BRPI0707763A2 - mÉtodo para produzir um Ácido hialurânico - Google Patents
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Abstract
METODO PARA PRODUZIR UM ÁCIDO HIALURâNICO A presente invenção diz respeito a métodos para produzir um a ácido hialurônico com um peso molecular médio desejado na faixa de 20.000-800.000 Dalton, os métodos compreendendo as etapas de: (a) cultivar uma célula hospedeira de Bacilius recombinante a uma primeira temperatura que conduz ao seu crescimento, em que a célula hospedeira de Bacilius compreende uma construção de ácido nucleico compreendendo uma seqúência que codifica a hialuronan sintase ligada operacionalmente a um promotor de seqúência estranha a uma seqúência que codifica a hialuronan sintase; (b) então, cultivar a célula hospedeira de Bacilius recombinante da etapa (a) a uma segunda temperatura maior que a primeira temperatura da etapa (a) sob condições adequadas para a produção de ácido hialurônico, através das quais a célula hospedeira de Bacilius produz ácido hialurônico com um peso molecular médio desejado na faixa de 20.000 - 800.000 Dalton; e (b) recuperar o ácido hialurônico.
Description
"MÉTODO PARA PRODUZIR UM ÁCIDO HIALURÔNICO"
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção diz respeito aos métodos para a produçãorecombinante em uma célula hospedeira Gram-positiva de ácido hialurônico(HA ou hialuronan) com um peso molecular médio baixo (MW) porfermentação controlada por temperatura. A célula hospedeira promotora deHA é primeiramente fermentada a uma temperatura que conduz ao seucrescimento, seguida por uma mudança para uma temperatura mais elevadafavorável à produção de HA de MW baixo desejado. A temperatura eopHfavoráveis para a produção de HA de MW baixo podem em algumasocorrências ainda estar situados foras das faixas de pH e temperaturanormalmente considerados favoráveis para o crescimento dos microrganismosque foram fermentados.
FUNDAMENTO DA INVENÇÃO
Os heteropolissacarídeos mais abundantes do corpo são asglicosaminoglicanas. Glicosaminoglicanas são polímeros de carboidratos nãoramificados, que consistem em unidades dissacarídicas repetidas (somente osulfato de queratan é ramificado na região central do carboidrato). Asunidades dissacarídicas geralmente compreendem, como uma primeiraunidade sacarídica, um dos dois açúcares modificados N-acetilgalactosamina(GaINAc) ou N-acetilglicosamina (GIcNAc). A segunda unidade énormalmente um ácido urônico, tais como ácido glicurônico (GIcUA) ouiduronato.
Glicosaminoglicanas são moléculas carregadas negativamente,e têm uma conformação estendida que transmite alta viscosidade quando emsolução. Glicosaminoglicanas estão localizadas basicamente na superfície dascélulas ou na matriz extracelular. Glicosaminoglicanas também têm baixacompressibilidade em solução e, como um resultado, são ideais como umfluido fisiológico lubrificante, por exemplo, nas articulações. A rigidez dasglicosaminoglicanas fornece a integridade estrutural das células e fornecepassagens entre as células, permitindo a migração da célula. Asglicosaminoglicanas de maior importância fisiológica são hialuronan, sulfatode condroitina, heparina, sulfato de heparina, sulfato de dermatan, e sulfato dequeratina. A maioria das glicosaminoglicanas liga-se covalentemente a umaproteína central proteoglicana por meio de estruturas oligossacarídicasespecíficas. O hialuronan forma agregados enormes com certasproteoglicanas, mas é uma exceção, já que cadeias de carboidrato livresformam complexos não-covalentes com proteoglicanas.
O ácido hialurônico é definido nesta como umaglicosaminoglicana não-sulfatada composta de unidades dissadarídicasrepetidas de N-acetilglicosamina (GIcNAc) e ácido glicurônico (GIcUA)ligados entre si alternando-se as ligações 1,4-beta e 1,3-beta-glicosídicas. Oácido hialurônico é também conhecido como hialuronan, hialuronato, ou HA.Os termos hialuronan e ácido hialurônico são usados indiferentemente nesta.
Inúmeras funções do hialuronan no corpo foram identificadas(veja, Laurent T. C. e Fraser J. R. E., 1992, FASEB J. 6: 2397-2404; e TooleB.P., 1991, "Proteoglycans e hyaluronan in morphogenesis anddifferentiation" In: Cell Biology of the Extracellular Matrix, pp. 305-341, HayE. D., ed., Plenum, New York). O hialuronan está presente na cartilagemhialina, fluido de articulação sinovial e tecido da pele, tanto derme quantoepiderme. Hialuronan é também suspeito de ter um papel em inúmerasfunções fisiológicas, tais como adesão, desenvolvimento, motilidade dacélula, câncer, angiogênese, e cicatrização de feridas. Devido à únicaspropriedades físicas e biológicas do hialuronan, este é empregado em cirurgianos olhos e articulações e está sendo avaliado em outros procedimentosmédicos. Produtos de hialuronan também foram desenvolvidos para o uso emortopedia, reumatologia e dermatologia.
Cristas de gaios são uma fonte comercial significante para ohialuronan. Microrganismos são uma fonte alternativa. A patente U.S.4.801.539 descreve um método de fermentação para preparar ácidohialurônico envolvendo uma cepa de Streptococcus zooepidemieus comrendimentos reportados de cerca de 3,6 g de ácido hialurônico por litro. Apatente européia EP0694616 descreve os processos de fermentação usandouma cepa aprimorada de Streptoeoceus zooepidemieus com rendimentosreportados de cerca 3,5 g de ácido hialurônico por litro.
Os microrganismos usados para a produção de ácidohialurônico por fermentação são cepas de bactérias patogênicas, em primeirolugar entre elas sendo vários Streptococcus spp. O grupo Aeo grupo Cestreptococo circundam-se com uma cápsula não-antigênica composta dehialuronan, que é idêntica em composição àquela encontrada em tecidoconjuntivo e articulações. Pasteurella multocida, uma outra bactériaencapsulada patogênica, também circunda suas células com hialuronan.
Hialuronan sintases foram descritas de vertebrados, patógenosbacterianos e vírus de algas (DeAngelis, P. L., 1999, Cell. Mot. Life Sei. 56:670-682). WO 99/23227 descreve um Grupo I sintase hialuronato deStreptococcus equisimilis. WO 99/51265 e WO 00/27437 descrevem umGrupo II sintase hialuronato de Pasturella multocida. Ferretti et al. descrevemo operon hialuronan sintase de Streptoeoceus pyogenes, que é composto detrês genes, hasA, hasB, e hasC, que codificam a sintase hialuronato,desidrogenase glicose UDP, e pirofosforilase glicose UDP, respectivamente(Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 98, 4658-4663, 2001). WO 99/51265 descreveum segmento de ácido nucleico tendo uma região codificada por umahialuronan sintase Streptoeoceus equisimilis.
A produção de ácido hialurônico, particularmente de pesomolecular médio baixo, tal como inferior a 1 MDa, é mais comumentealcançado inicialmente isolando-se o material com peso molecular mais alto(>1MDa) do caldo de fermentação ou de fontes animais. A redução desejadano peso molecular é então alcançada, tipicamente, por meio de fracionamento,por meios mecânico/físico, ou por meios químicos.
O fracionamento foi feito sobre uma membrana seletiva detamanho com as frações resultantes tendo um peso molecular médio na faixade 30.000 - 730.000 Dalton, moléculas maiores sendo retidas pela membrana.
A precipitação do solvente é também bem estabelecida, as moléculas maioressão precipitadas primeiro, mas este método carece da resolução dofracionamento da membrana. Em geral, os métodos fracionamento tendem serfavoráveis para o isolamento de moléculas maiores, e não realmenteadequados para a produção de moléculas pequenas.
Usando-se meios mecânicos, as moléculas estão sujeitas a umatensão de cisalhamento suficiente para causar a ruptura. Por exemplo, omaterial HA de 1.700.000 Da pode ser reduzido a menos de 500.000 Da emum homogeneizador de alta pressão (W09104279-A). O método pode sermelhorado, por exemplo, com máquinas do tipo Manton-Gaulin, estas sendodisponíveis em várias escalas e capazes de processar material em taxas de 10l/h superior à ordem de muitos m /h.
Meios físicos, tal como exposição ao ultra-som, também foramreportados como funcionais, mas é difícil implementar tais métodos emqualquer lugar maior que a escala de laboratório (Orvisky et al. 1993. Sizeexclusion chromatographic characterization of sodium hyaluronate fractionsprepared by high energetic sonication. Chromatographia vol. 37 (1-2): 20-22).
Meios químicos, tal como hidrólise a valores extremos de pH,também foram descritos, ou na presença de outros químicos. Tais métodospodem ser inadequados se o mediador de ph ou produto químico não puderestar presente no produto final, ou se um controle fino for necessário parainiciar e parar o processo; taxas de mistura podem ser limitantes em largaescala.
Quando o HA é isolado de fontes animais, não há nenhumcontrole sobre o MW de partida, e este é quase sempre de ordem alta(>5MDa). HA fermentado de microrganismos do tipo selvagem tem maiscomumente um MW menor que o das fontes animais, mas ainda maiores que1 Mda.
