BRPI0707480A2 - usos de um anticorpo monoclonal, um fragmento e/ou anticorpo geneticamente engenheirado ou humanizado, de uma seqüência de nucleotìdeos e de um vetor, produto, e, método para triar compostos - Google Patents

Abstract

USOS DE UM ANTICORPO MONOCLONAL, UM FRAGMENTO E/OU ANTICORPO GENETICAMENTE ENGENHEIRADO OU HUMANIZADO, DE UMA SEQUêNCIA DE NUCLEOTìDEOS E DE UM VETOR, PRODUTO, E, MéTODO PARA TRIAR COMPOSTOS Uso de um anticorpo monoclonal direcionado contra o dominio extracelular de fator de crescimento de hepatócito é descrito para a preparação de um medicamento para o tratamento de tumores e/ou metástases e de uma ferramenta de diagnóstico para detectar células neoplásicas bem como vetores compreendendo pelo menos uma porção da seqúência de nucleotídeos codificadora do anticorpo monoclonal anti-Met e/ou pelo menos um fragmento do mesmo e pelo menos um inibidor de quinase.

Description

ESOS DE UM ANTICORPO MONOCLONAL, UM FRAGMENTO E/OUANTICORPO GENETICAMENTE ENGENHEIRADO OUHUMANIZADO, DE UMA SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS E DE UMVETOR, PRODUTO, E, MÉTODO PARA TRIAR COMPOSTOS"

Campo da invenção

A presente invenção refere-se ao uso de um anticorpomonoclonal, fragmentos e/ou porções do mesmo, e ao uso de seqüência denucleotídeos codificadora de um anticorpo monoclonal, fragmentos e/ouporções do mesmo para a preparação de um medicamento para o tratamentode tumores e metástases e dispositivos de diagnóstico para detectar célulasneoplásicas, quer in vivo, quer in vitro. Em particular, a presente invençãorefere-se ao uso de um anticorpo monoclonal anti-Met direcionado contra odomínio extracelular receptor de fator de crescimento de hepatócito.

Fundamentos da invenção

Exploração científica de imunoterapia de câncer começou nosanos 1950s e a primeira aplicação baseou-se em anticorpos policlonais. Hoje,após mais do que cinco décadas, imunoterapia com anticorpos monoclonaiscontinua a oferecer uma alternativa promissora para tratamento de câncer(1,2). Vários anticorpos selecionadores de receptores de tirosina quinase(RTKs) em câncer são correntemente usados em prática clínica (3). Omecanismo de ação destes anticorpos é diferente em ocorrências diferentes, e- a despeito dos exemplos de aplicação bem sucedida - muitas vezes, éinsatisfatoriamente entendido (4). Bevacizumab e Cetuximab selecionamVEGF-VEGFR e EGF-EGFR, respectivamente, e atuam por prevenção dainteração de ligante-receptor, (5,6). Herceptina és um anticorpo monoclonalespecífico para HER2, um membro da família EGFR. O mecanismo de açãosubjacente à eficácia de Herceptina não está completamente claro mas temsido mostrado que promove degradação de HER2, diminuindo assim os níveisde receptor na superfície de células de tumor (7).O oncogene MET, codificador de receptor de tirosina quinasepara Fator de Crescimento de Hepatócito (HGF), controla programasgenéticos levando ao crescimento celular, invasão celular e proteção celularcontra apoptose. Ativação desregulada de HGFR é crítica não apenas para aaquisição de propriedades tumorigênicas mas também para a realização dofenótipo invasivo (8). O papel de MET em tumores de humano emergiu devárias abordagens experimentais e foi inequivocamente aprovado peladescoberta de MET ativando mutações em formas herdadas de carcinomas.(9,10). Além disso, ativação constitutiva de HGFR é freqüente também emcânceres esporádicos e estudos disto e outros laboratórios têm mostrado que ooncogene MET é sobre-expressado em tumores de histotipos específicos ou éativado através de mecanismos autócrinos. Além disso, o gene MET éamplificado em metástases hematogenosas de carcinomas colorretais (11).Interferência com ativação de Met está portanto se tornando uma abordagemdesafiadora para impedir os processos tumorigênicos e metastásicos. Nos anospassados, várias estratégias têm sido propostas para bloquear a sinalização deHGFR, seleção de qualquer um o HGFR ou seu ligante. Estas abordagensincluem o uso de antagonistas de HGF, anticorpos neutralizadores de HGFs,iscas de HGFR, inibidores de sítio de ligação de ATP de molécula pequena deHGFR ou moléculas pequenas tais como geldanamicina, ribozimas epolipeptídeos de domínio SH2 (revisto em 12).

Sumário da invenção

A presente invenção é relacionada ao uso de um anticorpomonoclonal direcionado contra o domínio extracelular receptor de fator decrescimento de hepatócito (HGFR) no tratamento de tumores e/ou metástasesem um indivíduo afetado por um tumor e em dispositivos de diagnóstico paradetectar células neoplásicas, quer in vivo, quer in vitro.

O objetivo da presente invenção é, portanto, o uso de i) umanticorpo monoclonal anti-Met, ii) um fragmento contendo a região deligação de epítopo de um anticorpo monoclonal anti-Met e/ou iii) umanticorpo geneticamente engenheirado contendo a região de ligação deepítopo ou as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de umanticorpo monoclonal anti-Met para a preparação de um medicamento para otratamento de tumores e metástases em um indivíduo sofrendo de um tumor epara dispositivos de diagnóstico para detectar células neoplásicas, quer invivo, quer in vitro, no qual o anticorpo monoclonal anti-Met - chamadoAntiMET-R - é produzido pela linhagem de célula de hibridoma depositadapelo Advanced Biotechnology Center (ABC), Interlab Cell Line Collection(ICLC), S.S. Banca Cellule e Colture in GMP, Largo Rosanna Benzi 10,Gênova, Itália com o número de acesso de ICLC PD 05006.

Outro objetivo da presente invenção é o uso de um vetorcompreendendo pelo menos uma porção da seqüência de nucleotídeoscodificadora da região de ligação de epítopo ou as CDRs do anticorpomonoclonal anti-Met produzido pela linhagem de célula de hibridoma ICLCPD 05006 para a preparação de um medicamento para o tratamento detumores e metástases em um indivíduo afetado por um tumor.

Outro objetivo da presente invenção é o uso de i) do anticorpomonoclonal anti-Met, ii) um fragmento contendo a região de ligação deepítopo do anticorpo monoclonal anti-Met e/ou iii) um anticorpogeneticamente engenheirado contendo a região de ligação de epítopo ou asCDRs do anticorpo monoclonal anti-Met e pelo menos um inibidor de quinasecomo uma preparação combinada para uso simultâneo, separado ouseqüencial em terapia de tumor e/ou de metásteses.

Outro objetivo da presente invenção é um método para triarcompostos capazes de se ligarem em pelo menos uma porção do receptor dedomínio extracelular de fator de crescimento de hepatócito (HGFR) para aidentificação de compostos farmacologicamente ativos na prevenção e/outratamento de tumor e/ou metástases.Outro objetivo da presente invenção é o uso do anticorpoAntiMET-R, fragmentos do mesmo e/ou anticorpos geneticamenteengenheirados contendo a região de ligação de epítopo ou as CDRs doanticorpo AntiMET-R como ferramenta de diagnóstico para detectar célulasneoplásicas, quer in vivo, quer in vitro.

De acordo com a presente invenção, estes propósitos sãoalcançados por meio das reivindicações que seguem, que são parte integral doensinamento técnico aqui proporcionado com respeito à invenção.

Breve descrição dos desenhos

- Figura 1. AntiMET-R prejudica ativação de HGFR etransdução de sinal. (A) Avaliação de ativação de HGFR. Células GTL16foram expostas a AntiMET-R nos tempos indicados. HGFR foiimunoprecipitado dos lisados celulares e Western blots foram sondados comAbs indicados. Tratamento com AntiMET-R resultou em um decréscimo deativação de receptor mais pronunciado do que regulagem negativa dereceptor, como indicado por quantificação de densidade de banda. (B) Análisede sinalização de HGFR. Células foram pré-tratadas quer com VSV-G quercom AntiMET-R e então estimuladas com HGF nos tempos indicados.Fosforilação Akt foi avaliada em lisados totais de célula. Como mostrado nopainel superior, AntiMET-R reduziu ambas a ativação Akt basal e HGF-induzida.

- Figura 2. AntiMET-R inibe o fenótipo transformado decélulas de câncer in vitro. (A) Crescimento ancoragem-independente decélulas GTLl6. Células pré-tratadas foram semeadas em ágar 0,5%. Célulasforam então mantidas na presença das quantidades indicadas de AbsAntiMET-R ou VSV-G e após 10 dias, colônias crescidas foram coradas.Crescimento ancoragem-independente foi drasticamente inibido até mesmoem doses baixas de AntiMET-R. (B) Ensaio de invasão. MDA-MB-435 β4foram pré-tratadas com os anticorpos indicados por 24 h antes da semeaduraem uma câmara Transwell revestida com matrigel. A câmara inferior foi cheiacom DMEM FBS 2% + HGF lOOng/mL. Após 24 h, as células migradasforam coradas e contadas. Capacidade invasiva em resposta ao HGF éexpressada como aumento de vezes comparado com as células nãoestimuladas. Como mostrado, tratamento com AntiMET-R reduziusignificativamente a invasão de célula.

- Figura 3. AntiMET-R inibe o fenótipo transformado decélulas de câncer in vivo (A, B) Ensaio de tumorigênese. Camundongos nusforam injetados subcutaneamente com l,5xl06 células GTLl6. Apóssurgimento de tumor, camundongos exibindo tumores de mesmo tamanhoforam selecionados e então injetados in situ duas vezes por semana com 2μg/g de quer VSV-G quer AntiMET-R. Volume de tumor foi medido eminstantes de tempo diferentes (A). Como mostrado, AntiMET-R prejudicou ocrescimento de tumor em camundongos nus enxertados com células de tumorde humano. Camundongos foram mortos após 8 semanas de tratamento e pesode tumor foi calculado (B). Em camundongos tratados com AntiMET-R,tumores foram significativamente menores do que em camundongos decontrole (p< 0,05) . (C) Avaliação de ativação de HGFR. Seções de tumor decamundongos tratados com VSV-G (painel A), ou AntiMET-R (painel B)foram coradas com anti-fosfo-HGFR de humano. Análise imuno-histoquímicade tumores revelou que os níveis de HGFR ativado foram fortementedecrescidos em camundongos tratados com AntiMET-R.

- Figura 4. Tratamento com AntiMET-R interfere com aprogressão de tumor in vivo. Camundongos nus foram inoculadossubcutaneamente com 2,5xl06 células MDA-MB-435 β4. Crescimento detumor foi avaliado em camundongos não tratados (A) e em camundongostratados com: 10 μg/g de VSV-G administrado IP (Β), 1 μg/g de AntiMET-RIP (C), 10 μg/g de AntiMET-R IP (D) e 2 μg/g de AntiMET-R IS (E). Comomostrado no diagrama (K), AntiMET-R inibiu o crescimento de tumor emcamundongos nus enxertados com células de tumor de humano. Coloraçãoimuno-histoquímica para anti-fosfo-HGFR de humano foi realizada em seçõesde tumor mostradas no painel esquerdo. Ativação forte de HGFR estevepresente em ambos camundongos não tratados (F) e em camundongostratados com anticorpo de controle (G). Administração de AntiMET-Rresultou em inibição de HGFR que igualou ao enfraquecimento decrescimento de tumor. (L) Análise de metástases pulmonares. Metástasesforam contadas por observação microscópica de seções de pulmão apóscoloração com hematoxilina/eosina. Uma redução dose-dependente denúmero de metástases foi evidente em camundongos tratados com AntiMET-R. (M-N) Avaliação de vascularização de tumor. Coloração deimunofluorescência sobre seções histológicas de tumor foi realizada com umanticorpo anti-CD31 de camundongo. Número e área de vasos foramavaliados por microscopia de fluorescência. Como mostrado, ambos o númeroe o tamanho de vasos foram reduzidos em resposta ao tratamento comAntiMET-R.

- Figura 5. AntiMET-R induz regulagem negativa de HGFR.Células GTL16 (A) e MDA-MB-435 β4 (B) foram tratadas com AntiMET-Rnos tempos indicados. Quantidades iguais de lisados de célula total foramprocessadas para Western blotting e sondadas com anti-HGFR (painéissuperiores) ou, como controle de carregamento, com anticorpos anti-Hsp70(painéis inferiores). Como mostrado, AntiMET-R foi capaz de induzirregulagem negativa de HGFR tanto em células sobre-expressando (GTL16)quanto em células expressando níveis normais de HGFR (MDA-MB435 β4).(C) Quantificação citofluorimétrica de HGFR sobre a superfície de célula.Células MDA-MB-435 β4 foram incubadas em meio sozinho (barras pretas)ou HGF (barras cinzas) ou AntiMET-R (barras brancas). Nos instantes detempo indicados, as células foram coradas com um Ab anti-extra HGFR(D024). Como mostrado, AntiMET-R foi capaz de eficientemente reduzir aquantidade de HGFR de superfície com redução máxima após 30 h detratamento.

