da centrifugação. 0 tempo necessário paracoagulação completa para cada amostra foi registrado.

Após coagulação total do sangue, as amostras foramcentrifugadas em 1300xg por 10 minutos utilizando um rotorde centrífuga de cabeça oscilante ou ângulo fixo. Os tubosforam cuidadosamente removidos a partir da centrífuga paraevitar perturbar as hemáciás no fundo.

0 tampo foi retirado de cada tubo sem perturbar apelota de células. 0 soro de cada doador foi combinado emum tubo rotulado utilizando uma pipeta de transferênciadescartável sem perturbar a camada de células ou permitir aentrada de quaisquer células na pipeta. Se as células foremperturbadas durante transferência, as amostras foram re-centrifugadas como descrito acima.Amostras de soro de cada doador foram misturadasinvertendo suavemente o tubo cinco vezes. Alíquotas de ummL foram colocadas em tubos rotulados e congeladas a -200Caté -80°C. Soro não foi armazenado em temperatura ambientepor mais de duas horas ou em 2-80C por mais de oito horasantes do congelamento.

Exemplo 2: Estudo de seleção de biomarcador de ovário- análise; de biomarcador individual

A finalidade do estudo de seleção de biomarcador foide avaliar a utilidade clínica inicial de um conjunto dequatorze biomarcadores candidatos de câncer de ovário. Apremissa do estudo era ser capaz de identificar equantificar a quantidade de cada biomarcador no soro de umpaciente. A expressão de proteína de biomarcador emamostras de soro foi detectada utilizando anticorposespecíficos de biomarcador comerciais ou novos em umformato de ELISA. Quatorze biomarcadores alvo foramanalisados, conforme descrito abaixo na Tabela 1:

Tabela 1. Marcadores Candidatos

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População alvo e demógrafia do estudo

Em avaliações desse tipo, é essencial que as amostrastestadas sejam representativas da população clínica, alvo,e que controles normais sejam casados demograficamente. Umtotal de 900 amostras de soro de pacientes foi analisadonesse estudo. 200 das amostras eram de pacientes com câncerno ovário em vários estágios da doença (isto é, as 200amostras foram divididas uniformemente entre amostras decâncer de ovário estágio 1, 2, 3). Um total de 500 sorosnormais foi utilizado no estudo. 104 das amostras de soronormal eram de mulheres pós-menopausa (definido comomulheres com mais de 55 anos de idades para o presenteestudo) para estabelecer os níveis de linha de base de cadabiomarcador e calcular os valores cut-off limiteapropriados. As 396 amostras de soro normais restantesforam divididas uniformemente entre mulheres pré-menopausacom menos de 55 anos de idade e mulheres pós-menopausa commais de 55 anos de idade. Essa distribuição permitiu apesquisa de quaisquer distribuições de pacientesrelacionadas à idade ou hormônio. As 200 amostras restantesno estudo foram coletadas a partir de doadores com váriascondições/doenças, como descrito acima (isto é, «condiçõesinterferentes" ou "patologias interferentes") . A inclusãodessas amostras permitiu a análise de quaisquer patologiasinterferentes que podem afetar o desempenho de biomarcadorindividual. Os sumários das populações de pacientesanalisadas e demografia de estudo são fornecidos nastabelas 2-4.

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Tabela 3: Características clínicas de pacientes com câncerde ovário em estudo

<table>table see original document page 71</column></row><table>Sarcoma estromal

Tabela 4: Distribuição de substâncias/patologiasinterferentes

<table>table see original document page 72</column></row><table>

Descrição geral de análise de automação e validação para oestudo

Todas as 900 amostras de soro foram processadas emduplicata para cada um dos 14 marcadores. Um sistema deensaio automatizado com rastreamento de código de barrasfoi utilizado na geração dos dados de seleção de marcador.

Os ensaios feitos nesse estudo de seleção de marcador foramtodos concluídos utilizando um manipulador de liquidorobótico automatizado Tecan Evo. 0 uso dessa plataformapermitiu que todas as 900 amostras fossem processadas paracada marcador em um curso experimental único (um curso pordia). A precisão da plataforma automatizada foi verificadaantes do processamento de quaisquer amostras de estudo.

Todos os ensaios ELISA foram processados para esseestudo utilizando uma solução tamponada como o diluentepara a curva padrão. Isso foi feito para padronizar, tantoquanto possível, os protocolos para cada um dos ensaios.

Os soros normais utilizados nesse estudo foramobtidos a partir de centros de coleta de sangue dacomunidade em conformidade com costumes IRB locais. Emboraesses soros possam ser considerados 1normais' , deve serobservado que esses doadores não foram classificados por umprofissional médico para confirmar seu estado normal oulivre de doença.

Detecção de expressão dé HE 4 em amostras de soro (umexemplo representativo)

Materiais e métodos

A. Revestimento de placas de ensaios:

Placas com 96 cavidades ELISA foram revestidas com100 μΐ/cavidade do anticorpo primário, monoclonal anti-HE490,1 #6, em 2 μ9/ήι1 em PBS, a seguir as placas foramincubadas a 40C durante a noite. No dia seguinte, as placasforam lavadas com PBS, a seguir 25 0 μg/cavidade de PBS-3%BSA foi adicionado a todas as cavidades, e as placas foramincubadas por 2 horas em 30°C. As placas foram entãoesvaziadas e secas em um forno sob vácuo por 2 horas emtemperatura ambiente. Então foram vedadas a calor dentro deum saco de folha mylar juntamente com um pacote dessecantee armazenadas a 40C até ser utilizada em um ensaio.

