JPS6045534A - 肝実質細胞増殖因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、肝実質細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ
ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　：　ＨＧＦ　）　、詳し
くは肝実質細胞を生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）で培養
でき、これにより該細胞の維持、増殖を可能とする新し
い生理活性を有する蛋白質に関する。

肝臓は、生体中で最も高度に分化の進んだ最大の原性器
官である。これは主に各種栄養素（糖質、蛋白質、脂質
、ビタミン、ホルモン等）の処理（代謝）、貯蔵、解毒
、分解、排泄等の重要な多種の機能を兼ね備えており、
なかでも生体内中間代謝の中心的役割を果たすことが知
られている。

また該肝臓の機能は、肝臓を構成する各肝実質細胞が夫
々担っていることが知られている。しかるに生体内（１
ｎｖｌｖｏ）において肝臓は各種のホルモンをはじめと
する極めて複雑な環境下におかれており、これを構成す
る上記肝実質細胞の機能等の研究は甚だ困難である。

従って本発明者は、上記肝実質細胞を、生体内と同等の
機能を維持した状態で、単純な生体外の系で再現するこ
とができれば、上記した肝機能の研究、あるいは種々の
ホルモン類、薬物等の肝実質細胞に対する作用等の研究
に極めて有用であるとの観点から、上記肝実質細胞を、
安定に継代培養できる生体外培養系の確立を目的として
鋭意研究を重ねてきた。

しかしながら、肝実質細胞は近年組織培養技術の急速な
発展に伴い、既に確立された各種の株細胞が活発に増殖
する哺乳動物血清の存在下でも、全く増殖が認められず
、通常約１週間で脱落が起り、その生体外長期継代培養
は不可能であった。

また本発明者らの研究によって、公知の各種株細胞の増
殖を支持する因子（ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）等、
例、ｔ　ハＩｔ　ｍ　芽ｍ胞増殖因子（ｆｉｂｒｏｂｌ
ａｓｔ　ａｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ　：　Ｆ　Ｇ　Ｆ　
、　Ｇ　ｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚｌｌ）　、、Ｊ　。

３　ｉｏｌ、ｃ　ｈｅｔ　２５０．２５１５　（１９７
５））、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ　−ｄ
ｅｒｉｖｅｄ　ｌ１ｌｒＯＷｔｈｆａｃｔｏｒ：　ＰＤ
ＧＦ、　Ｒｏｓｓ　、　Ｒ，、ｅｔ　ａｔ、Ｐ　ｒｏｃ
。

Ｎ　ａｔｌ、Ａ　ｃａｄ、ｓ　ｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　、、
　７二１，１２０７（１９７４））、’／ｖトメジン（
ｓｏｍａｔｏｍｅｄｔｎｅｓ　：Ｖａｎ　Ｗｙｋ、Ｊ、
Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｒｅｃ、ｐｒｏｇ。

Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅｓ、３０，２５９　（１９７４）
）、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ　１ｌｋｅ
　ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ：　ＩＧＦ、Ｒｌｎｄｅｒ
ｋｎｅｃｈｔ　、Ｅ、ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５３．　２７６９（１９
７８）、マルチプリケーション　ステイムレーティング
　アクティビティ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｔ
ｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ａｃＮｖｉｔｙ　：　Ｍ　３　Ａ
　、　Ｄ　ｕｌａｋ、　Ｎ　。

Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　、　Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ、　８１　。

１５３（１９７３））、トロンビン（ｔｈｒｏＩｌｌｂ
ｉｎ）、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　
）等は、いずれも上記肝実質細胞の増殖には、効果を奏
しえないことが確認された。僅かにインスリン（ｉｎｓ
ｕｌｉｎ　）及び表皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　
ｇｒｏｗｔｈ　ｒａｃｔｏｒ：ＥＧＦ、　Ｃａｒｐｅｎ
ｔｅｒ、　Ｑ、　ｅｔ　ａｌ、、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、４８，１９３　（１９７９））に、
肝実質細胞のＤＮＡ合成の促進活性が認められたが、こ
れ等もまたその利用により上記肝実質細胞の生体外継代
培養は困難であった。

