ES2758650T3 - Anticuerpos humanos contra la interleucina 22 (IL-22) humana - Google Patents

Anticuerpos humanos contra la interleucina 22 (IL-22) humana Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a IL-22, para su uso en el tratamiento o prevención de un trastorno asociado con la IL-22, en el que el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende: a) el dominio VH 5 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 131 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 132; b) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 149 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 150; c) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 617 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 618; d) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 491 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 492; e) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 167 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 168; f) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 185 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 186; g) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 203 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 204; h) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 527 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 528; i) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 221 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 222; j) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 239 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 240; k) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 257 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 258; l) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 275 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 276; m) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 599 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 600; n) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 581 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 582; o) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 563 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 564; o p) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 545 y el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 546; q) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 509 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 510; o r) un dominio Fv que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 331, o SEQ ID NO: 349; y en el que el anticuerpo bloquea la proliferación de células BaF3 mediada por IL-22 con una CI50 de 150 pM o menos, y en el que las células BaF3 comprenden un receptor de IL-22 humano.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos humanos contra la interleucina 22 (IL-22) humana
Campo de la técnica
La presente invención se refiere a anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos humanos, y a fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a la interleucina-22 (IL-22), en particular la IL-22 humana, y a su uso en la regulación de actividades asociadas con la IL-22. Los anticuerpos desvelados en el presente documento son útiles en el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de los trastornos asociados con la IL-22, por ejemplo, trastornos autoinmunitarios, incluida la artritis.
Antecedentes de la invención
Los antígenos inician las respuestas inmunitarias y activan las dos poblaciones más grandes de linfocitos: los linfocitos T y los linfocitos B. Después de encontrarse con un antígeno, los linfocitos T proliferan y se diferencian en células efectoras, mientras que los linfocitos B proliferan y se diferencian en células plasmáticas secretoras de anticuerpos. Estas células efectoras secretan y/o responden a las citocinas, que son proteínas pequeñas (< aproximadamente 30 kDa) secretadas por los linfocitos y otros tipos de células.
La interleucina-22 (IL-22) es una citocina de clase II que muestra homología de secuencia con la IL-10. Su expresión está regulada por aumento en los linfocitos T a través de la IL-9 o la ConA (Dumoutier L. y col., (2000) Proc Natl Acad Sc/ USA 97(18):10144-9). En otros estudios se ha demostrado que la expresión del ARNm de la IL-22 se induce in vivo en respuesta a la administración de LPS y que la IL-22 modula parámetros indicativos de una respuesta de fase aguda (Dumoutier L. y col., (2000); Pittman D. y col., (2001) Genes and Immunity 2:172). Además, la IL-22 potencia la expresión de péptidos antimicrobianos asociados con la defensa del huésped, incluyendo pdefensina, S100A7, S100A8 y S100a . Wolk y col., Immunity, 21:241-54 (2004); Boniface y col., J. Immunol.
174:3695-3702 (2005); Liang y col., J. Exp. Med., 203(10):2271-79 (2006). En conjunto, estas observaciones indican que la IL-22 desempeña un papel en la inflamación (Kotenko S.V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13(3):223-40). Adicionalmente, Li, J., y col., Int Immunopharmacol. Mayo de 2004; 4 (5): 693-708, analiza la IL-22 en los mecanismos de inflamación y el uso de un anticuerpo monoclonal de rata neutralizante como antagonista de la IL-22. Resmini, C., y col., vol. 14, n.° supl. 3, septiembre de 2003, página 129, analizan la disminución de la gravedad de la enfermedad en un modelo murino de artritis inducida por colágeno en respuesta al tratamiento con anticuerpo monoclonoal anti-IL22. El documento WO2002068476 desvela anticuerpos para IL-22 útiles para el tratamiento de trastornos inflamatorios. Rudikoff, S., y col., Proc Natl Acad Sci USA. Marzo de 1982; 79 (6): 1979­ 1983, sugieren que pequeñas cantidades de sustituciones en los anticuerpos pueden ser eficaces en algunas situaciones para alterar la especificidad de unión al antígeno. Winkler, K. y col., J Immunol. 15 de octubre de 2000; 165 (8): 4505-14, se refiere a la caracterización de mutantes de scFv mediante análisis por sustitución y al cambio de la especificidad de unión al antígeno por mutaciones de un solo puntuales individuales.
Se cree que la IL-22 se une a un complejo receptor que consiste en IL-22R e IL-10R2, dos miembros de la familia de receptores de tipo II de la citocina (c Rf2) (Xie M.H. y col., (2000) J Biol Chem 275(40):31335-9; Kotenko S.V. y col., (2001) J Biol Chem 276(4):2725-32). Ambas cadenas del receptor de la IL-22 se expresan de forma constitutiva en una serie de órganos. Las líneas celulares epiteliales derivadas de estos órganos responden a la IL-22 in vitro (Kotenko S.V. (2002) Cytokine & Growth. Factor Reviews 13(3):223-40). La IL-22 induce la activación de las rutas de JAK/STAT3 y ERK, así como intermedios de otras rutas de la MAPK (Dumoutier L. y col., (2000) mencionado anteriormente; Xie M.H. y col., (2000) mencionado anteriormente; Dumoutier L. y col., (2000) J Immunol 164(4):1814-9; Kotenko S.V. y col., (2001) J Biol Chem 276(4):2725-32; Lejeune, D. y col., (2002) J Biol Chem 277(37):33676-82).
Los miembros de la CRF2 son receptores para IFNa/p, IFNy, el factor de coagulación ViIa, la IL-10 y las proteínas relacionadas con la IL-10 IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26, así como las citocinas de tipo IFN recién identificadas, IL-28 e IL-29 (Kotenko S.V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13(3):223-40; Kotenko, S.V. y col., (2000) Oncogene 19(21):2557-65; Sheppard, P. y col., (2003) Nature Immunology 4(1):63-8; Kotenko, S.V. y col., (2003) Nature Immunology 4(1):69-77). Además de estos receptores de membrana, la familia de CRF2 también incluye una proteína soluble, la proteína de unión a IL-22 (IL-22BP), que es específica de la IL-22 y bloquea su actividad (Dumoutier, L. y col., (2001) J Immunol 166(12):7090-5; Kotenko, S.V. y col., (2001) J Immunol 166(12):7096-103; Xu, W. y col., (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98(17):9511-6; Gruenberg, B.H. y col., (2001) Genes & Immunity 2(6):329-34; Wei C-C y col., (2003) Genes & Immunity 4:204-211). Aunque el complejo del receptor de la IL-22 es único para la IL-22, cada cadena (es decir, IL-22R e IL-10R2) es compartida por otros miembros de la CRF2 para definir los receptores funcionales para otras citocinas, incluidas IL-20, IL-24 (IL-22R/IL-20R2), IL-28, IL-29 (IFN-AR1/IL-10R2) and IL-10 (IL-10R1/IL-10R2) (Dumoutier, L. y col., (2001) J. Immunol. 167(7):3545-9; Wang, M. y col., (2002) J Biol Chem 277(9):7341-7; Parrish-Novak, J. y col., (2002) J Biol Chem 277(49):47517-23; Kotenko, S.V. y col., (1997) EMBO J. 16(19):5894-903; Spencer, S.D. y col., (1998) J Exp Med 187(4):571-8).
Ambas cadenas del receptor compuesto de la CRF2 son necesarias para la transducción de señales. Una cadena del receptor compuesto se ha definido históricamente como cadena de unión al ligando (por ejemplo, IFNyR1 ) en base a su elevada afinidad por la citocina. La otra cadena (por ejemplo, IFNyR2) se ha caracterizado como una cadena auxiliar o accesoria y muestra una afinidad mínima por la citocina de forma individual (Kotenko, S.V. y col., (2000) Oncogene 19(21):2557-65). Para la IL-22, el IL-22R es la subunidad del receptor de alta afinidad, de modo que el IL-10R2 se une después al complejo IL-22/IL-22R (Li, J. y col., (2004) Int. Immunopharmacol. 4(5):673-708; Logsdon, N. J. y col., (2002) J. Interferon Cytokine Res 22(11):1099-1112).
Sumario de la invención
La presente invención es como se establece en las reivindicaciones. La presente divulgación proporciona agentes de unión a IL-22 tales como anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a la interleucina-22 ("IL-22"), en particular la IL-22 humana, con una elevada afinidad y especificidad. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención también se denominan en el presente documento “anticuerpos anti-IL-22" y “fragmentos de los mismos”, respectivamente. En una realización de la presente invención, el anticuerpo o fragmento del mismo reduce, inhibe o antagoniza la actividad de la IL-22. Dichos anticuerpos se pueden usar para regular las respuestas inmunitarias o los trastornos asociados con la IL-22 antagonizando la actividad de la IL-22. En otras divulgaciones, el anticuerpo anti-IL-22 se puede usar con fines diagnósticos o como anticuerpo dirigido para administrar un agente terapéutico o citotóxico frente a una célula que expresa IL-22. Por tanto, los anticuerpos anti-IL-22 de la invención son útiles en la artritis (incluida la artritis reumatoide) tratando y/o previniendo los trastornos asociados con la IL-22, por ejemplo, trastornos autoinmunitarios, por ejemplo artritis (incluidas artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artrosis, artritis psoriásica, artritis asociada con el lupus o espondilitis anquilosante), esclerodermia, eritematosis por lupus sistémico, VIH, síndrome de Sjogren, vasculitis, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis (incluidas la dermatitis atópica y la dermatitis eccematosa), miastenia gravis, enfermedad intestinal inflamatoria (EII), enfermedad de Crohn, colitis, diabetes mellitus (tipo I); afecciones inflamatorias de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, psoriasis), sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), hígado (por ejemplo, hepatitis), riñón (por ejemplo, nefritis) y páncreas (por ejemplo, pancreatitis); trastornos cardiovasculares, por ejemplo trastornos metabólicos del colesterol, lesiones con radicales libres de oxígeno, isquemia, trastornos asociados con la cicatrización de heridas, trastornos respiratorios, por ejemplo asma y EPOC (por ejemplo, fibrosis quística), afecciones inflamatorias agudas (por ejemplo, endotoxemia, sepsis y septicemia, síndrome del shock tóxico y enfermedades infecciosas), rechazo de trasplantes y alergia. En una realización, el trastorno asociado con la IL-22 es un trastorno artrítico, por ejemplo un trastorno seleccionado de uno o más de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artrosis, artritis psoriásica o espondilitis anquilosante; un trastorno respiratorio (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)), o una afección inflamatoria de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, psoriasis), el sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), del sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), del hígado (por ejemplo, hepatitis), del riñón (por ejemplo, nefritis), del páncreas (por ejemplo, pancreatitis) y de los órganos gastrointestinales, por ejemplo colitis, enfermedad de Crohn y EII.
De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, la invención caracteriza un anticuerpo aislado que se une a la IL-22, en concreto a la IL-22 humana. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-IL-22 puede tener al menos una de las características siguientes: (1 ) es un anticuerpo monoclonal o de especificidad única; (2) es un anticuerpo humano; (3) es un anticuerpo generado in vitro; (4) es un anticuerpo generado in vivo (por ejemplo, sistema transgénico); (5) como se desvela, se une a la IL-22 con una constante de asociación de al menos 1012 M-1; (6) como se desvela, se une a la IL-22 con una constante de asociación de al menos 1011 M-1; (7) como se desvela, se une a la IL-22 con una constante de asociación de al menos 1010 M-1; (8) como se desvela, se une a la IL-22 con una constante de asociación de al menos 109 M-1;(9) como se desvela, se une a la IL-22 con una constante de asociación de al menos 106 M-1; (10) como se desvela, se une a la IL-22 con una constante de asociación de 500 nM o menor; (11) como se desvela, se une a la IL-22 con una constante de asociación de 10 nM o menor; (12) como se desvela, se une a la IL-22 con una constante de asociación de 150 pM o menor; (13) como se desvela, se une a la IL-22 con una constante de asociación de 60 pM o menor; (14) de acuerdo con la invención, inhibe la unión de IL-22 al IL-22R o un complejo receptor de IL-22R e IL-10R2 con una CI50 de 10 nM o menor; (15) de acuerdo con la invención, bloquea la proliferación mediada por la IL-22 de las células BaF3 receptor de la IL-22 modificado con una CI50 de 1 nM o menor en una realización, con una CI50 de 150 pM o menor, en otra realización, como se desvela, con una CI50 de 100 pM o menor, y como se desvela, con una CI50 de 10 pM o; y (16) como se desvela, bloquea la secreción de GROa mediada por la IL-22 por células HT29 con una CI50 de 1 nM o menor en una divulgación, con una CI50 de 150 pM o menor en otra realización, y con una CI50 de 10 pM o menor en otra divulgación. La proliferación de BaF3 mediada por la IL-22 y la secreción de GROa mediada por IL-22 por las células HT29 se pueden medir como se ha descrito en los ejemplos.
Realizaciones ilustrativas no limitantes de los anticuerpos de la invención se denominan en el presente documento, de acuerdo con la divulgación "GIL01," "GIL16," "GIL45," "GIL60," "GIL68," "GIL92," "097D09," de acuerdo con la invención "062A09," "062G05," "087B03," "367D04," "368D04," "166B06," "166G05," "375G06," "376B10," "354A08," "355B06," "355E04," y "356A11." Estos anticuerpos pueden estar modificados en la línea germinal o no. En otra realización, el anticuerpo se selecciona de 356A11-, 354A08, 087B03 y 368D04. Los anticuerpos de la divulgación pueden unirse específicamente al mismo epítopo de la IL-22 o a un epítopo similar (por ejemplo, un epítopo solapante) al que se unen GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04, o 356A11. En otras divulgaciones; los anticuerpos se unen específicamente a un fragmento de una IL-22, por ejemplo, un fragmento de al menos 10, 20, 50, 75, 100, 150, o 200 aminoácidos contiguos a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 o una secuencia es al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la misma. En otras divulgaciones, el anticuerpo inhibe de forma competitiva la unión de al menos uno de GIL01-, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04, o 356A11 a su epítopo diana.
En una realización, el anticuerpo de la presente invención incluye un dominio Vh, un dominio Vl o una combinación de los mismos, del fragmento Fv de, de acuerdo con la divulgación, GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, de acuerdo con la invención 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 o 356A11. Por ejemplo, el anticuerpo incluye un dominio Vh y/o Vl que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en las Tablas 1 y 7 (de acuerdo con la divulgación, la SEQ ID NO: 5, 23, 41, 59, 77, 95, 113, de acuerdo con la invención la SEQ ID NO: 131, 149, 167, 185, 203, 221, 239, 257, 275, de acuerdo con la divulgación la SEQ ID NO: 293, 311, 329, 347, 365, 383, 401, 419, 437, 455, 473, de acuerdo con la invención la SEQ ID NO: 491, 509, 527, 545, 563, 581, 599 o 617 para Vh y de acuerdo con la divulgación las SEQ ID NO: 6, 24, 42, 60, 78, 96, 114, de acuerdo con la invención la SEQ ID NO: 132, 150, 168, 186, 204, 222, 240, 258, 276, de acuerdo con la divulgación la SEQ ID NO: 294, 312, 330, 348, 366, 384, 402, 420, 438, 456, 474, de acuerdo con la invención la SEQ ID NO: 492, 510, 528, 546, 564, 582, 600 o 618 para Vl), o de acuerdo con la divulgación una secuencia sustancialmente idéntica a las mismas (por ejemplo, una secuencia al menos aproximadamente un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a las mismas o que difiere en no más de 1, 2, 5, 10 o 15 restos de aminoácidos de las SEQ ID NO: 5, 6, 23, 24, 41, 42, 59, 60, 77, 78, 95, 96, 113, 114, 131, 132, 149, 150, 167, 168, 185, 186, 203, 204, 221, 222, 239, 240, 257, 258, 275, 276, 293, 294, 311, 312, 329, 330, 347, 348, 365, 366, 383, 384, 401, 402, 419, 420, 437, 438, 455, 456, 473, 474, 491, 492, 509, 510, 527, 528, 545, 546, 563, 564, 581, 582, 599, 600, 617 o 618).
En otra realización, el anticuerpo de la presente invención incluye un dominio Vh, un dominio Vl o una combinación de los mismos, del fragmento Fv de un anticuerpo seleccionado de 356A11-, 354A08, 087B03 y 368D04. En esta realización, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende:
un dominio Vh que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 167 o 491 y/o un dominio Vl que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 168 o 492 (087B03); un dominio Vh que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 545 y/o un dominio Vl que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 294 o 546 (354A08);
un dominio Vh que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 203 o 617 y/o un dominio Vl que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 204 o 618 (368D04); o de acuerdo con la divulgación, un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 599 y/o un dominio Vl que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: o 600 (356A11).
En otra divulgación, el anticuerpo incluye un dominio Vh y/o Vl codificado por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en las tablas 1 y 7 (como se desvela, la SEQ ID NO: 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, de acuerdo con la invención la SEQ ID NO: 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, como se desvela, la SEQ ID NO: 302, 320, 338, 356, 374, 392, 410, 428, 446, 464, 482, de acuerdo con la invención la SEQ ID NO: 500, 518, 536, 554, 572, 590, 608, o 626 para Vh y las SEQ ID NO:, como se desvela las SEQ ID NO: 15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, de acuerdo con la invención la SEQ ID NO: 141, 159, 177, 195, 213, 231, 249, 267, 285, como se desvela la SEQ ID NO: 303, 321, 339, 357, 375, 393, 411, 429, 447, 465, 483, , de acuerdo con la invención la SEQ ID NO: 501, 519, 537, 555, 573, 591, 609, o 627 para Vl), o una secuencia sustancialmente idéntica a las mismas (por ejemplo, una secuencia al menos aproximadamente un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a las mismas, o que difiere en no más de 1, 2, 3, 6, 15, 30 o 45 nucleótidos de SEQ ID NO: 14, 15, 32, 33, 50, 51, 68, 69, 86, 87, 104, 105, 122, 123, 140, 141, 158, 159, 176, 177, 194, 195, 212, 213, 230; 231, 248, 249, 266, 267, 284, 285, 302, 303, 320, 321, 338, 339, 356, 357, 374, 375, 392, 393, 410, 411, 428, 429, 446, 447, 464, 465, 482, 483, 500, 501, 518, 519, 536, 537, 554, 555, 572, 573, 590, 591, 608, 609, 626 o 627).
En otras realizaciones, el anticuerpo incluye un dominio Fv que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en las Tablas 1 y 7 (de acuerdo con la divulgación, la SEQ ID NO: 7, 25, 43, 61, 79, 97, 115, de acuerdo con la invención, la SEQ ID NO: 133, 151, 169, 187, 205, 223, 241,259, 277, como se desvela, la SEQ ID NO: 295, 313, 331, 349, 367, 385, 403, 421, 439, 457, 475, de acuerdo con la invención la SEQ ID NO: 493, 511, 529, 547, 565, 583, 601 o 619), o de acuerdo con la divulgación una secuencia sustancialmente idéntica a las mismas (por ejemplo, una secuencia al menos aproximadamente un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a las mismas, o que difiere en no más de 1, 2, 5, 10, 15, 20, 30 o 35 restos de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7, 25, 43, 61, 79, 97, 115, 133, 151, 169, 187, 205, 223, 241, 259, 277, 295, 313, 331, 349, 367, 385, 403, 421, 439, 457, 475, 493, 511, 529, 547, 565, 583, 601 o 619). En otra realización, el anticuerpo de la presente invención incluye un dominio Fv de un anticuerpo seleccionado de 356A11 ((SEQ ID NO: 601), 354A08 (s Eq ID NO: 547), 087B03 (SEQ ID NO: 169 o 493), y 368d04 (SEQ ID NO: 205 o 619). En otra realización, el anticuerpo incluye un dominio Fv codificado por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en las Tablas 1 y 7 (como se desvela, la SEQ ID NO: 16, 34, 52, 70, 88, 106, 124, de acuerdo con la invención la SEQ ID NO: 142, 160, 178,
196, 214, 232, 250, 268, 286, como se desvela, la SEQ ID NO: 304, 322, 340, 358, 376, 394, 412, 430, 448, 466,
484, de acuerdo con la invención la SEQ ID NO: 502, 520, 538, 556, 574, 592, 610 o 628), o como se desvela una
secuencia sustancialmente idéntica a las mismas (por ejemplo, una secuencia al menos aproximadamente un 85 %,
90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a las mismas, o que difiere en no más de 1, 2, 3, 6, 15, 30, 45,
60, 90 o 105 nucleótidos de SEQ ID NO: 16, 34, 52, 70, 88, 106, 124, 142, 160, 178, 196, 214, 232, 250, 268, 286,
304, 322, 340, 358, 376, 394, 412, 430, 448, 466, 484, 502, 520, 538, 556, 574, 592, 610 o 628). En otras
realizaciones más, el anticuerpo comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) o
estos dominios Vh y Vl. Por ejemplo, el anticuerpo puede incluir una, dos o tres CDR del dominio Vh que tiene una
secuencia de aminoácidos como se ha expuesto o incluido en las secuencias de las Tablas 1 y 7 (como se desvela,
la SEQ ID NO: 5, 7, 8, 9,10, 23, 25, 26, 27, 28, 41, 43, 44, 45, 46, 59, 61, 62, 63, 64, 77, 79, 80, 81, 82, 95, 97, 98,
99, 100, 113, 115, 116, 117, 118, de acuerdo con la invención la SEQ ID NO: 131, 133, 134, 135, 136, 149, 151,
152, 153, 154, 167, 169, 170, 171, 172, 185, 187, 188, 189, 190, 203, 205, 206, 207, 208, -221, 223, 224, 225, 226,
239, 241, 242, 243, 244, 257, 259, 260, 261, 262, 275, 277, 278, 279, 280, como se desvela, la SEQ ID NO: 293,
295, 296, 297, 298, 311, 313, 314, 315, 316, 329, 331, 332, 333, 334, 347, 349, 350, 351, 352, 365, 367 370, 383, 385, 386, 387, 388, 401, 403, 404, 405, 406, 419, 421, 422, 423, 424, 437, 439, 440, 441, 442, 455, 457,
458, 459, 460, 473, 475, 476, 477, 478, de acuerdo con la invención la SEQ ID NO: 491, 493, 494, 495, 496, 509,
511, 512, 513, 514, 527, 529, 530, 531, 532, 545, 547, 548, 549, 550, 563, 565, 566, 567, 568, 581, 583, 584, 585,
586, 599, 601, 602, 603, 604, 617, 619, 620, 621 o 622), o como se desvela una secuencia sustancialmente
homóloga a las mismas (por ejemplo, una secuencia al menos aproximadamente un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %,
98 %, 99 % o más idéntica a las mismas). En otra realización, el anticuerpo de la presente invención incluye una,
dos o tres CDR del dominio Vh de un anticuerpo seleccionado de 356A11-, 354A08, 087B03 y 368D04. En esta
realización, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de la cadena
pesada que comprende:
a) SEQ ID NO: 170 o 494; b) SEQ ID NO: 171 o 495; y/o e) SEQ ID NO: 172 o 4986(087B03);
a) SEQ ID NO: 296 o 548; b) SEQ ID NO: 549; y/o c) SEQ ID NO: 550 (354A08);
a) SEQ ID NO: 206 o 620; b) SEQ ID NO: 207 o 621; y/o c) SEQ ID NO. 208 o 622 (368D04); o
a) SEQ ID NO: 602; b) SEQ ID NO: 351 o 603; y/o c) SEQ ID NO: 604 (356A11).
En otra realización, el anticuerpo puede incluir una, dos o tres CDR del dominio Vl que tiene una secuencia de
aminoácidos como se expone o incluye en las secuencias en las Tablas 1 y 7 (como se desvela, la SEQ ID NO: 6, 7,
11, 12, 13, 24, 25, 29, 30, 31, 42, 43, 47, 48, 49, 60, 61, 65, 66, 67, 78, 79, 83, 84, 85, 96, 97, 101, 102, 103, 114,
115, 119, 120, 121, de acuerdo con la invención la SEQ ID NO: 132, 133, 137, 138, 139, 150, 151, 155, 156, 157,
168, 169, 173, 174, 175, 186, 187, 191, 192, 193, 204, 205, 209, 210, 211, 222, 223, 227, 228, 229, 240, 241, 245,
246, 247, 258, 259, 263, 264, 265, 276, 277, 281, 282, 283, 294, 295, 299, 300, 301, 312, 313, 317, 318, 319, 330, 331, 335, 336, 337, 348, 349, 353, 354, 355, 366, 367, 371, 372, 373, 384, 385, 389, 390, 391, 402, 403, 407, 408,
409, 420, 421, 425, 426, 427, 438, 439, 443, 444, 445, 456, 457, 461, 462, 463, 474, 475, 479, 480, 481, de acuerdo
con la invención la SEQ ID NO: 492, 493, 497, 498, 499, 510, 511, 515, 516, 517, 528, 529, 533, 534, 535, 546, 547,
551, 552, 553, 564, 565, 569, 570, 571, 582, 583, 587, 588, 589, 600, 601, 605, 606, 607, 618, 619, 623, 624 o 625),
o como se desvela, una secuencia sustancialmente idéntica a las mismas (por ejemplo, una secuencia al menos
aproximadamente un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a las mismas). En otra realización,
el anticuerpo de la presente invención incluye una, dos o tres CDR del dominio Vl de un anticuerpo seleccionado de
356A11, 354A08, 087B03 y 368D04. En esta realización, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo,
comprende una región variable de la cadena ligera que comprende:
a) SEQ ID NO: 173 o 497; b) SEQ ID NO: 174 o 498; y/o c) SEQ ID NO: 175 o 499 (087B03);
a) SEQ ID NO: o 551; b) SEQ ID NO: 552; y/o c) SEQ ID NO: 301 o 553 (354A08);
a) SEQ ID NO: 209 o 623; b) SEQ ID NO: 210 o 624; y/o c) SEQ ID NO: 211 o 625 (368D04); o
a) SEQ ID NO: 605; b) SEQ ID NO: 606; y/o c) SEQ ID NO: 355 o 607 (356A11).
En todavía una realización adicional, el anticuerpo comprende un fragmento H3 del dominio Vh de, como se desvela,
GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, de acuerdo con la invención, 062A09, 062G05, 087B03,
367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04, o 356A11, por ejemplo un
fragmento H3 que tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en las Tablas 1 y 7 (como se desvela, la SEQ
ID NO: 10, 28, 46, 64, 82, 100, 118, de acuerdo con la invención la SEQ ID NO: 136, 154, 172, 190, 208, 226, 244,
262, 280, como se desvela, la SEQ ID NO: 298, 316, 334, 352, 370, 388, 406, 424, 442, 460, 478, 496, 514, 532,
550, 568, 586, 604 o 622), o como se desvela, una secuencia sustancialmente idéntica a las mismas (por ejemplo,
una secuencia al menos aproximadamente un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a las
mismas).
El anticuerpo de la invención puede ser de longitud completa (por ejemplo, incluir al menos una cadena pesada completa y al menos una cadena ligera completa) o puede incluir únicamente un fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2, Fv, un fragmento Fv de cadena sencilla, un fragmento Fd o un fragmento dAb). El anticuerpo puede incluir una región constante, o una porción de la misma, seleccionado de cualquiera de: los genes de la región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu. Por ejemplo, se pueden usar las regiones constantes de la cadena pesada de los diversos isotipos, incluyendo: IgGi, IgG2, IgG3 , IgG4 , IgM, IgAi, IgA2 , IgD e IgE. La región constante de la cadena ligera se puede seleccionar de kappa o lambda. El anticuerpo puede ser una IgG o también puede ser IgGK o IgGv.
El anticuerpo anti-IL-22 descrito en el presente documento se puede obtener o ligar a otra molécula funcional (tal como otro péptido o proteína (por ejemplo, un fragmento Fab)). Por ejemplo, un anticuerpo de la divulgación puede estar ligado funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a al menos otra entidad molecular, tal como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o multiespecífico), toxina, radioisótopo, agente citotóxico o citostático, entre otros.
En otro aspecto, la divulgación caracteriza una composición farmacéutica que contiene al menos un anticuerpo anti-IL-22 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede además incluir una combinación de al menos un anticuerpo anti-lL-22 y al menos un agente terapéutico (por ejemplo, inhibidores de citocinas y del factor de crecimiento, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, inhibidores metabólicos, inhibidores enzimáticos, agentes citotóxicos, agentes citostáticos o combinaciones de los mismos, como se describe con más detalle en el presente documento). Las combinaciones del anticuerpo anti-IL-22 y un agente terapéutico también están dentro del ámbito de la divulgación. Las composiciones y combinaciones de la divulgación se pueden usar para regular las afecciones inflamatorias asociadas con la IL-22, por ejemplo modulando la señalización de la IL-22 a través de sus receptores localizados en las células epiteliales de diversos tejidos, incluidos, entre otros, los del páncreas, la piel, los pulmones, los intestinos, el hígado, los riñones, las glándulas salivales y el endotelio vascular, además de las células inmunitarias potencialmente activadas y localizadas en el tejido.
En otro aspecto, la invención caracteriza un procedimiento de tratamiento de un sujeto con un trastorno asociado con la IL-22. El procedimiento incluye administrar al sujeto un anticuerpo anti-IL-22 en una cantidad suficiente para inhibir al menos una actividad de IL-22 de células inmunitarias, de modo que se trata el trastorno asociado con la IL-22.