B. Métodos de ensaio

Os sacos de folha contendo as placas de ensaio foramaquecidos até a temperatura ambiente imediatamente antes douso no' ensaio. As amostras de soro foram diluídas 1:4 emPBS-soro bovino 1% - 0,05% Tween 20-1 mg/ml de IgG decamuhdongo. A proteína de antígeno de HE4 foi diluída a 100ng/ml, a seguir diluída em série duas vezes em PBS-1% desoro bovino - 0,05% Tween 20 - 1 mg/ml de IgG decamundongo, então todas as amostras de curva padrãoindividuais foram adicionalmente diluídas 1:4 no tampão demodo que seriam diluídas iguais as amostras de soro.

As amostras de soro diluídas e amostras de curvapadrão foram adicionadas às placas de ensaio revestidas comanti-HE4 em volumes de 100 μΐ/cavidade. A seguir as placasforam incubadas por 2 horas a 3 0°C. As placas foram lavadasa seguir 5x com 250μ1/cavidade de PBS-0,05% Tween 20.

O anticorpo secundário, monoclonal anti-HE471,1#1,13-HRP, foi diluído 1:16,000 em PBS-1% IgG bovino-0,05% Tween 20- 1 mg/ml de IgG de camundongo. A solução deanticorpo secundária foi então adicionada às placasaspiradas em volumes de 100 μΐ/cavidade. As placas foramincubadas por 1 hora a 30°C.As placas foram lavadas 5x com 25(^l/cavidade de PBS-0,05% Tween 20. A solução de revelação, TMB (3,3',5,5'-tetrametil benzidina) foi aquecida à temperatura ambienteantes do uso, e então a TMB foi adicionada às placasaspiradas em volumes de 100 μΐ/cavidade.

As placas foram incubadas por 10 minutos emtemperatura ambiente e então a solução de Parar, 2N H2SO4,foi adicionada às placas (contendo o TMB) em volumes de 100μΐ/cavidade.

As placas foram incubadas por 10 minutos emtemperatura ambiente, e então foram lidas na leitora deplaca 5SpectraMax da Molecular Devices a 450 nm, com umcomprimento de onda de referência de 650 nm, utilizandosoftware SoftMax Pro.

Os dados foram salvos como arquivos SoftMax Pro, etambém exportados como arquivos de texto para uso com MSExcel.

Controles: soro utilizado como o Controle elevado:Uniglobe #72372

Soro utilizado como o Controle baixo: Üniglobe #72404

Controle de tampão utilizado foi PBS-1% de sorobovino - 0,05% Tween 1 mg/ml de IG de camundongo

Os CV's para os controles através de todas as 25placas são resumidos na tabela 5.

Tabela 5: Os CV's para os controles através de todasas 25 placas

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Resultados (curvas padrão)

Uma curva padrão para HE4 foi preparada diluindo aproteína HE4 em PBS/1% de soro bovino/0,05% Tween 20-1mg/mL de IgG de camundongo. A preparação de tais curvaspadrão é bem conhecida na técnica. Curvas padrão e osníveis ou concentrações dos biomarcadores em todas asamostras de soro foram produzidos para os biomarcadoresrestantes, essencialmente como descrito acima para HE4, comvariações que poderiam ser apreciadas e implementadas poruma pessoa versada na técnica. Faixas de curva padrão eequações de ajuste de curva para os biomarcadoresanalisados (isto é, HE4, glicodelina, SPLI, PLAU-R, MUC-1,PAI-I, MMP-7, inibina, CA125, CTHRCl, KLK-6, KLK-IO, alfa-1antitripsina, e prolactina) são apresentadas abaixo:

HE4

Faixa experimental de curva padrão = 0,7 8 ng/ml a100 ng/ml, em diluições seriais em duas vezes

ajuste de curva = polinômio de terceira ordem, y =-1E-07X3 - 0,OOOlx2 + 0,0402x + 0,0157; R2 = 0,9999

As amostras de curva padrão e as amostras de soroforam então ambas diluídas 1:4 para conduzir o ensaio; umavez que tanto as amostras de soro como as amostras de curvapadrão foram diluídas do mesmo modo não houve necessidadede utilizar um fator de diluição durante análise de dadospara determinar as concentrações das amostras desconhecidasde soro.

Glicodelina

Faixa experimental de curva padrão = 3 ng/ml a 100ng/ml, em diluições seriais em duas vezes

ajuste de curva = quadrática, y = -0,0003x3 +0,0478x + 0,0952; R2 = 0,9851

as amostras de soro foram conduzidas no ensaio nãodiluídas, de modo que nenhum fator de diluição foiutilizado na análise de dados.

SPLI

Faixa experimental de curva padrão = 2,3 8 ng/ml a305 ng/ml, em diluições seriais em duas vezes

ajuste de curva = polinômio de terceira ordem, y =-7Ε-05Χ3 - 7E-05X2 + 0,0237x + 0,039; R2 = 0,9997

As amostras de soro foram diluídas 1:6,1 em umaetapa inicial da técnica de preparação automatizada deamostra. A seguir aquelas amostras de soro diluídas foramadicionalmente diluídas 1:6,6 em outra etapa automatizadapara obter uma diluição total de 1:40. Aquelas amostrasdiluídas 1:40 foram então conduzidas no ensaio.

As amostras de curva padrão foram preparadas nasconcentrações mencionadas acima (faixa experimental), aseguir aquelas amostras de curva padrão foram todasadicionalmente diluídas 1:6,1, e aquelas amostras diluídas1:6,1 foram então conduzidas no ensaio.

