BRPI0708148A2 - peptìdeos com capacidade antitumoral e imunomoduladora provenientes da região 32-51 da proteìna lalf, compostos quìmicos miméticos aos peptìdeos, composição farmacêutica e uso dos peptìdeos e compostos quìmicos - Google Patents
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Abstract
PEPTìDEOS COM CAPACIDADE ANTITUMORAL E IMUNOMODULADORA PROVENIENTES DA REGIãO 32-51 DA PROTEINA LALF, COMPOSTOS QUìMICOS MIMETICOS AOS PEPTìDEOS, COMPOSIçãO FARMACêUTICA E USO DOS PEPTìDEOS E COMPOSTOS QUìMICOS Resumo: A presente invenção se refere ao desenvolvimento de peptídeos provenientes da sequência HYRiIKPTFRRLKWKKYKGKFW na qual se introduziram substituições de aminoácidos que garantem a dissociação da capacidade de união ao lipopolissacarídeo e potenciam o efeito antitumoral e imunomodulador. Estes peptídeos ou combinações deles são úteis para o tratamento do câncer, bem como em sinergismo com as terapias convencionais.
Description
"PEPTÍDEOS COM CAPACIDADE ANTITUMORAL EIMUNOMODULADORA PROVENIENTES DA REGIÃO 32-51 DAPROTEÍNA LALF5 COMPOSTOS QUÍMICOS MIMÉTICOS AOSPEPTÍDEOS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DOS PEPTÍDEOSE COMPOSTOS QUÍMICOS"
Campo da técnica
A presente invenção se refere ao campo da imunoterapia docâncer. Em particular com peptídeos ou combinações deles, provenientes daregião 32-51 da proteína Fator anti-LPS de Limulus, os quais não unemlipopolissacarídeos e apresentam propriedades anti-tumorais eimunomoduladoras úteis para o tratamento do câncer e metástase.
Estado da técnica anterior
Recentemente, foi publicada a utilização de modificadores daresposta biológica no tratamento para o câncer principalmente emcombinação com as terapias já existentes procurando aumentar o benefício dotratamento (US 2004/0101511). Por outro lado, a utilização de seqüênciasCpG as quais são agonista do Receptor tipo Toll 9 (em inglês Toll-Iikereceptor, abreviado TLR9) estão sendo desenvolvidos como novas drogaspara o tratamento, controle e prevenção de múltiplas indicações para câncerex: células não pequenas de câncer de pulmão, melanoma, carcinoma renal(Klinman D. M., et al., (2004) Immunotherapeutic uses of CpGoligodeoxynucleotides. Nat Rev Immunol. 4:249-258). A ativação do sistemaimune por um agonista do TLR7 se encontra em ensaio clínico fase I comresultados promissores como nova droga para o tratamento de melanoma eoutros tumores (Dudek A. Z., et al. (2005) ASCO Annual Meeting). Osanteriormente referidos agonistas dos TLR9 e TLR7 estão sendo avaliadostambém em infecções virais, dada sua capacidade de promover uma efetivaresposta imune no hospedeiro. Além disso, as denominadas Heat shockprotein (Hsp), as quais se unem ao TLR4, foram desenvolvidas ecomercializadas como um produto de fusão com a oncoproteína E7. Este novoenfoque imunoterapêutico também é conhecido como vacinas terapêuticas etem ampla perspectiva na terapia de doenças relacionadas com o vírus dopapiloma humano (Chu N. R. et al., (2000) Immunotherapy of a humanpapillomavirus (HPV) type 16 E7-expressing tumour por administration offusion protein comprising Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin(BCG) hsp65 and HPV16 E7. Clin Exp Immunol 121 :216-225). Osreceptores tipo Toll são receptores que se encontram em células do sistemaimune e reconhecem padrões moleculares sócios a patogênicos, exemplo:lipopolissacarídeos (em inglês Lipopolysaccharide, abreviado LPS), ácidolipotecóico, seqüências não metiladas CpG, RNA viral de cadeia dupla esimples. O reconhecimento do patogênico invasor pelos TLRs ajuda aosistema imune a dirigir um tipo de resposta compartilhada Thl/Th2 quepermite ao organismo erradicar eficientemente a infecção. A utilização deagonistas dos TLRs como drogas para o câncer, baseia-se na ativação dosistema imune inato e adaptativo. Seu principal mecanismo radica na ativaçãode uma resposta tipo Th 1, dada fundamentalmente por Interferons de tipo I(em inglês Interferon, abreviado IFNa.p) e interleucina-12 (IL-12). Istoconduz a uma resposta imune adaptativa altamente específica e mantida(Switaj T., Jalili A., et al., (2004) CpG Immunostimulatoryoligodeoxynucleotide 1826 enhances antitumor effect of interleukin 12 gene-modified tumor vaccine in a melanoma model in mice. Clinicai CâncerResearch, Vol. 10:4165-4175). Esta ativação dual do sistema imune sediferencia de muitas outras aproximações imuno-terapêuticas, as quais sãogeralmente incapazes de criar um efeito mantido sobre a resposta imuneadaptativa e por outro lado a ativação não específica do sistema imune inatoimplica em efeitos não desejados (Speiser