El anticuerpo anti-IL-22 se puede administrar al sujeto, solo o, como se desvela, en combinación, con otros agentes terapéuticos como se ha descrito en el presente documento. El sujeto puede ser un mamífero, por ejemplo, un ser humano. Por ejemplo, el procedimiento se puede usar para tratar a un sujeto con un trastorno asociado con la IL-22 tal como trastornos autoinmunitarios, por ejemplo artritis (incluidas artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artrosis, artritis psoriásica, artritis asociada con lupus o espondilitis anquilosante), esclerodermia, lupus eritematoso sistémico, VIH, síndrome de Sjogren, vasculitis, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eccematosa), miastenia gravis, enfermedad intestinal inflamatoria (EII), enfermedad de Crohn, colitis, diabetes mellitus (tipo I), afecciones inflamatorias de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, psoriasis), el sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), del sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), el hígado (por ejemplo, hepatitis), del riñón (por ejemplo, nefritis) y el páncreas (por ejemplo, pancreatitis); trastornos cardiovasculares, por ejemplo trastornos metabólicos del colesterol, lesión por radicales libres de oxígeno, isquemia, trastornos asociados con la cicatrización de heridas, trastornos respiratorios, por ejemplo asma y EPOC (por ejemplo, fibrosis quística), afecciones inflamatorias agudas (por ejemplo, endotoxemia, sepsis y septicemia, síndrome del shock tóxico y enfermedades infecciosas), rechazo de trasplantes y alergia. En una realización, el trastorno asociado con la iL-22 es un trastorno artrítico, por ejemplo un trastorno seleccionado de uno o más de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artrosis, artritis psoriásica o espondilitis anquilosante; un trastorno respiratorio (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)), o una afección inflamatoria de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, psoriasis), el sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), del sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), del hígado (por ejemplo, hepatitis), del riñón (por ejemplo, nefritis), del páncreas (por ejemplo, pancreatitis) y de los órganos gastrointestinales, por ejemplo colitis, enfermedad de Crohn y EII.
En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento de disminuir, inhibir o reducir una respuesta de fase aguda en un sujeto. El procedimiento incluye administrar al sujeto un agente de unión a IL-22, por ejemplo, un antagonista de lL-22 (por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-22 o fragmento del mismo como se describe en el presente documento), en una cantidad suficiente para disminuir, inhibir o reducir la respuesta de fase aguda en el sujeto. En una realización, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un ser humano que sufre un trastorno asociado con la IL-22, incluyendo, por ejemplo, trastornos respiratorios, trastornos inflamatorios y trastornos autoinmunitarios. En una divulgación, el agente de unión a IL-22 se administra localmente, por ejemplo, por vía tópica, subcutánea u otras administraciones que no están en la circulación general.
En otro aspecto, se puede usar un agente de unión a IL-22 para alterar el tipo de respuesta inmunitaria y/o incrementar la eficacia de una formulación de vacuna usada para inmunizar a un sujeto. Por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-22 de la presente divulgación se puede administrar antes, durante y/o después de una inmunización para aumentar la eficacia de la vacuna. En una divulgación, la formulación de vacuna contiene uno o más antagonistas de la IL-22 y un antígeno, es decir un inmunógeno, incluyendo, por ejemplo, antígenos virales, bacterianos o tumorales.
En otra divulgación, el antagonista de la IL-22 y el inmunógeno se administran por separado, por ejemplo, separados entre sí por una hora, tres horas, un día o tres días.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para detectar la presencia de IL-22 en una muestra in vitro. Las muestras pueden incluir muestras biológicas tales como suero, plasma, tejido y biopsia. El procedimiento sujeto se puede usar para diagnosticar un trastorno, tal como un trastorno asociado con la IL-22 como se ha descrito en el presente documento. El procedimiento incluye: (1) poner en contacto la muestra o una muestra control con un anticuerpo anti-IL-22 y (2) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-IL-22 y la muestra o la muestra control, en el que un cambio estadísticamente significativo en la formación del complejo en la muestra respecto a una muestra control es indicativo de la presencia de IL-22 en la muestra.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para detectar la presencia de IL-22 in vivo (por ejemplo, obtención de imágenes in vivo en un sujeto). El procedimiento se puede usar para diagnosticar un trastorno, por ejemplo, un trastorno asociado con la IL-22 como se ha descrito en el presente documento. El procedimiento incluye: (1) administrar un anticuerpo anti-IL-22 a un sujeto o un sujeto control en condiciones que permiten la unión del anticuerpo anti-IL-22 y (2) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo y la IL-22, en el que un cambio estadísticamente significativo en la formación del complejo en el sujeto con respecto a un control, por ejemplo, un sujeto control, es indicativo de la presencia de IL-22.
El anticuerpo puede estar marcado directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Sustancias detectables adecuadas incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para liberar o dirigir un agente, por ejemplo, un agente terapéutico o citotóxico, a una célula que expresa IL-22 in vivo. El procedimiento incluye administrar un anticuerpo anti-IL-22 a un sujeto en condiciones que permitan la unión del anticuerpo a la IL-22. El anticuerpo puede acoplarse a un segundo radical terapéutico, tal como una toxina.
La divulgación proporciona secuencias de ácido nucleico de los dominios Vh y Vl de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 y 356A11. También se proporcionan secuencias de ácido nucleico que comprenden al menos una CDR de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G08, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 y 356A11. La divulgación también proporciona vectores y células huésped que comprenden dichos ácidos nucleicos.
La divulgación proporciona adicionalmente procedimientos de producir nuevos dominios Vh y Vl y anticuerpos funcionales que comprenden todos o una porción de dichos dominios derivados de los dominios Vh o Vl de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 o 356A11.
Aspectos adicionales de la divulgación se expondrán en parte en la descripción y en parte serán obvios a partir de la descripción o se pueden aprender mediante la práctica de la divulgación. La invención se expone y se señala particularmente en la divulgación de las reivindicaciones.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Potencia de los clones de scFv anti-IL-22 en el ensayo del complejo del receptor de la IL-22: ensayo de competición DELFIA del complejo de unión de la IL-22 al receptor de IL-22.
Figura 2. Perfil de los clones scFv principales en el ensayo del complejo del receptor de la IL-22: ensayo de competición DELFIA del complejo de unión de la IL-22 al receptor de IL-22. (A) Derivado de GIL 1. (B) Derivado de GIL 16. (C) Derivado de GIL 16, GIL 60 y GIL 68. (D) Derivado de GIL 60. (E) Derivado de GIL 68. (F) Derivado de GIL 68. (G) Derivado de GIL 92.
Figura 3. Potencia de IgG en ensayos basados en células GROa. GIL-IgG optimizadas en ensayo de huIL-22 GROa. (A) IgG modificada en la línea germinal. (B) IgG no modificada en la línea germinal.
Figura 4. Reactivad de especies cruzada de los anticuerpos frente a IL-22 mediante ELISA. Gil-IgG optimizadas se unen específicamente a la IL-22. (A) IgG modificada en la línea germinal. (B) IgG no modificada en la línea germinal.
Figura 5. Secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la IL-22 humana. La secuencia de nucleótidos de la IL-22 humana es la SEQ ID NO: 2 e incluye una cola de poli (A). La secuencia de nucleótidos desvelada incluye un marco de lectura abierto y la secuencia de aminoácidos de la proteína IL-22 de longitud completa correspondiente a la secuencia de nucleótidos anterior se notifica en la SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos de la IL-22 madura corresponde aproximadamente a los aminoácidos 34-179 de La SEQ ID NO: 1. Figura 6. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de IL-22 de ratón.
Figura 7. Secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G08, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 y 356A11 no modificados en la línea germinal, incluyendo los dominios Vh y Vl y las CDR (H1, H2, H3, L1, L2 y L3).
Figura 8. Secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 087B03, 166B06, 166G05, 354A08, 355B06, 355E04, 356A11 y 368D04, modificados en la línea germinal, incluyendo los dominios Vh y Vl y las CDR (H1, H2, H3, L1, L2 y l3).
Figura 9. Secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de scFv para GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G08, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 y 356A11 no modificados en la línea germinal, con las CDR subrayadas (H1, H2, H3, L1, L2 y L3).
Figura 10. Secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de scFv para GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 087B03, 166B06, 166G05, 354A08, 355B06, 355E04, 356A11 y 368D04, modificados en la línea germinal con las CDR subrayadas (HI1, H2, H3, L1, L2 y L3).
Figuras 11A-B. Semivida in vivo de (A) 356A11 y (B) 368D04.
Figuras 12A-B. Puntuaciones medias de la gravedad de la enfermedad (A) o puntuaciones de la gravedad de la enfermedad (B) con varias dosis de 356A11 administradas en días alternos en un modelo de AIC murina.
Figuras 13A-D. Puntuaciones medias de la gravedad de la enfermedad de 8 mg kg "1 de 356A11 administrado en días alternos en un modelo de AIC murina en varios estudios.
Figuras 14A-B. Puntuaciones medias de la gravedad de la enfermedad de 8 mg kg "1 de 356A11 administrado una o dos veces a la semana en un modelo de AIC murina.
Figuras 15A-B. Puntuaciones de la gravedad de la enfermedad de dos estudios distintos de 8 mg kg-1 de 356A11 administrado en días alternos, dos veces a la semana o una vez a la semana en un modelo de AIC murina. Figuras 16A-F. Evaluación histológica (pata) de la progresión de la enfermedad en varios estudios usando ratones tratados con (A) 8 mg kg-1 de 356A11 en días alternos o (B) 16 mg kg-1 de 356A11 en días alternos, (C) 8 mg kg-1 de 356A11 en días alternos, una vez a la semana o dos veces a la semana, (D) 8 mg kg-1 de 356A11 una vez a la semana, (E) 8 mg kg-1 de 356A11 dos veces a la semana, o (F) 8 mg kg-1 de 356A11 días alternos en un modelo de AIC murina.
Figura 17. Detección y estabilización de IL-22 in vivo (ng/ml) en ratones artríticos tratados con 356A11.
Figura 18. Detección de IL-22 (ng/ml) in vivo en ratones artríticos a los que se ha administrado un anticuerpo control de isotipo.
Figura 19. Regulación por aumento de la proteína IL-22 e IL-22R en lesiones psoriásicas humanas.
Figura 20. Evaluación de la enfermedad en ratones tratados con 16 mg/kg de 356A11, 368D04, o anticuerpo control en un modelo murino de psoriasis. (A) Progresión de la enfermedad clínica durante 10 semanas. (B) Puntuación clínica a las 10 semanas.
Figura 31. Detección de los niveles séricos in vivo de IL-22 (pg/ml) en ratones psoriásicos tratados con 16 mg/kg de 356A11, 368D04, o un anticuerpo control.
Figura 22. Detección de los niveles séricos in vivo de (A) IL-17A, (B) IL-17F, (C) IL-17A/F; y (D) IL-6 en ratones psoriásicos tratados con 16 mg/kg de 356A11, 368D04, o un anticuerpo control.
Figura 23. Análisis por citometría de flujo de células de ganglios linfáticos CD4+ agrupadas tratadas con PMA e ionomicina tras el aislamiento de ratones psoriásicos tratados con 16 mg/kg de 356A11, 368D04, o un anticuerpo control y teñidos para detectar IL-22 e IL-17A; IL-22 e IL-17F; IL-17A e IL-17F; IL-22 y TNFa; IL-22 e IFNy; o TNFa e IFNy.
Figura 24. Expresión génica de citocinas en las orejas de ratones psoriásicos tratados con 16 mg/kg de 356A11, 368D04, o un anticuerpo control. (A) IL-22. (B) IL-17. (C) IFNy. (D) IL-17F. (E) IL-6.
Figura 25. Detección de citocinas en los sobrenadantes de las células de ganglios linfáticos agrupadas de ratones psoriásicos tratados con 16 mg/kg de 356A11, 368D04, o un anticuerpo control y estimuladas ex vivo con y sin anticuerpo anti-CD3 unido en las placas. (A) IL-22. (B) IL-6. (C) I FNy (D) IL-17F. (E) IL-17A/F. (F) IL-17A. Figura 26. Expresión génica de citocinas en células de ganglios linfáticos agrupadas de ratones psoriásicos tratados con 16 mg/kg de 356A11, 368D04, o un anticuerpo control y estimuladas ex vivo con anticuerpo anti-CD3 unido en las placas. (A) IL-22. (B) IL-6. (C) IFNy (D) IL-17F. (E) IL-17A.
Figura 27. Evaluación de la enfermedad en ratones tratados con 16 mg/kg de 356A11 o anticuerpo control en un modelo murino de psoriasis. Ratones tratados con IL-12 y LPS el día 1 tras la transferencia adoptiva de linfocitos T. (A) Progresión de la enfermedad clínica durante 10 semanas. (B) Puntuación clínica a las 10 semanas.
Figura 28. Detección de los niveles séricos in vivo de IL-22 (ng/ml) en ratones psoriásicos tratados con 16 mg/kg de 356A11 o un anticuerpo control. Ratones tratados con IL-12 y LPS el día 1 tras la transferencia adoptiva de linfocitos T.
Figura 29. Detección de los niveles séricos in vivo de (A) IL-17A, (B) IL-17F, (C) IL-17A/F; y (D) IL-6 en ratones psoriásicos tratados con 16 mg/kg de 356A11 o un anticuerpo control. Ratones tratados con IL-12 y LPS el día 1 tras la transferencia adoptiva* de linfocitos T.
Figura 30. Expresión génica de citocinas en las orejas de ratones psoriásicos tratados con 16 mg/kg de 356A11 o un anticuerpo control. (A) IL-17. (B) IL-22. (C) IL-17F. (D) IFNy. (E) IL-6. Ratones tratados con IL-12 y LPS el día 1 tras la transferencia adoptiva de linfocitos T.
Figura 31. Análisis por citometría de flujo de células de ganglios linfáticos CD4+ agrupadas tratadas con PMA e ionomicina tras el aislamiento de ratones psoriásicos tratados con 16 mg/kg de 356A11 o un anticuerpo control y teñidos para detectar IL-22 e IL-17A; IL-22 e IL-17F; IL-17A e IL-17F; IL-22 y TNFa; IL-22 e IFNy; o TNFa e IFNy. Ratones tratados con IL-12 y LPS el día 1 tras la transferencia adoptiva de linfocitos T.
Figura 32. Detección de citocinas en los sobrenadantes de las células de ganglios linfáticos agrupadas de ratones psoriásicos tratados con 16 mg/kg de 356A11 o un anticuerpo control y estimuladas ex vivo con y sin anticuerpo anti-CD3 unido en las placas. (A) IL-22. (B) IL-6. (C) IFNy (D) IL-17A. (E) IL-17F. Ratones tratados con IL-12 y LPS el día 1 tras la transferencia adoptiva de linfocitos T.
Figura 33. Expresión génica de citocinas en células de ganglios linfáticos agrupadas de ratones psoriásicos tratados con 16 mg/kg de 356A11 o un anticuerpo control y estimuladas ex vivo con anticuerpo anti-CD3 unido en las placas. (A) IL-22. (B) IL-6. (C) IFNy (D) IL-17A. (E) IL-17F. Ratones tratados con IL-12 y LPS el día 1 tras la transferencia adoptiva de linfocitos T.
Figura 34. Evaluación de la enfermedad en ratones tratados con 16 mg/kg de 356A11 o anticuerpo control en un modelo murino de psoriasis. (A) Progresión de la enfermedad clínica durante 10 semanas. (B) Puntuación clínica a las 10 semanas.
Figura 35. Detección de los niveles séricos in vivo de IL-22 (ng/ml) en ratones psoriásicos tratados con 16 mg/kg de 356A11 o un anticuerpo control.
Figura 36. Expresión génica de citocinas en las orejas de ratones psoriásicos tratados con 16 mg/kg de 356A11 o un anticuerpo control. (A) IL-22, (B) IL-17, (C) IL-17FS, (D) IL-1 F6 (miembro 6 de la familia de IL-I), (E) IL-6, (F) IFNy, (G) IL-22 BP (proteína de unión a la IL-22), o (H) IL-22R1 (subunidad del receptor de la IL-22).
Figura 37. Evaluación de la enfermedad en ratones tratados con 16 mg/kg de 356A11 o anticuerpo control en un modelo murino de psoriasis. (A) Progresión de la enfermedad clínica durante 10 semanas. (B) Puntuación clínica a las 10 semanas. Ratones tratados con IL-12 y LPS el día 1 tras la transferencia adoptiva de linfocitos T.
Figura 38. Detección de los niveles séricos in vivo de IL-22 (ng/ml) en ratones psoriásicos tratados con 16 mg/kg de 356A11 o un anticuerpo control. Ratones tratados con IL-12 y LPS el día 1 tras la transferencia adoptiva de linfocitos T.
Figura 39. Detección de los niveles séricos in vivo de (A) IL-17A y (B) IL-6 en ratones psoriásicos tratados con 16 mg/kg de 356A11 o un anticuerpo control (sin
Coadministración de IL-12 y LPS) y (C) IL-17A y (D) IL-6 en ratones psoriásicos tratados con 16 mg/kg de 356A11 o un anticuerpo control (IL-12 y LPS coadministrados el día 1 tras la transferencia adoptiva de linfocitos T).
Figura 40. (A) Puntuación media de la gravedad de la enfermedad o (B) Puntuación de la gravedad de la enfermedad el día 30 de 16 mg kg_1 de 356A11 administrado en días alternos en un modelo de AIC murina. Figuras 41. Puntuación media de la gravedad de la enfermedad de 8 mg kg_1 de 356A11 administrado en días alternos, una vez a la semana o dos veces a la semana en un modelo de AIC murina.
Figura 42. Evaluación histológica (pasta) de la progresión de la enfermedad en ratones tratados con (A) 8 mg kg_ 1 de 356A11 una vez a la semana, (B) 8 mg kg_1 de 356A11 dos veces a la semana o (C) 8 mg kg_1 de 356A11 en días alternos.
Figura 43. Evaluación histológica (puntuación media de la gravedad en la pata) de la progresión de la enfermedad en ratones tratados con 8 mg kg_1 de 356A11 una vez a la semana, dos veces a la semana o en días alternos.
Figuras 44A-B. Puntuaciones medias de la gravedad de la enfermedad de dos estudios separados de 8 mg kg'1 de 356A11 administrado una o vez a la semana en un modelo de AIC murina.
Figuras 45A-B. Evaluación histológica (pata) de la progresión de la enfermedad de dos estudios distintos en ratones tratados con 8 mg kg-1 de 356A11 una vez a la semana en un modelo de AIC murina.
Figuras 46A-C. Puntuaciones medias de la gravedad de la enfermedad de tres estudios separados de 8 mg kg-1 de 368D04 administrado una o vez a la semana en un modelo de AIC murina.
Figuras 47A-C. Evaluación histológica (pata) de la progresión de la enfermedad de tres estudios distintos en ratones tratados con 8 mg kg-1 de 368D04 una vez a la semana en un modelo de AIC murina.
Figura 48. Niveles séricos de (A) IL-6 (pg/ml) y (B) CXCL1 (ng/ml) de ratones tratados con 356A11 (8 mpk una vez a la semana) en un modelo de AIC murina.
Descripción detallada
I. Definiciones
Con el fin de que la presente invención pueda entenderse con mayor facilidad, primero se definen ciertos términos y expresiones. A lo largo de la descripción detallada se exponen definiciones adicionales.
El término “anticuerpo” hace referencia a una inmunoglobulina o fragmento de la misma y abarca cualquier polipéptido que comprende un fragmento de unión a antígeno o un dominio de unión a antígeno. El término incluye, entre otros, anticuerpos policlonales, monoclonales, monoespecíficos, poliespecíficos, inespecíficos, humanizados, humanos, monocatenarios, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados, injertados y generados in vitro. A menos que vaya precedido por la palabra “intacto”, el término “anticuerpo” incluye fragmentos de anticuerpo tales como Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, y otros fragmentos de anticuerpo que conserven la función de unión al antígeno. Típicamente, tales fragmentos comprenderían un dominio de unión al antígeno.
Las expresiones “dominio de unión a antígeno” y “fragmento de unión a antígeno” hacen referencia a una parte de una molécula de anticuerpo que comprende los aminoácidos responsables de la unión específica entre anticuerpo y antígeno. La parte del antígeno que es reconocida específicamente y unida por el anticuerpo se conoce como “epítopo”. Un dominio de unión a antígeno puede comprender una región variable de la cadena ligera (Vl) del anticuerpo y una región variable de la cadena pesada (Vh) del anticuerpo; no obstante, no tiene que comprender ambas. Los fragmentos Fd, por ejemplo, tienen dos regiones Vh y a menudo retienen alguna función de unión a antígeno del dominio de unión a antígeno intacto. Ejemplos de fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo incluyen (1) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que tienen los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1; (2) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (3) un fragmento Fd que tiene los dominios Vh y Ch1; (4) un fragmento Fv que tiene los dominios Vl y Vh de un único brazo de un anticuerpo; (5) un fragmento dAb (Ward y coI., Nature 341 :544-546, que tiene un dominio Vh; (6) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada; y (7) un Fv monocatenario (ScFv). Aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, están codificados por genes distintos, pueden unirse, usando procedimientos recombinantes, mediante un ligador sintético que permite que se formen en forma de una proteína de una cadena en la que las regiones Vl y Vh se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242:423-426; y Huston y col., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas para los expertos en la técnica y los fragmentos se evalúan para determinar la función del mismo modo que son anticuerpos intactos.
La expresión “cantidad eficaz” hace referencia a una dosis o cantidad que es suficiente para regular la actividad de la IL-22 para mejorar los síntomas clínicos o conseguir un desenlace biológico deseado, por ejemplo, menor actividad de linfocitos T y/o de linfocitos B, supresión de autoinmunidad, supresión de rechazos de trasplantes etc. La expresión “anticuerpo humano” incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes correspondientes sustancialmente a las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana conocidas en la materia, incluyendo, por ejemplo, los descritos por Kabat y col., (Véase Kabat y col., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication N° 91­ 3242). Los anticuerpos humanos de la divulgación pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y, en particular, CDR3. El anticuerpo humano puede tener al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o más posiciones sustituidas por un resto de aminoácido que no está codificado por la secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana.
La frase “inhibir” o “antagonizar” la actividad de la IL-22 y sus afines hace referencia a una reducción, inhibición o, de otro modo, disminución de al menos una actividad de la IL-22 debido a la unión a un anticuerpo anti-IL-22, en el que la reducción es relativa a la actividad de la IL-22 en ausencia del mismo anticuerpo. La actividad se puede medir usando cualquier técnica conocida en la materia, incluyendo, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos 7 y 9. Inhibición o antagonismo no necesariamente indican una eliminación total de la actividad biológica del polipéptido IL-22. Una reducción en la actividad puede ser de aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o más.
El término “interleucina 22" o “ IL-22" hace referencia a una citocina de clase II (que puede ser de mamífero) capaz de unirse al IL-22R y/o a un complejo receptor de IL-22R e IL-10R2 y tiene al menos una de las características siguientes: (1) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de IL-22 de mamífero de origen natural (de longitud completa o la forma madura) o un fragmento del mismo, por ejemplo una secuencia de aminoácidos mostrada como la SEQ ID NO: 1 (ser humano) o la SEQ ID N1 3 (murino) o un fragmento del mismo; (2) una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a, por ejemplo, al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idéntica a, una secuencia de aminoácidos mostrada como la SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos 34-179 de la misma (humana) o la SEQ ID NO: 3 (murina) o un fragmento de la misma; (3) una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos de la IL-22 de mamífero de origen natural o un fragmento de la misma (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2 o los nucleótidos 71 a 610 (humanos) o la SEQ ID NO: 4 (murina) o un fragmento de la misma; (4) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a, por ejemplo, al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idéntica a, una secuencia de nucleótidos mostrada como la SEQ ID NO: 2 o los nucleótidos 71 a 610 de la misma (humana) o la SEQ ID NO: 4 (murina) o un fragmento de la misma; (5) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos degenerada a una secuencia de nucleótidos de la IL-22 de origen natural o un fragmento de la misma, por ejemplo la SEQ ID NO: 2 (humana) o la SEQ ID NO: 4 (murina) o un fragmento de la misma; o (6) una secuencia de nucleótidos que hibrida con una de las secuencias nucleotídicas anteriores en condiciones rigurosas, por ejemplo condiciones altamente rigurosas. La IL-22 se puede unir al IL-22R y/o un complejo receptor de IL-22R e IL-10R2 de origen mamífero, por ejemplo, de ser humano o de ratón.
La secuencia de nucleótidos y la secuencia predicha de aminoácidos de la IL-22 humana se muestran en la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 1, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la IL-22 humana madura corresponde a los aminoácidos 34-179 de la SEQ ID NO: 1. El análisis de la IL-22 humana recombinante revela muchos dominios estructurales. (Nagem y col., (2002) Structure, 10:1051-62; solicitud de patente de EE.UU. N° US 2002/0187512 A1).
La expresión “actividad de la IL-22” hace referencia a al menos un proceso celular iniciado o interrumpido como resultado de la unión de la IL-22 a un complejo receptor que consiste en IL-22R e IL-10R sobre la célula. Las actividades de la IL-22 incluyen al menos uno de, entre otros: (1) unión al IL-22R o a un complejo receptor de la IL-22R e IL10R2 (por ejemplo, IL-22R humano con o sin IL-10R2 humano); (2) asociación con moléculas de la transducción de la señal (por ejemplo, JAK-1); (3) estimulación de la fosforilación de las proteínas STAT (por ejemplo, STAT5, STAT3, o una combinación de los mismos); . (4) activación de las proteínas STAT; y (5) modulación (por ejemplo, incremento o disminución) de la proliferación, diferenciación, función de las células efectoras, actividad citolítica, secreción de citocinas, supervivencia o combinaciones de las mismas, de células epiteliales, fibroblastos o células inmunitarias. Las células epiteliales incluyen, entre otros, células de la piel, los intestinos, el hígado y los riñones, así como células endoteliales. Los fibroblastos incluyen, entre otros, fibroblastos sinoviales. Las células inmunitarias incluyen linfocitos T CD8+ y CD4+, células NK, linfocitos B, macrófagos y megacariocitos. La actividad de la IL-22 puede determinarse un vitro usando, por ejemplo, el ensayo de inhibición del receptor de la IL-22 como se describe en los Ejemplos 2 y 6, el ensayo de secreción de GROa en el Ejemplo 9 o el ensayo de proliferación de BAF3 del Ejemplo 7. La actividad de la IL-22 también se puede determinar in vivo mediante, por ejemplo, la puntuación de la progresión de una respuesta inmunitaria o trastorno como se describe en el Ejemplo 13.
Como se usa en el presente documento, “anticuerpo generado in vitro’’ hace referencia a un anticuerpo en el que todo o parte de la región variable (por ejemplo, al menos una CDR) se genera en una selección de células no inmunológicas (por ejemplo, una expresión en fagos in vitro, chip proteico o cualquier otro procedimiento en el que las secuencias candidato se pueden analizar para determinar su capacidad para unirse a un antígeno). Este término excluye las secuencias generadas mediante reordenación genómica en una célula inmunitaria.
El término “aislado” hace referencia a una molécula que carece sustancialmente de su ambiente natural. Por ejemplo, una proteína aislada carece sustancialmente de material celular u otras proteínas de la fuente celular o tisular de la que ha derivado. El término también se refiere a preparaciones en las que la proteína aislada es lo bastante pura para las composiciones farmacéuticas; o tiene una pureza de al menos un 70-80 % (p/p) o tiene una pureza de al menos un 80-90 % (p/p) o tiene una pureza de al menos un 90-95 % o tiene una pureza de al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % (p/p).
La frase “porcentaje idéntico” o “identidad en porcentaje” hace referencia a la similitud entre al menos dos secuencias diferentes. Esta identidad en porcentaje se puede determinar mediante algoritmos de alineación estándar, por ejemplo, la herramienta Basic Local Alignment Tool (BLAST) descrita por Altshul y col., ((1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410); el algoritmo de Needleman y col., ((1970) J. Mol. Biol., 48: 444-453); el algoritmo de Meyers y col., ((1988) Comput. Appl. Biosci., 4:11-17). Un conjunto de parámetros puede ser la matriz de puntuación Blosum 62 con una penalización por espacio de 12, una penalización de extensión por espacio de 4 y una penalización por espacio de cambio de marco de 5. La identidad en porcentaje entre dos secuencias de aminoácidos o de nucleótidos también se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers and W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17), que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) usando una tabla de restos en peso PAM120, una penalización por longitud de espacio de 12 y una penalización por espacio de 4. La identidad en porcentaje normalmente se calcula comparando las secuencias de longitud similar.
El término “repertorio” hace referencia a al menos una secuencia de nucleótidos derivada total o parcialmente de al menos una secuencia que codifica al menos una inmunoglobulina. La o las secuencias se pueden generar mediante reordenación in vivo de los segmentos V, D y J de las cadenas pesadas y los segmentos V y J de las cadenas ligeras. Como alternativa, la o las secuencias se pueden generar a partir de una célula en respuesta a la cual se produce la reordenación, por ejemplo, estimulación in vitro. Como alternativa, parte o todas las secuencias se pueden obtener mediante corte y empalme del ADN, síntesis de nucleótidos, mutagénesis y otros procedimientos, véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.565.332. Un repertorio puede incluir solo una secuencia o puede incluir una pluralidad de secuencias, incluyendo unas en una colección genéticamente diversa.