Uma vez que havia uma discrepância entre a diluiçãodas amostras de soro (1:40) em comparação com a diluiçãodas amostras de curva padrão (1:6,1), todos os valores deconcentração de amostra de soro obtidos a partir da curvapadrão foram multiplicados por um fator de diluição de"6,6" para corrigir a discrepância (1:40 = 1:6,1 χ 1:6,6).

UPar (PLAU-R)

Faixa experimental de curva padrão = 62,5 pg/ml a4000 pg/ml, em diluições seriais em duas vezes

ajuste de curva = linear, y = 0,0006x + 0,0522; R2= 0,9977

As amostras de soro foram diluídas 1:6 em uma etapainicial da técnica de preparação automatizada de amostra. Aseguir aquelas amostras de soro diluídas foramadicionalmente diluídas 1:3 em outra etapa automatizadapara obter uma diluição total de 1:18. Aquelas amostrasdiluídas 1:18 foram então conduzidas no ensaio.

As amostras de curva padrão foram preparadas nasconcentrações mencionadas acima (faixa experimental), aseguir aquelas amostras de curva padrão foram todasadicionalmente diluídas 1:3, e aquelas amostras diluídas

1:3 foram então conduzidas no ensaio.

Uma vez que havia uma discrepância entre a diluiçãodas amostras de soro (1:18) em comparação com a diluiçãodas amostras de curva padrão (1:3), todos os valores deconcentração de amostra de soro obtidos a partir da curvapadrão foram multiplicados por um fator de diluição de "6"para corrigir a discrepância (1:18 = 1:3 χ 1:6).

MUC-I

Faixa experimental de curva padrão =0,3 U/ml a 600U/ml, em diluições seriais em três vezes

ajuste de curva = polinômio de terceira ordem, y =3Ε-07Χ3 - 0,OOOlx2 + 0,0236x + 0,0371;R2 = 1,0

as amostras de curva padrão e as amostras de soroforam então ambas diluídas 1:2 para conduzir o ensaio; umavez que tanto as amostras de soro como as amostras de curvapadrão foram diluídas do mesmo modo não houve necessidadede utilizar um fator de diluição durante análise de dadospara determinar as concentrações das amostras de sorodesconhecidas.

PAI-I

Faixa experimental de curva padrão = 0,78 ng/ml a100 ng/ml, em diluições seriais em duas vezes

ajuste de curva = linear, y = 0,0139x + 0,0151; R2= 0,9996

as amostras de curva padrão e as amostras de soroforam então ambas diluídas 1:4 para conduzir o ensaio; umavez que tanto as amostras de soro como as amostras de curvapadrão foram diluídas do mesmo modo não houve necessidadede utilizar um fator de diluição durante análise de dadospara determinar as concentrações das amostras de sorodesconhecidas.

MMP-7

.Faixa experimental de curva padrão = 0,16 ng/ml a20 ng/ml, em diluições seriais em duas vezes

ajuste de curva = polinômio de terceira ordem, y =0,OOOlx3 - 0,0046x2 + 0,1578x + 0,0936; R2 = 0,9999

as amostras de curva padrão e as amostras de soroforam então ambas diluídas 1:1 para conduzir o ensaio; umavez que tanto as amostras de soro como as amostras de curvapadrão foram diluídas do mesmo modo não houve necessidadede utilizar um fator de diluição durante análise de dadospara determinar as concentrações das amostras de sorodesconhecidas.Inibina

. Faixa experimental de curva padrão = 10 pg/ml a1000 pg/ml, diluições seriais em duas vezes

. ajuste de curva = linear, y = 0,0007x + 0,0136; R2= 0,9997

as amostras de curva padrão e as amostras de soroforam então ambas diluídas 1:3 para conduzir o ensaio; umavez que tanto as amostras de soro como as amostras de curvapadrão foram diluídas do mesmo modo não houve necessidadede utilizar um fator de diluição durante análise de dadospara determinar as concentrações das amostras de sorodesconhecidas.

CA125

Faixa experimental de curva padrão = 15U/ml a 4 00U/ml, diluições seriais em duas vezes

. ajuste de curva = linear, y = 0,0021x + 0,0892; R2= 0,9986

as amostras de soro foram conduzidas no ensaio nãodiluídas, assim nenhum fator de diluição foi utilizado naanálise de dados.

CTHRCl

Faixa experimental de curva padrão = 0,78 ng/ml a100 ng/ml, em diluições seriais em duas vezes

Ajuste de curva = linear; y = 0,0261x + 0,042; R2 =0,9991

as amostras de curva padrão e as amostras de soroforam então ambas diluídas 1:2 para conduzir o ensaio; umavez que tanto as amostras de soro como as amostras de curvapadrão foram diluídas do mesmo modo não houve necessidadede utilizar um fator de diluição durante análise de dadospara determinar as concentrações das amostras de sorodesconhecidas.

KLK-6

Faixa experimental de curva padrão = 0,78 ng/ml a100 ng/ml, em diluições seriais em duas vezes

ajuste de curva = polinômio de terceira ordem, y =-4E-07X3 + 0,OOOlx2+ 0,0133x + 0,0662;

R2 = 1,0

as amostras de curva padrão e as amostras de soroforam então ambas diluídas 1:1 para conduzir o ensaio; umavez que tanto as amostras de soro como as amostras de curvapadrão foram diluídas do mesmo modo não houve necessidadede utilizar um fator de diluição durante análise de dadospara determinar as concentrações das amostras de sorodesconhecidas.

KLK-10

Faixa experimental de curva padrão = 1 ng/ml a 80ng/ml, em diluições seriais em duas vezes

ajuste de curva = linear; y = 0,0758x - 0,0312; R2= 0,9976

as amostras de curva padrão e as amostras de soroforam então ambas diluídas 1:4 para conduzir o ensaio; umavez que tanto as amostras de soro como as amostras de curvapadrão foram diluídas do mesmo modo não houve necessidadede utilizar um fator de diluição durante análise de dadospara determinar as concentrações das amostras de sorodesconhecidas.