- Figura 6. Regulagem negativa induzida por anticorpo edependente de ligante segue rotas diferentes. (A) Células HeLa (painelsuperior) e GTL16 (painel inferior) foram pré-tratadas com lactacistina (Iact)ou concanamicina (conc) ou ambas por 2 horas, antes do tratamento comHGF ou AntiMET-R Regulagem negativa de HGFR foi avaliada sobre oslisados de célula totais. Na presença de inibidores de proteassomo, regulagemnegativa de HGFR ligante-induzida foi enfraquecida, enquanto que Ab-induzida não o foi. Nesta condição, um fragmento de 60Kd (seta), detectávelapenas por um Ab direcionado contra a porção intracelular (anti-intra Met),foi acumulado nas células. Além disso, sondagem com anticorpos anti-ubiquitina (B, painel superior) mostrou que este fragmento foi etiquetado comgrupos ubiquitina, como esperado para uma molécula comprometida peladegradação proteassomal.

- Figura 7. AntiMET-R induz a clivagem proteolítica deHGFR e separação de Domínio Extracelular (ECTODOMAIN). (A) CélulasGTL16 foram metabolicamente marcadas com 35S Metionina e 35S Cisteína eentão tratadas quer com HGF quer com AntiMET-R por 4 h. Sobrenadantesforam coletados e imunoprecipitados com um Ab anti-HGFR direcionadocontra o domínio extracelular. Geles foram corridos sob condição não-redutoras (painel superior) e redutoras (painel inferior). Na ausência deagentes cadeias α e β de HGFR migram como um complexo, enquanto que asduas bandas correm separadamente na presença de β-mercapto-etanol. Comomostrado na figura, AntiMET-R mas não HGF foi capaz de induzir separaçãode ectodomínio de HGFR. (B) AntiMET-R induz separação de ectodomíniotambém em células endoteliais. Células HUYEC foram expostas ao anticorponos tempos indicados. Meios de cultura foram coletados e imunoprecipitadoscom um anticorpo reconhecendo a porção extracelular de cadeia-β de HGFR.Western blots foram sondados com o mesmo anti-extra HGFR. (C, D)Separação de HGFR é dose- e tempo-dependente. Células foram estimuladascom quantidade crescente de AntiMET-R (C) ou por tempos diferentes (D).Meios de cultura foram tratados como em (B)

- Figura 8. Ativação de transdução de sinal não é requeridapara separação de HGFR. Células Cos-7 foram transfectadas com mutantes deHGFR diferentes e 48 horas mais tarde foram tratadas com AntiMET-R por 4h. Quantidades iguais de lisados de célula e meios condicionados foramprocessadas para Western blotting. Como mostrado, AntiMET-R foi capaz deinduzir regulagem negativa e separação de ectodomínio de todos os mutantesde HGFR. HGFR KD = HGFR Quinase Morta, faltante de atividade dequinase; HGFR Duplo = mutante de HGFR faltante de 2 tirosinas deancoragem 1349, 1356 e assim incapaz de recrutar transdutores de sinal;HGFR-GFP = mutante de HGFR onde toda a porção intracelular foisubstituída pela seqüência GFP.

- Figura 9. O ectodomínio separado de HGFR comporta-secomo uma "isca" . Células pré-tratadas com AntiMET-R foram estimuladascom HGF quer na ausência quer na presença de ectodomínio de HGFR (Metecto) no meio de cultura. Como mostrado, ectodomínio de HGFR separadoprejudicou a ativação Akt e comportou-se como uma "isca" .

- Figura 10. Células geneticamente modificadas por meiotransferência de gene mediada por vetor lentiviral expressam AntiMET-R. (A)Desenho esquemático do vetor lentiviral bidirecional (forma integral) usadopara expressar AntiMET-R; LTR: HIV-I Long Terminal Repeats [RepetiçõesTerminais Longas de HIV-I]; a região U3 é deletada na posição -18 da regiãoR. SD: Splice donor [Doador de União]. SA: Splice Acceptor [Aceptor deUnião]. PolyA SV40: sítio de poliadenilação do vírus simiano 40. Cte:elemento de transporte constitutivo derivado do vírus Mason-Pfizer demacaco. PminCMV: promotor mínimo derivado de CitoMegaloVirus. hPGK:promotor de humano do gene Fosfoglicerato-Quinase. PRE: elementosregulatório de pós-transcrição do vírus de hepatite de marmota. EtiquetaFLAG: seqüência codificadora de epítopo DYKDDDK 3 vezes repetido.Etiqueta His: seqüência codificadora de 7 resíduos de Histidina. (B) Análisepor Western blot de sobrenadantes de cultura livre de soro (cada amostra de75 μΕ) coletados de duas linhagens celulares representativas com vetorlentiviral trazendo AntiMET-R cDNAs. Amostras foram submetidas à SDS-PAGE sob condição redutora e os filtros correspondentes foram sondadoscom Ig anti-camundongo. (C) Tabela relatando a quantificação de AntiMET-R em sobrenadantes de cultura derivados de um painel de linhagens de célulatransduzidas com vetor lentiviral trazendo AntiMET-R cDNAs.

- Fieura 11: O AntiMET-R recombinante liga-se comafinidade alta no domínio extracelular de Met . (A) Análise por Western blotde lisados de célula contendo o Receptor Met imunoprecipitado com oAntiMET-R derivado de fontes diferentes (hibridoma ou linhagem de célulade carcinoma geneticamente modificada). A imunoprecipitação foi realizadaincubando Seph. Prot. G com sobrenadantes de cultura de célula de 1:Hibridoma produzindo MAb não relacionado; 2 Hibridoma produzindoAntiMET-R MAb; 3: células MDA-MB 435 infectadas com vetor lentiviraltrazendo cDNAs para AntiMET-R MAb 4: células MDA-MB 435 nãoinfectadas. Amostras foram submetidas à SDS-PAGE sob condição redutora eos filtros correspondentes foram sondados com um anticorpo anti-Metdirecionado contra a cauda c-Terminal do receptor. (B) Ensaio de ligação doAntiMET-R e o AntiMET-R recombinante no domínio extracelular doReceptor Met . Placa de 96 cavidades revestida com domínio extracelularMET purificado fusionado no domínio Fc derivado de Ig de Humano (100ng/cavidade) foi incubada com concentrações crescentes de AntiMET-Rpurificado ou AntiMET-R recombinante (de 0 a 5,5 nM). Curva de ligação foirevelada usando anticorpo ligado em Ig anti-camundongo - HRP. Paracontrolar a especificidade de ligação realizamos o mesmo ensaio usandocavidades revestidas com Fc-Ron (uma proteína quimera gerada de fusão dedomínio Fc de Ig de Humano no domínio extracelular do receptor Ron, umaproteína pertencente à família de receptores Met).

- Figura 12: O AntiMET-R recombinante induz a clivagemproteolítica de HGFR e separação de Domínio Extracelular(ECTODOMAIN). Células HCT-116, uma linhagem de célula derivada decarcinoma colorretal, foram incubadas em condição livre de soro por 24 hcom a quantidade indicada de AntiMET-R (A) purificado ou AntiMET-Rrecombinante (B). Lisados de célula totais (painéis superiores) esobrenadantes de cultura celular (painéis inferiores) foram submetidos à SDS-PAGE seguida por Western Blot. A diminuição da forma madura de Met(pl45) nas células e o aumento correspondente de ectodomínio Met (p80) nossobrenadantes de cultura foram monitorados sondando filtros com mAb DL-21 anti-Met que reconhece um domínio localizado na porção extracelular decadeia β de Met.

- Figura 13: Transdução com vetor lentiviral codificador deAntiMET-R inibe o fenótipo transformado de células de câncer in vitro e invivo. (A) Ensaio de crescimento independente de ancoragem. Células HCT-116 transduzidas (AntiMET-R) ou não (WT) com vetor lentiviral codificadorde AntiMET-R foram semeadas em ágar 0,5% . As células foram entãomantidas em meio suplementado com FCS 2%+ HGF 80 ng /mL. Colôniasforam armazenadas após 14 dias; no topo de uma cavidade representativa émostrado; no fundo o gráfico representa o número de colônias (calculado detriplicatas). (B) Ensaio de invasão. Células HCTl 16 transduzidas (AntiMET-R) ou não (WT) com vetor lentiviral codificador de AntiMET-R foramplaqueadas em uma câmara Transwell revestida com matrigel. A câmarainferior foi cheia com meio FBS 2% + HGF 80 ng/mL. Após 24 h as célulasfixadas na parte inferior dos filtros foram contadas. Figuras são camposrepresentativos dos filtros. (C) Latência de tumor in vivo. Células HCT-116transduzidas (AntiMET-R) ou não (WT) com vetor lentiviral codificador deAntiMET-R foram injetadas sob-cútis no flanco de camundongos nusanímicos (3x IO6 células/camundongo, η = 6 para cada grupo). Massa detumor foi avaliada a cada 2 dias com um compasso de calibre. Camundongosforam considerados positivos para presença de tumor quando massa de tumorultrapassou 15 mm3. (D) Crescimento de tumor in vivo. Células HCT-116transduzidas (AntiMET-R) ou não (WT) com vetor lentiviral codificador deAntiMET-R foram injetadas sob-cútis no flanco de camundongos nusanímicos (3x IO6 células/camundongo, η = 6 por cada grupo). Cinética decrescimento de tumor foi avaliada medindo a massa de tumor com umcompasso de calibre a cada 3 dias. No 65° dia todos os camundongos forammortos.

- Figura 14: Liberação intra-tumor direta de vetor lentiviralcodificador de AntiMET-R inibe crescimento de tumor. Células HCT-116 (4

x 106 células/camundongo) foram injetadas sob-cútis no flanco decamundongos nus anímicos. Quando a massa de tumor foi ao redor de 10mm3 partículas de vetor lentiviral (1 μg p24 /camundongo) foramadministradas intra-tumoralmente no dia 0 e no dia 3. Um grupo (CTRL)recebeu partículas de vetor codificadoras de GFP, enquanto que o outro gruporecebeu partículas de vetor codificadoras de AntiMET-R (AntiMEt-R).Cinética de crescimento de tumor foi avaliada medindo massa de tumor comum compasso de calibre a cada 3 dias.

- Figura 15: Mapa do plasmídeo codificador de Anti-MET-R.

- Figura 16: Mapa do plasmídeo codificador de Anti-MET-RFLAG-His.

- Figura 17: Desenho esquemático dos domínios derivados daporção extracelular do HGFR (ectodomínio Met) .

- Figura 18: AntiMET-R especificamente reconhece umepítopo localizado na região IPTs. Meios condicionados de células MDA-MB-435 transduzidas com partículas de vetor lentiviral codificadoras de IscaMet myc-etiquetada, SEMA PSI myc-etiquetado e PSI IPT1-4 myc-etiquetado foram imunoprecipitados com o anticorpo antiMET-R e detectadospor Western blot usando um anticorpo biotinilado anti-myc (painel direito).Quantidades iguais de meios condicionados foram carregadas como umcontrole para expressão de proteína (painel esquerdo). CTRL: meiocondicionado de células MDA-MB-435 transduzidas com um vetor lentiviralvazio. Isca Met : meio condicionado de células MDA-MB-435 transduzidascom um vetor lentiviral expressando o domínio extracelular inteiro de HGFR.PSI-IPT: meio condicionado de células MDA-MB-435 transduzidas com umvetor lentiviral expressando domínios PSI, IPT-1, IPT-2, IPT-3, IPT-4 doHGFR. SEMA-PSI: meio condicionado de células MDA-MB-435transduzidas com um vetor lentiviral expressando domínios Sema e PSI doHGFR. À direita é mostrado peso molecular em KD.

- Figura 19: AntiMET-R reconhece um epítopo localizado naregião IPT-4. Lisados de célula de células MDA-MB-435 transduzidas compartículas de vetor lentiviral expressando regiões individuais IPT-1, IPT-2,IPT-3, IPT-4, todas elas etiquetadas com indicador, foram imunoprecipitadoscom o anticorpo AntiMET-R e detectadas por Western blot usando umanticorpo anti-indicador (painel esquerdo); como controle para expressão deproteína, quantidades similares de lisados celulares foram imunoprecipitadascom um anticorpo anti-indicador e detectadas por Western blot usando omesmo anticorpo anti-indicador (painel direito). CTRL: Lisado de célula decélulas MDA-MB435 transduzidas com um vetor lentiviral vazio. IPTl:Lisado de célula de células MDA-MB-435 transduzidas com um vetorlentiviral expressando a região IPT-I de HGFR. IPT2: Lisado celular decélulas MDA-MB-435 transduzidas com um vetor lentiviral expressando aregião IPT2 de HGFR. IPT3: Lisado de célula de células MDA-MB-435transduzidas com um vetor lentiviral expressando a região IPT-3 de HGFR.IPT4: Lisado de célula de MDA-MB-435 transduzidas com um vetorlentiviral expressando a região IPT-4 de HGFR. À direita peso molecular emKD é mostrado.

