BRPI0707893A2 - sistemas de enzima de talaromyces emersonii - Google Patents

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Patrick Gerard Murray
Caroline Teresa Gilleran
Catherine Majella Collins
Francis Jeremiah Renn
Lasarina Patrivk Mclouglin
Anne Geraldine Stephanie Lydon
Alan Patrick Maloney
Mary Noelle Heneghan
Anthony John O'donoghue
Cathal Sean Mahon
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Abstract

SISTEMAS DE ENZIMA DE TALAROMYCES EMERSONII A invenção relaciona-se as cepas de Talaromyces emersonhl que são termoestáveis e codificam enzimas termoestáveis. As enzimas retêm a atividade em temperaturas acima de 55<198>C. Estas cepas e enzimas encontram o uso em uma variedade de processos da redução resíduos à produção de ingredientes alimentícios de alimento novos e à produção de combustíveis biológicos.

Description

SISTEMAS DE ENZIMA DE TALAROMYCES EMERSONII
INTRODUÇÃO
A presente invenção relaciona-se a uma cepa deTalaromyces emersonii e enzimas e sistemas enzimáticosisolados deste para utilização em gerenciamento ambiental ede dejetos, produção e processamento químico e bioquímico,processos biotecnológicos, em conjuntos de teste e dediagnósticos, probiótica e sinbiótica, produtos de cuidadosde saúde, alimentos e bebidas funcionais e novéis, produçãode surfactante, aplicações agrícolas e horticulturais.
Atualmente a Europa defronta uma crise nogerenciamento de dejetos com 2.000 milhões de toneladas dedejetos sendo produzidos a cada ano. Boa parte dessesdejetos é orgânico, derivado de materiais de plantas(biomassa), é rico em carboidratos (açúcares) e, portanto,representa um recurso de valia quando decomposto para seusaçúcares componentes. Outros tipos de dejetos como o dejetode frutas putrefazem e representam um risco ambiental. Estedejeto é geralmente combinado com ração para suínos paraextrair algum valor dele, mas, no entanto, é considerado umdejeto de baixo custo.
A biomassa representa uma matéria prima altamentevariada e variável e, no entanto, é a matéria prima deenergia mais renovável na Terra. Sé utilizado, poderiafornecer uma alternativa sustentável aos estoques cada vezt.mais se esgotando dos combustíveis fósseis. Há um interesseglobal em converter, a reserva de energia na biomassa emformas de energia utilizável. Embora um grande enfoquetenha sido a produção de biocombustíveis, como o bioetanol,para.fins de transporte, mercados para co-produtos valiososgerados durante a produção de biocombustíveis (por exemplo,CO2, resíduos riços em lignina, matéria prima química)também foram identificados. Atualmente, nos Estados Unidos,aproximadamente 13,6 bilhões de litros de etanol sãoproduzidos do milho anualmente, essencialmente para uso nosetor de combustível de transporte. Isto representa apenasaproximadamente 1% do total de consumo de combustível paraveículos motorizados, e é previsto que até 2010, a produçãode bioetanol terá aumentado mais de 7 vezes, e incluiráoutros substratos de biomassa como resíduos da madeira. Seos resíduos da madeira forem derivados de fontes de'dejetos' rapidamente renováveis geralmente consideradoscomo 'cerrado' ou mato cerrado, valor considerável pode serderivado tanto em termos dos custos do processo, satisfaçãode metas de produção e questões ambientais locais. Asvantagens do bioetanol como uma alternativa limpa eambientalmente amigável ao petróleo e outros combustíveisfósseis são claras. A adoção global do bioetanol como oprincipal combustível automotivo faria recuar muitos dosproblemas de poluição do ar que são uma característica deáreas urbanas densamente populadas. Os automóveis modernospodem ser facilmente adaptados para rodar em misturas deetanol/gasolina e novos motores estão disponíveis que podemutilizar o etanol puro como a única fonte de combustível.
A biomassa de plantas, incluindo as espécies de ✓madeiras moles, é rica em carboidratos complexos(polissacarídeos) que podem ser decompostos por meiosenzimáticos ou químicos para açúcares simples fermentáveis.Por exemplo, madeiras moles como o espruce Sitka e o pinhocontêm (% em peso seco) aproximadamente 41 a 43% decelulose (um polímero de β-1,4 unidades de glicoseligadas) , 20 a 30% de emicelulose (uma mistura de manose,galactose xilose e arabinose contendo polissacarídeos) e 25a 30% de lignina, um polímero polifenólico não-carboidratode alto valor calorífico. Se modo que cerca de 65-70% dopeso seco de resíduos de madeiras é carboidrato complexoque pode ser utilizado para fornecer matéria prima rica emaçúcares para fermentação até bioetanol.
Fungos representam uma das formas viventes microbiaismais importantes que decompõem esses materiais. Talaromycesemersonii é um fungo aeróbico termofílico encontradonaturalmente em monturos de composto e outros ecossistemasque degradam materiais ricos em biomassa. A estabilidadetérmica é uma característica marcante de muitos dossistemas de enzimas de Talaromyces emersonii isolados atéagora. Considerados como sendo uma espécie deapodrecimento mole', que pode ter como alvo todas aspartes do material da planta, este euasomiceto produzsistemas enzimáticos modificadores de carboidratosabrangentes, incluindo enzimas celulolíticas,hemicelulolíticas, pectinolíticas, e amiololíticas, bemcomo uma malha de atividades de oxidase/oxidoreductase eproteolíticas. Assim o Talaromyces emersonii pode acessarcomplexos substratos de crescimento encontrados em seuhabitat natural. PCT Publication números WO 01/70998 e WO02/24926 revelam o isolamento de celulases de Talaromycesemersonii e, em particular, celulases tendo atividade de β-glucanase e de xilanoase. A desvantagem dessas enzimas éque elas só podem direcionar um tipo (ou um númerolimitado) de constituintes de um substrato. Assim, parametabolizar um certo substrato é necessário identificar oscomponentes daquele substrato, produzir polipeptídeos tendoatividade adequada de enzimas para metabolizar essescomponentes, produzir a quantidade necessária dopolipeptidio por procedimentos rotineiros como técnicasrecombinantes, modificar os polipeptidios se necessáriopara alterar a termo-estabilidade ou o pH ótimo paraexemplo das enzimas, expressas o polipeptidio e utilizar aenzima resultante para direcionar aquele constituintedaquele substrato. Estes são procedimentos que consomemmuito tempo e que são caros.
Ademais, esses procedimentos não levam em conta o fatode que algumas enzimas podem exibir mais de uma atividadeou, quando utilizada em combinação com outra enzima,poderia ter eficiência modificada. Assim, esses métodospoderiam levar à superprodução de enzimas que não sãonecessárias assim também levando a despesas excessivas ecustos de tempo. Portanto, há uma necessidade de enzimas esistemas enzimáticos isolados de Talaromyces emersonii e ummétodo de isolar essas enzimas e sistemas enzimáticos quesupera as desvantagens mencionadas acima.
Um objetivo da invenção é o desenvolvimento decomposições enzimáticas otimizadas, particularmentecomposições de enzimas termicamente estáveis, para gerar'xaropes' ricos em açúcares fermentáveis, para utilizaçãona biomassa para iniciativas de bioetanol. Como o alvo desubstratos de biomassa ou de matéria prima para a produçãode bioetanol pode variar desde fluxos de dejetos (porexemplo, VFCWs e OFMSWs [Fração Vegetal de DejetosColetados e Fração Orgânica de Dejetos Sólidos Municipais)a colheitas agrícolas (por exemplo, milho, beterraba,pastos, etc.) a biomassa de madeiras, obter a preparaçãoenzimática correta, a um baixo custo de processo, paraobter produções máximas de açúcares fermentáveis é umdesafio significativo. Há muitos anos o custo das enzimasutilizadas na conversão da biomassa antes da produção debioetanol por fermentação microbial tem sido um fatornegativo de porte. É assim um objeto produzir preparaçõesde enzimas a baixo custo para esses fins.
As preparações de enzimas da presente invenção sãoderivadas de fontes fungais geralmente consideradas comoseguras (GRAS), enquanto as enzimas fungais em uso atéagora nas aplicações comerciais e de pesquisa de bioetanolsão essencialmente de fontes mesofílicas (por exemplo,Trichoderma sp. /Gliocladium SP., Aspergillus SP. ePenicillium SP.).
Um outro objeto da invenção é fornecer preparações deenzima que funcionam a temperaturas de reação maiselevadas, isto é, enzimas termo-estáveis permitem tempos dereação mais curtos/etapas no tratamento enzimático,permitem a pasteurização simultânea do hidrolisado,resultam em hidrólise/sacarificação geral significativa,têm um potencial para reduzir o carregamento de enzima,e/ou o potencial para reciclar a preparação de enzima,todos os quais poderão servir para reduzir os custosassociados ao uso dessas enzimas.
DECLARAÇÃO DA INVENÇÃO
A presente invenção relaciona-se a uma cepa deTalaromyces emersonii que foi depositada com oInternational Mycological Institute (CABI Bioscience UK) em22 de novembro de 2005 sob o número IMI 393751.
A vantagem de utilizar Talaromyces emersonii como afonte de enzima é que ele é um microrganismo 'geralmenteconsiderado como seguro' (GRAS) e tem um longo histórico deuso nos setores de alimentação, de bebidas, de raçõesanimais e farmacêutico.
A vantagem desta cepa novel de Talaromyces emersonii éque as enzimas dela derivadas possuem atividade ótima atemperaturas entre 540C e 85°C, com algumas enzimasmantendo atividade a temperaturas de até 95°C. Assim, essasenzimas reterão atividade mesmo quando altas temperaturasde processamento são desejáveis ou necessárias, porexemplo, produção de matéria prima rica em açúcares para aprodução bioquímica, biofarmacêutica, química ou debiocombustíveis (etanol e metano), em que temperaturas dereação de 65 a 90°C facilitam velocidades de reação maisaltas simultâneas, conversão de substrato mais rápida epasteurização simultânea de matéria prima, que aprimora oarmazenamento e o potencial de transporte. Adicionalmente,como temperaturas mais altas podem ser utilizadas com essasenzimas, cada processo tem um tempo de reação mais curto demodo que há tanto a economia de tempo como de custo. Umaoutra vantagem é que se a temperatura for alta osuficiente, a pasteurização ocorrerá matando quaisquermicrorganismos indesejáveis que não podem suportar essastemperaturas elevadas. Adicionalmente as enzimaspurificadas desta cepa demonstraram ter uma vida útil maislonga.
De acordo com a invenção é ainda fornecido um sistemade enzima que compreende celobiohidrolase I oucelobiohidrolase II ou uma mistura deles, {3-glucosidase 1,um xilanoase e um endo-β-(1,3)4-glucanase. A invençãotambém fornece um método de utilizar este sistema de enzimapara a bioconversão de planta ou de materiais derivados deplantas, como materiais de plantas virgens de origemterrestre ou marinha, e os fluxos de dejetos delas,incluindo resíduos de café, de chá, de destilaria e debebidas, frutas e cascas/peles de frutas, cascas devegetais, processamento de alimentos e para reuniões efestas, dejetos de folhas/horticultura, dejetos defloristas, resíduos de cereais e de processamento decereais, outros dejetos agrícolas e de jardins, produção depadarias e dejetos de lojas, produtos de papel comorevistas coloridas brilhantes e papel de impressãocolorido, papel de impressão preto-e-branco, papel branco,de cor e reciclado, papel marrom, sacos de papel, cartolinae papelão, copos e pratos de papel, lenços de papel,toalhas de papel, celofane e Sellotape®, embalagembiodegradável, dejetos hospitalares ricos em celulose comobandagens, papéis, toalhas de papel, máscaras, têxteis comopijamas e toalhas e para uso subseqüente na produção debiocombustível (bioetanol e biogás).
A invenção ainda relaciona-se a um sistema de enzimaque compreende um celobiohidrolase I ou um celobiohidrolaseII ou uma mistura deles, um β-glucosidase 1, um xilanoase eum endo-p-(1,3)4-glucanase. A invenção também fornece ummétodo de utilização deste sistema de enzima na produção dematérias primas ricas em monossacarídeos de resíduos deplantas para a geração de produtos de alto valor, porexemplo, antibióticos, antibióticos e antivirais,carotenóides, antioxidantes, solventes e outros químicos ebioquímicos, incluindo ingredientes de grau de alimentos,aditivos para cosméticos, oligossacarídeos e glicopeptídeospara pesquisa e glicomicos funcionais.
A invenção fornece uma cepa termofílica de Talaromycesemersonii, que tem uma faixa de temperatura de crescimentode 30 a 90°C, com uma faixa ótima de 30 a 55°C e que produzativamente enzimas a temperaturas acima de 55°C. A cepa deTalaronyces emersonii foi depositada com a deposição númeroIMI 393751. A invenção relaciona-se a um mutante do mesmotambém codificando enzimas termoestáveis. Uma enzimaproduzida pela cepa que retém atividade a temperaturasacima de 55°C. A enzima poderá ser selecionada do grupo queconsiste de enzimas modificadoras de carboidratos, enzimasproteolíticas, oxidases e oxidoredutases.
A invenção também fornece uma composição de enzima quecompreende um celobiohidrolase I ou um celobiohidrolase IIou uma mistura destes, um β-glucosidase 1, um xilanoase eum endo-{3-(1, 3 ) 4-glucanase. A composição de enzima poderácompreender 0,5 a 90% de celobiohidrolase I ou ocelobiohidrolase II ou uma mistura destes, 0,1 a 33% de J3-glocisidase 1, 0,6 a 89% de xilanoase e 0,4 a 68% de endo-{3- (1,3)4-glucanase.
É ainda fornecido um sistema de enzima que compreendeCBH I (10-30%), CBH II (10-15%), β-(1,3)4-glucanase (20-45%), {3-glucosidase (2-15%), e Xilanoase (18-55%). Acomposição poderá ainda compreender um ou mais do seguinte:{3-Xilosidase, α-Glucuronidase, exoxilanoase, a-L-Arabinofuranosidase, enzimas pectinolíticas, hemicelulases,enzimas modificadoras de amido, oxidoreductase/oxidase eesterases; e proteases.
A invenção também fornece um método de utilizaçãodeste sistema de enzima no processamento e na reciclagem detoras de madeiras, madeiras e produtos derivados damadeira. Este sistema de enzima é eficaz contra materiaisde madeira altamente lignifiçados, e é resistente amoléculas inibidoras potenciais presentes em resíduos demadeiras e materiais processados (por exemplo, extrativos,resinas, produtos da decomposição da lignina, furfural ederivativos do hidroxifurfural).
A invenção ainda relaciona-se a um sistema de enzimaque compreende CBH I (15-30%), CBH II (10-40), 0(1,3)4-glucanase (15-40%), β-glucosidase (2-15%), Xilanoase (15-30%), e 1-8% β-Xilosidase. A composição poderá aindacompreender um ou mais do que segue: Exoxilanoase; a-Glucuronidase; α-L-Arabinofuranosidase; enzimaspectinolíticas, incluindo galactosidases,ramnogalacturonase, poligalacturonase, exogalacturonase egalactanase; atividade modificadora de amido; outrashemicelulases, incluindo galactosidases;oxidoreductase/oxidase e esterases; e protease. A invençãotambém fornece um método de utilização deste sistema deenzima no processamento e reciclagem de têxteis.
É ainda fornecido um sistema de enzima que compreendeCBH I (5-55%), CBH II (8-50), β(1,3)4-glucanase (10-30%),p-glucosidase (0,5-30%), Xilanoase (5-30%), e β-Xilosidase(0,1-10%) . A composição poderá ainda compreender um ou maisdo que segue: a-L-Arabinofuranosidase; α-Glucuronidase.Outras hidrolases, incluindo enzimas Pectinolíticasselecionadas, esterases; protease, e oxidases. A invençãotambém fornece um método de utilização deste sistema deenzima na sacarifiçação de dejetos de papéis.
A invenção ainda relaciona-se a um sistema de enzimaque compreende CBH I (2-10%), CBH II (2-10%), {3(1,3)4-glucanase (10-45%)m {3-glucosidase (5-10%), e Xilanoase (1-30%) . A composição poderá ainda compreender um ou mais doseguinte: N-Acetilglucosaminidase; chitinase; {3(1,3)6-glucanase; {3-Xilosidase; α-Glucuronidase; a-L-Arabinofuranosidase; enzimas pectinolíticas, incluindogalactosidases, ramnogalacturonase, poligalacturonase,exogalacturonase e galactanase; atividade modificadora deamido; outras hemicelulases, incluindo galactosidases;oxidoreductase/oxidase e esterases,· e protease. A invençãotambém fornece um método de utilização deste sistema deenzima em estratégias antifungais, de biocontrole e decontrole de lodo em setores ambientais, médicos e daconstrução (por exemplo, controle da podridão seca), e naindústria de papel e polpa (por exemplo, controle do lodo).
É ainda fornecido um sistema de enzima que compreendeCBH I (1-20%), CBH II (1-28%), β (1,3)4-glucanase (15-40%),{3-glucosidase (2-15%) , Xilanoase (18-55%) , β-Xilosidase(0,1-10%) e a-L-Arabinofuranosidase (0,5-5,0%). Acomposição poderá ainda compreender um o mais do seguinte:α-Glucuronidase; atividade modificadora de amido; outrashemicelulases, incluindo galactosidases;oxidoreductase/oxidase e esterases; protease; exoxilanoase.Outras hidrolases, incluindo enzimas Pectinolíticas, ácidofenólico e acetil(xilano)esterases; Protease; e atividadesde oxidase modificadoras de lignina. A invenção tambémfornece um método de utilização desse sistema de enzima emaplicações horticulturais, por exemplo, produção ' decompostos bioativos novéis para a promoção do crescimento eresistência à doença. Por exemplo, este sistema pode serutilizado para a liberação de glicosídeos flavonóidebioativo, produção de oligogalacturonideos de materiaisricos em pectina, xiloglucooligosacarídeos de xiloglucanos,galactooligosacarídeos de galactanas, xilooligosacarídeossubstituídos de xilanos de plantas, ou 1,3-glucooligosacarídeos (laminarioligosacarídeos) de β-glucanoda parede de célula fungai, ou laminarana algal, para apromoção do crescimento em plantas, ativação dos mecanismosde resposta de defesa da planta contra patógenos de plantase aumentar a resistência à doença, pois alguns dessesoligosacarldeos (por exemplo, laminarioligosacarídeos) podeiniciar e mediar propriedades bioativas que são anti-fungais, anti-bacteriais e anti-nematóides.
A invenção relaciona-se ainda mais a um sistema deenzima que compreende CBH I (5-30%) , CBH II (1-15%) ,B (1, 3) 4-glucanase (10-40%), β-glucosidase (2-15%),Xilanoase (18-48%), 0,1-20% de β-Xilosidase, 1-10% de a-Glucuronidase e 0,1-5% de α-L-Arabinofuranosidase. Acomposição poderá ainda compreender um ou mais do quesegue: Exoxilanoase; enzimas pectinolíticas, incluindogalactosidases, ramnogalacturonase, poligalacturonase,exogalacturonase e galactanase; atividade modificadora doamido,· outras hemicelulases, incluindo galactosidases;exidoreductase/oxidase e esterases e protease. A invençãotambém fornece um método de utilização deste sistema deenzima na produção de alimentos animais para aprimorar adigestibilidade de alimentos animais com base em cereais.Este sistema degrada os componentes fibrosos dos alimentosanimais com base no cereal para oligosacarídeos emonosacarídeos (açúcares simples), alguns dos quais sãoabsorvidos no intestino e metabolizados. 0 sistema tambémproduz oligosacarídeos 'probióticos' (por exemplo,glocooligosacarídeos de enlace misto de β-glucanos decereais não-celulósico) que estimulam o crescimento debactérias probiõticas, e podem liberar anti-oxidantes, porexemplo, ácido ferúlico, e produzem oligosacarídeos(glucurono-xilooligosacarídeos substituídos de xilanos decereais) que têm um efeito anti-bactericida em espécies damicroflora intestinal conhecidas como produtoras demoléculas carcinogênicas (por exemplo, fenóis, aminas, etc.).
É ainda fornecido um sistema de enzima que compreendeCBH I (0,5-10%), CBH II (0,5-10%), β (1,3)4-glucanase (15-43%), {3-glucosidase (2-10%), Xilanoase (30-88%), 0,1-2,0%de p-Xilosidase, 0,1-3,0% de a-/glucuronidase, 0,1-4,0% deα-L-arabinofuranosidase. A composição poderá aindacompreender um ou mais do que segue: enzimaspectinolíticas; atividade modificadora do amido;oxidoreductase/oxidase e esterases; e protease. A invençãotambém fornece um método de utilização deste sistema deenzima na produção de alimentos animais com base em cereaisque contêm baixa pentose para animais monogástricôs comdigestibilidade aprimorada e baixo conteúdo de β-glucanonão-celulósico. β-glucanos não-celulósicos e arabinoxilanosde cereais têm alta capacidade de ligação com a água egeram soluções altamente viscosas. Animais monogástricos(por exemplo, suínos e frangos) são incapazes de degradaresses carboidratos, o que prejudica o aproveitamento e abiodisponibilidade de nutrientes importantes, aumenta adifusão de enzimas digestivas, prejudica a mistura adequadado conteúdo intestinal e age como uma barreira física paraa degradação da proteína e do amido presentes nessesalimentos animais. Em geral, esses polisacarídeos podemlevar a características de desempenho de crescimento fraco.0 sistema de enzima nesta invenção pode catalisar adegradação dos arabinoxilanos do cereal e β-glucanos não-celulósicos para produzir oligosacarídeos (essencialmenteDP3) , alguns dos quais têm propriedades probióticaspotenciais, sem a liberação de açúcares pentose (arabinosee xilose), que são mal metabolizadas por animaismonogástricos e podem ter efeitos anti-nutricionais. Assim,a invenção fornece um método de utilizar cereaisalternativos como alimentos animais, por exemplo, sorgo emilho.
A invenção ainda relaciona-se a um sistema de enzimaque compreende CBH I (3-15%), CBH II (3-15%), (1,3)4-glucanase (25-45%), a-glucosidase (2-15%), Xilanoase (18-55%), 0,5 = 7,0 de J3-Xilosidase, 0,5-10% de α-Glucuronidase,e 0,1-5,0% de α-L-Arabinofuranosidase. A composição poderáainda compreender um ou mais do que segue: Exoxilanoase;enzimas pectinolíticas, incluindo galactosidases,ramnogalacturonase, poligalacturonase, exogalacturonase egalactanase; atividade modificadora de amido; outrashemicelulases, incluindo galactosidases;oxidoreductase/oxidase e esterases,· e protease. A invençãotambém fornece um método de utilização deste sistema deenzima na produção de alimentos animais funcionais compotencial bioativo para uso em veterinária e cuidados dasaúde humana. Este sistema pode produzir oligosacarídeosbioativos de matérias primas com estado de GRAS para usonos cuidados da saúde animal (animais de estimação egrandes animais), incluindo β-glucooligo-sacarídeos imuno-estimulatório de plantas e fungos terrestres e marinhos,xilooligosacarídeos com propriedades probióticas e anti-microbiais e potencial anti-viral de paredes de células decrustáceos e fungos, e compostos fenólicos com potencialantioxidante.
É ainda fornecido um sistema de enzima que compreendeCBH I (1-15%), CBH II (1-15%), β (1,3)4-glucanase (10-45%),a-glucosidase (2-10%), Xilanoase (1-55%), 0,5-12% de β-Xilosidase. A composição poderá ainda compreender um oumais do que segue: α-Glucuronidase, a-L-
Arabinofuranosidase; β(1,3)6-glucanase; N-Acetilglucose-aminidase; enzimas pectinolíticas de chitinase, incluindogalactosidases, ramnogalacturonase, poligalacturonase,exogalacturonase e galactanase; atividade modificadora doamido; outras hemicelulases, incluindo galactosidases;oxidoreductase/oxidase e esterases; protease. A invençãotambém fornece um método de utilização deste sistema deenzima na produção de lacticínios especializados ouprodutos dietéticos, por exemplo, alimentos e formulaçõesde bebidas para o cuidado de saúde do infante e geriátrico.Por exemplo, este sistema pode ser utilizado para aprodução de alimentos facilmente digeríveis ricos emprobióticos para a nutrição geriátrica e infantil, e tambémpara a produção de produtos isentos de lactose paraindivíduos com galactosemia ou aqueles que são intolerantesà lactose.
A invenção ainda se relaciona a um sistema de enzimaque compreende CBH I (1-10%), CBH II (5-15%), β (1,3)4-glucanase (15-40%), a-galactosidase (2-30%), Xilanoase (15-55%), 1-12% de β-Xilosidase, 1-8% de α-Glucuronidase e 0,5-5,0% de α-L-Arabinofuranosidase. A composição poderá aindacompreender um ou mais do seguinte: enzimas pectinolíticas,incluindo galactosidases, ramnogalacturonase,poligalacturonase, exogalacturonase e galactanase;
10 atividade modificadora do amido; outras hemicelulases,incluindo galactosidades; oxidoreductase/oxidase eesterases; protease. A invenção também fornece um método deutilizar este sistema de enzima nos setores de padaria econfeitaria, e na formulação de produtos de padaria de
15 alimentos de saúde novéis. Sistemas de enzimas selecionadassão adequadas para a utilização de cereais novéis/materiaisprimas como centeio, milho e sorgo. 0 sistema de enzimapode aumentar o volume do pão e aprimorar a vida útil naprateleira ao modificar seletivamente os componentes
2 0 arabinoxilano das farinhas de cereais, gerar
oligosacarídeos probióticos e imuno-estimulatórios eefetuar a liberação de moléculas anti-oxidantes (porexemplo, ácidos ferúlico e coumárico), e modificar atextura, o aroma e as propriedades sensoriais de produtos
25 da padaria e da confeitaria.
É ainda fornecido um sistema de enzima que compreendeCBH I (1-20%), CBH II (1-40%), β (1,3)4-glucanase (15-45%),a-glucosidase (2-30%), Xilanoase (10-55%), 0,5-10% de β-Xilosidase, 0,5-5% de α-L-Arabinofuranosidase. A composição
3 0 poderá ainda compreender um ou mais do seguinte: β(1,3)6-glucanase; N-Acetilglucosaminidase; chitinase α-glucuronidase; enzimas pectinoliticas, incluindogalactosidases, ramnogalacturonase, poligalacturonase,exogalacturonase e galactanase;atividade modificadora deamido; oxidoreductase/oxidase e esterases; protease. Ainvenção também fornece um método de utilizar este sistemade enzima na geração de sabores, aroma e compostos deprecursores sensoriais na indústria de alimentos ao liberarmonisacarídeos e dissacarídeos que podem ser fermentadospara uma variedade de produtos incluindo ácido cítrico,vanilina, etc. liberando glicoconjugados de sabor(precursores de aroma) de frutas/polpas de fruta (porexemplo, alcoóis aromáticos glicossilados encontrados nossabores doce, ácidos amino para a transformação paraadoçantes (por exemplo, fenilalanina) e moléculas fenólicas(ácidos cinâmicos, glicosídeos flavonóides como quercetin-3-0-ramnoside), que tem sabor, aroma ou propriedadessensoriais ou são precursores desses produtos, por exemplo,ramnose, que pode ser biotransformado para furaneol, umamolécula com sabor de morango. Além disso, algumas dessasmoléculas como os glicosídeos flavonóides possuem atividadeantioxidante e anti-microbial (anti-protozoária).