Alfa 1 antitripsinaFaixa experimental de curva padrão = 3,3 ng/ml a 90ng/ml, em diluições seriais em duas vezes

ajuste de curva = quadrático, y = -0,0002x2 +0,0412x + 0,0592; R2 = 0,9997

As amostras de soro foram diluídas 1:250,000, eentão aquelas amostras diluídas foram conduzidas no ensaio.

As amostras de curva padrão foram diluídas em série comomencionado acima (faixa experimental) e então aquelasamostras foram conduzidas no ensaio.

Uma vez que houve uma discrepância entre a diluiçãodas amostras de soro (1:250,000) em comparação com adiluição das amostras de curva padrão (não diluída além dasdiluições seriais), todos os valores de concentração deamostra de soro obtidos a partir da curva padrão forammultiplicados por um fator de diluição de "250,000" paracorrigir a discrepância.

Prólactina

faixa experimental de curva padrão = 2 ng/ml a 24 0ng/ml, em diluições seriais em duas vezes

ajuste de curva = linear, y = 0,0049x + 0,0363; R2= 0,9917

as amostras de curva padrão e as amostras de soroforam então ambas diluídas 1:5 para conduzir o ensaio; umavez que tanto as amostras de soro como as amostras de curvapadrão foram diluídas do mesmo modo não houve necessidadede utilizar um fator de diluição durante análise de dadospara determinar as concentrações das amostras de sorodesconhecidas.

Resultados - desempenho individual de marcador

Entre os 500 casos normais utilizados no presenteestudo, 104 casos normais foram utilizados como grupo decontrole para selecionar o ponto de corte limite. A Tabela6 provê a média, desvio padrão, faixa, média+2*padrão,média+3*padrão baseado nesses 104 casos normais limite paracada marcador. A Tabela 7 e Tabela 8 fornecem o desviomédio padrão, faixa, média+2*padrão em todos os casosnormais de estudo (396 casos) e com casos normais de estudoa partir de pacientes acima de 55 anos de idade (195 oumenos). Os desvios médio e padrão foram muito similaresentre os casas de controle limite normais e os casosnormais de estudo para pacientes acima de 55 anos de idadepara cada biomarcador exceto para marcadores HE4 e Inibina.

Vide as Tabelas 6 e 8.

Tabela 6: Média e Padrão de cada biomarcador em 105 casosnormais de controle

<table>table see original document page 83</column></row><table>Tabela 7: Média e Padrão de cada biomarcador em 396 casosnormais de estudo

<table>table see original document page 84</column></row><table>

Tabela 8: Média e padrão de cada biomarcador em casos normais de estudo (Pacientes acima de 55 ano s de idade)

<table>table see original document page 84</column></row><table><table>table see original document page 85</column></row><table>

* O desvio padrão era maior nos casos normais de estudo do quenos casos normais de controle para pacientes acima de 55 anos deidade

** a média e desvio padrão foram maiores nos casos normais deestudo do que nos casos normais de controle para pacientes acimade 55 anos de idade

Para cada marcador individual, a curva ROC foiobtida. A curva ROC consiste somente dos 3 96 casos normaise dos 200 casos de câncer de ovário. Os 104 casos normaiscomo controle e 200 casos de patologia/substânciainterfèrente não foram incluídos nessa análise. As curvasROC para HE4, Inibina A, prolactina, PLAU-R, glicodelina,SLPI, CTHRCl, PAI-1, KLK-10, CA125, KLK-6, MUC-I e MMP-7são apresentados nas figuras 2-14, respectivamente.

Também, a percentagem de amostras positivas enegativas foi determinada para cada marcador por grupo deidade, por estágio de câncer, e por categoria depatologia/substância interferente. Essas determinaçõesforam baseadas em dois tipos de pontos de corte: (1)média+2*pad, e (2) o melhor corte a partir da curva ROC. Osmelhores pontos de corte foram selecionados a partir dacurva ROC com o valor mais elevado de sensibilidade maisespecificidade. 0 melhor ponto de corte foi listado naTabela 6. Sumários dos resultados positivos para cadabiomarcador por grupo de idade, estágio de câncer, ecategoria de patologia/substância interferente sãoapresentados nas tabelas 9 a 47.

Biomarcador: HE4

Tabela 9: Sumário por grupo de idade para HE4

<table>table see original document page 86</column></row><table>

Tabela 10: Sumário por categoria de patologia/substância

<table>table see original document page 86</column></row><table><table>table see original document page 87</column></row><table>

Tabela 11: Sumario por Estagio de Cancer para HE4

<table>table see original document page 87</column></row><table>

Biomarcador Muc-ITabela 12: Sumário por grupo de idade para Muc-I

<table>table see original document page 88</column></row><table>

Tabela 13: Sumário por categoria de patologia/substânciainterferente para Muc-I

<table>table see original document page 88</column></row><table><table>table see original document page 89</column></row><table>

Tabela 14: Sumário por estágio de câncer para Muc-I

<table>table see original document page 89</column></row><table>

Biomarcador: KLK-6

Tabela 15: Sumário por grupo de idade para KLK-6

<table>table see original document page 89</column></row><table><table>table see original document page 90</column></row><table>

Tabela 16: Sumário por categoria de patologia/sustânciainterferente para KLK-6

<table>table see original document page 90</column></row><table><table>table see original document page 91</column></row><table>