Las expresiones “unión específica” o “se une específicamente” hace referencia a dos moléculas que forman un complejo que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica se caracteriza por una afinidad alta y una capacidad de baja a moderada en contraposición a la unión inespecífica que normalmente tiene una afinidad baja con una capacidad de moderada a alta. Normalmente, la unión se considera específica cuando la constante de asociación Ka es superior a 106 M-1. En caso necesario, la unión inespecífica se puede reducir sin que afecte sustancialmente a la unión específica variando las condiciones de unión. Un experto en la técnica puede optimizar las condiciones de unión adecuadas, tales como la concentración de anticuerpos, la fuerza iónica de la solución, la temperatura, el tiempo permitido para la unión, la concentración de un agente de bloqueo (por ejemplo, seroalbúmina, caseína de la leche) etc. usando técnicas de rutina. Condiciones ilustrativas se exponen en el Ejemplo 3, pero otras condiciones conocidas por los expertos en la técnica entran dentro del ámbito de la presente divulgación.
Como se usa el presente documento, “riguroso” describe condiciones las condiciones de hibridación y lavado. Los expertos en la técnica conocen las condiciones rigurosas y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. En dicha referencia se describen procedimientos acuosos y no acuosos y se puede usar cualesquiera de ellos. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en 6X cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de al menos un lavado en 0,2X de SSC, SDS al 0,1 % a 50 °C. Un segundo ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en 6X SSC a aproximadamente 45 °C, seguida de al menos un lavado en 0,2X de SDS al 0,1 % a 55 °C. Otro ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en 6X de SSC a aproximadamente 45 °C, seguida de al menos un lavado en 0,2X de SSC, SDS al 0,1 % a 60 °C. Un ejemplo adicional de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en 6X de SSC a aproximadamente 45 °C, seguido de al menos un lavado en 0,2X de SSC, SDS al 0,1 % a 65 °C. Condiciones de rigurosidad alta incluyen hibridación en fosfato sódico 0,5 M, 7 % de SDS a 65 °C, seguida de al menos un lavado a 0,2X de SSC, SDS al 1% a 65 °C.
Las frases “sustancialmente como se ha indicado”, “sustancialmente idéntica” o “sustancialmente homóloga” significa que la secuencia de aminoácidos o nucleótidos relevante (por ejemplo, CDR, dominio Vh, o Vl) será idéntica o tendrá diferencias poco sustanciales (a través de sustituciones conservadoras de aminoácidos) en comparación con las secuencias como se han expuesto. Diferencias insustanciales incluyen cambios menores de aminoácidos, tales como 1 o 2 sustituciones en una secuencia de 5 aminoácidos de una región especificada. En el caso de los anticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad y tiene al menos un 50% de la afinidad del primer anticuerpo.
Las secuencias sustancialmente idénticas u homólogas (por ejemplo, una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 85 %) a las secuencias desveladas en el presente documento también forman parte de la presente divulgación. En algunas realizaciones, la identidad de secuencia puede ser de aproximadamente 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o superior. Como alternativa, existe una identidad ú homología sustancial cuando los segmentos de ácido nucleico hibridan en condiciones de hibridación selectiva (por ejemplo, condiciones de hibridación altamente rigurosas) con la hebra complementaria. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular, o en forma parcialmente purificada o sustancialmente pura.
La expresión “agente terapéutico” es una sustancia que trata o ayuda a tratar un trastorno médico. Los agentes terapéuticos pueden incluir, entre otros, sustancias que modulan las células inmunitarias o las respuestas inmunitarias de un modo que complementan la actividad de la IL-22 de los anticuerpos anti-IL-22. Ejemplos no limitantes y usos de los agentes terapéuticos se describen en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, una “cantidad terapéuticamente eficaz” de un anticuerpo anti-IL-22 hace referencia a una cantidad de un anticuerpo que es eficaz, tras la administración de una o varias dosis a un sujeto (como un paciente humano) en el tratamiento, prevención, curación, retraso, reducción de la gravedad y/o mejora de al menos un síntoma de un trastorno o trastorno recurrente, o prolongación de la supervivencia del sujeto más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento.
El término "tratamiento" hace referencia a una medida terapéutica o preventiva. El tratamiento se puede administrar a un sujeto que tenga un trastorno médico o que, en última instancia, pueda contraer el trastorno, con el fin de prevenir, curar, retrasar, reducir la gravedad y/o mejorar uno o más síntomas de un trastorno o trastorno recurrente o con el fin de prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento.
II. Anticuerpos anti-IL-22
La divulgación proporciona nuevos anticuerpos anti-IL-22 que comprenden nuevos fragmentos de unión a antígeno.
Se dispone de numerosos procedimientos conocidos por los expertos en la técnica para obtener anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos usando procedimientos de ADN recombinante (patente de EE.UU. N° 4.816.567). Los anticuerpos monoclonales también se pueden producir mediante generación de hibridomas (véase, por ejemplo, Kohler y Milstein (1975) Nature, 256: 495-499) de acuerdo con procedimientos conocidos. Los hibridomas formados de este modo se detectan después usando procedimientos estándar, como ensayo de inmunosorción ligado a enzimas (ELISA) y análisis por resonancia en plasmón superficial (BIACORE™) para identificar uno o más hibridomas que producen un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno especificado. Cualquier forma del antígeno especificado se puede usar como inmunógeno, por ejemplo, antígeno recombinante, formas de origen natural, cualquier variante o fragmentos del mismo, así como péptido antigénico del mismo.
Un procedimiento de ejemplo de fabricación de anticuerpos incluye detección selectiva de bibliotecas de expresión de proteínas, por ejemplo, bibliotecas de expresión en fagos o ribosomas. La expresión en fagos se describe en, por ejemplo, Ladner y col., patente de EE.UU. N° 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; Clackson y col., (1991) Nature, 352: 624-628; Marks y col., (1991) J. Mol Biol., 222: 581-597 documentos WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; y WO 90/02809.
Además del uso de bibliotecas de expresión, el antígeno especificado se puede usar para inmunizar un animal no humano, por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón, hámster o rata. En una divulgación, el animal no humano incluye al menos una parte de un gen de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, es posible modificar cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con fragmentos grandes de los loci de Ig humana. Usando la tecnología del hibridoma se pueden producir y seleccionar anticuerpos monoclonales específicos de antígeno derivados de los genes con la especificidad deseada. Véase, por ejemplo, XENOMOUSE™, Green y col., (1994) Nature Genetics 7:13-21, documento US 2003-0070185, documento w O 96/34096, publicado el 31 de octubre de 1996, y solicitud de PCT n.° PCT/US96/05928, presentada el 29 de abril de 1996.
En otra divulgación se obtiene un anticuerpo monoclonal del animal no humano y, después se puede producir modificado, por ejemplo, humanizado, desinmunizado, quimérico, usando técnicas de ADN recombinante conocidas en la materia. Se han descrito diversos abordajes para fabricar anticuerpos quiméricos. Véase, por ejemplo, Morrison y col., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 81:6851, 1985; Takeda y col., Nature 314:452, 1985, Cabilly y col., patente de EE.UU. N° 4.816.567; Boss y col., patente de EE.UU. N° 4.816.397; Tanaguchi y col., LA publicación de patente europea EP171496; LA publicación de patente europea 0173494, la patente del Reino Unido Gb 2177096B. Los anticuerpos humanizados también se pueden producir, por ejemplo, usando ratones transgénicos que expresan los genes de las cadenas ligeras y pesadas humanas pero que no pueden expresar los genes de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina de ratón endógena. Winter describe un procedimiento de injerto de CDR ilustrativo que se puede usar para preparar los anticuerpos humanizados descritos en el presente documento (patente de EE.UU. N° 5.225.539). Todas las CDR de un anticuerpo humano concreto pueden sustituirse con al menos una porción de una CDR no humana o solo algunas de las CDR se pueden sustituir con CDR no humanas. Solo es necesario reemplazar el número de CDR necesarias para la unión del anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado.
Los anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos se pueden generar sustituyendo secuencias del dominio variable Fv que no están implicadas directamente en la unión del antígeno con secuencias equivalentes de dominios variables Fv humanos. Procedimientos de ejemplo para generar anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos se proporcionan en Morrison (1985) Science 229:1202-1207; en Oi y col., (1986) BioTechniques 4:214; y en los documentos US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.693 ,762; US 5.859.205; y US 6.407.213. Dichos procedimientos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican todos o parte de los dominios variables Fv de inmunoglobulina de al menos una de una cadena pesada o ligera. Dichos ácidos nucleicos se pueden obtener a partir de un hibridoma productor de un anticuerpo contra una diana predeterminada, como se ha descrito anteriormente, así como de otras fuentes. El ADN recombinante que codifica la molécula de anticuerpo humanizado se puede clonar después en un vector de expresión adecuado.
En determinadas divulgaciones, un anticuerpo humanizado se optimiza mediante la introducción de sustituciones conservadoras, sustituciones de secuencias consenso, sustituciones de línea germinal y/o retromutaciones. Dichas moléculas de inmunoglobulina alteradas se pueden producir mediante cualquiera de varias técnicas conocidas en la materia (por ejemplo, Teng y col., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor y col., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson y col., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982), y se pueden producir de acuerdo con las enseñanzas de la publicación pCr WO92/06193 o EP 0239400).
Un anticuerpo o fragmento del mismo también se puede modificar mediante deleción específica de epítopos de linfocitos T humanos o “desinmunización” mediante los procedimientos desvelados en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. En pocas palabras, los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo se pueden analizar para detectar péptidos que se unen al MHC de clase II; estos péptidos representan potenciales epítopos de linfocitos T (como se define en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección de potenciales epítopos de linfocitos T se puede aplicar un abordaje de modelo informático denominado “enhebrado de péptidos” y, además, se puede realizar búsquedas en una base de datos de los péptidos de unión del MHC de clase II humano de motivos presentes en las secuencias de Vh y Vl, como se describe en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 alotipos principales de DR de MHC de clase II y, por tanto, constituyen potenciales epítopos de los linfocitos T. Los potenciales epítopos de los linfocitos T detectados se pueden eliminar sustituyendo un número pequeño de restos de aminoácidos en los dominios variables o, preferentemente, mediante sustituciones de un solo aminoácido. Normalmente se realizan sustituciones conservadoras. A menudo, aunque no exclusivamente, se puede usar un aminoácido común a una posición en las secuencias de anticuerpo de la línea germinal humana. Las secuencias de la línea germinal humana, por ejemplo, se desvelan en Tomlinson, y col., (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. y col., (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; Chothia, D. y col., (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; y Tomlinson y col., (1995) EMBO J. 14:4628-4638. El directorio V BASE proporciona un directorio exhaustivo de las secuencias de la región variable de la inmunoglobulina humana (recopilado por Tomlinson, I.A. y col., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido). Estas secuencias se pueden usar como fuente de secuencias humanas, por ejemplo, para regiones marco y CDR. También se pueden usar regiones marco humanas consenso, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. n° 6.300.064.
En determinadas divulgaciones, un anticuerpo puede contener una región Fc o constante alterada de la inmunoglobulina. Por ejemplo, un anticuerpo producido de acuerdo con las enseñanzas del presente documento se puede unir con más fuerza o con más especificidad a moléculas efectoras, como el complemento y/o receptores de Fc, que pueden controlar varias funciones inmunitarias del anticuerpo, tal como la actividad de las células efectoras, la lisis, la actividad mediada por el complemento, el aclaramiento de anticuerpos y la semivida de los anticuerpos. Los receptores de Fc típicos que se unen a una región Fc de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo IgG) incluyen, entre otros, receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII y FcRn, incluyendo variantes alélicas y formas de corte y empalme alternativas de estos receptores. Los receptores de Fc se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92, 1991; Capel y col., Immunomethods 4:25-34.1994; y de Haas y col., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41, 1995).
Para técnicas de producción de anticuerpos adicionales véase Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow y col., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. La presente divulgación no está necesariamente limitada a ninguna fuente, procedimiento de producción u otras características especiales de un anticuerpo.
Los anticuerpos, también conocidos como inmunoglobulinas, son normalmente proteínas tetraméricas glicosiladas compuestas por dos cadenas ligeras (L) de aproximadamente 25 kDa y dos cadenas pesadas (H) de aproximadamente 50 kDa cada una. En los anticuerpos se pueden encontrar dos tipos de cadena ligera, denominadas lambda y kappa. En función de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de las cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a cinco clases principales. A, D, E, G, and M, y varios de éstos pueden además dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG-i, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2. Cada cadena ligera incluye un dominio variable (V) en el extremo N (VL) y un dominio constante (C) (CL). Cada cadena pesada incluye un dominio V en el extremo N (VH) y cuatro dominios C (CH) y una región bisagra. El dominio CH más proximal a VH se denomina CH 1. Los dominios VH y VL consisten en cuatro regiones de secuencias relativamente conservadas denominadas regiones marco (FR1, FR2, FR3, y FR4), que forman un armazón para tres regiones de secuencias hipervariables (regiones determinantes de la complementariedad, CDR). Las CDR contienen la mayoría de los restos responsables de interacciones específicas del anticuerpo con el antígeno. Las CDR se denominan CDR1, CDR2 y CDR3. De acuerdo con lo anterior, los constituyentes CDR de la cadena pesada se denominan H1, H2 y H3, mientras que los constituyentes CDR de la cadena ligera se denominan L1, L2 y L3.
La CDR3 normalmente es la fuente más grande de diversidad molecular dentro del sitio de unión al anticuerpo. H3, por ejemplo, puede ser tan corta como de dos restos de aminoácidos o más de 26 aminoácidos. Las estructuras de la subunidad y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas en la técnica. Para una revisión de la estructura de los anticuerpos véase Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow y col., 1988. Un experto en la técnica reconocerá que cada estructura de subunidad, por ejemplo una estructura de CH, VH, CL, VL, CDR, FR, comprende fragmentos activos, por ejemplo la porción de la subunidad VH, VL, o CDR que se une al antígeno, es decir, el fragmento de unión a antígeno o, por ejemplo, la porción de la subunidad CH que se une y/o activa, por ejemplo, un receptor de Fc y/o el complemento. Las CDR normalmente se refieren a las CDR de Kabat, como se describe en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat y col., Otro patrón para caracterizar el sitio de unión a antígeno es hacer referencia a los bucles hipervariables como describe Chothia. Véase, por ejemplo, Chothia, D. y col., (1992; J. Mol. Biol. 227:799-817; y Tomlinson y col., (1995) EMBO J. 14:4628-4638. Otros patrones más es la definición de AcMo usada por el software de modelación de anticuerpos AcMo de Oxford Molecular. Véase, en general, por ejemplo, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. En: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. y Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). Las divulgaciones descritas con respecto a las CDR de Kabat pueden implementarse alternativamente usando relaciones similares descritas con respecto a los bucles hipervariables de Chothia o a los bucles definidos por los AcMo.
El fragmento Fab (fragmento unión a antígeno, Fragment antigen-binding)) consiste en los dominios Vh-CHI y Vl-Cl unidos covalentemente por un puente disulfuro entre las regiones constantes. El fragmento Fv es más pequeño y consiste en los dominios Vh y Vl unidos de forma no covalente. Para superar la tendencia de los dominios unidos de forma no covalente a disociarse se puede construir un fragmento Fv monocatenario (scFv) El scFv contiene un polipéptido flexible que une (1) el extremo C de Vh al extremo N de Vl, o (2) el extremo C de Vl al extremo N de Vh. Se puede usar un péptido (Gly4Ser)3 de 15 unidades como enlazador, pero en la técnica se conocen otros enlazadores.
La secuencia de los genes de los anticuerpos tras el ensamblaje y la mutación somática es muy variable, y se estima que estos genes variados codifican 1010 moléculas de anticuerpo diferentes (Immunoglobulin Genes, 2a ed., eds. Jonio y col., Academic Press, San Diego, CA, 1995).
Un anticuerpo “biespecífico” o “bifuncional” es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante diversos procedimientos, incluidos fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin: Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny y col., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). En una divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende un primer polipéptido del dominio de unión, tal como un fragmento Fab', unido a través de una región constante de la inmunoglobulina a un segundo polipéptido del dominio de unión.
Las sustancias inmunofarmacéuticas modulares pequeñas (Small Modular [mmunoPharmaceuticals (SMI P™)) proporcionan un ejemplo de una molécula variante que comprende un polipéptido del dominio de unión. Las SMIP y sus usos y aplicaciones de desvelan en, por ejemplo, las solicitudes de patente de EE.UU. publicadas n° 2003/0118592, 2003/0133939, 2004/0058445, 2005/0136049, 2005/0175614, 2005/0180970, 2005/0186216, 2005/0202012, 2005/0202023, 2005/0202028, 2005/0202534, and 2005/0238646, y miembros relacionados de la familia de patentes de las mismas, todas ellas incorporadas en el presente documento por referencia en su totalidad.
Una SMIP™ normalmente hace referencia a una proteína de fusión de inmunoglobulina-dominio de unión que incluye un polipéptido del dominio que está fusionado o conectado de otro modo a un polipéptido región bisagra de la inmunoglobulina, o que actúa como bisagra, que a su vez está fusionado o conectado de otro modo a una región que comprende una o más regiones constantes modificadas o más nativas de una cadena pesada de la inmunoglobulina, aparte de CH 1, por ejemplo las regiones CH2 y CH3 de IgG e IgA o las regiones c H3 y CH4 de la IgE (véase, por ejemplo, el documento U.S. 2005/0136049 de Ledbetter, J. y col., que se incorpora por referencia, para una descripción más completa). La proteína de fusión dominio de unión-inmunoglobulina puede incluir además una región que incluye un polipéptido de la región constante CH2 de la cadena pesada de la inmunoglobulina nativa o modificada (o CH3 en el caso de una construcción derivada por completo o en parte de la IgE) que está fusionada o conectada de otro modo al polipéptido de la región bisagra y un polipéptido de la región constante CH3 de la cadena pesada de la inmunoglobulina nativa o modificada (o CH4 en el caso de una construcción derivada por completo o en parte de la IgE) que está fusionada o conectada de otro modo con el polipéptido de la región constante CH2 (o CH3 en el caso de una construcción derivada por completo o en parte de la IgE). Normalmente, dichas proteínas de fusión dominio de unión-inmunoglobulina son capaces de al menos una actividad inmunológica seleccionada del grupo que consiste en citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, fijación del complemento y/o unión a una diana, por ejemplo, un antígeno diana, tal como la IL-22 humana.
Las proteínas terapéuticas, es decir una proteína o péptido que tiene un efecto biológico sobre una región en el cuerpo o que actúa sobre una región del cuerpo sobre la cual actúa remotamente a través de intermedios, son útiles para poner en práctica la divulgación. Una proteína terapéutica puede incluir miméticos peptídicos. Los miméticos son moléculas que contienen péptidos que imitan a los elementos de la estructura secundaria de las proteínas. Véase, por ejemplo, Johnson y col., "Peptide Turn Mimética" En BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto y col., Eds., (Chapman y Hall, Nueva York, 1993). El fundamento subyacente al uso de miméticos peptídicos es que la estructura peptídica de las proteínas existe principalmente para orientar las cadenas laterales de aminoácidos de modo que se faciliten las interacciones moleculares, como las de los anticuerpos y los antígenos. Cabe esperar que un mimético peptídico permita interacciones moleculares similares a la molécula natural. Estos principios se pueden usar para modificar las moléculas de segunda generación que tienen muchas de las propiedades naturales de los péptidos dirigidos desvelados en el presente documento, pero con características alteradas y potencialmente mejoradas.
Otras divulgaciones de proteínas terapéuticas incluyen proteínas de fusión. Estas moléculas generalmente tienen todo o una porción sustancial de un péptido dirigido, por ejemplo, IL-22 o un anticuerpo anti-IL-22, unido al extremo C o N, a todo o una porción de un segundo polipéptido o proteína. Por ejemplo, las proteínas de fusión pueden emplear secuencias líder de otras especies para permitir la expresión recombinante de una proteína en un huésped heterólogo. Otra proteína de fusión incluye la adición de un dominio inmunológicamente activo, tal como un epítopo de anticuerpo, para facilitar la purificación de la proteína de fusión. La inclusión de un sitio de escisión en o próximo a la unión de fusión facilitará la eliminación del polipéptido extraño tras la purificación. Otras fusiones útiles incluyen enlaces de dominios funcionales, tales como sitios activos de enzimas, dominios de glicosilación, señales dirigidas celulares o regiones transmembrana. Ejemplos de proteínas o péptidos que se pueden incorporar en una proteína de fusión incluyen proteínas citostáticas, proteínas citocidas, agentes proapoptosis, agentes antiangiogénesis, hormonas, citocinas, factores de crecimiento, fármacos peptídicos, anticuerpos, fragmentos Fab de anticuerpos, antígenos, proteínas receptoras, enzimas, lectinas, proteínas del MHC, proteínas de adhesión celular y proteínas de unión. Los expertos en la técnica conocen bien procedimientos de generar proteínas de fusión, Dichas proteínas se pueden producir mediante, por ejemplo, fijación química usando reactivos de reticulación bifuncionales, mediante síntesis de novo de la proteína de fusión completa o mediante fijación de una secuencia de ADN que codifica el péptido dirigido a una secuencia de ADN que codifica el segundo péptido o proteína, seguido de la expresión de la proteína de fusión intacta.
En una divulgación, el péptido dirigido, por ejemplo, IL-22 o un anticuerpo anti-IL-22, se fusiona con una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, tal como un fragmento Fc, que contiene dos dominios de la región constante y una región bisagra, pero carece de la región variable (véanse las patentes de EE.UU. N° 6.018.026 y 5.750.375). La región Fc puede ser una región Fc de origen natural o se puede alterar para mejorar determinadas cualidades, tales como cualidades terapéuticas, el tiempo de circulación, agregación reducida etc. Los péptidos y las proteínas fusionadas con una región Fc normalmente exhiben una semivida in vivo mayor que la del homólogo sin fusionar. Asimismo, una fusión a una región Fc permite la dimerización/multimerización del polipéptido de fusión.
Las moléculas VHH (o nanocuerpos), como las conoce el experto en la técnica, son dominios variables de la cadena pesada derivados de inmunoglobulinas desprovistas de forma natural de cadenas ligeras, como los derivados de Camelidae como se describe en el documento WO9404678. Dicha molécula VHH puede derivar de anticuerpos producidos en especies Camelidae, por ejemplo, en camello, llama, dromedario, alpaca y guanaco, y en ocasiones se denomina un dominio variable de camélido o camelizado. Véase, por ejemplo, Muyldermans., J. Biotechnology (2001) 74(4):277-302. Otras especies además de Camelidae pueden producir anticuerpos de cadena pesada desprovistos de forma natural de la cadena ligera. Las moléculas VHH son aproximadamente 10 veces más pequeñas que las moléculas de IgG. Son polipéptidos sencillos y muy estables que resisten condiciones de pH y temperatura extremas. Además, son resistentes a la acción de las proteasas, lo que no es el caso para los anticuerpos convencionales. Adicionalmente, la expresión in vitro de las VHH produce VHH funcionales adecuadamente plegadas y con un rendimiento elevado. Además, los anticuerpos generados en camélidos reconocerán epítopos aparte de los reconocidos por los anticuerpos generados in vitro mediante el uso de bibliotecas de anticuerpos o a través de la inmunización de mamíferos aparte de camélidos (véase el documento WO 9749805).
Un aspecto de la presente invención comprende anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que se unen a IL-22. La divulgación proporciona nievas CDR derivadas de las bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. La estructura par llevar una CDR generalmente es un a cadena pesada o ligera de anticuerpo, o una porción de la misma, en la que la CDR se localiza en una región de CDR de origen natural. Las estructuras y localizaciones de los dominios variables se pueden determinar como se describe en Kabat y col., M Sequences of Proteins of Immunological Interest, N° 91-3242, National Institutes of Health Publications, Bethesda, MD (1991).
Las secuencias de ADN y de aminoácidos (AA) de las realizaciones ilustrativas de los anticuerpos anti-IL-22 de la invención, incluyendo sus fragmentos scFv, los dominios Vh y Vl y las CDR, se exponen en las Figuras 7-10 y se enumeran en las Tablas 1 y 7. Veinte anticuerpos específicos no modificados en la línea germinal se identifican como desvelados como GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, de acuerdo con la invención como 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 y 356A11. Las posiciones de las CDR en los dominios Vh and Vl de los anticuerpos no modificados en la línea germinal se enumeran en la Tabla 2. Quince anticuerpos específicos modificados en la línea germinal se identifican de acuerdo con la divulgación como GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, de acuerdo con la invención como 062A09, 087B03, 166B06, 166G05, 354A08, 355B06, 355E04, 356A11 y 368D04.
Los anticuerpos anti-IL-22 de la presente invención pueden comprender opcionalmente regiones constantes del anticuerpo o partes de las mismas. Por ejemplo, un dominio Vl puede estar unido en su extremo del C terminal a un dominio constante de la cadena ligera como CK o CA. De un modo similar, un dominio Vh o porción del mismo puede estar unido a todo o parte de una cadena ligera como IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y cualquier subclase de isotipo. Las regiones constantes se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, No. 91-3242, National Institutes of Health Publications, Bethesda, m D (1991)). Por tanto, los anticuerpos dentro del ámbito de la presente invención incluyen los dominios Vh y Vl, o una porción de los mismos, combinados con regiones constantes conocidas en la materia.
Determinadas realizaciones comprenden un dominio Vh, un dominio Vl o una combinación de los mismos, del fragmento Fv de, de acuerdo con la divulgación, GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, de acuerdo con la invención, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 o 356A11. Otra realización comprende un dominio Vh, un dominio Vl o una combinación de los mismos, del fragmento Fv de un anticuerpo elegido de 356A11, 354A08, 087B03 y 368D04. Otras realizaciones comprenden una, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de los dominios Vh y Vl. Los anticuerpos cuyas secuencias de CDR están incluidas en las SEQ ID NO:, de acuerdo con la divulgación, 5-13, 23­ 31, 41-49, 59-67, 77-85, 95-103, 113-121, de acuerdo con la invención 131-139, 149-157, 167-175, 185-193, 203­ 211, 221-229, de acuerdo con la divulgación 239-247, 257-265, 275-283, 293-301, 311-319, 329-337, 347-355, 365­ 373, 383-391, 401-409, 419-427, 437-445, 455-463, 473-481, de acuerdo con la invención 491-499, 509-517, 527­ 535, 545-553, 563-571, 581-589, 599-607, o 617-625 están abarcados dentro del ámbito de la presente invención. Por ejemplo, en una realización, un anticuerpo comprende un fragmento H3 del dominio Vh de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 o 356A11 de acuerdo con la divulgación, modificados en la línea germinal o no modificados en la línea germinal o de un anticuerpo elegido de 356A11, 354A08, 087B03, y 368D04.
En determinadas realizaciones, los dominios Vh y/o Vl pueden estar modificados en la línea germinal, es decir las regiones marco (FR) de estos dominios están mutadas usando técnicas de biología molecular convencionales para coincidir con las producidas por las células de línea germinal. En otras realizaciones, las secuencias FR siguen divergentes de las secuencias de línea germinal consenso. En una realización de la presente invención, los anticuerpos modificados en la línea germinal se muestran en la Tabla 7.
En una realización, la invención proporciona secuencias de aminoácidos y, como se desvela, de ácido nucleico para GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09 de acuerdo con la divulgación, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 o 356A11 de acuerdo con la divulgación, modificados en la línea germinal. Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos para el dominio Vh de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92 de acuerdo con la divulgación, 062A09, 087B03, 166B06, 166G05, 354A08, 355B06, 355E04, 356A11 y 368D04 de acuerdo con la invención, modificados en la línea germinal se representan en la Tabla 7 y la Figura 8. Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos para el dominio Vl de los desvelados GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, y realizados 062A09, 087B03, 166B06, 166G05, 354A08, 355B06, 355E04, 356A11 y 368D04 modificados en la línea germinal se representan también en la Tabla 7 y la Figura 8.
En una divulgación, la mutagénesis se usa para fabricar un anticuerpo más similar a una o más secuencias de línea germinal. Esto puede ser deseable cuando se introducen mutaciones en la región marco de un anticuerpo a través de mutagénesis somática o mediante PCR propensa a error. Las secuencias de línea germinal para los dominios Vh and Vl se pueden identificar realizando alineaciones de las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos contra la base de datos VBASE (MRC Center for Protein Engineering, Reino Unido). VBASE es un directorio exhaustivo de todas las secuencias de la región variable de la línea germinal humana recopiladas de más de mil secuencias publicadas, incluyendo las emisiones actuales de las bibliotecas de datos GenBank y EMBL. En algunas divulgaciones, las regiones FR de los scFv están mutadas conforme a las coincidencias más estrechas en la base de datos VBASE y las porciones de CDR se mantienen intactas.
