BRPI0707785A2 - produÇço de Ácidos nuclÉicos estranhos e polipeptÍdeos em sistemas de planta - Google Patents

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BRPI0707785A2
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Vadim Mett
Shailaja Rabindran
Moneim Shamloul
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Abstract

PRODUÇçO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS ESTRANHOS E POLIPEPTIDEOS EM SISTEMAS DE PLANTA. A presente invenção refere-se a sistemas e métodos para produção de um ácido nuclé iço ou proteína em plantas jovens. Tipicamente, as plantas jovens são crescidas em um ambiente regulável contido. Em algumas concretizações, expressão de uma proteína farmaceuticamente ativa nas plantas jovens é controlada por um promotor exogenamente induzível ou um promotor viral. Em algumas concretizações, as plantas jovens são comiveis e podem ser comidas vivas ou preferivelmente colhidas vivas para preservar a atividade biológica máxima do ácido nucléico ou proteína. Em algumas concretizações, a planta jovem é uma planta de ervilha jovem ou uma planta Nicotiana jovem.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRODUÇÃODE ÁCIDOS NUCLÉICOS ESTRANHOS E POLIPEPTÍDEOS EM SISTE-MAS DE PLANTA".
Pedidos de Patente Relacionados
Este pedido de Patente é uma continuação em parte de e reivin-dica o benefício do Pedido de Patente dos Estados Unidos co-pendente N011/353.905, depositado em 13 de fevereiro de 2006, e intitulado "Produçãode Ácidos Nucléicos Estranhos e Polipeptídeos em Sistemas de Germina-ção". Os conteúdos totais deste pedido de patente são, desse modo, incor-porados por referência.
Este pedido de patente também reivindica o benefício de cadaum dos Pedidos de Patente Provisórios dos Estados Unidos co-pendentesNumerados 60/773.255 (intitulado "Vaccine Compositions, and Related Me-thods"); 60/773.374 (intitulado "Antigens, Vaccines Compositions, and Rela-ted Methods"); e 60/773.378 (intitulado "Influenza Antigen, Vaccine Composi-tions, and Related Methods"), cada um dos quais sendo depositado em 13de fevereiro de 2006. Os conteúdos totais de cada um destes pedidos depatente são, desse modo, incorporados por referência.
Este pedido de patente adicionalmente reivindica o benefício doPedido de Patente Provisório dos Estados Unidos co-pendente Número60/813.955, depositado em 15 de junho de 2006, e intitulado "Influenza Anti-gens, Vaccine Compositions, and Related Methods". Os conteúdos totaisdeste pedido de patente são, desse modo, incorporados por referência.
Este pedido de patente adicionalmente reivindica o benefício doPedido de Patente Provisório dos Estados Unidos co-pendente Número60/944.770, depositado em 15 de setembro de 2006, e intitulado "InfluenzaAntibodies, Vaccine Compositions, and Related Methods". Os conteúdostotais deste pedido de patente são, desse modo, incorporados por referên-cia.
Este pedido de patente adicionalmente reivindica o benefício doPedido de Patente Provisório dos Estados Unidos co-pendente Número60/879.450, depositado em 9 de janeiro de 2007, intitulado "Launch Vectorfor the Production of Vaccine Antigens in Plants". Os conteúdos totais decada um destes pedidos de patente são, desse modo, incorporados por refe-rência.
Antecedentes da Invenção
O custo de farmacêuticos é exorbitantemente alto e continua ase elevar. Alguns farmacêuticos, em adição ao seu alto custo, são tambémlimitados no suprimento, tornando impossível para eles serem disponíveis atodo paciente em necessidade dos mesmos. Isto é particularmente proble-mático nos países em desenvolvimento, quando ambos custo e disponibili-dade evitam a distribuição de farmacêuticos às populações necessitadas.
Vários fatores contribuem com os altos custos de produção defarmacêuticos, e resultam no alto preço dos farmacêuticos para o consumi-dor. Um fator de contribuição maior é a falta de meios econômicos de produ-ção do produto. Isto é particularmente verdadeiro para medicamentos base-ados em proteína e peptídeo. Outro fator de contribuição para alguns medi-camentos é a inabilidade de se administrar terapeuticamente quantidadeseficazes do agente farmacêutico oralmente. Muitos farmacêuticos podemsomente serem administrados por injeção em um local particular no corpo.Por exemplo, muitos medicamentos de imunização para o tratamento de a-lergia ou doenças infecciosas requerem administração por injeção. Os far-macêuticos de proteína e peptídeo, tais como hormônio de crescimento hu-mano e insulina, podem, freqüentemente, somente serem administrados porinjeção. Outro fator que contribui para o custo de muitos medicamentos far-macêuticos é sua distribuição para o hospital ou local de distribuição. Parti-cularmente em climas quentes, a distribuição e armazenamento de medica-mentos farmacêuticos requerem equipamento de refrigeração custoso. Esteé um maior desafio nos países em desenvolvimento, onde tal equipamento éfreqüentemente indisponível.
Proteínas e peptídeos farmacêuticos têm sido produzidos emuma ampla variedade de hospedeiros. Muitas proteínas terapêuticas têmsido produzidas em sistemas de expressão heterólogos, incluindo procario-tes, tais como, Escherichia coli e Bacillus subtilis, e eucariotes, tais comolevedura, fungo, células de inseto, células de animal e animais transgênicos.Sistemas de expressão bacterial são relativamente fáceis de manipular e orendimento do produto é alto. Contudo, proteínas de mamífero freqüente-mente requerem modificação pós-tranlacional extensiva para atividade fun-cional, que pode ser um fator Iimitante em sistemas de expressão bacterial.Sistemas de cultura de célula, tais como sistemas de cultura de mamífero,humano e inseto, são mais convenientes para a produção de proteínas com-plexas. Contudo, longo tempo de condução, baixa recuperação do produto,possível transferência patogênica, e altos custos de capital e de produçãoapresentam sérias concernências. Os animais transgênicos podem propor-cionar um suprimento ilimitado de proteínas complexas. Infelizmente, estesistema é limitado pelo longo período de tempo que leva para gerar novos eaperfeiçoados produtos, e pelo risco de transferência de patogenia aos indi-víduos humanos.
As limitações econômicas e bioquímicas para produção de pro-teínas e peptídeos farmacêuticos em células procarióticas e eucarióticas,incluindo altos custos de produção, baixos rendimentos, problemas de se-creção, modificações inapropriadas em processamento de proteína, dificul-dades na escala de volumes maiores, e comunicação, têm conduzido ospesquisadores a examinarem plantas como novos hospedeiros para a pro-dução em grande escala de proteínas e peptídeos com a expectativa de re-duzir custo. A produção de proteínas em plantas transgênicas é descrita, porexemplo, nas Patentes dos Estados Unidos N°s 5.750.871; 5.565.347;5.464.763; 5.750.871; e 5.565.347. Embora as plantas sejam menos custo-sas para crescer e colher em volume do que as células procarióticas e euca-rióticas, a expressão do gene estranho em células de planta é tipicamentebaixa. Em adição, a colheita da planta tipicamente requer quebra das plan-tas, por exemplo, pela remoção das folhas, separação dos talos a partir dasraízes, ou remoção das raízes. Tal quebra usualmente resulta em um pro-cesso que inicia a formação da parte da planta ou apoptose da planta. Umaplanta suportando apoptose gera proteases que contribuem para a degrada-ção da proteína transgenicamente expressa antes da purificação da proteínaainda no começo. Mesmo se a planta é para ser diretamente consumida, aatividade da proteína farmacêutica expressa pode ser reduzida pela maqui-naria de degradação intercelular induzida pela colheita.
Outro interesse maior associado com produção de proteínas es-tranhas em plantas transgênicas que são crescidas em campos abertos é apossibilidade de polinização-cruzada com plantas na terra, tornando possívelque a proteína estranha entre na cadeia de alimento. A complexidade dosregulamentos governamentais que circundam as práticas da agricultura paraplantas transgênicas torna difícil obter novas plantas transgênicas aprovadaspara uso agrícola. Além disso, o ambiente externo é impossível de controlar,tornando o crescimento, desenvolvimento e regulação corretos de expressãode gene estranho difíceis de garantir. Por exemplo, a indução de um calorinduzível, luz induzível, hormônio induzível, ou promotor quimicamente indu-zível seria praticamente impossível em um ambiente externo. Naturalmente,a temperatura externa e níveis altos não podem ser controlados. Adicional-mente, hormônios ou químicos pulverizados em uma planta são similarmen-te para serem dispersos não em uma planta, mas no ambiente pelo vento echuva. A pulverização dos campos de colheita é também muito custosa.
Existe uma necessidade de sistemas aperfeiçoados para a pro-dução de proteínas ou polipeptídeos. Existe uma necessidade particular desistemas aperfeiçoados para a produção de proteínas e polipeptídeos emplantas. Por exemplo, existe uma necessidade de um sistema regulável con-trolado para produção de proteínas farmacêuticas em plantas que diminuema quantidade de degradação intercelular da proteína expressa após colheita.
Sumário da Invenção
A presente invenção proporciona sistemas para a produção deproteínas ou polipeptídeos (e/ou ácidos nucléicos), particularmente proteínasou polipeptídeos farmacêuticos, em plantas.
Em um aspecto, a presente invenção proporciona sistemas paraexpressão rápida de proteínas ou polipeptídeos em plantas. Em algumasconcretizações, portanto, a presente invenção proporciona expressão deproteínas ou polipeptídeos em plantas jovens. Em algumas concretizações,tais plantas jovens são brotos germinados. Em algumas concretizações, asplantas jovens (por exemplo, brotos germinados) podem ser consumidas oucolhidas vivas. Em algumas concretizações, as plantas são crescidas (porexemplo, de uma semente) em um ambiente regulável contido, por exemplo,interno.
Em algumas concretizações, uma proteína ou polipeptídeo aserem produzidos de acordo com a presente invenção é expressa emcélulas de planta de um construto de ácido nucléico que é introduzida naplanta pela mão do homem. Em algumas concretizações, uma proteína oupolipeptídeo a serem produzidos de acordo com a presente invenção étransladada em células de planta de um RNA com características de umaplanta. Em algumas concretizações, estas características incluem ou sãoselecionadas a partir do grupo consistindo em auto-replicação, movimentode célula a célula, movimento sistêmico, e combinações destes. Em algumasconcretizações, o RNA é de auto-replicação e capaz de movimento de célulaa célula, mas não é capaz de movimento sistêmico na planta.
Em algumas concretizações, uma proteína ou polipeptídeo aserem produzidos de acordo com a presente invenção é expresso emcélulas de planta de um construto de ácido nucléico que replica emAgrobacterium. Em algumas concretizações, a presente invenção utiliza umconstruto que replica em Agrobacterium, e também contém um promotor dedirecionamento de expressão de um RNA com características de um vírusde planta. Em algumas concretizações, este RNA inclui seqüências quecodificam a proteína ou polipeptídeo de interesse. Desse modo, em algumasconcretizações da presente invenção, uma proteína ou polipeptídeo deinteresse é produzido em plantas por um processo envolvendo introduçãonas células de uma planta de um vetor que replica Agrobacterium, e tambémcontém um promotor de direcionamento de expressão de um RNA comcaracterísticas de um vírus de planta, cujo RNA não é capaz de movimentosistêmico em uma planta, mas é capaz de auto-replicação, e cujo RNAadicionalmente codifica a proteína ou polipeptídeo de interesse.
Em algumas concretizações da invenção, onde um construto éutilizado que replica em Agrobacterium, o construto é introduzido em célulasde planta por agro infiltração.
Enquanto a presente invenção é descrita aqui em referência aseu uso para produção de proteínas farmacêuticas, a invenção geralmenteencontra uso para produção de essencialmente qualquer ácido nucléico(DNA e/ou RNA) e/ou proteína de interesse, sem limitação como ao(s) u-so(s) particular(es) do ácido nucléico ou proteína. Por exemplo, enzimas deuso em qualquer de uma ampla área de interesse de processos industriaisou processos de bio-remediação (por exemplo, enzimas que degradam po-luentes) podem ser produzidos. Desse modo a descrição da invenção, e asreivindicações, são para serem consideradas como se aplicando a qualquerácido nucléico ou proteína de interesse, mesmo se não explicitamente indi-cado, incluindo aqueles com aplicação terapêutica e aqueles sem aplicaçãoterapêutica. Em certas concretizações, a proteína não é uma proteína nutri-cionalmente importante. Qualquer proteína particular pode ser excluída dapresente invenção sem ser aqui denominada.
Em certas concretizações da invenção em qualquer de seus as-pectos, o ácido nucléico ou proteína de interesse é pós-transcricionalmentee/ou pós-translacionalmente processado na célula em que ele é expresso.Em certas concretizações da invenção, uma proteína de interesse é secreta-da a partir da célula que ela é expressa. Por exemplo, a proteína pode natu-ralmente compreender uma seqüência de sinal de secreção, ou a região decodificação de um ácido nucléico que codifica a proteína pode ser modifica-da para incluir uma porção que codifica uma seqüência de sinal de secreção.
As seqüências de sinal de secreção são bem-conhecidas na técnica.
Em certas concretizações da invenção em qualquer de seus as-pectos, uma seqüência heteróloga que codifica uma proteína de interessepode ser alterada para empregar códons diferentes daqueles presentes naseqüência que ocorre naturalmente, de modo a aperfeiçoar a expressão emplantas geralmente, e/ou em plantas de uma espécie particular. Por exem-plo, a seqüência pode ser códon otimizado para expressão em uma espécieparticular. Métodos para realização de otimização de códon são bem-conhecidos na técnica.
A presente invenção também proporciona, entre outras coisas,plantas contendo construtores de expressão conforme descritos aqui, com-posições contendo tais plantas, preparações de proteínas/polipeptídeos iso-lados de tais plantas, composições contendo tais proteínas/polipeptídeosisolados de tais plantas, métodos de realizar tais isolamentos, e métodos deuso de tais proteínas/polipeptídeos isolados (ou composições contendo osmesmos), incluindo métodos de tratamento de um mamífero com uma prote-ína farmaceuticamente ativa expressa em plantas.
Definições
"Administração" de uma proteína ou polipeptídeo farmaceutica-mente ativo a um indivíduo em necessidade deste é pretendida como a pro-visão da proteína farmaceuticamente ativa a tal indivíduo em uma maneiraque retém a eficiência terapêutica de tal proteína por um comprimento detempo suficiente para proporcionar um efeito benéfico desejado a tal hospe-deiro.
O termo "animal" cobre todos as formas de vida de vertebrados,seres humanos, bovinos, ovinos, suínos, caninos, felinos, furões, roedores,primatas, peixes, pássaros, por exemplo, aves domésticas, e similares. Emalgumas concretizações, os animais são mamíferos. Em algumas concreti-zações, os animais são seres humanos.
De acordo com a presente invenção, uma "porção característica"de um polipeptídeo ou proteína é uma que contém uma extensão contínuade amino ácidos, ou uma coleção de extensões contínuas de amino ácidos,que juntas são características de uma proteína ou polipeptídeo. Em algumasconcretizações, cada tal extensão contínua geralmente conterá pelo menos2, 5, 10, 20 ou mais amino ácidos. Em geral, uma porção característica éuma que, em adição a identidade de seqüência acima especificada, tem emcomum pelo menos uma característica funcional com a proteína intacta rele-vante. Em algumas concretizações, a porção característica pode ser biologi-camente ativa.
Um "domínio" de uma proteína ou polipeptídeo, conforme estetermo é aqui usado, se refere geralmente a um segmento de seqüência deproteína ou polipeptídeo que, quando produzido separado do resto da se-qüência de proteína ou polipeptídeo, mantém um grau de integridade e/ouestrutura tridimensional. Conforme é bem-conhecido na técnica, quaisquerproteínas e polipeptídeos têm estruturas de domínio. Em algumas concreti-zações, o domínio tem atividade (por exemplo, de ligação, catalítica, etc).Em algumas concretizações, um domínio é imunogênico. Um domínio imu-nogênico é pelo menos tão grande quanto um epitopo simples, e é tipica-mente maior; em algumas concretizações, um domínio imunogênico contémseqüência suficiente em adição ao epitopo para assegurar apresentaçãocorreta do epitopo.
"Expressão" se refere à transcrição e/ou translação de um geneendógeno ou um transgene em uma planta, por exemplo, uma muda. Otransgene pode ou não pode estar integrado no DNA genômico da planta.Por exemplo, "expressão" se refere à transcrição e/ou translação em umaplanta de um gene presente em um bacterial, plasmídeo, ou ácido nucléicoviral, indiferente de se o bacterial, plasmídeo, ou ácido nucléico viral estáintegrado no DNA genômico da planta. O gene pode ser um gene que é he-terólogo ao bacterium, plasmídeo, ou vírus.
"Cassete de expressão" ou "vetor de expressão" se refere a umaseqüência de DNA (ou uma seqüência de RNA no caso de vírus de RNA ouplasmídeos de RNA), capaz de direcionar expressão de uma seqüência denucleotídeo particular em uma célula hospedeira apropriada. Por exemplo,um cassete de expressão pode incluir um promotor operavelmente ligado auma seqüência de nucleotídeo de interesse, que é opcionalmente ligado àsseqüências 3', tais como seqüências regulatórias 3", ou sinais terminais. Umcassete de expressão pode também tipicamente incluir seqüências requeri-das para translação correta da seqüência de nucleotídeo se quaisquer se-qüências são necessárias. A região de codificação usualmente codifica parauma proteína de interesse, mas pode também codificar para um RNA fun-cional de interesse, por exemplo, um RNA de anti-sentido, ou um RNA não-transladado que inibe expressão de um gene particular. O cassete de ex-pressão incluindo a seqüência de nucleotídeo de interesse pode ser quiméri-co, significando que a seqüência de nucleotídeo inclui mais do que uma se-qüência de DNA de origem distinta que são fundidas juntas por técnicas deDNA recombinantes, resultando em uma seqüência de nucleotídeo que nãoocorre naturalmente, e que não ocorre particularmente na planta na qual épara ser expressa. Um cassete de expressão pode também ser um que estánormalmente ocorrendo, mas foi obtido em uma forma recombinante útil pa-ra expressão heteróloga. Tipicamente, contudo, o cassete de expressão éheterólogo com relação ao hospedeiro, isto é, a seqüência de DNA particulardo cassete de expressão não ocorre naturalmente na célula hospedeira, edeve ter sido introduzido na célula hospedeira ou um predecessor da célulahospedeira por um evento de transformação. A expressão da seqüência denucleotídeo no cassete de expressão pode ser sob o controle de um promo-tor constitutivo ou de um promotor induzível que inicia transcrição somentequando a célula hospedeira é exposta a algum estímulo externo particular.No caso de um organismo multicelular, tal como uma planta, o promotor po-de também ser específico a um tecido, órgão ou estágio de desenvolvimentoparticular. Um cassete de expressão nuclear é usualmente inserido no ge-noma nuclear de uma planta, e é capaz de direcionar a expressão de umaseqüência de nucleotídeo particular a partir do genoma nuclear da planta.Um cassete de expressão de plastídeo é usualmente inserido no genoma deplastídeo de uma planta, e é capaz de direcionar a expressão de uma se-qüência de nucleotídeo particularmente a partir do genoma de plastídeo daplanta. No caso de um cassete de expressão de plastídeo, para expressãode seqüência de nucleotídeo de um genoma de plastídeo, elementos adicio-nais, por exemplo, locais de ligação de ribossomo, ou estruturas de haste-laço 3' que impedem polialdenilação do RNA de plastídeo, e degradaçãosubseqüente pode ser requerida. Em certas concretizações da invenção, umcassete de expressão é utilizado, que compreende um promotor que é umpromotor mínimo, tal como um elemento TATA, e presença de um fatortrans-ativante pode ser necessário para direcionar expressão da seqüênciade nucleotídeo, particularmente para direcionar expressão de alto nível. Porexemplo, o cassete de expressão pode compreender uma região de DNApara ligação de um ativador transcricional. Tais cassetes de expressão, e ospromotores nestes, são referidos como sendo "ativáveis".
Um "alimento" ou "produto de alimento" é uma preparação líqui-da ou sólida que pode ser ingerida por humanos ou outros animais. Preferi-velmente, os termos incluem preparações das plantas brutas ou vivas (porexemplo, brotos germinados) que podem ser alimentadas vivas diretamentea seres humanos e/ou outros animais. Os materiais obtidos de uma plantasão pretendidos para incluir uma planta comestível total que pode ser ingeri-da por um ser humano ou outro animal. O termo pode também incluir qual-quer planta processada (por exemplo, muda germinada) junto com um veícu-lo nutricional que é alimentado aos seres humanos e outros animais. As eta-pas de processamento podem incluir etapas comumente usadas no alimentoou indústria de alimentos. Tais etapas incluem, mas não estão limitadas a,concentração ou condensação da matéria sólida da planta para formar, porexemplo, um pélete, produção de uma pasta, secagem, ou liofilização, oupodem ser produzidas por corte, amassamento, ou moagem da planta a vá-rias extensões, ou por extração da parte líquida da planta para produzir umasopa, um xarope, ou um suco. Uma etapa de processamento pode incluircozimento, por exemplo, fumegamento da planta (por exemplo, muda germinada).
Um "gene" é uma seqüência que codifica uma proteína ou poli-peptídeo (ou RNA) de interesse. Um gene pode incluir seqüências regulató-rias associadas. Uma seqüência de codificação de gene pode ser transcritano RNA, tais como mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, RNA de sentido, ou RNA deanti-sentido. Conforme será apreciado por aqueles versados na técnica, con-tudo, um "gene" pode também ser um RNA (por exemplo, um gene em umvetor de RNA viral). Exemplos de "seqüência regulatórias" são seqüênciaspromotoras, seqüências não-transladadas 5" e 3', e seqüências de termina-ção. Em adição, íntrons e éxons podem ser incluídos. Em certas concretiza-ções, o gene é a seqüência de codificação e as seqüências regulatórias as-sociadas são seqüências regulatórias."Seqüências regulatórias" conforme usadas aqui, significam deorigem natural diferente ou de origem sintética. Por exemplo, se um ácidonucléico é introduzido em uma célula hospedeira, e a célula hospedeira nãocontém naturalmente alguma ou todas as seqüências presentes no ácidonucléico, então estas seqüências (e/ou o ácido nucléico) são referidas paraserem heterólogas com relação à célula hospedeira. O ácido nucléico intro-duzido pode incluir um promotor heterólogo, uma seqüência de codificaçãoheteróloga, ou uma seqüência de terminação heteróloga. Alternativamente, atransformação do ácido nucléico pode ser completamente heteróloga, oupode incluir qualquer combinação possível de seqüências de ácido nucléicoheteróloga ou endógena. Similarmente, heteróloga se refere a uma seqüên-cia de nucleotídeo derivada e inserida no mesmo tipo de célula original natu-ral, mas que está presente em um estado não-natural, por exemplo, um nú-mero de cópia diferente, ou sob o controle de elementos regulatórios diferen-tes. O termo "heteróloga" se aplica a células, incluindo planta e células bac-teriais, e também a plasmídeos, plastídeos e vírus.
Uma "célula hospedeira" é uma célula em que um ácido nucléicoé introduzido para expressão. Tipicamente, tal introdução requer a mão dohomem.
Um "cassete de expressão inativo" ou "vetor de expressão inati-vo" é uma seqüência de DNA ou RNA que compreende uma seqüência deácido nucléico inativa ou silenciada estranha, que é capaz de direcionar ex-pressão de um ácido nucléico ou polipeptídeo de interesse após sua ativa-ção. Geralmente, um cassete de expressão inativo tem as propriedades deum cassete de expressão conforme descrito acima, exceto que a seqüênciaque codifica para um ácido nucléico ou polipeptídeo de interesse não podeser operativamente ligada a um promotor, por exemplo, pode ser separadado promotor (ou de outro elemento regulatório) por uma região de ácido nu-cléico de intervenção. Ligação operativa ocorre em seguida a um evento derecombinação, de modo que expressão, em seguida, ocorre. Tal cassete deexpressão é referido como sendo "ativável".
