BRPI0708125A2

BRPI0708125A2 - peptìdio restrito á hla-a*3303 da wt1 e composição farmacêutica compreendendo o mesmo

Info

Publication number: BRPI0708125A2
Application number: BRPI0708125-1A
Authority: BR
Inventors: Sugiyama Haruo
Original assignee: International Institute Of Cancer Immunology, Inc
Priority date: 2006-02-22
Filing date: 2007-02-21
Publication date: 2011-05-17
Also published as: US8968745B2; JP5393144B2; HK1125968A1; RU2435782C2; PT1988163E; AU2007218649A1; IL232409A0; ZA200806542B; IL193026A; CA2886615A1; US8778350B2; PH12012502372B1; ES2558330T3; US8945578B2; KR101391561B1; RU2008137635A; CA2886551A1; IL218172A0; US20140193442A1; US20140193443A1

Abstract

PEPTIDIO RESTRITO à HLA-A*33O3 DA WT1 E COMPOSIçãO FARMACêUTICA COMPREENDENDO O MESMO. A presente invenção refere-se a um peptídio compreendendo uma seqúéncia de aminoácidos consistindo em nove resíduos aminoácidos seqúenciais provenientes de uma proteína WT1, em que um resíduo amino- ácido na posição 2 da seqúência de aminoácidos é selecionado do grupoconsistindo em Ala, Ile, Leu, Vai, Phe, Tyr, Ser e Asp e um resíduo aminoá- cido na posição 9 da seqúência de aminoácidos é Arg; um polinucleotídio codificando o peptídio; uma composição farmacêutica compreendendo o peptídio; e outros.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PEPTÍDIORESTRITO À HLA-A*3303 DA WT1 E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICACOMPREENDENDO O MESMO".

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a um peptídio restrito à HLA-A*3303, especificamente um peptídio compreendendo uma seqüência deaminoácidos composta de 9 aminoácidos seqüenciais de uma proteína WT1,em que um aminoácido na posição 2 da seqüência de aminoácidos é sele-cionado do grupo consistindo em Ala, lie, Leu, Vai, Phe, Tyr, Ser e Asp, eum aminoácido na posição 9 é Arg. Além disso, a presente invenção refere-se a um polinucleotídio codificando o peptídio, uma composição farmacêuti-ca para o tratamento ou a prevenção de um câncer compreendendo o mes-mo, e assim por diante.

ANTECEDENTES PA INVENÇÃO

O gene da WT1 (gene do tumor 1 de Wilms) foi identificado co-mo um gene responsável pelo tumor de Wilms que é um câncer renal emcrianças (Documentos 1 e 2, não Patentes). WT1 é um fator de transcriçãopossuindo uma estrutura de dedo de zinco. Inicialmente, considerou-se queo gene WT1 era um gene de supressor de tumor. Contudo, estudos subse-qüentes (Documentos 3, 4, 5 e 6, não Patentes) mostraram que o gene WT1em vez disso funciona como um oncogene nos tumores hematopoiéticos enos cânceres sólidos.

O gene WT1 é expressado em níveis elevados em muitos tiposde tumores malignos. Foi examinado se o produto genético WT1 sem muta-ções, que é uma proteína autóloga, possui imunogenicidade em um corpovivo. Os resultados revelaram que a proteína derivada do gene WT1, que éexpressado em níveis elevados nas células de tumor, é fragmentado peloprocessamento intracelular; os peptídios resultantes formam complexos commoléculas MHC da classe I, e os complexos são apresentados nas superfí-cies de células, e aqueles CTLs reconhecendo tais complexos podem serinduzidos pela vacinação do peptídio (Documentos 7, 8 e 9, não Patentes).

Também foi mostrado que em um rato imunizado com um peptídio WT1 oucom WT1 cDNA, as células de tumor transplantadas que expressam um ge-ne WT1 são rejeitadas com uma elevada probabilidade (Documentos 7 e 10,não Patentes), enquanto os tecidos normais que expressam fisiologicamenteo gene WT1 não são danificados pelo CTLs induzido (Documento 7, nãoPatente). Foi mostrado em experimentos in vitro usando células humanasque quando o peptídio Db126 ou o peptídio WH187 (aminoácidos 187 a 195da SEQ ID NQ: 1, SLGEQQYSV) possuindo uma elevada capacidade de li-gação com a molécula HLA-A*0201, que é uma das moléculas humanasMHC da classe I, são usados para estimular as células mononucleares dosangue periférico humano possuindo HLA-A*0201, os CTLs são induzidosespecíficos para a WT1, os CTLs induzidos possuem uma atividade citotóxi-ca específica para células de tumor que expressam endogenamente um ge-ne WT1 em níveis elevados, e a atividade citotóxica de tais CTLs está restri-ta à HLA-A2 (Documento 11, não Patente). Foi mostrado em experimentos invitro em células humanas usando peptídio da WT1 que combina com a HLA-A 2402 (que foi encontrado como sendo o mais freqüentemente em pessoasjaponesas entre os alelos HLA-A) (WTI235; aminoácidos 235 a 243 da SEQID N-: 1, CMTWNQMNL) que são induzidas os CTLs (TAK-1) específicospara WT1 (Documento 12, não Patente), e os CTLs induzidos não suprimema atividade formadora de colônias das células tronco hematopoiéticas nor-mais que expressam parcialmente fisiologicamente um gene WT1 (Docu-mentos 13 e 14, não Patentes). Esses relatórios sugerem fortemente quenão só em ratos, mas também em seres humanos, podem ser induzidos osCTLs específicos para a WT1, tais CTLs possuem uma atividade citotóxicacontra células de tumor que expressam um gene WT1 em níveis elevados,mas não possuem uma atividade citotóxica contra células normais que ex-pressam um gene WT1 em níveis fisiológicos (Documentos, não Patentes 7,10, 11, 12, 13e 14).