D. E, et al. (2005) Rapad andstrong human CD8+T cell responses to vaccination with peptide, IFA, andCpG oligodeoxynucleotide 7909. The Journal of Clinicai Inv. Vol. 115 (3).As células dendríticas (em inglês Dendritic Cells, abreviadoDC), são células profissionais apresentadoras de antígenos, cujo principalpapel é vincular a resposta imune inata e adaptativa através da interação diretacélula-célula e a produção de citocinas. As DC podem ser de origem mielóideou linfóide atendendo à expressão de uma série de marcadores de superfície,bem como à expressão de diferentes TLRs. As DC de origem linfóideconhecidas como células dendríticas plasmacitóides são as principaisprodutoras de IFNs de tipo I. Em virtude destas características, as célulasdendríticas foram manipuladas como um promissor adjuvante celular para odesenvolvimento de vacinas terapêuticas contra o câncer e infecções viraiscrônicas (Santini S.M., et al. (2003) A new type IIFN- mediated pathway forrapid differentiattion of monocytes into highly ative dendritic cells. StemCells, 21:357-362). No entanto, esta é uma técnica altamente onerosa e difícilpor isso na atualidade se está trabalhando para encontrar estratégiasalternativas mais práticas e menos onerosas (Van Epps H.L. (2005) New hopefor tumor vaccines. The Journal of Experimental Medicine, Vol.202:1615).
Originalmente descritos por sua atividade antiviral, osInterferons de tipo I (IFNa-β), recentemente mostraram exercer importantesefeitos sobre o sistema imune, incluindo a promoção de respostas celular ehumoral mediada por seu efeito adjuvante sobre as células dendríticas(Bogdan, C. (2000) The function of type I interferons in antimicrobialimmunity. Curr, Opin Immunol 12:419-424). Trabalhos recentes mostramuma função crítica para os Interferones de tipo I produzidos endogenamente,nos processos de regressão de um sarcoma murino singênico altamenteimunogênico e em proteger ao hospedeiro da formação de tumores primárioscarcinogênicos (Gavin P. Dunn, et al. (2005) A criticai function for type Iinterferons in câncer immunoediting. Nature Immunology, June 12). Alémdisso, o Interferon alfa tem um papel importante na iniciação da resposta viraldos linfócitos T, via uma ativação direta dos linfócitos T CD4+ e CD8+ eminfecções virais como Influenza (Fonteneau J. F, et al. (2003) Activation ofinfluenza virus-specific CD+4 and CD+8 T cells: a new role for plasmacytoiddendritic cells in adaptive immunity. Immunobiology, 101 : 3520-3526).
Por sua vez, Hoess (WO 95/ 05393) relaciona sua invenção asubstâncias as quais se unem com grande afinidade ao LPS e são de utilidadepara a prevenção ou tratamento de por exemplo: sepsia mediadas porbactérias Gram-negativas e Gram-positivas e para o tratamento de infecçõesbacterianas em general e por fungos. A referidas substâncias são peptídeosque unem LPS contendo um domínio de união para a endotoxina (Hoess A.,et al., (1993) Crystal structure of an endotoxin-neutralizing protein from thehorseshoe crab, Limulus anti-LPS fator, at 1.5A0 resolution. The EMBO J.12:3351-3356). Esta revela um laço ou Ioop na estrutura da proteína Fatoranti-LPS de Limulus (em inglês Limulus anti-LPS fator, abreviado LALF) aqual tem rasgos similares à polimixina B, por estar carregado positivamente,ter caráter anfipático e conter resíduos hidrofóbicos e aromáticos expostos.Por este mesmo princípio, discute-se a capacidade da região compreendidaentre os aminoácidos 31-52 da proteína LALF de se unir e neutralizar osefeitos associados com a heparina, exemplo: anticoagulação, angiogêneses e ainibição da proliferação de células endoteliais e tumorais. No entanto nãoexiste nenhum dado experimental que suporte este argumento na mencionadapatente, de fato as reivindicações outorgadas foram as referentes para umaparato para remover LPS de uma solução, o referido aparato compreende ospeptídeos imobilizados em um suporte sólido (US 6.384.188).
Por outro lado, Vallespí (US 6.191.114) relaciona suainvenção ao peptídeo que compreende os aminoácidos 31-52 da proteínaLALF, o qual exerce um efeito antiviral sobre células tipo Hep-2 e MDBK emvirtude da indução de IFN-α e γ; bem como relaciona sua invenção àutilização do referido peptídeo para o tratamento de infecções virais edesordens relacionadas a imunossupressão. Além disso, o mesmo autordemonstrou o efeito anti-infecção deste peptídeo em modelos animais desepsia, (Vallespi M. G., et al.l (2003) A Limulus anti-LPS fator-derivedpeptide modulates cytokine gene expression and promotes resolution ofbacterial acute infection in mice. Intebrnational Immunopharmacology,3:247-256).