O termo "promotor induzível" significa um promotor que é giradopela presença ou ausência de um estímulo particular que aumenta a ativida-de do promotor direta ou indiretamente. Alguns exemplos não-limitativos detal estímulo incluem calor, luz, fatores regulatórios desenvolventes, lesões,hormônios e químicos, por exemplo, moléculas pequenas. Um exemplo deum promotor induzível leve é o promotor ribulose-5-fosfatase carboxilase.Promotores quimicamente induzíveis também incluem sistemas mediadospor receptor, por exemplo, aqueles derivados de outros organismos, taiscomo expressão de gene dependente de esteróide, o sistema repressor Lace o sistema de expressão utilizando o receptor USP de Drosophilia mediadapor hormônio de crescimento juvenil, descrito em W097/13864, incorporadoaqui por referência, bem como sistemas utilizando combinações de recepto-res, por exemplo, descrito em WO 96/27673, também incorporado aqui porreferência. Promotores quimicamente induzíveis adicionais incluem promoto-res induzidos por eliciador, promotores induzidos por safener, bem como osistema de ativação de gene AlcA/alcR que é induzível por certos álcoois ecetonas (WO 93/21334; Caddick et al. (1998) Λ/aí. Biotechnol. 16:177-180,os conteúdos do qual sendo aqui incorporados por referência). Promotoresinduzíveis incluiriam promotores para inibidores de proteinase, por exemplo,promotor de inibidor Il de proteinase de batata, e outros promotores deriva-dos de planta envolvidos na trajetória de resposta de enrolamento, tais comopromotores para polifenil oxidases, LAP e TD. Ver, por exemplo, Gatz"Chemical Control of Gene Expression", Ann. Plant. PhysioL Plant. Moi Biol.(1997) 48:89-108), incorporado aqui por referência. Outros promotores indu-zíveis incluem promotores derivados de planta, tais como os promotores natrajetória de resistência adquirida sistêmica, por exemplo, promotores de PR.É notado que onde promotores induzíveis são aqui discutidos, os promotoresativáveis e cassetes de expressão podem ser usados em um modo similarem certas concretizações da invenção.
Um "geme marcador" é um gene que codifica um traço selecio-nável ou classificável.
Um "alimento modificado" inclui uma composição que é comidaou bebida por um indivíduo, e tem um efeito terapêutico no indivíduo. Umalimento médico inclui, por exemplo, uma planta (por exemplo, uma mudagerminada) em que uma proteína ou polipeptídeo farmacêutico foi produzido,ou uma matéria de planta derivada do mesmo. Um alimento médico pode seringerido sozinho, ou pode ser administrado em combinação com uma com-posição farmacêutica bem-conhecida nas técnicas médicas. Um alimentomédico também inclui os gêneros alimentícios equivalentes para animaisnão-humanos.
"Operavelmente ligado" se refere à associação de elementos deácido nucléico. Por exemplo, um promotor operavelmente ligado a um DNAheterólogo, que codifica uma proteína, promove a produção de mRNA fun-cional correspondente ao DNA heterólogo. Uma seqüência de DNA regulató-rio é referida para ser "operavelmente ligada a" ou "associada com" umaseqüência de DNA que codifica para um RNA ou uma proteína se as duasseqüências estão situadas tal que a seqüência de DNA regulatório afeta aexpressão da seqüência de DNA de codificação.
"Administração oral" de um peptídeo ou proteína farmaceutica-mente ativa significa administração principalmente por meio da boca, preferi-velmente por comida, mas também pretende incluir qualquer administraçãoque proporciona tais peptídeos ou proteínas ao estômago do hospedeiro outrato digestivo. Em uma concretização preferida, a administração oral resultano contato da proteína farmaceuticamente ativa com a mucosa do intestino.
Um "ácido nucléico farmaceuticamente ativo" é um ácido nucléi-co que codifica uma proteína farmaceuticamente ativa, ou é farmaceutica-mente ativo por si mesmo, por exemplo, tem uma ou mais atividades farma-cêuticas tais como aquelas descritas para proteínas farmaceuticamente ati-vas. Por exemplo, o ácido nucléico pode ser uma ou mais trançados de umagente (RNAi) de transferência de RNA. Tais agentes incluem RNAs de in-terferência curta (siRNAs), ou RNAs de grampo de cabelo curtos {shRNAs),ou precursor de um siRNA ou microRNA similar a RNA, objetivado para umatranscrição alvo, por exemplo, uma transcrição de um agente infeccioso, ouuma transcrição relacionada à doença endógena de um indivíduo.
Uma "proteína ou polipeptídeo farmaceuticamente ativo" auxiliaou contribui para a condição de um hospedeiro em uma maneira positivaquando administrado ao hospedeiro em uma quantidade terapeuticamenteeficaz. Uma proteína ou polipeptídeo farmaceuticamente ativo tem proprie-dades de restabelecimento curativo ou paliativo contra uma doença, e podeser administrado para melhorar alívio, aliviar, inverter, retardar começo de,ou diminuir a severidade de um ou mais sintomas de uma doença ou enfer-midade. Uma proteína ou polipeptídeo farmaceuticamente ativo pode terpropriedades profiláticas, e podem ser usados para retardar o começo deuma doença ou diminuir a severidade de tal doença ou condição patológicaquando ela emerge. O termo "proteína ou polipeptídeo farmaceuticamenteativo" inclui proteína ou polipeptídeo totais, e pode também se referir a frag-mentos farmaceuticamente ativos destes. Ele pode também incluir análogosfarmaceuticamente ativos da proteína ou polipeptídeo, ou análogos de frag-mentos da proteína ou polipeptídeo. O termo "proteína ou polipeptídeo far-maceuticamente ativo" também pode se referir a uma pluralidade de proteí-nas ou peptídeos que agem cooperativa ou sinergisticamente para propor-cionar um benefício terapêutico. É notado que o termo "proteína ou polipep-tídeo farmaceuticamente ativo" inclui especificamente proteínas que com-preendem antígenos de vacina, isto é, administração da proteína a um indi-víduo induz uma resposta imune parcialmente ou totalmente protetora nohospedeiro. Em certas concretizações da invenção, a resposta imune prote-ge o indivíduo contra um agente infeccioso, por exemplo, um vírus, bacterial,fungo, ou patogenia protozoal. Exemplos de antígenos de vacina incluemantígeno de superfície de hepatite B (HBsAg), enterotoxin instável a calor deE. coli, glicoproteína de vírus da raiva, e proteína de capsid de vírus Nor-walk. Em outras concretizações da invenção, a resposta imune protege oindivíduo contra uma condição não-infecciosa ou doença, ou diminui a seve-ridade de pelo menos um sinal ou sintoma da condição ou doença. Doençasde interesse neste particular incluem, mas não estão limitadas a, câncer edoenças auto-imunes. O termo "proteína ou polipeptídeo farmaceuticamenteativo" inclui proteínas que tolerizam parcialmente ou totalmente um indivíduoa exposição a um alérgeno que induziria, de outro modo, uma resposta alér-gica ou anafilática.
Um "promotor", conforme aqui usado, é uma seqüência de DNAque inicia transcrição de uma seqüência de DNA associada. A região dopromotor pode também incluir elementos que agem como reguladores deexpressão de gene tais como ativadores, intensificadores, e/ou repressores.
"Elementos regulatórios" se referem a seqüências envolvidas naconferência da expressão de uma seqüência de nucleotídeo. Elementos re-gulatórios incluem seqüências regulatórias 3', tais como promotores que po-dem ser ligados à seqüência de nucleotídeo de interesse, seqüências 3', taiscomo seqüência regulatória 3', ou sinais de terminação. Os elementos regu-latórios também tipicamente envolvem seqüências requeridas para transla-ção correta da seqüência de nucleotídeo.
"Moléculas pequenas" são tipicamente menores do que cerca deum kilodalton, e são compostos biológicos, orgânicos, ou mesmo inorgânicos(por exemplo, cisplatina). Exemplos de tais moléculas pequenas incluemnutrientes, tais como açúcares e derivados de açúcar (incluindo derivados defosfato), hormônios (tais como fitohormônios giberélicos ou ácido absisíco), emoléculas pequenas sintéticas.
"Especificamente regulável" se refere à capacidade de uma mo-lécula pequena afetar preferencialmente a transcrição de um promotor ougrupo de promotores, conforme oposto aos efeitos não-específicos, tais co-mo intensificação ou redução de transcrição global no interior de uma célula.
Uma "muda germinada" ou "broto" é um broto jovem de umasemente ou raiz, preferivelmente uma semente recentemente germinada.Em algumas concretizações, as brotos germinados da invenção são mudasou brotos germinados comestíveis (por exemplo, alfafa, brotos, brotos demunguba, brotos de rabanete, brotos de trigo, brotos de mustarda, brotos deespinafre, broto de cenoura, brotos de beterraba, brotos de cebola, brotos dealho, brotos de aipo, brotos de ruibarbo, uma folha tal como brotos de repo-lho, ou brotos de alface, agrião ou brotos de agrião, brotos de erva tais comobrotos de salsa ou trevo, brotos de couve-flor, brotos de brócolis, brotos defeijão-soja, brotos de lentilha, brotos de flores comestíveis, tais como brotosde girassol, etc). De acordo com a presente invenção, a muda germinadadesenvolveu os dois estágios de folha. Geralmente, os brotos da invençãosão de dois a quatorze dias de idade.
"Substancialmente isolado" é usado em vários contextos, e tipi-camente se refere à purificação pelo menos parcial de uma proteína ou poli-peptídeo fora dos componentes não-relacionados ou contaminantes (porexemplo, planta estrutural e proteínas metabólicas). Os métodos para isolare purificar proteínas ou polipeptídeos são bem-conhecidos na técnica.
"Transformação" se refere à introdução de um ácido nucléico emuma célula, particularmente a integração estável de uma molécula de DNAno genoma de um organismo de interesse.
Descrição dos Desenhos
A figura 1 é uma representação esquemática de estratégias dife-rentes para expressão de gene estranho usando vetores baseados em vírus.
A figura 2 é uma representação esquemática de genomas ALMVe TMV.
A figura 3 é uma representação de uma mancha Western de ex-pressão de GFP recombinante em plantas Nicotiana benthamiana isoladascom Av/A4 e Av/GFP.
A figura 4 é uma representação de uma mancha Western deprodução de hormônio de crescimento humano (hGH) em plantasN.benthamiana infectadas com transcritos in vitro de GH.
A figura 5 é uma representação esquemática de construtos detransformação para expressão de proteínas recombinantes em Brassicajun-cea.
A figura 6 é uma representação de uma imunomancha de Bras-sica juncea transgênica que expressa hormônio de crescimento humano sobcontrole do promotor HSP18.2.
A figura 7 representa uma representação esquemática de váriosconstrutos agrobacteriais contendo genes-alvo. A figura 7A: Vetor pBIV, emque um gene-alvo é integrado entre uma planta promovida (IV=qualquerpromotor de planta, promotor artificial, ou outro promotor que funciona emcélulas de planta, por exemplo, um promotor de um vírus de planta, tal comovírus de mosaico de couve-flor) e o terminador nos; a figura 7B: Vetor pBIV-GUS, em que o gene GUS é inserido em pBIV. A figura 7C: pBIV-Vetor deVírus + Alvo, em que um vetor viral ou replicon (por exemplo, um genomaviral ou porção de genoma) conduzindo um gene-alvo é inserido no pBIV;FIGURA 7D: pBIV-Vetor de Vírus + GFP, em que GFP é um gene-alvo con-duzido por um vetor viral ou replicon inserido pBIV. Os vetores representa-dos nas Figuras 7C e 7D são considerados vetores de "lançamento" porque,após introdução nas células de planta, eles "lançam" a produção das se-qüências virais (que podem ser auto-replicantes, pelo menos no contexto dacélula de planta particular em que eles são laçados.
A figura 8 demonstra manchamento de GUS após agro infiltra-ção de brotos com pBIV-GUS. A figura 8A demonstra manchamento de brotode munguba; A figura 8B demonstra manchamento de brotos Fenugreek.
A figura 9 demonstra manchamento de GUS após agro infiltra-ção de brotos de Brassica com pBIV-GUS. A figura 9A demonstra os resul-tados do manchamento; A figura 9B é uma tabela listando tipos diferentes debrotos testados para sua capacidade de expressar proteína ou polipeptídeodistribuído por meio de um construto agrobacterial que inclui uma expressãode direcionamento de promotor de seqüências virais conduzindo um geneque codifica a proteína ou polipeptídeo de interesse.
A figura 10 demonstra expressão de GFP em N. benthamianasobre o tempo após infiltração com pBI121/D4-GFPC3.
A figura 11 demonstra análise de Western blot de expressão dehGH em plantas como um resultado de infiltração com Agrobacterium con-tendo um vetor de vírus contendo uma seqüência que codifica hGH. Rotas:Rota 1: escada; Rota 2: 50 ng de hGH; Rota 3: Amostra de planta infiltradacom pBI121/D4-HGH 6dpi diluição 1:2; Rota 4: Amostra de planta infiltradacom pBI121/D4-HGH 6dpi diluição 1:10; Rota 5: Amostra de planta infiltradacom pBI121/D4-HGH 6dpi diluição 1:50; Rota 6: Amostra de planta infiltradacom pBI121/D4-HGH 6dpi diluição 1:100; Rota 7: Amostra de planta de plan-ta Saudável; Rota 8: Amostra de planta de pBI121-folhas infiltradas; Rota 9:Amostra de planta de planta infectada D4-HGH 13dpi; Rota 10: Amostra delinha de raiz clonal infectada D4-HGH. Para amostras de planta: um disco defolha (tecido de ~5 mg) é moído em 100 uL de tampão Bradley com tampãode carregamento Laemmli. 10 ul é carregado por rota. Portanto, para as ro-tas 3-6, esta amostra primária foi diluída.
A figura 12 demonstra expressão de proteína IA-2ic plantas deNicotiana benthamiana crescidas em hidroponias. Rotas: 1: padrão IA-2ic; 2.Marcador Mágico; 3. Plantas de crescimento de solo injetadas com agrobac-téria; 4,5. Plantas de crescimento hidropônico 4 dias após infiltração; 6,7.Plantas de crescimento hidropônico 6 dias após infiltração.
A figura 13 representa uma concretização de um sistema de a-gro infiltração utilizado de acordo com a presente invenção para distribuir umvetor agrobacterial que lança seqüências virais que conduzem uma proteína-alvo de interesse em plantas jovens.
A figura 14 ilustra a atividade de Iichenase detectada em váriasvariedades de ervilha submetidas a agro infiltração usando o sistema da fi-gura 13.
A figura 15 mostra a expressão de GFP e crescimento de plantapara ervilhas manchadas submetidas a agro infiltração usando o sistema dafigura 13.
A figura 16 mostra a especificidade de tecido e dias ótimos pós-infiltração para certas ervilhas manchadas submetidas a agro infiltração u-sando o sistema da figura 13.
A figura 17 representa uma molécula veículo de Iichenase quepode ser usada em fusões com proteínas ou polipeptídeos de interesse deacordo com certas concretizações da invenção. O painel A representa umarepresentação esquemática de 1,3-1,4-glucanase (Iichenase) de Clostribiumthermocellum. O painel B apresenta uma representação esquemática doLicKM veículo circularmente permutado. Em cada painel, a hachura verticalcorresponde à região de terminal N do domínio catalítico, e a caixa tracejadacorresponde à região de terminal C do domínio catalítico.
A figura 18 apresenta um diagrama esquemático do vetor delançamento pBID4.
A figura 19 é uma representação esquemática de cada etapaenvolvida no processo de otimização de gene-alvo para purificação de umproduto final que está pronto para armazenagem de acordo com uma con-cretização específica da invenção.
A figura 20 representa um equipamento designado útil para au-tomação de etapas de semeadura de planta para colheita de tecido. Con-forme representado, o módulo é estimado para ocupar uma área de base decerca de 12,192 m a 21,336 m (40 pés a cerca de 70 pés), e para ser cercade 9,754 m (32 pés de altura). O sistema mostrado inclui os seguintes com-ponentes conectados pelos veículos: unidades de prateleira central onde asplantas são mantidas entre etapas, uma unidade de semeadura, uma unida-de de infiltração de vácuo e enxaguamento, e uma unidade de colheita detecido.
Descrição de Certas Concretizações Preferidas
Proteínas e Polipeptídeos
A presente invenção é aplicável à produção de qualquer proteínaou polipeptídeo (ou qualquer DNA funcional ou molécula de RNA) em siste-mas de planta. Conforme indicado acima, em certas concretizações, a in-venção é dirigida à produção de proteínas farmacêuticas, mas a invençãogeralmente não é limitada pelo(s) uso(s) particular(es) do ácido nucléico ouproteína. Por exemplo, enzimas de uso em qualquer de uma ampla varieda-de de processos industriais ou processos de bio-remediação (por exemplo,enzimas que degradam poluentes) podem ser produzidas. Desse modo, adescrição da invenção, e as reivindicações, são para serem consideradascomo se aplicando a qualquer ácido nucléico ou proteína de interesse mes-mo se não explicitamente indicado, incluindo aquelas com aplicações tera-pêuticas e aquelas sem. Em certas concretizações, a proteína não é umaproteína nutricionalmente importante. Qualquer proteína particular pode serexcluída a partir da presente invenção sem ser denominada aqui.
Tipicamente, a proteína ou polipeptídeo expresso não é um queé expresso na planta na natureza. Mesmo se a proteína ou polipeptídeo éum que é expresso na planta na natureza, de acordo com a presente inven-ção, ele é tipicamente expresso em tecido de planta jovem em concentra-ções acima daquela que seria presente em tecido comparável na natureza.
Para dar, mas uns poucos exemplos específicos, a presente in-venção pode ser utilizada para produzir proteínas farmacêuticas de interesseincluindo, mas não limitadas a, hormônios (insulina, hormônio tireóide, cate-colaminas, gonadotropinas, hormônios tróficos, prolactin, oxitocin, dopamina,somatotropina bovina, Ieptins e similares), hormônios de crescimento (porexemplo, hormônio de crescimento humano), fatores de crescimento (porexemplo, fator de crescimento epidermal, fator de crescimento de nervo, fa-tor de crescimento similar à insulina e similares), receptores de fator decrescimento, citoquinas e proteínas de sistema imune (por exemplo, inter-leukins, fator de estimulação de colônia (CSF)1 fator de estimulação de colô-nia de granulócito (G-CSF), fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF), eritropoietin, fator de necrose de tumor (TNF), interfe-rons, integrins, adressins, seletins, receptores de hormônio, receptores decélula T, imunoglobulinas, antígenos de complexo de histocompatibilidademaior solúvel, antígenos imunologicamente ativos, tais como bacteriais, pa-rasíticos, ou antígenos virais ou alérgenos), auto-antígenos, anticorpos), en-zimas (ativador de plasminogem de tecido, estreptokinase, colesterol biosin-tético ou degradativo, enzimas esteriodogênicas, kinases, fosfodiesterases,metilases, de-metilases, dehidrogenases, celulases, proteases, lípases, fos-folipases, aromatases, citocromos, adenilato ou guanilaste ciclases, neura-midases, e similares), receptores (receptores de hormônio de esteróide, re-ceptores de peptídeo), proteínas de ligação (proteínas de ligação de sterpod,hormônio de crescimento ou proteínas de ligação de fator de crescimento, esimilares), fatores de transcrição e translação, oncoproteínas ou proto-oncoproteínas (por exemplo, proteínas de ciclo de célula), proteínas de mús-culo (miosina ou tropo miosina, e similares), mieloproteínas, proteínas neu-roativas, proteínas de supressão de crescimento de tumor (angiostatin ouendostatin, ambas que inibem angiogênese), proteínas anti-sepsis (proteínade aumento de permeabilidade bactericidal), proteínas estruturais (tais comocolágeno, fibroin, fibrinogênio, elastin, tubulin, actin, e miosina), proteínas desangue (trombin, albumina de soro, Fator VII, Fator VIII, insulina, Fator IX,Fator X, ativador de plasminogênio de tecido, Proteína C, fator de von Wile-brand, antitrombin III, glucocerebrosidase, fator de estimulação de colônia degranulócito de eritropoietin (GCSF) ou Fator Vlll modificado, anticoagulantes,tal como huridin), e similares.
Em algumas concretizações particulares, a presente invenção éutilizada para produzir proteínas ou polipeptídeos antigênicos. Por exemplo,a presente invenção pode ser utilizada para produzir proteínas (ou porçõesdestas) de organismos infecciosos que são reconhecidos pelo sistema imu-ne de um indivíduo infectado. Tais proteínas ou polipeptídeos podem ter usoparticular no desenvolvimento de vacinas para proteção contra infecção pe-los organismos relevantes. Para dar, mas uns poucos exemplos específicos,proteínas antigênicas úteis de anthrax (Bacillus anthracis; por exemplo, LF,PA), cólera (Vibrio cholerae), citomegalovírus, cepas de enterotoxigênicas deE. coli, vírus de doença de pé e boca, hepatite B (por exemplo, antígeno desuperfície de hepatite B, HBsAg), hepatite C (por exemplo, proteína de nú-cleo de HCV), vírus da imunodeficiência humana (por exemplo, Tat, Rev,Nef, gp160, gp120, etc), vírus de papiloma humano (por exemplo, E7, E6),gripe (por exemplo, HA, NA), malária (Plasmodium falciparunr, por exemplo,Pfs25, Pfs28, Pfs48/45, Pfs230), vírus do sarampo, vírus norwalk, peste(Yersinia pestis; por exemplo, F1, LcrV), Pseudomonas aeruginosa, vírus daraiva, vírus sincitial respiratório (por exemplo, proteína F, proteína G), rinoví-rus, rota vírus, Staphylococcus aureus, vírus de gastrenterite transmissível,tripanossomos (Trypanosoma brucer, por exemplo, alfa-tubulin, beta-tubulin),tuberculose, SARS, etc, podem ser produzidos de acordo com o sistema dapresente invenção.
Em algumas concretizações particulares, a presente invenção éutilizada para produzir complexos de proteína multiméricos, incluindo, porexemplo, proteínas de imunoglobulina, tais como anticorpos (isto é, anticor-pos monoclonais). Para dar, mas uns poucos exemplos específicos, anti-PA,anti-LF, anti-NA, anti-TNFa, anti-interleukin-12, etc, podem ser produzidos deacordo com o sistema da presente invenção. Mais geralmente, anticorposmonoclonais para antígenos associados com doenças, tais como câncer (porexemplo, leucemia mielóide aguda (AML), câncer do seio, câncer colorretal,leucemia linfocítica crônica (CLL), Iinfoma de não-Hodgkin, carcinoma decélula renal, tumores sólidos), enfermidades inflamatórias e auto-imunes (porexemplo, Asma, doença de Crohn, Diabetes, doença de hospedeiro versusEnxerto (rejeição de órgão), doença inflamatória do intestino, Lupus, Escle-rose múltipla, Psoríase, Artrite Psoriática, Artrite reumatóide, Trombose,Vasculite1 etc), doenças infecciosas (por exemplo, Bacillus anthracis), cólera,(Vibrio cholerae), citomegalovírus, cepas enterotoxigênicas de E. coli, vírusda doença do pé e da boca, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, vírus daimunodeficiência humana, vírus de papiloma humano, gripe, malária (P/as-modium falciparum), vírus do sarampo, vírus norwalk, peste (Yersinia pestis),Pseudomonas aeruginosa, vírus da raiva, vírus sincitial respiratório, rinoví-rus, rota vírus, Staphylococcus aureus, vírus de gastrenterite transmissível,tripanossomos (Trypanosoma brucei), tuberculose, SARS), etc, podem serpreparados de acordo com a presente invenção.
Em algumas concretizações particulares, a presente invenção éutilizada para produzir hGH, auto-antígenos para doenças auto-imunes (porexemplo, IA-2ic para diabetes), antígenos da gripe, antígenos de anthrax,antígenos de HPV, anticorpos da gripe, etc. (ver Exemplos).
Em algumas concretizações da presente invenção, proteínasheterólogas de comprimento total são produzidas. Isto é, uma proteína queocorre na natureza, ou que foi preparada ou designada em outro contexto éproduzida em sua totalidade em plantas jovens. Em algumas tais concretiza-ções, a proteína produzida está livre de quaisquer outras seqüências. Emoutras concretizações, somente uma porção da proteína é produzida, tipica-mente uma porção que tem uma atividade desejável conhecida (por exem-plo, um epitopo de uma proteína antigênica; um domínio ativo de uma prote-ína enzimática, etc). Em algumas concretizações, a porção produzida é umaporção característica da proteína ou polipeptídeo. Em algumas concretiza-ções, a porção produzida compreende um epitopo. Em algumas concretiza-ções, a porção produzida compreende um domínio imunogênico. Em algu-mas concretizações, a porção produzida compreende um domínio de proteí-na.
