BRPI0707268A2 - purificação e uso de um fator para ajudar a cura de ferimento - Google Patents
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Abstract
PURIFICAçãO E USO DE UM FATOR PARA AJUDAR A CURA DE FERIMENTO Um processo para fabricação de uma composição contendo um fator purificado para ajudar a cura de ferimento selecionado entre o gurpo consistindo em Fator de Crescimento de Hepatócitos (HGF), Fator de Crescimento derivado de plaquetas (PDGF), Fator de Crescimento Epidérmico (EGF), Fator de Crescimento Transformante alfa (TGF-<244>), Fator de Crescimento Transformante beta (TGF-<225>), Fator de Crescimento semelhante à insulina (IGF-I) e Fator de Crescimento de Fibroblastos (FGF) de fontes, tais como sangue, contendo o fator para ajudar a cura de ferimento, em que o processo de fabricação compreende etapas de purificação as quais são rea-lizadas na presença de antitrombina III (AT-lII).
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PURIFICA-ÇÃO E USO DE UM FATOR PARA AJUDAR A CURA DE FERIMENTO".
A presente invenção refere-se a processos para a purificação euso de um fator derivado de plasma para ajudar a cura de ferimento. Aspec-tos particulares da invenção incluem purificação e métodos para proteger amolécula contra degradação tanto in vitro quanto in vivo.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
Entre outros, HGF é um fator para ajudar a cura de ferimento e éuma proteína expressa nas células mesenquimais tais como fibroblastos emacrófagos pulmonares, células de Kupffer no fígado, e leucócitos. HGF éuma citocina, a qual é secretada em lesão celular e parece ser importantepara a regeneração de alguns órgãos e para a cura de ferimentos. Quimica-mente HGF é uma glicoproteína, a qual primeiro é sintetizada como um pre-cursor nativo (inativo). O precursor é clivado para HGF ativo no órgão danifi-cado através de um ativador particular. HGF e outros fatores ligam à hepari-na, a qual parece ser importante para a ativação de HGF e a ligação a seureceptor. O receptor ligando a HGF é c-MET. Como o receptor c-MET so-mente é regulado para baixo em órgãos danificados, somente células nestesórgãos danificados é que parecem responder a uma interação HGF-receptor.
Exemplos de semelhantes fatores na família de fatores de crescimento tendoafinidades de ligação de heparina cujos fatores têm uma influência sobre oprocesso de cura de ferimentos, incluem entre outros Fator de crescimentoderivado de plaquetas (PDGF), Fator de crescimento epidérmico (EGF), Fa-tor de crescimento transformante alfa (TGF-α), Fator de crescimento trans-formante beta (TGF-β), Fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-I) eFator de crescimento de fibroblastos (FGF).
Antitrombina Ill (AT-III) é uma glicoproteína plasmática que inibeserina proteases na cascata de coagulação e, deste modo, desempenha umpapel importante na regulação da coagulação sangüínea. AT-III é um inibidordos Fatores IXa, Xa, XI, Xlla, e da trombina. Portanto, AT-III regula a forma-ção de coágulo em diferentes estágios da cascata de coagulação. Uma pe-quena redução do teor de AT-III no sangue está associada com aumento dorisco de tromboembolismo. Concentrados de AT-III são usados na profilaxiiae no tratamento de distúrbios tromboembólicos em pacientes com deficiênciade AT-III adquirida ou hereditária. Além disso, foi reportado que AT-III estáenvolvida em muitas outras reações biológicas, por exemplo, reações deangiogênese e inflamatórias. A função de AT-III nestes mecanismos aindanão está totamente entendida.
É conhecida na técnica a purificação de AT-III com cromatogra-fia por afinidade, usando heparina como o Iigante ligado de fase sólida. Mil-ler-Andersson et al. (Thrombosis Research 5, 439-452, 1974) descreve ouso de heparina-Sefarose para purificar AT-III humana. O procedimento in-teiro, o qual incluiu cromatografia de permuta tônica e de filtração por gel,proporcionou um rendimento de 34%.
Glicoproteína rica em histidina (HRGP) é uma proteína plasmáti-ca de cadeia única isolada originalmente em 1972. A função fisiológica exata15 da HRGP ainda é desconhecida. Devido à interação com heparina, fibrino-gênio e fibrina, plasminogênio e plaquetas ativadas, a HRGP é consideradaum modulador de coagulação e fibrinólise (Koide, T. In: Fibrinolysis: CurrentProspects. Gaffney, PJ (Ed.), John Libbey & Co., London 1988, p.55-63). Acadeia de polipeptídeo consiste em 507 resíduos aminoácidos e contém re-gioes que partilham homologia com outras proteínas plasmáticas, por exem-plo, AT-III (Koide, T. et al. (1986) Biochemistry 25, 2220-2225).
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
A forma ativa do fator para ajudar a cura de ferimento é rapida-mente degradada in vivo, especialmente na área de ferimentos a qual tenhainiciado o processo de coagulação e o sistema proteolítico incluindo protea-ses. Durante um processo de purificação, também é importante in vitro sercapaz de inibir a degradação tanto da forma nativa quanto da ativa do fatorpara ajudar a cura de ferimento. Sabe-se que um dos fatores, HGF, é trans-portado no sangue como um precursor inativo e deve ser ativado durantelesão por ativadores específicos. A título de exemplo, a forma inativa (desna-turada) de HGF pode ser detectada em pequenas quantidades em quasetodos os métodos de purificação testados, ao passo que a forma ativadae/ou não ativada somente foi encontrada usando os métodos da invenção.Surpreendentemente foi visto que a remoção de proteases e/ou precursor deproteases, em combinação com co-purificação de dois estabilizantes (AT-IIIe/ou HRGP) de HGF, resultou em forma de HGF enriquecia e ativada e/ounão ativada a qual facilmente age ou pode ser convertida em sua forma ati-va. Devido ao fato de que HGF normalmente circula em sua forma precurso-ra inativa in vivo, é evidente que um produto medicinal de HGF nativo e/ouum ativo pode melhorar significativamente o tratamento de uma série de dis-funções no corpo, especialmente onde é possível uma aplicação local, porexemplo, durante cura de ferimento. Isto também pode ser esperado paraoutros fatores de crescimento com propriedades de ligação de heparina co-mo, por exemplo, Fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), Fatorde crescimento epidérmico (EGF), Fator de crescimento transformante alfa(TGF-α), Fator de crescimento transformante beta (TGF-β), Fator de cresci-mento semelhante à insulina (IGF-I) e Fator de crescimento de fibroblastos(FGF) e também se espera que a purificação e uso destes fatores de cres-cimento sejam melhorados na presença de AT-III e HRGP.
