BRPI0708148B1 - peptídeos com capacidade antitumoral e imunomoduladora provenientes da região 32-51 da proteína lalf, compostos químicos miméticos aos peptídeos, composição farmacêutica e uso dos peptídeos e compostos químicos - Google Patents
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Abstract
peptídeos com capacidade antitumoral e imunomoduladora provenientes da região 32-51 da proteina lalf, compostos químicos mimeticos aos peptídeos, composição farmacêutica e uso dos peptídeos e compostos químicos resumo: a presente invenção se refere ao desenvolvimento de peptídeos provenientes da sequência hyriikptfrrlkwkkykgkfw na qual se introduziram substituições de aminoácidos que garantem a dissociação da capacidade de união ao lipopolissacarídeo e potenciam o efeito antitumoral e imunomodulador. estes peptídeos ou combinações deles são úteis para o tratamento do câncer, bem como em sinergismo com as terapias convencionais.
Description
“PEPTÍDEOS COM CAPACIDADE ANTITUMORAL E IMUNOMODULADORA PROVENIENTES DA REGIÃO 32-51 DA PROTEÍNA LALF, COMPOSTOS QUÍMICOS MIMÉTICOS AOS PEPTÍDEOS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DOS PEPTÍDEOS E COMPOSTOS QUÍMICOS”
Campo da técnica
A presente invenção se refere ao campo da imunoterapia do câncer. Em particular com peptídeos ou combinações deles, provenientes da região 32-51 da proteína Fator anti-LPS de Limulus, os quais não unem lipopolissacarídeos e apresentam propriedades anti-tumorais e imunomoduladoras úteis para o tratamento do câncer e metástase.
Estado da técnica anterior
Recentemente, foi publicada a utilização de modificadores da resposta biológica no tratamento para o câncer principalmente em combinação com as terapias já existentes procurando aumentar o beneficio do tratamento (US 2004/0101511). Por outro lado, a utilização de seqüências CpG as quais são agonista do Receptor tipo Toll 9 (em inglês Toll-like receptor, abreviado TLR9) estão sendo desenvolvidos como novas drogas para o tratamento, controle e prevenção de múltiplas indicações para câncer ex: células não pequenas de câncer de pulmão, melanoma, carcinoma renal (Klinman D. M., et al., (2004) Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides. Nat Rev Immunol. 4:249-258). A ativação do sistema imune por um agonista do TLR7 se encontra em ensaio clínico fase I com resultados promissores como nova droga para o tratamento de melanoma e outros tumores (Dudek A. Z., et al. (2005) ASCO Annual Meeting). Os anteriormente referidos agonistas dos TLR9 e TLR7 estão sendo avaliados também em infecções virais, dada sua capacidade de promover uma efetiva resposta imune no hospedeiro. Além disso, as denominadas Heat shock protein (Hsp), as quais se unem ao TLR4, foram desenvolvidas e comercializadas como um produto de fusão com a oncoproteína E7. Este novo enfoque imunoterapêutico também é conhecido como vacinas terapêuticas e tem ampla perspectiva na terapia de doenças relacionadas com o vírus do papiloma humano (Chu N. R. et al., (2000) Immunotherapy of a human 5 papillomavirus (HPV) type 16 E7-expressing tumour por administration of fusion protein comprising Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin (BCG) hsp65 and HPV 16 E7. Clin Exp Immunol 121 :216-225). Os receptores tipo Toll são receptores que se encontram em células do sistema imune e reconhecem padrões moleculares sócios a patogênicos, exemplo: 10 lipopolissacarídeos (em inglês Lipopolysaccharide, abreviado LPS), ácido lipotecóico, seqüências não metiladas CpG, RNA viral de cadeia dupla e simples. O reconhecimento do patogênico invasor pelos TLRs ajuda ao sistema imune a dirigir um tipo de resposta compartilhada Thl/Th2 que permite ao organismo erradicar eficientemente a infecção. A utilização de 15 agonistas dos TLRs como drogas para o câncer, baseia-se na ativação do sistema imune inato e adaptativo. Seu principal mecanismo radica na ativação de uma resposta tipo Thl, dada fundamentalmente por Interferons de tipo I (em inglês Interferon, abreviado IFNa.p) e interleucina-12 (IL-12). Isto conduz a uma resposta imune adaptativa altamente específica e mantida 20 (Switaj T., Jalili A., et al., (2004) CpG Immunostimulatory oligodeoxynucleotide 1826 enhances antitumor effect of interleukin 12 genemodified tumor vaccine in a melanoma model in mice. Clinicai Câncer Research, Vol. 10:4165-4175). Esta ativação dual do sistema imune se diferencia de muitas outras aproximações imuno-terapêuticas, as quais são 25 geralmente incapazes de criar um efeito mantido sobre a resposta imune adaptativa e por outro lado a ativação não específica do sistema imune inato implica em efeitos não desejados (Speiser D. E, et al. (2005) Rapad and strong human CD8+T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. TheJournal of Clinicai Inv. Vol. 115 (3).
