ITTO20130012A1 - Nuovi frammenti anticorpali, relative composizioni ed usi - Google Patents

Description

“Nuovi frammenti anticorpali, relative composizioni ed usiâ€

TESTO DELLA DESCRIZIONE

Campo dell’Invenzione

La presente invenzione si riferisce a nuovi frammenti anticorpali con migliorata stabilità in vivo.

Sfondo

Una terapia mirata, la nuova frontiera del trattamento del cancro, impiega strumenti farmacologici (farmaci o antibiotici) che bloccano specificamente prodotti genici cruciali che sostengono il fenotipo trasformato. Attualmente, la terapia mirata contro il cancro viene impiegata in clinica per il trattamento di leucemie mieloidi croniche (CML), dipendenti dalla molecola di tirosina chinasi ABL, per il trattamento di un sottogruppo di Cancri del Polmone Non a Piccole Cellule (NSCLC) e Carcinomi del Colon-Retto (CRC) che dipendono dall’attivazione del Recettore del Fattore di Crescita Epidermico (EGFR/HER-1) e per il trattamento di melanomi BRAF-dipendenti.

I recettori con attività di tirosina chinasi (RTK) sono candidati interessanti per una terapia mirata poiché sono spesso iperattivati in diversi tipi di tumori. Essi possono venire inibiti da differenti tipi di molecole di bersagliamento, come anticorpi, che per interazione con la parte extracellulare del recettore sono in grado di perturbare la segnalazione intracellulare indotta dal recettore, e piccole molecole sintetizzate chimicamente che interferiscono con l’attività catalitica del recettore.

Tra i differenti RTK, il prodotto del proto-oncogene c-met, il Recettore del Fattore di Crescita degli Epatociti (HGFR/Met), sta emergendo come il più importante oncogene attivato nel cancro. Met controlla un programma genetico noto come †̃crescita invasiva’ che comprende segnali promitogenici, pro-invasivi e anti-apoptotici. Mediante questi segnali fisiologici, Met fornisce al tumore un miglior vigore, favorendolo nel superamento delle barriere selettive alla progressione del cancro. Inoltre, Met sostiene la crescita tumorale grazie alla sua capacità di favorire l’angiogenesi tumorale. Negli ultimi anni, Met à ̈ anche risultato responsabile dell’aggressività sviluppata da tumori trattati con agenti antiangiogenici e della resistenza alla radioterapia convenzionale. Inoltre, l’alterazione del gene MET può essere la causa principale di trasformazione, in tutti quei casi in cui à ̈ stato geneticamente selezionato per il mantenimento a lungo termine del fenotipo trasformato primario.

Tutte le scoperte precedentemente elencate hanno indotto lo sviluppo di diverse molecole adatte per inibire la segnalazione di Met, che comprendono inibitori competitivi di HGF, inibitori chimici di Met chinasi, anticorpi anti-HGF e anti-Met. Alcune di questa molecole, finora, sono state testate solo a scopo di ricerca. Prove cliniche sono attualmente in corso con anticorpi anti-HGF, anticorpi anti-Met e diverse molecole piccole neutralizzanti.

Da diversi punti di vista, un anticorpo anti-Met in grado di inibire la segnalazione di Met sarebbe preferibile. Gli anticorpi sono altamente specifici, stabili e, grazie al loro progetto naturale, vengono generalmente ben tollerati dall’ospite. Negli ultimi anni, sono stati fatti diversi tentativi per generare anticorpi anti-Met terapeutici. Tuttavia, sono stati registrati molti insuccessi, poiché la maggior parte degli anticorpi anti-Met si comporta da agonista, imitando l’azione di HGF. Questo à ̈ soprattutto dovuto al fatto che, grazie alla loro struttura bivalente, gli anticorpi possono stabilizzare dimeri recettoriali, consentendo la transfosforilazione di Met, con la sua conseguente attivazione. In un caso, un anticorpo anti-Met agonista (5D5) à ̈ stato ingegnerizzato e convertito in una forma monovalente (5D5 a un solo braccio) che, competendo per il legame con HGF, à ̈ dotato di potenziale terapeutico (1,2). Questa molecola à ̈ stata recentemente inserita in una prova clinica di fase III per il trattamento di un sottogruppo di pazienti affetti da Cancro del Polmone Non a Piccole Cellule, caratterizzato da un alto livello di espressione di Met nei tumori, in combinazione con erlotinib (3).

L’anticorpo monoclonale DN30 à ̈ una IgG2A di topo diretta contro la parte extracellulare del recettore Met umano (4). Esso si lega con affinità sub-nanomolare con il quarto dominio IPT della regione extracellulare del recettore Met. All’inizio, esso à ̈ stato caratterizzato come agonista parziale di Met, in grado di favorire alcune delle risposte biologiche delle cellule mediate da Met, ma non tutte. Successivamente à ̈ stato dimostrato che esso agisce come inibitore di crescita e metastasi tumorale mediante un meccanismo di †̃dispersione’ dei recettori (5). La dispersione dei recettori à ̈ un meccanismo cellulare fisiologico di degradazione delle proteine che agisce su diversi fattori di crescita, citochine, recettori e molecole di adesione. La dispersione di Met si articola in due fasi: in primo luogo una metalloproteasi, la ADAM-10, scinde il dominio extracellulare di Met riconoscendo una specifica sequenza che si trova subito a monte della regione transmembrana; quindi il frammento transmembrana rimanente diventa il substrato di una seconda proteasi (γsecretasi) che distacca la porzione contenente chinasi dalla membrana e la indirizza rapidamente verso il percorso di degradazione dei proteosomi (6,7). Il potenziamento di questo meccanismo esercitato da DN30 porta a una riduzione del numero di recettori Met esposti sulla superficie cellulare. Nello stesso tempo, rilascia un ectodominio †̃di richiamo’, solubile, nello spazio extracellulare. Quest’ultimo compete con il recettore transmembrana intatto per il legame con il ligando e inibisce l’omodimerizzazione del recettore formando complessi eterodimerici con Met bona fide. Tutte queste azioni indeboliscono fortemente la segnalazione mediata da Met e portano all’impedimento degli effetti biologici a valle.

Recentemente i presenti inventori hanno dimostrato che il frammento Fab monovalente dell’anticorpo monoclonale anti-Met DN30 (DN30 Fab) à ̈ privo di qualsiasi attività agonista e mantiene la capacità di indurre dispersione, avendo quindi come risultato a un potenziale inibitore di Met (8). L’induzione della dispersione di Met da parte di DN30-Fab à ̈ dipendente dall’interazione anticorpo selettivoantigene ma à ̈ indipendente dall’attivazione del recettore. Questo meccanismo di azione, basato sulla semplice eliminazione di Met dalla superficie cellulare, conferisce al DN30-Fab un forte vantaggio sugli altri inibitori, poiché esso può essere efficace contro tutte le forme di attivazione di Met, HGF-dipendente o meno, indotta da sovraespressione, mutazione o amplificazione genica.

Sebbene il DN30-Fab ricombinante sia molto desiderabile per applicazioni cliniche, la breve semivita di Fab nel plasma – soprattutto per la clearance renale – limita fortemente il suo uso per il trattamento di pazienti.

Attualmente, la tecnica più consolidata per migliorare le proprietà farmacologiche di un frammento Fab consiste nell’aumentare il suo peso molecolare mediante coniugazione con Polietilenglicole (PEG). La PEGilazione di Fab à ̈ una via perseguita nella maggior parte dei casi che impiegano Fab in clinica. L’attacco covalente delle catene di polimero al frammento anticorpale, ottenuto efficientemente e senza perdita di proprietà di legame con l’antigene, non à ̈ un processo chiaro e richiede un grande sforzo di preparazione.

Un’altra tecnica usata per migliorare le proprietà farmacologiche di un frammento Fab à ̈ quella descritta in EP-A-1 718 677. Tale procedura, usata per generare la forma a un solo braccio di anticorpo monoclonale 5D5 precedentemente commentata, consiste nella produzione – su base ricombinante – di tre differenti catene di anticorpo nella stessa cellula, la catena leggera (VL-CL), la catena pesante (VH-CH1-CH2-CH3) e la porzione Fc di una catena pesante (CH2-CH3). I domini CH2-CH3 non sono di tipo selvatico: sono incluse mutazioni, che danno origine a specifiche strutture tridimensionali. In un polipeptide, la regione CH2-CH3 incorpora una sequenza che forma una protuberanza, mentre nell’altro polipeptide la regione CH2-CH3 contiene una sequenza che forma una cavità, in cui la protuberanza può inserirsi (struttura “knob in hole†). La presenza di queste strutture tridimensionali consente la preferibile formazione di eterodimeri in cui la catena pesante forma legami disolfuro con il frammento Fc, ma non esclude affatto la formazione di omodimeri (cioà ̈ due catene pesanti legate insieme e due Fc legati insieme). La purificazione che consente la separazione di omodimeri indesiderati dagli eterodimeri desiderati à ̈ obbligatoria. Quindi, la “procedura per la forma a un solo braccio†, sebbene molto elegante, à ̈ scomoda poiché richiede fasi addizionali nel procedimento totale che complicano la produzione e riducono la resa dell’anticorpo ricombinante.

Si sente quindi la necessità di una soluzione differente per aumentare la semivita di Fab nel plasma per un uso terapeutico in vivo.

Sintesi dell’Invenzione

Lo scopo della presente invenzione consiste nel fornire un frammento anticorpale con migliorata stabilità in vivo.

Secondo l’invenzione, il suddetto scopo viene ottenuto grazie all’oggetto a cui si fa specificamente riferimento nelle rivendicazioni seguenti, che sono da intendere come facenti parte integrante della presente descrizione.

Una forma di realizzazione della presente invenzione fornisce un frammento anticorpale che comprende un primo polipeptide che comprende un dominio variabile di una catena leggera e due domini costanti e un secondo polipeptide che comprende un dominio variabile di una catena pesante e due domini costanti, in cui due domini costanti sono domini costanti di una catena leggera e due domini costanti sono domini costanti CH1 di una catena pesante, fusi in combinazioni differenti con i domini variabili.

Una ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione si riferisce a un frammento anticorpale come precedentemente definito che à ̈ più stabile in vivo rispetto alla molecola Fab comprendente i domini variabili di una catena leggera e di una catena pesante.

Ancora una ulteriore forma di realizzazione si riferisce a un frammento anticorpale come precedentemente definito che si lega specificamente al recettore del fattore di crescita degli epatociti (HGFR/Met).