Dependendo do uso, a forma ativada e/ou não ativada do fatorpara ajudar a cura de ferimento pode ser suprida com ou sem dois estabili-zantes específicos, AT-III e HRGP, o qual entre outros age comó um inibidorda degradação proteolítica da forma nativa e ativada do fator para ajudar acura de ferimento, portanto, aumentando a eficácia e a meia-vida do produto.Dependendo da aplicação, em alguns casos pode ser vantajoso suprir so-mente ou a forma ativada ou a não ativada do fator para ajudar a cura deferimento ao paciente e em outros casos pode ser vantajoso suprir uma mis-tura dos mesmos, incluindo a adição dos estabilizantes selecionados AT-III eHRGP. Isto é devido a quão rápido a molécula do fator para ajudar a cura deferimento deve agir. É óbvio que este princípio também é válido para outrosfatores de crescimento tendo propriedades de ligação de heparina os quaistem similaridades com HGF, por exemplo, Fator de crescimento derivado deplaquetas (PDGF), Fator de crescimento epidérmico (EGF), Fator de cresci-mento transformante alfa (TGF-α), Fator de crescimento transformante beta(TGF-β), Fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-I) e Fator de cres-cimento de fibroblastos (FGF).
A invenção diz respeito a um processo para fabricação de umfator purificado para ajudar a cura de ferimento contendo composição defontes contendo o fator para ajudar a cura de ferimento, tais como sangue,em que são realizadas etapas de purificação na presença de Antitrombina Ill(AT-III), glicoproteína rica em Histidina (HRGP) ou combinações das mes-mas. Os fatores para ajudar a cura de ferimento são selecionados entre ogrupo consistindo em Fator de crescimento de hepatócito (HGF) Fator decrescimento derivado de plaquetas (PDGF)1 Fator de crescimento epidérmi-co (EGF), Fator de crescimento transformante alfa (TGF-α), Fator de cresci-mento transformante beta (TGF-β), IGF-I e Fator de crescimento de fibro-blastos (FGF) de fontes, tais como sangue, contendo o fator para ajudar acura de ferimento, em que o processo de fabricação compreende etapas depurificação as quais são realizadas na presença de Antitrombina Ill (AT-III).
O processo da invenção pode ser realizado pelas seguintes eta-pas:
(i) descongelar sangue congelado, removendo eventualmenteum precipitado e processando adicionalmente um sobrenadante,
(ii) submeter o sobrenadante a um contato com um materialde cromatografia de permuta aniônica em uma solução tampão necessáriapara cromatografia de permuta aniônica, o tampão tendo concentrações sa-linas comparáveis com condições fisiológicas e um valor de pH em cerca deneutro, ao passo que a parte principal das proteínas é não ligada (incluindofatores para ajudar a cura de ferimento, AT-III, HRGP, albumina, IgG, Trans-ferina, Haptoglobulina etc.) e específica, proteínas e proteases ligam à resi-na aniônica (por exemplo, protrombina, FX, FIX etc.),
(iii) separar o material de cromatografia de permuta aniônicaobtendo uma solução (incluindo fatores para ajudar a cura de ferimento, AT-III, HRGP, albumina, IgG, Transferina, Haptoglobulina etc.),
(iv) contactar a solução com material de cromatografia por afi-nidade de heparina ao passo que a parte principal das proteínas são nãoligadas (albumina, IgG1 Transferina, Haptoglobulina etc.),
(v) separar a solução e tratar o material de cromatografia porafinidade de heparina com um tampão de dessorção tendo uma força iônicasuficiente para permitir dessorver o fator para ajudar a cura de ferimento domaterial de cromatografia por afinidade de heparina (opcionalmente tratandoo material de heparina sefarose com um tampão de lavagem antes da des-sorção da fração dos fatores para ajudar a cura de ferimento, a solução delavagem tendo uma força iônica aumentada suficiente para dessorver prote-ínas de impurezas (por exemplo, co-fator Il de heparina etc) mas não des-sorvendo a fração dos fatores para ajudar a cura de ferimento),
(vi) coletar o tampão de dessorção o qual contém o fator paraajudar a cura de ferimento, AT-III e HRGP.
Em uma segunda alternativa, o processo da invenção pode serrealizado empregando as seguintes etapas:
(i) descongelar plasma sangüíneo congelado, removendo op-cionalmente um precipitado e processando adicionalmente um sobrenadan-te;
(ii) adicionar um material de adsorção inorgânico, tal comoterra diatomácea, sílica gel, alumina e incubação por um tempo suficientepara ligar material indesejado, por exemplo, FXII e ativador de pré-calicreínae etc.,
(iii) adicionar álcool alifático inferior; tal como álcool C1-C4; pa-ra formar a Fração de Cohn I;
(iv) remover o precipitado, se houver, e o material de adsorçãoinorgânico;
(v) processar o sobrenadante da Fração de Cohn I através deum material de cromatografia por afinidade por meio do qual fator nativo/ativo para ajudar a cura de ferimento, AT-III e HRGP (fator nativo/ativo paraajudar a cura de ferimento, AT-III e HRGP são nas partes que se seguemreferidos como HAH) são ligados, ao passo que a parte principal de outrasproteínas plasmáticas (por exemplo, albumina, IgG, Transferina, Haptoglobu-Iina etc.) permanecem não ligadas e é removida;(vi) elutriar e coletar o material do fator para ajudar a cura deferimento contendo o material de cromatografia por afinidade (opcionalmentetratando a resina de afinidade com um tampão de lavagem antes da dessor-ção da fração dos fatores para ajudar a cura de ferimento, a solução de Ia-vagem tendo uma força iônica aumentada suficiente para dessorver proteí-nas de impurezas (por exemplo, co-fator Il de heparina e etc), mas não des-sorvendo a fração dos fatores para ajudar a cura de ferimento).