O produto genético WT1 está presente como uma proteína nu-clear, e é processado pelos proteossomas no citoplasma para ser fragmen-tado em peptídios. Os peptídios fragmentados são transportados para dentrodo lúmen do retículo endoplasmático por moléculas TAP (transportador as-sociado com o processamento de antígeno), formam complexos com as mo-léculas MHC da classe I, e são apresentados nas superfícies das células. OsCTLs específicos para a WT1 são induzidos como um resultado do reconhe-cimento dos complexos da molécula da classe I da MHC do peptídio da WT1por células do precursor CTL via TCR1 exercendo desse modo um efeito ci-totóxico sobre as células de tumor apresentando um produto genético WT1através moléculas classe I da MHC (Documentos, 7, 8 e 9, não Patentes).Então, é necessário pelo menos que um peptídio WT1 usado na imunotera-pia do câncer que visa um produto genético WT1 esteja na forma que se ligaa uma molécula da classe I da MHC em um corpo vivo. Entretanto, as molé-culas da classe I da MHC são diferentes e as seqüências de aminoácidosdos peptídios da WT1 que se ligam às respectivas moléculas da classe I daMHC são diferentes umas das outras. Desse modo, é necessário fornecerum peptídio que se combine com cada subtipo da classe I da MHC. Entre-tanto, somente os peptídios restritos à molécula HLA-A*2402, à moléculaHLA-A 0201 e à molécula HLA-A*2601 são conhecidos como peptídios WT1restritos à molécula HLA até agora (Documento de Patente 1, Documento11, não Patente e o Documento de Patente 2, respectivamente). A HLA-A*3303 está presente na próxima percentagem mais elevada em relação àHLA-A*2402 em japoneses. Desse modo, existe uma necessidade de seencontrar um peptídio WT1 que seja restrito à HLA-A*3303.

Documento de Patente 1: WO 2003/106682.

Documento de Patente 2: WO 2005/095598.

Documento não Patente 1:Daniel A. Haber et al., Cel!. 1990 Jun29; 61 (7): 1257-69.

Documento não Patente 2:Call KM et al., Cell. 1990 Feb 9;60(3):509-20.

Documento não Patente 3:Menke AL et al., Int Rev CyXol 1998;181:151-212. Review.

Documento não Patente 4:Yamagami T et al., Blood. 1996 Apr1; 87(7):2878-84.

Documento não Patente 5:lnoue K et al., Blood. 1998 Apr 15;91(8):2969-76.

Documento não Patente 6:Tsuboi A et al., Leuk Res. 1999 May;23(5):499-505.

Documento não Patente 7:Oka Y et al., J Immunol. 2000 Feb 15;164(4):1873-80.

Documento não Patente 8:Melief CJ et al., Immunol Rev. 1995Jun; 145:167-77.

Documento não Patente 9:Ritz J, J Clin Oncol. 1994 Feb;12(2):237-8.

Documento não Patente 10:Tsuboi A et al., J Clin Immunol. 2000May; 20(3): 195-202.

Documento não Patente 11 :Oka Y et al., Immunogenetics. 2000Feb; 51(2):99-107.

Documento não Patente 12:Ohminami H et al., Blood. 2000 Jan1; 95(1):286-93.

Documento não Patente 13:Gao L et al., Blood. 2000 Apr 1;95(7):2198-203.

Documento não Patente 14: Ohminami H et al., Blood. 2000 Jan1; 95(1):286-93.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO.

Problemas a Serem Resolvidos pela Invenção.

Os problemas a serem resolvidos pela presente invenção sãoprover um peptídio da WT1 restrito para HLA-A*3303, e um polinucleotídiocodificando o mesmo, bem como uma composição farmacêutica para o tra-tamento/prevenção de um câncer compreendendo o mesmo, e assim pordiante.

Meios de Resolver os Problemas.

Em conseqüência de estudos intensivos em vista da situação a-cima descrita, os atuais inventores encontraram que um peptídio compreen-dendo uma seqüência de aminoácidos composta de 9 aminoácidos seqüen-ciais de uma proteína WT1, em que um aminoácido na posição 2 da se-qüência de aminoácidos é selecionado do grupo consistindo em Ala, lie, Leu,Val1 Phe1 Tyr1 Ser e Asp, e um aminoácido na posição 9 da seqüência deaminoácidos é Arg pode induzir um CTL específico para a WT1 com umaelevada taxa. Assim, a presente invenção foi concluída.

A presente invéncão fornece:

(1) Um peptídio compreendendo uma seqüência de aminoácidosconsistindo em 9 aminoácidos seqüenciais de uma proteína WT1, em queum aminoácido na posição 2 da seqüência de aminoácidos é selecionado dogrupo consistindo em Ala, lie, Leu, Vai, Phe, Tyr, Ser e Asp, e um aminoáci-do na posição 9 da seqüência de aminoácidos é Arg:

(2) O peptídio de acordo com (1), em que a seqüência de ami-noácidos é selecionada do grupo consistindo em:

Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg (SEQ ID N9: 2),

Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg (SEQ ID Ne: 3),

Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID NQ: 4), e

Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg (SEQ ID N5: 5);

(3) O peptídio de acordo com (2), em que a seqüência de ami-noácidos é Asp Ser Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID Ns: 4);

(4) Uma composição farmacêutica para o tratamento ou preven-ção de um câncer, compreendendo o peptídio de acordo com (1);

(5) Um método para o tratamento ou a prevenção de um câncer,compreendendo a administração de uma quantidade eficaz da composiçãofarmacêutica de acordo com (4) para um indivíduo positivo para HLA-A*3303;

(6) Uso do peptídio de acordo com (1) para a fabricação dacomposição farmacêutica de acordo com (4);

(7) Um polinucleotídio codificando o peptídio de acordo com (1);

(8) Um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídio deacordo com (7);

(9) Uma composição farmacêutica para o tratamento ou a pre-venção de um câncer, compreendendo o polinucleotídio de acordo com (7)ou o vetor de acordo com (8);

(10) Um método para o tratamento ou a prevenção de um cân-cer, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz da composi-ção farmacêutica de acordo com (9) para um indivíduo positivo para HLA-A*3303;

(11) Uso do polinucleotídio de acordo com (7) ou o vetor de a-cordo com (8) para a fabricação da composição farmacêutica de acordo com(9);

(12) Um CTL específico para a WT1, que é induzível pelo peptí-dio de acordo com (1);

(13) Um método para indução de um CTL específico para aWT1, compreendendo o cultivo de uma célula mononuclear de sangue peri-férico na presença do peptídio de acordo com (1) para induzir o CTL especí-fico para a WT1 da célula mononuclear do sangue periférico;

(14) Um kit para indução de um CTL específico para a WT1,compreendendo o peptídio de acordo com (1) como um ingrediente essenci-al;

(15) Uma célula apresentando o antígeno e apresentando umpeptídio WT1, que é induzível pelo peptídio de acordo com (1);