En determinadas divulgaciones, los anticuerpos reaccionan específicamente con un epítopo que es el mismo que el epítopo reconocido por GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 o 356A11, de modo que inhiben de forma competitiva la unión de GIL01, GIL16. GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 o 356A11 a la IL-22 humana. Dichos anticuerpos se pueden determinar en ensayos de unión competitiva. En una divulgación, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo de IL-22 que es reconocido por 368D04, de forma que el anticuerpo inhibe competitivamente la unión de 368D04 a la IL-22 humana. En otra divulgación, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo de IL-22 que es reconocido por 356A11, de forma que el anticuerpo inhibe competitivamente la unión de 356A11 a la IL-22 humana. En otra divulgación, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo de IL-22 que es reconocido por 354A08. de forma que el anticuerpo inhibe competitivamente la unión de 354A08 a la IL-22 humana. En otra divulgación, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo de IL-22 que es reconocido por 087B03, de forma que el anticuerpo inhibe competitivamente la unión de 087B03 a la IL-22 humana. En una divulgación, la constante de asociación (Ka) de estos anticuerpos para la IL-22 humana es de al menos 106 M-1. En otra divulgación, la constante de asociación de estos anticuerpos para la IL-22 humana es de al menos 109 M-1. En otra divulgación, la constante de asociación de estos anticuerpos para la IL-22 humana es de al menos 1010 M-1, de al menos 1011 M-1, o de al menos 1012 M'-1. La afinidad de unión se puede determinar usando técnicas conocidas en la materia, tal como ELISA, tecnología de biosensor, tal como análisis de interacción bioespecífica, u otras técnicas, incluyendo las descritas en esta solicitud.
Se contempla que los anticuerpos de esta divulgación se pueden unir a otras proteínas, tales como, por ejemplo, las proteínas recombinantes que comprenden toda o una porción de IL-22.
Un experto habitual en la técnica reconocerá que los anticuerpos desvelados se pueden usar para detectar, medir y/o inhibir proteínas que difieren algo de la IL-22. Por ejemplo, estas proteínas pueden ser homólogas de la IL-22. Cabe esperar que los anticuerpos anti-IL-22 se unan a proteínas que comprenden una secuencia que es al menos aproximadamente un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más idéntica a cualquier secuencia de al menos 100, 80, 60, 40 o 20 aminoácidos contiguos en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1.
Además de los análisis de homología de secuencia, el mapeo de epítopos (véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, ed. Morris, Humana Press, 1996) y los análisis de estructura secundaria y terciaria se pueden llevar a cabo para identificar estructuras 3D específicas asumidas por los anticuerpos desvelados en el presente documento y sus complejos con antígenos. Dichos procedimientos incluyen, entre otros, cristalografía de rayos X (Engstom (1974) Biochem. Exp. Biol., 11:7-13) y modelación informática de representaciones virtuales de los presentes anticuerpos (Fletterick y col., (1986) Computer Graphics and Molecular Modeling, en Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
La divulgación proporciona un procedimiento para obtener anticuerpos anti-IL-22 que comprende crear anticuerpos con secuencia(s) de Vh y/o Vl alteradas en la Tabla 1. Dichos anticuerpos pueden derivarse de un experto en la técnica usando técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, se pueden introducir sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en las regiones FR y/o CDR. Los cambios en la FR normalmente se diseñan para mejorar la estabilidad y la inmunogenicidad del anticuerpo, mientas que los cambios de las CDR normalmente se diseñan para aumentar la afinidad del anticuerpo por su antígeno. Los cambios que aumentan la afinidad se pueden analizar alterando la secuencia de la CDR y midiendo la afinidad del anticuerpo por su diana (véase Antibody Engineering, 2a ed., Oxford University Press, ed. Borrebaeck, 1995).
Los anticuerpos cuyas secuencias de CDR difieren insustancialmente de los incluidos o incluidos dentro de las secuencias en las SEQ ID NO: 5-13, 23-31, 41-49, 59-67, 77-85, 95-103, 113-121, 131-139, 149-157, 167-175, 185­ 193, 203-211, 221-229, 239-247, 257-265, 275-283, 293-301, 311-319, 329-337, 347-355, 365-373, 383-391, 401­ 409, 419-427, 437-445, 455-463, 473-481, 491-499, 509-517, 527-535, 545-553, 563-571, 581-589, 599-607, o 617­ 625, están abarcados dentro del ámbito de la presente divulgación. Normalmente esto implica la sustitución de un aminoácido con un aminoácido que tiene características hidrofóbicas o estereoquímicas o de carga similares. También se pueden realizar sustituciones más drásticas en las regiones FR, en contraste con las regiones CDR, siempre que no afecten de forma adversa (por ejemplo, reduzcan la afinidad en más del 50 % en comparación con el anticuerpo sin sustituir) a las propiedades de unión del anticuerpo. Las sustituciones también se pueden realizar para que el anticuerpo sea de línea germinal o estabilizar el sitio de unión a antígeno.
Las modificaciones conservadoras producirán moléculas que tienen características funcionales y químicas similares a las de la molécula a partir de las cuales se realizan dichas modificaciones. En contraste con esto se pueden realizar modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de las moléculas seleccionando sustituciones en la secuencia de aminoácidos de que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento (1 ) de la estructura del armazón molecular en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o en hélice, (2) de la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (3) el tamaño de la molécula. Por ejemplo, una “sustitución de aminoácido conservadora” puede implicar una sustitución de un resto de aminoácido nativo con un resto no nativo, de modo que haya poco o ningún efecto sobre la polaridad o la carga del resto de aminoácido en dicha posición. (Véase, por ejemplo, MacLennan y col., 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl.
643:55-67; Sasaki y col., 1998, Adv. Biophys. 35:1-24).
Los expertos en la técnica pueden determinar sustituciones de aminoácidos deseadas (conservadoras o no conservadoras) en el momento en el que se deseen dichas sustituciones. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos se pueden usar para identificar restos importantes de la secuencia de la molécula o aumentar o disminuir la afinidad de las moléculas descritas en el presente documento. Ejemplos de sustituciones de aminoácidos incluyen, entre otras, las expuestas en la Tabla 3.
En determinadas divulgaciones, las sustituciones de aminoácidos conservadoras también abarcan restos de aminoácidos no naturales, que normalmente se incorporan mediante síntesis peptídica química en lugar de síntesis en sistemas biológicos.
En una divulgación, el procedimiento para producir un dominio Vh variante comprende añadir, eliminar o sustituir al menos un aminoácido en los dominios Vh desvelados o combinando los dominios Vh desvelados con al menos un dominio Vl y analizando el dominio Vh variante para la unión a IL-22 o la modulación de la actividad de la IL-22. Un procedimiento análogo para producir un dominio Vl variante comprende añadir, eliminar o sustituir al menos un aminoácido en los dominios Vl desvelados o combinando los dominios Vl desvelados con al menos un dominio Vh y analizando el dominio Vl variante para la unión a IL-22 o la modulación de la actividad de la IL-22.
Un aspecto adicional de la divulgación proporciona un procedimiento para preparar anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a IL-22. El procedimiento comprende:
(a) proporcionar un repertorio de partida de ácidos nucleicos que codifican un dominio Vh que carece de al menos una CDR o contiene al menos una CDR a sustituir;
(b) insertar o sustituir la región de CDR del repertorio de partida con al menos un ácido nucleico donante que codifica una secuencia de aminoácidos como se establece sustancialmente en el presente documento para una CDR de Vh, dando un repertorio de productos;
(c) expresar los ácidos nucleicos del repertorio de productos;
(d) seleccionar un fragmento de unión a antígeno específico que se une a IL-22; y
(e) recuperar el fragmento de unión a antígeno específico o ácido nucleico que lo codifica.
En un procedimiento análogo, al menos una CDR de Vl de la divulgación se combina con un repertorio de ácidos nucleicos que codifican un dominio de Vl que carece de al menos una CDR o contiene al menos una CDR a reemplazar. La al menos una CDR de Vh o Vl puede ser una CDR1, a CDR2, a CDR3, o una combinación de las mismas, incluyendo las combinaciones de las CDR de Vh y Vl como las expuestas en las Tablas 1 o 7, incluyendo las expuestas en las SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 620, 621, 622, 623, 624 o 625.
En una divulgación, el dominio variable incluye una CDR3 a sustituir o carece de una región que codifica la CDR3 y el al menos un ácido nucleico donante codifica un aminoácido sustancialmente como se expone en las SEQ ID NO: 10, 13, 28, 31, 46, 49, 64, 67, 82, 85, 100, 103, 118, 121, 136, 139, 154, 157, 172, 175, 190, 193, 208, 211, 226, 229, 244, 247, 262, 265, 280, 283, 298, 301, 316, 319, 334, 337, 352, 355, 370, 373, 388, 391, 406, 409, 424, 427, 442, 445, 460, 463, 478, 481,496, 499, 514, 517, 532, 535, 550, 553, 568, 571, 586, 589, 604, 607, 622 o 625.
En otra divulgación, el dominio variable incluye una CDR1 a sustituir o carece de una CDR1 que codifica la región y el al menos un ácido nucleico donante codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en las SEQ ID NO: 8, 11, 26, 29, 44, 47, 62, 65, 80, 83, 98, 101, 116, 119, 134, 137, 152, 155, 170, 173, 188, 191, 206, 209, 224, 227, 242, 245, 260, 263, 278, 281, 296, 299, 314, 317, 332, 335, 350, 353, 368, 371, 386, 389, 404, 407, 422, 425, 440, 443, 458, 461, 476, 479, 494, 497, 512, 515, 530, 533, 548, 551, 566, 569, 584, 587, 602, 605, 620 o 623.
En otra divulgación, el dominio variable incluye una CDR2 a reemplazar o carece de una región de codificación de CDR2 y el al menos un ácido nucleico donante codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en las SEQ ID NO: 9, 12, 27, 30, 45, 48, 63, 66, 81, 84, 99, 102, 117, 120, 135, 138, 153, 156, 171, 174, 189, 192, 207, 210, 225, 228, 243, 246, 261, 264, 279, 282, 297, 300, 315, 318, 333, 336, 351, 354, 369, 372, 387, 390, 405, 408, 423, 426, 441, 444, 459, 462, 477, 480, 495, 498, 513, 516, 531, 534, 549, 552, 567, 570, 585, 588, 603, 606, 621 o 624.
En otra divulgación, el dominio variable incluye una CDR3 a reemplazar o carece de una región de codificación de CDR3 y además comprende una CDR1 a reemplear o carece de una región de codificación de CDR1, en el que el al menos un ácido nucleico donante codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en las Tablas 1 o 7.
En otra divulgación, el dominio variable incluye una CDR3 a reemplazar o carece de una región de codificación de CDR3 y además comprende una CDR2 a reemplear o carece de una región de codificación de CDR2, en el que el al menos un ácido nucleico donante codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en las Tablas 1 o 7.
En otra divulgación, el dominio variable incluye una CDR3 a reemplazar o carece de una región de codificación de CDR3 y además comprende una CDR1 y una CDR2 a reemplear o carece de una región de codificación de CDR1 o CDR2, en el que el al menos un ácido nucleico donante codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en las Tablas 1 o 7.
Usando metodología de ADN recombinante se puede introducir una secuencia de CDR desvelada en un repertorio de los dominios Vh o Vl que carecen de las respectivas CDR (Marks y col., (BioTechnology (1992) 10: 779-783). Por ejemplo, un cebador adyacente al extremo 5' del dominio variable y un cebador al tercer FR se pueden usar para generar un repertorio de las secuencias del dominio variable que carecen de CDR3. Este repertorio se puede combinar con una CDR3 de un anticuerpo desvelado. Usando técnicas análogas, se pueden barajar porciones de una secuencia de CDR desvelada con porciones de las secuencias de CDR de otros anticuerpos para proporcionar un repertorio de fragmentos de unión a antígeno que se unen a IL-22. Cualquier repertorio se puede expresar en un sistema huésped, tal como expresión en fagos (descrito en el documento WO 92/01047 y su correspondiente patente de e E.UU. N° 5.969.108) de forma que se puedan seleccionar fragmentos de unión a antígeno adecuados que se unen a IL-22.
Una alternativa adicional usa mutagénesis aleatoria de las secuencias de Vh o Vl desveladas para generar los dominios Vh o Vl variantes todavía capaces de unirse a la IL-22. Una técnica que usa PCR propensa a error se describe en Gram y col., (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89: 3576-3580).
Otro procedimiento usa mutagénesis directa de las secuencias de Vh o Vl desveladas. Dichas técnicas se desvelan en Barbas y col., (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1994) 91: 3809-3813) y Schier y col., (J. Mol. Biol. (1996) 263: 551­ 567).
Una porción de un dominio variable comprenderá al menos una región CDR sustancialmente como se expone en el presente documento y, opcionalmente, regiones marco intermedias de los dominios Vh o Vl como se expone en el presente documento. La porción puede incluir la mitad de FR1 en el extremo C y/o la mitad de FR4 del extremo N. Restos adicionales en el extremo N o el extremo C del dominio variable pueden no ser los mismos restos hallados en los anticuerpos de origen natural. Por ejemplo, la construcción de anticuerpos mediante técnicas de ADN recombinante a menudo introduce restos en N o C-terminal de su uso de enlazadores. Algunos enlazadores se pueden usar para unir dominios variables a otros dominios variables (por ejemplo, diacuerpos), dominios constantes o marcadores proteináceos.
Aunque las realizaciones ilustradas en los ejemplos comprenden un par “coincidente” de dominios Vh y Vl, un experto en la técnica reconocerá que las divulgaciones alternativas pueden comprender fragmentos de unión a antígeno que solo contienen una única CDR de cualquiera de los dominios Vl o Vh. Cualquiera de los dominios de unión a antígeno específicos de cadena sencilla se puede usar para seleccionar dominios complementarios capaces de formar un fragmento de unión a antígeno específico de dos dominios capaz de, por ejemplo, unirse a la IL-22. La detección selectiva se puede realizar mediante procedimientos de detección selectiva de expresión en fagos usando el denominado abordaje combinatorio doble jerárquico desvelado en el documento WO 92/01047. En este abordaje se usa una colonia individual que contiene un clon de la cadena H o L para infectar una biblioteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H) y el dominio de unión a antígeno específico de dos cadenas se selecciona de acuerdo con las técnicas de expresión en fagos como se ha descrito.
En algunas divulgaciones alternativas, los anticuerpos anti-IL-22 pueden unirse a una proteína (por ejemplo, albúmina) mediante procedimientos de reticulación química o recombinantes. Los anticuerpos desvelados también pueden estar unidos a diversos polímeros no proteináceos (por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxoalquilenos) de las formas expuestas en las patentes de EE.UU. N° 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; o 4.179.337. Los anticuerpos se pueden modificar químicamente mediante conjugación covalente a un polímero para, por ejemplo, incrementar su semivida en la circulación sanguínea. Polímeros de ejemplo y procedimientos de unión se muestran en las patentes de EE.UU. N° 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285; y 4.609.546.
Los anticuerpos desvelados se pueden modificar para alterar su glicosilación, es decir al menos un radical de hidrato de carbono se puede eliminar o añadir al anticuerpo. La deleción o adición de los sitios de glicosilación se puede conseguir cambiando las secuencias de aminoácidos para eliminar o crear sitios consenso de glicosilación que son bien conocidos en la materia. Otro medio de añadir radicales de hidratos de carbono es el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos a los restos de aminoácidos del anticuerpo (véase el documento WO 87/05330 y Aplin y col., (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259-306). La eliminación de los radicales de hidratos de carbono también se puede conseguir químicamente o enzimáticamente (véase Hakimuddin y col., (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259:52; Edge y col., (1981) Anal. Biochem., 118: 131; Thotakura y col., (1987) Meth. Enzymol., 138: 350).
En la técnica se conocen procedimientos para alterar una región constante del anticuerpo, Los anticuerpos con la función alterada (por ejemplo, afinidad alterada por un ligando efector tal como FcR en una célula o el componente C1 del complemento) se pueden producir sustituyendo al menos un resto de aminoácidos en la porción constante del anticuerpo con un resto diferente (véanse, por ejemplo, los documentos EP 388.151 A1, US 5.624.821 y US 5.648.260). Se podrían describir tipos similares de alteraciones que si se aplican a un anticuerpo murino o de otra especie reducirían o eliminarían funciones similares.
Por ejemplo, es posible alterar la afinidad de una región Fc de un anticuerpo (por ejemplo, una IgG, tal como una IgG humana) para FcR (por ejemplo, Fc gamma R1) o C1q. La afinidad se puede alterar sustituyendo al menos un resto especificado con al menos un resto que tiene una funcionalidad adecuada en su cadena lateral o introduciendo un grupo funcional cargado, tal como glutamato o aspartato, o quizás un resto no polar aromático tal como fenilalanina, tirosina, triptófano o alanina (véase, por ejemplo, el documento US 5.624.821).
Por ejemplo, sustituyendo el resto 297 (asparagina) por alanina en la región constante de la IgG inhibe significativamente el reclutamiento de células efectoras, aunque reduciendo solo ligeramente (aproximadamente tres veces más débil) la afinidad por Clq (véase, por ejemplo, el documento US 5.624.821). La numeración de los restos en la cadena pesada es la del índice de la UE (véase Kabat y col., 1991 mencionada anteriormente). Esta alteración destruye el sitio de glicosilación y se cree que la presencia de hidrato de carbono es necesaria para la unión al receptor de Fc. Se cree que cualquier otra sustitución en este sitio que destruye el sitio de glicosilación produce una disminución similar de la actividad lítica. Otras sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, el cambio de uno cualquiera de los restos 318 (Glu) 320 (Lys) y 322 (Lys), en Ala, también se sabe que anulan la unión de Clq a la región Fc de los anticuerpos IgG. (véase, por ejemplo, el documento US 5.624.821).
Se pueden producir anticuerpos modificados que tienen una interacción reducida con un receptor de Fc. Por ejemplo, se ha demostrado que la IgG3 humana, que se une al receptor gamma R1 de FC humano, el cambio de Leu 235 a Glu destruye su interacción con el receptor. Las mutaciones en sitios adyacentes o cercanos en la región de unión a la bisagra de un anticuerpo (por ejemplo, sustituyendo los restos 234, 236 o 237 por Ala) también se pueden usar para afectar a la afinidad del anticuerpo por el receptor gamma R1 de Fc. La numeración de los restos en la cadena pesada se basa en el índice de la UE (véase Kabat y col., 1991 mencionada anteriormente).
Procedimientos adicionales para alterar la actividad lítica de un anticuerpo, por ejemplo, alterando al menos un aminoácido en la región N-terminal del dominio CH2, se describen en el documento WO 94/29351 de Morgan y col., y el documento US 5.624.821.
Los anticuerpos de la presente divulgación se pueden marcar con un marcador detectable o funcional. Estos marcadores incluyen radiomarcadores (por ejemplo, 131I o 99Tc), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina) y otros radicales químicos (por ejemplo, biotinA).
La invención también puede caracterizar un anticuerpo aislado que se une a la IL-22, en concreto a la IL-22 humana. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-IL-22 puede tener al menos una de las características siguientes: de acuerdo con la divulgación (1) es un anticuerpo monoclonal o de especificidad única; de acuerdo con la invención (2) es un anticuerpo humano; de acuerdo con la divulgación (3) es un anticuerpo generado in vitro; (4) es un anticuerpo generado in vivo (por ejemplo, sistema de ratón transgénico); (5) se une a IL-22 con una constante de asociación de al menos 1012 M-1; (6) se une a IL-22 con una constante de asociación de al menos 1011 M-1; (7) se une a IL-22 con una constante de asociación de al menos 1010 M-1; (8) se une a IL-22 con una constante de asociación de al menos 109 M-1; (9) se une a IL-22 con una constante de asociación de al menos 106 M-1; (10) se une a IL-22 con una constante de disociación de 500 nM o menos; 11) se une a IL-22 con una constante de disociación de 10 nM o menos; (12) se une a IL-22 con una constante de disociación de 150 pM o menos; (13) se une a IL-22 con una constante de disociación de 60 pM o menos; de acuerdo con la invención (14) inhibe la unión de IL-22 a IL-22R o un complejo receptor de IL-22R e IL-10R2 con una CI50 de 10 nM o menos; de acuerdo con la invención (15) bloquea la proliferación mediada por IL-22 de células BaF3 con el receptor de IL-22 modificado con una CI50 de 1 nM o menos en una realización, con una CI50 de 150 pM o menos en otra divulgación, con una CI50 de 100 pM o menos en otra divulgación, y con una CI50 de 10 pM o menos en otra divulgación; y como se desvela, (16) bloquea la secreción de GROa mediada por IL-22 a partir de HT29 con una CI50 de 1 nM o menos en una divulgación, con una CI50 de 150 pM o menos en otra divulgación, y con una CI50 de 10 pM o menos en otra divulgación.
Un experto en la materia apreciará que las modificaciones descritas anteriormente no son todas exhaustivas y que muchas otras modificaciones son obvias para un experto a la luz de las enseñanzas de la presente divulgación. III. Ácidos nucleicos, clonación y sistemas de expresión
La divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican los anticuerpos desvelados. Los ácidos nucleicos pueden comprender ADN o ARN y pueden ser sintéticos (completa o parcialmente) o recombinantes (completa o parcialmente). La referencia a una secuencia de nucleótidos como se expone en el presente documento abarca una molécula de ADN con la secuencia especificada y abarca una molécula de ARN con la secuencia especificada en la que U se sustituye por T.
También se proporcionan ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de codificación para una, dos o tres CDR, un dominio Vh, un dominio Vl o combinaciones de los mismos, como se desvela en el presente documento, o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la misma o que es capaz de hibridar en condiciones rigurosas con las secuencias desveladas).
En una divulgación, los ácidos nucleicos aislados tienen secuencias de nucleótidos que codifican regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo anti-IL-22 que tiene al menos una CDR elegida de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 8-13, 26-31, 44-49, 62-67, 80-85, 98-103, 116-121, 134-139, 152­ 157, 170-175, 188-193, 206-211, 224-229, 242-247, 260-265, 278-283, 296-301, 314-319, 332-337, 350-355, 368­ 373, 386-391, 404-409, 422-427, 440-445, 458-463, 476-481, 494-499, 512-517, 530-535, 548-553, 566-571, 584­ 589, 602-607, o 620-625; o secuencia que codifica una CDR que difiere en uno o dos aminoácidos de las secuencias descritas en el presente documento.
El ácido nucleido puede codificar únicamente la región variable de la cadena ligera o de la cadena pesada o puede también codificar una región constante de la cadena ligera o de la cadena pesada de un anticuerpo unida operativamente a la correspondiente región variable. En una divulgación, la región variable de la cadena ligera está unida a una región constante elegida de una región constante kappa o lambda. La región constante de la cadena ligera también puede ser un tipo kappa o lambda humana. En otra divulgación, la región variable de la cadena pesada está unida a una región constante de la cadena pesada de un isotipo de anticuerpo elegido de IgG (por ejemplo, IgG-i, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA-i, IgA2 , IgD, e IgE. La región constante de la cadena pesada puede ser un isotipo de IgG (por ejemplo, una IgG-i)
Las composiciones de ácido nucleico de la presente divulgación, aunque a menudo en la secuencia nativa (del ADNc o el ADN genómico o mezclas de los mismos) excepto por los sitios de restricción modificados y similares, pueden mutarse de acuerdo con técnicas estándar para proporcionar secuencias génicas. Para las secuencias de codificación, estas mutaciones pueden afectar a la secuencia de aminoácidos como se desee. En particular, se contemplan las secuencias de nucleótidos sustancialmente idénticas o derivadas de las secuencias nativas V, D, J, constantes, cambios y otras secuencias como las descritas en el presente documento (en el que “derivada” indica que una secuencia es idéntica o está modificada de otra secuencia.
En una divulgación, el ácido nucleico difiere (por ejemplo, difiere mediante sustitución, inserción o deleción) del de las secuencias proporcionadas (por ejemplo, del siguiente modo: En al menos uno, pero menos de 10, 20, 30 o 40 nucleótidos; al menos uno, pero menos del 1 %, 5 %, 10 % o 20 % de los nucleótidos en el ácido nucleico sujeto). Si es necesario para este análisis, las secuencias deberán alinearse para la homología máxima. Las secuencias en “bucle” de deleciones o inserciones o apareamientos erróneos se consideran diferencias. La diferencia puede estar en uno o más nucleótidos que codifican uno o más restos no esenciales o la diferencia puede ser una o más sustituciones conservadoras.
La divulgación también proporciona construcciones de ácido nucleico en forma de plásmidos, vectores, casetes de transcripción o expresión, que comprenden al menos un ácido nucleico como se describe en el presente documento. La divulgación además proporciona una célula huésped que comprende al menos una construcción de ácido nucleico descrita en el presente documento.
También se proporcionan los procedimientos de fabricar la o las proteínas codificadas a partir del o los ácidos nucleicos que comprenden la secuencia descrita en el presente documento. El procedimiento comprende cultivar las células huésped en las condiciones adecuadas de forma que expresan la proteína a partir del ácido nucleico. Tras la expresión y la producción, el dominio Vh o Vl o el miembro de unión específica se puede aislar y/o purificar usando cualquier técnica adecuada, después se puede usar según sea adecuado. El procedimiento también puede incluir las etapas de fusionar un ácido nucleico que codifica un scFv con ácidos nucleicos que codifican una porción Fc de un anticuerpo y que expresan el ácido nucleico fusionado en una célula. El procedimiento también puede incluir una etapa de línea germinal.
Los fragmentos de unión a antígeno, los dominios Vh y/o Vl y las moléculas de ácido nucleico codificantes y los vectores se pueden aislar y/o purificar de su entorno natural en una forma sustancialmente pura u homogénea o, en el caso de ácido nucleico, libres o sustancialmente libres de ácido nucleico o genes de origen distinto a la secuencia que codifica un polipéptido con la función requerida.
Los sistemas de clonación y expresión de los polipéptidos en diversas células huésped se conocen en la técnica. Se describen células adecuadas para producir anticuerpos en, por ejemplo, Fernández y col., (1999) Gene Expression Systems, Academic Press, eds. En resumen, las células huésped adecuadas incluyen células de mamífero, células de insecto, células vegetales, células de levadura o células procariotas, por ejemplo E. coli. Las células de mamífero disponibles en la materia para expresión de polipéptidos heterólogos incluyen líneas de células linfocíticas (por ejemplo, NSO), células HEK293, células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células HeLa; células renales de hámster neonato, células oocitos y células de un animal transgénico, por ejemplo, células epiteliales de mama. En una divulgación, los anticuerpos GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04, y 356A11 se expresan en las células HEK293 o CHO. En otra divulgación, una selección de anticuerpos elegidos de 365A11, 354A08, 087B03 y 368D04 se expresan en células HEK293 o CHO. En otras divulgaciones, los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención se colocan bajo el control de un promotor específico de tejido (por ejemplo, un promotor específico de mama) y los anticuerpos se producen en animales transgénicos. Por ejemplo, los anticuerpos se secretan en la leche del animal transgénico, tal como una vaca, un cerdo, un caballo, una oveja, una cabra o un roedor transgénicos.
Se pueden escoger o construir vectores adecuados de modo que contengan las secuencias reguladoras adecuadas, incluidas secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras o genes marcadores y otras secuencias. Los vectores también pueden contener una estructura de plásmido o viral. Para detalles, véase, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Muchas técnicas establecidas usadas con los vectores, incluyendo la manipulación, preparación, mutagénesis, secuenciación y transfección de ADN se describen en Current Protocols in Molecular Biology, Segunda edición, Ausubel y col, eds., John Wiley & Sons (1992).
Un aspecto adicional de la divulgación proporciona un procedimiento de introducir el ácido nucleico en una célula huésped. Para las células eucariotas, las técnicas de transfección adecuadas pueden incluir fosfato cálcico, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otros virus, por ejemplo, vaccinia o baculovirus. Para las células bacterianas, técnicas adecuadas pueden incluir transformación de cloruro cálcico, electroporación y transfección usando bacteriófagos. La introducción del ADN puede seguirse de un procedimiento de selección (por ejemplo, resistencia a fármacos) para seleccionar células que contengan el ácido nucleico.
IV. Usos de los anticuerpos anti-IL-22
Los anticuerpos anti-IL-22 que actúan como antagonistas de la IL-22 se pueden usar para regular al menos una respuesta inmunitaria mediada por IL-22, tal como actuando sobre células epiteliales en tejidos blandos e, indirectamente, modulando las respuestas inmunitarias aguas abajo, tal como bloqueando la expansión de las subpoblaciones de linfocitos T, incluyendo, por ejemplo, linfocitos T Th17. En una divulgación, los anticuerpos de la invención se usan en un procedimiento para regular una respuesta inmunitaria, comprendiendo el procedimiento poner en contacto la IL-22 con un anticuerpo de la invención, regulando de este modo la respuesta inmunitaria, En una divulgación, la respuesta inmunitaria comprende proliferación celular, actividad citolítica, secreción de citocinas o secreción de quimiocinas.