- Figura 20: AntiMet-R especificamente cora o receptor HGFem células intactas. Painel A: Perfil de GTL-16 analisado por citometria defluxo com o anticorpo antiMet-R. Linha fina: GTL-16 incubada com o isótipoanticorpo CTRL; Linha em negrito: GTL-16 incubadas com AntiMet-R. MFI:Intensidade de fluorescência média. Painel C: Análise de imunofluorescênciade células GTL-16 marcadas com o anticorpo AntiMet-R reveladas por umaIg de cabra anti-camundongo conjugada com o fluorocromo Alexa Fluor 488.Painel B: Células GTL-16 marcadas apenas com a Ig anti-camundongo /Alexa Fluor 488. (Magnificação original, χ 63)

- Figura 21: Seqüência de ácido nucleico (a) e de aminoácidos(b) de cadeia pesada de AntiMET-R. As regiões CDR estão sublinhadas tantona seqüência de nucleotídeos quanto na seqüência de aminoácidos.

- Figura 22: Seqüência de ácido nucleico (a) e de aminoácidos(b) de cadeia leve de AntiMET-R. As regiões CDR estão sublinhadas tanto naseqüência de nucleotídeos quanto na seqüência de aminoácidos.

Descrição detalhada da invenção

O Receptor de Fator de Crescimento de Hepatócito, codificadopelo proto-oncogene MET, é um receptor de tirosina quinase que, sobativação, gera um espectro complexo de respostas biológicas conhecido como"crescimento invasivo" (8). Isto implica indução e coordenação deproliferação, migração, diferenciação e sobrevivência celulares. Sobcondições fisiológicas, este programa de crescimento invasivo desempenhaum papel importante em organogênese, durante desenvolvimento de embriãomas, quando desatrelado em câncer, contribui para progressão e metástase detumor (13).O envolvimento de HGFR em tumores de humano está agorafirmemente estabelecido, como mutações missense de linhagem germinativado gene MET são responsáveis por algumas formas hereditárias de câncer(9,10) e ativação inapropriada de HGFR tem sido mostrada na maioria dostipos de tumores sólidos, muitas vezes correlacionados com prognósticoinsatisfatório (14). A alteração mais freqüente em cânceres de humano é asobre-expressão de receptor (15) que leva à dimerização constitutiva e àativação do receptor, até mesmo na ausência de ligante (16). Expressãoaumentada de HGFR pode ser devido a (i) amplificação de gene, como emtumores colorretais, onde MET confere às células neoplásicas uma vantagemseletiva para metástase hepática (11), (ii) transcrição intensificada, induzidapor outros oncogenes, tais como Ras, Ret e Ets (17,18), (iii) transcriçãoativada por hipoxia, neste caso, a quantidade maior de receptor hiper-sensibiliza as células ao HGF e promove a invasão de tumor (19).

Duas estratégias são correntemente usadas na prática clínicacom o objetivo de interferir com os receptores de tirosina quinase (RTKs): (i)tratamento com moléculas pequenas inibindo a atividade de tirosina quinase;(ii) tratamento com anticorpos interferindo com ativação de receptor.

A presente invenção é direcionada ao uso na terapia de tumorde um anticorpo anti-HGFR, e em particular um anticorpo monoclonal anti-Met - chamado AntiMET-R - produzido pela linhagem de célula de hibridomadepositada por ICLC com número de acesso de PD 05006, quesurpreendentemente foi verificado ser capaz de induzir regulagem negativa dereceptor.

Em uma modalidade, a presente invenção envolve o uso deanticorpo monoclonal AntiMET-R para a preparação de um medicamentopara o tratamento de tumores e metástases em um paciente sofrendo de umtumor.

Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se aouso do anticorpo AntiMET-R para a manufatura de dispositivos dediagnóstico para a detecção de células neoplásicas quer in vivo quer in vitro.

AntiMET-R é um anticorpo monoclonal (mAb) específico paradomínio extracelular de HGFR (20). Este anticorpo monoclonal não ativatodos os efeitos biológicos gerados pelo fator de crescimento de hepatócito(motilidade, proliferação, sobrevivência celular, invasão, tubulogênese eangiogênese) mas induz apenas motilidade. Além disso, ele supra-regula aexpressão constitutiva de ativador de plasminogênio de tipo uroquinase masnão é capaz de induzir e manter a expressão de receptor de ativador deplasminogênio de tipo uroquinase por períodos de tempo prolongados. EstemAb ativa a fosforilação de receptor, que, sendo estritamente dependente debivalência de mAb, requer dimerização de receptor.

A capacidade agonista desta anticorpo não é suficiente - per se

- para justificar sua atividade terapêutica. De fato, um anticorpo monoclonalantiMET-R diferente (DO-24), que os inventores examinaram, não é capaz deinduzir uma regulagem negativa de receptor eficiente e não promoveseparação da porção extracelular do receptor.

AntiMET-R não previne a interação de HGFR com HGF, maseficientemente promove a regulagem negativa de HGFR como mostrado emExemplo abaixo e discutido com referência à Figura 5. Esta interação leva àinibição de transdução de sinal mediada por HGFR e em particular da rotaAkt, conhecida em estar envolvida na resposta anti-apoptótica.

Como será evidente dos resultados descritos abaixo, osinventores demonstraram que tratamento in vitro com AntiMET-R resultouem enfraquecimento da capacidade celular para crescer em uma maneiraindependente de ancoragem (veja Exemplo 2 e Figura 2), uma propriedadeque requer o escape de apoptose devido à falta de ancoragem.

Além disso in vivo - como descrito em detalhe em Exemplo 3

- em animais tratados com AntiMET-R, os presentes inventores têmobservado que os tumores exibem uma velocidade aumentada de apoptose,sem mudanças importantes na velocidade de proliferação. Por outro lado, osinventores não têm observado modificação de propriedades de crescimentocelular em resposta ao anticorpo, nem in vitro, nem in vivo, em concordânciacom a falta de efeito inibitório de AntiMET-R sobre a ativação da rotaMAPK. Esta dissociação da capacidade de HGFR de ativar rotas diferente nãoé nova, já tem sido mostrada para mutantes diferentes de HGFR (21) e emresposta aos agonistas parciais de HGFR (22).

Intra-regulação de HGFR induzida por anticorpo envolveseparação da porção extracelular do receptor. Separação de ectodomínio é umprocesso no qual o domínio extracelular de proteínas de membrana éproteoliticamente solto da superfície celular, permitindo assim que uma célulamude rapidamente sua superfície em resposta aos estímulos ambientais e paradar reguladores solúveis. Os presentes inventores mostram evidência destaatividade de AntiMET-R em Exemplos 6 e 7.

No presente pedido os inventores produzem evidências - emparticular em Exemplo 3 - que anticorpo AntiMET-R é ativo in vivo onde eleenfraquece o crescimento de tumor e a formação de metástases espontâneasde células de câncer enxertadas em camundongos nus. Os experimentossugerem que estes efeitos são mediados pela ação do anticorpo sobre ambosas células de câncer e o microambiente. De fato células endoteliais expressamHGFR (24) e temos demonstrado que antiMet-R induz separação do HGFRtambém neste tipo de células (dados não mostrados). Neo-vascularização dotumor primário é um requerimento absoluto para ambos o crescimento e ametástase de tumor (23) e tem sido firmemente estabelecido que HGF é umfator angiogênico potente (24). Além disso sob ativação de HGFR, ocorre umaumento na liberação de VEGF e de outros fatores angiogênicos (48-49-40).Assim, o efeito sobre a vascularização de tumor também poderia ser indiretoporque inibição de função de Met em células de tumor poderia anular aliberação de tais fatores do tumor. Os inventores da presente invenção têmobservado uma redução significativa de neovascularização de intratumor,devido a uma diminuição do número de vasos germinando do microambienteapós tratamento com AntiMET-R.

Não é importante que a atividade de AntiMET-R sobre célulashospedeiras influencie a funcionalidade de órgãos diferentes tais como baço,medula óssea, fígado, coração, osso e rim, que não mostraram alteraçõespatológicas evidentes (dados não mostrados) após exposição de longa duraçãoao anticorpo. Assim, a despeito do reconhecimento de HGF-R em ambascélulas normais e neoplásicas, o AntiMET-R exibe a capacidade para detectarsobre-expressão de HGF-R e para induzir mudanças em viabilidade de célula.

Em conclusão, os resultados aqui mostrados sugerem queregulagem negativa de HGFR induzida por AntiMET-R é um mecanismocandidato para imunoterapia e o uso de AntiMET-R ou fragmentos do mesmoem uma composição farmacêutica pode proporcionar um outro modo notratamento de tumores e prevenção de metástases em pacientes afetados portumor.

Adicionalmente, AntiMET-R pode ser usado como ferramentade diagnóstico para detectar células neoplásicas quer in vivo quer in vitro, porexemplo por marcação de AntiMET-R com marcadores adequados.

AntiMET-R conforme a presente invenção pode ser produzidopor métodos convencionais em animais ou, preferivelmente, por técnicas deengenharia genética.

O uso do anticorpo monoclonal AntiMET-R de acordo com apresente invenção é intencionado para também incluir o uso de anticorposhumanizados e geneticamente engenheirados e de anticorpos marcados commarcadores de diagnóstico adequados. Anticorpos humanizados egeneticamente engenheirados e métodos para a produção deles sãoconhecidos na arte. Veja, para uma revisão (25).O uso de AntiMET-R também inclui o uso de fragmentoscontendo a região de ligação de epítopo do mesmo, tais como peptídeoscontendo a região de ligação de epítopo ou Regiões Determinantes deComplementaridade (CDRs), fragmentos Fv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2-Fragmentos convencionais são tipicamente produzidos por clivagemproteolítica, mas podem ser produzidos por síntese química, tal como sínteseem fase sólida ou líquida, bem como por técnicas de DNA recombinante.

AntiMET-R e seus fragmentos são preferivelmente usados emcomposições farmacêuticas na forma de proteína solúvel, cuja liberação podeser realizada usando métodos convencionais de liberação de droga.Administração de composições farmacêuticas compreendendo o anticorpoAntiMET-R e/ou fragmentos do mesmo pode ser realizada por qualquermétodo conhecido pela pessoa experiente. Por exemplo, a composição podeser administrada em uma solução aquosa que é injetada ou infundida paradentro do paciente. A determinação da dosagem apropriada depende donúmero de variáveis específicas de caso, incluindo a idade e o peso dopaciente e envolve experimentação de rotina dentro da especialidade dapessoa experiente.

Outra modalidade da presente invenção envolve a produção decomposições farmacêuticas contendo o anticorpo monoclonal AntiMET-Rmarcado com um marcador diagnóstico adequado para a detecção in vivo ouin vitro de células neoplásicas em um paciente sofrendo de um tumor.

A presente invenção envolve a produção de um vetor DNAcompreendendo um promotor sintético obtido juntando um promotor denúcleo mínimo (promotor minCMV) a montante em uma orientação oposta àdo promotor eficiente do gene Fosfoglicerato Quinase de humano e DNAcodificador de pelo menos uma porção da anticorpo monoclonal AntiMET-RAs seqüências de DNA compreendida no vetor codificam a cadeia leve e/oupesada de AntiMET-R; substituições conservativas nas seqüências de DNAtambém estão incluídas pela presente invenção bem como seqüênciasmodificadas pela adição de seqüências de etiqueta em ambas a terminação 5'ou 3'. As seqüências de nucleotídeos codificadoras das cadeias pesada e levede AntiMET-R são representadas em SEQ ID No.: 1 e SEQ ID No.:2,respectivamente.

Além disso os inventores modificaram a cadeia pesadaadicionando uma seqüência de etiqueta em 3' da cadeia pesada de AntiMET-R(SEQ ID No.: 3). Esta seqüência permite purificação de MAb usando umacoluna de Níquel e é reconhecida especificamente por anticorpos anti-indicador (SIGMA).

Embora a produção de vetores de DNA da presente invençãopode ser realizada por uma variedade de métodos conhecidos na arte,produção é exemplificada em Exemplo 10.

Em outra modalidade, a presente invenção envolve o uso deum vetor de DNA compreendendo DNA codificador de região de ligação deepítopo do anticorpo monoclonal AntiMET-R para a preparação de ummedicamento para o tratamento de tumor e metástases em um indivíduo. Aliberação dos vetores de DNA da presente invenção pode ser realizada usandométodos conhecidos de terapia de gene. Por exemplo fazer referência a (10).