A invenção ainda relaciona-se a um sistema de enzimaque compreende CBH I (1-15%), CBH II (1-15%), β (1,3)4-glucanase (10-45%), β-glucosidase (2-30%), Xilanoase (1-55%), 0,5-12% de β-Xilosidase. A composição poderá aindacompreender um ou mais do seguinte: a-L-Arabinofuranosidase; β (1,3)6-glucanase; N-Acetilglucosaminidase; chitinase α-Glucuronidase; enzimaspectinoliticas, incluindo galactosidases, ramnogalacto-uronase, poligalacturonase, exogalacturonase e galactanase;atividade modificadora de amido; outras hemicelulases,incluindo galactosidases; oxidoreductase/oxidase eesterases; e protease. A invenção também fornece um métodode utilização deste sistema de enzima para a geração dealimentos funcionais, especificamente, a modificação decarboidratos de plantas (terrestre e algumas marinhas) paragerar alimentos com propriedades aprimoradas promotoras desaúde, por exemplo, alimentos enriquecidos porglucooligosacarídeos imino-estimulatórios,xilooligosacarídeos, oligosacarídeos de soja,(arabino)galactooligosacarídeos, (galacto) e/ou(gluco)manooligosacarídeos, gentioligosacarídeos,isomaltooligosacarídeos e oligosacarídeos palatinose, epromover a liberação de moléculas antioxidantes comocaratenóides e substâncias fenólicas (ácidos cinâmicos,catechins e glicosídeos flavonóides).
É ainda fornecido um sistema de enzimas que compreendeCBH 1 (1-15%), CBH II (1-15%), β (1,3)4-glucanase (10-45%),{3-glucosidase (1-15%) , Xilanoase (1-30%) , 05-20% de β-Xilosidase. A composição poderá ainda compreender um oumais do seguinte: α-L-Arabinofuranosidase; β(1,3)6-glucanase; N-Acetilglucosaminidase; chitinase; a-Glucuronidase; enzimas pectinolíticas, incluindogalactosidases, ramnogalacturonase, poligalacturonase,exogalacturonase e galactanase; atividade modificadora deamido; oxidoreductase/oxidase e esterases; protease. Ainvenção também fornece um método de utilização destesistema de enzima para a produção de bebidas não-alcoólicase alcoólicas de projetista novel, sucos de frotas e bebidasde saúde. Este sistema pode modificar β-(1,3)4=glucans,substâncias pécticas, arabinans, xilanos, lactose,proteínas e substâncias fenólicas para gerar bebidas não-alcoólicas e alcoólicas de baixa caloria, sucos de frutas ebebidas de saúde com potencial aprimorado sensorial, anti-oxidante, elevador do sistema imune, anti-bactericida,anti-viral. Por exemplo, uma cerveja 'leve' com teor de B-glucan residual baixo para impedir a formação deatordoamento (mas com β-glucan suficiente para fornecercaracterísticas de sensibilidade bucal) que contémglucooligosacarídeos de ligação mista bioativa e ácidoscinâmicos (antioxidantes) , ou um suco de fruta rico emfragmentos de pectina (oligosacarídeos) que tem um efeitoprobiótico, e ácidos cinâmicos e glicosídeos flavonóidesselecionados que fornecem potencial antioxidante.
A invenção fornece uma composição de enzima CBH I (1-25%), CBH II (1-28%), J3(1,3)4-glucanase (18-40%), β-glucosidase (2-30%), Xilanoase (15-55%) , e β-Xilosidase(0,7-20%). A composição poderá ainda compreender um ou maisdo seguinte: a-Glucuronidase (1-10%), a-L-Arabinofuranosidase (0,1-5,0%), 1-15% de exoxilanoase, 5-25% de enzimas pectinolíticas, 2-12% de atividademodificadora de amido, 2-11% de hemicelulases, 1-15% deoxidoreductases/oxidase e esterases e 2-15% de protease. Acomposição poderá ser utilizada na produção de alimentosanimais ricos em monossacarídeos de resíduos de plantas.
A invenção fornece uma composição de enzima quecompreende CBH I (12-55%), CBH II (15-30%), J3(l,3)4-glucanase (12-26%), β-glucosidase (5-12%), Xilanoase (5-30%), p-Xilosidase (0,1-10%) e α-L-Arabinofuranosidase(0,5-3,0%) . A composição poderá ainda compreender um oumais do seguinte: α-Glucuronidase, outras hidrolases queincluem enzimas pectinolíticas, ácido fenólico eacetil(xilano)esterases, protease e atividades de oxidasemodificadora de lignina, proteases e oxidases. A composiçãopoderá ser utilizada no processamento e na reciclagem demadeira, produtos de papel e papel.
A invenção fornece uma composição de enzima quecompreende CBH I (3-15%), CBH II (3-15%), β(1,3)4-glucanase(15-45%) , β-glucosidase (1-15%) , Xilanoase (16-55%) , e j3-Xilosidase (0,5-7%). A composição poderá ainda compreenderum ou mais do seguinte: α-Glucuronidase, a-L-Arabinofuranosidase, exoxilanoase, enzimas pectinolíticas,enzimas com atividade modificadora de amido, hemicelulases,oxidoreductases/oxidase e oxidases e proteases. Acomposição poderá ser utilizada na produção de biofármacos,como os oligosacarídeos bioativos (incluindo a ligaçãomista 1,3(4) e 1,3(6)-glucooligo-sacarideos,xilooligosacarídeos ramificados e lineares,(galacto)glucomanooligosacarídeos) , glicopeptídeos eglicosídeos flavonóides de plantas terrestres e marinhas,resíduos de plantas, fungos e fluxos de dejetos ou sub-produtos ricos em açúcares simples.
A invenção ainda se relaciona a uma composição deenzima que compreende CBH I (1-20%) , CBH II (1-40%) ,β(1,3)4-glucanase (15-45%), β-glucosidase (2-12%),Xilanoase (1-35%) , e J3-Xilosidase (1-5%) . A composição deenzima poderá ainda compreender um ou mais do seguinte: a-Glucuronidase, α-L-Arabinofuranosidase, exixilanoase,enzimas pectinolíticas, atividade modificadora de amido,hemicelulases, oxidoreductases/oxidase e esterases eproteases. A composição poderá ser utilizada para aumentara biodisponibilidade de biomoléculas com atividade anti-bactericida e anti-viral naturais, incluindo glicosídeosflavonóides e cianogênicos, saponinas, oligosacarídeos efenólicos (incluindo ácidos ferúlico e p-coumarica,epicatequina, catequina, ácido pirogálico e assemelhados).
A invenção ainda se relaciona a uma composição deenzima que compreende CBH I (3-15%) , CBH II (3-15%) ,ρ(1,3)4-glucanase (25-45%), β-glucosidase (2-15%),Xilanoase (10-30%), β-Xilosidase (0,5-8%). A composição deenzima poderá ainda compreender um ou mais do seguinte: a-Glucuronidase, α-L-Arabinofuranosidase, exoxilanoase,enzimas pectinolíticas, atividade modificadora de amido,hemicelulases, oxidoreductases/oxidase e esterases eprotease. A composição poderá ser utilizada para aumentar abiodisponibilidade de biomoléculas antioxidantes naturais,por exemplo, carotenóides, licopenes, xantophilos,antocianinas, fenólicos e glicosídeos de todos os materiaisde plantas, resíduos, dejetos, incluindo várias frutas epequenas frutas.
A invenção ainda se relaciona a uma composição deenzima que compreende CBH I (1-25%), CBH II (1-40%),β(1,3)4-glucanase (15-40%), β-glucosidase (2-15%),Xilanoase (18-35%), e p-Xilosidase (0,5-12%). A composiçãode enzima poderá ainda compreender um ou mais do seguinte:a-Glucuronidase, α-L-Arabinofuranosidase, enzimaspectinolíticas, atividade modificadora de amido,hemicelulases, oxidoreductases/oxidase e esterases eprotease. A composição poderá ser utilizada para a geraçãode matéria prima de materiais de plantas brutas, resíduosde plantas e dejetos para utilização na produção microbialde antibióticos por fungos e bactéria, incluindoPenicillium sp. e Streptomyces sp. .
A invenção ainda se relaciona a uma composição deenzima que compreende CBH I (1-30%) , CBH II (1-40%) ,P(1,3)4-glucanase (15-40%), β-glucosidase (2-15%),Xilanoase (18-35%), e β-Xilosidase (0,5-8%). A composiçãode enzima poderá ainda compreender um ou mais do seguinte:α-Glucuronidase, α-L-Arabinofuranosidase, enzimaspectinolíticas, atividade modificadora de amido,hemicelulases, oxidoreductases/oxidase e esterases eprotease. A composição poderá ser utilizada na geração dematérias primas de materiais de plantas brutas, resíduos deplantas e dejetos para uso na produção microbial de ácidocítrico.
A invenção ainda se relaciona a uma composição deenzima que compreende CBH I (2-15%) , CBH II (2-15%) ,β (1,3) 4-glucanase (20-45%), {3-glucosidase (2-25%),Xilanoase (1-30%), e {3-Xilosidase (0,5-8%). A composição deenzima poderá ainda compreender um ou mais do seguinte: a-Glucuronidase, α-L-Arabinofuranosidase, enzimaspectinolíticas, atividade modificadora de amido,hemicelulases, oxidoreductases/oxidase e esterases,exoxilanoase e proteases. A composição poderá ser utilizadana produção de oligosacarídeos de polisacarídeos algais(por exemplo, laminarana e fucoidan) e aditivos derivadosde extratos de plantas, por processos consideradosgeralmente como seguros, na formulação de cosméticos.
A invenção ainda se relaciona a uma composição deenzima que compreende CBH I (3-30%), CBH II (1-10%),β(1,3)4-glucanase (10-45%), β-glucosidase (2-12%),Xilanoase (1-48%), e β-Xilosidase (0,1-8%). A composição deenzima poderá ainda compreender um ou mais do seguinte: a-Glucuronidase, α-L-Arabinofuranosidase, enzimaspectinolíticas, atividade modificadora de amido,hemicelulases, oxidoreductases/oxidase e esterases,exoxilanoase e proteases. A composição poderá ser utilizadana produção de oligosacarídeos e glicopeptídeos para usocomo reagentes em pesquisa, na produtor de biosensores ecomo ferramentas na glicômica funcional para sondarinterações receptor-ligante e na produção de bibliotecas desubstrato para criar o perfil de especificidade enzima-substrato.
A invenção ainda se relaciona a uma composição deenzima que compreende CBH I (5-15%) , CBH II (5-30%) ,β(1, 3)4-glucanase (20-45%), p-glucosidase (1-12%),Xilanoase (10-30%), e β-Xilosidase (0,5-8%). A composiçãode enzima poderá ainda compreender um ou mais do seguinte:α-Glucuronidase, α-L-Arabinofuranosidase, enzimaspectinolíticas, enzimas com atividade modificadora deamido, hemicelulases, oxidoreductases/oxidase e esterases,e proteases. A composição poderá ser utilizada para aprodução de celulose modificada e β-glucanos,celooligasacarídeos, amidos modificados emaltooligosacarídeos, lactulose e polióis (por exemplo,manitol, glucitol ou dulcitol, xilitol, arabitol).
A invenção também fornece a utilização de um substratoproduzido por qualquer um dos métodos acima como umamatéria prima na produção de biocombustível, e bioetanol oubiogás como metano ou dióxido de carbono sempre queproduzido por aquele processo. A vantagem de utilizar estesistema de enzima para produzir bioetanol ou biogás, é queeste é um método eficaz de custo de produzir um produto devalia que pode ser utilizado em muitas indústrias, de umproduto de dejeto de pouco valor. Ao mesmo tempo em queproduz um produto valioso, há uma redução no dejeto que,por sua vez, tem um impacto ambiental positivo.
Todos os métodos descritos acima poderiam serrealizados com as composições de enzima conforme aquidefinidas, ou com as cepas microbiais aqui descritas.
A invenção também fornece composições de enzima emétodos de utilizá-las que ainda compreendem enzimasderivadas de outras espécies fungais que incluem Chaetomiumthermophile e Thermoascus arantiacus.
Preferivelmente a cepa de microrganismo é selecionadado grupo que consiste de um ou mais de Talaromycesemersonii, Chaetomium thermophile e Thermoascusaurantiacus.
Ainda preferivelmente a cepa de microrganismo éTalaromyces emersonii IMI 393751 ou um mutante da mesma quetambém seja capaz de produzir enzimas capazes de atividadeem temperaturas de ou acima de 55°C.
De acordo com a invenção é ainda fornecido um métodopara obter um sistema de enzima adequado para converter umsubstrato alvo, o método compreendendo: obter uma amostrado substrato alvo; permitir que um inóculo de uma cepa domicrorganismo cresça no substrato alvo e secrete enzimas;recuperar as enzimas secretadas durante o crescimento nosubstrato alvo; determinar as atividades enzimáticas e aspropriedades das enzimas; construir um perfil de expressãode gene; identificar proteínas da enzima e construir umperfil de expressão de proteína; comparar a expressão degene com o perfil de expressão de proteína; purificar asenzimas. As enzimas poderão então ser armazenadas. 0 métodopoderá ainda compreender analisar as enzimas; e/ou projetarum sistema de enzima.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A invenção será mais claramente compreendida dadescrição seguinte de uma versão da mesma, dada apenas pormeio de exemplo com referência aos desenhos acompanhantes,em que:
A Figura 1 é um delineio de processo para um métodopara projetar um sistema de enzima adequado para converterum substrato alvo.
A Figura 2 ilustra a geração de uma matéria rica emaçúcares para a produção de biocombustível pelo tratamentopor termozima de polpa/bagaço da maçã.
A Figura 3 ilustra o cromatograma de camada fina dosprodutos gerados durante a hidrólise de copo de papel.
A Figura 4 ilustra a microscopia eletrônica de coposde papel antes (Oh) e depois (24h) do tratamento comTalarowyces emersonii do coquetel induzido por copo depapel demonstrando extensa hidrólise do substrato alvo.
As Figuras 5A-5D apresentam a comparação da produçãode xilanoase pela cepa 393751 e a cepa do tipo selvagem CBS549.92 (anteriormente CBS 814.70).
As Figuras 6A-6E apresentam uma comparação da produçãode glucanase e de (galacto)mananase pela cepa 393751 e acepa do tipo selvagem CBS 54 9,92.A Figura 7 ilustra a redução de volume do dejetoclínico rico em celulose esterilizado catalisado peloscoquetéis de 10 enzimas a 50°C após 24 horas.
A Figura 8 ilustra a redução do dejeto clínico rico emcelulose esterilizado por STG e catalisado pelo coquetel de10 enzimas a 70°C após 24 horas.
As Figuras 9A e 9B mostram o dejeto rico em celulosenão tratado (A), e o dejeto tratado enzimaticamente (B).
As Figuras IOA e IOB ilustram a produção por S.cerevisiae em hidrolisados obtidos pelo tratamento dedejeto clínico rico em celulose esterilizado a 70°C por 24horas (unidade a 60%) com o Coquetel 5 (A) e o Coquetel 8(B) .
A Figura IlA ilustra o efeito do pH na atividade dacelulase em coquetéis de T. emersonii.
A Figura IlB ilustra o efeito do pH sobre a atividadede xilanoase nos coquetéis de T. emersonii.
A Figura 12 apresenta o efeito da temperatura naatividade de celulase nos coquetéis de T. emersonii.
A Figura 13 mostra o efeito da temperatura naatividade de xilanoase nos coquetéis de T. emersonii.
A Figura 14 ilustra a nova xilanoase purificada contradiferentes xilanos, OSX, Xilano de Aveia de Spelts, WSX,xilano de palha de trigo, LWX, xilano de madeira de lariço,BWX, xilano de vidoeiro, RM, Rhodymenan (algal vermelha1,3; 4 -|3-D-xilanoo) . A atividade é expressa como umaporcentagem relativa ao xilano de aveia de Spelts (100%).
As Figuras 15A e 15B apresentam a atividade de Xyn IVpurificado (A) e Xyn XI (B) contra diferentes xilanos. Aatividade é expressa como uma porcentagem em relação aoxilano de aveia de Spelts (100%).
As Figuras 15C e 15D ilustram a atividade de Xyn VIIpurificado (C), e de Xyn VIII (D) contra diferentesxilanos. A atividade é expressa como uma porcentagem emrelação ao xilano de aveia de Spelts (100%).
As Figuras 15E e 15F mostram a atividade do Xyn IXpurificado (E) e do Xyn X (F) contra diferentes xilanos. Aatividade é expressa como uma porcentagem em relação aoxilano de aveia de Spelts (100%).
A Figura 15G mostra a atividade do Xyn XI purificadocontra diferentes xilanos. A atividade é expressa como umaporcentagem em relação ao xilano de aveia de Spelts (100%) .
A Figura 16 apresenta a atividade relativa emporcentagem do Xyn XII purificado contra uma variedade depolisacarídeos purificados. OSX, xilano de aveia de Spelts;BBG , {3-glucano de cevada; LIC, Liquenano; CMC,Carboxiletilcellose; LAM, Laminarina; Dl, Dextrano; D2,Dextrina; INU, Inlina; ARA, Arabinana; GAL L, Galactana(Lupin); GAL P, Galactana (Batata); RG, Ramnogalacturonana;LWAG, arabino-galactana de vidoeiro.
A Figura 17 ilustra a atividade específica do Xin XIIpurificada contra aril β-xilosídeos e aril β-glucosideos.
A Figura 18 mostra uma comparação das atividadesespecificas de xilanoases selecionadas expressas por IMI393751 e CBS 549,92 contra OSX como substrato de ensaio.
Com referência à Figura 1, é fornecido um esboço deprocesso para projetar um sistema de enzima para converterum substrato alvo. Na etapa 1, o substrato alvo é obtido.Na etapa 2, o substrato alvo é inoculado com omicrorganismo que é cultivado no substrato alvo parafornecer uma cultura. 0 microrganismo secreta enzimas eestas enzimas são recuperadas na etapa 3, ao obter amostrasda cultura. As amostras da cultura são separadas em fraçãocelular e filtrado da cultura na etapa 4. A fração celular(nRNA) é analisada na etapa 5, para determinar asatividades e propriedades enzimáticas. Na etapa 6, umperfil de expressão de gene é construído com base naanálise da etapa 5. Na etapa 7, o filtrado da cultura éselecionado quanto à atividade de proteína e um perfil deexpressão de proteína é construído na etapa 8. Na etapa 9,os perfis de expressão de gene e de proteína sãocomparados. Na etapa 10, as enzimas são purificadas. Asenzimas poderão ser armazenadas na etapa 11 e na etapa 12as enzimas poderão ainda ser analisadas e um sistema deenzima é projetado na etapa 13.
Verificou-se que quando o fungo é utilizado como omicrorganismo, resultados melhores são obtidos quando osubstrato for inoculado com o micélio do fungo. Estecultivo é preferivelmente realizado em um fermentador e ascondições de reação irão variar dependendo do tipo demicrorganismo e substrato utilizados. 0 cultivo poderá serquer na forma de fermentação líquida ou de estado sólido.
Para Talaromyces emersonii, a temperatura de cultivo naregião de 45°C a 65°C é preferível, as enzimas estandoativas otimamente até 85-90°C
As enzimas são recuperadas do substrato alvo pelaseparação da biomassa celular (fungai) do filtrado decultura extracelular utilizando centrifugação no caso deenzimas produzidas por fermentação líquida, ou com oauxílio de um sistema de separação de célula para culturasmaiores. As enzimas são então recuperadas da fração debiomassa celular pela homogeneização de um peso conhecidoda biomassa em dois volumes de tampão. Tampões adequadosincluem 50 mM de acetato de amônia, pH 4,5-6,0 ou 50 mM defosfato de sódio, pH 7,0-8,0. Para a extração das enzimaspara culturas no estado sólido, as culturas forammisturadas com 10 volumes de 100 mM de tampão de citrato defosfato, pH 5,0, contendo 0,01% (v/v) Tween 80,homogeneizado e extraído por agitação durante duas horas a14,7 rad/s à temperatura ambiente. Um extrato rico emenzimas é então recuperado por centrifugação.
É essencial que seja realizada uma comparação dosistema de enzima tanto ao nível de genoma como deproteoma, isto é, os genes, produtos de expressão (mRNA) eas proteínas identificadas são comparadas. Isto é devido aofato de que poderá haver informaçao genética presente que éexpressa ao nível de mRNA, mas não traduzida para proteínafuncional ao nível de proteína. As análisestranscriptômica, genômica e proteômica são importantes paradeterminar a abundância relativa de certas enzimas.
Um isolado da cepa de fungo filamentoso, da qualalgumas das enzimas da invenção foram isoladas foidepositada com o International Mycological Institute (IMI)(CABI Bioscience UK), Bakeham Lane, Englefield Green,Egham, Surrey TW209TY, Reino Unido, para os fins doprocedimento de patente em 22 de novembro de 2005 - Númerode depósito IMI 393751. Após a purificação das enzimas elaspodem ser opcionalmente armazenadas ou analisadasdiretamente para obter (a) informação detalhada sobre atermo-estabilidade individual/atividade térmica empropriedades catalítica e funcional gerais, (b) informaçãodetalhada sobre seu modo de ação e potencial catalítico,individualmente e em combinação, (c) informação sobreinterações sinérgicas, (d) informação de seqüência parcialque auxiliaria na clonagem dos genes, e (e) em algunscasos, obter proteína suficiente para facilitar a coleta dedados estruturais em 3-D. A análise dessas enzimas é entãoexplorada para identificar sistemas de enzima chaves etempos de colheita ótimos para esses sistemas. Os sistemaspodem ser otimizados com relação aos níveis de atividadeschaves e misturas de enzimas chaves, características dedesempenho e condição (na escala de laboratório) para asaplicações- alvo.
Exemplo 1: T. emersonii IMI393751, isolamento:
Cortes de grama (gramados) limpa recém colhida (~200g)e outra biomassa de planta mista foram colocados em umdepósito fechado para simular um ambiente de compostagem, eincubada em câmara de temperatura constante, a 65°C, poraproximadamente duas horas (pasteurização combinada eequilíbrio do substrato). O teor de umidade foi mantido a~65-70°C. O depósito foi dotado de uma linha que fornece umpulso baixo de ar filtrado úmido a intervalos. Após duashoras, uma suspensão de esporo (1x10^8 esporos em 2% de águaestéril) de T. emersonii (cepas de laboratório de umisolado de 12 anos de idade, originalmente de CBS814,70)foi utilizado para inocular a região central da biomassa. Atemperatura foi mantida a 65°C por dois dias, e aumentadaem intervalos de 2°C a cada 24 horas daí em diante até umatemperatura de ar de 70 °C ser atingida internamente nacâmara. A cultura foi crescida por mais sete dias antes deuma amostra da região central ou 'ponto quente' inoculadoser removido assepticamente e transferido para placas deágar. (meio de ágar de Emerson para os fungostermofílicos), e sub-culturado, para assegurar a pureza dacultura; a pureza foi conferida por verificação cruzada poranálise microscópica. Meio liquido contendo nutrientesbásicos (Tuohy et al., 1992; Moloney et al., 1983) e 2%(m/v) de glicose foi inoculado com peças de 1 cm2 dematerial de micélios das culturas da placa de ágar de 36horas de idade. Culturas líquidas foram crescidas a 550C emfrascos Erlenmeyer de 250 mL (contendo 100 mL de meio decrescimento), com agitação a 23 rad/s. Alíquotas (2,0 mL)de suspensões de micélios foram removidas após 3 6 horas,lavadas assepticamente com água estéril, transferidas, paraplacas de Petri estéreis (100 mm de diâmetro) e irradiadascom luz UV a intervalos cronometrados (10-60 s) . Meio deágar estéril (ágar nobre contendo 0,2% m/v de repressoresde catabólitos individuais, como 2-deoxiglicose) foraminoculados com amostras do micélio fungai irradiado.
Culturas replicadas foram incubadas a 45 e a 58°C. Colôniasúnicas foram cuidadosamente selecionadas (aparência brancafofa), transferida assepticamente para placas de ágar dedextrose de Sabouraud e purificada ainda através de váriastransferências. A cepa IMI 393751 representa um isoladotomado das placas incubada a 58°C. 0 mutante foi avaliadoem estudo comparativo com o organismo paterno, porestabilidade térmica aprimorada e produção de enzima, querevelou diferenças claras entre ambas as cepas em termos deaparência da cultura, capacidade de esporular (a cepa IMI393751 e não-espurolante), termofilicidade e estabilidade,padrões de produção de enzima sob condições de crescimentoidênticas, expressão diferencial e níveis de atividadesenzimáticas individuais.
Diferenças Fisiológicas/Micolõgicas entre CBS 814,70 eIMI 393751
Aparência da cultura durante o crescimento em mídia de ágardiferentes
Quando cultivada em ágar de Emerson CBS814,70 tem ascaracterísticas típicas desta espécie (Stolk & Samson,1972) , isto é, pálido, cremosa/amarelo claro, com tonsamarelados pálidos próximo da superfície de ágar (ao redorda zona de inoculação) , que passa para uma cor maisprofunda amarelado escuro/marrom avermelhado com amaturação da cultura, e consiste de um material de micéliosdenso de muitos ascomata. Em contraste, IMI393751 é bemmais branca e a cultura tem uma aparência muito "fofa".
Diferenças com relação à esporulação: CBS814,70 é umacepa esporulante de T. emersonii que produz conidióforos,asei e ascósporos. Os conidióforos parecem como ramosperpendiculares em hifas (de cor amarelo pálido e septado).O asei, ou esporo que contém sacos são de formato um tantoelipsóide, e muitas vezes pode ser encontrado em cadeias;os ascósporos são lisos e de formato elíptico (aparênciaverde em micrógrafo de elétrons). Em contraste, os micéliosdo IMI393751 produzem muito poucos conidióforos clássicos,asei e ascósporos. Em contraste completo ao CBS814.70,IMI3 93 751 só produz um número parco de esporos sobcondições extremas e bastante específicas, enquanto a cepaCBS814,70 produz esporos em vários meios diferentes.
