ES2587980T3

ES2587980T3 - Péptido WT1 con restricción HLA-A*3303 y composición farmacéutica que lo contiene

Info

Publication number: ES2587980T3
Application number: ES11161436.8T
Authority: ES
Inventors: Haruo Sugiyama
Original assignee: International Institute of Cancer Immunology Inc
Current assignee: International Institute of Cancer Immunology Inc
Priority date: 2006-02-22
Filing date: 2007-02-21
Publication date: 2016-10-28
Anticipated expiration: 2027-02-21
Also published as: US20140193442A1; US20140199332A1; CN101384716A; CA2886551A1; ES2558330T3; MX2008010842A; US20140193443A1; ES2387685T3; CN102702319B; US8945578B2; EP1988163B1; EP1988163A4; SI1988163T1; IL193026A0; US20100292160A1; EP2518149A1; RU2435782C2; CA2638122A1; US8933038B2; KR101391561B1

Abstract

Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer en un sujeto positivo a HLA-A*3303, que incluye un péptido consistente en una secuencia de aminoácidos (1) o (2): (1) una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg (SEC. ID. Nº 2), Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg (SEC. ID. Nº 3) y 10 Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg (SEC. ID. Nº 5); (2) una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEC. ID. Nº 2, la SEC. ID. Nº 3 y la SEC. ID. Nº 5, en donde un aminoácido está substituido con otro aminoácido, siempre que el aminoácido en la posición 2 sea cualquiera de Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr, Ser y Asp, y que el aminoácido en la posición 9 sea Arg, donde el péptido consistente en una secuencia de aminoácidos (2) tiene capacidad para unirse a una molécula HLA-A*3303 y tiene capacidad para inducir CTL, y donde el cáncer es cualquiera de un tumor hematopoyético, tal como leucemia, síndrome mielodisplásico, mieloma múltiple o linfoma maligno, y un cáncer sólido, tal como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células germinales, cáncer hepático, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer uterino, cáncer cervical o cáncer ovárico.

Description

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(a): la reacción del complejo con una muestra, y

(b): la obtención de un CTL que reconoce el complejo contenido en la muestra. El complejo de un péptido WT1 y una molécula HLA-A* 3303 ha sido descrito anteriormente. La muestra puede ser cualquiera, siempre que exista la posibilidad de que contenga un linfocito. Como ejemplos de las muestras, se incluyen una muestra de un sujeto, tal como sangre, y un cultivo celular. Se puede obtener el CTL que reconoce el complejo usando un método conocido para un experto en la técnica, tal como FACS o MACS. La presente invención permite cultivar el CTL específico de WT1 obtenido y usarlo para el tratamiento o la prevención de diversos cánceres.

Por lo tanto, la presente invención también se relaciona con un CTL específico de WT1 que puede ser obtenido mediante el método anterior para la producción de un CTL específico de WT1 usando un complejo de un péptido WT1 y una molécula HLA-A*3303.

Se desvelan polinucleótidos codificantes del péptido WT1 con restricción HLA-A*3303 (a los que de aquí en adelante se hará referencia como un polinucleótido WT1). El polinucleótido puede ser de ADN o ARN. Se puede determinar la secuencia de bases del polinucleótido en base a la secuencia de aminoácidos del péptido WT1 con restricción HLAA*3303. Se puede preparar el polinucleótido, por ejemplo, mediante un método para la síntesis de ADN o de ARN o un método de PCR.

También se desvela un vector de expresión que contiene el polinucleótido (al que de aquí en adelante se hará referencia como un vector de expresión WT1). El tipo del vector de expresión y la secuencia incluida distinta de la secuencia del polinucleótido pueden ser apropiadamente seleccionados dependiendo del tipo de hospedador en el que se introduce el vector de expresión de la presente invención o del objetivo de uso. Es posible tratar o prevenir tumores hematopoyéticos o cánceres sólidos administrando el vector de expresión a un sujeto positivo a HLAA*3303 para producir un péptido WT1 en un organismo vivo e inducir un CTL específico de WT1 y dañar las células de los tumores hematopoyéticos o las células de los cánceres sólidos en el sujeto.

El aspecto (3) de la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica para uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer, que contiene el polinucleótido WT1 antes definido o el vector de expresión WT1 antes definido. La composición farmacéutica para uso en el tratamiento del cáncer en este aspecto es como se ha descrito anteriormente.

