BRPI0708002A2 - métodos de uso de anticorpos contra a il-22 humana - Google Patents

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Martin Hegen
Deborah P Luxemberg
Margot O'toole
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Abstract

MéTODOS DE USO DE ANTICORPOS CONTRA A IL-22 HUMANA. A presente invenção refere-se a anticorpos humanos e fragmentos dos mesmos de ligação a antígeno que se ligam especificamente a interleucina-22 humana (IL-22) e a métodos de uso desses anticorpos, por exemplo, em diagnose, tratamento ou prevenção de distúrbios inflamatórios, doenças auto-imunes, alergias, choque séptico, doenças infecciosas, rejeição de transplante, câncer e outros distúrbios do sistema imune.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSDE USO DE ANTICORPOS CONTRA A IL-22 HUMANA".
Campo Técnico
A presente invenção refere-se a anticorpos, por exemplo, a anti-corpos humanos, e a seus fragmentos de ligação a antígeno que se ligam àinterleucina 22 (IL-22), particularmente, a IL-22 humana, e ao seu uso naregulação de atividades associadas a IL-22. Os anticorpos aqui descritossão úteis no diagnóstico, prevenção e/ou tratamento de distúrbios associa-dos com a IL-22, por exemplo, distúrbios auto-imunes, incluindo artrite.
Antecedentes da Invenção
Antígenos iniciam respostas imunes e ativam as duas maiorespopulações de linfócitos: as células T e as células B. Depois de encontrar oantígeno, as células T se proliferam e se diferenciam em células efetoras,enquanto que as células B se proliferam e se diferenciam em células plas-máticas secretoras de anticorpo. Essas células efetoras secretam e/ou res-pondem às citocinas, as quais são proteínas pequenas (< do que cerca de30 KDa) secretadas por linfócitos e outros tipos celulares.
Interleucina 22 (IL-22) é uma citocina de classe Il que apresentahomologia de seqüência a IL-10. Sua expressão é supra-regulada nas célu-las T pela IL-9 ou ConA (Dumoutier L. et al. (2000) Proc Natl Aead Sci USA97(18): 10144 - 9). Outros estudos têm demonstrado que a expressão doMRNA de IL-22 é induzida in vivo em resposta à administração de LPS, eque a IL-22 modula parâmetros indicativos de uma resposta de fase aguda(Dumoutier L. et al. (2000); Pittman D. et al. (2001) Genes and Immunity2:172). Além disso, a IL-22 intensifica a expressão de peptídeos antimicrobi-anos associados com a defesa do hospedeiro, incluindo β-defensina,S100A7, S100A8 e S100A. Wolk et al., Immunity, 21: 241-54 (2004); Bonifa-ce et al., J. Immunol. 174: 3695-3702 (2005); Liang et al., J. Exp. Med.,203(10): 2271 - 79 (2006). Tomadas juntas, essas observações indicam quea IL-22 desempenha um papel na inflamação (Kotenko S.V. (2002) Cytokine& Growth Factor Reviews 13(3): 223 - 40).
Acredita-se que a IL-22 se ligue a um complexo receptor consis-tindo em IL-22R e de IL-10R2, dois membros da família de receptores decitocina tipo II (CRF2) (Xie M.H. et al. (2000) J Biol Chem 275(40): 31335 - 9;Kotenko S.V. et al. (2001) J Biol Chem 276(4): 2725 - 32). Ambas as cadeiasdo receptor de IL-22 são expressas constitutivamente em uma variedade deórgãos. As inhagens de células epiteliais derivadas desses órgãos são res-ponsivas à IL-22 in vitro (Kotenko S.V. (2002) Cytokine & Growth Factor Re-views 13(3): 223 - 40). A IL-22 induz a ativação das vias JAK-STAT3 e ERK,assim como intermediários de outras vias MAPK (Dumoutier L. et al. (2000)supra-, Xie M.H. et al. (2000) supra; Dumoutier L. et al. (2000) J Immunol164(4): 1814-9; Kotenko S.V. et al. (2001) J Biol Chem 276(4): 2725 - 32;Lejeune, D. et al. (2002) J Biol Chem 277(37): 33676 - 82).
Membros de CRF2 são receptores para IFNa/β, IFNy1 fator decoagulação Vila, IL-10 e as proteínas relacionadas com IL-10 IL-19, IL-20,IL-22, IL-24, IL-26, assim como as citocinas tipo IFN recentemente identifi-cadas, IL-28 e IL-29 (Kotenko S.V. (2002) Cytokine & Growth Factor Revi-ews 13(3): 223 - 40; Kotenko, S.V. et al. (2000) Oncogene 19(21): 2557 - 65;Sheppard, P. et al. (2003) Nature Immunology 4(1): 63 - 8; Kotenko, S.V. etal. (2003) Nature Immunology 4(1): 69 - 77). Além desses receptores demembrana, , a família CRF2 também inclui uma proteína solúvel, a proteínade ligação a IL-22 (IL-22BP), a qual é específica para IL-22 e bloqueia suaatividade (Dumoutier, L. et al. (2001) J Immunol 166(12): 7090 - 5; Kotenko,S.V. et al. (2001) J Immunol 166(12): 7096 - 103; Xu, W. et al. (2001) ProeNatIAeadSei USA 98(17): 9511 - 6; Gruenberg, B.H. et al. (2001) Genes &Immunity 2(6): 329 - 34; Wei C-C et al. (2003) Genes & Immunity 4: 204 -211). Enquanto o complexo receptor de IL-22 é único para a IL-22, cada ca-deia (isto é, IL-22R e 1-10R2) é compartilhada com outros membros CRF2para definir receptores funcionais para outras citocinas, incluindo IL-20, IL-24(IL-22R/IL-20R2), IL-28, IL-29 (IFN-ÀR1/IL-10R2) e IL-10 (IL-10R1/IL-10R2)(Dumoutier, L. et al. (2001) J. Immunol. 167(7): 3545 - 9; Wang, M. et al.(2002) J Biol Chem 277(9): 7341 - 7; Parrish-Novak, J. et al. (2002) J BiolChem 277(49): 47517 - 23; Kotenko, S.V. et al. (1997) EMBO J. 16(19): 5894- 903; Spencer, S.D. et al. (1998) J Exp Med 187(4): 571 - 8).Ambas as cadeias do receptor composto por CRF-2 são necessáriaspara a transdução de sinal. Uma cadeia do receptor composto tem sido his-toricamente definida como a cadeia de ligação do Iigante (por exemplo,IFNyRI) baseando-se na sua alta afinidade para a citocina. A outra cadeia(por exemplo, IFNyR2) foi caracterizada como um auxiliador ou cadeia aces-sória, e apresenta uma afinidade mínima para a citocina sozinha (Kotenko,S.V. et al. (2000) Oncogene 19(21): 2557 - 65). Para a IL-22, IL-22 é umasubunidade do receptor de alta afinidade com a IL-10R2 se ligando subse-qüentemente ao complexo IL-22/IL-22R (Li, J. et al. (2004) Int. Immuno-pharmacol. 4(5): 673 - 708; Logsdon, N. J. et al. (2002) J. Interferon CytokineRes 22(11): 1099 - 1112).
Sumário da Invenção
O presente pedido de patente proporciona, pelo menos em par-te, agentes de ligação a IL-22, tais como anticorpos e seus fragmentos deligação a antígeno que se ligam à interleucina 22 ("IL-22"), particularmente, aIL-22 humana, com alta afinidade e especificidade. Os anticorpos e seusfragmentos de ligação a antígeno da presente invenção são também aquireferidos como "anticorpos anti-IL-22" e "seus fragmentos", respectivamente.Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento seu reduz, inibe ou antagoni-za a atividade da IL-22. Tais anticorpos podem ser usados para regular asrespostas imunes de distúrbios associados com a IL-22 pelo antagonismo daatividade da IL-22. Em outras modalidades, o anticorpo anti-IL22 pode serusado para diagnóstico, ou como um anticorpo de alvejamento para distribuirum agente terapêutico ou citotóxico a uma célula que expresse IL-22. Con-seqüentemente, os anticorpos anti-IL-22 da invenção são úteis no diagnósti-co, tratamento e/ou prevenção de distúrbios associados com a IL-22, porexemplo, doenças auto-imunes, por exemplo, artrite (incluindo artrite reuma-tóide, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática, artrite associa-da com lúpus ou espondilite anquilosante), escleroderma, lúpus eritematososistêmico, HIV, síndrome de Sjogren, vasculite, esclerose múltipla, tiroiditeauto-imune, dermatite (incluindo dermatite atópica e dermatite eczematosa),miastenia gravis, doença do intestino inflamatória (IBD), doença de Crohn,colite, diabetes mellitus (tipo I); condições inflamatórias, por exemplo, da pele(por exemplo psoríase), sistema cardiovascular (por exemplo, aterosclerose),sistema nervoso (por exemplo, doença de Alzheimer), fígado (por exemplo,hepatite), rim (por exemplo, nefrite) e pâncreas (por exemplo, pancreatite);doenças cardiovasculares, por exemplo, distúrbios metabólicos do coleste-rol, injúria por radical livre de oxigênio, isquemia; distúrbios associados comcicatrização de ferida; distúrbios respiratórios, por exemplo, asma e DPOC(por exemplo, fibrose cística); condições inflamatórias agudas (por exemplo,endotoxemia, sepse e septicemia, síndrome do choque tóxico e doença in-fecciosa); rejeição de transplante e alergia. Em uma modalidade, o distúrbioassociado com a IL-22 é um distúrbio artrítico, por exemplo, um distúrbioescolhido de um ou mais dentre artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil,osteoartrite, artrite psoriática ou espondilite anquilosante; um distúrbio respi-ratório (por exemplo, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC); ouuma condição inflamatória, por exemplo, da pele (por exemplo, psoríase),sistema cardiovascular (por exemplo, aterosclerose), sistema nervoso (porexemplo, doença de Alzheimer), fígado (por exemplo, hepatite), rim (por e-xemplo, nefrite), pâncreas (por exemplo, pancreatite) e órgãos gastrointesti-nais, por exemplo, colite, doença de Crohn e IBD.
Concordantemente, em um aspecto, a invenção exibe um anti-corpo isolado que se liga a IL-22, particularmente, a IL-22 humana. Em cer-tas modalidades, o anticorpo anti-IL-22 pode ter pelo menos uma das se-guintes características: (1) ele é um anticorpo monoclonal ou de especifici-dade individual; (2) ele é um anticorpo humano; (3) ele é um anticorpo gera-do in vitro\ (4) ele é um anticorpo gerado in vivo (por exemplo, um sistematransgênico); (5) ele se liga a IL-22 com uma constante de associação depelo menos 1012 M'1; (6) ele se liga a IL-2 com uma constante de associaçãode pelo menos 1011 M"1; (7) ele se liga a IL-22 com uma constante de asso-ciação de pelo menos 1010 M"1; (8) ele se liga a IL-22 com uma constante deassociação de pelo menos 109 M"1; (9) ele se liga a IL-22 com uma constan-te de associação de pelo menos 106 M'1; (10) ele se liga a IL-22 com umaconstante de dissociação de 500 nM ou menos; (11) ele se liga a IL-22 comuma constante de dissociação de 10 nM ou menos; (12) ele se liga a IL-22com uma constante de dissociação de 150 pM ou menos; (13) ele se liga aIL-22 com uma constante de dissociação de 60 pM ou menos; (14) ele inibea ligação da IL-22 a IL-22R de um complexo receptor de IL-22R e IL-10R2com uma IC50 de 10 nM ou menos; (15) ele bloqueia a proliferação mediadapor IL-22 das células BaF3 projetadas para o receptor IL-22 com um IC50 de1 nM ou menos em uma modalidade, com uma IC50 de 150 pM ou menosem outra modalidade, com uma IC50 de 100 pM ou menos em outra modali-dade e com uma IC50 de 10 pM ou menos em outra modalidade; e (16) elebloqueia a secreção de GROa mediada por IL-22 das células HT29 com umaIC50 de 1 nM ou menos em uma modalidade, com uma IC50 de 150 pM oumenos em outra modalidade e com uma IC50 de 10 pm ou menos em outramodalidade. A proliferação de células BaF3 mediada por IL-22 e a secreçãode GROa mediada por IL-22 de células HT29 pode ser medida conformedescrito nos Exemplos.
Modalidades não-ilustrativas dos anticorpos da invenção sãoreferidas aqui como "GIL01," "GIL16," "GIL45," "GIL60," "GIL68," "GIL92,""097D09," "062A09," "062G05," "087B03," "367D04," "368D04," Ί66Β06,""166G05," "375G06," "376B10," "354A08," "355B06," "355E04" e "356A11."Esses anticorpos podem ser ou não de linhagem germinativa. Em outra mo-dalidade, o anticorpo é escolhido dentre 356A11, 354A08, 087B03 e368D04. Os anticorpos da invenção podem se ligar especificamente aomesmo epitopo de IL-22 ou a um epitopo similar (por exemplo, um epitopode sobreposição) que GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09,062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06,376B10, 354A08, 355B06, 355E04, ou 356A11 se ligam, em outras modali-dades, os anticorpos se ligam especificamente a um fragmento de uma IL-22,por exemplo, a um fragmento de pelo menos 10, 20, 50, 75, 100, 50 ou 200aminoácidos contíguos à seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ IDNO: 1, ou uma seqüência que seja pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,98%, 99% ou mais idêntica a ela. Em outras modalidades, o anticorpo inibecompetitivamente a ligação de pelo menos um de GIL01, GIL16, GIL45,GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062Α09, 062G05, 087Β03, 367D04, 368D04,166Β06, 166G05, 375G06, 376Β10, 354Α08, 355Β06, 355Ε04, ou 356A11ao seu epitopo-alvo.
Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção inclui umdomínio VH, um domínio Vl ou uma combinação desses do fragmento Fv deGIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05,087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08,355B06, 355E04, ou 356A11. Por exemplo, o anticorpo inclui um domínio Vhe/ou um domínio Vl com uma seqüência de aminoácidos conforme estabe-lecida nas Tabelas 1 a 7 (SEQ ID NO:5, 23, 41, 59, 77, 95, 113, 131, 149,167, 185, 203, 221, 239, 257, 275, 293, 311, 329, 347, 365, 383, 401, 419,437, 455, 473, 491, 509, 527, 545, 563, 581, 599, ou 617 para Vh e SEQ IDNO:6, 24, 42, 60, 78, 96, 114, 132, 150, 168, 186, 204, 222, 240, 258, 276,294, 312, 330, 348, 366, 384, 402, 420, 438, 456, 474, 492, 510, 528, 546,564, 582, 600, ou 618 para VL), ou uma seqüência substancialmente idênticaa essa (por exemplo, uma seqüência pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a ela, ou a qual difira em não mais doque 1, 2, 5, 10 ou 15 resíduos de aminoácidos das SEQ ID NO:5, 6, 23, 24,41, 42, 59, 60, 77, 78, 95, 96, 113, 114, 131, 132, 149, 150, 167, 168, 185,186, 203, 204, 221, 222, 239, 240, 257, 258, 275, 276, 293, 294, 311, 312,329, 330, 347, 348, 365, 366, 383, 384, 401, 402, 419, 420, 437, 438, 455,456, 473, 474, 491, 492, 509, 510, 527, 528, 545, 546, 563, 564, 581, 582,599, 600, 617, ou 618).
Em outra modalidade, o anticorpo da presente invenção incluium domínio VH, um domínio Vl ou uma combinação desses, do fragmentoFv de um anticorpo escolhido de 356A11, 354A08, 087B03 e 368D04. Nes-sa modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compre-ende:
um domínio Vh compreendendo a seqüência de aminoácidosestabelecida na SEQ ID NO: 167 ou 491 e/ou um domínio Vl compreenden-do a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 168 ou 492(087B03);um domínio Vh compreendendo a seqüência de aminoácidosestabelecida na SEQ ID NO: 293 ou 545 e/ou um domínio Vl compreenden-do a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 294 ou 546(354A08);
um domínio Vh compreendendo a seqüência de aminoácidosestabelecida na SEQ ID NO: 203 ou 617 e/ou um domínio Vl compreenden-do a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 204 ou 618(368D04); ou
um domínio Vh compreendendo a seqüência de aminoácidosestabelecida na SEQ ID NO: 347 ou 599 e/ou um domínio Vl compreenden-do a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 348 ou 600(356A11);
Em outra modalidade, o anticorpo inclui um domínio Vh e/ou Vlcodificado por um ácido nucléico com uma seqüência de nucleotídeos con-forme estabelecida nas Tabelas 1 e 7 (SEQ ID NO: 14, 32, 50, 68, 86, 104,122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356, 374,392, 410, 428, 446, 464, 482, 500, 518, 536, 554, 572, 590, 608, ou 626 paraVh e SEQ ID NO:15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231,249, 267, 285, 303, 321, 339, 357, 375, 393, 411, 429, 447, 465, 483, 501,519, 537, 555, 573, 591, 609, ou 627 para VL), ou uma seqüência substanci-almente igual a ela (por exemplo, uma seqüência que com pelo menos cercade 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade a ela, ou aqual difira por não mais do que 1, 2, 3, 6, 15, 30 ou 45 nucleotídeos da SEQID NO: 14, 15, 32, 33, 50, 51, 68, 69, 86, 87, 104, 105, 122, 123, 140, 141,158, 159, 176, 177, 194, 195, 212, 213, 230, 231, 248, 249, 266, 267, 284,285, 302, 303, 320, 321, 338, 339, 356, 357, 374, 375, 392, 393, 410, 411,428, 429, 446, 447, 464, 465, 482, 483, 500, 501, 518, 519, 536, 537, 554,555, 572, 573, 590, 591, 608, 609, 626, ou 627).
Em outras modalidades, o anticorpo inclui um domínio Fv comuma seqüência de aminoácidos conforme estabelecida nas Tabelas 1 e 7(SEQ ID NO: 7, 25, 43, 61, 79, 97, 115, 133, 151, 169, 187, 205, 223, 241,259, 277, 295, 313, 331, 349, 367, 385, 403, 421, 439, 457, 475, 493, 511,529, 547, 565, 583, 601, ou 619), ou uma seqüência substancialmente idên-tica a ela (por exemplo, uma seqüência com pelo menos cerca de 85%,90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade em relação a ela, oua qual difira por não mais do que 1, 2, 5, 10, 15, 20, 30 ou 35 resíduos deaminoácidos da SEQ ID NO: 7, 25, 43, 61, 79, 97, 115, 133, 151, 169, 187,205, 223, 241, 259, 277, 295, 313, 331, 349, 367, 385, 403, 421, 439, 457,475, 493, 511, 529, 547, 565, 583, 601, ou 619). Em outra modalidade, oanticorpo da presente invenção inclui um domínio Fv do anticorpo escolhidode 356A11 (SEQ ID NO:349 ou 601), 354A08 (SEQ ID NO:295 ou 547),087B03 (SEQ ID NO:169 ou 493) e 368D04 (SEQ ID N0:205 ou 619). Emoutra modalidade, o anticorpo inclui um domínio Fv codificado por um ácidonucléico com uma seqüência de nucleotídeos conforme estabelecida nasTabelas 1 e 7 (SEQ ID NO:16, 34, 52, 70, 88, 106, 124, 142, 160, 178, 196,214, 232, 250, 268, 286, 304, 322, 340, 358, 376, 394, 412, 430, 448, 466,484, 502, 520, 538, 556, 574, 592, 610 ou 628), ou uma seqüência substan-cialmente idêntica a ela (por exemplo, uma seqüência com pelo menos cercade 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade a ela, ou aqual difira por não mais do que 1, 2, 3, 6, 15, 30, 45, 60, 90 ou 105 nucleotí-deos da SEQ ID NO: 16, 34, 52, 70, 88, 106, 124, 142, 160, 178, 196, 214,232, 250, 268, 286, 304, 322, 340, 358, 376, 394, 412, 430, 448, 466, 484,502, 520, 538, 556, 574, 592, 610 ou 628). Ainda em outras modalidades, oanticorpo compreende pelo menos uma região determinante de complemen-taridade (CDR) desses domínios Vh e VL. Por exemplo, o anticorpo podeincluir um, dois ou três CDRs do domínio Vh com uma seqüência de amino-ácidos conforme estabelecida em ou incluída nas seqüências das Tabelas 1e 7 (SEQ ID NO: 5, 7, 8, 9, 10, 23, 25, 26, 27, 28, 41, 43, 44, 45, 46, 59, 61,62, 63, 64, 77, 79, 80, 81, 82, 95, 97, 98, 99, 100, 113, 115, 116, 117, 118,131, 133, 134, 135, 136, 149, 151, 152, 153, 154, 167, 169, 170, 171, 172,185, 187, 188, 189, 190, 203, 205, 206, 207, 208, 221, 223, 224, 225, 226,239, 241, 242, 243, 244, 257, 259, 260, 261, 262, 275, 277, 278, 279, 280,293, 295, 296, 297, 298, 311, 313, 314, 315, 316, 329, 331, 332, 333, 334,347, 349, 350, 351, 352, 365, 367, 368, 369, 370, 383, 385, 386, 387, 388,401, 403, 404, 405, 406, 419, 421, 422, 423, 424, 437, 439, 440, 441, 442,455, 457, 458, 459, 460, 473, 475, 476, 477, 478, 491, 493, 494, 495, 496,509, 511, 512, 513, 514, 527, 529, 530, 531, 532, 545, 547, 548, 549, 550,563, 565, 566, 567, 568, 581, 583, 584, 585, 586, 599, 601, 602, 603, 604,617, 619, 620, 621 ou 622) ou uma seqüência substancialmente homóloga aela (por exemplo, uma seqüência pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a ela). Em outra modalidade, o anti-corpo da presente invenção inclui uma, duas ou três CDRs do domínio Vh deum anticorpo escolhido dentre 356A11, 354A08, 087B03 e 368D04. Nessamodalidade, o anticorpo, ou seu fragmento de ligação a antígeno, compre-ende uma região variável de cadeia pesada compreendendo:
a) SEQ ID N0:170 ou 494; b) SEQ ID NO: 171 ou 495; e/ou c)SEQ ID NO: 172 ou 496 (087B03);
a) SEQ ID NO:296 ou 548; b) SEQ ID NO:297 ou 549; e/ou c)SEQ ID NO:298 ou 550 (354A08);
a) SEQ ID N0:206 ou 620; b) SEQ ID N0:207 ou 621; e/ou c)SEQ ID N0:208 ou 622 (368D04); ou
a) SEQ ID N0:350 ou 602; b) SEQ ID NO:351 ou 603; e/ou c)SEQ ID NO:352 ou 604 (356A11).
Em outra modalidade, o anticorpo pode incluir um, dois ou trêsCDRs do domínio Vl com uma seqüência de aminoácidos conforme estabe-lecida em ou incluída nas seqüências nas Tabelas 1 e 7 (SEQ ID NO:6, 7,11, 12, 13, 24, 25, 29, 30, 31, 42, 43, 47, 48, 49, 60, 61, 65, 66, 67, 78, 79,83, 84, 85, 96, 97, 101, 102, 103, 114, 115, 119, 120, 121, 132, 133, 137,138, 139, 150, 151, 155, 156, 157, 168, 169, 173, 174, 175, 186, 187, 191,192, 193, 204, 205, 209, 210, 211, 222, 223, 227, 228, 229, 240, 241, 245,246, 247, 258, 259, 263, 264, 265, 276, 277, 281, 282, 283, 294, 295, 299,300, 301, 312, 313, 317, 318, 319, 330, 331, 335, 336, 337, 348, 349, 353,354, 355, 366, 367, 371, 372, 373, 384, 385, 389, 390, 391, 402, 403, 407,408, 409, 420, 421, 425, 426, 427, 438, 439, 443, 444, 445, 456, 457, 461,462, 463, 474, 475, 479, 480, 481, 492, 493, 497, 498, 499, 510, 511, 515,516, 517, 528, 529, 533, 534, 535, 546, 547, 551, 552, 553, 564, 565, 569,570, 571, 582, 583, 587, 588, 589, 600, 601, 605, 606, 607, 618, 619, 623,624 ou 625), ou uma seqüência substancialmente idêntica a ela (por exem-plo, uma seqüência com pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,98%, 99% ou mais de identidade com ela). Em outra modalidade, o anticor-po da presente invenção inclui um, dois ou três CDRs do domínio Vl de umanticorpo escolhido de 356A11, 354A08, 087B03 e 368D04. Nessa modali-dade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno seu compreende umaregião variável de cadeia leve compreendendo:
a) SEQ ID NO: 173 ou 497; b) SEQ ID NO: 174 ou 498; e/ou c)SEQ ID NO:175 ou 499 (087B03);
a) SEQ ID NO:299 ou 551; b) SEQ ID N0:300 ou 552; e/ou c)SEQ ID N0:301 ou 553 (354A08);
a) SEQ ID N0:209 ou 623; b) SEQ ID N0:210 ou 624; e/ou c)SEQ ID NO:211 ou 625 (368D04); ou
a) SEQ ID NO:353 ou 605; b) SEQ ID NO:354 ou 606; e/ou c)SEQ ID NO:355 ou 607 (356A11).
Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo compreende umfragmento H3 do domínio Vh de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92,097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05,375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 ou 356A11, por exemplo, umfragmento H3 com a seqüência de aminoácidos conforme estabelecida nasTabelas 1 e 7 (SEQ ID NO: 10, 28, 46, 64, 82, 100, 118, 136, 154, 172, 190,208, 226, 244, 262, 280, 298, 316, 334, 352, 370, 388, 406, 424, 442, 460,478, 496, 514, 532, 550, 568, 586, 604 ou 622), ou uma seqüência substan-cialmente idêntica a ela (por exemplo, uma seqüência com pelo menos cercade 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade com ela).
O anticorpo da invenção pode ser de comprimento total (por e-xemplo, incluir pelo menos uma cadeia pesada completa e pelo menos umacadeia leve completa) ou pode incluir somente um fragmento de ligação aantígeno (por exemplo, um FAB, F(ab')2, Fv, um fragmento Fv de cadeia úni-ca, um fragmento Fd ou um fragmento dAb). O anticorpo pode incluir umaregião constante ou uma porção sua escolhida de qualquer um dentre: osgenes da região constante de capa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e um.Por exemplo, regiões constantes de cadeia pesada dos vários isotipos po-dem ser usadas, incluindo: IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE.A região constante de cadeia leve pode ser escolhida de capa ou lambda. Oanticorpo pode ser uma IgG ou ele também pode ser IgGiK ou IgGiy.
O anticorpo anti-IL22 descrito aqui pode ser derivatizado ou liga-do a outra molécula funcional (tal como outro peptídeo ou proteína (por e-xemplo, um fragmento FAB)). Por exemplo, um anticorpo da invenção podeser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusãogenética, associação não-covalente ou outra forma) a pelo menos uma enti-dade molecular, tal como outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo bies-pecífico ou multiespecífico), toxina, radioisótopo, agente citotóxico ou citostá-tico, dentre outros.
Em outro aspecto, a presente invenção apresenta uma composi-ção farmacêutica contendo pelo menos um anticorpo anti-IL-22 e um veículofarmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ainda incluiruma combinação de pelo menos um anticorpo anti-IL22 e pelo menos umagente terapêutico (por exemplo, citocina e inibidores do fator de crescimen-to, imunossupressores, agentes antiinflamatórios, inibidores metabólicos,inibidores enzimáticos, agentes citotóxicos, agentes citostáticos ou combina-ções suas, conforme descrito aqui em maiores detalhes). Combinações doanticorpo anti-IL-22 e um agente terapêutico também estão dentro do esco-po da invenção. As composições e combinações da invenção podem serusadas para regular condições inflamatórias associadas com a IL-22, porexemplo, por modulação da sinalização de IL-22 através de seus receptoreslocalizados nas células epiteliais de uma variedade de tecidos incluindo, po-rém sem se limitar, àqueles do pâncreas, pele, pulmão, intestino, fígado, rim,glândula salivar e endotélio vascular, além de células imunes localizadas notecido e potencialmente ativadas.
Em outro aspecto, a invenção exibe um método de tratamentode um indivíduo com um distúrbio associado com a IL-22. O método inclui aadministração ao indivíduo de um anticorpo anti-IL-22 em uma quantidadesuficiente para inibir pelo menos uma atividade IL-22 das células imunes,deste modo tratando o distúrbio associado com a IL-22.
O anticorpo anti-IL-22 pode ser administrado ao indivíduo, sozi-nho ou em combinação com outros agentes terapêuticos conforme aqui des-crito. O indivíduo pode ser um mamífero, por exemplo, um ser humano. Porexemplo, o método pode ser usado para tratar um indivíduo com um distúr-bio associado com a IL-22 tal como distúrbios auto-imunes, por exemplo,artrite (incluindo artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite,artrite psoriática, artrite associada com lúpus ou espondilite anquilosante),escleroderma, lúpus eritematoso sistêmico, HIV, síndrome de Sjogren, vas-culite, esclerose múltipla, tiroidite auto-imune, dermatite (incluindo dermatiteatópica e dermatite eczematosa), miastenia gravis, doença do intestino in-flamatória (IBD), doença de Crohn, colite, diabetes mellitus (tipo I); condi-ções inflamatórias, por exemplo, da pele (por exemplo, psoríase), sistemacardiovascular (por exemplo, aterosclerose), sistema nervoso (por exemplo,doença de Alzheimer), fígado (por exemplo, hepatite), rim (por exemplo, ne-frite) e pâncreas (por exemplo, pancreatite); doenças cardiovasculares, porexemplo, distúrbios metabólicos do colesterol, injúria por radical livre de oxi-gênio, isquemia; distúrbios associados com cicatrização de ferida; distúrbiosrespiratórios, por exemplo, asma e DPOC (por exemplo, fibrose cística);condições inflamatórias agudas (por exemplo, endotoxemia, sepse e septi-cemia, síndrome do choque tóxico e doença infecciosa); rejeição de trans-plante e alergia. Em uma modalidade, o distúrbio associado com a IL-22 éum distúrbio artrítico, por exemplo, um distúrbio escolhido de um ou maisdentre artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite psori-ática ou espondilite anquilosante; um distúrbio respiratório (por exemplo,asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC); ou uma condição infla-matória, por exemplo, da pele (por exemplo, psoríase), sistema cardiovascu-lar (por exemplo, aterosclerose), sistema nervoso (por exemplo, doença deAlzheimer), fígado (por exemplo, hepatite), rim (por exemplo, nefrite), pân-creas (por exemplo, pancreatite) e órgãos gastrointestinais, por exemplo,colite, doença de Crohn e IBD.Em outro aspecto, a invenção exibe um método de diminuição,inibição ou redução de uma resposta de fase aguda em um indivíduo. O mé-todo inclui a administração ao indivíduo de um agente de ligação a IL-22, porexemplo, um antagonista da IL-22 (por exemplo, um anticorpo anti-IL-22 oufragmento seu conforme aqui descrito), em uma quantidade suficiente paradiminuir, inibir ou reduzir a resposta de fase aguda no indivíduo. Em umamodalidade, o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um ser humano so-frendo de um distúrbio associado com a IL-22 incluindo, por exemplo, distúr-bios respiratórios, distúrbios inflamatórios e doenças auto-imunes. Em umamodalidade, o agente de ligação IL-22 é administrado localmente, por exem-plo, tópica ou subcutaneamente ou outras administrações que não estão emofertas gerais.