Uma outra modalidade da presente invenção envolve umproduto compreendendo o anticorpo AntiMET-R e/ou fragmentos do mesmoe inibidores de quinase como uma preparação combinada para usosimultâneo, separado ou seqüencial em terapia de tumor. Exemplos deinibidores de quinase que podem ser vantajosamente usados na presenteinvenção são análogo de estaurosporina K252A (Calbiochem-NovabiochemIntl.; 36); PHA-665752 (3Z)-5-[(2,6-dicloro-benzil)-sulfonil]-3-[(3,5-dimetil--4- {[(2R)-2-(pirrolidin-1 -il-metil)-pirrolidin-1 -il]-carbonil} -1 H-pirrol-2-il)-metileno]-1,3-di-hidro-2H-indol-2-ona (34); SUl 1274 [(3Z)-N-(3-cloro-fenil)-3-( {3,5-dimetil-4-[(4-metil-piperazin-1 -il)-carbonil]- lH-pirrol-2-il} -metileno)-N-metil-2-oxo-indolina-5-sulfonamida] (37, 38, 35); SUl 1271[(3Z)-5-(2,3-di-hidro-lH-indoM^

piperazin-1 -il)-carbonil]- lH-pirrol-2-il} -metileno)-1,3-di-hidro-2H-indol-2-ona] (38); SUl 1606 [(3Z)-N-(3-cloro-fenil)-3-{[3,5-dimetil-4-(3-morfolin-4-il-propil)-lH-pirrol-2-il]-metileno}-N-metil-2-oxo-indolina-5-sulfonamida](38).

Os inventores têm, de fato, observado que o mecanismoinibitório ativado por AntiMET-R não requer atividade de HGFR tirosinaquinase. Esta característica representa uma vantagem relevante em umabordagem terapêutica. Em prática clínica, de fato, é freqüente combinardrogas diferentes com o objetivo de melhorar o efeito da molécula alvo. Nocaso de HGFR, portanto é possível combinar inibidores de quinase com oanticorpo, permitindo a ação contemporânea sobre ambos os níveis e ativaçãode HGFR. Isto provavelmente intensifica a eficácia terapêutica da terapia alvoem tumores sobre-expressando Met, com o objetivo de interferir com ocrescimento de tumor e com a aquisição de um fenótipo metastásico.

O anticorpo AntiMET-R e seus fragmentos parte do produtode acordo com a presente invenção são produzidos como especificado acima.Os inibidores de quinase a serem usados nas preparação combinada de acordocom a presente invenção podem ser produzidos por síntese químicaconvencional ou técnicas de engenharia genética.

Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui ummétodo para triar compostos capazes de se ligarem em pelo menos umaporção do receptor de domínio extracelular de fator de crescimento dehepatócito, no qual estes compostos possuem uma atividade antagonistaversus o Receptor de Fator de Crescimento de Hepatócito e sãofarmacologicamente ativos na prevenção e/ou no tratamento de tumor e/oumetástases. Em particular, estes compostos são capazes de induzemregulagem negativa de Receptor de Fator de Crescimento de Hepatócito ouseparação de pelo menos uma porção do domínio extracelular de Receptor deFator de Crescimento de Hepatócito.

A presente invenção agora será descrita em relação a algumasmodalidades preferidas por meio de exemplos não limitantes.

Anticorpos, inibidores e outros reagentes.

AntiMET-R Monoclonal anti-HGFR foi originalmente descritopor Prat (20). Outros anticorpos usados para Imunoprecipitação e análise dewestern blot são: anticorpos D024 e DL21 anti-HGFR (reconhecedores dedomínio extracelular de HGFR descrito em 20); PY20 anti-fosfotirosina(Transduction Laboratories), anti-ubiquitina (Babco), anti-Hsp70 (Stressgen),anti-fosfo Akt (Ser473, Cell Signaling Technology), anti-Akt (Santa CruzBiotechnologies) anti-domínio intracelular de HGFR (Cl2, Santa CruzBiotechnologies). Colorações imuno-histoquímicas foram realizadas com:anticorpo anti-fosfo-HGFR de humano (Cell Signaling) e anti-CD31 decamundongo (Pharmingen). Para experimentos in vitro e in vivo anticorpoanti-vírus de estomatite vesicular (VSV-G, Sigma) foi usado como umcontrole. Lactacistina e concanamicina foram adquiridos de Calbiochem.Seqüências de aminoácidos e nucleotídeos antiMET-R.

A tradução da seqüência de nucleotídeos de cadeia pesada deAntiMET-R correspondendo à SEQ ID No.: 1 e figura 21a é relatada emfigura 21b e SEQ ID No:6.

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos correspondentesàs regiões CDR estão sublinhadas em Figuras 21a e 21b; suas seqüências deaminoácidos são: CDR-Hl: GYTFTSYW (SEQ ID NO.:8); CDR-H2:INPSSGRT(SEQ ID NO.: 9); CDR-H3: ASRGY(SEQ ID NO.: 10) .

A tradução da seqüência de nucleotídeos de cadeia leve deAntiMET-R correspondendo à SEQ ID No.: 2 e figura 22a é relatada emfigura 22b e em SEQ ID NO.:7.

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos correspondendoàs regiões CDR estão sublinhadas em Figuras 22a e 22b; suas seqüências deaminoácidos são: CDR-L1: QSVDYDGGSY (SEQ ID NO.:ll); CDR-L2:AAS (SEQ ID NO.: 12); CDR-L3: QQSYEDPLT (SEQ ID NO.:13).Transfeccão transiente de células 293T para produção de vetores lentivirais.

Aproximadamente 24 horas antes da transfecção 6,0 χ IO6células 293T foram semeadas em uma placa de 15 cm. 2 Horas antes datransfecção o meio de cultura foi mudado adicionando 22 mL de IMDM,suplementado com FBS inativado por calor (10%), Penicilina (25U/mL),Estreptomicina (25U/mL) e Glutamina (1%). A mistura de DNA plasmídeopara transfecção foi preparada pela adição de: plasmídeo ENV (VSV-G), 9plasmídeo PACKAGING pMDLg/pRRE 16,2 plasmídeo REV,6.25μg; plasmídeo TRANSFER VECTOR #330 ou #331, 37^g. A soluçãode plasmídeo foi completada para um volume final de 1125 μϊ, com 0,1 XTEAlH2O (2:1). 125 μι de CaCl2 2,5M foram adicionados e deixados na RTpor 5'. Então, agitação na velocidade máxima, 1.250 yL de solução 2X HBSforam adicionados e então imediatamente adicionados em gotas na cultura decélulas. DNA plasmídeo precipitado por CaPi foi incubado por 14-16 horas,então o meio foi substituído por um fresco adicionado de butirato de sódio 1mM (18 mL por placa). Sobrenadante de cultura celular, contendo partículasde vetor, foi coletado a 30-36 horas após mudança do meio. Após coleta, ossobrenadantes foram centrifugados a 2.500 RPM por 10', filtrados através de0,2 μπι e armazenados a -80°C.

Infeccão de células alvo por sobrenadante de célula contendo vetor lentiviral.

Células foram semeadas com meio de cultura frescosuplementado com 10% de FBS, glutamina. Para infecção as linhagens decélula foram incubadas, na presença de polibreno 8 μg/mL, com sobrenadantecontendo partículas de vetor lentiviral como descrito acima na concentraçãofinal de partículas de vetor entre 10 e 150 ng /mL de equivalente HIV-I Gagp24 (medido pelo ensaio ELISA). Após 18 horas o meio foi mudado e ascélulas foram deixadas crescerem. Quando a cultura foi 80% confluente, ascélulas foram incubadas com o meio sem soro e após 72 h o sobrenadantecontendo AntiMET-R foi coletado.

Ensaio de regulagem negativa de HGFR.

Células foram mantidas em meio de Eagle modificado porDulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino.Tratamentos com os anticorpos e HGF foram realizados em meio livre de sorocom 80 μg/mL e 80 ng/mL, respectivamente. Onde indicado, as células forampré-incubadas por 2 h quer com lactacistina 10 μΜ quer com concanamicina100 nM, antes da estimulação. Para a análise de degradação de HGFR, ascélulas foram lisadas em tampão LB (SDS 2%, Tris-HCl 0,5 M pH=6,8) e aconcentração de proteína em lisados de célula foi avaliada com o Kit deEnsaio de Proteína BCA (Pierce). Então, quantidades iguais de proteínastotais foram analisadas por SDS-PAGE e Western Blotting. Paraexperimentos de imunossupressão, as células foram lisadas em tampão EB(Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, EDTA 5 mM, NaCl 150 mM, glicerol 10%, TritonX-100 1%) na presença de inibidores e ortovanadato de Na 1 mM. Apósimunoprecipitação com os anticorpos apropriados, foram realizadas lavagensde estringência alta. As proteínas imunoprecipitadas foram processadas paraWestern Blotting de acordo com métodos padrão. Detecção final foi realizadausando o sistema de detecção ECL (Amersham).

Marcação metabólica e análise de separação de HGFR.

Células foram privadas de soro por 16 horas, pulso-marcadascom [35S] metionina e [35S] cisteína (100 μα/mL, Amersham Corp.) por 30min. em meio DMEM livre de metionina e de cisteína e então tratadas comAntiMET-R ou VSV-G ou HGF por 4 horas. Meios condicionados foramcoletados e submetidos à imunoprecipitação com anticorpo extracelular anti-HGFR. Proteínas imunoprecipitadas foram separadas por SDS-PAGE eautorradiografia foi realizada como previamente descrito em (26).Ensaios biológicos in vitro.

Para avaliação de crescimento independente de ancoragem,GTL16 foram pré-tratadas com AntiMET-R ou VSV-G em meio usado por 48horas. Então 1.500 células foram semeadas em DMEM 2% FBS mais ágarmacio 0,5% (SeaPlaque agarose, BMA) em cada cavidade e mantidas napresença das quantidades indicadas de anticorpos e HGF por 10 dias.Colônias crescidas foram finalmente visualizadas por coloração de tetrazólio(47). O ensaio de invasão foi realizado em câmaras Transwell (Corning). Osfiltros de policarbonato (tamanho de poro de 8 μπι) foram revestidos com 15μg/cm2 de membrana basal de Matrigel (Collaborative Research). Tratamentocom anticorpo foi realizado pré-incubando as células por 24 horas antes desemeadura com AntiMET-R ou VSV-G 20 nM. Então 5x104 células foramsemeadas sobre o lado superior dos filtros e incubadas em DMEM + 2% FBScom 100 ng/mL de HGF adicionados nas cavidades de fundo das câmaras.Após 48 horas, células sobre o lado superior dos filtros foram mecanicamenteremovidas. Células migradas para o lado inferior foram fixadas, coradas econtadas. O índice de migração foi obtido pela divisão do número de célulasmigradas sob estimulação de HGF por aquelas migradas sem estimulação.Marcação in vitro de HGFR com AntiMet-R.

Para análise de citometria de fluxo, 105 células GTL-16 foramsoltas com PBS-EDTA 0,025%, lavadas com PBS e incubadas com 50 μg/mLde anticorpo antiMet-R ou a mesma quantidade de Ig de camundongo decontrole isótipo por 15' na RT. Após 2 lavagens com PBS, as células foramincubadas com 15 μg/mL de Ig de cabra anti-camundongo conjugada comFITC (Jackson Immunoresearch Laboratories) por 15' na RT. Células foramentão lavadas, ressuspensas em PBS-5%BSA e analisadas por citometria defluxo (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Células GTL-16 foramfixadas em metanol : acetona (3:1) por 5' sobre gelo então bloqueadas comsoro de cabra 2% em PBS por 30' na RT. AntiMet-R purificado foiadicionado em uma concentração de 2,5 μΒ/πιΙ. em soro de cabra 2% em PBSe incubadas 1 h na RT, então após 3 semanas com PBS, anticorpo anti-HGFRligado foi revelado com 4 μg/mL de Ig anti-mouse conjugada com AlexaFluor 488 (Molecular Probes). Análise das amostras foi realizada commicroscópio de fluorescência (DM-IRB, Leica Microsystems).

Experimentos in vivo.

Os experimentos in vivo foram realizados pela inoculaçãosubcutânea com IxlO6 GTL16 ou com 2,5xl06 ΜϋΑ-ΜΒ-435β4 para dentrosemanas de idade em Swiss CDl background (Charles River Laboratories).Com surgimento de tumor, os camundongos possuindo massas de tamanhocomparável foram selecionados e inoculados com I.P. ou I.S. (I.S. apenas, nocaso de camundongos injetados com GTL16) duas vezes por semana com asquantidades indicadas de AntiMET-R e anti-VSV-G. Após 8 semanas detratamento, camundongos foram mortos e o peso de tumor foi calculado. Emcamundongos injetados com MDA-MB 435β4 os pulmões foram analisadospara a presença de metástase espontânea. Coloração imuno-histoquímica detumores primários para avaliação de HGFR fosforilado foi realizada sobreseções de tumor embebidas em parafina de 5 μηι usando um anticorpo anti-fosfoHGFR (Cell Signaling, 1:100). O número de metástases foi estabelecidopor meio de observação microscópica dos pulmões após coloração comhematoxilina/eosina realizada de acordo com o protocolo de Masson-Trichrome (Sigma) para investigação patológica de rotina. Avaliação devascularização de tumor foi realizada por imuno-histoquimica em amostrasembebidas em composto Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek) e imediatamentecongeladas a -80°C. Para as colorações imuno-histoquímicas foi usado umanticorpo monoclonal de rato anti-CD31 de camundongo (Pharmingen).Evaliação de apoptose.