Breve descrizione dei disegni

L’invenzione verrà ora descritta dettagliatamente, solo a scopo di esempio illustrativo e non limitativo e facendo riferimento ai disegni allegati, in cui:

- FIGURA 1: Dispersione e sottoregolazione di Met in cellule Met-dipendenti trattate con MvDN30 chimerico o DN30 Fab murino. A SNU-5 à ̈ una linea di cellule di carcinoma gastrico umano; B H1993-NCl à ̈ una linea di cellule di carcinoma del polmone non a piccole cellule. Le cellule sono state incubate per 48 h in un mezzo privo di siero con le concentrazioni indicate dei due frammenti anticorpali derivati da DN30 mAb. I livelli totali di Met sono stati determinati mediante analisi Western blot di estratti di cellule usando anticorpi anti-Met. Le due bande di Met corrispondono alla forma non processata (p190 Met) e alla forma matura (p145 Met) del recettore. La dispersione di Met à ̈ stata determinata mediante analisi Western blot del mezzo condizionato usando anticorpi anti-Met. Entrambe le molecole inducono efficientemente la dispersione/sottoregolazione di Met.

- FIGURA 2: Saggio di crescita di cellule Metdipendenti trattate con MvDN30 chimerico o DN30 Fab murino.

A EBC-1 à ̈ una linea di cellule di carcinoma del polmone non a piccole cellule; B Hs746T à ̈ una linea di cellule di carcinoma gastrico umano. Le cellule sono state piastrate in piastre a 96 pozzetti (1000/pozzetto) in un mezzo di FCS al 10%. Dopo 24 h le cellule sono state trattate con concentrazioni crescenti di anticorpi per ulteriori 72 h. Il numero di cellule à ̈ stato valutato mediante Cell titerglo (Perkin Elmer). Ciascun punto à ̈ la media di valori in triplicato; le barre rappresentano la deviazione standard. Entrambe le molecole inibiscono efficientemente la crescita cellulare di cellule Met-dipendenti.

- FIGURA 3: Rappresentazione schematica delle nuove molecole derivate da DN30. Parte superore: DN30 Fab chimerizzato (MvDN30); parte centrale: Fab con duplice domino costante con i domini costanti duplicati in tandem (DCD-MvDN30.1); parte inferiore: Fab con duplice dominio costante con i domini costanti duplicati reciprocamente scambiati (DCD-MvDN30.2). VH: dominio variabile di una catena pesante di DN30. VL: dominio variabile di una catena leggera di DN30. CH1: dominio costante 1 derivato da una catena pesante di IgG1 umana. CL: dominio costante derivato da una catena leggera kappa umana. Tag (= marcatore) His e Strep: sequenze incluse per consentire la purificazione e l’immunorivelazione delle proteine.

- FIGURA 4: Analisi delle nuove molecole derivate da DN-30. Le proteine purificate indicate sono state sottoposte a SDS-PAGE in condizioni riducenti. Il gel à ̈ stato colorato con blu Gel Code (Pierce). Tutte le molecole mostrano due bande con il peso molecolare previsto.

- FIGURA 5: Legame con Met di molecole DCD-MvDN30. Analisi di legame mediante ELISA di MvDN30, DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 (fase liquida) con una chimera Met-Fc (fase solida). Il legame à ̈ stato rivelato usando anticorpi antistrepTAG. O.D.: Densità Ottica; A.U.: unità arbitrarie. Ciascun punto à ̈ la media di valori in triplicato; le barre rappresentano la deviazione standard. Le nuove molecole si legano con Fc-Met con la stessa elevata affinità.

- FIGURA 6: Attività agonista di molecole DCD-MvDN30. Cellule A549 sono state tenute a digiuno per 24 h e quindi stimolate per 10 min a 37°C con molecole differenti alle concentrazioni indicate. L’attivazione di Met à ̈ stata determinata mediante immunoprecipitazione con anticorpi anti-Met facendo seguire il Western blot con anticorpi anti-Met specifici per i residui Met con Tyr 1234/1235 fosforilati, il maggior sito di fosforilazione (Parte Superiore). Lo stesso blot à ̈ stato nuovamente sondato con anticorpi anti-Met (Parte Inferiore). Le nuove molecole non attivano in modo significativo il recettore Met.

- FIGURA 7: Attività agonista di molecole DCD-MvDN30. Cellule A549 sono state tenute a digiuno per 24 h e quindi stimolate per 10 min a 37°C con le differenti molecole alle concentrazioni indicate. L’attivazione di AKT ed ERK-1,2 à ̈ stata determinata mediante Western blot con anticorpi anti-AKT o anti-ERK specifici per la forma fosforilata. Lo stesso blot à ̈ stato nuovamente sondato con anticorpi antivinculina (Parte Inferiore) per controllare il carico di proteina. Le nuove molecole non attivano in modo significativo la segnalazione Met-dipendente.

- FIGURA 8: Dispersione e sottoregolazione di MET in cellule trattate con molecole DCD-MvDN30. Cellule A549 sono state incubate per 72 h in un mezzo privo di siero con le molecole indicate (500 nM). I livelli di Met totali sono stati determinati mediante analisi Western blot di estratti di cellule usando anticorpi anti-Met. Le due bande di Met corrispondono alla forma non processata (p190 Met) e alla forma matura (p145 Met) del recettore. Come controllo di carico, il filtro à ̈ stato sondato con una proteina non correlata (actina). La dispersione di Met à ̈ stata determinata mediante analisi Western blot del mezzo condizionato usando anticorpi anti-Met. Le nuove molecole inducono efficientemente la dispersione di Met.

- FIGURA 9: Inibizione dell’attivazione di Met indotta da HGF da parte di molecole DCD-MvDN30. Cellule A549 sono state incubate per 24 h in un mezzo privo di siero più le molecole indicate (1000 nM) e quindi stimolate per 10 min con HGF (100 ng/ml). L’attivazione di Met à ̈ stata determinata in lisati di cellule totali mediante Western blot con anticorpi anti-Met specifici per i residui Met con Tyr 1234/1235 fosforilati, il maggior sito di fosforilazione. Lo stesso blot à ̈ stato nuovamente sondato con anticorpi anti-Met. L’attivazione di AKT ed ERK-1,2 à ̈ stata determinata mediante Western blot con anticorpi antifosfoAKT o anti-fosfoERK. Lo stesso blot à ̈ stato nuovamente sondato con anticorpi anti-AKT o ERK-1,2. Per controllare il carico di proteina il filtro à ̈ stato inoltre sondato con anticorpi anti-vinculina. Le nuove molecole inibiscono fortemente l’attivazione di Met indotta da HGF e la segnalazione Met-dipendente.

- FIGURA 10: Crescita dipendente dall’ancoraggio di cellule Met-dipendenti trattate con DCD-MvDN30.1 oppure DCDMvDN30.2 oppure MvDN30. A, B, C, D linee di cellule di carcinoma gastrico umano; E, F linee di cellule di carcinoma del polmone non a piccole cellule. Le cellule sono state piastrate in una piastra costar a 96 pozzetti (1000/pozzetto) in un mezzo di FCS al 5%. Dopo 24 h le cellule sono state trattate con concentrazioni crescenti delle differenti molecole per ulteriori 72 h. Il numero di cellule à ̈ stato valutato mediante Cell titer-glo (Promega). I grafici rappresentano la percentuale di cellule vive rispetto al controllo non trattato. Ciascun punto à ̈ la media di valori in triplicato. Le nuove molecole inibiscono efficientemente la crescita cellulare di cellule Metdipendenti.

- FIGURA 11: Crescita indipendente dall’ancoraggio di cellule trattate con DCD-MvDN30.1 oppure DCD-MvDN30.2 oppure MvDN30. Cellule A549 sono state piastrate in un mezzo semisolido (5% di agarosio) con o senza HGF (50 ng/ml) in presenza di 1,5 mM di DCD-MvDN30.1, oppure DCD-MvDN30.2 oppure MvDN30. Dopo 21 giorni le colonie sono state colorate con sale di tetrazolio. Le colonie sono state quantificate mediante conteggio dei pixel nell’area di ciascun pozzetto con il software MetaMorphOffline. Ciascun punto à ̈ la media di valori in triplicato. Le nuove molecole inibiscono efficientemente la crescita di cellule indipendenti dall’ancoraggio HGF-dipendenti.

- FIGURA 12: Profilo farmacocinetico in vivo di DCD-MvDN30.1, DCD-MvDN30.2 e MvDN30. A topi immunodeficienti à ̈ stata iniettata per via intraperitoneale una singola dose (100 mg) di DCD-MvDN30.1, oppure DCD-MvDN30.2 oppure MvDN30. È stato prelevato sangue periferico a differenti punti temporali. Le concentrazioni nel siero delle molecole terapeutiche sono state misurate mediante ELISA. Il grafico rappresenta la quantità di molecole in circolazione in funzione del tempo. I campioni sono in triplicato, le barre rappresentano le deviazioni standard.

- FIGURA 13: Sequenze di nucleotidi e amminoacidi di una prima forma di realizzazione di un primo polipeptide di un frammento anticorpale secondo la presente descrizione. Le sequenze corrispondono al polipeptide derivato dalla catena leggera, VL-CL-CL. Le regioni CDR sono sottolineate nelle sequenze di nucleotidi e di amminoacidi.

- FIGURA 14: Sequenze di nucleotidi e amminoacidi di una prima forma di realizzazione di un secondo polipeptide di un frammento anticorpale secondo la presente descrizione. Le sequenze corrispondono al polipeptide derivato dalla catena pesante, VH-CH1-CH1-TAG. Le regioni CDR sono sottolineate nelle sequenze di nucleotidi e di amminoacidi. TAG di Istidina e Strep in carattere corsivo maiuscolo.

- FIGURA 15: Sequenze di nucleotidi e amminoacidi di una seconda forma di realizzazione di un primo polipeptide di un frammento anticorpale secondo la presente descrizione. Le sequenze corrispondono al polipeptide derivato dalla catena leggera, VL-CL-CH1-TAG. Le regioni CDR sono sottolineate nelle sequenze di nucleotidi e di amminoacidi. TAG di Istidina e Strep in carattere corsivo maiuscolo.

- FIGURA 16: Sequenze di nucleotidi e amminoacidi di una seconda forma di realizzazione di un secondo polipeptide di un frammento anticorpale secondo la presente descrizione. Le sequenze corrispondono al polipeptide derivato dalla catena pesante, VH-CH1-CL. Le regioni CDR sono sottolineate nelle sequenze di nucleotidi e di amminoacidi.