HA de fermentações de Streptococcus do tipo selvagem foramcom freqüência citados com tendo um peso molecular médio na faixa de 1,5MDa a 3,2 MDa. Um Streptoeoeeus zooepidemieus que foi desenvolvido emuma estrutura em que este teve uma taxa de crescimento específica máxima à40°C, foi relatado por produzir ácido hialurônico de peso molecular cada vezmaior quando a temperatura de fermentação foi reduzida de 40°C para 32°C.Isto foi sugerido como o resultado de uma diminuição da taxa de crescimentoespecífica (Armstrong & Johns. 1997. Appl. Envir. Microbiol. vol. 63: 2759-2764). Outros autores confirmaram uma correlação entre a taxa decrescimento específica de S. zooepidemieus e sua produtividade HA, bemcomo o peso molecular do HA que este produz (Chong B.F., et al. 2005.Microbial acid hyaluronic production. Appl. Microbiol. e Biotech. vol. 66(4):341-351). Entretanto, a literatura do assunto de produção de HA microbiana étotalmente focada em maximizar o peso molecular de HA, não reduzi-lo.
Bacilos são bem consagrados como sistemas de célulahospedeira para a produção de proteínas nativas e recombinantes, incluindoexpressão recombinante de enzimas hialuronan sintase exógenas, quepermitem a célula hospedeira produzir ácido hialurônico (WO 2003054163).É um objeto da presente invenção fornecer métodos para produzir um ácidohialurônico com um baixo peso molecular médio desejado na faixa de 20.000- 800.000 Dalton em uma célula hospedeira de Bacillus recombinante.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Como mencionado anteriormente, a produção de ácidohialurônico com um baixo peso molecular médio, tal como, inferior a 800.000Da, é mais comumente alcançada primeiramente isolando o material comMW maior (>lMDa) e então reduzindo o peso molecular, tipicamente, pormeio de fracionamento, por meios mecânico/físico ou por meios químicos.
As presentes invenções fornecem um método de fermentaçãocom uma célula hospedeira recombinante que diretamente produz HA tendo obaixo MW desejado menor que 800.000 Da que por sua vez fornece inúmerosbenefícios de processamento posteriores.
Quando um material HA é produzido diretamente tendo umbaixo MW desejado próximo, então cada etapa do processo de produção,incluindo as operações de fermentação e unidade de recuperação, se beneficiade uma viscosidade mais baixa. Além disso, torna-se possível operar em umamaior concentração geral de HA maior que com moléculas de um MW maior.Isto libera a capacidade de produção, permite um resultado máximo maisrápido, e resultados em um processo mais eficiente que é mais prontamentecontrolado. Há também benefícios no controle de qualidade.
Conseqüentemente, em um primeiro aspecto, a invenção dizrespeito a um método para produzir um ácido hialurônico com um pesomolecular médio desejado na faixa de 20.000 - 800.000 Dalton, o métodocompreendendo as etapas de:
(a) cultivar uma célula hospedeira de Bacillus recombinanteem uma primeira temperatura que conduz ao seu crescimento, em que a célulahospedeira de Bacillus compreende uma construção de ácido nucleicocompreendendo uma seqüência que codifica a hialuronan sintase ligadaoperacionalmente a um promotor de seqüência estranha a uma seqüência quecodifica a hialuronan sintase;
(b) então, cultivar a célula hospedeira de Bacillusrecombinante da etapa (a) a uma segunda temperatura maior que a primeiratemperatura da etapa (a) sob condições adequadas para a produção de ácidohialurônico, pelas quais a célula hospedeira de Bacillus produz ácidohialurônico com um peso molecular médio desejado na faixa de 20.000 -800.000 Dalton; e
(b) recuperar o ácido hialurônico.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS
A figura 1 mostra a tendência para o peso molecular médio nofinal das fermentações em função da temperatura de fermentação final,determinado por GPC-MALLS. A figura mostra que um MW desejado podeser selecionado por meio de manipulação da temperatura de fermentação. Háum máximo em temperaturas finais baixas de 17°C, e um mínimo emtemperaturas de fermentação altas de 52°C. A identidade do máximoverdadeiro foi protegida selecionando-se uma origem não-zero para o pesomolecular.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção diz respeito a métodos para produzir umácido hialurônico com um peso molecular médio desejado na faixa de 20.000- 800.000 Dalton, os métodos compreendendo as etapas de:
(a) cultivar uma célula hospedeira de Bacillus recombinanteem uma primeira temperatura que conduz ao seu crescimento, em que a célulahospedeira de Bacillus compreende uma construção de ácido nucleicocompreendendo uma seqüência que codifica a hialuronan sintase ligadaoperacionalmente a um promotor de seqüência estranha a uma seqüência quecodifica a hialuronan sintase;
(b) então, cultivar a célula hospedeira de Bacillusrecombinante da etapa (a) a uma segunda temperatura maior que a primeiratemperatura da etapa (a) sob condições adequadas para a produção de ácidohialurônico, pelas quais a célula hospedeira de Bacillus produz ácidohialurônico com um peso molecular médio desejado na faixa de 20.000 -800.000 Dalton; e
(b) recuperar o ácido hialurônico.
Os métodos da presente invenção representam uma melhoriaalém da produção de hialuronan de bactérias patogênicas, encapsuladas cometapas de processo subseqüentes para reduzir o peso molecular. Nas bactériasencapsuladas, uma quantidade grande de hialuronan é produzida na cápsula.No processo e purificação do hialuronan de tais fontes, é primeiramentenecessário remover o hialuronan da cápsula, tais como pelo uso de um agentetensoativo, ou detergente, tal como SDS. Isto cria uma etapa complicada naprodução comercial do hialuronan, já que o agente tensoativo pode seradicionado de maneira a liberar uma grande porção do hialuronan, esubseqüentemente o agente tensoativo pode ser removido antes da purificaçãofinal.
A presente invenção permite a produção de uma grandequantidade de um hialuronan de baixo MW, que é produzido em uma célulahospedeira não-encapsulada segura, como hialuronan livre.
Uma vez que o hialuronan da célula Bacillus recombinante éretirada diretamente do meio de cultura, um processo simples pode ser usadopara isolar o hialuronan do meio de cultura. Primeiramente, as célulasBacillus e os fragmentos celulares são fisicamente removidos do meio decultura. O meio de cultura pode ser diluído primeiro, se desejado, para reduzira viscosidade do meio. Muitos métodos são conhecidos pelos versados natecnologia para remover células do meio de cultura, tais como centrifugaçãoou microfiltração. Se desejado, o sobrenadante remanescente pode então serfiltrado, tal como por ultrafiltração, para concentrar e remover contaminantesde molécula pequena do hialuronan. Seguindo a remoção das células efragmentos celulares, uma precipitação simples de hialuronan do meio éexecutada por mecanismos conhecidos. Sal, álcool, ou combinações de sal eálcool podem ser usados para precipitar o hialuronan do líquido filtrado. Umavez reduzido a um precipitado, o hialuronan pode ser facilmente isolado dasolução por meios físicos. Alternativamente, o hialuronan pode ser seco ouconcentrado da solução filtrada por usar técnicas evaporativas conhecidas natecnologia, tal como secagem por aspersão.
Os métodos da presente invenção, dessa forma, representamuma melhoria em relação às técnicas existentes para produzir hialuronancomercialmente por fermentação, posto que não requerer o uso de um agentetensoativo na purificação do hialuronan das células em cultura.
Nos métodos da invenção, o hospedeiro Bacillus é cultivadoem uma primeira temperatura que conduz ao seu crescimento de maneira aconstruir uma grande quantidade de biomassa ativa para a síntese subseqüentede HA. Bacilos são capazes de crescer em uma ampla faixa de temperaturas,desde que não haja outros fatores limitantes. Por exemplo, em meio de culturarico, deve-se assegurar que há suficiente aeração a temperaturas maiores paraalcançar uma taxa de crescimento específica.
Conseqüentemente, uma modalidade preferida diz respeito aométodo do primeiro aspecto, em que a primeira temperatura está na faixa de10°C - 60°C, preferivelmente 20°C - 50°C, e mais preferivelmente na faixa de30°C - 45°C, acima de tudo preferivelmente na faixa de 34°C - 40°C.
Uma vez que a quantidade desejada de biomassa foiestabelecida, o hospedeiro Bacillus é cultivado a uma segunda temperaturaque é ajustada maior que a primeira temperatura durante a construção dabiomassa, e sob condições adequadas para a produção de ácido hialurônico.Precisamente até que ponto mais alto tem que ser ajustada a segundatemperatura depende do MW desejado do HA a ser produzido. Quanto menoro MW desejado, mais alta a temperatura deve ser ajustada.
Assim, uma modalidade preferida diz respeito ao método doprimeiro aspecto, em que a segunda temperatura está na faixa de 20°C - 70°C,preferivelmente 30°C - 60°C, e mais preferivelmente na faixa de 40°C - 55°C.Naturalmente, as faixas preferidas da primeira temperatura de cultivo devemser combinadas com as faixas preferidas adequadas da segunda temperaturade cultivo no método da invenção.Em uma modalidade preferida do método da invenção, asegunda temperatura é pelo menos 1°C maior que a primeira temperatura,preferivelmente a segunda temperatura é pelo menos 2°C, maispreferivelmente pelo menos 3°C, 4°C, 5°C, 6°C, TC, 8°C, 9°C, 10°C, 11°C,12°C, 13°C, 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C,24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, e acima de tudo preferivelmente pelomenos 3 O0C maior que a primeira temperatura.
A duração da etapa de cultivo na primeira temperatura nosmétodos da invenção, em que a biomassa é construída, depende de inúmerosfatores, incluindo as condições da cultura, o volume de fermentação, a cepaBacillus particular escolhida, etc., e, é claro, também da primeira temperatura.
A duração da etapa de cultivo na segunda temperatura, que é quando o HAcom baixo MW é produzido, também depende de diferentes fatores.