As células dendríticas (em inglês Dendritic Cells, abreviado DC), são células profissionais apresentadoras de antígenos, cujo principal papel é vincular a resposta imune inata e adaptativa através da interação direta célula-célula e a produção de citocinas. As DC podem ser de origem mielóide ou linfóide atendendo à expressão de uma série de marcadores de superfície, bem como à expressão de diferentes TLRs. As DC de origem linfóide conhecidas como células dendríticas plasmacitóides são as principais produtoras de IFNs de tipo I. Em virtude destas características, as células dendríticas foram manipuladas como um promissor adjuvante celular para o desenvolvimento de vacinas terapêuticas contra o câncer e infecções virais crônicas (Santini S.M., et al. (2003) A new type IIFN- mediated pathway for rapid differentiattion of monocytes into highly ative dendritic cells. Stem Cells, 21:357-362). No entanto, esta é uma técnica altamente onerosa e difícil por isso na atualidade se está trabalhando para encontrar estratégias alternativas mais práticas e menos onerosas (Van Epps H.L. (2005) New hope for tumor vaccines. The Journal of Experimental Medicine, Vol.202:1615).
Originalmente descritos por sua atividade antiviral, os Interferons de tipo I (ΙΡΝα.β), recentemente mostraram exercer importantes efeitos sobre o sistema imune, incluindo a promoção de respostas celular e humoral mediada por seu efeito adjuvante sobre as células dendríticas (Bogdan, C. (2000) The function of type I interferons in antimicrobial immunity. Curr, Opin Immunol. 12:419-424). Trabalhos recentes mostram uma função crítica para os Interferones de tipo I produzidos endogenamente, nos processos de regressão de um sarcoma murino singênico altamente imunogênico e em proteger ao hospedeiro da formação de tumores primários carcinogênicos (Gavin P. Dunn, et al. (2005) A criticai function for type I interferons in câncer immunoediting. Nature Immunology, June 12). Além disso, o Interferon alfa tem um papel importante na iniciação da resposta viral dos linfócitos T, via uma ativação direta dos linfócitos T CD4+ e CD8+ em infecções virais como Influenza (Fonteneau J. F, et al. (2003) Activation of influenza virus-specific CD+4 and CD+8 T cells: a new role for plasmacytoid dendritic cells in adaptive immunity. Immunobiology, 101 : 3520-3526).
Por sua vez, Hoess (WO 95/ 05393) relaciona sua invenção a substâncias as quais se unem com grande afinidade ao LPS e são de utilidade para a prevenção ou tratamento de por exemplo: sepsia mediadas por bactérias Gram-negativas e Gram-positivas e para o tratamento de infecções bacterianas em general e por fungos. A referidas substâncias são peptídeos que unem LPS contendo um domínio de união para a endotoxina (Hoess A., et al., (1993) Crystal structure of an endotoxin-neutralizing protein from the horseshoe crab, Limulus anti-LPS fator, at 1.5A° resolution. The EMBO J. 12:3351-3356). Esta revela um laço ou loop na estrutura da proteína Fator anti-LPS de Limulus (em inglês Limulus anti-LPS fator, abreviado LALF) a qual tem rasgos similares à polimixina B, por estar carregado positivamente, ter caráter antipático e conter resíduos hidrofóbicos e aromáticos expostos. Por este mesmo princípio, discute-se a capacidade da região compreendida entre os aminoácidos 31-52 da proteína LALF de se unir e neutralizar os efeitos associados com a heparina, exemplo: anticoagulação, angiogêneses e a inibição da proliferação de células endoteliais e tumorais. No entanto não existe nenhum dado experimental que suporte este argumento na mencionada patente, de fato as reivindicações outorgadas foram as referentes para um aparato para remover LPS de uma solução, o referido aparato compreende os peptídeos imobilizados em um suporte sólido (US 6.384.188).
Por outro lado, Vallespí (US 6.191.114) relaciona sua invenção ao peptídeo que compreende os aminoácidos 31-52 da proteína LALF, o qual exerce um efeito antiviral sobre células tipo Hep-2 e MDBK em virtude da indução de IFN-α e γ; bem como relaciona sua invenção à utilização do referido peptídeo para o tratamento de infecções virais e desordens relacionadas a imunossupressão. Além disso, o mesmo autor demonstrou o efeito anti-infecção deste peptídeo em modelos animais de sepsia, (Vallespi M. G., et al.l (2003) A Limulus anti-LPS fator-derived peptide modulates cytokine gene expression and promotes resolution of bacterial acute infection in mice. Intebrnational Immunopharmacology, 3:247-256).