Sob outro aspecto, um agente de ligação da IL-22 pode ser usa-do para alterar o tipo de resposta imune e/ou aumentar a eficácia de umaformulação de vacina usada para imunizar um indivíduo. Por exemplo, umanticorpo anti-IL-22 da presente invenção pode ser administrado antes, du-rante e/ou depois de uma imunização para aumentar a eficácia da vacina.Em uma modalidade, a formulação de vacina contém um ou mais antagonis-tas IL-22 e um antígeno, isto é, um imunógeno incluindo, por exemplo, antí-genos virais, bacterianos ou tumorais. Em outra modalidade, o antagonistaIL-22 e o imunógeno são administrados separadamente, por exemplo, dentrode uma hora, três horas, um dia ou dois dias de intervalo um do outro.
Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para de-tectar a presença da IL-22 em uma amostra in vitro. Amostras podem incluiramostras biológicas tais como soro, plasma, tecido e biópsia. O método refe-rido pode ser usado para diagnosticar um distúrbio, tal como um distúrbioassociado com a IL-22 conforme aqui descrito. O método inclui: (1) o contatoda amostra ou amostra de controle com um anticorpo anti-IL-22, e (2) a de-tecção de formação de um complexo entre o anticorpo anti-IL-22 e a amostraou amostra de controle, em que uma alteração estatisticamente significativana formação do complexo na amostra em relação a uma amostra de controleé indicativa da presença da IL-22 na amostra.Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para de-tectar a presença da IL-22 in vivo (por exemplo, uma visualização in vivo emum indivíduo). O método pode ser usado para diagnosticar um distúrbio, porexemplo, um distúrbio associado com a IL-22 conforme aqui descrito. O mé-todo inclui: (1) a administração de m anticorpo anti-IL-22 a um indivíduo ou aum indivíduo de controle sob condições que permitem a ligação do anticorpoa IL-22, e (2) a detecção da formação de um complexo entre o anticorpo eIL-22, em que uma alteração estatisticamente significativa na formação docomplexo no indivíduo em relação ao controle, por exemplo, um indivíduo decontrole, é indicativo da presença da IL-22.
O anticorpo pode ser direta ou indiretamente marcado com umasubstância detectável para facilitar a detecção do anticorpo ligado ou não-liga-do. Substâncias detectáveis adequadas incluem várias enzimas, grupos prostéti-cos, materiais fluorescentes, materiais Iuminescentes e materiais radioativos.
Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para dis-tribuir ou alvejar um agente, por exemplo, um agente terapêutico ou citotóxi-co em uma célula expressando IL-22 in vivo. O método inclui a administra-ção de um anticorpo anti-IL-22 em um indivíduo sob condições que permitama ligação do anticorpo a IL-22. O anticorpo pode ser acoplado com uma se-gunda porção terapêutica, tal como uma toxina.
A descrição proporciona seqüências de ácidos nucléicos dosdomínios Vh e Vl de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09,062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06,376B10, 354A08, 355B06, 355E04 e 356A11. São também fornecidas se-qüências de ácidos nucléicos que compreendem pelo menos uma CDR deGIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05,087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08,355B06, 355E04 e 356A11. A descrição também proporciona vetores e célu-las hospedeiras compreendendo tais ácidos nucléicos.
A descrição ainda proporciona métodos de produção de novosdomínios Vh e Vl e anticorpos funcionais compreendendo toda ou uma por-ção de tais domínios derivados dos domínios Vh ou Vl de GIL01, GIL16,GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062Α09, 062G05, 087Β03, 367D04,368D04, 166Β06, 166G05, 375G06, 376Β10, 354Α08, 355Β06, 355Ε04 ou356A11.
Aspectos adicionais da descrição serão estabelecidos em parteda descrição, e em parte serão óbvios a partir da descrição, ou podem seraprendidos pela prática da invenção. A invenção é estabelecida e particu-larmente comentada nas reivindicações, e a descrição não deve ser constru-ída como Iimitante do escopo das reivindicações. A seguinte descrição deta-lhada inclui representações exemplares de várias modalidades da invenção,as quais não são restritivas da invenção conforme reivindicado. As figurasassociadas constituem uma parte desse relatório descritivo e, juntamentecom a descrição, servem somente para ilustrar modalidades e não para limi-tar a invenção.
Breve Descrição das Figuras
Figura 1. Potência dos clones scFv anti-IL-22 de origem no en-saio do complexo receptor IL-22: ensaio de competição DELFIA do comple-xo receptor da IL-22 de ligação ao bio.lL-22.
Figura 2. Perfil de clones scFv exemplares no ensaio do comple-xo receptor de IL-22: ensaio de competição DELFIA do complexo receptorda IL-22 de ligação ao bio.IL-22. (A) derivado de GIL 1. (B) derivado de GIL16. (C) derivado de GIL 16, GIL 60 e GIL 68. (D) derivado de GIL 60. (E) de-rivado de GIL 68. (F) derivado de GIL 68. (G) derivado de GIL 92.
Figura 3. Potência da IgG em ensaios baseados nas célulasGROa. GIL-IgGs otimizadas no ensaio GROa hulL-22. (A) IgG de linhagemgerminativa. (B) IgG de linhagem não-germinativa.
Figura 4. Reatividade de espécies cruzadas de anticorpos IL-22por ELISA. GIL-IGGs otimizados se ligam especificamente a IL-22. (A) IgGde linhagem germinativa. (B) IgG de linhagem não-germinativa.
Figura 5. Seqüências de aminoácidos e de nucleotídeos da IL-22humana. A seqüência de nucleotídeos da IL-22 humana é a SEQ ID NO: 2 einclui uma cauda poli (A). A seqüência de nucleotídeos descrita inclui umaestrutura de leitura aberta e a seqüência de aminoácidos da proteína IL-22de comprimento total correspondendo à seqüência de nucleotídeos prece-dente é reportada na SEQ ID NO: 1. A seqüência de aminoácidos da IL-22madura corresponde a cerca de 34-179 aminoácidos da SEQ iD NO: 1.
Figura 6. Seqüências de aminoácidos e nucleotídeos da IL-22 decamundongo.
Figura 7. Seqüências de aminoácidos e nucleotídeos de GIL01,GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03,367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06,355E04 e 356A11 de linhagem não-germinativa, incluindo domínios Vh e VL,e CDRs (H1, H2, H3, L1, L2 e L3).
Figura 8. Seqüências de aminoácidos e nucleotídeos de GIL01,GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 062A09, 087B03, 166B06, 166G05,354A08, 355B06, 355E04, 356A11 e 368D04 de linhagem germinativa, inclu-indo os domínios Vh e VL) e CDRs (Η1, H2, H3, L1, L2 e L3).
Figura 9. Seqüências de aminoácidos e nucleotídeos de scFvspara GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05,087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08,355B06, 355E04, e 356A11, de linhagem não-germinativa com CDRs subli-nhados (Η1, H2, H3, L1, L2 e L3).
Figura 10. Seqüências de aminoácidos e nucleotídeos de scFvspara GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 062A09, 087B03, 166B06,166G05, 354A08, 355B06, 355E04, 356A11 e 368D04 de linhagem germina-tiva com CDRs sublinhados (H1, H2, H3, L1, L2 e L3).
Figuras 11A-B. Meia vida in vivo de (A) 356A11 e (B) 368D04.
Figuras 12A-B. Pontuações de severidade da doença médias (A)ou pontuações de severidade da doença (B) com várias doses de 356A11administradas dia sim dia não em um modelo CIA de murino.
Figuras 13A-D. Pontuações de severidade da doença médias de8mg.Kg"1 de 356A11 administradas dia sim dia não em um modelo CIA demurino em múltiplos estudos.
Figuras 14A-B. Pontuações de severidade da doença médias de8 mg.Kg"1 de 356A11 administradas uma ou duas vezes por semana em ummodelo CIA de murino.
Figuras 15A-B. Pontuações de severidade de doença de doisestudos separados de 8 mg.Kg"1 de 356A11 administradas dia sim dia não,duas vezes por semana ou uma vez por semana em um modelo CIA de mu-rino.
Figuras 16A-F. Avaliação histológica (pata) da progressão da do-ença em múltiplos estudos usando camundongos tratados com (A) 8 mg.Kg"1de 356A11 dia sim dia não ou (B) 16 mg.Kg"1 de 356A11 dia sim dia não, (C)8 mg.Kg"1 de 356A11 dia sim dia não, uma vez por semana ou duas vezespor semana, (D) 8 mg.Kg"1 de 356A11 uma vez por semana, (E) 8 mg.Kg"1de 356A11 duas vezes por semana ou (F) 8 mg.Kg'1 de 356A11 dia sim dianão em um modelo CIA de murino.
Figura 17. Detecção e estabilização de IL-22 in vivo (ng/mL) emcamundongos artríticos tratados com 356A11.
Figura 18. Detecção de IL-22 in vivo (ng/mL) em camundongosartríticos administrados com um anticorpo de controle isotípico.
Figura 19. Supra-regulação de IL-22 e da proteína IL-22R emlesões psoriáticas humanas.
Figura 20. Avaliação de doença de camundongos tratados com16 mg/Kg de 356A11, 368D04 ou anticorpo de controle em um modelo demurino de psoríase. (A) Progressão de doença clínica durante 10 semanas.(B) Pontuação clínica em 10 semanas.
Figura 21. Detecção de níveis de soro in vivo de IL-22 (pg/mL)em camundongos psoriáticos tratados com 16 mg/Kg de 356A11, 368D04 ouum anticorpo de controle.
Figura 22. Detecção dos níveis de soro in vivo de (A) IL-17A, (B)IL-17F, (C) IL-17A/F; e (D) IL-6 em camundongos psoriáticos tratados com16 mg/Kg de 356A11, 368D04 ou um anticorpo de controle.
Figura 23. Análise citométrica de fluxo de células do gânglio Iin-fático de CD4+ reunidos com PMA e ionomicina seguido por isolamento decamundongos psoriáticos tratados com 16 mg/Kg de 356A11, 368D04 ou umanticorpo de controle e marcado para a IL-22 e IL-17A; IL-22 e IL-17F; IL-17A eIL-17F; IL-22 e TNFa; IL-22 e IFNy; ou TNFa e IFNy.
Figura 24. Expressão do gene da citocina nas orelhas de ca-mundongos psoriáticos tratados com 16 mg/Kg de 356A11, 368D04 ou umanticorpo de controle. (A) IL-22. (B) IL-17. (C) IFNy. (D) IL-17F. (E) IL-6.
Figura 25. Detecção de citocina nos sobrenadantes de célulasdo gânglio linfático reunidas de camundongos psoriáticos tratados com 16mg/Kg de 356A11, 368D04 ou um anticorpo de controle e estimulados exvivo com e sem platebound, anticorpo anti-CD3. (A) IL-22. (B) IL-6. (C) IFNy(D) IL-17F. (E) IL-17A/F. (F) IL-17A.
Figura 26. Expressão do gene da citocina em células do gângliolinfático reunidas isoladas de camundongos psoriáticos tratados com 16 mg/Kgde 356A11, 368D04 ou um anticorpo de controle e estimulados ex vivo complatebound, anticorpo anti-CD3. (A) IL-22. (B) IL-6. (C) IFNy (D) IL-17F. (E)IL-17 A.
Figura 27. Avaliação da doença em camundongos tratados com16 mg/Kg de 356A11 ou anticorpo de controle em um modelo murino de pso-ríase. Camundongos tratados com IL-12 e LPS em 1 dia após a transferên-cia adotiva das células T. (A) Progressão da doença clínica em 10 semanas.(B) Pontuação clínica em 10 semanas.
Figura 28. Detecção dos níveis séricos in vivo de IL-22 (mg/mL)em camundongos psoriáticos tratados com 16 mg/Kg de 356A11 ou um anti-corpo de controle. Camundongos tratados com IL-12 e LPS no dia 1 após atransferência adotiva de células T.
Figura 29. Detecção de níveis séricos in vivo de (A) IL-17A, (B)IL-17F, (C) IL-17A/F; e (D) IL-6 em camundongos psoriáticos tratados com16 mg/Kg de 356A11 ou um anticorpo de controle. Camundongos tratadoscom IL-12 e LPS no dia 1 após a transferência adotiva de células T.
Figura 30. Expressão do gene de citocina nas orelhas de ca-mundongos psoriáticos tratados com 16 mg/Kg de 356A11 ou um anticorpode controle. (A) IL-17. (B) IL-22. (C) IL-17F. (D) IFNy. (E) IL-6. Camundongostratados com IL-12 e LPS no dia 1 após a transferência adotiva de células T.
Figura 31. Análise citométrica de fluxo de células do gânglio Iin-tático CD4+ reunidas com PMA e ionomicina após o isolamento de camun-dongos psoriáticos tratados com 16 mg/Kg de 356A11 ou um anticorpo decontrole e marcadas para IL-22 e IL-17A; IL-22 e IL-17F; IL-17A e IL-17F; IL-22e TNFa; IL-22 e IFNy; ou TNFa e IFNy. Camundongos tratados com IL-12 eLPS no dia 1 após a transferência adotiva de células T.
Figura 32. Detecção de citocina nos sobrenadantes de célulasdo gânglio linfático reunidas isoladas de camundongos psoriáticos tratadascom 16 mg/Kg de 356A11 ou um anticorpo de controle e estimuladas ex vivocom ou sem platebound, anticorpo anti-CD3. (A) IL-22. (B) IL-6. (C) IFNy (D)IL-17A. (E) IL-17F. Camundongos tratados com IL-12 e LPS no dia 1 após atransferência adotiva de células T.
Figura 33. Expressão do gene de citocina em células do gângliolinfático reunidas isoladas de camundongos psoriáticos tratados com 16mg/Kg de 356A11 ou um anticorpo de controle e estimuladas ex vivo complatebound, anticorpo anti-CD3. (A) IL-22. (B) IL-6. (C) IFNy (D) IL-17A. (E)IL-17F. Camundongos tratados com IL-12 e LPS no dia 1 após a transferên-cia adotiva de células T.
Figura 34. Avaliação da doença de camundongos tratados com16 mg/Kg de 356A11 ou anticorpo de controle em modelo murino de psoría-se. (A) Progressão da doença clínica em 10 semanas. (B) Pontuação clínicaem 10 semanas.
Figura 35. Detecção dos níveis séricos in vivo de IL-22 (ng/mL)em camundongos psoriáticos tratados com 16 mg/Kg de 356A11 ou um anti-corpo de controle.
Figura 36. Expressão do gene de citocina nas orelhas de ca-mundongos psoriáticos tratados com 16 mg/Kg de 356A11 ou um anticorpode controle. (A) IL-22, (B) IL-17, (C) IL-17F, (D) IL-1F6 (membro da famíliade IL-1 6), (E) IL-6, (F) IFNy, (G) IL-22 BP (proteína de ligação IL-22) ou (H)IL-22R1 (subunidade do receptor de IL-22).
Figura 37. Avaliação da doença em camundongos tratados com16 mg/Kg de 356A11 ou anticorpo de controle no modelo murino de psoría-se. (A) progressão da doença clínica em 10 semanas. (B) Pontuação clínicaem 10 semanas. Camundongos tratados com IL-12 e LPS no dia 1 após atransferência adotiva de células T.
Figura 38. Detecção de níveis de soro in vivo de IL-22 (ng/mL)em camundongos psoriáticos tratados com 16 mg/Kg de 356A11 ou um anti-corpo de controle. Camundongos tratados com IL-12 e LPS no dia 1 após atransferência adotiva de células T.
Figura 39. Detecção de níveis de soro in vivo de (A) IL-17A e (B)IL-6 em camundongos psoriáticos tratados com 16 mg/Kg de 356A11 ou umanticorpo de controle (sem a co-administração de IL-12 e LPS) e (C) IL-17Ae (D) IL-6 em camundongos psoriáticos tratados com 16 mg/Kg de 356A11ou um anticorpo de controle (IL-12 e LPS co-administrado) no dia 1 após atransferência adotiva de células T).
Figura 40. (A) Pontuação de severidade de doença média ou (B)pontuação de severidade de doença no dia 30 de 16 mg.Kg"1 de 356A11administrado dia sim dia não em um modelo CIA de murino.
Figura 41. Pontuação e severidade de doença média de 8 mg.Kg"1de 356A11 administrado dia sim dia não, uma vez por semana ou duas vezespor semana em um modelo CIA de murino.
Figura 42. Avaliação histológica (pata) da progressão da doençaem camundongos tratados com (A) 8 mg.Kg"1 de 356A11 uma vez por se-mana, (B) 8 mg.Kg"1 de 356A11 duas vezes por semana ou (C) 8 mg Kg"1 de356A11 dia sim dia não.
Figura 43. Avaliação histológica (pontuação da severidade dapata média) da progressão da doença em camundongos tratados com 8 mgKg"1 de 356A11 uma vez por semana, duas vezes por semana ou dia sim dianão.
Figuras 44A-B. Pontuações de severidade de doença média dedois estudos separados de 8 mg Kg'1 de 356A11 administrada uma vez porsemana em um modelo CIA de murino.
Figuras 45A-B. Avaliação histológica (pata) da progressão dadoença a partir de dois estudos separados em camundongos tratados com 8mg Kg"1 de 356A11 uma vez por semana em modelo CIA de murino.Figuras 46A-C. Pontuações de severidade de doença média detrês estudos separados de 8 mg Kg"1 de 368D04 administrada uma vez porsemana no modelo CIA de murino.
Figuras 47A-C. Avaliação histológica (pata) de progressão dedoença a partir de três estudos separados em camundongos tratados com 8mg Kg"1 de 368D04 uma vez por semana em um modelo CIA de murino.
Figura 48. Níveis de soro de (A) IL-6 (pg/mL) e (B) CXCL1 (ng/mL)de camundongos tratados com 356A11 (8 mpk uma vez por semana) em ummodelo CIA de murino.
Desrição Detalhada
I. Definições
Para que a presente invenção possa ser mais prontamente en-tendida, certos termos são primeiramente definidos. Definições adicionaissão estabelecidas através da descrição detalhada.
O termo "anticorpo" se refere a uma imunoglobulina ou frag-mento seu e engloba qualquer polipeptídeo compreendendo um fragmentode ligação a antígeno ou um domínio de ligação a antígeno. O termo inclui,porém não está limitado, a anticorpos policlonais, monoclonais, monoespecí-ficos, poliespecíficos, não-específicos, humanizados, humanos, de cadeiaúnica, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, modificados, enxerta-dos e gerados in vitro. A não ser que seja precedido pela palavra "intacto", otermo "anticorpo" inclui fragmentos de anticorpo tais como FAB, F(ab')2, Fv,scFv, Fd, dAb e outros fragmentos de anticorpo que retêm a função de liga-ção a antígeno. Tipicamente, tais fragmentos poderiam compreender umdomínio de ligação a antígeno.
Os termos "domínio de ligação a antígeno" e "fragmento deligação a antígeno" se referem a uma parte de uma molécula de anticorpoque compreende aminoácidos responsáveis pela ligação específica entreanticorpo e antígeno. A parte do antígeno que é especificamente reconheci-da e ligada pelo anticorpo é referida como o "epitopo". Um domínio de liga-ção a antígeno pode compreender uma região variável de cadeia leve deanticorpo (Vl) e uma região variável de cadeia pesada de anticorpo (VH);entretanto, ele não tem que compreender ambos. Fragmentos Fd1 por e-xemplo, têm duas regiões Vh e geralmente retêm alguma função de ligaçãoa antígeno do domínio de ligação a antígeno intacto. Exemplos de fragmen-tos de ligação a antígeno de um anticorpo incluem (1) um fragmento FAB,um fragmento monovalente com os domínios VL, VH, Cl E Ch1; (2) um frag-mento F(ab')2, um fragmento bivalente com dois fragmentos Fab ligados poruma ponte dissulfeto na posição de dobradiça; (3) um fragmento Fd com osdois domínios Vh e Ch1; (4) um fragmento Fv com os domínios Vl e Vh deum único ramo de um anticorpo, (5) um fragmento dAb (Ward et al., (1989)Nature 341: 544 - 546), o qual tem um domínio Vh; (6) uma região determi-nante de complementaridade isolada (CDR); e (7) um Fv de cadeia única(scFv). Embora os dois domínios do fragmento Fv, Vl e Vh sejam codifica-dos por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombi-nantes, por um Iigante sintético que os capacite a serem feitos como umacadeia de proteína individual na qual as regiões Vl e Vh se emparelhem paraformar moléculas monovalentes (conhecida como Fv de cadeia única (scFv);vide, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423 - 426; e Huston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879 - 5883). Esses fragmentos deanticorpo são obtidos pelo uso de técnicas convencionais conhecidas pelaspessoas versadas na técnica, e os fragmentos são avaliados quanto à fun-ção da mesma forma que são os anticorpos intactos.
O termo "quantidade eficaz" se refere a uma dosagem ou quan-tidade que é suficiente para regular a atividade da IL-22 para melhorar ossintomas clínicos ou alcançar um efeito biológico desejado, por exemplo,atividade de célula T e/ou de célula B diminuída, supressão de auto-imunidade, supressão de rejeição de transplante, etc.
O termo "anticorpo humano" inclui anticorpos com regiões va-riáveis e constantes correspondendo substancialmente às seqüências deimunoglobulina de linhagem germinativa humana conhecidas na técnica in-cluindo, por exemplo, aqueles descritos por Kabat et al. (Vide Kabat, et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S.Department of Health and Human Services, Publicação NIH N2 91-3242). Osanticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos nãocodificados por seqüências de imunoglobulinas de linhagem germinativahumana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagêneses aleatóriasou sítio-específicas in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplonos CDRs, e particularmente, CDR3. O anticorpo humano pode ter pelo me-nos uma, duas, três, quatro, cinco ou mais posições substituídas com umresíduo de aminoácidos que não é codificado pela seqüência de imunoglo-bulina de linhagem germinativa humana.
A frase "inibe" ou "antagoniza" a atividade da IL-22 e seuscognatos se refere à redução, inibição ou, de outro modo, diminuição de pelomenos uma atividade de IL-22 devido à ligação de um anticorpo anti-IL-22,em que a redução é relativa à atividade da IL-22 na ausência do mesmo an-ticorpo. A atividade pode ser medida usando qualquer técnica incluindo, porexemplo, conforme descrito nos Exemplos 7 e 9. A inibição do antagonismonão necessariamente indica a eliminação total da atividade biológica do poli-peptídeo da IL-22. Uma redução na atividade pode ser de cerca de 10%,20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais.
O termo "interleucina-22" ou "IL-22" se refere à classe Il de ci-tocina (o qual pode ser de mamífero) capaz de se ligar a IL-22R e/ou umcomplexo receptor de IL-22R e IL-10R2, e tem pelo menos uma das seguin-tes características: (1) uma seqüência de aminoácidos de um polipeptídeoIL-22 de mamífero de ocorrência natural (comprimento total ou forma madu-ra) ou um fragmento seu, por exemplo, uma seqüência de aminoácidos mos-trada como a SEQ ID NO: 1 (humana) ou SEQ ID NO: 3 (murino) ou umfragmento seu; (2) uma seqüência de aminoácidos substancialmente idênti-ca a, por exemplo, pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% daidentidade de uma seqüência de aminoácidos mostrada como a SEQ ID NO:1 ou seus aminoácidos 34-179 (humana) ou SEQ ID NO: 3 (murino) ou umfragmento seu; (3) uma seqüência de aminoácidos a qual seja codificada poruma seqüência de nucleotídeos de IL-22 de mamífero de ocorrência naturalou um fragmento seu (por exemplo, SEQ ID NO: 2 ou nucleotídeos de 71 a610 (humana) ou SEQ ID NO: 4 (murino) ou um fragmento seu); (4) umaseqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de nucleotídeos aqual seja substancialmente idêntica a, por exemplo, pelo menos 85%, 90%,95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade com uma seqüência de nucleotí-deos mostrada como SEQ ID NO: 2 ou seus nucleotídeos 71 a 610 (huma-na) ou SEQ ID NO: 4 (murino) ou um fragmento seu; (5) uma seqüência deaminoácidos codificada por uma seqüência de nucleotídeos degenerada emuma seqüência de nucleotídeos da IL-22 de ocorrência natural ou um frag-mento seu, por exemplo, SEQ ID NO: 2 (humana) ou SEQ ID NO: 4 (murino)ou um fragmento seu; ou (6) uma seqüência de nucleotídeos que hibridizeuma ou mais das seqüências de nucleotídeos precedentes sob condiçõesestringentes, por exemplo, condições altamente estringentes. A IL-22 podese ligar a IL-22R e/ou a um complexo receptor da IL-22R e IL-10R2 de ori-gem mamífera, por exemplo, humano ou camundongo.
A seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos previs-ta da IL-22 humana estão mostradas na SEQ ID NO: 2 e na SEQ ID NO: 1, res-pectivamente. A seqüência de aminoácidos da IL-22 humana madura corres-ponde aos aminoácidos 34 - 179 da SEQ ID NO: 1. A análise da IL-22 hu-mana recombinante revela muitos domínios estruturais. (Nagem et al. (2002)Structure, 10: 1051 - 62; Pedido de Patente U.S. No. US 2002/0187512 A1).
O termo "atividade da IL-22" se refere à pelo menos um pro-cesso celular iniciado ou interrompido como resultado da ligação da IL-22 aum complexo receptor consistindo da IL-22R e da IL-10R2 na célula. As ati-vidades da IL-22 incluem pelo menos uma, porém não estão limitadas, à: (1)ligação da IL-22R ou um complexo receptor da IL-22R e IL-10R2 (por exem-pio, IL-22R humana com ou sem IL-10R2 humana); (2) associação com mo-léculas de transdução de sinal (por exemplo, JAK-1); (3) estímulo da fosfori-lação de proteínas STAT (por exemplo, STAT5, STAT3 ou uma combinaçãodesses); (4) ativação das proteínas STAT; e (5) modulação (por exemplo,aumento ou diminuição) da proliferação, diferenciação, função de célulasefetoras, atividade citolítica, secreção de citocina, sobrevivência ou combi-nações desses, das células epiteliais, fibroblastos ou células imunes. Célulasepiteliais incluem, porém não estão limitadas, às células da pele, intestino,fígado e rim, assim como às células endoteliais. Os fibroblastos incluem, po-rém não estão limitados, aos fibroblastos sinoviais. As células imunes podemincluir células T CD8+ e CD4+, células NK, células B, macrófagos e megaca-riócitos. A atividade da IL-22 pode ser determinada in vitro, por exemplo, u-5 sando o ensaio de inibição do receptor da IL-22 conforme descrito nos E-xemplos 2 e 6, o ensaio de secreção GROa no Exemplo 9 ou o ensaio deproliferação BAF3 do Exemplo 7. A atividade da IL-22 também pode ser de-terminada in vivo, por exemplo, pela pontuação da progressão de uma res-posta ou distúrbio imune conforme descrito no Exemplo 13.
Conforme usado aqui, "anticorpo gerado in vitro" se refere aum anticorpo onde toda ou parte da região variável (por exemplo, pelo me-nos uma CDR) é gerada em uma seleção de célula não-imune (por exemplo,uma exposição de fagos in vitro, chip de proteína ou qualquer outro métodono qual seqüências candidatas possam ser testadas quanto À sua capacida-de de se ligar a um antígeno). Esse termo exclui seqüências geradas pelorearranjo genômico em uma célula imune.
O termo "isolado" se refere a uma molécula que é substancial-mente livre de seu ambiente natural. Por exemplo, uma proteína isolada ésubstancialmente livre de material celular ou de outras proteínas da fontecelular ou de tecido do qual ela foi derivada. O termo também se refere àspreparações onde a proteína isolada é suficientemente pura para composi-ções farmacêuticas; ou pelo menos de 70 a 80% (p/p) pura; ou pelo menosde 80 a 90% (p/p) pura; ou pelo menos 90 a 95% (p/p) pura; ou pelo menos95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (p/p) pura.
A frase "identidade porcentual" ou "porcentagem idêntica" serefere à similaridade entre pelo menos duas seqüências diferentes. Essaidentidade porcentual pode ser determinada por algoritmos de alinhamentopadrão, por exemplo, a Ferramenta de Alinhamento Local Básica (BLAST)descrita por Altshul et al. ((1990) J. Mol. Biol., 215: 403 - 410); o algoritmo deNeedleman et al. ((1970) J. Mol. Biol., 48: 444 - 453); ou o algoritmo de Me-yers et al. ((1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11 - 17). Um grupo de parâme-tros pode ser a matriz de pontuação Blosum 62 com uma penalidade de in-tervalo de 12, uma penalidade de extensão de intervalo de 4 e uma penali-dade de intervalo de mudança de estrutura de 5. A identidade porcentualentre duas seqüências de aminoácidos ou nucleotídeos também pode serdeterminada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller ((1989) CABIOS,4: 11 - 17), o qual foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usandouma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade de extensão deintervalo de 12 e uma penalidade de intervalo de 4. A identidade porcentualé geralmente calculada pela comparação das seqüências de comprimentosimilar.
O termo "repertório" se refere a pelo menos uma seqüência denucleotídeos derivada completamente ou parcialmente de pelo menos umaseqüência codificando pelo menos uma imunoglobulina. A(s) seqüência(s)pode(m) ser gerada(s) pelo rearranjo in vivo dos segmentos V, D e J de ca-deias pesadas, e os segmentos V e J de cadeias leves. Alternativamente,a(s) seqüência(s) pode(m) ser gerada(s) de uma célula em resposta a querearranjo ocorre, por exemplo, estimulação in vitro. Alternativamente, parteou toda(s) a(s) seqüência(s) pode(m) ser obtida(s) por união de DNA, sínte-se de nucleotídeos, mutagênese e outros métodos, vide, por exemplo, a Pa-tente U.S. 5.565.332. Um repertório pode incluir somente uma seqüência oupode incluir uma pluralidade de seqüências, incluindo aquelas em uma cole-ção geneticamente diversa.
Os termos "ligação específica" ou "se liga especificamente"se refere a duas moléculas formando um complexo que é relativamente es-tável sob condições fisiológicas. A ligação específica é caracterizada poruma alta afinidade e por uma capacidade de baixa a moderada conformedistinguido de ligação não-específica, a qual usualmente tem uma baixa afi-nidade com uma capacidade de alta a moderada. Tipicamente, a ligação éconsiderada específica quando a constante de associação Ka é mais alta doque 1-6 M"1. Caso necessário, a ligação não-específica pode ser reduzidasem afetar substancialmente a ligação específica pela variação das condi-ções de ligação. As condições de ligação apropriadas, tais como concentra-ção de anticorpos, força iônica da solução, temperatura, tempo permitidopara ligação, concentração de um agente de bloqueio (por exemplo, albumi-na sérica, caseína do leite), etc. podem ser otimizadas por um versado natécnica usando técnicas de rotina. As condições ilustrativas estão estabele-cidas no Exemplo 3, porém outras condições conhecidas da pessoa nor-malmente versada na técnica caem dentro do escopo dessa invenção.