Existe um número de terapias dirigidas ao tratamento docâncer que incluem quimioterapia, radiações e terapia genética. Umadesvantagem destas terapias é a toxicidade associada à maioria dostratamentos. Além disso, grandes doses têm que ser administradas por umlongo período de tempo antes de se obter um benefício terapêutico. Portanto,ainda persiste a necessidade do desenvolvimento de novas drogas paraacometer tratamentos mais efetivos.
Sobre a base do papel crucial que tem o sistema imune emdetectar e dirigir uma resposta eficiente contra o tumor, o desenho de drogasque atuem sobre os mecanismos de defesa do hospedeiro tanto inato comoadaptativo pode se converter em poderosas ferramentas para a terapêutica docâncer.
Até o momento não se descreveu substituições de aminoácidosespecíficos na seqüência HYRIKPTFRRLKWKKYKGKFW da proteínaLALF, que permita eliminar a capacidade de união ao LPS e potenciar oefeito imunomodulador, além de lhe conferir efeito antitumoral in vivo contradiferentes tumores.
Explicação da invenção
A presente invenção resolve o problema mencionadoanteriormente, ao proporcionar peptídeos provenientes da seqüênciaHYRIKPTFRRLKWKKYKGKFW (SEQ. Id. No: 13) que corresponde àregião 32-51 da proteína LALF, na qual se introduziram substituições deaminoácidos que garantem eliminar a capacidade de união ao LPS epotenciam o efeito antitumoral e imunomodulador.Os peptídeos análogos derivados das referidas substituições asquais não unem LPS nem heparina e mostram um maior efeito antitumoral eimunomodulador do que o peptídeo parental apresentam as seguintesseqüências:
HARIKPTFRRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. No: 1)
HYRIKPTARRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. No: 2)
HYRIKPTFRRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. No: 3)
HYRIKPTFRRLKWKYKGKFA (SEQ. ID. No: 4)
A capacidade de união ao LPS dos peptídeos descritos porHoess e Vallespí tem como desvantagem que sua administração na presençade LPS desvia o padrão de citocinas de um perfil compartilhado Thl/Th2 paraum predominante Th2, o que seria contra-indicado em pacientes com câncer.Estes pacientes geralmente apresentam infecções concomitantes produto deseu estado imunodeprimido, por isso não se descarta a presença de partículasde LPS no sangue. A administração de um peptídeo que possa induzir um tipode resposta predominante Th2 na presença da endotoxina seria um efeito nãodesejado que deterioraria ainda mais o estado imunológico do paciente,piorando a resposta do hospedeiro contra o tumor. Além disso, a união aoLPS, por parte do peptídeo reportado por Vallespí, poderia minimizar o efeitoimunomodulador descrito para este peptídeo. Por outro lado, a não união aheparina dos peptídeos descritos nesta invenção tem vantagens sobre osdescritos anteriormente por Hoess e Vallespí. Em pacientes críticos como porexemplo: cardiopatia isquêmica, doença cerebrovascular, doençatromboembólica venosa (trombose venosa profunda e embolia pulmonar),isquemia de membros inferiores, a utilização de heparina está indicada comotratamento (D. Cabestrero Alonso, et al. (2001) Heparinas de bajo pesomolecular en pacientes críticos: usos, indicaciones y tipos. MedicinaIntensiva, Vol. 95:18-26), porque a administração de um peptídeo que tenha apropriedade de se unir à heparina poderia ser contra-indicada por bloquear oefeito da referida droga nesse contexto. A associação entre câncer e doençasrelacionadas a trombo-embolismos é um fenômeno bem conhecido e podecontribuir significativamente para a morbilidade e mortalidade do pacientecom câncer, como por exemplo, a trombose venosa profunda e embolismopulmonar. Pelas razões expostas anteriormente é vantajoso dispor depeptídeos que não se unam a heparina e tenham efeito antitumoral eimunomodulador no tratamento do paciente com câncer, o qual em umagrande porcentagem são submetidos a cirurgia e apresentam outrostranstornos como hipercoagulabilidade, (Castelli R., et al. (2004) The hepatiteand câncer: Review of clinicai trials and biological properties. VascularMedicine, Vol.9:l-9).
A invenção também inclui peptídeos, onde dois ou maisresíduos aminoácidos são substituídos por alanina e compreendem asseqüências de aminoácidos:
HYRIKPTARRLAWKYXGKFW (SEQ. ID. No: 8)
HARIKPTARRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. No: 9)
ARIKPTFRRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. No: 10)
HARIKPTARRTAWKYKGKFW (SEQ. ID. No: 11)
HARIKPTARRLAWKYKGKFA (SEQ. ID. No: 12)
e qualquer variante homóloga ou mimética dos peptídeos anteriores, quetenha sido obtida por via sintética ou recombinante, bem como qualquerpeptídeo de fusão que as contenha. Entende-se por variante homólogaqualquer peptídeo que não tenha capacidade de união ao LPS ou heparina emantenha um efeito antitumoral e imunomodulador. Igualmente se entendepor variante mimética qualquer molécula de origem química (não protéica)cuja estrutura não tenha capacidade de união ao LPS ou heparina e mantenhaum efeito antitumoral e imunomodulador.