El aspecto (4) de la presente invención se relaciona con el uso del polinucleótido WT1 o del vector de expresión WT1 para preparar un medicamento para el tratamiento o la prevención de un cáncer en un sujeto positivo a HLAA*3303. Como ejemplos de cánceres que han de ser tratados o prevenidos, se incluyen tumores hematopoyéticos, tales como la leucemia, el síndrome mielodisplásico, el mieloma múltiple o el linfoma maligno, y cánceres sólidos, tales como el cáncer gástrico, el cáncer de colon, el cáncer de pulmón, el cáncer de mama, el cáncer de células germinales, el cáncer hepático, el cáncer de piel, el cáncer de vejiga, el cáncer de próstata, el cáncer uterino, el cáncer cervical o el cáncer de ovario.

Se desvela además una célula que contiene el vector de expresión. La célula puede ser preparada, por ejemplo, transformando una célula huésped, tal como E. coli, una levadura, una célula de insecto o una célula animal, con el vector de expresión. El método para la introducción del vector de expresión en una célula huésped puede ser apropiadamente seleccionado entre diversos métodos. Cultivando la célula transformada y recuperando y purificando el péptido WT1 producido, se puede preparar el péptido WT1.

El aspecto (5) de la presente invención se relaciona con un CTL específico de WT1, que es inducido por el péptido WT1 con restricción HLA-A*3303. El CTL de la presente invención reconoce un complejo de un péptido WT1 y una molécula HLA-A*3303. Por lo tanto, el CTL de la presente invención puede ser usado para dañar específicamente una célula tumoral positiva para HLA.A* 3303 y que expresa WT1 a un alto nivel.

También se desvela un método para el tratamiento o la prevención de un cáncer, consistente en administrar un CTL específico de WT1 a un sujeto positivo a HLA-A*3303. El método de administración del CTL específico de WT1 puede ser apropiadamente seleccionado dependiendo de condiciones tales como el tipo de enfermedad, el estado del sujeto o el sitio diana. Como ejemplos de dichos métodos, se incluyen la administración intravenosa, la administración intradérmica, la administración subcutánea, la administración intramuscular, la administración nasal y la administración oral.

El aspecto (6) de la presente invención se relaciona con un método para la inducción de un CTL específico de WT1, consistente en cultivar una célula mononuclear de sangre periférica en presencia del péptido WT1 con restricción HLA-A*3303 para inducir el CTL específico de WT1 a partir de la célula mononuclear de sangre periférica. El sujeto del que deriva la célula mononuclear de sangre periférica puede ser cualquiera, siempre que sea positivo para HLAA*3303. Cultivando las células mononucleares de sangre periférica en presencia del péptido WT1 con restricción HLA-A*3303, se inducen CTL específicos de WT1 a partir de células precursoras de CTL contenidas en las células mononucleares de sangre periférica. Es posible tratar o prevenir tumores hematopoyéticos o cánceres sólidos en un sujeto positivo a HLA-A*3303 administrando el CTL específico de WT1 obtenido según la presente invención al

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sujeto.

El aspecto (7) de la presente invención se relaciona con una célula presentadora de antígeno (tal como una célula dendrítica) que presenta un péptido WT1 a través de una molécula HLA-A*3303, que es inducida por el péptido WT1 con restricción HLA-A*3303. Utilizando la célula presentadora de antígeno de la presente invención, se inducen eficazmente CTL específicos de WT1.

También se desvela un método para el tratamiento o la prevención de un cáncer, consistente en administrar la célula presentadora de antígeno que presenta un péptido WT1 a través de una molécula HLA-A*3303 a un sujeto positivo a HLA-A*3303. El método de administración de la célula presentadora de antígeno puede ser apropiadamente seleccionado dependiendo de condiciones tales como el tipo de enfermedad, el estado del sujeto o el sitio diana. Como ejemplos de dichos métodos, se incluyen la administración intravenosa, la administración intradérmica, la administración subcutánea, la administración intramuscular, la administración nasal y la administración oral.

El aspecto (8) de la presente invención se relaciona con un método para la inducción de una célula presentadora de antígeno que presenta un péptido WT1 a través de una molécula HLA-A*3303, consistente en cultivar una célula presentadora de antígeno inmadura en presencia del péptido WT1 con restricción HLA-A*3303 para inducir la célula presentadora de antígeno que presenta un péptido WT1 a través de una molécula HLA-A*3303 a partir de la célula presentadora de antígeno inmadura. La célula presentadora de antígeno inmadura se refiere a una célula, tal como una célula dendrítica, inmadura que puede madurar hacia una célula presentadora de antígeno. El sujeto del que deriva la célula presentadora de antígeno inmadura puede ser cualquiera, siempre que sea positivo para HLAA*3303. Como las células presentadoras de antígeno inmaduras están contenidas, por ejemplo, en las células mononucleares de sangre periférica, dichas células pueden ser cultivadas en presencia del péptido WT1.