しかるに本発明者らは引続く研究において、肝実質細胞
は、上記の通り血清自体の存在下では全く増殖し得ない
に拘らず、該血清中に含まれるある特定の蛋白成分の存
在下において生体外で極めて良好に増殖し、継代培養が
行ない得ることを見い出し、且つ該特定の血清成分の分
離に成功した。

本発明は上記知見に基づいて完成されたものである。

すなわち本発明は、哺乳動物血清に由来し、下記の理化
学的性質及び生理活性を有する蛋白質であることを特徴
とする肝実質細胞増殖因子（以下ｒｌ（ＧＦＪと呼ぶ）
に係る。

ａ）ゲル濾過法による推定分子量が約１５万である、 ｂ）１０ｍＭｊＪン酸緩衝液（１）Ｈ−７，０）ｒ平衡
化したＤＥＡＥ−セルロースに吸着し、０．２Ｍ塩化ナ
トリウムを含む同緩衝液にて溶離する、 ｃ　）　１０ＲＩ　Ｍ！Ｊ　＞Ｆｌｉｆｍ衝液（＋）Ｈ
＝７．０）ｒ平衡化したＣＭ−セルロースに吸着しない
、ｄ）１０１ＩＩＭリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ＝７．０）で
平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂに吸着し
、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む同Ｎ！ｉｉ液では溶出
じず、１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む同ａｌｌ！ｉ液に
て溶出する、 ｅ）肝実質細胞を生体外において増殖させる活性を有す
る。

本発明のＨＧＦは、哺乳動物の血清に由来し、上記特性
を有する点において特徴付けられる。従来哺乳動物Ｉｆ
ｉＩ消成分については種々研究されているが、該血清中
に上記肝実質細胞の増殖活性を有する因子が存在するこ
とは全（知られておらず、勿論かかる因子を血清より分
離した例も皆無であり、また血清より分離された既知の
成分は、上記活性を有するものではない。

本発明のＨＧＦの上記特性及びその他の性状に一ついて
は、後記実施例において詳述する。

本発明のＨＧＦの利用によれば、ヒトをはじめとして各
種動物由来の肝実質細胞を生体外で極めて容易に増殖、
維持することができる。かくして増殖、維持される肝実
質細胞は、例えば肝機能等の基礎的研究用に、また各種
ホルモン若しくは薬剤等の肝実質１１１ｗａに対する作
用の研究用に、肝疾患治療薬等のスクリーニング試験用
に、更に発癌試験用及び肝炎ウィルスの生体外培養にお
ける宿　□主細胞として、極めて有用である。本発明に
よればかかる有用な生理活性物質を提供できる。

以下、本発明のＨＧＦの製造方法につき詳述する。

本発明ＨＧＦは、哺乳動物血清より分離される。

ここで原料として用いられる哺乳動物血清としては、特
に限定はなく例えばヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、
ウサギ、マウス等に由来する血清をいずれも利用するこ
とができる。２等血清は、その起源とする哺乳動物の血
液より、常法に従い分離される。上記血清は未変性の新
鮮自消であるのが望ましい。殊に本発明に用いる血清は
、起源動物からの採血及び分離に当り、事前に２等動物
乃至血液に何等特別な処置等を行なわない通常の所謂正
常血清でよいが、ヒト以外の動物血清の場合は、肝部分
切除後の再生肝時の血清を使用するのがＨＧＦの収率の
面からより好ましいものである。