Em uma realização preferida da invenção, a composiçãofarmacêutica contém um ou mais peptídeos e compostos químicos ou seussais farmaceuticamente aceitáveis, bem como excipientes ou veículosfarmaceuticamente aceitáveis.
Em outra realização preferida, a composição farmacêuticacontém adicionalmente um antígeno selecionado do grupo que consiste de umantígeno bacteriano, viral e de câncer.
Igualmente os peptídeos da invenção podem ser empregadoscombinados com os tratamentos convencionais contra o câncer, como porexemplo quimioterapia, cirurgia, radiação, etc.
Também é parte da presente invenção a utilização dospeptídeos e os compostos químicos para a preparação de uma composiçãofarmacêutica para o tratamento e/ou a prevenção de desordens imunológicas,nos quais se precise desenvolver uma efetiva resposta imune tipo Thl ;tratamento e/ou prevenção do câncer, bem como para desenvolver umaefetiva resposta imune ante infecções de origem bacteriana e viral.
Os peptídeos descritos foram definidos por sua capacidade denão se unir ao LPS, já que a seqüência originalHYRIKPTFRRLKWKYKGKFW está previamente descrita como domínioconsenso ótimo para a união ao LPS (Hoess et al., (1993) Crystal structure ofan endotoxin-neutralizing protein from the horseshoe crab, Limulus anti- LPSfator, at 1.5A0 resolution. The EMBO J. 12:3351-3356). Assim mesmo, ospeptídeos descritos nesta invenção potenciam o efeito imunomodulador dadopela expressão de IFN-α, comparado ao peptídeo da proteína LALF quecompreende os aminoácidos 31-52, o qual Vallespí em sua invenção (US6,191 ,114) se refere como um peptídeo anti-viral e imunomodulador.
Igualmente, os peptídeos descritos nesta invenção podem seradministrados a pacientes que estão imunossuprimidos e precisam de umaativação da capacidade de resposta do sistema imune ex; pacientes com asíndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS), pacientes submetidos acirurgias complexas.Do mesmo modo, os dados experimentais in vivo demonstrama efetividade dos peptídeos análogos em tumores já implantados em ratos,provenientes de células murinas de melanoma B16; células epiteliais depulmão malignizadas derivadas de ratos C57BL/6 e células 3LL-D122provenientes de câncer de pulmão de rato.
Em outra materialização a administração dos peptídeos podeser usada para reduzir eventos de metástases.
Outros resultados da presente invenção indicam que ospeptídeos descritos têm efeito antiproliferativo sobre linhas tumorais dediferentes origens histológicas, demonstrando um efeito citotóxico diretosobre as células cancerígenas.
Em princípio, os peptídeos descritos podem ser utilizadossozinhos ou em combinação com as terapias atuais para o tratamento docâncer, como exemplo: cirurgia, radiação, quimioterapia.
Igualmente, os peptídeos descritos nesta invençãoadministrados profilaticamente implicam em uma rápida resposta imune inatacontra o tumor, com um subseqüente desenvolvimento de uma resposta imuneadaptativa antígeno específica, enfatizando seu uso em vacinas profilácticasou terapêuticas contra câncer.
Breve descrição das figuras: Figura 1: Efeito dos peptídeossobre a capacidade de se unir ao lipopolissacarideo bacteriano (LPS). FiguraIA, estes experimentos se realizaram em triplicata, se mostram as curvas deinibição de um experimento. As porcentagens de inibição mostradas na figuraIB são a média de três experimentos independentes.
Figura 2: Efeito dos peptídeos sobre a capacidade de se unir aocomposto aniônico heparina. Mostra-se a média de três experimentosindependentes.
Figura 3: Efeito dos peptídeos sobre a produção de IFNa.y eIL-12 em células mononucleares humanas. Realizaram-se três experimentosFigura 8: Capacidade anti-metástase do peptídeo análogo L-2.Figura 9: Efeito do peptídeo análogo L-2 sobre a proliferaçãode células TC-I , H- 125 e L929.
EXPOSIÇÃO DETALHADA DE MODOS DE REALIZAÇÃO /EXEMPLOS
procedimento em fase sólida. O peptídeo cru é extraído com uma solução deácido acético aos 30%, liofilizado e posteriormente purificado por RP-HPLC.A massa molecular dos peptídeos purificados é verificadas usando umespectrômetro de massa JEOL JMS- HXl IOHF com um FAB gun. Apreparação resultante é não antigênica, não pirogênica e farmaceuticamenteaceitável para sua administração em animais e humanos. As substituiçõesforam realizadas pontualmente introduzindo o aminoácido alanina em cadauma das posições da seqüência original HYRIKPTFRRLKWKYKGKFW.