- FIGURA 17: Sequenze di nucleotidi e amminoacidi del dominio variabile di una catena leggera di DN30. Le regioni CDR sono sottolineate nelle sequenze di nucleotidi e di amminoacidi.

- FIGURA 18: Sequenze di nucleotidi e amminoacidi del dominio variabile di una catena pesante di DN30. Le regioni CDR sono sottolineate nelle sequenze di nucleotidi e di amminoacidi.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

L’invenzione verrà ora descritta dettagliatamente, a titolo di esempio non limitativo, facendo riferimento a frammenti anticorpali in grado di legarsi specificamente al recettore del fattore di crescita degli epatociti.

È evidente che il campo della presente descrizione non à ̈ in alcun modo limitato a tale antigene bersaglio, poiché i frammenti anticorpali descritti in questa sede possono venire caratterizzati per il legame specifico con altri antigeni bersaglio.

Nella seguente descrizione, vengono riportati numerosi dettagli specifici per permettere la completa comprensione delle forme di realizzazione. Le forme di realizzazione possono venire messe in pratica senza uno o più dettagli specifici, o con altri procedimenti, componenti, materiali, ecc. In altri casi, strutture, materiali, od operazioni ben noti non vengono mostrati o descritti per evitare di confondere aspetti delle forme di realizzazione.

In tutta la presente descrizione il riferimento a “una certa forma di realizzazione†o “una forma di realizzazione†indica che un/una particolare aspetto, struttura, o caratteristica descritto/a facendo riferimento alla forma di realizzazione à ̈ incluso/a in almeno una forma di realizzazione. Quindi, la presenza delle espressioni “in una certa forma di realizzazione†oppure “in una forma di realizzazione†in vari punti in tutta la presente descrizione non si riferisce necessariamente sempre alla stessa forma di realizzazione. Inoltre, i particolari aspetti, strutture, o caratteristiche possono venire combinati in qualsiasi modo adatto in una o più forme di realizzazione.

Le intestazioni fornite in questa sede sono presenti solo a scopo di convenienza e non interpretano il campo o il significato delle forme di realizzazione.

Gli anticorpi sono tetrameri complessi in cui le catene leggere e pesanti sono costituite da più domini Ig, ciascuno ripiegandosi indipendentemente. All’inizio dell’era degli anticorpi à ̈ stato dimostrato che, mediante trattamento enzimatico, un anticorpo può dare origine a frammenti che mantengono la struttura originaria e le proprietà di legame con l’antigene.

Successivamente, applicando le tecniche di ingegnerizzazione delle proteine, à ̈ stata generata una pletora di differenti frammenti anticorpali ingegnerizzati. Secondo il progetto molecolare, ciascun nuovo frammento anticorpale à ̈ caratterizzato da aspetti particolari (cioà ̈, aumentata avidità, multivalenza, multispecificità, ADCC-deficiente, chimerizzato, ecc.).

Tuttavia, nessuno degli studi precedenti ha affrontato il problema della clearance renale per prolungare la semivita in vivo di frammenti anticorpali.

A questo scopo, i presenti inventori hanno sviluppato un frammento anticorpale ricombinante che comprende un primo polipeptide comprendente un dominio variabile di una catena leggera e due domini costanti e un secondo polipeptide comprendente un dominio variabile di una catena pesante e due domini costanti, in cui due domini costanti sono due domini costanti di una catena leggera e due domini costanti sono domini costanti CH1 di una catena pesante, fusi in combinazioni differenti con i domini variabili.

In una certa forma di realizzazione, il frammento anticorpale descritto in questa sede à ̈ più stabile in vivo rispetto alla molecola Fab comprendente detti domini variabili di una catena leggera e pesante.

In una certa forma di realizzazione, il frammento anticorpale ha una semivita prolungata in vivo quando viene somministrato a un paziente umano rispetto alla molecola Fab comprendente detti domini variabili di una catena leggera e pesante per effetto di una ridotta clearance renale.

Questi frammenti anticorpali sono stati denominati †̃Fab a duplice dominio costante’ (DCD†Fab).

In una forma di realizzazione preferita, la presente invenzione si riferisce a un frammento anticorpale che comprende un primo polipeptide comprendente un dominio variabile di una catena leggera e due domini costanti e un secondo polipeptide comprendente un dominio variabile di una catena pesante e due domini costanti, in cui due domini costanti sono domini costanti di una catena leggera umana e due domini costanti sono domini costanti CH1 di una catena pesante umana, fusi in combinazioni differenti con i domini variabili, in cui il frammento anticorpale à ̈ più stabile in vivo della molecola Fab comprendente detti domini variabili di una catena leggera e pesante, e in cui il frammento anticorpale si lega specificamente con il recettore del fattore di crescita degli epatociti (HGFR/Met).

In una certa forma di realizzazione, il dominio variabile di una catena leggera à ̈ fuso in corrispondenza del suo terminale carbossilico con un dominio costante di una catena leggera, che à ̈ fuso in corrispondenza del suo terminale carbossilico con un dominio costante di una catena leggera.

In un’altra forma di realizzazione, il dominio variabile di una catena leggera à ̈ fuso in corrispondenza del suo terminale carbossilico con un dominio costante di una catena leggera, che à ̈ fuso in corrispondenza del suo terminale carbossilico con un dominio costante CH1 di una catena pesante.

In una certa forma di realizzazione, il dominio variabile di una catena pesante à ̈ fuso in corrispondenza del suo terminale carbossilico con un dominio costante CH1 di una catena pesante, che à ̈ fuso in corrispondenza del suo terminale carbossilico con un dominio costante CH1 di una catena pesante.

In un’altra forma di realizzazione, il dominio variabile di una catena pesante à ̈ fuso in corrispondenza del suo terminale carbossilico con un dominio costante CH1 di una catena pesante, che à ̈ fuso in corrispondenza del suo terminale carbossilico con un dominio costante di una catena leggera.

In una certa forma di realizzazione, i domini costanti contenuti nel primo e secondo polipeptide – quando vengono accoppiati insieme nel frammento anticorpale –sono in grado di generare ponti disolfuro.

In una ulteriore forma di realizzazione preferita, la presente invenzione si riferisce a frammenti anticorpali come precedentemente definiti in cui la specificità per l’antigene viene fornita impiegando come domini variabili di una catena leggera e pesante i domini variabili di una catena leggera e pesante di DN30 oppure i domini variabili di una catena leggera e pesante umanizzata comprendenti le regioni di determinazione della complementarità (CDR) dall’anticorpo monoclonale DN30. L’anticorpo monoclonale DN30 à ̈ stato descritto nella domanda di brevetto internazionale WO-A-2007/090807.

Un frammento anticorpale dell’invenzione à ̈ generalmente un anticorpo terapeutico. Per esempio, un anticorpo dell’invenzione può essere un anticorpo antagonista, un anticorpo bloccante o un anticorpo neutralizzante.

In un aspetto, l’invenzione fornisce procedimenti per trattare o ritardare la progressione di una malattia somministrando a un soggetto affetto dalla malattia una quantità efficace di un frammento anticorpale dell’invenzione, efficace per trattare o ritardare la progressione della malattia.

In una certa forma di realizzazione, la malattia à ̈ un tumore o una metastasi tumorale.

In un’altra forma di realizzazione, la malattia à ̈ associata alla disregolazione della segnalazione e/oppure attivazione del recettore del fattore di crescita degli epatociti.

Un frammento anticorpale dell’invenzione à ̈ adatto per il trattamento o la prevenzione di condizioni patologiche associate ad anomalie all’interno del percorso di segnalazione di HGF/HGFR.

In una certa forma di realizzazione, un anticorpo dell’invenzione à ̈ un antagonista di HGFR.

In una certa forma di realizzazione, il frammento anticorpale comprende sequenze di legame con l’antigene da un donatore non umano innestate in una sequenza eterologa non umana, umana o umanizzata (per esempio sequenze strutturali e/oppure di domini costanti). In una certa forma di realizzazione, il donatore non umano à ̈ un topo.

In una certa forma di realizzazione, le sequenze di legame con l’antigene comprendono tutte le CDR e/oppure le sequenze di domini variabili di un anticorpo murino anti-HGFR.

In una certa forma di realizzazione preferita, il dominio variabile di una catena leggera murina à ̈ fuso in corrispondenza del suo terminale carbossilico con un dominio costante di una catena leggera kappa umana, che à ̈ fuso in corrispondenza del suo terminale carbossilico con un dominio costante di una catena leggera kappa umana. In un’altra forma di realizzazione, il dominio variabile di una catena leggera murina à ̈ fuso in corrispondenza del suo terminale carbossilico con un dominio costante di una catena leggera kappa umana, che à ̈ fuso in corrispondenza del suo terminale carbossilico con un dominio costante CH1 di una catena pesante di IgG1 umana. In una certa forma di realizzazione, il dominio variabile di una catena pesante murina à ̈ fuso in corrispondenza del suo terminale carbossilico con un dominio costante CH1 di una catena pesante di IgG1 umana, che à ̈ fuso in corrispondenza del suo terminale carbossilico con un dominio costante CH1 di una catena pesante di IgG1 umana. In un’altra forma di realizzazione, il dominio variabile di una catena pesante murina à ̈ fuso in corrispondenza del suo terminale carbossilico con un dominio costante CH1 di una catena pesante di IgG1 umana, che à ̈ fuso in corrispondenza del suo terminale carbossilico con un dominio costante di una catena leggera kappa umana.

In una certa forma di realizzazione preferita, un frammento anticorpale dell’invenzione comprende un primo polipeptide comprendente un dominio variabile di una catena leggera comprendente le sequenze CDR di un anticorpo murino anti-HGFR, più preferibilmente le CDR di DN30, e due domini costanti, in cui i due domini costanti sono: due domini costanti di una catena leggera oppure un dominio costante di una catena leggera e un dominio costante CH1 di una catena pesante. In una certa forma di realizzazione i due domini costanti sono domini costanti umani.

In una certa forma di realizzazione, un frammento anticorpale dell’invenzione comprende un secondo polipeptide comprendente un dominio variabile di una catena pesante comprendente le sequenze CDR di un anticorpo murino anti-HGFR, più preferibilmente le CDR di DN30, e due domini costanti, in cui i due domini costanti sono: due domini costanti CH1 di una catena pesante o un dominio costante CH1 di una catena pesante e un dominio costante di una catena leggera. In una certa forma di realizzazione i due domini costanti sono domini costanti umani.