Avaliação morfológica de apoptose foi avaliada de acordo comos critérios de Kerr. Por causa do número grande de células necróticasindividuais e apoptose induzida por isquemia próxima dos focos necróticos,apenas tecido pelo menos 1 HPF (High Power Field [Campo de PotênciaAlta] = 0,63 mm) longe das áreas de necrose foi considerado confiável paracontagem apoptótica. Casos com necrose tumoral massiva não foramavaliados. Todos os casos foram agrupados em uma das duas categorias: maisou menos do que 10 figuras apoptóticas /10 HPF.

Inibicão de proteases

Antes da estimulação com anticorpo as células foram tratadaspor 2 horas com os seguintes inibidores: amilorida 4 mM (Sigma) para inibirUroquinase; 1,10-fenantrolina 5 mM (Sigma) para inibir ADAM e proteasesdependentes de Zn; aprotinina 20 μg/mL e leupeptina 100 μg/mL para inibirserina e cisteína proteases, pepstatina A 10 μg/mL para inibir proteases ácidas(Calbiochem). PKC foi inibida pelo tratamento das células com TPA ΙμΜ por24 horas.

Métodos de triagem

A invenção proporciona ensaios para triagem de compostos deteste que modulam a expressão / função / atividade biológica de HGFR ouinduzem separação de domínio extracelular de HGFR na presença ou ausênciade HGF ou de outros agonistas de receptor.

Um composto de teste se liga em HGFR preferivelmenteinteragindo com a porção extracelular de receptor. Mais preferivelmente, umcomposto de teste diminui a atividade biológica mediada via HGFR por pelomenos cerca de 10, preferivelmente cerca de 50, mais preferivelmente cercade 75, 90, ou 100% relativo à ausência do composto de teste.

Um outro composto de teste preferivelmente regula expressãode HGFR. Mais preferivelmente, um composto de teste infra-regula proteínaou transcrito de HGFR em pelo menos cerca de 10, preferivelmente cerca de50, mais preferivelmente cerca de 75, 90, ou 100% relativo à ausência docomposto de teste.Compostos de teste

Os compostos de teste podem ser agentes farmacológicos,peptídeos ou proteínas já conhecidos na arte ou podem ser compostospreviamente desconhecidos em possuírem qualquer atividade farmacêutica.Os compostos de teste podem ser naturalmente ocorrentes ou planejados emlaboratório. Podem ser isolados de microorganismos, animais, ou plantas,podem ser produzidos por técnicas recombinantes ou sintetizados pormétodos químicos conhecidos na arte. Se desejado, os compostos de testepodem ser obtidos usando qualquer um dos numerosos métodos de bibliotecacombinatória conhecidos na arte, incluindo mas não limitados a, bibliotecasbiológicas, bibliotecas de fase de solução ou de fase sólida paralelaespacialmente localizáveis, métodos de biblioteca sintética requerendodeconvolução, o método de biblioteca "um-glóbulo um-composto", e métodosde biblioteca sintética usando seleção por cromatografia de afinidade. Aabordagem de biblioteca biológica é limitado às bibliotecas de polipeptídeo,enquanto que as outras quatro abordagens são aplicáveis às bibliotecas decompostos de polipeptídeos, de oligômeros de não-peptídeo, ou de moléculaspequenas.

Ensaios de ligação

Para os ensaios de ligação, o composto do teste épreferivelmente uma molécula que se liga na porção extracelular de HGFR,onde a citada molécula imita a atividade de AntiMet-R de tal modo que aatividade biológica normal de HGFR é evitada. Exemplos de tais moléculasincluem, mas não são limitados a, moléculas pequenas, peptídeos oumoléculas semelhantes a peptídeo.

Em ensaios de ligação, qualquer composto de teste ou porçãoextracelular de HGFR pode compreender uma marcação detectável, tal comouma marcação de radioisótopo, fluorescente, quimioluminescente, ouenzimática (e.g. iodo radiomarcado, fósforo radiomarcado, fluoróforos ouproteínas fluorescentes, luciferase, peroxidase de rábano ou fosfatasealcalina). Detecção de um composto de teste que é ligado no domínioextracelular de HGFR pode ser então realizada, por exemplo, por contagemdireta de radioemissão, por contagem de cintilação, ou por determinação deconversão de um substrato apropriado em um produto detectável, onde HGFRou uma porção de seu domínio extracelular é ligada em um suporte ouexpressada por uma célula ou pode ser recuperado de acordo com métodosbem conhecidos por um perito no campo.

Ensaios funcionas

Os compostos de teste podem ser testados para a capacidadede detectar um efeito biológico de HGFR. Tais efeitos biológicos podem serdeterminados usando os ensaios funcionais descritos no presente pedido. Sãoreferidos como o ensaio de crescimento independente de ancoragem e oensaio de invasão (ambos descritos em detalhe nos exemplos 2 e 11) e aavaliação do fenótipo transformado in vivo (descrito em detalhe nos exemplos3, 11, 12). Assim, ensaios funcionais podem ser realizados in vitro, usandoqualquer linhagem celular expressando HFGR ou in vivo usando qualquermodelo animal no qual é possível estudar o desenvolvimento de um tumorexperimental ou naturalmente ocorrente expressando o HGFR. Um compostode teste que diminui uma atividade biológica de HFGR em pelo menos cercade 10, preferivelmente de acordo com 50, mais preferivelmente cerca de 75,90, ou 100% é identificado como um agente farmacológico potencial paradiminuir a atividade biológica de HGFR.

EXEMPLOS

Exemplo 1. O anticorpo anti-Met AntiMET-R prejudica a transducão de sinalde HGFR.

AntiMET-R é um anticorpo monoclonal direcionado contra odomínio extracelular de receptor HGF onde ele reconhece um epítopo distintodaquele ligado pelo ligante. Este mAb comporta-se como um agonista parcial,porque não ativa todos os efeitos biológicos gerados pelo fator de crescimentode hepatócito (motilidade, proliferação, sobrevivência de célula, invasão,tubulogênese e angiogênese) mas induz apenas motilidade. Além disso, elesupra-regula a expressão constitutiva de ativador de plasminogênio de tipouroquinase mas não é capaz de induzir e manter a expressão de receptor deativador de plasminogênio de tipo uroquinase por períodos de tempoprolongados. Este mAb ativa a fosforilação de receptor, que, sendoestritamente dependente da bivalência de mAb, requer dimerização dereceptor.

Para solucionar a questão de se o anticorpos AntiMET-R poderepresentar uma ferramenta para interferir com a ativação de receptor HGFconstitutivo em tumores sobre- expressando, os inventores primeiroanalisaram sua atividade bioquímica e biológica em células de tumorcronicamente expostas ao anticorpo. Como um modelo, os inventores usaramcélulas GTL16, derivadas de um carcinoma gástrico de humano, onde HGFRé sobre-expressado e portanto oligomerizado e constitutivamente ativado (27).Figura IA mostra, uma redução significativa na expressão de HGFR efosforilação de tirosina.

O efeito do anticorpo sobre transdução de sinal de HGFR foientão avaliado. Visto que é sabido que HGFR promove um programa anti-apoptótico forte pela estimulação de ativação Akt, os inventores avaliaram onível de fosforilação de Akt sob tratamento com AntiMET-R. Como mostradoem Figura 1B, fosforilação de Akt foi inibida em ambas condições basais ecélulas estimuladas por HGF.

Outra rota importante ativada por HGFR é a rota MAPK,conhecida em estar envolvida na estimulação de crescimento celular. Osinventores checaram o nível de ativação de MAPKs em células tratadas com oanticorpo, mas não observaram inibição significativa desta rota (dados nãomostrados).

Exemplo 2. AntiMET-R inibe o fenótipo transformado de células de câncer invitro.

O efeito do anticorpo sobre o crescimento celular e sobre ofenótipo transformado foi avaliado pela medição da capacidade das células decrescerem em maneira dependente e independente de ancoragem e deinvadirem as matrizes extracelulares. Como mostrado em Figura 2A, não foiobservada diferença na capacidade das células de crescerem em condições dedependência de ancoragem sob tratamento com anticorpo.

Crescimento dependente de ancoragem é estritamentedependente da capacidade das células para suplantarem apoptose devido àfalta de ancoragem, a denominada "anoikis"; esta propriedade é normalmenteanalisada pela avaliação da capacidade das células para crescerem em ágarmole (28). Visto que muitos relatórios têm mostrado que ativação de HGFR écapaz de conferir às células esta propriedade, os inventores semearam célulasGTL16 em ágar 0,5% e mantiveram a cultura na presença ou ausência dequantidades diferentes de AntiMET-R ou de um anticorpo isótipo-combinadoirrelavante (VSV-G), como um controle. Como mostrado em Figura 2B,células tratadas e não tratadas com foram capazes de formarem numerosascolônias. De modo oposto, AntiMET-R dramaticamente inibiu o crescimentoancoragem-independente de células de câncer em uma maneira dependente dedose. É interessante notar que as células GTL16 foram capazes de formaremcolônias em ensaio de ágar mole até mesmo em condição basal, devido àativação de HGFR constitutiva, e que o anticorpo reduziu o fenótipotransformado destas células em ambas na presença e na ausência de HGF.

Para avaliar a capacidade do anticorpo para interferir com ainvasividade celular, os inventores estudaram MDA-MB-435 β4, umalinhagem celular de carcinoma mamário que, em resposta ao HGF, é capaz deinvadir membranas basais reconstituídas (29). Como mostrado em Figura 2C,tratamento in vitro destas células com AntiMET-R resultou em uma reduçãodose-dependente de propriedades invasivas em resposta ao HGF.

Exemplo 3. AntiMET-R inibe o fenótipo transformado in vivo

Para avaliar a atividade de AntiMET-R sobre crescimento detumor in vivo, os inventores inocularam subcutaneamente células GTL16 noflanco posterior de camundongos fêmeas nu/nu imunodeficientes. Os animaisforam tratados duas vezes por semana com AntiMET-R ou VSV-G,administrado in situ (2 \iglg). A terapia iniciou 1 semana após o transplante,com surgimento de tumores no sítio de injeção: apenas animais possuindotumores de tamanho comparável foram tratados por 4 semanas. Volume detumor foi monitorado durante todo o tratamento e um crescimento diminuídofoi observado em camundongos tratados com AntiMET-R (Figura 3A). Apóso tratamento, os camundongos foram autopsiados e os tumores foramexcisados e pesados. Como mostrado em Figura 3B, em camundongostratados com AntiMET-R, tumores foram significativamente menores do queem controles (p < 0,05). Nestes tumores o nível de ativação de HGFR,mostrado por coloração com anticorpos específicos contra a forma fosforiladado receptor, foi diminuído (Figura 3C) enquanto que a presença de célulasapoptóticas foi significativamente aumentada (Figura 3D). Além disso ospresentes inventores avaliaram nas seções de tumor após coloração comhematoxilina/eosina figuras mitóticas e apoptóticas. Embora apoptose fossesignificativamente aumentada em tecidos de tumor obtidos de camundongostratados com o AntiMET-R, o número de mitoses foi quase não modificado(dados não mostrados) .

Os inventores realizaram o mesmo topo de experimentostambém em células MDA-MB-435 β4, um sistema modelo para metástaseespontânea in vivo (29). Animais foram tratados duas vezes por semana comdoses diferentes de AntiMET-R ou o anticorpo de controle, administradosquer sistemicamente (1 μg/g ou 10 μg/g intraperitonealmente) quer no tumor(2 μ g/g in situ). A terapia iniciou no dia do transplante e foi realizada por oitosemanas (o tempo para o potencial metastático ser expressado). Apóstratamento, os camundongos foram autopsiados e análise de tumoresprimários e pulmões (o sítio privilegiado de metásteses para estas células) foirealizada. Órgãos diferentes (baço, medula óssea, fígado, coração, osso e rim)também foram examinados para rejeitar efeitos tóxicos potenciais. Análisemacroscópica mostrou que o tratamento com AntiMET-R resultou eminibição de crescimento da massa de tumor primário (Figura 4A-E e K).Coloração imuno-histoquímica com anticorpos reconhecendo a formatirosina-fosforilada de HGFR mostrou, também neste caso, uma reduçãomarcante de ativação de receptor (Figura 4F-J). Além disso, análisemicroscópica das seções de pulmão revelou que ambas a injeção de tumorintra e a administração sistêmica de AntiMET-R preveniram a o surgimentode metástases distantes no pulmão e nos órgãos inspecionados (Figura 4L).