Existe um número de terapias dirigidas ao tratamento do câncer que incluem quimioterapia, radiações e terapia genética. Uma desvantagem destas terapias é a toxicidade associada à maioria dos tratamentos. Além disso, grandes doses têm que ser administradas por um longo período de tempo antes de se obter um benefício terapêutico. Portanto, ainda persiste a necessidade do desenvolvimento de novas drogas para acometer tratamentos mais efetivos.
Sobre a base do papel crucial que tem o sistema imune em detectar e dirigir uma resposta eficiente contra o tumor, o desenho de drogas que atuem sobre os mecanismos de defesa do hospedeiro tanto inato como adaptativo pode se converter em poderosas ferramentas para a terapêutica do câncer.
Até o momento não se descreveu substituições de aminoácidos específicos na seqüência HYRIKPTFRRLKWKKYKGKFW da proteína LALF, que permita eliminar a capacidade de união ao LPS e potenciar o efeito imunomodulador, além de lhe conferir efeito antitumoral in vivo contra diferentes tumores.
Explicação da invenção
A presente invenção resolve o problema mencionado anteriormente, ao proporcionar peptídeos provenientes da seqüência HYRIKPTFRRLKWKKYKGKFW (SEQ. Id. No: 13) que corresponde à região 32-51 da proteína LALF, na qual se introduziram substituições de aminoácidos que garantem eliminar a capacidade de união ao LPS e potenciam o efeito antitumoral e imunomodulador.
Os peptídeos análogos derivados das referidas substituições as quais não unem LPS nem heparina e mostram um maior efeito antitumoral e imunomodulador do que o peptídeo parental apresentam as seguintes seqüências:
HARIKPTFRRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. No: 1) HYRIKPTARRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. No: 2) HYRIKPTFRRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. No: 3) HYRIKPTFRRLKWKYKGKFA (SEQ. ID. No: 4)
A capacidade de união ao LPS dos peptídeos descritos por Hoess e Vallespí tem como desvantagem que sua administração na presença de LPS desvia o padrão de citocinas de um perfil compartilhado Thl/Th2 para um predominante Th2, o que seria contra-indicado em pacientes com câncer. Estes pacientes geralmente apresentam infecções concomitantes produto de seu estado imunodeprimido, por isso não se descarta a presença de partículas de LPS no sangue. A administração de um peptídeo que possa induzir um tipo de resposta predominante Th2 na presença da endotoxina seria um efeito não desejado que deterioraria ainda mais o estado imunológico do paciente, piorando a resposta do hospedeiro contra o tumor. Além disso, a união ao LPS, por parte do peptídeo reportado por Vallespí, podería minimizar o efeito imunomodulador descrito para este peptídeo. Por outro lado, a não união a heparina dos peptídeos descritos nesta invenção tem vantagens sobre os descritos anteriormente por Hoess e Vallespí. Em pacientes críticos como por exemplo: cardiopatia isquêmica, doença cerebrovascular, doença tromboembólica venosa (trombose venosa profunda e embolia pulmonar), isquemia de membros inferiores, a utilização de heparina está indicada como tratamento (D. Cabestrero Alonso, et al. (2001) Heparinas de bajo peso molecular en pacientes críticos: usos, indicaciones y tipos. Medicina Intensiva, Vol. 95:18-26), porque a administração de um peptídeo que tenha a propriedade de se unir à heparina podería ser contra-indicada por bloquear o efeito da referida droga nesse contexto. A associação entre câncer e doenças relacionadas a trombo-embolismos é um fenômeno bem conhecido e pode contribuir signifícativamente para a morbilidade e mortalidade do paciente com câncer, como por exemplo, a trombose venosa profunda e embolismo pulmonar. Pelas razões expostas anteriormente é vantajoso dispor de peptídeos que não se unam a heparina e tenham efeito antitumoral e imunomodulador no tratamento do paciente com câncer, o qual em uma grande porcentagem são submetidos a cirurgia e apresentam outros transtornos como hipercoagulabilidade, (Castelli R., et al. (2004) The hepatite and câncer: Review of clinicai trials and biological properties. Vascular Medicine, Vol.9:l-9).