Conseqüentemente, o tempo total de cultivo, que é definido como a duraçãode ambas as etapas de cultivo, não é facilmente determinado. Entretanto, emuma modalidade preferida, a etapa de cultivo na segunda temperaturarepresenta pelo menos 20% do tempo total de cultivo, preferivelmente a etapade cultivo na segunda temperatura representa pelo menos 30%, 40%, 50%,60%, 70%, 80%, ou acima de tudo preferivelmente pelo menos 90% do tempototal de cultivo.
Uma modalidade preferida diz respeito ao método do primeiroaspecto, em que a segunda temperatura é suficientemente maior que aprimeira temperatura para permitir que a célula hospedeira de Bacillusproduza ácido hialurônico com um peso molecular médio desejado em umafaixa selecionada do grupo de faixas de peso molecular que consistem em 20 -50 kDa, 50 - 100 kDa, 100 - 150 kDa, 150 - 200 kDa, 200 - 250 kDa, 250 -300 kDa, 300 - 350 kDa, 350 - 400 kDa, 400 - 450 kDa, 450 - 500 kDa, 500 -550 kDa, 550 - 600 kDa, 600 - 650 kDa, 650 - 700 kDa, 700 - 750 kDa, e 750- 800 kDa.Uma outra modalidade preferida diz respeito ao método doprimeiro aspecto, em que a segunda temperatura é suficientemente maior quea primeira temperatura para permitir que a célula hospedeira de Bacillusproduza ácido hialurônico com um peso molecular médio desejado em umafaixa selecionada do grupo de faixas de peso molecular que consistem em 20 -100 kDa, 100 - 200 kDa, 200 - 300 kDa, 300 - 400 kDa, 400 - 500 kDa, 500 -600 kDa, 600 - 700 kDa, 700 - 800 kDa.
O nível de ácido hialurônico produzido por uma célulahospedeira de Bacillus da presente invenção pode ser determinado de acordocom o método carbazol modificado (Bitter e Muir, 1962, Anal Biochem. 4:330-334). Além disso, o peso molecular médio do ácido hialurônico pode serdeterminado usando métodos padrões na tecnologia, tais como aquelesdescritos por Ueno et al., 1988, Chem. Pharm. Buli. 36, 4971-4975; Wyatt91993, Anal. Chim. Acta 272: 1-40; e Wyatt Technologies, 1999, "LightScattering University DAWN Course Manual" e "DAWN EOS Manual"Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, Califórnia.
O ácido hialurônico obtido pelos métodos da presenteinvenção podem estar sujeitos a várias técnicas conhecidas na tecnologia paramodificar o ácido hialurônico, tal como ligação cruzada descrita, porexemplo, nas patentes U.S. 5.616.568, 5.652.347 e 5.874.417. Além disso, opeso molecular do ácido hialurônico pode ser alterado usando-se técnicasconhecida na tecnologia.
Células Hospedeiras
Nos métodos da presente invenção, a célula hospedeira deBacillus pode ser qualquer célula Bacillus adequada para a produçãorecombinante de ácido hialurônico. A célula hospedeira de Bacillus pode seruma célula Bacillus do tipo selvagem ou um mutante desta. Células Bacillusúteis na prática da presente invenção incluem, mas sem limitações, células deBacillus agaraderhens, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaeiens,Bacillus brevis, Bacillus cireulans, Bacillus elausii, Bacillus coagulans,Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus Iieheniformis,Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillussubtilis, e Bacillus thuringiensis. Células de Bacillus subtilis mutantesparticularmente adaptadas para a expressão recombinante estão descritas emWO 98/22598. Células Bacillus não-encapsuladas são particularmente úteisna presente invenção.
Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira de Bacillusé um Baeillus amyloliquefaeiens, Bacillus elausii, Bacillus lentus, Bacilluslieheniformis, Bacillus stearothermophilus ou uma célula Bacillus subtilis.Em uma modalidade mais preferida, a célula Bacillus é uma célula Bacillusamyloliquefaeiens. Em uma outra modalidade mais preferida, a célulaBacillus é uma célula Bacillus elausii. Em uma outra modalidade maispreferida, a célula Bacillus é uma célula Bacillus lentus. Em uma outramodalidade mais preferida, a célula Bacillus é uma célula Bacilluslieheniformis. Em uma outra modalidade mais preferida, a célula Bacillus éuma célula Bacillus subtilis. Em uma modalidade acima de tudo preferida, acélula hospedeira de Bacillus é um Bacillus subtilis A164A5 (veja PatenteU.S. 5.891.701) ou Bacillus subtilis 168A4.
A transformação da célula hospedeira de Bacillus com umaconstrução de ácido nucleico da presente invenção pode, por exemplo, serefetuada por uma transformação protoplasta (veja, por exemplo, Chang eCohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), por usar célulascompetentes (veja, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, Journal ofBacteriology 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, Journal ofMolecular Biology 56: 209-221), por eletroporação (veja, por exemplo,Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou por conjugação(veja, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169:5271-5278).Construções de Acido Nucleieo
"Construção de ácido nucleico" está definida nesta como umamolécula de ácido nucleico, tanto de fita simples quanto dupla, que é isoladade um gene que ocorre naturalmente, ou que foi modificada para contersegmentos de ácido nucleico que são combinados e justapostos de umamaneira que de outra forma não existiriam na natureza. O termo construçãode ácido nucleico pode ser sinônimo do termo expressão cassete quando aconstrução de ácido nucleico contém todas as seqüências controles requeridaspara a expressão de uma seqüência de codificação. O termo "seqüência decodificação" está definido nesta como uma seqüência que é transcrita emRNAm e traduzida em uma enzima de interesse quando colocada sob ocontrole das seqüências controle mencionadas anteriormente. Os limites daseqüência de codificação são geralmente determinados por um local deligação ribossômica localizado justamente acima do quadro aberto de leiturana extremidade 5' do RNAm e uma seqüência terminadora de transcriçãolocalizada à jusante do quadro aberto de leitura na extremidade 3' do RNAm.Uma seqüência de codificação pode incluir, mas sem limitações, seqüênciasde DNA, cDNA e ácido nucleico recombinantes.
As técnicas usadas para isolar ou clonar uma seqüência deácido nucleico que codifica um polipeptídeo são bem conhecidas natecnologia e incluem, por exemplo, isolamento de DNA genômico,preparação do cDNA, ou uma combinação destas. A clonagem das seqüênciasde ácido nucleico de tal DNA genômico pode ser efetuada, por exemplo,usando uma seleção de anticorpos de bibliotecas de expressão para detectarfragmentos de DNA clonado com características estruturais comuns, ou a bemconhecida reação da cadeia polimerase (PCR). Veja, por exemplo, Innis et al.,1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Application, Academic Press,Nova Iorque. Outros procedimentos de amplificação do ácido nucleico, taiscomo reação de cadeia ligase, transcrição ativa ligada, e amplificação baseadana seqüência de ácido nucleico podem ser usados. Os procedimentos declonagem podem envolver a retirada e isolamento de um fragmento de ácidonucleico desejado compreendendo a seqüência de ácido nucleico que codificao polipeptídeo, inserção do fragmento em uma molécula vetor, e incorporaçãodo vetor recombinante em uma célula Bacillus em que clones da seqüência deácido nucleico serão replicados. A seqüência de ácido nucleico pode ser deorigem genômica, cDNA, RNA, semi-sintética, sintética, ou quaisquercombinações destas.
Uma seqüência de ácido nucleico isolada codificando umaenzima pode ser manipulada em uma variedade de aspectos para fornecer aexpressão da enzima. A manipulação da seqüência de ácido nucleico antes desua inserção em uma construção ou vetor pode ser desejável ou necessáriadependendo do vetor expressão ou célula hospedeira de Bacillus. As técnicaspara modificar as seqüências de ácido nucleico utilizando os métodos declonagem são bem conhecidas na tecnologia. Entende-se que a seqüência deácido nucleico pode também ser manipulada in vivo na célula hospedeirausando métodos bem conhecidos na tecnologia.
Inúmeras enzimas estão envolvidas na biossíntese de ácidohialurônico. Estas enzimas incluem a hialuronan sintase, UDP-glicose 6-desidrogenase, UDP-glicose pirofosforilase, pirofosforilase UDP-N-acetilglicosamina, glicose-6-fosfato isomerase, hexoquinase,fosfoglicomutase, amidotransferase, mutase, e acetil transferase. A hialuronansintase é a enzima chave na produção de ácido hialurônico.
"Hialuronan sintase" é definida nesta como uma sintase quecatalisa o prolongamento de uma cadeia hialuronan pela adição de precursoresde açúcares GIcUA e GIcNAc. As seqüências de aminoácido das hialuronansintases estreptocócicas, hialuronan sintases de vertebrados, e a hialuronansintase viral são distintas da hialuronan sintase Pasteurella, e foram propostaspara classificação como hialuronan sintases de Grupo I e Grupo II, o Grupo Ide hialuronan sintases incluindo hialuronan sintases Streptococcal(DeAngelis, 1999). Para a produção de hialuronan em células hospedeira deBaeillus, as hialuronan sintases de uma origem eucariótica, tais como ashialuronan sintases de mamíferos, são menos preferidas.
A seqüência que codifica a hialuronan sintase pode serqualquer seqüência de ácido nucleico capaz de ser expressa em uma célulahospedeira de Baeillus. A seqüência de ácido nucleico pode ser de qualquerorigem. Os genes hialuronan sintase preferidos incluem qualquer de ou doGrupo I ou Grupo II, tais como os genes hialuronan sintase do Grupo I deStreptoeoceus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptoeoceus uberis, eStreptoeoeeus equi subsp. zooepidemieus, ou os genes hialuronan sintase doGrupo II de Pasturella multoeida.