Conforme aqui utilizado, o termo "estringente" descreve condi-ções para hibridização e lavagem. Condições estringentes são conhecidaspelas pessoas versadas na técnica e podem ser encontradas em CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6.Métodos aquosos e não-aquosos são descritos naquela referência e qual-quer um deles pode ser usado. Um exemplo de condições de hibridizaçãoestringentes é a hibridização em cloreto de sódio/citrato de sódio 6X (SSC) acerca de 45°C, seguido por pelo menos uma lavagem em SSC 0,2X, SDS0,1% a 50°C. Um segundo exemplo de condições de hibridização estirngen-tes é a hibridização em SSC 6X em cerca de 45°C por pelo menos uma la-vagem em SSC 0,2X, SDS 0,1% a 55°C. Outro exemplo de condições dehibridização estringentes é a hibridização em SSC 6X em cerca de 45°C,seguido por pelo menos uma lavagem em SSC 0,2X, SDS 0,1% a 60°C. Umoutro exemplo de condições de hibridização estringentes é a hibridização emSSC 6X em cerca de 45°C, seguido por pelo menos uma lavagem em SSC0,2X, SDS 0,1% a 65°C. Condições estringentes elevadas incluem a hibridi-zação em fosfato de sódio 0,5M, SDS 7% a 65°C, seguido por pelo menosuma lavagem a SSC 0,2X, SDS 1 % a 65°C.
A frase "substancialmente conforme estabelecido", "subs-tancialmente idêntico" ou "substancialmente homólogo" significa que aseqüência de aminoácido ou nucleotídeo relevante (por exemplo, domínioVh, Vl ou CDR(s)) serão idênticos a ou terão diferenças não-substanciais(através de substituições de aminoácidos conservadas) em comparação comas seqüências as quais são estabelecidas. Diferenças não-substanciais in-cluem alterações de aminoácidos menores, tais como 1 ou 2 substituiçõesem uma seqüência de 5 aminoácidos de uma região especificada. No casodos anticorpos, o segundo anticorpo tem a mesma especificidade e tem pelomenos 50% da afinidade do primeiro anticorpo.
Seqüências substancialmente idênticas ou homólogas (por e-xemplo, pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüência) com as se-qüências aqui descritas também é parte desse pedido. Em algumas modali-dades, a identidade de seqüência pode ser de cerca de 85%, 90%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% ou maior. Alternativamente, a identidade ou homologiasubstancial existe quando os segmentos de ácido nucléico hibridizarem sobcondições de hibridização seletivas (por exemplo, condições de hibridizaçãoaltamente estringentes) com o complemento da fita. Os ácidos nucléicos po-dem estar presentes em células inteiras, em um Iisado celular ou em umaforma parcialmente purificada ou substancialmente pura.
O termo "agente terapêutico" é uma substância que trata ouauxilia no tratamento de um distúrbio médico. Agentes terapêuticos podemincluir, porém não estão limitados, a substâncias que modulam as célulasimunes ou respostas imunes de um modo que complemente a atividade daIL-22 de anticorpos anti-IL-22. Exemplos não-limitativos e usos de agentesterapêuticos são aqui descritos.
Conforme aqui utilizado, uma "quantidade terapeuticamenteeficaz" de um anticorpo anti-IL-22 se refere a uma quantidade de um anti-corpo a qual é eficaz, na administração de uma dose única ou múltipla a umindivíduo (tal como um paciente humano) no tratamento, prevenção, cura,retardo, redução da severidade de e/ou melhoria de pelo menos um sintomade um distúrbio ou distúrbio recorrente, ou prolongamento da sobrevivênciado indivíduo além da esperada na ausência de tal tratamento.
O termo "tratamento" se refere a uma medição terapêutica oupreventiva. O tratamento pode ser administrado a um indivíduo com um dis-túrbio médico ou o qual, no fim das contas, pode adquirira a doença, paraprevenir, curar, retardar, reduzir a severidade de, e/ou melhorar um ou maissintomas de um distúrbio ou distúrbio recorrente, ou para prolongar a sobre-vivência de um indivíduo além daquela esperada na ausência de tal trata-mento.II. Anticorpos anti-IL-22
A descrição proporciona novos anticorpos anti-IL-22 que com-preendem novos fragmentos de ligação a antígeno.
Vários métodos conhecidos pelas pessoas versadas na técnicasão disponíveis para obter anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antí-geno. Por exemplo, anticorpos podem ser produzidos usando métodos deDNA recombinante (Patente U.S. 4.816.567). Anticorpos monoclonais tam-bém podem ser produzidos por geração de hibridomas (vide, por exemplo,Kohler e Milstein (1975) Nature, 256: 495 - 499) de acordo com os métodosconhecidos. Hibridomas formados deste modo são, então, varridos usandométodos padrão, tais como o ensaio imunosorvente ligado a enzima (ELISA)e análise de ressonância de plásmons de superfície (BIACORE®) para iden-tificar um ou mais hibridomas que produzem um anticorpo que se liga espe-cificamente com um antígeno especificado. Qualquer forma de antígeno es-pecificado pode ser usada como o imunógeno, por exemplo, antígeno re-combinante, formas de ocorrência natural e variantes ou fragmentos seus,assim como seus peptídeos antigênicos.
Um método exemplar de fazer anticorpos inclui a varredura debibliotecas de expressão de proteína, por exemplo, bibliotecas de exibiçãode fago ou ribossomo. A exibição de fago é descrita, por exemplo, em Lad-ner et ai, Patente U.S. No. 5.223.409; Smith (1985) Science 228: 1315 -1317; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624 - 628; Marks et al. (1991) J.Moi Biol., 222: 581 - 597 WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; e WO 90/02809.
Além do uso de bibliotecas de exibição, o antígeno especificadopode ser usado para imunizar um animal não-humano, por exemplo, um ro-edor, por exemplo, um camundongo, hâmster ou rato. Em uma modalidade,o animal não-humano inclui pelo menos uma parte de um gene de imuno-globulina humano. Por exemplo, é possível projetar raças de camundongodeficientes na produção de anticorpo de camundongo com grandes fragmen-tos de locais Ig humanos. Usando a tecnologia do hibridoma, anticorpos mo-noclonais antígeno-específicos derivados dos genes com a especificidadedesejada podem ser produzidos e selecionados. Vide, por exemplo, XENO-MOUSE®, Green etal. (1994) Nature Genetics 7: 13 - 21, US 2003-0070185,WO 96/34096, publicado em 31 de outubro de 1996, e o Pedido de PatentePCT No. PCT/US96/05928, requerido em 29 de abril de 1996.
Em outra modalidade, um anticorpo monoclonal é obtido de umanimal não-humano, e a seguir modificado, por exemplo, um humanizado,desimunizado, quimérico, pode ser produzido usando técnicas de DNA re-combinantes conhecidas na técnica. Uma variedade de abordagens parafazer anticorpos quiméricos foram descritas. Vide, por exemplo, Morrison etai, Proc. Nati Acad. Sei. U.S.A. 81: 6851, 1985; Takeda et ai., Nature314:452, 1985, Cabilly etal., Patente U.S. N- 4.816.567; Boss etal., PatenteU.S. N2 4.816.397; Tanaguchi et ai, Publicação de Patente EuropéiaEP171496; Publicação de Patente Européia 0173494, Patente do Reino U-nido GB 2177096B. Anticorpos humanizados também podem ser produzi-dos, por exemplo, usando camundongos transgênicos que expressam genesde cadeia pesada e leve humanos, porém que são incapazes de expressaros genes de cadeia pesada e leve de imunoglobulina de camundongo endó-genos. Winter descreve um método de enxerto de CDR exemplar que podeser usado para preparar os anticorpos humanizados descritos aqui (PatenteU.S. N2 5.225.539). Todos os CDRs de um anticorpo humano particular po-dem ser substituídos com pelo menos uma porção de uma CDR não-humano, ou somente alguns dos CDRs podem ser substituídos com CDRsnão-humanos. Somente é necessário substituir a quantidade de CDRs ne-cessária para ligação do anticorpo humanizado a um antígeno predetermi-nado.
Anticorpos ou fragmentos humanizados seus podem ser geradospela substituição de seqüências de domínio variável Fv que não estejam di-retamente envolvidos na ligação do antígeno com seqüências equivalentesde domínios variáveis Fv humanos. Métodos exemplares para gerar anticor-pos humanizados ou fragmentos seus são fornecidos por Morrison (1985)Science 229: 1202 - 1207; por Oi et ai (1986) BioTechniques 4: 214; e porUS 5.585.089; US 5.693.761; US 5.693.762; US 5.859.205; e US 6.407.213.Aqueles métodos incluem o isolamento, manipulação e expressão das se-qüências de ácidos nucléicos que codificam todo ou parte dos domínios va-riáveis Fv de imunoglobulina de pelo menos uma cadeia pesada ou leve.Tais ácidos nucléicos podem ser obtidos de um hibridoma produtor de umanticorpo contra um alvo predeterminado, conforme descrito acima, assimcomo de outras fontes. O DNA recombinante codificando a molécula de anti-corpo humanizada pode, então, ser clonada em um vetor de expressão a-propriado.
Em certas modalidades, um anticorpo humanizado é otimizadopela indução de substituições conservativas, substituições de seqüência deconsenso, substituições de linhagens germinativas e/ou mutações reversas.Tais moléculas de imunoglobulinas alteradas podem ser feitas por qualqueruma das várias técnicas conhecidas na Literatura (por exemplo, Teng et ai,Proc. NatL Acad. Sei. U.S.A., 80: 7308 - 7312, 1983; Kozbor et ai, Immuno-logy Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3- 16, 1982) epodem ser feitas de acordo com os ensinamentos da Publicação PCTW092/06193 ou EP 0239400).
Um anticorpo ou fragmento seu também pode ser modificadopela anulação específica de epitopos de células T humanas ou "desimuniza-ção" pelos métodos descritos em WO 98/52976 e WO 00/34317. Resumi-damente, os domínios variáveis de cadeia pesada e leve de um anticorpopodem ser analisados para os peptídeos que se ligam ao MHC de classe II;esses peptídeos representam epitopos de células T potenciais (conformedefinido em WO 98/52976 e em WO 00/34317). Para a detecção de epitoposde células T potenciais, uma abordagem de modelagem por computadornomeada "enfileiramento de peptídeos" pode ser aplicada, e além disso umbanco de dados de proteínas de ligação de MHC de classe Il humana po-dem ser procurados por porções presentes nas seqüências Vh e Vl, confor-me descrito em WO 98/52976 e WO 00/34317. Essas porções se ligam aqualquer um dos 18 alotipos DR de MHC de classe Il principais, e deste mo-do constituem epitopos de células T potenciais. Epitopo de células T poten-ciais detectados podem ser eliminados pela substituição de pequenas quan-tidades de resíduos de aminoácidos nos domínios variáveis, ou preferivel-mente, por substituições de aminoácidos individuais. Tipicamente, são feitassubstituições conservativas. Geralmente, porém não exclusivamente, umaminoácido comum a uma posição em seqüências de anticorpo de linhagemgerminativa humana pode ser usado. Seqüências de linhagem germinativahumana, por exemplo, são descritas em Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol.227: 776 - 798; Cook, G. P. et al. (1995) lmmunol. TodayVol. 16 (5): 237 -242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 799 - 817; e Tomlinson et al.(1995) EMBO J. 14: 4628 - 4638. O diretório V BASE proporciona um diretó-rio compreensivo de seqüências de região variável de imunoglobulina huma-nas (compiladas por Tomlinson, I.A. et al. MRC Centre for Protein Enginee-ring, Cambridge, Reino Unido). Essas seqüências podem ser usadas comouma fonte da seqüência humana, por exemplo, para regiões de estrutura eCDRs. Regiões de estrutura humana de consenso também podem ser usa-das, por exemplo, conforme descrito na Patente U.S. N2 6.300.064.
Em certas modalidades, um anticorpo pode conter uma constan-te de imunoglobulina alterada ou região Fe. Por exemplo, um anticorpo pro-duzido de acordo com os ensinamentos aqui pode se ligar mais fortementeou com maior especificidade às moléculas efetoras tais como complementoe/ou receptores Fc, os quais podem controlar várias funções imunes do anti-corpo, tais como a atividade celular efetora, lise, atividade mediada por com-plemento, depuração do anticorpo e meia-vida do anticorpo. Receptores Fctípicos que se ligam a uma região Fc de um anticorpo (por exemplo, um anti-corpo IgG) incluem, porém não estão limitados, aos receptores das subclas-ses FcyRI, FcyRII, FcyRIII e FcRn, incluindo variantes alélicas e formas alter-nativamente unidas desses receptores. Os receptores Fc são revisados emRavetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457 - 92, 1991; Capei et al., Immu-nomethods 4: 25 - 34, 1994; e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330 -41, 1995).
Para técnicas de produção de anticorpos adicionais, vide Anti-bodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Labora-tory, 1988. A presente invenção não está necessariamente limitada a qual-quer fonte, método de produção ou outras características particulares de umanticorpo.
Anticorpos, também conhecidos como imunoglobulinas, são tipi-camente proteínas tetraméricas glicosiladas compostas de duas cadeias Ie-ves (L) de aproximadamente 25 KDa cada, e duas cadeias pesadas (H) deaproximadamente 50 KDa cada. Dois tipos de cadeia leve, nomeadas lâmb-da e capa, podem ser encontradas nos anticorpos. Dependendo da seqüên-cia de aminoácidos do domínio constante de cadeias pesadas, as imunoglo-bulinas podem ser atribuídas a cinco classes principais: A, D, E, G e M, evárias dessas podem ser ainda divididas em subclasses (isotipos), por e-xemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Cada cadeia leve inclui um do-mínio variável N-terminal (V) (VL) e um domínio constante (C) (CL). Cadacadeia pesada inclui um domínio V N-terminal (VH), de três a quatro domí-nios C (CHs) e uma região de dobradiça. O domínio CH mais próximo de VHé designado como CH1. Os domínios VH e VL consistem em quatro regiõesde seqüências relativamente conservadas chamadas de regiões de estrutura(FR1, FR2, FR3 e FR4), as quais formam um esqueleto para as três regiõesde seqüências hipervariáveis (regiões determinantes de complementaridade,CDRs). Os CDRs contêm a maior parte dos resíduos responsáveis por inte-rações específicas do anticorpo com o antígeno. CDRs são referidos comoCDR1, CDR2 e CDR3. Concordantemente, os constituintes CDR na cadeiapesada são referidos como Η1, H2 e H3, enquanto que os constituintes CDRna cadeia leve são referidos como L1, L2 e L3.
CDR3 é tipicamente a maior fonte de diversidade molecular nosítio de ligação a antígeno. H3, por exemplo, pode ser tão curto quanto doisresíduos de aminoácidos ou maior do que 26 aminoácidos. As estruturas desubunidade e configurações tridimensionais de diferentes classes de imuno-globulinas são bem-conhecidas na técnica. Para uma revisão da estrutura deanticorpo, vide Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora-tory, eds. Harlow et al., 1988. Uma pessoa versada na técnica irá reconhecerque cada estrutura de subunidade, por exemplo, uma estrutura CH, VH, CL,VL, CDR, FR, compreende fragmentos ativos, por exemplo, a porção da su-bunidade VH, VL ou CDR que se liga ao antígeno, isto é, o fragmento deligação a antígeno ou, por exemplo, a porção da subunidade CH que se ligaa e/ou ativa, por exemplo, um receptor Fc e/ou complemento. As CDRs tipi-camente se referem às CDRs de Kabat, conforme descrito em Sequences ofProteins of Immunological lnterest, US Department of Health and HumanServices (1991), eds. Kabat et ai Outro padrão para caracterizar o sítio deligação a antígeno é se referir às alças hipervariáveis conforme descrito porChothia. Vide, por exemplo, Chothia, D. et al. (1992; J. Mol. Biol. 227: 799 -817; e Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 4628 - 4638. Ainda outro padrãoé a definição AbM usada pelo programa de computador de modelagem deanticorpo AbM de Oxford Molecular. Vide, de um modo geral, por exemplo,Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. Em:Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. e Kontermann, R., Sprin-ger-Verlag, Heidelberg). Modalidades descritas em relação aos CDRs Kabatpodem ser alternativamente implementadas usando relações descritas simi-lares em relação às alças hipervariáveis de Chothia ou às alças AbM defini-das.
O fragmento Fab (fragmento de ligação a antígeno) consiste emdomínios VH-Ch1 e VL-CL ligados covalentemente por uma ponte dissulfetoentre as regiões constantes. O fragmento Fv é menor e consiste em domíniosVH e VL ligados não-covalentemente. Para contornar a tendência de domí-nios ligados não-covalentemente de se dissociar, um fragmento Fv de cadeiaúnica (scFv) pode ser construído. O scFv contém um polipeptídeo flexívelque liga (1) o C-terminal de VH ao N-terminal de VL, ou (2) o C-terminal de VLao N-terminal de VH. um peptídeo 15-mer (GIy4Ser)3 pode ser usado comoum ligante, porém outros ligantes são conhecidos na técnica.
A seqüência de genes de anticorpo depois da montagem e mu-tação somática é altamente variada, e esses genes variados são estimadosque codifiquem 1010 moléculas de anticorpos diferentes (ImmunoglobulinGenes, 2§ ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995).
Um "biespecífico" ou "anticorpo bifuncional" é um anticorpo hí-brido artificial com dois pares de cadeia pesada/leve diferentes e dois sítiosde ligação diferentes. Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos poruma variedade de métodos incluindo a fusão de hibridomas ou ligação dosfragmentos Fab'. Vide, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Im-munol. 79: 315 - 321 (1990); Kostelny et ai., J. Immunol. 148, 1547 - 1553(1992). Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende um pri-meiro polipeptídeo de domínio de ligação, tal como um fragmento Fab', liga-do através de uma região constante de imunoglobulina em um segundo poli-peptídeo de domínio de ligação.
Pequenos Imunofarmacêuticos Modulares (SMIP®) proporcio-nam um exemplo de uma molécula variante compreendendo um polipeptí-deo de domínio de ligação. SMIPs e seus usos e aplicações são descritos,por exemplo, nos Pedidos de Patente U.S. Publicado Nss 2003/0118592,2003/0133939, 2004/0058445, 2005/0136049, 2005/0175614, 2005/0180970,2005/0186216, 2005/0202012, 2005/0202023, 2005/0202028, 2005/0202534 e2005/0238646, e nos seus membros da família de patentes relacionadas,todas as quais são por meio disso incorporadas aqui por referência nas suastotalidades.
Um SMIP® tipicamente se refere a uma proteína de fusão deimunoglobulina de domínio de ligação que inclui um polipeptídeo de domíniode ligação que é fundido ou, de outro modo, conectado a uma dobradiça deimunoglobulina ou polipeptídeo da região de atuação da dobradiça, o qualpor sua vez está fundido ou, de outro modo, conectado em uma região com-preendendo uma ou mais regiões constantes naturais ou projetadas de umacadeia pesada de imunoglobulina, diferente de CH1, por exemplo, as regiõesCH2 e CH3 de IgG e IgA, ou as regiões CH3 e CH4 de IgE (vide, por exem-plo, U.S. 2005/0136049 por Ledbetter, J. et ai, a qual é incorporada por refe-rência, para uma descrição mais completa). A proteína de fusão de imuno-globulina do domínio de ligação pode ainda incluir uma região que inclua umpolipeptídeo da região constante CH2 de cadeia pesada de imunoglobulinanatural ou projetada (ou CH3 no caso de um constructo derivado totalmenteou em parte de IgE) que seja fundido ou, de outro modo, conectado ao poli-peptídeo da região de dobradiça e um polipeptídeo da região constante CH3de cadeia pesada de imunoglobulina natural ou projetada (ou CH4 no casode um constructo derivado totalmente ou em parte de IgE) que seja fundidoou, de outro modo, conectado ao polipeptídeo da região constante de CH2(ou CH3 no caso de um constructo derivado totalmente ou em parte de IgE).
Tipicamente, tais proteínas de fusão de imunoglobulina do domínio de liga-ção são capazes de pelo menos uma atividade imunológica selecionada dogrupo consistindo em citotoxicidade mediada por célula dependente de anti-corpo, fixação do complemento e/ou ligação a um alvo, por exemplo, um an-tígeno alvo, tal como IL-22 humana.
Proteínas terapêuticas, isto é, uma proteína ou peptídeo que te-nha um efeito biológico na região no corpo na qual ele aja ou uma região docorpo na qual ele aja remotamente através dos intermediários, também sãoúteis para praticar a invenção, uma proteína terapêutica pode incluir pepti-domiméticos. Miméticos são moléculas contendo peptídeos que mimetizamelementos da estrutura secundária da proteína. Vide, por exemplo, Johnsonet al., "Peptide Turn Mimeticsn em BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY,Pezzuto et al., Eds., Chapman and Hall, New York (1993), aqui incorporadopor referência. O racional subjacente por trás do uso de peptidomiméticos éque a estrutura peptídica das proteínas existe principalmente para orientaras cadeias laterais de aminoácidos de tal forma a facilitar as interações mo-leculares, tais como aquelas de anticorpo e antígeno. Espera-se que umpeptidomimético permita interações moleculares semelhantes à moléculanatural. Esses princípios podem ser usados para projetar moléculas de se-gunda geração com muitas das propriedades naturais dos peptídeos-alvoaqui descritos, porém com características alteradas e potencialmente melho-radas.
Outras modalidades de proteínas terapêuticas incluem proteínasde fusão. Essas moléculas geralmente têm toda ou uma porção substancialde um peptídeo-alvo, por exemplo, IL-22 ou um anticorpo anti-IL-22, ligadono terminal N- ou C-, em toda ou uma porção de um segundo polipeptídeoou proteína. Por exemplo, fusões podem empregar seqüências líder de ou-tras espécies para permitir a expressão recombinante de uma proteína emum hospedeiro heterólogo. Outra fusão útil inclui a adição de um domínioimunologicamente ativo, tal como um epitopo de anticorpo, para facilitar apurificação da proteína de fusão. A inclusão de um sítio e clivagem em oupróximo da junção de fusão irá facilitar a remoção do polipeptídeo estranhodepois da purificação. Outras fusões úteis incluem a ligação de domíniosfuncionais, tais como sítios ativos de enzimas, domínios de glicosilação, si-nais de alvejamento celular ou regiões transmembranares. Exemplos de pro-teínas ou peptídeos que podem ser incorporados em uma proteína de fusãoincluem proteínas citostáticas, proteínas citocidal, agentes pró-apoptose,agentes anti-angiogênicos, hormônios, citocinas, fatores de crescimento,fármacos peptídicos, anticorpos, fragmentos Fab de anticorpos, antígenos,proteínas receptoras, enzimas, lectinas, proteínas MHC, proteínas de ade-são celular e proteínas de ligação. Métodos de geração de proteínas de fu-são são bem-conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Tais proteínaspodem ser produzidas, por exemplo, pela ligação química usando reagentesde reticulação bifuncionais, pela síntese de novo da proteína de fusão com-pleta ou pela ligação de uma seqüência de DNA codificando o peptídeo-alvoa uma seqüência de DNA codificando o segundo peptídeo ou proteína, se-guido pela expressão da proteína de fusão intacta.
Em uma modalidade, o peptídeo de alvejamento, por exemplo,IL-22 ou um anticorpo anti-IL-22, é fundido com uma região constante decadeia pesada de imunoglobulina, tal como um fragmento Fc, o qual contémdois domínios de região constante e uma região de dobradiça, porém nãotem a região variável (Vide Patentes Americanas N-s 6.018.026 e 5.750.375,aqui incorporadas por referência). A região Fc ode ser uma região Fc de o-corrência natural, ou pode ser alterada para melhorar certas qualidades, taiscomo qualidades terapêuticas, tempo de circulação, agregação reduzida,etc. Peptídeos e proteínas fundidos em uma região Fc tipicamente exibemuma meia vida maior in vivo do que a contraparte não-fundida. Também umafusão a uma região Fc permite a dimerização/multimerização do polipeptídeode fusão.
Moléculas VHH (ou nanocorpos), conforme conhecido pelo ver-sado na técnica, são domínios variáveis de cadeia pesada derivados de i-munoglobulinas naturalmente livres de cadeias leves, tais como aquelas de-rivadas de Camelidae conforme descrito em WO 9404678, aqui incorporadapor referência. Tal molécula VHH pode ser derivada de anticorpos promovi-dos em espécies de Camelidae, por exemplo, em camelos, lhamas, drome-dários, alpacas e guanacos e é, algumas vezes, chamada de um domíniovariável camelídeo ou camelizado. Vide, por exemplo, Muyldermans., J. Bio-technology (2001) 74(4): 277 - 302, aqui incorporado por referência. Outrasespécies além de Camelidae podem produzir anticorpos de cadeia pesadanaturalmente livres de cadeia leve. Moléculas VHH são aproximadamente 10vezes menores do que moléculas IgG. Elas são polipeptídeos individuais emuito estáveis, resistindo ao pH e a condições de temperatura extremas.Além disso, elas são resistentes à ação de proteases, o que não é o casopara anticorpos convencionais. Além disso, a expressão in vitro de VHHsproduz VHHs funcionais propriamente dobrados com alto rendimento. Alémdisso, anticorpos gerados em camelídeos reconhecerão epitopos diferentesdaqueles reconhecidos pelos anticorpos gerados in vitro através do uso debibliotecas de anticorpos ou através da imunização de mamíferos diferentesde camelídeos (vide WO 9749805, o qual é aqui incorporado por referência).
Um aspecto da presente invenção compreende anticorpos efragmentos de ligação a antígeno que se ligam a IL-22. A descrição propor-ciona novos CDRs derivados de bibliotecas de genes de imunoglobulinahumanos. A estrutura para carregar uma CDR é geralmente uma cadeia pe-sada ou leve de anticorpo ou porção sua, onde o CDR está localizado emuma região de CDR de ocorrência natural. As estruturas e locais de domí-nios variáveis podem ser determinadas conforme descrito em Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological lnterest, N2 91 - 3242, National Ins-titutes of Health Publications, Bethesda, MD (1991).
Seqüências de DNA e aminoácidos (AA) de modalidades ilustra-tivas dos anticorpos anti-IL-22 dessa invenção, incluindo seus domínios VH,Vl e fragmentos scFv, e CDRs, são estabelecidas nas figuras 7 - 10 e enu-meradas nas Tabelas 1 e 7. Vinte modalidades específicas dos anticorposque não são de linhagem germinativa são identificados como GIL01, GIL16,GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04,368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 e356A11. As posições de CDR nos domínios Vh e Vl dos anticorpos que nãosão de linhagem germinativa estão listadas na Tabela 2. Quinze modalida-des específicas dos anticorpos de linhagem germinativa estão identificadoscomo GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 062A09, 087B03, 166B06,166G05, 354A08, 355B06, 355E04, 356A11 e 368D04.Tabela 1A: Seqüên-cias de nucleotídeos e aminoácidos de domínios Vh e VLl Fv e CDRs de an-ticorpos que não são de linhagem germinativa<table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table>Anticorpos anti-IL-22 dessa invenção podem compreender op-cionalmente regiões constantes de anticorpos ou partes suas. Por exemplo,um domínio Vl pode ser ligado em sua extremidade C-terminal em um do-mínio constante de cadeia leve tipo Ck ou Ολ. Semelhantemente, um domí-nio Vh ou uma porção sua pode estar ligado a toda ou a uma parte de macadeia pesada tipo IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e qualquer subclasse de isoti-pos. Regiões constantes são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Ka-bat et al., Sequences of Proteins of Immunological lnterest, N2 91-3242, Na-tional Institutes of Health Publications, Bethesda, MD (1991)). Conseqüen-temente, anticorpos dentro do escopo da invenção incluem domínios Vh eVL) ou uma porção deles, combinados com regiões constantes conhecidasna técnica.
Certas modalidades compreendem um domínio VH, um domínioVl ou uma combinação desses, do fragmento Fv de GIL01, GIL16, GIL45,GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04,166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04, ou 356A11.Outra modalidade compreende um domínio VH, um domínio Vl ou uma com-binação desses, do fragmento Fv de um anticorpo escolhido dentre 356A11,354A08, 087B03 e 368D04. Outras modalidades compreendem uma, duas,três, quatro, cinco ou seis regiões determinantes de complementaridade (C-DRs) dos domínios Vh e VL. Anticorpos cuja seqüência de CDR são incluí-das nas SEQ ID No: 5-13, 23-31, 41-49, 59-67, 77-85, 95-103, 113-121, 131-139, 149-157, 167-175, 185-193, 203-211, 221-229, 239-247, 257-265, 275-283, 293-301, 311-319, 329-337, 347-355, 365-373, 383-391, 401-409, 419-427, 437-445, 455-463, 473-481, 491-499, 509-517, 527-535, 545-553, 563-571, 581-589, 599-607 ou 617-625 são englobadas dentro do escopo dessainvenção. Por exemplo, em uma modalidade, um anticorpo compreende umfragmento H3 de domínio Vh de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92,097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05,375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04, ou 356Α11 de linhagem germi-nativa ou não-germinativa ou de um anticorpo escolhido de 356A11, 354A08,087B03 e 368D04.Em certas modalidades, os domínios Vh e/ou Vl podem ser delinhagem germinativa, isto é, as regiões de estrutura (FR) desses domíniossão modificadas usando técnicas de biologia molecular convencionais paraemparelhar com aqueles produzidos pelas linhagens germinativas. Em ou-tras modalidades, as seqüências FR permanecem divergentes das seqüên-cias germinativas de consenso. Em uma modalidade dessa invenção, anti-corpos de linhagem germinativa são mostrados na Tabela 7.
Em uma modalidade, a invenção proporciona seqüências de a-minoácidos e de ácidos nucléicos para GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06,166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04, ou 356A11 de linha-gem germinativa. Seqüências de aminoácidos e de nucleotídeos para o do-mínio Vh de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 062A09, 087B03,166B06, 166G05, 354A08, 355B06, 355E04, 356A11 e 368D04 de linhagemgerminativa são demonstradas na Tabela 7 e na Figura 8. Seqüências deaminoácidos e de nucleotídeos para o domínio Vl de GIL01, GIL16, GIL45,GIL60, GIL68, GIL92, 062A09, 087B03, 166B06, 166G05, 354A08, 355B06,355E04, 356A11 e 368D04 de linhagem germinativa também estão demons-tradas na Tabela 7 e na Figura 8.