L’invenzione fornisce, in una forma di realizzazione molto preferita, un frammento anticorpale umanizzato che si lega con HGFR umano, in cui l’anticorpo à ̈ efficace per inibire l’attività in vivo di HGF/HGFR, l’anticorpo comprendendo i) nel dominio variabile (VH) di una catena pesante le tre sequenze CDR del dominio variabile di una catena pesante dell’anticorpo monoclonale DN30 (SEQ ID N.: 19,20,21) e sostanzialmente una sequenza consenso umana, per esempio sostanzialmente i residui di una regione strutturale (FR) consenso umana di un sottogruppo di una catena pesante umana e (ii) nel dominio variabile (VL) di una catena leggera le tre sequenze CDR del dominio variabile di una catena leggera dell’anticorpo monoclonale DN30 (SEQ ID n.: 25,26,27) e sostanzialmente i residui di una regione strutturale (FR) consenso umana del sottogruppo I di una catena leggera K umana (VKI).

In una certa forma di realizzazione, un frammento anticorpale dell’invenzione comprende un primo polipeptide comprendente come dominio variabile di una catena leggera la sequenza del dominio variabile di una catena leggera riportata in SEQ ID. N.: 12 (dominio variabile di una catena leggera di DN30) e un secondo polipeptide comprendente come dominio variabile di una catena pesante la sequenza del dominio variabile di una catena pesante riportata in SEQ ID N.: 4 (dominio variabile di una catena pesante DN30).

In un aspetto, l’invenzione fornisce l’uso di un frammento anticorpale dell’invenzione (per esempio un frammento anticorpale antagonista di HGFR dell’invenzione) nella preparazione di un medicamento per il trattamento terapeutico e/oppure profilattico di una malattia, come un cancro, un tumore, un disturbo della proliferazione cellulare.

In un aspetto, l’invenzione fornisce un procedimento per il trattamento di una condizione patologica associata alla disregolazione dell’attivazione di HGFR in un soggetto, detto procedimento comprendendo la somministrazione al soggetto di una quantità efficace di un frammento anticorpale antagonista di HGFR dell’invenzione, con cui viene trattata detta condizione.

In un aspetto, l’invenzione fornisce un procedimento per inibire la crescita di una cellula che esprime HGFR, detto procedimento comprendendo il portare a contatto detta cellula con un frammento anticorpale antagonista di HGFR dell’invenzione, determinando quindi una inibizione della crescita di detta cellula.

In un aspetto, l’invenzione fornisce un procedimento per il trattamento terapeutico di un mammifero avente un tumore canceroso che comprende una cellula che esprime HGFR, detto procedimento comprendendo la somministrazione a detto mammifero di una quantità efficace di un frammento anticorpale antagonista di HGFR dell’invenzione, trattando quindi efficacemente detto mammifero.

In un aspetto, l’invenzione fornisce un procedimento per il trattamento o la prevenzione di un disturbo della proliferazione cellulare associato ad una aumentata espressione o attività di HGFR, detto procedimento comprendendo la somministrazione a un soggetto che necessita di tale trattamento di una quantità efficace di un frammento anticorpale antagonista di HGFR dell’invenzione, trattando o prevenendo quindi efficacemente detto disturbo della proliferazione cellulare.

In un aspetto l’invenzione fornisce un procedimento per il trattamento terapeutico di un tumore in un mammifero, in cui la crescita di detto tumore dipende almeno in parte da un effetto di potenziamento della crescita di HGFR, detto procedimento comprendendo il portare a contatto una cellula tumorale con una quantità efficace di un frammento anticorpale antagonista di HGFR dell’invenzione, trattando quindi efficacemente detto tumore. La cellula tumorale può essere una scelta tra una cellula di tumore della mammella, del colon-retto, del polmone, del colon, del pancreas, della prostata, dell’ovaio, della cervice, del sistema nervoso centrale, del rene, epatocellulare, della vescica, gastrico, della testa-collo, cellula di carcinoma papillare (per esempio la ghiandola tiroide), melanoma, linfoma, mieloma, glioma/glioblastoma (per esempio astrocitoma anaplastico, glioblastoma multiforme, oligodendroglioma anaplastico, oligodendroastrocitoma anaplastico), leucemia. In una certa forma di realizzazione, una cellula che viene bersagliata in un procedimento dell’invenzione à ̈ una cellula iperproliferativa e/oppure iperplastica. In una certa forma di realizzazione, una cellula che viene bersagliata in un procedimento dell’invenzione à ̈ una cellula displastica. In ancora un’altra forma di realizzazione, una cellula che viene bersagliata in un procedimento dell’invenzione à ̈ una cellula metastatica. In una ulteriore forma di realizzazione, una cellula che viene bersagliata in un procedimento dell’invenzione à ̈ una cellula che esprime HGFR che appartiene al microambiente che sostiene il tumore e/oppure la metastasi.

Procedimenti dell’invenzione possono inoltre comprendere fasi di trattamento addizionali. Per esempio, in una certa forma di realizzazione, un procedimento comprende inoltre una fase in cui un tessuto e/oppure una cellula tumorale bersagliato/bersagliata viene esposto/esposta a un trattamento mediante radiazioni o a un agente chemioterapico. In un’altra forma di realizzazione, un tessuto e/oppure una cellula tumorale bersagliato/bersagliata viene trattato/trattata, oltre che con il frammento anticorpale antagonista dell’invenzione, con inibitori di HGF (cioà ̈ anticorpi anti-HGF) o altri composti anti-HGFR (cioà ̈ inibitori di chinasi a molecole piccole). In una ulteriore forma di realizzazione, un tessuto e/oppure una cellula tumorale bersagliato/bersagliata viene trattato/trattata, oltre che con il frammento anticorpale antagonista dell’invenzione, con molecole che colpiscono specificamente altri bersagli pertinenti nel mantenimento del fenotipo trasformato (cioà ̈ molecole anti-EGFR).

L’attivazione di HGFR à ̈ un processo biologico importante; la sua deregolazione porta a numerose condizioni patologiche. Di conseguenza, in una certa forma di realizzazione dei procedimenti dell’invenzione, una cellula che viene bersagliata (per esempio una cellula cancerosa) à ̈ una cellula in cui l’attivazione di HGFR à ̈ aumentata rispetto a una cellula normale della stessa origine tissutale. In una certa forma di realizzazione, un procedimento dell’invenzione causa la morte o l’arresto della crescita cellulare di una cellula bersagliata. Per esempio, il contatto con un frammento anticorpale antagonista dell’invenzione può portare all’inabilità della cellula a trasmettere il segnale attraverso il percorso di HGFR, il che porta alla morte della cellula o all’arresto della crescita cellulare.

L’invenzione si riferisce inoltre a immunoconiugati, o a coniugati anticorpo-farmaco (ADC), che comprendono un frammento anticorpale coniugato con un agente citotossico come un agente chemioterapico, un farmaco, un agente di inibizione della crescita, una tossina (per esempio una tossina enzimaticamente attiva di origine batterica, fungina, vegetale, o animale, o un suo frammento), o un isotopo radioattivo (cioà ̈ un radioconiugato).

L’uso di coniugati anticorpo-farmaco per il rilascio locale di agenti citotossici o citostatici, cioà ̈ farmaci per uccidere o inibire la crescita delle cellule tumorali nel trattamento del cancro, consente un rilascio mirato della parte di farmaco ai tumori, e un accumulo intracellulare all’interno, dove la somministrazione sistemica di questi agenti farmacologici non coniugati può portare a livelli inaccettabili di tossicità nelle cellule normali come pure nelle cellule tumorali che si à ̈ cercato di eliminare.

Le formulazioni terapeutiche che comprendono un frammento anticorpale dell’invenzione vengono preparate per la conservazione miscelando il frammento anticorpale avente il grado desiderato di purezza con veicoli, eccipienti o stabilizzanti fisiologicamente accettabili (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16<a>edizione, a cura di Osol, A. (1980)), sotto forma di soluzioni acquose, formulazioni liofilizzate o altre formulazioni anidre. Veicoli, eccipienti, o stabilizzanti accettabili non sono tossici per i riceventi ai dosaggi e alle concentrazioni impiegati, e comprendono tamponi; antiossidanti; conservanti; polipeptidi a basso peso molecolare (meno di circa 10 residui); proteine, come sieroalbumina, gelatina, o immunoglobuline; polimeri idrofili come polivinilpirrolidone; amminoacidi; monosaccaridi, disaccaridi, e altri carboidrati; agenti chelanti; zuccheri; controioni formanti sali; complessi di metallo e/oppure tensioattivi non ionici.

La formulazione di questa sede può anche contenere più di un composto attivo come necessario per la particolare indicazione che viene trattata, preferibilmente quelli con attività complementari che non incidono svantaggiosamente l’uno sull’altro. Tali molecole sono opportunamente presenti in combinazione in quantità che sono efficaci per lo scopo previsto.

Gli ingredienti attivi possono anche venire intrappolati in una microcapsula preparata mediante tecniche descritte i.a. in Remington’s Pharmaceutical Sciences 16<a>edizione, a cura di Osol, A. (1980).

Le formulazioni da usare per la somministrazione in vivo devono essere sterili.

Si possono preparare preparazioni a rilascio prolungato. Esempi adatti di preparazioni a rilascio prolungato comprendono matrici semipermeabili di polimeri idrofobi solidi contenenti il frammento anticorpale dell’invenzione, le quali matrici sono in forma di articoli sagomati, per esempio pellicole, o una microcapsula.

Un frammento anticorpale della presente invenzione può venire usato in procedimenti terapeutici in vitro, ex vivo e in vivo. L’invenzione fornisce vari procedimenti basati sull’uso di frammenti anticorpali aventi proprietà superiori rispetto ad anticorpi monovalenti convenzionali.

La presente invenzione fornisce frammenti anticorpali, che possono venire usati per una varietà di scopi, per esempio come agenti terapeutici, profilattici e diagnostici.

I frammenti anticorpali dell’invenzione possono venire usati da soli o in combinazione con altre composizioni in una terapia. Per esempio, un frammento anticorpale dell’invenzione può venire co-somministrato con un altro anticorpo, agente(i) chemioterapico(i) (compresi cocktail di agenti chemioterapici), un altro(i) agente(i) citotossico(i), agente(i) antiangiogenico(i), citochine, e/oppure agente(i) di inibizione della crescita. Tali terapie combinate precedentemente indicate comprendono la somministrazione combinata (in cui i due o più agenti vengono inclusi nella stessa formulazione o in formulazioni distinte), e la somministrazione separata, nel qual caso la somministrazione dell’anticorpo dell’invenzione può avvenire prima e/oppure dopo la somministrazione della terapia o delle terapie aggiuntive.