Em algumas concretizações da presente invenção, proteínas oupolipeptídeos são produzidos como fusões com outras seqüências de prote-ína ou polipeptídeo. Conforme é conhecido na técnica, fusões podem serusadas para qualquer de uma variedade de razões. Por exemplo, proteínasou polipeptídeos para serem produzidos em plantas jovens (por exemplo,brotos germinados), de acordo com a presente invenção, podem ser fundi-dos com uma ou mais porções para facilitar detecção e/ou isolamento. Porexemplo, proteínas ou polipeptídeos de interesse devem ser fundidos comum epitopo antigênico conhecido para qual um anticorpo ou outro Iiganteespecífico é disponível, e pode ser usado para facilitar isolamento ou purifi-cação. Alternativa ou adicionalmente, proteínas ou polipeptídeos de interes-se podem ser fundidos com outro polipeptídeo de estrutura tridimensionaldefinida, por exemplo, para conceder um arranjo tridimensional desejado àproteína ou polipeptídeo de interesse. Como ainda outro exemplo, proteínasou polipeptídeos de interesse podem ser fundidos com uma ou mais porçõesque direcionarão sua localização sub-celular (ou secreção) em células deplanta. Particularmente quando a proteína ou polipeptídeo de interesse é umantígeno de proteína (por exemplo, para uso na preparação de uma vacinade subunidade), será freqüentemente desejável produzir a proteína comouma fusão com uma molécula veículo, por exemplo, para aumentar expres-são, estabilidade, e/ou imunogenecidade, e/ou para auxiliar no isolamentoou purificação. Certos padrões de fusão exemplares conhecidos na técnicaincluem, por exemplo, epitopos de anticorpo (por exemplo, etiqueta His, etc),proteínas veículos imunogênicas, toxina da cólera, enterotoxina instável acalor, etc (ver, por exemplo, Vella et al., Biotechnology 20:1, 1992; Kelly etal., Immunology 113:163, 2004; Buttery et al., JR Coll Physlcians Lond34:163, 2000; Jacobson et al., Minerva Peditr. 54:295, 2002; Dertzbaugh etal., Infect Immunol. 61:48, 1993; Mashar et al., Vaeeine 11:235, 1993; Liljeq-vist et al., J. Immunol. Methods 210:125, 1997; Stahl et al., Proe. Nati Aead.Sci USA 86:6283, 1989; Ulrich et al., Adv. Vírus Res. 50:141, 1998; Smith etal., Virology 348:475, 2006; Turpen et al., Biotechnology 13:53, 1995).
Um padrão de fusão particular contemplado de acordo com apresente invenção é uma proteína termoestável, tal como Iichenase B deClostridium thermocellum (ver, por exemplo, Pedido de Patente Provisóriodos Estados Unidos 60/472.495, depositado em 22 de maio de 2003, e Pe-dido PCT US04/016452, depositado em 24 de maio de 2004, e publicadocomo WO 2005/026375 em 24 de março de 2005. A Iichenase de compri-mento total (cerca de 35 kDa) consiste em um peptídeo de sinal, um domíniocatalítico, uma caixa rica em Pro-Thr, e um domínio de limitação (ver figura17). De acordo com a presente invenção, ambos a caixa rica em Pro-Thr e odomínio de limitação podem ser retirados nas proteínas de fusão. Também,o peptídeo de sinal nativo pode ser substituído com um que opera nas plantas.
O domínio catalítico desta Iichenase tem uma estrutura de laçodividindo-a em duas regiões, a região N terminal (N: 32-84 amino ácidos), ea região C terminal (C: 85-246 amino ácidos). Estas duas regiões podem serdivididas na estrutura de laço e circularmente permutadas para produzir amolécula mais receptiva a inserções sem afetar a atividade enzimática. Umlocal de clonagem múltiplo (MCS) foi introduzido na junção entre estas duasregiões, e uma etiqueta 6xHis e a seqüência KDEL foram colocadas na ex-tremidade 3" do veículo permutado para facilitar purificação e retenção noretículo endoplasmático, respectivamente. A figura 7 mostra um diagramaesquemático da Iichenase modificada (LicKM; número de acesso no Bancode Gene DQ776900), que tem um peso molecular de cerca de 27 kDa. Aseqüência de proteína ou polipeptídeo-alvo pode ser expressa como fusõesde terminal N ou C, e/ou como fusões internas no MCS, uma característicaque permite a expressão simultânea de alvos múltiplos.
LicKM permite fusões em moléculas variando em tamanho depeptídeos pequenos a proteínas de comprimento total de até cerca de 100kDa ou mais. LicKM mantém sua atividade enzimática em altas temperaturas(65°C), uma propriedade que também geralmente se aplica a fusões. Estacaracterística permite recuperação fácil e de custo eficaz de proteínas-alvoporque um tratamento de calor de 10 minutos a 65°C remove até 50% deproteínas de planta de contaminação. Proteínas de fusão de LicKM podemser rastreadas durante purificação pelo monitoramento da atividade de Iiche-nase. O uso de LicKM como uma molécula veículo contribui com vantagensadicionais, incluindo o potencial para expressão aumentada, e incorporaçãode polipeptídeos múltiplos de interesse (por exemplo, determinantes de va-cina múltiplos).
Plantas
Os ensinamentos da presente invenção são aplicáveis a umaampla variedade de plantas diferentes. Em geral, quaisquer plantas que sãoaperfeiçoáveis a expressão de construtos introduzidas, conforme descritoaqui, são úteis de acordo com a presente invenção. Em muitas concretiza-ções, será desejável usar plantas jovens de modo a aperfeiçoar a velocidadede produção de proteína/polipeptídeo. Conforme indicado aqui, em muitasconcretizações, brotos germinados são utilizadas. Conforme é conhecido natécnica, muitos brotos são plantas comestíveis de crescimento rápido produ-zidas de sementes de armazenamento. Contudo, aqueles versados na técni-ca apreciarão que o termo "brotos germinados" tem sido usado em um con-texto mais geral, para se referir a plantas jovens se ou não de uma varieda-de tipicamente classificada como "brotos". Qualquer planta que é crescidalonga bastante para ter biomassa verde suficiente para permitir introduçãoe/ou expressão de um construto de expressão conforme provido aqui (reco-nhecendo que o tempo relevante pode variar dependendo do modo de distri-buição e/ou expressão do construto de expressão), pode ser consideradacomo uma "muda germinada" aqui.
Em muitas concretizações da invenção, plantas comestíveis sãoutilizadas {isto é, plantas que são comestíveis por - não tóxicas - ao indiví-duo a quem a proteína ou polipeptídeo é para ser administrado).
Em certas concretizações preferidas, as plantas da invençãopodem ser plantas da espécie Brassica ou Arabidopsis. Algumas plantasadequadas que são aperfeiçoáveis a transformação, e são comestíveis co-mo brotos germinados incluem alfaia, munguba, rabanete, trigo, mustarda,espinafre, cenoura, beterraba, cebola, alho, aipo, ruibarbo, uma planta folho-sa, tais como repolho ou alface, agrião, ervas, tais como salsa, hortelã outrevos, couve-flor, brócolis, feijão-soja, lentilhas, flores comestíveis, tal comoo girassol, etc.
Uma ampla variedade de espécie de planta foi testada para suaadequabilidade na prática da presente invenção. Uma variedade de feijãodiferente e outras espécies incluindo, por exemplo, feijão adzuki, alfafa, ce-vada, brócolis, ervilha "bill jump", trigo-mouro, repolho, couve-flor, trevo,couves verdes, "fenugreek", linho, feijão garbanzo, ervilha verde, espinafrejaponesa, couve galega, "kamut", couve-rábano, ervilha graúda, munguba,mustarda verdes, feijão malhado, rabanete, trevo vermelho, feijão-soja, ervi-lha manchada, girassol, nabo, ervilha amarela, e outras, foram testadas parasua receptividade a produção de proteínas heterólogas de vetores virais Ian-çados de um construto agrobacterial (introduzida por agro infiltração confor-me descrito aqui) (ver, por exemplo, Exemplos 5 e 8, figura 9, etc). A presen-te invenção proporciona o resultado surpreendente que certas variedades deervilha são particularmente receptíveis a tal manipulação. Por exemplo, deacordo com a presente invenção, ervilha "bill jump", ervilha verde, ervilhagraúda, ervilha salpicada, e/ou ervilha amarela são particularmente úteis deacordo com este aspecto da invenção. Em certas concretizações, portanto, apresente invenção proporciona produção de proteínas ou polipeptídeos (porexemplo, antígenos, anticorpos, e/ou outras proteínas) em uma ou mais des-tas plantas usando um vetor agrobacterial que lança um construto viral (istoé, um RNA com características de um vírus de planta) que codifica a proteí-na ou polipeptídeos relevantes de interesse. Em algumas concretizações, oRNA tem características de (e/ou inclui seqüências de) A1MV. Em algumasconcretizações, o RNA tem características de (e/ou inclui seqüências de)TMV.
Será apreciado que, em um aspecto, a presente invenção pro-porciona plantas jovens (por exemplo, brotos) que expressam uma proteínaou polipeptídeo-alvo de interesse. Em algumas concretizações, as plantasjovens foram crescidas de sementes transgênicas; a presente invenção tam-bém proporciona sementes que podem ser geradas e/ou utilizadas para osmétodos aqui descritos. Sementes transgênicas para qualquer gene de inte-resse podem ser germinadas e opcionalmente induzidas para produção deuma proteína ou polipeptídeo de interesse. Por exemplo, sementes capazesde expressar qualquer gene de interesse podem ser germinadas e induzidasatravés de: i) infecção de vírus, ii) agro infiltração, ou iii) bactéria que contémgenoma de vírus. Sementes capazes de expressar um transgene para ca-deia pesada ou leve de qualquer anticorpo monoclonal podem ser germina-das e induzidas para produção de molécula de comprimento total através de:i) infecção de vírus, ii) agro infiltração, ou iii) inoculação com bactéria quecontém genoma de vírus. Sementes capazes de expressar um transgenepara um ou mais componentes de uma molécula complexa compreendendocomponentes múltiplos tais como slgA podem ser germinadas e usadas paraprodução de uma molécula totalmente funcional através de: i) infecção devírus, ii) agro infiltração, ou iii) inoculação com bactéria que contém genomade vírus. Sementes de plantas não-transgênicas saudáveis podem ser ger-minadas e usadas para produção de seqüências alvos através de: i) infecçãode vírus, ii) agro infiltração, ou iii) inoculação com bactéria que contém ge-noma de vírus.
Em algumas concretizações, as plantas jovens foram crescidasde sementes que não eram transgênicas. Tipicamente, tais plantas jovensabrigarão seqüências virais que direcionam expressão da proteína ou poli-peptídeo de interesse. Em algumas concretizações, as plantas podem tam-bém abrigar seqüências agrobacteriais, opcionalmente incluindo seqüênciasque "lançam" as seqüências virais.
Sistemas para Expressar Proteínas ou polipeptídeos em Plantas
De acordo com a presente invenção, qualquer de uma variedadede sistemas diferentes pode ser usada para expressar proteínas ou polipep-tídeos em plantas jovens (por exemplo, brotos germinados). Em algumasconcretizações, linhas de células transgênicas ou sementes são geradas,que são, em seguida, germinadas e crescidas por um período de tempo demodo que uma proteína ou polipeptídeo incluído nas seqüências transgêni-cas é produzido em tecidos de planta jovem (por exemplo, em brotos germi-nados). Tecnologias típicas para a produção de células de planta transgêni-ca e/ou sementes incluem transferência de gene mediada por Agrobacteriumtumefaciens e bombardeio de microprojétil, ou eletroporação.
Em algumas concretizações, sistemas de expressão transientesão utilizados. Tecnologias típicas para a produção de expressão transientede proteínas e polipeptídeos em tecidos de plantas utilizam vírus de planta.A transformação viral é um método mais rápido e menos custoso de trans-formação de embriões e brotos germinados que podem ser colhidos sem umretardo experimental ou geracional antes da obtenção do produto desejado.Por outro lado, vírus que não são atenuados podem infectar outras plantas,causando potencialmente problemas ambientais.
A presente invenção proporciona sistemas de expressão tendovantagens de sistemas de expressão viral (por exemplo, expressão rápida,altos níveis de produção), e de transformação de Agrobacterium (por exem-plo, administração controlada). Em particular, conforme discutido em deta-lhes abaixo, a presente invenção proporciona sistemas em que um construtoagrobacterial (isto é, um construto que replica em Agrobacterium e, portanto,pode ser distribuído para células de planta por distribuição de Agrobacteri-um) inclui um promotor de planta que, após ser introduzido em uma planta,direciona expressão de seqüências virais (por exemplo, incluindo seqüênciasde replicação viral) conduzindo um gene para uma proteína ou polipeptídeode interesse. Este sistema permite expressão de transiente de alto nível deproteínas e polipeptídeos em plantas.
Uma variedade de concretizações diferentes de sistemas de ex-pressão, alguns dos quais produzem plantas transgênicas e outros dos quaisproporcionam expressão transiente, são discutidos em detalhes adicionaisindividualmente abaixo. Para qualquer destas técnicas, o versado na técnicalendo o presente relatório descritivo apreciaria como ajustar e otimizar osprotocolos para expressão de proteínas e polipeptídeos em tecidos de plantajovem (por exemplo, brotos germinados).Transformação de Aarobacterium
Agrobacterium é um gene representativo da família gram-negativa Rhizobiaceae. Esta espécie é responsável por tumores de planta,tais como doença de bile de coroa e raiz peluda. Em tecido de planta dife-renciado, que é característico de tumores, derivados de amino ácido conhe-cidos como opines são produzidos pelo Agrobacterium e catabolizados pelaplanta. Os genes bacteriais responsáveis pela expressão de opines são umafonte conveniente de elementos de controle para cassetes de expressãoquiméricos. De acordo com a presente invenção, o sistema de transforma-ção de Agrobacterium pode ser usado para gerar plantas jovens (por exem-plo, brotos germinados, incluindo brotos germinados comestíveis), que sãomeramente colhidos antes das plantas amadurecerem. Os métodos detransformação de Agrobacterium podem facilmente serem aplicados pararegenerar plantas jovens (por exemplo, brotos germinados) que expressamproteínas farmacêuticas.
Em geral, a transformação das plantas com Agrobacterium en-volve a transformação de células de planta crescidas em cultura de tecidopor co-cultivo com um Agrobaeterium tumefaeiens conduzindo uma plan-ta/vetor bacterial. O vetor contém um gene que codifica uma proteína farma-cêutica. O Agrobaeterium transfere o vetor para a célula hospedeira da plan-ta e é, em seguida, eliminado usando tratamento antibiótico. As células deplanta transformadas que expressam a proteína farmacêutica são seleciona-das, diferenciadas, e, finalmente, regeneradas em plantinhas completas(Hellen et al., Plant Molecular Biology (2000) 42(819-832); Pilon-Smits et al.,Plant Physiolog. (Jan 1999) 119(1 ):123-132; Barfield and Pua Plant Cell Re-ports (1991 )10(6/7):308-314); Riva et al., Journal of Bioteehnology (15 dedezembro de 1998) 1(3), cada incorporado aqui por referência.
Vetores de expressão agrobacterial para uso na presente inven-ção incluem um gene (ou cassete de expressão) que codifica uma proteínafarmacêutica designada para operação em plantas, com seqüências compa-nheiras a montante e a jusante do cassete de expressão. As seqüênciascompanheiras são geralmente de plasmídeo ou de origem viral, e proporcio-nam características necessárias ao vetor para transferir DNA da bactéria aohospedeiro de planta desejado.
O construto básico bacterial/vetor de planta proporciona preferi-velmente uma origem de replicação de procariote de hospedeiro de faixaampla, um marcador selecionável de procariote. Marcadores selecionáveisprocarióticos adequados incluem resistência a antibióticos, tais como ampici-Iina ou tetraciclina. Outras seqüências de DNA que codificam funções adi-cionais que são bem-conhecidas podem também estarem presentes no vetor.
Seqüências de Agrobacterium T-DNA são requeridas para trans-ferência mediada por Agrobacterium de DNA para o cromossomo da planta.Os genes de indução de tumor do T-DNA são tipicamente removidos duranteconstruto de um construtor de expressão agrobacterial, e são substituídoscom seqüências que codificam a proteína ou polipeptídeo farmacêutico. Asseqüências de limite de T-DNA são retidas porque elas iniciam a integraçãoda região de T-DNA no genoma da planta. Se expressão das proteínas far-macêuticas não é prontamente acessível para detecção, o construto bacteri-al/de vetor de planta também incluirá um gene marcador selecionável ade-quado para determinação se uma célula de planta foi transformada, por e-xemplo, gene de resistência nptll karamicin.
No mesmo ou diferente vetor bacterial/de planta (pasmídeo Ti)são seqüências Ti. Seqüências Ti incluem os genes de virulência, que codifi-cam um conjunto de proteínas responsáveis pela excisão, transferência eintegração do T-DNA no genoma da planta (Schell, Science (1987)237:1176-1183). Outras seqüências adequadas para permissão de integração da se-qüência heteróloga no genoma da planta podem também incluir seqüênciasde transposon, e similares, para recombinação homóloga.
Certos construtos incluirão o cassete de expressão que codificaa proteína de interesse. Um, dois ou mais cassetes de expressão podem serusados em uma dada transformação. O cassete de expressão recombinantecontém, em adição á proteína farmacêutica que codifica seqüência, pelomenos os seguintes elementos: uma região de promotor, seqüências não-transladadas 5' de planta, códon de iniciação (dependendo se ou não o geneexpresso tem seu reconhecimento), e seqüências de terminação de transcri-ção e terminação. Em adição, terminadores de transcrição e translação po-dem ser incluídos nos cassetes de expressão ou genes quiméricos da pre-sente invenção. Seqüências de secreção de sinal que permitem processa-mento e translocação da proteína, conforme apropriado, podem também serincluídas no cassete de expressão.
Uma variedade de promotores, seqüências de sinal, e termina-dores de transcrição e translação são descritos, por exemplo, em Lawton etal., Plant MoL Biol (1987) 9:315-324, ou Patente dos Estados Unidos N05.888.789, incorporados aqui por referência. Em adição, genes estruturaispara resistência a antibiótico são comumente utilizados como um fator deseleção (Fraley et al., Proc. Natl. Acad. ScLl USA (1983) 80:4803-4807), a-qui incorporado por referência. Locais de enzima de restrição únicos nasextremidades 5" e 3' do cassete permitem fácil inserção em um vetor pre-existente.
Outros sistemas de vetor binário para transformação mediadapor Agrobacterium, conduzindo pelo menos uma seqüência limite de T-DNA,são descritos em PCT/EP99/07414, incorporado aqui por referência. Outradiscussão de transformações mediadas por Agrobacterium é encontrada emGelvin, S. B., "Agrobacterium-Meó\a\eà Plant Transformation: the Biologybehind the "Gene-Jockeying" Tool", Microbiology and Molecular Biology Re-views, 67(1): 16-37 (2003), incorporados aqui por referência, e referênciasnos mesmos, todos das quais sendo incorporados aqui por referência; Lo-rence A, Verpoorte R., Gene transfer and expression in plants. Methods MolBiol. (2004) 267:329-50, incorporado aqui por referência.
Em certas concretizações da invenção, bactéria e outras do queAgrobacterium são usados para introduzir uma seqüência de ácido nucléicoem uma planta. Ver, por exemplo, Broothaerts W, et al., Transferência degene para plantas por espécies diversas de bactéria, Nature (2005),433(7026):629-633, que é incorporado aqui por referência.
Sementes são preparadas de plantas que foram infectadas comAgrobactéria (ou outra bactéria), tal que o gene heterólogo desejado quecodifica uma proteína ou polipeptídeo de interesse é introduzido. Tais se-mentes são colhidas, secas, limpas e testadas para viabilidade e para a pre-sença e expressão de um produto de gene desejado. Uma vez que este te-nha sido determinado, estoque de semente é armazenado sob condiçõesapropriadas de temperatura, umidade, saneamento e segurança a seremusadas quando necessário. As plantas totais são então regeneradas de pro-toplastos cultivados, por exemplo, conforme descrito em Evans et al., Hand-book of Plant Cell Cultures, Vol. 1:MacMillan Publishing Co. New York,1983); e Vasil I. R. (ed.), Cell Culture and Somatic Cell Genetics of PlantslAcad. Press, Orlando, Vol. I, 1984, e Vol. III, 1986, incorporados aqui porreferência.
Em certas concretizações, as plantas não são regeneradas emplantas adultas. Por exemplo, em algumas concretizações, as plantas sãoregeneradas somente ao estágio de broto germinado. Em outras concretiza-ções, as plantas totais são regeneradas para produzir estoques de sementee plantas jovens (por exemplo, brotos germinados) para uso de acordo coma presente invenção são geradas a partir das sementes do estoque de se-mente.
Todas as plantas das quais protoplastos podem ser isolados ecultivados para dar plantas totais regeneradas podem ser transformadas porAgrobactéria de acordo com a presente invenção de modo que as plantastotais são recuperadas, que contêm um gene transferido que codifica umaproteína ou polipeptídeo de interesse. É sabido que praticamente todas asplantas podem ser regeneradas a partir dás células de cultura ou tecidos,incluindo, mas não limitadas a, todas as espécies maiores de plantas queproduzem brotos comestíveis. Algumas plantas adequadas incluem alfafa,munguba, rabanete, trigo, mustarda, espinafre, cenoura, beterraba, cebola,alho, aipo, ruibarbo, uma planta folhosa, tais como repolho ou alface, agrião,ervas, tais como salsa, hortelã, ou trevos, couve-flor, brócolis, feijão-soja,lentilhas, flores comestíveis, tal como girassol, etc.
Meios para regeneração de plantas de células transformadaspodem variar de uma espécie de plantas para a próxima. Contudo, aquelesversados na técnica apreciarão que geralmente uma suspensão de proto-plantas transformadas contendo cópias do gene heterólogo é primeiro provi-da. Tecido de calo é formado, e brotos podem ser induzidos de calo e, sub-seqüentemente, arraigados. Alternativamente, formação de embrião podeser induzida a partir da suspensão de protoplastos. Estes embriões germi-nam como embriões naturais para formar plantas. O afundamento da se-mente na água, ou a pulverização da semente com água para aumentar oteor de umidade da semente para entre 35-45%, inicia a germinação. Para agerminação proceder, as sementes são tipicamente mantidas em ar satura-do com água sob condições de temperatura controlada e fluxo de ar. O meiode cultura geralmente conterá vários amino ácidos e hormônios, tais comoauxina e citoquinins. É também vantajoso adicionar ácido glutâmico e prolinaao meio, especialmente para espécies, tal como alfafa. Brotos e raízes nor-malmente se desenvolvem simultaneamente. A regeneração eficiente de-penderá do meio, do genótipo, e da história da cultura. Se estas três variá-veis são controladas, então a regeneração é totalmente reproduzível e repe-tível.
As plantas maduras, crescidas a partir de células de plantatransformadas, e plantas trangênicas homozigóticas de não-segregação, sãoidentificadas. A planta congênita produz sementes contendo o gene transfe-rido que codifica uma proteína ou polipeptídeo de interesse. Estas sementespodem ser germinadas e crescidas ao estágio de planta jovem (por exemplo,brotos germinados), para produzir a proteína ou polipeptídeo de interesse.
Em concretizações relacionadas, sementes transgênicas (con-duzindo o gene transferido que codifica uma proteína ou polipeptídeo de in-teresse, tipicamente integrado no genoma) podem ser formadas nos produ-tos de semente, e vendidas com instruções de como desenvolver plantasjovens a um estágio apropriado (por exemplo, ao estágio de broto germina-do) para colheita e/ou administração, ou formulação, conforme descrito aqui.Em outras concretizações relacionadas, híbridos ou novas variedades con-cretizando os traços desejados (isto é, o gene tradicional que codifica umaproteína ou polipeptídeo de interesse), são desenvolvidos de plantas trans-gênicas congênitas.
Integração Direta
Integração direta de fragmentos de DNA no genoma de célulasde planta por bombardeio de microprojétil ou eletroporação pode tambémser usada para introduzir construtos de expressão que codificam proteínasou polipeptídeos de interesse em tecidos de planta de acordo com a presen-te invenção (ver, por exemplo, Kikkert1 J. R. Humiston et al., In Vitro Cellular& Developmental Biology Plant: Journal of the Tissue Culture Association(Jan/Fev 1999) 35 (1):43-50; Bates, G. W. Florida State University, Tallahas-see, FL. Molecular Biotechnology (Out 1994) 2(2):153-145. Mais particular-mente, vetores contendo um gene que codifica uma proteína ou polipeptídeode interesse podem ser introduzidos nas células de planta por uma varieda-de de técnicas. Conforme descrito acima, os vetores podem incluir marcado-res selecionáveis para uso em células de planta. Os vetores podem tambémincluir seqüências que permitem sua seleção e propagação em um hospe-deiro secundário, tais como seqüências contendo uma origem de replicaçãoe marcador selecionável. Tipicamente, hospedeiros secundários incluembactéria e levedura. Em uma concretização preferida, o hospedeiro secundá-rio é Escherichia coli, a origem de replicação é um origem tipo CoIEI de re-plicação, e o marcador selecionável é um gene que codifica resistência aampicilina. Tais seqüências são bem-conhecidas na técnica, e são comerci-almente disponíveis (por exemplo, Clontech, Palo Alto, CA ou Stratagene, LaJolla, CA).