Em uma modalidade, a mutagênese é usada para tornar um an-ticorpo mais parecido com uma ou mais seqüências de linhagem germinati-va. Isso pode ser desejável quando são introduzidas mutações na região deestrutura de um anticorpo através de mutagêneses somáticas ou através dePCR propenso a erro. Seqüências de linhagens germinativas para os domí-nios Vh e Vl podem ser identificadas efetuando-se alinhamentos de seqüên-cias de aminoácidos e de ácidos nucléicos contra o banco de dados VBASE(MRC Center for Protein Engineering, Reino Unido). VBASE é um diretóriocompreensivo de todas as seqüências de região variável de linhagem germi-nativa humana compilados de mais de mil seqüências publicadas, incluindoaquelas nos atuais lançamentos das bibliotecas de dados Genbank e EMBL.Em algumas modalidades, as regiões FR dos scFvc são modificadas emconformidade com os emparelhamentos mais próximos no banco de dadosVBASE e as porções CDR são mantidas intactas.
Em certas modalidades, os anticorpos da invenção reagem es-pecificamente com um epitopo que é o mesmo que o epitopo reconhecidopor GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05,087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08,355B06, 355E04 ou 356A11, de modo que eles inibem competitivamente aligação de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09,062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10,354A08, 355B06, 355E04, ou 356A11 a IL-22 humana. Tais anticorpos po-dem ser determinados em ensaios de ligação competitivos. Em uma modali-dade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno seu se liga a um epi-topo IL-22 que é reconhecido por 368D04, de modo que o anticorpo inibe aligação de 368D04 com a IL-22 humana. Em outra modalidade, o anticorpoou fragmento de ligação a antígeno seu se liga a um epitopo da IL-22 que éreconhecido por 356A11, de modo que o anticorpo inibe competitivamente aligação de 356A11 a IL-22 humana. Em outra modalidade, o anticorpo oufragmento de ligação a antígeno seu se liga a um epitopo da IL-22 que é re-conhecido por 354A08, de modo que o anticorpo inibe competitivamente aligação de 354A08 a IL-22 humana. Em outra modalidade, o anticorpo oufragmento de ligação a antígeno seu se liga a um epitopo da IL-22 que é re-conhecido por 087B03, de modo que o anticorpo inibe competitivamente aligação de 087B03 com a IL-22 humana. Em uma modalidade, a constantede associação (Ka) desses anticorpos para a IL-22 humana é de pelo menos106 M"1. Em outra modalidade, a constante de associação desses anticorpospara a IL-22 humana é de pelo menos 109 M'1. Em outras modalidades, aconstante de associação desses anticorpos para a IL-22 humana é de pelomenos 1010 M"1, pelo menos 1011 M"1 ou de pelo menos 1012 M'1. A afinidadede ligação pode ser determinada usando técnicas conhecidas na arte, talcomo ELISA, tecnologia de biossensor, tal como análise de interação bioes-pecífica ou outras técnicas incluindo aquelas descritas nesse pedido de pa-tente.
É contemplado que os anticorpos dessa invenção podem se ligara outras proteínas tais como, por exemplo, proteínas recombinantes com-preendendo toda ou uma porção da IL-22.
Uma pessoa normalmente versada na técnica irá reconhecerque os anticorpos descritos podem ser usados para detectar, medir e/ou ini-bir as proteínas que diferem em algo da IL-22. Por exemplo, essas proteínaspodem ser homólogas da IL-22. Espera-se que os anticorpos anti-IL-22 seliguem às proteínas que compreendem uma seqüência a qual tenha pelomenos cerca de 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais de identidade a qual-quer seqüência de pelo menos 100, 80, 60, 40 ou 20 aminoácidos contíguosna seqüência estabelecida SEQ ID NO: 1.
Além das análises de homologia de seqüência, o mapeamentode epitopos (vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, ed. Morris, Hu-mana Press, 1996), e as análises de estrutura secundária e terciária podemser executadas para identificar estruturas 3D específicas assumidas pelosanticorpos presentemente descobertos e seus complexos com antígenos.Tais métodos incluem, porém não estão limitados, a cristalografia de raio-X(Engstom (1974) Biochem. Exp. Biol., 11:7-13) e modelagem computacionalde representações virtuais dos presentes anticorpos (Fletterick et al. (1986)Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications inMolecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
A descrição proporciona um método para obter anticorpos anti-IL-22 que compreende a criação de anticorpos com seqüência(s) Vh e/ou Vlda Tabela 1 alteradas. Tais anticorpos podem ser derivados por um versadona técnica usando técnicas conhecidas. Por exemplo, substituições, anula-ções ou adições de aminoácidos podem ser introduzidas nas regiões FRe/ou CDR. Alterações de FR são geralmente projetadas para melhorar a es-tabilidade e imunogenicidade do anticorpo, enquanto que alterações de CDRsão tipicamente projetadas para aumentar a afinidade do anticorpo por seuantígeno. As alterações que aumentam a afinidade podem ser testadas pelaalteração da seqüência de CDR e pela medição da afinidade do anticorpopor seu alvo (vide Antibody Engineering, 2ã ed., Oxford University Press, ed.Borrebaeck, 1995).Anticorpos cujas seqüências CDR diferem não-substancialmentedaquelas incluídas em ou incluídas nas seqüências nas SEQ ID NO: 5-13,23-31, 41-49, 59-67, 77-85, 95-103, 113-121, 131-139, 149-157, 167-175,185-193, 203-211, 221-229, 239-247, 257-265, 275-283, 293-301, 311-319,329-337, 347-355, 365-373, 383-391, 401-409, 419-427, 437-445, 455-463,473-481, 491-499, 509-517, 527-535, 545-553, 563-571, 581-589, 599-607ou 617-625 são englobados dentro do escopo dessa invenção. Tipicamente,isso envolve a substituição de um aminoácido com um aminoácido com ca-racterísticas de carga, hidrofobicidade ou estereoquímica similares. Substitu-ições mais drásticas nas regiões FR, ao contrário de regiões CDR, tambémpodem ser feitas contanto que elas não afetem adversamente (por exemplo,reduzam a afinidade em mais de 50% em comparação com o anticorpo não-substituído) das propriedades de ligação do anticorpo. As substituições tam-bém podem ser feitas para a linhagem germinativa do anticorpo ou estabili-zar o sítio de ligação a antígeno.
Modificações conservativas irão produzir moléculas com caracte-rísticas funcionais e químicas semelhantes àquelas da molécula da qual taismodificações são feitas. Ao contrário, modificações substanciais nas carac-terísticas funcionais e/ou químicas das moléculas podem ser efetuadas pelaseleção de substituições na seqüência de aminoácidos que diferem significa-tivamente nos seus efeitos na manutenção (1) da estrutura da estrutura mo-lecular na área de substituição, por exemplo, como uma conformação defolha ou de hélice, (2) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo,ou (3) do tamanho da molécula.
Por exemplo, uma "substituição de aminoácido conservativa"pode envolver uma substituição de um resíduo de aminoácido natural comum resíduo não-natural de modo que haja pouco ou nenhum efeito na polarida-de ou carga do resíduo de aminoácido naquela posição. (Vide, por exemplo,MacLennan et al., 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643: 55 - 67; Sasaki etal., 1998, Adv. Biophys. 35: 1 - 24).
Substituições de aminoácidos desejadas (sejam conservativasou não-conservativas) podem ser determinadas pelas pessoas versadas natécnica no momento que tais substituições forem desejadas. Por exemplo,substituições de aminoácidos podem ser usadas para identificar resíduosimportantes da seqüência da molécula, ou para aumentar òu diminuir a afini-dade das moléculas aqui descritas. Substituições de aminoácidos exempla-res incluem, porém não estão limitadas, àquelas estabelecidas na Tabela 3.
Tabela 3: Substituições de aminoácidos
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Em certas modalidades, substituições de aminoácidos conserva-tivas também englobam resíduos de aminoácidos não-naturais os quais sãotipicamente incorporados por síntese química de peptídeos ao invés de porsíntese em sistemas biológicos.
Em uma modalidade, o método para fazer um domínio Vh vari-ante compreende a adição, anulação ou substituição de pelo menos um a-minoácido nos domínios Vh descritos, ou a combinação dos domínios Vhdescritos com pelo menos um domínio VL, e a testagem do domínio Vh vari-ante para ligação a IL-22 ou modulação da atividade da IL-22.
Um método análogo para fazer um domínio Vl compreende aadição, anulação ou substituição de pelo menos um aminoácido nos domí-nios Vl descritos, ou a combinação dos domínios Vl descritos com pelo me-nos um domínio VH, e a testagem do domínio Vl variante para ligação a IL-22 ou modulação da atividade da IL-22.
Um outro aspecto da descrição proporciona um método parapreparar anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno que se ligam espe-cificamente a IL-22. O método compreende:
(a) proporcionar um repertório de partida de ácidos nucléicoscodificando um domínio Vh o qual não tenha pelo menos uma CDR ou con-tenha pelo menos uma CDR a ser substituído;
(b) inserir em ou substituir a região CDR do repertório de partidaco pelo menos um ácido nucléico doador codificando uma seqüência de a-minoácidos conforme substancialmente estabelecido aqui para uma CDR deVH, produzindo um repertório produto;
(c) expressar os ácidos nucléicos do repertório do produto;
(d) selecionar um fragmento de ligação a antígeno específicoque se ligue a IL-22; e
(e) recuperar o fragmento de ligação a antígeno específico ouácido nucléico que o codifica.
Em um método análogo, pelo menos uma CDR Vl da invenção écombinado com um repertório de ácidos nucléicos codificando um domínioVl o qual não tem pelo menos uma CDR ou contém pelo menos uma CDR aser substituído. O pelo menos uma CDR Vh ou Vl pode ser uma CDR1, CDR2,CDR3 ou uma combinação desses, incluindo combinações de CDRs Vh eVL, tais como aquelas estabelecidas nas Tabelas 1 ou 7, incluindo aquelasestabelecidas nas SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 26, 27, 28, 29, 30, 31,44, 45, 46, 47, 48, 49, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 98, 99,100, 101, 102, 103, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 134, 135, 136, 137, 138,139, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 188, 189,190, 191, 192, 193, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 224, 225, 226, 227, 228,229, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 278, 279,280, 281, 282, 283, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 314, 315, 316, 317, 318,319, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 368, 369,370, 371, 372, 373, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 404, 405, 406, 407, 408,409, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 458, 459,460, 461, 462, 463, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 494, 495, 496, 497, 498,499, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 548, 549,550, 551, 552, 553, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 584, 585, 586, 587, 588,589, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 620, 621, 622, 623, 624 ou 625.
Em uma modalidade, ο domínio variável inclui uma CDR3 a sersubstituído ou não tem uma região codificadora de CDR3 e pelo menos umácido nucléico doador codifica um aminoácido substancialmente conformeestabelecido nas SEQ ID NO: 10, 13, 28, 31, 46, 49, 64, 67, 82, 85, 100,103, 118, 121, 136, 139, 154, 157, 172, 175, 190, 193, 208, 211, 226, 229,244, 247, 262, 265, 280, 283, 298, 301, 316, 319, 334, 337, 352, 355, 370,373, 388, 391, 406, 409, 424, 427, 442, 445, 460, 463, 478, 481, 496, 499,514, 517, 532, 535, 550, 553, 568, 571, 586, 589, 604, 607, 622 ou 625.
Em outra modalidade, o domínio variável inclui uma CDR1 a sersubstituído ou não tem uma região codificadora de CDR1 e pelo menos umácido nucléico doador que codifica uma seqüência de aminoácidos substan-cialmente conforme estabelecido nas SEQ ID NO: 8, 11, 26, 29, 44, 47, 62,65, 80, 83, 98, 101, 116, 119, 134, 137, 152, 155, 170, 173, 188, 191, 206,209, 224, 227, 242, 245, 260, 263, 278, 281, 296, 299, 314, 317, 332, 335,350, 353, 368, 371, 386, 389, 404, 407, 422, 425, 440, 443, 458, 461, 476,479, 494, 497, 512, 515, 530, 533, 548, 551, 566, 569, 584, 587, 602, 605,620, ou 623.
Em outra modalidade, o domínio variável inclui uma CDR2 a sersubstituído ou não tem uma região codificadora de CDR2 e pelo menos umácido nucléico doador que codifica uma seqüência de aminoácidos substan-cialmente conforme estabelecido nas SEQ ID NO: 9, 12, 27, 30, 45, 48, 63,66, 81, 84, 99, 102, 117, 120, 135, 138, 153, 156, 171, 174, 189, 192, 207,210, 225, 228, 243, 246, 261, 264, 279, 282, 297, 300, 315, 318, 333, 336,351, 354, 369, 372, 387, 390, 405, 408, 423, 426, 441, 444, 459, 462, 477,480, 495, 498, 513, 516, 531, 534, 549, 552, 567, 570, 585, 588, 603, 606,621, ou 624.
Em outra modalidade, o domínio variável inclui uma CDR3 a sersubstituído ou não tem uma região codificadora de CDR3 e compreende aindauma CDR1 a ser substituído ou não tem ma região codificadora de CDR1, ondepelo menos um ácido nucléico doador que codifica uma seqüência de ami-noácidos substancialmente conforme estabelecida nas Tabelas 1 ou 7.
Em outra modalidade, o domínio variável inclui uma CDR3 a sersubstituído ou não tem uma região codificadora de CDR3 e compreende a-inda uma CDR2 a ser substituído ou não tem uma região codificadora deCDR2, onde pelo menos um ácido nucléico doador que codifica uma se-qüência de aminoácidos substancialmente conforme estabelecida nas Tabe-las 1 ou 7.
Em outra modalidade, o domínio variável inclui uma CDR3 a sersubstituída ou não tem uma região codificadora de CDR3 e compreende a-inda uma CDR1 e uma CDR2 a serem substituídas ou não tem ma regiãocodificadora de CDR1 e CDR2, onde pelo menos um ácido nucléico doadorcodifica uma seqüência de aminoácidos substancialmente conforme estabe-lecido nas Tabelas 1 ou 7.
Usando a metodologia de DNA recombinante, uma seqüência deCDR descrita pode ser introduzida em um repertório de domínios Vh ou Vlsem a CDR respectiva (Marks et al. (BioTechnoIogy (1992) 10: 779 - 783).Por exemplo, um iniciador adjacente à extremidade 5' do domínio variável eum iniciador para o terceiro FR pode ser usado para gerar um repertório deseqüências de domínios variáveis sem CDR3. Esse repertório pode sercombinado com uma CDR3 de um anticorpo descrito. Usando técnicas aná-logas, porções de uma seqüência CDR descrita podem ser misturadas comporções de seqüências CDR de outros anticorpos para proporcionar um re-pertório de fragmentos de ligação a antígeno que se ligam a IL-22. Qualquerrepertório pode ser expresso em um sistema hospedeiro tal como de exibi-ção de fago (descrito em WO 92/01047 e sua Patente U.S. correspondenteN2 5.969.108), de modo que fragmentos de ligação a antígeno adequadosque se liguem a IL-22 possam ser selecionados.
Uma outra alternativa utiliza mutagênese aleatória das seqüên-cias Vh ou Vl descritas para gerar domínios Vh ou Vl variantes ainda capa-zes de se ligar a IL-22. Uma técnica usando PCR propenso a erro é descritapor Gram et al. (Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. (1992) 89: 3576 - 3580).
Outro método usa a mutagênese direta das seqüências Vh ou Vldescritas. Tais técnicas são descritas por Barbas et al. (Proc. Nat. Acad. Sei.U.S.A. (1994) 91: 3809 - 3813) e Schier et al. (J. Mol. Biol. (1996) 263: 551 -567).
Uma porção de um domínio variável irá compreender pelo me-nos uma região CDR substancialmente conforme estabelecida aqui e, opcio-nalmente, regiões de estrutura intervenientes dos domínios Vh ou Vl con-forme estabelecido aqui. A porção pode incluir a porção C-terminal de FR1e/ou a porção N-terminal de FR4. Resíduos adicionais na extremidade N-terminal ou C-terminal do domínio variável podem não ser os mesmos resí-duos encontrados em anticorpos de ocorrência natural. Por exemplo, a cons-trução de anticorpos por técnicas de DNA recombinante geralmente introduzresíduos N- ou C-terminais a partir de seu uso de ligantes. Alguns Iigantespodem ser usados para unir domínios variáveis a outros domínios variáveis(por exemplo, diacorpos), domínios constantes ou marcadores proteináceos.
Embora as modalidades ilustradas nos Exemplos compreendamum par "que se emparelha" de domínios Vh e VL, um versado na técnica iráreconhecer que modalidades alternativas podem compreender fragmentosde ligação a antígeno contendo somente um único CDR do domínio Vl ouVh. Qualquer um dos domínios de ligação a antígeno específicos de cadeiaindividuais pode ser usado para varrer por domínios complementares capa-zes de formar um fragmento de ligação a antígeno específico de dois domí-nios capaz de, por exemplo, se ligar a IL-22. A varredura pode ser efetuadapor métodos de varredura de exibição de fagos usando a camada aborda-gem combinatorial dual hierárquica descrita em WO 92/01047. Nessa abor-dagem, uma colônia individual contendo um clone de cadeia ou H ou L éusado para infectar uma biblioteca completa de clones codificando a outracadeia (L ou H) e o domínio de ligação a antígeno específico de duas cadei-as resultante é selecionado de acordo com técnicas de exibição de fago con-forme descrito.
Em algumas modalidades alternativas, os anticorpos anti-IL-22podem ser ligados a uma proteína (por exemplo, albumina) por reticulaçãoquímica ou métodos recombinantes. Os anticorpos descritos podem tambémestar ligados a uma variedade de polímeros não-proteináceos (por exemplo,polietilenoglicol, polipropilenoglicol ou polioxialquilenos) nas maneiras esta-belecidas nas Patentes Americanas N2s 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144;4.670.417; 4.791.192; ou 4.179.337. Os anticorpos podem ser quimicamentemodificados por conjugação covalente a um polímero, por exemplo, paraaumentar suas meias-vidas na circulação sangüínea. Polímeros exemplares emétodos de ligação são mostrados nas Patentes Americanas Nss 4.766.106;4.179.337; 4.495.285; e 4.609.546.
Os anticorpos descritos podem ser modificados para alterar assuas glicosilações; isto é, pelo menos uma porção de carboidrato pode seranulada ou adicionada ao anticorpo. A anulação ou adição de sítios de glico-silação pode ser efetuada pela alteração da seqüência de aminoácidos paraanular ou criar sítios de consenso de glicosilação, os quais são bem-conhecidos na técnica. Outra forma de adicionar porções de carboidratos é oacoplamento químico ou enzimático de glicosídeos a resíduos de aminoáci-dos do anticorpo (vide WO 87/05330 e Aplin et al. (1981) CRC Crit. Rev. Bi-ochem., 22: 259 - 306). A remoção das orções de carboidrato também po-dem ser realizadas química ou enzimaticamente (vide Hakimuddin et al.(1987) Arch. Biochem. Biophys., 259: 52; Edge et al. (1981) Anal. Biochem.,118: 131; Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol., 138: 350).
Métodos de alteração de uma região constante de anticorpo sãoconhecidos na técnica. Anticorpos com função alterada (por exemplo, afini-dade alterada para um Iigante efetor, tal como FcR em uma célula ou ocomponente C1 do complemento) podem ser produzidos pela substituiçãode pelo menos um resíduo de aminoácido na porção constante do anticorpocom um resíduo diferente (vide, por exemplo, EP 388.151 A1, US 5.624.821e US 5.648.260). Tipos semelhantes de alterações poderiam ser descritos osquais se aplicados em um anticorpo de murino ou de outras espécies pode-ria reduzir ou eliminar funções similares.
Por exemplo, é possível alterar a afinidade de uma região Fc deum anticorpo (por exemplo, uma IgG, tal como uma IgG humana) para FcR(por exemplo, Fc gama R1) ou C1q. A afinidade pode ser alterada pela subs-tituição de pelo menos um resíduo especificado com pelo menos um resíduocom uma funcionalidade apropriada na sua cadeia lateral, ou pela introduçãode um grupo funcional carregado, tal como glutamato ou aspartato, ou talvezum resíduo não-polar aromático tal como fenilalanina, tirosina, triptofano oualanina (vide, por exemplo, US 5.624.821).
Por exemplo, a substituição do resíduo 297 (asparagina) comalanina na região constante de IgG inibe significativamente o recrutamentode células efetoras, enquanto somente reduz levemente (cerca de três vezesmais fraca) a afinidade por Clq (vide, por exemplo, US 5.624.821). A nume-ração dos resíduos na cadeia pesada é aquela do índice EU (vide Kabat etal., 1991 supra). Essa alteração destrói o sítio de glicosilação e acredita-seque a presença de carboidrato seja requerida para a ligação do receptor Fc.Acredita-se que qualquer outra substituição nesse sítio que destrua o sítio deglicosilação cause um decréscimo similar na atividade lítica. Outras substitu-ições de aminoácidos, por exemplo, alterando qualquer um dos resíduos 318(Glu), 320 (Lys) e 322 (Lys), para Ala também são conhecidas por abolir aligação de Clq à região Fc dos anticorpos IgG (vide, por exemplo, US5.624.821).
Anticorpos modificados podem ser produzidos os quais têm umainteração reduzida com um receptor Fe. Por exemplo, foi demonstrado quena IgG3 humana, a qual se liga ao receptor Fc gama R1 humano, alterandoLeu 235 para Glu destrua sua interação com o receptor.
Mutações em sítiosadjacentes ou próximos na região de ligação da dobradiça de um anticorpo(por exemplo, substituindo os resíduos 234, 236 ou 237 com Ala) tambémpodem ser usadas para afetar a afinidade do anticorpo para o receptor Fcgama R1. A numeração dos resíduos na cadeia pesada é baseada no índiceEU (vide Kabat et al., 1991 supra).
Métodos adicionais para alterar a atividade lítica de um anticor-po, por exemplo, pela alteração de pelo menos um aminoácido na região N-terminal do domínio CH2 são descritos em WO 94/29351 por Morgan et al. eUS 5.624.821.
Os anticorpos dessa invenção podem estar marcados com ummarcador detectável ou funcional. Esses marcadores incluem radiomarcado-res (por exemplo, 131I ou 99Tc), marcadores enzimáticos (por exemplo, pero-xidase de rábano silvestre ou fosfatase alcalina) e outras porções químicas(por exemplo, biotina).
A invenção pode ainda exibir um anticorpo isolado que se liga aIL-22, particularmente, a IL-22 humana. Em certas modalidades, o anticorpoanti-IL-22 pode ter pelo menos uma das seguintes características: (1) ele éum anticorpo monoclonal ou de especificidade única; (2) ele é um anticorpohumano; (3) ele é um anticorpo gerado in vitro\ (4) ele é um anticorpo geradoin vivo (por exemplo, um sistema de camundongo transgênico); (5) ele seliga a IL-22 com uma constante de associação de pelo menos 1012 M'1; (6)ele se liga a IL-22 com uma constante de associação de pelo menos 1011 M"1; (7) ele se liga a IL-22 com uma constante de associação de pelo menos1010 M'1; (8) ele se liga a IL-22 com uma constante de associação de pelomenos 109 M'1; (9) ele se liga a IL-22 com uma constante de associação depelo menos 106 M"1; (10) ele se liga a IL-22 com uma constante de associa-ção de 500 nM ou menos; (11) ele se liga a IL-22 com uma constante de as-sociação de 10 nM ou menos; (12) ele se liga a IL-22 com uma constante deassociação de 150 pM ou menos. (13) ele se liga a IL-22 com uma constantede associação de 60 pM ou menos; (14) ele inibe a ligação da IL-22 a IL-22Rou um complexo receptor de IL-22R e IL-10R2 com uma IC50 de 10 nM oumenos; (15) ele bloqueia a proliferação mediada por IL-22 das células BaF3projetadas do receptor de IL-22 com uma IC5o de 1 nM ou menos em umamodalidade, com uma IL50 de 150 pM ou menos em outra modalidade, comuma IC5O de 100 pM ou menos em outra modalidade e com uma IC5o de 10pM ou menos em outra modalidade; e (16) ele bloqueia a secreção de GROamediada por IL-22 de HT29 com uma IC5o de 1 nM ou menos em uma moda-lidade, com uma IC5o de 150 pM ou menos em outra modalidade, e com umaIC5O de 10 pM ou menos em outra modalidade.
Uma pessoa versada na técnica irá perceber que as modifica-ções descritas acima não são todas exaustivas, e que muitas outras modifi-cações são óbvias para um versado na técnica à luz dos ensinamentos dapresente descrição.
III. Ácidos nucléicos. clonagem e sistemas de expressão
A descrição proporciona ácidos nucléicos isolados codificandoos anticorpos descritos. Os ácidos nucléicos podem compreender DNA ouRNA, e eles podem ser sintéticos (completa ou parcialmente) ou recombi-nantes (completa ou parcialmente). Referência a uma seqüência de nucleo-tídeos conforme aqui estabelecido engloba uma molécula de DNA com aseqüência especificada, e engloba uma molécula de RNA com a seqüênciaespecificada na qual U é substituído por T.
São também fornecidos ácidos nucléicos que compreendemuma seqüência codificadora para uma, duas ou três CDRs, um domínio VH,um domínio Vl ou uma combinação deles, conforme aqui descrito, ou umaseqüência substancialmente idêntica a eles (por exemplo, uma seqüênciacom pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identi-dade a ela, ou a qual seja capaz de hibridizar sob condições estringentescom as seqüências descritas).
Em uma modalidade, os ácidos nucléicos isolados têm seqüên-cias de nucleotídeos codificando regiões variáveis de cadeia pesada e decadeia leve de um anticorpo anti-IL-22 com pelo menos uma CDR escolhidadas seqüências de aminoácidos das SEQ ID NO: 8-13, 26-31, 44-49, 62-67,80-85, 98-103, 116-121, 134-139, 152-157, 170-175, 188-193, 206-211, 224-229, 242-247, 260-265, 278-283, 296-301, 314-319, 332-337, 350-355, 368-373, 386-391, 404-409, 422-427, 440-445, 458-463, 476-481, 494-499, 512-517, 530-535, 548-553, 566-571, 584-589, 602-607 ou 620-625; ou seqüên-cias codificando um CDR o qual difira por um ou dois aminoácidos das se-qüências aqui descritas.
O ácido nucléico pode codificar somente a região variável dacadeia leve ou da cadeia pesada, ou também pode codificar uma regiãoconstante da cadeia leve ou pesada de um anticorpo, operativamente ligadaà região variável correspondente. Em uma modalidade, a região variável dacadeia leve está ligada a uma região constante escolhida de uma regiãoconstante capa ou lâmbda. A região constante da cadeia leve pode tambémser uma do tipo capa ou lâmbda humana. Em outra modalidade, a regiãovariável da cadeia pesada está ligada a uma região constante da cadeia pe-sada de um isotipo de anticorpo escolhido de IgG (por exemplo, IgGi, lgG2,IgG3, IgG4), IgM, IgAi, IgA2, IgD e IgE. A região constante da cadeia pesadapode ser um isotipo de IgG (por exemplo, uma IgG-i).
As composições de ácido nucléico da presente invenção, embo-ra geralmente na seqüência natural (de DNAc ou DNA genômico ou misturassuas) exceto pelos sítios de restrição modificados e semelhantes, podem sermodificadas de acordo com técnicas padrões para proporcionar seqüênciasde genes. Para seqüências codificadoras, essas mutações podem afetar aseqüência de aminoácidos conforme desejado. Particularmente, seqüênciasde nucleotídeos substancialmente idênticas a ou derivadas de V, D, J, cons-tante, trocas naturais e outras tais seqüências descritas aqui são contempla-das (onde "derivado" indica que uma seqüência é idêntica ou modificada deoutra seqüência).
Em uma modalidade, o ácido nucléico difere (por exemplo, diferede substituição, inserção ou anulação) daquelas seqüências fornecidas (porexemplo, como se segue: por pelo menos, porém não menos do que 10, 20,30 ou 40 nucleotídeos; pelo menos, porém não menos do que 1%, 5%, 10%ou 20% dos nucleotídeos no referido ácido nucléico). Caso necessário paraessa análise, as seqüências devem estar alinhadas para uma máxima homo-logia. Seqüências "formando alças para fora de anulações ou inserções, oumaus-emparelhamentos, são considerados diferenças. A diferença pode es-tar em um nucleotídeo(s) codificando um/uns resíduo(s) não-essencial(is),ou a diferença pode ser uma(s) substituição(ões) conservativa(s).
A descrição também proporciona constructos de ácido nucléicona forma de plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou expressão, osquais compreendem pelo menos um ácido nucléico conforme aqui descrito.
A descrição ainda proporciona uma célula hospedeira que com-preende pelo menos um constructo de ácido nucléico aqui descrito.
São também fornecidos os métodos para fazer a(s) proteína(s)codificante(s) a partir do(s) ácido(s) nucléico(s) compreendendo a seqüênciaaqui descrita. O método compreende o cultivo de células hospedeiras sobcondições apropriadas de modo que elas expressem a proteína do ácidonucléico. Após a expressão e a produção, o domínio Vh ou VL, ou o membrode ligação específico pode estar isolado e/ou purificado usando qualquertécnica adequada, a seguir usado conforme apropriado. O método tambémpode incluir as etapas de fundir um ácido nucléico codificando scFv com áci-dos nucléicos codificando ma porção Fc de um anticorpo e expressando oácido nucléico fundido em uma célula. O método também pode incluir umaetapa de formar linhagens germinativas.
Fragmentos de ligação a antígeno, domínios Vh e/ou Vl e molé-culas de ácido nucléico codificantes e vetores podem ser isolados e/ou puri-ficados a partir de seu ambiente natural, em uma forma substancialmentepura ou homogênea ou, no caso do ácido nucléico, livre ou substancialmentelivre de ácido nucléico ou genes de origem diferente da seqüência codifican-do um polipeptídeo com a função requerida.
Sistemas para clonagem e expressão de polipeptídeos em umavariedade de células hospedeiras são conhecidos na técnica. Células ade-quadas para produzir anticorpos estão descritas, por exemplo, em Fernan-dez et al. (1999) Gene Expression Systems, Academic Press, eds. Em re-sumo, células hospedeiras adequadas incluem células de mamíferos, célulasde insetos, células vegetais, células de levedura ou células procarióticas, porexemplo, E. coli. Células de mamíferos disponíveis na técnica para a ex-pressão de polipeptídeos heterólogos incluem linhagens de células linfocíti-cas (por exemplo, NSO), células HEK293, células de ovário de hâmster chi-nês (CHO), células COS, células HeLa1 células de rim de hâmster jovem,células de oócito e células de um animal transgênico, por exemplo, célulaepitelial de mamífero. Em uma modalidade, os anticorpos GIL01, GIL16,GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04,368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 e356A11 são expressos em células HEK293 ou CHO. Em outra modalidade,uma seleção de anticorpos escolhidos dentre 365A11, 354A08, 087B03 e368D04 são expressos em células HEK293 ou CHO. Em outras modalida-des, os ácidos nucléicos codificando os anticorpos da invenção são coloca-dos sob o controle de um promotor tecido-específico (por exemplo, um pro-motor específico de mamífero) e os anticorpos são produzidos em animaistransgênicos. Por exemplo, os anticorpos são secretados no leite do animaltransgênico, tal como uma vaca, porco, cavalo, ovelha, cabra ou roedortransgênico.
Vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos paraconter seqüências regulatórias apropriadas, incluindo seqüências promotoras,seqüências terminadoras, seqüências de poliadenilação, seqüências intensi-ficadoras, genes marcadores e outras seqüências. Os vetores também po-dem conter uma estrutura de vírus ou plasmídeo. Para detalhes, vide Sam-brook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press (1989). Muitas técnicas estabelecidas usadas comvetores, incluindo a manipulação, preparação, mutagênese, seqüenciamentoe transfecção de DNA são descritas em Current Protocols in Molecular Bio-logy, Segunda Edição, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons (1992).
um outro aspecto da invenção proporciona um método de intro-dução do ácido nucléico em uma célula hospedeira. Para células eucarióti-cas, técnicas de transfecção adequadas podem incluir fosfato de cálcio, DE-AE-Dextran, eletroporação, transfecção mediada por Iipossomo e transduçãousando retrovírus ou outros vírus, por exemplo, vaccinia ou baculovírus. Pa-ra células bacterianas, técnicas adequadas podem incluir transformação comcloreto de cálcio, eletroporação e transfecção usando bacteriófagos. A intro-dução de DNA pode ser seguida por um método de seleção (por exemplo,resistência a fármaco) para selecionar células que contêm o ácido nucléico.IV. Usos de anticorpos anti-IL-22
Anticorpos anti-IL-22 que agem como antagonistas da IL-22 po-dem ser usados para regular pelo menos uma resposta imune mediada pelaIL-22, tal como atuação nas células epiteliais em tecido sólido e pela modu-lação indireta à jusante de respostas imunes, tais como o bloqueio da ex-pansão de subgrupos de células T incluindo, por exemplo, células T TH17.Em uma modalidade, anticorpos da invenção são usados em um métodopara regular uma resposta imune, o método compreendendo o contato da IL-22 com um anticorpo da invenção, conseqüentemente regulando a respostaimune. Em uma modalidade, a resposta imune compreende a proliferaçãocelular, a atividade citolítica, a secreção de citocina ou a secreção de quimi-ocina.
Concordantemente, os anticorpos da invenção podem ser usa-dos para inibir diretamente ou indiretamente a atividade (por exemplo, proli-feração, diferenciação e/ou sobrevivência) de uma célula imune ou hemato-poiética (por exemplo, uma célula de linhagem mielóide, linfóide ou eritróide,ou suas células precursoras) e, conseqüentemente, podem ser usadas paratratar uma variedade de distúrbios imunes e distúrbios hiperproliferativos.Exemplos não-limitativos de distúrbios imunes que podem ser tratados inclu-em, porém não estão limitados, a distúrbios auto-imunes, por exemplo, artri-te (incluindo artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artritepsoriática, artrite associada com lúpus ou espondilite anquilosante), esclero-derma, lúpus eritematoso sistêmico, HIV, síndrome de Sjogren, vasculite,esclerose múltipla, tiroidite auto-imune, dermatite (incluindo dermatite atópi-ca e dermatite eczematosa), miastenia grave, doença do intestino inflamató-ria (IBD), doença de Chron, colite, diabetes mellitus (tipo I); condições infla-matórias, por exemplo, da pele (por exemplo, psoríase), sistema cardiovas-cular (por exemplo, aterosclerose), sistema nervoso (por exemplo, doençade Alzheimer), fígado (por exemplo, hepatite), rim (por exemplo, nefrite) epâncreas (por exemplo, pancreatite); distúrbios cardiovasculares, por exem-plo, distúrbios metabólicos do colesterol, injúria por radical livre de oxigênio,isquemia; distúrbios associados com cicatrização de ferida; distúrbios respi-ratórios, por exemplo, asma e DPOC (por exemplo, fibrose cística); condi-ções inflamatórias agudas (por exemplo, endotoxemia, sepse e septicemia,síndrome do choque tóxico e doença infecciosa); rejeição de transplante ealergia. Em uma modalidade, o distúrbio associado com a IL-22 é um distúr-bio artrítico, por exemplo, um distúrbio escolhido de um ou mais dentre artri-te reumatóide, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática ouespondilite anquilosante; um distúrbio respiratório (por exemplo, asma, do-ença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC); ou uma condição inflamatória, porexemplo, da pele (por exemplo, psoríase), sistema cardiovascular (por e-xemplo, aterosclerose), sistema nervoso (por exemplo, doença de Alzhei-mer), fígado (por exemplo, hepatite), rim (por exemplo, nefrite), pâncreas(por exemplo, pancreatite) e órgãos gastrointestinais, por exemplo, colite,doença de Crohn e IBD; condições inflamatórias agudas, por exemplo, endo-toxemia, sepse e septicemia, síndrome do choque tóxico e doença infeccio-sa; falência de órgãos múltipla; doença respiratória (ARD); amiloidose; ne-fropatias tais como glomerulosclerose, neuropatia membranosa, arterioscle-rose renal, glomerulonefrite, doenças fibroproliferativas do rim, assim comooutras disfunções do rim e tumores renais. Devido aos efeitos da IL-22 noepitélio, anticorpos anti-IL-22 podem ser usados para tratar cânceres epiteli-ais, por exemplo, carcinoma, melanoma e outros. Para uma descrição deuma análise racional para a inibição da IL-22 nesses e em outros estados dedoença vide WO 03/083062 (páginas 58 a 75).
Esclerose múltipla é uma doença do sistema nervoso central queé caracterizada pela inflamação e perda da bainha de mielina - o materialgraxo que isola os nervos e é necessário para a função nervosa adequada.A inflamação que resulta de uma resposta imune que é dependente da IL-22pode ser tratada com os anticorpos e composições dessa invenção. Na en-cefalite auto-imune experimental (EAE) camundongos modelo para esclero-se múltipla (Tuohy et al. (J. Immunol. (1988) 141: 1126 - 1130), Sobel et al.(J. Immunol. (1984) 132: 2393 - 2401) e Traugott (Cell Immunol. (1989) 119:114 - 129), o tratamento dos camundongos com injeções de GIL01, GIL16,GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04,368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 ou356A11 antes (e continuamente) à indução de EAE pode retardar profunda-mente o início da doença. Isso pode servir como um modelo para confirmaro uso do anticorpo da invenção. Os anticorpos da invenção podem seme-lhantemente ser usados para tratar esclerose múltipla em seres humanos.
Artrite é uma doença caracterizada por inflamação nas juntas.Artrite reumatóide (RA) é a forma mais freqüente de artrite, envolvendo in-flamação do tecido conjuntivo e da membrana sinovial, uma membrana quese alinha com a junta. A membrana sinovial inflamada geralmente infiltra ajunta e danifica a cartilagem da junta e o osso. IL-22 e a proteína e/ou trans-crito da IL-22 estão associados com ambas as doenças humanas. Nas bióp-sias sinoviais de RA, a proteína IL-22 é detectada nos fibroblastos sinoviaisde Vimentina+ e em alguns macrófagos CD68+ enquanto que a IL-22R é de-tectada nos fibroblastos sinoviais. O tratamento dos fibroblastos sinoviaiscom IL-22 induz a produção da proteína quimioatratora de monócitos 1,MCP-1, assim como a atividade metabólica geral (lkeuchi, H., et al. (2005)Arthritis Rheum. 52: 1037 - 46). Os inibidores da IL-22 melhoram os sintomasda artrite reumatóide (WO 2005/000897 A2; Patente U.S. Ne 6.939.545). Asecreção aumentada de quimiocinas e de citocinas inflamatórias e, de ummodo mais importante, o resultado de doença aumentado das respostas i-munes que são dependentes da IL-22 podem ser tratados com os anticorposdessa invenção. Semelhantemente, os anticorpos e composições dessa in-venção podem ser usados para tratar RA ou outras doenças artríticas emseres humanos.
Rejeição a transplante é o fenômeno imunológico onde os teci-dos de um doador são especialmente "atacados" por células imunes do hos-pedeiro. O princípio células "atacantes" são células T cujos receptores decélulas T reconhecem as moléculas MHC do doador como "estranhas". Essereconhecimento ativa as células T, as quais se proliferam e secretam umavariedade de citocinas e proteínas citolíticas que, em última instância des-troem o transplante. MLR e modelos de transplante foram descritos por Cur-rent Protocols in Immunology, Segunda Edição, Coligan et al. eds., John Wi-ley & Sons, 1994; Kasaian et al. (Immunity (2002) 16: 559 - 569); Fulmer etal. (Am. J. Anat. (1963) 113: 273 - 285) e Lenschow et al. (Science (1992)257: 789 - 792). Os anticorpos e composições dessa invenção podem serusados para reduzir MLR e tratar a rejeição de transplante e doenças rela-cionadas (por exemplo, doença de enxerto versus hospedeiro) em sereshumanos que são dependentes da IL-22.
Os anticorpos dessa invenção também podem ser usados paratratar distúrbios hiperproliferativos associados com a atividade aberrante decélulas responsivas a IL-22 e células responsivas a IL-22R/IL-10R2 pelaadministração dos anticorpos em uma quantidade suficiente para inibir oureduzir a hiperproliferação de células responsivas a IL-22 e/ou IL-22R e/ouIL-10R2 em um indivíduo e permitindo que os anticorpos tratem ou previnamo distúrbio. A expressão da IL-22 e da IL-22R é constitutiva nas células epi-teliais em uma variedade de tecidos incluindo, porém sem se limitar, ao pân-creas, pulmão, pele, intestino, fígado, rim (Kotenko, S.V. et al. (2001) J. Biol.Chem. 276: 2725 - 32; Xie, M.H. et al. (2000) J. Biol. Sem. 275: 31335 - 9;Wolk, K. et al. (2004) Immunity 21: 241 - 54). Além disso, o complexo recep-tor da IL-22 também é expresso na superfície de fibroblastos da junta doentee do intestino normal (Ikeuchi, H. et al. (2005) Arthritis Rheum. 52: 1037 - 46;Andoh, A. et al. (2005) Gastroenterology 129: 969 - 84). Derivados neoplási-cos desses tipos celulares podem ser hiper-responsivos a IL-22, modulandoessas capacidades das células de sobreviver no organismo. Deste modo, osanticorpos para a IL-22 podem ser usados para inibir a progressão de taisneoplasmas, por exemplo, carcinomas de célula escamosa, carcinomas decélula basal, papilomas e carcinomas de célula transitória, adenomas, ade-nocarcinoma, Iinitis plastica, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, vipoma,colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma adenóide cítico,tumor carcinóide do apêndice, prolactinoma, oncocitoma, adenoma da célulahurthle, carcinoma de célula renal, tumor de Grawitz, adenomas endócrinosmúltiplos, adenoma endometróide, neoplasmas adnexos e apêndices da pe-le, neoplasmas mucoepidermóides, neoplasmas císticos, mucinosos e sero-sos, cistadenoma, pseudomixoma peritoneal, neoplasmas ductais, Iobularese medulares, neplasmas de célula acinar, neoplasmas epiteliais complexos,tumor de Warthin, timoma, neoplasmas gonadais especializados, tumor doestroma - cordão sexual, tecoma, tumor de célula granulosa, arrenoblasto-ma, tumor de célula de sertoli-leydig, paraganglioma, feocromocitoma, tumorglomo, nevo melanocítico, melanoma maligno, melanoma, melanoma nodu-lar, nevo displástico, sinais malignos, melanoma de espalhameto superficialou melanoma Ientiginoso acral. Enquanto o receptor da IL-22 não é detec-tado em células imunes naif ou ativadas, a desregulação do receptor podetornar tais células neoplásticas derivadas responsivas à IL-22 e, deste nodo,a inibição por um anticorpo à IL-22.
Em outro aspecto, a invenção exibe um método para diminuir,inibir ou reduzir uma resposta de fase aguda em um indivíduo. O métodoinclui a administração ao indivíduo de um anticorpo anti-IL-22 ou fragmentoseu conforme aqui descrito, em uma quantidade suficiente para diminuir,inibir ou reduzir a resposta de fase aguda no indivíduo. Em uma modalidade,o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um humano sofrendo de um distúr-bio associado com a IL-22 conforme aqui descrito incluindo, por exemplo,distúrbios respiratórios, distúrbios inflamatórios e distúrbios auto-imunes. Emuma modalidade, o agente de ligação da IL-22 é administrado localmente,por exemplo, tópica ou subcutaneamente ou outras administrações que nãoestão em circulação geral.
Acredita-se que a IL-22 exerça seus efeitos inflamatórios local-mente, por exemplo, atuando (por exemplo, por atuação direta) como ummodulador ou regulador de inflamação tecidual em oposição dos efeitos sis-têmicos diretos. Concordantemente, a inibição da atividade da IL-22 usando,por exemplo, um anticorpo anti-IL-22 da presente invenção pode proporcio-nar um agente antiinflamatório tecido-específico mais eficaz (menos tóxico)do que as modalidades antiinflamatórias sistêmicas. Além disso, a inibiçãoda IL-22 local usando, por exemplo, um anticorpo anti-IL-22 ou fragmentoseu aqui descrito pode proporcionar um candidato útil para combinação commodalidades antiinflamatórias sistêmicas.V. Terapia de combinação
Em uma modalidade, uma composição farmacêutica compreen-dendo pelo menos um anticorpo anti-IL-22 e pelo menos um agente terapêu-tico é administrada na terapia de combinação. A terapia é útil para tratarcondições ou distúrbios patológicos, tais como distúrbios imunes e inflamató-rios. O termo "em combinação" nesse contexto significa que a composiçãodo anticorpo e o agente terapêutico são dadas substancialmente ao mesmotempo, seja simultânea ou seqüencialmente. Em uma modalidade, se dadosseqüencialmente, no início da administração do segundo composto, o pri-meiro dos dois compostos ainda é detectável em concentrações eficazes nosítio de tratamento. Em outra modalidade, se dado seqüencialmente, no iní-cio da administração do segundo composto, o primeiro dos dois compostosnão é detectável em concentrações eficazes no sítio de tratamento.
Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir pelo menosum anticorpo anti-IL-22 co-formulado com, e/ou co-administrado com pelomenos um agente terapêutico adicional. Os agentes adicionais podem incluirpelo menos um inibidor de citocina, inibidor do fator de crescimento, imunos-supressor, agente antiinflamatório, inibidor metabólico, inibidor enzimático,agente citotóxico e agente citostático, conforme descrito em maiores deta-lhes abaixo. Em uma modalidade, o agente adicional é um tratamento pa-drão para artrite incluindo, porém sem se limitar, a agentes antiinflamatóriosnão-esteroidais (NSAIDs); corticosteróides, incluindo prednisolona, predni-sona, cortisona e triamcinolona; e fármacos anti-reumáticos modificadoresda doença (DMARDs), tais como metotrexato, hidroxicloroquina (PIaqueniI) esulfassalazina, Ieflunomida (Arava), inibidores do fator de necrose tumoral,incluindo etanercept (Enbrel), infliximab (Remicade) (com ou sem metotrexa-to) e adalimumab (Humira), anticorpo anti-CD20 (por exemplo, Rituxan), re-ceptor de interleucina 1 solúvel, tal como anakinra (Kineret), ouro, minocicli-na (Minocin), penicilamina e agentes citotóxicos, incluindo azatioprina, ciclo-fosfamida e ciclosporina. Tais terapias de combinação podem utilizar vanta-josamente dosagens menores dos agentes terapêuticos administrados, evitan-do desta forma toxicidades ou complicações possíveis associadas com as vá-rias monoterapias. Além disso, os agentes terapêuticos adicionais aqui des-critos agem nas vias de adição a ou que diferem da via da IL-22/1L-22R/lL-10R2, e deste modo espera-se que intensifiquem e/ou sinergizem com osefeitos dos anticorpos anti-IL-22.
Agentes terapêuticos usados em combinação com anticorposanti-IL-22 podem ser aqueles agentes que interferem em diferentes estágiosna resposta auto-imune e inflamatória subseqüente. Em uma modalidade,pelo menos um anticorpo anti-IL-22 aqui descrito pode ser co-formuladocom, e/ou co-administrado com pelo menos uma citocina e/ou antagonistado fator de crescimento. Os antagonistas podem incluir receptores solúveis,inibidores de peptídeo, moléculas pequenas, fusões de ligantes, anticorpos eseus fragmentos de ligação (que se ligam às citocinas ou fatores de cresci-mento ou seus receptores ou outras moléculas de superfície celular) e "cito-cinas antiinflamatórias" e seus agonistas.
Exemplos não-limitativos dos agentes que podem ser usados emcombinação com os anticorpos anti-IL-22 aqui descritos incluem, porém nãoestão limitados, aos agonistas de pelo menos uma interleucina (por exemplo,IL-I, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12 (ou uma de suas subunidades p35 ou p40),IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A-F (incluindo seus heterodímeros, por exemplo,heterodímero IL-17A/IL-17F), IL-18, IL-19, IL-20, IL-21 e IL-23 (ou uma desuas subunidades p19 ou p40); citocina (por exemplo, TNFa, LT, EMAP-II eGM-CSF); e fator de crescimento (por exemplo, FGF e PDGF). Os agentestambém podem incluir, porém não estão limitados, a antagonistas de pelomenos um receptor para uma interleucina, citocina e fator de crescimento.Anticorpos anti-IL-22 também podem ser combinados com inibidores (porexemplo, anticorpos ou seus fragmentos de ligação) em moléculas de super-fície celular tais como CD2, CD3, CD4, CD8, CD20 (por exemplo, Rituxan),CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90ou seus ligantes (por exemplo, CD154 (gp39, CD40L)) ou LFA-1/ICAM-1 eVLA-4/VCAM-1 (Yusuf-Makagiansar et al. (2002) Med Res Rev 22(2): 146 -67)). Em certas modalidades, os antagonistas que podem ser usados emcombinação com anticorpos anti-IL-22 aqui descritos podem incluir antago-nistas da 1-1, IL-12 (ou uma de suas subunidades p35 ou p40), TNFa, IL-15,IL-17A-F (incluindo seus heterodímeros, por exemplo, o heterodímero IL-17A/IL-17H), IL-18, IL-19, IL-20, IL-21 e IL-23 (ou uma de suas subunidadesp19 ou p40) e seus receptores.
Exemplos daqueles agentes incluem antagonistas IL-12 (taiscomo anticorpos que se ligam à IL-12 (vide, por exemplo, WO 00/56722) ouuma de suas subunidades p35 ou p40); inibidores do receptor da IL-12 (taiscomo anticorpos do receptor da IL-12); e receptor IL-12 solúvel e seus frag-mentos. Exemplos de antagonistas da IL-15 incluem anticorpos contra IL-15ou seu receptor, fragmentos solúveis do receptor da IL-15 e proteínas deligação da IL-15. Exemplos de antagonistas da IL-18 incluem anticorpos paraa IL-18, fragmentos solúveis do receptor da IL-18 e proteínas Iigantes à IL-18(IL-18BP, Mallet et al. (2001) Circ. Res. 28). Exemplos de antagonistas daIL-1 incluem inibidores da enzima conversora de interleucina 1 (ICE) (taiscomo VX740), antagonistas da IL-1 (por exemplo, IL-1RA (ANIKINRA (ouKineret), AMGEN)), slL-1 Rll (Immunex) e anticorpos do receptor anti-IL-1.
Em uma modalidade, a terapia de combinação inclui pelo menosum anticorpo anti-IL-22 co-formulado com e/ou co-administrado com um an-tagonista, tal como um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno seu ouum receptor solúvel, de pelo menos um heterodímero de IL-17A, IL-17F, IL-17A/IL-17F ou IL-23 (ou uma de suas subunidades p19 ou p40).
Exemplos de agonistas TNF incluem anticorpos para o TNF (porexemplo, TNFa humano) tal como D2E7 (anticorpo anti-TNFa humano, U.S.6.258.562, Humira®, BASF); CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356 (anticorposanti-TNFa humanizados, Celltech/Pharmacia); cA2 (anticorpo anti-TNFaquimérico, Remicade®, Centocor); e fragmentos de anticorpo anti-TNF (porexemplo, CPD870). Outros exemplos incluem fragmentos e derivados doreceptor de TNF solúvel (por exemplo, p55 ou p75 humano), tais como p55kdTNFR-lgG (proteína de fusão de IgG do receptor de TNF de 55 KD, Le-nercept®) e 75 kdTNFR-lgG (proteína de fusão de IgG do receptor de TNFde 75 KD, Enbrel®, Immunex, vide, por exemplo, Arthritis & Rheumatism(1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A). Outros exemplosincluem antagonistas enzimáticos (por exemplo, inibidores da enzima con-versora de TNFa (TACE) tais como derivado do ácido alfa-sulfonilidroxâmico(WO 01/55112) ou inibidor da N-hidroxiformamida (GW 3333, -005, ou -022))e TNF-bp/s-TNFR (proteína de ligação ao TNF solúvel, vide, por exemplo,Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N2 9 (suplemento), S284; e Am. J.Physiol. Heart Circ. Physiol. (1995) Vol. 268, pp. 37 - 42). Antagonistas doTNF também podem ser fragmentos e derivados do receptor de TNF solúvel(por exemplo, p55 ou p75 humano), tal como 75 kdTNFR-lgG; e inibidoresda enzima conversora de TNFa (TACE).
Em outras modalidades, os anticorpos anti-IL-22 aqui descritospodem ser administrados em combinação com pelo menos um dos seguin-tes: antagonistas IL-13, tais como receptores IL-13 solúveis e/ou anticorposanti-IL-13; e antagonistas da IL-2, tais como proteínas de fusão da IL-2 (porexemplo, DAB 486-IL-2 e/ou DAB 389-IL-2 Seragen, vide por exemplo, Art-hritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223) e anticorpos anti-IL-2R (por e-xemplo, anti-Tac (anticorpo humanizado, Protein Design Labs, vide CâncerRes. 1990 Mar 1; 50(5): 1495 - 502)). Outra combinação inclui anticorposanti-IL-22 em combinação com inibidores anti-CD4 não-esgotadores taiscomo IDEC-CE9.1//SB 210396 (anticorpo anti-CD4, IDEC/SmithKline). Aindaoutras combinações incluem anticorpos anti-IL-22 com antagonistas (taiscomo anticorpos, receptores solúveis ou Iigantes antagonísticos) de molécu-las co-estimulatórias, tais como CD80 (B7.1) e CD86 (B7.2); ICOSL, ICOS,CD28 e CTLA4 (por exemplo, CTLA4-lg (atabacept)); Iigante de glicoproteí-na da P-selectina (PSGL); e citocinas antiinflamatórias e seus agonistas (porexemplo, anticorpos). As citocinas antiinflamatórias podem incluir IL-4(DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000, IL-10 recombinante, DNAX/Schering);IL-13; eTGF.
Em outras modalidades, pelo menos um anticorpo anti-IL-22 po-de ser co-formulado com, e/ou co-administrado com pelo menos um fármacoantiinflamatório, imunossupressor, inibidor metabólico e inibidor enzimático.Exemplos não-limitativos dos fármacos ou inibidores que podem ser usadosjuntamente com os antagonistas da IL-22 aqui descritos incluem, porém nãoestão limitados, a pelo menos um de: fármaco antiinflamatório não-esteroidal(AINES) (tal como ibuprofeno, TEnidap (vide, por exemplo, Arthritis & Rheu-matism (1996) Vol. 39, N2 9 (suplemento), S280)), Naproxen (vide, por e-xemplo, Neuro Report (1996) Vol. 7, pp. 1209 - 1213), Meloxicam, Piroxicam,Diclofenaco e lndometacina); Sulfasalazina (vide, por exemplo, Arthritis &Rheumatism (1996) Vol. 39, Ns 9 (suplemento), S281); corticosteróide (talcomo prednisolona); fármaco antiinflamatório supressor de citocina (CSAID);e um inibidor da biossíntese de nucleotídeo (tal como um inibidor da biossín-tese de purina (por exemplo, antagonista de folato, tal como metotrexato) eum inibidor da biossíntese de pirimidina (por exemplo, um inibidor da diidroo-rotato desidrogenase (DHODH) tal como Ieflunomida (vide, por exemplo,Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, Ns 9 (suplemento), S131; Inflammati-on Research (1996) Vol. 45, pp. 103 - 107)). Agentes terapêuticos para usoem combinação com antagonistas IL-22/IL-22R ou IL-22/IL-10R2 podem in-cluir inibidores de DHODH, AINES, CSAIDs (tal como leflunomida) e antago-nistas de folato (tais como metotrexato).
Exemplos de inibidores adicionais incluem pelo menos um de:corticosteróide (oral, inalatório ou injeção local); imunossupressor (tal comociclosporina e tacrolimus (FK-506); um inibidora da mTOR (tal como siroli-mus (rapamicina) ou um derivado da rapamicina (por exemplo, derivado deéster de rapamicina tal como CCI-779 (Elit. L. (2002) Current Opinion Inves-tig. Drugs 3(8): 1249 - 53; Huang, S. et al. (2002) Current Opinion Investig.Drugs 3(2): 295 - 304))); um agente o qual interfere com a sinalização dascitocinas pro-inflamatórias tais como TNFa e IL-1 (por exemplo, inibidor daMAP quinase, IRAK, NIK, IKK ou p38) / um inibidor da COX2 (por exemplo,celecoxib e variantes suas (MK-966), vide, por exemplo, Arthritis & Rheuma-tism (1996) Vol. 39, N2 9 (suplemento), S81); um inibidor da fosfodiesterase(tal como R973401, vide por exemplo Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39,N2 9 (suplemento), S282)); um inibidor da fosfolipase (por exemplo, um inibi-dor da fosfolipase citosólica 2 (cPLA2) tais como análogos da trifluormetilce-tona (US 6.350.892)); um inibidor do fator de crescimento de célula endoteli-al vascular (VEGF); um inibidor do receptor de VEGF; e um inibidor da angi-ogênese. Agentes terapêuticos para uso em combinação com anticorposanti-IL-22 podem incluir imunossupressores (tais como ciclosporina e tacro-limus (FK-506)); e inibidores da mTOR (tais como sirolimus (rapamicina) ouderivados da rapamicina (por exemplo, derivados de éster de rapamicina taiscomo CCI-779)); inibidores da COX2 (tal como celecoxib e suas variações);e inibidores da fosfolipase (tais como inibidores da fosfolipase citosólica 2(cPLA2) (por exemplo, análogos da trifluormetilcetona)).
Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser co-administrados e/ou co-formulados com pelo menos um anticorpo anti-IL-22incluem, porém não estão limitados, a pelo menos um dentre: antagonistasde TNF (tais como anticorpos anti-TNF); fragmentos solúveis dos receptoresde TNF (por exemplo, p55 e p75 humana) e seus derivados (tais como p55kdTNFR-lgG (proteína de fusão IgG - receptor de TNF de 55 Kd, Lener-cept®) e 75 kdTNFR-lgG (proteína de fusão IgG - receptor de TNF de 75 Kd,Enbrel®); antagonistas da enzima TNF (tais como inibidores TACE); antago-nistas da IL-12 (ou uma de suas subunidades p35 ou p40), IL-15, IL-17A-F(incluindo seus heterodímeros, por exemplo, heterodímero IL-17A/IL-17F),IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22 e IL-23 (ou uma de suas subunidades p19 oup40); agentes esgotadores de célula T e célula B (tais como anticorpos anti-CD4 ou anti-CD22); inibidores de moléculas pequenas (tais como metotrexa-to e leflunomida); sirolimus (rapamicina) e seus análogos (tais como CCI-779); inibidores da Cox-2 e cPLA2; inibidores da NFkB, p38, TPL-2 e Mk-2;RAGE e RAGE solúvel; inibidores da PSGL-1 e P-selectina (tais como anti-corpos para e inibidores de moléculas pequenas); e agonistas do receptorbeta de estrogênio (ERB); e antagonistas de ERB-NFkb. Agentes terapêuti-cos que podem ser co-administrados e/ou co-formulados com pelo menosum anticorpo anti-IL-22 podem incluir pelo menos um dentre: um fragmentosolúvel de um receptor de TNF (por exemplo, p55 ou p75 humano) tal como75 kdTNFR-lgG (proteína de fusão de IgG - receptor de TNF de 75 KD, En-brel®); metotrexato/ leflunomida; e sirolimus (rapamicina) e seus análogos(tal como CCI-779).
Os anticorpos anti-IL-22 aqui descritos podem ser usados emcombinação com outros agentes terapêuticos para tratar distúrbios imunoes-pecíficos conforme discutido em maiores detalhes abaixo.
Exemplos não-limitativos de agentes para tratar distúrbios artríti-cos (por exemplo, artrite reumatóide, artrite inflamatória, artrite reumatóide,artrite reumatóide juvenil, osteoartrite e artrite psoriática), com os quais qual-quer anticorpo anti-IL-22 pode ser combinado incluem um dos seguintes:antagonistas de TNF (tais como anticorpos anti-TNF); fragmentos solúveisdos receptores de TNF (por exemplo, p55 e p75 humano) e seus derivados(tal como p55 kdTNFR-lgG (proteína de fusão IgG - receptor de TNF de 55KD, Lenercept®) e 75 kdTNFR-lgG (proteína de fusão IgG - receptor de TNFde 75 KD1 Enbrel®)); antagonistas de enzima TNF (tal como inibidores daTACE); antagonistas da IL-12 (ou uma de suas subunidades p35 ou p40), IL-15,IL-17A-F (incluindo seus heterodímeros, por exemplo, heterodímeroIL-17A/IL-17F) IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-23 (ou uma de suas subunidadesp19 ou p40), e IL-24; agentes esgotadores de célula T e célula B (tais comoanticorpos anti-CD4, anti-CD20 ou anti-CD22); inibidores de moléculas pe-quenos (tal como metotrexato e leflunomida); sirolimus (rapamicina) e seusanálogos (por exemplo, CCI-779); inibidores da Cox-2 e cPLA2; inibidores daNFkB; NSAIDs; p38, TPL-2 e Mk-2; RAGE ou RAGE solúvel; P-selectina ouinibidores de PSGL-1 (tais como inibidores de moléculas pequeno e anticor-pos para tal); agonistas do receptor beta de estrogênio (ERB) e antagonistasERB-NFkB. Agentes terapêuticos que podem ser co-administrados e/ou co-formulados com pelo menos um antagonista de IL-22/IL-22R/IL-10R2 podemincluir pelo menos um dentre: um fragmento solúvel de um receptor de TNF(por exemplo, p55 ou p75 humano) tal como 75 kdTNFR-lgG (proteína defusão IgG - receptor de TNF de 75 KD, Enbrel®)); metotrexato; leflunomida;e sirolimus (rapamicina) ou um análogo seu (por exemplo, CCI-779).
Exemplos não-limitativos dos agentes para tratar esclerose múl-tipla com os quais um anticorpo anti-IL-22 pode ser combinado inclui interfe-ron-β, por exemplo IFNp-Ia e IFNp-Ib), copaxona, corticosteróides, inibido-res da IL-I, inibidores de TNF, anticorpos para o Iigante CD40, anticorpospara CD80 e antagonistas da IL-12, incluindo anticorpos que se ligam à IL-12(ou uma de suas subunidades p35 ou p40).