A invenção também inclui peptídeos, onde dois ou mais resíduos aminoácidos são substituídos por alanina e compreendem as seqüências de aminoácidos:
HYRIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. No: 8) HARIKPTARRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. No: 9) ARIKPTFRRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. No: 10) HARIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. No: 11) HARIKPTARRLAWKYKGKFA (SEQ. ID. No: 12) e qualquer variante homóloga ou mimética dos peptídeos anteriores, que tenha sido obtida por via sintética ou recombinante, bem como qualquer peptídeo de fusão que as contenha. Entende-se por variante homóloga qualquer peptídeo que não tenha capacidade de união ao LPS ou heparina e mantenha um efeito antitumoral e imunomodulador. Igualmente se entende por variante mimética qualquer molécula de origem química (não protéica) cuja estrutura não tenha capacidade de união ao LPS ou heparina e mantenha um efeito antitumoral e imunomodulador.
Em uma realização preferida da invenção, a composição farmacêutica contém um ou mais peptídeos e compostos químicos ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, bem como excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.
Em outra realização preferida, a composição farmacêutica contém adicionalmente um antígeno selecionado do grupo que consiste de um antígeno bacteriano, viral e de câncer.
Igualmente os peptídeos da invenção podem ser empregados combinados com os tratamentos convencionais contra o câncer, como por exemplo quimioterapia, cirurgia, radiação, etc.
Também é parte da presente invenção a utilização dos peptídeos e os compostos químicos para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou a prevenção de desordens imunológicas, nos quais se precise desenvolver uma efetiva resposta imune tipo Thl ; tratamento e/ou prevenção do câncer, bem como para desenvolver uma efetiva resposta imune ante infecções de origem bacteriana e viral.
Os peptídeos descritos foram definidos por sua capacidade de não se unir ao LPS, já que a seqüência original HYRIKPTFRRLKWKYKGKFW está previamente descrita como domínio consenso ótimo para a união ao LPS (Hoess et al., (1993) Crystal structure of an endotoxin-neutralizing protein from the horseshoe crab, Limulus anti- LPS fator, at 1.5A° resolution. The EMBO J. 12:3351-3356). Assim mesmo, os peptídeos descritos nesta invenção potenciam o efeito imunomodulador dado pela expressão de IFN-α, comparado ao peptídeo da proteína LALF que compreende os aminoácidos 31-52, o qual Vallespí em sua invenção (US 6,191 ,114) se refere como um peptídeo anti-viral e imunomodulador.
Igualmente, os peptídeos descritos nesta invenção podem ser administrados a pacientes que estão imunossuprimidos e precisam de uma ativação da capacidade de resposta do sistema imune ex; pacientes com a síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS), pacientes submetidos a cirurgias complexas.
Do mesmo modo, os dados experimentais in vivo demonstram a efetividade dos peptídeos análogos em tumores já implantados em ratos, provenientes de células murinas de melanoma BI6; células epiteliais de pulmão malignizadas derivadas de ratos C57BL/6 e células 3LL-D122 provenientes de câncer de pulmão de rato.
Em outra materialização a administração dos peptídeos pode ser usada para reduzir eventos de metástases.
Outros resultados da presente invenção indicam que os peptídeos descritos têm efeito antiproliferativo sobre linhas tumorais de diferentes origens histológicas, demonstrando um efeito citotóxico direto sobre as células cancerígenas.
Em princípio, os peptídeos descritos podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com as terapias atuais para o tratamento do câncer, como exemplo: cirurgia, radiação, quimioterapia.
Igualmente, os peptídeos descritos nesta invenção administrados profilaticamente implicam em uma rápida resposta imune inata contra o tumor, com um subseqüente desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa antígeno específica, enfatizando seu uso em vacinas profilácticas ou terapêuticas contra câncer.
Breve descrição das figuras: Figura 1: Efeito dos peptídeos sobre a capacidade de se unir ao lipopolissacarídeo bacteriano (LPS). Figura IA, estes experimentos se realizaram em triplicata, se mostram as curvas de inibição de um experimento. As porcentagens de inibição mostradas na figura 1B são a média de três experimentos independentes.
Figura 2: Efeito dos peptídeos sobre a capacidade de se unir ao composto aniônico heparina. Mostra-se a média de três experimentos independentes.
Figura 3: Efeito dos peptídeos sobre a produção de IFNa.y e IL-12 em células mononucleares humanas. Realizaram-se três experimentos com doadores diferentes. Mostram-se os resultados de um doador.
Figura 4: Efeito antitumoral dos peptídeos no modelo de tumor TC-1.
Figura 5: Efeito antitumoral do peptídeo L-2 no modelo melanoma.
Figura 6: Efeito antitumoral do peptídeo análogo L-2 em esquema de administração profilático no modelo de tumor TC-L.
Figura 7: Efeito antitumoral do peptídeo análogo L-2 em um esquema de dupla ameaça com as células tumorais TC-1.
Figura 8: Capacidade anti-metástase do peptídeo análogo L-2.