Os métodos da presente invenção também incluem construçõespelas quais os açúcares precursores do hialuronan são fornecidos à célulahospedeira, tanto ao meio de cultura quanto sendo codificados por genesendógenos, por genes não-endógenos, ou por uma combinação de genesendógenos e não-endógenos na célula hospedeira de Baeillus. O açúcarprecursor pode ser o ácido D-glicurônico ou N-acetil-glicosamina.
Nos métodos da presente invenção, a construção de ácidonucleico pode compreender adicionalmente um ou mais genes que codificamenzimas na biossíntese de um açúcar precursor de um hialuronan.Alternativamente, a célula hospedeira de Baeillus pode compreenderadicionalmente uma ou mais construções de ácido nucleico secundáriascompreendendo um ou mais genes que codificam enzimas na biossíntese doaçúcar precursor. A produção hialuronan é melhorada pelo uso de construçõescom uma seqüência de ácido nucleico ou seqüências codificando um gene ougenes direcionados à etapa no percurso da síntese do açúcar precursor dóhialuronan. Entende-se por "direcionado à etapa no percurso da síntese doaçúcar precursor do hialuronan" que a proteína expressa do gene é ativa naformação do N-acetil-glicosamina ou ácido D-glicurônico, ou um açúcar queé um precursor de um dos dois N-acetil-glicosamina e ácido D-glicurônico.
Em um método preferido para fornecer açúcares precursores,são fornecidas construções para melhorar a produção de hialuronan em umacélula hospedeira tendo uma hialuronan sintase, cultivando uma célulahospedeira tendo uma construção recombinante com uma região promotoraheteróloga operacionalmente ligada a uma seqüência de ácido nucleico quecodifica um gene direcionado a uma etapa no percurso da síntese do açúcarprecursor do hialuronan. Em um método preferido, a célula hospedeiratambém compreende uma construção recombinante tendo uma regiãopromotora operacionalmente ligada a uma hialuronan sintase, que pode usar amesma ou diferente região promotora da seqüência de ácido nucleico parauma sintase envolvida na biossíntese de N-acetil-glicosamina. Em umamodalidade preferida adicional, a célula hospedeira pode ter uma construçãorecombinante com uma região promotora operacionalmente ligada adiferentes seqüências de ácido nucleico que codifica um segundo geneenvolvido na síntese de um açúcar precursor do hialuronan.
Dessa forma, a presente invenção também diz respeito aconstruções para melhorar a produção de hialuronan pelo uso de construçõescom uma seqüência de ácido nucleico que codifica um gene direcionado paraa etapa no percurso da síntese do açúcar precursor do hialuronan. A seqüênciade ácido nucleico para o açúcar precursor pode ser expressa por promotorigual ou diferente como a seqüência de ácido nucleico que codifica ahialuronan sintase.
Os genes envolvidos na biossíntese dos açúcares precursorespara a produção de ácido hialurônico incluem um gene UDP-glicose 6-desidrogenase, gene UDP-glicose pirofosforilase, gene UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase, gene glicose-6-fosfato isomerase, genehexoquinase, gene fosfoglicomutase, gene amidotransferase, gene mutase, egene acetil transferase.
Em uma célula contendo uma hialuronan sintase, qualquer umou combinação de dois ou mais de hasB, hasC e hasD, ou os homólogosdestes, tais como os Bacillus subtilis tuaD, gtaB, e gcaD, respectivamente, tãobem quanto hasE, podem ser expressos para aumentar as poças de açúcaresprecursores disponíveis para a hialuronan sintase. O genoma Bacillus estádescrito em Kunst, et al., Nature 390. 249-256, "The complete genomasequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis" (novembro 1997).Em algumas ocorrências, tais como onde a célula hospedeira não tem umaatividade de hialuronan sintase nativa, a construção pode incluir o gene hasA.
A seqüência de ácido nucleico que codifica as enzimasbiossintéticas podem ser nativas para a célula hospedeira, ao passo que, emoutros casos, a seqüência heteróloga pode ser utilizada. Se dois ou mais genessão expressos, eles podem ser genes que estão associados com um outro emum operon nativo, tais como os genes do operon HAS do Streptococcusequisimilis, que compreende hasA, hasB, hasC e hasD. Em outrasocorrências, o uso de alguma combinação das seqüências de gene precursorpode ser desejado, sem que cada elemento do operon seja incluído. O uso dealguns genes nativos na célula hospedeira, e outros que são exógenos podemtambém ser preferidos em outros casos. A escolha dependerá das poçasdisponíveis de açúcares em uma dada célula hospedeira, da capacidade de acélula acomodar uma produção exagerada sem interferir em outras funções dacélula hospedeira, e se a célula regula a expressão de seus genes nativosdiferentemente dos genes exógenos.
Como um exemplo, dependendo das exigências metabólicas econdições de crescimento da célula, e das poças disponíveis de açúcarprecursor, pode ser desejável aumentar a produção de N-acetil-glicosaminapela expressão de uma seqüência de ácido nucleico que codifica UDPN-acetilglicosamina pirofosforilase, tais como o gene hasD, o gene gcaDBacillus e homólogos destes. Alternativamente, o açúcar precursor pode ser oácido D-glicurônico. Em uma tal modalidade, a seqüência de ácido nucleicocodifica a UDP-glicose 6-desidrogenase. Tais seqüências de ácido nucleicoincluem o gene tuaD Bacillus, o gene hasB de Streptococcus, e homólogosdestes. A seqüência de ácido nucleico pode também codificar a UDP-glicosepirofosforilase, tal como no gene gtaB Bacillus, o gene hasC de Streptoeoeeuse homólogos destes.
Nos métodos da presente invenção, o gene UDP-glicose 6-desidrogenase pode ser um gene hasB ou um gene tuaD, ou homólogosdestes.
Nos métodos da presente invenção, o gene UDP-glicosepirofosforilase pode ser um gene hasC ou um gene gtaB, ou homólogosdestes.
Nos métodos da presente invenção, o gene UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase pode ser um gene hasD ou geaD, ouhomólogos destes.
Nos métodos da presente invenção, o gene glicose-6-fosfatoisomerase pode ser um hasE ou homólogo deste.
Nos métodos da presente invenção, o gene hialuronan sintase eum ou mais genes que codificam um açúcar precursor estão sob o controle domesmo promotor. Alternativamente, um ou mais genes que codificam umaçúcar precursor estão sob o controle do mesmo promotor, mas um promotordiferente conduzindo o gene hialuronan sintase. Uma alternativa adicional éque o gene hialuronan sintase e cada um dos genes que codificam um açúcarprecursor estão sob o controle de promotores diferentes. Em uma modalidadepreferida, o gene hialuronan sintase e um ou mais genes que codificam umaçúcar precursor estão sob o controle do mesmo promotor.
Em alguns casos, a célula hospedeira terá uma construçãorecombinante com uma região promotora heteróloga que estáoperacionalmente ligada a uma seqüência de ácido nucleico que codifica umgene direcionado a uma etapa no percurso da síntese de um açúcar precursorde hialuronan, que pode ser de acordo com a expressão da hialuronan sintasede uma construção recombinante. A hialuronan sintase pode ser expressa damesma região ou de uma região promotora diferente da seqüência de ácidonucleico que codifica uma enzima envolvida na biossíntese do precursor. Emuma outra modalidade preferida, a célula hospedeira pode ter uma construçãorecombinante com uma região promotora operacionalmente ligada a umaseqüência diferente de ácido nucleico que codifica um segundo geneenvolvido na síntese de um açúcar precursor de hialuronan.
A seqüência de ácido nucleico que codifica as enzimasenvolvidas na biossíntese do(s) açúcar(s) precursores pode ser expressa domesmo promotor ou de um promotor diferente da seqüência de ácido nucleicoque codifica a hialuronan sintase. Em um bom senso prévio, "operonsartificiais" são construídos, que podem imitar o operon do Streptococcusequisimilis em tendo cada hasA, hasB, hasC e hasD, ou homólogos destes, ou,alternativamente, podem utilizar menos que o complemento completopresente no operon do Streptococcus equisimilis. Os "operons artificiais"podem também compreender um gene glicose-6-fosfato isomerase (hasE) tãobem quanto um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em umgene hexoquinase, gene fosfoglicomutase, gene amidotransferase, genemutase, e gene acetil transferase. No operon artificial, pelo menos um doselementos é heterólogo a um outro dos elementos, tal como a regiãopromotora sendo heteróloga às seqüências de codificação.
Em uma modalidade preferida, a construção de ácido nucleicocompreende hasA, tuaD, e gtaB. Em uma outra modalidade preferida, aconstrução de ácido nucleico compreende hasA, tuaD, gtaB, e geaD. Em umaoutra modalidade preferida, a construção de ácido nucleico compreende hasAe tuaD. Em uma outra modalidade preferida, a construção de ácido nucleicocompreende hasA. Em uma outra modalidade preferida, a construção de ácidonucleico compreende hasA, tuaD, gtaB, gcaD, e hasE. Em uma modalidadepreferida, a construção de ácido nucleico compreende hasA, hasB, hasC, ehasD. Em uma modalidade preferida, a construção de ácido nucleicocompreende hasA, hasB, hasC, hasD e hasE. Baseado nas modalidadespreferidas anteriormente mencionadas, os genes notados podem sersubstituídos pelos seus homólogos.
Nos métodos da presente invenção, as construções de ácidonucleico compreendem uma hialuronan sintase que codifica uma seqüênciaoperacionalmente ligada a uma seqüência promotora estranha à seqüência quecodifica a hialuronan sintase. A seqüência promotora pode ser, por exemplo,um único promotor ou um promotor em tandem.