Exemplos não-limitativos de agentes para tratar a doença dointestino inflamatória ou doença de Chron com a qual um anticorpo anti-IL-22pode ser combinado incluem budesonida; fator de crescimento epidérmico;corticosteróides; ciclosporina; sulfassalazina; aminossalicilatos; 6-mercapto-purina; azatioprina; metronidazol; inibidores da lipoxigenase; mesalamina;olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inibidores de tromboxano; antago-nistas do receptor de IL-1; anticorpos monoclonais anti-IL-1. anticorpos mo-noclonais anti-IL-6; fatores de crescimento; inibidores da elastase; compostosde piridinilimidazol; antagonistas do TNF conforme aqui descritos; IL-4, IL-10,IL-13 e/ou TGFp ou seus agonistas (por exemplo, anticorpos agonistas); IL-11;promedicamentos conjugados com glucuronida ou dextrano de prednisolona,dexametasona ou budesonida; oligodesoxinucleotídeos de fosforotioato anti-sentido ICAM-1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor do comple-mento solúvel 1 (TP10; T Cell Sciences, Inc.); mesalazina de liberação lenta;metotrexato; antagonistas do fator de ativação plaquetária (PAF); ciprofloxa-cina; e lignocaína.
Em outras modalidades, um anticorpo anti-IL-22 pode ser usadoem combinação com pelo menos um anticorpo direcionado para outros alvosenvolvidos na regulação das respostas imunes, por exemplo, rejeição detransplante ou doença de enxerto versus hospedeiro. Exemplos não-limi-tativos de agentes para tratar respostas imunes com os quais um antagonis-ta de IL-22/IL-22R/IL10R2 da invenção podem ser combinados incluem osseguintes: anticorpos contra moléculas de superfície celular incluindo, porémsem se limitar, a CD25 (receptor α da IL-2), CD11a (LFA-1), CD54 (ICAM-1),CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) ou combinações des-ses. Em outra modalidade, um anticorpo anti-IL-22 é usado juntamente compelo menos um agente imunossupressor geral, tal como ciclosporina A ouFK506.
Outro aspecto da presente invenção se refere concordantementeaos kits para efetuar a administração combinada dos anticorpos anti-l-22com outros agentes terapêuticos. Em outra modalidade, o kit compreendepelo menos um anticorpo anti-IL-22 formulado em um veículo farmacêutico,e pelo menos um agente terapêutico formulado conforme apropriado emuma ou mais preparações farmacêuticas separadas.
VI. Usos de diagnóstico.
Os anticorpos também podem ser usados para detectar a pre-sença de IL-22 em amostras biológicas. Pela correlação da presença ou ní-vel dessas proteínas com ma condição médica, uma pessoa versada na téc-nica pode diagnosticar a condição médica associada. Por exemplo, IL-22inclui alterações associadas com aquelas causadas pelas citocinas inflama-tórias (tais como IL-1 e TNFa) e inibidores de IL-22 melhoram os sintomasda artrite reumatóide (WO 2005/000897 A2). Condições médicas ilustrativasque podem ser diagnosticadas pelos anticorpos dessa invenção incluem es-clerose múltipla, artrite reumatóide, psoríase, doença de intestino inflamató-ria, pancreatite e rejeição de transplante.
Métodos de detecção baseados em anticorpo são bem-conhe-cidos na técnica, e incluem ELISA, radioimunoensaios, imunoblots, Westernblots, citometria de fluxo, imunofluorescência, imunoprecipitação e outrastécnicas relacionadas. Os anticorpos podem ser fornecidos em um kit dediagnóstico que incorpora pelo menos um desses procedimentos para detec-tar IL-22. O kit pode conter outros componentes, embalagens, instruções ououtros materiais para ajudar a detecção da proteína e uso do kit.
Anticorpos podem ser modificados com marcadores detectáveis,incluindo grupos Iigantes (por exemplo, biotina), fluoróforos e cromóforos,radioisótopos, reagentes de densidade eletrônica ou enzimas. Enzimas sãodetectadas pela sua atividade. Por exemplo, peroxidase de rábano silvestreé detectada pela sua capacidade de converter tetrametilbenzidina (TMB) emum pigmento azul, quantificável com um espectrofotômetro. Outros parceirosde ligação adequados incluem biotina e avidina, IgG e proteína A, e outrospares receptor-ligante conhecidos na técnica.
Anticorpos também podem ser funcionalmente ligados (por e-xemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não-covalenteou de outra forma) a pelo menos uma entidade molecular, tal como outroanticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecífico ou multiespecífico), toxi-nas, radioisótopos, agentes citotóxicos ou citostáticos, dentre outros. Outraspermutações e possibilidades são aparentes para as pessoas normalmenteversadas na técnica, e elas são consideradas equivalentes dentro do escopodessa invenção.
VII. Composições farmacêuticas e métodos de administração
Certas modalidades da invenção incluem composições compre-endendo os anticorpos descritos. As composições podem ser adequadaspara o uso farmacêutico e administração a pacientes. As composições com-preendem um anticorpo da presente invenção e um excipiente farmacêutico.Conforme aqui utilizado, "excipiente farmacêutico" inclui solventes, meios dedispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes deretardo de absorção e isotonicidade, etc., que sejam compatíveis com a ad-ministração farmacêutica. O uso desses agentes para substâncias farmaceu-ticamente ativas é bem-conhecido na técnica. As composições também po-dem conter outros compostos ativos proporcionando funções terapêuticassuplementares, adicionais ou intensificadas. As composições farmacêuticaspodem também ser incluídas em um recipiente, embalagem ou dispensadorjuntamente com instruções para administração.
Uma composição farmacêutica da invenção é formulada para sercompatível com sua via de administração tencionada. Métodos para efetuara administração são conhecidos pelas pessoas normalmente versadas natécnica. Composições farmacêuticas podem ser topicamente ou oralmenteadministradas, ou capazes de se propagar pelas membranas mucosas. E-xemplos de administração de uma composição farmacêutica incluem inala-ção ou ingestão oral. A administração também pode ser intravenosa, intrape-ritoneal, intramuscular, intracavidade, subcutânea, cutânea ou transdérmica.
Soluções ou suspensões usadas para aplicação intradérmica ousubcutânea tipicamente incluem pelo menos um dos seguintes componen-tes: um diluente estéril tal como água, solução solução salina, óleos fixados,polietilenoglicol, glicerina, propilenoglicol ou outro solvente sintético; agentesantibacterianos tais como álcool benzílico ou metilparabenos; antioxidantestais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tais co-mo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA); tampões tais como acetato, ci-trato ou fosfato; e agentes de tonicidade tais como cloreto de sódio ou dex-trose; o pH pode ser ajustado com ácidos ou bases. Tais preparações po-dem ser encerradas em ampolas, seringas descartáveis ou em frascos dedoses múltiplas.
Soluções ou suspensões usadas para administração intravenosaincluem um veículo tal como solução salina fisiológica, água bacteriostática,Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ), etanol ou poliol. Em todos os ca-sos, a composição deve ser estéril e fluida para uma fácil capacidade de serpuxada com o auxílio de uma seringa. A fluidez própria pode geralmente serobtida usando Iecitina ou tensoativos. A composição também deve ser está-vel sub as condições de produção e estocagem. A prevenção e microrga-nismos pode ser alcançada com agentes antibacterianos e antifúngicos, porexemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, etc. Emmuitos casos, agentes isotônicos (açúcar), polialcoóis (manitol e sorbitol) oucloreto de sódio podem ser incluídos na composição. A absorção prolongadada composição pode ser efetuada pela adição de um agente o qual retarde aabsorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
Composições orais incluem um diluente inerte um veículo co-mestível. A composição pode ser encerrada em gelatina ou compressa emcomprimidos. Para o propósito de administração oral, os anticorpos podemser incorporados com excipientes e colocados em comprimidos, trociscos oucápsulas. Agentes de ligação farmaceuticamente compatíveis ou materiaisadjuvantes podem ser incluídos na composição. Os comprimidos, trociscos ecápsulas podem conter (1) um aglutinante tal como celulose microcristalina,goma tragacanto ou gelatina; (2) um excipiente tal como amido ou lactose,(3) um agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel ou amido demilho; (4) um lubrificante tal como estearato de magnésio; (5) um agente dedeslizamento tal como dióxido de silício coloidal; ou (6) um agente adoçanteou um agente flavorizante.
A composição também pode ser administrada por uma viatransmucosal ou transdérmica. Por exemplo, anticorpos que compreendemuma porção Fc podem ser capazes de cruzar membranas mucosas no intes-tino, boca ou pulmões (através de receptores Fe). A administração transmu-cosal pode ser efetuada através do uso de pastilhas, borrifos nasais, inala-dores ou supositórios. A administração transdérmica também pode ser efe-tuada através do uso de uma composição contendo ungüentos, pomadas,géis ou cremes conhecidos na técnica. Para administração transmucosal outransdérmica, penetrantes apropriados para a barreira ser permeada sãousados. Para administração por inalação, os anticorpos são distribuídos emum pulverizador de aerossol a partir de um recipiente ou dispersante pressu-rizado, o qual contém um propelente (por exemplo, líquido ou gás) ou umnebulizador.
Em certas modalidades, os anticorpos dessa invenção são pre-parados com veículos para proteger os anticorpos contra a rápida eliminaçãodo corpo. Polímeros biodegradáveis (por exemplo, acetato de etilenovinila,polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido polilático)são geralmente usados. Métodos para a preparação de tais formulações sãoconhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Suspensões Iipossomaispodem ser usadas também como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Oslipossomos podem ser preparados de acordo com métodos estabelecidosconhecidos na técnica (Patente U.S. N2 4.522.811).
Os anticorpos ou composições de anticorpo da invenção sãoadministrados em quantidades terapeuticamente eficazes conforme descrito.Quantidades terapeuticamente eficazes podem variar com a idade, condi-ção, sexo e severidade da condição médica do indivíduo. Uma dosagem a -propriada pode ser determinada por um versado baseado em indicaçõesclínicas. Os anticorpos ou composições podem ser dadas como uma doseem bolus para maximizar os níveis circulantes de anticorpos pela maior du-ração de tempo. A infusão contínua pode também ser usada depois da dosedo bolus.Conforme aqui utilizado, o termo "indivíduo" é tencionado a in-cluir animais humanos e não-humanos. Indivíduos pode incluir um pacientehumano com um distúrbio caracterizado por célula que expressam IL-22, porexemplo, uma célula cancerígena ou uma célula imune. O termo "animaisnão-humanos" da invenção inclui todos os vertebrados, tais como primatasnão-humanos, ovelhas, cachorros, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc.
Exemplos de faixas de dosagem que podem ser administradas aum indivíduo podem ser escolhidas de: 1 pg/Kg a 20 mg/Kg, 1 pg/Kg a10 mg/Kg, 1 pg/Kg a 1 mg/Kg, 10 pg/Kg a 1 mg/Kg, 10 pg/Kg a 100 pg/Kg,100 pg/Kg a 1 mg/Kg, 250 pg/Kg a 2 mg/Kg, 250 pg/Kg a 1 mg/Kg, 500pg/Kg a 2 mg/Kg, 500 pg/Kg a 1 mg/Kg, 1 mg/Kg a 2 mg/Kg, 1 mg/Kg a5 mg/Kg, 5 mg/Kg a 10 mg/Kg, 10 mg/Kg a 20 mg/Kg, 15 mg/Kg a 20 mg/Kg,10 mg/Kg a 25 mg/Kg, 15 mg/Kg a 25 mg/Kg, 20 mg/Kg a 25 mg/Kg, e 20mg/Kg a 30 mg/Kg (ou mais altas). Essas dosagens podem ser admi-nistradas diária, semanal, bissemanal, mensal ou menos freqüentemente,por exemplo, bianualmente, dependendo da dosagem, método de adminis-tração, distúrbio ou sintoma(s) a ser(em) tratado(s), e das característicasindividuais do indivíduo. As dosagens também podem ser administradas a-través de infusão contínua (tal como através de uma bomba). A dose admi-nistrada também pode depender da via de administração. Por exemplo, aadministração subcutânea pode requerer uma dosagem mais alta do que aadministração intravenosa.
Em certas circunstâncias, pode ser vantajoso formular composi-ções na forma de unidade de dosagem para facilidade de administração euniformidade de dosagem. A forma de unidade de dosagem, conforme aquiutilizada, se refere a unidades fisicamente distintas ajustadas para o pacien-te. Cada unidade de dosagem contém uma quantidade predeterminada deanticorpo calculada para produzir um efeito terapêutico em associação como veículo. A unidade de dosagem depende das características dos anticor-pos e do efeito terapêutico particular a ser alcançado.
A toxicidade e o efeito terapêutico da composição podem serdeterminados por procedimentos farmacêuticos padronizados em culturas decélulas ou animais experimentais, por exemplo, a determinação da LD50 (adose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficazem 50% da população). A proporção de dose entre os efeitos tóxico e tera-pêutico é o índice terapêutico e ele pode ser expresso como a proporçãoLD50/ED50. Anticorpos que exibem grandes índices terapêuticos podem sermenos tóxicos e mais terapeuticamente eficazes.
Os dados obtidos dos ensaios de cultura celular e estudos emanimais podem ser usados para formular uma faixa de dosagem em sereshumanos. A dosagem desses compostos pode ficar dentro da faixa de con-centrações de anticorpo circulante no sangue, que inclui uma ED50 com pou-ca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa de-pendendo da forma de composição de dosagem empregada e da via de ad-ministração. Para qualquer anticorpo usado na presente invenção, a doseterapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada usando ensaios decultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais paraalcançar uma faixa de concentração plasmática circulante que inclui a IC50(isto é, a concentração de anticorpo a qual alcança uma inibição meio-máxima dos sintomas). Os efeitos de qualquer dosagem particular podemser monitorados por um bioensaio adequado. Exemplos de bioensaios ade-quados incluem ensaios de replicação de DNA, ensaios baseados em trans-crição, ensaios de ligação de IL-22/IL-22R, ensaios de ligação de IL-22/IL-10R2, IL-22/IL-22R/lL-10R2 e outros ensaios imunológicos.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Seleção de scFvs anti-IL-22Seleção de GIL01 e GIL689 de origem
GIL01 e GIL68 foram isolados de bibliotecas scFv por seleçãosolúvel em IL-22. As seleções solúveis foram executadas usando IL-22 bioti-nilada cm uma proteína marcada His/FLAG N-terminal (bio. IL-22 H/F). Bio.IL-22 H/F foi inicialmente usada em uma concentração de 100 nM. Uma bi-blioteca de fagemídeo scFv, a qual é uma versão expandida da biblioteca1,38 χ 1010 descrita (Vaughan et al., 1996), foi usada para selecionar anti-corpos específicos para a IL-22. Fagos scFv purificado (1012 unidades trans-dutoras (tu)) foram bloqueados por 30 minutos em 100 μΙ_ de MPBS 3% (3%de leite em pó em PBS), a seguir bio. IL-22 H/F foi adicionada e incubadaem temperatura ambiente por 1 hora. Fago/antígeno foi adicionado a 50 μΙ_de contas magnéticas de estreptavidina Dynal M280, as quais tinham sidobloqueadas por 1 hora a 37°C em 1 mL de MPBS 3%, a seguir incubado pormais 15 minutos em temperatura ambiente. As contas foram capturadas u-sando um gabinete magnético e lavadas 4x em 1 mL de MPBS 3%/Tween20 0,1% (v/v) seguido por três lavagens em PBS. Depois da última lavagem,as contas foram ressuspensas em 100 μί de PBS e usadas para infectar 5mL de células de E. coli TG-1 em crescimento exponencial. As células e ofago nas contas foram incubados por 1 hora a 37°C (30 minutos estacioná-rio, 30 minutos agitando a 250 rpm), a seguir espalhados em placas 2TYAG.As placas forma incubadas a 30°C de um dia para o outro e as colônias fo-ram visualizadas no dia seguinte. As colônias foram removidas por raspa-gem das placas em 10 mL de caldo 2TY e 15% de glicerol foi adicionadopara estocagem a -70°C.
Culturas de estoque de glicerol do primeiro ciclo de seleção debusca foram superinfectadas com fago auxiliador e resgatados para propor-cionar partículas de fago expressando anticorpo scFv para o segundo ciclode seleção. Um segundo e terceiro ciclo de seleção solúvel foi efetuado con-forme descrito acima, diminuindo a concentração de bio.IL-22 H/F para 50nM.
Isolamento de GIL16, GIL45, GIL60 e GIL92 de origem
GIL16, GIL45, GIL60 e GIL92 foram isolados de bibliotecas descFv por uma combinação de busca em uma proteína de fusão de IL-22 eseleção solúvel em bio.lL-22 H/F. Cavidades de uma placa de microtitulaçãoforam revestidas com proteína de fusão de IL-22 humana 10 μg/mL (PBSDulbecco, pH 7,4) e incubados de um dia para o outro a 4°C. As cavidadesforam lavadas em PBS e bloqueadas por 2 horas a 37°C em MPBS 3%. Fa-gos purificados (1012 tu) em 100 μί de MPBS 3% foram adicionados as ca-vidades bloqueadas e incubados em temperatura ambiente por 1 hora. Ascavidades foram lavadas 10 vezes com PBST (PBS contendo Tween 200,1% v/v), a seguir 10 vezes com PBS. As partículas de fago ligadas forameluídas com 100 μL de solução de tripsina (0,5 μg/mL de tripsina em Tris pH8 50 mM, CaCI2 1 mM) por 30 minutos a 37°C. os fagos eluídos foram usa-dos para infectar 10 mL de E. coli TG1 em crescimento exponencial. As célu-las infectadas cresceram em caldo 2TY por 1 hora a 37°C, como acima, aseguir esfriadas em placas 2TYAG e incubadas de um dia para o outro a30°C. As colônias produzidas foram removidas por raspagem das placas eos fagos foram resgatados conforme descrito acima. Um segundo ciclo deseleção solúvel foi executado conforme descrito acima, usando 100 nM debio.lL-22 H/F.
Exemplo 2. Ligação de Blocos de ScFv da IL-22 à IL-22R
Foram efetuados ensaios de inibição nos anticorpos de origemde GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68 e GIL92 para identificar anticorposque bloqueiem ou alterem a ligação de IL-22 à IL-22R e/ou complexo recep-tor da IL-22. scFv bruto contendo extratos periplásmicos foram varridosquanto à capacidade de inibir a ligação de bio.IL-22 H/F à proteína receptorada IL-22 humana (hlL-22R). As colônias produzidas a partir das seleçõesforam tomadas em placas de 96 cavidades contendo 100 μl 2TYAG. A pro-dução de ScFv foi induzida pela adição de IPTG 1 mM em culturas de cres-cimento exponencial e foi feita uma incubação de um dia para o outro a30°C. Extratos periplásmicos foram preparados (Griffiths et al., 1993) emMOPS 50 mM pH 7,4/EDTA 0,5 mM/sorbitol 0,5 M.
Placas de microtitulação foram revestidas com 1,25 μg/mL deum anticorpo de proteína do receptor IL-22 (em PBS) por 1,5 hora em tem-peratura ambiente. As placas foram, a seguir, lavadas três vezes em PBS ebloqueadas por 1 hora em temperatura ambiente com PBS contendo 2% deleite em pó (MPBS 2%). Depois de mais 3 lavagens, 50 μl de meio condi-cionador de células 25% contendo proteína receptor de IL-22 foram adicio-nados a cada cavidade e incubado de um dia para o outro a 4°C. No dia se-guinte, 25 μl de amostra e 25 μl de bio.lL-22 H/F (54 ng/mL em PBS/BSA0,05%/Tween 0,05%) foram adicionados às placas de lavagem e incubadospor 1,5 hora em temperatura ambiente. Depois de 3 lavagens em PBST, aligação de bio.lL-22 H/F foi detectada com Európio-Estreptavidina e TRF foidetectado com o kit reagente DELFIA® e o Leitor de Placas Victor 2® (PerkinElmer).
Os clones que apresentaram inibição da ligação da IL-22 foramretestados como scFv purificada. Ambos os ensaios de ligação IL-22/IL-22R(descritos acima) e o ensaio do complexo IL-22/receptor de IL-22 (descritoabaixo) foram usados. As concentrações de ScFv foram tituladas para esta-belecer as potências do clone conforme medidas pelos valores de IC5o doensaio. Esses foram determinados usando o programa de computador Gra-phPad Prism e um ajuste de curva de equação logística de quatro parâme-tros. Os resultados da amostra do ensaio do complexo receptor de IL-22 es-tão mostrados na Figura 1.
Exemplo 3. Verificação da ligação da IL-22 por fago-ELISA
Para estabelecer a especificidade dos scFvs para IL-22, um fa-go-ELISA foi efetuado usando a proteína de fusão IL-22, IL-22 H/F e umaproteína não-relacionada. Colônias de E. coli individuais contendo fagemí-deo foram inoculadas em pacas de 96 cavidades contendo 10O μL de meio2TYAG por cavidade. Os fagos M13K07 auxiliadores foram adicionados auma multiplicidade de infecções (moi) de 10 à cultura em crescimento expo-nencial e as placas foram incubadas por mais 1 hora a 37°C. AS placas fo-ram centrifugadas em uma centrífuga de bancada de laboratório a 2.000 rpmpor 10 minutos. O sobrenadante foi removido e os péletes celulares foramressuspensos em 100 μL de 2TYAK e incubados a 30°C de um dia para ooutro com agitação. No dia seguinte, as placas foram centrifugadas a 2.000rpm por 10 minutos e 100 μL de sobrenadante contendo fago de cada cavi-dade foram transferidos para uma placa de 96 cavidades fresca. As amos-tras de fago foram bloqueadas em uma concentração final de MPBS 3% por1 hora em temperatura ambiente.
Placas de microtitulação foram revestidas com 1 μg/mL de prote-ína de fusão IL-22, IL-22 H/F ou uma proteína não-relacionada e incubadasde um dia para o outro a 4°C. Depois do revestimento, as soluções foramremovidas as cavidades e as placas foram bloqueadas por 1 hora em tempe-ratura ambiente em MPBS 3%. As placas foram rinsadas com PBS, a seguir50 μΙ_ do fago pré-bloqueado foi adicionado em cada cavidade. As placasforam incubadas em temperatura ambiente por 1 hora, a seguir lavadas com2 mudanças de PBST seguido por 3 mudanças de PBS. Em cada cavidade,50 μL de uma diluição 1:5.000 de um conjugado anti-M13-HRP (Pharmacia)foi adicionada e as placas foram incubadas em temperatura ambiente por 1hora. As placas foram lavadas 3 vezes com PBST, a seguir 3 vezes comPBS. Cinqüenta μL de substrato TMB foram adicionados a cada cavidade eincubados até o desenvolvimento de cor. A reação foi interrompida pela adi-ção de 25 μL de H2SO4 0,5 M e a absorvância a 450 nm foi medida. Essesexperimentos confirmaram a ligação específica dos clones scFv à IL-22.
Exemplo 4: Conversão de scFv em IgG
As regiões V das cadeias pesada e leve de clones scFv foramamplificadas com iniciadores clone-específicos. Os produtos de PCR foramdigeridos com enzimas de restrição apropriadas e subclonados em vetorescontendo domínio constante de cadeia pesada lgG4 humana (para domíniosVH) ou vetores contendo domínios constantes de cadeia leve capa ou lâmb-da humana conforme apropriado (domínios VL). As linhagens germinativashumanas mais próximas dos segmentos Vh e Vl foram determinadas e essainformação foi usada para indicar que domínios constantes de cadeia levecapa ou lâmbda foram usados (Tabela 4). A inserção correta de domínios deregião V em plasmídeos foi verificada pelo seqüenciamento do DNA deplasmídeo a partir de colônias de E. coli individuais. Os plasmídeos forampreparados a partir de culturas de E. coli por técnicas padrão e constructosde cadeia pesada e leve co-transfectados em células HEK 293 EBNA usan-do técnicas padronizadas. IgG secretada foi purificada usando proteína Asefarose (Pharmacia) e o tampão trocado em PBS.Tabela 4. Linhagens germinativas Vh e Vl de clones neutralizantes de IL-22
<table>table see original document page 84</column></row><table>
A potência da IgG purificada foi verificada no ensaio de inibiçãodo complexo receptor da IL-22 bioquímico conforme descrito abaixo. As con-centrações de IgG foram tituladas para obter os valores de potência. Os da-dos de potência das amostras estão mostrados na Tabela 5.
Tabela 5. Potência da IL-22 scFv e IgG no ensaio de inibição do complexoreceptor de IL-22
<table>table see original document page 84</column></row><table>
Exemplo 5. Otimização do anticorpo IL-22
Grandes bibliotecas de exibição de ribossomos foram criadas evarridas para scFvs que reconheciam especificamente a IL-22 humana, es-sencialmente conforme descrito em Hanes et al (2000). Inicialmente os cincoclones de origem (GIL01, GIL16, GIL60, GIL68 e GIL92) foram convertidosem um formato de exibição de ribossomo, e esse molde foi subseqüente-mente usado para a criação da biblioteca. No nível de DNA1 um promotor T7foi adicionado na extremidade 5' para a transcrição eficiente para MRNA. Nonível do MRNA, o constructo continha um sítio de ligação de ribossomo pro-cariótico (seqüência Shine-Dalgarno) e alças da haste 5' & 3' para estabili-dade de MRNA. Na extremidade 3' da cadeia individual, o códon de paradafoi removido e uma porção da glll foi adicionada para agir como espaçador,permitindo a dobragem do scFv longe do túnel ribossomal (Hanes et al.2000).
Bibliotecas de exibição de ribossomos derivadas dos clones líde-res foram criadas por mutagênese das regiões determinantes de comple-mentaridade de cadeia única (CDRs) usando PCR com Taq DNA polimerasesem prova de leitura. Seleções baseadas em afinidade foram efetuadas on-de a biblioteca foi incubada com bio.lL-22H/F, seguido por contas paramag-néticas revestidas com estreptavidina (Dynal M280). Complexos terciários(MRNA-ribossomo-scFv) foram recuperados por separação magnética, en-quanto que complexos não-ligados foram removidos por lavagem. Os RNAmscodificando os scFvs ligados foram, a seguir, resgatados por RT-PCR confor-me descrito (Hanes et al., 2000) e o processo de seleção foi repetido comconcentrações decrescentes (100 nM - 10 pM durante 5 ciclos) de bio.IL-22H/F.
PCR propenso a erro foi introduzido pra aumentar ainda mais otamanho da biblioteca. A taxa de erro que foi empregada criou, em média,7,2 mutações por 1.000 pb depois de uma reação de PCR padrão baseadano método de Cadwell and Joyce (1992). Reações de PCR propensas a erroiniciais ocorreram entre o primeiro e segundo ciclo de seleção.
Bibliotecas de recombinação VhAZl para cada clone de origemforam preparadas a partir dos resultados de exibição de ribossomo e CDR(Vh e VL) depois ou do segundo ou do quarto ciclo de seleções. A porção Vhda produção de seleção de CDR Vh para uma linhagem particular foi especi-ficamente amplificada por PCR, usando iniciadores específicos de clone. Aporção Vl da produção de seleção de CDR Vl para a mesma linhagem foiamplificada separadamente. Esses dois produtos de PCR foram recombina-dos através de uma reação de PCR de sobreposição. Isso criou uma biblio-teca completa de produtos scFv contendo todos os componentes requeridospara outros ciclos de seleção de exibição de ribossomo.
Para alguns clones, as bibliotecas de exibição de fago tambémforam utilizadas. AS bibliotecas de fagos foram criadas por mutagênese deCDRs de cadeia única usando reações de PCR com iniciadores apropriados,e selecionados conforme descrito acima. Esses produtos também foramcombinados com produções de seleção de exibição de ribossomo para criarbibliotecas de recombinação VhAZl. As produções de seleção Vh do quartociclo de exibição de ribossomo, juntamente com as produções do terceirociclo de exibição de fago, foram recombinadas com as produções de Vl damesma linhagem. Isso foi conseguido usando iniciadores específicos de clo-nes e PCR de sobreposição para produzir bibliotecas de recombinaçãoVh/Vl. As seleções com bio.lL-22 H/F solúvel continuaram no formato deexibição de ribossomo, conforme descrito acima. As regiões scFv dos produ-tos de seleção foram direcionalmente clonadas em pCANTAB6 para a pro-dução de scFv para varredura de alta produtividade bioquímica.
Exemplo 6. Identificação de clones otimizados.
Dois ensaios foram usados para varreduras de alta produtivida-de de produtos de seleção. Os produtos derivados dos clones GIL01, GIL16e GIL68 foram varridos em um ensaio de fluorescência em tempo resolvido(HTRF®, Cis Biointernational), enquanto que os produtos de GIL60 e GIL92foram varridos em um ensaio DELFIA® (Perkin Elmer).
Ensaio de competição de epitopo HTRF®scFv bruto contendo sobrenadantes de cultura de clones produ-zidos de GIL01, GIL16 e GIL68 foram preparados conforme descrito acima evarridos quanto à inibição da ligação de bio.lL-22F/F GIL68 em um ensaioHTRF.
IgG GIL68 marcada com criptato (kit de marcação da Cis Biointer-national) foi diluída 400 vezes em um tampão de ensaio (PBS/KF 0.4M/BSA0,05%/Tween 0,05%), seguido pela adição de Estreptavidina XL665 7,5 nM(Xlent, Cis Biointernational). Essa solução foi misturada com amostra descFv bruto (diluído 125x) e bio.lL-22H/F em uma Optiplate de 384 cavidadespretos Packard (Perkin Elmer). As placas foram incubadas por 1 hora emtemperatura ambiente, a seguir foram lidas usando um leitor de placas Victor2® (Perkin Elmer). A proporção de emissão de 665 nM/620 nM foi usada pa-ra calcular a porcentagem de ligação específica em cada cavidade.DELFIA® Ensaio de fluorescência separada por tempo
Clones produzidos de GIL60 e GIL92 foram varridos quanto àinibição da ligação de bio.lL-22H/F a um complexo receptor de IL-22.
Placas de microtitulação foram revestidas com anticorpo docomplexo receptor de IL-22 (1 μg/mL em PBS) e incubadas por 1,5 hora emtemperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes em PBST e blo-queadas por 1 hora em temperatura ambiente com MPBS 2%. Depois demais 3 lavagens, o meio condicionado de célula diluída contendo um com-plexo receptor de IL-22 foi adicionado e incubado de um dia para o outro a4°C. Sobrenadantes de scFv bruto foram preparados conforme descrito aci-ma. No dia seguinte, 25 μί de amostra de scFv diluída e 25 μί de bio.IL-22H/F (6 ng/mL) foram adicionados às placas de lavagem, e incubados por 1,5hora em temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3 vezes em PBST,a seguir a ligação de bio.lL-22H/F ao complexo receptor de IL-22 foi detec-tada com Európio-Estreptavidina e o kit reagente DELFIA® (Perkin Elmer). Afluorescência separada por tempo foi medida usando um Leitor de PlacasVictor 2® (Perkin Elmer).
scFv purificados dos clones positivos identificados da varreduraforam testados no ensaio de competição de complexo receptor IL-22 DELFIA®conforme descrito acima. Uma titulação das concentrações de scFv foi usa-da para estabelecer a potência do clone conforme medida pelos valores deIC50 no ensaio. Os resultados da amostra estão mostrados na Figura 2. Ca-torze clones otimizados foram designados 097D09, 062A09, 062G05,087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08,355B06, 355E04 e 356A11.