Em uma terceira alternativa, o processo da invenção pode serrealizado empregando as seguintes etapas:
(i) descongelar plasma sangüíneo congelado, removendo op-cionalmente um precipitado e processando adicionalmente um sobrenadante;
(ii) submeter o sobrenadante a um contato com um materialde cromatografia de permuta aniônica em uma solução tampão necessáriapara cromatografia de permuta aniônica, o tampão tendo concentrações sa-linas comparáveis com condições fisiológicas e um valor de pH em cerca deneutro, ao passo que a parte principal das proteínas é não-ligada (incluindoo fator para ajudar a cura de ferimento, AT-III, HRGP, albumina, IgG, Trans-ferina, Haptoglobulina e etc.) e específicas, proteínas e proteases ligam àresina aniônica (por exemplo, protrombina, FX, FIX etc.),
(iii) separar o material de cromatografia de permuta aniônicaobtendo uma solução (incluindo o fator para ajudar a cura de ferimento, AT-III, HRGP, albumina, IgG, Transferina, Haptoglobulina etc.),
(iv) adicionar um material de adsorção inorgânico, tal comoterra diatomácea, sílica gel, alumina e incubação por um tempo suficientepara ligar material indesejado, por exemplo, FXII e ativador de pré-calireínaetc.,
(v) adicionar álcool alifático inferior; tal como álcool C1-C4; pa-ra formar a Fração de Cohn I;
(vi) remover o precipitado, se houver, e o material de absorçãoinorgânico;
(vii) processar o sobrenadante da Fração de Cohn I através deum material de crorriatografia por afinidade por meio do qual fatores ativospara ajudar a cura de ferimento, AT-III e HRGP (HAH) são ligados, ao passoque a parte principal de outras proteínas plasmáticas (por exemplo, albumi-na, IgG, Transferina, Haptoglobulina e etc.) permanecem não ligadas e éremovida;
(viii) elutriar e coletar material contendo fatores para ajudar acura de ferimento do material de cromatografia por afinidade (opcionalmentetratando a resina de afinidade com um tampão de lavagem antes de dessor-ção da fração dos fatores para ajudar a cura de ferimento, a solução de Ia-vagem tendo uma força iônica aumentada suficiente para dessorver proteí-nas de impurezas mas não dessorvendo a fração dos fatores para ajudar acura de ferimento).
Em uma quarta alternativa, o processo da invenção pode serrealizado empregando as seguintes etapas:
(i) descongelar plasma sangüíneo congelado, removendo op-cionalmente um precipitado e processando adicionalmente um sobrenadan-te;
(ii) processar o sobrenadante através de um material de cro-matografia por afinidade por meio do qual fator ativo para ajudar a cura deferimento, AT-III e HRGP (HAH) são ligados, ao passo que a parte principalde outras proteínas plasmáticas (por exemplo, albumina, IgG, Transferina,Haptoglobulina etc.) permanece não ligada e é removidas;
(iii) elutriar e coletar o material do fator para ajudar a cura deferimento contendo do material de cromatografia por afinidade (opcionalmen-te tratando a resina de afinidade com um tampão de lavagem antes de des-sorção da fração do fator para ajudar a cura de ferimento, a solução de lava-gem tendo uma força iônica aumentada suficiente para dessorver proteínasde impurezas (por exemplo, co-fator Il de heparina etc.) mas não dessorven-do a fração dos fatores para ajudar a cura de ferimento).
Em uma modalidade particular da invenção, o processo compre-ende uma inativação viral em particular depois da etapa (vi). A inativaçãoviral neste estágio do processo é preferencialmente um tratamento com pro-dutos químicos os quais são capazes de inativar vírus. Semelhante inativa-ção viral é descrita em mais detalhes na EP-A-131740, o denominado pro-cesso solvente/detergente. A descrição da EP-A-131740 é incorporada pormeio de referência. Depois da etapa de inativação viral pode ser realizadauma cromatografia de permuta aniônica. Também é possível realizar umacromatografia de permuta catiônica, em particular depois da cromatografiade permuta aniônica. Em uma modalidade adicional do processo da inven-ção é realizada uma cromatografia sobre fosfato de celulose. Uma cromato-grafia sobre fosfato de celulose pode ser vantajosa porque é suficiente pararealizar somente esta cromatografia. No entanto, também pode ser vantajo-so empregar a cromatografia sobre fosfato de celulose junto com a cromato-grafia de permuta aniônica e/ou catiônica.
Tipicamente, a fração contendo HGF é empregada sobre a ma-triz de fosfato de celulose em um tampão o qual permite que HGF seja ad-sorvido sobre este material de fosfato de celulose. A elutriação do HGF éobtida tipicamente com tampões tendo uma força iônica de > 0,05 M de clo-reto de sódio ou equivalência da mesma.
De acordo com a invenção, as frações coletadas obtidas nasalternativas são concentradas e/ou diafiltradas para obter um concentrado. Oconcentrado opcionalmente pode ser adicionalmente processado contactan-do o concentrado com um material de permuta catiônica. O material de per-muta catiônica é tratado com um tampão tendo uma força iônica para elutriaruma fração A1 contendo predominantemente (> 90%) AT-III e tratando o ma-terial subseqüentemente com um tampão tendo maior força iônica para elu-triar predominantemente o fator para ajudar a cura de ferimento e HRGP oqual é coletado. A fração contendo fator para ajudar a cura de ferimento eHRGP é concentrada ou diafiltrada para obter uma fração A2.
Na segunda alternativa do processo da invenção em que umtampão de precipitação é adicionado ao concentrado, é realizada uma filtra-ção e o precipitado é tratado com um tampão para recuperação do fator paraajudar a cura de ferimento e AT-III.