"Promotor" está definido nesta como uma seqüência de ácidonucleico envolvida na ligação da RNA polimerase para iniciar a transcriçãode um gene. "Promotor em tandem" está definido nesta como duas ou maisseqüências promotoras, cada uma das quais é operacionalmente ligada a umaseqüência de codificação e media a transcrição da seqüência de codificaçãoem RNAm. "Operacionalmente ligado" está definido nesta como umconfiguração em que uma seqüência de controle, por exemplo, uma seqüênciapromotora, é devidamente colocada em uma posição relativa a uma seqüênciade codificação tal que a seqüência de controle direcione a produção de umpolipeptídeo codificado pela seqüência codificadora. Como notadoanteriormente, uma "seqüência codificadora" está definida nesta como umaseqüência de ácido nucleico que é transcrita em RNAm e traduzida em umpolipeptídeo quando colocada sob o controle das seqüências de controleapropriadas. Os limites da seqüência codificador são geralmente determinadospor um local de ligação ribossômica justamente acima do quadro aberto deleitura na extremidade 5' do RNAm e uma seqüência terminadora detranscrição localizada à jusante do quadro aberto de leitura na extremidade 3'do RNAm. Uma seqüência codificadora pode incluir, mas sem limitações,seqüências de ácido nucleico de DNA genômico, cDNA, semi-sintético,sintético, e recombinante.
Em uma modalidade preferida, as seqüências promotoraspodem ser obtidas de uma fonte bacteriana. Em uma modalidade maispreferida, as seqüências promotoras podem ser obtidas de uma bactéria Gram-positiva, tais como uma cepa Bacillus, por exemplo, Bacillus agaradherens,Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacilluscirculans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacilluslautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacilluspumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillusthuringiensis·, ou uma cepa Streptomyces, por exemplo, Streptomyces lividansou Streptomyces murinus; ou de uma bactéria Gram-negativa, por exemplo, E.coli ou Pseudomonas sp.
Exemplos de promotores adequados para conduzir atranscrição de uma seqüência de ácido nucleico nos métodos da presenteinvenção são os promotores obtidos do operon E. coli lac, gene Streptomycescoelicolor agarase (dagA), Bacillus lentus ou gene protease alcalina Bacillusclausii (aprH), gene protease alcalina Bacillus licheniformis (gene Carlsbergsubtilisina), gene levansucrase Bacillus subtilis (,sacB), gene alfa-amilaseBacillus subtilis {amyE), gene alfa-amilase Bacillus licheniformis (,amyL),gene amilase maltogênico Bacillus stearothermophilus (amyM), gene alfa-amilase Bacillus amyloliquefaciens {amyQ), gene penicilinase Bacilluslicheniformis (penP), genes xylA e xylB Bacillus subtilis, gene Bacillusthuringiensis subsp. tenebrionis CrylilA (crylllA) ou porções destes, genebeta-lactamase procariótico (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75:3727-3731). Outros exemplos são ospromotores do promotor bacteriófago spol e o fragmento de DNA (DeBoer etal., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25).Promotores adicionais estão descritos em " Useful proteins from recombinantbactéria" no Scientific American, 1980. 242:74-94; e em Sambrook, Fritsch,e Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, ColdSpring Harbor, New York.
O promotor pode também ser um promotor "consenso" tendo aseqüência TTGACA para a região "-35" e TATAAT para a região "-10". Opromotor consenso pode ser obtido de qualquer promotor que pode agir emuma célula hospedeira de Bacillus. A construção de um promotor "consenso"pode ser realizada por mutagênese direcionada ao local para criar umpromotor que se adeque mais perfeitamente às seqüências consensoestabelecidas para as regiões "-10" e "-35" de promotores" tipo sigma A"vegetais para Bacillus subtilis (Voskuil et al., 1995, Molecular Microbiology17: 271-279).
Em uma modalidade preferida, o promotor "consenso" éobtido de uma promotor obtido do operon E. coil Iac, gene agaraseStreptomyces coelicolor (dagA), gene protease alcalina Bacillus clausii ouBacillus lentus (,aprH), gene protease alcalina Bacillus licheniformis (geneCarlsberg subtilisina), gene levansucrase Bacillus subtilis (,sacB), gene alfa-amilase Bacillus subtilis (amyE), gene alfa-amilase Bacillus licheniformis(amyL), gene amilase maltogênico Bacillus stearothermophilus («amyM), genealfa-amilase Bacillus amyloliquefaciens (,amyQ), gene penicilinase Bacilluslicheniformis (penP), genes xylA e xylB Bacillus subtilis, gene Bacillusthuringiensis subsp. tenebrionis CryllIA (crylllA) ou porções destes, oupromotor bacteriófago spol gene beta-lactamase procariótico. Em umamodalidade mais preferida, o promotor "consenso" é obtido do gene alfa-amilase Bacillus amyloliquefaciens {amyQ).
Widner, et al., patentes Estados Unidos 6.255.076 e 5.955.310,descrevem promotores e construções em tandem e métodos para uso naexpressão em células Bacillus, incluindo o promotor consenso amyQ curto(também chamado scBAN). O uso da seqüência estabilizadora crylllA, econstruções usando a seqüência, para melhor produção em Bacillus sãotambém descritos nesta.
Cada seqüência promotora do promotor em tandem pode serqualquer seqüência de ácido nucleico que mostre atividade de transcrição nacélula Bacillus de escolha incluindo um promotor mutante, truncado ehíbrido, e pode ser obtida de genes que codificam polipeptídeos extracelularou intracelular, tanto homólogo quanto heterólogo à célula Bacillus. Cadaseqüência promotora pode ser nativa ou estranha à seqüência de ácidonucleico que codifica o polipeptídeo e nativa ou estranha à célula Bacillus. Asseqüências promotoras podem ser a mesma seqüência promotora ouseqüências promotoras diferentes.
As duas ou mais seqüências promotoras do promotor emtandem podem simultaneamente promover a transcrição da seqüência deácido nucleico. Alternativamente, uma ou mais das seqüências promotoras dopromotor em tandem podem promover a transcrição da seqüência de ácidonucleico em diferentes estágios de crescimento da célula Bacillus.
Em uma modalidade preferida, o promotor em tandem contémpelo menos o promotor amyQ do gene alfa-amilase Baeillusamyloliquefaeiens. Em uma outra modalidade preferida, o promotor emtandem contém pelo menos um promotor "consenso" tendo uma seqüênciaTTGACA para a região "-35" e TATAAT para a região "-10". Em uma outramodalidade preferida, o promotor em tandem contém pelo menos o promotoramyL do gene alfa-amilase Bacillus lieheniformis. Em uma outra modalidadepreferida, o promotor em tandem contém pelo menos o promotor crylllA ouporções destes (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107).
Em uma modalidade mais preferida, o promotor em tandemcontém pelo menos o promotor amyL e o promotor crylllA. Em uma outramodalidade mais preferida, o promotor em tandem contém pelo menos opromotor amyQ e o promotor crylllA. Em uma outra modalidade maispreferida, o promotor em tandem contém pelo menos um promotor"consenso" tendo a seqüência TTGACA para a região "-35" e TATAAT paraa região "-10" e o promotor cry///A. Em uma outra modalidade maispreferida, o promotor em tandem contém pelo menos duas cópias do promotoramyL. Em uma outra modalidade mais preferida, o promotor em tandemcontém pelo menos duas cópias do promotor amyQ. Em uma outramodalidade mais preferida, o promotor em tandem contém pelo menos duascópias de um promotor "consenso" tendo a seqüência TTGACA para a região"-35" e TATAAT para a região "-10". Em uma outra modalidade maispreferida, o promotor em tandem contém pelo menos duas cópias do promotorcrylllA.
"Uma seqüência de processamento/estabilização de RNAm"está definida nesta como uma seqüência localizada à jusante de uma ou maisseqüências promotoras e à montante de uma seqüência codificadora nas quaiscada uma de uma ou mais seqüências promotoras são ligadasoperacionalmente, de maneira tal que todos RNAms sintetizados de cadaseqüência promotora possam ser processados para gerar transcrições deRNAm com uma seqüência estabilizadora na extremidade 5' das transcrições.A presença de uma seqüência estabilizadora na extremidade 5' dastranscrições do RNAm aumenta sua meia-vida (Agaisse e Lereclus, 1994,supra, Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471). A seqüênciade processamento/estabilização de RNAm é complementar à extremidade 3'de um RNA ribossômico 16S bacteriano. Em uma modalidade preferida, aseqüência de processamento/estabilização de RNAm gera essencialmentetranscrições de tamanho único com uma seqüência estabilizadora naextremidade 5' das transcrições. A seqüência de processamento/estabilizaçãode RNAm é preferivelmente uma, que é complementar à extremidade 3' deum RNA ribossômico 16S bacteriano. Veja patente U.S. 6.255.076 e5.955.310.
Em uma modalidade mais preferida, a seqüência deprocessamento/estabilização de RNAm é a seqüência deprocessamento/estabilização de RNAm Bacillus thuringiensis crylllA descritaem WO 94/25612 e Agaisse e Lereclus, 1994, além, ou porções deste queretenham a função de processamento/estabilização do mRNA. Em uma outramodalidade mais preferida, a seqüência de processamento/estabilização deRNAm é a seqüência de processamento/estabilização de RNAm Bacillussubtilis SP82 descrita em Hue et al., 1995, além, ou porções deste queretenham a função de processamento/estabilização do RNAm.
Quando o promotor crylllA e sua seqüência deprocessamento/estabilização de RNAm são empregados nos métodos dapresente invenção, um fragmento de DNA contendo a seqüência descrita emWO 94/25612 e Agaisse e Lereclus, 1994, supra, ou porções desta que retêmo promotor e as funções da seqüência de processamento/estabilização deRNAm pode ser usado. Além disso, os fragmentos de DNA contendo somenteo promotor crylllA ou somente a seqüência de processamento/estabilização deRNAm crylllA podem ser preparados usando-se métodos bem conhecidos natecnologia para construir vários promotores em tandem e combinações deseqüência de processamento/estabilização de RNAm. Nesta modalidade, opromotor crylllA e sua seqüência de processamento/estabilização de RNAmsão preferivelmente colocados abaixo de outra(s) seqüência(s) promotora(s)constituindo o promotor em tandem e à montante da seqüência codificadorado gene de interesse.