(16) Um método para indução de uma célula apresentando umantígeno apresentando um peptídio WT1, compreendendo o cultivo uma cé-lula imatura apresentando o antígeno na presença do peptídio de acordocom (1) para induzir a célula apresentando o antígeno apresentando umpeptídio WT1 a partir da célula imatura apresentando o antígeno;

(17) Um kit para indução de uma célula apresentando o antíge-no apresentando um peptídio WT1, compreendendo o peptídio de acordocom (1) como um ingrediente essencial;

(18) Um método para diagnóstico de um câncer, compreenden-do utilização do CTL de acordo com (12) ou a célula apresentando o antíge-no de acordo com (15);

(19) Um método para determinar a presença ou a quantidade deum CTL específico para a WT1 em um indivíduo positivo para HLA-A*3303,compreendendo:

(a) reagir um complexo de um peptídio WT1 e uma molécula deHLA-A*3303 com uma amostra do indivíduo; e

(b) determinar a presença ou a quantidade de um CTL reconhe-cendo os complexos contidos na amostra; e

(20) o método de acordo com (19), em que o complexo é umaforma de tetrâmero.

Efeitos da Presente Invenção.

A presente invenção fornece um peptídio da WT1 restrito paraHLA-A*3303, e um polinucleotídio codificando o mesmo, bem como umacomposição farmacêutica para o tratamento ou a prevenção de um câncercompreendendo o mesmo, e assim por diante. Desse modo, é possível indu-zir in vivo e in vitro CTLs específicos para as WT1 em indivíduos possuindoHLA-A 3303. Como aproximadamente 24% dos japoneses possuem pelomenos uma molécula de HLA-A*3303, Os CTLs específicos para a WT1 po-de ser induzido em uma faixa muito ampla de indivíduos.

Breve Descrição de Desenhos.

A figura 1 representa a atividade citotóxica do CTL induzido comWTI337.

A figura 2 representa a atividade citotóxica do CTL induzido comWT1364.

A figura 3 representa a atividade citotóxica do CTL induzido comWTI367.

A figura 4 representa a atividade citotóxica do CTL induzido comWTI409.

A figura 5 representa a atividade citotóxica do CTL induzido comWT1364 contra a célula expressando um gene WT1 endogenamente.

A figura 6 representa a atividade citotóxica do CTL induzido comWT1367 contra a célula expressando um gene WT1 endogenamente.

A figura 7 representa a atividade citotóxica do CTL induzido comWTI409 contra a célula expressando um gene WT1 endogenamente.

A figura 8 representa a atividade citotóxica do CTL induzido comWT1367 contra a célula expressando um gene WT1.Melhor Modo para Realizar a Invenção.

Uma seqüência de aminoácidos de uma proteína WT1 humanaé mostrada na SEQ ID N9: 1. Um gene WT1 é expressado na sua forma na-tiva em níveis elevados, por exemplo, em tumores hematopoiéticos, tais co-mo leucemia, síndrome mielodisplásica, mieíoma múltiplo ou Iinfoma malignoe cânceres sólidos, tais como câncer gástrico, câncer do cólon, câncer dopulmão, câncer da mama, câncer da célula germinativa, câncer do fígado,câncer de pele, câncer da bexiga, câncer da próstata, câncer do útero, cân-cer do colo do útéro ou câncer do ovário. Além disso, um motivo de ancora-gem para o HLA-A 3303 é caracterizado pelo fato de que um aminoácido naposição 2 é qualquer um entre Ala, lie, Leu, Vai, Phe1Tyr, Ser e Asp, e umaminoácido na posição 9 é Arg. Assim, em um aspecto, a presente invençãorefere-se a um peptídio da WT1 restrito para HLA-A*3303 compreendendouma seqüência de aminoácidos composta de 9 aminoácidos seqüenciais deuma proteína WT1, em que um aminoácido na posição 2 da seqüência deaminoácidos é preferivelmente selecionado do grupo consistindo em Ala, lie,Leu, Vai, Phe, Tyr, Ser e Asp, e um aminoácido na posição 9 da seqüênciade aminoácidos é preferivelmente Arg (daqui por diante denominado peptídioWT1).

A seqüência de aminoácidos composta de 9 aminoácidos com-preendidos no peptídio de acordo com a presente invenção é preferivelmen-te, Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg (SEQ ID N9: 2), Phe Ser Arg SerAsp Gln Leu Lys Arg (SEQ ID N9: 3), Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg(SEQ ID N9: 4) ou Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg (SEQ ID N9: 5). Maispreferivelmente, é Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID N9: 4). A-lém disso, ela pode ter uma substituição de um a diversos aminoácidos, pre-ferivelmente de um a cinco aminoácidos com outros aminoácidos nos 9 ami-noácidos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 2 a 5. Qualquer um entre os 9aminoácidos, ou outros aminoácidos substituídos, pode ser adequadamentemodificado. Em qualquer caso, o peptídio da presente invenção conservauma capacidade de se ligar a uma molécula de HLA-A*3303.

Como descrito em cima, é um objeto da presente invenção deobter um peptídio da WT1 restrito para HLA-A*3303. Assim, o peptídio deacordo com a presente invenção pode ser qualquer um enquanto ele com-preender uma seqüência de aminoácidos que é derivada de uma proteínaWT1 e consistè em 9 aminoácidos seqüenciais. Assim, o peptídio de acordocom a presente invenção pode ser, por exemplo, um peptídio consistindosomente da seqüência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQID Nos: 2 a 5, ou uma proteína WT1 ou uma parte da mesma compreenden-do a seqüência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID Nos:2 a 5. Várias substâncias podem ser ligadas no N terminal e/ou no C termi-nal da seqüência de aminoácidos composta de 9 aminoácidos seqüenciaisno peptídio de acordo com a presente invenção. Por exemplo, podem seranexados um aminoácido, um peptídio ou um análogo dos mesmos. Se es-sas substâncias forem ligadas ao peptídio de acordo com a presente inven-ção, eles podem ser processados, por exemplo, por uma enzima em umcorpo vivo ou por um processo, tal como um processamento intracelular, efinalmente a seqüência de aminoácidos composta de 9 aminoácidos se-qüenciais pode ser produzida e apresentada como um complexo com umamolécula de HLA-A*3303 na superfície de uma célula, resultando assim noefeito de induzir um GTL. Estas substâncias podem ser aqueles que modu-Iam a solubilidade dos peptídios da presente invenção, ou aumentam a suaestabilidade (resistência à protease, etc.). Alternativamente, estas substân-cias podem ser aquelas que liberam os peptídios da presente invenção es-pecificamente, por exemplo, para um determinado tecido ou órgão, ou elaspodem possuir a ação de aumentar a eficiência da absorção por uma célulaapresentando o antígeno ou similares. Estas substâncias podem ser aquelesque aumentam a capacidade de induzir um CTL, tal como peptídios auxilia-res ou similares.