Tabela 17: Sumário por grupo de estágio de câncer para KLK-6

<table>table see original document page 91</column></row><table>

Biomarcador: KL-10

Tabela 18: Sumário por grupo de idade para KLK-IO

<table>table see original document page 91</column></row><table><table>table see original document page 92</column></row><table>

Tabela 19: Sumário por grupo de patologia/substânciainterferente para KLK-IO

<table>table see original document page 92</column></row><table>

Tabela 20: Sumário por grupo de estágio de câncer paraKLK-IO

<table>table see original document page 93</column></row><table>

Biomarcador: PAI-I

Tabela 21: Sumário por grupo de idade para PAI-I

<table>table see original document page 93</column></row><table>

Tabela 22: Sumário por grupo de patologia/substânciainterferente para PAI-I

<table>table see original document page 94</column></row><table>

Tabela 23: Sumário por grupo de estágio de câncer para

PAI-1 _

<table>table see original document page 94</column></row><table><table>table see original document page 95</column></row><table>

Biomarcador: CTHRCl

Tabela 24: Sumário por grupo de idade para CTHRCl

<table>table see original document page 95</column></row><table>

Tabela 25: Sumário por grupo de patologia/substânciainterferente para CTHRCl

<table>table see original document page 95</column></row><table><table>table see original document page 96</column></row><table>

Tabela 26: Sumário por grupo de estágio de câncer paraCTHRCl

<table>table see original document page 96</column></row><table><table>table see original document page 97</column></row><table>

Biomarcador: SLPI

Tabela 27: Sumário por grupo de idade para SLPI

<table>table see original document page 97</column></row><table>

Tabela 28: Sumário por Grupo de patologia/substância

interferente para SLPI

<table>table see original document page 97</column></row><table><table>table see original document page 98</column></row><table>

Tabela 29: Sumário por grupo de estágio de câncer para SLPI

<table>table see original document page 98</column></row><table>

Biomarcador: Inibina A

Tabela 30: Sumário por grupo de idade para Inibina<table>table see original document page 99</column></row><table>

Tabela 31: Sumário por Grupo de patologia/substânciainterferente para Inibina

<table>table see original document page 99</column></row><table><table>table see original document page 100</column></row><table>

Tabela 32: Sumário por grupo de estágio de câncer para Inibina

<table>table see original document page 100</column></row><table>

Biomarcador: Glicodelina

Tabela 33: Sumário por grupo de idade para Glicodelina

<table>table see original document page 100</column></row><table><table>table see original document page 101</column></row><table>

Tabela 34: Sumário por Grupo de patologia/substânciainterferente para Glicodelina

<table>table see original document page 101</column></row><table><table>table see original document page 102</column></row><table>

Tabela 35: Sumário por grupo de estágio de câncer paraGlicodelina

<table>table see original document page 102</column></row><table>

Biomarcador: MMP-7

Tabela 36: Sumário por grupo de idade para MMP-7

<table>table see original document page 102</column></row><table><table>table see original document page 103</column></row><table>

Tabelav 37: Sumário por Grupo de patologia/substânciainterferente para MMP-7

<table>table see original document page 103</column></row><table>

Tabela 38: Sumário por grupo de estágio de câncer paraMMP-7

<table>table see original document page 104</column></row><table>

Biomarcador: PLAU-R

Tabela 39: Sumário por grupo de idade para PLAU-R

<table>table see original document page 104</column></row><table>

Tabela 40: Sumário por Grupo de patologia/substânciainterferente para PLAU-R 10

Tabela 41: Sumário por grupo de estágio de câncer para

<table>table see original document page 105</column></row><table><table>table see original document page 106</column></row><table>

Biomarcador: Prolactina

Tabela 42: Sumário por grupo de idade para Prolactina

<table>table see original document page 106</column></row><table>

Tabela 43: Sumário por Grupo de patologia/substânciainterferente para Prolactina

<table>table see original document page 106</column></row><table><table>table see original document page 107</column></row><table>

Tabela 44: Sumário por grupo de estágio de câncer paraProlactina

<table>table see original document page 107</column></row><table><table>table see original document page 108</column></row><table>

Biomarcador: CAl25 (Lab Corp data)

Tabela 45: Sumário por grupo de idade para CA12 5 (LabCorpData)

<table>table see original document page 108</column></row><table>

Tabela 46: Sumário por Grupo de patologia/substânciainterferente para CA12 5 (LabCorp data)

<table>table see original document page 108</column></row><table><table>table see original document page 109</column></row><table>

Tabela 47: Sumário por grupo de estágio de câncer para CA125 (LabCorp data)

<table>table see original document page 109</column></row><table>

Os sumários da sensibilidade de treze biomarcadoresanalisados são apresentados nas Tabelas 48-50, com base emestágio de tumor, limites de desvio padrão-2 normais, ou"melhor ajuste", respectivamente.

Tabela 48: Sumário de sensibilidade de marcador individualpor estágio de tumor (com base no melhor corte)

<table>table see original document page 110</column></row><table>

Tabela 49: Sumário de sensibilidade de marcador Individual(baseado em limite Normal 2SP)

<table>table see original document page 110</column></row><table><table>table see original document page 111</column></row><table>

Tabela 50: Sumário de sensibilidade de marcador Individual(baseado no melhor corte)

<table>table see original document page 111</column></row><table>

Exemplo 3: Estudo de seleção de biomarcador de ovário -análise de biomarcadores múltiplos

O método de regressão logística foi utilizado paraseleção de biomarcadores ótimos para esse estudo.