Il frammento anticorpale dell’invenzione (e l’agente terapeutico aggiuntivo) viene/vengono somministrato/somministrati mediante qualsiasi mezzo adatto, che comprende la somministrazione parenterale, sottocutanea, intraperitoneale, intrapolmonare, e intranasale e, se la si desidera per un trattamento locale, la somministrazione intralesionale. Il frammento anticorpale viene opportunamente somministrato mediante infusione arteriosa, in particolare con dosi diminuite dell’anticorpo. Il dosaggio può avvenire mediante qualsiasi via adatta, per esempio mediante iniezioni, come iniezioni intravenose o sottocutanee, che dipende in parte se la somministrazione à ̈ di breve durata o cronica. Il frammento anticorpale dell’invenzione può anche venire rilasciato per trasferimento genico mediante vettori virali (cioà ̈ vettori lentivirali), somministrati a livello locale o sistemico.

Il frammento anticorpale dell’invenzione verrà formulato, dosato, e somministrato in un modo conforme ad una buona pratica medica. I fattori da considerare in questo contesto comprendono il particolare disturbo che viene trattato, il particolare mammifero che viene trattato, la condizione clinica del singolo paziente, la causa del disturbo, il sito di rilascio dell’agente, il procedimento di somministrazione, il programma di somministrazione, e altri fattori noti ai medici. Non à ̈ necessario, ma l’anticorpo viene opzionalmente formulato con uno o più agenti attualmente usati per prevenire o trattare la malattia in questione. La quantità efficace di tali altri agenti dipende dalla quantità di anticorpi dell’invenzione presente nella formulazione, dal tipo di disturbo o trattamento, e da altri fattori precedentemente discussi. Questi vengono generalmente usati agli stessi dosaggi e con vie di somministrazione usate in precedenza o da circa l’1 al 99% dei dosaggi finora impiegati.

Per la prevenzione o il trattamento di una malattia, il dosaggio adatto di un frammento anticorpale dell’invenzione (quando viene usato da solo o in combinazione con altri agenti come agenti chemioterapici) dipenderà dal tipo di malattia da trattare, dal tipo di anticorpo, dalla gravità e dal decorso della malattia, se il frammento anticorpale viene somministrato per scopi preventivi o terapeutici, da una terapia precedente, dall’anamnesi clinica del paziente e dalla risposta all’anticorpo, e dalla discrezione del medico curante. Il frammento anticorpale viene opportunamente somministrato al paziente in una volta o nel corso di una serie di trattamenti. A seconda del tipo e della gravità della malattia, circa 1 mg/kg fino a 15 mg/kg di anticorpo rappresenta un dosaggio candidato iniziale per la somministrazione al paziente, per esempio mediante una o più somministrazioni distinte, o mediante infusione continua. Un dosaggio giornaliero tipico potrebbe variare da circa 1 mg/kg a 100 mg/kg o più, a seconda dei fattori precedentemente menzionati. Per somministrazioni ripetute per diversi giorni o più, a seconda della condizione, il trattamento viene sostenuto fino al manifestarsi della soppressione desiderata dei sintomi della malattia. Un dosaggio di esempio del frammento anticorpale sarebbe nel campo da circa 0,05 mg/kg a circa 10 mg/kg. Quindi, una o più dosi di circa 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4.0 mg/kg o 10 mg/kg (o qualsiasi loro combinazione) possono venire somministrate al paziente. Tali dosi possono venire somministrate in modo discontinuo, per esempio ogni settimana od ogni tre settimane (cosicché, per esempio, il paziente riceve da circa due a circa venti, per esempio circa sei dosi dell’anticorpo). Si può somministrare una dose di carico iniziale più elevata, seguita da una o più dosi minori. Un regime di dosaggio di esempio comprende la somministrazione di una dose di carico iniziale di circa 4 mg/kg, seguita da una dose di mantenimento settimanale di circa 2 mg/kg dell’anticorpo. Tuttavia, possono essere utili altri regimi di dosaggio. La progressione di questa terapia viene facilmente monitorata mediante tecniche e saggi convenzionali.

RISULTATI

Generazione del DN30 Fab chimerico e caratterizzazione delle sue proprietà biochimiche e biologiche.

Come altri anticorpi monoclonali con potenziale terapeutico, DN30 à ̈ stato ottenuto nei topi. Quindi, il suo impiego diretto nell’uomo a scopo terapeutico non à ̈ applicabile, poiché la molecola murina verrebbe riconosciuta dagli anticorpi anti-murini umani (HAMA), il che porta alla clearance immuno-mediata dell’attività anticorpale. La sostituzione di regioni costanti murine dell’anticorpo con sequenze derivate da immunoglobuline umane (chimerizzazione di anticorpi) à ̈ sufficiente per ridurre fortemente la risposta di HAMA. mAb e Fab chimerizzati vengono attualmente usati in clinica. Mediante tecniche classiche di biologia molecolare, i presenti inventori hanno sostituito i domini costanti di una catena leggera e di una catena pesante di Fab DN30 con domini costanti derivati da immunoglobuline umane: il dominio costante di una catena leggera à ̈ stato sostituito con il dominio tipo kappa umano, il più rappresentato negli anticorpi umani naturali, mentre il dominio costante CH1 di una catena pesante à ̈ stato sostituito con il dominio omologo derivato dalla IgG1 umana. Questa combinazione à ̈ efficace: il DN30 Fab chimerizzato (MvDN30) si lega con Met con alta affinità, induce la dispersione di Met e inibisce la proliferazione di cellule Met-dipendenti, sovrapponendosi alle proprietà della molecola murina corrispondente (Fig. 1 e Fig. 2).

Progetto molecolare del Fab a duplice dominio costante.

Usando la sequenza MvDN30 come stampo, i presenti inventori hanno duplicato i domini costanti in ciascuna catena leggera e pesante (Fab a duplice dominio costante). La nuova molecola ingegnerizzata ha un peso molecolare previsto di 75 kD. I presenti inventori hanno generato due differenti DCD-Fab. Nella prima molecola i domini costanti umani sono stati duplicati in tandem, generando quindi una catena pesante chimerica VH-CH1-CH1 e una catena leggera chimerica VL-CL-CL. Nella seconda molecola i domini terminali sono stati reciprocamente scambiati, generando quindi una catena pesante chimerica VH-CH1-CL e una catena leggera chimerica VL-CL-CH1 (Fig.3). Le corrispondenti molecole ricombinanti dimeriche sono state denominate DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2. cDNA che codificano per queste nuove molecole sono stati clonati in un plasmide di espressione e quindi espressi in cellule eucariotiche. Le proteine sono state purificate dal supernatante della coltura cellulare grazie a StrepTAG che à ̈ stato inserito nel terminale carbossilico della sequenza. La Figura 4 mostra la separazione mediante SDS-Page in condizioni riducenti delle molecole ricombinanti purificate aventi l’esatto valore di peso molecolare.

DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 si legano con Met con alta affinità.

DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 purificati sono stati caratterizzati per la loro capacità di legarsi con il recettore Met. A questo scopo, i presenti inventori hanno eseguito saggi ELISA usando l’ectodominio di Met in fase solida e MvDN30, DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 in fase liquida. Il legame à ̈ stato rivelato usando anticorpi antistrepTAG (Fig. 5). Questa analisi ha dimostrato che le tre molecole monovalenti derivate da DN30 si legano con Met con affinità simile (MvDN30, Kd= 0,141 ± 0,03 nM; DCD-MvDN30.1, Kd= 0,133 ± 0,02 nM; DCD-MvDN30.2, Kd= 0,130 ± 0,03 nM).

DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 non inducono la fosforilazione di Met.

I presenti inventori hanno testato se le nuove molecole derivate da DN30 potevano mostrare un’attività agonista di Met in un saggio di fosforilazione di Met. Questa à ̈ stata analizzata usando cellule di carcinoma del polmone umano A459, che rappresentano un sistema standard per determinare l’attivazione di Met in risposta alla stimolazione acuta con ligando. Infatti, le cellule A549 esprimono livelli fisiologici di Met, inattivo in condizioni basali, ma incline a venire attivato da HGF o una molecola mimetica del ligando (4, 10). Le cellule sono state stimolate per 15 minuti con quantità crescenti di MvDN30, DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2. Le cellule sono anche state stimolate con HGF e DN-30 mAb come controlli positivi. L’attivazione di Met à ̈ stata determinata mediante immunoblotting con anticorpi anti-fosfoMet. Come mostrato nella Figura 6, le nuove molecole non hanno dimostrato alcuna attività antagonista significativa. DCD-MvDN30.1 era indistinguibile da MvDN30, che era privo di qualsiasi attività agonista. DCD-MvDN30.2 ha mantenuto un’attività agonista residua minima, che era in ogni caso irrilevante rispetto a DN30 mAb o HGF. I presenti inventori hanno anche verificato l’attivazione di molecole che agiscono come effettori a valle di Met. Mentre la stimolazione con HGF ha indotto l’attivazione delle Chinasi 1 e 2 Regolate dal segnale Extracellulare (ERK-1 e ERK-2) e AKT/Proteina Chinasi B (AKT), DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2, come MvDN30, non hanno influenzato lo stato di fosforilazione di questi trasduttori del segnale (Fig. 7).

DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 inducono la dispersione di Met I presenti inventori hanno ricercato se le nuove molecole derivate da MvDN30 mantengono la capacità di favorire la dispersione e la sottoregolazione del recettore. Cellule A549 sono state incubate con DCD-MvDN30.1, DCD-MvDN30.2 e MvDN30. Dopo 48 ore, la presenza di ectodominio di Met nel mezzo condizionato à ̈ stata analizzata mediante immunoblotting usando un anticorpo monoclonale diretto contro la porzione extracellulare di Met. I livelli cellulari totali di Met sono anche stati determinati su lisati di cellule usando lo stesso anticorpo. Questa analisi ha rivelato che DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 hanno indotto efficientemente il taglio di Met e hanno favorito la sottoregolazione di Met, portando al rilascio di ectodominio solubile di Met nello spazio extracellulare e a livelli ridotti di Met nella cellula (Fig. 8). Quindi, le nuove molecole derivare da MvDN30, come MvDN30, permettono di ottenere la completa disassociazione tra le proprietà antagoniste e agoniste del DN-30 mAb parentale.

DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 inibiscono la fosforilazione di Met indotta da HGF e la segnalazione a valle.

I presenti inventori hanno ricercato se DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 potevano inibire la fosforilazione di Met indotta da HGF e la segnalazione a valle. Cellule A549 sono state incubate con DCD-MvDN30.1, DCD-MvDN30.2 e MvDN30 per 24 h e quindi stimolate per 15 minuti con HGF. L’attivazione di Met à ̈ stata determinata mediante immunoblotting con anticorpi anti-fosfoMet. Come mostrato nella Fig. 9, le due molecole ingegnerizzate, come MvDN30, hanno sottoregolato efficientemente il recettore Met e hanno ridotto fortemente il livello della sua fosforilazione. Questo ha portato a una inibizione dell’attivazione di AKT e ERK-1,2 (Fig. 9).

DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 inibiscono la crescita dipendente dall’ancoraggio di cellule MET-dipendenti.

La crescita dipendente dall’ancoraggio può venire ridotta mediante un inibitore di Met solo nelle cellule che dipendono dalla segnalazione di Met per la proliferazione/sopravvivenza, le cosiddette cellule METdipendenti. I presenti inventori hanno analizzato il gruppo completo di cellule tumorali MET-dipendenti (GTL-16, SNU-5, Hs746T, MKN-45 – cellule di carcinoma gastrico umano - e H1993, EBC-1 – cellule di carcinoma del polmone umano). Cellule a crescita esponenziale sono state incubate con concentrazioni crescenti di DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2. MvDN30 à ̈ stato incluso nel saggio come controllo positivo. Dopo 72 ore, la crescita cellulare à ̈ stata determinata usando un saggio dell’ATP basato sulla luminescenza. Entrambe le molecole derivate da MvDN30 hanno inibito tutta la crescita delle cellule MET-dipendenti in un modo dipendente dalla dose (Fig. 10). Le proprietà di inibizione delle due molecole DCD erano comparabili a quelle di MvDN30 in tutte le cellule testate.

DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 inibiscono la crescita cellulare indipendente dall’ancoraggio.

I presenti inventori hanno testato la capacità di DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 di inibire la crescita indipendente dall’ancoraggio di cellule A549. Sono state inseminate cellule in un mezzo semisolido, sono state incubate o meno con HGF e trattate con una singola dose di DCD-MvDN30.1, DCD-MvDN30.2 e MvDN30. Dopo due settimane, le colonie di cellule sono state colorate e quantificate. Anche in questo saggio, DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 hanno ridotto la formazione di colonie dipendente da HGF in modo simile a quello di MvDN30 (Fig. 11).

DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 mostrano un profilo farmacocinetico migliorato in vivo rispetto a MvDN30.

I presenti inventori hanno studiato le proprietà farmacocinetiche di DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2, rispetto a MvDN30. Una dose singola delle molecole precedentemente menzionate à ̈ stata somministrata mediante iniezione intraperitoneale a topi immunodeficienti. Sangue periferico dai topi trattati à ̈ stato prelevato a differenti punti temporali dopo la somministrazione. Le concentrazioni in circolazione delle molecole studiate sono state determinate mediante ELISA eseguita sui campioni di siero. DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 hanno raggiunto livelli in circolazione più elevati rispetto a MvDN30. Inoltre, entrambe le molecole hanno dimostrato una semivita aumentata e una maggior durata in circolazione, essendo biologicamente disponibili per un tempo più prolungato. La clearance di DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 à ̈ fortemente migliorata rispetto a MvDN30 (riduzione della clearance rispetto a MVDN30: 9,6 e 13,7 volte rispettivamente per DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2) (Fig. 12 e Tabella 1).

Tabella 1. Parametri farmacocinetici delle molecole derivate da DN30

t1/2 CL Vss Cmax Tmax AUCtot kel (ml/h) (ml) (ng/ml) (h) (ng/ml)h (1/h) MVDN30 8,41 4,36 11,96 7595 0,5 22933 0,082 DCD-MvDN30.110,53 0,45 5,77 24130 4 220188 0,066 DCD-MvDN30.210,27 0,32 4,36 24952 4 314667 0,068 t1/2: semivita; CL: clearance; Vss: Volume di distribuzione; Cmax: concentrazione molecolare massima; Tmax: tempo per raggiungere Cmax; AUCtot: area sotto la Curva; Kel: costante di eliminazione.

MATERIALI E PROCEDIMENTI

Coltura di cellule

La linea di cellule di carcinoma del polmone EBC-1 e la linea di cellule di carcinoma gastrico MKN-45 sono state ottenute presso la Japanese Collection of Research Bioresources (Osaka, Giappone). Cellule di carcinoma gastrico umano GTL-16 sono state derivate da cellule MKN-45 come descritto (11). Tutte le altre linee cellulari sono state ottenute dalla ATCC-società LGC Standards (Sesto San Giovanni, Italia). Tutte le linee cellulari sono state mantenute in RPMI eccetto Hs746T – in DMEM - e SNU-5 – in IMDM. I mezzi per cellule sono stati integrati con il 10% (20% per SNU-5) di Siero Fetale Bovino e 2 mM di glutammina (Mezzi, siero e glutammina erano della Sigma Life Science, St. Louis, Missouri).

Ingegnerizzazione delle proteine

DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 sono costituite da una catena pesante e una catena leggera.

La catena pesante di DCD-MvDN30.1 (SEQ ID N.:1 e 2) corrisponde al dominio VH di DN30 Fab di tipo selvatico (2; SEQ ID N.: 3 e 4) fuso con il dominio CH1 dell’immunoglobulina G1 umana ripetuto in tandem (SEQ ID N.: 5 e 6). Nel terminale carbossilico, uno STREP tag (ST, SEQ ID N.:7) e un tag di poli-istidina (HT, SEQ ID N.:8) sono stati aggiunti per scopi di purificazione e rivelazione. La struttura generale corrisponde (dal terminale amminico al terminale carbossilico) a: VH-CH1-CH1-ST-HT. Le sequenze di nucleotidi e amminoacidi della catena pesante di DCD-MvDN30.1 sono riportate rispettivamente nella Figura 14A e B.

La catena leggera di DCD-MvDN30.1 (SEQ ID N.:9 e 10) corrisponde al dominio VL di DN30 Fab di tipo selvatico (SEQ ID N.:11 e 12) fuso con il dominio CL della catena kappa della immunoglobulina umana (SEQ ID N.:13 e 14) ripetuto in tandem. La struttura generale corrisponde (dal terminale amminico al terminale carbossilico) a: VL-CL-CL. Le sequenze di nucleotidi e amminoacidi della catena leggera di DCD-MvDN30.1 sono riportate rispettivamente nella Figura 13A e B.

La catena pesante di DCD-MvDN30.2 (SEQ ID N.:15 e 16) corrisponde al dominio VH di DN30 Fab di tipo selvatico (SEQ ID N.:3 e 4) fuso con il dominio CH1 dell’immunoglobulina G1 umana (SEQ ID N.: 5 e 6) più la regione CL della catena kappa dell’immunoglobulina umana (SEQ ID N.:13 e 14). La struttura generale corrisponde (dal terminale amminico al terminale carbossilico) a: VH-CH1-CL. Le sequenze di nucleotidi e amminoacidi della catena pesante di DCD-MvDN30.2 sono riportate rispettivamente nella Figura 16A e B.

La catena leggera di DCD-MvDN30.2 (SEQ ID N.:17 e 18) corrisponde al dominio VL di DN30 Fab di tipo selvatico (SEQ ID N.:11 e 12) fuso con il dominio CL della catena kappa dell’immunoglobulina umana (SEQ ID N.:13 e 14) più il CH1 dell’immunoglobulina G1 umana (SEQ ID N.: 5 e 6) più lo STREP tag (ST, SEQ ID N.:7) e il tag di poli-istidina (HT, SEQ ID N.:8). La struttura generale corrisponde (dal terminale amminico al terminale carbossilico) a: VL-CL-CH1-ST-HT. Le sequenze di nucleotidi e amminoacidi sono della catena leggera di DCD-MvDN30.2 riportate rispettivamente nella Figura 15A e B.

I cDNA che codificano per DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 sono stati sintetizzati chimicamente mediante il servizio GeneArt® (Life Technologies, Paisley, Regno Unito). Le sequenze di nucleotidi e amminoacidi dei domini variabili di una catena leggera e di una catena pesante di DN30 Fab sono riportate rispettivamente nelle Figure 17 e 18. Le regioni CDR sono sottolineate nelle sequenze di nucleotidi e amminoacidi, in cui le CDR del dominio variabile di una catena pesante hanno le sequenze di amminoacidi e nucleotidi riportate in SEQ ID N.:19 a 24, e le CDR del dominio variabile di una catena leggera hanno le sequenze di amminoacidi e nucleotidi riportate in SEQ ID N.:25 a 30.

Tutti i costrutti sono stati ingegnerizzati per contenere un sito BamHI all’estremità 5’ e un sito NotI all’estremità 3’. I frammenti BamHI-NotI sono stati subclonati nel vettore di espressione pUPEX (U-Protein Express, Utrecht, Paesi Bassi). La produzione in media scala di DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 à ̈ stata appaltata alla U-Protein Express che l’ha ottenuta mediante transfezione transitoria in cellule HEK (Renali Epiteliali Umane). Le proteine sono state purificate mediante cromatografia per affinità usando lo STREP tag e il tag di poli-istidina. Le proteine purificate sono state conservate in PBS più lo 0,02% di Tween-80 (Sigma-Aldrich) e conservate a 4°C. La purezza à ̈ stata determinata mediante SDS-PAGE in condizioni riducenti e non riducenti facendo seguire la colorazione di Coomassie.

Immunoprecipitazione e Western blot L’immunoprecipitazione à ̈ stata eseguita come descritto (12) usando mAb anti-Met DO-24 (4). Il Western blot à ̈ stato eseguito usando i seguenti anticorpi: clone DL-21 di mAb anti-Met umano che riconosce un dominio che si trova nella porzione extracellulare di Met (4); il clone di mAb antifosfotirosina 4G10 mAb (Millipore, Temecula, California); anti-fosfo-Met (Tyr 1234/1235), anti-fosfo-Met (Tyr 1349), anti-fosfo-Akt (Ser 473), anti-Akt, anti-fosfo-ERK (Thr 202/Tyr 204) e Ab policlonali anti-ERK (Cell Signaling Technology, Beverly, Massachusetts).