O peptídio de acordo com a presente invenção pode ser sinteti-zado por métodos geralmente usados na técnica ou modificações dos mes-mos. Tais métodos são descritos, por exemplo, nos Peptide Synthesis, In-terscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., NewYork, Í976; Peptide-Gosei, Maruzen Co., Ltd., 1975; Peptide-Gosei No KisoTo Jikken, Maruzen Co., Ltd., 1985; e Iyakuhin No Kaihatsu (Zoku), Vol. 14,Peptide-Gosei, Hirokawa - Book store, 1991.

O peptídio de acordo com a presente invenção também podeser preparado usando técnicas de engenharia genéticas baseadas na infor-mação sobre a seqüência de nucleotídios que codifica o peptídio de acordocom a presente invenção. Tais técnicas de engenharia genética são bemconhecidas a uma pessoa versada na técnica.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a umacomposição farmacêutica para o tratamento ou a prevenção de um câncer,compreendendo o peptídio restrito à HLA-A*3303 da WT1. O gene WT1 éexpressado em níveis elevados em tumores hematopoiéticos, tais como leu-cemia, síndrome mielodisplásica, mieloma múltiplo ou Iinfoma maligno, ecãnceres sólidos, tais como câncer gástrico, câncer do cólon, câncer dopulmão, câncer da mama, câncer da célula germinativa, câncer do fígado,câncer de pele, câncer da bexiga, câncer da próstata, câncer do útero, cân-cer do colo do útero ou câncer do ovário. Desse modo, a composição farma-cêutica de acordo com a presente invenção pode ser usada para o tratamen-to ou a prevenção de um câncer. Quando a composição farmacêutica deacordo com a presente invenção é administrada a um indivíduo positivo paraHLA-A*3303, os CTLs específicos para a WT1 são induzidos pelo peptídiorestrito à HLA-A*3303 da WT1 compreendido na composição farmacêutica, eas células de câncer no indivíduo são danificadas por tais CTLs.

A composição farmacêutica de acordo com a presente invençãopode compreender além do peptídio restrito à HLA-A*3303 da WT1 como umingrediente ativo, por exemplo, um veículo, um excipiente ou similares.

O peptídio restrito à HLA-A*3303 da WT1 compreendido na composição far-macêutica de acordo com a presente invenção induz um CTL específico paraa WT1. Assim, a composição farmacêutica de acordo com a presente inven-ção pode compreender um adjuvante apropriado, ou pode ser administradaem conjunto com um adjuvante apropriado para realçar a eficiência da indu-ção. Os exemplos de adjuvantes preferidos incluem, mas não estão limitadosa, adjuvante completo ou incompleto de Freund e hidróxido de alumínio.O método de administração da composição farmacêutica de a-cordo com a presente invenção pode ser adequadamente selecionado de-pendendo das condições, tais como do tipo de doença, da condição do indi-víduo ou do sítio-alvo. Os exemplos de tais métodos incluem, mas não estãolimitados a, administração intradérmica, administração subcutânea, adminis-tração intramuscular, administração intravenosa, administração nasal e ad-ministração oral. A quantidade do peptídio compreendido na composiçãofarmacêutica de acordo com a presente invenção, bem como a forma de do-sagem, o número de vezes de administração e assim por diante, em relaçãoà composição farmacêutica de acordo com a presente invenção podem seradequadamente selecionados dependendo de condições, tais como o tipoda doença, a condição do indivíduo ou o sítio-alvo. A dose única do peptídioé de normalmente, 0,0001 mg a 1.000 mg, preferivelmente, de 0.001 mg a10.000 mg.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um métodopara o tratamento ou a prevenção de um câncer, compreendendo a adminis-tração de uma quantidade eficaz da composição farmacêutica a um indiví-duo positivo para HLA-A*3303. O câncer a ser tratado ou prevenido pode serqualquer um, e os exemplos dos mesmos incluem tumores hematopoiéticos,tais como leucemia, síndrome mielodisplásica, mieloma múltiplo ou Iinfomamaligno e cânceres sólidos, tais como câncer gástrico, câncer do cólon, cân-cer do pulmão, câncer da mama, o câncer da célula germinativa, câncer dofígado, câncer de pele, câncer da bexiga, câncer da próstata, câncer do úte-ro, câncer do colo do útero ou câncer do ovário.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de umpeptídio da WT1 restrito para HLA-A*3303 para fabricação da composiçãofarmacêutica.

Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a ummétodo para determinar a presença ou a quantidade de um CTL específicopara a WT1 em um indivíduo positivo para HLA-A*3303, compreendendo:

(a) reagir um complexo de um peptídio WT1 e uma molécula deHLA-A*3303 com um tipo de amostra do indivíduo; e(b) determinar a presença ou a quantidade de um CTL reconhe-cendo os complexos contidos na amostra. A amostra de um indivíduo podeser qualquer uma desde que exista a possibilidade da mesma conter um Iin-fócito. Os exemplos das amostras incluem os fluidos corporais, tais como osangue ou a linfa e um tecido. O complexo de um peptídio WT1 e uma molé-cula de HLA-A*3303 pode ser preparado, por exemplo, como um tetrâmeroou um pentâmero pela utilização de um método conhecido por uma pessoaversada na técnica, tal como método de biotina-estreptavidina. A presençaou a quantidade do CTL reconhecendo tal complexo podem ser medidas porum método conhecido por uma pessoa versada na técnica. Neste aspectoda presente invenção, o complexo pode ser marcado. Um marcador conhe-cido, tal como um marcador fluorescente ou um marcador radioativo podemser usados como o marcador. A marcação torna a determinação da presen-ça ou da quantidade de um CTL um método fácil e rápido. O método desseaspecto da presente invenção pode ser usado para diagnosticar um câncer,prognosticar os mesmos ou similares.

Assim, a presente invenção também fornece uma composiçãopara determinação da presença ou da quantidade de um CTL específico pa-ra a WT1 em um indivíduo positivo para HLA-A*3303, compreendendo umcomplexo de um peptídio WT1 e uma molécula de HLA-A*3303.