Utilizando regressão logística, a seleção escalonada iniciadescobrindo o biomarcador que produz o maior valorquadrado-R com a variável dependente. A seguir, dado que o"melhor" biomarcador está no modelo, a regressão logísticaverifica o melhor biomarcador seguinte em termos de adiçãoao quadrado-R. Esse processo de descobrir um conjunto debiomarcadores que adiciona ao quadrado-R é parado quandobiomarcadores não mais podem adicionar ao quadrado-R, deacordo com certos critérios estatísticos. Esses conjuntosde biomarcadores não são exclusivos porque alguns dosbiomarcadores têm o mesmo desempenho predizível.

Com base em um modelo selecionado, um gráfico ROCpode ser produzido, o qual provê a relação entre as taxasde sensibilidade e especificidade. Portanto, umaespecificidade e sensibilidade apropriadas podem serescolhidas para se obter um PPV esperado com sensibilidadeaceita.

As Tabelas 51 e 52 fornecem vários exemplos queenvolvem a seleção de um conjunto de biomarcadores com umaespecificidade mais elevada e uma sensibilidade apropriadacom um PPV de aproximadamente 10% e uma taxa desensibilidade combinada em torno de 70% - 80% sob aassunção de que a população é de 8.000.000 e a prevalênciadoença é 0,25%. Valores alvo diferentes parasensibilidade, especificidade, NPV e PPV podem ser obtidospor seleção de diferentes cortes de ensaio, diferentescombinações de biomarcador, e diferentes regras paracombinar os biomarcadores. 0 desempenho de biomarcador foianalisado utilizando os valores de biomarcador comovariáveis contínuas (Tabela 51) e como variáveiscategóricas (Tabela 52).

Como definição, quando duas etapas de ensaio sãoexecutadas, a primeira etapa de ensaio pode ser mencionadacomo o "teste de triagem" e a segunda etapa pode sermencionada como o "teste de reflexo." "Melhor ponto decorte" se refere ao valor obtido a partir do gráfico ROCpara um biomarcador específico que produz a melhorsensibilidade e especificidade. "Média+2*pad" se refere aonível de expressão média mais duas vezes o desvio padrão,com base em análise de amostras normais a partir depacientes que não apresentam câncer de ovário.<table>table see original document page 114</column></row><table><table>table see original document page 115</column></row><table><table>table see original document page 116</column></row><table><table>table see original document page 117</column></row><table><table>table see original document page 118</column></row><table>Resultados de sensibilidade, especificidade, PPV e_NPVobtidos com aplicação de "regras de teste"

No estudo atual, os biomarcadores HE4, CA125, PLAU-R,glicodelina, Muc-1, PAI-1, MMP-7, e inibina foram osmarcadores mais freqüentemente selecionados com base emdesempenho de marcador como variáveis continuas oucategóricas. Em contraste com os métodos estatísticosdescritos acima, a Tabela 53 fornece a sensibilidade,especificidade, PPV e NPV estimados (ajustados pelaprevalência da doença) com base em duas regras de teste:(1) se quaisquer dois dos biomarcadores acima forempositivos (isto é, superexpressos) , então o teste édeclarado positivo ou (2) se quaisquer 3 dos biomarcadoresacima forem positivos (isto é, superexpressos), o teste édeclarado positivo. Contrário aos resultados apresentadosacima nas Tabelas 51 e 52, no entanto, a aplicação dequalquer regra de teste não produziu uma taxa deespecificidade elevada, que por sua vez leva a um PPBinaceitavelmente baixo (<1,5%) quando ajustado para a taxade prevalência baixa de câncer do ovário. A aplicação de"regras de teste," como aquelas descritas aqui, érepresentativa do estado atual da técnica na identificaçãode pacientes com risco aumentado de câncer do ovário.Tabela 53: Sensibilidade, especificidade, PPV e NPVestimados ajustados por prevalência de doença com base em

Ex. Marcador selecionado e regra Desempenho* Sensibi- lidade Especifi- cidade PPV NPV<table>table see original document page 120</column></row><table><table>table see original document page 121</column></row><table>

* CAl25 corte >= 35 em quaisquer casos de melhor corte oumédia + 2pad

** considere a população = 8.000.000; prevalência = 0,25%,casos estimados de câncer = 20.000 na população.

Exemplo 4 : Estudo de seleção de biomarcador de ovário -Análise de múltiplos biomarcadores utilizando método detriagem de uma etapa

A expressão dos biomarcádores HE4, CA125glicodelina é combinações dos mesmos para todas aspacientes e a idade das pacientes sendo acima de 55 anos,foi avaliada utilizando um método de triagem de uma etapa,como descrito acima. Em particular, a Tabela 54 provê osresultados para um algoritmo de uma etapa para pacientesacima de 55 anos de idade. O algoritmo de teste se baseouem um modelo de regressão logística linear, e o valorefetivo de cada marcador foi utilizado no modelo. Modelosde regressão logística linear (e outros algoritmos) sãorotineiros e bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo,Fleiss (2003) Statistical Methods for rates and Proportions(3a ed.), que é aqui incorporado a título de referência naíntegra. 0 algoritmo ofereceu 76,8% de sensibilidade em96,4% de especificidade. Üm resultado de teste definidocomo positivo foi baseado no seguinte modelo de regressãologísticà linear: ln(P/(I-P))= -4,2391 + -0,0888*CA125 +0,1790*HE4 + 0,234 9*GLY, onde P é a probabilidadecondicional de câncer de ovário, CA125, HE4 e glicodelinasendo dados como superexpressos na amostra de sangue dapaciente. Um resultado similar foi obtido com CA125determinado utilizando o valor de corte recomendado defabricação de > 35 u/mL.