De acuerdo con lo anterior, los anticuerpos de la invención se pueden usar para inhibir directa o indirectamente la actividad (por ejemplo, proliferación, diferenciación y/o supervivencia) de una célula inmunitaria o hematopoyética (por ejemplo, una célula de linaje mieloide, linfoide o eritroide, o células precursoras de las mismas) y, por tanto, se pueden usar para tratar diversos trastornos inmunitarios y trastornos hiperproliferativos. Ejemplos no limitantes de trastornos inmunitarios que se pueden tratar incluyen, entre otros, trastornos autoinmunitarios, por ejemplo artritis (incluidas artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artrosis, artritis psoriásica, artritis asociada con el lupus o espondilitis anquilosante), esclerodermia, eritematosis por lupus sistémico, VIH, síndrome de Sjogren, vasculitis, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis (incluidas la dermatitis atópica y la dermatitis eccematosa), miastenia gravis, enfermedad intestinal inflamatoria (EII), enfermedad de Crohn, colitis, diabetes mellitus (tipo I), afecciones inflamatorias de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, psoriasis), sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), hígado (por ejemplo, hepatitis), riñón (por ejemplo, nefritis) y páncreas (por ejemplo, pancreatitis); trastornos cardiovasculares, por ejemplo trastornos metabólicos del colesterol, lesiones con radicales libres de oxígeno, isquemia, trastornos asociados con la cicatrización de heridas, trastornos respiratorios, por ejemplo asma y EPOC (por ejemplo, fibrosis quística), afecciones inflamatorias agudas (por ejemplo, endotoxemia, sepsis y septicemia, síndrome del shock tóxico y enfermedades infecciosas), rechazo de trasplantes y alergia. En una realización, el trastorno asociado con la IL-22 es un trastorno artrítico, por ejemplo un trastorno seleccionado de uno o más de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artrosis, artritis psoriásica o espondilitis anquilosante; un trastorno respiratorio (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)), o una afección inflamatoria de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, psoriasis), el sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), del sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), del hígado (por ejemplo, hepatitis), del riñón (por ejemplo, nefritis), del páncreas (por ejemplo, pancreatitis) y de los órganos gastrointestinales, por ejemplo colitis, enfermedad de Crohn y EII; afecciones inflamatorias agudas, por ejemplo endotoxemia, sepsis y septicemia, síndrome del shock tóxico y enfermedades infecciosas, insuficiencia multiorgánica, enfermedad respiratoria (SDRA), amiloidosis, neuropatías tal como glomeruloesclerosis, neuropatía membranosa, arteriosclerosis renal, glomerulonefritis, enfermedades fibroproliferativas del riñón, así como otras 3 disfunciones del riñón y tumores renales. Dados los efectos de la IL-22 sobre el epitelio, se pueden usar anticuerpos anti-IL-22 para tratar los cánceres epiteliales, por ejemplo, carcinoma, melanoma y otros. Para una descripción de un fundamento para la inhibición de la IL-22 en estas y otros estados de enfermedad véase el documento WO 03/083062 (páginas 58-75).
La esclerosis múltiple es una enfermedad del sistema nervioso central que se caracteriza por inflamación y pérdida de las vainas de mielina, el material graso que aísla los nervios y es necesario para una función nerviosa adecuada. La inflamación resultado de una respuesta inmunitaria dependiente de la IL-22 se puede tratar con los anticuerpos y composiciones de la presente invención. En el modelo de encefalitis autoinmune experimental (EAE) en ratón para la esclerosis múltiple (Tuohy y col., (J. Immunol. (1988) 141: 1126-1130), Sobel y col., (J. Immunol. (1984) 132: 2393-2401) y Traugott (Cell Immunol. (1989) 119: 114-129), el tratamiento de ratones con inyecciones de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 o 356A11 antes (y de forma continua) de la inducción de la EAE puede retrasar profundamente el inicio de la enfermedad. Esto puede servir como modelo para confirmar el uso del anticuerpo de la invención Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar de forma similar para tratar la esclerosis múltiple en seres humanos.
La artritis es una enfermedad caracterizada por inflamación de las articulaciones. La artritis reumatoide (AR) es la forma más frecuente de artritis que implica inflamación del tejido conjuntivo y la membrana sinovial, una membrana que reviste la articulación. La membrana sinovial inflamada a menudo infiltra la articulación y daña el cartílago de la articulación y el hueso. Las proteínas y/o transcritos de IL-22 e IL-22R se asocian con ambas enfermedades humanas. En las biopsias sinoviales de AR, la proteína IL-22 se detecta en fibroblastos sinoviales vimentina+ y en algunos macrófagos CD68+, mientras que el IL-22R se detecta en fibroblastos sinoviales. El tratamiento de los fibroblastos sinoviales con IL-22 induce la producción de la proteína 1 quimioatrayente de monocitos, MCP-1, así como la actividad metabólica general (Ikeuchi, H., y col.'(2005) Arthritis Rheum. 52:1037-46). Los inhibidores de la IL-22 mejora los síntomas de la artritis reumatoide (documento WO 2005/000897 A2; patente de EE.UU. N° 6.939.545). El incremento de la secreción de citocinas y quimiocinas inflamatorias y, más importante, el incremento de la enfermedad por las respuestas inmunitarias dependientes de la IL-22 se pueden tratar con los anticuerpos de la presente invención. De un modo similar, los anticuerpos y las composiciones de la presente invención se pueden usar para tratar la AR u otras enfermedades artríticas en seres humanos.
El rechazo de trasplante es el fenómeno inmunológico en el que los tejidos de un donante son “atacados” específicamente por las células inmunitarias del huésped. Las principales células “de ataque” son los linfocitos T, cuyos receptores de linfocitos T reconocen las moléculas del MHC del donante como “extrañas”. Este reconocimiento activa los linfocitos T, que proliferan y secretan diversas citocinas y proteínas citolíticas que, en última instancia, destruyen el trasplante. Se han descrito modelos de RLM y trasplantes en Current Protocols in Immunology, Segunda edición, Coligan y col., eds., John Wiley & Sons, 1994; Kasaian y col., (Immunity (2002) 16: 559-569); Fulmer y col., (Am. J. Anat. (1963) 113: 273-285), y Lenschow y col., (Science (1992) 257: 789-792). Los anticuerpos y composiciones de la presente invención se pueden usar para reducir la RLM y tratar el rechazo del trasplante y enfermedades relacionadas (por ejemplo, enfermedad del injerto contra el huésped) en seres humanos que son dependientes de la IL-22.
Los anticuerpos de la presente invención también se pueden usar para tratar trastornos hiperproliferativos asociados con una actividad aberrante de las células respondedoras a la IL-22 y las células respondedoras a IL-22R/IL-10R2 administrando los anticuerpos en una cantidad suficiente para inhibir o reducir la hiperproliferación de las células respondedoras a IL-22 y/o IL-22R y/o IL-10R2 en un sujeto y permitir que los anticuerpos traten o prevengan el trastorno. La expresión de IL-22 and IL-22R es constitutiva en las células epiteliales en una serie de tejidos, incluidos, entre otros, el páncreas, los pulmones, la piel, los intestinos, el hígado, los riñones (Kotenko, S.V. y col., (2001) J. Biol. Chem. 276:2725-32; Xie, M.H. y col., (2000) J. Biol. Chem. 275:31335-9; Wolk, K. y col., (2004) Immunity 21:241-54). Además, el complejo del receptor de la IL-22 también se expresa sobre la superficie de los fibroblastos de la articulación enferma y el intestino normal (Ikeuchi, H. y col., (2005) Arthritis Rheum. 52:1037-46; Andoh, A. y col. (2005) Gastroenterology 129:969-84). Los derivados neoplásicos de estos tipos de células pueden ser hiperrespondedores a la IL-22, lo que modula la capacidad de las células para sobrevivir en el organismo. Por tanto, los anticuerpos frente a la IL-22 se pueden usar para inhibir la progresión de dichas neoplasias, por ejemplo carcinomas de células escamosas, carcinomas de células basales, papilomas y carcinomas de células transicionales, adenomas, adenocarcinoma, linitis plástica, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, vipoma, colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma adenoide cíclico, tumor carcinoide del apéndice, prolactinoma, oncocitoma, adenoma de células de Hürthle, carcinoma de células renales, tumor de Grawitz, adenomas endocrinos múltiples, adenoma endometroide, neoplasias de la piel y tejidos anexos, neoplasias mucoepidermoides, neoplasias quísticas, mucinosas y serosas, cistadenoma, pseudomixoma peritoneal, neoplasias ductales, lobulares y medulares, neoplasias de células acinares, neoplasias epiteliales complejas, tumor de Warthin, neoplasias gonadales especializadas, tumor estromal-cordón sexual, tecoma, tumor de células de la granulosa, arrenoblastoma, tumor de las células de Sertoli-Leydig, paraganglioma, feocromocitoma, tumor glómico, nevus melanocítico, melanoma maligno, melanoma, melanoma nodular, nevus displásico, lentigo maligno, melanoma de extensión superficial o melanoma lentiginoso acral. Aunque el receptor de IL-22 no se detecta ex vivo en células inmunitarias no tratadas previamente o activadas, la alteración de la regulación del receptor podría hacer que dichas células neoplásicas derivadas respondieran a la IL-22 y, por tanto, a la inhibición mediante un anticuerpo frente a la IL-22.
En otro aspecto, la invención caracteriza un procedimiento de disminuir, inhibir o reducir una respuesta de fase aguda en un sujeto. El procedimiento incluye administrar al sujeto un anticuerpo anti-IL-22 o fragmento del mismo como se describe en el presente documento, en una cantidad suficiente para disminuir, inhibir o reducir la respuesta de fase aguda en el sujeto. En una realización, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un ser humano que sufre un trastorno asociado con la IL-22 como se describe en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, trastornos respiratorios, trastornos inflamatorios y trastornos autoinmunitarios. En una divulgación, el agente de unión a IL-22 se administra localmente, por ejemplo, por vía tópica, subcutánea u otras administraciones que no están en la circulación general.
Se cree que la IL-22 ejerce sus efectos inflamatorios localmente, por ejemplo, actuando (por ejemplo, acción directa) como modulador o regulador de la inflamación del tejido, frente a los efectos sistémicos directos. De acuerdo con lo anterior, la inhibición de la actividad de la IL-22 usando, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-22 de la presente invención, puede proporcionar un agente antiinflamatorio más eficaz (por ejemplo, menos tóxico) específico de tejido que las modalidades antiinflamatorias sistémicas. Adicionalmente, la inhibición de la IL-22 local usando, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-22 o fragmento del mismo descrito en el presente documento, puede proporcionar un candidato útil para la combinación con modalidades antiinflamatorias sistémicas.
V. Terapia de combinación
En una divulgación, una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo anti-IL-22 y al menos un agente terapéutico se administra en terapia de combinación. La terapia es útil para tratar afecciones o trastornos patológicos, tales como trastornos inmunitarios e inflamatorios. La expresión “en combinación” en este contexto significa que la composición del anticuerpo y el agente terapéutico se administran sustancialmente de forma contemporánea, simultánea o secuencialmente. En una divulgación, si se administra secuencialmente, al inicio de la administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos sigue siendo detectable a concentraciones eficaces en el punto de tratamiento. En otra divulgación, si se administra secuencialmente, al inicio de la administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos sigue no es detectable a concentraciones eficaces en el lugar de tratamiento.
Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir al menos un anticuerpo anti-IL-22 formulado junto con y/o administrado junto con al menos un agente terapéutico adicional. Los agentes adicionales pueden incluir al menos un inhibidor de citocinas, inhibidor de factor de crecimiento, inmunosupresor, agente antiinflamatorio, inhibidor metabólico, inhibidor enzimático, agente citotóxico y agente citostático, como se describe con mayor detalle más adelante. En una divulgación, el agente adicional es un tratamiento estándar para la arritis, incluyendo, entre otros, agentes antiinflamatorios no esteroideos (AINE), corticosteroides, incluyendo prednisolona, prednisona, cortisona y triamcinolona; y fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (FAME), tales como metotrexato, hidroxicloroquina (Plaquenil) y sulfasalazina, leflunomida (Arava), inhibidores del factor de necrosis tumoral, incluyendo etanercept (Enbrel), infliximab (Remicade) (con o sin metotrexato), y adalimumab (Humira), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, Rituxan), receptor soluble de interleucina-1, tal como anakinra (Kineret), oro, minociclina (Minocin), penicilamina, y agentes citotóxicos, incluyendo azatioprina, ciclofosfamida y ciclosporina. Dichas terapias de combinación pueden usar de forma ventajosa dosis menores de los agentes terapéuticos administrados, de forma que se evitan posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias. Además, los agentes terapéuticos adicionales desvelados en el presente documento actúan sobre las rutas además de o que difieren de la ruta de IL-22/IL-22R/IL-10R2 y, por tanto, cabe esperar que potencien y/o sinergicen con los efectos de los anticuerpos anti-IL-22.
Los agentes terapéuticos usados en combinación con anticuerpos anti-IL-22 pueden ser los agentes que interfieren en diferentes estadios en la respuesta autoinmune e inflamatoria posterior. En una divulgación, al menos un anticuerpo anti-IL-22 descrito en el presente documento se puede formular junto con y/o administrar junto con al menos una citocina y/o antagonista del factor de crecimiento. Los antagonistas pueden incluir receptores solubles, inhibidores peptídicos, moléculas pequeñas, fusiones de ligandos, anticuerpos y fragmentos de unión de los mismos (que se unen a citocinas o factores de crecimiento o sus receptores u otras moléculas de superficie celular) y “citocinas antiinflamatorias” y agonistas de las mismas.
Ejemplos no limitantes de los agentes que se pueden usar en combinación con los anticuerpos anti-IL-22 descritos en el presente documento incluyen, entre otros, antagonistas de al menos una interleucina (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12 (o una de sus subunidades p35 o p40), IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A-F (incluyendo heterodímeros de las mismas, por ejemplo el heterodímero IL-17A/IL-17F), IL-18, IL-19, IL-20, IL-21 e IL-23 (o una de sus subunidades p19 o p40); citocina (por ejemplo, TNFa, LT, EMAP-II y GM-CSF); factor de crecimiento (por ejemplo, FGF y PDGF). Los agentes también pueden incluir, entre otros, antagonistas de al menos un receptor para una interleucina, citocina y factor de crecimiento. Los anticuerpos anti-IL-22 también se pueden combinar con inhibidores (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos) de las moléculas de superficie tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD20 (por ejemplo, Rituxan), CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, o sus ligandos (por ejemplo, CD154 (gp39, CD40L)), o LFA-1/ICAM-1 y VLA-4/VCAM-1 (Yusuf-Makagiansar y col., (2002) Med Res Rev 22(2):146-67)). En determinadas divulgaciones, antagonistas que se pueden usar en combinación con anticuerpos anti-IL-22 descritos en el presente documento pueden incluir antagonistas de IL-1, IL-12 (o una de sus subunidades p35 o p40), TNFa, IL-15, IL-17A-F (incluyendo heterodímeros de los mismos, por ejemplo el heterodímero IL-17A/IL-17F), IL-18, IL-19, IL-20, IL-21 e IL-23 (o una de sus subunidades p19 o p40), y sus receptores.
Ejemplos de dichos agentes incluyen antagonistas de IL-12 (tales como anticuerpos que se unen a la IL-12 (véase, por ejemplo, el documento WO 00/56772) o una de sus subunidades p35 o p40); inhibidores del receptor de la IL-12 (tales como anticuerpos frente al receptor de la IL-12) y el receptor soluble de IL-12 y fragmentos del mismo. Ejemplos de antagonistas de la IL-15 incluyen anticuerpos contra la IL-15 o su receptor, fragmentos solubles del receptor de la IL-15 y proteínas de unión a la IL-15. Ejemplos de antagonistas de la IL-18 incluyen anticuerpos frente a la IL-18, fragmentos solubles del receptor de la IL-18 y proteínas de unión a la IL-18 (IL-18BP, Mallet y col., (2001) Circ. Res. 28). Ejemplos de antagonistas de la IL-1 incluyen inhibidores de la enzima convertidora de la interleucina-1 (ICE) (tales como Vx740), antagonistas de la IL-1 (por ejemplo, IL-1 RA (ANIKINRA (o Kineret), AMGEN)), sIL-1RII (Immunex), y anticuerpos anti-receptor de la IL-1.
En una divulgación, la terapia de combinación incluye al menos un anticuerpo anti-IL-22 formulado junto con y/o administrado junto con un antagonista, tal como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o un receptor soluble de al menos uno de IL-17A, IL-17F, heterodímero IL-17A/IL-17F o IL-23 (o una de sus subunidades p19 o p40).
Ejemplos de antagonistas de TNF incluyen anticuerpos frente al TNF (por ejemplo, TNFa humano), tales como D2E7 (anticuerpo anti-TNFa humano, documento U.S. 6.258.562, Humira™, BASF); CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356 (anticuerpos anti-TNFa humanizados, Celltech/Pharmacia); cA2 (anticuerpo anti-TNFa quimérico, Remicade™, Centocor); y fragmentos del anticuerpo anti-TNF (por ejemplo, CPD870). Otros ejemplos incluyen fragmentos y derivados del receptor soluble de TNF (por ejemplo, p55 o p75 humanos), tales como p55 kdTNFR-IgG (proteína de fusión de 55 kDa receptor del TNF-IgG, Lenercept™) y 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión de 75 kDa receptor de TNF-IgG, Enbrel™, Immunex, véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44; 235A). Otros ejemplos incluyen antagonistas enzimáticos (por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora del TNFa (TACE) tales como derivado del ácido alfa-sulfonilhidroxámico (documento WO 01/55112) o inhibidor de N-hidroxiformamida (GW 3333, -005, o -022)) y TNF-bp/s-TNFR (proteína de unión al TNF soluble, véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S284; y Am. J. Physiol. Heart Circ.
Physiol. (1995) Vol. 268, pág. 37-42). Los antagonistas del TNF pueden ser fragmentos y derivados del receptor de TNF soluble (por ejemplo, p55 o p75), tales como 75 kdTNFR-IgG; e inhibidores de la enzima convertidora del TNFoc (TACE).
En otras divulgaciones, los anticuerpos anti-IL-22 descritos en el presente documento se pueden administrar en combinación con al menos uno de los siguientes: Antagonistas de IL-13, tales como receptores solubles de IL-13 y/o anticuerpos anti-IL-13; y antagonistas de IL-2, tales como las proteínas de fusión de IL-2 (por ejemplo, DAB 486-IL-2 y/o DAB 389-IL-2, Seragen, véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36.1223) y anticuerpos anti-IL-2R (por ejemplo, anti-Tac (anticuerpo humanizado, Protein Design Labs, véase Cancer Res. 1990 Mar 1;50(5):1495-502)). Otra combinación incluye anticuerpos anti-IL-22 en combinación con inhibidores anti-CD4 que no producen depleción, tales como IDEC-CE9.1/SB 210396 (anticuerpo anti-CD4, IDEC/SmithKline). Otras combinaciones más incluyen anticuerpos anti-IL-22 con antagonistas (tales como anticuerpos, receptores solubles o ligandos antagonistas) de moléculas coestimuladoras, tales como CD80 (B7.1) y CD86 (B7.2); ICOSL, ICOS, CD28 y CTLA4 (por ejemplo, CTLA4-Ig (atabacept)); ligando de la glicoproteína P-selectina (PSGL) y citocinas antiinflamatorias y agonistas de las mismas (por ejemplo, anticuerpos). Las citocinas antiinflamatorias pueden incluir IL-4 (DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000, IL-10 recombinante, DNAX/Schering); IL-13 y TGF.
En otras divulgaciones, al menos un anticuerpo anti-IL-22 se puede formular junto con, y/o administrar junto con, al menos un fármaco antiinflamatorio, un inmunosupresor, un inhibidor metabólico y un inhibidor enzimático. Ejemplos no limitantes de los fármacos o inhibidores que se pueden usar en combinación con los antagonistas de la IL-22 descritos en el presente documento incluyen, entre otros, al menos uno de: Fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE) (tal como ibuprofeno, Tenidap (véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N° 9 (suplemento), S280)), naproxeno (véase, por ejemplo, Neuro Report (1996) Vol. 7, pág. 1209-1213), meloxicam, piroxicam, diclofenaco e indometacina); sulfasalazina (véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N° 9 (suplemento), S281); corticosteroide (tal como prednisolona); fármacos antiinflamatorios supresores de citocinas (AISC); y un inhibidor de la biosíntesis de nucleótidos (tal como un inhibidor de la biosíntesis de purinas (por ejemplo, antagonista de folatos, tal como metotrexato) y un inhibidor de la biosíntesis e las pirimidinas (por ejemplo, una dihidoorotato deshidrogenasa (DHODH) tal como leflunomida (véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N° 9 (suplemento), S131; Inflammation Research (1996) Vol. 45, pág. 103-107)). Agentes terapéuticos para usar en combinación con antagonistas de IL-22/IL-22R o IL-22/IL-10R2 pueden incluir AINE, AISC, inhibidores de DHODH (tal como leflunomida) y antagonistas de folatos (tal como metotrexato).
Ejemplos de inhibidores adicionales incluyen al menos uno de: Corticosteroides (oral, inhalado e inyección local), inmunosupresores (tal como ciclosporina y tacrolimus (FK-506)), un inhibidor de mTOR (tal como sirolimus (rapamicina) o un derivado de rapamicina (por ejemplo, derivado de éster de rapamicina tal como CCI-779 (EHt.. L. (2002) Current Opinion Investig. Drugs 3(8):1249-53; Huang, S. y col., (2002) Current Opinion Investig. Drugs 3(2):295-304))); un agente que interfiere con la señalización de las citocinas proinflamatorias tales como TNFa e IL-1 (por ejemplo, IRAK, NIK, IKK, p38 o un inhibidor de la MAP quinasa); un inhibidor de la COX2 (por ejemplo, celecoxib y variantes de los mismos (MK-966), véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N° 9 (suplemento), S81); un inhibidor de la fosfodiesterasa (tal como R973401, véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N° 9 (suplemento), S282)); un inhibidor de la fosfolipasa (por ejemplo, un inhibidor de la fosfolipasa citosólica 2 (cPLA2) tal como análogos de trifluorometilcetona (documento U.S. 6.350.892)); un inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un inhibidor del receptor de VEGF y un inhibidor de la angiogénesis. Agentes terapéuticos para usar en combinación con anticuerpos anti-IL-22 pueden incluir inmunosupresores (tales como ciclosporina y tacrolimus (FK-506)); e inhibidores de mTOR (tales como sirolimus (rapamicina) o derivados de rapamicina (por ejemplo derivados éster de rapamicina tales como CCI-779)); inhibidores de la COX2 (tales como, celecoxib y variantes del mismo); e inhibidores de la fosfolipasa (tales como, inhibidores de la fosfolipasa 2 citosólica (cPLA2) (por ejemplo, análogos de trifluorometilcetona)).
Ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden administrar junto con y/o formular junto con al menos un anticuerpo anti-IL-22 incluyen, entre otros, al menos uno de: Antagonistas del TNF (tales como anticuerpos anti-TNF), fragmentos solubles de los receptores del TNF (por ejemplo, p55 y p75 humanos) y derivados de los mismos (tales como p55 kdTNFR-IgG (proteína de fusión de 55 kDa receptor del TNF-IgG, Lenercept™) y 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión de 75 kDa receptor del TNF-IgG, Enbrel™)); antagonistas enzimáticos del TNF (tales como inhibidores de la TACE); antagonistas de la IL-12 (o una de sus subunidades p35 o p40), IL-15, IL-17A-F (incluyendo heterodímeros de las mismas, por ejemplo el heterodímero IL-17A/IL-17F), IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22 e IL-23 (o una de sus subunidades p19 o p40); agentes de depleción de linfocitos T y de linfocitos B (tales como anticuerpos anti-CD4 o anti-CD22); inhibidores de molécula pequeña (tales como metotrexato y leflunomida); sirolimus (rapamicina) y análogos de los mismos (tales como CCI-779); inhibidores de la Cox-2 y de la cPLA2; inhibidores de p38, TPL-2, Mk-2 y NFKB; RAGE y RAGE soluble; inhibidores de la P-selectina y PSg L-1 (tales como anticuerpos e inhibidores de molécula pequeña) y agonistas de los receptores de estrógenos beta (ERB) y antagonistas de ERB-NFkb. Agentes terapéuticos que se pueden administrar junto con y/o formular junto con al menos un anticuerpo anti-IL-22 pueden incluir al menos uno de: un fragmento soluble de un receptor del TNF (por ejemplo, p55 o p75 humana) tal como 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión de 75 kDa receptor del TNF-IgG, Enbrel™); metotrexato; leflunomida y sirolimus (rapamicina) y análogos de los mismos (tales como CCI-779).
Los anticuerpos anti-IL-22 desvelados en el presente documento se pueden usar en combinación con otros agentes terapéuticos para tratar trastornos inmunitarios específicos como se trata con detalle más adelante.
Ejemplos no limitantes de agentes para tratar trastornos artríticos (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis inflamatoria, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artrosis y artritis psoriásica), con los que se puede combinar un anticuerpo anti-IL-22 incluyen al menos uno de los siguientes: antagonistas del TNF (tales como anticuerpos anti-TNF), fragmentos solubles de los receptores del TNF (por ejemplo, p55 y p75 humanos) y derivados de los mismos (tales como p55 kdTNFR-IgG (proteína de fusión de 55 kDa receptor del TNF-IgG, Lenercept™) y 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión de 75 kDa receptor del TNF-IgG, Enbrel™)); antagonistas enzimáticos del TNF (tales como inhibidores de la TACE); antagonistas de la IL-12 (o una de sus subunidades p35 o p40), IL-15, IL-17A-F (incluyendo heterodímeros de las mismas, por ejemplo el heterodímero IL-17A/IL-17F), IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22 , IL-23 (o una de sus subunidades p19 o p40) e iL-24; agentes de depleción de linfocitos T y de linfocitos B (tales como anticuerpos anti-CD4, anti-CD20 o anti-CD22); inhibidores de molécula pequeña (tales como metotrexato y leflunomida); sirolimus (rapamicina) y análogos de los mismos (por ejemplo, CCI-779); inhibidores de la Cox-2 y de la cPLA2; A iNE; inhibidores de p38, TPL-2, Mk-2 y NFKB; Ra Ge o RAGE soluble; inhibidores de la P-selectina o PSGL-1 (tales como anticuerpos e inhibidores de molécula pequeña); agonistas de los receptores de estrógenos beta (ERB) y antagonistas de ERB-NFKB. Agentes terapéuticos que se pueden administrar junto con y/o formular junto con al menos un antagonista de IL-22/IL-22R/IL-10R2 pueden incluir al menos uno de: un fragmento soluble de un receptor del TNF (por ejemplo, p55 o p75 humana) tal como 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión de 75 kDa receptor del TNF-IgG, Enbrel™); metotrexato; leflunomida y sirolimus (rapamicina) o un análogo del mismo (por ejemplo, CCI-779).
Ejemplos no limitantes de agentes para tratar la esclerosis múltiple con los que se puede combinar el anticuerpo anti-IL-22 incluyen interferón-p, por ejemplo IFNp-1a e IFNp-1b), Copaxona, corticosteroides, inhibidores de la IL-1, inhibidores del TNF, anticuerpos frente al ligando de CD40, anticuerpos frente a CD80 y antagonistas de la IL-12, incluyendo anticuerpos que se unen a la IL-12 (o una de sus subunidades p35 o p40).
Ejemplos no limitantes de agentes para tratar la enfermedad intestinal inflamatoria o la enfermedad de Crohn con los que se puede combinar un anticuerpo anti-IL-22 incluyen budesonida, factor de crecimiento epidérmico, corticosteroides, ciclosporina, sulfasalazina, aminosalicilatos, 6-mercaptopurina, azatioprina, metronidazol, inhibidores de la lipooxigenasa, mesalamina, olsalazina, balsalazida, antioxidantes, inhibidores de tromboxano, antagonistas del receptor de la IL-1, anticuerpos monoclonales anti-IL-1, anticuerpos monoclonales anti-IL-6, factores de crecimiento, inhibidores de la elastasa, compuestos de piridinil-imidazol, antagonistas del TNF como se describe en el presente documento; IL-4, IL-10, IL-13, y/o TGFp o agonistas de los mismos (por ejemplo, anticuerpos agonistas), IL-11, profármacos conjugados con glucurónido o dextrano de prednisolona, dexametasona o budesonida; oligodesoxinucleótidos de fosforitoato antisentido ICAM-1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor 1 soluble del complemento (TP10; T Cell Sciences, Inc.), mesalazina de liberación lenta, metotrexato, antagonistas del factor de activación de plaquetas (PAF), ciprofloxacino y lignocaína.
En otras divulgaciones, un anticuerpo anti-IL-22 se puede usar en combinación con al menos un anticuerpo dirigido a otras dianas implicadas en la regulación de las respuestas inmunitarias, por ejemplo, rechazo de trasplantes o enfermedad del injerto contra el huésped. Como se desvela, los ejemplos no limitantes de agentes para tratar las respuestas inmunitarias con los que se puede combinar un antagonista de IL-22/IL-22R/IL10R2 de la invención incluyen los siguientes: anticuerpos contra moléculas de superficie celular, incluyendo, entre otros, CD25 (receptora de la IL-2), CDHa (LFA-1), CD54 (ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), o combinaciones de los mismos. En otra divulgación se usa un anticuerpo anti-IL-22 en combinación con al menos un agente inmunosupresor general, tal como ciclosporina A o FK506.