Figura 9: Efeito do peptídeo análogo L-2 sobre a proliferação de células TC-1 , H- 125 e L929.
EXPOSIÇÃO DETALHADA DE MODOS DE REALIZAÇÃO / EXEMPLOS
Exemplo 1. Síntese de peptídeos.
Os peptídeos da invenção são sintetizados usando um procedimento em fase sólida. O peptídeo cru é extraído com uma solução de ácido acético aos 30%, liofilizado e posteriormente purificado por RP-HPLC. A massa molecular dos peptídeos purificados é verificadas usando um espectrômetro de massa JEOL JMS- HX110HF com um FAB gun. A preparação resultante é não antigênica, não pirogênica e farmaceuticamente aceitável para sua administração em animais e humanos. As substituições foram realizadas pontualmente introduzindo o aminoácido alanina em cada uma das posições da seqüência original HYRIKPTFRRLKWKYKGKFW.
Exemplo 2: Seleção de peptídeos análogos que não apresentam capacidade de união ao lipopolissacarídeo (LPS).
Este ensaio consiste em um sistema de competência de tipo ELISA (Hardy E., et al. (1994) Enhaced ELISA sensitivity using TCA for efficient coating of biologically active LPS or Lipid A to the solid phase. J.
Immunol. Meth. Vol. 176: 111-116). Placas de poliestireno (Costar, USA) foram recobertas com LPS de E.coli 0111:B4 (1 pg/mL) com o emprego de ácido tricloroacético (TCA) a 0.2%. As placas foram incubadas toda a noite a 37°C e depois foram lavadas 10 vezes com tampão fosfato salino (PBS IX) com tween-20 a 0.1% (solução de lavagem). A união dos peptídeos análogos ao LPS fixado na superfície sólida foi avaliada por concorrência direta com o peptídeo LALF32.51 marcado com biotina (LALF32.5i-biotina) a uma concentração de 0.2 μΜ, para que se obtenha 90% da união máxima ao LPS. Para estimar as curvas de inibição, utilizaram-se diferentes concentrações dos peptídeos análogos desde 10 μΜ até 0.01 μΜ e como controle do experimento se realizou a curva do LALF32.5i. O LALF32.5Í-biotina, na presença dos peptídeos análogos, foi incubado durante 2 h a 37°C e depois as placas foram lavadas 5 vezes com solução de lavagem. O LALF32.5i-biotina unido ao LPS foi detectado por encubação durante 45 min a 37°C com estreptavidina conjugada a peroxidase (estreptavidina-peroxidase) em diluição 1:2000. As placas foram lavadas 5 vezes com solução de lavagem e se adicionou então a solução de substrato (tampão citrato-fosfato 0,05 M pH 5,5, 1 tablete de 3,3’,5,5’- tetrametilbenzidina, peróxido de hidrogênio a 0,025%). Foi incubado por 15 minutos adicionais e a reação foi detida por adição de ácido sulfurico 2 Μ. A absorvência a 450 nm foi quantificada utilizando um leitor de placas (Sensident Scan). Existe uma correlação entre os valores de densidade ótica e a capacidade de união ao LPS dos peptídeos análogos. Peptídeos análogos com maior capacidade de união ao LPS apresentam curvas de inibição com valores de D.Ou menor com respeito à curva de inibição do LALF32.51.
Peptídeos análogos com menor capacidade de união ao LPS apresentam curvas de inibição com valores de D.O maior com respeito à curva de inibição do LALF32_51. Os resultados deste exemplo plasmados na figura IA, demonstraram que os peptídeos denominados L-2, L-8, L-12 e L12 perdem a capacidade de união ao LPS, no entanto os peptídeos L-9 e L-19 evidenciam uma capacidade de união ao LPS similar ao LALF32-51. Por sua vez o análogo L-3 mostra uma maior capacidade de união ao LPS.
Na figura 1B se apresentam as porcentagens de inibição dos peptídeos análogos, a uma concentração fixa de 0.5 μΜ, quanto à capacidade de deslocar a união do LALF32-5rbiotina (0.2 μΜ) ao LPS fixado a superfície sólida.
% de inibição = {1- (( [D.O] ^tra - [D.O] min) / ( [D.O] max- [D.O]min))} χ100 [D.O] amostra Valor de densidade ótica na presença de uma concentração fixa dos peptídeos análogos;
[D.O] min: fundo de ELISA;
[D.O] max· Valor de densidade ótica na ausência dos peptídeos análogos.