Visto que muitos trabalhos têm mostrado que HGF é um fatorangiogênico potente e que sinalização de HGFR contribui para angiogênesede tumor, os inventores analisaram a vascularização de tumor sob tratamentocom AntiMET-R. Nestes tumores os inventores verificaram uma reduçãosignificativa do número de vasos (que foram menos e maiores em tamanho) ede suas ramificações (Figura 4 M,N). Os inventores assim concluem que oefeito anti-tumor e anti-metastático observado do tratamento foi devido à açãocombinada do anticorpo sobre o tumor e sobre os vasos germinando domicroambiente.

Exemplo 4. AntiMET-R induz regulagem negativa de HGFR

Para estudar o mecanismo através do qual AntiMET-R é capazde interferir com ativação de HGFR, os inventores trataram células sobre-expressando HGFR quer com AntiMET-R quer com VSV-G; este casoparece-se com o que é freqüentemente observado em muitos tumoresnaturalmente ocorridos. Como mostrado em Figura 5A, os inventoresobservaram que a quantidade total de HGFR diminuiu, em uma maneiradependente de tempo, sob tratamento com AntiMET-R mas não com VSV-G.Isto sugere que o anticorpo anti-Met especificamente induziu regulagemnegativa de receptor. É interessante sublinhar que nestas células, sobre-expressando HGFR, HGF, o ligante, foi incapaz de induzir regulagemnegativa de receptor (Figura 6, painel inferior).

Os inventores então verificaram se o anticorpo AntiMET-Rpoderia disparar regulagem negativa de receptor também em célulasexpressando níveis normais de HGFR. Como mostrado em figura 5B, painelesquerdo, também nestas células, AntiMET-R eficientemente infra-regulouHGFR.

Redução anticorpo-induzida de HGFR exposto na membranacelular também foi avaliada por análise FACS. A análise citofluorimétricamostrou que o tratamento com anticorpo reduziu a quantidade de HGFRexpressado na superfície celular com eficiência maior do que a do próprioHGF (Figura 5B, painel direito). Uma redução similar, no mesmo ensaio,também foi observado em células GTL16 (não mostrado).Exemplo 5. Mecanismo molecular de regulagem negativa de HGFR induzidapor AntiMET-R

Regulagem negativa independente de anticorpo e dependentede ligante pode seguir rotas diferentes. Regulagem negativa de RTKsdependente de ligante é um processo de múltiplas etapas incluindointernalização, ubiquitinilação, classificação endossomal e finalmentedegradação lisossomal ou proteassomal (30).

Para avaliar qual rota de degradação está envolvida em intra-regulação de HGFR induzida por anticorpo,os inventores bloquearam aatividade quer de lisossomo quer de proteassomo com os inibidoresespecíficos concanamicina e lactacistina, respectivamente, antes daestimulação com anticorpo. Surpreendentemente, embora inibição da rotaproteassomal severamente prejudicou a degradação de HGFR induzida porligante, não afetou regulagem negativa de receptor devido ao tratamento comAntiMET-R (Figura 6A, painel superior), assim indicando que o anticorpo e oligante promovem regulagem negativa de HGFR através de mecanismosmoleculares diferentes. Além disso, quando a atividade do proteassomo foienfraquecida, um fragmento de 60 Kd, dificilmente detectável em condiçãobasal, foi pesadamente acumulado em células sob tratamento com anticorpo(Figura 6A, painel inferior). Este fragmento foi detectável sobre Western blotsapenas com um anticorpo anti-HGFR intracelular e consistiu no domíniocitoplásmico do receptor. Além disso, como esperado para moléculas postassob degradação proteassomal, o fragmento de 60 Kd foi etiquetado comgrupos ubiquitina (Figura 6B).

Como o domínio extracelular (Ectodomain) do receptor nãofoi detectável em lisados de célula sob tratamento com AntiMET-R, osinventores verificaram se ele foi liberado para fora das células sob clivagem,um fenômeno conhecido como "separação" (31). Para testar esta hipótese osinventores olharam para a presença do ectodomínio HGFR em meio decultura de célula. Células foram metabolicamente marcadas com S-Cisteinae 35S-Metionina radioativas e então tratadas com HGF ou AntiMET-R por 4horas. Meios foram coletados e submetidos à imunoprecipitação com umanticorpo anti-HGFR reconhecendo o domínio extracelular. Como mostradoem Figura 7A, do meio de cultura de células metabolicamente marcadas, osinventores imunoprecipitaram uma banda correndo sob condições não-redutoras com um MW aparente de 130 Kd (correspondendo ao complexo dascadeias-αβ extracelulares); quando o gel foi corrido sob condições redutoras,o complexo foi resolvido nas duas bandas de 80Kd (cadeia-β) e 45Kd (cadeia-a). Embora estimulação de HGF não intensificou este processo, separação dereceptor foi dramaticamente aumentada sob ligação de anticorpo. De acordocom dados prévios (15), uma quantidade pequena de ectodomínio de HGFR, éconhecidamente constitutivamente liberada no ambiente extracelular. Einteressante sublinhar que separação de ectodomínio induzida por anticorpotambém foi observada em células expressando níveis normais de HGFR, taiscomo células endoteliais (Fig. 7B).

Pelo tratamento das células com quantidade crescente deanticorpo por 4 horas os inventores observaram que separação de HGFRmediada por anticorpo foi dependente de dose (Figura 7C). Para analisar acinética de separação de HGFR induzida por anticorpo, os inventoresestimularam as células com a mesma quantidade de AntiMET-R ou VSV-Gpor tempos diferentes. Níveis crescentes do ectodomínio foram detectados nomeio de células tratadas com AntiMET-R - mas não com VSV-G, mostrandoque a separação induzida por anticorpo foi específica e dependente de tempo(Figura 7D) .

Exemplo 6. Separação de HGFR induzida por anticorpo ocorre na superfícieda célula

Para testar se endocitose é requerida para separação de HGFRos inventores utilizaram uma linhagem celular estavelmente transfectadascom uma forma mutante de Dynamin (Dyn K44A), que conhecidamenteprejudica a endocitose dependente de clatrina e cuja expressão está sob ocontrole de um sistema regulado por tetraciclina. Células foram mantidas por48 horas quer na presença (Ctr) quer na ausência (K44A Dyn) de tetraciclinacom o objetivo de enfraquecer a endocitose como uma conseqüência daexpressão de mutante Dynamin. Como mostrado em Figura 7D, separaçãoinduzida por anticorpo não foi enfraquecida em células nas quais foi inibidaendocitose dependente de clatrina.

As proteases mais comumente envolvidas na separação deproteínas de membrana pertencem às α-secretases da família ADAM. Em umatentativa para identificar a enzima responsável pela separação de HGFR, oagente quelante de Zn, 1,10-fenantrolina, um inibidor de ADAMS e dasproteases dependentes de Zn, foi adicionado nas células antes do tratamentocom anticorpo. Nesta condição, a separação de receptor não foi afetada (dadosnão mostrados), mostrando que a clivagem proteolítica de ectodomínio deHGFR não é mediada por α-secretase mas por uma protease independente deZn.

Visto que é sabido que HGFR transcricionalmente regulagenes envolvidos em coagulação de mancha, os inventores também checaramse uma protease do sistema de coagulação poderia ser responsável pelaseparação de ectodomínio. Contudo, o papel dos fatores pró-coagulantes nesteprocesso foi rejeitado porque sua inibição com aprotinina não alterou aseparação de ectodomínio de HGFR induzida por anticorpo (dados nãomostrados). Usando um painel de outros inibidores (amilorida, pepstatina A,leupeptina) os inventores também excluíram o envolvimento de outrashidrolases conhecidas, tais como Uroquinase, proteases ácidas, serina ecisteína proteases (dados não mostrados). Além disso, os inventores tambémprovaram que separação do ectodomínio é independente da ativação de PKCa,porque inibição desta enzima com dose alta (1 μΜ) e tratamento prolongado(24 horas) com o forbol éster TPA, não diminuiu a separação de ectodomínio(dados não mostrados).

Este conjunto de experimentos, todos realizados com oscontroles positivos apropriados, indica que a enzima responsável pelaseparação de ectodomínio de HGFR está fora da lista das proteasesobviamente envolvidas em separação de receptor.

Exemplo 7. Ativação de HGFR não é requerida para separação induzida poranticorpo.

Como os inventores previamente relataram, um complexotrimérico contendo Endofilina, CIN85 e Cbl medeia regulagem negativa deHGFR dependente de ligante (32). Este complexo é recrutado para o receptorsob ativação de HGFR e promove endocitose, ubiquitinilação e degradação dereceptor. Com o objetivo de verificar se ativação de receptor e transdução desinal são requeridos para separação e infra-modulação induzidas poranticorpo, os inventores estimularam a capacidade de AntiMET-R para infra-regular vários mutantes de HGFR. Os inventores expressaram em célulasCOS-7 quer HGFR de tipo selvagem quer qualquer um dos seguintesmutantes: i) MET KD, codificador de um receptor "morto" destituído deatividade de tirosina quinase, devido a uma substituição de Lys-Ala nacavidade de ligação de ATP, ii) MET "duplo", codificador de um HGFRfaltante de tirosinas Yl349, Yl356 ancorando os transdutores de sinal, iii)MET-GFP, um mutante negativo dominante onde a seqüência codificadora dedomínio intracelular inteiro do receptor foi substituída por seqüências GFP.

Quarenta e oito horas após transfecção, células foram tratadas com AntiMET-R por 3 horas. Extratos celulares e meios extracelulares foram analisados porWestern blot. Inesperadamente, AntiMET-R foi capaz de disparar regulagemnegativa e de induzir separação de HGFR em todos os mutantes (Figura 8).

Este experimento sugere que regulagem negativa de receptor de HGFinduzida por anticorpo não requer atividade de quinase, nem o recrutamentode transdutores citoplásmicos, e que o domínio intracelular inteiro édispensável para o processo. Isto adicionalmente confirma que o anticorpo e oligante ativam mecanismos infra-regulatórios diferentes.

Exemplo 8. O ectodomínio separado de HGFR comporta-se como uma "isca"Visto que tem sido mostrado que um domínio extracelulargeneticamente engenheirado do HGFR pode efetivamente funcionar comomolécula "isca" negativa dominante (33), os inventores testaram a capacidadedo ectodomínio separado na inibição de sinalização de HGFR. Células pré-tratadas opor 72 h com AntiMET-R ou VSV-G foram estimuladas por temposdiferentes com HGF quer na presença (Figura 9, pistas 4-6) quer na ausência(pistas 7-9) de ectodomínio de HGFR no meio de cultura. Como mostrado, napresença de ectodomínio de HGFR, fosforilação de Akt ativada por HGF foifortemente enfraquecida, confirmando assim a idéia de que o fragmentoseparado, como a isca (33), atua como ambos um competidor pela ligação deHGF como uma molécula negativa dominante interferindo com ativação deHGFR.

Exemplo 9. O anticorpo aeonista AntiMET-R DO-24 não induz separação deectodominio.

A capacidade agonista deste anticorpo não é suficiente - per se- para justificar sua atividade terapêutica. De fato, um anticorpo monoclonalantiMET-R diferente (DO-24) que temos examinado não promove separaçãoda porção extracelular do receptor mas é capaz de totalmente ativar oreceptor.

Exemplo 10. Produção de AntiMET-R por meio de transferência de gene viavetor lentiviral.

Os inventores inseriram seqüências de cadeias pesada e leve deAntiMET-R em um vetor lentiviral bidirecional (51) (Fig. 10A, 15 e 16). Estevetor lentiviral permite a expressão coordenada de dois cDNAs separadosgraças à presença de um promotor sintético (ACCTGGGTT, SEQ ID No.:4)obtido juntando um promotor de núcleo mínimo (promotor minCMV) amontante e em orientação oposta ao promotor hPGK (51). Este promotorsintético é capaz de conduzir a atividade de transcrição em ambas as direções.Assim posicionamento de dois cDNAs codificadores de AntiMET-R, um amontante em orientação de anti-senso (a cadeia leve) e o outro a jusante emorientação de senso (a cadeia pesada), é possível gerar coordenadamente doismRNAs independentes. Os inventores produziram partículas de vetor comtransfecção transiente de células 293T como descrito. Então, paramodificação permanente do genoma de células alvo, os inventores infectaramum a painel de linhagens de células derivadas de carcinoma com sobrenadantecontendo partículas de vetor. Após infecção, as células foram privadas domeio sem soro e incubadas por 72 horas para coletar os sobrenadantes decultura de célula. A presença de anticorpo AntiMET-R foi avaliada pelaanálise de Western Blot (Fig. 10B) e a quantificação de AntiMET-R foi feitapor ELISA (Fig. 10C). Todas as linhagens de células transduzidas produziramo anticorpo AntiMET-R que foi corretamente secretado no sobrenadante decultura. A produção do anticorpo foi variável, dentro da faixa de 0,2-6 μg/mL,dependendo da linhagem de célula analisada. A especificidade de AntiMET-Rrecombinante foi controlada pelo ensaio de imunoprecipitação (Fig. 11A),enquanto que a afinidade de ligação foi avaliada pelo ensaio ELISA (Fig.11B). AntiMET-R recombinante foi capaz de especificamente reconhecer oreceptor de Met com uma afinidade dentro da mesma faixa de uma obtidapelo AntiMET-R convencionalmente produzido pelo hibridoma. Além disso,o AntiMET-R recombinante, como o AntiMET-R produzido pelo hibridoma,foi capaz de induzir a clivagem proteolítica de Met e separação do DomínioExtraCelular (Fig. 12).