Otro aspecto de la presente divulgación se refiere, de acuerdo con lo anterior, a kits para llevar a cabo la administración combinada de los anticuerpos anti-IL-22 con otros agentes terapéuticos. En una divulgación, el kit comprende al menos un anticuerpo anti-IL-22 formulado en un vehículo farmacéutico y al menos un agente terapéutico, formulado según sea adecuado en una o más preparaciones farmacéuticas separadas.
VI. Usos diagnósticos
Los anticuerpos también se pueden usar para detectar la presencia de IL-22 en muestras biológicas. Correlacionando la presencia o el nivel de estás proteínas con una afección médica, un experto en la técnica puede diagnosticar la afección médica asociada. Por ejemplo, la IL-22 induce cambios asociados con los causados por las citocinas inflamatorias (tales como IL-1 y TNFa) y los inhibidores de la IL-22 mejoran los síntomas de artritis reumatoide (documento WO 2005/000897 A2). Afecciones médicas ilustrativas que se pueden diagnosticar mediante los anticuerpos de la presente divulgación incluyen esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad intestinal inflamatoria, pancreatitis y rechazo de trasplante.
Los procedimientos de detección basados en anticuerpos son bien conocidos en la materia e incluyen ELISA, radioinmunoensayos, inmunotransferencias, transferencias de tipo Western, citometría de flujo, inmunofluorescencia, inmunoprecipitación y otras técnicas relacionadas. Los anticuerpos se pueden proporcionar en un kit diagnóstico que incorpora al menos uno de estos procedimientos para detectar IL-22. El kit puede contener otros componentes, embalajes, instrucciones u otro material para ayudar a la detección de la proteína y al uso del kit.
Los anticuerpos se pueden modificar con marcadores detectables, incluyendo grupos de ligandos (por ejemplo, biotina), fluoróforos y cromóforos, radioisótopos, reactivos densos a los electrones o enzimas. Las enzimas se detectan por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano se detecta por su capacidad para convertir la tetrametilbencidina (TMB) en un pigmento azul cuantificable con un espectrofotómetro. Otras parejas de unión adecuadas incluyen biotina y avidina, IgG y proteína A, y otros pares receptor-ligando conocidos en la materia. Los anticuerpos también pueden estar ligados funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a al menos otra entidad molecular, tal como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o multiespecífico), toxinas, radioisótopos, agente citotóxico o citostático, entre otros. Otras permutaciones y posibilidades son evidentes para los expertos en la materia y se consideran equivalentes dentro del ámbito de la presente divulgación.
VII. Composiciones farmacéuticas y procedimientos de administración
Determinadas divulgaciones incluyen composiciones que comprenden los anticuerpos desvelados. Las composiciones pueden ser adecuadas para uso farmacéutico y administración a los pacientes. Las composiciones comprenden un anticuerpo de la presente invención y un excipiente farmacéutico. Como se usa en el presente documento, “excipiente farmacéuticamente aceptable” incluye disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, que son compatibles con la administración farmacéutica. El uso de estos agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la materia. Las composiciones también pueden contener otros compuestos activos que proporcionan funciones terapéuticas complementarias, adicionales o potenciadas. Las composiciones farmacéuticas también se pueden incluir en un contenedor, envase o dispensador junto con instrucciones de administración.
Una composición farmacéutica de la divulgación se formula para que sea compatible con su vía de administración destinada. Los expertos habituales en la materia conocen procedimientos para conseguir la administración. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por vía tópica u oral o pueden transmitirse a través de las membranas mucosas. Ejemplos de administración de una composición farmacéutica incluyen ingestión oral o inhalación. La administración también puede ser intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavitaria, subcutánea, cutánea o transdérmica.
Soluciones o suspensiones usadas para aplicación intradérmica o subcutánea normalmente incluyen al menos uno de los componentes siguientes: un diluyente estéril tal como agua, solución salina, aceites fijos, polietilenglicol, glicerina, propilenglicol u otro disolvente sintético; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); tampones tales como acetato, citrato o fosfato, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases. Dichas preparaciones se pueden introducir en ampollas, jeringuillas desechables o viales de múltiples dosis.
Las soluciones o suspensiones usadas para administración intravenosa incluyen un vehículo, tal como solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ), etanol o poliol. En todos los casos, la composición debe ser estéril y fluida para que pase con facilidad por la jeringuilla. La fluidez adecuada a menudo se puede obtener usando lecitina o tensioactivos. La composición también debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La prevención de microorganismos se puede conseguir con agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal etc. En muchos casos, en la composición se pueden incluir agentes isotónicos (azúcar), polialcoholes (manitol y sorbitol) o cloruro sódico. La absorción prolongada de la composición se puede conseguir añadiendo un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las composiciones orales incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. La composición se puede encerrar en gelatina o comprimir en comprimidos. Para los fines de administración oral, los anticuerpos se pueden incorporar con excipientes e introducir en comprimidos, trociscos o cápsulas. Se pueden incluir en la composición agentes de unión o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles. Los comprimidos, trociscos y cápsulas pueden contener (1 ) un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina, (2) un excipiente tal como almidón o lactosa, (3) un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz, (4) un lubricante tal como estearato de magnesio, (5) un deslizante tal como dióxido de sílice coloidal o (6) un agente edulcorante o un agente aromatizante.
La composición también se puede administrar por vía transmucosa o transdérmica. Por ejemplo, los anticuerpos que comprenden una porción de Fc pueden ser capaces de atravesar las membranas mucosas en el intestino, la boca o los pulmones (mediante receptores de Fc). La administración transmucosa se puede conseguir mediante el uso de pastillas, pulverizadores nasales, inhaladores o supositorios. La administración transdérmica también se puede realizar mediante el uso de una composición que contiene pomadas, bálsamos, geles o cremas conocidas en la materia. Para administración transdérmica o transmucosa se usan penetrantes adecuados para la barrera que se va a atravesar. Para administración mediante inhalación, los anticuerpos se liberan en un pulverizador de aerosoles desde un envase o dispensador presurizado que contiene un propelente (por ejemplo, líquido o gas) o un nebulizador.
En determinadas divulgaciones, se preparan con vehículos para proteger los anticuerpos contra la eliminación rápida del cuerpo. A menudo se usan polímeros biodegradables (por ejemplo, acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico). Los procedimientos para la preparación de dichas formulaciones son conocidos por los expertos en la técnica. Las suspensiones liposómicas también se pueden usar como vehículos farmacéuticamente aceptables. Los liposomas se pueden preparar de acuerdo con procedimientos establecidos conocidos en la materia (patente de EE.UU. N° 4.522.811).
Los anticuerpos o composiciones de anticuerpos de la divulgación se administran en cantidades terapéuticamente eficaces como se ha descrito. Las cantidades terapéuticamente eficaces pueden variar con la edad, el estado, el sexo del sujeto y la gravedad de la afección médica. La dosis adecuada la puede determinar un médico en base a las indicaciones clínicas. Los anticuerpos o composiciones se pueden administrar como una dosis en bolo para maximizar los niveles circulantes de los anticuerpos durante la mayor duración. También se puede usar infusión continua después de la dosis en bolo.
Como se usa en el presente documento, con el término “sujeto” se pretende incluir animales humanos o no humanos. Los sujetos pueden incluir un paciente humano que tenga un trastorno caracterizado por células que expresan IL-22, por ejemplo, una célula cancerosa o una célula inmunitaria. La expresión "animales no humanos" de la divulgación incluye todos los vertebrados, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles etc.
Ejemplos de intervalos de dosis que se pueden administrar a un sujeto se pueden elegir de: de 1 pg/kg a 20 mg/kg, de 1 pg/kg a 10 mg/kg, de 1 pg/kg a 1 mg/kg, de 10 pg/kg a 1 mg/kg, de 10 pg/kg a 100 pg/kg, de 100 pg/kg a 1 mg/kg, de 250 pg/kg a 2 mg/kg, de 250 pg/kg a 1 mg/kg, de 500 pg/kg a 2 mg/kg, de 500 pg/kg a 1 mg/kg, de 1 mg/kg a 2 mg/kg, de 1 mg/kg a 5 mg/kg, de 5 mg/kg a 10 mg/kg, de 10 mg/kg a 20 mg/kg, de 15 mg/kg a 20 mg/kg, de 10 mg/kg a 25 mg/kg, de 15 mg/kg a 25 mg/kg, de 20 mg/kg a 25 mg/kg y de 20 mg/kg a 30 mg/kg (o mayor). Estas dosis se pueden administrar a diario, semanalmente, dos veces a la semana, mensualmente o con menos frecuencia, por ejemplo, bianualmente, según la dosis, el procedimiento de administración, el trastorno o los síntomas a tratar y las características de cada sujeto individual. Las dosis se pueden administrar mediante infusión continua (tal como a través de una bomba). La dosis administrada también puede depender de la vía de administración. Por ejemplo, la administración subcutánea puede requerir una dosis más alta que la administración intravenosa.
En determinadas circunstancias, puede ser ventajoso formular composiciones en forma de unidad de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosis como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente pequeñas adecuadas para el paciente. Cada unidad de dosis contiene una cantidad predeterminada de anticuerpos calculada para producir un efecto terapéutico en asociación con el vehículo. La unidad de dosis depende de las características de los anticuerpos y del efecto terapéutico concreto a alcanzar.
La eficacia terapéutica y la toxicidad de la composición se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación DL50/DE50. Los anticuerpos que exhiben índices terapéuticos grandes pueden ser menos tóxicos y/o más eficaces terapéuticamente.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y estudios animales se pueden usar en un intervalo de dosis en seres humanos. Las dosis de estos compuestos pueden residir dentro del intervalo de concentraciones circulantes en sangre de los anticuerpos, que incluyen una DE50 con poca o nula toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de la composición para dosificación empleada y la vía de administración usada. Para cualquier agente usado en la presente invención, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente usando ensayos con cultivos celulares. Una dosis se puede formular en modelos animales para alcanzar un intervalo de concentración en plasma circulante que incluye la CI50 (es decir, la concentración del anticuerpo que alcanza una inhibición semimáxima de los síntomas). Los efectos de cualquier dosificación concreta se pueden monitorizar mediante un bioensayo adecuado. Ejemplos de bioensayos adecuados incluyen ensayos de replicación de ADN, ensayos basados en transcripción, ensayos de unión de IL-22/IL-22R, ensayos de unión de IL-22/IL-10R2, IL-22/IL-22R/lL-10R2 y otros ensayos inmunológicos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Selección de scFv de anti-IL-22
Selección de GIL01 y GIL68 parentales
GIL01 y GIL68 se aislaron de bibliotecas de scFv mediante selección soluble en IL-22. Las selecciones solubles se llevaron a cabo usando IL-22 biotinilada con una proteína marcada con His/FLAG en el extremo N (bio.IL-22 H/F). Bio.IL-22 H/F se usó inicialmente a una concentración de 100 nM. Una biblioteca de fagémidos de scFv, que es una versión expandida de la biblioteca 1,38 x 1010 descrita (Vaughan y col., 1996) se usó para seleccionar anticuerpos específicos de IL-22. Los fagos de scFv purificados (1012 unidades de transducción (ut)) se bloquearon durante 30 minutos en 100 |jl de MPBS al 3 % (3 % de leche en polvo en PBS), después se añadió bio.IL-22 H/F y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió fago/antígeno a 50 j l de perlas magnéticas con estreptavidina Dynal M280, que se bloquearon durante 1 hora a 37 °C en 1 ml de 3 % de MPBS, después se incubó durante 15 minutos más a temperatura ambiente. Las perlas se capturaron usando una gradilla magnética y se lavaron 4 veces en 1 ml de 3 % de MPBS/ 0,1 % (v/v) de Tween 20, seguido por tres lavados en PBS. Después del último lavado, las perlas se resuspendieron en 100 j l de PBS y se usaron para infectar 5 ml de células E. coli TG-1 en crecimiento exponencial. Las células y los fagos en perlas se incubaron durante 1 hora a 37 °C (30 minutos en reposo, 30 minutos en agitación a 250 rpm), después se extendieron sobre placas 2TYAG. Las placas se incubaron a 30 °C durante la noche y las colonias se visualizaron al día siguiente. Se rasparon las colonias de las placas y se introdujeron en 10 ml de caldo 2TY y se añadió 15 % de glicerol para almacenar a -70 °C.
Los cultivos de reserva de glicerol de la primera ronda de selección por adsorción se superinfectaron con el fago colaborador y se rescataron para dar partículas de fago de expresión del anticuerpo scFv para la segunda ronda de selección. Se llevaron a cabo una segunda y una tercera ronda de selección soluble como se ha descrito anteriormente, disminuyendo la concentración de bio.lL-22 H/F a 50 nM.
Aislamiento de GIL16, GIL45, GIL60 y GIL92 parentales
Se aislaron GIL16, GIL45, GIL60 y GIL92 de las bibliotecas de scFv mediante una combinación de adsorción en una proteína de fusión de IL-22 y selección soluble en bio.IL-22 H/F. Los pocillos de una placa de microtitulación se revistieron con 10 jg/ml (PBS de Dulbecco a pH 7,4) de la proteína de fusión de IL-22 humana y se incubaron durante la noche a 4° C. Los pocillos se lavaron en PBS y se bloquearon durante 2 horas a 37° C en 3 % de MPBS. Se añadieron fagos purificados (1012 ut) en 100 j l de 3% de MPBS a los pocillos bloqueados y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pocillos se lavaron 10 veces con PBST (PBS que contiene 0,1 % v/v de Tween20), después 10 veces con PBS. Las partículas unidas al fago se eluyeron con 100 j l de solución de tripsina (0,5 jg/ml de tripsina en Tris 50 mM a pH 8, CaCl21 mM) durante 30 minutos a 37° C. Los fagos eluidos se usaron para infectar 10 ml de E. coli TG1 en crecimiento exponencial. Las células infectadas se cultivaron en caldo 2TY durante 1 hora a 37 °C como se ha indicado anteriormente, después se extendieron sobre placas 2TYAG y se incubaron durante la noche a 30 °C. Las colonias producidas se rasparon de las placas y los fagos se rescataron como se ha descrito anteriormente. Se llevó a cabo una segunda ronda de selección soluble como se ha descrito anteriormente usando bio.IL-22 H/F 100 nM.
Ejemplo 2: ScFv bloquea la unión de IL-22 a IL-22R
Se realizaron ensayos de inhibición con los anticuerpos parentales GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, and GIL92 para identificar los anticuerpos que bloquean o alteran la unión de IL-22 a IL-22R y/o al complejo receptor de la IL-22. Los extractos periplásmicos que contienen scFv brutos se sometieron a detección selectiva de la capacidad para inhibir la unión de bio.IL-22 H/F a una proteína receptora de IL-22 humana (hIL-22R). La producción de colonias de las selecciones se aplicó a placas de 96 pocillos que contenían 100 j l de 2TYAG. La producción de scFv se indujo mediante la adición de IPTG 1 mM a cultivos en crecimiento exponencial e incubación durante la noche a 30 °C. Los extractos periplásmicos se prepararon (Griffiths y col., 1993) en MOPS 50 mM a pH 7,4/ EDTA 0,5 mM / Sorbitol 0,5 M.
Las placas de microtitulación se revistieron con 1,25 jg/ml de un anticuerpo de la proteína receptora de IL-22 (en PBS) durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Después, las placas se lavaron tres veces en PBS y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con PBS que contiene 2 % de polvo de leche (2 % de MPBS). Después de 3 lavados más, a cada pocillo se añadieron 50 j l de un medio celular acondicionado al 25 % que contiene la proteína receptora de IL-22 y se incubaron durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, a las placas lavadas se añadieron 25 j l de la muestra y 25 j l de bio.IL-22 H/F (54 ng/ml en PBS/0,05 % de BSA/0,05 % de Tween) y se incubaron durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Después de 3 lavados en PBST, la unión de bio.IL-22 H/F se detectó con europio-estreptavidina y se detectó TRF con el kit reactivo DELFIA® y el lector de placas Victor 2™ (Perkin Elmer). Los clones que mostraron inhibición de la unión de IL-22 se volvieron a analizar como scFv purificado. Se usaron tanto el ensayo de unión a IL-22/IL-22R (descrito anteriormente) como el ensayo con el complejo receptor de IL-22 / IL-22 (descrito más adelante). Las concentraciones de ScFv se titularon con el fin de establecer las potencias del clon medidas mediante los valores de CI50 en el ensayo. Estos se determinaron usando el software GraphPad Prism y ajuste de la curva en la ecuación logística de cuatro parámetros. Los resultados de la muestra del ensayo del complejo receptor de IL-22 se muestran en la Figura 1.
Ejemplo 3: Verificación de la unión a IL-22 mediante ELISA en fagos
Para establecer la especificidad de los scFv por IL-22 se realizó un ELISA en fagos usando la proteína de fusión de IL-22, IL-22 H/F, y una proteína no relacionada. Colonias individuales de E. coli que contenían el fagémido se inocularon en placas de 96 pocillos que contenían 100 j l de medio 2TYAG por pocillo. Al cultivo en crecimiento exponencial se añadió el fago auxiliar M13K07 a una multiplicidad de infección (mdi) de 10 y las placas se incubaron una hora adicional a 37 °C. Las placas se centrifugaron en una centrífuga de mesa a 2.000 rpm durante 10 minutos.
Se retiró el sobrenadante y los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 |jl de 2TYAK y se incubaron a 30 °C durante la noche con agitación. Al día siguiente, las placas se centrifugaron a 2.000 rpm durante 10 minutos y 100 j l del sobrenadante que contenía el fago de cada pocillo se transfirieron a una placa de 96 pocillos fresca. Las muestras de fago se bloquearon en una concentración final de 3 % de MPBS durante 1 hora a temperatura ambiente.
Las placas de microtitulación se revistieron con 1 jg/ml de la proteína de fusión de IL-22, IL-22 H/F o una proteína no relacionada, y se incubaron durante la noche a 4 °C. Después del revestimiento, se retiraron las soluciones de los pocillos y las placas se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en 3 % de MPBS. Las placas se aclararon con PBS, después, a cada pocillo se añadieron 50 j l del fago prebloqueado. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora, después se lavaron con 3 cambios de PBST, seguidos de 3 cambios con PBS. A cada pocillo se añadieron 50 j l del conjugado anti-M13-HRP (Pharmacia) a una dilución de 1: 5.000 y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron 3 veces con PBST, después 3 veces con PBS. A cada pocillo se añadieron cincuenta j l del sustrato TMB y se incubaron hasta que se desarrolló color. La reacción se detuvo mediante la adición de 25 j l of de H2SO40,5 M y se midió la absorbancia a 450 nm. Estos experimentos confirmaron la unión específica de los clones scFv a IL-22.
Ejemplo 4: Conversión de scFv en IgG
Las regiones V de las cadenas pesada y ligera de los clones de scFv se amplificaron con cebadores específicos del clon. Los productos de la PCR se digirieron con las enzimas de restricción adecuadas y se subclonaron en vectores que contenían el dominio constante de la cadena pesada de la IgG4 humana (para los dominios Vh) o vectores que contienen los dominios constantes de la cadena ligera lambda o kappa humana según sea adecuado (dominios Vl) Se determinaron las líneas germinales humanas más cercanas de los segmentos de Vh y Vl y esta información se usó para indicar si se usaban los dominios constantes de la cadena ligera kappa p lambda (Tabla 4). La inserción correcta de los dominios de la región V en plásmidos se verificó secuenciando el ADN del plásmido de colonias de E. coli individuales. Los plásmidos se prepararon a partir de cultivos de E. coli mediante técnicas estándar y las construcciones de las cadenas pesada y ligera se cotransfectaron en células HEK 293 EBNA usando técnicas estándar. La IgG secretada se purificó usando proteína A sefarosa (Pharmacia) y tampón intercambiado en PBS.
Tabla 4: Líneas germinales de Vh y Vl de los clones neutralizantes de IL-22
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La potencia de la IgG purificada se verificó en el ensayo bioquímico de inhibición del complejo receptor de IL-22 como se describe a continuación. Las concentraciones de IgG se titularon con el fin de obtener los valores de la potencia. Los datos de la potencia de la muestra se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5: Potencia del scFv y la IgG de la IL-22 en el ensayo de inhibición del complejo receptor de IL-22
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Ejemplo 5: Optimización del anticuerpo frente a la IL-22
Se crearon grandes bibliotecas de expresión en ribosomas y se realizó la detección selectiva de scFv que reconocieran específicamente la IL-22 humana recombinante, esencialmente como se describe en Hanes y col., (2000). Inicialmente, los cinco clones parentales (GIL01, GIL16, GIL60, GIL68 y GIL92) se convirtieron en el formato de expresión en ribosomas y este molde se usó después para crear la biblioteca. A nivel de ADN se añadió un promotor T7 en el extremo 5' para una transcripción eficiente en ARNm. A nivel de ARNm, la construcción contenía un sitio de unión al ribosoma procariota (secuencia de Shine-Dalgarno) y horquillas en 5' y 3' para estabilidad del ARNm. En el extremo 3' de la cadena sencilla se eliminó el codón de terminación y se añadió una porción de gIII para actuar como espaciador, lo que permite el plegamiento del scFv lejos del túnel ribosómico (Hanes y col., 2000). Las bibliotecas de expresión en ribosomas derivadas de los clones principales se crearon mediante mutagénesis de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) monocatenarias usando PCR con ADN polimerasa Taq sin actividad correctora de errores. Se realizaron selecciones basadas en la afinidad cuando se incubó la biblioteca con bio.IL-22H/F, seguido de perlas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina. Mediante separación magnética se recuperaron complejos terciarios (ARNm-ribosoma-scFv), mientras que los complejos no unidos se eliminaron mediante lavado. Los ARNm que codifican los scFv unidos se rescataron después mediante RT-PCR como se ha descrito (Hanes y col., 2000) y el proceso de selección se repitió con concentraciones decrecientes (100 nM -10 pM en 5 rondas) de bio.IL-22H/F.
Se introdujo la PCR propensa a error para aumentar adicionalmente el tamaño de la biblioteca. La tasa de error que se usó creó, de media, 7,2 mutaciones por 1.000 pb ras una reacción de PCR estándar en base al procedimiento de Cadwell y Joyce (1992). Las reacciones iniciales de la PCR propensa a error tuvieron lugar entre la primera y la segunda rondas de selección.
Las bibliotecas de recombinación de Vh/Vl para cada clon parental se prepararon a partir de las producciones de expresión en ribosomas de CDR de Vh y Vl después de la segunda o la cuarta ronda de selecciones. La porción Vh de la producción de selección de CDR de Vh para un linaje concreto se amplificó específicamente por pCr usando cebadores específicos del clon. La porción Vl de la selección de la producción de CDR de Vl para el mismo linaje se amplificó por separado. Estos dos productos de PCR se recombinaron mediante una reacción de PCR solapante. Esto creó una biblioteca completa de productos de scFv que contenía todos los componentes requeridos para las rondas posteriores de selección por expresión en ribosomas.
Para algunos clones también se usaron bibliotecas de expresión en fagos. Las bibliotecas de fagos se crearon mediante mutagénesis de CDR de cadena sencilla usando reacciones de PCR con los cebadores adecuados y se seleccionaron como se ha descrito anteriormente. Estas producciones también se combinaron con las producciones de selección de expresión en ribosomas para crear bibliotecas de recombinación de Vh/Vl. Las producciones de la selección de Vh de la cuarta ronda de expresión en ribosomas, junto con las producciones de la tercera ronda de expresión en fagos, se recombinaron con las producciones de Vl del mismo linaje. Esto se consiguió durante cebadores específicos de clones y PCR solapante para producir bibliotecas de recombinación de Vh/Vl. Las selecciones con bio.IL-22 H/F soluble continuaron en formato de expresión en ribosomas, como se ha descrito anteriormente. Las regiones scFv de las producciones de selección se clonaron direccionalmente en pCANTAB6 para la producción de scFv para la detección selectiva bioquímica de alto rendimiento.
Ejemplo 6: Identificación de clones optimizados
Se usaron dos ensayos para la detección selectiva de alto rendimiento de las producciones de selección. Las producciones derivadas de los clones GIL01, GIL16 y GIL68 se sometieron a detección selectiva en un ensayo de fluorescencia resuelta de tiempo homogéneo (HTRF®, Cis Biointernational), mientras que las producciones de GIL60 and GIL92 se sometieron a detección selectiva en un ensayo DELFIA® (Perkin Elmer).
Ensayo de competición de epítopos HTRF®
Los sobrenadantes del cultivo que contenían scFv bruto de los clones de producción GIL01, GIL16 y GIL68 se prepararon como se ha descrito anteriormente y se sometieron a detección selectiva para detectar la inhibición de la unión de bio.IL-22H/F a GIL68 en un ensayo de HTRF.
La IgG de GIL68 marcada con criptato (kit de marcaje de Cis Biointernational) se diluyó 400 veces en un tampón de ensayo (PBS/KF 0,4 M/ 0,05 % de BsA/ 0,05 % de Tween), seguido de la adición de estreptavidina 7,5 nM XL665 (Xlent, Cis Biointernational). Esta solución se mezcló con la muestra de scFv bruto (diluida 125 veces) y bio.IL-22H/F en una placa de 384 pocillos negra de Packard Optiplate (Perkin Elmer). Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, después se leyeron usando un lector de placas Victor 2™ (Perkin Elmer). La relación de emisión 665 nM/620 nM se usó para calcular el porcentaje de unión específica en cada pocillo.
Ensayo de fluorescencia en tiempo resuelto DELFIA®
Los clones producidos de GIL60 y GIL92 se sometieron a detección selectiva para detectar la inhibición de la unión de bio.IL-22H/F a un complejo receptor de IL-22.
Las placas de microtitulación se revistieron con el anticuerpo del complejo receptor de IL-22 (1 pg/ml en PBS) y se incubaron durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces en PBSt y se bloquearon durante 1 hora a temperatura con 2 % de MPBS. Después de 3 lavados más se añadió medio acondicionado celular diluido que contenía un complejo receptor de IL-22 y se incubó durante la noche a 4 °C. Los sobrenadantes con scFv bruto se prepararon como se ha descrito anteriormente. Al día siguiente, a las placas lavadas se añadieron 25 |jl de la muestra de scFv diluida y 25 j l de bio.IL-22 H/F (6 ng/ml) y se incubaron durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces en PBST, después se detectó la unión de bio.IL-22H/F al complejo receptor de IL-22 con europio-estreptavidina y el kit reactivo DELFIA® (PerkinElmer). La fluorescencia en tiempo resuelto se midió usando un lector de placas Victor 2™ (Perkin Elmer).
El scFv purificado de clones positivos identificados de la detección selectiva se analizó en el ensayo de competición del complejo receptor de IL-22 DELFIA® como se ha descrito anteriormente. Se usó una titulación de las concentraciones de scFv con el fin de establecer la potencia del clon medida mediante los valores de la CI50 en el ensayo. Los resultados de la muestra se muestran en la Figura 2. Catorce clones optimizados se denominaron 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04y356A11.
Ejemplo 7: Clasificación de los clones optimizados en el ensayo de proliferación BAF3-IL-22
Los ensayos de proliferación se realizaron para evaluar la capacidad del anticuerpo para bloquear la proliferación de células BaF3 mediada por IL-22. Las células BaF3 que expresan hIL22R/hlLl0R2 se generaron mediante cotransfección de las células BaF3 con hIL22R-GFP y hIL10R2-YFP. Las células BaF3 que expresan tanto hIL22R como hIL10R2 (células receptoras BaF3-IL-22) se clasificaron y recolectaron mediante FACS.
Las células receptoras BaF3-IL-22 se mantuvieron de forma rutinaria en medio RPMI1640 con 10% de FBS y 1 ng/ml de IL-3 murina. Inmediatamente antes de la organización del ensayo, las células se lavaron 4 veces en medio de ensayo (RPMI1640 con 10 % de FBS, 100 U/ml de penicilina y 100 jg/ml de estreptomicina), se resuspendieron en medio de ensayo y se incubaron a 37 °C, 5 % de CO2 durante 6 - 8 horas. Para preparar las placas de ensayo se añadieron 100 j l de células (1 x 105 /ml en medio de ensayo) a los 60 pocillos centrales de una placa de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo plano (Costar). Se prepararon muestras de prueba de scFv o IgG diluyendo la muestra de reserva en medio de ensayo, seguido de filtración a través de un filtro de 0,22 jM. Se prepararon diluciones en serie por cinco en una placa de dilución aparte. Los pocillos que contenían las células se trataron con 50 j l de la muestra, seguido de 50 j l de IL-22 humana (40 ng/ml en medio de ensayo) y se incubaron después durante 40 horas a 37 °C en 5 % de CO2. Los pocillos de controles incluyeron medio solo y las células solas o en presencia de 10 ng/ml de IL-22 humana.