Tabela 1. Seqüência dos peptídeos utilizados nos exemplos
| Peptídeo | seqüência de aminoácido |
| L-2 | 32HARIKPTFRRLKWKYKGKFW51 (SEQ. ID. No. 1) |
| L-3 | 32HYAIKPTFRRLKWKYKGKFW51 (SEQ. ID. No. 5) |
| L-8 | 32HYRIKPTARRLKWKYKGKFW5i (SEQ. ID. No. 2) |
| L-9 | 32HYRIKPTFARLKWKYKGKFW51 (SEQ. ID. No. 6) |
| L-12 | 32HYRIKPTFRRLAWKYKGKFW51 (SEQ. ID. No. 3) |
| L-19 | 32HYRIKPTFRRLKWKYKGKAW51 (SEQ. ID. No. 7) |
| L-20 | 32HYRIKPTFRRLKWKYKGKFA51 (SEQ. ID. No. 4) |
Como resultado destas análises realizamos mutações duplas, 15 tríplices e em quatro aminoácidos, partindo dos peptídeos que não unem LPS:
HYRIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 8)
HARIKPTARRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 9)
HARIKPTFRRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 10)
HARIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 11) HARIKPTARRLAWKYKGKFA (SEQ. ID. NO: 12)
Exemplo 3: Avaliação da união a heparina dos peptídeos análogos L-2, L-8, L-12 e L-20.
Este ensaio consiste num sistema de concorrência de tipo
ELISA, similar ao descrito anteriormente. O peptídeo LALF32.5i-biotina em PBS IX foi fixado a placas de poliestireno (Costar, USA) e foi incubado toda a noite a 4°C. Os peptídeos análogos L-2, L-8, L-12 e L-20 com uma molaridade de 2 μΜ se misturaram com 250 unidades de heparina (Heparina sódica, 5000 U/ML, Liorad) em PBS+0.1% de albumina bovina(BSA). Posteriormente, foram adicionados à placa de ELISA contendo 0.02 μΜ do peptídeo LALF32-5i-biotina unido a superfície sólida. Passado 1 h de encubação a temperatura ambiente, as placas foram lavadas 5 vezes com solução de lavagem, e o peptídeo LALF ’ -biotina fixado à superfície sólida foi detectado por encubação durante 45 min. a 37°C com estreptavidina conjugada a peroxidase (estreptavidina-peroxidase) em diluição 1:2000. em seguida, as placas foram lavadas 5 vezes com solução de lavagem e se adicionou então a solução de substrato. Incubou-se por 15 min. adicionais e se deteve a reação por adição de ácido sulfurico 2 Μ. A não união a heparina dos peptídeos análogos correlaciona com a diminuição da densidade ótica, já que estes não são capazes de deslocar a união do peptídeo LALF32.5i-biotina fixado à superfície sólida à heparina. Paralelamente foi incluído como controle no ensaio o LALF32.5i não marcado em um excesso molar de 100X. A união a heparina do peptídeo LALF32.5i não marcado se demonstra pelo aumento dos valores de densidade ótica, já que o excesso de peptídeo frio compete pela união à heparina. Como se pode observar na figura 2, os resultados indicam que os peptídeos L-2, L-8, L-12 e L-20 descritos nesta invenção não se unem à heparina.
Exemplo 4: Efeito dos peptídeos análogos L-2, L-8, L-12 e L20 sobre a expressão de IFN-a, IFN-γ e IL-12 em células mononucleares humanas.
Para este ensaio se realizou o isolamento de células mononucleares humanas por gradiente de Ficoll-Hypaque a partir de um concentrado leucocitário Buffy Coat de um doador. Um total de 5x106 células foi semeado em placas de 24 pontos em meio RPMI 1640+10% de soro fetal bovino. Depois se adicionou cada peptídeo a uma concentração de 40 pg/ML em um volume de 0.1 ML em meio RPMI e o cultivo celular se manteve durante 18 horas a 37°C e 5% de CO2. A extração de RNA total foi realizada pelo método de TriReagent. Posteriormente a expressão dos genes para IFN-a, IFN-γ e IL-12 foi determinada pela técnica de reação de transcrição reversa e amplificação por PCR (conjunto de RT-PCR Perkin Elmer). Os resultados são mostrados como níveis relativos de RNA mensageiro normalizados com o gene da β-actina. Os resultados obtidos neste ensaio demonstraram que os peptídeos L-2, L-8, L-12 e L-20 descritos nesta invenção são capazes de induzir a expressão dos genes para IFN-γ e IL-12, figura 3A. Os peptídeos análogos L-2, L-8 e L-12 são particularmente mais efetivos na indução do gene para IFN-α do que o peptídeo LALF32-52, figura 3B. Este exemplo demonstra que substituições de aminoácidos na seqüência original 32-51 da proteína LALF eliminam a capacidade de união ao LPS e potência o efeito imunomodulador.