Tabela 54: Sensibilidade e especificidade de ensaio detriagem de etapa única para distinguir câncer de ovário(todos os estágios) a partir de controles ém pacientesacima de 55 anos de idade

<table>table see original document page 122</column></row><table>

Exemplo 5: Método de análise de auto-realizaçãoValidação de métodos de estudo

Um método de análise de auto-realização também foirealizado para assegurar uma estimativa robusta desensibilidade e especificidade para os estudos acima dadoque um conjunto de soros de câncer único e independente nãoestava disponível para validar o modelo. 0 método de auto-realização consistiu em criar artificialmente 1000conjuntos de dados aleatórios com seleção de substituição apartir do conjunto de amostra de estudo. Um conjunto dosmarcadores mais freqüentemente selecionados no estudo combase em desempenho ótimo foi selecionado: HE4, CA125, PLAU-R, glicodelina, MUCl e PAI-I. Um "teste" foi definido comoa seguir: o teste é positivo se (1) HE4 for positivo equalquer um entre CAÍ25, Glicodelina, MMP-7, PLAU-4 forpositivo ou (2) HE4 for negativo porém CA125, Glicodelina,MMP-7, PLAU-R forem todos positivos; de outro modo, o"teste" fé negativo. A partir das 1000 amostras aleatórias,o desvio padrão/médio e 95% de intervalo de confiança dasensibilidade/especificidade desse -teste definido foram,obtidos.

Tabela 55: Informações de seqüência de biomarcador

<table>table see original document page 123</column></row><table><table>table see original document page 124</column></row><table><table>table see original document page 125</column></row><table>

Todas as publicações e pedidos de patente mencionadosno relatório descritivo são indicativos do nível daquelesversados na técnica à qual a presente invenção se refere.

Todas as publicações e pedidos de patente são aquiincorporados a título de referência até o mesmo ponto comose cada publicação ou pedido de patente individual fosseespecífica e individualmente indicado como sendoincorporado a título de referência.

Embora a invenção acima tenha sido descrita em algumdetalhe como ilustração e exemplo para fins de clareza ecompreensão, será óbvio que certas alterações emodificações podem ser postas em prática compreendidas noescopo das modalidades apensas.

Claims (38)

1. Método de triagem para identificar pacientescom probabilidade aumentada de terem câncer de ovário, ométodo caracterizado por compreender:a) executar uma primeira etapa de ensaiocompreendendo detectar a expressão de um primeirobiomarcador ou primeiro painel de biomarcadores em umaamostra de sangue e determinar se o primeiro biomarcador ouo primeiro painel de biomarcadores é superexpresso; eb) executar uma segunda etapa de ensaio se oprimeiro biomarcador ou o primeiro painel de biomarcadoresfor determinado como sendo superexpresso na etapa (a) , asegunda etapa de ensaio compreendendo detectar a expressãode um segundo biomarcador ou um segundo painel debiomarcadores na amostra do corpo e determinar se o segundobiomarcador ou segundo painel de biomarcadores ésuperexpresso;em que a superexpressão de ambos os primeiro esegundo biomarcadores ou painéis de biomarcadores éindicativa de probabilidade aumentada da paciente tercâncer de ovário.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que as pacientes identificadascomo tendo probabilidade aumentada de terem câncer deovário são submetidas a teste de diagnóstico adicional paradeterminar se a paciente tem câncer de ovário, em que oteste de diagnóstico adicional é selecionado a partir dogrupo que consiste em exame pélvico, ultra-somtransvaginal, varredura CT, MRI, laparotomia, laparoscopia,e biópsia de amostra de tecido.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que as pacientes identificadascomo tendo probabilidade aumentada de terem câncer deovário que são determinadas como não tendo atualmentecâncer de ovário são adicionalmente monitoradas em uma baseregular em relação ao desenvolvimento de câncer de ovário.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o método é utilizado paradetectar câncer de ovário em estágio inicial.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que um nível de expressão limitepara cada biomarcador é determinado pela análise de umgráfico de Característica operacional de receptor (ROC)para cada biomarcador, em que um nível de expressão acimade um nível limite indica que um biomarcador específico ésuperexpresso.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que o nível de expressão limitepara cada biomarcador é determinado em relação ao nível deexpressão e uma população de pacientes normais.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que as pacientes classificadasde acordo com o método da reivindicação 1 sãoassintomáticas e têm histórico familiar de câncer de ovárioou fatores de risco clínico indicando alto risco dedesenvolver câncer ovário.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o método de triagem éexecutado em uma população de pacientes do sexo femininopós-menopausa.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a amostra do corpo é umaamostra de soro ou sangue.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a expressão dos primeiro esegundo biomarcadores ou painéis de biomarcadores édetectada no nível de proteína utilizando anticorpos.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que a expressão das primeira esegunda proteínas de biomarcador ou painéis de proteínas debiomarcador é detectada utilizando um formato ELISA ou umimunoensaio baseado em conta multíplex.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a expressão dos primeiro esegundo biomarcadores ou painéis de biomarcadores édetectada no nível de ácido nucléico utilizando RT-PCR.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que os biomarcadores sãoselecionados a partir do grupo que consiste em HE4, CA125,glicodelina, MMP-7, Muc-1, PAI-1, CTHRC1, inibina A, PLAU-R, prolactina, KLK-10, KLK-6, SLPI, e alfa-1 antitripsina.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que os biomarcadores sãoselecionados a partir do grupo que consiste em CA125, HE4,glicodelina, MMP-7, SLPI, PLAU-R, Muc-1, inibina A e PAI=I.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a sensibilidade da primeiraetapa de ensaio é pelo menos aproximadamente 85%, e em quea especificidade da primeira etapa de ensaio é pelo menos aproximadamente 7 5%.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a sensibilidade da segundaetapa de ensaio é pelo menos aproximadamente 8 0%, e em quea especificidade da segunda etapa de ensaio é pelo menosaproximadamente 8 5%.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a sensibilidade combinadadas primeira e segunda etapas de ensaio é pelo menosaproximadamente 70%, e em que a especificidade combinadados primeiro e segundo testes de triagem é pelo menosaproximadamente 95%.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o valor predizível negativo(NPV) do método de triagem combinado compreendendo asprimeira e segunda etapas de ensaio é pelo menosaproximadamente 99%.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o PPV é pelo menosaproximadamente 8%.

20. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o teste de triagem combinadocompreendendo a primeira e segunda etapa de ensaio tem umasensibilidade de pelo menos aproximadamente 90%, umaespecificidade de pelo menos aproximadamente 98%, um NPV depelo menos aproximadamente 99,9% e um PPV de pelo menosaproximadamente 10%.

21. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o biomarcador é HE4 e osegundo painel de biomarcadores é selecionado a partir dogrupo que consiste em um painel que compreende CA125,glicodelina, Muc-1, PAI-1, e PLAU-R7 um painelcompreendendo CAl25 e PAI-I, um painel compreendendo CA125,glicodelina, PAI-I e MMP-7, um painel compreendendo CA125,glicodelina, PAI-I, e PLAU-R, um painel compreendendoCAl25, glicodelina, PAI-1, e PLAU-4, um painelcompreendendo glicodelina, Muc-1, PLAU-R, e inibina A, umpainel compreendendo CA125, Muc-1, glicodelina, PAI-1, ePLAU-R e um painel compreendendo CA125, MMP-7, glicodelinae PLAU-R.

22. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o método de triagem éexecutado em um modo automatizado, semi-automatizado oumanual.

23. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a primeira e segunda etapade ensaio são executadas como um teste único ou como testesindividuais, em que a primeira etapa de ensaio compreendeum primeiro teste, e em que a segunda etapa de ensaiocompreende um segundo teste.

24. Método de triagem para identificar pacientescom probabilidade aumentada de terem câncer de ovário, ométodo caracterizado por compreender:a) detectar a expressão de uma pluralidade debiomarcadores em uma amostra de corpo; eb) aplicar um modelo matemático aos dados denível de expressão de biomarcador para identificarpacientes com probabilidade aumentada de terem câncer deovário.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que o modelo matemático éselecionado do grupo que consiste em um modelo de regressãoescalonada logística para seleção dos melhoresbiomarcadores e a curva de característica operacional derecepção (ROC) utilizada para seleção de um melhor ponto decorte para um biomarcador.

26. Método, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que o método é utilizado paradetectar câncer de ovário em estágio inicial.

27. Método, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que as pacientes classificadassão assintomáticas e têm histórico familiar de câncer deovário ou fatores de risco clínico indicando alto risco dedesenvolver câncer de ovário.

28. Método, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que o método de triagem éexecutado em uma população de pacientes do sexo femininopós-menopausa.

29. Método, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que a amostra do corpo é umaamostra de sangue ou soro.

30. Método, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que a pluralidade debiomarcadores é selecionada do grupo que consiste em HE4,CXAl2 5, glicodelina, MMP-7, Muc-1, PAI-1, CTHRCl, inibinaA, PLAU-R, prolactina, KLK-IO1 KLK-6, SLPI e alfa-1antitripsina.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado pelo fato de que a pluralidade debiomarcadores é selecionada do grupo que consiste em HE4,CAl25, e glicodelina.

32. Método de triagem de etapa única paraidentificar pacientes cora probabilidade aumentada de teremcâncer de ovário, o método caracterizado por compreenderdetectar a expressão de pelo menos três biomarcadoresselecionados do grupo que consiste em HE4, CA125,glicodelina, MMP-7, Muc-1, PAI-1, CTHRC1, inibina A, PALU-R, prolactina, KLK-IO, KLK-6, SLPI, e alfa-1 antitripsina,glicodelina, HE4 e CA125 em uma amostra de corpo, em que asuperexpressão de pelo menos um dos biomarcadores éindicativa da paciente ter probabilidade aumentada dapaciente ter câncer de ovário.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que a superexpressão de pelomenos um dos biomarcadores selecionados a partir do grupoque consiste em HE4, glicodelina e CA125 é indicativo daprobabilidade aumentada da paciente ter câncer de ovário.

34. Kit caracterizado por compreender umapluralidade de anticorpos, em que cada um dos anticorposliga-se especificamente a uma proteína de biomarcadordistinta que é seletivamente superexpressa em câncer deovário, em que as proteínas de biomarcador são selecionadasa partir do grupo que consiste em HE4, CA125, glicodelina,MMP-7, Muc-1, PAI-1, CTHRCl, inibina A, PLAU-R, prolactina,KLK-10, KLK-6, SLPI e alfa-1 antitripsina.

35. Kit, de acordo com a reivindicação 34,caracterizado pelo fato de que as proteínas de biomarcadorsão selecionadas do grupo que consiste em CA125, HE4,glicodelina, MMP-7, SLPI, PLAU-R, Muc-1, inibina A e PAI-I.

36. Kit, de acordo com a reivindicação 34,caracterizado pelo fato de que o kit compreende aindaprodutos químicos para a detecção de ligação de anticorpoàs proteínas de biomarcador.

37. Kit para executar o método de triagem, deacordo com a reivindicação 1, como um teste único,caracterizado pelo fato de que o teste compreende asprimeira e segunda etapas de ensaio.

38. Kit caracterizado por ser para executar aprimeira ou segunda etapa de ensaio do método de acordo coma reivindicação 1.