La proliferación celular se detectó mediante la adición de 20 j l de azul alamar (Serotec) a los pocillos, seguido de incubación durante 5 horas ± 30 minutos a 37 °C en 5 % de CO2. Las placas se mezclaron mediante golpes suaves para garantizar que se produce una señal uniforme a través de los pocillos antes de medir la fluorescencia (excitación = 560 nM, emisión = 590 nM). Los valores de CE50 y CI50 se estimaron usando ajuste de curva logístico de cuatro parámetros (software Graphpad Prism 2) y se usaron para clasificar los anticuerpos. Los datos de la potencia de la muestra para scFv e IgG optimizados se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6. Valores de CI50 de los clones de scFv e IgG en el ensayo de proliferación de BaF3-IL-22
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Ejemplo 8: Modificación en la línea germinal
Se usaron los datos relativos a la secuencia de los seis clones parentales para identificar la secuencia de la línea germinal más cercana para las cadenas pesada y ligera de cada clon. Se realizaron mutaciones usando técnicas de mutagénesis dirigida a sitio estándar con los cebadores mutagénicos adecuados. La mutación de las secuencias se confirmó mediante análisis de secuencia. Las secuencias para los clones modificados en la línea germinal y sus scFv y dominios Vh and Vl se muestran en la Tabla 7. Los scFv purificados de los clones parentales modificados en la línea germinal se analizaron en el ensayo de competición de la unión de IL-22 biotinilada al complejo receptor de IL-22 como se ha descrito anteriormente, con el fin de establecer la potencia del clon medido por los valores de CI50 en el ensayo. Los resultados se resumen en la tabla 8.
Tabla 7A: Secuencias de aminoácidos y nucleótidos de los dominios Vh y Vl, Fv y CDR de los anticuerpos modificados en la línea germinal (GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 062A09 y 087B03)
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Tabla 7B: Secuencias de aminoácidos y nucleótidos de los dominios Vh y Vl, Fv y CDR de los anticuerpos modificados en la línea germinal (166B06, 166G05, 354A08, 355B06, 355E04, 356A11 y 368D04)
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Tabla 8: Potencias de ScFv de clones parentales modificados en la línea germinal y no modificados en la línea germinal en el ensayo de competición por el receptor de IL-22
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Nueve de los anticuerpos optimizados se modificaron en la línea germinal como se ha descrito anteriormente. Ocho de las IgG modificadas en la línea germinal se analizaron en el ensayo de proliferación de BaF3-IL-22 como se ha descrito anteriormente. Los valores de CI50 del anticuerpo de un experimento representativo se muestran en la Tabla 9.
Después, las secuencias de los anticuerpos se enviaron a GENEART North America (28 Kirk Bradden Rd. East, Toronto, ON, Canadá M8Y2E6), donde se sintetizaron para obtener una expresión optimizada en células CHO usando el algoritmo de optimización propiedad de GENEART.
Tabla 9: Potencias de las IgG de clones optimizados modificados en la línea germinal en el ensayo de proliferación de BaF3-IL-22R
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Ejemplo 9: El anticuerpo inhibe la secreción de GROa inducida por IL-22 en células HT29
Los ensayos de proliferación se realizaron para evaluar la capacidad del anticuerpo para bloquear la secreción de GROa inducida por IL-22 en células HT29. Las células HT20 se sembraron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo plano (Corning Inc. n° de cat. 3595) en medio DMEM (DMEM 1o% de FBS 100 unidades/ml de penicilina y estreptomicina glutamina 2 mM) a 5 x 104/pocillo. Se mezclaron 10 ng/ml de IL-22 con anticuerpos diluidos en serie en medio DMEM y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. 24 horas después de sembrar se retiró el medio de las células HT29 y a las células en placas de 96 pocillos se añadieron IL-22 y anticuerpo premezclados. Tras 48 horas de incubación a 37 °C con 5 % de CO2 se recogió el medio y se la GROa secretado se analizó usando el kit de inmunoensayo de GROa humano (R&D Systems, Cat. DGR00), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan en la Figura 3.
Ejemplo 10: El anticuerpo se une a la IL-22 de diferentes especies y la inhibe
La reactividad de especies cruzadas de los anticuerpos optimizados modificados en la línea germinal y no modificados en la línea germinal se determinó del siguiente modo. Placas de ELISA (Costar, N° de cat. 3590) se revistieron durante la noche con 1 pg/ml de IL-22 de rata, de ratón o humana, o de IL-26 humana en tampón PBS. Las placas se lavaron con tampón PBST (0,05 % de Tween20 en PBS) 3 veces, después se bloquearon con 1 % de BSA (Sigma A8918) / PBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos se añadieron a 1 pg/ml, se incubaron 1 hora a 25 °C. Las placas se lavaron, después se añadió anticuerpo IgG antihumano de cabra conjugado con HRP (Southern Biotech Association, n° de cat. 2040-05). Las placas se incubaron durante 1 hora a 25 °C, después se lavaron con PBST y se desarrollaron con TMB (KPL, N° de cat. 50-76-04). La reacción se detuvo con H2SO40,18 M. Las placas se leyeron a una DO de 450 nm. Los resultados se presentan en la Figura 4.
Estos anticuerpos también se evaluaron en el ensayo celular de GROa y el ensayo de proliferación de BaF3-IL-22. Como se muestra en las Tablas 10(a) and 10(b), los anticuerpos bloquearon la actividad de la señalización de la IL-22 humana, de mono, de rata y de ratón a través de un recetor de IL-22 humana. 356A11 y 368D04 también demostraron reactividad de especies cruzadas contra la IL-22 murina, de rata y de mono usando análisis de interacción bioespecífica (BIA) en tiempo real, como se trata más adelante en el Ejemplo 11.
Tabla 10(a). Los anticuerpos frente a la IL-22 son muy potentes para bloquear otras especies de IL-22, como se muestra en el sistema de ensayo celular de GROa. Los valores mostrados representan los valores de la CI50 en pM.
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Tabla 10(b). Los anticuerpos frente a la IL-22 son muy potentes para bloquear otras especies de IL-22, como se muestra en el sistema de ensayo de células BaF3. Los valores mostrados representan los valores de la CI50 en pM.
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Ejemplo 11: Comparación de la cinética de unión entre los anticuerpos monoclonales anti-IL-22 de rata y los anticuerpos monoclonales anti-IL-22 humanos
La cinética de unión de los anticuerpos monoclonales anti-IL-22 humanos (356A11 and 368D04) y los anticuerpos monoclonales anti-IL-22 de rata (P3/3 (Ab-02) y P3/2 (Ab-04) de los documentos WO 2005/000897 y WO 02/068476) frente a la IL-22 humana se evaluó mediante análisis de interacción bioespecífica (BIA) en tiempo real usando la tecnología de resonancia en plasmón superficial.
Para preparar la superficie del biosensor para los anticuerpos monoclonales de rata, la proteína A/G (Pierce #21186, Rockford, IL) se inmovilizó sobre un chip de carboximetildextrano (CM5) de calidad de investigación usando acoplamiento de amina. La superficie se activó con EDC/NHS. La proteína A/G se inyectó a una concentración de 50 |jg/ml en tampón de acetato sódico (pH 4,0). La inmovilización se realizó usando las herramientas de asistencia con el objetivo de 3.000 (UR) para la proteína A/G. Los grupos activados restantes se bloquearon con etanolamina 1,0 M (pH 8,0). La primera celda de flujo se usó como superficie de referencia para corregir el índice de refracción mayor, los efectos de la matriz y la unión inespecífica. Las celdas de flujo segunda, tercera y cuarta se revistieron con la molécula de captura. Los anticuerpos monoclonales de rata Ab-02 y Ab-04, que se unen a la proteína A/G se capturaron sobre la superficie de la proteína A/G inyectando 30 j l de una solución de 1 jg/ml. La diferencia neta entre el valor basal y el punto aproximadamente 90 segundos después de completar la inyección de Ab-02 o Ab-04 se usó para representar la cantidad de ligando unido.
Para preparar la superficie del biosensor para los anticuerpos monoclonales humanos, el anticuerpo monoclonal humano (356A11 o 368D04) o el anticuerpo control se inmovilizaron sobre un chip de carboximetildextrano (CM5) de calidad de investigación usando acoplamiento de amina. La superficie se activó con EDC/NHS. Los anticuerpos de captura se inyectaron a una concentración de 1 jg/ml en tampón de acetato sódico (pH 5,5). Los grupos activados restantes se bloquearon con etanolamina 1,0 M (pH 8,0). La primera celda de flujo se usó como superficie de referencia para corregir el índice de refracción mayor, los efectos de la matriz y la unión inespecífica. Las celdas de flujo segunda, tercera y cuarta se revistieron con la molécula de captura.
Para Ab-02 y Ab-04, se inyectaron soluciones de IL-22 humana a concentraciones de 300, 100, 50, 25, 12,5, 6,4, 3,2, 1,6 y 0 nM por triplicado a un caudal de 30 j l por minuto durante 3 minutos y la cantidad de material unido como función del tiempo se registró en sensorgramas. La fase de disociación se monitorizó en tampón HBS/EP durante 10 minutos al mismo caudal, seguido de una inyección de 5 j l de 0,1 % de TFA y una inyección de 5 j l de glicina a pH 1,5 para regenerar una superficie de captura completamente activa.
Para 356A11 y 368D04, se inyectaron soluciones de IL-22 humana a concentraciones de 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, y 0 nM por triplicado a un caudal de 100 j l por minuto (alto flujo para evitar la unión inespecífica) durante 3 minutos y la cantidad de material unido como función del tiempo se registró en sensorgramas. La fase de disociación se monitorizó en tampón HBS/EP durante 60 minutos al mismo caudal, seguido de dos inyecciones de 5 j l de glicina a pH 1,5 para regenerar una superficie de captura completamente activa.
Todos los experimentos cinéticos se realizaron a 22,5 °C en tampón HBS/EP. Los efectos del blanco y del tampón se restaron para cada sensorgrama usando referenciación doble. En los experimentos control, la primera inyección contenía tampón.
Los datos cinéticos se analizaron usando el software BIAevaluation3.0.2 aplicado a un modelo 1:1. Las constantes de la velocidad de disociación (Kd) y asociación (Ka) aparente se calcularon a partir de las regiones adecuadas de los sensorgramas usando un análisis global. Las constantes de afinidad de la interacción entre anticuerpo y analito se calcularon a partir de las constantes de la velocidad cinética mediante las fórmulas siguientes: Kd = Kd / Ka, donde Kd es la constante de disociación, y Ka = Ka/Kd, donde Ka es la constante de asociación. Los datos de unión para Ab-02 y AB-04 se resumen en las Tablas 11A y 11B. Los datos de unión para 356A11 y 368D04 se resumen en la Tabla 12.
Tabla 11A. Parámetros cinéticos para la interacción entre la IL-22 humana y los anticuerpos anti-IL22 Ab-02 y Ab-04
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Tabla 11B. Datos cinéticos de los anticuerpos monoclonales de rata para la IL-22 humana
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Tabla 12. Datos cinéticos de los anticuerpos monoclonales humanos para la IL-22 humana
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Estos resultados muestran que los anticuerpos monoclonales anti-IL-22 humanos de la presente invención tienen una afinidad significativamente mayor por la IL-22 humana que los anticuerpos monoclonales anti-IL-22 de rata Ab-02 and Ab-04, descritos en los documentos WO 2005/000897 and WO 02/068476, ya que tienen la capacidad de neutralizar la IL-22 humana. Específicamente, la constante de disociación de 356A11 (Kd = 5,40 x 10'11M o 0,054 nM) para la IL-22 humana es aproximadamente 1.000 veces y más de 40 veces mayor que las constantes de disociación de Ab-02 (Kd = 5,22 x 10'8 M o 52 nM) y Ab-04 (Kd = 2,38 x 10'9 M o 2,38 nM), respectivamente. De un modo similar, 368D04 (Kd = 1,32 x 10'1° M o 0,132 nM) tiene una afinidad por la IL-22 humana aproximadamente 400 veces y 18 veces más fuerte que la de Ab-02 and Ab-04, respectivamente. Los perfiles de unión de 356A11 y 36804 para la IL-22 de mono, murina y de rata fueron similares a los de la IL-22 humana (datos no mostrados). Las especificidades de unión de 356A11 y 368D04 también se evaluaron usando BIA. Ningún anticuerpo mostró reactividad cruzada con la IL-10 humana, la IL-19 humana, la IL-20 humana, la IL-24 humana, la IL-28a humana, la IL-29 humana, el IFN-a2c humano o el IFN-ui humano (datos no mostrados).
Ejemplo 12: Semivida in vivo de los anticuerpos anti-IL-22 humana.
Los anticuerpos anti-IL-22 humana de la invención tienen semividas in vivo prolongadas. Por ejemplo, la semivida in vivo tanto de 356A11 como de 368D04 en ratones DBA/1 fue de ocho días. Específicamente, se administró una única dosis de 356A11 o 368D04 (16 mg/kg) por vía intraperitoneal a ratones DBA/1. Los anticuerpos 356A11 y 368D04 se detectaron en suero de ratones usando un ELISA de IgG1 humana. Los cursos de tiempo de las concentraciones en suero de 356A11 y 368D04 se muestran en las Figuras 11A y B. Los parámetros FC de 356A11 and 368D04 se resumen en la Tabla 13 a continuación.
Tabla 13. Parámetros FC de 3536A11 y 368D04
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Ejemplo 13: Tratamiento de la artritis
La artritis es una enfermedad caracterizada por inflamación de las articulaciones. La artritis reumatoide (AR) es la forma más frecuente de artritis que implica inflamación del tejido conjuntivo y la membrana sinovial, una membrana que reviste la articulación. La membrana sinovial inflamada a menudo infiltra la articulación y daña el cartílago de la articulación y el hueso. Tanto las proteínas como los transcritos de IL-22 e IL-22R se asocian con enfermedad humana. En las biopsias sinoviales de AR, la proteína IL-22 se detecta en fibroblastos sinoviales vimentina+ y en algunos macrófagos CD68+, mientras que el IL-22R se detecta en fibroblastos sinoviales. El tratamiento de los fibroblastos sinoviales con IL-22 induce la producción de la proteína 1 quimioatrayente de monocitos, MCP-1, así como la actividad metabólica general (Ikeuchi, H., y col., (2005) Arthritis Rheum. 52:1037-46).
La IL-22 se usa para estudiar su efecto sobre las células de la membrana sinovial, la membrana que reviste las articulaciones. Los sinoviocitos similares a los fibroblastos humanos (HFLS) (Cell Applications (San Diego, CA)) se aíslan de los tejidos sinoviales de pacientes con artritis reumatoide sometidos a cirugía articular. Los HFLS se cultivan con la IL-22 humana durante 48 horas y los sobrenadantes se retiran y se analizan para detectar quimiocinas y citocinas mediante ELISA. La IL-22 aumentará la secreción de los HFLS de las quimiocinas MCP-1, eotaxina e IP-10, y las citocinas TNFa, IL-6, e IL-8. Estas quimiocinas y citocinas son conocidas en la técnica para estimular la inflamación a través de una serie de actividades y las concentraciones crecientes en las articulaciones producidas por la IL-22 exacerba la inflamación y la AR.
La capacidad de los anticuerpos anti-IL-22 humana para mejorar los síntomas en la artritis inducida por colágeno (AIC) se analizó usando los anticuerpos 356A11 y 368D04. La AIC es el modelo estándar de ratones y ratas para estudiar la artritis reumatoide, véase, por ejemplo, Holmdahl y col., (2002) Ageing Res. Rev., 1:135. El día 0, en ratones DBA/1 macho (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) se inyectaron por vía subcutánea en la base de la cola 100 |jg de colágeno de tipo II bovino (Chondrex, Redmond, WA) en adyuvante completo de Freund y el día 21 se reforzó a los ratones con 100 jg de colágeno de tipo bovino en adyuvante incompleto de Freund.
Se monitorizó a los ratones al menos dos veces a la semana para determinar la progresión de la enfermedad. La gravedad de la enfermedad se puntuó usando la evaluación macroscópica de la pata del siguiente modo: 0 = sin inflamación, 1 = 1 a 2 dedos inflamados o tobillo inflamado, 2 = más de 2 dedos inflamados o inflamación leve de la pata, 3 = inflamación extensa de la pata y 4 = anquilosis de la pata. Los ratones a los que se inyectó un anticuerpo control de isotipo tras las inyecciones de colágeno desarrollaron la enfermedad de forma progresiva. El tratamiento con 356A11 o 368D04 redujo significativamente la progresión de la enfermedad. Estos fueron estudios ciegos, de modo que los investigadores no sabían qué grupo de animales recibía qué anticuerpo hasta el final del estudio. Se evaluaron varias dosis de 356A11 y 368D04. Los tratamientos de 356A11 o 368D04 (o un anticuerpo control de isotipo IgG1A humano) se iniciaron cuando el 10 % de los ratones del grupo de tratamiento tenía una puntuación de la gravedad de la enfermedad de al menos 1. El anticuerpo se administró a varias frecuencias: en días alternos, una vez a la semana o dos veces a la semana, y se monitorizó a los ratones para vigilar la progresión de la enfermedad. La administración de 8 o 16 mg kg_1 de 356A11 en días alternos bloqueó significativamente la progresión de la AIC en varios estudios, como se muestra en las Figuras 12A-B, 13 y 40-41. En cuatro estudios aparte de AIC (Figuras 13A-D), en los que se analizó la dosis de 8 mg kg_1 de 356A11 en días alternos, se muestra que el anticuerpo 356A11 bloqueaba de forma consistente la progresión de la enfermedad en el modelo de AIC murina. Sorprendentemente, las dosis dos veces a la semana e incluso dosis semanales de 8 mg kg_1 de 356A11 también fueron suficientes en varios estudios para bloquear significativamente la progresión de la enfermedad, como se muestra en las Figuras 14-15, 41 y 44A-B.
En el primer estudio de AIC con 368D04 (administrado en días alternos a 16 mg kg_1) se observó poca o ninguna eficacia. No obstante, la administración de 8 mg kg_1 de 368D04 una vez a la semana en varios estudios bloqueó significativamente la progresión de la enfermedad, como se muestra en las Figuras 46A-C.
La capacidad del anticuerpo frente a la IL-22 humana para bloquear significativamente la progresión de la enfermedad cuando se administró una vez a la semana en el modelo de AIC indica que el anticuerpo podría administrarse con una frecuencia de dosificación similar o incluso una frecuencia de dosificación ampliada, tal como una vez cada dos semanas, cuando se administra en seres humanos.
Los efectos del tratamiento del anticuerpo anti-IL-22 también se evaluaron mediante análisis histopatológico de las patas. Al final del estudio, se sacrificó a los animales, se recolectaron las patas y se fijaron con 10 % de formalina para la histología, se descalcificaron y se incluyeron en parafina para cortar secciones y realizar la tinción estándar con H y E. Las patas se puntuaron con un procedimiento de puntuación de 5 grados (de 0 a 4) para caracterizar la intensidad y la extensión de la artritis. Para la puntuación se usaron los infiltrados inflamatorios, además de otros cambios relacionados con la inflamación, como la formación de pannus, la fibrosidad de la membrana sinovial, la erosión del cartílago articular y/o la destrucción de hueso subcondral. Los grados histológicos se determinaron usando lecturas de patas individuales: NAD=0 o nada anormal descubierto; 1= de ligero a moderado; 2= de leve a moderado; 3= marcado 4= masivo. El efecto histológico de la administración terapéutica de los anticuerpos anti-IL-22 se muestra en las Figuras 16A-F, 42A-C, 43 y 45A-B. A. Como se muestra en las Figuras 16A-F, 42a -C, 43, y 45A-B, la administración de 356A111 en múltiples estudios mejoró los síntomas de la artritis inducida por colágeno en ratones. De un modo similar, la administración de 368D04 en días alternos a 8 mg kg-1 en varios estudios mejoró los síntomas de la artritis inducida por colágeno en ratones. Figuras 47A-C.
Además de las evaluaciones histopatológicas también se analizó la destrucción ósea en los ratones tratados. Al final del estudio, las patas se fijaron en una posición lateral y se tomaron imágenes con rayos X con una máquina Faxitron. La Faxitron proporciona radiografías de ratos x de alta resolución y la capacidad de alto aumento proporciona un mejor rendimiento de la obtención de imágenes. Las radiografías Faxitron se correlacionaron con las puntuaciones de la evaluación macroscópica visual de las patas y mostraron el tratamiento con el anticuerpo anti-IL-22 prevenía la destrucción ósea en comparación con el tratamiento con el anticuerpo control de isotipo (datos no mostrados).
Ejemplo 14: Detección de IL-22 en suero mediante ELISA y detección incrementada de IL-22 en suero in vivo con tratamiento con 356A11
Hasta la fecha, la detección de la expresión del gen de la IL-22 solo se ha notificado a nivel de ARN. Con el ELISA descrito anteriormente, la IL-22 no se detecta en ratones normales. No obstante, los inventores han descubierto que este ELISA permite la detección de IL-22 en la circulación de ratones artríticos. Adicionalmente, la administración del anticuerpo 356A11 permite la detección de IL-22 a niveles diez veces mayores. El anticuerpo 356A11 a las dosis administradas secuestra la citocina, por lo que neutraliza su actividad, como se ha mostrado en los ejemplos anteriores. Con la circulación de este anticuerpo dentro de la corriente sanguínea, la IL-22 secuestrada por el anticuerpo se detecta ahora a niveles más altos con este ELISA. Esto se debe a los epítopos únicos y distintos de los anticuerpos de captura y detectores que constituyen este ELISA de mIL-22. Este ELISA detecta IL-22/356A11, IL-22BP/IL-22, IL-22BP/356A11/IL-22 e IL-22 desnuda de forma equivalente.
En el contexto de los estudios de AIC que se han tratado anteriormente (Ejemplo 13), los ratones artríticos se trataron en días alternos con 16 mg kg'1 del anticuerpo 356A11. El día 30 después del refuerzo con colágeno se obtuvo suero de los ratones después de sacrificarlos. Los niveles de IL-22 en las muestras de suero se midieron después mediante ELISA.
Para este formato de ELISA, una placa de ELISA de microtitulación de 96 pocillos se revistió con 1mGIL19P3/1, un anticuerpo monoclonal IgG1k anti-IL-22 murina de rata, para usar como anticuerpo de captura. Las muestras de suero obtenidas de ratones artríticos se diluyeron en serie y después se añadieron a las placas de microtitulación revestidas. Después de dejar incubar las muestras con 1mGIL19p3/1 en las placas de microtitulación, las placas se lavaron y a las placas se añadió 2hmGIL19P3/5-bio, un anticuerpo monoclonal IgG2ak anti-IL-22 conjugado con biotina como anticuerpo de detección. Después de otra etapa de incubación y lavado se añadió estreptavidina conjugada a peroxidasa de rábano (HRP), que convierte la tetrametilbencidina (TMB) en un pigmento azul y es cuantificable con un espectrofotómetro, se incubó y la placa se lavó. Tras la incubación final con TMB seguida de la adición de H2SO4 diluido para detener la reacción enzimática, la absorbancia se midió a 450 nm usando un espectrómetro. Como alternativa y porque el isotipo del anticuerpo detector, IgG2ak de rata, es distinto del isotipo del anticuerpo de revestimiento, también se puede usar un anticuerpo secundario conjugado con HRP que se une al anticuerpo IgG2a de rata. Usando este ELISA de tipo sándwich, los inventores demostraron que la adición de cantidades crecientes de mIL-22BP y/o 356A11 no afecta a la capacidad para detectar una concentración fija de IL-22 murina. Este ELISA se ha usado para detectar IL-22 en el suero de ratones tras una inyección i.p. de LPS.
Cuando a los ratones con AIC se administró el anticuerpo 356A11 como se ha indicado anteriormente, se detectó IL-22 en el suero a niveles variables de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 9 ng/ml. Véase la Figura 17. Por el contrario, los ratones artríticos en el grupo de tratamiento control, que recibió un anticuerpo control de isotipo IgG1A humano, registró niveles in vivo significativamente menores de IL-22 (menos de 1 ng/ml). Véanse las Figuras 17 y 18. Por tanto, el anticuerpo 356A11 captura la IL-22 in vivo para producir un complejo anticuerpo/citocina estabilizado que circula. Esto, a su vez, permite la detección de IL-22 in vivo con una sensibilidad aumentada como se muestra en la Figura 16. En contraste con las cantidades grandes de anticuerpo usadas en el estudio anterior, se ha propuesto que también se podrían administrar niveles considerablemente menores de 356A11 y tienen el mismo efecto.
Ejemplo 15: Tratamiento de la psoriasis
Los niveles de ARN de IL-22 y de IL-22R se midieron en muestras apareadas de tejido (lesión frente a ausencia de lesión) de pacientes psoriásicos humanos usando PCR cuantitativa. En este estudio se demostró que los niveles de IL-22 e IL-22R estaban regulados por aumento en las lesiones psoriásicas. Figura 19. Otras pruebas implican a la IL-22 en el desarrollo de la psoriasis. Por ejemplo, los ratones transgénicos que expresan de forma constitutiva IL-2 presentan piel gruesa, infiltrados de células inmunitarias mononucleares, características de las lesiones psoriásicas, y mueren poco después del nacimiento. Documento WO 03/083062. De un modo similar, la administración de IL-22 a los ratones induce un engrosamiento de la piel e infiltrados de células inmunitarias mononucleares. Documento WO 03/083062. La IL-22 también induce hiperplasia queratinocítica humana, lo que sugiere un papel importante en los procesos inflamatorios de la piel. Boniface y col., J. Immunol., 2005174:3695-3702.
El trasplante xenogénico en ratones SCID es un modelo reconocido para estudiar la psoriasis, véase, por ejemplo, Boehncke y col., Br. J. Dermatol. 2005, 153(4):758-66. Con anestesia local, piel agrietada lesionada (de un espesor de aproximadamente 0,5 mm) se escinde de un paciente con psoriasis en placas crónica. Los injertos divididos humanos se trasplantan al dorso de ratones SCID de 6-8 semanas de edad. Se da a los ratones 3 semanas para aceptar el injerto y que cicatrice. A los 22 días del trasplante se inyecta en los ratones por vía intraperitoneal 8 mg kg-1 de anticuerpos anti-IL-22 humanos, tales como 087B03, 368D04, 354A08 o 356A11 modificados en la línea germinal en días alternos. Como control negativo, los ratones reciben aplicaciones intragástricas diarias de 200 pl de PBS. Como control positivo, los ratones reciben aplicaciones intragástricas diarias de 2 mg kg-1 dexametasona en 200 pl de PBS. Los controles negativos desarrollan características de psoriasis, incluyendo acantosis, papilomatosis, paraqueratosis y un infiltrado mononuclear denso. Se sacrifica a los ratones el día 50 tras el trasplante y se extirpan los injertos con la piel adyacente. La mitad del injerto se fija en formalina y la otra mitad se congela en nitrógeno líquido. Se realizan tinciones de rutina con hematoxilina y eosina y los cambios patológicos de los injertos se analizan tanto cualitativa (diferenciación epidérmica) como cuantitativamente (espesor de la epidermis, infiltrado inflamatorio). El espesor epidérmico medio se puede medir desde la punta de las crestas interpapilares al borde de la epidermis viable usando un micrómetro ocular. La densidad del infiltrado inflamatorio se puede determinar contando el número de células en tres campos de potencia adyacentes. La progresión de la enfermedad se puede evaluar usando análisis histológico para medir las características de la psoriasis, tal como acantosis, papilomatosis, paraqueratosis, infiltrados inflamatorios y la aparición de capas corneanas y granulares.
Los ratones de control negativo a los que se inyectaron 200 pl de PBS o un anticuerpo control de isotipo equivalente tras el trasplante de injertos desarrollan progresivamente psoriasis. Dado que las lesiones psoriásicas expresan niveles más altos de IL-22, cabe esperar que el tratamiento con los anticuerpos anti-IL-22, por ejemplo, con 087B03, 368D04, 354A08 o 356A11 modificados en la línea germinal suprima o retrase la psoriasis, como se confirma en el estudio de transferencia adoptiva indicado más adelante.
La transferencia adoptiva de linfocitos T CD4+CD45rbhigh en ratones scid/scid es otro modelo reconocido para estudiar la psoriasis en ratones. Hong y col., J. Immunol., 162(1):7480-91 (1999). En este modelo, la administración conjunta de LPS e IL-2 o la enterotoxina B de estafilococos en ratones scid/scid 1 día después de la transferencia adoptiva de los linfocitos T CD4+CD45rbhigh induce lesiones cutáneas que exhiben las características observadas en la psoriasis humana.
Usando una ligera modificación de este modelo, los linfocitos T CD4+CD45rbhigh se transfirieron a ratones scid/scid con o sin coadministración de LPS e IL-12 el día uno tras la transferencia adoptiva. Los linfocitos T CD4+CD45rbhighCD25- fueron capaces de inducir lesiones psoriásicas cuando se transfieren a ratones scid/scid, incluso cuando se administraron sin LPS e IL-12. Por tanto, la administración de IL-12 y LPS tras la transferencia adoptiva no parecía alterar la eficacia de los anticuerpos anti-IL-22 en este modelo.