Exemplo 2: Seleção de peptídeos análogos que não apresentamcapacidade de união ao lipopolissacarídeo (LPS).
Este ensaio consiste em um sistema de competência de tipoELISA (Hardy E., et al. (1994) Enhaced ELISA sensitivity using TCA forefficient coating of biologically active LPS or Lipid A to the solid phase. J.
Exemplo 1. Síntese de peptídeos.
Os peptídeos da invenção são sintetizados usando umImmunol. Meth Vol. 176: 111-116). Placas de poliestireno (Costar, USA)foram recobertas com LPS de E.coli 0111 :B4 (1 μg/mL) com o emprego deácido tricloroacético (TCA) a 0.2%. As placas foram incubadas toda a noite a37°C e depois foram lavadas 10 vezes com tampão fosfato salino (PBS IX)com tween-20 a 0.1% (solução de lavagem). A união dos peptídeos análogosao LPS fixado na superfície sólida foi avaliada por concorrência direta com opeptídeo LALF32-Si marcado com biotina (LALF32-Srbiotina) a umaconcentração de 0.2 μΜ, para que se obtenha 90% da união máxima ao LPS.Para estimar as curvas de inibição, utilizaram-se diferentes concentrações dospeptídeos análogos desde 10 μΜ até 0.01 μΜ e como controle do experimentose realizou a curva do LALF32-51. O LALF32.5i-biotina, na presença dospeptídeos análogos, foi incubado durante 2 h a 37°C e depois as placas foramlavadas 5 vezes com solução de lavagem. O LALF32-Si-biotina unido ao LPSfoi detectado por encubação durante 45 min a 37°C com estreptavidinaconjugada a peroxidase (estreptavidina-peroxidase) em diluição 1:2000. Asplacas foram lavadas 5 vezes com solução de lavagem e se adicionou então asolução de substrato (tampão citrato-fosfato 0,05 M pH 5,5, 1 tablete de3,3',5,5'- tetrametilbenzidina, peróxido de hidrogênio a 0,025%). Foiincubado por 15 minutos adicionais e a reação foi detida por adição de ácidosulfurico 2 Μ. A absorvência a 450 nm foi quantificada utilizando um leitorde placas (Sensident Scan). Existe uma correlação entre os valores dedensidade ótica e a capacidade de união ao LPS dos peptídeos análogos.Peptídeos análogos com maior capacidade de união ao LPS apresentamcurvas de inibição com valores de D.Ou menor com respeito à curva deinibição do LALF32.5i.
Peptídeos análogos com menor capacidade de união ao LPSapresentam curvas de inibição com valores de D.O maior com respeito àcurva de inibição do LALF32_5i. Os resultados deste exemplo plasmados nafigura IA, demonstraram que os peptídeos denominados L-2, L-8, L-12 e L-20 perdem a capacidade de união ao LPS, no entanto os peptídeos L-9 e L-19evidenciam uma capacidade de união ao LPS similar ao LALF32-Si. Por suavez o análogo L-3 mostra uma maior capacidade de união ao LPS.
Na figura IB se apresentam as porcentagens de inibição dospeptídeos análogos, a uma concentração fixa de 0.5 μΜ, quanto à capacidadede deslocar a união do LALF32-Si-biotina (0.2 μΜ) ao LPS fixado a superfíciesólida.
% de inibição = {1- (( [D.O] amostra - [D.O] min) / ( [D.O] max- [D.O]min))} χ100
[D.O] amostra: Valor de densidade ótica na presença de umaconcentração fixa dos peptídeos análogos;
[D.O] min: fundo de ELISA;
[D.O] max: Valor de densidade ótica na ausência dos peptídeosanálogos.
Tabela 1. Seqüência dos peptídeos utilizados nos exemplos
<table>table see original document page 13</column></row><table>
Como resultado destas análises realizamos mutações duplas,tríplices e em quatro aminoácidos, partindo dos peptídeos que não unem LPS:
HYRIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 8)HAR1KPTARRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 9)HARIKPTFRRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 10)HARIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 11)HARIKPTARRLAWKYKGKFA (SEQ. ID. NO: 12)
Exemplo 3: Avaliação da união a heparina dos peptídeosanálogos L-2, L-8, L-12 e L-20.