Exemplo 7: Classificação de clones otimizados no Ensaio de Proliferação deBAF3-IL-22
Os ensaios de proliferação foram efetuados para avaliar a capa-cidade do anticorpo de bloquear a proliferação celular de BaF3 mediada porIL-22. As células BaF3 expressando hll_22R/hlL10R2 foram geradas pela co-transfecção das células BaF3 com hlL22R-GFP e hlL10R2-YFP. AS célulasBaF3 expressando tanto hIL22R quanto hIL10R2 (células receptoras deBaF3-IL-22) foram selecionadas e coletadas por FACS.
As células do receptor de BaF3-IL-22 foram rotineiramente man-tidas em RPM11640 com FBS 10% e IL-3 de murino 1 ng/mL. Imediatamenteantes da configuração do ensaio, as células foram lavadas 4 vezes no meiode ensaio (RPMI1640 com FBS 10%, penicilina 100 U/mL e 100μg/mL deestreptomicina), ressuspensas em meio de ensaio e incubadas a 37°C, 5%de CO2 por 6 a 8 horas. Para preparar as placas do ensaio, 100 μL de célu-las (1 χ 105 ml_ em meio de ensaio) foram adicionados aos 60 cavidadescentrais de uma placa de cultura de tecido de fundo plano de 96 cavidades(Costar). O teste das amostras de scFv ou IgG foi preparado pela diluição daamostra estoque em um meio de ensaio seguindo pela filtração através deum filtro de 0,22 μΜ. Diluções de 5 vezes em série das amostras foram pre-paradas em uma placa de diluição separada. As cavidades contendo as cé-lulas foram tratadas com 50 μL de amostra seguido por 50 μL de IL-22 hu-mana (40 ng/mL em meio de ensaio) e foram a seguir incubados por 40 ho-ras a 37°C em CO2 5%. As cavidades de controle incluíam somente meio eas células ou sozinhas ou na presença de IL-22 humana 10 ng/mL.
A proliferação celular foi detectada pela adição de 20 μL de AzulAlamar (Serotec) ás placas, seguido pela incubação por 5 horas ± 30 min a37°C em 5% de CO2. As placas foram misturadas por batidas leves para as-segurar um sinal constante através das cavidades antes da medição da fluo-rescência (excitação = 560 nm, emissão = 590 nm). Os valores de EC50 eIC50 foram estimados usando um ajuste de curva logístico de quatro parâme-tros (programa de computador Graphpad Prism) e foram usados para classi-ficar os anticorpos. Os dados de potência da amostra para scFvs e IgGs oti-mizados estão mostrados na Tabela 6.Tabela 6. Valores de IC50 de clones de scFv e IgG no ensaio de proliferaçãode BaF3-IL-22
<table>table see original document page 89</column></row><table>
* Clones derivados de GIL-92 foram testados como IgGs de li-nhagem germinativa.
Exemplo 8: criação de linhagens germinativas
Dados de seqüência para os seis clones de origem foram usa-dos para identificar a seqüência de linhagem germinativa mais próxima paraas cadeias pesada e leve de cada clone. Mutações apropriadas foram feitasusando técnicas de mutagênese direcionada a sítios padrão com os iniciadoresmutagênicos apropriados. A mutação das seqüências foi confirmada pela análi-se de seqüência. As seqüências para os clones de linhagem germinativa eseus scFv e domínios Vh e Vl estão mostradas na Tabela 7. scFv purificadodos clones de origem de linhagem germinativa foram testados no ensaio decompetição do complexo receptor IL-22 de ligação à IL-22 biotinilada conformedescrito anteriormente, para estabelecer a potência do clone conforme medidopelos valores de IC50 no ensaio. Os resultados estão resumidos na Tabela 8.<table>table see original document page 90</column></row><table><table>table see original document page 91</column></row><table><table>table see original document page 92</column></row><table>Tabela 8: Potências ScFv de clones de origem de linhagem germinativa e delinhagem não-germinativa no ensaio de competição do receptor de IL-22scFv clone de origem nM IC50 média no ensaio de competição de IL-22 <table>table see original document page 93</column></row><table>
Nove dos anticorpos otimizados foram tornados de linhagemgerminativa conforme descrito acima. Oito IgGs de linhagem germinativa foramtestadas no ensaio de proliferação de BaF3-IL-22 conforme descrito acima.Valores de IC50 dos anticorpos de um experimento representativo estãomostrados na Tabela 9.
As seqüências do anticorpo foram, a seguir, enviadas para GE-NEART North America (28 Kirk Bradden Rd. East, Toronto, ON1 CanadaM8Y2E6), onde elas foram sintetizadas para a expressão ótima em célulasCHO usando o algoritmo de otimização proprietário da GENEART.
Tabela 9. Potências de IgG de clones otimizados que se tornaram de linha-gem germinativa no ensaio de proliferação BaF3-IL-22R
<table>table see original document page 93</column></row><table>
* amostra continha precipitado
ND = não determinadoExemplo 9: Anticorpo inibe a secreção de GROa induzida por IL-22 de célu-las HT29
Os ensaios de GROa foram efetuados para avaliar a capacidadedo anticorpo de bloquear a secreção de GROa induzida por IL-22 das célu-las HT29. As células HT29 foram semeadas em placas de cultura de tecidode fundo plano de 96 cavidades (Corning Inc. Cat. N2 3595) em meio DMEM(DMEM + FBS 10% + 100 unidades/mL de penicilina e estreptomicina + glu-tamina 2 mM) a 5 χ 104/cavidade. 10 ng/mL de IL-22 foram misturados comanticorpo serialmente diluído em meio DMEM e incubadas por 30 min a37°C. 24 horas depois da semeadura, o meio foi removido a partir das célu-las HT29 e IL-22 pré-misturada e anticorpo foram adicionados às células naplaca de 96 cavidades.
Depois de 48 horas de incubação a 37°C com CO2 5%, o meiofoi coletado e a GROa secretada foi testada usando o kit de imunoensaioGROa humana (R&D Systems, Cat. DGROO), de acordo com as instruçõesdo fabricante. Os resultados estão apresentados na Figura 3.
Exemplo 10: Anticorpo se liga a e inibe diferentes espécies de IL-22
A reatividade de espécies cruzadas de anticorpos otimizadostornados de linhagem germinativa e de linhagem não-germinativa foram de-terminados como se segue: placas de ELISA (Costar, Cat. N2 3590) foramrevestidas de um dia para o outro com 1 μg/mL de IL-22 de rato, camundon-go ou ser humano ou IL-26 humana em tampão PBS. As placas foram lava-das com tampão PBST (Tween 20 0,05% em PBS) 3 vezes, a seguir blo-queadas com BSA 1% (Sigma A8918) / PBST por 1 h em temperatura ambi-ente. Os anticorpos foram adicionados em 1 μg/mL, incubados por 1 h a25°C. As placas foram lavadas, a seguir anticorpo IgG anti-humano de cabraconjugado com HRP (Southern Biotech Association, Cat. N2 2040-05) foi a-dicionado. As placas foram incubadas por 1 hora a 25°C, a seguir lavadascom PBST e desenvolvidas com TMB (KPL, Cat. N2 50-76-04) A reação foiinterrompida com H2SO4 0,18 M. As placas foram lidas em OD 450 nm. Osresultados estão apresentados na Figura 4.
Esses anticorpos também foram avaliados tanto no ensaio decélulas GROa quanto no ensaio de proliferação de BaFe-IL-22. Conformemostrado nas Tabelas 10(a) e 10(b), os anticorpos bloquearam a atividadeda sinalização de IL-22 humana, de macaco, de rato e camundongo atravésdo receptor de IL-22 humana. 356A11 e 368D04 também demonstraram rea-tividade de espécies cruzada contra IL-22 de murinos, ratos e macaco usan-do análise de interação bioespecífica em tempo real (BIA) conforme discuti-do adicionalmente no Exemplo 11.
Tabela 10a. Anticorpos IL-22 são altamente potentes para bloquear outrasespécies de IL-22 conforme mostrado no sistema de ensaio baseado emcélulas GROa. Os valores mostrados representam valores de IC50 em pM.
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Tabela 10b. Anticorpos IL-22 são altamente potentes para bloquear outrasespécies de IL-22 conforme mostrado no sistema de ensaio baseado emcélulas BaF3. Os valores mostrados representam os valores de IC50 em pM.
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Exemplo 11. Comparação das cinéticas de ligação entre anticorpos mono-clonais anti-IL-22 de rato e anticorpos monoclonais anti-IL-22 humanos
As cinéticas de ligação dos anticorpos anti-IL-22 monoclonaishumanos (356A11 e 368D04) e os anticorpos anti-l-22 monoclonais de rato(P3/3 (Ab-02) e P3/2 (Ab-04) de WO 2005/000897 e WO 02/068476) à IL-22humana foram avaliadas por análise de interação bioespecífica em temporeal (BIA) usando a tecnologia de ressonância de plásmon de superfície.
Para preparar a superfície do biossensor para os anticorpos mo-noclonais de rato, a proteína A/G (Pierce N- 21186, Rockford, IL) foi imobili-zada em um chip de carboximetildextran grau de pesquisa (CM5) usandoacoplamento com amina. A superfície foi ativada com EDC/NHS. A proteínaA/G foi injetada em uma concentração de 50 μς/ιηΙ- em tampão de acetatode sódio (pH 4,0). A imobilização foi feita usando as ferramentas peritas como alvo de 3000 (RUs) para a proteína A/G. Os grupos que permaneceramativados foram bloqueados co etanolamina 1,0 M (pH 8,0). O primeiro fluxode células foi usado como a superfície de referência para corrigir o índice derefração da massa, efeitos de matriz e ligação não-específica. O segundo,terceiro e quarto fluxo de células foram revestidos com a molécula de captu-ra. Os anticorpos monoclonais de rato Ab-02 e Ab-04, os quais se ligam àproteína A/G, foram capturados na superfície A/G da proteína pela injeçãode 30 μΐ_ de uma solução 1 μg/mL. A diferença líquida entre a linha de basee o ponto de aproximadamente 90 segundos depois de completar a injeçãode Ab-02 e Ab-04 foi usada para representar a quantidade de Iigante ligado.
Para preparar a superfície do biossensor para os anticorpos mo-noclonais humanos, ou o anticorpo monoclonal humano (356A11 ou368D04) ou o anticorpo de controle foram imobilizados em um chip de car-boximetildextran grau de pesquisa (CM5) usando o acoplamento de aminapadrão. A superfície foi ativada com EDC/NHS. Os anticorpos de capturaforam injetados em uma concentração de 1 μg/mL em tampão acetato desódio (pH 5,5). Os grupos remanescentes ativados foram bloqueados cometanolamina 1,0 M (pH 8,0). O primeiro fluxo de células foi usado como asuperfície de referência para corrigir o índice de refração da massa, efeitosde matriz e ligação não-específica. O segundo, terceiro e quarto fluxos decélulas foram revestidos com a molécula de captura.
Para Ab-02 e Ab-04, as soluções de IL-22 humana nas concen-trações de 300, 100, 50, 25, 12,5, 6,4, 3,2, 1,6 e 0 nM foram injetadas emtriplicatas em uma taxa de fluxo de 30 μΐ_ por minuto por 3 minutos e quanti-dade de material ligado em função do tempo foi registrada como sensorgra-mas. A fase de dissociação foi monitorada em tampão HBS/EP por 10 minu-tos na mesma taxa de fluxo seguido por uma injeção de 5 μΙ_ de TFA 0,1% euma injeção de 5 μL de glicina pH 1,5 para regenerar uma superfície de cap-tura completamente ativada.
Para 356A11 e 368D04, soluções de IL-22 humana a 400, 200,100, 50, 25, 12,5, 6,25 eOnM foram injetadas em triplicatas em uma taxa defluxo de 100 μL por minuto (fluxo elevado para evitar ligação não-específica)por 3 minutos, e a quantidade de material ligado em função do tempo foi re-gistrada como sensorgramas. A fase de dissociação foi monitorada em tam-pão NBS/EP por 60 minutos na mesma taxa de fluxo seguido por duas inje-ções de 5 μl. de glicina pH 1,5 para regenerar uma superfície de capturacompletamente ativa.
Todos os experimentos cinéticos foram feitos a 22,5°C em tam-pão HBS/EP. Os efeitos de branco e tampão foram subtraídos para cadasensorgrama usando o duplo referenciamento. Em experimentos de controlea primeira injeção continha tampão.
Os dados cinéticos foram analisados usando o programa decomputador BIAevaIuation 3.0.2 aplicado em um modelo 1:1. As constantesdas taxas de dissociação (Kd) e associação (Ka) aparente foram calculadas apartir das regiões apropriadas dos sensorgramas usando uma análise global.As constantes de afinidade da interação entre anticorpo e analito foram cal-culadas a partir das constantes de taxa cinética pelas seguintes fórmulas: Kd= Kd/Kg, onde K0 é a constante de dissociação, e Ka = KaZKd, onde Ka é aconstante de associação. Os dados de ligação para Ab-02 e AB-04 estãoresumidos nas Tabelas 11A e 11B. Os dados de ligação para 356A11 e368D04 estão resumidos na Tabela 12.
Tabela 11 A. Parâmetros cinéticos para a interação entre IL-22 humana eanticorpos anti-IL-22 Ab-02 e Ab-04
<table>table see original document page 97</column></row><table>Tabela 11 Β. Dados cinéticos de anticorpos monoclonais de rato para a IL-22humana
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Tabela 12 Β. Dados cinéticos de anticorpos monoclonais de rato para a IL-22humana
Esses resultados mostram que os anticorpos anti-IL-22 mono-clonais humanos dessa invenção têm uma afinidade significativamente maisalta para a IL-22 do que os anticorpos anti-IL-22 monoclonais de rato Ab-02e Ab-04, descritos na WO 2005/000897 e WO 02/068476 como tendo a ca-pacidade de neutralizar a IL-22 humana. Especificamente, a constante dedissociação de 356A11 (KD = 5,40 χ 10'11 M ou 0,054 nM) para a IL-22 hu-mana é de aproximadamente 1000 vezes e mais de 40 vezes maior do queas constantes de dissociação de Ab-02 (KD = 5,22 χ 10'8 M ou 52 nM) e Ab-04 (KD = 2,38 χ 10'9 M ou 2,38 nM), respectivamente. Semelhantemente,368D04 (KD = 1,32 χ 10"10 M ou 0,132 nM) teve uma afinidade aproximada-mente mais forte de 400 vezes e 18 vezes para a I-22 humana do que a Ab-02 e Ab-04, respectivamente. Os perfis de ligação de 356A11 e 36804 paraIL-22 de macaco, murino e rato foram similares àqueles da IL-22 humana(dados não apresentados).
As especificidades de ligação de 356A11 e 368D04 também fo-ram avaliadas usando ΒΙΑ. Nenhum anticorpo apresentou reatividde cruzadacom a IL-10 humana, a IL-19 humana, a IL-20 humana, a IL-24 humana, aIL-28A humana, a IL-29 humana, a IFN-oc2c humana ou a IFN-D humana(dados não apresentados).
Exemplo 12: Meia vida in vivo de anticorpos anti-IL-22 humana.
Os anticorpos anti-IL-22 humana da invenção têm meias-vidas
longas in vivo. Por exemplo, a meia vida in vivo tanto de 356A11 quanto de368D04 em camundongos DBA/1 foi de oito dias. Especificamente, uma úni-ca dose ou de 356A11 ou de 368D04 (16 mg/Kg) foi administrada intraperi-tonealmente a camundongos DBA/1. Os anticorpos 356A11 e 368D04 foramdetectados no soro de camundongo usando um ELISA IgGI humano. Osprogressos de tempo das concentrações de soro de 356A11 e de 368D04estão mostrados nas figuras 11A e B. Os parâmetros PK de 356A11 e368D04 estão resumidos na Tabela 13 abaixo.
Tabela 13. Parâmetros PK de 3536A11 e 368D04
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Exemplo 13. Tratamento de artrite
Artrite é uma doença caracterizada por inflamação nas juntas.Artrite reumatóide (RA) é a forma mais freqüente de artrite, envolvendo ainflamação do tecido conjuntivo e da membrana sinovial, uma membranaque se alinha com a junta. A membrana sinovial inflamada geralmente infiltraa junta e danifica o osso e a cartilagem da junta. Tanto a proteína IL-22quanto IL-22R e/ou o transcrito estão associados com a doença humana.Nas biópsias sinoviais de RA, a proteína IL-22 é detectada nos fibroblastossinoviais de vimentina* e alguns macrófagos CD68*, enquanto que a IL-22Ré detectada nos fibroblastos sinoviais. O tratamento dos fibroblastos sinovi-ais com a IL-22 induz a produção da proteína quimioatratora de monócitos 1,MCP-1, assim como a atividade metabólica geral (Ikeuchi, H. et al. (2005)Arthritis Rheum. 52: 1037 - 46).
IL-22 é usada para estudar o seu efeito nas células da membra-na sinovial, a membrana que se alinha com as juntas. Sinoviócitos tipo fibro-blasto humano (HFLS) (Cell Applications (San Diegor-CA)) são isolados dostecidos sinoviais de pacientes com artrite reumatóide sofrendo cirurgia dejunta. HFLS são cultivadas com IL-22 humana por 48 horas, e os sobrena-dantes são removidos e testados para quimiocinas e citocinas por ELISA. IL-22irá aumentar a secreção de HFLS de quimiocinas MCP-1, Eotaxina e IP-10,e citocinas TNFa, IL-6 e IL-8. Essas quimiocinas e citocinas são conhecidasna arte por promover a inflamação através de uma variedade de atividades,e concentrações aumentadas nas juntas causada pela inflamação exacerba-da de IL-22 e RA.
A capacidade do anticorpo humano anti-IL-22 humana de melho-rar os sintomas na artrite induzida por colágeno (CIA) foi examinada usandoos anticorpos 356A11 e 368D04. CIA é o camundongo padrão e modelo derato para estudar artrite reumatóide, vide, por exemplo, Holmdahl et al.,(2002) Ageing Res. Rev., 1:135. No dia O, camundongos DBA/1 machos(Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) foram injetados subcutaneamentena base do rabo com 100 μg de colágeno tipo Il bovino (Chondrex, Red-mond, WA) no adjuvante de Freund completo, e no dia 21, os camundongosforam "impulsionados" com 100 μg de colágeno tipo Il bovino no adjuvantede Freund incompleto.
Os camundongos foram monitorados pelo menos duas vezespor semana quanto à progressão da doença. A severidade da doença foiclassificada usando a avaliação da pata global como se segue: 0 = sem in-chaço, 1 = 1 a 2 dedos inchados ou tornozelo inchado, 2 = mais de 2 dedosinchados ou inchaço da pata brando, 3 = inchaço extensivo da pata e 4 =anquilose da pata. Camundongos injetados com um anticorpo de controle deisotipo depois das injeções de colágeno desenvolveram progressivamente adoença. O tratamento ou com 356A11 ou com 368D04 reduziu significativa-mente a progressão da doença. Esses foram estudos cegos de modo que osinvestigadores não sabiam que grupo de animais recebeu que anticorpo atéo final do estudo.
Várias doses de 356A11 e 368D04 foram avaliadas. Os trata-mentos de 356A11 e 368D04 (ou um anticorpo de controle de isotipo IgGUhumano) foram iniciados quando 10% dos camundongos no grupo de trata-mento tiveram uma pontuação de severidade de doença de pelo menos 1. Oanticorpo foi administrado em várias freqüências: dia sim dia não, uma vezpor semana ou duas vezes por semana, e os camundongos foram monitora-dos quanto à progressão da doença. A administração ou de 8 ou 16 mg. Kg'1de 356A11 dia sim dia não bloqueou significativamente a progressão de CIAem múltiplos estudos, conforme mostrado nas figuras 12A-B, 13 e 40-41.
Quatro estudos CIA separados (figuras 13A-D), testando com 8 mg Kg"1 de356A11 dia sim dia não mostram que o anticorpo 356A11 bloqueou consis-tentemente a progressão da doença no modelo CIA de murino. Surpreen-dentemente, a dosagem de duas vezes por semana e mesmo semanal com8 mg Kg1 de 356A11 também foi suficiente em vários estudos para bloquearsignificativamente a progressão da doença conforme mostrado nas figuras14-15, 41 e 44A-B.
No primeiro estudo CIA com 368D04 (administrado dia sim dianão em 16 mg Kg"1), foi observada pouca ou nenhuma eficácia. Entretanto, aadministração de 8 mg Kg'1 de 368D04 uma vez por semana em múltiplosestudos bloqueou significativamente a progressão da doença conforme mos-trado nas figuras 46A-C.
A capacidade do anticorpo anti-IL-22 humana de bloquear signi-ficativamente a progressão da doença quando administrado uma vez porsemana no modelo CIA indica que o anticorpo poderia ser administrado comuma freqüência de dosagem similar, ou ainda uma freqüência de dose adi-cionalmente estendida, tal como de uma em cada duas semanas, conformeadministrado em seres humanos.
Os efeitos do tratamento do anticorpo anti-IL-22 também foramavaliados pela análise histológica das patas. No fim do estudo, os animaisforam eutanasiados, as patas foram coletadas e fixadas em 10% de formali-na para a histologia, descalcificadas e embebidas em parafina para seccio-namento e manchamento com H&E padrão. As patas foram classificadas emum método de classificação de grau 5 (0 a 4) para caracterizar a intensidadee a extensão da artrite. Infiltrados inflamatórios foram usados para a classifi-cação, além de outras alterações relacionadas com a inflamação, tais comoformação de pannus, fibroso da membrana sinovial, erosin da cartilagemarticular e/ou destruição do osso subcondral. Os graus da histologia foramdeterminados usando leituras das patas individuais: NAD - 0 ou nada anor-mal descoberto; 1 = de leve a moderado; 2 = brando a moderado; 3 = acen-tuado; 4 = massivo. O efeito histológico da administração terapêutica dosanticorpos anti-IL-22 estão mostrados nas figuras 16A-F, 42A-C, 43 e 45A-B.
Conforme mostrado nas figuras 16A-F, 42A-C, 43 e 45A-B, a administraçãode 356A11 em vários estudos melhorou os sintomas de artrite induzida porcolágeno em camundongos. Semelhantemente, a administração de 368D04dia sim dia não em 8 mg Kg1 em vários estudos melhorou os sintomas deartrite induzida por colágeno em camundongos. Figuras 47A - C.
Além das avaliações histopatológicas, a destruição óssea emcamundongos tratados também foi examinada. No final do estudo, as patasforam fixadas na posição lateral e as chapas de raio-X foram tiradas em umamáquina Faxitron. Faxitron proporciona radiografias de raio-X de alta resolução,e a elevada capacidade de ampliação proporciona um desempenho de visuali-zação melhorado. As radiografias de Faxitron correlacionaram com as classifi-cações de avaliação da para grossa visual e mostraram que o tratamento como anticorpo anti-IL-22 preveniu a destruição óssea em comparação com o tra-tamento com o anticorpo de controle de isotipo (dados não mostrados).Exemplo 14: Detecção de IL-22 de soro por ELISA e detecção aumentadada IL-22 do soro in vivo com tratamento com 356A11
Até o momento, a detecção da expressão do gene da IL-22 so-mente foi reportada no nível do RNA. Com o ELISA descrito abaixo, a IL-22não é detectada em camundongos normais. Descobriu-se, contudo , queesse ELISA permite a detecção da IL-22 na circulação de camundongos ar-tríticos. Além disso, a administração do anticorpo 356A11 permite a detec-ção da IL-22 em níveis dez vezes ais elevados. O anticorpo 356A11 nas do-ses dadas seqüestra a citocina, neutralizando deste modo sua atividade con-forme demonstrado nos exemplos anteriores. Com a circulação desse anti-corpo na corrente sangüínea, a IL-22 seqüestrada por anticorpo é agora de-tectada em níveis mais altos com esse ELISA. Isso ocorre devido aos epito-pos únicos e distintos de captura e aos anticorpos detectores que constituemesse ELISA mlL-22. Esse ELISA detecta IL-22/356A11, IL-22BP/IL-22, IL-22ΒΡ/356Α11/IL-22 e IL-22 nu, equivalentemente.
No contexto dos estudos de CIA discutidos anteriormente (E-xemplo 13), camundongos artríticos foram tratados dia sim dia não com 16mg Kg"1 de anticorpo 356A11. No dia 30 depois do aumento de colágeno, osoro foi coletado dos camundongos depois do sacrifício. Os níveis de IL-22nas amostras de soro foram, a seguir, medidos por ELISA.
Para esse formato de ELISA, 1mGIL19P3/1, um anticorpo anti-IL-22 de murino monoclonal IgGIk de rato foi revestido em uma placa deELISA de microtitulação de 96 cavidades a ser usado como o anticorpo decaptura. As amostras de soro obtidas de camundongos artríticos foram diluí-das em série e, a seguir, adicionadas às placas de microtitulação revestidas.Depois de deixar as amostras incubarem com 1mGIL19P3/1 nas placas demicrotitulação, as placas foram lavadas e 2hmGIL19P3/5-bio, um anticorpoanti-IL-22 monoclonal lgG2ak de rato conjugado com biotina foi adicionadoàs placas como um anticorpo de detecção. Depois de outra etapa de incuba-ção e lavagem, a estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano silves-tre (HRP), a qual converte a tetrametilbenzidina (TMB) em um pigmento azule é quantificável com um espectrofotômetro foi adicionada, incubada e a pla-ca foi lavada. Depois da incubação final com TMB seguido pela adição deH2SO4 diluído para interromper a reação enzimática, a absorvância foi medi-da a 450 nm usando um espectrômetro. Alternativamente, e por causa doisotipo do anticorpo detector, lgG2ak de rato é distinta do isotipo do anticor-po de revestimento, e o anticorpo secundário conjugado com HRP que seliga ao anticorpo lgG2a de rato também pode ser usado. Usando esse ELI-SA sanduíche, demonstrou-se que a adição de quantidades crescentes oude mlL-22BP e/ou 356A11 não afeta a capacidade de detectar uma concen-tração fixa de IL-22 de murino. Esse ELISA tem sido usado para detectar aIL-22 no soro de camundongos depois de uma injeção de LPS i. p..
Quando camundongos CIA foram administrados com o anticorpo356A11, conforme indicado acima, a IL-22 foi detectada no soro em níveisvariando de cerca de 1 ng/mL até cerca de 9 ng/mL. Vide figura 17. Ao con-trário, os camundongos artríticos no grupo de tratamento de controle, rece-bendo um anticorpo de controle de isotipo IgG^ humano, registraram níveis invivo significativamente mais baixos de IL-22 (menos de 1 ng/mL). Vide figuras17 e 18. Deste modo, o anticorpo 356A11 captura a IL-22 in vivo para produzirum complexo anticorpo/citocina estabilizado circulante. Isso, por sua vez, per-mite a detecção da IL-22 in vivo com sensibilidade aumentada conforme mos-trado na Figura 16. Ao contrário das grandes quantidades de anticorpo usa-das no estudo acima, é proposto que 356A11 em níveis consideravelmentemais baixos também possa ser administrado e tenha o mesmo efeito.
Exemplo 15: Tratamento de psoríase
Os níveis de RNA de IL-22R e de IL-22 foram medidos em a-mostras de tecido pareadas (lesão vs. não-lesão) de pacientes psoriáticoshumanos usando PCR quantitativo. Esse estudo demonstrou que os níveisde IL-22 e de IL-22R foram supra-regulados em lesões psoriáticas. Figura19. Outras evidências implicam a IL-22 no desenvolvimento da psoríase. Porexemplo, camundongos transgênicos que expressam constitutivamente a IL-22 presente com a pele espessa, infiltrados de células imunes mononuclea-res, característica de lesões psoriáticas e morrem precocemente após a ge-ração. WO 03/083062. Semelhantemente, a administração da IL-22 em ca-mundongos induz o espessamento da pele e os infiltrados de células imunesmononucleares. WO 03/083062. IL-22 também inclui hiperplasia de querati-nócito humana, sugerindo um papel importante nos processos inflamatóriosda pele. Boniface et al., J. Immunol., 2005 174: 3695 - 3702.
O transplante xenogênico em camundongos SCID é um modeloreconhecido para estudar a psoríase, vide, por exemplo, Boehncke et al. Br.J. Dermatol. 2005, 153(4): 758 - 66. Sob anestesia local, pele rompida porlesão (espessura de cerca de 0,5 mm) é cortada de um paciente com psorí-ase em estágio de placa crônica. Enxertos de porções humanas são trans-plantados no dorso de camundongos SCID de 6 a 8 semanas de idade. Sãodadas 3 semanas para os camundongos aceitarem o enxerto e cicatrizarem.Aos 22 dias após o transplante, os camundongos são injetados intraperito-nealmente com 8 mg Kg"1 de anticorpos anti-IL-22 humanos, tal como087B03, 368D04, 354A08 ou 356A11, dia sim dia não. Como controle nega-tivo, os camundongos recebem aplicações intragástricas diárias de 200 μΐ_de PBS. Como controle positivo, os camundongos recebem a aplicação in-tragástrica diária de 2 mg Kg "1 de dexametasona em 200 μί de PBS. Oscontroles negativos desenvolvem marcas de psoríase, incluindo acantose,papilomatose, paraqueratose e um denso infiltrado mononuclear: os camun-dongos são sacrificados no dia 50 após o transplante e os enxertos com apele circundante são cortados. Metade do enxerto é fixada em formalina e aoutra metade é congelada em nitrogênio líquido. Manchamentos com hema-toxilina e eosina de rotina são efetuados e as alterações patológicas dos en-xertos são analisadas tanto qualitativamente (diferenciação epidérmica)quanto quantiativamente (espessura epidérmica, infiltrado inflamatório). Aespessura epidérmica média pode ser medida da ponta da saliência da redepara a margem da epiderme viável usando um micrômetro ocular. A densi-dade do infiltrado inflamatório pode ser determinada pela contagem da quan-tidade de células em três campos de força adjacentes. A progressão da do-ença pode ser avaliada usando a análise histológica para medir as marcasda psoríase, tais como acantose, papilomatose, paraqueratose, infiltradosinflamatórios e a aparência das camadas córnea e granular.