Saggi di legame ELISA

Il legame di MvDN30, DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 à ̈ stato determinato mediante ELISA usando una chimera Met-Fc in fase solida (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) e concentrazioni crescenti di anticorpo ricombinante marcato con FLAG in fase liquida. Il legame à ̈ stato rivelato usando un anticorpo anti-strepTAG II coniugato con perossidasi di rafano (IBA, Olivette, Missouri). I dati sono stati analizzati e adattati usando il programma Prism (Graph Pad Software, San Diego, California). La chimera Met-Fc à ̈ una proteina di fusione in cui il dominio Fc derivato da una IgG umana viene fuso in frame con la porzione extracellulare di Met.

Analisi dell’attivazione di Met

Cellule di carcinoma del polmone umano A549 subconfluenti sono state incubate in un mezzo privo di siero per 48 ore e quindi stimolate per 10 minuti con le concentrazioni indicate di HGF ricombinante (R&D Systems) o DN-30 mAb, MvDN30, DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 purificati come descritto (13). Dopo la stimolazione, le cellule sono state immediatamente lisate e trattate come descritto (12). Gli estratti cellulari sono stati immunoprecipitati con anticorpi anti-Met (DO-24), risolti mediante SDS-PAGE e analizzati mediante Western blot usando anticorpi antifosfotirosina. Gli stessi blot sono stati nuovamente sondati con anticorpi anti-Met (DL-21) per normalizzare la quantità di Met immunoprecipitato.

Per l’inibizione della fosforilazione di Met indotta da HGF, cellule A549 sono state trattate per 24 h in un mezzo privo di siero con MvDN30, DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2 e quindi stimolate con HGF come precedentemente descritto. Monostrati di cellule sono stati lisati con tampone di Laemmli e quantità uguali di proteine totali, separati in gel di acrilammide mediante SDS-PAGE e analizzati mediante immunoblotting con anticorpi antifosfo-Met (Tyr 1234/1235).

Analisi della dispersione di Met

Monostrati di A549 subconfluenti sono stati lavati due volte con PBS e quindi incubati in un mezzo privo di siero con le concentrazioni indicate di DN-30 FAb o mAb. Dopo 48 ore, il mezzo condizionato à ̈ stato raccolto e le cellule sono state lisate con tampone di Laemmli. I livelli di proteine Met sono stati determinati in 50 Î1⁄4l di lisati di cellule totali e in 50 Î1⁄4l di supernatante di coltura cellulare mediante Western blot usando l’mAb DL-21 anti-Met.

Saggi biologici in vitro

Per l’analisi della crescita cellulare, sono state inseminate cellule in piastre a 96 pozzetti (1.000 cellule/pozzetto) in un mezzo contenente il 10% di FBS. Dopo 24 ore, il mezzo à ̈ stato sostituito con mezzo fresco contenente le molecole derivate da DN30 più anticorpi in FCS al 5% alle concentrazioni indicate. Il numero di cellule à ̈ stato valutato dopo 72 h usando il saggio delle vitalità delle cellule luminescenti CellTiter-Glo (Promega Corporation, Madison, Wisconsin) secondo le istruzioni del produttore. La chemioluminescenza à ̈ stata rilevata con un’apparecchiatura Multilabel Reader PerkinElmer 2030 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finlandia).

Per i saggi di crescita indipendenti dall’ancoraggio, sono state inseminate cellule in piastre a 48 pozzetti (500 cellule/pozzetto) in un mezzo contenente il 2% di FBS e lo 0,5% di agarosio SeaPlaque (BMA, Rockland, Maine). Sono stati aggiunti anticorpi (1,5 Î1⁄4M) e HGF (50 ng/ml) nel mezzo di coltura ogni 3 giorni. Dopo 21 giorni di coltura, le colonie sono state colorate mediante sali di tetrazolio (Sigma Life Science) e valutate mediante il Programma MetaMorphOffline (Molecular Device LLC, Sunnyvale, California).

Analisi farmacocinetica

A topi NOD-SCID immunodeficienti adulti (peso corporeo tra 18 e 22 g, media di 20 g) sono stati iniettati IP 100 Î1⁄4g di DCD-MvDN30.1 o DCD-MvDN30.2 o MvDN30. È stato prelevato sangue periferico in tempi differenti (per MvDN30: 10, 20 e 30 min, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 24, 48 ore; per DCD-MvDN30.1 e DCD-MvDN30.2: 30 min, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 24, 48, 72, 96, 144 ore dopo la somministrazione). Le concentrazioni delle molecole terapeutiche sono state valutate mediante ELISA come precedentemente descritto nella sezione relativa al saggio di legame, mediante interpolazione dei valori di assorbanza dei campioni sulla parte lineare di una curva standard ottenuta mediante diluizioni seriali delle differenti molecole purificate. Ciascun punto del tempo era il valore medio di almeno 3 topi.

RIFERIMENTI

1) Martens, T., et al. A novel one-armed anti-c-Met antibody inhibits glioblastoma growth in vivo. Clin Cancer Res. (2006); 12: 6144-52.

2) Jin, H., et al. MetMAb, the one-armed 5D5 anti-c-Met antibody, inhibits orthotopic pancreatic tumor growth and improves survival. Cancer Res. (2008); 68: 4360-8.

3) www.clinicaltrial.gov; Codice Identificativo: NCT01456325.“A study of Onartuzumab (MetMab) in combination with Tarceva (Erlotinib) in patients with Met diagnosticpositive Non-Small Cell Lung cancer who have received chemotherapy for advanced or metastatic disease (MetLung)†.

4) Prat, M., et al. Agonistic monoclonal antibodies against the Met receptor dissect the biological responses to HGF. J Cell Sci. (1998); 111: 237-47.

5) Petrelli, A., et al. Ab-induced ectodomain shedding mediates hepatocyte growth factor receptor downregulation and hampers biological activity. Proc Natl Acad Sci U S A. (2006); 103: 5090-5.

6) Foveau, B., et al. Down-regulation of the met receptor tyrosine kinase by presenilin-dependent regulated intramembrane proteolysis. Mol Biol Cell. (2009); 20: 2495-507.

7) Schelter, F, et al. A disintegrin and metalloproteinase-10 (ADAM-10) mediates DN30 antibodyinduced shedding of the met surface receptor. J Biol Chem. (2010); 285: 26335-40.

8) Pacchiana G, et al. Monovalency unleashes the full therapeutic potential of the DN-30 anti-Met antibody. J Biol Chem. (2010); 285: 36149-57.

9) Reichert JM. Antibody-based therapeutics to watch in 2011. MAbs. (2011); 3: 76-99.

10) Michieli P, et al. An HGF-MSP chimera disassociates the trophic properties of scatter factors from their pro-invasive activity. Nat Biotechnol (2002); 20:488-495.

11) Giordano S, et al. p145, A protein with associated tyrosine kinase activity in a human gastric carcinoma cell line. Mol Cell Biol 19888:3510-3517.

12) Longati P, et al. Tyrosines1234-1235 are critical for activation of the tyrosine kinase encoded by the MET proto-oncogene (HGF receptor). Oncogene 1994 9:49-57.

13) Vigna E, et al. “Active†cancer immunotherapy by anti-Met antibody gene transfer. Cancer Res 2008 68:9176-9183

ELENCO DELLE SEQUENZE

<110> Metheresis Translational Research

<120> Nuovi frammenti anticorpali, relative composizioni ed usi

<130> BIT15799-CF

<160> 30

<170> PatentIn versione 3.5

<210> 1

<211> 1155

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> catena pesante di DCD-MvDN30.1

<400> 1

atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgg ccactcccag 60 gtccaactgc aacagcctgg gactgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagt tactggatac actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca gcggtcgtac taactacaac 240 gagaaattca agaacaaggt cacagtgact gtagacaaat cttccaccac agcctacatg 300 caactcagca acctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag taggggctac 360 tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagctagca cgaagggccc atcggtcttc 420 cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 480 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 540 gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 600 accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 660 agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt gtgcaagcac gaagggccca 720 tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 780 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 840 accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 900 agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 960 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 1020 cacacaggtg ccgcatggag ccacccccag ttcgaaaaag gggccgcatg gagccacccc 1080 cagttcgaaa aaggggccgc atggagccac ccccagttcg aaaaaggggc cgcacaccat 1140 caccatcacc attag 1155

<210> 2

<211> 384

<212> PRT

<213> artificiale

<220>

<223> aa di una catena pesante di DCD-MvDN30.1

<400> 2

Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 1 5 10 15

Gly His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45

Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Asn Lys Val Thr Val Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 115 120 125

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 130 135 140

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 145 150 155 160 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

165 170 175

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 180 185 190

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 195 200 205

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 210 215 220

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Ala Ser Thr Lys Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

245 250 255

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 260 265 270

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 275 280 285

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 290 295 300

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

305 310 315 320

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

325 330 335

Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu

340 345 350

Lys Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp

355 360 365

Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala His His His His His His

370 375 380

<210> 3

<211> 334

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> dominio VH di DN30

<400> 3

ggtccaactg caacagcctg ggactgaact ggtgaagcct ggggcttcag tgaagctgtc 60 ctgcaaggct tctggctaca ccttcaccag ttactggata cactgggtga agcagaggcc 120 tggacaaggc cttgagtgga ttggagagat taatcctagc agcggtcgta ctaactacaa 180 cgagaaattc aagaacaagg tcacagtgac tgtagacaaa tcttccacca cagcctacat 240 gcaactcagc aacctgacat ctgaggactc tgcggtctat tactgtgcaa gtaggggcta 300 ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 334

<210> 4

<211> 112

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> aa del dominio VH di DN30

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Lys Val Thr Val Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 5

<211> 315

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> dominio CH1 umano

<400> 5

aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 60 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 120 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 180 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 240 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 300 gacaaaactc acaca 315

<210> 6

<211> 105

<212> PRT

<213> artificiale

<220>

<223> aa del dominio CH1 umano

<400> 6

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

1 5 10 15

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

20 25 30

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

35 40 45

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

50 55 60

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

65 70 75 80

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

85 90 95

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

100 105

<210> 7

<211> 108

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> strep tag

<400> 7

ggtgccgcat ggagccaccc ccagttcgaa aaaggggccg catggagcca cccccagttc 60 gaaaaagggg ccgcatggag ccacccccag ttcgaaaaag gggccgca 108

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> tag di poli-istidina

<400> 8

caccatcacc atcaccat 18

<210> 9

<211> 1035

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> catena leggera di DCD-MvDN30.1