A purificação adicional do concentrado de fatores para ajudar acura de ferimento nativos resultantes, usando uma resina de permuta catiô-nica em que o fator nativo para ajudar a cura de ferimento e HRGP liga àresina, pode ser realizada empregando no mínimo uma das seguintes etapas:
(i) a fração dos fatores para ajudar a cura de ferimento/HRGPé elutriada da resina de permuta cátiônica com um tampão tendo uma con-dutividade de 10 a 450 mS/cm em temperatura ambiente, mais preferencial20 a 200 mS/cm, o mais preferencial 30 a 100 mS/cm;
(ii) o pH durante a cromatografia é mantido entre 6 a 9, emparticular 6,5 a 8 ou 6,75 a 7,25;
(iii) os grupamentos carregados da resina são fixados à resinausando cadeias de carbono poliméricas ligeiramente hidrofóbicas consistin-do em a partir de cerca de 10 a cerca de 100 unidades monoméricas.
Em mais detalhes, as condições para a segunda alternativa depurificação do concentrado de fator para ajudar a cura de ferimento resultan-te, usando uma etapa de salgação pela qual HRGP é precipitado, compre-endem:
(i) é usado um sal de acordo com a série de Hofmeister, pre-ferencialmente selecionado entre o grupo consistindo em sulfato de sódio,fosfato de sódio, citrato de sódio, sulfato de amônio e combinações dosmesmos;
(ii) a concentração de sal sendo selecionada dentro da faixade 0,3 a 3 M, em particular de 0,5 a 2 M ou de 0,75 a 1,5 M;
(iii) o pH da solução sendo selecionado dentro da faixa de 4 a10, em particular de 6 a 9 ou de 7 a 8;
(iv) a precipitação resultante é removida por filtração ou centri-fugação.
De modo a proporcionar uma fração de fator para ajudar a curade ferimento aplicável comercialmente, o concentrado de fator nativo resul-tante para ajudar a cura de ferimento é tratado para reduzir patógenos com-preendendo no mínimo um dos seguintes métodos:
(i) inativação viral com uma solução detergente de solvente;(ii) inativação viral usando tratamento luminoso (por exemplo,UVC) ou radioativo;
(iii) inativação viral usando tratamento térmico;
(iv) remoção viral usando filtros virais.
A substância em questão da presente invenção também é umacomposição de substância obtenível de acordo com o processo da invenção,compreendendo a forma ativada e/ou não ativada do fator para ajudar a curade ferimento, a forma ativa do fator para ajudar a cura de ferimento ou com-binações das mesmas.
Em uma modalidade da invenção, a composição contém a formaativada e/ou não ativada do fator para ajudar a cura de ferimento e AT-IIIpara aumentar a estabilidade do fator para ajudar a cura de ferimento in vivoe in vitro. Em outra modalidade, a composição da invenção contém a formaativada e/ou não ativada do fator para ajudar a cura de ferimento e HRGP foiincluída para aumentar a estabilidade do fator nativo para ajudar a cura deferimento in vivo e in vitro. Em particular, o fator para ajudar a cura de feri-mento é ou totalmente ativado ou o fator para ajudar a cura de ferimento énão ativado.
Pode ser vantajoso adicionar estabilizantes selecionados entre o20 grupo consistindo em sacarídeos e aminoácidos às frações contendo o fatorde cura de ferimento e HRGP. Tipicamente, os estabilizantes podem ser po-liol, arginina, trealose, lisina, manitol ou combinações dos mesmos.
A substância em questão da invenção também é uma composi-ção farmacêutica compreendendo uma composição da invenção.
A composição farmacêutica da invenção pôde estar presente emuma forma ativada e/ou não ativada do fator para ajudar a cura de ferimentoou combinação das mesmas, a qual preferencialmente está em forma líquidaou seca por congelamento e tipicamente é aplciada localmente, misturadaem um gel, spray ou similar com um regime de dosagem aproximadamente entre 1 a 10 ng de fator para ajudar a cura de ferimento/cm2 de ferimen-to/dia. A composição também pode ser administrada potencialmente (de-pendendo da aplicação) usando um ou mais dos seguintes modos: por viaintravenosa, por via intramuscular, por via subcutânea, através de inalação,por via intratecal ou por via retal.
MÉTODOS EXPERIMENTAIS
Determinação quantitativa de AT-III
A atividade biológica (lU/ml) de AT-III foi determinada como ati-vidade de co-fator de heparina monitorando a clivagem do Substrato cromo-gênico H-D-Phe-Pip-Arg-pNA · 2 HCI (Chromogenix, Suécia) por trombinaem presença de heparina e AT-III. Vide Frantzen Handeland et al. (Scand. J.Haematol. 31,427-436, 1983) e van Voorhuizen et al. (Thromb. Haemostas.52(3), 350-353, 1984).Proteína Total
A concentração de proteína total foi determinada por mediçõesda absorção a 280 nm (A28o)- Concentração (mg/ml) para Soluções de AT-IIIfoi calculada usando o coeficiente de 6,4 lU/mg.
A atividade específica (SA) de AT-III foi definida como a propor-ção entre atividade de co-fator de heparina calculada como lU/ml e A 280.Determinação quantitativa de glicoproteína rica em histidina
HRGP foi quantificada usando técnica de eletroforese do tiporocket em que a altura do "rocket" é proporcional à concentração de antíge-no (Laurell, C-B, (1966) Analyt. Biochem. vol. 15, p. 45; e Laurell, C-B (1972)J. Clin. Lab. Invest. vol. 29, suppl. 124, p. 21). Anticorpos HRGP de coelho(Behringwerke) foram incluídos em um gel a 1% Agarose A (AmershamPharmacia Biotech). A amostra de HRGP (5 μΙ) foi aplicada ao gel, o qual foinm de um dia para o outro (150 V, 1 V/cm). O complexo antígeno-anticorporesultante foi corado e comparado com o Padrão (soro humano).Focalização isoelétrica
Foi realizada focalização isoelétrica usando o PhastSystem (A-mersham Pharmacia Biotech) com géis pré-moldados, pl 3-9, de acordo coma técnica de separação manual Phast arquivo Nq 100. (desenho incluso).Caracterização de HGF
Para confirmar a disponibilidade de HGF intacto com as múlti-plas funções características desta citocina, foi realizada análise Westernblot. Portanto, foi realizado um SDS-PAGE sob condições redutoras e nãoredutoras. As proteínas, transferidas eletroforeticamente para folhas de ni-trocelulose, foram incubadas com uma IgG de HGF anti-humana disponívelcomercialmente (R&D Systems, Inc.) e em seguida com um segundo anti-corpo conjugado disponível comercialmente (R&D Systems, Inc.), específicopara a primeira. Visualização do antígeno (proteína) foi feita por uma reaçãode cor.