Diferenças com relação à termofilicidade e faixa detemperatura para crescimento ótimo: CBS814,70 tem uma faixade crescimento estreita de 35-55°C, com fraco crescimento atemperaturas mais baixas ou mais altas e uma faixa decrescimento ótimo de 40-45°C. Por outro lado, IMI393751exibe uma faixa de temperatura de crescimento mais ampla de30-65°C, com bom crescimento a 80°C, 85°C e até 90°C, com oótimo entre 48-55°C. IMI393751 cresce muito bem >55°C econtinua a produzir altos níveis de biomassa fúngíca(micélios) e secretar ativamente quantidades significativasde várias proteínas.
Diferenças com relação ao crescimento a valores de pHmais altos: CBS 814,70 não cresce bem (em verdade, começa amorrer) a valores de pH superiores ao pH 6-6,5 (dadosanteriores, Tuohy & Coughlan, 1992), enquanto IMI393751cresce bem e secreta níveis substanciais de enzimas avalores de pH até pH 9,0.
Crescimento sob condições de nutrientes limitadas/depauperadas: IMI393751 sobrevive bem em culturas comnutrientes depauperados por até 55 dias, enquanto CBS814,70 sobre autólise de 7 dias em diante e poucosmicélios/células sobreviventes permanecem após 15 dias. Osmicélios colhidos de culturas líquidas depauperadas denutrientes de 55 dias de idade de IMI393751 puderam serressuscitados pela transferência para meio de ágar dedextrose de Saburaud, enquanto os restos de micélios dacepa CBS814,70 (55 dias de idade) não puderam serreavivados pela mesma abordagem.
Exemplo 2: um sistema de enzima de Talaromycesemersonii para converter materiais hemicelulósicos: Ahidrólise completa de xilano requer a ação sinérgica dexilanoases, β-xilosidase, α-glucuronidase, α-L-arabinofuranosidase e esterases. A Tabela 1 dá um exemplode substratos alvos selecionados (incluindodejetos/resíduos) e a porcentagem de fonte de carbonoindutor utilizada neste exemplo. A porcentagem de induçãorefere-se ao peso da fonte de carbono por volume de meio(g/lOOmls).
Tabela 1: Substratos de crescimento/fontes de carbonoindutor para a produção de enzima por T. emersonii
<table>table see original document page 34</column></row><table>
AIncluído para fins de comparação.Com base nos resultados obtidos, um sistema de enzimasfoi projetado utilizando enzimas purificadas de Talaromycesemersonii para a degradação de um pelicelulose (xilano) ouproduto derivado de madeira rico em xilano, resíduo oudejeto. As quantidades relativas das enzimas chavespresentes no sistema de enzima são tabuladas na Tabela 2.
Tabela 2: Sistema para a degradação de uma hemicelulose ouproduto de madeira rico em xilano
<table>table see original document page 35</column></row><table>
As quantidades relativas das atividades cerne, operfil e as quantidades relativas das atividades acessóriasirão variar dependendo da composição do substrato alvo. ATabela 3 esboça sistemas de enzima de Talaromyces emersoniique foram projetados para aplicações específicas.
Tabela 3: Sistemas de enzimas específicos adequados para adegradação de oligosacarídeos de xilanoos de madeira,jornais e resíduos madeirosos
<table>table see original document page 35</column></row><table><table>table see original document page 36</column></row><table><table>table see original document page 37</column></row><table>
Exemplo 3: Sistema de Talaromyces emersonii paraconverter cereais, polpa de beterraba, e outros materiais(incluindo dejetos) ricos em arabinoxilanos e hemicelulosesacetiladas.
A Tabela 4 fornece quantidades relativas de diferentesatividades enzimáticas em sistemas de enzima projetados deTalaromyces emersonii IMI393751 e duas cepas mutantesidentificadas anteriormente projetadas para a conversão decereais, polpa de beterraba, e outros materiais (incluindodejetos) ricos em arabinoxilanoos e hemicelulosesacetiladas.
Tabela 4: Atividades de enzima para conversão de materiaisricos em arabinooxilanoos e hemiceluloses acetiladas<table>table see original document page 38</column></row><table>
Exemplo 4: Sistemas de Talaromyces emersonii paraconverter materiais não-celulósicos, como folhas de chá ealfarroba em pó.
A caracterização de três endoglucanases (EG) novas,que são importantes tanto para a modificação seletivaquanto a degradação de uma variedade de resíduos decereais, incluindo candidatos potenciais para cervejarias ealimentos para animais, como sorgo, milho e centeio.Essastrês enzimas foram purificadas de Talaromyces emersoniiIMI393751.
O teor de carboidratos totais das preparações deenzima purificada foi determinada pelo método de ácidosulfúrico-fenol (Dubois et al.) por referência a curvaspadrão de glicose ou manose (20-100 pg.mL-1) .
Técnicas de separação de proteína.
A filtração de gel seqüencial, a troca de íons, ainteração hidrofóbica e as cromatografias de afinidade deIect ina e cronomatofocalizaçao (pseudo troca de íons) foramnecessárias para obter preparações altamente purificadas deEG V, EG VI e EG VII. Eletroforese de gel não-denaturado efocalização isoelétrica seguida por tingimento de azul decoomassie foi efetuada pela metodologia padrão conhecidapor pessoa versada no campo e fornece as referênciasrelevantes (por exemplo, Murray et al. , 2001; Tuohy %Coughlan, 1992, Tuohy et al 2002; Maloney et al, 2004).Experimentos iniciais revelaram que os valores pi do EG V-Vll foram <pH 3,5. Portanto, a cromatof ocalizaçao em PBE94, pré-equilibrada com 0,025 M piperazina-HCl, pH 3,5, foiutilizada para determinar valores de pi precisos para EG V-VII. 0 pH correspondente ao pico de elução para {3-glucanasefoi determinado como sendo o pi. Diferenças de 0,01unidades de pH poderiam ser detectadas assim produzindovalores de pi precisos para cada enzima.
pH e temperatura e estabilidades ótimas.
Valores de pH ótimos foram determinados pelamonitoração da atividade de enzima a valores de pH entre2,5 e 9,0, a 50°C, em tampão de citrato-fosfato de potênciaiônica constante. Para avaliar os efeitos do pH naatividade de EG V-VII, amostras purificadas de cada enzimaforam incubadas ao pH de 4,0, 5,0 e 6,0 a 50°C. Alíquotasforam removidas após 0, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24, 36, 48 e até336 horas (14 dias), diluído de maneira apropriada emtampão de 100 mM NaOAc, pH 5,0 (ensaio de pH normal) eensaiado para atividade residual de acordo com o método deensaio padrão. A estabilidade de cada enzima purificada foiinvestigada a 50°C, 60°C, 70°C e 80°C, na ausência dosubstrato. EG V-VII não eram proteínas modulares poisnenhuma das três enzimas adsorvida para celulose (ou outrocarboidrato insolúvel, isto é, eles não continham ligaçãode carboidrato.
A especificidade de substrato em vários polisacarídeose glicosídeos sintéticos foi avaliada ao medir a atividadecontra uma ampla variedade de carboidratos (BBG, lichenan,CMC, outros polisacarídeos e glicosídeos sintéticos)utilizando o procedimento normal de ensaio de β-glucanase.
Efeitos de íons de metais, reagentes de modificaçãoquímica e inibidores potenciais
Uma gama de íons monovalentes, divalentes e de metaispesados, em concentrações de ensaio final de 1,0 mM, foraminvestigadas por seus efeitos potenciais nas atividades deEG V, EG VI, e EG VII, ao incubar os enzimas com osprodutos químicos e depois conduzir o ensaio de enzimanormal. Finalmente, foram examinados os efeitos inibidoresde glicosídeos, como os dissacarídeos, lactonas eglicosídeos flavonóides nas enzimas purificadas.
Concentrações especificadas de cada glicosídeos foramincluídas nos coquetéis de ensaio normais e a atividaderesidual determinada por comparação com controles (nenhumglicosídeo presente).
Um resumo da purificação de EG V, EG VI e EG VII, e osparâmetros de purificação como produção (%) são dados naTabela 5.<table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table>Produções, bem como os valores de atividadeespecífica final, foram similares para EG V E EG VII,enquanto EG VI foi obtido a uma produção mais baixa e tinhauma atividade específica mais alta.
Homogeneidade de enzima Mr e valores pi.
O tingimento positivo com o reagente Schiff(resultadosnão mostrados) indicaram que todas as três enzimas eramglicoproteínas de subunidade única. A homogeneidade de cadapreparação de enzima foi verificada pelo IEF. Os valores piobtidos foram os seguintes: EG V, 2,45; EG VI, 3,00; EGVII, 2,85.
Evidência para a glicosilação e estimativa decoeficientes de extinção molar.
Teor de carboidratos totais (m/m) foram de 22,6±0,1%,14, 7 + 0, 1%, e 65,9±0,04% para EG V, EG VI e EG VII,respectivamente. Os valores de coeficiente de extinçãomolar (ε28ο) (mol.L.cm"1) foram de l,04xl0~5 para EG V, de8, 8 OxlO"6 para EG VI e de 7,05xl0"6 para EG VII.
pH e temperatura ótima e estabilidades
As três enzimas estiveram ativas por faixas de pHrelativamente amplas mas exibiram valores ótimos de pHacídico de 5,7, 5,4, e de 5,7 para EG V, EG VI e EG VII,respectivamente. Um pH ótimo de 4,5 foi obtido para aatividade BBGase no extrato cru de T. emersonii.
Aproximadamente 75% da atividade ótima foi evidente entrepH 3,0 e 7,0 (EG V), pH 2,5 e 7,5 (EG VI) e pH 2,8 e 7,5(EG VII).
A liberação de açúcares redutores de BBG, ao pH de 5,0por mais de 10 min, a 30-90°C. Valores de temperatura ótimapara a atividade foram 78, 0°C, 78,0°C e 76, 0°C para EG V,EG VI, e EG VII, respectivamente. Energias de ativação(Ea), estimadas de plotagens de Arrhenius, foram de21,2 + 0,05 kJ.mol"1 para EG V, 23,5±0,02 kJ.mol-1 para EGVI, e 26,7 + 0,05 kJ.mol"1 para EG V, 23,5±0,02 kJ.mol"1 paraEG VI, e 26 , 7 + 0, 05 kJ.mol"1 para EG VII.
O efeito do ph na estabilidade da enzima foiinvestigada a pH 5,0, pH 5,5 e pH 6,0 (a 50° e a 70°C). Aestabilidade do pH foi maior na faixa de pY 4,0-7,0, por umperíodo de incubação de uma hora, com um decréscimoacentuado observado no pH <4,0 e >7,0 EG V perdeu nenhumaatividade a pH 5,0 e 50°C por um período de 15 dias,enquanto EG VI e EG VII perderam atividade mínima (13,0% e11,5%, respectivamente) . No entanto, a 70°C e o mesmo pH,EG V, EG VI e EG VII perderam 42%, 35% e 33%,respectivamente, da atividade original em cada amostra porum período de 60 minutos. Ao pH de 5,5 (50°C), EG VI, EG VIe EG VII perderam 30%, 22% e 8% de suas respectivasatividades originais por um período de 15 dias, mas a 70°C,EG V foi desestabilizado ainda mais (diminuição de 58% naatividade original após 60 minutos), enquanto a atividadede EG VI e de EG VII após 60 minutos foi muito similaràquela obtida após a incubação ao pH de 5,5 e 70°C. EG Vfoi consideravelmente menos estável ao pH 6,0 e 50 °C,perdendo 63% de sua atividade original em 15 dias. EG VI eEG VII foram consideravelmente mais estáveis neste últimopH, com estabilidades similares àquelas determinadas ao pH5,5 (perda de 30% da atividade para ambas as enzimas) . Aoaumentar a temperatura de incubação para 70°C, a atividadedo EG V diminuiu acentuadamente (65%) por um período deincubação de 60 minutos (ao pH de 6,0), enquanto EG VIIpermaneceu admiravelmente estável, perdendo apenas 22% desua atividade original. Valores de meia vida (T 1/2) foramem excesso de 15 dias ao pH de 5,0 e 50°C, enquanto a 70°Cos valores variaram de 67 minutos (EG V) para >8 0 minutos(EG VI e EG VII).
Evidência para estrutura modular
EG V, EG VI, e EG VII adsorveram fracamente paraAvicel (celulose microcristalina) ao pH de 5,0 e 4°C(adsorção de 8-15%); no entanto, esta extensão de adsorçãonão é indicativa da presença de um módulo de ligação decarboidrato (CBM).
Efeito dos íons de metais, modificadores químicos einibidores potenciais na atividade da enzima
Os efeitos de 1 mM de concentrações finais de umafaixa de cátions mono, di e multivalentes na atividade deEG V, EG VI e EG VII, foram investigados. A atividade foiexpressa como um porcentual relativo a um controle (nenhumIon de metal presente na mistura de incubação) . Em geral,íons de metal pesado são tidos como inativadores de enzimasao formar sais covalentes com cisteína, histidina ou gruposcarboxil. Embora um número dos íons de metal, Mg2+, Zn2+ eMo6+ aprimoraram a atividade de todas as três enzimas eíons como Ag+, Fe2+ e especialmente Mg2+ diminuíramacentuadamente a atividade de EG V-VII. Notáveis diferençasinter-enzimáticas foram observadas para os efeitos deoutros íons de metal. Os sais de cloreto de Na+ e de K+ ounão tinham efeito ou estimularam ligeiramente a atividadede cada enzima, por exemplo, K+ aumentou a atividade de EGVII por 2 0%, enquanto Na+ aprimorou a atividade de EG V por>3 9%. Ba2+ e Ca2+ diminuíram a atividade de EG V por 16,5% e21,5-24,6%, respectivamente, enquanto ambos os íonsaumentaram a atividade de EG VI por 37,6% e 10%. Outroscátions divalentes como Cd2+, Co2+ e Cu2+ exerceram um efeitoinibitório notável em EG V (perda de atividade de -26,5-77,4%). Inibição quase total da atividade de todas as trêsenzimas pelo Hg2+ sugere a presença de um grupo tiolessencial envolvido na catálise. Foi observado que avalência modulou a atividade, por exemplo, Fe3+ exerceu umefeito negativo mais potente na atividade de todas as trêsenzimas (35,4-88,0% de diminuição na atividade), emcontraste com Fe2+, que efetivamente aprimora a atividadede EG V por 20%, tem efeitos mínimos em EG VII e diminui aatividade de EG VI por 38,6% (Fe3+ diminui a atividade deEG VI por 53,6-59,3%). A natureza do contra-ânion, isto é,Cl" verso SO42" teve um efeito profundo na atividade em queambos os sais de um ânion particular foram investigados.Sais de SO42" de Ca2+ e de Fe3+ aprimoraram seletivamente aatividade de EG VII -duas vezes e -4,5 vezes,respectivamente, em relação à atividade observada com o salCl" correspondente. Em contraste, o sal de S042" de Mg2+diminuiu acentuadamente a atividade de EG V (54,2%) e de EGVI (50,1%) em relação ao sal Cl" do mesmo cátion. Umaseleção de reagentes conhecida como modificadora de aminoácido de grupos R em proteínas foram testados por seusefeitos em EG V, EG VI e EG VII, tanto na ausência como napresença de substrato (efeitos protetores de substratopuderam ser observados desta maneira) (ver a Tabela 6) .<table>table see original document page 48</column></row><table><table>table see original document page 49</column></row><table>O potente efeito inibitório de N-bromosucinimida(NBS) sugere o envolvimento de triptofano na ligação e/oucatalise. No entanto, o-ftaldialdeído, outro reagentemodificador de triptofano não tem qualquer efeito líquidona atividade de EG Vi de EG VI ou de EG VII, portanto, BNSpoderia estar modificando outro resíduo de amino ácido como qual ele é conhecido por ter reatividade lateral, porexemplo, cisteína. Ademais, o fracasso do substrato emproteger contra a inativação da enzima eliminaria um papeldireto para o triptofano na ligação ou na catálise. Como acisteína e o ditiotreitol (DTT) ambos protegeram contra ainativação, o efeito de NBS poderá ser devido a reaçõeslaterais, por exemplo, a oxidação da cisteína. Os reagentesde sulfidril iodiacetamide, p-hidroximercuri-benzoato e N-etilmaleimida causam pouca ou nenhuma inibição quer napresença ou na ausência do substrato, que pareceria sugerirque EG V, EG VI e EG VII não têm grupos tiol essenciais. Noentanto, a cisteína, o DTT e o ditioerithitol ativam todasas três enzimas, especialmente EG VI e EG VII, que poderásugerir a redução de um disulfido oxidado talvez durante aextração e/ou purificação da enzima, assim restaurando aconformação nativa da região de sítio ativa da enzima, ou amolécula da enzima como um todo. Borohidrido de sódio, umforte agente redutor, inibe as três enzimas (especialmenteEG VI) na presença de substrato. Em contraste, a oxidaçãode outros grupos reativos no sítio ativo pela ação deagentes de forte oxidação como periodato de sódio, iodina eácido tioglicólico aprimoram notadamente a atividade detodas as três enzimas com os efeitos sendo maispronunciados com periodato de sódio e EG VI, na presença desubstrato. O reagente K de Woodward, um reagentemodificador de carboxilato aprimorou a atividade de EG V,EG VI e EG VII, sendo mais eficaz na ausência de substrato.
Em geral, substâncias fenólicas, como m-fenilfenol, (-) epicatequin, (+)catequina, ácido o-cumárico, ácidocafeico, ácido ferúlico, ácido siríngico, e ácido tânico,para citar apenas alguns dos compostos testados, nãotiveram um efeito inibidor acentuado na atividadeenzimática (na ausência do substrato) com a exceção doácido tânico que é um inibidor potente devido a sua funçãoprecipitadora de proteína. Na verdade, alguns doscompostos, por exemplo, ácido protocatecuico, ácidosiríngico, ácido cafeico e polivinilálcool ativaramacentuadamente todas as três enzimas (resultados obtidosdurante a pré-incubação da enzima com inibidor na ausênciade substrato). No entanto, quando co-incubado com enzima esubstrato, vários dos fenólicos foram observados a efetuaruma diminuição na atividade de -7,32% (o substrato nãoprotegeu nenhuma das enzimas contra o efeito potente doácido tânico).
Em geral, a maioria dos detergentes testados nãoresultou em perda da atividade enzimática. No entanto, oácido taurocólico, o ácido taurodeoxicólico, Tween 20 eTween 80 todos diminuíram a atividade de EG V, por 47,7%,22,7%, 12,7% e 30,8%, respectivamente, quando pré-incubadoscom enzima antes do acréscimo do substrato. Com a exceçãodo Tween 80 (perda de 34,2% de atividade), a incubaçãosimultânea com o substrato restaurou a atividade integral.A atividade aprimorada foi observada quando o substrato, aenzima e detergente (ácido deoxicólico, CHAPS, ácidotaurodeoxicólico e ácido quenodeoxicólico) foram incubadossimultaneamente, por exemplo, a atividade de EG VI foiaumentada >2 vezes na presença do substrato e do ácidodeoxicólico.
Glicosídeos como salicina, esculina e arbutina nãotiveram qualquer efeito aparente na atividade de EG V-VII,similar aos disacarideos melibiose, maltose, sucrose e oalditol, sorbitol. No entanto, concentrações de celobiosede 50-75 mM inibiram acentuadamente todas as três enzimas,especialmente EG V, que também foi inibida pela lactose aconcentrações >75 mM. A lactose também efetuou -50% deinibição de EG VI e de EG VII a atividade de BBGase aconcentrações de -120 mM. Glucono-S-Iactona e glucoheptono-1,4-Iactona também inibem EG V-VII mas a concentrações bemmais elevadas (500 a >750 mM para 50% de inibição).
Especificidade do substrato
Extratos crus de T. emersonii, catalisam a hidrólisede uma variedade de polissacarídeos incluindo celulose,CMC, BBG, laminarana, lichenana, xilano, pectina, e umespectro de derivativos de glicosídeos sintéticos. Nenhumadas três enzimas purificadas eram ativas contra 4-nitrofenil derivativos de β-D-xilopiranosídeo, ou a-D-galactopiranosídeo (Tabela 7).
Tabela 7
Especificidades de substrato de EG V, EG VI e EG VIIpurificados de Talaromyces emersonii
<table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table>Ademais, EG V, EG VI e EG VII não exibiram qualqueratividade contra papel de filtro, Avicel, galactomanana degoma de grão de alfarrobeira, e não catalisaram a oxidaçãode celobiose, mesmo em incubação extensa com substrato. Osresultados são expressos em termos de % de atividade emrelação ao controle (atividade contra WG designado o valorde 100%). Todas as três enzimas exibem atividade máximacontra o p-glucanos de ligação mista, BBG e liquenana, comacentuadamente mais atividade neste último substrato.Atividade de traço exibida por todas as três enzimas comxilano em períodos de incubação extensos poderá serexplicado pelo fato de que a preparação de xilano de aveiaSpelts utilizada continha quantidades contaminantessecundárias de p-glucano.
Após realizar análise similar em cada uma das enzimasexpressas, um sistema de enzima foi projetado utilizandoenzimas purificadas de Talaromyces emersonii para adegradação de material não-celulósico como folhas de chá,pó de alfarroba e outros materiais similares.
A Tabela 8 dá um exemplo das quantidades relativas deatividades enzimáticas diferentes para este sistema deenzima.
Tabela 8
Sistema para conversão de materiais não-celulósicos, porexemplo, folhas de chá, pó de alfarroba
<table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table>
Exemplo 5:
Sistema de T. emersonii para converter celulose,dejetos ricos em celulose e celooligosacarídeos
Talaromyces emersonii IMI383751 foi crescida em umavariedade de dejetos de papel e produtos de papel comosubstrato. As enzimas excretadas foram extraídas e aexpressão de enzima foi monitorada e quantificada poranálises de proteoma e de transcriptoma e por um espectrorigoroso de ensaios funcionais. Vários dejetos de papelprovaram ser excelentes indutores de celulases (eatividades complementares, por exemplo, enzimashidrolisadoras de amido, em que produtos de papelrevestidos/acabados foram utilizados). Diferenças foramclaramente evidentes com relação às quantidades/tiposrelativos de enzimas de celulase induzidas por diferentesprodutos/dejetos de papel. Os dados obtidos confirmaram queas isoenzimas celobiohidrolase I (CBH I) e celobiohidrolaseII (CBH II) foram as atividades de celulase maisimportantes e, quando era desejado a mais completasacarificação/bioconversão da celulose no substrato alvo(por exemplo, geração de matéria prima rica emmonosacarideos para produção de biocombustível) , β-glucosidase I (BG I) também foi muito importante.Placas de papel induziram níveis admiráveis deatividade degradadora do papel de filtro (FP) (1573 IU/g,em que IU representa pmoles de produto formado/tempo dereação em min/substrato indutor g), baixos níveis deendocelulase (27,5 IU/g) e baixos níveis de {3-glucosidase(6,05 IU/g). Ao nível de transcriptoma, CBH I foi o maisabundante/altamente expresso celulase, uma observaçãocomplementada ao nível funcional com 242,0 IU/g deatividade do tipo CBH I sendo detectada. As enzimasproduzidas durante o crescimento em copos de papel eramsignificativamente mais exo-atuantes, com 495,0 IU/g deatividade FP e 53,9 IU/g de p-glucosidase sendo detectada.
Neste último exemplo, a expressão de gene e ensaiosfuncionais indicaram que CBH II foi a celulase chave(níveis de transcrito e de enzima para CBH II foram ~2vezes os níveis correspondentes para as enzimas CBH I). CBHII foi novamente a celulase chave induzida por papelmarrom, papelão corrugado e papel de escritório branco.
Sistemas de enzima individuais, e combinações deles (porexemplo, para a amplificação de atividades chaves oulaterais/acessórias) foram mostradas como sendo ferramentaseficazes para a conversão de celulose (ehemiceluloses/outros carboidratos) em uma ampla variedadede materiais virgens, secundários e de dejetos ricos emcelulose.
Enzimas foram isoladas e analisadas por procedimentosconvencionais (Walsh (1997) e et al, 2002).
CBH IA, contendo traços de xilanoase como a únicaatividade contaminante, eluiu a uma concentração de NaClentre 115 e 170 mM. Frações 52-66 foram reunidas edializadas por 16 horas contra 4 mudanças de 100 mM detampão de acetato de amônia, pH 5,0, e submetido àcromatografia de afinidade em uma coluna (1,4 χ 11,3 cm) deCH-Sefarose 4B substituído por p-aminobenzil-l-celobioside.
A atividade de xilanoase contaminadora residual não ligou efoi eluída na aplicação e tampões de lavagem. CBH IA foieluído utilizando 0,1 M de lactose em 100 mM de tampão deacetato de amônia, pH 5,0. Frações 13-21 foram reunidas,dializadas contra água destilada para remover a lactose earmazenada a 40C até ser utilizada.
CBH IB da etapa de troca de ânion (DE-52 a pH de 5,5)foi dializada verso 100 mM de tampão de acetato de amônia,pH 5,5 e aplicada na coluna de afinidade como para o CBHIA. As atividades contaminantes residuais, essencialmenteendoglucanase, não ligaram à matriz de afinidade e forameluídos na lavagem. CBH IB foi especificamente eluídoutilizando 0,1 M lactose em tampão de afinidade. As frações43-48 foram reunidas e dializadas contra água destiladapara remover a lactose e armazenada a 4 0C até serutilizada.
Com base na análise acima, o sistema de enzimaseguinte foi projetado utilizando enzimas purificadas deTalaromyces emersonni para a degradação de dejetos de papele produtos de papel, e outros dejetos contendocelooligosacarídeos.
Tabela 9
Sistema para conversão da celulose, dejetos ricos emcelulose e celooligosacarídeos _
<formula>formula see original document page 57</formula><table>table see original document page 58</column></row><table>
Exemplo 6: Sistema de espécies fungais termofílicas,Chaetomium thermophile e Thermoascus aurantiacus
A estratégia delineada para projeto de sistemas deenzimas/composições termozime de T. emersonii IMI393751 emutantes conhecidos anteriormente foi adaptada para aprodução de composições modificadores de carboidratos pormais de 23 espécies fungais mesofílicas e termofílicas.Atenção particular foi dada à produção/indução dehelicelulase potente (xilanoase, mananase) e sistemas deenzima ricos em pectinase por estas espécies fungais.
Chaetomium thermophile e Themoascus aurantiacus foramcultivados individualmente em fermentação líquida, comodescrito anteriormente, no meio de nutriente de T.emersonii contendo 1-6% de fonte de carbono indutora(produção de enzima por fermentação sólida também foiinvestigada) . Um sistema de enzima de degradação de mananpotente foi obtido pelo cultivo de C. thermophile por 96-120 horas em dejeto de café. A composição deste sistema foicaracterizada e mostrada como contendo 45-60% de atividadeshidrolizadoras de manan, 0,7-4,0% de enzimas modificadorasde pectina, 35,2-52,0% de atividades modificadoras dexilano, com o restante sendo atribuído a atividades decelulase (CBY muito baixo ou traço e β-glucosidase foramobservados).