本発明ＨＧＦの製造は基本的には、この種血清等の生体
物質からの蛋白質の分離に利用される通常の方法と同様
にして、目的とするＨＧＦの物理的、化学的性質等を利
用した各種処理操作に従い実施することができる（例え
ば「生化学データブックＩ［Ｊ　Ｐｌ　１７５〜１２５
９、第１版第１刷、１９８０年６月２３日、株式会社東
京化学同人発行参照）。該方法としては具体的には例え
ば通常の蛋白沈澱剤による処理、限外濾過、分子ふるい
クロマトグラフィ＝（ゲル濾過）、遠心分離、電気泳動
、アフィニティークロマ１−グラフィー、透析法、これ
らの組み合せ等が挙げられる。一般には、血清を、分子
量１５万程度の蛋白質が分画範囲に含まれるゲル濾過剤
によるゲル濾過に付すことにより目的のＨＧＦが収得さ
れる。該ゲル濾過剤としては、特に限定はなく、例えば
、通常のデキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、
アガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガロースゲル
、セルロース等を素材とするものをいずれも使用するこ
ができる。これらの具体例としては例えば、セファデッ
クスＧタイプ、同ＬＨタイプ、セファ０−スタイプ、セ
ファクリルタイプ（以上、ファルマシア社）、セルロフ
ァイン（チッソ■）、バイオグルＰタイプ、同Ａタイプ
（バイオ−ラド社）、ウルトロゲルＡＣＡタイプ（ＬＫ
Ｂ社）、ＴＳＫ−Ｇタイプ（東洋曹達工業■）等の市販
品を例示することができる。上記グル濾過に際し、血清
は、特に必要ではないが、事前にこれを当該分子量両分
を含む蛋白成分に部分精製しておくこともできる。この
部分精製は、例えばアセトン、メタノール、エタノール
、プロパツール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の
蛋白沈澱剤を用いる処理、硫酸アンモニウム、硫酸ナト
リウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いる処理及び
／又は透析膜、平板膜、中空ｍａｎ等を用いる限外濾過
処理等により行なわれる。これら各処理の操作及び条件
は、通常のこの種方法のそれらと同様のものとすればよ
い。

かくして得られるＨＧＦは、原料血清中に存在している
にもかかわらず、血清中に共存する増殖阻害因子や細胞
毒性因子などのため該血清自体では、肝実質細胞増殖活
性は一般に弱く、これを上記の如く分画することにより
初めてその強い活性が得られるものであり、前記の理化
学的性質及び生理活性により特定される。

以下に実施例及び試験例を示し、本発明をより具体的に
述べるが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ ウィスター系雌性ラット（２００〜２５０ｇ）及びヒギ
ンスとアンダーリンの方法（Ｈ１ＱＱｉｎｓ。

Ｇ、　Ｉｙｌ、　ａｎｄ　Ａｎｄｅｒｓｏｎ　、　Ｒ、
Ｍ、　、　Ａｒｃｈ　。

Ｐａｔｈｏｆ、、　１２．１８６〜２０２　（１９３１
）　）に従い、２／３肝臓部分摘除術を行なった２日後
の同ラットのそれぞれの慶大動脈から採血し、血清を分
離した。

得られた各血清のそれぞれ３０曽をリン９Ｍ％食塩水（
ＰＢＳ）で１．５倍希釈し、同ＰＢＳで平衡化したセフ
ァデックス０２００カラム（ファルマシア社、４．４φ
Ｘ８５ｃｍ）によるゲルか過に付し、１５回づつのフラ
クションに分画した。

該セファデックスＧ２００によるゲル濾過時の吸光度（
八２８０ｎｍ）における分画パターンを第１図に示す。

該図において横軸はフラクションＮＯを、縦軸は吸光度
を示す。また図において（１）は正常ラット血清の場合
を、（２）は２／３肝臓部分摘除４８時間後の再生肝ラ
ットの場合をそれぞれ示す。更に第１図においては各フ
ラクションの分子量の目安として、以下の分子量マーカ
ー（ファルマシア社）の同ゲル濾過時の溶出位置をそれ
ぞれ矢印を付して示した。

ＩｆｌｌＧ・・・・分子量：　１５００００Ｈｂ・・・
・・・　〃　；　６４５００Ｃｙｔ、Ｃ−・　〃　：　
１３８００ 尚、ボイドボリウム（■０）は、ブルーデキストラン２
０００．ｌ−一タルボリウム（Ｖ【）は、ＤＮＰ−アラ
ニンをマーカーとして決定した。

上記ゲルか過により、ボイドに引続き溶出する第２番目
の蛋白のピーク画分（７ランシヨンＮ０４０〜５０）を
集め、これをアミコンダイアフロ膜ＰＭ３０　（アミコ
ン社）を用いて１５ｍＱｋ：濃縮して、各血清よりそれ
ぞれ本発明１−ＩＧＦを得た。

以下、正常血清より得たものをｒＨＧＦ−１Ｊ、再生肝
血清より得たものをｒｌ−ＩＧＦ−２Ｊと略記する。

実施例２ 健康成人より裸面した、凝固後の血清２０鵬を用いて、
上記実施例１と同様にして、フラクションＮｏ、４０〜
５０の両分を集め、同様に１５鵬に濃縮してヒト由来の
ＨＧＦを得た。以下これをｒＨＧＦ−３Ｊと略記する。