Exemplo 11. Transducão com vetor lentiviral codificador de AntiMET-Rinibe o fenótipo transformado de células de câncer in vitro e in vivo.

Os inventores transduziram células HCT-116 com vetorlentiviral codificador de AntiMET-R (25 ng p24/mL). Células transduzidasforam testadas, em comparação com células de tipo selvagem, para seufenótipo transformado, analisando propriedades de invasão e crescimentoindependente de ancoragem em tumorigênese in vitro e in vivo. Paracrescimento independente de ancoragem, os inventores semearam célulasprodutoras de antiMET-R e células de tipo selvagem como controle em ágar0,5% e as colônias obtidas após 15 dias de cultura foram contadas. Célulastransduzidas foram inibidas em sua capacidade de crescimento independentede ancoragem visto que crescem para um número reduzido de colônias, sãomenores em tamanho comparadas com as colônias geradas com células detipo selvagem (Fig. 13A). Para testar invasividade celular, os inventoresanalisaram a capacidade das células para invadirem membrana basalreconstituída. Como mostrado em Fig. 13B células transduzidas mostraramuma redução de suas propriedades invasivas. Os inventores também testarama tumorigênese in vivo das células transduzidas com vetor lentiviralcodificador de AntiMET-R injetando-as sub-cútis dentro do flanco decamundongos nus atímicos. Dados mostrados em Fig. 13 C e D indicaram queas células transduzidas foram enfraquecidas em suas propriedades detumorigênese in vivo porque latência de tumor e crescimento de tumor foraminibidas em comparação com células de tipo selvagem.

Exemplo 12 : Administração de intra-tumor direta de vetor lentiviralcodificador de AntiMET-R inibe crescimento de tumor.

Para se ter prova formal da eficácia de transferência de geneAntiMET-R, os inventores administraram partículas de vetor lentiviraltrazendo cDNAs codificadores de anticorpo diretamente em tumores pré-formados por injeção sub-cútis de células HCT-116 no flanco decamundongos nus. Tumores tratados como vetores codificadores deAntiMET-R mostraram velocidade de crescimento mais lenta em comparaçãocom os tumores tratados com vetor de controle (Fig. 14).

Exemplo 13: Sítio de ligação de AntiMET-R em ectodomínio de Met.

Para mapear o epítopo reconhecido por AntiMET-R,experimentos de imunoprecipitação foram realizados usando domíniosextracelulares diferentes do Receptor de Fator de Crescimento de Hepatócito(também conhecido como ectodomínio Met) (Fig. 17).

-Isca Met (aminoácidos 1-932): é uma proteína recombinantesolúvel correspondendo à região extracelular inteira de Met de humanotrancada antes do domínio de transmembrana (Michieli et al. 2004);

-SEMA PSI (aminoácidos 1-562): é uma forma trancada deIsca Met contendo o domínio SEMA (aminoácidos 1-515) (Stamos et al,2004; Gherardi et al. 2004) e a região PSI (aminoácidos 516-562) (Kozlov etal. 2004).-PSIIPT (aminoácidos 1-24; 516-932): é uma forma truncadade Isca Met contendo a seqüência líder endógena (aminoácidos 1-24)fusionada na região PSI (aminoácidos 516-562) e os quatro domínios IPT(aminoácidos 563-932) (Bork et al, 1999; Gherardi et al., 2004).

Uma etiqueta poli-histidina e etiqueta de epítopo-Myc foramadicionadas na terminação-C de cada molécula.

Seqüência de Isca Met foi derivada da seqüência codificadacom o Número de Acesso do Gene Bank de X54559 (Giordano et al., 1991);esta seqüência corresponde ao transcrito maior do gene Met de humano quecodifica uma proteína tirosina quinase que é corretamente processada e estálocalizada na membrana.

Outros relatórios referem-se à seqüência codificada com oNúmero de Acesso do Gene Bank de J02958 (Park ey al., 1987); estanumeração corresponde a um transcrito menor alternativamente editorado contendo uma inserção de 54pb em posição do nucleotídeo 2264 aonucleotídeo 2318. Este transcrito codifica uma proteína tirosina quinase quenão é corretamente processada e não está localizada na membrana (Rodriguezet al., 1991). De acordo com esta seqüência, a região extracelular de Metcorresponde aos aminoácidos 1-950 e o terceiro domínio IPT (IPT3) contém uma inserção de 18 aminoácidos.

Tabela 1 sumariza as posições dos domínios diferentes de Metde acordo com as seqüências X54559 e J02958.

Tabela 1.

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Os cDNAs para as moléculas engenheiradas foramsubclonados no vetor lentiviral pRRL.sin.PPT.CMV.Wpre (Follenzi et al.,2000); partículas lentivirais recombinantes foram produzidas em grandeescala e usadas para transduzir linhagens de célula de tumor de humano(Michieli et al., 2004).

Meios condicionados de células MDA-MB-435 transduzidascom Isca Met myc-etiquetada, SEMA PSI e PSIIPT foram imunoprecipitadascom o anticorpo AntiMET-R e detectadas por Western blot usando umanticorpo biotinilado anti-myc (Fig. 18, painel direito). Quantidades iguais demeios condicionados foram carregadas como um controle para a expressão deproteína (fig. 18, painel esquerdo), no qual o controle é um meiocondicionado de células MDA-MB-435 transduzidas com um vetor lentiviralvazio. Como mostrado no painel direito de Figura 18, AntiMET-R é capaz deimunoprecipitar Isca Met e PSI-IPT mas não SEMAPSI. Portanto, reconheceuum epítopo na região IPT.

Para mapear com mais detalhe o epítopo reconhecido peloanticorpo AntiMET-R experimentos de imunoprecipitação foram realizadosusando domínios IPT individuais (Bork et al., 1999). Cada IPT é uma formatrancada de PSI-IPT contendo a seqüência líder endógena (aminoácidos 1-24)fusionada em IPT 1 (aminoácidos 563-656) ou IPT 2 (aminoácidos 657-741)ou IPT 3 (aminoácidos 742-838) ou IPT 4 (aminoácidos 839-932).

Uma etiqueta de poli-histidina e etiqueta de Flag-epítopoforam adicionadas na terminação-C de cada molécula. Os cDNAs para asmoléculas engenheiradas foram subclonados no mesmo vetor lentiviral comopreviamente relatado e partículas lentivirais recombinantes foram usadas paratransduzir linhagens de célula de tumor.

Todas estas proteínas recombinantes são fatores solúveis, masIPT 2 não é secretado para o meio condicionado das células transduzidas. Poreste motivo os experimentos de imunoprecipitação foram realizados emlisados de célula.Lisados celulares de células MDA-MB-435 transduzidas comIPTs individuais etiquetados com indicador foram imunoprecipitados com oanticorpo AntiMET-R e detectados por Western blot usando um anticorpoanti-indicador (Fig. 19, painel esquerdo); quantidades similares de Westernblot usando o mesmo anticorpo anti-indicador, como um controle paraexpressão de proteína (Fig. 19, painel direito).

Como mostrado no painel esquerdo, AntiMET-R é capaz deimunoprecipitar IPT 4, mas nenhum dos outros três domínios LPT. AntiMET-R reconhece um epítopo contido no domínio IPT 4 da região extracelular MET.

Exemplo 14: AntiMET-R reconheceu o HGFR em células intactas por análiseFACS ou análise de imunofluorescência.

Células GTL-16, uma linhagem de célula de carcinomagástrico de humano, foram incubadas com o anticorpo AntiMET-R. Perfil deGTL-16 analisado por citometria de fluxo revelou que o antiMET-R foi capazde especificamente corar células expressando o HGFR. De fato a média daintensidade de fluorescência em células marcadas com o anticorpo antiMet-Rfoi aumentada com respeito às células ctrl (Fig. 20, painel A). Células GTL-16 também foram incubadas, após fixação, com o anticorpo antiMet-R pararealizar uma análise de imunofluorescência. A coloração revelou umamarcação específica sobre as superfícies celulares correspondendo ao receptorMet (Fig. 20, painéis B,C).

Naturalmente, embora o princípio da invenção permaneça omesmo, os detalhes de construção e as modalidades podem amplamente variarcom respeito ao que tem sido descrito e ilustrado puramente por meio deexemplo, sem se desviarem do escopo da presente invenção como definidonas reivindicações anexadas.BIBLIOGRAFIA

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51. Amendola M, Venneri MA, Biffi A, Vigna E, Naldini L.(2005) Nature Biotech. 23: 108-116.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Università degli Studi di Torino

<120> Anticorpo monoclonal Anti-Met, fragmentos e vetores do mesmo para otratamento de tumores e produtos correspondentes<13O> BW08034-CF

<150> EP06101345.5

<151> 2006-02-06

<160 > 13

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 1386

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Cadeia pesada de AntiMET-R<400> 1

atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgg ccactcccag 60gtccaactgc agcagcctgg gactgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagt tactggatac actgggtgaa gcagaggcct 180ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca gcggtcgtac taactacaac 240gagaaattca agaacaaggt cacagtgact gtagacaaat cttccaccac agcctacatg 300caactcagca acctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag taggggctac 360tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagccaaaa caacagcccc atcggtctat 420ccactggccc ctgtgtgtgg aaatacaact ggctcctcgg tgactctagg atgcctggtc 480aagggttatt tccctgagcc agtgaccttg acctggaact ctggatccct gtccagtggt 540gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct gacctctaca ccctcagcag ctcagtgact 600gtaacctcga gcacctggcc cagccagtcc atcacctgca atgtggccca cccggcaagc 660agcaccaagg tggacaagaa aattgagccc agagggccca caatcaagcc ctgtcctcca 720tgcaaatgcc cagcacctaa cctcttgggt ggaccatccg tcttcatctt ccctccaaag 780atcaaggatg tactcatgat ctccctgagc cccatagtca catgtgtggt ggtggatgtg 840agcgaggatg acccagatgt ccagatcagc tggtttgtga acaacgtgga agtacacaca 900gctcagacac aaacccatag agaggattac aacagtactc tccgggtggt cagtgccctc 960cccatccagc accaggactg gatgagtggc aaggagttca aatgcaaggt caacaacaaa 1020gacctcccag cgcccatcga gagaaccatc tcaaaaccca aagggtcagt aagagctcca 1080caggtatatg tcttgcctcc accagaagaa gagatgacta agaaacaggt cactctgacc 1140tgcatggtca cagacttcat gcctgaagac atttacgtgg agtggaccaa caacgggaaa 1200acagagctaa actacaagaa cactgaacca gtcctggact ctgatggttc ttacttcatg 1260tacagcaagc tgagagtgga aaagaagaac tgggtggaaa gaaatagcta ctcctgttca 1320gtggtccacg agggtctgca caatcaccac acgactaaga gcttctcccg gactccgggt 1380aaatqa 1386

<210> 2<211> 717<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Cadeia leve de AntiMET-R<400> 2

a t- naana CΛçy acacaatcct actatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg gtagttatat gagttggttc 180caacagagac caggacagcc acccaaactc ctcatctctg ctgcatccaa tctagaatct 240gggatcccag ccaggtttag tggcagtggc tctgggacag acttcaccct caatatccat 300cctgtggagg aggaggatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagttatga ggatccgctc 360acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660actcacaaga catctacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag 717

<210> 3

<211> 1473

<212> DNA

<213> artificial

<22 O >

<223> Cadeia pesada de Anti-MET-R com uma seqüência tag para 3'

<400> 3 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgg ccactcccag 60gtccaactgc agcagcctgg gactgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagt tactggatac actgggtgaa gcagaggcct 180ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca gcggtcgtac taactacaac 240gagaaattca agaacaaggt cacagtgact gtagacaaat cttccaccac agcctacatg 300caactcagca acctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag taggggctac 360tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagccaaaa caacagcccc atcggtctat 420ccactggccc ctgtgtgtgg aaatacaact ggctcctcgg tgactctagg atgcctggtc 480aagggttatt tccctgagcc agtgaccttg acctggaact ctggatccct gtccagtggt 540gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct gacctctaca ccctcagcag ctcagtgact 600gtaacctcga gcacctggcc cagccagtcc atcacctgca atgtggccca cccggcaagc 660agcaccaagg tggacaagaa aattgagccc agagggccca caatcaagcc ctgtcctcca 720tgcaaatgcc cagcacctaa cctcttgggt ggaccatccg tcttcatctt ccctccaaag 780atcaaggatg tactcatgat ctccctgagc cccatagtca catgtgtggt ggtggatgtg 840agcgaggatg acccagatgt ccagatcagc tggtttgtga acaacgtgga agtacacaca 900gctcagacac aaacccatag agaggattac aacagtactc tccgggtggt cagtgccctc 960cccatccagc accaggactg gatgagtggc aaggagttca aatgcaaggt caacaacaaa 1020gacctcccag cgcccatcga gagaaccatc tcaaaaccca aagggtcagt aagagctcca 1080caggtatatg tcttgcctcc accagaagaa gagatgacta agaaacaggt cactctgacc 1140tgcatggtca cagacttcat gcctgaagac atttacgtgg agtggaccaa caacgggaaa 1200acagagctaa actacaagaa cactgaacca gtcctggact ctgatggttc ttacttcatg 1260tacagcaagc tgagagtgga aaagaagaac tgggtggaaa gaaatagcta ctcctgttca 1320gtggtccacg agggtctgca caatcaccac acgactaaga gcttctcccg gactccgggt 1380aaagctagct ctgactacaa ggacaacgat gacaagaacg attacaaaga cgatgatgat 1440aagctgcagc atcaccacca tcatcaccat tga 1473

<210> 4<211> 9<212 > DNA<213> artificial<220 >

<223> promoter sintético - a montante<400> 4

acctgggtt 9

<210> 5

<211> 13

<212> DNA

<213 > artificial

<22 0 >

<223> promoter sintético - a jusante<400> 5

attggttggt tgg<210> 6<211> 461<212> PRT<213> artificial<220>

<223> Cadeia pesada de AntiMET-R<400> 6

Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp15 10 15

Gly His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Asn Lys Val Thr Val Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr85 90 95

13Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 HO

Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

115 120 125

Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro

130 135 140

Val Cys Gly Asn Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val145 150 155 160

Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu

180 185 190

Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser

195 200 205

Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val

210 215 220.

Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro225 230 235 240

Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile

245 250 255

Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile

260 265 270

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln

275 280 285

Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

290 295 300

Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu305 310 315 320

Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys

325 330 335

Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys

340 345 350

Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro

355 360 365

Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr

370 375 380

Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys385 390 395 400

Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

405 410 415

Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val420 425 430Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn

435 440 445

His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 7<211> 238<212> PRT<213> artificial<220>

<223> Cadeia leve de AntiMET-R<400> 7

Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro15 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr Met Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser65 70 75 80

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 HO

Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly

165 170 175

Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp

195 200 205

Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr

210 215 220

Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys225 230 235

<210> 8<211> 8<212> PRT<213> artificial<22O>

<223> Cadeia pesada de AntiMET-R - CDR-Hl<400> 8

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp1 5

<210> 9<211> 8<212> PRT<213> artificial<220>

<223> Cadeia pesada de AntiMET-R - CDR-H2<400> 9

Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Thr1 5

<210> 10<211> 5<212> PRT<213> artificial<220>

<223> Cadeia pesada de Anti-MET-R - CDR-H3<400> 10

Ala Ser Arg Gly Tyr1 5

<210> 11<211> 10<212> PRT<213> artificial<220>

<223> Cadeia leve de AntiMET-R - CDR-Ll<400> 11

Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr1 5 10

<210> 12<211> 3<212> PRT<213> artificial<220>

<223> Cadeia leve de AntiMET-R - CDR-L2<400> 12Ala Ala Ser1

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> artificial

<22O >

<223> Cadeia leve de AntiMET-R - CDR-L3<400> 13

Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr1 5

Claims (30)

1. Uso de um anticorpo monoclonal, um fragmento e/ouanticorpo geneticamente engenheirado ou humanizado, i) citado anticorpomonoclonal sendo anticorpo monoclonal anti-Met, ii) citado fragmento sendofragmento contendo a região de ligação de epítopo de um anticorpomonoclonal anti-Met e/ou iii) citado anticorpo sendo anticorpo geneticamenteengenheirado ou humanizado contendo a região de ligação de epítopo de umanticorpo monoclonal anti-Met, caracterizado pelo fato de ser para a produçãode um medicamento para o tratamento de tumor e/ou metástases em umpaciente sofrendo de tumor, em que o citado anticorpo é produzido pelalinhagem de célula de hibridoma ICLC PD 05006.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que os citado anticorpo, citado fragmento e/ou citado anticorpogeneticamente engenheirado estão na forma de proteína solúvel.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o citado anticorpo e/ou citado anticorpo geneticamenteengenheirado são produzidos por um método selecionado do grupoconsistindo de técnica recombinante de DNA, síntese em fase sólida, sínteseem fase líquida.

4. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o citado fragmento é selecionado do grupo consistindo de Fab,F(ab')2, Fab1, Fv, scFv, e um peptídeo contendo a região de ligação de epítopo.

5. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o citado fragmento é produzido por um método selecionado dogrupo consistindo de clivagem proteolítica de citado anticorpo, técnicarecombinante de DNA, síntese em fase sólida, síntese em fase líquida.

6. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o citado medicamento é administrado por injeção ou por infusão.

7. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o citado tumor é selecionado de tumor colorretal, e tumorhepático.

8. Uso de uma seqüência de nucleotídeos codificadora de i) umanticorpo monoclonal anti-Met, ii) um fragmento contendo a região deligação de epítopo de um anticorpo monoclonal anti-Met, ou iii) um anticorpogeneticamente modificado ou humanizado contendo a região de ligação deepítopo de um anticorpo monoclonal anti-Met, caracterizado pelo fato de serpara a produção de um medicamento para o tratamento de tumor e/oumetástases em um paciente sofrendo de tumor, em que o citado anticorpomonoclonal anti-Met é produzido pela linhagem de célula de hibridoma ICLCPD 05006.

9. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que a seqüência de nucleotídeos compreende pelo menos:i) SEQ ID NO.: 1 e SEQ ID NO.:2,ii) uma seqüência de nucleotídeos correspondendo a SEQ IDNO.: 1 e SEQ ID NO.:2, na qual uma ou mais substituições conservativasestão presentes, ouiii) SEQ ID NO.:8 (CDR-H1), SEQ ID NO.:9 (CDR-H2), SEQID NO.: 10 (CDR-H3), SEQ ID NO.: 11 (CDR-L1), SEQ ID NO.: 12 (CDR-L2) e SEQ ID NO.: 13 (CDR-L3).

10. Uso de um vetor compreendendo pelo menos umaseqüência de nucleotídeos codificadora de i) um anticorpo monoclonal anti-Met, ii) um fragmento contendo pelo menos uma região de ligação de epítopode um anticorpo monoclonal anti-Met, ou iii) um anticorpo geneticamentemodificado ou humanizado contendo a região de ligação de epítopo de umanticorpo monoclonal anti-Met, em que o anticorpo monoclonal anti-Met éproduzido pela linhagem de célula de hibridoma ICLC PD 05006,caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para otratamento de tumor e/ou metástases em um indivíduo sofrendo de tumor.

11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelofato de que o citado vetor compreende uma seqüência de nucleotídeosselecionada de:i) SEQ ID NO.: 1 e SEQ ID NO.:2,ii) uma seqüência de nucleotídeos correspondendo a SEQ IDNO.:l e SEQ ID NO.:2, na qual uma ou mais substituições conservativasestão presentes, ouiii) SEQ ID NO.:8 (CDR-H1), SEQ ID NO.:9 (CDR-H2), SEQID NO.: 10 (CDR-H3), SEQ ID NO.: 11 (CDR-L1), SEQ ID NO.: 12 (CDR-L2) e SEQ ID NO.: 13 (CDR-L3).

12. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelofato de que o citado vetor está na forma de uma partícula.

13. Produto, caracterizado pelo fato de que contém i) umanticorpo monoclonal anti-Met, ii) um fragmento contendo a região deligação de epítopo e/ou iii) um anticorpo geneticamente modificado ouhumanizado contendo a região de ligação de epítopo de um anticorpomonoclonal anti-Met e pelo menos um inibidor de quinase como umapreparação combinada para uso simultâneo, separado ou seqüencial notratamento de tumores e/ou metástases, em que o citado o anticorpomonoclonal anti-Met é produzido pela linhagem de célula de hibridoma ICLCPD 05006.

14. Produto de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que os citado anticorpo e/ou citado pelo menos um fragmento domesmo estão na forma de proteína solúvel.

15. Produto de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que o citado anticorpo e/ou citado anticorpo geneticamenteengenheirado são produzidos por um método selecionado do grupoconsistindo de: clivagem proteolítica de citado anticorpo, técnicarecombinante de DNA, síntese em fase sólida, síntese em fase líquida.

16. Produto de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que citado fragmento é selecionado do grupo consistindo de Fab,F(ab')2, Fab', Fv, scFv, peptídeo contendo pelo menos uma região de ligaçãode epítopo.

17. Produto de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que o citado fragmento é produzido por um método selecionadodo grupo consistindo de: clivagem proteolítica de citado anticorpo, técnicarecombinante de DNA, síntese em fase sólida, síntese em fase líquida.

18. Produto de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que o citado pelo menos um inibidor de quinase é selecionado dogrupo consistindo de K252A análogo de estaurosporina; (3Z)-5-[(2,6-dicloro-benzil)-sulfonil]-3-[(3,5-dimetil-4-{[(2R)-2-(^-1 -il]-carbonil}-1 H-pirrol-2-il)-metileno]-1,3-di-hidro-2H-indol-2-ona; [(3Z)-N-(3-cloro-fenil)-3-({3,5-dimetil-4-[(4-metil-piperazin-l-il)-carbonil]-lH-pirrol-2-il} -metileno)-N-metil-2-oxoindolina-5-sulfonamida];[(3Z)-5-(2,3-di-hidro- ΙΗ-indol-1 -il-sulfonil)-3-( {3,5-dimetil-4-[(4-metil-piperazin-1 -il)-carbonil]- lH-pirrol-2-il} -metileno)- 1,3-di-hidro-2H-indol-2-ona]; [(3Z)-N-(3-cloro-fenil)-3 -{[3,5 -dimetil-4-(3 -morfolin-4-il-propil)-1 H-pirrol-2 -il]-metileno} -N-metil-2-oxo-indolina-5 -sulfonamida].

19. Produto de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que o citado produto é administrado por injeção ou por infusão.

20. Método para triar compostos capazes de se ligarem empelo menos uma porção do receptor de domínio extracelular de fator decrescimento de hepatócito (HGFR), citados compostos possuindo umaatividade antagonista versus o HGFR e sendo farmacologicamente ativos naprevenção e/ou tratamento de tumor e/ou metástases, caracterizado pelo fatode que o citado método compreende o uso de pelo menos uma porção dodomínio extracelular de HGFR como alvo para os citados compostos.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que os citados compostos são capazes de induzirem regulagemnegativa de HGFR.

22. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que os citados compostos são capazes de induzirem separação depelo menos uma porção do domínio extracelular de HGFR.

23. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que os citados compostos são capazes de limitarem proliferaçãoe/ou intensificam apoptose de células neoplásicas pela alteração desinalização de HGFR.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-20 a 23, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma porção do domínioextracelular de HGFR é selecionada de isca Met, SEMA PSI, PSI IPT, IPT,IPT 1, IPT 2, IPT 3, IPT 4 ou uma combinação dos mesmos.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que a pelo menos uma porção do domínio extracelular de HGFRé selecionada de IPT 1, IPT 2, IPT 3, IPT 4 ou uma combinação dos mesmos.

26. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que a pelo menos uma porção do domínio extracelular de HGFRé IPT 4.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-20 a 26, caracterizado pelo fato de que compreende:a) proporcionar uma célula hospedeira contendo um gene queexpressa pelo menos uma porção do domínio extracelular de HGFR;b) administrar um composto à citada célula;c) determinar se o citado composto é capaz de induzir:-regulagem negativa de HGFR,-separação de pelo menos uma porção de domínio extracelularde HGFR, ou-alteração de sinalização de HGFR e portanto limitação deproliferação de células neoplásicas.

28. Uso de um anticorpo monoclonal, um fragmento e/ouanticorpo geneticamente engenheirado ou humanizado, i) citado anticorpomonoclonal sendo anticorpo monoclonal anti-Met, ii) citado fragmento sendofragmento contendo a região de ligação de epítopo de um anticorpomonoclonal anti-Met e/ou iii) citado anticorpo sendo anticorpo geneticamentemodificado ou humanizado contendo a região de ligação de epítopo de umanticorpo monoclonal anti-Met, caracterizado pelo fato de ser para amanufatura de uma preparação diagnostica para a detecção de célulasneoplásicas, em que o citado anticorpo monoclonal anti-Met é produzido pelalinhagem de célula de hibridoma ICLC PD 05006.

29. Uso de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelofato de que os citado anticorpo monoclonal anti-Met, citado fragmento oucitado anticorpo geneticamente engenheirado ou humanizado estãoconjugados em um marcador.

30. Uso de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelofato de que o citado marcador é selecionado de: um radioisótopo, umamolécula fluorescente, um traçador quimiofluorescente ou um indicadormolecular.