O cultivo do mesmo fungo em farelo de soja produziu umsistema de enzima xilanolítico potente (70,2-86,5% deatividades totais sendo atribuídas às enzimas modificadorasde xilano); -10,6-28,0% e -8,6-22,5% das atividadesmodificadoras de carboidratos restantes foram atribuídas acelulase, pectinolítica e baixos níveis de enzimasmananolíticas.
De modo similar, um potente sistema de enzimamodificador de pectina foi induzido durante o cultivo deTh. aura.ntia.cus em farelo de trigo e polpa de beterraba(1:1), com >56,5-80,% do perfil de atividade modificadorade carboidrato total sendo representado pelas atividadespectinolíticas; este sistema de enzima também contínua-22,1-40,1% de enzimas modificadoras de xilano, com orestante sendo essencialmente atividades modificadoras decelulase/p-glucano. Em contraste, o cultivo de Th.aurantiacus em farelo de soja induziu um potente sistema deenzima zianolítico (>62,1-85,8%), complementado por -3,5-11,0% de enzimas modificadoras de pectina com as atividadesrestantes sendo predominantemente modif icadoras de ]3-glucan. Em contraste ao C. thermophile, Th. aurantiacus nãoelaborou níveis significativos de enzimas degradadoras demanan durante o cultivo em nenhum dos dois substratos.
Esses sistemas, por eles próprios e em combinação umcom o outro ou com outros sistemas de enzima (por exemplo,T. emersonii) foram mostrados como efetuando extensasacarificação (liberação de açúcar) de uma ampla gama dediferentes materiais agrícolas, alimentos/verduras,bebidas, madeira/papel e outros materiais virgens e dedejetos ricos em carboidratos, e podem ser utilizados paraa geração de produtos oligosacarídeos especializados oumateriais primas ricas em açúcar para uma ampla gama deaplicações biotecnológicas (por exemplo, produção debiocombustível).
Exemplo 7: Sistema de T. emersonii para a geração dematérias primas ricas em açúcar de alimentos/bebidas, papele dejetos madeirosos, a serem utilizados na produção debiocombustível.
(a) Bioconversão de um dejeto de alimentos/bebidas:polpa/bagaço de maçã
Dejetos de maçãs (em polpas), polpa e bagaço de maçãforam obtidos de fornecedores de frutas locais, efornecedores de produção de cidra/bebidas. T. emersonii foicultivado em 2-6% de bagaço/polpa de maçã (ambos porfermentação sólida e líquida) e altos níveis de uma gama deenzimas modificadoras de carboidrato foram mensuradas. Estesistema foi caracterizado por altos níveis de hidrolases dep-glucanos, principalmente β-glucanases não celulósicas(-27,4% em 120 horas de filtrados de cultura líquida),quantidades substanciais de exo-glicosidases chaves comníveis especialmente elevados de α-arabinofuranosidase(13,3% da atividade de carbohidrase total) e β-galactosidase (22,6%). Enzimas de esterase, pectina exilano-modificadoras adicionais também foram detectadas(>7,2-33,5%). Assim utilizando a análise acima, é possívelprojetar um sistema de enzima adequado para degradar dejetode maçã.
Os estudos iniciais utilizaram um carregamento deenzima que continha 2.344 nkat xilanoase, 5.472 nkat de β-glucanase ligado misto e 8.529 nkat de liquenanase porsubstrato de 3,6 Kg e uma temperatura de reação de 70° foiutilizada. A pasteurização completa do hidrolisado foialcançada a 70°C, e o hidrolisado foi utilizado paraalimentar reatores anaeróbicos de fluxo ascendentetermofilico (UAHR), 100% de utilização da matéria prima deaçúcar foi observada, com produção concomitante de metano(50-70% no fluxo de biogás). Estudos de otimizaçãosubseqüentes foram conduzidos, que demonstraram que aincubação a 80°, com agitação suave (-12,6 rad/s) por umperíodo de 24 horas com aproximadamente 2/3 da dosagem deenzima original, atingiu -87% de sacarificação doscarboidratos presentes para açúcares simples efermentáveis.
Os açúcares produzidos por este sistema de enzimapodem ser utilizados como matéria prima rica emmonossacarídeos para a produção de biocombustível.
(b) Bioconversão de dejetos de papel: copos de papel eprodutos do papel
T. emersonii foi cultivado sem suplementação em umavariedade de dejetos de papel em fermentação líquida (verExemplo 5). Copos de papel provaram ser indutores decarbohidrase muito eficientes, produzindo um coquetel deenzimas multi-componentes potente com altos níveis dexilanoase e atividades enzimáticas degradadoras de amido, eníveis de atividades de celulase mais elevadas do que areportada em substratos de crescimento convencionais.O potencial deste sistema de enzima para liberar comeficiência açúcares de redução e efetuar a degradação dedejetos de papel foi claramente ilustrado por testesbioquímicos e microscopia eletrônica de varredura. 0 efeitodo tratamento de termozima na integridade e morfologia dosubstrato utilizando a microscopia eletrônica de varredurapara confirmar o potencial desses coquetéis comoferramentas biotecnológicas potentes para a conversão dedejetos de papel. SEM forneceu provas claras para adegradação de fibra de celulose extensa (perda completa daestrutura da fibra em certas amostras) após o tratamento dosubstrato rico em celulose com os coquetéis de T.emersonii.
O coquetel de enzimas produzido pelo T. emersonii após108 horas de crescimento em copos de papel contém umabateria de enzimas degradadoras de celulose, hemicelulose eamido e estudos de sacarificação conduzidos com estecoquetel multi-componente demonstra sua capacidade deliberar com eficácia glicose e outros açúcares de reduçãodos substratos convencionais de celulose e dejetos depapel. Este coquetel de enzimas foi verificado como sendoativo em todos os substratos de dejetos de papel e decelulose convencional analisados. Embora todos ossubstratos tenham sido crescentemente degradados com otempo, diferentes susceptibilidades à biodegradação foramexibidas em resposta às diferentes composições desubstrato.
Antes de qualquer pré-tratamento a embalagembiodegradável mostrou a susceptibilidade mais forte nosentido da hidrólise enzimática seguida de lenço de papel,copos de papel e papelão corrugado. 0 sistema de enzimainduzido por copo de papel funciona otimamente, liberandoníveis de açúcar máximos de dejetos de papel, a umatemperatura de 50°C, pH de 4,5, a uma dosagem de enzima de4 mL/g de substrato e enquanto agita a 3,9 rad/s. Ahomogeneização dos copos de papel aumentou o nível dehidrólise por 2,3 vezes. Sob essas condições experimentais(dosagem de enzima de 36 FPU) (unidades de filtro de papel)uma hidrólise porcentual total de 85% foi alcançada, com aglicose sendo responsável por -80% dos açúcares de reduçãoliberados. A glicose e a xilose foram os principaisprodutos liberados (ver a Figura 3). No entanto, diminuir adosagem de enzima para 9 FPU efetuou uma hidrólise geral de-76%. A microscopia eletrônica demonstrou as excelentespropriedades hidrolíticas deste coquetel (Figura 4).
0 tratamento por calor aumentou a conversão do papelãopelo mesmo sistema de enzima, por um fator de 34% (umahidrólise de carboidrato geral com base em açúcares deredução liberados de -88%), enquanto a combinação tanto dotratamento por calor como homogeneização aumentou osaçúcares de redução liberados por 80%, produzindo 1,47mg/ml de glicose (31,7% dos açúcares totais liberados).Pratos de papel foram degradados rapidamente pelo coquetelde enzimas induzido por copos de papel, com a glicoseapresentando -67% dos açúcares totais liberados.
A sacarificação enzimática de dejetos de papel e dealimentos foi investigada em Hidrólise Seqüencial eSacarificações (SHF), isto é, pré-tratamento por enzimasseguido por fermentação por levedura para produzir etanol,e em Hidrólise Simultânea e Sacarificação(SSF) , em que amatéria prima é continuamente gerada e imediatamentefermentada pela levedura. As temperaturas de reação pré-tratamento enzimático são diferentes em ambos os processos,isto é, mais alto em SHF à medida que o hidrolisado éresfriado antes da fermentação, e a uma temperatura próximadas temperaturas ambiente para o crescimento da levedura ea fermentação em SSF. Embora as enzimas de T. emersoniiIMI393751 sejam mais eficientes e com taxas de reação maisaltas, e a pasteurização é alcançada (e menos enzima énecessária), as enzimas T. emersonii ainda funcionambastante bem a 25-37°C e comparam bem com preparações deenzimas comerciais de outras fontes fungais. As matériasprimas ricas em açúcar produzidas verificaram-se seradequadas para a produção de biocombustível (bioetanol ebiogás).
(c) Bioconversão de resíduos de madeiras moles para aprodução de bioetanol
Resíduos madeirosos e dejetos de fontes primárias esecundárias (por exemplo, cascas, gravetos, e dejetos deprocessamento, como cepilhas e pó de serra) representam umamplo recurso com até 65-70% de seu peso seco compreendendocarboidratos complexos como hemicelulose (-19-28% eessencialmente xilanos e mananas com alguns outrospolisacarídeos) e celulose (-39-46%), que estão envoltas emlignina.
T. emersonii IMI383751 foi crescido em fermentaçãolíquida ou de estado sólido, em resíduos madeirosos, comopó de serra de espruce sitka e cepilhos de cinza para gerarsistemas de enzimas com o perfil aproximado de enzimas paraconversão do dejeto alvo. Diferentes temperaturas dereação/pré-tratamento e dosagens de enzimas foraminvestigados. Os sistemas de enzima avaliados incluíramcoquetéis obtidos durante o crescimento de T. emersonii emuma variedade de substratos. Temperaturas de reação de50°C, 60°C, 70°C e 80°C foram investigadas, e um número desubstratos diferentes foi utilizado, isto é, resíduosmadeirosos não tratados e pré-tratados. 0 carregamento daenzima também foi investigado, com estudos iniciaisiniciando com 60 FPU, posteriormente aumentado até 200 FPU(FPU: unidades de papel de filtragem, uma medida daatividade de celulase total).Tabela 10
Sacarificação de resíduos madeirosos por T. emersonii(coquetel WB/BP (1:1) _
<table>table see original document page 65</column></row><table>
Teor de hexose é dado como g liberada de um lote inicial de10g em período de relação de 24 horas
• Mistura = coquetel de T. emersonii WB/BP 1:1 + dejetode café induzido de C. thermophile
• A hidrólise sob condições untampãoed e tampãoed foiinvestigada, como foi o efeito de níveis de umidade dereação e dosagem de enzima
Os efeitos da dosagem da enzima nas produções teóricasde etanol são apresentados na Tabela 11.
Tabela 11
Efeito da dosagem de enzima em % de conversão e produçãoteórica de etanol
<table>table see original document page 66</column></row><table>
*Mistura = T. emersonii (coquetel WB/BP (1:1)) + dejeto decafé induzido de C. thermophile; Teor de hexose é dado comog liberado de um lote inicial de 10 g em um período dereação de 24 horas
Exemplo 8: Sacarificação de biomassa madeirosa
Preparo do substrato de teste: Pastilhas de espruce(2-10 mm de diâmetro) foram impregnadas com dióxido deenxofre (3% m/v umidade) por 2 0 minutos à temperaturaambiente a uma taxa de absorção de 2,5% w/w de umidade. Oespruce tratado com SO2 foi tratado com vapor a 215°C por 2a 5 minutos. O teor de hemicelulose foi quase quecompletamente hidrolizado; a recuperação de sólidos foi de60-65% da matéria prima inicial.
Enzimas MGBG Termoenzimas: Numeradas MGBGl, MGBF2,MGBG3 e MGBG4. As enzimas comerciais utilizadas foramCelluclast 2L de T. reesei e Novozym 188 de A. Niger (NovoIndustri A/S, Bagsvaerd, Dinamarca.
Avaliação da hidrólise enzimática
A hidrólise enzimática padrão foi realizada a 37°C,50°C e a 60°C em 300 mL, em vasos de reação de IL e de 10L,com agitação a -13,6 rad/s. A dosagem de enzima foi de32FPU de cada preparo de enzima por g de celulose em umasolução de substrato com tampão (Gilleran, 2004). 0 pH dotampão da reação foi ajustado para pH 5,0 para as enzimasMGBG e pH 4,8 para as preparações comerciais. Amostrasforam removidas a intervalos cronogramados e a açãoenzimática foi terminada ao ferver cada mistura de reação(e controles) por 10 minutos. Nas temperaturas de reaçãomais baixas (37-50°C) , duas das preparações de enzimas dainvenção efetuam tão bem quanto a preparação Celluclastcomercial, e (ii) o desempenho de 3 das enzimas MGBG estána mesma faixa que o Celluclast comercial (e a misturaCelluclast/Novozym).
A produção de glicose utilizando a composição dainvenção foi similar às preparações comerciais otimizadas,mas elas produzem níveis mais altos de açúcaresfermentáveis adicionais do que as enzimas comerciais.
As preparações de enzima da invenção tiveramdesempenho superior às enzimas comerciais/misturascomerciais nas condições de reação mais elevadas (60-70°C),em termos da extensão de hidrólise geral, produção doproduto e estabilidade da enzima. Uma dosagem de enzimamais baixa poderia ser utilizada às temperaturas de reaçãomais altas para atingir um desempenho de hidrólise similar(dependendo da preparação da enzima, apenas 62,5-78% docarregamento da enzima comercial é necessário). Elas tambémsão menos afetadas por substâncias inibitórias presentes nosubstrato pré-tratado por vapor e concentrações mais altasde glicose e de celobiose nos hidrolisados ricos em açúcar.
Elas também produzem uma quantidade maior de açúcar em 24horas a 60°C do que as enzimas comerciais atingem em7 2horas a 50°C, a temperatura de trabalho ótima para asenzimas comerciais.
Os resultados chaves para a hidrólise enzimática sãoapresentados na Tabela 12, enquanto as melhores combinaçõesde temperatura de reação/tempo de reação para um porcentualde hidrólise ótimo, para cada uma das composições comerciale de enzima da invenção testada são dadas na Tabela 13.<table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table><table>table see original document page 71</column></row><table><table>table see original document page 72</column></row><table>Tabela 13
Combinações de temperatura de reação/tempo de reação paramáxima porcentagem de hidrólise, para cada uma das enzimascomerciais e MGBG investigadas
<table>table see original document page 73</column></row><table>
Sacarificação e Fermentação Simultâneas (SSF)
Experimentos SSF em lote com hidrolisado de espruceforam realizados para comparar o desempenho de diferentespreparações de enzima. A fermentação foi realizada a umaconcentração de fibras de espruce de 4%, o material pré-tratado foi diluído com água estéril na concentraçãodesejada. 0 pH foi mantido em 5,0 com o acréscimo de NaOH2M. A temperatura de fermentação foi de 37°C e a velocidadedo misturador foi de 52,3 rad/s. 0 meio reator foiespargido com nitrogênio (600 ml/min) e o teor de CO2 foimedido com um analisador de gás. A preparação de enzima foiacrescentada diretamente no fermentador a uma carga de 25unidades de papel de filtragem (FPU)/g de celulose. 0 meiode fermentação foi suplementado com nutrientes: 0,5g/l (NH4) 2HPO4, 0,025 g/l MgSo4.7H20 e 1,0 g/l de extrato delevedura (levedura de padaria, Saccharomyces cerevisiae)massa celular acrescentada foi de 5 g/l e todos osexperimentos SSF foram realizados a 37°C por 72 horas.
Amostras foram retiradas a vários intervalos de tempo,foram centrifugadas em tubos de microcentrífugas de 1,5 mla 14.000 g por 5 minutos (Z 160 M; Hemle Labortechnik,Alemanha), o sobrenadante foi então preparado para aanálise HPLC.
Os produtos da hidrólise gerados durante a degradaçãode materiais lignocelulósicos foram analisados por HPLC.Celobiose, glicose, xilose, galactose, manose, HMF efurfural foram separados em uma coluna de polímero (AminexHPX-87P) a 85°C, a fase móvel foi miliporo de água a umataxa de fluxo de 0,5 ml/min. Concentrações de etanol,glicerol e acetato foram determinadas utilizando uma colunaAminex HPX-87H a 60°C utilizando um sistema HPLC Shimadzuequipado com um detector de índice refrativo. A fase móvelfoi uma solução aquosa de 5 mM de H2SO4 a uma taxa de fluxode 0,5 ml/min. 0 etanol produzido também foi determinadoutilizando um ensaio ligado à enzima (r-Biopharm,Alemanha).
O crescimento da levedura ocorre em duas fases. 0dióxido de carbono é um sub-produto importante do processode fermentação de etanol pois a fermentação anaeróbica deum mol de glicose produz um mol de etanol e dois mols dedióxido de carbono. Portanto, a medição da concentração dedióxido de carbono na saída de gás é uma medida indireta dataxa de fermentação. Na primeira fase de crescimento aglicose disponível é consumida e etanol é formado, e aresposta rápida inicial à glicose presente é representadapor um pico na evolução de CO2.
Os resultados obtidos durante a SSF são dados naTabela 3. Como foi mencionado anteriormente, o tempo totaltomado para o SSF, para cada preparação de enzima foi de 72horas, e a temperatura utilizada para o SSF foi de 37°C. Aeficiência da fermentação foi determinada ao dividir aconcentração efetiva de etanol produzido (g/L) pelo etanolteórico total (g/L) que seria produzido se todo o substratodisponível fosse convertido a açúcar solúvel e fermentávele todo o açúcar fosse convertido para etano, e multiplicarpor 100.
Com base nos dados obtidos, a produção de etanol paracada combinação de enzima/SSF são dadas em Letanol/tonelada seca, e as unidades americanascorrespondentes, galões de etanol/tonelada seca americana.
Tabela 14
<table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table>
Exemplo 9
Comparação das enzimas comercial e MGBG em umaestratégia de hidrólise e fermentação (SHF) para a produçãode bioetanolAs produções de bioetanol obtidas pela hidrólise efermentação seqüencial, foram investigadas para aspreparações comercial e da enzima da invenção. Uma vantagemdo SSF é que o processo consiste de uma fermentação rápidainicial e metabolismo dos açúcares monoméricos resultantesda etapa de pré-tratamento. Uma vez liberada a glicose dosubstrato pela ação das enzimas hidrolíticas que foramacrescentadas, a fermentação é rápida, o que significa que,no SSF, a concentração de açúcares livres sempre permanecebaixa. No SSF, a taxa de fermentação eventualmente diminuicomo resultado quer de uma diminuição na taxa de conversãodo substrato pelas enzimas, ou a inibição do metabolismo dalevedura, seja qual for aquela cuja taxa é limitante. Osdados obtidos nesses experimentos estão resumidos na Tabela 15.
Tabela 15
Resumo dos experimentos SHF
<table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table>
* Preparação da enzima utilizada a uma temperatura de reação mais alta.
% Este coquetel de enzimas é particularmente eficaz na liberação de açúcares fermentáveis de substratos ricos em hemicelulose e não se esperaria que fosse tão eficaz em um substrato que tem uma parte significativa da fração de hemicelulose removida (etapa do pré-tratamento).
A análise HPLC confirmou que os principais produtosformados são monossacarídeos (açúcares únicos) comquantidades muito pequenas de oligômeros mais altosformados (celobiose, que é um dissacarídeo, sendo oprincipal, ou único, açúcar de cadeia mais alta presentenos hidrolisados).
Exemplo 10: Aplicações em rações para animais
Cada composição de enzima foi avaliada em aplicaçõesalvo individuais, com estudos modelos conduzidos em escalade laboratório com 5-25 g do substrato (cereal, farinha decereal ou outro resíduo de planta) em volumes de reaçãofinal de 50-250 mL, a um pH entre 2,5-7,0 e 37-85°C, com ousem agitação. O desempenho da enzima foi avaliado com e sempré-tratamento do substrato, isto é, pré-tratamento comvapor suave (105°C, 8 p.s.i. por 5 minutos), moenda usandoum pilão e armação, homogeneização em um homogeneizadorParvalux ou Ultraturrax. Para frutas moles etecidos/resíduos de vegetais, o substrato foi maceraaogrosseiramente por mistura, e incubado com a enzima, sempré-tratamento. A hidrólise do substrato foi monitorada por(i) medição dos açúcares de redução liberados e ensaiospara detectar e quantificar açúcares individuais, (ii)análise HPLC e TLC confirmatória dos produtos de açúcar dahidrólise, (iii) análise da redução do peso/volume doresíduo, (iv) comparação do teor da celulose, dahemicelulose, do amido e da pectina antes e após otratamento enzimático, e (v) análise física da degradaçãodo substrato por microscopia eletrônica de varredura (SEM)para substratos fibrosos como papel e dejetos madeirosos.<table>table see original document page 80</column></row><table><table>table see original document page 81</column></row><table><table>table see original document page 82</column></row><table><table>table see original document page 83</column></row><table><table>table see original document page 84</column></row><table><table>table see original document page 85</column></row><table><table>table see original document page 86</column></row><table><table>table see original document page 87</column></row><table><table>table see original document page 88</column></row><table><table>table see original document page 89</column></row><table><table>table see original document page 90</column></row><table><table>table see original document page 91</column></row><table>Para alimentos enriquecidos em oligosacarídeos chaves,por exemplo:
Galactooligosacarídeos - coquetel de enzimas MGBG 16 émelhor
Glucooligosacarídeos - MGBF 16 e 22 são os melhoresFructooligosacarídeos - coquetel MGBG 21 é o melhorPara as preparações de alimentos enriquecidos porantioxidantes, os melhores coquetéis a usar para tratamentosão aqueles preparados com: MGBG 13, 16 e 23.
Exemplo 11: Aplicações de alimentação de animaismonogástricos:
Estudos foram realizados a temperaturas acima da faixade 50-85°C (com agitação a 14,7 rad/s), com frações decereais grosseiros (lotes de 1-5 g). A hidrólise decarboidratos no substrato, por cada preparação de enzimadosagem máxima de 0,5 IU por g de substrato), foimonitorada durante 24 horas ao quantificar os açúcaresredutores liberados, e os produtos formados em amostrasremovidas da mistura de reação a intervalos periódicos.<table>table see original document page 93</column></row><table><table>table see original document page 94</column></row><table><table>table see original document page 95</column></row><table><table>table see original document page 96</column></row><table>Hidrólise significativa do xilano e da fração de J3-glucano não-celulósica foi observada, que resultou naformação de produtos oligosacarídeos de cadeia média a maislonga da hidrólise, que também seriam substratos defermentação adequados para microorganismos probióticos.
Produção de biogás de exemplo
Dois reatores híbridos anaeróbicos de fluxo ascendentede 10 L (UAHR; Reynolds, 1986) , um mantido a 37°C e o outroa 55 °C foram utilizados para a produção de biogás porpopulações mistas individuais de bactérias mesofílicas etermofílicas, respectivamente. 0 hidrolisado rico em açúcarfoi bombeado através da cama de lama e degradado pelascomunidades de microorganismos presentes. Um dispositivoseparador no topo do reator foi utilizado para separar ogás produzido de qualquer partícula de lama que possa haversido solta durante a digestão anaeróbica. Ambos os reatoresforam avaliados continuamente por todo o período deoperação de 650 dias ao monitorar a eficiência da remoçãode COD (APHA, 1992) , redução de carboidratos totais (métodode Dubois) e produção de metano. A produção de ácidosgraxos, um indicador do metabolismo do açúcar, e a produçãode metano foram monitoradas por cromatografia gasosa (GC).
0 biocombustível pode ser produzido de um número dematérias primas. Muitas delas exigem a utilização dediferentes coquetéis de enzimas. MGBG 16 é o melhorcoquetel para a produção de matérias primas dos dejetosalimentares e de vegetais listados abaixo para a produçãode biogás pela digestão anaeróbica.<table>table see original document page 98</column></row><table><table>table see original document page 99</column></row><table><table>table see original document page 100</column></row><table>Os dados na Tabela 18 foram alcançados com tempos deretenção de apenas 3 dias, em contraste com relatórios naliteratura, em que tempos de retenção são normalmente entre9 a 30 dias. Os tempos de retenção indicam o período levado(ou fase de atraso) para o metabolismo da matéria prima decarboidrato e a produção do biogás.
Exemplo 12: Produção de bioetanol
A hidrólise enzimática padrão foi realizada a 37°C,50°C, e 60°C em 300 mL e contâineres de 1 L com agitação a-13,6 rad/s. A dosagem de enzima foi de 32 FPU de cadapreparação de enzima por grama de celulose em uma soluçãode substrato em tampão (conforme descrito por Gillera,(NUI, Galway, Tese de Ph.D., 2004) peso total processado =100g em estudos em escala de laboratório). O pH do tampãoda reação foi ajustado para pH 5,0. Amostras foramremovidas a intervalos cronometrados e a ação enzimáticafoi terminada por fervura por 10 minutos. Por um período de0-72 horas foi mensurado o seguinte:
· Liberação de açúcares de redução e detecção equantificação dos açúcares individuais (expressoscomo g/L)
• Análise de HPLC dos produtos de açúcar da hidrólise(quantidades do produto expressas em g/L)
· Redução no peso/volume do resíduo
• Teor de fibra de celulose antes e após o tratamentoenzimático.
A microscopia eletrônica de varredura (SEM) daintegridade do substrato antes e após o tratamentoenzimático. A produção de ácidos graxos chaves durante ometabolismo dos açúcares pelas bactérias anaeróbicas, e aprodução de metano, foram monitoradas por cromatografiagasosa (GC). O bioetanol produzido por fermentação delevedura foi medido utilizando duas abordagens, um kit deensaio ligado a enzima para quantificação do etanol (r-Biopharm, Alemanha) e também por cromatografia líquida dealto desempenho (HPLC).
0 hidrolisado de espruce Sitka, dejeto de papel eresíduos madeirosos (mistura de resíduos de coníferas,essencialmente espruce Sitka) foram testadas em estudos emescala de laboratório. Dois formatos de produção de etanolforam investigados, SHF (Sequential Hydrolysis andFermentation - Hidrólise e Fermentação Seqüencial) e SSF(Simultaneous Saccharification and FermentationSacarificação e Fermentação Simultâneas)
Tabela 19
Composição de coquetel de enzimas para produção debioetanol
<table>table see original document page 102</column></row><table><table>table see original document page 103</column></row><table><table>table see original document page 104</column></row><table><table>table see original document page 105</column></row><table><table>table see original document page 106</column></row><table><table>table see original document page 107</column></row><table><table>table see original document page 108</column></row><table><table>table see original document page 109</column></row><table><table>table see original document page 110</column></row><table><table>table see original document page 111</column></row><table><table>table see original document page 112</column></row><table><table>table see original document page 113</column></row><table><table>table see original document page 114</column></row><table><table>table see original document page 115</column></row><table><table>table see original document page 116</column></row><table><table>table see original 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177</column></row><table><table>table see original document page 178</column></row><table><table>table see original document page 179</column></row><table><table>table see original document page 180</column></row><table><table>table see original document page 181</column></row><table><table>table see original document page 182</column></row><table><table>table see original document page 183</column></row><table><table>table see original document page 184</column></row><table><table>table see original document page 185</column></row><table>Vários dos coquetéis listados acima possuem aplicaçõesem uma ampla gama de outras aplicações. Nessas aplicações,as principais diferenças no uso dos coquetéis situam-se em(a) dosagem da enzima, ou quantidade utilizada em cadatratamento, e (b) a duração da incubação. Por exemplo, MGBG18 é muito bem adequado no tratamento de certos fluxos dedejetos, bem como em aplicações nutracêuticas. Nas etapasde tratamento de 'dejetos'/sacarificação, uma dosagem maisalta da enzima é utilizada e o tempo de reação é de 18/24horas (-25-32 unidades de papel de filtragem). A meta finalé alcançar uma extensa decomposição do resíduo alvo paramonossacarídeos fermentáveis. Em contraste, quando aprodução de oligossacarídeos bioativos (querglucoligossacarídeos e xilooligossacarídeos) é necessária,e/oü uma mudança na textura para pães, uma concentração deenzima mais baixa é necessária e o tempo de modificação (oude reação) poderá não levar mais do que 1 (máximo 2) horaspara alcançar o ponto terminal desejado.