以下、上記実施例で得たＨＧＦの生理活性及び理化学的
性質を明らかにする試験例を挙げる。

試験例１　肝実質細胞増殖活性 （１）ウィスター系雄ラット（１８０〜２００す）を用
い、コラゲナーゼ還流法（Ｔａｎａｋａ　、　Ｋ、　ｅ
ｔａｌ、、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、（Ｔｏｋｙｏ）　、
　８４．９３７〜９４６　（１９７Ｂ））により肝実質
細胞を分離、調製した。この肝実質細胞を５％牛ｌ１ｉ
１清及び１０−８Ｍインスリンを添加したウィリアムス
Ｅ培地（）Ｏ−ラボラトリ−社）に懸濁し、１２ウェル
−マルチプレート（リンプロ社）に３．３×１０４個／
Ｃｌ１１２の低濃度でまき込み、５％炭酸ガス及び３０
％酸素ガスの存在下で培養した。培養４時間後、培地を
５％牛血清及び５Ｘ１０−’Ｍデキサメサゾンを含むウ
ィリアムスＥ培地に変換し、同時に所定量の被検試料（
本発明ＨＧＦ又は他の各種増殖因子）を添加した。２０
時間後、更に同一の培地交換及び試料の添加を行なった
。

２２時間後、３Ｈ−チミジンの１．２５μＣｉ／四（０
，４μＣｉ／μｍｏｌ　）を添加し、４時間培養した。

尚、上記３Ｈ−チミジンによるラベルの１５分前にハイ
ドロキシウレア（２５ｍＭ）を添加した群をコント０−
ル群とした。上記４時間の培養によるラベル後、細胞を
ＰＢＳで洗い、冷１０％トリクロル酢酸（ＴＣＡ）水溶
液で固定した。細胞を１ウェル当り０．５ｍＱの１Ｎ水
酸化ナトリウム水溶液によって可溶化し、一部を取って
蛋白量をＯ−り一法に従って測定した。残液にＴＣＡを
２０％となるように添加し、ＴＣＡ不溶性画分を遠心沈
澱により集め、５％ＴＣＡ水溶液で洗浄後、１０％ＴＣ
Ａ水溶液１ｍ１ｌｉを加え、９０℃、１５分間煮沸し、
上清画分の放射能をトルエン−エタノール系シンチレー
タ−により測定した。

被検試料により肝実質ｌｌｌ胞ＤＮへに取り込まれた３
日−チミジン量をコントロールとのカウントの差として
め、これを肝実ＩＨＩＩ］ｆｆ２１１ｍｇ蛋白最及び１
時間当りに算出してＤＮＡ合成活性（ｄａｗｎ／ａ＋ｇ
蛋白、’ｈｒ）とし、これを被検試料の肝実質細胞増殖
活性の指標とした。

尚、上記試験は以下の被検試料のそれぞれを用いて２回
（試験■及び試験■）に分けて行なった。

〈試験工〉 ■トロンビン：（シグマ社） ■ＦＧＦ　：　（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　ＲＧＳ
、Ｉｎｃ、　）■ＨＧＦ−１；実施例１で得たもの ■ＨＧＦ−２：　〃　１ ■１−（ＧＦ−３：　〃　２ 〈試験■〉 ■ＰＤＧＦ　；　（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ
ｓ、Ｉｎｃ、）■インスリン（Ｉｎｓ、；（シグマ社）
■Ｉ　ｎｓ＋　Ｅ　Ｇ　Ｆ　：　（Ｃｏ１１ａｂｏｒａ
ｔｉｖｅ　Ｒｅｓ。