Além disso, a presente invenção fornece um kit para determinara presença ou a quantidade de um CTL específico para a WT1 em um indi-víduo positivo para HLA-A*3303, compreendendo um complexo de um pep-tídio WT1 e uma molécula de HLA-A*3303.

Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a ummétodo de produção de um CTL específico para a WT1, a utilização de umcomplexo de um peptídio WT1 e uma molécula de HLA-A*3303, compreen-dendo:

(a) reagir o complexo com uma amostra; e

(b) obter um CTL reconhecendo os complexos contidos na a-mostra. O complexo de um peptídio WT1 e uma molécula de HLA-A*3303 édescrito em cima. A amostra pode ser qualquer uma desde que exista apossibilidade da mesma conter um linfócito. Os exemplos das amostras in-cluem uma amostra de um indivíduo, tal como sangue, e uma cultura de cé-lula. O CTL reconhecendo o complexo pode ser obtido usando um métodoconhecido de úma pessoa versada na técnica, tal como FACS ou MACS. Apresente invenção permite à cultura o CTL específico para a WTi obtido eusá-lo para o tratamento ou a prevenção de vários cânceres.

Assim, a presente invenção também se refere a um CTL especí-fico para a WT1 que é obtido por um método de produção de um CTL espe-cífico para a WT1 pela utilização de um complexo de um peptídio WT1 euma molécula de HLA-A*3303.

Além disso, a presente invenção refere-se a um kit para a pro-dução de um CTL específico para a WT1, compreendendo um complexo deum peptídio WT1 e uma molécula de HLA-A*3303.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polinu-cleotídio codificando o peptídio restrito à HLA-A*3303 da WT1 (daqui pordiante denominado como polinucleotídio WT1). O polinucleotídio da presenteinvenção pode ser um DNA ou um RNA. A seqüência baseada do polinucle-otídio da presente invenção pode ser determinada baseada da seqüência deaminoácidos do peptídio restrito à HLA-A*3303 da WT1. O polinucleotídiopode ser preparado, por exemplo, por um método da síntese de DNA ouRNA, o método de PCR ou similares.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor deexpressão compreendendo o polinucleotídio (daqui por diante denominadocomo vetor de expressão WT1). O tipo do vetor de expressão, a seqüênciacompreendida diferente da seqüência do polinucleotídio e assim por diantepode ser adequadamente selecionada dependendo do tipo de hospedeiro noqual o vetor de expressão da presente invenção é introduzido, seu objetivode uso, ou similares. É possível tratar ou prevenir tumores hematopoiéticosou cânceres sólidos administrando o vetor de expressão da presente inven-ção a um indivíduo positivo para HLA-A*3303 produzir um peptídio WT1 emum corpo vivo e induzir um CTL específico para a WT1, e danificando hema-topoiéticos células de tumor ou células de câncer sólidas no indivíduo.Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma compo-sição farmacêutica para o tratamento ou a prevenção de um câncer, com-preendendo o polinucleotídio WT1 ou o vetor de expressão WT1. A compo-sição, o método de administração e tudo mais para a composição farmacêu-tica de acordo com a presente invenção, nesse aspecto, são descritos acima.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um métodopara o tratamento ou a prevenção de um câncer, compreendendo a adminis-tração de uma quantidade eficaz da composição farmacêutica compreen-dendo o peptídiõ WT1 ou o vetor de expressão WT1 a um indivíduo positivopara HLA-A*3303. Os exemplos de cânceres a serem tratados ou preveni-dos incluem tumores hematopoiéticos, tais como leucemia, síndrome mielo-displásica, mieloma múltiplo ou Iinfoma maligno e cânceres sólidos, tais co-mo câncer gástrico, câncer do cólon, câncer do pulmão, câncer da mama,15 câncer da célula germinativa, câncer do fígado, câncer de pele, câncer dabexiga, câncer da próstata, câncer do útero, câncer do colo do útero ou cân-cer do ovário.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de umWT1 polinucleotídio ou um vetor de expressão WT1 para a fabricação dacomposição farmacêutica compreendendo o WT1 polinucleotídio ou o vetorde expressão WT1.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célulacompreendendo o vetor de expressão. A célula da presente invenção podeser preparada, por exemplo, transformando uma célula de hospedeiro, talcomo E. coli, levedura, célula de inseto ou célula dos animais com o vetor deexpressão. O método de introdução do vetor de expressão em uma célula dehospedeiro pode ser adequadamente selecionado de vários métodos. Pelocultivo da célula transformada, a recuperação e a purificação do peptídioWT1 produzido, pode ser preparado o peptídio de acordo com a presenteinvenção.

Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a umCTL específico para a WT1, que é induzido pelo peptídio restrito à HLA-A*3303 da WT1. O CTL da presente invenção reconhece um complexo deum peptídio WT1 e uma molécula de HLA-A*3303. Assim, o CTL da presen-te invenção pode ser utilizado para danificar especificamente uma célula detumor positiva para HLA-A*3303 e expressando a WT1 em um alto nível,

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um métodopara o tratamento ou a prevenção de um câncer, compreendendo a adminis-tração de um CTL específico para a WT1 a um indivíduo positivo para HLA-A*3303. O método da administração do CTL específico para a WT1 pode seradequadamente selecionado dependendo de condições, tais como o tipo dadoença, a condição do indivíduo ou o sítio-alvo. Os exemplos de tais méto-dos incluem, mas não estão limitados a, administração intravenosa, adminis-tração intradérmica, administração subcutânea, administração intramuscular,administração nasal e administração oral.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um métodopara indução de um CTL específico para a WT1, compreendendo o cultivode uma célula mononuclear do sangue periférico na presença do peptídiorestrito à HLA-A*3303 da WT1 para induzir o CTL específico para a formaWT1 da célula mononuclear do sangue periférico. O indivíduo do qual a célu-la mononuclear é derivada do sangue periférico pode ser qualquer um en-quanto for positivo para HLA-A*3303. Por cultivo as células mononuclearesdo sangue periférico na presença de peptídio restrito à HLA-A*3303 da WT1,os CTLs específicos para a WT1 são induzidos a partir das células do pre-cursor do CTL contidas nas células mononucleares do sangue periférico. Épossível tratar ou prevenir tumores hematopoiéticos ou cânceres sólidos emum indivíduo positivo para HLA-A*3303 administrando ao indivíduo o CTLespecífico para a WT1 obtido de acordo com a presente invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit paraindução de um CTL específico para a WT1, compreendendo um peptídio daWT1 restrito para HLA-A*3303 como um ingrediente essencial. Preferivel-mente, o kit é usado no método para indução de um CTL específico para aWT1. O kit de acordo com a presente invenção pode compreender tambémdo peptídio restrito à HLA-A*3303 da WT1, por exemplo, um meio de obteruma célula mononuclear do sangue periférico, um adjuvante, um vaso parareação ou similares. Em geral, um manual de instrução é anexado ao kit.Usando o kit de acordo com a presente invenção, os CTLs específicos paraa WT1 podem ser induzidos eficientemente.

Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a umacélula apresentando o antígeno (tal como uma célula dendrítica) a apresen-tação de um peptídio WT1 por uma molécula de HLA-A*3303, que é induzidapelo peptídio restrito à HLA-A*3303 da WTI. Usando a célula apresentandoo antígeno de acordo com a presente invenção, os CTLs específicos para aWT1 são induzidos eficientemente.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um métodopara o tratamento ou a prevenção de um câncer, compreendendo a adminis-tração da célula apresentando o antígeno apresentando um peptídio WT1por uma molécula de HLA-A*3303 a um indivíduo positivo para HLA-A*3303.O método da administração da célula apresentando o antígeno pode ser a-dequadamente selecionado dependendo de condições, tais como o tipo dadoença, a condição do indivíduo ou o sítio-alvo. Os exemplos de tais méto-dos incluem, mas não estão limitados a, administração intravenosa, adminis-tração intradérmica, administração subcutânea, administração intramuscular,administração nasal e administração oral.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um métodopara indução de uma célula apresentando o antígeno apresentando um pep-tídio WT1 por uma molécula de HLA-A*3303, compreendendo o cultivo deuma célula imatura apresentando o antígeno na presença do peptídio restritoà HLA-A*3303 da WT1 para induzir a célula apresentando o antígeno apre-sentando um peptídio WT1 por uma molécula de HLA-A*3303 a partir dacélula imatura apresentando o antígeno. A célula imatura apresentando oantígeno libera uma célula, tal como uma célula dendrítica imatura que podeser amadurecida em uma célula apresentando o antígeno. Um indivíduo doqual a célula imatura apresentando o antígeno é derivada pode ser qualquerum enquanto seja positivo para HLA-A*3303. Como as células imaturas queapresentam o antígeno são contidas, por exemplo, nas células mononuclea-res do sangue periférico, tais células podem ser cultivadas na presença dopeptídio WT1.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit paraindução de uma célula apresentando o antígeno apresentando um peptídioWT1 por uma molécula de HLA-A*3303, compreendendo o peptídio restrito àHLA-A*3303 da WT1 como um ingrediente essencial. Preferivelmente, o kit éusado no método para indução de uma célula apresentando o antígeno. Ou-tro ingrediente a ser compreendido no kit de acordo com a presente inven-ção e assim por diante é descrito acima. O kit de acordo com a presente in-venção pode ser utilizado para induzir eficientemente uma célula apresen-tando o antígeno apresentando um peptídio WT1 por uma molécula de HLA-A*3303.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpocontra um peptídio da WT1 restrito para HLA-A*3303 ou a um anticorpo con-tra um polinucleotídio codificando o peptídio. O anticorpo da presente inven-ção pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal.

Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a ummétodo para o diagnóstico de um câncer, compreendendo utilização do CTLespecífico para a WT1, a célula apresentando o antígeno apresentando umpeptídio WT1 por uma molécula de HLA-A*3303, ou o anticorpo contra umpeptídio da WT1 restrito para HLA-A*3303 ou o anticorpo contra um polinu-cleotídio codificando o peptídio. Preferivelmente, o CTL específico para aWT1 é usado no método para diagnóstico de acordo com a presente inven-ção. Por exemplo, é possível diagnosticar um câncer incubando o CTL, acélula apresentando o antígeno ou o anticorpo com uma amostra de um in-divíduo positivo para HLA-A*3303, ou administrando-o a um indivíduo positi-vo para HLA-A*3303, e a determinação, por exemplo, da posição, do sítio oudo crescimento do mesmo. O CTL, a célula apresentando o antígeno ou oanticorpo podem ser marcados. Anexando um marcador, o método para di-agnóstico da presente invenção pode ser praticado eficientemente.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit do di-agnóstico de um câncer, compreendendo o CTL específico para a WT1, acélula apresentando o antígeno apresentando um peptídio WT1 através deuma molécula de HLA-A*3303, ou anticorpo contra um peptídio da WT1 res-trito para HLA-A*3303 ou o anticorpo contra um polinucleotídio codificando opeptídio como um ingrediente essencial.

Os seguintes exemplos ilustram mais detalhadamente a presen-te invenção, mas não devem ser interpretados como Iimitantes do alcanceda mesma.

EXEMPLOS.

Exemplo 1.

Seleção do peptídio WT1.

O Programa NetMHC2.0 (Universidade Técnica da Dinamarca)esteve usado para selecionar os WTI337, WT1364, WT1367 e WTI409, que sãopeptídios hidrofílicos consistindo em 9 aminoácidos com o motivo de anco-ragem conveniente para a HLA-A*3303 (o segundo aminoácido do N-terminal é qualquer um entre Ala, lie, Leu, Vai, Phe, Tyr, Ser e Asp, e o ami-noácido na C-terminal é Arg) e são esperados com possuindo uma elevadaafinidade de ligação a uma molécula de HLA-A*3303 de um peptídio WTi deuma proteína WT1 (SEQ ID N9: 1). As seqüências de aminoácidos e as afi-nidades de ligação a uma molécula HLA-A*3303 destes peptídios são mos-tradas na Tabela 1.

Tabela 1.

<table>table see original document page 19</column></row><table>Preparação de célula B-LCL.

As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foramseparadas por um gradiente de densidade pelo método de centrifugação emum Ficoll-Hypaque do sangue periférico que tinha sido coletado de um doa-dor (HLA-A*3303/0207) positivo ao HLA-A*3303. Os PBMCs foram entãosemeadas em uma placa de cultivo celular de 24 cavidades a uma densida-de de aproximadamente 1 χ 107 células em um meio RPMI-1640 que contémFCS a 10%, e foi acrescentada uma cultura sobrenadante de células B95-8(células que produzem vírus EB). Elas foram cultivadas a 37°C com CO2 a5% durante aproximadamente 1 mês. Foram obtidas as células B-LCL trans-formadas com o vírus de EB, que são células B de células de tumor. Confir-mou-se que as células B-LCL resultantes não expressaram o gene WT1. Ascélulas de B-LCL foram pulsadas incubando-as então com 20 pg/ml deWTI337, WTI364, WTI367 ou WTI409 durante duas horas, e radiadas com 80Gy de radiação. As células B-LCL resultantes (daqui por diante denominadascomo células de B-LCL pulsadas com um peptídio WT1) foram usadas comoas células apresentando o antígeno nos seguintes experimentos.Indução da WT1 específica do CTL.