<400> 9

atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg gtagttatat gagttggttc 180 caacagagac caggacagcc acccaaactc ctcatctctg ctgcatccaa ccttgaatct 240 ggcatcccag ccaggtttag tggcagtggc tctgggacag acttcaccct caatatccat 300 cctgtggagg aggaggatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagttatga agacccgctc 360 acgttcggtg ctggtaccaa ggtggagatc aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgtactgtg 720 gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc 780 tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 840 gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac 900 agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa 960 gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 1020 aggggagagt gttaa 1035

<210> 10

<211> 344

<212> PRT

<213> artificiale

<220>

<223> aa di una catena leggera di DCD-MvDN30.1

<400> 10

Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr Met Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

65 70 75 80

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

165 170 175

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Val

225 230 235 240

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

245 250 255

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

260 265 270

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

275 280 285

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

290 295 300

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

305 310 315 320

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

325 330 335

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

340

<210> 11

<211> 336

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> dominio VL di DN30

<400> 11

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg gtagttatat gagttggttc 120 caacagagac caggacagcc acccaaactc ctcatctctg ctgcatccaa ccttgaatct 180 ggcatcccag ccaggtttag tggcagtggc tctgggacag acttcaccct caatatccat 240 cctgtggagg aggaggatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagttatga agacccgctc 300 acgttcggtg ctggtaccaa ggtggagatc aaacga 336

<210> 12

<211> 112

<212> PRT

<213> artificiale

<220>

<223> aa del dominio VL di DN30

<400> 12

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Gly Ser Tyr Met Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 13

<211> 318

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> dominio CL umano

<400> 13

actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60 actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120 aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180 aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240 cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300 ttcaacaggg gagagtgt 318

<210> 14

<211> 106

<212> PRT

<213> artificiale

<220>

<223> aa del dominio CL umano

<400> 14

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 15

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> catena pesante di DCD-MvDN30.2

<400> 15

atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgg ccactcccag 60 gtccaactgc aacagcctgg gactgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagt tactggatac actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca gcggtcgtac taactacaac 240 gagaaattca agaacaaggt cacagtgact gtagacaaat cttccaccac agcctacatg 300 caactcagca acctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag taggggctac 360 tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagctagca cgaagggccc atcggtcttc 420 cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 480 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 540 gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 600 accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 660 agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt gtactgtggc tgcaccatct 720 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 780 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 840 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 900 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 960 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 1020 taa 1023

<210> 16

<211> 340

<212> PRT

<213> artificiale

<220>

<223> aa di una catena pesante di DCD-MvDN30.2

<400> 16

Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp

1 5 10 15

Gly His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Asn Lys Val Thr Val Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 115 120 125

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 130 135 140

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 145 150 155 160 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

165 170 175

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 180 185 190

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 195 200 205

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 210 215 220

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Thr Val Ala Ala Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala

245 250 255

Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 260 265 270

Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 275 280 285

Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 290 295 300

Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 305 310 315 320 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn

325 330 335

Arg Gly Glu Cys

340

<210> 17

<211> 1167

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> catena leggera di DCD-MvDN30.2

<400> 17

atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg gtagttatat gagttggttc 180 caacagagac caggacagcc acccaaactc ctcatctctg ctgcatccaa ccttgaatct 240 ggcatcccag ccaggtttag tggcagtggc tctgggacag acttcaccct caatatccat 300 cctgtggagg aggaggatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagttatga agacccgctc 360 acgttcggtg ctggtaccaa ggtggagatc aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgtgcaagc 720 acgaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 780 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 840 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 900 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 960 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 1020 tgtgacaaaa ctcacacagg tgccgcatgg agccaccccc agttcgaaaa aggggccgca 1080 tggagccacc cccagttcga aaaaggggcc gcatggagcc acccccagtt cgaaaaaggg 1140 gccgcacacc atcaccatca ccattag 1167

<210> 18

<211> 388

<212> PRT

<213> artificiale

<220>

<223> aa di una catena leggera di DCD-MvDN30.2

<400> 18

Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr Met Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro 50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110

Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val 115 120 125

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

165 170 175

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ala Ser 225 230 235 240 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

245 250 255

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 260 265 270

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 275 280 285

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 290 295 300

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 305 310 315 320 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

325 330 335

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Ala Ala Trp Ser His 340 345 350

Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 355 360 365

Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala His His 370 375 380

His His His His

385

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> artificiale

<220>

<223> aa di CDRH1 di DN30

<400> 19

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> CDRH1 di DN30

<400> 20

ggctacacct tcaccagtta ctgg 24

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> aa di CDRH2 di DN30

<400> 21

Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Thr

1 5

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> CDRH2 di DN30

<400> 22

attaatccta gcagcggtcg tact 24

<210> 23

<211> 5

<212> PRT

<213> artificiale

<220>

<223> aa di CDRH3 di DN30

Ala Ser Arg Gly Tyr

1 5

<210> 24

<211> 15

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> CDRH3 di DN30

<400> 24

gcaagtaggg gctac 15

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> artificiale

<220>

<223> aa di CDRL1 di DN30

<400> 25

Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr

1 5 10

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> CDRL1 di DN30

<400> 26

caaagtgttg attatgatgg tggtagttat 30

<210> 27

<211> 3

<212> PRT

<213> artificiale

<220>

<223> aa di CDRL2 di DN30

<400> 27

Ala Ala Ser

1

<210> 28

<211> 9

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> CDRL2 di DN30

<400> 28

gctgcatcc 9

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> artificiale

<220>

<223> aa di CDRL3 di DN30

<400> 29

Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr

1 5

<210> 30

<211> 27

<212> DNA

<213> artificiale

<220>

<223> aa di CDRL3 di DN30

<400> 30

cagcaaagtt atgaagaccc gctcacg 27

Claims (21)

1. RIVENDICAZIONI 1. Frammento anticorpale che comprende un primo polipeptide comprendente un dominio variabile di una catena leggera e due domini costanti e un secondo polipeptide comprendente un dominio variabile di una catena pesante e due domini costanti, in cui due domini costanti sono domini costanti di una catena leggera e due domini costanti sono domini costanti CH1 di una catena pesante.
2. 2. Frammento anticorpale secondo la rivendicazione 1, in cui detto dominio variabile di una catena leggera viene scelto tra un dominio variabile di una catena leggera non umana o un dominio variabile di una catena leggera umana o umanizzata che comprende le regioni che determinano la complementarità (CDR) da un anticorpo non umano.
3. 3. Frammento anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 2, in cui detto dominio variabile di una catena pesante viene scelto tra un dominio variabile di una catena pesante non umana o un dominio variabile di una catena pesante umana o umanizzata che comprende le regioni che determinano la complementarità (CDR) da un anticorpo non umano.
4. 4. Frammento anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui il primo polipeptide comprende un dominio variabile di una catena leggera e due domini costanti di una catena leggera umana, in cui il dominio variabile di una catena leggera à ̈ fuso con un dominio costante di una catena leggera umana e i due domini costanti di una catena leggera umana sono fusi l’uno con l’altro.
5. 5. Frammento anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, in cui il secondo polipeptide comprende un dominio variabile di una catena pesante e due domini costanti di una catena pesante umana, in cui il dominio variabile di una catena pesante à ̈ fuso con un dominio costante CH1 di una catena pesante umana e i due domini costanti CH1 di una catena pesante umana sono fusi l’uno con l’altro.
6. 6. Frammento anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui il primo polipeptide comprende un dominio variabile di una catena leggera, un dominio costante di una catena leggera umana e un dominio costante CH1 di una catena pesante umana, in cui il dominio variabile di una catena leggera à ̈ fuso con il dominio costante di una catena leggera umana, e il dominio costante di una catena leggera umana à ̈ fuso con il dominio costante CH1 di una catena pesante umana.
7. 7. Frammento anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3 o 6, in cui il secondo polipeptide comprende un dominio variabile di una catena pesante, un dominio costante CH1 di una catena pesante umana e un dominio costante di una catena leggera umana, in cui il dominio variabile di una catena pesante à ̈ fuso con il dominio costante CH1 di una catena pesante umana, e il dominio costante CH1 di una catena pesante umana à ̈ fuso con il dominio costante di una catena leggera umana.
8. 8. Frammento anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7, in cui il dominio costante di una catena leggera à ̈ un dominio costante di una catena leggera kappa umana.
9. 9. Frammento anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 8, in cui il dominio costante CH1 di una catena pesante à ̈ un dominio costante CH1 di una catena pesante gamma umana.
10. 10. Frammento anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 9, in cui il dominio costante CH1 di una catena pesante deriva da una IgG1 umana.
11. 11. Frammento anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 10, in cui il frammento anticorpale à ̈ più stabile in vivo rispetto alla molecola Fab che comprende detti domini variabili di una catena leggera e pesante.
12. 12. Frammento anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 11, in cui detto frammento anticorpale si lega specificamente con il recettore del fattore di crescita degli epatociti (HGFR).
13. 13. Composizione farmaceutica che comprende il frammento anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 12 e un veicolo farmaceuticamente accettabile.
14. 14. Frammento anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 12 per l’uso nel trattamento di un paziente affetto da un tumore e/oppure una metastasi.
15. 15. Frammento anticorpale secondo la rivendicazione 14, in cui detto tumore e/oppure metastasi à ̈ associato/associata con la disregolazione delle segnalazione e/oppure attivazione di HGFR.
16. 16. Prodotto contenente un frammento anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 12 e almeno uno tra un inibitore di HGF e un inibitore di HGFR, come preparazione combinata per l’uso simultaneo, separato o sequenziale nel trattamento di tumori e/oppure metastasi, preferibilmente un tumore e/oppure una metastasi associato/associata alla disregolazione della segnalazione e/oppure attivazione di HGFR.
17. 17. Prodotto secondo la rivendicazione 16, in cui l’almeno un inibitore viene scelto tra anticorpi anti-HGF, molecole ricombinanti che competono con HGF, inibitori di HGFR a molecole piccole, inibitori o anticorpi anti-HGFR.
18. 18. Acido nucleico isolato che codifica per il frammento anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 12.
19. 19. Vettore comprendente almeno una sequenza di nucleotidi che codifica per il frammento anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 12.
20. 20. Composizione che comprende due o più acidi nucleici che codificano per il frammento anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 12.
21. 21. Acido nucleico isolato secondo la rivendicazioni 18, vettore secondo la rivendicazione 19, o composizione secondo la rivendicazione 20 per l’uso nel trattamento di un paziente affetto da un tumore e/oppure una metastasi, preferibilmente un tumore e/oppure una metastasi associato/associata con la disregolazione della segnalazione e/oppure attivazione di HGFR.