Ｉｎｃ、） 各試験結果を下記第１表に示す。尚表中被検試料の使用
最は試験系の最終濃度にて表示した。

第１表 被検試料　ＤＮＡ合成活性 使用ｆｆｉ　（ｄｐＨ／ＩＩＩ＋＋蛋白／ｈｒ）〈試験
■） ■トロンビン　ＩＵ／１１１１２　６１４０．５Ｕ／ｍ
Ｑ　３１５ ０．１Ｕ／ＩＲＱ　５０６ ■ＦＧＦ　２０ｎｏ／ｍＱ　９９８ １０ｎｏ／ｍＱ　２５８ ２０ｇ／鶴　４０５ 被検試料　ＤＮＡ合成活性 使用ｆｉ　（ｄｐｍ／ｍ＜＋蛋白／ｌ＋ｒ）■ＨＧＦ−
１１ｍｏ蛋白ｆｆｉ／＋ｎＱ　６０８９（１０Ｖ／Ｖ％
血清相当） ２ｍｏ蛋白量／鶴　１２０３６ （２０Ｖ／Ｖ％而清相当） ■ＨＧ　Ｆ　−２１ｒａａ蛋白ｆｆｉ／ｍ１２　１１０
７１（ＩＯＶ／Ｖ％血清相当） ２ｕ蛋白伶／噌　２１８８４ （２０Ｖ／Ｖ％血清相当） ■ＨＧＦ−３１，０５ｎｏ＋蛋白量／ｍ９２２８２（１
０Ｖ／Ｖ％血清相当） ２．１ｍｇ蛋白ｍ／ＭＵ　３０５７ （２０Ｖ／Ｖ％血清相当） −（無添加）　−９９９ 〈試験■〉 ■ＰＤＧＦ　２．５Ｕ／四　７８１ １Ｕ／鵬　９８７ ０．２５Ｕ／ｍＱ　８９３ ■Ｉｎｓ　１０−７Ｍ　１２７゜ 被検試ＦＩ　ＤＮＡ合成活性 使用壷　（ｄｕ＋　／ｍｇ蛋白／ｈ「）■Ｉｎｓ＋　１
０−’Ｍ ＥＧＦ　２０ｎｇ／１Ｉｌｉ２　３７３８−（無添加）
　７３３ 上記第１表より、現在入手可能であり物性の明確な増殖
因子においては、いずれも肝実質細胞のＤＮＡ合成促進
活性は検出し得ない。これに対し本発明のＨＧＦには、
強力な肝実質細胞ＤＮＡ合成促進活性が認められ、例え
ばＨＧＦ−２を元の血清の２０％に相当する用量で使用
した場合は、対照（無添加）の約２２倍ものＤＮＡ合成
活性が得られ、これはインスリン及びＥＧＦ併用での最
大ＤＮＡ合成活性と比較しても約５．８倍の高値である
。この濃度で起るＤＮＡ合成活性は、全肝細胞数の８０
〜９０％の細胞がＤＮＡ合成を開始した時の値に相当し
、事実、３Ｈ−チミジンでラベルされる検数（％ｌａｂ
ｅｌｌｉｎｇ　ｎｕｃｌｅｉ）の測定によりこのことを
確認している。また、ＨＧＦ−１はＨＧＦ−２の約５５
％のＤＮＦ合成活性を示し、このことは、肝部分切除に
より血清中のＨＧＦ活性が約２倍に増加することを示唆
している。

（２）前記実施例１で得たＨＧＦ−２を用いて、上記（
１）と同様にしてＤＮＡ合成活性をめ、容量依存曲線を
作成した。結果を第２図に示す。

第２図において縦軸はＤＮＡ合成活性（ｄｐｌＩｌ／ｍ
。

蛋白／ｈｒｘ１０−３）を、横軸はＨＧＦ−２の添加量
を試験系の最終濃度（ＩＩ１ｇ蛋白量／鵬）で示した。

また図中各マークは以下の通りである。

（１）・・・・ＨＧＦ−２単独使用 （２）　・−・・ＨＧＦ−２＋Ｉｎ５１０−　’　Ｍ（
３）　・・−・１−ＩＧＦ−２＋ＥＧＦ２０ｎａ／ｍＱ
試験例２　１−ＩＧＦのイオン交換体に対する親和性試
験 ＨＧＦ−２を用い、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ＞
及びカルボキシメチル（ＣＭ＞のイオン交換体に対する
親和性を検討した。即ち、ＨＧＦ−２の２．５１１０　
（１４，２１１ｇ蛋白！／ｍＱ　）を、１０＋＋Ｍリン
酸緩衝液（ｐ　Ｈ＝７．０）でそれぞれ平衡化したＤＥ
ＡＥ−セルロース（ワットマン社）又はＣＭ−セルロー
ス（ワットマン社）のカラム（１φｘ５ｃ＋ｎ）に付し
、同緩衝液で洗浄（バイパス画分）後、０．２Ｍ塩化ナ
トリウムを含む同緩衝液、次いで０．５Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む同緩衝液にて溶出した（流速２２ｗ＋Ｑ／ｈｒ
）。