Quando o substrato alvo for essencialmente rico emcelulose, as concentrações de enzima teem por base'unidades de papel de filtragem ou FPU' . Quando umoligossacarideo bioativo (por exemplo, J3-glucooligossacarídeo não-celulósico) estiver sendoproduzido, as concentrações de enzima têm por base aatividade principal necessária para fragmentar o substratoalvo (por exemplo, {3-1,3; 1,4-glucanos ou β-1,3; 1,6-glucanos de enlace misto de fontes de fundos ou de algas) .
Exemplo 13
Produção de enzima por cepas de T. emersonii durantefermentação líquidaAs cepas de Talaromyces emersonni examinadas foram:IMI (Imperial Mycological Institute (CABIBioscience))393751 (Patente da cepa), IMI393753 (CBS(Centraal Bureau voor Schimmelcultures)180.68) , IMI393759(CBS 397.64), IMI393760 (CBS472,92), IMI393752 (CBS549.92),IMI393761 (CBS 759.71).
Fermentação líquida: Culturas líquidas replicadas doT. emersonii individual foram criadas a 45°C, no meiodescrito por Moloney et al., (1983) e Tuohy & Coughlan(19 92) , sob condições não controladas de pH. As quatrofontes de carbono selecionadas foram: glicose(monossacarídeo), xilano de trigo de aveia
(arabinoglucuronoxilano), pó de alfarrobeira e uma misturade folhas de chá 1:l/pratos de papel (fragmentado em umliqüidificador por -15-20 segundos, supernatantes dacultura foram recuperados (Tuohy & Coughlan, 1992; Murrayet al. , 2002) e utilizados para analisar a produção deenzima extracelular.
Ensaios de enzima: A atividade enzimática foi expressaem Unidades Enzimáticas Internacionais (IU) por grama defonte de carbono indutora. Uma unidade de IU libera 1micromole do produto (açúcar de redução, 4-nitrofenol,etc.) por minuto. Todos os ensaios de exoglicosidase e deendo-hidrolase das enzimas foram conduzidos conformedescrito anteriormente (Tuohy & Coughlan, 1992; Tuohy etal, 1994, 2002; Murray et al. , 2002; Gilleran, 2004). Amenos que seja dito de forma diferente, todas as mediçõesde atividade inicial foram conduzidas a 50°C e a pH de 5,0.Atividades de exoglicosidase incluíram: {3-Glucosidase, a-Glucosidase, {3-Xilosidase, β-Galactosidase, β-Manosidase,J3 - Fucosidase, α-Arabinofuranosidase, N-Acetilglucosaminidase, α-Ramnopiranosidase, α-Galaetosidase, α-Fueosidase, α-Arabinopiranosidase, α-Manosidase, e a atividade de α-Xilosidase e de a-Glucuronidase foi ensaiada por um método de redução deaçúcar utilizando uma mistura de ácidos aldourônicosreduzidos como substrato (Megazyme International Ltd). Estesubstrato continua ácidos aldotriourônico, aldotetraurônicoe aldopentaurônico reduzidos em uma proporção aproximada de40:40:20. A atividade foi mensurada em pH de 5,0 com umestoque de 5 mg/ml desta mistura. Os grupos de reduçãoliberados durante um período de incubação de 3 0 minutosforam detectados pelo método DNS. Como algumas das amostrasde enzimas continham atividade de β-Xilosidase apreciávelque poderia liberar resíduos de xilose dos ácidos Aldo-urônicos, o ensaio foi repetido e xilose incluída namistura de reação para inibir a atividade de β-xilosidase.
Enzimas xilanolíticas de exo-atuação adicionais como:α-arabinoxilano arabinofuranohidrolase (liberação dearabinose de arabinoxilan de palha de trigo mensuradautilizando um ensaio ligado à enzima), acetil esterase(utilizando substratos de acetato de 4-nitrofenil e de 4-metilumbeliferil), atividade de acetil xilano esterase(monitorar a liberação de acetato do xilano de madeira defaia acetilatado), esterase de ácido ferúlico (ensaioespectrofotométrico e métodos HPLC) também foram medidos.
Atividades endohidrolase incluídas: Xiloglucanase(xiloglucano de tamarindo), Laminarinase (laminarana deLaminaria digitata), endo-1,4-β-glucanase, (referida comoCMCase), com base na atividade contra o substrato comercialde carboximetilcelulose, {3-mananase (galactomanana dealfarroba) pectinase e poligalactronase, ramnogalacturonase(ramnogalacturonana de feijão de soja), galactanase(galactanas pécticos de lupin e de batata como substratos) ,arabinanase (arabinana de beterraba), amilase,glucoamilase, e dextrinase.
Temperatura e pH ótimos e estabilidades: A temperaturaótima para a atividade foi determinada ao realizar osensaios padrão apropriados a incrementos de temperaturapela faixa de 30-100°C, em tampão de ensaio normal (100 mMNaOAc, 5,0) . A variação do pH com a temperatura foi levadaem consideração. pH ótimos foram determinados utilizando osseguintes tampões de pH 2,2-7,6: tampão de cirato-fosfatode potência iônica constante do tipo McIlvaine; tampãoTris-HCl de pH 10. Todos os tampões independentemente do pHforam ajustados para a mesma potência iônica com KCl.
Temperatura e estabilidades de pH foram determinadasconforme descritas anteriormente (Tuohy et al. , 1993;Gilleran, 2004; Braet, 2005).
Determinação de proteína: A concentração de proteínasnas amostras de enzimas (amostras de culturas cruas) foiestimada pela modificação de Bensadoun e Weinstein dométodo de Lowry (Bensadoun e Weinstein, 1976; Lowry et al.,1951) utilizando a fração BSA V como o padrão (Murray etal., 2001) .
Eletroforese e zimografia: Para determinar o perfil deproteínas presentes em filtrados de cultura, um volumeconhecido de cada amostra foi concentrado pela liofilizaçãoe analisado por Native e/ou renaturação SDS-PAGE ou afocalização isoelétrica (IEF; Tuohy & Coughlan, 1992).bandas ativas de Endoglicanase nos géis renaturados SDS-PAGE e IEF foram identificados utilizando uma modificaçãoda técnica de sobreposição de gel de MacKenzie & Williams(1984), (Tuohy & Coughlan, 1992). Para detectar a atividadede exoglicosidase, gels foram incubados imediatamente em50-100 de solução do derivativo apropriado 4-metillumbelliferil glicosídeo (período de reação de 2-30minutos). Bandas ativas de enzima foram visualizadas sobluz UV utilizando um Fluor-S™ Multimanger (Bio-Rad).
Resultados:
O cultivo líquido das cepas foi repetido pelo menos 3vezes, em experimentos independentes conduzidos em períodosde tempo diferentes. Os filtrados de cultura colhidos (120horas) de frascos replicados (para cada combinação decepa/fonte de carbono) foram ensaiados quanto à atividadeenzimática; múltiplos replicados foram ensaiados a umafaixa de diluições de enzima. Além disso, os resultadosforam validados por medições intra- e inter-medições dosensaios, e independência dos testes de volume. Houvediferenças claras entre as culturas em termos de aparênciada cultura e padrão de crescimento. Por exemplo, a cepaIMI393751 produziu rapidamente uma cultura filamentosabastante densa em glicose, enquanto as várias das outrascepas (por exemplo, CBS180.68, CBS355.92, CBS393.64,CBS395.64, CBS397.64, CBS 549.92 e CBS 759.71) exibiram umcrescimento limitado e morfologia atípica, isto é, ausênciade crescimento filamentoso normal e formação de uma massade cultura limitada e de aparência pegajosa. A cepaCBS394.64 produziu uma biomassa de micélios mais baixa, mascresceu como uma cultura filamentosa, enquanto CBS472.92adotou morfologia de pelotas sob condições de crescimentoidênticas. Um ponto no tempo de crescimento de 120 horasfoi selecionado, como estudos anteriores demonstraram que aexoglicosidase extracelular e as atividades endoglicanaseestão presentes em quantidades significativas durante ocrescimento de T. emersonii na maioria das fontes decarbono (em condições não controladas de pH, 'altos ebaixos' das atividades chaves foi observado. No entanto, aatividade máxima é geralmente detectada no sentido do fimdo ciclo de fermentação).
A utilização da glicose foi de aproximadamente 15-25%por 120 horas para muitas das cepas. A cepa CBS394.64utilizou -50-55% enquanto CBS472.92 (que exibiu morfologiade pelota) utilizou -20-25% da glicose no meio. Emcontraste, -95% da glicose no meio de cultura foi utilizadapela cepa da invenção (IMI393751 por 72 horas e nenhumaglicose foi detectada no meio de cultura no ponto de tempoda colheita de 120 horas.
As Tabelas 3IA-D mostram a produção de exoglicosidasesselecionadas pelas cepas. Como é revelado pelos resultados,pode-se observar distinções claras entre a cepa da invençãoe outras cepas de T. emersonii com relação à produção deexoglicosidase.
A glicose não reprime completamente a produção deexoglicosidase pelas cepas de T. emersonii (Tabela 31A). Acepa 393751 produz níveis significativamente mais altos deβ-glucosidase (Bgase) que as demais cepas e o segundo nívelmais alto de N-acetilglucosaminidase (NAGase) durante ocrescimento em glicose. O padrão de produção obtido para acepa 393751 contrasta acentuadamente com aquela para a cepaCBS549.92 (anteriormente CBS814.70). A produção de váriosníveis de atividades de exoglicosidase pela última cepaparece ser reprimida pela glicose. Deve-se observar que osníveis de atividade de exoglicosidase foram medidas emfiltrados de cultura não dialisados e dializados no caso deglicose residual no meio estar inibindo a BGase e/ou NAGasepresentes (padrões similares foram observados nas amostrasdializadas).
A alfarroba induz a produção diferencial deglicosidases extracelulares pelas cepas (Tabela 31B) . Acepa CBS 394.64 produz relativamente nenhuma atividade deexoglicosidase além de uma α-arabinofurosidase. Baixosníveis de todas as exoglicosidases foram produzidos pelacepa CBS3 93.64, CBS495.64 e CBS549.92. A cepa 393751produziu níveis significativos de CE uma ampla gama deexoglicosidades (níveis mais altos de certas atividades,por exemplo, a pectina modificadora de exoglicosidase β-fucosidase).
Produção de Endoglicanase pelas cepas de T. emersonii
A. Produção de Xilanase: Dois dos principais tipos deatividades de endohidrolase necessários para a conversão debiomassa de planta e de resíduos de dejetos ricos empolissacarídeos não-amido são glucanase e xilanase. Detodas as atividades degradadoras de glicano poliméricoensaiadas, a glucanase e a xilanase foram as atividades deglicanase predominantes presentes.
As Tabelas 32A-D apresentam valores para a produção daxilanase por todas as cepas nas mesmas fontes de carbono.Estudos anteriores demonstraram que o tipo selvagem(CBS814.70) e outras cepas mutantes produzem um sistema deenzima xilanolítico complexo (Tuohy et al. , 1993; 1994),com múltiplas endoxilanases. Várias das xilanases isoladasexibem especificidade seletiva no sentido de tiposdiferentes de xilanos, por exemplo, arabinoxilanos,arabinoglucuronoxilanos, glucurononxilanos, mais xilanossubstituídos verso xilanos não substituídos (de resultadosanteriores e os resultados em andamento com as enzimas dacepa da invenção. Como os resultados mostram, a glicose éum forte repressor da expressão de xilanase em todas ascepas de T. emersonii. Níveis significativos de atividadede xilanase ativa contra trigo de aveia arabinoxilano deaveia (OSX) é expressa pela cepa 393751. Este componentenão é ativo contra arabinoxilanos de centeio ou de trigo.
A alfarroba, que é essencialmente rica emgalactomananas (contém algum xilano), é um indutor potentede níveis muito altos de atividade de xilanase contra todosos substratos de xilano pela cepa 393751. 0 papel daalfarroba como indutor de atividade de xilanase potente nãoseria esperado com base no conhecimento de sua composição.
A aparência das culturas obtidas para um número das cepasCBS (após 120 horas) foi significativamente diferente ediferenças morfológicas claras puderam ser observadas entreas cepas 393751 e a CBS549.92, isto é, crescimento demicélios densos (filamentosos) para a IMI393751 e formaçãode uma massa de cultura militada e de aparência pegajosa(não filamentosa) para a cepa CBS549.92. Como é mostrado naTabela 31B, os níveis de xilanase são significativamentemais altos para a cepa 393751 do que qualquer outra. Emcontraste com a cepa 393751, a alfarroba é um indutor muitopobre da xilanase nas cepas CBS3 94.64, CBS3 95.64, eCBS549. 92 . Outra diferença acentuada pode ser observada notipo de atividade de xilanase induzida pela alfarroba. Nacepa 393751, atividade potente é produzida contra todos osxilanos. Nas demais cepas, em geral, muito pouca ou nenhumaatividade contra arabinoxilanos em centeio e em trigo éproduzida. Apenas duas cepas outras além da 393751 produzemníveis apreciáveis de atividade contra ambos dessesxilanos, isto é, a CBS472.92 e a CBS759.71. A análise dezimograma do filtrado da cultura da cepa 393751 reveloualtos níveis de múltiplas bandas de xinalase ativas,incluindo uma nova xilanase bi-funcional que foi isolada.
A mistura folhas de chá/pratos de papel (TL/PPL)também provaram ser um indutor potente da atividade dexilanase na cepa 393751 (Tabela 32C) , e enquanto estamistura de fato induziu a expressão de xilanase nas outrascepas, os níveis eram significativamente mais baixos. Comofoi observado com a alfarroba, foi produzida uma atividadepotente pela cepa 393751 contra todos os xilanos, com quase1,8 vezes maior atividade contra o arabinoxilano de centeio(Rye AX) sendo obtida e atividade mais baixa contra OSX exilano de madeira de faia. Isto sugere a expressãodiferencial de xilanases individuais pela TL/PPL eindutores de alfarroba, que foi suportada subseqüentementepela análise de zimograma. TL/PPL também induz um sistemade enzima xilanolítico multicomponente e atividade deesterase e oxidase/peroxidase complementares na cepa 303751e não nas outras cepas. Essas atividades complementaresaprimoram a eficácia de hidrolases polissacarídicas noscoquetéis de enzimas otimizados para aplicações dedegradação de biomassa chaves (por exemplo, cereais,dejetos de planta, resíduos madeirosos, produtos de papel).Em comparação com a alfarroba, TL/PPL induz produção dexilanase mais alta por todas as cepas (especialmente aatividade contra as arabinoxilanos), mas níveis são bemmais baixos do que para a cepa 393751. Embora OSX seja umindutor conhecido da xilanase em fungos e de fato induziu aprodução de enzimas por todas as cepas, a indução maisacentuada foi com a cepa 393751. No entanto, em contrastecom a cepa 393751, apenas OSX induziu alta atividade dexilanase e TL/OOL foi um fraco indutor da produção dexilanase pela cepa 472.92. 0 padrão de produção de enzimana OSX é diferente daquele obtido com a alfarroba e TL/PPL.Em geral, os resultados para a produção de xilanase em OSXsugerem que a cepa 3 93751 pode metabolizar os substratosgrosseiros muito rápida e eficientemente para gerarindutores solúveis de xilanase. A hemicelulose emsubstratos grosseiros mais complexos é mais acessível aesta cepa. Os resultados também sugerem que os coquetéis deenzimas produzidos pela cepa 3 93751 nesses substratoscomplexos seria mais adequada para a hidrólise de materiaise resíduos de planta grosseiros complexos. Estudos modelose aplicações investigados até agora (por exemplo, conversãode biomassa madeirosa, sacarificação de dejetos vegetais ede alimentos ricos em carbohidratos e OFMSW e cereais)confirmaram o potencial desses coquetéis.
Finalmente, as Figuras 32A-D comparam e contrastam aprodução de xilanase ativa contra os diferentes substratosde ensaio (isto é, 0SX, Rye AX, etc.) pela cepa 393751 e acepa parente CBS549.92 (também a CBS814.70) em todas asquatro fontes de carbono.Produção de Β. Glucanase e Mananase: Estudosanteriores mostraram que o tipo selvagem (CBS814.70) eoutras cepas mutantes produz um sistema de enzimaglucanolítico complexo (Murray et al. , 2001, 2004; Tuohy etal., 2002; McCarthy et al., 2003, 2005), que incluicelulases e uma malha de atividades modificadoras de β-glucan não-celulolítica. Como é observado para o sistemaxilanolitico, múltiplas endoglucanases são produzidas,dependendo da fonte de carbono. Várias das β-glucanasesisoladas exibem especificidade seletiva no sentido de tiposdiferentes de β-glucanos.
As Tabelas 7A-D mostram a atividade contra o {3-1,4-glucano CMS comercial modificado (Signa Aldrich) , {3-1,3;1,4-glucanos de cevada (BBG; Megazyme) e o liquenCetraria islandica (Lichenan; Sigma Aldrich) , xiloglucano(coluna dorsal de {3-1,4-glucano; Megazyme) de Tamarindo egalactomanana de alfarroba (Megazyme). {3-glucanos não-celulósicos estão presentes em concentrações significativasno componente polissacarídeo não-amido de um número deresíduos de plantas, especialmente aqueles derivados decereais. As Tabelas 7A-D ilustram a indução diferencial dasatividades respectivas nas cepas, com o padrão de induçãosendo completamente diferente nas fontes de carbono(grosseiro) mais complexo.
A glicose é um potente repressor da produção deglucanase e de mananase em quase todas as cepas (Tabela33A). Para todas as amostras, as atividades forammensuradas em amostras dialisadas e não-dializadas. Comorevelam os resultados, a alfarroba é um indutor potente dealtos níveis de β-1,3;1,4-glucanase (contra BBG eliquenano) na cepa 393751, os níveis mais altos para todasas cepas testadas (Tabela 33B). Os níveis de β-1,4-glucanase (contra CMC) produzido pela cepa 393751 foram -10vezes mais baixos do que a atividade contra BBG (o nível deCMCase foi mais alto para esta cepa quando comparado comoutras cepas). A xiloglucanase ainda mais baixa foidetectada, com os níveis obtidos para a cepa 393751 sendoos mais altos. A analise por zimograma confirmou que ostipos de componentes de endoglucanase, padrão de expressãoe níveis relativos da expressão dos componentes daglucanase nos respectivos filtrados de culturas de T.emersonii são acentuadamente diferentes. Baixos níveis de(galacto)mananase foram produzidos por todas as cepasdurante o crescimento em alfarroba.
A mistura TL/PPL foi um indutor ainda mais potente dep-1,3;1,4-glucanase (tanto BBGase como liquenase) , e(galacto)mananase, pela cepa 393751 (Tabela 33C). No geralesses resultados destacam a não-equivalência da produção deJ3-glucanase pelas cepas de T. emersonii e confirmam que acepa 393751 é uma fonte excelente de diferentes atividadesde β-glucanase e a mistura TL/PPL induz um coquetel potentedessas atividades.
OSX (Tabela 33D), como esperado, induziu níveis bemmais baixos de {3-glucanase do que a alfarroba ou o TL/PPL.O padrão da produção de enzima é diferente para a as cepas393751 e CBS549.92. Na Tabela 33D, níveis de β-1,4-Glucanase (atividade carboximetilcelulase) foram maisbaixos para a maioria das cepas exceto a CBS397.64, queproduziu níveis duas vezes mais altos do que a cepa 393751(sobre OSX como indutor) , e não foi detectado em filtradosde cultura das quatro cepas (isto é, CBS3 93;64, CBS3 92.64,CBS3 95;64 e CBS549.92). Significativa atividade(galacto)mananase foi produzida durante o crescimento sobreOSX pela cepa 393751 (mais baixa do que com TL/PPL comoindutor) e CBS472.92. A Figura 6A-E compara e contrasta aprodução de glucanase e de mananase sob as condiçõesexperimentais delineadas pelas cepas 393751 e CBS814.70.Em conclusão, os resultados indicam que:a cepa 393751 é um produtor potente de altos níveis deuma faixa de atividades enzimáticas muito importantes, acepa 393751 é a única cepa de T. emersonii que produzníveis muito altos tanto de xilanase como de |3-1,3;1,4-glucanase em duas atividades de polimerização hemicelulase,em indutores de baixo custo (alfarroba e TL/PPL), e
níveis mais altos de atividade foram obtidos sobrefontes de carbono grosseiras assim fornecendo demonstraçãode que a cepa 393751 é uma fonte eficaz de custo de umamalha potente de coquetéis de enzimas.<table>table see original document page 199</column></row><table><table>table see original document page 200</column></row><table><table>table see original document page 201</column></row><table><table>table see original document page 202</column></row><table><table>table see original document page 203</column></row><table><table>table see original document page 204</column></row><table><table>table see original document page 205</column></row><table><table>table see original document page 206</column></row><table><table>table see original document page 207</column></row><table><table>table see original document page 208</column></row><table><table>table see original document page 209</column></row><table><table>table see original document page 210</column></row><table><table>table see original document page 211</column></row><table><table>table see original document page 212</column></row><table><table>table see original document page 213</column></row><table><table>table see original document page 214</column></row><table><table>table see original document page 215</column></row><table><table>table see original document page 216</column></row><table>Exemplo 14
Termoenzimas de Τ. emersonii IMI393751 com potencialpara produção de bioenergia
O objeto foi reduzir o componente biodegradável dedejeto clínico rico em celulose esterilizado, assimreduzindo o volume de dejeto para aterros, e recuperar olíquido enriquecido de açúcares emitido após o tratamentocom enzima e recuperar a energia na forma de bicombustível.
O fluxo de dejetos continha uma alta proporção decelulose (>50%) e consistiu essencialmente de papel, lençosde papel, lenços de limpeza médica e bandagens ricas emalgodão e tecidos, algodão em camada, etc. A principal'fibra' no fluxo de dejetos é a celulose, mas muitosprodutos são 'acabados' com revestimentos depolissacarídeos, agentes de ligação e enchimentos, de modoque uma mistura de enzimas acessórias (a saber,hemicelulase, pectinase e enzimas degradadoras de amido) éessencial para aprimorar a acessibilidade à celulose emelhorar a redução do dejeto ou a conversão para simplesaçúcares solúveis (por exemplo, glicose, galactose, xilose,etc.).
Abordagem experimental
O perfil de atividades de enzimas de endohidrolase ede exoglicosidase em cada um dos 10 coquetéis determoenzima, derivados da cepa 393751, foram determinados(Tuohy Sc Coughlan 1992; Tuohy et al. , 1993, 1994, 2002;Murray et al. , 2001, 2004) . A Tabela 34 resume os níveisrelativos de atividades chaves determinada em uma seleçãodos coquetéis. As preparações de enzima foram acrescentadasem diferentes concentração em lotes de 100 g de STG dedejeto rico em celulose tratado, a 50°C e a 70°C, eincubado por 24-48 horas (a níveis de umidade de 50-60%).Amostras do licor rico em açúcares (e materiais ricos emcelulose, por exemplo, lenço de papel, etc.) foramremovidos periodicamente durante as 4 8 horas e analisadosquanto a (1) redução de peso e de volume, (ii) volume delicor rico em açúcares recuperado, (iii) açúcares deredução liberados, (iv) estrutura física do substrato apóso tratamento enzimático (utilizando microscopia eletrônicade varredura), (v) análise qualitativa dos tipos deaçúcares liberados pelo TLC, (vi) análise quantitativa dosaçúcares produzidos por HPLC, GC-MS e ESI-Q-TOF-MS, (vii)substâncias potencialmente tóxicas para microorganismos defermentação (produção de bioenergia), (viii) esterilidadedos hidrolisados, (ix) produção de bioetanol, e (x)produção de biogás, conforme descrito por Tuohy et al.,1993, 1994, 2002; Murray et al., 2001, 2004,Gilleran (2004)e Braet (2005) .
Resultados
A. Redução do peso e do volume, volume de licor ricoem açúcares recuperado, açúcares de redução liberados
Os pesos dos tratamentos pré- e pós enzimas foramregistrados e estimativas da redução no volume registradaspara todas as preparações de enzima que foram feitas. Osdados de redução de volume e dos açúcares de reduçãoobtidos a 50°C, utilizando os mesmos parâmetros de reação(carregamento de enzima, 6 0% de teor de umidade e um tempode reação de 24 horas), são ilustrados na Figura 7.
Em resumo, 700C por 24 horas a 60% de umidade produziuos melhores resultados em termos de redução do volume paratodos os coquetéis. Em estudos repetidos com os 6 coquetéisselecionados (e com testes replicados), a redução de volumefoi consistentemente entre -60-75% dependendo do coquetel(ver a Figura 8) . Os açúcares de redução liberados foramconvertidos para % de hidrólise ou conversão da celulosepresente que era entre 66-82% da fração rica em celulosepresente no dejeto esterilizado inicial. Uma redução devolume de 60-75% foi obtida em testes de laboratório.
Por lote de 10 0 g, aproximadamente 70-10 0 mL deumidade acrescentada (H2O) foram acrescentadas para trazero teor de umidade final para 50-60%. Os volumes derecuperação do líquido, pós hidrólise enzimática, variou de69-105 mL. Experimentos também foram completados atemperaturas de reação de 75-85°C e diferentes valores depH. Acima de 70°C um aumento marginal (-2-5,5%) nahidrólise geral foi observado, quando comparado com valoresobtidos a 70°C, e embora o pH de 3,5-4,0 produziu níveisótimos de hidrólise, os valores não foramsignificativamente maiores (<5%) do que aqueles obtidosutilizando H2O.
B. Perda física da integridade do substrato, produtosde açúcares gerados e quantidades relativas de cada tipo deaçúcar
SEM demonstrou uma perda significativa na estrutura dafibra de celulose (Figura 9B).