Exemplo 5: Efeito antitumoral dos peptídeos análogos L-2, L8, L-12 e L-20 no modelo de tumor TC-1.
Nestes ensaios foram utilizaram ratos C57BL/6 de sexo feminino e entre 8 e 10 semanas de nascidos, (n=10 animais por grupo experimental). Para a implantação do tumor neste modelo, usaram-se as células TC-1 derivadas de células epiteliais de pulmão de C57BL/6 malignizadas, as quais foram ressuspensas em solução salina (PBS). Uma quantidade de 50 000 células em um volume de 200 μι foi inoculada aos ratos por via subcutânea na pata posterior direita. A Ia administração dos peptídeos foi realizada subcutânea no lado direito uma vez que os tumores atingiram 100 mm3 de volume, a 2a injeção foi realizada 10 dias depois. Neste ensaio se avaliou uma dose de 4 mg de peptídeo por Kg de peso (80 pg/rato). Os parâmetros avaliados para medir o efeito antitumoral dos peptídeos de interesse foi a sobrevida dos animais e a massa tumoral, como se pode observar nas figura 4A e figura 4B. Os peptídeos análogos L-2, L-8, L-12 e L20 foram efetivos quanto à capacidade de inibir a progressão do tumor e aumentar a sobrevida dos ratos, respectivamente. Estes resultados evidenciam a eficácia antitumoral dos peptídeos análogos em um modelo de tumor sólido. A análise estatística para determinar diferenças significativas entre os grupos foi realizada pelo método de Log Rank. Os resultados evidenciam que os peptídeos análogos L-2, L-8, L-12 e L-20 aumentam significativamente (p< 0.05) a sobrevida dos animais em comparação ao peptídeo LALF32-51. Estes resultados demonstram que substituições de aminoácidos na seqüência original 32-51 da proteína LALF podem aumentar significativamente a capacidade antitumoral.
Exemplo 6: Efeito antitumoral do peptídeo análogo L-2 no modelo de melanoma.
Nestes ensaios foram utilizados ratos C57BL/6 de sexo feminino e entre 8 e 10 semanas de nascidos, (n = 10 animais por grupo experimental). Para a implantação do tumor neste modelo, usaram-se as células MB16-F10 as quais foram ressuspensas em solução salina (PBS). Uma quantidade de 15 000 células em um volume de 200 pL foi inoculada aos ratos por via subcutânea na pata posterior direita. Passado 4 dias da inoculação das células tumorais foi administrado o peptídeo L-2, a segunda injeção foi realizada 7 dias depois da Ia injeção e 14 dias posteriores foi realizada a terceira injeção. Neste ensaio foi avaliada uma dose de 4 mg de peptídeo por Kg de peso. Os parâmetros avaliados para medir o efeito antitumoral do peptídeo de interesse foi o tempo de detenção do tumor e a sobrevida dos animais. Como se pode observar na figura 5A, o peptídeo análogo L-2 retardou significativamente a retenção do tumor (*p< 0.05, método de Log Rank). A análise de sobrevida realizado pelo método de Log Rank, demonstrou que o peptídeo L-2 aumentou significativamente (*p<
0.05) a sobrevida dos animais, sendo mais efetivo do que o peptídeo LALF3251 figura 5B. Estes resultados evidenciam a eficácia antitumoral do peptídeo L-2 não só para células epiteliais de pulmão como também para células tumorais de outras localizações e tipos histológicos como a de melanoma.
Exemplo 7: Efeito antitumoral do peptídeo análogo L-2 em esquema de tratamento profilático no modelo de tumor TC-1.
Nestes ensaios foram utilizaram ratos C57BL/6 de sexo feminino e entre 8 e 10 semanas de nascidos, (n=10 animais por grupo experimental). Para a implantação do tumor neste modelo, usaram-se as células TC-1, as quais foram ressuspensas em solução salina (PBS). Os ratos receberam uma primeira injeção do peptídeo L-2 (4 mg de peptídeo por Kg de peso), passado 7 dias receberam uma segunda injeção utilizando a mesma dose; passado 14 dias da primeira injeção de peptídeo, os animais forma inoculados com 50 000 células TC-1 em um volume de 200 pL de PBS por via subcutânea na pata posterior direita. Os parâmetros avaliados para medir o efeito antitumoral do peptídeo de interesse foi o tempo de retenção do tumor, figura 6A e a sobrevida dos animais, figura 6B. Os resultados obtidos neste ensaio demonstraram que o peptídeo L-2 desta invenção é efetivo quanto a prevenir o desenvolvimento do tumor e aumentar a sobrevida dos animais. Estes resultados evidenciam que o peptídeo desta invenção tem um efeito profilático, prevenindo a aparição do tumor.