溶出されてきた全蛋白量を下記第２表に示す。

第　２　表 ＤＥＡＥ　ＣＭ （ｍｕ蛋白）（［ｌ１ｇ蛋白） バイパス画分　５．３９　３２．７ ０．２Ｍ　Ｎａ　Ｃ１２９，７２，６３溶出画分 ０．５Ｍ　ＮａＣｌ　Ｏ，０４０，１６溶出画分 上記第２表の各両分を、それぞれ、アミコンダイＶフロ
膜ＰＭ−１０（アミコン社）を用いて２、５１１１Ｑに
濃縮し、前記試験例１−＜１）と同様にして、そのＤＮ
Ａ合成活性を測定した。

結果を下記第３表に示す。

第３表 ※　尚各使用量は、いずれも、１０Ｖ／Ｖ％血清に相当
する。

第３表より、本発明１−Ｉ　Ｇ　Ｆは、中性でＤＥＡＥ
に吸着し、０．２Ｍ　Ｎａ　Ｃｌで溶離されることから
等電点が５〜６の酸性蛋白賀であると推定される。

試験例３　８ＧＦの安定性試験 ＨＧＦ−’２の１ａ［（１３，３ｕ蛋白長／綬）をそれ
ぞれ用いて、以下の各処理後、そのＤＮＡ合成活性を、
前記試験例１−（１）と同様にして測定し、活性の安定
性を試験した。

■　酢酸処理；酢酸を１Ｎとなるように加え、室温に１
２時間放置後、ＰＢＳで透析し、遠沈後（１０５０００
ｘり、３０分）その上清（７，２３ｉｏ蛋白量／ｍＱ）
を採取し、これを試験に供した。

■　＠酸処理：＊ｍを１％となるように加え、４℃に、
１２時間放置後、ＰＢＳで透析し、遠沈後（１０５００
０ＸＩＪ　、３０分）その上清（９，３５ｕ蛋白量／舖
）を採取し、これを試験に供した。

■　熱処理；イ〉５５℃、３０分の熱処理後、沈澱物が
認められず、これをその まま試験に供した。

口）１００℃、９０秒の熱処理優遠 沈（１０５０００ｘａ　、３０分） し、その上清（１１，７１１１（ｌ蛋白量／ｍＱ）を採
取し、これを試験 に供した。

■　トリプシン処理：）−ＩＧＦ−２にトリプシン２１
１１Ｇ（シグマ社Ｎ０Ｔ−８２５，２０ＢＡＥＥ単位）
を加え、３７℃、２時間インキュベート後、トリプシン
インヒビター４＋ｇ（シグマ社Ｎ０Ｔ−９３７８、イン
ヒビター活性として６４単位）を加えて反応を停止し、
これを試験に供した。

結果を第４表に示す。

第４表 ※　尚各使用量は、いずれも、１０Ｖ／Ｖ％血清に相当
する。

第４表より本発明のＨＧＦは、酸及び熱に不安定な蛋白
性増殖因子であることが判る。強力な肝実質細胞増殖活
性を有し、このような性質を示す増殖因子は、従来全く
例をみない。

試験例４（紫外・可視部吸収スペクトル）ＬＪＶ２５０
　（島津製作所）を使用シ、ＨＧＦ−２（０，８３１Ｂ
蛋白量／舖）の紫外・可視部吸収を測定した。その結果
を第３図に示す。該図において、２７８ｎｍの主ピーク
は、芳香族アミノ酸による蛋白質の典型的な吸収スペク
トラムである。

４２０ｎｍの可視部のピークは、ヘムタンパクのソーレ
ー帯であり、ＨＧＦ−２が薄い褐赤色を呈しているのも
この吸収にもとづき、これは、ＨＧＦ−２中に混在せる
ヘムタンパクによると考えられる。