A seqüência de ácido nucleico isolada que codifica a(s)enzima(s) desejada(s) envolvida(s) na produção de ácido hialurônico podeentão ser adicionalmente manipulada para melhorar a expressão da seqüênciade ácido nucleico. Entende-se que expressão inclui qualquer etapa envolvidana produção do polipeptídeo, incluindo, mas sem limitações, transcrição,modificação pós-transcrição, tradução, modificação pós-tradução e secreção.As técnicas para modificar as seqüências de ácido nucleico utilizando osmétodos de clonagem são bem conhecidas.
Uma construção de ácido nucleico compreendendo um aseqüência de ácido nucleico que codifica uma enzima pode seroperacionalmente ligada a uma ou mais seqüências controles capazes dedirecionar a expressão da seqüência codificadora em uma célula Bacillus sobcondições compatíveis com as seqüências controles.
O termo "seqüências de controle" está definido nesta incluindotodos os componentes que são necessários ou vantajosos para a expressão daseqüência codificadora de uma seqüência de ácido nucleico. Cada seqüênciade controle pode ser nativa ou estranha à seqüência de ácido nucleico quecodifica a enzima. Além de produzir as seqüências descritas anteriormente,tais seqüências controles incluem, mais sem limitações, um líder, umaseqüência indicadora e um terminador de transcrição. No mínimo, asseqüências controles incluem um promotor, e indicações de parada datranscrição e tradução. As seqüências controles podem ser fornecidas comligantes com o propósito de introduzir locais de restrição específicos,facilitando a ligação das seqüências controles com a região codificadora daseqüência de ácido nucleico que codifica uma enzima.
A seqüência de controle pode também ser uma seqüênciaterminadora da transcrição adequada, uma seqüência reconhecida por umacélula Bacillus para terminar a transcrição. A seqüência terminadora estáoperacionalmente ligada à extremidade 3' da seqüência de ácido nucleico quecodifica a enzima ou a última enzima de um operon. Qualquer terminador queseja funcional na célula Bacillus de escolha pode ser usado na presenteinvenção.
A seqüência de controle pode também ser uma seqüência líderadequada, uma região não traduzida de um RNAm que é importante para atradução pela célula Bacillus. A seqüência líder está operacionalmente ligadaà extremidade 5' da seqüência de ácido nucleico que codifica a enzima.Qualquer seqüência líder que seja funcional na célula Bacillus de escolhapode ser usada na presente invenção.
A seqüência de controle pode também ser uma regiãocodificadora de peptídeo sinal, que codifica para uma seqüência deaminoácidos ligada à extremidade amino de um polipeptídeo que podedirecionar o polipeptídeo expresso no percurso secretório da célula. A regiãocodificadora de peptídeo sinal pode ser nativa para o polipeptídeo ou pode serobtida de fontes externas. A extremidade 5' da seqüência que codifica aseqüência de ácido nucleico pode basicamente conter uma região codificadorade peptídeo sinal naturalmente ligada na quadro de leitura da tradução com osegmento da região codificadora que codifica o polipeptídeo secretado.
Alternativamente, a extremidade 5' da seqüência codificadora pode conteruma região codificadora de peptídeo sinal que é estranha àquela porção daseqüência codificadora que codifica o polipeptídeo secretado. A regiãocodificadora de peptídeo sinal estranha pode ser requerida onde a seqüênciacodificadora não contenha normalmente uma região codificadora de peptídeosinal. Alternativamente, a região codificadora de peptídeo sinal estranha podesimplesmente substituir a região codificadora de peptídeo sinal natural demaneira a obter uma secreção elevada do polipeptídeo relativa à regiãocodificadora de peptídeo sinal natural normalmente associada com aseqüência codificadora. A região codificadora de peptídeo sinal pode serobtida de um gene amilase ou uma protease de uma espécie Bacillus.
Entretanto, qualquer região codificadora de peptídeo sinal capaz de direcionaro polipeptídeo expresso no percurso secretório de uma célula Bacillus deescolha, pode ser usada na presente invenção.
Uma região codificadora de peptídeo sinal efetiva para célulasBacillus é a região codificadora de peptídeo sinal obtida do gene amilasemaltogênico de Bacillus NCIB 11837, o gene alfa-amilase Bacillusstearothermophilus, o gene subtilisina Bacillus lieheniformis, o gene beta-lactamase Bacillus lieheniformis, os genes proteases neutros Bacillusstearothermophilus (nprT, nprS, nprM), e o gene prsA Bacillus subtilis.Peptídeos indicadores adicionais são descritos por Simonen e Paiva, 1993,Microbiological Reviews 57:109-137.
A seqüência de controle pode também ser uma regiãocodificadora pró-peptídeo que codifica para uma seqüência aminoácidoposicionada na extremidade amino de um polipeptídeo. O polipeptídeoresultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou umzimogênio em alguns casos). Um pró-polipeptídeo é geralmente inativo epode ser convertido a um polipeptídeo ativo maduro por uma clivagemcatalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo do pró-polipeptídeo. A regiãocodificadora do pró-peptídeo pode ser obtida dos genes para protease alcalinaBacillus subtilis (aprE) e protease neutra Bacillus subtilis {nprT).
Onde tanto regiões de peptídeo sinal quanto de pró-peptídeoestão presentes na extremidade amino de um polipeptídeo, a região pró-peptídeo está posicionada próxima à extremidade amino de um polipeptídeo ea região codificadora do peptídeo sinal está posicionada próxima àextremidade amino da região pró-peptídeo.
Pode-se também ser desejável adicionar seqüênciasreguladoras que permitem a regulação da expressão do polipeptídeo relativaao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas regulatórios sãoaqueles que fazem com que a expressão do gene seja ativada ou inativada emresposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de umcomposto regulador. Sistemas reguladores nos sistemas procarióticos incluemos sistemas operadores lac, tac, e trp.
Vetores de expressãoNos métodos da presente invenção, um vetor de expressãorecombinante compreendendo uma seqüência de ácido nucleico, um promotore indicadores de parada da tradução e transcrição podem ser usados para aprodução recombinante de um enzima envolvida na produção de ácidohialurônico. Os vários ácidos nucleicos e seqüências controles descritosanteriormente podem ser unidos entre si para produzir um vetor de expressãorecombinante que pode incluir um ou mais locais de restrição convenientesque permitem a inserção ou substituição da seqüência de ácido nucleico quecodifica o polipeptídeo ou enzima em tais locais. Alternativamente, aseqüência de ácido nucleico pode ser expressa inserindo-se a seqüência deácido nucleico ou uma construção de ácido nucleico compreendendo aseqüência em um vetor apropriado para expressão. Criando-se o vetor deexpressão, a seqüência codificadora fica localizada no vetor até que aseqüência codificadora seja operacionalmente ligada com as seqüênciascontroles apropriadas para expressão, e possivelmente secreção.
O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetorque pode estar convenientemente sujeito aos procedimentos do DNArecombinante e pode ocasionar a expressão da seqüência de ácido nucleico. Aescolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com acélula Bacillus na qual o vetor é introduzido. Os vetores podem serplasmídeos lineares ou circulares fechados. O vetor pode ser um vetorreplicante livremente, por exemplo, um vetor que existe como uma entidadeextracromossômica, a replicação deste é independente da replicaçãocromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elementoextracromossômico, um mini-cromossomo, ou um cromossomo artificial. Ovetor pode conter quaisquer meios para assegurar sua própria replicação.Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célulaBacillusi fique integrado no genoma e replicado entre si com o(s)cromossomo(s) em que este foi integrado. O sistema vetor pode ser um vetorúnico ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que entre sicontenham o DNA total a ser introduzido no genoma da célula Bacillus, ouum transposon pode ser usado.
Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm umelemento(s) que permite a integração do vetor no genoma da célulahospedeira de Bacillus ou replicação autônoma do vetor na célulaindependente do genoma.
Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vetorpode contar com a seqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo ouqualquer outro elemento do vetor para integração do vetor no genoma porrecombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor podeconter seqüências de ácido nucleico adicionais para direcionar a integraçãopor recombinação homóloga no genoma da célula Bacillus. As seqüências deácido nucleico adicionais capacitam o vetor ser integrado no genoma dacélula Bacillus em uma localização precisa no cromossomo. Para aumentar aprobabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos deintegração deveriam preferivelmente conter um número suficiente de ácidosnucleicos, tais como de 100 a 1.500 pares de base, preferivelmente de 400 a1.500 pares de base, e acima de tudo preferivelmente de 800 a 1.500 pares debase, que são altamente homólogos com a seqüência alvo correspondente paraaumentar a probabilidade da recombinação homóloga. Os elementos deintegração podem ser qualquer seqüência que é homóloga com a seqüênciaalvo no genoma da célula Bacillus. Além disso, os elementos de integraçãopodem ser seqüências de ácido nucleico não codificadora ou codificadora. Poroutro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira porrecombinação não homóloga.
Para replicação autônoma, o vetor pôde compreenderadicionalmente uma fonte de replicação capacitando o vetor a replicarlivremente na célula Bacillus em questão. Exemplos de fontes bacterianas dereplicação são as fontes de replicação dos plasmídeos pUBllO, pE194,pTA1060, e ρΑΜβΙ permitindo a replicação no Bacillus. A fonte de replicaçãopode ser uma tendo uma mutação para tornar sua função sensível àtemperatura na célula Bacillus (veja, por exemplo, Ehrlich, 1978, Proeeedingsof the National Aeademy of Sciences USA 75:1433).