Produtos da hidrólise: Análise qualitativa pelo TLC;Análise quantitativa pelo HPLC
>76-92% do açúcar liberado foi o monossacarídeo paraos 7 melhores coquetéis, e isto consistiu principalmente deglicose, com alguma galactose, manose e xilose. Porexemplo, níveis de açúcar variaram de 0,2-0,55 g/mL e asfaixas de concentração de monossacarídeos determinada peloHPLC foram as seguintes (dependente do coquetel dethermozyme e lote de dejeto):
Glicose: 43-70%; manose: 5-15%; galactose: 4-10%;xilose: 20-30%; celobiose: 4-12% e oligossacarídeos maisaltos: 5-26%.
C. Filtragem para substâncias que são potencialmentetóxicas para microorganismos da fermentação (produção debioenergia) antes e apôs a fermentação, análise daesterilidade dos hidrolisados, e produção de bioetanol e debiogás.
A fração líquida recuperada não pareceu ser tóxica àsespécies de levedura selecionadas para a fermentação doshidrolisados ricos em açúcares para bioetanol, isto é, nãoimpediram o crescimento de S. cerevisiae (levedo depadeiro), Pachysolen tannophilus, Pichia sp., Candidashehatae e Kluveromyces marxianos. Além disso, a análise daprodução de etanol (utilizando um kit de ensaio ligado aoenzima) indicou que os levedos estavam produzindo etanol.
Placas de ágar (contendo o meio de ágar apropriado)foram inoculadas com amostras dos licores ricos em açúcarese dejetos residuais, incubadas sob as condiçõesrecomendadas (para o microorganismo) e analisadas para apresença de colônias (bactéria e levedura) e crescimentoradial (fungos filamentosos). Nenhum crescimento microbialocorreu nas placas inoculadas com os licores ricos emaçúcares e amostras de dejetos dos tratamentos de enzima a70°C, isto é, o estrago microbial (e perda de açúcar) doshidrolisados de dejeto não ocorreu.Produção de bioetanol
A produção do bioetanol de matérias primas ricas emaçúcares por diferentes espécies de levedura, por exemplo,Saccharomyces cerevisiae, Pachysolen tannophilus, Pichiasp., Candida shehatae e Kluveromyces marxianus (e cepas)foi avaliada. Os pontos terminais mensurados incluíram ocrescimento da levedura (e biomassa da levedura), autilização de açúcares, a evolução do CO2 e do etanolproduzido. Duas das digestas de enzimas a 700C(hidrolisados gerados pelos coquetéis 5 & 8 na Figura 8)foram selecionados como as matérias primas para teste paraa produção de bioetanol por todas as espécies de levedurasem culturas em escala de laboratório de 1 L.
As Figuras 10A e 10B ilustram os perfis de produção deetanol obtidos com S. cerevisiae. As produções de etanolsão similares com ambas as matérias primas, embora ocoquetel de thermozyme 8 produza marginalmente maisaçúcares simples no hidrolisado. No entanto, a digesta docoquetel 8 contém pentose mais alta (não fermentada por S.cerevisiae) que aquela gerada pelo coquetel de thermozyme5. A digesta do coquetel de thermonyze 5 contém algumacelobiose (e quantidades menores de celooligossacarideos)que são facilmente metabolizados pela levedura.
Tabela 34
Resultados para um número de combinações de levedura+digesta rica em açúcares
<table>table see original document page 221</column></row><table><table>table see original document page 222</column></row><table>
Análise de produtos de final da fermentaçãopotencialmente tóxicos
Uma gama de técnicas (HPLC, MS) , especialmente GC-MS,foram utilizadas para determinar a presença de produtos definal de fermentação potencialmente tóxicos. Quase completautilização dos açúcares foi alcançada (com a exceção dedigestas ricas em açúcares pentose (xilose, arabinose) paraS. cerevisiae, e produtos de final de fermentação normaisforam detectados, isto é, glicerol, acetato e algum traçode sub-produtos (solventes).
Produção de biogás
Lotes maiores da digesta dos coquetéis 5 e 8 forampreparados para alimentar digestores Upflow AnaerobicHybrid Reactor (UAHR - Reator Híbrido Anaeróbico de FluxoAscendente) mesofílico e termofílico. Os níveis decarboidratos totais dos influentes e dos efluentes de ambosos reatores foram mensurados (Dubois et al. 1956; Protocolode laboratório). Os açúcares de redução presentes emamostras influentes e efluentes foram determinados (Tuohyet al. , 1994) . Para determinar a Demanda de OxigênioQuímico (COD - Demanda de Oxigênio Químico), um volumeconhecido do hidrolisado foi oxidado utilizando dicromatode potássio (ácido sulfúrico concentrado com sulfato deprata como catalisador) , por duas horas (método de testeinternacional; protocolo de laboratório). 0 dicromatorestante foi determinado por titulaçao com uma soluçãopadronizada de sulfato de amônia ferroso. COD e aeficiência da remoção de carboidrato foram mensurados(amostras diárias) por todo o experimento. A atividademetanogênica específica (SMA) das lamas foram analisadasutilizando a técnica de transdutor de pressão (Colleran ePistilli, 1994; Coates et al. , 1996). Uma amostra da lamafoi removida da cama de lama através de uma porta de saídae testes foram realizados quer a 37°C (para a lama doreator mesofílico) ou 55°C (para a lama do reatortermofílico).
Os açúcares presentes na digesta geradaenzimaticamente foram metabolizados rapidamente pelasbactérias tanto nos UAHRs mesofílicos (37°C) como notermofílico (55°C), isto é, redução de 95-97% docarboidrato nas taxas de carregamento de 4,5 g C0D/m3/dia,sob condições não-otimizadas. Os níveis de metano no fluxode biogás obtido foram entre 55-61%, e o tempo de retenção(dias) estimado tomado para metabolizar todo o açúcar eatingir níveis de metano máximos foi de -3,0-4,0 dias. 0 pHdo efluente foi monitorado e não houve qualquer mudançaobservável no pH dos efluentes de qualquer dos reatores.
C. Otimização dos sistemas thermozyme para otratamento de fluxos de dejetos clínicos ricos em celuloseUma combinação de genômica e proteômica funcional foiutilizada para identificar as condições de crescimentoótimo e os substratos a utilizar (com base na informaçãodos 10 coquetéis utilizados nos experimentos iniciais) paraobter um coquetel de enzimas que teria níveis ótimos detodos os componentes de enzimas chaves. Duas combinações deindutores foram selecionadas: uma mistura 1:1 de folhas dechá usadas e dejetos de pratos de papel, e uma mistura 1:1de sorgo e polpa de beterraba não caramelada. Misturasadicionais de coquetéis selecionados dos 10 utilizadosacima também foram preparadas. O novo coquetel e asmisturas foram caracterizadas com relação às enzimascomponentes e sua capacidade de catalisar extensa conversãode celuloses comerciais, hemiceluloses, e dejetos ricos emcelulose esterilizados para açúcares fermentáveis simples.pH e temperatura ótimos para a reatividade máxima daenzima, a estabilidade térmica do sistema de enzimaotimizado e coquetéis misturados, e inibição potencialpelos produtos finais da reação, os açúcares simples, oumoléculas potencialmente tóxicas (compostosfenólicos/derivativos de benzina) foram determinados.
Temperatura ótima
75 - 80 °C com >70-85% de atividade restante a 85°C,dependendo da preparação de enzima/mistura (a atividade daenzima ainda foi detectada a 90-95°C).
Estabilidade térmica
Nenhuma perda real de atividade após 24 horas a 50°C e<5-10% de perda da atividade após uma semana à mesmatemperatura.
A 70°C, <2-20% de perda de atividade nas primeiras 24horas, com <10% de mais perda de atividade daí em diantepor um período de cinco dias.
pH ótimo
Embora as enzimas fossem mais ativas entre o pH de 4-5, >60% da atividade foi observada no pH de 3,0 e no pH de6,8, com todas as enzimas ainda exibindo atividade no pH de7,0. As preparações de enzima eram mais estáveis entre pHde 3,5-6,0 (4-50°C por um período de uma semana).
Embora a taxa de reação/conversão do substrato paramonossacarídeos de fato diminuiu ou atingiu um patamar emque altas concentrações de glicose e outros monossacarídeosestavam presentes, as preparações de enzima ainda estavambastante ativas na presença de altas concentrações (até 100mM) de monossacarídeos (glicose, xilose, arabinose,galactose). Além disso, embora os compostosfenólicos/derivativos de benzeno de fato diminuíram aatividade geral dos coquetéis, as concentrações utilizadasnos testes foram significativamente maiores do que opotencialmente presente no dejeto. Apesar disso, certoscoquetéis e o coquetel de enzimas otimizado exibiramatividade significativa (>50-70%) na presença dessescompostos.
No todo, as concentrações de cada enzima necessáriapara atingir valores de hidrólise de -65-75% foramsurpreendentemente baixas. (9=16 unidades de celulase/10 gde dejeto) e, embora dependente do coquetel/mistura, dosesmais altas (até 60 unidades de celulase) não aumentaram ograu final da hidrólise acentuadamente. O escalamento paracima do tratamento de enzima para lotes de 100 e 10 Kgproduziram um grau final semelhante de hidrólise, e umperfil similar e concentração dos produtos de açúcares. Osmelhores valores de redução de volume obtidos para oscoquetéis otimizados foram de 73-80%, enquanto os valoresde % de hidrólise correspondente para a conversão da fraçãocelulósica para açúcares simples foram de 72-81%. Duas dasmisturas otimizadas produziram pontos terminais similaresem termos da redução de volume e da hidrólise da celulose.A produção de etanol obtida foi de 195-210 L/ton. com S.cerevisiae e 215-220 L/ton. com P. tannophilus.Aproximadamente, 80-85% do bioetanol poderia ser recuperadopor destilação, mas isto poderia ser melhorado.
Exemplo 15
Termoenzimas de T. emersonii IMI393751 para a geraçãode matérias primas ricas em açúcares, de dejetos de papéise de lenços de papel ricos em celuloseMedições da atividade da enzima
Preparações de enzimas grosseiras foram analisadaspara uma gama de diferentes atividades de lignocelulose-hidrólise de enzimas utilizando 10-30 mg/L de concentraçõesdos substratos relevantes para enzimas endo-atuantes, papelde filtro de 50 mg/mL de volume de reação para 'paperase defiltro' (celulase geral) ou 1 mM do derivativo 4-nitrofenil-glicoside apropriado (Tuohy et al. , 2002; Murrayet al., 2001). Ensaios foram efetuados em triplicata. Todosos resultados são representativos de dois experimentosidênticos utilizando preparações de enzima grosseirasdiferentes.
Requisitos de pH e de temperatura para atividade eestabilidade
Os requisitos de pH e de temperatura para a atividadeenzimática e a estabilidade foram avaliados sobre a faixade pH de 2,6-7,6, e sobre a faixa de temperatura que varioude 30-90°C, utilizando os procedimentos de ensaio normais.
Estudos de hidrôlise em escala modelo
Uma alíquota de enzimas individuais, contendo 5-60 FPU(ou 2-20 unidades de xilanase, conforme apropriado), foiincubada com 1 g do substrato alvo, no pH e temperatura dereação apropriados, para até 24 horas. Amostras foramremovidas a intervalos cronometrados e o teor de açúcares(açúcares de redução) e a composição analisados.Substratos ricos em celulose investigados
Papel de lenço de papel e de lavatório mistos, dejetosde papel de escritório, papel de embrulho, jornais mistos.
Resumo dos resultados
Os coquetéis de thermozyme exibiram alta atividade emum amplo espectro de substratos de carboidratos e assimrefletem a complexidade e a eficiência da produção deenzimas por T. emersonii IMI393751. A produção determoenzimas particulares refletiu a composição e avariação do substrato indutor (Tabela 35).
Tabela 35
<table>table see original document page 227</column></row><table><table>table see original document page 228</column></row><table>
MGBG 2, derivado de culturas de T.emersonii de 108horas criadas era uma mistura de 1:1 de folhas de cháusadas/papéis de prato; MGBF 3, derivado de culturas de T.emersonii de 120 horas criada em uma mistura de 1:1 desorgo/polpa de beterraba; MGBG 4, derivado de culturas deT. emersonii de 120 horas criadas em uma mistura de 1:1 defarelo de trigo/polpa de beterraba; MGBG 5, derivado deculturas de T. emersonii de 120 horas criadas em umamistura de 1:1 de pratos de papel/polpa de beterraba; MGBG6, derivado de culturas de T. emersonii de 120 horas criadaem uma (2:1:1) mistura de papel de embrulho/pratos depapel/polpa de beterraba; MGBG7, derivado de culturas de T.emersonii de 120 Horas criada em uma mistura de 1:1 deflocos de centeio/farelo de trigo; MGBG 8, derivado deculturas de T. emersonii de 12 0 horas cultivadas em umamistura de 1:1 de polpa de beterraba/folhas de chá usadas.
Celulase nos coquetéis de thermozyme foram mais ativosao redor de pH de 4,0 (Figura 11A) e entre 70°C e 80°C(Figura 12) . Os componentes da celulase em cada preparaçãode enzima são ativos por uma ampla gama de pH (<pH de 2,6->pH de 6,5). A atividade de xilanase presente nos mesmoscoquetéis foi mais ativa ao pH de 4,0-5,0 (Figura 11B) eentre 75°-85°C (Figura 13) . No entanto, a atividade dexilanase nos coquetéis estava ativa sobre uma ampla gama depH (<pH de 2,6 a >ph de 7,0) enquanto níveis de atividadesimilares foram observados a 90°C e a 50°C.A estabilidade térmica de vários dos coquetéis MGBG(listados na Tabela 35) foi refletida nos longos valores demeia-vida a 50°C e a 70°C, isto é, efetivamente nenhumaperda mínima em atividade de endoxilanase ou deendocelulase a 500C após a incubação apenas em tampão (pHde 5,0) . Todos os coquetéis eram preparações de enzimagrosseiras e nenhum estabilizador ou aprimorador foiacrescentado. A atividade de xilanase presente noscoquetéis 2, 5, 6 e 8 foi particularmente estável a 70°C(apenas ~<2-20% de perda de atividade de xilanase após 25horas). Por exemplo, o valor tl/2 do coquetel 2 a 70°C foide 6 dias. As estabilidades a 70°C dos coquetéis 3 e 4, e-em grau menor o coquetel 7,foram mais baixos devido apresença de altos níveis de eqolisin protease (valores detl/2 de 2 horas, 12 horas e 25 horas) . Na presença dosubstrato (isto é, dejetos grosseiros), a estabilidade detodos os três coquetéis foi acentuadamente maior, isto é,(valores de tl/2 de 22 horas, 46 horas e 72 horas) . 0desempenho geral dos coquetéis MGBG em celulose esubstratos de hemicelulose foi muito alto (Tabela 36) . 0nível de hidrólise aumentou significativamente quando atemperatura de reação foi aumentada de 50 0C para 7 O0C(Tabela 37) . Nas temperaturas de reação mais altas (porexemplo, 70°C), o % de hidrólise foi atingido em 18 horas efoi similar, e em alguns casos maior, do que o % dehidrólise obtido após 24 horas a 50°C (Tabela 37) . Esteresultado destaca a vantagem dos termoenzimas comparado comas enzimas de organismos mesofílicos, que estariam ativos atemperaturas mais baixas.
Tabela 36% de hidrólise de materiais ricos em celulose
<table>table see original document page 230</column></row><table>
Tabela 37
% de hidrólise de lenço de papel rico em celulose
<table>table see original document page 230</column></row><table>
Os produtos da hidrólise no decurso de tempo dacelulose e da hemicelulose, que foram analisados pelo TLC,conformaram a alta eficiência de conversão dos termoenzimasMGBG. Os substratos de polissacarídeos foram inicialmentedegradados para oligossacarídeos e finalmente para glicose,que era quase o único produto da hidrólise, enquanto acelulose presente em dejetos ricos em celulose, porexemplo, lenço de papel eram similarmente hidrolisadosquase que completamente para glicose.
As implicações desses resultados para a indústria combase no bioetanol são significativos e indicam o potencialdos sistemas thermozyme de T. emersonii.
Exemplo 16
Bioconversão da polpa de beterraba para hidrolisadosricos em açúcares para a produção de bioetanol
Oito coquetéis de thermozyme foram selecionados de umafaixa inicial de 20 coquetéis. 0 perfil de atividades deenzima de endohidrolase e de exoglicosidase em cada um dos8 coquetéis, derivados da cepa 3 93 751, foram determinados(Tuohy & Coughlan, 1992, Tuohy et al. , 1993, 1994, 2002;Murray et al., 2001, 2004).
As preparações de enzima foram combinadas emconcentrações ou dosagens diferentes com lotes de 1 g defrações de beterraba açucareira, preparadas utilizandométodos de extração diferentes. As frações foram asseguintes:
A. Topos e pedúnculos da beterraba açucareira (1 g depeso seco/10 ml de volume total)
B. Polpa da beterraba açucareira (1 g de peso seco/10ml de volume total)
C. Fruto da beterraba açucareira (1 g de peso seco)
D. Casca da beterraba açucareira (1 g de peso seco)
As frações de beterraba açucareira A-D foramhomogeneizadas em um liqüidificador Waring (2 rajadas de 30segundos) . Alíquotas de enzima, isto é, de 2 ml e de 5 mldas soluções de enzima (1-8) foram acrescentadas a umvolume de reação total final de 10 ml (com água de bica, pH7,2) e incubadas a 63 0C inicialmente. Outros experimentosforam conduzidos para otimizar a temperatura de reação(75°C) , pH (pH de 4,0) e para reduzir o tempo de incubação(16 horas). Amostras foram tomadas a intervaloscronogramados durante a incubação de 16-4 8 horas,
centrifugadas, e a ação enzimática terminada ao ferver a100°C por 10 minutos. A fração supernatante foi analisadaquanto aos açúcares liberados.
A análise qualitativa dos tipos de açúcares liberadosfoi analisada pelo TLC, e a análise quantitativa dosaçúcares produzidos foi determinada pelo HPLC. Matériasprimas ricas em açúcares foram avaliadas quanto à produçãode bioetanol (Tuohy et al., 1993, 1994, 2002; Murray etal., 2001, 2004; Gilleran, 2004; Braet, 2005).
Resultados
As condições de reação ótimas foram 75°C e pH de 4,0.A Tabela 3 8 apresenta os açúcares de redução liberados após16 horas sob condições ótimas. Aumentar a incubação para 48horas aumentou o % de hidrólise no caso da casca e dasfrações do fruto. A otimização das condições decarregamento da enzima permitiu que o tempo de incubaçãofosse diminuído pela metade (isto é, 24 horas) com asproduções mostradas na Tabela 39.
Tabela 38
15 % de hidrólise dos carboidratos presentes após 16 horas a75 °C
<table>table see original document page 232</column></row><table>O desenvolvimento e a otimização de um coquetel deenzimas para efetuar a hidrólise foi efetuado utilizandouma combinação de genômica e proteômica funcional (com basena informação dos 8 coquetéis utilizados nos experimentosiniciais). Dois coquetéis foram produzidos, rotulados MGBGSB#1 e MGBG SB#2. A hidrólise da planta de beterrabaaçucareira total e o componente do fruto total pelos doiscoquetéis otimizados foram comparados aos coquetéis 3 e 5dos experimentos anteriores. As reações foram conduzidasnas condições ótimas para os dois coquetéis novéis, isto é,71 °C e pH de 4,5. A Tabela 40 dá os níveis relativos deenzimas incluídas em cada reação por g de substrato (istoé, planta de beterraba açucareira total ou o componente dofruto total) . As Tabelas 41 e 42 resumem os resultadosobtidos pela hidrólise.
Tabela 40
<table>table see original document page 233</column></row><table>
As principais diferenças entre os coquetéis otimizadose os coquetéis e 5 foram nas quantidades relativas deatividades chaves, especialmente exo-glicosidases.
Tabela 41
% de hidrólise com base nos açúcares de redução liberados(71°C, pH de 4,5) após 24 horas
<table>table see original document page 233</column></row><table><table>table see original document page 234</column></row><table>
Tabela 42% do total de açúcares liberados que corresponde à glicose
<table>table see original document page 234</column></row><table>
Ambos os coquetéis novos liberaram altos níveis deaçúcar de redução do homogeneizado da planta total. Dosaçúcares de redução liberados aproximadamente 88-90% foi demonossacarídeo do qual aproximadamente 43-67% foi glicose.
Fermentação para bioetanol
Foram realizados estudos para investigar a produção debioetanol dos hidrolisados da planta total e da beterraba.Mais de 90% da glicose presente no hidrolisado da plantatotal foi convertido para bioetanol por S. cerevisiae (de40 g/L de açúcar fermentável, aproximadamente 9,0 g/L deetanol foram obtidos). Outras espécies de leveduras foraminvestigadas para a produção de bioetanol (condiçõesaeróbicas), por exemplo, Pachysolen tannophilus. Estaúltima levedura utilizou os açúcares da glicose e pentoseliberados (xilose e arabinose) em repetidas fermentações(>92-95% metabolismo). No entanto, as produções de etanolforam ligeiramente mais baixas do que com S. cerevisiae (de40 g/L de açúcar fermentável, aproximadamente 6,7 g/L deetanol foram obtidos).
Propriedades bioquímicas selecionadas dos coquetéisnovos
Temperatura ótima
75-80°C, com >75-87% de atividade restante a 85°,dependendo do coquetel.
Termo-estabilidade
Nenhuma perda real de atividade após 24 horas a 50°C e<10% de perda após 3 semanas a 50°C.
pH ótimo e estabilidades
Embora ambos os coquetéis terem sido mais ativos ao pH4,5, >55% de atividade foi observada ao pH <2,6 e >50-60%ao pH 6,8; ambas as enzimas exibiram atividadesignificativa (>48-58%) ao pH de 7,0. As preparações deenzima foram mais estáveis entre o pH de 3,5-6,0 (4-50°C,por um mês).
Exemplo 17
Identificação e propriedades selecionadas de umxilanase bi-funcional novel produzido por Talaromycesemersonii IMI3 93751
Talaromyces emersonii secreta entre 14-20 componentesde endoxilanase quando criado na fonte de carbonoapropriada. Treze dessas endoxilanases foram purificadasaté a homogeneidade e caracterizada com relação apropriedades catalíticas. Os pesos moleculares dasendoxilanases purificadas variam entre 30-13 0 kDa. Aexpressão de xilanase e de glucanase não é equivalenteentre 10 cepas de T. emersonii criadas sob condiçõesidênticas no mesmo meio de nutriente e indutores decarbono. Uma nova xilanase de peso molecular baixo foiidentificada, Xyn XII (17,5 kDa) do sistema de degradaçãode xilano da cepa de T. emersonii IMI393751. A secreção dexilanases com valores de Mr inferior ou igual a 210 kDa foireportada para um número de outras espécies bacteriais efungais, mas não para T. emersonii antes disto.Purificação e caracterização da enzima
T. emersonii IMI393751 foi criado em uma mistura de1:1 de farelo de trigo e polpa de beterraba por 120 horas a45°C, 22 rad/s (ou alternativamente por 11 dias emfermentação sólida (estática), 33% de substrato: 67% deumidade; 45°C). Xilanase e teor de proteína das amostras deenzima grosseira e fracionada foram analisadas conformedescrito anteriormente (Tuohy & Coughlan, 1992; Tuohy etal., 1993, 1994; Murray et al., 2001). 0 extrato de enzimagrosseiro foi colhido conforme descrito anteriormente(Tuohy & Coughlan, 1992). Ultrafiltração utilizando umsistema Amicon DC2, equipado com um dializador de fibra ocaHlP 10-43 foi utilizado para separar a xilanase nova(fração de permeado) das xilanases de peso molecular maisalto (retentado). Xyn XII foi purificado para homogeneidadeutilizando uma combinação de técnicas de fracionamento,incluindo 'salgar para fora' ou precipitação com (NH4)2SO4(0-90% corte), cromatografia de permeação de gel (GPC) emSephacryl S-200 SF (100 mM NaOAc como tampão, pH de 5,0como eluente) , cromatograf ia de troca de íon (IEC) noWhatman DE-52 (equilibrado com 3 0 mM NaOAc como tampão, pHde 5,0; a xilanase foi eluída pela aplicação de umgradiente 0,0-0,3 M NaCl), seguido por cromatografia deinteração hidrofóbica (HIC) em fenil Sefarose CL-4B(equilibrado com 15% (NH4)2SO4 em 30 mM de NaOc, pH de 5,0) .Antes do HIC, a amostra de xilanase foi 'salgada paradentro' com (NH4) 2S04 até uma concentração final de 15%(w/v). Sais de tampão e (NH4)2SO4 foram removidos pelaaplicação da amostra ao Sephadex G-25 (não mostrado aqui).Finalmente, as frações ricas em xilanase foram fracionadasainda mais pela aplicação a uma segunda coluna deintercâmbio de ânions de DE-52, ao pH de 7,0, seguido pelacromatografia de permeação de gel em Sephacryl S-100 RH(100 mM NaOAc como tampão, pH de 5,0 utilizado como tampãode equilibração e de irrigação) e uma etapa final defracionamento em DEAE-Sefarose, pré-equilibrado com 50 mMNH4OAc como tampão, pH de 5,5 (0,0-0,2 M de NaCl degradiente utilizado para eluir a xilanase) . A enzimaagrupada foi dessalinizada pela aplicação do Sephadex G-25ou do BioGel P-6 e liofilizada antes da análiseeletroforésica.
Propriedades selecionadas da nova xilanase bi-funcionalPropriedades fisioquímicas seletas
A pureza da nova enzima foi confirmada pelaeletroforese em gel SDS-poliacrilamida em 15%(acrilamida/bis-acrilamida) gel, de acordo com o método deLaemmli. SDS-PAGE revelou uma única banda de proteína emtingimento a prata que correspondeu a um Mr estimado de17,5 kDa. Ademais, uma única banda de proteína foi obtidano IEF correspondente a um valor de pi de pH 5,0 para XynXII. 0 ótimo de temperatura para a degradação catalisada deXyn XII de OSX foi determinada como sendo de 75°C e o pHótimo para a atividade foi pH de 4,0-4,5. No entanto,diferentemente de Nyn I-XI, que perderam entre 25-81% dasatividades originais respectivas durante um período deincubação de 10 minutos ao pH de 3,0, Xyn XII foiadmiravelmente estável sob acidez e reteve mais de 91% desua atividade original ao pH de 3,0 mesmo em uma incubaçãoextensa.
Propriedades catalíticas selecionadas
Alíquotas adequadamente diluídas de Xyn XII foramincubadas com uma faixa de polissacarídeos, incluindovários xilanos, J3-glucanos, polímeros pécticos e frutano(tudo a 1,0% (m/v) de concentração). Açúcares de reduçãoliberados durante um período de incubação extenso de 3 0minutos foram quantificados conforme descrito acima. Aatividade contra aril-glicosides (l,0mM) foi determinadautilizando um método de micro ensaio (Murray et al. , 2001) .