Os vetores da presente invenção podem também ser modifica-dos em plasmídeos de transformação de planta intermediários que contêmuma região de homologia a um vetor de Agrobacterium tumefaciens, umaregião limite de T-DNA de Agrobaeterium tumefaciens, e genes quiméricosou cassetes de expressão descritos acima. Vetores adicionais podem incluirtumor de planta desarmado incluindo plasmídeo de Agrobacterium tumefaci-ens.
De acordo com a presente concretização, transformação diretados vetores da invenção envolve microinjeção dos vetores diretamente nascélulas da planta pelo uso de micropipetas para transferir mecanicamente oDNA recombinante (ver, por exemplo, Crossway,Mol. Gen. Genet., 202:179-185, 1985, incorporado aqui por referência). O material genético pode tam-bém ser transferido na célula da planta pelo uso de polietileno glicóis (ver,por exemplo, Krens et al., Nature (1982) 296:72-74). Outro método de intro-dução de segmentos de ácido nucléico é penetração balística de alta veloci-dade por partículas pequenas com o ácido nucléico, ou dentro da matriz degotas pequenas, ou partículas, ou na superfície (ver, por exemplo, Klein etal., Nature (1987) 327:70-73; Knudsen and Muller Planta (1991) 185:330-336)). Ainda outro método de introdução é fusão de protoplastos com outrasentidades, ou minicélulas, células, lisossomos, ou outros corpos de superfí-cie de lipídeo fusíveis (ver, por exemplo, Fraley et al., Proc. NatL Acad. Sei.USA (1982) 79:1859-1863). Vetores da invenção podem também ser intro-duzidos nas células da planta por eletroporação (ver, por exemplo, Fromm etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1985) 82:5824). De acordo com esta técnica,protoplastos de planta são eletroporados na presença de plasmídeos con-tendo o construto de gene. Impulsos elétricos de reversibilidade de resistên-cia de campo alta permeabilizam biomembranas permitindo a introdução dosplasmídeos. Os protoplastos de planta eletroporados reformam a célula, di-videm a parede, e formam calo da planta, que podem ser regenerados paraformar os brotos germinados da invenção. Aqueles versados na técnica a-preciariam como utilizar estes métodos para transformar células de plantaque podem ser usadas para gerar brotos germinados comestíveis.
Transformação Viral
De acordo com a presente invenção, vetores de vírus de plantasão usados para infectar e produzir proteína estranha em sementes, embri-ões, brotos germinados. Neste particular, infecção inclui qualquer método deintrodução de um genoma viral, ou porção deste, em uma célula, incluindo,mas não limitado a, o processo infeccioso natural de um vírus, abrasão, ino-culação, etc. O termo inclui introdução de uma transcrição de RNA genômi-co, ou uma cópia de cDNA desta, em uma célula. O genoma viral não ne-cessita ser um genoma completo, mas tipicamente conterá seqüências sufi-cientes para permitir replicação. O genoma pode codificar uma replicase vi-ral, e pode conter quaisquer elementos de ácido nucléico de cis-ação neces-sários para replicação. Expressão de níveis altos de genes estranhos quecodificam peptídeos curtos, bem como proteínas complexas grandes (porexemplo, por vetores tobamoviral) é descrita, por exemplo, por McCormick etal. (Proc. Nati Acad. Sei. USA (1999) 96:703-708; Kumagai et al., (Gene(2000) 245:169-174 e Verch et al., (J. Immunol. Methods (1998) 220, 69-75,cada incorporado aqui por referência). Desse modo, vetores de vírus deplanta têm uma capacidade demonstrada de expressar peptídeos curtos,bem como proteínas complexas grandes.
Em certas concretizações, plantas jovens (por exemplo, brotos)que expressam proteínas farmacêuticas, tais como insulina, GAD, e IA-2associado como diabetes tipo 1, são geradas utilizando hospedeiro/sistemade vírus. Plantas jovens produzidas por infecção viral proporcionam umafonte de proteína ou polipeptídeo de interesse que já foi demonstrada sersegura. Por exemplo, brotos estão livres de contaminação com patogeniasanimais. Diferentemente, por exemplo, tabaco, proteínas de um broto co-mestível podiam pelo menos na teoria serem usadas em aplicações oraissem purificação, reduzindo significantemente os custos.
Em adição, um sistema de vírus/planta jovem (por exemplo, bro-to) também oferece uma rota muito mais simples, menos custosa para esca-la e fabricação, visto que os genes relevantes (que codificam a proteína oupolipeptídeo de interesse) são produzidos no vírus, que pode ser desenvol-vido a uma escala comercial dentro de uns poucos dias. Em contraste, plan-tas transgênicas podem requerer até 5-7 anos antes que sementes suficien-te ou material de planta estejam disponíveis para ensaios de grande escalaou comercialização.
De acordo com a presente invenção, os vírus de RNA de plantatêm certas vantagens, enquanto os tornam atrativos como vetores para ex-pressão de proteína estranha. A biologia e patologia molecular de um núme-ro de vírus de RNA de planta são bem-caracterizadas, e existe conhecimen-to considerável de biologia, genéticas e seqüência regulatória de vírus. Mui-tos vírus de RNA de planta têm genomas pequenos, e clones de cDNA in-fecciosos são disponíveis para facilitar manipulação genética. Uma vez queo material de vírus infeccioso entra na célula hospedeira susceptível, ele re-plica a altos níveis e se espalha rapidamente através de toda a planta (um adez dias pós-inoculação). As partículas de vírus são facilmente e economi-camente recuperadas de tecido infectado. Os vírus têm uma faixa ampla dehospedeiro, capacitando o uso de um construto simples para infecção devárias espécies susceptíveis. Estas características são facilmente transferí-veis para os brotos.
A figura 1 ilustra várias estratégias para expressar genes estra-nhos usando vírus de planta. Seqüências estranhas podem ser expressaspela substituição de um dos genes virais com seqüência desejada, pela in-serção de seqüências estranhas no genoma do vírus em uma posição apro-priada, ou pela fusão de peptídeos estranhos às proteínas estruturais de umvírus. Além disso, quaisquer destas aproximações podem ser combinadaspara expressarem seqüências estranhas por trans-complementação de fun-ções vitais de um vírus. Um número de estratégias diferentes existe comoferramentas para expressar seqüências estranhas nas plantas infectadas porvírus usando vírus de mosaico de tabaco (TMV), vírus de mosaico de alfafa(AIMV), e quimeras destes.
O genoma de AIMV é um representante da família Bromoviridaede vírus, e consiste em três RNAs genômicos (RNAs1-3) e RNA subgenômi-co (RNA4) (figura 2). Os RNAs genômicos 1 e 2 codificam proteínas replica-ses de vírus P1 e P2, respectivamente. O RNA3 genômico codifica a proteí-na de movimento de célula a célula P3 e a proteína de revestimento (CP). ACP é transladada de RNA4 subgenômico, que é sintetizado de RNA3 genô-mico, e é requerido para iniciar a infecção. Estudos têm demonstrado o en-volvimento da CP em funções múltiplas, incluindo ativação de genoma, repli-cação, estabilidade de RNA, formação de sintoma, e encapsidação de RNA(ver, por exemplo, Bole t al., Virology (1971) 46: 73-85; Van Der Vossen etal., Virology (1994) 202: 891-903; Yusibov et al., Virology 208: 405-407; Yu-sibov et al., Virology (1998) 242:1-5; Bole t al., (Review, 100 refs.). J. Gen.Viroi (1990) 80:1089-1102; De Graaff1 Virology (1995) 208:583-589; Jasparset al., Adv. Vírus Res (1974). 19, 37-149; Loesch-Fries, Virology (1985) 146:177-187; Neeleman et al., Virology (1991) 181: 687-693; Neeleman et al.,Virology (1993) 196:883-887; Van Der Kuyl et al., Virology (1991) 183: 731-738; van Der Kuyl et al., Virology (1991) 185: 496-499).
A encapsidação de partículas virais é essencial para movimentode longa distância de vírus de partes inoculadas a não-inoculadas da se-mente, embrião, ou planta jovem (por exemplo, brotos germinados) e parainfecção sistêmica. De acordo com a presente invenção, inoculação podeocorrer em qualquer estágio de desenvolvimento de planta. Em embriões ebrotos, a difusão do vírus inoculado deve ser muito rápida. Virions de AIMVsão encapsidatados por uma CP única (24 kD), formando mais do que umtipo de partícula. O tamanho (30 a 60 mm de comprimento e 18 nm de diâ-metro) e forma (esférica, elipsoidal, ou baciliforme) da partícula dependemdo tamanho do RNA encapsidatado. Após montagem, o terminal N do AIMVCP é para estar localizado na superfície das partículas de vírus, e não pare-ce interferir com a montagem do vírus (Bole t al., Virology (1971) 6: 73-85).Adicionalmente, o AIMV CP com um adicional de 38 peptídeo amino ácidosem seu terminal N forma partículas in vitro e retém atividade biológica (Yusi-bov et al., J. Gen. ViroL (1995) 77: 567-573).
O AIMV tem uma faixa de hospedeiro ampla, que inclui um nú-mero de plantas de colheita agriculturalmente valiosa, incluindo sementes deplanta, embriões, e brotos. Juntas, estas características tornam o AIMV CPum excelente candidato como uma molécula veículo e AIMV um vetor candi-dato atrativo para a expressão de seqüências estranhas para a expressãode seqüências estranhas na planta no estágio de broto de desenvolvimento.Além disso, após expressão de um vetor heterólogo, tal como TMV, o AIMVCP encapsidata o genoma de TMV sem interferir com a infectividade do ví-rus (Yusibov et al., Proc. NatL Acad. Sei. USA (1997) 94: 5784-5788, incor-porado aqui por referência). Isto permite o uso de TMV como um vírus veícu-lo para AIMV CP fundido às seqüências estranhas.TMV, o protótipo do tobamovírus, tem um genoma consistindoem um RNA simples mais de sentido encapsidatado com uma CP de 17,0kD, que resulta em partículas em forma de haste (300 nm de comprimento)(figura 2). A CP é a única proteína estrutural de TMV1 e é requerida para en-capsidação e movimento de longa distância do vírus em um hospedeiro in-fectado (Saito et ai., Virology (1990) 176: 329-336). As 183 e 128 kD de pro-teínas são transladadas de RNA genômico, e são requeridas para replicaçãode vírus (Ishikawa et al., NucIeicAcids Res. (1986) 14: 8291-8308). A proteí-na de 30 kD é a proteína de movimento de célula a célula de vírus (Meshi etal., EMBO J. (1987) 6: 2557-2563). As proteínas de movimento e de reves-timento são transladadas de RNAs subgenômicos (Hunter et al., Nature(1976) 260: 759-760; Bruening et al., Virology (1976) 71: 498-517; Beachy etal., Virology (1976) 73: 498-507, cada um incorporado aqui por referência).
A representação esquemática de genomas de AIMV e TMV émostrada na figura 2. Os RNAs 1 e 2 de AIMV codificam proteínas replicaseP1 e P2, respectivamente; o RNA3 genômico codifica a proteína de movi-mento de célula a célula P3, e a proteína de revestimento viral (CP). A CP étransladada de RNA4 subgenômico sintetizado de RNA3 genômico. As pro-teínas de 126 kD e 183 kD de TMV são requeridas para replicação; a proteí-na de 30 kD é a proteína de movimento de célula a célula viral; e a proteínade 17 kD é a CP de vírus. A CP e a proteína de 30 kD são transladadas deRNAs subgenômicos. As setas indicam a posição de promotores subgenô-micos.
Transformação de Flor
Outros métodos que podem ser utilizados para introduzir um ge-ne que codifica uma proteína ou polipeptídeo de interesse em células deplanta incluem a transformação da flor da planta. A transformação de Arabi-dopsis thaliana pode ser alcançada pela imersão das flores da planta emuma solução de Agrobaeterium tumefaeiens (Curtis and Nam, TransgenieReseraeh (Agosto de 2001) 10 4:363-371; Qing et al., Molecular Breeding·.New Strategies in Plant Improvement (Fev 2000). (1):67-72). Plantas trans-formadas são formadas na população de sementes geradas pelas "plantasimersas". Em um ponto específico durante desenvolvimento da flor, um poroexiste na parede do ovário através da qual Agrobacterium tumefaciens ga-nha acesso ao interior do ovário. Uma vez no interior do ovário, o Agrobacte-ríum tumefaciens prolifera e transforma os óvulos individuais (Desfeux et al.,Plant Physiology (Julho de 2000) 123(3):895-904). Os óvulos transformadosseguem a trajetória típica de formação de semente no interior do ovário.Expressão Transiente Mediada por Aarobacterium
Conforme indicado aqui, em muitas concretizações da presenteinvenção, sistemas para expressão rápida (por exemplo, transiente) de pro-teínas ou polipeptídeos em plantas são desejáveis. Entre outras coisas, apresente invenção proporciona um sistema poderoso para alcançar tal ex-pressão rápida em plantas (particularmente em plantas jovens, por exemplo,brotos germinados) que utiliza um construto agrobacterial para distribuir umsistema de expressão viral que codifica a proteína ou polipeptídeo de inte-resse.
Especificamente, de acordo com a presente invenção, um "vetorde lançamento" é preparado para conter seqüências agrobacteriais incluindoseqüências de replicação e também conter seqüências virais de planta (in-cluindo seqüências de auto-replicação) que conduzem um gene que codificaa proteína ou polipeptídeo de interesse. O vetor de lançamento é introduzidono tecido da planta, preferivelmente por agro infiltração, que permite distribu-ição substancialmente sistêmica. Para transformação transiente, cópias deT-DNA não-integradas do vetor de lançamento permanecem transientemen-te presentes no núcleo, e são transcritas conduzindo a expressão dos genesde condução (Kapila et al., 1997). A expressão transiente mediada por Agro-bacterium, diferentemente dos vetores virais, não podem conduzir à difusãosistêmica da expressão do gene de interesse. Uma vantagem deste sistemaé a possibilidade de clonar genes maiores do que 2kb para gerar construtosque seriam impossíveis de obter com vetores virais (Voinnet et al,. 2003).Além disso, usando-se tal técnica, é possível transformar a planta com maisdo que um transgene, tal que proteínas multiméricas (por exemplo, subuni-dades de anticorpos de proteínas complexadas) podem ser expressas emontadas. Além disso, a possibilidade de co-expressão de transgenes múlti-plos por meio de co-infiltração com Agrobacterium diferente pode ser levadaem vantagem de, ou por infiltração separada, ou usando culturas misturadas.
Em certas concretizações, o vetor de lançamento inclui seqüên-cias que permitem seleção (ou pelo menos detecção) em Agrobacterium, etambém seleção/detecção em tecidos infiltrados. Além disso, o vetor de lan-çamento tipicamente inclui seqüências que são transcritas na planta paraproduzir produção de RNA viral, seguida por geração de proteínas virais.
Além disso, a produção de proteínas virais e RNA viral produz produção rá-pida de cópias múltiplas de RNA que codificam a proteína farmaceuticamen-te ativa de interesse. Tal produção resulta na produção de proteína rápida doalvo de interesse em um período relativamente curto de tempo. Desse modo,um sistema altamente eficiente para produção de proteína pode ser gerado.
A técnica de agro infiltração utilizando vetores de expressão viralpode ser usada para produzir quantidade limitada de proteína de interessede modo a verificar os níveis de expressão antes de se decidir se vale à pe-na gerar plantas transgênicas. Alternativa ou adicionalmente, a técnica deagro infiltração utilizando vetores de expressão viral é útil para geração rápi-da de plantas capazes de produzir vastas quantidades de proteína comouma plataforma de produção primária. Desse modo, este sistema de expres-são transiente pode ser usado em escala industrial.
Adicionalmente providos são qualquer de uma variedade deplasmídeos Agrobacteriais diferentes, plasmídeos binários, ou derivadosdestes, tais como pBIV, pBI1221, pGreen, etc, que podem ser usados nestese outros aspectos da invenção. Numerosos vetores adequados são conheci-dos na técnica, e podem ser direcionados e/ou modificados de acordo commétodos conhecidos na técnica, ou aqueles descritos aqui de modo a seutilizar nos métodos descritos aqui providos.
A figura 18 apresenta um diagrama esquemático de um vetor delançamento exemplar particular, pBID4. Este vetor contém o promotor 35Sde vírus de mosaico de couve-flor (um vírus de planta de DNA) que aciona atranscrição inicial do genoma viral recombinante em seguida a introduçãonas plantas, e o terminador nos, o terminador transcricional de Agrobaeteri-um napolina sintase. O vetor adicionalmente contém seqüências do genomade vírus de mosaico de tabaco incluindo genes para replicação de vírus(126/183K) e movimento de célula a célula (MP). O vetor adicionalmentecontém um gene que codifica um polipeptídeo de interesse, inserido em umlocal de clonagem único no interior das seqüências de genoma de vírus demosaico de tabaco, e sob o controle transcricional do promotor mRNA sub-genômico de proteína de revestimento. Devido a este "gene-alvo" (isto é,gene que codifica uma proteína ou polipeptídeo de interesse) substituir se-qüências de codificação para a proteína de revestimento de TMV, o vetorviral resultante é RNA de auto-replicação exposto que é menos submetido àrecombinação do que vetores contendo CP, e que não podem eficaz se es-palhar e sobreviver no ambiente. Seqüências limite esquerda e direita (LB eRB) delimitam a região do vetor de lançamento que é transferido em célulasde planta em seguida a infiltração de plantas com Agrobacterium recombi-nante que conduz o vetor. Após introdução de agrobactéria que conduz estevetor no tecido da planta (tipicamente por agro infiltração, mas alternativa-mente por injeção, ou outros meios), cópias de DNA de trançado simplesmúltiplas (ssDNA) de seqüência entre LB e RB são geradas e liberadas emcerca de minutos. Estas seqüências introduzidas são então amplificadas porreplicação viral. A translação do gene-alvo resulta no acúmulo de grandesquantidades de proteína ou polipeptídeo-alvo em um curto período de tempo.
Em algumas concretizações da invenção, a expressão transientemediada por Agrobacterium produz até cerca de 5 g ou mais de proteína-alvo por kg de tecido de planta. Por exemplo, em algumas concretizações,até cerca de 4, 3, 2, 1 ou 0,5 g de proteína-alvo é produzido por kg de tecidode planta. Em algumas concretizações, pelo menos cerca de 20-500 mg, oucerca de 50-500 de proteína-alvo, ou cerca de 50-200, ou cerca de 50, 60,70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou cerca de200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900,950, 1000, 1500, 1750, 2000, 2500, 3000 mg, ou mais de proteína por kg detecido de planta, é produzido.
Em algumas concretizações da invenção, estes níveis de ex-pressão são alcançados dentro de cerca de 6, 5, 4, 3 ou 2 semanas de infil-tração. Em algumas concretizações, estes níveis de expressão são alcança-dos dentro de cerca de 10, 7, 5, 4, 3, 2 dias, ou mesmo 1 dia de introduçãodo construto de expressão. Desse modo, o tempo de introdução (por exem-plo, infiltração) para colher é tipicamente menor do que cerca de 2 semanas,10 dias, 1 semana, ou menos. Além disso, um aspecto muito atrativo destaconcretização da invenção é que ela permite produção de proteínas dentrode cerca de 8 semanas ou menos a partir da seleção de seqüência de aminoácido (mesmo incluindo tempo para estudos de expressão "preliminares").Também, cada batelada de proteína pode tipicamente ser produzida dentrode cerca de 8 semanas, 6 semanas, 5 semanas, ou menos. Aqueles versa-dos na técnica apreciarão que estes números podem variar algum tanto de-pendendo do tipo de planta usado. Muitos brotos, incluindo ervilhas, cairãodentro dos números dados. Nicotiana benthamiana, contudo, podem sercrescidas mais longas, particularmente antes da infiltração, visto que elas sedesenvolvem mais vagarosamente (de uma semente muito pequena). Ou-tros ajustes esperados tornar-se-ão claros àqueles versados na técnica ba-seados na biologia das plantas particulares utilizadas.
Os inventores também verificaram que várias plantas Nicotianasão particularmente úteis na prática deste aspecto da invenção, incluindo emparticular Nicotiana benthamiana. Será compreendido por aqueles versadosna técnica que plantas Nicotiana não são geralmente consideradas serem"brotos". Não obstante, a presente invenção ensina que plantas jovens Nieo-tiana (particularmente plantas jovens Nieotiana benthamiana) são úteis naprática da invenção. Em geral, na prática desta concretização da invenção,plantas Nieotiana benthamiana são crescidas por um tempo suficiente parapermitir desenvolvimento de uma quantidade apropriada de biomassa antesda infiltração (isto é, para distribuição de agrobactéria contendo o vetor delançamento). Tipicamente, as plantas são crescidas por um período de maisdo que cerca de 3 semanas, mais tipicamente mais do que cerca de 4 se-manas, ou entre cerca de 5-6 semanas para acumular biomassa antes dainfiltração.
Os presentes inventores verificaram surpreendentemente adi-cionalmente que, embora ambas seqüências de TMV e AIMV possam secomprovarem eficazes em tais construtos de vetor de lançamento, em algu-mas concretizações, seqüências de AIMV são particularmente eficientes emassegurar alto nível de produção de proteína ou polipeptídeos distribuídos.
Desse modo, em certas concretizações particulares da presenteinvenção, proteínas ou polipeptídeos de interesse são produzidos em plan-tas de ervilha jovens, ou plantas jovens Nicotiana (por exemplo, Nicotianabenthamiana) de um vetor de lançamento que direciona produção de se-qüências de AIMV conduzindo o gene de interesse.
Construtos de Expressão
Muitas características de construtos de expressão úteis de acor-do com a presente invenção serão específicas ao sistema de expressão par-ticular usado, conforme discutido acima. Contudo, certos aspectos que po-dem ser aplicáveis através de sistemas de expressão diferentes são discuti-dos em detalhe adicional aqui.
Para dar, mas um exemplo, em muitas concretizações da pre-sente invenção, será desejável que a expressão da proteína ou polipeptídeo(ou ácido nucléico) de interesse seja induzível. Em muitas tais concretiza-ções, a produção de um RNA que codifica a proteína ou polipeptídeo de inte-resse (e/ou produção de um RNA de anti-sentido) está sob o controle de umpromotor induzível (por exemplo, exogenamente induzível). Promotores exo-genamente induzíveis são propensos a aumentar ou diminuir a expressão deuma transcrição em resposta a um estímulo externo, preferivelmente do queinterno. Um número de fatores ambientais pode agir como tal estímulo ex-terno. Em certas concretizações da invenção, a transcrição é controlada porum promotor induzível de calor, tal como um promotor de choque de calor.
Promotores externamente induzíveis podem ser particularmenteúteis no contexto de ajustes de crescimento reguláveis controlados. Por e-xemplo, usando-se um promotor de choque de calor, a temperatura de umambiente contido pode simplesmente ser elevada para induzir expressão datranscrição relevante. Será apreciado, naturalmente, que um promotor indu-zível de calor nunca pode ser usado ao ar livre porque a temperatura no ex-terior não pode ser controlada. O promotor seria ligado a qualquer hora quea temperatura exterior se elevasse acima de um certo nível. Similarmente, opromotor seria desligado toda hora que a temperatura externa caísse. Taisalterações de temperatura podem ocorrer em um único dia, por exemplo,ligando a expressão no dia e desligando a noite. Um promotor induzível decalor, tal como aquele aqui descrito, do mesmo modo, não seria mesmo prá-tico para uso em uma estufa, que é susceptível a alterações climáticas paraquase o mesmo grau conforme os exteriores. O crescimento de plantas ge-ralmente projetadas em uma estufa é muito custoso. Em contraste, no pre-sente sistema, muita variável pode ser controlada de modo que a quantidademáxima de expressão pode ser alcançada com toda colheita.
Outros promotores externamente induzíveis que podem ser utili-zados de acordo com a presente invenção incluem promotores indizíveis deluz. Os promotores induzíveis de luz podem ser mantidos como promotoresconstitutivos se a luz no ambiente regulável contido está sempre ligada. Al-ternativamente, a expressão da transcrição relevante pode ser ligada em umtempo particular durante desenvolvimento ligando-se simplesmente a luz.
Em ainda outras concretizações, um promotor quimicamenteinduzível é usado para induzir expressão da transcrição relevante. De acor-do com estas concretizações, o químico pode simplesmente ser misturadoou pulverizado em uma semente, embrião, ou planta jovem (por exemplo,broto) para induzir expressão da transcrição relevante. A pulverização e e-nevoamento podem ser precisamente controladas e direcionadas em umasemente particular, embrião, ou planta jovem (por exemplo, broto) conformedesejado. Um ambiente contido é destituído de vento ou correntes de ar, quepodem dispersar o químico para fora do recipiente pretendido, de modo queo químico fica no recipiente para o qual ele era pretendido.