3 χ 106 de PBMCs (HLA-A*3303/1101) foram cultivadas em umaplaca de cultivo celular de 24 cavidades em um meio completo (45% deRPMI, 45% de meio AMI-V e 10% de soro humano AB) contendo 20 Mg/mlde WTI337, WTI364, WTI367 ou WTI409 a 37°C com CO2 a 5% durante umasemana para obter células de resposta. 2 χ 106 das células de resposta re-sultantes forma cultivadas com 1 χ 106 células B-LCL pulsadas com o mes-mo peptídio WT1 no meio completo durante 1 semana (primeira estimula-ção). Os PBMCs foram co-cultivados com as células B-LCL pulsadas com opeptídio WT1 mais três vezes (da segunda à quarta estimulação) sob ascondições sob as quais 20 lU/ml (concentração final) de IL-2 foram acres-centadas como se segue: segunda estimulação: duas vezes em dias alter-nados 3 dias depois da iniciação da estimulação; terceira e quarta estimula-ções: três vezes em intervalos de um dia a partir do dia posterior à iniciaçãoda estimulação. As células resultantes foram concentradas usando o Kit deAlimentação Gravimétrica de Colunas de Seleção Negativa (StemSp) paraque a proporção de células T positivas ao CD8 até que se tornassem apro-ximadamente 80%, e co-cultivadas com as células B-LCL pulsadas com opeptídio WT1 (quinta estimulação). As células T Positivas ao CD8 (CTLs)obtidas 5 dias depois da estimulação final foram usadas para a medição daatividade citotóxica.

Atividade de Citotóxica do CTL.

A atividade citotóxica de CTLs foi medida usando o ensaio de li-beração de 51Cr. As células de CTL (daqui por diante denominadas comocélulas efetoras) foram misturadas na proporção (razão E/T) de 1:1, 5:1 ou10:1 em 200 μΙ do meio com células alvo nas quais o 51Cr tinha sido incorpo-rado, e cultivadas em uma placa de cultivo celular de 96 cavidades a 37°Ccom CO2 a 5% durante 4 horas. As células de B-LCL pulsadas com o mes-mo peptídio WT1 que usado para a indução de CTLs (BLCL-Ps), e as célu-las B-LCL não pulsadas com um peptídio WT1 (BLCL-NPs) foram usadascomo células alvo. Depois do cultivo, os sobrenàdantes foram coletados porcentrifugação. As quantidades de 51Cr liberadas nos sobrenadantes forammedidas usando um contador de cintilação líquida. A atividade citotóxica (%)foi determinada usando a seguinte fórmula:

(51Cr Liberado no sobrenadante da amostra - Liberação espon-tânea de 51Cr) / (Liberação máxima de 51Cr - Liberação espontânea de 51Cr)χ 100;

em que Liberação espontânea de 51Cr é a liberação de 51Cr ob-servada quando as células alvo nas quais 51Cr tinha sido incorporado foramcultivadas sozinhas sob as mesmas condições, e Liberação máxima de 51Cré a liberação de 51Cr observada quando as células alvo nas quais 51Cr tinhasido incorporado foram completamente Iisadas pela utilização de Triton X-100 a 1%. Os resultados são mostrados nas Figuras 1 a 4. Nas Figuras, oseixos verticais representam a Iise específica (%), e os eixos horizontais re-presentam as proporções E/T. As BLCL-Ps são representadas usando linhascheias, e BLCL-NPs são representadas usando linhas pontilhadas. Foi con-firmado que os CTLs induzidos com WTI337, WTI364, WTI367 ou WTI409 da-nificaram especificamente as BLCL-Ps apresentando o peptídio WT1 comoum complexo com uma molécula de HLA-A*3303 comparando com as BL-CL-NPs. Os CTLs induzidos com WT1364, WTI36? ou WT140g foram usadospara novos experimentos abaixo.

Atividade de Citotóxica do CTL Contra Células Expressando Endoaenamen-te um Gene da WT1

A atividade citotóxica de CTLs induzidos com WT1364, WT1367 ouWTI409 contra células TF-1 que são células de tumor que expressam umgene WT1 (positivas para HLA-A*3303) foi determinada usando o método talcomo descrito acima. Como um controle, foram usadas as células de K562que expressam um gene WT1 e são negativas para HLA-A*3303. Os resul-tados são mostrados nas Figuras 5 a 7. Nas Figuras, os eixos verticais re-presentam a Iise específica (%), e os eixos horizontais representam propor-ções E/T. A TF-1 é representada usando linhas cheias, e K562 é represen-tado usando linhas pontilhadas. Foi confirmado que CTLs induzidos comWT1364, WT1367 ou WT1409 também possuem uma atividade citotóxica contraa célula expressando endogenamente um gene WT1.

A atividade citotóxica de CTLs induzidas com WT1367 contra acélula B-LCL expressando WT1 foi determinada usando o método tal comodescrito acima. O B-LCL expressando a WT1 (B-LCL-WT1) se refere à célu-la B-LCL na qual um gene WT1 humano é introduzido e expressa uma prote-ína WT1 na célula, apresentando um peptídio consistindo em aproximada-mente 9 aminoácidosque resultam de processamento em uma molécula deHLA-A*3303. Como um controle, foi usada uma célula de B-LCL (B-LCL-CV)na qual foi introduzido um gene de controle diferente de um gene WT1. Osresultados são mostrados nA figura 8. Nas Figuras, os eixos verticais repre-sentam a Iise específica (%), e os eixos horizontais representam as propor-ções E/T. O B-LCL-WT1 é representado usando linhas cheias, e o B-LCL-CVé representado usando linhas pontilhadas. Foi confirmado que os CTLs in-duzidos com WT1367 danificam somente a célula que é positiva pra HLA-A*3303 e que expressa a WT1.Aplicabilidade Industrial

A presente invenção refere-se um peptídio da WT1 restrito paraHLA-A*3303, um polinucleotídio codificando o peptídio, uma composiçãofarmacêutica compreendendo o mesmo e assim por diante. Desse modo, apresente invenção pode ser usada nos campos da medicina e conseqüen-temente, por exemplo, nos campos de desenvolvimento e preparação deuma composição farmacêutica para a prevenção ou o tratamento de váriostumores hematopoiéticos e de cânceres sólidos expressando o gene WT1em níveis elevados.