También se desvela un anticuerpo contra un péptido WT1 con restricción HLA-A*3303 o un anticuerpo contra un polinucleótido codificante del péptido. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal.

El aspecto (9) de la presente invención se relaciona con un método para el diagnóstico de un cáncer, consistente en usar el CTL específico de WT1, la célula presentadora de antígeno que presenta un péptido WT1 a través de una molécula HLA-A*3303 o el anticuerpo contra un péptido WT1 con restricción HLA-A*3303 o el anticuerpo contra un polinucleótido codificante del péptido. Preferiblemente, se usa el CTL específico de WT1 en el método para el diagnóstico de la presente invención. Por ejemplo, es posible diagnosticar un cáncer incubando el CTL, la célula presentadora de antígeno o el anticuerpo con una muestra de un sujeto positivo a HLA-A*3303, o administrándolos a un sujeto positivo a HLA-A*3303, y determinando, por ejemplo, su posición, sitio o cantidad. Se puede marcar el CTL, la célula presentadora de antígeno o el anticuerpo. Mediante la unión de un marcaje, se puede llevar eficazmente a la práctica el método para el diagnóstico de la presente invención.

Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención con más detalle. Los ejemplos que ya no quedan dentro del alcance de las reivindicaciones tienen un fin ilustrativo.

Ejemplos

Ejemplo 1

Selección del péptido WT1

Se usó el Programa NetMHC2.0 (Technical University of Denmark) para seleccionar WT1337, WT1364, WT1367 y WT1409, que son péptidos hidrofílicos consistentes en 9 aminoácidos con la unidad de anclaje adecuada para HLAA*3303 (el segundo aminoácido desde el extremo N es cualquiera de Ala, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr, Ser y Asp, y el aminoácido en el extremo C es Arg) y se espera que tengan una gran afinidad de unión hacia una molécula HLAA*3303 de un péptido WT1 de una proteína WT1 (SEC. ID. Nº 1). En la Tabla 1, se muestran las secuencias de aminoácidos y las afinidades de unión hacia una molécula HLA-A*3303 de estos péptidos.

[Tabla 1]

Péptido Número de aminoácido en Secuencia de aminoácidos Afinidad de unión hacia la la SEC. ID. Nº 1 molécula HLA-A*3303

WT1337 (SEC. ID. Nº 2): 337-345 LSHLQMHSR 18,827

WT1364 (SEC. ID. Nº 3): 364-372 FSRSDQLKR 15,143

WT1367 (SEC. ID. Nº 4): 367-375 SDQLKRHQR 14,496

WT1409 (SEC. ID. Nº 5): 409-417 TSEKPFSCR 15,310

Preparación de célula B-LCL

Se separaron las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) por el método de centrifugación con gradiente 9 5

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de densidad Ficoll-Hypaque de sangre periférica que había sido recogida de un donante sano positivo a HLA-A*3303 (HLA-A*3303/0207). Se sembraron entonces las PBMC en una placa de cultivo celular de 24 pocillos a una densidad de aproximadamente 1 x 107 en medio RPMI 1640 que contenía un 10% de FCS, y se añadió un sobrenadante de cultivo de células B95-8 (células productoras de virus EB). Se cultivaron a 37°C con un 5% de CO2 durante aproximadamente 1 mes. Se obtuvieron células B-LCL transformadas con virus EB, que son células de tumores de células B. Se confirmó que las células B-LCL resultantes no expresaban el gen WT1. Se pulsaron las células B-LCL incubándolas con 20 g/ml de WT1337, WT1364, WT1367 o WT1409 durante 2 horas, y se las irradió con 80 Gy de radiación. Se usaron las células B-LCL resultantes (a las que de aquí en adelante se hará referencia como células B-LCL pulsadas con un péptido WT1) como células presentadoras de antígeno para los experimentos siguientes.