Determinação quantitativa de HGF
Um ELISA de fase sólida disponível comercialmente (R&D Sys-tems, Inc.) que é planejado para medir os níveis de HGF em sobrenadantesde cultura celular, soro, e plasma foi usado para determinar valores de mas-sa relativos para HGF natural.
Um anticorpo monoclonal específico para HGF é pré-revestidosobre uma microlâmina. Padrões e amostras foram pipetados para dentrodas cavidades e qualquer HGF presente foi ligado pelo anticorpo imobiliza-do. Depois de lavar quaisquer substâncias não ligadas, um anticorpo policlo-nal ligado à enzima específico para HGF foi adicionado às cavidades. De-pois de uma lavagem para remover qualquer reagente de anticorpo-enzimanão ligado, uma solução de substrato foi adicionada às cavidades e se de-senvolveu cor em proporção à quantidade de HGF ligado na etapa inicial.Depois do desenvolvimento de cor ser parado, foi determinada a densidadeótica de cada cavidade usando uma leitora de microlâminas ajustada para450 nm.
Atividade biológica de HGF
A atividade biológica foi determinada usando testes disponíveiscomercialmente de cura de ferimento, migração, e proliferação. Vide B. Raf-ferty et al. (J. Immunol. Methods 258 (2001) 1-11).
EXEMPLOS
EXEMPLO 1:
Purificação de HGF nativo (ativo), estabilizado com AT-III eHRPG, de acordo com a invenção.
Etapa 1Plasma sangüíneo humano fresco reunido congelado de doado-res saudáveis (1.200 kg) foi descongelado a 0°C e o crioprecipitado resultan-te (compreendendo, por exemplo, fator Vlll e fibronectina) foi removido atra-vés de centrifugação. O precipitado é normalmente usado para purificaçãoadicional de FVIII.
Etapa 2
O criossobrenadante resultante (da etapa 1) foi processado atra-vés de uma coluna de permuta aniônica (70 litros DEAE-Sefarose FF, Amer-sham Pharmacia Biotech) para ligar proteínas dependentes de vitamina K(fator IX, fator X, fator II, Proteína C, Proteína S etc.). A coluna foi lavadacom um tampão contendo cloreto de sódio a 0,14 M e fosfato de sódio a5 mM pH 7.0. A fração de proteína não ligada (cerca de 1.270kg) foi adicio-nalmente processada para a etapa 3, ao passo que proteínas ligadas à colu-na foram adicionalmente processadas para purificar FIX, trombina etc.
Etapa 3
A fração de proteína não ligada da etapa 2, foi adicionalmenteprocessada por adição de etanol para uma concentração final de 8% (v/v)para obter precipitado da Fração de Cohn I, compreendendo, por exemplo,fibrinogênio e lipoproteínas (Cohn et al. (1946) J. Am. Chem. Soe. 68, 459-475). Antes da adição de etanol, 5,5 kg de material de terra diatomácea (Hy-flow Super cel) foram adicionados à solução. O precipitado e o material deterra diatomácea foram removidos por centrifugação.
Etapa 4
O sobrenadante da Fração de Cohn I (cerca de 1.400 kg) teve opH ajustado para pH 7,8 e depois disso foi processado através de uma colu-na de cromatografia por afinidade (120 litros heparina-Sefarose FF, Amer-sham Pharmacia Biotech) por meio da qual HGF nativo (ativo), AT-III eHRGP (HAH) ligaram, ao passo que a parte principal de outras proteínasplasmáticas (albumina, IgG etc.) passou através da coluna. A coluna foi Ia-vada com 600 kg de tampão (cloreto de sódio a 0,4 M e fosfato de sódio a0,01 M, pH 7,8) para remover formas inativas de proteínas, e a fração deHAH foi elutriada com 500 kg de tampão (NaCI a 2,3 M e fosfato de sódio a0,01 Μ, ρΗ 7,.8). O HAH-elutriado resultante foi concentrado e diafiltradocontra fosfato de sódio a 0,05 M, pH 7,5, usando uma membrana de ultrafil-tração (Biomax-10, Millipore). O HAH-concentrado diafiltrado obtido foi de-signado como UF1.
EXEMPLO 2:
Purificação de HGF nativo (ativado e/ou não ativado) estabiliza-do com AT-III e HRPG, de acordo com a invenção.
Etapa 1
Plasma sangüíneo humano fresco reunido congelado de doado-res saudáveis (1.200 kg) foi descongelado a O0C e o crioprecipitado resultan-te (compreendendo, por exemplo, fator Vlll e fibronectina) foi removido atra-vés de centrifugação. A precipitação é normalmente usada para purificaçãoadicional de FVIII.
Etapa 2
O criossobrenadante da etapa 1, foi adicionalmente processadopor adição de etanol para uma concentração final de 8% (v/v) para obterprecipitado da Fração de Cohn I, compreendendo, por exemplo, fibrinogênioe lipoproteínas (Cohn et al. (1946) J. Am. Chem. Soe. 68, 459-475). Antes daadição de etanol, 5,5 kg de material de terra diatomácea (Hyflow Super cel)foram adicionados à solução, a solução foi agitada por 1 a 2 horas. O preci-pitado e o material de terra diatomácea foram removidos por centrifugação.
Etapa 3
O sobrenadante da Fração de Cohn I (cerca de 1.400 kg) teve opH ajustado para pH 7,8 e depois disso foi processado através de uma colu-na de cromatografia por afinidade (120 litros heparina-Sefarose FF, Amer-sham Pharmacia Biotech) por meio do qual HGF nativo (ativo), AT-III eHRGP (HAH) ligaram, ao passo que a parte principal de outras proteínasplasmáticas (albumina, IgG etc.) passou através da coluna. A coluna foi la-vada com 600 kg de tampão (cloreto de sódio a 0,4 M e fosfato de sódio a0,01 M, pH 7,8) para remover formas inativas de proteínas, e a fração deHAH foi elutriada com 500 kg dê tampão (NaCI a 2,3 M e fosfato de sódio a0,01 M, pH 7,8). O HAH elutriado resultante foi concentrado e diafiltrado con-tra fosfato de sódio a 0,05 M, pH 7,5, usando uma membrana de ultrafiltra-ção (Biomax-10, Millipore). O concentrado diafiltrado obtido foi designadocomoUFI.