Este ensaio consiste num sistema de concorrência de tipoELISA, similar ao descrito anteriormente. O peptídeo LALF32-S ι-biotina emPBS IX foi fixado a placas de poliestireno (Costar, USA) e foi incubado todaa noite a 4°C. Os peptídeos análogos L-2, L-8, L-12 e L-20 com umamolaridade de 2 μΜ se misturaram com 250 unidades de heparina (Heparinasódica, 5000 U/ML, Liorad) em PBS+0.1% de albumina bovina(BSA).Posteriormente, foram adicionados à placa de ELISA contendo 0.02 μΜ dopeptídeo LALF32-Srbiotina unido a superfície sólida. Passado 1 h deencubação a temperatura ambiente, as placas foram lavadas 5 vezes comsolução de lavagem, e o peptídeo LALF32"5 ^biotina fixado à superfície sólidafoi detectado por encubação durante 45 min. a 37°C com estreptavidinaconjugada a peroxidase (estreptavidina-peroxidase) em diluição 1:2000. emseguida, as placas foram lavadas 5 vezes com solução de lavagem e seadicionou então a solução de substrato. Incubou-se por 15 min. adicionais e sedeteve a reação por adição de ácido sulfurico 2 Μ. A não união a heparina dospeptídeos análogos correlaciona com a diminuição da densidade ótica, já queestes não são capazes de deslocar a união do peptídeo LALF32-Sí-biotinafixado à superfície sólida à heparina. Paralelamente foi incluído comocontrole no ensaio o LALF32.5i não marcado em um excesso molar de 100X.A união a heparina do peptídeo LALF32.5i não marcado se demonstra peloaumento dos valores de densidade ótica, já que o excesso de peptídeo friocompete pela união à heparina. Como se pode observar na figura 2, osresultados indicam que os peptídeos L-2, L-8, L-12 e L-20 descritos nestainvenção não se unem à heparina.
Exemplo 4: Efeito dos peptídeos análogos L-2, L-8, L-12 e L-20 sobre a expressão de IFN-a, IFN-γ e IL-12 em células mononucleareshumanas.
Para este ensaio se realizou o isolamento de célulasmononucleares humanas por gradiente de Ficoll-Hypaque a partir de umconcentrado leucocitário "Buffy Coat" de um doador. Um total de 5x106células foi semeado em placas de 24 pontos em meio RPMI 1640+10% desoro fetal bovino. Depois se adicionou cada peptídeo a uma concentração de40 μg/ML em um volume de 0.1 ML em meio RPMI e o cultivo celular semanteve durante 18 horas a 37°C e 5% de CO2. A extração de RNA total foirealizada pelo método de TriReagent. Posteriormente a expressão dos genespara IFN-a, IFN-γ e IL-12 foi determinada pela técnica de reação detranscrição reversa e amplificação por PCR (conjunto de RT-PCR PerkinElmer). Os resultados são mostrados como níveis relativos de RNAmensageiro normalizados com o gene da β-actina. Os resultados obtidos nesteensaio demonstraram que os peptídeos L-2, L-8, L-12 e L-20 descritos nestainvenção são capazes de induzir a expressão dos genes para IFN-γ e IL-12,figura 3A. Os peptídeos análogos L-2, L-8 e L-12 são particularmente maisefetivos na indução do gene para IFN-α do que o peptídeo LALF32-52, figura3B. Este exemplo demonstra que substituições de aminoácidos na seqüênciaoriginal 32-51 da proteína LALF eliminam a capacidade de união ao LPS epotência o efeito imunomodulador.
Exemplo 5: Efeito antitumoral dos peptídeos análogos L-2, L-8, L-12 e L-20 no modelo de tumor TC-1.
Nestes ensaios foram utilizaram ratos C57BL/6 de sexofeminino e entre 8 e 10 semanas de nascidos, (n=10 animais por grupoexperimental). Para a implantação do tumor neste modelo, usaram-se ascélulas TC-I derivadas de células epiteliais de pulmão de C57BL/6malignizadas, as quais foram ressuspensas em solução salina (PBS). Umaquantidade de 50 000 células em um volume de 200 μί foi inoculada aosratos por via subcutânea na pata posterior direita. A Ia administração dospeptídeos foi realizada subcutânea no lado direito uma vez que os tumoresatingiram 100 mm3 de volume, a 2a injeção foi realizada 10 dias depois. Nesteensaio se avaliou uma dose de 4 mg de peptídeo por Kg de peso (80 μg/rato).Os parâmetros avaliados para medir o efeito antitumoral dos peptídeos deinteresse foi a sobrevida dos animais e a massa tumoral, como se podeobservar nas figura 4A e figura 4B. Os peptídeos análogos L-2, L-8, L-12 e L-20 foram efetivos quanto à capacidade de inibir a progressão do tumor eaumentar a sobrevida dos ratos, respectivamente. Estes resultados evidenciama eficácia antitumoral dos peptídeos análogos em um modelo de tumor sólido.A análise estatística para determinar diferenças significativas entre os gruposfoi realizada pelo método de Log Rank. Os resultados evidenciam que ospeptídeos análogos L-2, L-8, L-12 e L-20 aumentam significativamente (p<0,05) a sobrevida dos animais em comparação ao peptídeo LALF32-51. Estesresultados demonstram que substituições de aminoácidos na seqüênciaoriginal 32-51 da proteína LALF podem aumentar significativamente acapacidade antitumoral.
Exemplo 6: Efeito antitumoral do peptídeo análogo L-2 nomodelo de melanoma.