Listagem de Seqüência

<110> International Institute of câncer immunology, Inc.

<120> WTl restrita ao pepitidio hla-a*3303 e composição farmacêutica com-preendendo o mesmo.

<130> 667343<150> JP 2006-045287<151> 2006-02-22<160> 5

<170> Versão de Patente 3.2<210> 1<211> 449<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 1

Met Gly ser Asp vai Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala vai Pro1 5 10 15

ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro vai Ser Gly Ala Ala

20 25 30

Gln Trp Ala Pro vai Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala ser Ala Tyr35 40 45

Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro50 55 60Pro Pro Pro ργο His ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly65 70 75 80

Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr vai His Phe

85 90 95

Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe

100 105 110

Gly Pro Pro Pro Pro Ser. Gln Ala Ser ser Gly Gln Ala Arg Met Phe

115 120 125

Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu ser Gln Pro Ala lie

130 135 140

Arg Asn Gln Gly Tyr ser Thr vai Thr Phe Asp Gly Thr Pro ser Tyr145 150 155 160

Gly His Thr Pro ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe

165 170 175

Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln

180 185 190

Tyr Ser vai Pro Pro Pro vai Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser

195 200 205

Cys Thr Gly ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp

210 215 220

Asn Leu Tyr Gln Met Thr ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln225 230 235 240

Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly vai Ala Ala Gly Ser Ser ser

245 250 255

ser vai Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu

260 265 270

ser Asp Asn His Thr Thr Pro lie Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg lie

275 280 285

His Thr His Gly vai Phe Arg Gly lie Gln Asp vai Arg Arg vai Pro

290 295 300

Gly vai Ala Pro Thr Leu vai Arg ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys305 310 315 320Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys

325 330 335

Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro340 345 350

Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe ser Arg Ser Asp355 360 365

Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly vai Lys Pro Phe Gln

370 375 380

Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr385 390 395 400

His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys

405 410 415

Arg Trp Pro ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu vai420 425 430

Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala435 440 445

Leu<210> 2<211> 9<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 2

Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg1 5

<210> 3<211> 9<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 3

Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg1 5<210> 4<211> 9<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 4

Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg<210> 5<211> 9<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 5

Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg1 5

Claims

1. Peptídio compreendendo uma seqüência de aminoácidoscomposta de 9 aminoácidos seqüenciais de uma proteína WT1, em que umaminoácido na posição 2 da seqüência de aminoácidos é selecionado dogrupo consistindo em Ala, lie, Leu, Vai, Phe1 Tyr, Ser e Asp, e um aminoáci-do na posição 9 da seqüência de aminoácidos é Arg.

2. Peptídio de acordo com a reivindicação 1, em que a seqüên-cia de aminoácidos é selecionada do grupo consistindo em:Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg (SEQ ID Ns: 2),Phe Ser Arg Ser AspGIn Leu Lys Arg (SEQ ID NQ: 3),Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID Ne: 4), eThr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg (SEQ ID Ne: 5).

3. Peptídio de acordo com a reivindicação 2, em que a seqüên-cia de aminoácidos é Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg (SEQ ID N9: 4).

4. Composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção deum câncer, compreendendo o peptídio como definido na reivindicação 1.

5. Método para o tratamento ou a prevenção de um câncer,compreendendo a administração de uma quantidade eficaz da composiçãofarmacêutica como definido na reivindicação 4, em um indivíduo positivo pa-ra HLA-A*3303.

6. Uso do peptídio como definido na reivindicação 1, para a fa-bricação da composição farmacêutica como definido na reivindicação 4.

7. Polinucleotídio codificando o peptídio como definido na reivin-dicação 1.

8. Vetor de expressão compreendendo o polinucleotídio comodefinido na reivindicação 7.

9. Composição farmacêutica para o tratamento ou a prevençãode um câncer, compreendendo o polinucleotídio como definido na reivindica-ção 7, ou o vetor como definido na reivindicação 8.

10. Método para o tratamento ou a prevenção de um câncer,compreendendo a administração de uma quantidade eficaz da composiçãofarmacêutica como definido na reivindicação 9, em um indivíduo positivopara HLA-A*3303.

11. Uso do polinucleotídio como definido na reivindicação 7, ouo vetor como definido na reivindicação 8, para a fabricação da composiçãofarmacêutica como definido na reivindicação 9.

12. CTL específico para a WT1, que é induzível pelo peptídiocomo definido na reivindicação 1.

13. Método para indução de um CTL específico para a WT1,compreendendo o cultivo de uma célula mononuclear de sangue periféricona presença do peptídio como definido na reivindicação 1, para induzir oCTL específico para a WT1 a partir da célula mononuclear do sangue perifé-rico.

14. Kit para indução de um CTL específico para a WT1, com-preendendo o peptídio como definido na reivindicação 1, como um ingredien-te essencial.

15. Célula apresentando o antígeno apresentando um peptídioWT1, que é induzível pelo peptídio como definido na reivindicação 1.

16. Método para indução de uma célula apresentando o antíge-no apresentando um peptídio WT1, compreendendo o cultivo de uma célulaimatura apresentando o antígeno na presença do peptídio como definido nareivindicação 1, para induzir a célula apresentando o antígeno apresentandoum peptídio WT1 a partir da célula imatura apresentando o antígeno.

17. Kit para indução de uma célula apresentando o antígeno a-presentando um peptídio WT1, compreendendo o peptídio como definido nareivindicação 1, como um ingrediente essencial.

18. Método para diagnóstico de um câncer, compreendendo uti-lização do CTL como definido na reivindicação 12, ou a célula apresentandoo antígeno como definido na reivindicação 15.

19. Método para determinar a presença ou a quantidade de umCTL específico para a WT1 em um indivíduo positivo para HLA-A*3303,compreendendo:(a) reagir um complexo de um peptídio WT1 e uma molécula deHLA-A*3303 com uma amostra do indivíduo; e(b) determinar a presença ou a quantidade de um CTL reconhe-cendo os complexos contidos na amostra.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o com-plexo é uma forma de tetrâmero.