試験例５　１−ＩＧＦのヘパリンに対する親和性試験Ｈ
ＧＦ−２を用いヘパリン−セファロースＣＬ−〇Ｂに対
する親和性とこれによる精製の可能性について検討した
。

すなわち、ＨＧＦ−２の４ＷｆＩ（１２，６＋ｎｏ蛋白
量／−）を、１０１１Ｍリン酸緩衝液（ａｔ−１＝７．
０）で平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ　
（ファルマシア社）のカラムく１φ×５ｃ＋ａ）ら付し
、同１１１ｉｉ液で洗浄後、１５ｍ１２／ｈｒの流速で
０．５Ｍ塩化ナトリウムまでの勾配溶出を行ない、各１
．９１１Ｑのフラクションに分取した。

続いて０．５Ｍ塩化ナトリウムまでに溶出されない蛋白
質を１．５Ｍ塩化ナトリウムで溶出し、同様に分画した
。分画パターンを第４図に示す。第４図において、縦軸
は、２８０　ｎｍにおける吸光度（←−１）及び電導度
（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）　（−−−−）を、横軸
はフラクションＮｏ、を示す。

得られた全フラクションを画分■（フラクションＮ００
２〜１２）、画分■（フラクションＮＯ。

１３〜２０）、画分■（フラクションＮｏ、２１〜３０
）、画分■（フラクションＮ０．３１〜４０）及び画分
Ｖ（フラクションＮｏ、４１〜５０）に分け、それぞれ
の両分をアミコンダイヤ７０膜ＰＭ−１０を用いて４ｍ
１２に濃縮し、ＰＢＳで透析後、各両分のＤＮＡ合成活
性を、前記試設例１−（１）と同様にして測定した。結
果を下記第５表に示す。

第５表 ※　尚各使用量は、いずれも、ＩＯＶ／Ｖ％血清に相当
する。

第５表より、本発明のＨＧＦは、ヘパリン−セファロー
スＣＬ−６Ｂに強く吸着し、０．５Ｍ塩化ナトリウムで
は溶出されず、１．５Ｍ塩化す１〜リウムにて溶出され
ることが判る。このことから、多くの血液凝固系の蛋白
質と同様に、ＨＧＦはヘパリンに強い親和性を示す蛋白
質であることが確認される。また、ヘパリン−セファロ
ースＣＬ　−６Ｂによる肝性異性アフィニティークロマ
１−グラフィーにより、）ＩＧＦ−２は約６６倍に精製
され、１９μｇ蛋白量／或の用量で強い肝実質細胞増殖
活性が認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１に従うセファデックスＧ−２００によ
るゲル濾過時の分画パターンを示す図であり、第２図は
実施例１で得た本発明肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ−２
）の肝実質細胞増殖活性（ＤＮＡ合成活性）を示すグラ
フであり、第３図は同ＨＧＦ−２の紫外・可視部吸収ス
ペクトル分析図であり、第４図は同ＨＧＦ−２のヘパリ
ン−セファロース０Ｌ−６Ｂに対する親和性試験の結果
を示すグラフである。 （以　上） とで了＼ ′、）１ 代理人　弁理士　三　枝　英　二　１１．。 第１図 フフクショじＮｏ。 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■　哺乳動物自消に由来し、下記の理化学的性質及び生
   理活性を有する蛋白質であることを特徴とする肝実質細
   胞増殖因子。 ａ）ゲル濾過法による推定分子量が約１５万である、 ｂ）１０１１１Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ＝７．０）で平
   衡化したＤＥＡＥ−セルロースに吸着し、０．２Ｍ塩化
   ナトリウムを含む同緩衝液にて溶出する、 ｃ）１０ｍＭリン酸緩Ｉ酸液（ａ　ｌ−１＝７．０）で
   平衡化したＣＭ−セルロースに吸着しない、ｄ）１０Ｉ
   ＩＩＭリン酸緩衝液（ｔ＋　Ｈ＝７．０）で平衡化した
   ヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂに吸着し、０．５Ｍ
   塩化ナトリウムを含む同緩衝液では溶出せず、１．５Ｍ
   塩化ナトリウムを含む同！！ｌｆｉ液にて溶出する、ｅ
   ）肝実質細胞を生体外において増殖させる活性を有する
   。