Os vetores preferivelmente contêm um ou mais marcadoresseletivos que permitem a fácil seleção de células transformadas. Um marcadorseletivo é um gene, o produto do qual fornece resistência para biocida,resistência a metais pesados, prototrofia à auxotrofia, e similares. Exemplosde marcadores seletivos bacterianos são os genes dal de Bacillus subtilis ouBacillus licheniformis, ou marcadores que conferem resistência antibiótica, talcomo resistência à ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Alémdisso, a seleção pode ser efetuada por co-transformação, por exemplo, comodescrito em WO 91/09129, em que o marcador seletivo está em um vetorseparado.
Mais que uma cópia de uma seqüência de ácido nucleico podeser inserida na célula hospedeira para aumentar a produção do produto gene.Um aumento no número de cópias da seqüência de ácido nucleico pode serobtido integrando pelo menos uma cópia adicional da seqüência no genomada célula hospedeira ou incluindo um gene marcador selecionável que podeser ampliado com seqüência de ácido nucleico em que células contendocópias ampliadas do gene marcador selecionável, e, dessa forma, cópiasadicionais da seqüência de ácido nucleico, podem ser selecionadas cultivandoas células na presença do agente selecionável apropriado. Um métodoconveniente para atingir a amplificação das seqüências de DNA genômicoestá descrito em WO 94/14968.
Os procedimentos usados para ligar os elementos descritosanteriormente para construir os vetores de expressão recombinante são bemconhecidos pelos versados na tecnologia (veja, por exemplo, Sambrook et al.,1989, supra).Produção
Nos métodos da presente invenção, as células hospedeirasBacillus são cultivadas em um meio nutriente adequado para a produção deácido hialurônico usando os métodos conhecidos na tecnologia. Por exemplo,a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco com agitação, fermentaçãoem pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínua, emlotes, lote-alimentado, ou em estado sólido) em fermentadores laboratoriaisou industriais executadas em um meio adequado e sob condições quepermitem que as enzimas envolvidas na síntese do ácido hialurônico sejamexpressas e o ácido hialurônico seja isolado. O cultivo ocorre em um meionutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e saisinorgânicos, usando procedimentos conhecidos na tecnologia. Meiosadequados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou podem serpreparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, emcatálogos da American Type Culture Collection). O ácido hialurônicosecretado pode ser recuperado diretamente do meio.
O ácido hialurônico resultante pode ser isolado por métodosconhecidos na tecnologia. Por exemplo, o ácido hialurônico pode ser isoladodo meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas semlimitações, centrifugação, filtração, extração, secagem por aspersão,evaporação, ou precipitação. O ácido hialurônico isolado pode então seradicionalmente purificado por uma variedade de procedimentos conhecidosna tecnologia incluindo, mas sem limitações, cromatografia (por exemplo,troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem, e exclusão detamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétricapreparatória), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfatode amônia), ou extração (veja, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Jansone Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).Nos métodos da presente invenção, as células hospedeirasBacillus produzem uma quantidade de ácido hialurônico por litro maior quecerca de 4 g, preferivelmente maior que cerca de 6 g, mais preferivelmentemaior que cerca de 8 g, ainda mais preferivelmente maior que cerca de 10 g, eacima de tudo preferivelmente maior que cerca de 12 g.
Deleções/Interrupções
Técnicas de deleção ou substituição de gene podem ser usadaspara a remoção completa de um gene marcador selecionável ou de outro geneindesejável. Em tais métodos, a deleção do gene marcador selecionável podeser feita por recombinação homóloga usando um plasmídeo que foi construídopara conter contiguamente as regiões 5' e 3' que flanqueiam o gene marcadorselecionável. As regiões contíguas 5' e 3' podem ser introduzidas em umacélula Bacillus em um plasmídeo sensível à temperatura, por exemplo, pE194,em associação com um segundo marcador selecionável a uma temperaturapermissível para permitir o plasmídeo tornar-se estabelecido na célula. Acélula é então mudada para uma temperatura não-permissível para seleção porcélulas que tenham o plasmídeo integrado no cromossomo em uma dasregiões de flanco homólogas. A seleção para integração do plasmídeo é feitapela seleção do segundo marcador selecionável. Após a integração, um eventode recombinação na segunda região de flanco homóloga é estimulada,deslocando as células para a temperatura permissível para muitas geraçõessem seleção. As células são plaqueadas para obter colônias únicas e ascolônias são examinadas pela perda de ambos marcadores selecionáveis (veja,por exemplo, Perego, 1993, In A.L. Sonneshein, J.A. Hoch, e R. Losick,editors, Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bactéria, Chapter 42,American Society of Microbiology, Washington, D.C., 1993).
Um gene marcador selecionável pode também ser removidopor recombinação homóloga introduzindo na célula mutante um fragmento deácido nucleico compreendendo as regiões 5' e 3' do gene defeituoso, masfaltando o gene marcador selecionável, seguido pela seleção no meio deseleção por contagem. Por recombinação homóloga, o gene defeituosocontendo o gene marcador selecionável é substituído com o fragmento deácido nucleico faltando o gene marcador selecionável. Outros métodosconhecidos na tecnologia podem também ser usados.
Patente U.S. 5.891.701 descreve técnicas para deletar muitosgenes incluindo spollAC, aprE, nprE, e amyE.
Outros compostos biológicos indesejáveis podem também serremovidos pelos métodos descritos anteriormente, tal como o pigmentovermelho sintetizado por cypX (acessão no. BGl2580) e/ou yvmC (acessãono. BG14121).
Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira de Bacillusé desmarcada com quaisquer marcadores selecionáveis heterólogos ouexógenos. Em uma outra modalidade preferida, a célula hospedeira deBacillus não produz nenhum pigmento vermelho sintetizado por cypX eyvmC.
EXEMPLOS
Exemplo 1
Uma cepa Bacillus recombinante foi construída como descritoem detalhe em WO 2003054163, cujos conteúdos relacionados à construçãoda cepa estão incorporados nesta pela referência. Esta cepa foi então cultivadacomo se segue: primeiramente, um estágio de disseminação em ágar a umatemperatura constante, em seguida um estágio de disseminação em um tanquede agitação a uma temperatura constante, e finalmente uma fermentaçãoprincipal em lote alimentado em um tanque de agitação a uma temperaturainicial favorável ao crescimento da cepa Bacillus, por exemplo, 37°C. Maistarde, após o início, a temperatura de fermentação foi mudada para cima oupara baixo em experimentos separados para vários outros valores detemperaturas na faixa de 17 - 52°C. A temperatura foi então mantidaconstante por um período de 7 h, após o início da fase de lote alimentação.
A cepa Bacillus foi fermentada em fermentadores pequenospadrões em um meio composto por litro de 6,5 g de KH2PO4, 4,5 g deNa2HPO4, 3,0 g de (NH4)2SO4, 2,0 g de Na3-citrato-2H20, 3,0 g deMgS04.7H20, 6,0 ml gt Mikrosoy-2, 0,15 mg de biotina (1 ml de etanol 0,15mg/ml), 15,0 g de sacarose, 1,0 ml de SB 2066, 2,0 ml de P2000, 0,5 g deCaCl2.2H20. O meio tinha pH 6,3 a 6,4 (desajustado) antes da autoclave. OCaCl2.2H20 foi adicionado após a autoclave.
O meio de disseminação usado foi o B-3, por exemplo, Agar-3sem ágar, ou meio "S/S-I". O meio Agar-3 era composto por litro de 4,0 g decaldo nutriente, 7,5 g de proteína hidrolisada, 3,0 g de extrato de levedura, 1,0g de glicose, e 2% de ágar. O pH não foi ajustado; pH antes da autoclave foide aproximadamente 6,8; após a autoclave aproximadamente o pH era 7,7.
O meio frasco de disseminação de sacarose/soja (S/S-l) eracomposto por litro de 65 g de sacarose, 35 g de farinha de soja, 2 g de Na3-citrato-2H20, 4 g de KH2PO4, 5 g de Na2HPO4, e 6 ml de microelementos. OpH do meio foi ajustado para cerca de 7 com NaOH; após dispensar o meioaos frascos, 0,2% de óleo vegetal foi adicionado para suprimir a formação deespuma. Microelementos eram compostos por litro de 100 g de ácido cítrico-H20, 20 g de FeSO4JH2O, 5 g de MnS04.H20, 2 g deCuS04.5H20, e 2 g deZnCl2.
O pH foi ajustado para 6,8 - 7,0 com amônia antes dainoculação, e controlado desde então em pH 7,0 + 0,2 com amônia e H3PO4.A temperatura foi mantida à 37°C. A agitação foi de um máximo de 1300RPM usando dois propulsores rushton de seis pás de 6 cm de diâmetro em umtanque de 3 litros com volume inicial de 1,5 litro. A aeração teve um máximode 1,5 WM.
Para alimentação, foi usada uma simples solução de sacarose.A alimentação começou por cerca de 4 horas após a inoculação, quando ooxigênio dissolvido (D.O.) estava ainda sendo diminuído (por exemplo, antesda depleção da sacarose). A temperatura foi mudada para uma temperaturamais elevada pré-selecionada na faixa de 37 - 52°C. A vazão foi entãomovimentada linearmente de 0 à aproximadamente 6 g de sacarose/LO-hr comuma duração de tempo de 7 horas. Uma vazão mais baixa, aumentadalinearmente de 0 para aproximadamente 2 g sacarose/LO-hr, foi também usadaem algumas fermentações.