Ambientes de CrescimentoUm aspecto da presente invenção é a produção de proteínas oupolipeptídeos (e/ou ácidos nucléicos) em plantas sob condições de cresci-mento reguladas controladas. De acordo com a presente invenção, uma ca-racterística atrativa associada com produção de proteínas ou polipeptídeosem plantas jovens (por exemplo, brotos germinados) é que tempos de cres-cimento reduzidos são requeridos do que seriam utilizados se o mesmo tipode planta fosse desenvolvido a idade adulta. Além disso, em muitos exem-plos, espaços menores podem ser utilizados do que seriam requeridos seplantas fossem desenvolvidas a seu tamanho adulto total. Em geral, o cres-cimento de plantas que expressam proteínas ou polipeptídeos farmacêuticosem um ambiente regulável controlado proporciona um produto farmacêuticomais rápido (porque as plantas são colhidas mais jovens), e com menos es-forço, risco, e considerações regulatórias do que o desenvolvimento de plan-tas geneticamente projetadas. Um ambiente regulável contido usado na pre-sente invenção reduz ou elimina o risco de plantas de polinização cruzadana natureza.
Em muitas concretizações da invenção, proteínas ou polipeptí-deos são expressos em plantas crescidas em um sistema encerrado. Talsistema evita risco de contaminação ambiental, e também proporciona am-biente reproduzível regulável capaz de alcançar resultados comparáveis re-petidos. Além disso, tal sistema permite indução controlada de expressão deproteína ou polipeptídeo onde desejado, por exemplo, através do uso de umpromotor induzível, ou outra característica regulável conforme descrito aqui.
Em certas concretizações da presente invenção, as plantas sãocrescidas em um ambiente regulável contido. Em algumas concretizações, oambiente regulável contido é uma unidade de alojamento ou ambiente queas sementes podem ser crescidas internamente. Todos os fatores ambien-tais do ambiente regulável contido podem ser controlados. Desde que osbrotos não requeiram luz para crescer, e iluminação pode ser custosa, emuma concretização particular, as plantas são crescidas (por exemplo, ao es-tágio de broto germinado) internamente na ausência de luz.
Outros fatores ambientais que podem ser regulados em um am-biente regulável contido da presente invenção incluem temperatura, umida-de, água, nutrientes, gás (por exemplo, teor de O2 ou CO2, ou circulação dear), químicos (moléculas pequenas, tais como açúcares e derivados de açú-car, ou hormônios, tais como os fitohormônios giberélico ou ácido absísico,etc), e similares.
Em muitas concretizações da invenção, plantas são crescidashidroponicamente. Os sistemas de crescimento hidropônicos oferecem umnúmero de vantagens. Por exemplo, sistemas de crescimento hidropônicosrequerem menos espaço do que sistemas baseados em solo para desenvol-ver o mesmo número de plantas. Nutrientes ou outros agentes podem tipi-camente serem escoados através de um sistema hidropônico, tornando ocrescimento controlado mais fácil de acompanhar do que nos sistemas ba-seados em solo. Muitos aspectos do crescimento hidropônico podem serautomáticos. Além disso, a colheita de plantas que crescem hidroponica-mente é trivial. As plantas podem ser colhidas simplesmente pela elevaçãode sua solução de crescimento. Nenhuma limpeza é requerida na hora dacolheita. Sendo capaz de colher plantas jovens (por exemplo, brotos germi-nados) diretamente de um ambiente hidropônico sem lavagem ou esfrega-mento, minimizando-se a quebra do material colhido. A quebra e definha-mento de plantas induzem apoptose. Durante apoptose, certas enzimas pro-teolíticas tornam-se ativas, que podem degradar uma proteína ou polipeptí-deo farmacêutico expressos no broto germinado, resultando na atividadeterapêutica diminuída da proteína. A proteólise induzida por apoptose podediminuiu significantemente a produção de proteína de plantas maduras. U-sando-se os métodos da presente invenção, a apoptose é preferivelmentenunca induzida (isto é, a apoptose é evitada), por exemplo, porque nenhumacolheita ocorre até o momento das proteínas serem extraídas da planta.
Em certas concretizações, da presente invenção, plantas (porexemplo, brotos germinados) são crescidas em bandejas que podem serirrigadas, pulverizadas, ou enevoadas em qualquer tempo durante desenvol-vimento. Por exemplo, a bandeja pode ser assentada com um ou mais apa-relhos de irrigação, pulverização, enevoamento e drenagem que podem dis-tribuir e/ou remover água, nutrientes, químicos, etc., no tempo específico, eem quantidades precisas durante desenvolvimento do broto germinado. Porexemplo, as sementes requerem umidade suficiente para mantê-las úmidas.
A umidade em excesso drena através de furos nas bandejas nos drenos nosolo do ambiente. Preferivelmente, a água de drenagem é tratada conformeapropriado para remoção de químicos nocivos antes da descarga de volta noambiente.
Outra vantagem de bandejas é que elas podem estar contidasdentro de um espaço muito pequeno. Desde que nenhuma luz é requeridapara plantas jovens (por exemplo, brotos germinados) crescerem, as bande-jas contendo sementes, embriões ou plantas jovens (por exemplo, brotosgerminados) podem ser apertadamente empilhadas verticalmente uma sobrea outra, proporcionando uma grande quantidade de biomassa por unidadeespaço de solo em uma facilidade de alojamento construída especificamentepara esta proposta. Em adição, as pilhas de bandejas podem ser dispostasem séries horizontais dentro de uma unidade de alojamento. Uma vez queos brotos tenham crescido a um estágio apropriado para colheita (por exem-plo, cerca de dois a quatorze dias ou mais, dependendo do tipo de planta, daproteína ou polipeptídeo a ser produzido, etc), as bandejas individuais sãomovidas em uma facilidade de processamento, ou manualmente ou por mei-os automáticos, tal como uma correia transportadora.
Uma variedade de aspectos de condições de crescimento e téc-nicas aplicáveis à prática da presente invenção serão prontamente aparenteàqueles versados na técnica. Por exemplo, quando um sistema de expres-são induzível é utilizado, o tempo no qual a expressão é induzida pode dese-javelmente ser selecionado para maximizar a expressão da proteína ou poli-peptídeo de interesse na planta jovem pelo tempo de colheita. A indução deexpressão em um embrião em um estágio particular de crescimento (por e-xemplo, em um número particular de dias após germinação), pode resultarem produção máxima da proteína ou polipeptídeo de interesse no tempo decolheita. Por exemplo, a indução de expressão a partir do promotor 4 diasapós germinação pode resultar em mais síntese de proteína do que induçãode expressão a partir do promotor após 3 dias ou após 5 dias. Aqueles ver-sados na técnica apreciarão que a maximização da expressão pode ser al-cançada por experimentação de rotina. Em concretizações preferidas, plan-tas jovens, particularmente brotos germinados, são colhidos em cerca de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11 ou 12 dias após germinação. Em outras concreti-zações, particularmente plantas Nicotiana, são crescidas por várias semanasapós germinação.
Quando um sistema de expressão constitutivo preferivelmentedo que um sistema de expressão induzível é utilizado, plantas jovens podemser colhidas há um certo tempo após introdução de seqüências de codifica-ção. Por exemplo, se um broto germinado fosse viralmente transformado emum estágio anterior de desenvolvimento (por exemplo, no estágio de embri-ão), os brotos germinados podem ser colhidos em um tempo quando ex-pressão está em sua pós-transformação máxima, por exemplo, em cerca de1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias pós-transformação. Podetambém ser que plantas jovens (por exemplo, brotos) se desenvolvam um,dois, três ou mais meses pós-transformação, dependendo da germinação dasemente.
Geralmente, uma vez que a expressão da proteína farmacêuticase inicia, as sementes, embriões ou plantas jovens (por exemplo, brotosgerminados) são permitidos crescerem até que níveis suficientes de proteínaou polipeptídeo farmacêutico de interesse sejam expressos. Em certas con-cretizações, níveis suficientes são níveis que proporcionariam um benefícioterapêutico a um paciente se a biomassa colhida fosse material em brutoingerido. Alternativamente, níveis suficientes são níveis dos quais a proteínaou polipeptídeo farmacêutico pode ser concentrado ou purificado a partir dabiomassa e formulado em uma composição farmacêutica que proporcionaum benefício terapêutico a um indivíduo após administração.
Em certas concretizações, uma vez que a expressão da proteínafarmacêutica é induzida, crescimento é permitido continuar até o estágio debroto germinado, em cujo tempo os brotos germinados são colhidos. Emuma concretização particularmente preferida, os brotos germinados são co-lhidos vivos. Os brotos germinados de colheita viva têm várias vantagens,incluindo esforço e quebra mínimos.
Entre outras coisas, a presente invenção proporciona um siste-ma único que, por sua vez, proporciona biomassa de planta jovem contendoaltos níveis de proteína ou polipeptídeo expresso (e/ou ácido nucléico) deinteresse. Se diretamente consumido ou processado na forma de uma com-posição farmacêutica, quando plantas jovens (por exemplo, brotos germina-dos) são crescidos em ambiente regulável contido, a biomassa de plantae/ou composição farmacêutica derivada a partir da biomassa pode ser provi-da a um consumidor em baixo custo. Em adição, o fato que as condiçõespara crescimento das plantas jovens podem ser controladas torna a qualida-de e pureza do produto consistentes. O ambiente regulável contido da in-venção também torna óbvio muitas regulações seguras da EPA que podeimpedir cientistas de desenvolverem produtos agriculturais geneticamenteprojetados ao ar livre.
Preparações de Proteína/Polipeptídeo
A presente invenção proporciona várias preparações e formula-ções de proteínas ou polipeptídeos (e/ou ácidos nucléicos ativos) produzidasem plantas jovens.
Em algumas concretizações da invenção, proteínas ou polipeptí-deos produzidos não são isolados do tecido da planta, mas preferivelmentesão providos no contexto de plantas jovens vivas (por exemplo, brotos ger-minados). Em algumas concretizações, onde a planta é comestível, o tecidoda planta contendo proteína ou polipeptídeo expresso é provido diretamentepara consumo. Desse modo, a presente invenção proporciona biomassa deplanta jovem comestível (por exemplo, brotos germinados comestíveis) con-tendo proteína ou polipeptídeo expresso.
Onde plantas jovens comestíveis (por exemplo, brotos germina-dos) expressam níveis suficientes de proteínas ou polipeptídeos farmacêuti-cos, e são consumidas vivas, em algumas concretizações absolutamentenenhuma colheita ocorre antes dos brotos germinados serem consumidos.Desse modo, é garantido que não existe quebra proteolítica induzida pelacolheita da proteína farmacêutica antes da administração da proteína farma-cêutica a um paciente em necessidade de tratamento. Por exemplo, plantasjovens (por exemplo, brotos germinados) que estão prontas para serem con-sumidas podem ser distribuídas diretamente a um paciente. Alternativamen-te, sementes geneticamente projetadas ou embriões são distribuídos a umpaciente em necessidade de tratamento e desenvolvidos ao estágio de brotogerminado pelo paciente. Em uma concretização, um suprimento de brotosgerminados geneticamente projetados é provido a um paciente, ou a ummédico que estará tratando os pacientes, de modo que um estoque contínuode brotos germinados que expressam certas proteínas farmacêuticas dese-jáveis pode ser cultivado. Isto pode ser particularmente valioso para popula-ções em países em desenvolvimento, onde farmacêuticos custosos são ofe-recidos ou distribuídos. A facilidade com qual os brotos germinados da in-venção podem ser crescidos torna os brotos germinados da presente inven-ção particularmente desejáveis para tal população em desenvolvimento.
Em algumas concretizações, a biomassa de planta é processadaantes do consumo ou formulação, por exemplo, por homogeneização, tritu-ração, secagem, ou extração. Em algumas concretizações, a proteína oupolipeptídeo expresso é isolado ou purificado a partir da biomassa, e formu-lado em uma composição farmacêutica.
Por exemplo, plantas jovens vivas (por exemplo, brotos) podemser moídas, trituradas ou misturadas para produzir uma pasta fluida de bio-massa, em inibidores de protease contendo tampão. Preferivelmente o tam-pão está a cerca de 4°C. Em certas concretizações, a biomassa é seca a ar,pulverizada seca, congelada, ou congelada seca. Como em plantas imunes,alguns destes métodos, tal como secagem a ar, podem resultar em umaperda de atividade da proteína ou polipeptídeo farmacêutico. Contudo, devi-do às plantas utilizadas (por exemplo, brotos germinados) serem muito pe-quenas e tipicamente terem uma grande área superficial em razão de volu-me, isto é muito menos provável de ocorrer. Aqueles versados na técnicaapreciarão que muitas técnicas para colheita da biomassa que minimizam aproteólise da proteína ou polipeptídeo farmacêutico são disponíveis e podemser aplicadas a presente invenção.
Administração e Composições Farmacêuticas
A presente invenção proporciona plantas jovens que expressamuma proteína ou polipeptídeo farmaceuticamente ativo que mantém sua ati-vidade farmacêutica quando administrado a um hospedeiro em necessidadedeste. Hospedeiros preferidos incluem vertebrados, preferivelmente mamífe-ros, mais preferivelmente seres humanos. De acordo com a presente inven-ção, os hospedeiros incluem indivíduos veterinários, tais como bovinos, ovi-nos, caninos, felinos, etc. Em concretizações preferidas, um broto comestívelé administrado oralmente a um indivíduo em uma quantidade terapeutica-mente eficaz. Em outras concretizações preferidas, a proteína farmaceuti-camente ativa é provida em uma preparação farmacêutica, conforme descri-to aqui.
As preparações farmacêuticas da presente invenção podem seradministradas em uma ampla variedade de modos ao hospedeiro, tais como,por exemplo, oral, enteral, nasal, parenteral, intramuscular ou intravenosa-mente, retal, vaginal, tópica, ocular, pulmonarmente, ou por aplicação decontato. Em uma concretização preferida, uma proteína farmacêutica ex-pressa em uma planta jovem (por exemplo, um broto) é administrada a umhospedeiro oralmente. Em outra concretização preferida, uma proteína far-maceuticamente ativa expressa em uma planta jovem (por exemplo, em umbroto) é extraída e/ou purificada, e usada para a preparação de uma compo-sição farmacêutica. As proteínas são isoladas e purificadas de acordo comcondições e técnicas convencionais conhecidas na técnica. Estas incluemmétodos, tais como extração, precipitação, cromatografia, cromatografia deafinidade, eletroforese, e similares.
As composições da presente invenção incluem tipicamente umaquantidade eficaz de uma proteína ou polipeptídeo farmaceuticamente ativojunto com um ou mais materiais veículo farmaceuticamente adequados, or-gânicos ou inorgânicos, líquidos ou sólidos.
Uma proteína farmaceuticamente ativa produzida de acordo coma presente invenção pode ser empregada em formas de dosagens, tais co-mo, comprimidos, cápsulas, pastilhas, dispersões, suspensões, soluções,cápsulas, cremes, ungüentos, aerossóis, pacotes de pó, soluções líquidas,solventes, diluentes, agentes ativos de superfície, agentes isotônicos, agen-tes de espessamento ou emulsificante, conservantes, ligações sólidas con-siderando-se que a atividade biológica da proteína não seja destruída por talforma de dosagem.
Exemplos de materiais que podem servir como veículos farmaceutica-mente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, açúcares, tais comolactose, glicose e sacarose, amidos, tais como amido de milho e amido debatata; celulose e seus derivados, tais como sódio carboximetil celulose, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte, gelatina; talco; ex-cipientes, tais como manteiga de cacau e ceras de supositório; óleos, taiscomo óleo de amendoim, óleo de semente de algodão; óleo de girassol; óleode gergelim; óleo de oliva; óleo de milho e óleo de soja; glicóis, tal comopropileno glicol; ésteres, tais como oleato de etila e Iaurato de etila; ágar;agentes de tamponamento, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido dealumínio; ácido algínico; água livre de pirogênio; solução solução salina iso-tônica; solução de Ringer; álcool etílico, e soluções tampão de fosfato, bemcomo outros lubrificantes não-tóxicos, tais como Iauril sulfato de sódio e es-tearato de magnésio, bem como agentes colorantes, agentes de liberação,agentes de revestimento, agentes de adoçamento, agentes aromatizantes, eagentes perfumantes, conservantes, e antioxidantes, podem também estarpresentes na composição, de acordo com o julgamento do formulador (vertambém Remington1S Pharmaceutical Sciences, Décima Quinta Edição, E.W. martin (Mack Publishing Co., Easton PA, 1975). Por exemplo, a proteínapode ser provida como uma composição farmacêutica por meio de proces-sos convencionais de produção de granulação por mistura, dissolução, Iiofili-zação, ou processos similares.
Em certas concretizações pode ser desejável prolongar o efeitode uma preparação farmacêutica pelo abaixamento da absorção da proteínaou polipeptídeo farmacêutico que é subcutâneamente ou intramuscular inje-tado. Isto pode ser acompanhado pelo uso de uma suspensão líquida dematerial cristalino ou amorfo com pobre solubilidade em água. A taxa de ab-sorção da proteína ou polipeptídeo depende de sua taxa de dissolução que,por sua vez, pode depender do tamanho e forma.
Alternativamente, absorção retardada de uma proteína parente-ralmente administrada é acompanhada pela dissolução ou suspensão daproteína em um veículo de óleo. Formas de depósito injetáveis são produzi-das pela formação de matrizes microencapsuladas da proteína em polímerosbiodegradáveis, tais como polilactide-poliglicolide. Dependendo da razão deproteína para polímero e da natureza do polímero particular empregado, ataxa de liberação pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biode-gradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). Formulações injetáveisde depósito são também preparadas pela retenção da proteína em Iiposso-mas ou microemulsões, que são compatíveis com os tecidos do corpo.
Preparações de proteína ou polipeptídeo enteralmente adminis-tradas podem ser introduzidas na forma sólida, semi-sólida, de suspensãoou de emulsão, e podem ser compotas com quaisquer veículos farmaceuti-camente aceitáveis, tais como água, agentes de suspensão, e agentes deemulsificação. As proteínas e polipeptídeos da invenção podem também se-rem administrados por meio de bombas ou formas de liberação sustentadas,especialmente quando administrados como uma medida preventiva, de mo-do a prevenir o desenvolvimento de uma doença em um indivíduo, ou melho-rar ou retardar uma doença já estabelecida.
As proteínas ou polipeptídeos produzidos de acordo com a pre-sente invenção são particularmente bem-adequados para administração oralcomo composições farmacêuticas. As plantas jovens colhidas (por exemplo,brotos) podem ser administradas vivas, ou podem ser processadas em umavariedade de modos, por exemplo, secagem a ar, secagem por congelamen-to, extração, etc., dependendo das propriedades do produto de proteína oupolipeptídeo desejado, e da forma desejada do produto final.
Em certas concretizações, tais composições conforme descritasacima são ingeridas oralmente somente, ou ingeridas juntas com alimenta-ção ou alimento, ou com uma bebida. As composições para administraçãooral incluem brotos germinados; extração das plantas jovens (por exemplo,brotos germinados), e proteínas ou polipeptídeos purificados de plantas jo-vens providas como pós secos, produtos alimentícios, solventes aquosos ounão-aquosos, suspensões ou emulsões.
Exemplos de solventes não-aquosos são propileno glicol, polieti-Ieno glicol, óleo vegetal, óleo de peixe, e ésteres orgânicos injetáveis.Transportadores aquosos incluem água, soluções de água-álcool, emulsõesou suspensões, incluindo solução salina e veículos parenterais mediais tam-ponados, incluindo solução de cloreto de sódio, solução de dextrose de Rin-ger, solução de dextrose mais cloreto de sódio, solução de Ringer contendoIactose, ou óleos fixados.
Exemplos de pós secos incluem qualquer biomassa de plantajovem (por exemplo, brotos germinados) que foi secada, por exemplo, seca-das por congelamento, secada em ar, ou secada por pulverização. Por e-xemplo, plantas jovens podem ser secadas por colocação das mesmas emum secador de ar comercial a cerca de 120 graus Fahrenheit até que a bio-massa contenha menos do que 5% de umidade por peso. As plantas secassão armazenadas para processamento adicional como sólidos de massa, ouadicionalmente processadas por moagem a um pó de tamanho de malhadesejado. Alternativamente, secagem por congelamento pode ser usada pa-ra produtos que são sensíveis a secagem por ar. Os produtos podem sersecados por congelamento pela colocação dos mesmos em um secador avácuo, e secados congelados sob um vácuo até que a biomassa contenhamenos do que 5% de umidade por peso. O material seco pode ser adicio-nalmente processado conforme descrito aqui.
Preparações herbáceas são bem-conhecidas na técnica. Aspreparações herbáceas que podem ser usadas para administrar plantas jo-vens da presente invenção incluem preparações herbáceas líquidas e sóli-das. Alguns exemplos de preparações herbáceas incluem tinturas, extratos(por exemplo, extratos aquosos, extratos de álcool), decocção, preparaçõessecas (por exemplo, secadas a ar, secadas por pulverização, ou secadaspor congelamento), pós, (por exemplo, pó liofilizado), e líquido. Preparaçõesherbáceas podem ser providas em qualquer veículo de distribuição padrão,tais como uma cápsula, comprimido, supositório, dosagem líquida, etc. A-queles versados na técnica apreciarão as várias formulações e modalidadesde distribuição de preparações herbáceas que podem ser aplicadas a pre-sente invenção.
Aquele versado na técnica apreciará que um método particular-mente preferido de obtenção da proteína ou polipeptídeo farmaceuticamenteativo desejado é por extração. Plantas jovens frescas (por exemplo, brotos)podem ser extraídas para remover os produtos de proteína desejados a par-tir da biomassa residual, aumentando, desse modo, a concentração e purezado produto. As plantas jovens podem também serem extraídas em uma so-lução tamponada. Por exemplo, as plantas colhidas frescas podem ser trans-feridas em uma quantidade de água resfriada com gelo a uma razão de umpara um por peso que tenha sido tamponado com, por exemplo, tampão defosfato. Inibidores de protease podem também serem adicionados conformerequerido. O tecido de planta pode ser rompido por mistura ou moagem vigo-rosas enquanto suspenso na solução tampão, e a biomassa externa removi-da por filtração ou centrifugação. O produto de proteína conduzido em solu-ção pode ser adicionalmente purificado por etapas adicionais, ou convertidoa um pó seco por secagem por congelamento, ou precipitação.
A extração pode também ser realizada por prensagem. As plan-tas vivas podem ser extraídas por prensagem em uma prensa, ou sendo tri-turadas à medida que elas são passadas através de rolos proximamenteespaçados. Os fluidos expressos a partir das plantas trituradas são coleta-dos e processados de acordo com métodos bem-conhecidos na técnica. Aextração por prensagem permite a liberação dos produtos em uma formamais concentrada. Contudo, o rendimento total do produto pode ser maisbaixo do que se o produto fosse extraído em solução.
As plantas jovens (por exemplo, brotos germinados), extrações,pós, preparações secas e produtos de proteína purificados, etc., podemtambém estarem na forma encapsulada com ou sem um ou mais excipientesconforme notado acima. Formas de dosagem sólidas de comprimidos, drá-geas, cápsulas, pílulas e grânulos podem ser preparadas com revestimentose invólucros, tais como revestimentos entéricos, revestimentos de liberaçãocontrolada, e outros revestimentos bem-conhecidos na técnica de formula-ção farmacêutica. Em tais formas de dosagem sólida a proteína farmacêuti-ca ativa pode ser misturada com pelo menos um diluente inerte, tal comosacarose, Iactose ou amido. Tais formas de dosagem podem também com-preender, conforme é prática normal, substâncias adicionais outras do quediluentes inertes, por exemplo, lubrificantes de comprimido e outros auxilia-res de comprimido, tais como um estearato de magnésio e celulose micro-cristalina. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as formas de dosa-gem podem também compreender agentes de tamponamento. Elas podemopcionalmente conter agentes de opacidade, e podem também serem deuma composição que elas liberam o(s) ingrediente(s) ativo(s) somente, oupreferencialmente, em uma certa parte do trato intestinal, opcionalmente, emuma maneira retardada. Exemplos de composições de encrustação que po-dem ser usadas incluem substâncias poliméricas e ceras.
Em outras concretizações, uma planta jovem expressando umaproteína farmaceuticamente ativa da presente invenção ou biomassa de talplanta jovem é administrada oralmente como alimento medicinal. Tais com-posições comestíveis são consumidas como produto em bruto de comer, seem uma forma sólida, ou por bebida, se na forma líquida. Em uma concreti-zação preferida, o material de planta é diretamente ingerido sem uma etapade processamento anterior, ou após preparação culinária mínima. Por e-xemplo, a proteína ou polipeptídeo farmaceuticamente ativo é expresso emum broto do qual pode ser comido diretamente. Por exemplo, a proteína éexpressa em um broto de alfafa, broto de munguba, ou broto de espinafre,ou broto de folha de alface, uma planta de ervilha jovem, etc. Em uma con-cretização alternativa, a biomassa de broto germinado é processada, e omaterial recuperado após a etapa de processamento é ingerido.