Camundongos de controle negativo injetados com PBS 200 μΙ_ou um anticorpo de controle emparelhado com isotipo após o transplante deenxerto desenvolveram progressivamente a psoríase. Devido ao fato daslesões psoriáticas expressarem altos níveis de IL-22, espera-se que o trata-mento com anticorpos anti-IL-22, por exemplo, com 087B03, 368D04,354A08 ou 356A11 de linhagem germinativa surpima ou retarde a psoríase,conforme confirmado no estudo de transferência adotiva reportado abaixo.
A transferência adotiva de células CD4+CD45rbhigh T em ca-mundongos scid/scid é outro modelo reconhecido para estudar a psoríaseem camundongos. Hong et al., J. Immunol, 162(1): 7480 - 91 (1999). Nessemodelo, a co-administração de LPS e IL-12 ou de enterotoxina estafilocócicaB em camundongos scid/scid 1 dia depois da transferência adotiva de célu-las CD4+CD45rbhigh T inclui lesões de pele exibindo as marcas observadasna psoríase humana.Usando uma leve modificação desse modelo, célulasCD4+CD45rbhigh T foram transferidas para camundongos scid/scid com ousem a co-administração de LPS e IL-12 no dia um após a transferência ado-tiva. Células CD4+CD45rbh'sh T foram capazes de induzir lesões psoriáticasquando transferidas para camundongos scid/scid mesmo quando elas foramadministradas sem LPS e IL-12. Deste modo, a administração da IL-12 e deLPS depois da transferência adotiva não aparentou alterar a eficácia dosanticorpos anti-IL-22 nesse modelo.
Células para transferência adotiva foram preparadas conformedescrito anteriormente com leve modificação. Baços foram coletados de ca-mundongos doadores BALB/cBy de 6 a 8 semanas de idade (Jackson Labo-ratory, Bar Harbor, Maine) e os esplenócitos foram isolados por homogenei-zação mecânica de baços inteiros. As células CD4+ T foram selecionadasusando o kit de enriquecimento CD4 de murino (R&D) de acordo com as ins-truções do fabricante. Células T CD4 enriquecidas foram marcadas com anti-CD4-PE (Pharmingen), anti-CD45RB-FITC e anti-CD25-APC (Pharmingen). Ascélulas foram selecionadas usando um selecionador de células Moflo (BectonDickinson, San Jose, CA). Células CD4+CD45Rbhi9hCD25 foram coletadas e es-tavam com > de 95% de pureza. As células foram ressuspensas em solução sa-lina a 2 χ 106 células/mL e 4 χ 105 células foram injetadas i. p. em camundongosC.B-17/Prkdc scid/scid (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine). Em algunscasos, 10 ng de IL-12 e 20 ug de LPS foram administrados i. p. nos camun-dongos receptores que receberam células CD4+CD45Rbhigh no dia 1 e umadose adicional de IL-12 foi administrada no dia 3. Os camundongos foramdosados com 16 mg/Kg ou de um anticorpo de controle de isotipo ou comanticorpos anti-IL-22 (356A11 ou 368D04) no dia da transferência adotiva euma vez por semana a partir daí durante 10 semanas. Os camundongos fo-ram monitorados quanto a sintomas clínicos ou lesões de pele duas vezespor semana. No final do estudo, a orelha, pele, gânglios linfáticos e baço doscamundongos foram coletados para estudos ex vivo adicionais.
Avaliação clínica
Os camundongos foram avaliados por investigadores "cegos"duas vezes por semana, iniciando em 10 dias após a transferência adotiva.Para registrar a progressão da doença,classificações clínicas semi-quantitativas de 0 a 6 foram dadas baseando-se na aparência física: 0 = semsintomas na pele ou orelha; 0,5 = leve eritema na orelha ou opérculo ocular,1 = eritema brando, moderado nas orelhas ou opérculos oculares com leveespessamento da orelha (< de 2% da superfície corporal); 2 = eritema demoderado a severo em 2 a 10% da superfície corporal, escamação branda;3 = eritema severo e escamação em 10 a 20% da superfície corporal; 4 =eritema muito severo, extensivo e escamação em 20% a 40% da superfíciecorporal; 5 = eritema muito severo, extensivo e escamação em 40% a 60%da superfície corporal; 6 = eritema muito severo e extensivo e escamaçãoem mais de 60% da superfície corporal. Foram notadas observações especí-ficas baseando-se na condição da pele, manifestações da orelha, aparênciado opérculo ocular e presença de inflamação nos membros e rabo.
No estudo sem a co-administração de LPS e IL-12, os anticorpos356A11 e 368D04 suprimiram significativamente a inflamação da pele, emcomparação com camundongos tratados com anticorpo de controle, inician-do tão cedo quanto no dia 21 para 356A11 e no dia 35 para 368D04 (figuras20A - B). Resultados similares foram observados no estudo com a co-administração de LPS e IL-12 no dia um após a transferência adotiva, com356A11 e 368D04 suprimindo significativamente as lesões da pele, em com-paração com o anticorpo de controle, iniciando tão logo quanto no dia 28após a transferência adotiva, (figuras 27A e B). Em um estudo separado,356A11, sem (figuras 34A - B) ou com (figuras 37A - B) a co-administraçãode LPS e IL-12 no dia um após a transferência adotiva, suprimiu significati-vamente a inflamação da pele, em comparação com os camundongos trata-dos com anticorpo de controle, iniciando tão logo quanto no dia 21.
Detecção de citocina
Soro ou sobrenadantes de camundongo da cultura celular foramquantificados para IL-6, IFNy e TNFa usando um kit de ELISA (R&D Sys-tem). ELISA para heterodímero de IL-17 A/F, IL-22, IL-17A e IL-17F envolve-ram o revestimento de uma placa de fundo plano de 96 cavidades (Costar)de um dia para o outro a 4°C com 100 μΙ_ de uma solução 2 μς)/ηΊΐ_ de anti-corpo anti-IL-22 (Ab-01), anti-IL-17A (R&D), ou anti-IL-17F (RK015-01) emPBS. As placas foram, a seguir, lavadas com PVS/Tween (Tween 20 0,05%em PBS) e bloqueadas com 200 μΐ_ de PBS mais BSA 1% por 1 h em tem-peratura ambiente. Os anticorpos para a IL-22 de murino (Ab-01, Ab-02 eAb-03) e IL-17F de murino (RK015-01) foram gerados pelos métodos descri-tos em Li et al., Int. Immunopharmacol. 4: 693 - 708 (2004). Entre todos ospassos seguintes, as placas foram lavadas com PBS/Tween. Padrões de IL-22(R&D), IL-17A (R&D), IL-17F e IL-17A/F, sobrenadantes de amostra e amos-tras de soro (diluídas com PBS 1:5) foram, a seguir, adicionadas. Anticorpossecundários biotinilados para anti-IL-22 (Ab-03), anti-IL-17A (R&D) e anti-IL-17F (RK015-01) foram a seguir adicionados nas respectivas placas a 0,5μg/mL em solução BSA/PBS 1% e incubadas por 1 h a 37°C. Estreptavidinapolimarcada com HRP (Pierce) foi adicionada de acordo com as instruçõesdo fabricante por 15 minutos. A placa foi desenvolvida pela adição do subs-trato TMB por 15 a 30 minutos. O ensaio foi, a seguir, lido em um leitor deplacas da Molecular Devices (Sunnyvale, CA) e os dados foram analisadosusando o programa de computador SOFTmax.
No estudo sem a co-administração de LPS e IL-12, níveis maisaltos de IL-22 de soro foram detectados em camundongos tratados com356A11 do que em camundongos tratados com anticorpo de controle, indi-cando que 356A11 captura e estabiliza a IL-22 in vivo (figura 21), conformediscutido no Exemplo 14. Resultados similares também foram observadosem camundongos tratados com 356A11 com a co-administração de LPS eIL-12 no dia um após a transferência adotiva (figura 28). Esses resultadosforam replicados em um estudo separado com 356A11 sem (figura 35) ecom (figura 38) a co-administração de LPS e IL-12 no dia um após a transfe-rência adotiva. IL-22 do soro não foi detectada em camundongos tratadoscom 368D04 (figura 21).
No estudo sem a co-administração de LPS e IL-12, níveis desoro significativamente mais baixos de IL-17F, IL-17A, IL-17A/F foram detec-tados em camundongos tratados com 356A11 e 368D04 (figuras 22A - C).Também foi observada uma tendência de redução dos níveis de IL-6 do soroem camundongos tratados com 356A11 e 368D04 (figura 22D). IFNy e TNFaestavam abaixo do limite de detecção no soro de camundongos tratados comcontrole, anticorpos 356A11 ou 368D04. Resultados similares também foramobservados em camundongos tratados com 356A11 com a co-administraçãode LPS e IL-12 no dia um após a transferência adotiva, (figuras 29 A - D).Em um estudo separado, níveis de soro significativamente mais baixos deIL-17A e IL-6 também foram observados em camundongos tratados com356A11 sem (figuras 39 A - B) e com (figuras 39 C - D) a co-administraçãode LPS e IL-12 no dia um após a transferência adotiva.
Isolamento e estimulação de células do gânglio linfático
Lesões psoriáticas nesse modelo geralmente progridem da ore-lha, olho, face e pescoço para o resto do corpo. Camundongos tratados comterapêuticos geralmente desenvolvem lesões de pele moderadas somenteao redor do olho e orelha. Conseqüentemente, gânglios linfáticos cervicaisque drenam a face foram isolados de cada camundongo para obter a quanti-dade mais alta de células ativadas. Células do gânglio linfático (LN) foramrecuperadas por homogeneização mecânica. As células LN foram reunidasde cerca de 9 a 10 camundongos por grupo e ressuspensas a 1 χ 106/mL emmeio RPMI 1640 completo suplementado com FBS 10% (HyCIone), 5 χ 10"5M 2-ME (Sigma), glutamina 2 mM (Life Technologies, Gaithersburg, MD), 10U/mL de penicilina, 100 μg de estreptomicina (Life Technologies) e HEPES15 mM. Um total de 200 μg/cavidade dessa suspensão foram então coloca-dos em uma placa de 96 cavidades e estimulados com anti-CD3 mais anti-CD28 (1 μg/mL cada) por 48 horas.
Manchamento com citocina intracelular
Para examinar os efeitos da neutralização da IL-22 na populaçãode células T efetoras, o manchamento com citocina intracelular foi efetuadonas células do gânglio linfático da cervical. As células foram estimuladascom 50 ng/mL de PMA (Sigma 1), 1 μg/mL de ionomicina (Sigma) e Golgi-Plug (Pharmingen) por 12 horas. As células foram primeiramente manchadaspara o antígeno de superfície (CD4) e, a seguir, foram tratadas com Cytofix/Cytoperm (Pharmingen) de acordo com as instruções do fabricante. O man-chamento com citocina intracelular foi efetuado usando anticorpos paraIFNy, IL-22, IL-17A, IL-17F, TNFa e controles de isotipo de IgG relevantes.Anti-IL-22 (Ab-02) foi marcado com Alexa 647 (Molecular Probes) e anti-IL-17F (RK015-01) foi marcado com FITC (Pierce Biotechnologies) de acordocom as orientações do fabricante.
As células foram analisadas em uma população CD4+ bloquea-da. Os resultados da análise FACS mostram que em camundongos tratadoscom 356A11 e 368D04 (sem a co-administração de LPS e IL-12) houveramporcentagens mais baixas de células T CD4+ produzindo IL-22, IL-17A etanto IL-22 quanto IL-17F, porém porcentagens mais altas de células TCD4+ produzindo IFNy em comparação com os camundongos tratados comcontrole de isotipo (figura 23). Resultados similares também foram observa-dos em camundongos tratados com 356A11 com a co-administração de LPSe IL-12 no dia um após a transferência adotiva, (figura 31).Quantificação de transcritos de citocina
RNA foi isolado das orelhas de camundongo em células LN (de-pois da estimulação) usando o kit Qiagen Rneasy (Qiagen). PCR quantitativopara transcritos de citocina foi efetuado usando iniciadores e sondas pré-qualificadas (Applied Biosystems). O método AACt foi usado para normalizaro transcrito para GAPDH e para calcular a indução do dobramento em rela-ção aos camundongos de controle.
Os resultados de PCR quantitativo usando RNA de camundongode orelhas de camundongo mostram que os camundongos tratados com356A11 e 368D04 tinham expressão do gene de IL-22, IL-17F, IL-17A e IL-6mais baixa, porém expressão de IFNy aumentada em comparação com ca-mundongos tratados com o anticorpo de controle (figuras 24A - E). Resulta-dos similares também foram observados em camundongos tratados com356A11 com a co-administração de LPS e IL-12 no dia um após a transfe-rência adotiva (figuras 30A - E). Esses resultados foram replicados em umestudo separado com 356A11 (sem a co-administração de LPS e IL-12), on-de também foi observado que camundongos tratados com 356A11 tinhamexpressão de gene da proteína 6 da família de IL-1 reduzida (IL-1F6) e pro-teína de ligação à IL-22 e expressão do gene da subunidade do receptor daIL-22 inalteradas, em comparação com camundongos tratados com o anti-corpo de controle (figuras 36A - H).
Os resultados de PCR quantitativo usando RNA de células do
gânglio linfático, estimuladas com anti-CD3 e anti-CD28 por 48 h, conforme des-crito acima, mostram que 356A11 e 368D04 suprimiram a expressão do gene daIL-22, IL-6, IL-17A e IL-17F ex vivo, porém não afetaram alterações significativasna expressão do gene de IFNy. (figuras 26 A - E). Resultados similares foramobservados em camundongos tratados com 356A11 com a co-administração deLPS e IL-12 no dia um após a transferência adotiva (figuras 33A - E).
Os sobrenadantes das células do gânglio linfático estimuladascom anti-CD3 e anti-CD28, conforme descrito acima, foram coletadas para aanálise de citocina usando kits de ELISA (R&D System) conforme discutidoanteriormente. Os resultados do ELISA de citocinas espelharam os dados deexpressão do gene LN, mostrando que 356A11 e 368D04 suprimiram a se-creção ex vivo de IL-22, IL-6, IL-17A e IL-17F, porém não produziram altera-ções significativas na secreção de IFNya partir de células estimuladas, (figu-ras 25A - F). Resultados similares foram observados em camundongos tra-tados com 356A11 com a co-administração de LPS e IL-12 no dia um após atransferência adotiva (figuras 32A - E).
Análise histopatológica
As necrópsias foram efetuadas em tecido de camundongo notérmino do estudo in vivo. Amostras teciduais da pele cortada de orelha fo-ram coletadas e fixas em solução de formalina 10% para preparação de se-ção e análise. Para registrar a severidade da doença, classificações histoló-gicas semiquantitativas de O a 5 foram atribuídas na severidade da inflama-ção. A avaliação histológica foi efetuada de um modo "cego" por um patolo-gista amplamente certificado. O = no limite normal; 1 = mínimo; 2 = branco; 3= moderado; 4 = acentuado; e 5 = severo.
Análise imunoistoquímica
Amostras teciduais foram coletadas e embebidas no composto Tis-sue Tek OCT(Miles, Elkhurt, IN) e congeladas em gelo seco para seções de cor-te criostato. As seções teciduais (5 μπι) foram fixadas em acetona 100% e man-chadas com anticorpos anti-CD4, anti-CD1 1B e antineutrófilos (PharMingen). Ostecidos foram avaliados como negativo = 0, brando = 1, moderado = 2 e severo=3 baseando-se na detecção por microscopia fluorescente visual.
Descrições histológicas demonstram que camundongos tratadoscom 356A11 e 368D04 experimentaram menor proliferação de queratinóci-tos, estacas em rede e infiltrados de células inflamatórios na pele em compa-ração com o tratamento de controle de isotipo. Adicionalmente, resultadosimunoistoquímicos mostraram que 356A11 reduziu a quantidade de CD4+,CD11B+ (macrófagos) e neutrófilos nas camadas epidérmica, dérmica esubcutânea. Os resultados histológicos espelharam aqueles das descriçõesclínicas e suportaram os antagonistas de IL-22, tais como os anticorpos des-sa invenção como agentes terapêuticos para o tratamento da psoríase e ou-tras doenças de pele tipo psoríase.
Os resultados globais demonstram que os anticorpos dessa in-venção, tais como 087B03, 368D04, 354A08 ou 356A11 são eficazes nessemodelo de murino de psoríase e indicam que o tratamento com anticorposanti-IL-22, incluindo 087B03, 368D04, 354A08 ou 356A11, proporciona umaestratégia eficaz para a intervenção terapêutica na psoríase humana.
Exemplo 16: Tratamento de pacientes
Pacientes com um distúrbio auto-imune, distúrbio respiratório,condição inflamatória da pele, sistema cardiovascular, sistema nervoso, rins,fígado e pâncreas ou pacientes transplantados estão dentre o tipo de paci-entes que pode ser tratado com os anticorpos da invenção. Regimes de tra-tamento exemplares e resultados esperados são fornecidos abaixo. As do-sagens e freqüências de administração diferentes daquelas na Tabela 14também podem ser usadas. O versado na técnica pode ajustar os regimesde tratamento conforme necessário baseando-se na via de administração ouem outras variáveis conhecidas, tais como a idade, peso, condição, sexo,severidade da condição médica, etc. do paciente a ser tratado.Tabela 14: regimes de tratamento
<table>table see original document page 113</column></row><table>A especificação é mais completamente entendida à luz dos en-sinamentos das referências citadas na especificação. As modalidades daespecificação proporcionam uma ilustração das modalidades da invenção enão devem ser construídas para limitar o escopo da invenção. O versado natécnica prontamente reconhece que muitas outras modalidades são englo-badas pela invenção. Todas as publicações e patentes citadas nessa descri-ção são incorporadas por referência na sua totalidade. Até a extensão domaterial incorporado por referência contradizer ou ser inconsistente com es-se relatório descritivo, o relatório descritivo irá superceder qualquer tal mate-rial. A citação de quaisquer referências aqui não é uma admissão de que taisreferências são técnica anterior à presente invenção.
A não ser que seja indicado de outra forma, todos os númerosexpressando quantidades de ingredientes, condições reacionais e assim pordiante usados no relatório descritivo, incluindo as reivindicações, são paraserem entendidos como sendo modificados em todos os exemplos pelo ter-mo "cerca de". Concordantemente, a não ser que seja indicado de outro mo-do ao contrário, os parâmetros numéricos são aproximações e podem variardependendo das propriedades desejadas que se procure obter pela presenteinvenção. Por último, e não como uma tentativa de limitar a aplicação dadoutrina de equivalentes para o escopo das reivindicações, cada parâmetronumérico deve ser construído à luz do número de dígitos significativos e a-proximações de arredondamento normais.
A não ser que seja indicado de outra forma, o termo "pelo me-nos" precedendo uma série de elementos é para ser entendido como se re-ferindo a todo elemento na série. As pessoas versadas na técnica irão reco-nhecer, ou ser capazes de determinar usando nada além do que a experi-mentação rotineira muitos equivalentes das modalidades específicas da in-venção aqui descrita. Tais equivalentes são tencionados a serem engloba-dos pelas seguintes reivindicações.

Claims (31)

1. Método para tratar ou prevenir um distúrbio associado com aIL-22 em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de umanticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que se ligaespecificamente à IL-22 humana, em uma quantidade suficiente para inibirou reduzir a atividade celular imune no indivíduo, deste modo tratando ouprevenindo o distúrbio, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antí-geno do mesmo compreende um domínio Vh compreendendo pelo menosuma região variável de cadeia pesada e um domínio Vl compreendendo pelomenos uma região variável de cadeia leve de qualquer uma das seqüênciasdentre SEQ ID NO: 11, 12, 13, 29, 30, 31, 47, 48, 49, 65, 66, 67, 83, 84, 85,-101, 102, 103, 119, 120, 121, 137, 138, 139, 155, 156, 157, 173, 174, 175,-191, 192, 193, 209, 210, 211, 227, 228, 229, 245, 246, 247, 263, 264, 265,-281, 282, 283, 299, 300, 301, 317, 318, 319, 335, 336, 337, 371, 372, 373,-389, 390, 391, 407, 408, 409, 425, 426, 427, 443, 444, 445, 461, 462, 463,-479, 480, 481, 497, 498, 499, 515, 516, 517, 533, 534, 535, 551, 552, 553,-569, 570, 571, 587, 588, 589, 605, 606, 607, 623, 624 ou 625.
2. Método para tratar ou prevenir um distúrbio associado com aIL-22 em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de umanticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que se ligaespecificamente à IL-22 humana, em uma quantidade suficiente para inibirou reduzir a atividade celular imune no indivíduo, deste modo tratando ouprevenindo o distúrbio, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antí-geno do mesmo compreende um domínio Vl compreendendo pelo menosuma região variável de cadeia leve e um domínio Vh compreendendo pelomenos uma região variável de cadeia pesada de qualquer uma das seqüên-cias dentre SEQ ID NO: 8, 9, 10, 26, 27, 28, 44, 45, 46, 62, 63, 64, 80, 81,-82, 98, 99, 100, 116, 117, 118, 134, 135, 136, 152, 153, 154, 170, 171, 172,-188, 189, 190, 206, 207, 208, 224, 225, 226, 242, 243, 244, 260, 261, 262,-278, 279, 280, 296, 297, 298, 314, 315, 316, 332, 333, 334, 350, 351, 352,-368, 369, 370, 386, 387, 388, 404, 405, 406, 422, 423, 424, 440, 441, 442,-458, 459, 460, 476, 477, 478, 494, 495, 496, 512, 513, 514, 530, 531, 532,-548, 549, 550, 566, 567, 568, 584, 585, 586, 602, 603, 604, 620, 621 ou 622.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menosuma região variável de cadeia pesada compreende qualquer uma dentre asSEQ ID NO: 8, 9, 10, 26, 27, 28, 44, 45, 46, 62, 63, 64, 80, 81, 82, 98, 99,-100, 116, 117, 118, 134, 135, 136, 152, 153, 154, 170, 171, 172, 188, 189,-190, 206, 207, 208, 224, 225, 226, 242, 243, 244, 260, 261, 262, 278, 279,-280, 296, 297, 298, 314, 315, 316, 332, 333, 334, 350, 351, 352, 368, 369,-370, 386, 387, 388, 404, 405, 406, 422, 423, 424, 440, 441, 442, 458, 459,-460, 476, 477, 478, 494, 495, 496, 512, 513, 514, 530, 531, 532, 548, 549,-550, 566, 567, 568, 584, 585, 586, 602, 603, 604, 620, 621 ou 622.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 3, em que o domínio Vl compreende a seqüência de aminoácidos de qual-quer uma dentre as SEQ ID NO: 6, 24, 42, 60, 78, 96, 114, 132, 150, 168,-186, 204, 222, 240, 258, 276, 294, 312, 330, 348, 366, 384, 402, 420, 438,-456, 474, 492, 510, 528, 546, 564, 582, 600 ou 618.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 4, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo,compreende um domínio Vh com a seqüência de aminoácidos de qualqueruma dentre as SEQ ID NO: 5, 23, 41, 59, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 85,-203, 221, 239, 257, 275, 293, 331, 329, 347, 365, 383, 401, 419, 437, 455,-473, 491, 509, 527, 545, 563, 581, 599 OU 617.
6. Método, de acordo com a reivindicação 3, em que o domínioVh compreende a seqüência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ IDNO: 5, 23, 41, 59, 77, 95, 113, 131, 149, 185, 221, 239, 257, 275, 331, 329,-365, 383, 401, 419, 437, 455, 473, 509, 527, 563 ou 581 e o domínio Vlcompreende a seqüência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO:-6, 24, 42, 60, 78, 96, 114, 132, 150, 186, 222, 240, 258, 276, 312, 330, 366,-384, 402, 420, 438, 456, 474, 510, 528, 564 ou 582.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o domínioVh compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 167 ou 491 e odomínio Vl compreende a seqüência da SEQ ID NO: 168 ou 492.
8. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o domínioVh compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 293 ou 545 e odomínio Vl compreende a seqüência da SEQ ID NO: 294 ou 546.
9. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o domínioVh compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 203 ou 617 e odomínio Vl compreende a seqüência da SEQ ID NO: 204 ou 618.
10. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o domínioVh compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 347 ou 599 e odomínio Vl compreende a seqüência da SEQ ID NO: 348 ou 600.
11. Método para tratar ou prevenir um distúrbio associado com aIL-22 em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de umanticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que se ligaespecificamente à IL-22 humana, em uma quantidade suficiente para inibirou reduzir a atividade celular imune no indivíduo, deste modo tratando ouprevenindo o distúrbio, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antí-geno do mesmo se liga especificamente à IL-22 humana, e tem uma cons-tante de associação para a IL-22 humana de pelo menos 1010 M"1.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que a cons-tante de associação para a IL-22 humana é de pelo menos 1011 M"1.
13. Método para tratar ou prevenir um distúrbio associado com aIL-22 em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de umanticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que se ligaespecificamente à IL-22 humana, em uma quantidade suficiente para inibirou reduzir a atividade celular imune no indivíduo, deste modo tratando ouprevenindo o distúrbio, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antí-geno do mesmo bloqueia a proliferação de células BAF3 mediada pela IL-22com uma IC50 de 150 pM ou menos, em que as células BAF3 compreendemum receptor da IL-22 humano.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que o anti-corpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo bloqueia a proliferaçãode células BAF3 mediada pela IL-22 com uma IC50 de 100 pM ou menos.
15. Método de tratamento ou prevenção de um distúrbio associ-ado com a IL-22 em um indivíduo, compreendendo a administração ao indi-víduo de um anticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo,que se liga especificamente à IL-22 humana, em uma quantidade suficientepara inibir ou reduzir a atividade celular imune no indivíduo, deste modo tra-tando ou prevenindo o distúrbio, em que o anticorpo ou fragmento de ligaçãoa antígeno do mesmo bloqueia a secreção de GROa das células HT29 me-diada pela IL-22 com uma IC5o de 1 nM ou menos.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que o anti-corpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo bloqueia a secreção deGROa das células HT29 mediada pela IL-22 com uma IC50 de 150 pM oumenos.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 16, em que o distúrbio associado com a IL-22 é escolhido dentre doençado intestino inflamatória, pancreatite, esclerose múltipla, artrite reumatóide,lúpus eritematoso sistêmico, HIV, síndrome de Sjogren, artrite reumatóidejuvenil, osteoartrite, artrite psoriática, espondilite anquilosante, psoríase, re-jeição de transplante e doença de Crohn.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, compreendendo ainda a administração ao indivíduo de outro agenteterapêutico escolhido dentre um inibidor de citocina, um inibidor do fator decrescimento, um imunossupressor, um agente antiinflamatório, um inibidormetabólico, um inibidor enzimático, um agente citotóxico e um agente citos-tático.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, em que o agenteterapêutico é escolhido de um antagonista de TNF, um antagonista da IL-12,um antagonista da IL-15, um antagonista da IL-17, um antagonista da IL-18,um antagonista da IL-19, um antagonista da IL-20, um antagonista da IL-21,um antagonista da IL-23, um agente de depleção de células B, metotrexato,leflunomida, sirolimus (rapamicina) ou um análogo seu, um inibidor da Cox-2, um inibidor da cPLA2, um AINES e um inibidor da p38.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, em que o indivíduo é um mamífero.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 19, em que o indivíduo é um ser humano.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 19, em que o anticorpo é administrado em uma faixa escolhida de 1pg/Kg a 20 mg/Kg, 1 pg/Kg a 10 mg/Kg, 1 pg/Kg a 1 mg/Kg, 10 pg/Kg a 1mg/Kg, 10 pg/Kg a 100 pg/Kg, 100 pg a 1 mg/Kg, 250 pg/Kg a 2 mg/Kg, 250pg/Kg a 1 mg/Kg, 500 pg/Kg a 2 mg/Kg, 1 mg/Kg a 5 mg/Kg, 5 mg/Kg a 10mg/Kg, 10 mg/Kg a 20 mg/Kg, 10 mg/Kg a 25 mg/Kg e 20 mg/Kg a 30mg/Kg.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 22, em que o distúrbio associado com a IL-22 é artrite, doença do intesti-no inflamatória e psoríase.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, em que o distúr-bio associado com a IL-22 é artrite reumatóide.
25. Método, de acordo com a reivindicação 23, em que o distúr-bio associado com a IL-22 é psoríase.
26. Método de tratamento ou prevenção de um distúrbio hiper-proliferativo, em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduode um anticorpo, ou de um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, quese liga especificamente à IL-22 humana, em uma quantidade suficiente parainibir ou reduzir a hiperproliferação das células responsivas à IL-22 e/ou daIL-22R e/ou da IL-10R2 no indivíduo, e permitindo que o anticorpo trate ouprevina o distúrbio, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação a antígenodo mesmo, compreende pelo menos uma região variável de cadeia pesadade qualquer uma das SEQ ID NO: 8, 9, 10, 26, 27, 28, 44, 45, 46, 62, 63, 64,-80, 81, 82, 98, 99, 100, 116, 117, 118, 134, 135, 136, 152, 153, 154, 170,-171, 172, 188, 189, 190, 206, 207, 208, 224, 225, 226, 242, 243, 244, 260,-261, 262, 278, 279, 280, 296, 297, 298, 314, 315, 316, 332, 333, 334, 350,-351, 352, 368, 369, 370, 386, 387, 388, 404, 405, 406, 422, 423, 424, 440,-441, 442, 458, 459, 460, 476, 477, 478, 494, 495, 496, 512, 513, 514, 530,-531, 532, 548, 549, 550, 566, 567, 568, 584, 585, 586, 602, 603, 604, 620,-621 ou 622.
27. Método de tratamento ou prevenção de um distúrbio associ-ado com a IL-22, em um indivíduo, compreendendo a administração ao indi-víduo de um anticorpo, ou de um fragmento de ligação a antígeno do mes-mo, que se liga especificamente a um epitopo da IL-22 que é reconhecidopor GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05,-087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08,-355B06, 355E04 ou 356A11, de modo que o anticorpo inibe completamentea ligação de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09,-062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10,-354A08, 355B06, 355E04, ou 356A11 à IL-22 humana, em uma quantidadesuficiente para inibir ou reduzir a atividade das células imunes no indivíduo,deste modo tratando ou prevenindo o distúrbio.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, em que o anti-corpo se liga especificamente a um epitopo da IL-22 que é reconhecido por-087B03, de modo que o anticorpo iniba competitivamente a ligação de-087B03 na IL-22 humana.
29. Método, de acordo com a reivindicação 27, em que o anti-corpo se liga especificamente a um epitopo da IL-22 que é reconhecido por-354A08, de modo que o anticorpo iniba competitivamente a ligação de-354A08 na IL-22 humana.
30. Método, de acordo com a reivindicação 27, em que o anti-corpo se liga especificamente a um epitopo da IL-22 que é reconhecido por-368D04, de modo que o anticorpo iniba competitivamente a ligação de-368D04 à IL-22 humana.
31. Método, de acordo com a reivindicação 27, em que o anti-corpo se liga especificamente a um epitopo da IL-22 que é reconhecido por-356A11, de modo que o anticorpo iniba competitivamente a ligação de-356A11 à IL-22 humana.
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