Células foram removidas diluindo-se uma 1 parte da culturacom 3 partes de água, misturando-se bem e centrifugando a cerca de 30.000 χg para produzir um sobrenadante claro e célula comprimida, que pode serlavada e seca.
Ensaios da concentração de ácido hialurônico foramexecutados usando o método ELISA, baseados em uma proteína ligantehialuronan (proteína e estojos comercialmente disponíveis de SeikagakuAmerica, Falmouth, MA). Concentrações de ácido hialurônico foramdeterminadas usando o método carbazol modificado (Bitter e Muir, 1962,Anal Biochem. 4: 330-334).
Os pesos moleculares foram determinados usando um ensaioGPC MALLS. Os dados foram colhidos de ensaios GPC MALLS usando oseguinte procedimento. GPC-MALLS (expansão de gel ou exclusão portamanho) cromatografia acoplada com dispersão à laser de multi-ângulos) éamplamente usada para caracterizar polímeros de alto peso molecular (MW).Separação de polímeros é obtida por GPC, baseada na divisão diferencial dasmoléculas de MW diferentes entre eluente e resina. O peso molecular médiode um polímero individual é determinado por MALLS baseado na dispersãodiferencial de extensão/ângulo das moléculas de MW diferentes. Princípios deGPCMALLS e protocolos adaptados para ácido hialurônico estão descritosporUeno et al., 1988, Chem. Pharm. Buli. 36, 4971-4975; Wyatt, 1993, Anal.Chim. Acta 272: 1-40; e Wyatt Technologies, 1999, "Light ScatteringUniversity DAWN Course Manual" e "DAWN EOS Manual" WyattTechnology Corporation, Santa Barbara, Califórnia). Um HPLC com fasemóvel constante Agilent 1100, uma coluna Tosoh Biosep G6000 PWxl para aGPC, e um Wyatt Down EOS para a MALLS foram usados. Um detector deíndice refrativo Agilent G1362A foi ligado abaixo do MALLS paradeterminação da concentração do eluído. Vários produtos ácido hialurônicocomerciais com pesos moleculares conhecidos serviram como padrões.
Os resultados são mostrados na figura 1 como as tendênciaspara o peso molecular médio no final das fermentações em função datemperatura de fermentação final, que foi mantida constante por 7 horas,determinado por GPC-MALLS. A figura, de maneira surpreendente, mostraque um MW desejado pode ser selecionado por meio da seleção cuidadosa emanipulação das temperaturas de fermentação. Há um MW máximo nastemperaturas baixas finais de 17°C, e um MW mínimo nas altas temperaturasfinais de fermentação de 52°C. A identidade do máximo verdadeiro foiprotegida selecionando-se uma fonte não-zero para o peso molecular.
Claims (29)
1. Método para produzir um ácido hialurônico com um pesomolecular médio desejado na faixa de 20.000 - 800.000 Dalton, caracterizadopelo fato de que compreende as etapas de:(a) cultivar uma célula hospedeira de Bacillus recombinanteem uma primeira temperatura que conduz ao seu crescimento, em que a célulahospedeira de Bacillus compreende uma construção de ácido nucleicocompreendendo uma seqüência que codifica a hialuronan sintase ligadaoperacionalmente a um promotor de seqüência estranha a uma seqüência quecodifica a hialuronan sintase;(b) então, cultivar a célula hospedeira de Bacillusrecombinante da etapa (a) a uma segunda temperatura maior que a primeiratemperatura da etapa (a) sob condições adequadas para a produção de ácidohialurônico, pelas quais a célula hospedeira de Bacillus produz ácidohialurônico com um peso molecular médio desejado na faixa de 20.000 -800.000 Dalton; e(b) recuperar o ácido hialurônico.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a seqüência que codifica hialuronan sintase codifica umHialuronan sintase de Grupo I.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que a seqüência que codifica hialuronan sintase de Grupo I é obtida deuma cepa Streptoeoceus.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que a cepa Streptoeoceus é Streptoeoceus equisimilis, Streptoeoceuspyogenes, Streptoeoceus uberis, ou Streptoeoceus equi subsp. zooepidemicus.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a seqüência que codifica hialuronan sintase codifica umHialuronan sintase de Grupo II.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que a seqüência que codifica hialuronan sintase de Grupo II é obtidade uma cepa Pasteurella.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que a cepa Pasteurella é Pasteurella multocida.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--7, caracterizado pelo fato de que um açúcar precursor do ácido hialurônico éfornecido ou produzido pela célula hospedeira de Bacillus.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que o açúcar precursor é ácido D-glicurônico ou N-acetil-glicosamina.
10. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9,caracterizado pelo fato de que o açúcar precursor é codificado por genesendógenos, por genes não-endógenos, ou por uma combinação de genesendógenos e não-endógenos na célula hospedeira de Bacillus.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--10, caracterizado pelo fato de que a construção de ácido nucleico compreendeadicionalmente um ou mais genes que codificam enzimas na biossíntese deum açúcar precursor do ácido hialurônico, ou a célula hospedeira de Bacilluscompreende adicionalmente uma ou mais construções de ácido nucleicosecundárias compreendendo um ou mais genes que codificam enzimas nabiossíntese de um açúcar precursor do ácido hialurônico.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que um ou mais genes são selecionados do grupo que consiste emum gene UDP-glicose 6-desidrogenase, gene UDP-glicose pirofosforilase,gene UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase, gene glicose-6-fosfatoisomerase, gene hexoquinase, gene fosfoglicomutase, gene amidotransferase,gene mutase, e gene acetil transferase.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o gene UDP-glicose 6-desidrogenase é um gene hasB ougene tuaD, ou homólogos destes.
14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o gene UDP-glicose pirofosforilase é um gene hasC ou genegtaB, ou homólogos destes.
15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o gene UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase é um genehasD ou gcaD, ou homólogos destes.
16. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o gene glicose-6-fosfato isomerase é um gene hasE ouhomólogo deste.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-11-16, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes que codificam umaçúcar precursor estão sob o controle do mesmo promotor ou um promotordiferente da seqüência que codifica hialuronan sintase.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que a mesma ou a seqüência promotora diferente compreende umpromotor "consenso" tendo a seqüência TTGACA para a região "-35" eTATAAT para a região "-10".
19. Método de acordo com a reivindicação 17 ou 18,caracterizado pelo fato de que a(s) mesma(s) seqüência(s) promotora(s), ouseqüência(s) promotora(s) diferente(s) é/são um promotor em tandem, em quecada promotor do promotor em tandem está operacionalmente ligado àseqüência que codifica a hialuronan sintase.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--19, caracterizado pelo fato de que a construção de ácido nucleico compreendeadicionalmente uma seqüência de processamento/estabilização do RNAmlocalizada à jusante da seqüência promotora e à montante da seqüência quecodifica a hialuronan sintase.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que a construção de ácido nucleico compreende adicionalmenteuma seqüência de processamento/estabilização do RNAm localizada à jusantede um promotor diferente ou promotores diferentes de um ou mais genes quecodificam enzimas na biossíntese do açúcar precursor e à montante de um oumais genes.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--21, caracterizado pelo fato de que a construção de ácido nucleico compreendeadicionalmente um gene marcador selecionável.
23. Método de quaisquer de quaisquer das reivindicações 1-22,caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira de Bacillus é selecionadado grupo consistindo em Bacillus agaradherens, Bacillus alkalophilus,Bacillus amyloliquefaeiens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillusclausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus,Baeillus Iieheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillusstearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis\preferivelmente a célula hospedeira de Bacillus é o Bacillus subtilis ouBacillus lieheniformis.
24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--23, caracterizado pelo fato de que a construção de ácido nucleico compreendeum gene hialuronan sintase, gene UDP-glicose 6-desidrogenase, e gene UDP-glicose pirofosforilase operacionalmente ligado a um promotor "consenso"pequeno de amyQ tendo a seqüência TTGACA para a região "-35" eTATAAT para a região "-10".
25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--24, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira de Bacillus contém umgene interrompido ou deletado eypXdou yvmC.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--25, caracterizado pelo fato de que a primeira temperatura está na faixa de-30°C - 40°C, e a segunda temperatura está na faixa de 40°C - 52°C.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--26, caracterizado pelo fato de que a segunda temperatura está pelo menos 1°Cmaior que a primeira temperatura, preferivelmente a segunda temperatura estápelo menos 2°C, mais preferivelmente pelo menos 3°C, 4°C, 5°C, 6°C, I0C,-8°C, 9°C, 10°C, Il0C, 12°C, 13°C, 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C,-20°C, 21°C, e acima de tudo preferivelmente pelo menos 22°C maior que aprimeira temperatura.
28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--27, caracterizado pelo fato de que a etapa de cultivo na segunda temperaturarepresenta pelo menos 20% do tempo total de cultivo, preferivelmente a etapade cultivo na segunda temperatura representa pelo menos 30%, 40%, 50%,-60%, 70%, 80%, ou acima de tudo preferivelmente pelo menos 90% do tempototal de cultivo.
29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--28, caracterizado pelo fato de que a segunda temperatura é suficientementemaior que a primeira temperatura para permitir a célula hospedeira deBacillus para produzir ácido hialurônico com um peso molecular médiodesejado em uma faixa selecionada do grupo de faixas de peso molecular queconsiste em 20 - 50 kDa, 50 - 100 kDa, 100 - 150 kDa, 150 - 200 kDa, 200 --250 kDa, 250 - 300 kDa, 300 - 350 kDa, 350 - 400 kDa, 400 - 450 kDa, 450 --500 kDa, 500 - 550 kDa, 550 - 600 kDa, 600 - 650 kDa, 650 - 700 kDa, 700 --750 kDa, e 750 - 800 kDa.
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