Métodos de processamento preferivelmente usados na presenteinvenção são métodos comumente usados na indústria de alimento e de ali-mentação. Os produtos finais de tais métodos ainda incluem uma quantidadesubstancial da proteína ou polipeptídeo farmaceuticamente ativo expresso, esão, preferivelmente, convenientemente comidos ou bebidos. O produto finalpode também ser misturado com outro alimento ou formas de alimentação,tais como sais, veículos, intensificadores de sabor, antibióticos, e similares, econsumidos na forma sólida, semi-sólida, de suspensão, de emulsão, oulíquida. Em outra concretização preferida, tais métodos incluem uma etapade conservação, tal como, por exemplo, pasteurização, cozimento, ou adiçãode agentes de conservação e de preservação.
Qualquer planta é usada e processada na presente invençãopara produzir matéria de planta comível ou bebível. A quantidade de proteí-na farmaceuticamente ativa em uma preparação de broto comível ou bebívelpode ser testada por métodos padrões na técnica, por exemplo, eletroforesede gel, Elisa, ou análise de mancha de Western, usando-se um anticorpoespecífico para a proteína. Esta determinação pode ser usada para padroni-zar a quantidade de proteína ingerida. Por exemplo, a quantidade de proteí-na terapeuticamente ativa em um suco de broto determinado e regulado, porexemplo, por mistura de bateladas de produto tendo níveis eficientes de pro-teína de modo que a quantidade de suco a ser bebida para ingerir uma dosesimples pode ser padronizada. O uso de um ambiente regulável contido deacordo com a presente invenção, contudo, deve minimizar a necessidade deefetuar tais procedimentos de padronização.
Uma proteína ou polipeptídeo farmaceuticamente ativo produzi-do em uma planta jovem (por exemplo, em um broto de semente) e comidopor um hospedeiro, é absorvido pelo sistema digestivo. Uma vantagem daingestão de um broto germinado ou preparação de broto germinado, particu-larmente brotos intactos ou biomassa de broto que foram somente minima-mente processados, é proporcionar encapsulamento ou seqüestro da proteí-na em células da planta. Desse modo, a proteína pode receber pelo menosalguma proteção de digestão no trato digestivo superior antes de alcançar ointestino, e uma proporção mais alta de ativo seria disponível para percep-ção.
As composições farmacêuticas da presente invenção podem seradministradas terapêutica ou profilaticamente. Em certas concretizações pre-feridas, as composições podem ser usadas para tratar ou prevenir (por e-xemplo, para retardar começo de) uma doença. Por exemplo, qualquer indi-víduo que sofre de uma doença, ou que está em risco de desenvolver umadoença, pode ser tratado. Será apreciado que um indivíduo pode ser consi-derado em risco de desenvolver uma doença sem ter sido diagnosticadocom quaisquer sintomas da doença. Por exemplo, se o indivíduo tem ummarcador genético particular identificado como sendo associado com riscoaumentado de desenvolver uma doença particular, este indivíduo será con-siderado em risco de desenvolver a doença. Similarmente, se membros deuma família de indivíduos foram diagnosticados com uma doença particular,por exemplo, câncer, o indivíduo pode ser considerado estar em risco dedesenvolver esta doença.
As formas de dosagem líquida para administração oral incluem,mas não estão limitadas a, emulsões farmaceuticamente aceitáveis, micro-emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires. Em adição as proteínaou polipeptídeo de interesse, as formas de dosagem líquida podem conterdiluentes inertes comumente usados na técnica, tais como, por exemplo,água ou outros solventes, agentes de solubilização e emulsificantes, taiscomo álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila,álcool benzílico, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, di-metilformamida, óleos (em particular, óleo de semente de algodão, óleo deamendoim, óleo de milho, óleo de germe, óleo de oliva, óleo de rícino, e óleode gergelim), glicerol, álcool tetrahidrofurano, polietileno glicóis e ésteres deácido graxo de sorbitano, e misturas destes. Além dos diluentes inertes, ascomposições orais podem também incluir adjuvantes, tais como agentes deumedecimento, agentes emulsificantes e agentes de suspensão, agentesadoçantes, aromatizantes e de perfume.
As composições para administração retal ou vaginal são preferi-velmente supositórios que podem ser preparados pela mistura das composi-ções desta invenção com excipientes ou veículos não-irritantes adequados,tais como manteiga de cacau, polietileno glicol, ou uma cera de supositórioque são sólidos à temperatura ambiente, mas líquidos na temperatura docorpo e, portanto, derretem no reto ou cavidade vaginal, e liberam a proteínaativa.
As formas de dosagem para administração tópica ou transder-mal de uma composição farmacêutica desta invenção incluem ungüentos,pastas, cremes, loções, géis, pós, soluções, pulverizações, inalantes ou em-plastros. A proteína ativa, ou preparação desta, é misturada sob condiçõesestéreis com um veículo farmaceuticamente aceitável e quaisquer conser-vantes ou tampões necessários conforme pode ser requerido. Formulaçãooftálmica, gotas no ouvido e gotas no olho são também contempladas comoestando dentro do escopo desta invenção. Adicionalmente, a presente in-venção contempla o uso de emplastros transdermais, que têm a vantagemadicional de proporcionar distribuição controlada de uma proteína farmaceu-ticamente ativa ao corpo. Tais formas de dosagem podem ser produzidaspor suspensão ou dispensa da proteína farmaceuticamente ativa no meiocorreto. Intensificadores de absorção podem também serem usados paraaumentar o fluxo de proteína farmaceuticamente ativa através da pele. Ataxa pode ser controlada, ou pela provisão de uma membrana de controle detaxa, ou pela dispersão da proteína farmaceuticamente ativa em uma matrizde polímero ou gel.
As composições são administradas em tais quantidades e por taltempo conforme é necessário para alcançar o resultado desejado. Conformedescrito acima, em certas concretizações da presente invenção, uma "quan-tidade terapeuticamente eficaz" de uma composição farmacêutica é aquelaquantidade eficaz para tratamento, atenuação, ou prevenção de uma doençaem um hospedeiro. Desse modo, a "quantidade eficaz para tratar, atenuarou prevenir doença", conforme usado aqui, se refere a uma quantidade não-tóxica, mas suficiente, da composição farmacêutica para tratar, atenuar ouprevenir doença em qualquer hospedeiro. Como um exemplo, a "quantidadeterapeuticamente eficaz" pode ser uma quantidade para tratar, atenuar ouprevenir diabetes.
A quantidade exata requerida variará de indivíduo para indiví-duo, dependendo da espécie, idade e condições gerais do indivíduo, do es-tágio da doença, a mistura farmacêutica particular, seu modo de administra-ção, e similares. Plantas jovens (por exemplo, brotos germinados) da inven-ção e/ou preparações de proteína destas são preferivelmente formuladas emforma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformi-dade de dosagem. A expressão "forma de unidade de dosagem", conformeaqui usada, se refere a uma unidade fisicamente distinta de proteína farma-ceuticamente ativa apropriada para o paciente a ser tratado. Será compre-endido, contudo, que o uso diário total das composições da presente inven-ção são preferivelmente decididos por um médico atendente dentro do esco-po do julgamento médico. O nível de dose terapeuticamente eficaz específi-co para qualquer paciente particular ou organismo dependerá de uma varie-dade de fatores, incluindo a enfermidade sendo tratada e a severidade daenfermidade; da atividade do composto específico empregado; da composi-ção específica empregada; da idade, peso corpóreo, saúde geral, sexo dopaciente, dieta do paciente, condições farmacocinéticas do paciente, dotempo de administração, rota de administração e taxa de excreção do com-posto específico empregado; da duração do tratamento; drogas usadas emcombinação ou coincidental com o composto específico empregado; e fato-res similares bem-conhecidos nas técnicas médicas.
Será também apreciado que as composições farmacêuticas da presente in-venção podem ser empregadas em terapias de combinação, isto é, as com-posições farmacêuticas podem ser administradas concorrentemente com,antes de, ou subseqüente a um ou mais outros terapêuticos desejados, ouprocedimentos médicos. A combinação particular de terapias (terapêuticosou procedimentos) para empregar em um regime de combinação levará emconta compatibilidade dos terapêuticos e/ou procedimentos desejados, e oefeito terapêutico desejado a ser alcançado. Também será apreciado que asterapias empregadas podem alcançar um efeito desejado para a mesma en-fermidade (por exemplo, um composto da invenção pode ser administradoconcorrentemente com outro agente anticâncer), ou eles podem alcançarefeitos diferentes.Kits
Em ainda outro aspecto, a presente invenção também propor-ciona um envoltório ou kit incluindo plantas jovens vivas (por exemplo, brotosgerminados) da presente invenção, ou preparações, extratos, ou composi-ções farmacêuticas contendo a proteína ou polipeptídeo farmaceuticamenteativo expresso pelas plantas jovens em um ou mais recipientes preenchidoscom um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas da inven-ção. Em certas concretizações, o envoltório ou kit farmacêutico inclui umagente terapêutico aprovado adicional para uso como uma terapia de com-binação. Opcionalmente associado com tal(is) recipiente(s) pode estar umaviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabri-cação, uso ou venda de produtos farmacêuticos, com avisos que refletemaprovação pela agência de fabricação, uso ou venda para administraçãohumana.
A presente invenção envolve a purificação e escala proporciona-da da produção de proteínas farmacêuticas de plantas jovens (por exemplo,brotos germinados) usando qualquer de uma variedade de sistemas de ex-pressão de planta, mais preferivelmente sistemas de expressão de plantaviral (isto é, sistemas incluindo um componente viral). Kits são providos queincluem cada proteína em um kit diagnóstico para doenças genéticas e imu-nológicas. Em uma concretização preferida, a presente invenção proporcio-na kits tendo amostras testes de proteínas biológicas e reagentes para testara presença de anticorpos em um soro do paciente para aquelas proteínasbiológicas. Por exemplo, o kit pode proporcionar IA-2 e GAD e reagentespara testar a presença de quantidades em excesso de anticorpos para estasproteínas em um soro do paciente, uma indicação clara da presença ou de-senvolvimento de diabetes tipo 1.
A presente invenção pode ser estendida para proporcionar rea-gentes de diagnóstico na forma de um kit. Como um exemplo não-limitativo,as proteínas insulinas, GAD e IA-2, associadas com a reação auto-imune emdiabetes, podem ser providas como formulações orais e administradas parainduzir tolerância oral a estas proteínas. Alternativamente, uma ou mais pro-teínas terapêuticas podem ser providas em uma formulação injetável, ouvacina para administração. De acordo com concretizações preferidas, dosesfarmacêuticas ou instruções destas são providas no kit para administração aum indivíduo diagnosticado com uma doença, por exemplo, um indivíduodiabético, ou um indivíduo em risco de desenvolver uma doença, por exem-plo, diabetes tipo 1.
Equivalentes
Os exemplos representativos que se seguem são pretendidospara ajudar a ilustrar a invenção, e não são pretendidos para, nem devemser construídos para limitar o escopo da invenção. De fato, várias modifica-ções da invenção e muitas concretizações adicionais destas, em adição à-quelas mostradas e descritas aqui, tornar-se-ão aparentes àqueles versadosna técnica a partir dos conteúdos totais deste documento, incluindo os e-xemplos que se seguem e as referências à literatura científica e de patenteaqui citada. Deve adicionalmente ser apreciado que os conteúdos daquelasreferências citadas são incorporados aqui por referência para ajudar a ilus-trar o estado da técnica. Os exemplos seguintes contêm informação, exem-plificação e guia adicional importantes, que podem ser adaptadas à práticadesta invenção em suas várias concretizações, e os equivalentes destas.
Exemplos
Exemplo 1: Produção de Proteínas ou Polipeptídeos Farmacêuticos em Bro-tos Transgênicos Preparados por Transformação de Agrobacterium
Sementes de plantas transformadas por Agrobacterium são co-lhidas, secadas, limpas e testadas para viabilidade e presença de materialgenético desejado. O estoque de semente é armazenado sob condições a-propriadas até uso. No tempo de uso, quantidades apropriadas de sementessão imersas em água contendo uma quantidade de agente de esterilizaçãode superfície (por exemplo, Clorox) por 20 minutos a 4 horas. As sementessão espalhadas em uma superfície planas de bandejas, que contêm provi-sões de apoio de crescimento e drenagem de água. As bandejas contendoas sementes são postas em prateleiras no ambiente regulável contido sobtemperatura controlada, acesso de iluminação, circulação de ar, suprimentode água, e drenagem. As bandejas são enevoadas com água de enevoado-res equipados com reguladores automáticos por um a 30 minutos em inter-valos de 30 minutos a quatro horas, suficiente para manter as sementes ú-midas. O excesso de umidade drena através dos furos nas bandejas emdrenos na base do ambiente.
As sementes são permitidas germinar e se desenvolver sobcondições controladas. As sementes são incubadas por cerca de dois asquatorze dias antes da colheita e processamento. Em algum ponto durante oprocesso de incubação, de quatro horas a sete dias de colher, as sementessão expostas a condições ambientais que causam a indução de uma se-qüência de promotor de DNA introduzida ou inerente que causa um aumentona síntese de uma ou mais proteínas desejadas nos tecidos do broto degerminação. Um aumento transiente na temperatura de incubação de cercade 30°C a cerca de 37°C para causar indução de um promotor de choque decalor.
Após incubação dos brotos por dois a quatorze dias, os brotossão colhidos pelo movimento das bandejas individuais em uma facilidade deprocessamento em uma correia transportadora. Os brotos colhidos são pro-cessados por extração em inibidores de protease contendo solução tampo-nada de fosfato. Os brotos são quebrados por mistura vigorosa ou moagemenquanto suspensos na solução tampão e a biomassa extraída removida porcentrifugação.
Exemplo 2: Produção de Proteínas ou Polipeptídeos Farmacêuticos em Bro-tos Germinados Transientemente Infectados por um Vírus de Plantas
Sementes de plantas desejadas são obtidas de um contrato decultivador comercial como sementes tipo selvagem. O estoque de semente éarmazenado sob condições apropriadas de temperatura, umidade, sanitari-zação, e segurança até uso. No tempo de uso, quantidades apropriadas desementes são imersas em água e incubadas em bandejas conforme descritoacima sob condições controladas.
Após incubação por dois a quatorze dias, os brotos germinadossão pulverizados com uma solução contendo um vírus que abriga um trans-gene, e adicionalmente ou simultaneamente tratado com um material quecausa abrasão mecânica do tecido de folha de planta. Neste exemplo, asfolhas são abradadas com uma pulverização de partículas abrasivas conten-do ar. O vírus é permitido infectar sistemicamente as plantas por um períodoapropriado; de cerca de um a cerca de dez dias, e a expressão da proteínaheteróloga desejada é monitorada.
Após infecção dos brotos por um a dez dias, os brotos são colhi-dos conforme descrito no Exemplo 1 acima.
Exemplo 3: Expressão de Proteínas Associadas com Diabetes e Hormôniode Crescimento Humano de Vetores Virais (AvA4) em Plantas NicotianaBenthamiana
Diabetes juvenil ou tipo 1 que começam cedo é uma doença queafeta crianças, adolescentes e adultos jovens. Células de ilha beta do siste-ma endócrino pancreático produzem insulina em resposta ao sinal metabóli-co de alta glicose no sangue. A etiologia subjacente da doença é o ataque edestruição das células de ilha beta pelo sistema imune do próprio corpo.
Os indivíduos com diabetes tipo 1 produzem anticorpos contrapelo menos três proteínas que são normalmente encontradas em todos osindivíduos, isto é, insulina, ácido glutâmico decarboxilase (GAD), e proteínasimilar à tirosina-fosfatase IA-2 (Leslie et al., Diabetologia (1999) 42:30-14).Auto-anticorpos a IA-21 e proteínas de GAD são encontrados em 50% a75% de pacientes de diabetes tipo 1 antes do começo da doença. Em adi-ção o aparecimento de auto-anticorpos contra estas proteínas aparente-mente normais ocorre 7 a 8 anos adiante do começo dos sintomas clássicosassociados com diabetes tipo 1.
Auto-antígenos tais como insulina, GAD e IA-2 são úteis na in-dução de pelo menos um grau de tolerância oral a estas proteínas em indiví-duos susceptíveis, e previnem ou reduzem o dano a células de ilha, que re-sulta no desenvolvimento de diabetes. Camundongos não-obesos diabéticos(NOD) desenvolvem espontaneamente uma forma auto-imune de diabetes(Zahang, et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA (1991) 88:10252-10256). O geneque codifica insulina humana foi fundido com o gene de subunidade B detoxina de cólera e o construto resultante expresso em plantas de batatatransgênicas. Quando estas plantas foram alimentadas aos camundongosNOD1 os animais mostraram uma redução substancial na inflamação da ilhapancreática e um retardo na progressão de diabetes (Arakawa et al., Nat.Biotecnoi (1998) 16:934-936. A proteína de GAD foi também expressa emplantas de batata. Estas batatas transgênicas, quando alimentadas aos ca-mundongos de NOD1 também ou previnem ou significantemente retardam ocomeço de diabetes após 40 semanas (Ma et al., Nature Medicine (1997)3:793-796).
Neste exemplo, certas condições não-limitantes para expressãoe recuperação de GAD e IA-2 de plantas são descritas. A produção de maté-ria prima e proteínas ocorre em dois estágios: 1) pequena escala (quantida-des em mg) para estudos preliminares em animais; e 2) média escala (quan-tidades em grama) para ensaios clínicos.
Estabilidade de Teste e Movimento: Para conduzir estabilidade viral e testesde movimento, pequenas quantidades de cado construto são sintetizadas.Cado construto contém um promotor de polimerase de RNA T7 ou SP6 fun-dido ao término 5' exato de RNA genômico viral, e um local de restrição úni-co na extremidade 3' que é usado para Iinearizar o plasmídeo antes detranscrição in vitro. A polimerase de RNA T7 ou SP6 então gera transcriçõesde fuga, que são usadas para inocular plantas. As plantas são inoculadasmecanicamente em dois estágios de folha, por fricção branda do inoculumna superfície da folha na presença de um agente abrasivo, tal como pó decarborundum (grão-320; Fisher, Pittsburgh, PA). Cinco a dez plantas sãoinoculadas por construto e 1-2 1g de cada transcrição de RNA é usada porinoculação. As plantas são monitoradas para severidade de sintomas, difu-são de vírus através de toda a planta, e recuperação de produto. Em 0-15dias pós-infecção (dpi), amostras de folha de amostras de folha infectadassão colhidas para avaliar a presença de IA-2 e GAD recombinante de tama-nho total. Uma porção do material colhido (10 folhas) é congelada a -80°C eretida como um inoculum de semente para a escala de produção subse-qüente de construtos selecionadas. O restante do tecido é processado ime-diatamente.
Em 15-20 dias pós infecção (dpi), IA-2 e GAD recombinante sãorecuperados. O procedimento é otimizado para recuperar quantidades óti-mas de produto de alta pureza (90-95% de pureza). Uma vez que os produ-tos com o tamanho esperado são recuperados e identidade sorológica (re-conhecida por anticorpos específicos usando Westernblot e ELISA) determi-nada, a estabilidade dos construtos é testada por três passagens em plantassaudáveis. Problemas com montagem, recuperação ou estabilidade de vírusrecombinante com proteínas na faixa de tamanho empregada são controla-dos no nível de seqüência de nucleotídeo ou seqüência de amino ácido pelamudança das condições de infecção, ou pelo uso de uma planta hospedeiraalternativa.
Estabelecimento de Lote de Semente e Procedimento para Produção deMédia Escala: Quando o estágio 1 é completado, uma pequena quantidade(100 nl) de transcrições sintetizadas in vitro dos construtos recombinantes épreparada e usada para inocular 10 plantas. Dentro de 10-12 dias após ino-culação, as folhas são colhidas, testadas para a presença de GAD ou IA-2por Westernblot, e armazenadas a -70°C como material de semente. Umaporção deste material (3-4) é usada para inocular 150-200 plantas (1-2 kg detecido fresco). Quinze a vinte dias após inoculação, proteína recombinante érecuperada e usada para estudos funcionais. Uma média de 60 mg de pro-duto por batelada é esperada.
Inoculacão de Planta e Recuperação de Produto: Transcrições in vitro devírus recombinante contendo GAD e IA-2 são sintetizadas usando-se polime-rase de RNA T7 e DNA de plasmídeo purificado. As transcrições são cober-tas usando-se o análogo de estrutura de cobertura de RNA m7G(5)ppp(5)G.Para inoculação, uma mistura de produtos de transcrição in vitro é aplicadaàs folhas das plantas hospedeiras-alvos após abradagem da superfície dafolha com carborundum e friccionando brandamente na superfície da folhapara espalhar o inoculum e, adicionalmente, abradar a superfície. A pureza eatividade da planta que produziu IA-1 e GAD são testadas. A capacidade deligação de anticorpo dos antígenos produzidos na planta é testada por ELI-SA durante e após purificação das proteínas.
Expressão de Proteína em Nicotiana Benthamiana: Para expressar proteínasde comprimento total em plantas infectadas por vírus, nós usamos uma a-proximação de complementação funcional para expressar proteína fluores-cente verde (GFP) de medusa em plantas N. benthamiana (figura 4). Duran-te passagens planta a planta, a quantidade de vírus de mosaico de Alfafa(Av)/GFP no tecido infectado diminui gradualmente e após a terceira transfe-rência, somente Av/A4 foi detectável. (Esta é uma vantagem de um ponto devista de segurança ambiental). Usando-se esta aproximação, nós podemosexpressar uma média de 100 pg de GFP por grama de tecido fresco. Umcomponente importante deste sistema, vírus de mosaico de Alfafa de CP, éúnico em sua capacidade de encapsidatar os RNAs genômicos de vírus não-relacionados em partículas infecciosas no hospedeiro infectado. Esta capa-cidade única do vírus de mosaico de Alfafa de CP é explorada para projetarvetores híbridos que especificamente objetivam espécie de colheita selecio-nada.
A expressão de GFP recombinante em plantas Nicotiana ben-thamiana inoculadas com Av/A4 e Av/A4GFP foi analisada por Manchamen-to Western (ver figura 3). Extratos de proteína de folhas infectadas sistemati-camente conforme descrito aqui foram separados por eletroforese em 12%de gel SDS-poliacrilamida, transferidos para uma membrana de nitrocelulo-se, e reagidos com anticorpos específicos de proteína. Vírus de mosaico deAlfafa de CP-anticorpos específicos reconheceram a proteína de tamanhoesperado (24,0 kD) em plantas inoculadas com Av/A4, ou com a mistura deAv/A4 e Av/A4GFP. Os anticorpos específicos de GFP reconhecem proteínasomente em extratos de plantas inoculadas com a mistura de Av/A4 eAv/A4GFP. Os anticorpos específicos de GFP não reagem com quaisquerproteínas em plantas inoculadas com somente Av/A4. Nem vírus de mosaicode Alfafa de CP, nem anticorpos específicos de GFP, reagem com qualquerproteína em extratos de plantas inoculadas com Av/GFP somente, sugerindoa falta de movimento sistêmico.
Também projetou-se e expressou-se hormônio de crescimentohumano usando este sistema de vetor Av/A4. Plantas Nicotiana benthamia-na foram inoculadas com transcrições in vitro, e as plantas monitoradas paraprodução de hGH. Nenhum sinal específico para a proteína podia ser detec-tado em 5 dpi (dias pós inoculação), embora em 11 dpi nós podíamos detec-tar um sinal para hGH nas plantas inoculadas. A figura 4 é um Manchamentode Western de hGH produzido em plantas N. benthamiana infectadas comtranscrições in vitro de 125C/hGH. As amostras foram analisadas 24 horaspós inoculação. 1 pg de hGH purificado foi carregado como padrão. MWM émarcador de peso molecular. A seta na figura 4 aponta para a faixa de hGHna mancha detectada por anticorpos específicos de hGH.
Exemplo 4: Expressão de Proteínas Associadas à Anthrax e Hormônio deCrescimento Humano em Plantas Transgênicas Brassica Juncea
A virulência de anthrax é devido a pelo menos dois fatores devirulência maiores. Estes fatores são uma cápsula de poliglutamato que aju-da a proteger o bacterium no hospedeiro, e uma toxina de circulação de trêspartes. A toxina de antrhax é codificada por um plasmídeo de 184 kb deno-minado pX01, e consiste em uma proteína de ligação de receptor denomi-nada antígeno protetor (PA), e duas proteínas enzimaticamente ativas de-nominadas fator de edema e fator letal (Bhatnagar and Batra. Crit. Rev. Mi-robiol. (2001) 27(3): 167-200).