EXEMPLO 3:
Purificação adicional de HGF nativo, para remover AT-IIIO processo foi realizado em temperatura ambiente (+22°C). Oconcentrado UF1 do exemplo 1 ou 2 (A28O= 23,6; Fig. 1, alameda 1) foi diluí-do 1+3 com água destilada. A solução diluída (2.050 g, condutividade de 2,6mS/cm) foi processada através de uma coluna (Pharmacia Biotech Biopro-cess Column, 15 cm de diâmetro) preenchida com meio de cromatografia depermuta catiônica (1,7 I) EMD S03-650 (M) Fractogel® equilibrado com citra-to de sódio a 10 mM, pH 7,5, 2,6 mS/cm. O índice de fluxo foi de 9 l/h.Quando a solução de proteína tinha sido carregada sobre a coluna, a colunafoi lavada com 7 volumes de tampão de equilibração. O material que nãoadsorveu à coluna foi misturado com a lavagem (14,6 kg, designada como"Fração A1"; Fig. 1, alameda 2). As proteínas mais fortemente adsorvidasforam elutriadas da coluna com 1,9 kg de tampão (NaCI a 1 M/citrato de só-dio a 10 mM, pH 7,5, condutividade de 106 mS/cm). O elutriado (1,9kg) foiconcentrado e diafiltrado contra a citrato de sódio a 0,1 M/1% de Sacarose, pH 7.0. A "A2" obtida continha HGF ativo e HRGP (Tabela I e Figura 1, ala-
meda 3).TABELA I
Separação das frações de AT-III e HGF/HRGP de acordo com a invenção
A280 Conteúdo de AT-III (%) HGF Nativo Presente HRGP (mg/ml)UF1 (HAH) 33 >80 + N.D.Fração Al (AT-III) 4,5 >95 - <0,01Fração A2 (HGF + HRGP) 16 <1 + 4.2
EXEMPLO 4:
Purificação adicional de HGF nativo, para remover HRGP
A 490 g de UF 1 (produzido de acordo com o exemplo 2) foi adi-cionado um tampão de precipitação compreendendo 532 g de tampão defosfato de sódio a 0,05 M pH 7,5, 372 g. de citrato de sódio e 237 g de su-crose. O tampão de precipitação foi adicionado à solução UF 1 durante 30minutos. Depois de agitar por 15 minutos, a precipitação foi removida usan-do um filtro de 0,45 a 0,2 μηι, o filtro foi laçado com o seguinte tampão pararecuperar HGF e AT-III: 1,617 g de citrato de sódio e 1,012 g de sucrose fo-ram dissolvidos em 4,400 g de fosfato de sódio a 0,05 M pH 7,5. O filtradoresultante foi denotado filtrado (vide a Tabela II).
TABELA II
Separação de AT-III e HGF de frações de HRGP de acordo com a invenção
<table>table see original document page 17</column></row><table>
Exemplo 5
De modo a investigar a importância de AT Ill e/ou HRGP para a recuperaçãoótima de HGF1 foi realizado o seguinte experimento:
A. A fração de fluxo contínuo de Heparina-Sefarose, conformerealizado de acordo com o exemplo 2 (etapas 1 a 3), foi usada para prepara-ção adicional. Esta fração destituída de HGF, AT-III ativo e HRGP, foi emseguida provida de HGF, mas não de AT-III ou HRGP. Depois de tratamentocom detergente de solvente (Octoxynol, TnBP), esta solução foi filtrada (filtrocom um tamanho de poro de 0,45 μιτι) e aplicada sobre uma coluna Q-Sefarose XL (resina de permuta aniônica). Depois de lavagem da colunacom uma solução de 20 mM de Tris/HCI, pH 7,0, a qual também serviu pararemover reagentes de SD1 proteínas ligadas foram elutriadas com um tam-pão de Tris/HCI, pH 7,0. contendo 0,2 M de NaCI. Este elutriado foi aplicadosobre uma coluna de Fractogel EMD SO3. Depois de uma etapa de lavagem,foi realizada elutriação com uma solução 10 mM de citrato de sódio, pH 5,5,e 1 M de NaCI.
Β. O procedimento de purificação foi realizado de modo idênticoao descrito em A, ao passo que AT -III purificado foi adicionado à soluçãoprovida de HGF.
Resultados:
Avaliação das diferentes frações obtidas dos procedimentos A eB mostraram que os rendimentos da etapa de ambas as cromatografias fo-ram significativamente maiores nos elutriados do procedimento B compara-dos com as cromatografias realizadas na ausência de AT-III, particularmenteda cromatografia Fractogel EMD SO3. Foi obtido um rendimento da etapa deHGF no mínimo o duplo do obtido na ausência de AT-III.
Notavelmente, na ausência de AT-III, HGF também foi detectadoem frações diferentes do elutriado, ao passo que não foi detectável HGF nasfrações de fluxo contínuo e lavagem da coluna do processo B, mas concen-trado no elutriado.
Em conclusão, estes resultados demonstram que a presença deAT-III ajuda significativamente o rendimento da etapa de HGF1 em particulartendo cromatografias de permuta aniônica e de permuta catiônica consagra-das realizadas aqui.Exemplo 6
O elutriado da coluna de Heparina-Sefarose e UF1 de acordocom o exemplo 2, isto é, contendo HGF, AT-III e HRGP, foi tratado com SDde acordo com o exemplo 5, filtrado (0,45 μητι) e aplicado sobre uma colunade fosfato de celulose, a qual foi lavada com tampão de fosfato a 1 mM, pH6,0. Elutriação de HGF foi realizada com NaCI a 1 M em tampão de fosfato.