Exemplo 8: Efeito antitumoral do peptídeo análogo L-2 em esquema de dupla ameaça.
Para este ensaio os animais que não tiveram retenção do tumor no esquema anterior (n=6 animais), foram atacados pela segunda vez com 50 000 células TC-1 em um volume de 200 pL de PBS por via subcutânea na pata posterior esquerda (dia 49 a partir do primeira ameaça). Como controle deste experimento foi inoculada a mesma quantidade de células tumorais em ratos “naive” do mesmo lote (para garantir homogeneidade dos ratos e idade) mantidos em iguais condições mas que nunca receberam o peptídeo, (n=10 animais). Os parâmetros avaliados para medir o efeito antitumoral do peptídeo L-2 foi o tempo de retenção do tumor e a sobrevida dos animais. Os resultados obtidos neste ensaio demonstram que o peptídeo L-2 é capaz de proteger aos ratos de uma segunda ameaça com as células tumorais, quanto ao retardo na aparição do tumor (figura 7A) e no aumento da sobrevida, figura 7B. Este resultado evidência que o peptídeo desta invenção é capaz de proporcionar uma manutenção de resposta antitumoral a um segundo golpe com as células tumorais, o que evidência o desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa antígeno específica.
Exemplo 9: Efeito antitumoral do peptídeo análogo L-2, no modelo de metástase de Carcinoma de Lewis.
Nestes ensaios foram utilizados ratos C57BL/6 de sexo feminino e entre 8 e 10 semanas de nascidos, (n=8 animais/grupo experimental). Nos animais foram inoculado no coxim plantar posterior direita 250 000 células 3LLD122 de câncer de pulmão de rato. Passado 7 dias foi injetado por via subcutânea uma dose de peptídeo L-2 de 4 mg por Kg de peso. Quando os tumores atingiram 8 mm de diâmetro se eliminou o tumor primário mediante cisão cirúrgica da pata portadora. Os ratos foram sacrificados 21 dias depois deste procedimento. Os pulmões foram pesados como parâmetro indicador da quantidade de metástases presentes nos mesmos. Os resultados mostrados na figura 8 indicam que o peptídeo análogo L-2 desta invenção é capaz de reduzir os eventos de metástases.
Exemplo 10: Efeito do peptídeo análogo L-2 sobre o crescimento de células tumorais.
Para este ensaio as células TC-1 , H-125 (células não pequenas de câncer de pulmão humano) e L929 (fibroblastos murino) foram semeadas em placas de 96 poços (Costar) a uma densidade de 2 x 104 células/ml em meio Dulbecco (DMEM) (Gibco) suplementado com Soro Fetal Bovino (Gibco). Ao cabo de 24 horas, os peptídeos foram adicionados ao meio de cultivo em uma gama de dose entre 9 μΜ e 300 μΜ. A incubação foi realizada por espaço de 72 horas na presença de CO a 5% e ao termino da mesma foi revelado com violeta cristal. As placas foram lavadas 5 extensamente com água corrente e finalmente se realizou a leitura da placa a uma absorvência de 562 nm. Os resultados são mostrados na figura 9. Para este ensaio foi empregado como controle positivo um peptídeo proapotótico com um demonstrado efeito antiproliferativo in vitro (Perea, S., et al. (2004) Antitumor Effect of a Novel Proapoptotic Peptide that Impairs the 10 Phosphorylation por the Protein Kinase 2 Câncer Research 64: 7127-7129).
Os resultados obtidos neste ensaio demonstraram que o peptídeo L-2 produz um efeito antiproliferação, de maneira dependente da dose, sobre as células TC-1 e H-125. No entanto nenhum efeito foi observado com o peptídeo desta invenção na linha celular L929 de fibroblastos murino. Este resultado 15 demonstra que o peptídeo desta invenção tem efeito citotóxico seletivo sobre células tumorais in vitro.
Claims (5)
- REIVINDICAÇÕES1. Peptídeos com capacidade antitumoral e imunomoduladora provenientes da região 32-51 da proteína LALF, que não unem LPS, nem heparina, caracterizado pelo fato de que compreendem as sequências de5 aminoácidos das SEQ. ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4.
- 2. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais peptídeos e compostos químicos como definidos na reivindicação 1, bem como excipientes ou veículos farmaceuticamente10 aceitáveis.
- 3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um imunogene.
- 4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o imunogene é selecionado do grupo que15 consiste de um imunogene de natureza peptídica, gangliosídica, protéica, partículas semelhantes a vírus ou vesículas protéicas de origem bacteriana.
- 5. Uso dos peptídeos e compostos químicos como definidos na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na manufatura de uma composição farmacêutica para o tratamento de câncer.
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