Nestes ensaios foram utilizados ratos C57BL/6 de sexofeminino e entre 8 e 10 semanas de nascidos, (n = 10 animais por grupoexperimental). Para a implantação do tumor neste modelo, usaram-se ascélulas MB16-F10 as quais foram ressuspensas em solução salina (PBS).Uma quantidade de 15 000 células em um volume de 200 uL foi inoculadaaos ratos por via subcutânea na pata posterior direita. Passado 4 dias dainoculação das células tumorais foi administrado o peptídeo L-2, a segundainjeção foi realizada 7 dias depois da Ia injeção e 14 dias posteriores foirealizada a terceira injeção. Neste ensaio foi avaliada uma dose de 4 mg depeptídeo por Kg de peso. Os parâmetros avaliados para medir o efeitoantitumoral do peptídeo de interesse foi o tempo de detenção do tumor e asobrevida dos animais. Como se pode observar na figura 5A, o peptídeoanálogo L-2 retardou significativamente a retenção do tumor (*p< 0.05,método de Log Rank). A análise de sobrevida realizado pelo método de LogRank, demonstrou que o peptídeo L-2 aumentou significativamente (*p<0.05) a sobrevida dos animais, sendo mais efetivo do que o peptídeo LALF32.51 figura 5B. Estes resultados evidenciam a eficácia antitumoral do peptídeoL-2 não só para células epiteliais de pulmão como também para célulastumorais de outras localizações e tipos histológicos como a de melanoma.
Exemplo 7: Efeito antitumoral do peptídeo análogo L-2 emesquema de tratamento profilático no modelo de tumor TC-1.
Nestes ensaios foram utilizaram ratos C57BL/6 de sexofeminino e entre 8 e 10 semanas de nascidos, (n=10 animais por grupoexperimental). Para a implantação do tumor neste modelo, usaram-se ascélulas TC-1, as quais foram ressuspensas em solução salina (PBS). Os ratosreceberam uma primeira injeção do peptídeo L-2 (4 mg de peptídeo por Kg depeso), passado 7 dias receberam uma segunda injeção utilizando a mesmadose; passado 14 dias da primeira injeção de peptídeo, os animais formainoculados com 50 000 células TC-I em um volume de 200 \xL de PBS porvia subcutânea na pata posterior direita. Os parâmetros avaliados para medir oefeito antitumoral do peptídeo de interesse foi o tempo de retenção do tumor,figura 6A e a sobrevida dos animais, figura 6B. Os resultados obtidos nesteensaio demonstraram que o peptídeo L-2 desta invenção é efetivo quanto aprevenir o desenvolvimento do tumor e aumentar a sobrevida dos animais.Estes resultados evidenciam que o peptídeo desta invenção tem um efeitoprofilático, prevenindo a aparição do tumor.
Exemplo 8: Efeito antitumoral do peptídeo análogo L-2 emesquema de dupla ameaça.
Para este ensaio os animais que não tiveram retenção do tumorno esquema anterior (n=6 animais), foram atacados pela segunda vez com 50000 células TC-I em um volume de 200 μί de PBS por via subcutânea napata posterior esquerda (dia 49 a partir do primeira ameaça). Como controledeste experimento foi inoculada a mesma quantidade de células tumorais emratos "naive" do mesmo lote (para garantir homogeneidade dos ratos e idade)mantidos em iguais condições mas que nunca receberam o peptídeo, (n=10animais). Os parâmetros avaliados para medir o efeito antitumoral dopeptídeo L-2 foi o tempo de retenção do tumor e a sobrevida dos animais. Osresultados obtidos neste ensaio demonstram que o peptídeo L-2 é capaz deproteger aos ratos de uma segunda ameaça com as células tumorais, quanto aoretardo na aparição do tumor (figura 7 A) e no aumento da sobrevida, figura7B. Este resultado evidência que o peptídeo desta invenção é capaz deproporcionar uma manutenção de resposta antitumoral a um segundo golpecom as células tumorais, o que evidência o desenvolvimento de uma respostaimune adaptativa antígeno específica.
Exemplo 9: Efeito antitumoral do peptídeo análogo L-2, no
modelo de metástase de Carcinoma de Lewis.
Nestes ensaios foram utilizados ratos C57BL/6 de sexofeminino e entre 8 e 10 semanas de nascidos, (n=8 animais/grupoexperimental). Nos animais foram inoculado no coxim plantar posteriordireita 250 000 células 3LLD122 de câncer de pulmão de rato. Passado 7 diasfoi injetado por via subcutânea uma dose de peptídeo L-2 de 4 mg por Kg depeso. Quando os tumores atingiram 8 mm de diâmetro se eliminou o tumorprimário mediante cisão cirúrgica da pata portadora. Os ratos foramsacrificados 21 dias depois deste procedimento. Os pulmões foram pesadoscomo parâmetro indicador da quantidade de metástases presentes nosmesmos. Os resultados mostrados na figura 8 indicam que o peptídeo análogoL-2 desta invenção é capaz de reduzir os eventos de metástases.
Exemplo 10: Efeito do peptídeo análogo L-2 sobre ocrescimento de células tumorais.