Las células para la transferencia adoptiva se prepararon como se ha descrito anteriormente con una ligera modificación. Se obtuvieron los bazos de ratones donantes BALB/cBy de 6 a 8 semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) y los esplenocitos se aislaron mediante homogeneización mecánica de los bazos enteros. Los linfocitos T CD4+ se seleccionaron usando el kit de enriquecimiento de CD4 murino (R&D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los linfocitos T enriquecidos con CD4 se marcaron con anti-CD4-PE (Pharmingen), anti-CD45RB-FITC y anti-CD25-APC (Pharmingen). Las células se clasificaron usando un clasificador celular Moflo (Becton Dickinson, San Jose, CA). Las células CD4+CD45RbhighCD25- se recogieron y tenían una pureza de >95%. Las células se resuspendieron en solución salina a 2 x 106 células/ml y 4 x 105 células se inyectaron i.p. en ratones C.B-17/Prkdc scid/scid (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine). En algunos casos se administraron 10 ng de IL-12 y 20 pg de LPS i.p. a los ratones receptores que recibieron células CD4+CD45Rbhigh el día 1 y se administró una dosis adicional de IL-12 el día 3. Se administró a los ratones dosis de 16 mg/kg de un anticuerpo de control de isotipo o anticuerpos anti-IL-22 (356A11 o 368D04) el día de la transferencia adoptiva y, después, una vez a la semana durante 10 semanas. Se monitorizó a los ratones para detectar los síntomas clínicos de lesiones cutáneas dos veces a la semana. Al final del estudio se recogieron orejas, piel, ganglios linfáticos y bazos de los ratones para estudios ex-vivo adicionales,
Evaluación clínica
Investigadores enmascarados evaluaron a los ratones dos veces a la semana comenzando 10 días después de la transferencia adoptiva. Para registrar la progresión de la enfermedad se realizaron puntuaciones clínicas semicuantitativas de 0 a 6 en base al aspecto clínico: 0 = ausencia de síntomas en la piel y en las orejas; 0,5 = eritema leve en las orejas o en los párpados, 1 = eritema leve o moderado en las orejas o los párpados con un engrosamiento leve de la oreja (<2 % de la superficie corporal); 2 = eritema moderado o grave en el 2-10 % de la superficie corporal, escamación leve; 3 = eritema grave y escamación en el 10 %-20 % de la superficie corporal; 4 = eritema extenso y muy grave y escamación en el 20 %-40 % de la superficie corporal. 5 = eritema extenso y muy grave y escamación en el 40 %-60 % de la superficie corporal. 6 = eritema extenso y muy grave y escamación en más del 60 % de la superficie corporal. Se realizaron observaciones específicas en base al estado del pelaje, las manifestaciones en las orejas, el aspecto del párpado y la presencia de inflamación en las extremidades y la cola.
En el estudio sin coadministración de LPS e IL-12, los anticuerpos 356A11 y 368D04 suprimieron significativamente la inflamación de la piel cuando se comparó con los ratones tratados con el anticuerpo control, comenzando ya el día 21 para 356A11 y el día 35 para 368D04 (Figuras 20A-B). Se observaron resultados similares en el estudio con la coadministración de LPS y de IL-12 el día uno después de la transferencia adoptiva, de modo que 356A11 y 368D04 suprimieron significativamente las lesiones cutáneas en comparación con el anticuerpo control, comenzando ya el día 28 después de la transferencia adoptiva. (Figuras 27A y B). En un estudio aparte, 356A11, sin (Figuras 34A-B o con (Figuras y 37A-B), la coadministración de LPS y de IL-12 el día uno tras la transferencia adoptiva suprimió significativamente la inflamación de la piel en comparación con los ratones tratados con el anticuerpo control, comenzando tan pronto como el día 21.
Detección de citocinas
El suero o los sobrenadantes de ratón del cultivo celular se cuantificaron para IL-6, IFNy y TNFa usando un kit de ELISA (sistema de R&D). ELISA para IL-22, IL-17A, IL-17F y el heterodímero IL-17 A/F implicó el revestimiento de una placa de 96 pocillos de fondo plano (Costar) durante la noche a 4 °C con 100 pl de una solución de 2 pg/ml del anticuerpo anti-lL-22 (Ab-01), anti-IL-17A (R&D) o anti-IL-17F (RK015-01) en PBS. Después, las placas se lavaron con PBS/Tween (0,05 % de Tween-20 en pBS) y se bloquearon con 200 pl de PBS más 1 % de bSa durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos frente a la IL-22 murina (Ab-01, Ab-02, and Ab-03) y la IL-17F murina (RK015-01) se generaron mediante procedimientos descritos en Li y col., Int. Immunopharmacol. 4:693-708 (2004). Entre todas las etapas siguientes, las placas se lavaron con PBS/Tween. Después se añadieron patrones de IL-22 (R&D), IL-17A (R&D), IL-17F e IL-17A/F, sobrenadantes de la muestra y muestras de suero (diluidas con PBS 1:5). Los anticuerpos secundarios biotinilados para anti-IL-22 (Ab-03), anti-IL-17A (R&D) y anti-IL-17F (RK015-01) se añadieron después a las respectivas placas a 0,5 pg/ml en solución de 1 % de BSA/PBS y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Se añadió estreptavidina marcada con poli-HRP (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante durante 15 minutos. La placa se desarrolló añadiendo sustrato TMB durante 15-30 minutos. Después, el ensayo se leyó en un lector de placas de Molecular Devices (Sunnyvale, CA) y los datos se analizaron usando el software SOFTmax.
En el estudio sin coadministración de LPS e IL-12 se detectaron niveles más altos de IL-22 en suero en los ratones tratados con 356A11 que en los ratones tratados con el anticuerpo control, lo que indica que 356A11 captura y estabiliza la IL-22 in vivo (Figura 21), como se trata en el Ejemplo 14. También se observaron resultados similares en los ratones tratados con 356A11 con la coadministración de LPS e IL-12 el día uno tras la transferencia adoptiva. (Figura 28). Estos resultados se duplicaron en un estudio aparte con 356A11 sin (Figura 25) y con (Figura 38) coadministración de LPS y de IL-12 el día uno tras la transferencia adoptiva. No se detectó IL-22 en suero en los ratones tratados con 368D04 (Figura 21).
En el estudio sin coadministración de LPS e IL-12 se detectaron niveles séricos significativamente menores de IL-17F, IL-17A, IL-17A/F en ratones tratados con 356A11 y 368D04 (Figuras 22A-C). También se observó una tendencia a la disminución de los niveles séricos de IL-6 en ratones tratados con 356A11 y 368D04 (Figura 22D). IFNy y el TNFa estaban por debajo del límite de detección en el suero de ratones tratados con anticuerpos control, 356A11 o 368D04. También se observaron resultados similares en ratones tratados con 356A11 con coadministración de LPS e IL-12 el día uno tras la transferencia adoptiva. (Figuras 29A-D). En un estudio aparte también se observaron niveles en suero de IL-17A e IL-6 significativamente menores en los ratones tratados con 356A11 sin (Figuras 39A-B) y con (Figuras 39C-D) coadministración de LPS e IL-12 el día uno tras la transferencia adoptiva.
Aislamiento y estimulación de células de ganglios linfáticos
Las lesiones psoriásicas en este modelo normalmente progresan desde las orejas, los ojos, la cara y el cuello al resto del cuerpo. Los ratones tratados con terapéuticas normalmente desarrollan lesiones cutáneas leves alrededor de únicamente los ojos y las orejas. Por tanto, se aislaron los ganglios linfáticos cervicales que drenan la cara de cada ratón para obtener el número más alto de células activadas. Las células de los ganglios linfáticos (GL) se recuperaron mediante homogeneización mecánica. Las células de los L se agruparon de aproximadamente 9 o 10 ratones por grupo y se resuspendieron a 1 x 106 /ml en medio RPMI 1640 completo suplementado con 10 % de FBS (HyClone), 5 x 10'5 M 2-ME (Sigma), glutamina 2 mM (Life Technologies, Gaithersburg, MD), 10 U/ml de penicilina, 100 pg de estreptomicina (Life Technologies) y HEPES 15 mM. Después, un total de 200 pg/pocillo de esta suspensión se introdujo en una placa de 96 pocillos y se estimuló con anti-CD3 más anti-CD28 (1 pg/ml cada uno) durante 48 horas.
Tinción intracelular de citocinas
Para investigar los efectos de la neutralización de la IL-22 sobre la población de linfocitos T efectores se realizó tinción intracelular de citocinas con las células de los ganglios linfáticos cervicales. Las células se estimularon con 50 ng/ml de PMA (Sigma), 1 pg/ml de ionomicina (Sigma) y GolgiPlug (Pharmingen) durante 12 horas. Las células se tiñeron después para el antígeno de superficie (CD4) y después se trataron con Cytofix/Cytoperm (Pharmingen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La tinción intracelular de citocinas se realizó usando los anticuerpos frente a IFNy, IL-22, IL-17A, IL-17F, TNFa, y los controles de isotipo de IgG relevantes. El anti-IL-22 (Ab-02) se marcó con Alexa 647 (Molecular Probes) y el anti-IL-17F (RK015-01) se marcó con FITC (Pierce Biotechnologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Las células se analizaron en una población CD4+ acotada. Los resultados del análisis FACS muestran que en ratones tratados con 356A11 y 368D04 (sin coadministración de LPS e IL-12), había porcentajes menores de linfocitos T CD4+ productores de IL-22, IL-17A, e IL-22 e IL-17f, pero porcentajes más altos de linfocitos T CD4+ productores de IFNy en comparación con los ratones tratados con el control de isotipo (Figura 23). También se observaron resultados similares en ratones tratados con 356A11 con coadministración de LPS e IL-12 el día uno tras la transferencia adoptiva. (Figura 31).
Cuantificación de transcritos de citocinas
Se aisló el ARN de las orejas de ratón o células de GL (tras estimulación) usando el kit Qiagen Rneasy (Qiagen). Se realizó PCR cuantitativa para los transcritos de las citocinas usando cebadores y sondas precualificados (Applied Biosystems). Se usó el procedimiento de AACt para normalizar el transcrito a GApDH y calcular la multiplicación de la inducción respecto a los ratones control.
Los resultados de la PCR cuantitativa usando ARN de las orejas de ratón muestran que los ratones tratados con 356A11 y 368D04 tenían una expresión de los genes de IL-22, IL-17F, IL-17A e IL-6 menor pero una expresión de IFNy potenciada en comparación con los ratones tratados con el anticuerpo control (Figuras 24A-E). También se observaron resultados similares en ratones tratados con 356A11 con coadministración de LPS e IL-12 el día uno tras la transferencia adoptiva. (Figuras 30A-E). Estos resultados se duplicaron en un estudio distinto con 356A11 (sin coadministración de LPS e IL-12), en el que también se observó que los ratones tratados con 356A11 tenían una expresión génica de la proteína de la familia 6 de la IL-1 (IL-1F6) menor y la expresión génica de la proteína de unión a IL-22 y de la subunidad del receptor de IL-22 (IL-22R1) sin alterar en comparación con los ratones tratados con el anticuerpo control. (Figuras 36A-H).
Los resultados de la PCR cuantitativa usando ARN de las células de los ganglios linfáticos estimuladas con anti-CD3 y anti-CD28 durante 48 horas, como se ha descrito anteriormente, muestran que 356A11 y 368D04 suprimía la expresión génica de IL-22, IL-6, IL-17A e IL-17F ex vivo pero no produjo cambios significativos en la expresión génica de IFNy. (Figuras 26A-E). Se observaron resultados similares en ratones tratados con 356A11 con coadministración de LPS e IL-12 el día uno tras la transferencia adoptiva. (Figuras 33A-E).
Los sobrenadantes de las células de los ganglios linfáticos estimuladas con anti-CD3 y anti-CD28, como se ha descrito anteriormente, se recogieron para los análisis de las citocinas usando kits de ELISA (R&D system) como se ha tratado anteriormente. Los resultados del ELISA de las citocinas reprodujeron los datos de la expresión génica en los GL, lo que demuestra que 356A11 y 368D04 suprimían la secreción de IL-22, IL-6; IL-17A e IL-17F ex vivo pero no producían cambios significativos en la secreción de IFNy de células estimuladas. (Figuras 25A-F). Se observaron resultados similares en ratones tratados con 356A11 con coadministración de LPS e IL-12 el día uno tras la transferencia adoptiva. (Figuras 32A-E).
Análisis histopatológicos
Se realizaron necropsias con tejido de ratón al terminar el estudio in vivo. Se recogieron muestras de tejido de la piel de la oreja y del tronco y se fijaron en 10 % de solución de formalina para la preparación de secciones y su análisis. Para registrar la gravedad de la enfermedad se asignaron puntuaciones histológicas semicuantitativas de 0 a 5 en base a la gravedad de la inflamación. Un patólogo certificado por el comité realizó la evaluación histológica de un modo enmascarado. 0 = dentro de los límites normales; 1 = mínima; 2= leve, 3 = moderada, 4=marcada y 5= grave. Análisis de inmunohistoquímica
Se recogieron muestras de tejido y se incluyeron en compuesto Tissue Tek OCT (Miles, Elkhurt, IN) y se congelaron con hielo seco para realizar secciones cortadas con crioestato. Las secciones de tejido ((5 pm) se fijaron en 100 % de acetona y se tiñeron con anticuerpo anti-CD4, anti-CD11b y antineutrófilos (PharMingen). Los tejidos se evaluaron como negativos =0, leve=1, moderado =2, y grave=3 en base a detección de microscopia fluorescente visual.
Los hallazgos de histología demuestran que los ratones tratados con 356A11 and 368D04 experimentaron menos proliferación de queratinocitos, crestas interpapilares e infiltrados de células inflamatorias en la piel en comparación con el tratamiento control del isotipo. Adicionalmente, los resultados de inmunohistoquímica mostraron que 356A11 disminuyó el número de CD4+, CD11b+ (macrófagos) y neutrófilos en las capas de epidermis, dermis y subcutis. Los resultados histológicos reflejaron los de los hallazgos clínicos y el respaldo usando antagonistas de IL-22, como los anticuerpos de la presente invención, como agentes terapéuticos para el tratamiento de la psoriasis y otras enfermedades de la piel similares a la psoriasis.
Los resultados globales demuestran que los anticuerpos de la presente invención, tales como 087B03, 368D04, 354A08 o 356A11, son eficaces en este modelo murino de psoriasis e indica que el tratamiento con anticuerpos anti-IL-22, incluyendo 087B03, 368D04, 354A08 o 356A11, proporciona una estrategia eficaz para la intervención terapéutica en la psoriasis humana.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a IL-22, para su uso en el tratamiento o prevención de un trastorno asociado con la IL-22, en el que el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende:
a) el dominio Vh comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 131 y el dominio Vl comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 132;
b) el dominio Vh comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 149 y el dominio Vl comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 150;
c) el dominio Vh comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 617 y el dominio Vl comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 618;
d) el dominio Vh comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 491 y el dominio Vl comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 492;
e) el dominio Vh comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 167 y el dominio Vl comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 168;
f) el dominio Vh comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 185 y el dominio Vl comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 186;
g) el dominio Vh comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 203 y el dominio Vl comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 204;
h) el dominio Vh comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 527 y el dominio Vl comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 528;
i) el dominio Vh comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 221 y el dominio Vl comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 222;
j) el dominio Vh comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 239 y el dominio Vl comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 240;
k) el dominio Vh comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 257 y el dominio Vl comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 258;
l) el dominio Vh comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 275 y el dominio Vl comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 276;
m) el dominio Vh comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 599 y el dominio Vl comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 600;
n) el dominio Vh comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 581 y el dominio Vl comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 582;
o) el dominio Vh comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 563 y el dominio Vl comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 564; o
p) el dominio Vh comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 545 y el dominio Vl comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 546;
q) un dominio Vh que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 509 y un dominio Vl que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 510; o
r) un dominio Fv que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 331, o SEQ ID NO: 349; y en el que el anticuerpo bloquea la proliferación de células BaF3 mediada por IL-22 con una CI50 de 150 pM o menos, y en el que las células BaF3 comprenden un receptor de IL-22 humano.
2. Un anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio Vh comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 617 y el dominio Vl comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 618.
3. Un anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 599 y el dominio Vl comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 600.
4. Un anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que
(a) el anticuerpo se une específicamente a una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 % idéntica a cualquier secuencia de al menos 100 aminoácidos contiguos en la secuencia expuesta SEQ ID NO: 1;
(b) el anticuerpo inhibe la unión de IL-22 a IL-22R o un complejo receptor que comprende IL-22R e IL-10R2 con una CI50 de 10 nM o menos;
(c) el anticuerpo es humano; o
(d) el anticuerpo es una IgG1 o una IgG4.
5. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a IL-22, para su uso en el tratamiento o prevención de un trastorno asociado a IL-22, en el que el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende:
(a) un dominio Vh que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (las CDR) que comprenden secuencias de aminoácidos que son idénticas a las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 602, SEQ ID NO: 603 y SEQ ID NO: 604 y un dominio Vl que comprende tres CDR que comprenden secuencias de aminoácidos que son idénticas a las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 605, SEQ ID NO: 606 y SEQ ID NO: 607;
(b) un dominio Vh que comprende tres CDR que comprenden secuencias de aminoácidos que son idénticas a las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 620, SEQ ID NO: 621 y SEQ ID NO: 622 y un dominio Vl que comprende tres CDR que comprenden secuencias de aminoácidos que son idénticas a las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 623, SEQ ID NO: 624 y SEQ ID NO: 625;
(c) el dominio Vh comprende tres CDR que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 459 y s Eq ID NO: 460 y el dominio Vl comprende tres CDR que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 462 y SEQ ID NO: 463;
(d) el dominio Vh comprende tres CDR que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 100 y el dominio Vl comprende tres CDR que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 103;
(e) el dominio Vh comprende tres CDR que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 423 y s Eq ID NO: 424 y el dominio Vl comprende tres CDR que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 425, SEQ ID NO: 426 y SEQ ID NO: 427;
(f) el dominio Vh comprende tres CDR que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64 y el dominio Vl comprende tres CDR que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 67; o
(g) el dominio Vh comprende tres CDR que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189 y s Eq ID NO: 190 y el dominio Vl comprende tres CDR que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192 y SEQ ID NO: 193;
y en el que el anticuerpo bloquea la proliferación de células BaF3 mediada por IL-22 con una CI50 de 150 pM o menos.
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6939545B2 (en) * 1999-04-28 2005-09-06 Genetics Institute, Llc Composition and method for treating inflammatory disorders
BRPI0619118A2 (pt) * 2005-12-02 2011-09-13 Genentech Inc composições e métodos para o tratamento de doenças e desordens associadas com a sinalização de citocina
TW200744634A (en) * 2006-02-21 2007-12-16 Wyeth Corp Methods of using antibodies against human IL-22
TWI417301B (zh) * 2006-02-21 2013-12-01 Wyeth Corp 對抗人類介白素-２２（ｉｌ-２２）之抗體及其用途
WO2007149814A1 (en) * 2006-06-19 2007-12-27 Wyeth Methods of modulating il-22 and il-17
CA2718634A1 (en) * 2008-03-21 2009-09-24 Wyeth Llc Antibodies against interleukin-10-like cytokines and uses therefor
EP2411416A1 (en) * 2009-03-24 2012-02-01 The Government of the United States of America as represented by The Secretary of the Department of Health and Human Services Anti-mesothelin antibodies
EP3409289B1 (en) 2010-02-26 2020-09-30 Novo Nordisk A/S Stable antibody containing compositions
RU2012153786A (ru) 2010-05-28 2014-07-10 Ново Нордиск А/С Стабильные многодозовые композиции, содержащие антитело и консервант
JP6698276B2 (ja) * 2012-01-16 2020-05-27 アトックス バイオ リミテッド 細菌感染の治療用の合成ペプチド
RU2523413C1 (ru) * 2012-12-14 2014-07-20 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" (ГБОУ ВПО УГМА Минздравсоцразвития России) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РЕВМАТОИДНОГО АРТИРИТА ПО НАЛИЧИЮ АНТИТЕЛ К МОДИФИЦИРОВАННОМУ ЦИНТРУЛЛИНИРОВАННОМУ ВИМЕНТИНУ (Anti-MCV) В РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ
CN107206254B (zh) * 2014-07-17 2021-08-24 领导医疗有限公司 白细胞介素-23受体的口服肽抑制剂以及其治疗炎症性肠病的用途
EA201891800A1 (ru) * 2016-02-10 2019-01-31 Кайман Кемикал Компани Инкорпорейтед Антитела к цитруллинированным hla-полипептидам и их применение
EP4053557A1 (en) * 2016-11-24 2022-09-07 Huvet Bio, Inc. Il-29 as a marker for a pancreatic disease
KR20210019464A (ko) * 2018-06-05 2021-02-22 바이오아트라, 인코퍼레이티드 항 il-22 항체, 항체 단편, 이의 면역접합체 및 이의 용도
EP3946592A4 (en) * 2019-03-26 2023-01-04 Astrazeneca Collaboration Ventures, LLC PATIENT POPULATIONS LIKELY TO BENEFIT FROM IL23 ANTAGONIST THERAPY
KR102517872B1 (ko) * 2019-06-12 2023-04-05 (주)아큐레시스바이오 암의 예방 또는 치료용 조성물
US12286482B2 (en) * 2020-08-05 2025-04-29 Synthekine, Inc. IL10RB binding molecules and encoding nucleic acids
AR124250A1 (es) * 2020-12-07 2023-03-01 UCB Biopharma SRL Anticuerpos
PE20231953A1 (es) 2020-12-07 2023-12-06 UCB Biopharma SRL Anticuerpos multiespecificos y combinaciones de anticuerpos
WO2023110942A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Charité-Universitätsmedizin Berlin Prevention of impaired fracture healing
WO2024044787A2 (en) * 2022-08-26 2024-02-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Treatment of metabolic syndrome and associated morbidities using intestinal th17 cells or intestinal th17 cell-derived molecules

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
DE3380726D1 (en) 1982-06-24 1989-11-23 Japan Chem Res Long-acting composition
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
WO1987005330A1 (en) 1986-03-07 1987-09-11 Michel Louis Eugene Bergh Method for enhancing glycoprotein stability
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US6018026A (en) 1988-01-22 2000-01-25 Zymogenetics, Inc. Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP0436597B1 (en) 1988-09-02 1997-04-02 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8905669D0 (en) 1989-03-13 1989-04-26 Celltech Ltd Modified antibodies
US5350836A (en) * 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
GB9021679D0 (en) 1990-10-05 1990-11-21 Gorman Scott David Antibody preparation
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
EP1820858B1 (en) 1991-03-01 2009-08-12 Dyax Corporation Chimeric protein comprising micro-protein having two or more disulfide bonds and embodiments thereof
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
US5833976A (en) * 1991-08-06 1998-11-10 Schering Corporation Use of interleukin-10 (IL-10) to treat endotoxin- or superantigen-induced toxicity
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
GB9214857D0 (en) 1992-07-13 1992-08-26 Medical Res Council Human nucleic acid fragments and their use
DK1621554T4 (da) 1992-08-21 2012-12-17 Univ Bruxelles Immunoglobuliner blottet for lette kæder
US5789192A (en) * 1992-12-10 1998-08-04 Schering Corporation Mammalian receptors for interleukin-10 (IL-10)
US5536637A (en) * 1993-04-07 1996-07-16 Genetics Institute, Inc. Method of screening for cDNA encoding novel secreted mammalian proteins in yeast
ES2162863T3 (es) * 1993-04-29 2002-01-16 Unilever Nv Produccion de anticuerpos o fragmentos (funcionalizados) de los mismos derivados de inmunoglobulinas de cadena pesada de camelidae.
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
RU2085200C1 (ru) * 1993-11-11 1997-07-27 Ростовский научно-исследовательский онкологический институт МЗ РФ Способ предоперационного лечения рака прямой кишки
US5939545A (en) * 1994-02-14 1999-08-17 Cocensys, Inc. Method, compositions, and compounds for allosteric modulation of the gaba receptor by members of the androstane and pregnane series
US5674487A (en) * 1994-09-28 1997-10-07 Univ Jefferson Method for treating autoimmune diseases
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JP3780030B2 (ja) * 1995-06-12 2006-05-31 株式会社ルネサステクノロジ 発振回路およびｄｒａｍ
ES2176484T3 (es) 1995-08-18 2002-12-01 Morphosys Ag Bancos de proteinas/(poli)peptidos.
MX336813B (es) 1996-02-09 2016-02-02 Abbvie Biotechnology Ltd Anticuerpos humanos que ligan el tnfa humano.
WO1997039772A1 (fr) * 1996-04-19 1997-10-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Remede contre l'arthrite rhumatoide contenant un anticorps anti-il-8 comme principe actif
ES2294799T3 (es) * 1996-06-27 2008-04-01 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw. Moleculas de anticuerpos que interactuan especificamente con el sitio activo o hendidura de una molecula diana.
US6492507B1 (en) * 1996-10-23 2002-12-10 Incyte Genomics, Inc. Polynucleotides encoding human eosinophil-derived basic protein
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
EP0983303B1 (en) 1997-05-21 2006-03-08 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
US20030032057A1 (en) * 1997-08-26 2003-02-13 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6551799B2 (en) * 1999-12-07 2003-04-22 Genentech, Inc. Interleukin-22 polypeptides, nucleic acids encoding the same and methods for the treatment of pancreatic disorders
WO2002016611A2 (en) 2000-08-24 2002-02-28 Genentech, Inc. Interleukin-22 polypeptides, nucleic acids encoding the same and methods for the treatment of pancreatic disorders
US6350892B1 (en) 1997-09-23 2002-02-26 Bristol-Myers Squibb Company Trifluoromethyl ketone analogs as selective cPLA2 inhibitors
CN101274962A (zh) * 1998-01-23 2008-10-01 霍夫曼-拉罗奇有限公司 人il-12抗体
US20010023070A1 (en) * 1998-05-29 2001-09-20 Reinhard Ebner Interleukins-21 and 22
EP1082433A4 (en) * 1998-05-29 2003-01-02 Human Genome Sciences Inc Interleukins 21 and 22
US6274710B1 (en) 1998-10-26 2001-08-14 Ludwig Institute For Cancer Research Antibodies which specifically bind T Cell inducible factors (TIFs)
US7081528B2 (en) * 1998-10-26 2006-07-25 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules encoding T cell derived inducible factors
WO2000024758A1 (en) 1998-10-26 2000-05-04 Ludwig Institute For Cancer Research ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULES WHICH ENCODE T CELL INDUCIBLE FACTORS (TIFs), THE PROTEINS ENCODED, AND USES THEREOF
AU776910B2 (en) 1998-12-08 2004-09-23 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Modifying protein immunogenicity
HUP0200575A3 (en) 1999-03-25 2004-11-29 Abbott Gmbh & Co Kg Human antibodies that bind human il-12 and methods for producing
US7307161B1 (en) * 1999-04-28 2007-12-11 Genetics Institute, Llc Human Gil-19/AE289 polynucleotides
US6939545B2 (en) * 1999-04-28 2005-09-06 Genetics Institute, Llc Composition and method for treating inflammatory disorders
AU5151100A (en) * 1999-05-19 2000-12-05 Incyte Genomics, Inc. Extracellular signaling molecules
AU5047600A (en) 1999-05-27 2000-12-18 Schering Corporation Mammalian interleukin-10 homologs: il-d110 and il-d210
EP1208195A2 (en) 1999-06-15 2002-05-29 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU2253301A (en) * 1999-12-03 2001-06-12 Zymogenetics Inc. Human cytokine receptor
US20030170823A1 (en) * 1999-12-23 2003-09-11 Presnell Scott R. Novel cytokine ZCYTO18
AU2292601A (en) 1999-12-23 2001-07-03 Zymogenetics Inc. Novel cytokine zcyto18
EP1252143A1 (en) 2000-01-27 2002-10-30 American Cyanamid Company Method for preparing alpha-sulfonyl hydroxamic acid derivatives
DE60135393D1 (de) * 2000-06-30 2008-09-25 Zymogenetics Inc Allelische Variante des Interferon-ähnlichen Proteins Zcyto21
US20030012788A1 (en) * 2000-07-27 2003-01-16 Jean-Christophe Renauld Method for influencing kinase pathways with IL-22
ES2349312T3 (es) 2000-07-27 2010-12-29 Wyeth Llc Uso de anticuerpos antagonistas del receptor de il-10 para inhibir la inducción por il-tif/il-21 de proteínas de fase aguda.
US7094570B2 (en) * 2003-03-11 2006-08-22 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules which encode a soluble IL-TIF/IL-22 receptor or binding protein which binds to IL-TIF/IL-22, and uses thereof
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2438238A1 (en) 2001-02-23 2002-09-06 Genetics Institute, Llc. Composition comprising il-22 inhibitors and use thereof for treating inflammatory disorders
US7638604B2 (en) * 2001-02-23 2009-12-29 Genetics Institute, Llc Monoclonal antibodies against interleukin-22
US20040058445A1 (en) 2001-04-26 2004-03-25 Ledbetter Jeffrey Alan Activation of tumor-reactive lymphocytes via antibodies or genes recognizing CD3 or 4-1BB
US20020187512A1 (en) 2001-09-10 2002-12-12 Nagem Ronaldo Alves Pinto Crystal structure of human interleukin-22
AU2003223344B9 (en) 2002-03-22 2009-07-16 Zymogenetics, Inc. Anti-IL-TIF antibodies and methods of using in inflammation
EP1644415B1 (en) 2003-06-23 2010-12-01 Genetics Institute, LLC Antibodies against interleukin-22 and uses therefor
TW200744634A (en) 2006-02-21 2007-12-16 Wyeth Corp Methods of using antibodies against human IL-22
US8359965B2 (en) 2007-09-17 2013-01-29 Oxford J Craig Apparatus and method for broad spectrum radiation attenuation

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