Inducción de CTL específico de WT1

Se cultivaron 3 x 106 PBMC (HLA-A*3303/1101) en una placa de cultivo celular de 24 pocillos en medio completo (45% de RPMI, 45% de medio AMI-V y 10% de suero AB humano) que contenía 20 g/ml de WT1337, WT1364, WT1367 o WT1409 a 37°C con un 5% de CO2 durante 1 semana para obtener células respondedoras. Se cocultivaron 2 x 106 células respondedoras resultantes con 1 x 106 células B-LCL pulsadas con el mismo péptido WT1 en medio completo durante 1 semana (primera estimulación). Se cocultivaron las PBMC con las células B-LCL pulsadas con el péptido WT1 tres veces más (segunda a cuarta estimulaciones) en condiciones en las cuales se añadieron 20 UI/ml (concentración final) de IL-2 como sigue: segunda estimulación: dos veces en días alternos a partir de los 3 días desde el inicio de la estimulación; tercera y cuarta estimulaciones: tres veces a intervalos de un día desde el día siguiente al inicio de la estimulación. Se concentraron las células resultantes usando el Negative Selection Columns Gravity Feed Kit (StemSp), de tal forma que la proporción de células T positivas a CD8 resultara de aproximadamente el 80%, y se cocultivaron con las células B-LCL pulsadas con el péptido WT1 (quinta estimulación). Se usaron las células T positivas a CD8 (CTL) obtenidas 5 días después de la estimulación final para la medición de la actividad citotóxica.

Actividad citotóxica de los CTL

Se midió la actividad citotóxica de los CTL usando el ensayo de liberación de 51Cr. Se mezclaron células CTL (a las que de aquí en adelante se hará referencia como células efectoras) en una proporción (razón E/T) de 1:1, 5:1 ó 10:1 en 200 l de medio con células diana a las que se había incorporado 51Cr, y se cultivaron en una placa de cultivo celular de 96 pocillos a 37°C con un 5% de CO2 durante 4 horas. Se usaron células B-LCL pulsadas con el mismo péptido WT1 que el usado para la inducción de CTL (BLCL-P) y células B-LCL sin pulsar con un péptido WT1 (BLCL-NP) como células diana. Tras el cultivo, se recogieron los sobrenadantes por centrifugación. Se midieron las cantidades de 51Cr liberadas a los sobrenadantes usando un contador de centelleo líquido. Se determinó la actividad citotóxica (%) usando la siguiente fórmula:

(liberación de 51Cr en el sobrenadante de la muestra -liberación espontánea de 51Cr) /

(liberación máxima de 51Cr -liberación espontánea de 51Cr) x 100

donde la liberación espontánea de 51Cr es la liberación de 51Cr observada cuando se cultivaron las células diana a las que se había incorporado 51Cr solas en las mismas condiciones, y la liberación máxima de 51Cr es la liberación de 51Cr observada cuando se lisaron por completo las células diana a las que se había incorporado 51Cr usando Triton X-100 al 1%. Los resultados son mostrados en las Figs. 1-4. En las figuras, los ejes longitudinales representan la lisis específica (%), y los ejes horizontales representan las razones E/T. Las BLCL-P están representadas usando líneas continuas, y las BLCL-NP están representadas usando líneas discontinuas. Se confirmó que los CTL inducidos con WT1337, WT1364, WT1367 o WT1409 dañan específicamente las BLCL-P que presentan el péptido WT1 como un complejo con una molécula HLA-A*3303 en comparación con las BLCL-NP. Se usaron los CTL inducidos con WT1364, WT1367 o WT1409 para otros experimentos que se indican a continuación.

Actividad citotóxica de los CTL frente a células que expresan el gen WT1 endógenamente

Se determinó la actividad citotóxica de los CTL inducidos con WT1364, WT1367 o WT1409 frente a células TF-1, que son células tumorales que expresan un gen WT1 (positivas a HLA-A*3303) usando el método antes descrito. Como control, se usaron células K562 que expresan un gen WT1 y son negativas para HLA-A*3303. Los resultados son mostrados en las Figs. 5-7. En las figuras, los ejes longitudinales representan la lisis específica (%), y los ejes horizontales representan las razones E/T. Se representa TF-1 usando líneas continuas, y se representa K562 usando líneas discontinuas. Se confirmó que los CTL inducidos con WT1364, WT1367 o WT1409 también tienen una actividad citotóxica frente a la célula que expresa un gen WT1 exógenamente.

Se determinó la actividad citotóxica de los CTL inducidos con WT1367 frente a células B-LCL que expresan WT1 usando el método antes descrito. La B-LCL que expresa WT1 (B-LCL-WT1) se refiere a una célula B-LCL en la que se introduce un gen WT1 humano y que expresa una proteína WT1 en la célula, y presenta un péptido consistente en aproximadamente 9 aminoácidos resultante del procesamiento sobre una molécula HLA-A*3303. Como control,

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Claims

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