Por esta cromatografia, a remoção de reagentes de SD e umapurificação adicional de HGF foi realizada com um rendimento da etapa doprocesso de mais de 50% de HGF comparado com a matéria-prima.
Claims (29)
1. Processo para fabricação de uma composição contendo umfator purificado para ajudar a cura de ferimento selecionado entre o grupoconsistindo em Fator de Crescimento de Hepatócito (HGF), fator de cresci-mento derivado de plaquetas (PDGF), Fator de crescimento epidérmico(EGF), Fator de crescimento transformante alfa (TGF-α), Fator de cresci-mento transformante beta (TGF-β), Fator de crescimento semelhante a insu-lina (IGF-I) e Fator de crescimento de fibroblastos (FGF) de fontes, tais comosangue, contendo o fator para ajudar a cura de ferimento, em que o proces-so de fabricação compreende etapas de purificação as quais são realizadasna presença de antitrombina Ill (AT-III).
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, compreendendoas etapas de:(i) descongelar sangue congelado, removendo eventualmenteum precipitado e processando adicionalmente um sobre-nadante,(ii) submeter o sobrenadante a um contato com um materialde cromatografia de permuta aniônica em uma soluçãotampão necessária para cromatografia de permuta aniôni-ca, o tampão tendo concentrações salinas comparáveiscom condições fisiológicas e um valor de pH em cerca deneutro,(iii) separar o material de cromatografia de permuta aniônicaobtendo uma solução,(iv) contactar a solução com material de cromatografia por afi-nidade de heparina,(v) separar a solução e tratar o material de cromatografia porafinidade de heparina com um tampão de dessorção tendouma força iônica suficiente para permitir dessorver o fatorpara ajudar a cura de ferimento do material de cromatogra-fia põr afinidade de heparina,(vi) coletar o tampão de dessorção o qual contém o fator paraajudar a cura de ferimento, AT-III e HRGP.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, compreendendoas etapas de:(i) descongelar plasma sangüíneo congelado, removendo op-cionalmente um precipitado e processando adicionalmenteum sobrenadante,(ii) adicionar um material de adsorção inorgânico, tal comoterra diatomácea, sílica gel, alumina e incubação por umtempo suficiente para ligar material indesejado,(iii) adicionar álcool alifático inferior; tal como CrC4 álcool; pa-ra formar Fração de Cohn I,(iv) remover o precipitado, se houver, e o material de adsorçãoinorgânico,(v) processar o sobrenadante da Fração de Cohn I através deum material de cromatografia por afinidade por meio doqual o fator para ajudar a cura de ferimento, AT-III e HRGP(HAH) são ligados, enquanto outras proteínas plasmáticaspermanecem não ligadas e são removidas,(vi) elutriar e coletar o fator para ajudar a cura de ferimento domaterial de cromatografia por afinidade.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, compreendendoas etapas de:(i) descongelar plasma sangüíneo congelado, removendo op-cionalmente um precipitado e processando adicionalmenteum sobrenadante;(ii) submeter o sobrenadante a um contato com um materialde cromatografia de permuta aniônica em uma soluçãotampão necessária para cromatografia de permuta aniôni-ca, o tampão tendo concentrações salinas comparáveiscom condições fisiológicas e um valor de pH em cerca deneutro, ao passo que a parte principal das proteínas sãonão ligadas (incluindo o fator para ajudar a cura de feri-mento, ΑΤ-ΙΙΙ, HRGΡ, albumina, IgG, Transferina1 Hapto-globulina etc.) e específicas, proteínas e proteases ligam àresina aniônica (por exemplo, protrombina, FX, FIX e etc.);(iii) separar o material de cromatografia de permuta aniônicaobtendo uma solução (incluindo o fator para ajudar a curade ferimento, AT-III, HRGP, albumina, IgG1 Transferina,Haptoglobulina etc.);(iv) adicionar um material de adsorção inorgânico, tal comoterra diatomácea, sílica gel, alumina e incubação por umtempo suficiente para ligar material indesejado, por exem-plo, FXII e ativador de pré-calicreína etc.;(v) adicionar álcool alifático inferior; tal como álcool CrC4; pa-ra formar a Fração de Cohn I;(vi) remover o precipitado, se houver, e o material de absorçãoinorgânico;(vii) processar o sobrenadante da Fração de Cohn I através deum material de cromatografia por afinidade por meio doqual o fator para ajudar a cura de ferimento, AT-III e HRGP(HAH) são ligados, ao passo que a parte principal de ou-tras proteínas plasmáticas (por exemplo, albumina, IgG,Transferina, Haptoglobulina e etc.) permanece não ligada esão removidas;(viii) elutriar e coletar o fator para ajudar a cura de ferimentocontendo material do material de cromatografia por afinida-de (opcionalmente tratando a resina de afinidade com umtampão de lavagem antes de dessorção da fração do fatorpara ajudar a cura de ferimento, a solução de lavagem ten-do uma força iônica alimentada suficiente para dessorverproteínas de impureza mas não dessorvendo a fração dofator para ajudar a cura de ferimento).
5. Processo de acordo com a reivindicação 1, compreendendoas etapas de:(i) descongelar plasma sangüíneo congelado, removendo op-cionalmente um precipitado e processando adicionalmenteum sobrenadante;(ii) processar o sobrenadante através de um material de cro-matografia por afinidade por meio do qual o fator para aju-dar a cura de ferimento, AT-III e HRGP (HAH) são ligados,ao passo que a parte principal de outras proteínas plasmá-ticas (por exemplo, albumina, IgG, Transferina1 Haptoglo-bulina etc.) permanece não ligada e são removidas;(iii) elutriar e coletar o fator para ajudar a cura de ferimentocontendo material do material de cromatografia por afinida-de (opcionalmente tratando a resina de afinidade com umtampão de lavagem antes de dessorção da fração do fatorpara ajudar a cura de ferimento, a solução de lavagem ten-do uma força iônica aumentada suficiente para dessorverproteínas de impureza (por exemplo, co-fator Il de heparinae etc) mas não dessorvendo a fração do fator para ajudar acura de ferimento).