Neste exemplo, dois componentes de toxina anthrax inativados,antígeno de proteção (PA) e fator letal (LF) são produzidos nas folhas deBrassica juncea em concentração de pelo menos 0,1 mg/gm de peso seco.Otimizou-se o uso de códon destes genes para plantas e mudamos as se-qüências de amino ácido para minimizar a toxicidade para ambas as molécu-las de toxina. Propôs-se inserir o DNA sintetizado nos vetores capazes deregular expressão de gene na Brassiea juncea. O gene de PA foi alteradopara retirar resíduos de fenilalanina nas posições 314 e 315. O gene de LFtem uma alanina substituída por uma histidina na posição 686 ou posição690 (ver, por exemplo, Singh et al.f J. Bioi Chem. (1994) 269:29039-29046;Klimpel etal., Mol. Mierobioi. (1994) 13: 1093-1097).
Vetor de Transformação: O vetor binário pGREENII 0229 (Hellen et al., PlantMolecular Biology (Abril 2000) 42(6):819-832) é usado para transformaçãode planta (ver figura 5). Este plasmídeo inclui os seguintes componentes: 1)
O suporte de plasmídeo de pGREENII inclui seqüências necessárias parareplicação em Escherichia coli e Agrobacterium tumefaciens. 2) As seqüên-cias de limite esquerda e direita de T-DNA de agrobacterium tumefaciens(LB e RB) são necessárias para integração de todas as seqüências entre LBe RB no genoma de planta. 3) O gene npt que codifica resistência de kana-micin para seleção de Escherichia coli e transformantes de Agrobacteriumtumefacientes. 4) O gene nos-barra, que codifica resistência ao herbicidaBialophos (resistência à Bioalophos é usada para selecionar plantas trans-gênicas). O gene nos-barra é transcrito a partir de promotor 35S de vírus demosaico de Couve-flor (CAMV) com atividade constitutiva em plantas, etranscrição do gene é terminada usando o terminador CaMV. 5) Expressãode genes vir PA e LF é acionada, ou por promotor 35S de CAMV, conformemostrado na figura 5, ou pelo promotor HSP18.2 (Acesso no banco de GeneN5 X17295, local At5g59720) para a proteína de choque de calor de baixopeso molecular Arabidopsis thaliana (Matsuhara et al., The Plant Journal: forCell & MolecuIarBioIog (Abril 2000) 22(1):79-86). A terminação transcricionalé mediada pelo terminador do gene sintase nopalina (nos). Os promotores35S e HSP18.2 onde escolhidos por suas atividades diferentes. O promotor35S é constitutivamente ativo em muitos tecidos de planta. Em muitos casoso promotor 35S aciona expressão de alto nível da proteína de interesse. Porcontraste, o promotor HSP18.2 é quase inativo, a menos que as plantas se-jam atingidas pelo choque de calor. A expressão de alto nível de algumasproteínas pode somente ser alcançada usando-se um sistema de promotorinduzível.
Construto de Vetor e Transformação de Planta: Os vetores são construídosusando DH5, uma cepa de laboratório de Escherichia coli. A construção éanalisada por mapeamento e seqüenciamento de endonuclease de restrição.
Após o construção ser confirmada, o vetor é usado para transformar cepaGV3101 de Agrobacterium tumefaciens, carecendo de um plasmídeo nativoTi e adequado para transferência do TDNA de vetores binários em plantas.Plantas Brassica juncea são transformadas pela introdução de GV3101 con-duzindo o vetor de transformação em flores por qualquer método de trans-formação disponível.
Modificações Introduzidas em Genes de PA e LF: As seqüências de nucleo-tídeo de ambos PA e LF são modificadas para expressão em plantas. A se-qüência de codificação de PA nativo é 2295 bp e LF nativo é 2430 bp. Estasseqüências são modificadas conforme segue: 1) Mutações são introduzidasque tornam PA e LF inativos como toxinas. Phe314 e Phe315 são retiradosde PA e His686 e His690 são mudados para Ala. 2) O uso do códon é otimi-zado para expressão em Brassica juncea. Desde que o uso do códon e ra-zão de GC/AT de Brassica juncea é neutro, as mudanças introduzidas emPA e LF não são extensivas. Quatro códons são mudados em PA e sete emLF. 3) Locais de restrição únicos são adicionados às extremidades 5' e 3'dos genes para clonagem no vetor de expressão de planta. [4] Uma seqüên-cia de consenso para iniciação de translação será adicionada (Joshi et ai.,PlantMolecuIarBioIogy. (Dez. 1997) 35(993-1001). Os locais de restrição elocal de iniciação de translação otimizado são ilustrados na figura 5. A ex-tremidade 5' mostra o local de restrição Xbal adicionado, e o local de inicia-ção de translação de consenso para genes de planta, que inclui o códon deiniciação seguido por um códon Ala. A extremidade 3' mostra o local de res-trição Sacl adicionado. Os genes de PA e LF modificados são quimicamentesintetizados por Entelechon, Inc. (Regensburg, Alemanha).
Uma segunda construção é também produzida para PA e LF. Aintenção da segunda construção é otimizar o acúmulo de PA e LF pela obje-tivação e retenção das proteínas no retículo endoplasmético40. A objetivaçãoe retenção no RE têm o potencial de produzir acúmulo de alto nível de umaproteína recombinante (Haseloff, et al., Proceedings of the National Aca-demy of Sciences USA. (18 de março de 1997) 94(6): 2122-2127). Para al-cançar isto, uma seqüência de sinal amino-terminal e uma seqüência de re-tenção de RE carboxil terminal é adicionada. A seqüência de sinal inclui 22códon derivados a partir do gene Arabidopsis thaliana chitinase (Haseloff, etal., supra). A seqüência de retenção de RE é o tetrapeptídeo HisAspGIu-Leu(Gomord et al., The Plant Journal: for Cell & Molecular Biology. (Fev1997) 11(2):313-325). A seqüência de sinal é adicionada por saturação dePCR usando-se os genes sintéticos produzidos por Entelechon como gabari-tos (Tomme et al., J. BacterioL (1995) 177:4356-4363). A seqüência de re-tenção de RE é adicionada por amplificação de PCR dos genes PA e LF u-sando-se um inciador 3' no qual a seqüência de codificação HisAspGIu Leufoi incorporada. Seqüências modificadas de PA e LF são clonadas em veto-res de expressão 35S e HSP18.2. Duas versões modificadas de cada PA eLF (um total de 4) são clonadas. No total, 8 construções diferentes são tes-tadas.
Seleção e Análise de Transaenes de Expressão de Plantas: Após transfor-mação de Brassica juncea com cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101conduzindo o construto de transformação, as plantas são permitidas progre-direm através de seu programa de desenvolvimento normal. Dentro de 25dias, sementes maduras são produzidas, secadas e colhidas. As sementessão semeadas em solo em pote e plantas em brotos são crescidas por 15dias. As folhas de cada planta são então pulverizadas com uma solução0,0058% (p/v) de Biolophos (FINALE, Farnam, Inc., Phoenix, AZ). Plantasnão-transgênicas sensíveis são tipicamente mortas dentro de 5 a 7 dias.Plantas resistentes a Bialophos são evidentes por sua aparência verde esaudável. As plantas transgênicas putativas são confirmadas e analisadasusando-se uma série de protocolos. Reação de cadeia de polimerase usan-do prímeres de oligonucleotídeo para o construto é usada para confirmar apresença da TDNA em plantas transgênicas putativas. A presença do TDNAé então para ser examinada por manchamento de DNA genômico usandouma sonda de DNA específica, os genes modificados de PA ou LF. Final-mente, a expressão da proteína de interesse é examinada por SDS-PAGE,seguido por manchamento com Coomissie Blue, ou imunomanchamento. Oprotocolo para análise de expressão de proteína difere dependendo do cons-truto usada para produzir a planta transgênica. As plantas conduzindo pro-motor 35S são analisadas diretamente, visto que expressão a partir destepromotor é constitutiva. As plantas conduzindo o promotor HSP18.2 são dechoque de calor antes da análise. As cinéticas de expressão de proteína re-combinante podem diferir em plantas transgênicas diferentes. Ultimamente,as condições de indução são otimizadas para cada métodos padrão em uso.Contudo, para análise inicial é possível efetuar um protocolo de choque decalor padronizado que é estabelecido para expressão de outras proteínasrecombinantes em Brassica juncea.
A figura 6 mostra uma imunomancha de Brassica juncea trans-gênica expressando hormônio de crescimento humano (hGH) sob controledo promotor HSP18.2. Brassica juncea transgênica foram crescidas em mis-tura de pote. Conforme mostrado na figura 6, uma folha pesando 1 a 3 gra-mas de peso fresco foi destacada da planta e colocada em uma placa dePetri contendo um papel filtro umedecido com água. A placa de Petri é co-berta em uma incubadora de alta umidade a 37°C por 1,5 horas. A placa dePetri contendo a folha foi então removida a partir da incubadora e colocadapor 5 horas em uma câmara de crescimento a 24°C sob luzes fluorescentesa uma intensidade de 100 μηιοΙ fótons m"2 s'1. O material de planta foi entãocolhido e analisado por imunomanchamento usando um anticorpo monoclo-nal contra hHG (Sigma Chemical Co., Product Nq G-8523). A faixa inferior éo hGH recombinante de 16 kDa. Esta faixa não é observada antes do cho-que de calor. A rota 8 mostra os resultados de uma planta transgênica trans-formada com o vetor sozinho. A faixa de peso molecular mais alta é umareação não-específica com o anticorpo secundário ligado a peroxidase derábano-silvestre usado para detectar imunocomplexos. PA é prognosticadopara ser aproximadamente 88 kDa e LF 93 kDa.
Após uma classificação inicial para expressão de toxina anthrax,uma análise mais detalhada de expressão é efetuada. Um método ELISA éusado para quantificar o nível de expressão. Análise adicional é efetuada nageração de planta subseqüente. De modo a evitar a necessidade de selecio-nar plantas transgênicas em gerações subseqüentes, é ultimamente neces-sário isolar linhas transgênicas que são de não-agregação do construto deTDNA. Isto é acompanhado por autopolinização das plantas transgênicasprimárias, elevando as plantas de geração secundárias a maturidade, e tes-tando a geração terciária para segregação de resistência de Bialophos. Indi-víduos de geração secundária são identificados que são de não-segregação.Em seguida, a progenia de plantas de não-segregação é aumentada e usa-da para análise de condições de escala de produção (por exemplo, 1.600 Kgpor mês de biomassa seca). Para escala de produção, as condições decrescimento e indução são otimizadas para crescimento de plantas comobrotos. Neste ponto é também desejável caracterizar o local de inserção enúmero de cópia de TDNA de linhas de elite e caracterizar expressão nonível de expressão de mRNA.
Exemplo 5: Expressão de um Relator de GUS em Brotos de um ConstrutoAgrobacterial Contendo Seqüências Virais
pBI121 contendo um gene de relator de GUS foi transformadoem Agrobacterium tumefaciens LBA 4404. Culturas bacteriais foram cresci-das durante a noite em meio de YEB contendo 50 pg/ml de kanamicin, 20μΜ de acetosiringona e 10 mM de MES pH 5,6. Culturas durante a noite fo-ram centrifugadas, ressuspensas em meio de MMA (sais de MS, 10 mM deMES pH 5,6, 200 μΜ de acetosiringona e 2% de sacarose) em OD60O 2,0, eusadas para filtração à vácuo de brotos.
Sementes de várias plantas foram embebidas em água por 24horas à temperatura ambiente em uma plataforma em balanço, transferidasem recipientes plásticos com filtro de papel úmido, e incubadas por 4 a 6dias (dependendo da espécie de planta) por 12 horas a luz do dia a 21 °C.
Após infiltração a vácuo, os brotos foram incubados por adicio-nais 48-60 horas por 12 horas a luz do dia a 21 °C, e a atividade de GUS foidetectada in situ usando substrato histoquímico X-glue. O manchamento foirealizado durante a noite a 37°C e as amostras de planta foram desprovidasde manchamento em etanol.
O sistema foi testado usando-se uma ampla variedade de bro-tos. Ver figura 8A e 8B, e figura 9.Exemplo 6: Expressão de Proteínas Associadas a Diabetes e Hormônio deCrescimento Humano de um Construto Agrobacterial Contendo SeqüênciasViraisCriou-se um vetor baseado em TMV em vetor agrobacterial: D4-hGH ou D4-GFP, Para isto, primeiro tem-se que criar locais de clonagemmúltiplos em pBI121 -Xba1-BanH1 -SaM -Pac1-BsiW1-Stu1 -Xho1 -Spe1-Kpn1-Sac1-pBI121. Usando-se prímeres e PCR apropriados, criou-se pBI121 comestes locais. Após confirmação da seqüência, nós então procedeu-se emintroduzir seqüência genômica de TMV neste plasmídeo. Ver tambémU.S.S.N. 10/770.600, depositado em 3 de fevereiro de 2004, e Pedido dePatente Provisório dos Estados Unidos n° 60/444.615, depositado em 3 defevereiro de 2003, incorporados aqui por referência, e U.S.S.N. 10/832.603 epedido de Patente provisório dos Estados Unidos 60/546.339, incorporadosaqui por referência, para discussão adicional de D4-hGH e D4-GFP. O vetorparenteral, D4, e vetores derivados deste, são descritos em Shivprasad etal., Virology, 255(2):312-23, 1999. O plasmídeo resultante é referido comopBID4.
O promotor 35S de vírus de mosaico de couve-flor foi fundido àseqüência de TMV. Desse modo, o promotor S35 dirige transcrição da se-qüência de TMV. Após incorporação bem-sucedida em uma célula, transcri-ções virais são produzidas. Em certas concretizações da invenção, compo-nentes necessários para replicação viral e difusão através de toda a plantasão também produzidos. Estes componentes incluem, por exemplo, replica-se, proteína de movimento, e proteína de revestimento, que podem ser deTMV ou de outro vírus, tal como vírus de mosaico de alfafa em várias con-cretizações. Estes componentes podem ser revestidos dentro da seqüênciade TMV, a seqüência de plasmídeo, provida em um vetor viral separado ouplasmídeo, ou a planta pode ser uma planta transgênica compreendendo umtransgene que codifica os componentes. Ver, por exemplo, USSN10/770.600, depositado em 3 de fevereiro de 2004, que é incorporado aquipor referência.
Um promotor de TMV subgenômico dentro da seqüência deTMV direciona transcrição da seqüência de hGH. Uma ribozima de cabeçade martelo foi introduzida 3' da seqüência de TMV. A ribozima não é reque-rida para a presente invenção. O terminador nos (bem-conhecido na técnica)é 3' da seqüência de ribozima.
O vetor final continha D4-hGH ou D4-GFP. Estos construtos empBI121 foram então usadas para transformar A. tumefaciens e plantas infil-tradas com Agrobacterium transformado. Desde que um vírus de replicaçãoestá presente, incuba-se as plantas por 2 semanas. Discos de folha foramanalisados para produção de hGH por manchas de Western. A expressão deGFP foi monitorada por iluminação das plantas com onda longa de luz ultravioleta e fotografada. Os resultados mostrados na figura 10 demonstram ex-pressão de GFP através de todas as folhas infiltradas. A análise de manchade Western mostrada na figura 11 usando anticorpo direcionado a hGH con-firmou que o construto foi funcional em plantas, e hGH podia ser detectadoem altos níveis.
Similarmente, IA-2ic foi projetado em plasmídeo de pBID4 paragerar pBID4-IA-2ic. Adicionalmente, vetor baseado em AMV viral conduzindoGFP foi gerado. O plasmídeo resultante foi usado para transformar Agrobac-terium e Nicotiana benthamiana hidroponicamente crescida foi infiltrada comAgrobaeterium transformado. Brevemente, sementes de Nieotiana bentha-miana foram semeadas em uma placa Rockwool (18 X 18 X1) pré-umedecida em solução Hoagland Vz de resistência como um nutriente emcondições hidropônicas. As plantas hidropônicas foram mantidas na mesmasolução por quatro semanas. Plantas de quatro semanas de idade foramentão infiltradas com vácuo em suspensão de Agrobaeterium (OD6oo 0,1)conduzindo pBID4-IA-2ie ou vetor baseado em AMV viral conduzindo GFP.
Culturas bacteriais foram crescidas e induzidas durante a noite,em seguida as células foram ressuspensas em meio de MMA (sais de MS,10 mM de MES, pH 5,6, 20 g/l de sacarose, 200 μΜ de acetosiringona) emOD600 de 0,1. A cultura ressuspensa foi incubada à temperatura ambientepor 2-3 horas com agitação branda, e plantas hidropônicas Nieotiana ben-thamiana foram colocadas na suspensão bacterial, em seguida vácuo foiaplicado por 30-60 segundos à temperatura ambiente. O vácuo foi rapida-mente liberado para facilitar infusão eficiente da bactéria no tecido, e plantasinfiltradas foram mantidas em nutriente de solução de Hoagland de resistên-cia 1/2 por 5-7 dias. Alternativamente, a suspensão bacterial foi forçada sob aepiderme de folhas totalmente expandidas, usando uma seringa de 10 cmsem agulha. As folhas foram colhidas entre 3-6 dias pós-infiltração e arma-zenadas a -80°C, ou analisadas para análise de expressão. A figura 12 de-monstra análise de manchamento de western de plantas que expressam IA-2ic. A análise de plantas infiltradas com construtos de GFP baseadas emAMV sob luz demonstrou expressão de GFP através de todas as folhas deplantas infiltradas.
Exemplo 7: Expressão de Proteínas (Proteína Fluorescente Verde; Lichena-se) em Variedades de Ervilha de um Construto Agrobacterial Contendo Se-qüências Virais
O presente Exemplo descreve agro infiltração de certas varieda-des de ervilha com construtos agrobacteriais que conduzem um vetor deexpressão viral.
A figura 13 representa a estratégia total utilizada para construtosagrobacteriais que conduzem seqüências de A1MV. Dado que A1MV temum genoma segmentado (conforme discutido acima), três construtos diferen-tes foram usados: um (pMOG-R1&2) que conduz seqüências de A1MV quecodificam replicases 1 e 2; um (pBI-RNA3) que conduz seqüências de A1MVRNA3 (opcionalmente incluindo um gene de interesse a ser expresso, quetipicamente substitui as seqüências de proteína de revestimento de A1MVnatural em RNA3); e um (pBI-CP) que conduz seqüências de A1MV que co-dificam a proteína de revestimento A1MV. Aqueles versados na técnica a-preciarão que a inclusão do construto que codifica a proteína de revestimen-to de A1MV não é, estritamente falando-se, requerida. Contudo, pode ser útilincluir tal construto, visto que a proteína de revestimento pode facilitar repli-cação e/ou difusão sistêmica de seqüências virais (e, portanto, do gene deinteresse que elas conduzem).
Mesmo onde é desejável assegurar expressão da proteína derevestimento de A1MV, não é essencial que três construtos sejam utilizados.Por exemplo, uma alternativa pode ser utilizar plantas que já são transgêni-cas para a proteína de revestimento de A1MV de modo que não necessitaser separadamente suprido. Alternativa ou adicionalmente, plantas podemser utilizadas que são transgênicas para uma ou ambas das proteínas repli-case de A1MV. Em tais plantas (opcionalmente adicionalmente transgênicaspara a proteína de revestimento de A1MV), um construto simples pode serutilizada, conduzindo apenas o RNA3 e gene de seqüências de interesse,para alcançar resultados similares.
Conforme indicado na figura 13, nestes experimentos particula-res, construtos expressando três proteínas diferentes, proteína de fluores-cência verde (GFP), Iichenase (Lich), e uma fusão de antígeno protetor delichenase-Anthrax (Li-PA) foram utilizados.
Nos experimentos particulares colocados na figura 13, pelo me-nos um litro de cada cepa agrobacterial (isto é, cada cepa conduzindo umadas três construtos pMOG-R1&R2, pBI-RNA3/Proteína de Interesse; pLI-CP)foi produzido, transformado em péletes, e ressuspenso em MMA a um D.E.de 1,0. Aqueles versados na técnica apreciarão que D.Es diferentes podemser desejáveis para plantas diferentes. Para ervilhas, D.Es mais altos, porexemplo, na faixa de 1,5 são freqüentemente desejáveis se tecnicamentealcançáveis.
Nos experimentos particulares providos na figura 13, cepas a-grobacteriais conduzindo replicase (pMOG-R1&R2), proteína de revestimen-to (pMOG-CP), e RNA3/Proteína Alvo (pBI-RNA3/GFP, Lich, ou Li-AO) fo-ram combinadas em uma razão de 1:1:2 a um volume total de 1,5 L. Aquelesversados na técnica apreciarão que estas razões e volumes não são críticos;a razão particular utilizada foi selecionada para refletir que o ciclo de vida deA1MV envolve tipicamente níveis mais altos de RNA3 do que de outroscomponentes de genoma. Também, existe um desejo de níveis mais altosdo RNA que conduzem o gene de interesse (isto é, a GFP, Lichenase, ougene de Antígeno Protetor de Lichenase).
Nos experimentos particulares providos na figura 13, brotos defeijão foram crescidos hidroponicamente com um suporte sem solo (nestecaso, tecido grosseiro de algodão) conforme é conhecido na técnica. Os bro-tos foram submersos na mistura combinada de agrobacterium, e vácuo foiaplicado por 90 segundos a -28 psi para alcançar agro infiltração. Em algunscasos, vácuo foi aplicado mais do que uma vez.
Nos experimentos particulares providos na figura 13, os brotosforam imersos uma vez em água de torneira após agro infiltração, e, em se-guida, foram retornados para o espaço de crescimento e irrigados. Os brotosforam colhidos mais tarde, reunidos, e extraídos.
As Figuras 14-16 apresentam os resultados de vários experi-mentos realizados de acordo com a estratégia ilustrada na figura 13. Porexemplo, conforme mostrado na figura 14, construtos que produzem Liche-nase foram agro infiltradas em brotos de ervilha salpicada (SP), ervilha ama-rela (YP), ou ervilha "bill jump" (BP). Antes da agro infiltração, os brotos fo-ram crescidos durante 2 dias no escuro (para permitir germinação), e 8 diasna luz (conforme indicado pela notação "2(8)". Estes 10 dias foram entãoagro infiltrados conforme descrito acima, e foram crescidos por 5 dias pósinoculação (dpi) antes da detecção de proteína produzida. Conforme podeser visto na figura 14, proteína Iichenase foi produzida por todas as três vari-edades de ervilha, com a ervilha amarela tendo níveis de produção um tantomais altos do que a ervilha salpicada, e ervilha "bill jump" tendo níveis deprodução um tanto mais baixos. Tal variabilidade está bem dentro do setorde experiência daqueles versados na técnica em expressão de proteínas emplantas; à luz destes resultados, não mais do que experimentos de rotinaseriem requeridos para selecionar uma variedade de planta para produçãode qualquer proteína particular. Em geral, níveis de expressão observadosnestes sistema de broto de ervilha foram aproximadamente 1/3 daquelesobservados quando da expressão das proteínas relevantes (por exemplo,Lich-PA) em Nicotiana benthamiana (não mostrado). Estes brotos têm a van-tagem sobre Nicotiana benthamiana que eles são comestíveis, que devesimplificar qualquer isolamento requerido de proteína(s) farmaceuticamenteativa(s) produzida(s) a medida que todos os componentes das plantas sãoconhecidos por serem nocivos pelo menos a seres humanos. Além disso,eles crescem rapidamente e são baratos. Por outro lado, o armazenamentode semente é mais fácil para Nicotiana benthamiana, a medida que as se-mentes são muito menores do que aquelas de brotos geralmente e ervilhaem particular.
Conforme pode ser visto com referência à figura 14, nestes ex-perimentos particulares, o sistema de produção de A1MV acima descrito foimais bem sucedido na produção de proteína do que foi em um sistema deTMV análogo (conforme discutido aqui). Aqueles versados na técnica apre-ciarão que um sistema de TMV será preferível para produção de certas pro-teínas particulares em certas espécies de planta particulares, pelo qualA1MV é preferível em outras circunstâncias incluindo estas.
A figura 15 mostra produção bem-sucedida de GFP em ervilhasalpicada e ervilha amarela crescidas por períodos diferentes de tempo an-tes da agro infiltração. Nos experimentos particulares apresentados na figura15, vácuo foi aplicado três vezes por 90 segundos cada. Também, o meio deressuspensão particular utilizado foi "MMA cheio". Aqueles versados na téc-nica apreciarão que qualquer de uma variedade de outro meio de infiltração,incluindo MMA mínimo, AB, etc., pode alternativamente ser usado, e podeaumentar ou diminuir a última eficiência de agro infiltração e, portanto, deprodução de proteína ou polipeptídeo.
A figura 16 mostra expressão de Iichenase em folhas de ervilhasalpicada (L), brotos inteiros (W), raízes (R), ou hipocotil (H) em períodosdiferentes de tempo de pós-infiltração. Conforme pode ser visto, mais ex-pressão está nas folhas. Além disso, a expressão é melhor neste sistemaparticular aproximadamente 5-7 dias após infiltração. Alguma variação deveser esperada baseada na idade e variedade de planta sendo utilizada, bemcomo na(s) proteína(s) sendo expressa(s).