Estudos preliminares para determinar as constantescinéticas foram realizados ao variar [substrato], xilan,entre 0,2-25 mg/ml, sob as condições normais de ensaio.
Os resultados apresentados na Figura 14 ilustram areatividade relativa da nova xilanase (Xyn XII) contradiferentes xilanos. Esta enzima é mais ativa em um enlacemisto, xilano não substituídp (1, 3 :1, 4-J3-D-xilano)conhecido como rodimenano da alga vermelha Palmariapalmata. Em contraste, dos dois arabinoxilanos de cereais,isto é, OSX e WSX, a enzima exibiu maior atividade contra aWSX mais substituída. 0 padrão geral de reatividade foi:
RM>WSX>LWX>OSX>BWX. Como as Figuras 15A-G demonstram, aspreferências de substrato de um número das outras xilanases(Xyn IV a Xyn XI) são bastante distintos de Xyn XII.
Com Xyn IV, OSX>RM>WSX>ÇWX>>>BWX (Figura 15A). A ordemde reatividade com Xyn VI é OSX>LWX>RM>BWX>WSX (Figura15Β), enquanto aquela exibida pela Xyn XII éRM>LWX>WSX>>LWX>>OSX (Figura 15C). A reatividade de Xyn VIIfoi RM>BWX>WSX>>LWX>OSX (Figura 15D) , e Xyn IX foiRM>LWX>BWX>OSW>WSX (Figura 15E). Finalmente, Xyn X exibiu aseguinte preferência RM>>BWX~WSX>OSX>>>LWX (Figura 15F eXyn VI RM&LWX>WSX>BWXaOSX (Figura 15G). Ademais,diferentemente de Xyn I-XI que eram estritamente ativoscontra xylans apenas, a nova xylanase bifuncional (Xyn XII)exibiu atividade substancial contra os aril-p-xilosides 4-nitreofenil β-D-xiloside (4NPX) ecloronitrof enil|3-D-xiloside (CNPX), com maior atividade contra este últimosubstrato (Figura 17) . Este resultado poderá refletir oefeito de retirada por eletrônica da moiedade cloro,tornando o grupo de clorinitrofenil um melhor 'grupo desaída'. No entanto, outras endoxilanases novas da cepaCBS814,7 0 de T. emersonii (Tuohy et al. , 1993; tambémproduzido pela cepa IMI393751, embora expressadiferencialmente) são significativamente ativos contra CNPXe exibem pouca ou nenhuma atividade contra 4NPX. Estefenômeno refletiu as características de ação v exo'parciais dessas enzimas, e também poderá refletir umacaracterística similar para Xyn XII. Além disso, foiobservada atividade baixa contra 4NP β-glucoside e CNP-β-celobioside, que não é inesperado pois Xyn XII é ativocontra 1,3:1,4-β-D-glucano e se ele possui algumaspropriedades de ação exo-, conforme observado com o aril {3-xilosides, poder-se-ia esperar ter atividade correspondentecontra o aril β-glucosides. Não foi observada reatividadecontra qualquer outro aril glicosides ligado a α ou β.
Assim, "in vivo", esta nova xilanase bifuncionalpoderá interpretar um papel muito importante para T.emersonii IMI393751 ao fornecer acesso à hemicelulose daparede da célula da planta, por exemplo, ao degradarglucanos de enlace misto em cereais e outras plantas,resíduos de plantas e dejetos.
Exemplo 18
Expressão de hidrolases chaves e outras enzimasacessórias pelas cepas de T. emersonii
A expressão das enzimas chaves na mesma fonte decarbono é diferente
O número, o tipo e a abundância relativa das xilanasesproduzidas pelo T. emersonii IMI393751 e outras cepas édiferente. Como foi mostrado anteriormente, níveis deenzima em filtrados de cultura são acentuadamentediferentes e sugerem que as cepas de T. emersonii ouproduzem níveis diferentes das mesmas xilanases, ouexpressam isoformas diferentes. Para ilustrar este ponto, otingimento de zimograma após a eletroforese SDS-PAGE em gel(renaturada conforme descrito por Tuohy & Coughlan (1992))e IEF foi conduzida com os filtrados da cultura das cepasIMI393751 e CBS549,92. Esses estudos confirmaram que (i)diferentes xilanases são expressas e (ii) o número deisoformas de xilanase expressas são acentuadamentediferentes.
Os resultados obtidos para a expressão de xilanase emalfarroba são resumidos conforme segue: as isoformas dexilanase detectadas (ver Tuohy et al. , (1994) parareferência às isoformas -pI e Mr)
IMI393751
Xyn IV, Xyn V, Xyn VI, Xyn IX e Xyn XI, Xyl I (b-xilosidase) e Xyl IICBS64 9, 92
Xyn II, Xyn Vii (nota: Xyn VII é idêntico à seqüênciapublicada em uma patente anterior(GenBank Accession NumberAX403831) e quantidades muito baixas de Xyl I (β-xilosidase). Além disso, IMI393751 é á única cepa queproduz Xyn XII durante o crescimento em folhas dechá/pratos de papel (e apenas em folhas de chá).
Padrão de expressão é diferente em fontes de carbonodiferentes
0 padrão da expressão de xilanase em diferentes fontesde carbono é não-equivalente, isto é:IMI3937 51
Glicose como a fonte de carbono: Xyn I, Xyn VIII, umaquantidade menor de Xyn Xi e nenhuma β-xilosidase
Alfarroba: Xyn IV, Xyn V, Xyn VI, Xyn IX e Xyn XI, XylI (p-xilosidase) e Xyl II
TL/PPÇ: Xyn III, Xyn V, Xyn IX, Xyn X, Xyn XII, Xyl Ie Xyl IICBS549,92
Glicose: Baixos níveis de um componente que pode serequivalente a Xyn IV e nenhuma β-xilosidase
Alfarroba: Xyn II, Xyn VII e quantidades muito baixasde Xyl I (β-xilosidase).TL/PPL: proteínas similares a Xyn I, Xyn VII e Xyn IX,alguma Xyl I
Além disso, outros exemplos claros de diferenças naexpressão foram observados, por exemplo, a expressão Xyl I.Nenhum Xyl I é expresso por IMI393751, CBS549,92,CBS180,68, CBS393,64, CBS394,64, ou CBS397,64 durante ocrescimento em glicose. Em contraste, sob condiçõesidênticas, Xyl I é expresso por CBS355,92, CBS395,64,CBS472,92 e CBS759,71.
De modo similar, em alfarroba, Xyl I é expresso portodas as cepas, embora a níveis acentuadamente diferentes,com a exceção de CBS3 94,64. Xyl I também é expresso portodas as cepas, exceto CBS180,68 e CBS394,64 durante ocrescimento em TL/PPL. Em OSX como fonte de carbono, Xyl Inão foi expresso por CBS180,68 e CBS394,64, mas foiexpresso por CBS393,64 (níveis baixos) e todas as demaiscepas. Diferenças gerais acentuadas nos níveis de expressãode Xyl Ieo padrão de expressão foi observado (isto é, ascepas que expressam as quantidades maior ou menor de Xyl I)entre todos os substratos indutores.
Diferenças na atividade específica de homólogosproduzidos por cepas diferentes
As cepas diferentes foram comparadas com relação àexpressão de xilanases chaves conforme descrito acima.Entretanto, além disso, as xilanases presentes em culturasinduzidas de IMI393751 e CBS549,92 foram fracionadas e aatividade específica dos componentes de xilanasepurificados comparados. No primeiro caso, apenas IMI393751parece produzir Xyn VII. Ainda, quando as atividadesespecíficas foram comparadas (os resultados para OSX comosubstrato de ensaio são apresentados abaixo), algumasdiferenças em atividade específica das enzimas individuaisforam claramente observadas (Figura 18) .
Produção de componentes novos por T. emersonniIMI393751 durante crescimento em fontes de carbonodiferentesT emersonii ΙΜΙ393751 foi cultivado em uma faixa defontes de carbono e perfilado pela renaturação de SDS-PAGEe IEF, seguido de tingimento de zimograma, conformedelineado acima. 0 que segue são uma amostra de alguns dosresultados obtidos:
(i) Folhas de chá como indutor: Xyn III, Xyn V, XynIX, algum Xyn X e Xyn XII; Xyl I e Xyl II
(ii) Alfarroba: Xyn IV, Xyn V, Xyn VI, Xyn IX e XynXI; Xyl I e Xyl II
(iii) Farelo de centeio: Xyn IV, Xyn V, Xyn VI, XynIX, com um componente de 'xilanase' novel extra de pl 6,5;Xyl I (p-xilosidase) e Xyl II retal
(iv) Farinha de varejo: Xyn III, Xyn VI, Xyn VIII, XynIX, Xyn X, Xyl I (p-xilosidase) e Xyl II, com componentede 'xilanase' novel adicional de pi 5,8
(v) Sorgo: Xyn I, Xyn VIII, Xyn IX, Xyn X, Xyn XI,algum Xyl I (p-xilosidase) e Xyl II
(vi) Xilose:Xyn I e Xyn VIII, Xyl I
(vii) Glicose: Xyn I, Xyn VIII, uma quantidade menorde Xyn XI e nenhuma p-xilosidase
Exemplo 19
Expressão diferencial de outras enzimas acessórias porcepas de T. emersonii de Glutatione Peroxidase
Amostras de filtrado de cultura (amostras não-concentradas e concentradas) foram processadas em 7,5% degels PAGE nativo, umedecido em glutatione reduzido a 50°Cseguido de incubação com 0,002% de H2O2. 0 gel foi entãotingido com 1% de cloreto férrico/1% de ferricianeto depotássio. Tingimento de zimograma também foi complementadopor ensaios de enzima nos filtrados de cultura.
IMI393751 produz Glutatione peroxidase (Mr~45 kDa) ,com expressão diferencial sendo observada em um número deindutores de carbono (os números 1-18 representam indutoresdiferentes). Em contraste, nenhuma atividade extracelularfoi observada para qualquer uma das outras cepas de T.emersonii, mesmo nas amostras concentradas. A cepaIMI393751 também produz níveis significativos deglutathione peroxidase extracelular durante o crescimentoem TL/PPL .
Catalase
Amostras de filtrado de cultura (amostras não-concentradas e concentradas) foram processadas em 7,7% degels PAGE nativo, seguido por incubação com 3% de H2O2. 0gel foi então tingido com 1% de cloreto férrico/1% deferricianeto de potássio (bandas de catalase aparecem comobandas de amarelo intenso). Tingimento de zimograma tambémfoi complementado por ensaios de enzima nos filtrados decultura, utilizando o método padrão publicado.
IMI393751 produz catalase extracelular (Mr~230 kDa) ,com expressão diferencial sendo observada em um número deindutores de carbono (os números 1-18 representam indutoresdiferentes) . Em contraste, nenhuma atividade extracelularfoi observada para qualquer uma das outras cepas de T.emersonii, mesmo em amostras concentradas.
A presença dessas atividades de enzima nos filtradosde cultura de IMI393751 seria potencialmente importante aoafetar a estrutura do substrato, mas também para removerquaisquer compostos que podem oxidase atividades dehidrolase chaves, por exemplo, xilanase ou glucanase.Exemplo 2 0
Comparação do fenótico de 10 cepas de T. emersonii emmídia sólida (ágar) diferente
B. Mídia de ágar
1. Ágar de dextrose de Sabouraud (Oxoid Ltd., Reino
Unido)
2. Ágar de maltose de batata (Oxoid Ltd., Reino Unido)
3. Czapek Dox (Oxoid Ltd., Reino Unido; pH nãoajustado)
4. Ágar de farinha de milho (Oxoid Ltd., Reino Unido)
5. Ágar de extrato de malte (POxoid Ltd., Reino Unido)Emerson's Agar (amigo solúvel de potássio delevedura); YpSs)
Os ingredientes seguintes foram acrescentados a 1 L deH2O destilada:
15,0 g de amido solúvel (Sigma-Aldrich, Dublin,Irlanda)
4,0 g de extrato de levedura (Oxoid Ltd., Reino Unido)l,0g de fosfato di-hidrogênio de potássio (KH2PO4)0,5 g Heptahidrato de sulfato de magnésio (MgSO4.7H20)20,0 g Agar No. 1 (Oxoid Ltd., Reino Unido)Pratos de ágar (cada tipo de ágar) foram inoculadoscom as 10 cepas diferentes de T. emersonii. Um lote depratos foi incubado a 45 0C e o segundo a 55 0C (teor deumidade do ar foi de -20-30%) . As culturas foramverificadas diariamente, e os resultados seguintes foramregistrados:
(a) medição do diâmetro da cultura (utilizando umcalibre)
(b) registro fotográfico utilizando uma câmara digitalde 7,0 M pixel
(c) registro de mudanças/diferenças fenotípicasvisíveis
(d) indicação de formação de esporos (análisemicroscópica) ou não
Resultados
O cultivo de cepas de T. emersonii em diferentesmídias de ágar revelou diferenças claras entre a cepa393751 e as outras 9 cepas com relação ao seguinte:
Tabelas 43 e 44
Resumo da velocidade e extensão do crescimento a 45°C- medições do diâmetro de cultura tomados no dia 2 e no dia 5.
Tabela 45: Velocidade de crescimento a 55°C - mediçõesde diâmetro de cultura tomados no dia 5.
Tabela 46: Resumo das mudanças fenotípicas visíveis eevidência para a formação de esporos.
Observação Importante 1: muitas das cepas IMI/CBSproduziram culturas multicoloridas. No entanto, a purezadessas culturas foi verificada. As cores/pigmentosproduzidos e o padrão da produção é típico de muitasespécies de Penicillium, por exemplo, P. pinophilum.Observação importante 2: Como é indicado na Tabela 20,existem diferenças claras entre a cepa 393751 e as demaisem termos de formação de esporos.<table>table see original document page 247</column></row><table><table>table see original document page 248</column></row><table><table>table see original document page 249</column></row><table><table>table see original document page 250</column></row><table><table>table see original document page 251</column></row><table>Exemplo 20:
Dejetos clínicos tem valor calorífico deaproximadamente 14GJ/tonne. Dessa maneira, contém aprox 50-55% de material rico em celulose, que possui um altacapacidade de ligação com água e baixor valor caloríficocomparado à plásticos presentes nos dejetos de rio. 0tratamento da celulose rica em componentes deste dejetousando coquetéis de enzima termostável da invenção, porexemplo coquetéis 5 e 8, podem diminuir o volume de dejetosem até~73-81%( e converter a celulose presente (79-84% deconversão) e gerar -2.25-2.61 GJ/tonne(valor de caloria). Oresíduo, que foi enriquecido com plásticos poderia ter sidousado como derivado de combustível comum potencialcalorífico de até 34-38 GJ/tonne.
Fração de dejetos sólidos municipais
A fração orgânica de dejetos sólidos municipais tamvalor calorífico de -9,2-10,2 GJ/tonne. Desta forma, elecontém -50-65% de material rico em carboidratos(principalmente de dejetos de comida e papel), o qualpossui alta capacidade de ligar com água e baixo valorxcalorífico comparadp com outros componentes, por exemplopoliestireno, plásticos e borracha presentes em dejetos.0tratamento do componente rico em celulose deste dejeto comos coquetéis de enzima termostável da invenção pode reduziro volume de dejeto em aproximadamente 50-70%, e converter ocarboidrato presente (71-91% de conversão). O resíduo, quefoi enriquecido em componentes não-biodegradáveis (ex:poliestireno, plásticos e borracha), pode ser usado comoderivado combustível com potencial calorífico de até 26-38GJ/tonne.É ainda possível tratar dejetos municipaise outrasformas de dejetos para incineração. Tratando tais matériasprimas poderia reduzir, aumentar ou alterar seus valorescaloríficos. Assim o tratamento produz um líquido deaçúcares mistos que pode ser coletado ou removido sendopossível reduzir o valor calorífico. A Alteração no valorcalorífico poderia facilitar a incinaração dessesmateriais: por exemplo reduzindo o valor calorífico para umnível facilitaria o controle do processo de incineração;aumentar o valor calorífico significa que a quantidadde deenergia requerida para incineração é reduzida. Por exemplo,convertendo a celulose presente em dejetos clínicos ricosem celulose para separar açúcares e recuperaçãodestesreduziria significantemente o valor calorífico de dejeto- oresíduo ainda teria valor calorífico, mas seria muito menor( e dependeria muito mais da lignina presente).
Assim, em um outro aspecto da invenção provê um métodode alterar o valor calorífico de um rio de dejetos tratandoeste com uma cepa Talaromyces emersonii da invenção ou umacomposição enzimática da invenção.
Referências
1. Raeder U. e Broda P. (1985), Lett. Appl. Microbiol.Vol. 1 pgs 17-20.
2. P. Chomozynski e N. Sacchi (1987), Anal. BiochemVol. 162, 156-159.
3. J. Sambrook, E. F. Fritsch e T. Maniatis (1989),"Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
4. G. Zaide, D. Shallom, S. Shulami, G. Zolotnitsky,G. Golan, T. Baasov, G. Shoham e Y. Shoham (2 001) Eur. J.Biochem. Vol. 268, 3006-1010.5. Ρ. G. Murray, C. Μ. Collins, Α. Grassick e M.G.Tuohy (2003), Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol 301, 280-286 .
6. Α. J. Harvey, Μ. Hrmova, R. De Gori, J.N. Varghesee G. B. Funcher, (2000) Proteins Vol. 41, 257-269.
7. Α.Ρ. Moloney, Τ. J. Haekett, Ρ. J. Considine, Μ. Ρ.Coughlan, (1983) Enzyme Mierob. Teehnol. Vol. 5, 260-264.
8. G. L. Miller (1951), Anal. Chem. Vol 31, 426-428.
9. Μ. Dubois, Κ. Gilles, Ρ. Α. Hamillton, Ρ. Α.Rebers, F. Smith, (1956) Anal. Chem. 28, 350-356.
10. U. R. Laemmli, (1970), Nature (London), Vol. 227,680-685.
11. Ρ. G. Murray, Α. Grassiek, C. D. Laffey, M.; Μ.Cuffe, Τ. Higgins, Α. V. Savage, Α. Planas, Μ. G. Tuohy,(2001), Enzyme Mierobial Teehnol. Vol. 29, 90-98.
12. Ο. Η. Lowry, Ν. J. Rosebrough, Α. L. Farr, R. J.Randall (1951), J. Biol. Chem. 193:265-275.
13. L. Falquet, Μ. Pagni, Ρ. Bueher, Ν. Hulo, C. J.Sigrist, Κ. Hofmann, Α. Bairoeh, (2002), Nueleie AeidsResearch, Vol. 30, 235-238.
14. Η. Nielsen, J. Engelbreeht, S. Brunak, G. οηHeigne, (1997), Int. J. Neural Syst., Vol. 8, 581-599.
15. D.Higgins, J. Thompson, Τ. Gibson (1994): NueleieAeidsRes, Vol. 22. 4673-4680.
16. Α. C. Stolk, R. Α. Ramson (1972) Studies inMyeology No. 2, ρρ.1-65.
17. Tuohy Μ. G., Coughlan, Μ. Ρ. (1992) BioresoureeTeehnol. 39, 131-137.
18. Tuohy Μ. G., Walsh, D. J. Murray, Ρ. G.,Claeyssens, Μ. Cuffe, Μ. M., Savage, Α. V., Coughlan, Μ. Ρ.(2002). Biochim. Biophys. Acta, 336-380.
19. Reynolds, Ρ. J. (1986) Tese de Ph.D., NationalUniversity of Ireland, Galway.
20. APHA, A., WEF. (1992) Standard methods for theexamination of wastewater.
21. Walsh, D. J. (1997) Tese de Ph. D., NationalUniversity of Ireland, Galway.
22. Gilleran, C. T. (2004) Tese de Ph. D, NationalUniversity of Ireland, Galway.
23. Maloney, A. P., Callan, S. M., Murray, P. G.,Tuohy, M. G. (2004) Eur. J. Biochem. 271, 3115-3126.
24. Braet, C. (2005) Tese de Ph. D, NationalUniversity of Ireland, Galway.
Bensadoun, A. e Weinstein, D. (1976). Anal. Biochem.70: 241-250.
25. Tuohy, M. G., Laf fey, C. D. & Coughlan, Μ. P.(1994) Bioresource Technol. 50, 37-42.
Tuohy, M. G., Puls, J. Claeyssens, Μ. M. Vrsanska, M.& Coughlan, M.P. (1993). Biochem. J. 290, 515-523.
26. Murray, P. G., Aro, N., Collins, C., Grassick, A.,Penttilá, M. Saloheimo, M. & Tuohy, M. 2004. Prot. Expre.Purif. Vol. 38, pp. 248-257.
27. McCarthy, T., Hanniffy, 0., Lalor, E., Savage, A.V. & Tuohy, M. G. 2005. Process Biochem. Vol. 40, pp. 1741-1748.
28. McCarthy, T., Hanniffy, 0., Savage, A.V. & Tuohy,M. G. (2003) Int. J. Biol. Macrmol. 33: 141-148.
29. Colleran, E. & Pistilli, A. (1993) Ann. Microbiol.Enzimo. 44: 1-18.
30. Coates, J. D., Coughlan, M. F. & Colleran, E.(1996) J. Microbiol. Meth. 26 237-246.

Claims (84)

1. Cepa termofílica de Talaromyces emersonii,caracterizada por possuir uma faixa de temperatura decrescimento de 30 a 900C e que secreta ativamente enzimas atemperaturas acima de 55°C.
2. Cepa de Talaromyces emersonii, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de incluir adeposição número IMI393751 ou um mutante deste tambémcodificar enzimas termo-estáveis.
3. Enzima produzida por uma cepa, de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de reteratividade a temperaturas acima de 55°C.
4. Enzima, de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de ser selecionada do grupo queconsiste de enzimas modificadoras de carboidratos, enzimasproteolíticas, oxidases e oxidoreductases.
5. Composição de enzima caracterizada pelo fato decompreender uma celobiohidrolase I ou uma celobiohidrolaseII o uma mistura destas, uma {3-glucosidase 1, uma xilanase,e uma endo-p-(1,3)4-glucanase.
6. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação-5, caracterizada pelo fato de a enzima ser uma enzimaconforme a reivindicação 3.
7. Composição de enzima, de acordo com a reivindicaçõe-5 ou 6, caracterizada pelo fato de a composição compreender-0,5 a 90% de clobiohidrolase I ou uma celobiohidrolase IIou uma mistura destas, 0,1 a 33% de β-glucosidase 1, 0,6 a-89% de xilanase e 0,4 a 68% de endo-J3- (1, 3) 4-glucanase.
8. Composição de enzima, de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (10-30%), CBH II (10-15%), β-(1,3)4-glucanase (20-45%), β-glucosidase (2-15%), e Xilanase (18--55%).
9. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação-8, caracterizada pelo fato de ainda compreender um ou maisdo seguinte: β-xilosidase, α-glucuronidase, exoxilanase, a-L-arabinofuranosidase, enzimas pectinolíticas,hemicelulases, enzimas modificadoras de amido,oxidoreductase/oxidase e esterases,· e proteases.
10. Composição de enzima, de acordo com areivindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de aindacompreender um ou mais do seguinte: β-Xilosidase (0,1-20%),a-glucuronidase (0,1-10%), exoxilanase (1-15%), a-L-Arabinofuranosidase, (0,1-5,0%), enzimas pectinolíticas (2--25%) , hemicelulases (5-10%) , enzimas modificadoras de amido(5-10%), oxidoreductase/oxidase e esterases (1-10%); eprotease (7-25%).
11. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 9 ou 10 ou uma cepa de microorganismo,de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelofato de incluir a bioconversão de materiais de planta ouderivados de plantas ou fluxos de dejetos que incluemdejetos hospitalares.
12. Composição de enzima, de acordo com quaisque umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (1-25%), CBH II (1-28%), β (1,3)4-glucanase (18-40%), β-glucosidase (2-30%), Xilanase (15--55%), e β-Xilosidase (0,7-20%).
13. Composição de enzima, de acordo com areivindicação 12, caracterizada pelo fato de compreender umou mais dos seguintes: a-glucuronidase (1-10%), a-L-Arabinofuranosidase (0,1-5,0%), exoxilanase (1-15%),enzimas pectinolíticas (5-25%), atividade modificadora deamido (2-12%), hemicelulases (2-11%),oxidoreductases/oxidase e esterases (1-15%), e protease (2-15% .
14. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 12 ou 13, ou uma cepa de microorganismode acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelofato de incluir a produção de matérias primas ricas emmonossacarideos de resíduos de plantas.
15. Composição de enzima, de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (12-55%), CBH II (15-30%), β(1,3)4-glucanase (12-26%), β-glucosidase (5-12%), Xilanase (5-30%), p-Xilosidase (0,1-10%) e α-L-Arabinofuranosidase(0,5-3,0%).
16. Composição de enzima, de acordo com areivindicação 15, caracterizada pelo fato de aindacompreender um ou mais do seguinte: a-glucuronidase (5-15%); outras hidrolases incluindo enzimas pectinolíticas,ácido fenólico e acetil(xilan)esterases, Protease eatividades de oxidase modificadoras de lignina, proteases eoxidases.
17. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 15 ou 16, ou uma cepa de microorganismode acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelofato de incluir o processamento e a reciclagem de madeira,produtos de papel e papel.
18. Composição de enzima, de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (15-30%), CBH II (10-40%), β(1,3)4-glucanase (15,40%), β-glucosidase (2-15%), Xilanase (15--30%), e p-Xilosidase (1-8%).
19. Composição de enzima , de acordo com areivindicação 18, caracterizada pelo fato de aindacompreender um ou mais dos seguintes: Exoxilanase; a-Glucuronidase; α-L-Arabinofuranosidase; enzimaspectinolíticas, incluindo galactosidases,ramnogalacturonase, poligalacturonase, exogalacturonase egalactanase; atividade modificadora de amido; outrashemicelulases, incluindo galactosidases;oxidoreductase/oxidase e esterases,· e protease.
20. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 18 ou 19, ou uma cepa de microorganismode acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelofato de incluir processamento e reciclagem de produtostêxteis.
21. Composição de enzima, de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (5-55%), CBH II (8-50%), β(1,3)4-glucanase (10-30%), β-glucosidase (0,5-30%), Xilanase (5--30%), e β-Xilosidase (0,1-10%).
22. Composição de enzima, de acordo com areivindicação 21, caracterizada pelo fato de aindacompreender um ou mais do seguinte: a-L-Arabinofuranosidase; α-glucuronidase; outras hidrolases,incluindo enzimas pectinolíticas selecionadas, esterases;protease; e oxidases.
23. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 21 ou 22, ou uma cepa de microorganismode acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelofato de incluir a sacarificação de dejetos de papel.