6. Processo de acordo com as reivindicações 2 a 5, em que asfrações coletadas são concentradas e/ou diafiltradas para obter um concen-trado.
7. Processo de acordo qualquer uma das reivindicações 2 a 6,em que é realizada uma inativação viral em particular depois da etapa (vi).
8. Processo de acordo qualquer uma das reivindicações 2 a 7,em que depois da etapa inativação viral é realizada uma cromatografia depermuta aniônica.
9. Processo de acordo qualquer uma das reivindicações 2 a 8,em que é realizada uma cromatografia de permuta catiônica, em particulardepois da cromatografia de permuta aniônica.
10. Processo de acordo qualquer uma das reivindicações 2 a 9,em que é realizada uma cromatografia sobre fosfato de celulose.
11. Processo de acordo qualquer uma das reivindicações 2 a 10,em que é realizada uma nanoíiltração.
12. Processo de acordo qualquer uma das reivindicações 2 a 11,em que a fração da etapa (vi) da reivindicação 2 ou 3, da etapa (viii) da rei-vindicação 4 ou da etapa (iii) da reivindicação 5 é submetida a uma inativa-ção viral com químicos inativadores de vírus.
13. Processo de acordo com a reivindicação 12, em que a fraçãotratada com químicos inativadores de vírus é submetida a uma cromatografiade fosfato de celulose.
14. Processo de acordo com a reivindicação 12, em que a fraçãotratada com químicos inativadores de vírus é submetida a uma cromatografiade permuta aniônica seguida por uma cromatografia de permuta catiônica.
15. Processo de acordo com a reivindicação 8 ou 14, em que omaterial de permuta catiônica é tratado com um tampão tendo uma forçaiônica para elutriar uma fração A1 contendo predominantemente (>90%) AT-III e tratar subseqüentemente com um tampão tendo maior força iônica paraelutriar predominantemente o fator para ajudar a cura de ferimento e HRGPo qual é coletado.
16. Processo de acordo com a reivindicação 15, em que a fraçãocontendo fator para ajudar a cura de ferimento e HRGP é concentrada oudiafiltrada para obter uma fração A2.
17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, em que um tampão de precipitação é adicionado ao concen-trado, é realizada uma filtração e o precipitado é tratado com um tampãopara recuperação do fator para ajudar a cura de ferimento e AT-III.
18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o concentrado de fator para aju-dar a cura de ferimento resultante é tratado para reduzir patógenos compre-endendo no mínimo um dos seguintes métodos:(i) inativação viral com uma solução detergente de solvente;(ii) inativação viral usando tratamento luminoso (tal comoUVG) ou radioativo;(iii) inativação viral usando tratamento térmico;(iv) remoção viral usando filtros virais.
19. Processo de qualquer uma das reivindicações precedentes,caracterizado pelo fato de que o concentrado de fator para ajudar a cura deferimento resultante é adicionalmente purificado usando uma resina de per-muta catiônica, em que o fator para ajudar a cura de ferimento e HRGP ligaà resina compreendendo no mínimo uma das seguintes etapas:(i) a fração de fator para ajudar a cura de ferimento/HRGP éelutriada da resina de permuta catiônica com um tampão tendo uma conduti-vidade de 10 a 450 mS/cm em temperatura ambiente, mais preferencial 20 a200 mS/cm, o mais preferencial 30 a 100 mS/cm,(ii) opH durante a cromatografia é mantido entre 6 a 9, maispreferencial 6,5 a 8, o mais preferencial 6,75 a 7,25,(iii) os grupamentos carregados da resina são fixados à resinausando cadeias de carbono poliméricas ligeiramente hidrofóbicas consistin-do em a partir de cerca de 10 a cerca de 100 unidades monoméricas.
20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o concentrado de fator para aju-dar a cura de ferimento resultante é adicionalmente purificado usando umaetapa de salgação pela qual HRGP é precipitada, caracterizado pelo fato deque:(i) é usado um sal de acordo com a série de Hofmeister, pre-ferencialmente selecionado entre o grupo consistindo em sulfato de sódio,fosfato de sódio, citrato de sódio, sulfato de amônio e combinações dosmesmos;(ii) a concentração de sal sendo selecionada dentro da faixade 0,3 a 3 M, em particular de 0,5 a 2 M ou de 0,75 a 1,5 M;(iii) o pH da solução sendo selecionado dentro da faixa de 4 a10, em particular de 6 a 9 ou de 7 a 8;(iv) a precipitação resultante é removida por filtração ou centri-fugação.
21. Composição de substância obtenível como definida em qual-quer uma das reivindicações precedentes compreendendo a forma ativadae/ou não ativada do fator para ajudar a cura de ferimento ou uma combina-ção do mesmo.
22. Composição de acordo com a reivindicação 21, caracteriza-da pelo fato de que contém a forma ativada e/ou não ativada do fator paraajudar a cura de ferimento e AT-III para aumentar a estabilidade do fator pa-ra ajudar a cura de ferimento in vivo e in vitro.
23. Composição de acordo com a reivindicação 21 e/ou 22, ca-racterizada pelo fato de que contém a forma ativada e/ou não ativada do fa-tor para ajudar a cura de ferimento e HRGP foi incluída para aumentar a es-tabilidade do fator nativo para ajudar a cura de ferimento in vivo e in vitro.
24. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 21 a 23, em que adicionalmente estão presentes estabilizantes sele-cionados entre o grupo consistindo em poliol, sacarídeos e/ou aminoácidos.
25. Composição farmacêutica compreendendo uma composiçãode acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 24.
26. Composição farmacêutica da reivindicação 25 na qual a forma ativadae/ou não ativada do fator para ajudar a cura de ferimento está em forma lí-quida ou seca por congelamento e é aplicada com um gel ou um spray.
27. Preparação farmacêutica em que a composição como defini-da na reivindicação 26, está sob a forma de um gel, pomada ou spray.
28. Fração enriquecida com HRGP obtenível como definido nareivindicação 1 a 20.
29. Fração de acordo com a reivindicação 28, obtenível por umprocesso em que depois de um tratamento de afinidade com heparina e ina-tivação viral a mistura resultante é submetida a um tratamento com um ma-terial de fosfato de celulose.
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