Outros experimentos similares demonstram, por exemplo, aque-le de uso de um construto de pBI-CP carecendo da produção aumentada deestrutura de 5/3' UTR da proteína de interesse, presumivelmente pelo au-mento de produção de proteína de revestimento (CP). Também, neste sis-tema, plantas de 9-12 dias de idade foram ótimas para expressão. Em geral,níveis mais altos de proteína foram expressos em tecido mais jovem, mastecido mais velho tinha mais biomassa.Ainda outros experimentos similares geraram que exposição dasplantas a 24 horas de luz preferivelmente do que um ciclo 12/12 deluz/escuro diminuiu materialmente os níveis da proteína de interesse.
Ainda outros experimentos similares demonstraram que exposi-ção de brotos de ervilha a detergente fraco durante agro infiltração podeaumentar os níveis de produção de proteína de interesse, presumivelmentepelo aumento da eficiência e/ou extensão de agro infiltração bem-sucedida.
Exemplo 8: Sistema Molecular para Produção de Grande Escala de Proteí-nas e Polipeptídeos em Plantas
O presente Exemplo descreve uma plataforma de tecnologia querevolucionará a fabricação de biofarmacêuticos, reduzindo muito o tempo deprodução, em alguns casos há cinco semanas. O sistema de produção parti-cular descrito neste Exemplo utiliza um vetor agrobacterial para distribuirnúmeros de cópias muito grandes de RNAs virais de planta que conduzem aseqüência de codificação da proteína ou polipeptídeo de interesse em plan-tas jovens dentro de uns poucos minutos. Altos níveis de expressão transi-ente da proteína ou polipeptídeo de interesse podem, desse modo, seremalcançados em biomassa de planta volumosa dentro de uma semana de in-trodução de vetor agrobacterial na planta.
A plataforma de tecnologia descrita neste Exemplo é aplicável auma ampla faixa de proteínas monoméricas ou diméricas, incluindo antíge-nos de vacina, anticorpos monoclonais, e outros terapêuticos (entre outrascoisas), e pode ser realizada em uma variedade de espécies de plantas. Aexpressão em plantas é mais provavelmente para proporcionar dobramentocorreto e solubilidade do que sistemas alternativos, e tem a vantagem adi-cionada de ser livre de patogenias animais. Neste Exemplo particular, focali-zou-se um projeto e produção de antígenos de vacina e anticorpos monoclo-nais em brotos.
Conforme descrito neste Exemplo, genes que codificam as pro-teínas ou polipeptídeos de interesse são clonados em um vetor de lança-mento que combina elementos de seqüências agrobacterial e de vírus RNAde plantas. Agrobacterium é então usado para introduzir milhões de cópiasdo vetor de lançamento em plantas por infiltração à vácuo. Em tecidos deplanta, as seqüências de vetor são adicionalmente massivamente amplifica-das através de replicação viral. As proteínas-alvo são então produzidas apartir destas transcrições virais em menos do que uma semana em seguidaa introdução do vetor. Será apreciado que não é requerido (embora sejatambém não-proibitivo) para o vetor agrobacterial se integrar nas células daplanta. Preferivelmente1 os elementos agrobacteriais do vetor meramentefacilitam a distribuição sistêmica rápida (via agro infiltração) do RNA viral decuja proteína é ultimamente produzido.
Este sistema pode ser usado para produzir quantidades muitograndes (por exemplo, quantidades de centenas de miligrama) de proteína-alvo por kg de tecido de planta fresco. Além disso, capacidade muito altapode ser alcançada, visto que grandes quantidades de sementes (que, con-forme notado, não necessitam serem transgênicas) podem ser prontamentetornadas disponíveis.
Conforme descrito aqui, em alguns exemplos, a proteína ou poli-peptídeo-alvo é produzido como uma fusão com uma molécula veículo, porexemplo, para estabilizar a proteína e/ou para facilitar processamento a ju-sante. Tais veículos podem ser particularmente úteis na produção de proteí-nas de antígeno. Transportadores de interesse particular incluem, por exem-plo, proteínas termoestáveis, tais como aquelas descritas, por exemplo, emUSSN 60/472.495, depositado em 22 de maio de 2003, ePCT/US04/016452, depositado em 24 de maio de 2004, e publicado comoWO 05/026375, depositado em 24 de março de 2005. Nós notamos que talmolécula veículo termoestável é uma versão projetada de β-1,2-1,4-gucanase (LicKM) de Clostridium termocellum. As seqüências alvos podemser prontamente projetadas como N-terminal, C-terminal, ou fusões internaspara LicKM. A presença de seqüências estranhas em LicKM não resulta emperda da termo estabilidade da molécula. Esta propriedade facilita recupera-ção fácil e de custo eficiente de proteínas-alvo. Uma etapa de tratamento decalor simples (por exemplo, até 10 minutos a 65°C) resulta na remoção demuito das proteínas hospedeiras. Além disso, mais do que uma proteína-alvo pode ser fundida a cada molécula de LicKM, mas usando locais de in-serção múltiplos simultaneamente.
Especificamente, sementes de plantas não-geneticamente modi-ficadas são germinadas em condições hidropônicas e mantidas por um perí-odo de tempo (por exemplo, tipicamente até cerca de 10 dias de brotos; asvezes 2-6 semanas para Nicotiana benthamania) em facilidades de plantainternas contidas antes de infiltração a vácuo. Sob estas condições, o rendi-mento de biomassa de planta por pé quadrado é tipicamente 4-5 vezes maisalto do que o alcançado com plantas crescidas no solo. Pelo uso de plantasjovens (por exemplo, brotos germinados), pode-se gerar uma cobertura den-sa com uma grande quantidade (por exemplo, cerca de 100-1000 kg) de te-cido verde por pé quadrado. Para dar uns poucos exemplos, pode-se tipica-mente gerar uma cobertura com cerca de 700 g de tecido verde/pé quadradocom brotos tais como ervilhas; uma cobertura com cerca de 200 g de tecidoverde/pé quadrado é tipicamente gerada com Nicotiana benthamiana. Aque-les versados na técnica apreciarão que outras plantas provavelmente esta-rão ente estas quantidades.
Capacidade muito alta pode ser alcançada pelo empilhamentode prateleiras de plantas jovens (por exemplo, brotos) uma acima da outrana prateleira com unidades de luz assentadas (um ambiente de crescimentode 92,903 m2 (1000 pés quadrados) proporcionará até quatro toneladas mé-tricas de biomassa em menos do que duas semanas). Todas as partes aé-reas das plantas são infiltradas com agrobactéria que abriga o vetor de lan-çamento por aplicação, e, em seguida, liberação rapidamente de um vácuo.Isto força a agrobactéria na cobertura total de tecido de planta com coberturade folha quase completa. A proteína-alvo então se acumula sobre um perío-do de uns poucos dias (por exemplo, cerca de 2 a cerca de 14 dias, em al-gumas concretizações cerca de 2 a 10, 3 a 7, 4 a 6, etc, dias).
O processo total de semente para tecido colhido tipicamente Ie-va umas poucas semanas (por exemplo, menos do que 6, 5, 4, 3 ou duassemanas; freqüentemente cerca de 2 semanas para brotos). Desde que omaterial de semente é não-transgênico, a geração e armazenagem de se-mente são baratas e diretas, e não existe eficazmente nenhuma limitação deescala. Desse modo, quantidades muito grandes de proteína recombinantepodem potencialmente ser geradas em uma questão de semanas.
As proteínas-alvo produzidas podem ser isoladas, se desejado.
Uma etapa de calor pode ser útil no isolamento de alvos fundidos a um veí-culo termoestável. Outras purificações podem envolver várias etapas de se-paração e/ou cromatografia. Por exemplo, etapas tais como precipitação desulfato de amônia, separação dependente do pH, cromatografia de exclusãode tamanho, cromatografia de troca de íon, e cromatografia de afinidade,podem ser empregadas.
O processo total contemplado neste Exemplo envolve 1) otimi-zação e síntese de gene; 2) clonagem ao vetor de lançamento; 3) prepara-ção de material de planta e culturas agrobacteriais; 4) infiltração de vácuo debrotos germinados; 5) expressão do alvo; 6) colheita de tecido; 7) e recupe-ração do alvo. Para permitir alta produção, automatizou-se muito deste pro-cesso. Especificamente, todas as etapas de semeadura de semente não-transgênica e fermentação de culturas agrobacteriais, através de homoge-neização, clareamento e redução de volume de material de planta homoge-neizado (ver figura 19), serão automatizadas. Designar-se-á e construir-se-áum módulo com capacidade para produzir 1,5 tonelada métricas de biomas-sa de planta em uma batelada. Especificamente, construir-se-á o equipa-mento conceitualmente mostrado na figura 20.
O desenho do equipamento representado na figura 20 usa umconceito de torre, tal que o módulo total assentará dentro de um espaço deaproximadamente 464,515 m2 (5000 pés quadrados). A unidade de pratelei-ra central proporciona o espaço necessário, luz e suprimento de água paracrescer (1,5 tonelada) métrica de biomassa de planta. Umidade, temperaturae luz são automaticamente monitoradas e controladas. No desenho repre-sentado na figura 20, as plantas serão crescidas hidroponicamente em ban-dejas que são de 0,305m χ 0,61 Om (11 χ 2') de tamanho. Desse modo, apro-ximadamente 6000 bandejas serão usadas. O módulo pode ser construídode 36 unidades de armazenagem individuais que são empilháveis. Cada u-nidade de armazenagem reterá bandejas de 6 χ 7 χ 4. A modularidade dodesenho permite produção de escala. Existem dois robôs, um em cada ladodas prateleiras, que colocam as bandejas dentro e fora das prateleiras. Asemeadura automática é feita em um material adequado para crescimentohidropônico. Uma vez que as plantas tenham alcançado uma maturidadeapropriada, um veículo as transporta para a unidade de infiltração, que temuma câmara de vácuo que tem a capacidade de infiltrar 1,5 tonelada métricade biomassa de planta em cerca de 8 horas. Uma unidade de inundaçãoremove o excesso de cultura agrobacterial. Uma vez que as plantas são i-nundadas, elas são transportadas de volta para a unidade de prateleira cen-tral para acúmulo do alvo por vários dias. Subseqüentemente, as bandejassão transportadas para a unidade de colheita onde as plantas são colhidas ehomogeneizadas. O extrato de planta homogeneizada é, em seguida, trans-portado para uma unidade de processamento a jusante.
Exemplo 9: Expressão de Antígeno de HPV de um Construto AbrobacterialContendo Seqüências Virais
Sistema de expressão transiente mediado por Agrobacteriumalcançado por infiltração de Agrobacterium pode ser utilizado (Turpen et al.,1993, J. Virol. Methods, 42:227). Folhas saudáveis de N. benthamiana foraminfiltradas com A. rhizogenes contendo vetores virais projetados para ex-pressar LicKM-E7 ou LicKM-0E7GGG.
A cepa A. rhizogenes A4 (ATCC 43057) ou A. tumefaciens(GV3103) foi transformada com os construtos de pBI-D4-PRACS-LiKM-E7-KDEL, pBI-D4-PRACS-LicKM-E7VAC, pBI-D4-PRACS-LicKM-E7GGG-KDELe pBI-D4-PRACS-LicKM-E7GGG-VAC. Culturas de Agrobacterium foramcrescidas e induzidas conforme descrito (Kapila et al., 1997, Plant Sei.,122:101). Uma cultura iniciadora de 2 ml (escolhida de uma colônia fresca)foi crescida durante a noite em YEB (5 g/l de extrato de carne bovina, 1 g/lde extrato de levedura, 5 g/l de peptona, 5 g/l de sacarose, 2 mM de MgSO4com 25 pg/ml de kanamicin a 28°C. A cultura iniciadora foi diluída 1:500 em500 ml de YEB com 25 Mg/ml de kanamicin, 10 mM de 2-4(-morfolino)ácidoetanossulfônico (MES) pH 5,6, 2 mM de MgSO4 adicional e 20 pg/ml de ace-tosiringona. A cultura diluída foi, em seguida, crescida durante a noite a umO.Deoo de -1,7 a 28°C. As células foram centrifugadas a 3.000 χ g por 15minutos e ressuspensas em meio de MMA (sais de MS, 10 mM de MES pH5,6, 20 g/l de sacarose, 200 μΜ de acetosiringona) a um O.Deoo 2,4, manti-das por 1 hora à temperatura ambiente, e usadas para infiltração de Agro-bacterium. Folhas de N. benthamiana foram injetadas com a suspensão deAgrobacterium usando-se uma seringa disponível sem uma agulha. As fo-lhas infiltradas foram colhidas 6 dias pós-infiltração.
Exemplo 10: Expressão de Antígeno de Anthrax de um Construto BacterialContendo Seqüências Virais
Um sistema de expressão transiente mediado por Agrobacteriumalcançado por infiltração de Agrobacterium pode ser utilizado para produzirantígeno(s) de anthrax. Folhas saudáveis de N. benthamiana foram infiltra-das com A. rhizogenes contendo vetores virais projetados para expressarLicKM-E7 ou LicKM-PAD4. O vetor usado foi pBI-D4, uma versão do vetorde expressão viral D4 introduzido no vetor Agrobaeterium pBI121. (Chen. Etal., 2003, Mol. Breed., 11:287). O promotor 35S é fundido na extremidade 5'da seqüência viral. A seqüência de vetor está posicionada entre os locaisBamHI e Sacl de PBI121. A ribozima de cabeça de martelo é colocada 3' daseqüência viral (Turpei et al., 1993, J. Virol. Methods, 42:227). Estes constru-tos incluem fusões de seqüências que codificam LicKM-PAD4 ou LicKM, aseqüências que codificam o peptídeo de sinal de tabaco PR-Ia proteína, um6x His alvo, e a seqüência de âncora de retenção de RE KDEL (ver SEQ IDN0:10).
A cepa A. rhizogenes A4 (ATCC 43057) foi transformada com osconstrutos de pBI-D4-PRLicKM-PAD4K e pBI-D4-PRLicKMK. Culturas deAgrobaeterium foram crescidas e induzidas conforme descrito (Kapila et al.,1997, PIantSei., 122:101). Uma cultura iniciadora de 2 ml (escolhida de umacolônia fresca) foi crescida durante a noite em YEB (5 g/l de extrato de carnebovina, 1 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de peptona, 5 g/l de sacarose, 2mM de MgSO4 com 25 pg/ml de kanamicin a 28°C. A cultura iniciadora foidiluída 1:500 em 500 ml de YEB com 25 pg/ml de kanamicin, 10 mM de 2-4(-morfolino)ácido etanossulfônico (MES) pH 5,6, 2 mM de MgSO4 adicional e20 pg/ml de acetosiringona. A cultura diluída foi, em seguida, crescida du-rante a noite a um O.D6oo de -1,7 a 28°C. As células foram centrifugadas a3.000 χ g por 15 minutos e ressuspensas em meio de MMA (sais de MS, 10mM de MES pH 5,6, 20 g/l de sacarose, 200 μΜ de acetosiringona) a umO.D6oo de 2,4, mantidas por 1 hora à temperatura ambiente, e usadas parainfiltração de Agrobacterium. Folhas de N. benthamiana foram injetadas coma suspensão de Agrobacterium usando-se uma seringa disponível sem umaagulha. As folhas infiltradas foram colhidas 6 dias pós-infiltração.
Exemplo 11: Expressão de Antígeno de Gripe de um Construto BacterialContendo Seqüências Virais
Um sistema de expressão transiente mediado por Agrobacteriumalcançado por infiltração de Agrobacterium pode ser utilizado para produzirantígeno(s) de gripe. (Turpey et al., (1993). Transfecção de plantas totais deenrolamentos inoculadas com Agrobacterium tumefaciens contendo cDNAde vírus de mosaico de tabaco (J. Virol. Methods, 42:227). Folhas saudáveisde N. benthamiana foram infiltradas com A. rhizogenes contendo vetoresvirais projetados para expressar LicKM-HA ou LicKM-NA.
A cepa A. rhizogenes A4 (ATCC 43057) foi transformada com osconstrutos de pBI-D4-PRACS-LicKM-HA-KDEL, pBI-D4-PRACS-LicKM-HA-VAC, pBI-D4-PRACS-LicKM-NA-KDEL e pBI-D4-PRACS-LicKM-NA-VAC.Culturas de Agrobacterium foram crescidas e induzidas conforme descritopor Kapila ., De Rycke R., Van Montagu M e Angenon G. (1997). Uma ex-pressão de gene transiente mediada por Agrobacterium para folhas intactas.Plant Sei. 122, 101-108). Uma cultura iniciadora de 2 ml (escolhida de umacolônia fresca) foi crescida durante a noite em YEB (5 g/l de extrato de carnebovina, 1 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de peptona, 5 g/l de sacarose, 2mM de MgSO4) com 25 pg/ml de kanamicin a 28°C. A cultura iniciadora foidiluída 1:500 em 500 ml de YEB com 25 pg/ml de kanamicin, 10 mM de 2-4(-morfolino)ácido etanossulfônico (MES) pH 5,6, 2 mM de MgSO4 adicional e20 pg/ml de acetosiringona. A cultura diluída foi, em seguida, crescida du-rante a noite a um O.D6oo de -1,7 a 28°C. As células foram centrifugadas a3.000 χ g por 15 minutos e ressuspensas em meio de MMA (sais de MS, 10mM de MES pH 5,6, 20 g/l de sacarose, 200 μΜ de acetosiringona) a umO.Deoo de 2,4, mantidas por 1-3 horas à temperatura ambiente, e usadaspara infiltração de Agrobacterium. Folhas de N. benthamiana foram injetadascom a suspensão de Agrobacterium usando-se uma seringa disponível semuma agulha. As folhas infiltradas foram colhidas 6 dias pós-infiltração. Asplantas podem ser classificadas para a presença de expressão de antígenode alvo por avaliação de ensaio de atividade de Iichenase e análise de imu-nomanchamento.
A análise de zimograma revelou a expressão de ambas proteí-nas HA e NA quiméricas nas raízes transgênicas de Nicotiana benthamianatestadas. A expressão é associada com atividade de lichenase. A faixa deatividade para as proteínas de fusão mostra um peso molecular mais alto doque o controle de lichenase, e o mesmo peso molecular do produto expressopor plantas após agro-infecção, confirmando a presença de produto de fusãototal.
Exemplo 12: Expressão de Anticorpo de Gripe de um Construto Agrobacteri-ai Contendo Seqüências Virais
Outras Concretizações
Aqueles versados na técnica apreciarão que o precedente re-presenta certas concretizações preferidas da presente invenção, e não de-vem ser construídas para limitar o espírito ou escopo da invenção conformedefinida pelas reivindicações seguintes:

Claims (45)

1. Método para produção de proteína farmaceuticamente ativaou polipeptídeo em plantas jovens, compreendendo as etapas de:infusão de uma planta de ervilha jovem com um construto agro-bacterial que inclui uma transcrição de controle de promotor de seqüênciasvirais, cujas seqüências virais transportam seqüências de codificação quecodificam uma proteína ou polipeptídeo de interesse;incubação da planta de ervilha jovem infundida sob condições epor um tempo suficiente para permitir transcrição a partir do promotor, talque um transcrito viral é produzido, cujo transcrito viral inclui seqüências quecodificam uma proteína ou polipeptídeo de interesse;incubação da planta de ervilha jovem infundida sob condições epor um tempo suficiente para permitir produção da proteína ou polipeptídeo.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o construtoagrobacterial compreende seqüências virais de vírus de mosaico de tabaco,vírus de mosaico de alfafa, vírus de mosaico de couve-flor, ou qualquercombinação dos precedentes.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o construtoagrobacterial compreende seqüências virais de vírus de mosaico de tabaco.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o construtoagrobacterial compreende seqüências virais de vírus de mosaico de alfafa.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o construtoagrobacterial compreende seqüências virais de vírus de mosaico de couveflor.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual as seqüên-cias virais estão sob o controle do promotor 35S do vírus de mosaico decouve-flor.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, no qual o promotor-35S de vírus de mosaico de couve-flor aciona transcrição inicial de um ge-noma viral recombinante seguindo infusão na planta de ervilha jovem.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a transcri-ção de controle de promotor de seqüências virais é um promotor constitutivo.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a transcri-ção de controle de promotor de seqüências virais é um promotor induzível.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, no qual o promotorinduzível é um promotor de choque térmico.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9, no qual o promotorinduzível é um promotor induzível de luz.
12. Método, de acordo com a reivindicação 9, no qual o promotorinduzível é um promotor quimicamente induzível.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o constru-to agrobacterial compreende um terminador transcricional.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, no qual o termi-nador transcricional é o terminador transcricional de Agrobacterium napolinasintase.
15. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o constru-to agrobacterial compreende um ou mais genes para replicação de vírus.
16. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o constru-to agrobacterial compreende um ou mais genes para movimento célula acélula.
17. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a proteínaou polipeptídeo de interesse está sob o controle transcricional de um promo-tor de mRNA viral.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, no qual o promo-tor de mRNA viral é o promotor de mRNA subgenômico de proteína de re-vestimento.
19. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o constru-to agrobacterial compreende seqüências de borda esquerda e direita.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, no qual as se-qüências de borda esquerda e direita delimitam a região do construto agro-bacterial que é transferido em células de planta de ervilha jovens seguindoinfusão da planta de ervilha jovem no construto agrobacterial.
21. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a plantade ervilha jovem é infundida com construtos múltiplos.
22. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual planta deervilha jovem é selecionada a partir do grupo consistindo em ervilha graúda,ervilha "bill jump", ervilha amarela, ervilha manchada, e ervilha verde.
23. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a proteínaou polipeptídeo de interesse é insulina.
24. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a proteínaou polipeptídeo de interesse é ácido glutâmico decarboxilase.
25. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a proteínaou polipeptídeo de interesse é tirosina-fosfatase similar a proteína IA-2.
26. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a proteínaou polipeptídeo de interesse é proteína fluorescente verde.
27. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a proteínaou polipeptídeo de interesse é hormônio de crescimento humano.
28. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a proteínaou polipeptídeo de interesse é um ou mais componentes de toxina anthrax.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, no qual o com-ponente de toxina anthrax é antígeno protetor.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, no qual uma mu-tação foi introduzida que torna o antígeno protetor inativo como uma toxina.
31. Método, de acordo com a reivindicação 28, no qual o com-ponente de toxina anthrax é fator letal.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, no qual uma mu-tação foi introduzida que torna o fator letal inativo como uma toxina.
33. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a proteínaou polipeptídeo de interesse compreende seqüências de lichenase.
34. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a plantade ervilha jovem infundida é incubada sob condições de crescimento hidro-pônico.
35. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual pelo me·nos 5 gramas da proteína ou polipeptídeo são produzidos por quilograma detecido de planta.
36. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual pelo me-nos cerca de 1 grama da proteína ou polipeptídeo é produzido por quilogra-ma de tecido de planta.
37. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual pelo me-nos cerca de 0,5 grama da proteína ou polipeptídeo é produzido por quilo-grama de tecido de planta.
38. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual pelo me-nos cerca de 20-500 mg da proteína ou polipeptídeo são produzidos por qui-Iograma de tecido de planta.
39. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o temposuficiente para permitir produção da proteína ou polipeptídeo é pelo menoscerca de 6 semanas de infusão do construto agrobacterial.
40. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o temposuficiente para permitir produção da proteína ou polipeptídeo é pelo menoscerca de 3 semanas de infusão do construto agrobacterial.
41. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o temposuficiente para permitir produção da proteína ou polipeptídeo é pelo menoscerca de 2 semanas de infusão do construto agrobacterial.
42. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o temposuficiente para permitir produção da proteína ou polipeptídeo é pelo menoscerca de 1 semana de infusão do construto agrobacterial.
43. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o temposuficiente para permitir produção da proteína ou polipeptídeo é pelo menoscerca de 1 dia de infusão do construto agrobacterial.
44. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual as plantasjovens são plantas de ervilha jovens.
45. Método para produção de proteína farmaceuticamente ativaou polipeptídeo em plantas Nicotiana, compreendendo as etapas de:infusão de uma planta Nicotiana jovem com um construto agro-bacterial que inclui uma transcrição de controle de promotor de seqüênciasvirais, cujas seqüências virais transportam seqüências de codificação quecodificam uma proteína ou polipeptídeo de interesse;incubação da planta Nicotiana jovem infundida sob condições epor um tempo suficiente para permitir transcrição a partir do promotor, talque um transcrito viral é produzido, cujo transcrito viral inclui seqüências quecodificam uma proteína ou polipeptídeo de interesse;incubação da planta Nicotiana jovem infundida sob condições epor um tempo suficiente para permitir produção da proteína ou polipeptídeo.
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