24. Composição de enzima , de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (2-10%), CBH II (2-10%), J3 (1,3)4-glucanase (10-45%), β-glucosidase (5-10%), e Xilanase (1-30%).
25. Composição de enzima , de acordo com areivindicação 24, caracterizada pelo fato de aindacompreender um ou mais do seguinte: N-Acetilglucosaminidase; quitinase; β (1, 3)6-glucanase; β-Xilosidase; α-Glucuronidase; α-L-Arabinofuranosidase;enzimas pectinolíticas, incluindo galactosidases,ramnogalacturonase, poligalacturonase, exogalacturonase egalactanase; atividade modificadora de amido; outrashemicelulases, incluindo galactosidases,oxidoreductase/oxidase e esterases,· e protease.
26. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 24 ou 25, ou uma cepa de microorganismode acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelofato de incluir controle antifungal, biocontrole e controlede lama.
27. Composição de enzima, de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (1-20%), CBH II (1-28%), β(1,3)4-glucanase (15-40%), β-glucosidase (2-15%), Xilanase (18-55%), β-Xilosidase (0,l-10%)e α-L-Arabinofuranosidase (0,5-5,0%)
28. Composição de enzima, de acordo com areivindicação 27, caracterizada pelo fato de aindacompreender um ou mais do seguinte: α-Glucuronidase;atividade modificadora de amido; outras hemicelulases,incluindo galactosidases; oxidoreductase/oxidase eesterases; protease; exoxilanase; outras hidrolases,incluindo enzimas pectinoliticas, ácido fenólico eacetil(xilan)esterases; protease; e atividades de oxidasemodificadora de lignina.
29. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 27 ou 28, ou uma cepa de microorganismode acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelofato de incluir aplicações horticulturais.
30. Composição de enzima , de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (5-30%), CBH II (1-15%), 0(1,3)4-glucanase (10=40%) , {3-glucosidase (2-15%) , Xilanase (18-- 48%), {3-Xilosidase (0,1-20%), a-Glucuronidase (1-10%), e a-L-Arabinofuranosidase (0,1-5,0%).
31. Composição de enzima, de acordo com areivindicação 30, caracterizada pelo fato de compreender umou mais do seguinte: Exoxilanase; enzimas pectinoliticas,incluindo galactosidases, ramnogalacturonase,poligalacturonase, exogalacturonase e galactanase;atividade modificadora de amido; outras hemicelulases,incluindo galactosidases; oxidoreductase/oxidase eesterases; e protease.
32. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 31, ou 32, ou uma cepa demicroorganismo , de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizada pelo fato de incluir a produção dealimentação animal para aprimorar a digestibilidade dealimentos com base em cereal.
33. Composição de enzima, de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (0,5-10%), CBH II (0,5-10%), β(1,3)4-glucanase (15-43%), β-glucosidase (2-10%), Xilanase (30-88%), Xilosidase (0,1-2,0%), a-Glucuronidase (0,1-3,0%), a-L-arabinofuranosidase.
34. Composição de enzima , de acordo com areivindicação 33, ou uma cepa de microorganismo , de acordocom a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato deincluir a produção de alimentos com base em cereaiscontendo baixa pentose para animais monogástricos comdigestibilidade aprimorada e baixo teor de β-glucan não-celulósico.
35. [Claim missing on original document]
36. Composição de enzima , de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato deainda compreender um ou mais do seguinte: exoxilanase,enzimas pectinolíticas, inclui8ndo galactosidases,ramnogalacturonase, poligalacturonase, exogalacturonase egalactanase; atividade modificadora de amido; outrashemicelulases, incluindo galactosidases,oxidoreductase/oxidase e esterases; e protease.
37. [Claim missing on original document]
38. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 36 ou 37, ou uma cepa de microorganismode acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelofato de incluir a produção de alimentos funcionais compotencial bioativo para utilização na saúde veterinária.
39. Composição de enzima , de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (1-15%), CBH II (1-15%), β(1,3)4-glucanase (10-45%), α-glucosidase (2-10%), Xilanase (1--55%), Xilosidase (0,5-12%).
40. Composição de enzima , de acordo com areivindicação 39, caracterizada pelo fato de aindacompreender um ou mais do seguinte: α-Glucuronidase, a-L-Arabinofuranosidase; β(1,3)6-glucanase; N-acetilglucosaminidase; chitinase, enzimas pectinolíticas,incluindo galactosidases, ramnogalacturonase,poligalacturonase, exogalacturonase e galactanase;atividade modificadora de amido; outras hemicelulases,incluindo galactosidases; oxidoreductase/oxidase eesterases; protease.
41. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 4 0 ou 41, ou uma cepa de microorganismode acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelofato de incluir a produção de produtos especializadoslácteos ou dietéticos, por exemplo, alimentos, eformulações de bebidas para o cuidado da saúde geriátrica ede infantes.
42. Composição de enzima, de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (1-10%), CBH II (5-15%), J3(l,3)4-glucanase (15-40%), a-glucosidase (2-30%), Xilanase (15--55%) , β-Xilosidase (1-12%), a-glucuronidase (1-8%), e a-L-Arabinofuranosidase (0,5-5,0%).
43. Composição de enzima , de acordo com areivindicação 42, caracterizada pelo fato de aindacompreender um ou mais do seguinte: enzimas pectinolíticas,incluindo galactosidases, ramnogalacturonase,poligalacturonase, exogalacturonase e galactanase;atividade modificadora de amido; outras hemicelulases,incluindo galactosidases; oxidoreductase/oxidase eesterases; protease.
44. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 42 ou 43, ou uma cepa de microorganismode acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelofato de incluir os setores de padaria e confeitaria, e naformulação de produtos de padaria de alimentos de saúdenovéis.
45. Composição de enzima, de acordo com areivindicação 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (1-20%), CBH II (1-40%), β(1,3)6-glucanase,· N-acetilglucosaminidase; chitinase; a-glucuronidase; enzimas pectinolíticas, incluindogalactosidases, ramnogalacturonase, poligalacturonase,exogalacturonase e galactanase; atividade modificadora deamido; oxidoreductase/oxidase e esterases; protease.
46. [Claim missing on original document]
47. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 45 ou 46, ou uma cepa de microorganismode acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelofato de incluir a geração de compostos precursores desabor, de aroma e sensórios na indústria de alimentos.
48. Composição de enzima, de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (1-15%), CBH II (1-15%), 0(1,3)4-glucanase (10-45%), pOglucosidase (2-30%), Xilanase (1-55%), β-Xilosidase (0,5-12%).
49. Composição de enzima, de acordo com areivindicação 48, caracterizada pelo fato de aindacompreender um ou mais do seguinte: a-L-Arabinofuranosidase(0,1-5,0%); β(1,3)6-glucanase; N-acetilglucosaminidase;chitinase; α-Glucuronidase; enzimas pectinolíticas,incluindo galactosidases, ramnogalacturonase,poligalactronase, exogalacturonase e galactanase; atividademodificadora de amido; outras hemicelulases, incluindogalactosidases; oxidoreductase/oxidase e esterases,· eprotease.
50. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 48 ou 49, ou uma cepa de microorganismode acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelofato de incluir a geração de alimentos funcionais.
51. Composição de enzima, de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (1-15%), CBH II (1-15%), β (1,3)4-glucanase (10-45%), β-glucosidase (1-15%),Xilanase (1-30%),P-Xilosidase (0,5-20%).
52. Composição de enzima, de acordo com areivindicação 51, caracterizada pelo fato de aindacompreender um ou mais do seguinte: a-L-Arabinofuranosidase(0,1-5%); β(1,3)6-glucanase; N-Acetilglucosaminidase ;chitinase; α-Glucuronidase; enzimas pectinolíticas,incluindo galactosidases, ramnogalacturonase,poligalacturonase, exogalacturonase e galactanase;atividade modificadora de amido; oxidoreductase/oxidase eesterases; protease.
53. Composição de enzima, de acordo com areivindicação 51 ou 52, ou uma cepa de microorganismo , deacordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fatode incluir a produção de bebidas alcoólicas e não-alcoólicas novéis de projetistas, sucos de frutas e bebidaspara a saúde.
54. Composição de enzima, de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (3-15%), CBH II (3-15%), β(1,3)4-glucanase (15-40%), β-glucosidase (1-15%), Xilanase (16--55), e β-Xilosidase (0,5-7%).
55. Composição de enzima, de acordo com areivindicação 54, caracterizada pelo fato de aindacompreender um ou mais do seguinte: a-Glucuronidase (0,5--4%) , a-L-Arabinofuranosidase (1-5%), exoxilanase (2-10%),enzimas pectinolíticas (5-25%) , atividade modificadora deamido (2-8%), hemicelulases (5-10%),oxidoreductases/oxidase e esterases (1-10%), e protease (5--15%).
56. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 54 ou 55, ou uma cepa de microorganismode acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelofato de compreender a produção de produtos biofarmacêuticoscomo oligossacarídeos bioativos (incluindo (1,3(4 e (1,3)6glucooligossacarídeos de enlace misto,galactooligossacarídeos, xilogucooligossacarídeos,oligossacarídeos pécticos, xilooligossacarídeos ramificadose lineares, (galacto)glucomanooligossacarídeos,glicopeptídeos e glicosides glavonóides de plantasterrestres e marinhas, resíduos de plantas, fungos e fluxosde dejetos ou sub-produtos ricos em açúcares simples.
57. Composição de enzima, de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (1-20%), CBH II (1-40%), 0(1,3)4-glucanase (15-45%), β-glucosidase (2-12%), Xilanase (1--35%), e β-Xilosidase (1-5%).
58. Composição de enzima, de acordo com areivindicação 57, caracterizada pelo fato de aindacompreender um ou mais do seguinte: a-Glucuronidase (0,5--10%), a-L-Arabinofuranosidase (1-5%), exoxilanase (1-10%),enzimas pectinolíticas (5-25%), atividade modificadora deamido (2-15%), hemicelulases (5-10%),oxidoreductases/oxidase e esterases (1-15%) e protease (5--15%).
59. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 57 ou 58, ou uma cepa de microorganismode acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelofato de compreender aumentar a biodisponibilidade debiomoléculas com atividade anti-bactericida e anti-viralnatural, incluindo glicosides flavonóide e cianogênico,saponinas, oligossacarídeos e fenólicos (incluindo ácidosferúlico e p-coumaric, epicatequin, catequin, ácidopirogálico e assemelhados).
60. Composição de enzima, de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (3-15%), CBH II (3-15%), £(1,3)4-glucanase (25-40%), β-glucosidase (2-15%), Xinalase (10--30%), e p-Xilosidase (0,5-8%).
61. Composição de enzima, de acordo com areivindicação 60, caracterizada pelo fato de aindacompreender um ou mais do seguinte: a-Glucuronidase (0,5--10%), a-L-Arabinofuranosidase (0,1-5%), exoxilanase (1,5%),enzimas pectinolíticas (2-15%), atividade modificadora deamido (2-7%), hemicelulases (5-10%),oxidoreductases/oxidase e esterases (1-10%) e protease (5-15%).
62. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 60 ou 61, ou uma cepa demicroorganismo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizada pelo fato de compreender aumentar abiodisponibilidade de biomoléculas antioxidantes naturais,por exemplo, carotenóides, licopenes, xantofils,antocianinas, fenólicos e glicosides de todos os materiaisde plantas, resíduos, dejetos, incluindo várias frutas emorangos.
63. Composição de enzima, de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (1-25%), CBH II (1-40%), J3(l,3)4-glucanase (15-40%), β-glucosidase (2-15%), Xilanase (18--35%), e β-Xilosidase (0,5-12%).
64. Composição de enzima, de acordo com areivindicação 63, caracterizada pelo fato de aindacompreender um ou mais do seguinte: a-Glucuronidase (0,5--10%), a-L-Arabinofuranosidase (0,5-5%), enzimaspectinolíticas (5-25%), atividade modificadora de amido (2--12%), hemicelulases (2-10%), oxidoreductases/oxidase eesterases (1-15%), e protease (3-15%).
65. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 63 ou 64, ou uma cepa de microorganismode acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelofato de compreender a geração de matérias primas demateriais de plantas cruas, resíduos de plantas e dejetospara uso na produção microbial de antibióticos por fungos ebactéria, incluindo Penicillium sp. e Streptomyces sp.
66. Composição de enzima, de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBY I (1-30%), CBH II (1-40%), β(1,3)4-glucanase (15-40%), β-glucosidase (2-15%), Xilanase (18--35%), e β-Xilosidase (0,5-8%).
67. Composição de enzima, de acordo com areivindicação 66, caracterizada pelo fato de aindacompreender um ou mais do seguinte: a-Glucuronidase (0,5--10%), a-L-Arabinofuranosidase (1-5%), enzimaspectinoliticas (5-25%), atividade modificadora de amido (5--12%), hemicelulases (3-10%) , oxidoreductases/oxidase eesterases (1-15%), exoxilanase (1-12%) e protease (5-15%).
68. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 66 ou 67, ou uma cepa de microorganismo-15, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelofato de compreendera geração de matérias primas demateriais de plantas cruas, resíduos de plantas e dejetospara uso na produção microbial de ácido cítrico.
69. Composição de enzima, de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (0,4-15%), CBH II (0,4-15%), 0(1,3)4-glucanase (7-45%), β-glucosidase (2-25%), Xilanase (1-78%),e β-Xilosidase (0,4-8%).
70. Composição de enzima, de acordo com areivindicação 69, caracterizada pelo fato de aindacompreender um ou mais do seguinte: a-Glucuronidase (0,5--4%), a-L-Arabinofuranosidase (0,1-5%), enzimaspectinoliticas (2-25%), atividade modificadora de amido (2--15%), hemicelulases (2-10%) , oxidoreductases/oxidase eesterases (1-15%), exoxilanase (2-12%) e protease (5-30%).
71. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 69 ou 70, ou uma cepa de microorganismode acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelofato de compreender a produção de oligossacarídeos depolissacarídeos algais (por exemplo, laminaran e fucoidan)e aditivos derivados de extratos de plantas, por processosgeralmente considerados como seguros, na formulação decosméticos.
72. Composição de enzima, de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (0,4-30%), CBH II (0,4-10%), J3(l,3)4-glucanase (7-45%), β-glucosidase (2-12%), Xilanase (1-78%),e p-Xilosidase (0,1-8%).
73. Composição de enzima, de acordo com areivindicação 72, caracterizada pelo fato de compreender umou mais do seguinte: a-Glucuronidase (0,1-2%), a-L-Arabinofuranosidase (0,1-5%), enzimas pectinolíticas (2--10%), atividade modificadora de amido )2-15%),hemicelulases (2-10%), oxidoreductases/oxidase e esterases(1-10%), exoxilanase (2-5%), e protease (8-15%).
74. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de aindacompreender um ou mais do seguinte: a-Glucuronidase (0,1--2%), α-L-Arabinofuranosidase (0,1-5%), enzimaspectinolíticas (2-10%), atividade modificadora de amido (2--15%), hemicelulases (2-10%), oxidoreductases/oxidase eesterases (1-10%), exoxilanase (2-5%) e protease (8-15%).
75. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de aindacompreender um ou mais do seguinte: a-Glucuronidase (0,1--2%), α-L-Arabinofuranosidase (0,1-5%), enzimaspectinolíticas (2-10%), atividade modificadora de amido (2--15%), hemicelulases (2-10%), oxidoreductases/oxidase eesterases (1-10%), exoxilanase (2-5%), e protease (8-15%).-74. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 72 ou 73, ou uma cepa demicroorganismo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizada pelo fato de compreender a produção deoligossacarideos e glicopeptides para uso reagentes depesquisa, na produção de biossensores e como ferramentas naglicômica funcional para sondar interações receptor-ligantee na produção de bibliotecas de substrato para fazer perfiscom especificidade de enzima-substrato.-75. Composição de enzima, de acordo com areivindicação 72 ou 73, ou uma cepa de microorganismo , deacordo com a reivindicaçãol ou 2, caracterizada pelo fatode compreender a produção de oligossacarideos eglicopeptideos para uso como reagentes de pesquisa, naprodução de biossensores e como ferramentas na glicômicafuncional para sondar interações receptor-ligante e naprodução de bibliotecas de substratos para fazer o perfilda especificidade enzima-substrato.-75. Composição de enzima, de acordo com quaisquer umadas reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato decompreender CBH I (0,4-15%), CBH II (0,4-30%), 0(1,3)4-glucanase (7-45%), β-glucosidase ) (1-12%), Xilanase (10--78%), e p-Xilosidase (0,4-8%).
76. Composição de enzima, de acordo com areivindicação 75, caracterizada pelo fato de aindacompreender um ou mais do seguinte: a-Glucuronidase (0,5--10%), α-L-Arabinofuranosidase (0,1-5%), enzimaspectinolíticas (2-15%), atividade modificadora de amido (2--8%) , hemicelulases (5-10%), oxidoreductases/oxidase eesterases (1-10%), e protease (5-15%).
77. Utilização de uma composição de enzima, de acordocom a reivindicação 75 ou 76, ou uma cepa demicroorganismo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizada pelo fato de compreender a produção decelulose modificada e p-glucans, celooligossacarídeos,amidos modificados e maltooligossacarídeos, lactulose epolióis (por exemplo, manitol, gluciton ou dulcitol,xilitol, arabitol).
78. Utilização de um substrato produzido pelosmétodos, de acordo com quaisquer uma das reivindicações 11,-15 14, 17, 20, 23, 26, 29, 33, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56,-59, 62, 68, 71, 74, ou 77 caracterizado por ser usado comomatéria prima na produção de bicombustível.
79. Bioetanol ou biogás caracterizado pelo fato de quesempre que produzido por um processo, este será de acordocom a reivindicação 78.
80. Método para obter um sistema de enzima adequadopara converter um substrato alvo, o método caracterizadopelo fato de compreender:obter uma amostra do substrato alvo; permitir que um inoculo de uma cepa de microorganismocresça no substrato alvo e secrete enzimas;recuperar as enzimas secretadas durante o crescimentono substrato alvo;determinar atividades de enzimas e propriedades daenzima;construir um perfil de expressão de gene;identificar proteínas da enzima e construir um perfilde expressão de proteína;comparar a expressão de gene com o perfil de expressãode proteína; epurificar as enzimas.
81. Método, de acordo com a reivindicação 55,caracterizado pelo fato de ainda compreender:analisar as enzimas; eprojetar o sistema de enzima.
82. Xilanase tendo um peso molecular de 17,5 kDa, umpH ótimo de 4-4,5, reter 91% da atividade no pH 3,0, e teratividade de degradação contra tanto D-xilanos de enlacemisto como D-glucans de enlace misto.
83. Xilanase, de acordo com a reivindicação 82,caracterizada pelo fato de também ter atividade contraaril-p-xilosides.
84. Xilanase, de acordo com a reivindicação 82 ou areivindicação 83, caracterizado pelo fato de ser derivadada cepa de Talaromyces emersonii com o número de deposiçãoIMI393751, ou uma cepa substancialmente similar a ela ou ummutante da mesma.
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Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7514247B2 (en) 2007-11-03 2009-04-07 Wise Landfill Recycling Mining, Inc. Systems and processes for cellulosic ethanol production
US7662617B2 (en) 2007-11-03 2010-02-16 Rush Stephen L Systems and processes for cellulosic ethanol production
EP2282648A4 (en) * 2008-06-09 2011-09-21 Temple Inland PREBIOTIC COMPOSITIONS AND MANUFACTURING AND USE METHOD THEREFOR
AU2009281253B2 (en) 2008-08-11 2014-11-27 Versalis S.P.A. Degradation of lignocellulosic material
WO2010059424A2 (en) * 2008-11-18 2010-05-27 Novozymes, Inc. Methods and compositions for degrading cellulosic material
FR2939446B1 (fr) 2008-12-05 2011-04-22 Valagro Carbone Renouvelable Utilisation de coton recycle pour produire de l'ethanol, et procede de production.
BRPI1015536A2 (pt) * 2009-04-24 2019-07-02 Dsm Ip Assets Bv polipeptídeo de degradação de carboidratos e usos do mesmo
AU2010267983A1 (en) * 2009-07-03 2012-01-19 Dsm Ip Assets B.V. Talaromyces strains and enzyme compositions
US8828970B2 (en) 2009-08-27 2014-09-09 Georgia-Pacific Wood Products Llc Methods of making and using a ruminant gas reduction composition
CA2774142C (en) * 2009-10-08 2021-06-29 Dsm Ip Assets B.V. Process for the preparation of a fermentation product from lignocellulose containing material
AU2014277778B2 (en) * 2009-10-08 2017-05-11 Versalis S.P.A. Process for the preparation of a fermentation product from lignocellulose containing material
CA2779796A1 (en) * 2009-11-04 2011-05-12 Dsm Ip Assets B.V. Talaromyces transformants
EP2509453A4 (en) 2009-12-08 2013-11-20 Tin Inc D B A Temple Inland NUTRITIONAL COMPOSITION AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME
IE20100062A1 (en) * 2010-02-08 2012-03-28 Nat Univ Ireland Biofuel production from algae
EA201201125A1 (ru) 2010-02-11 2013-03-29 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. Клетка-хозяин, способная продуцировать ферменты, пригодные для деградации лигноцеллюлозного материала
DK2588494T3 (en) 2010-06-29 2018-06-14 Dsm Ip Assets Bv POLYPEPTIDE WITH BETA-GLUCOSIDASE ACTIVITY AND APPLICATIONS THEREOF
BR112012033404B1 (pt) 2010-06-29 2021-05-18 Dsm Ip Assets B.V. célula recombinante, método para a preparação de um polipeptídeo, composição, método para o tratamento de um substrato que compreende material de carboidrato e uso de um polipeptídeo
WO2012021735A2 (en) * 2010-08-11 2012-02-16 Menon & Associates, Inc. Pharmaceutical products from gungal strains
US9273335B2 (en) * 2010-08-12 2016-03-01 Novozymes, Inc. Compositions comprising a polypeptide having cellulolytic enhancing activity and a quinone compound and uses thereof
US9458483B2 (en) 2010-08-12 2016-10-04 Novozymes, Inc. Compositions comprising a polypeptide having cellulolytic enhancing activity and a bicyclic compound and uses thereof
ES2563209T3 (es) * 2010-10-01 2016-03-11 Novozymes, Inc. Variantes de beta-glucosidasa y polinucleótidos que codifican las mismas
JP5850608B2 (ja) * 2010-10-18 2016-02-03 株式会社ダスキン バイオエタノールの製造方法
PL2468857T3 (pl) * 2010-12-22 2015-03-31 Neste Oil Oyj Zintegrowany układ technologiczny do wytwarzania lipidów i otrzymywania masy celulozowej
JP5589871B2 (ja) * 2011-01-27 2014-09-17 トヨタ自動車株式会社 セルロース系バイオマスの処理方法、セルロース系バイオマスからの糖又はアルコール又は有機酸の製造方法
MX2013010510A (es) * 2011-03-17 2013-10-07 Danisco Inc Enzimas glocosil hidrolasa y usos de estas para la hidrolisis de biomasa.
US8329455B2 (en) 2011-07-08 2012-12-11 Aikan North America, Inc. Systems and methods for digestion of solid waste
EP2756091A1 (en) 2011-09-13 2014-07-23 Novozymes North America, Inc. Methods of hydrolyzing and fermenting cellulosic material
WO2013067964A1 (en) * 2011-11-11 2013-05-16 Novozymes, Inc. Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
US20150010958A1 (en) * 2012-01-29 2015-01-08 Novoztmes A/S Methods for Degrading or Converting Cellulosic Material
EP2917359B1 (en) 2012-11-09 2019-07-03 DSM IP Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material by using oxygen
EP2917355B1 (en) 2012-11-09 2019-10-23 DSM IP Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material with addition of oxygen
WO2014072392A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CA2896251A1 (en) * 2013-01-11 2014-07-17 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material
CN105073986A (zh) 2013-02-04 2015-11-18 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 碳水化合物降解多肽及其用途
WO2014202621A1 (en) * 2013-06-20 2014-12-24 Dsm Ip Assets B.V. Carbohydrate degrading polypeptide and uses thereof
WO2015004099A1 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2015004098A1 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
KR20160143714A (ko) 2014-04-03 2016-12-14 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 리그노셀룰로스 물질을 효소적으로 가수분해하고 당을 발효시키는 방법 및 장치
US10337040B2 (en) 2014-04-30 2019-07-02 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
EP3139769B1 (en) 2014-05-05 2022-06-22 California Safe Soil, LLC Nutrient rich compositions
MY195095A (en) 2014-12-19 2023-01-10 Dsm Ip Assets Bv Process for Enzymatic Hydrolysis of Lignocellulosic Material And Fermentation Of Sugars
CN104988126B (zh) * 2015-07-31 2018-10-12 云南师范大学 一种β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3及其基因和NagGH3制备方法
CN106566818B (zh) * 2016-10-28 2019-05-17 中国农业科学院饲料研究所 酸性嗜热多聚半乳糖醛酸酶TePG28A及其编码基因和应用
CN107384899B (zh) * 2017-08-01 2020-03-27 中国农业科学院饲料研究所 一种真菌来源的酸性蛋白酶g412及其基因和应用
CA3080125A1 (en) * 2017-10-24 2019-05-02 Cinder Biological, Inc. Methods for rapidly digesting biopolymers with ultrastable enzymes for mass spectrometry-based analyses
EP3530744A1 (en) * 2018-02-23 2019-08-28 University of Limerick A polypeptide having xylanase and/or cellulase activity
CN109735518B (zh) * 2019-02-28 2020-08-25 北京理工大学 一种最适反应pH提高的β-葡萄糖醛酸苷酶突变体及其转化甘草酸工艺
CN113980823B (zh) * 2021-12-10 2022-10-14 中南大学 发菌科下一株新属菌株及其应用
EP4656729A1 (en) * 2024-05-31 2025-12-03 Renescience A/S Method of processing cellulosic material

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE795716A (fr) * 1972-02-22 1973-08-21 Glaxo Lab Ltd Compositions enzymatiques thermostables
FR2555602B1 (fr) * 1983-11-28 1990-05-11 Glaxo Group Ltd Enzyme et composition d'enzymes degradant les pentosanes, leurs procedes d'obtention et d'application
GB9928968D0 (en) * 1999-12-07 2000-02-02 Danisco Enzyme
CA2689798C (en) 2000-03-20 2015-01-20 Basf Aktiengesellschaft Talaromyces emersonii beta-glucanases
CZ2003798A3 (cs) 2000-09-21 2003-08-13 Dsm N. V. Polypeptid s aktivitou xylanázy, sekvence nukleové kyseliny kódující polypeptid, způsob přípravy a použití polypeptidu
EP1482050A1 (en) * 2003-05-28 2004-12-01 Facultés Universitaires Notre-Dame de la Paix Enzyme with xylanase activity at acidic ph
EP1735454B1 (en) * 2004-03-25 2017-05-10 Novozymes, Inc. Methods for degrading or converting plant cell wall polysaccharides

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