Para este ensaio as células TC-I , H-125 (células não pequenasde câncer de pulmão humano) e L929 (fibroblastos murino) foram semeadasem placas de 96 poços (Costar) a uma densidade de 2 χ IO4 células/ml emmeio Dulbecco (DMEM) (Gibco) suplementado com Soro Fetal Bovino(Gibco). Ao cabo de 24 horas, os peptídeos foram adicionados ao meio decultivo em uma gama de dose entre 9 μΜ e 300 μΜ. A incubação foirealizada por espaço de 72 horas na presença de CO2 a 5% e ao termino damesma foi revelado com violeta cristal. As placas foram lavadasextensamente com água corrente e finalmente se realizou a leitura da placa auma absorvência de 562 nm. Os resultados são mostrados na figura 9. Paraeste ensaio foi empregado como controle positivo um peptídeo proapotóticocom um demonstrado efeito antiproliferativo in vitro (Perea, S., et al. (2004)Antitumor Effect of a Novel Proapoptotic Peptide that Impairs thePhosphorylation por the Protein Kinase 2 Câncer Research 64: 7127-7129).Os resultados obtidos neste ensaio demonstraram que o peptídeo L-2 produzum efeito antiproliferação, de maneira dependente da dose, sobre as célulasTC-I e H-125. No entanto nenhum efeito foi observado com o peptídeo destainvenção na linha celular L929 de fibroblastos murino. Este resultadodemonstra que o peptídeo desta invenção tem efeito citotóxico seletivo sobrecélulas tumorais in vitro.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> Centro de Ingenieria Genética y Biotecnologia
<120> "PEPTÍDEOS ANTI-TUMOTAIS EIMUNOMODULADORES".
<130> Anti-tumoral
<14 0><141>
<150> CU 2006-0047<151> 24-02-2006
<160> 13
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1<211> 20<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<221> PEPTIDE<222> (1)..(20)
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo
de a.a. 32 a 51 da proteína LALF, modificado porsubstituição do a.a. 33 por Alanina
<4 00> 1
His Ala Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys1 5 10 15
Gly Lys Phe Trp20<210> 2<211> 20<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<221> PEPTIDE<222> (1)..(20)
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo
de a.a. 32 a 51 da proteína LALF, modificado porsubstituição do a.a. 39 por Alanina
<400> 2
His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Ala Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys1 5 10 15
Gly Lys Phe Trp20<210> 3<211> 20<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<221> PEPTIDE<222> (1)..(20)
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideode a.a. 32 a 51 da proteína LALF, modificado porsubstituição do a.a. 43 por Alanina
<400> 3
His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Ala Trp Lys Tyr Lys1 5 10 15
Gly Lys Phe Trp20
<210> 4<211> 20<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<221> PEPTIDE<222> (1)..(20)
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideode a.a. 32 a 51 da proteína LALF, modificado porsubstituição do a.a. 51 por Alanina
51
<400> 4
His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys15 10 15
Gly Lys Phe Ala20
<210> 5<211> 20<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<221> PEPTIDE<222> (1)..(20)
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo
de a.a. 32 a 51 da proteína LALF, modificado porsubstituição do a.a. 34 por Alanina
<400> 5
His Tyr Ala Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys15 10 15
Gly Lys Phe Trp20<210> 6<211> 20<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<221> PEPTIDE<222> (1)..(20)
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo
de a. a. 32 a 51 da proteína LALF, modificado porsubstituição do a.a. 4 0 por Alanina
<400> 6
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<210> 7<211> 20<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<221> PEPTIDE<222> (1)..(20)
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo
de a.a. 32 a 51 da proteína LALF, modificado porsubstituição do a.a. 50 por Alanina
<400> 7
His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys1 5 10 15
Gly Lys Ala Trp20
<210> 8<211> 20<212> PRT
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<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo
de a.a 32 a 51 da proteína LALF, modificado porsubstituição do a.a. 39 e 43 por Alanina
<400> 8
His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Ala Arg Arg Leu Ala Trp Lys Tyr Lys1 5 10 15
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<210> 9<211> 20<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<221> PEPTIDE<222> (1) .. (20)
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideode a.a 32 a 51 da proteína LALF, modificado porsubstituição do a.a. 33 e 39 por Alanina
<400> 9
His Ala Arg Ile Lys Pro Thr Ala Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys15 10 15
Gly Lys Phe Trp20
<210> 10<211> 20<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<221> PEPTIDE<222> (1) .. (20)
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo
de a.a. 32 a 51 da proteína LALF, modificado porsubstituição do a.a. 33 e 43 por Alanina
<400> 10
His Ala Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Ala Trp Lys Tyr Lys15 10 15
Gly Lys Phe Trp20
<210> 11<211> 20.<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<221> PEPTIDE<222> (1)..(20)
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo
de a.a. 32 a 51 da proteína LALF, modificado porsubstituição do a.a. 33, 39 e 43 por Alanina
<400> 11
His Ala Arg Ile Lys Pro Thr Ala Arg Arg Leu Ala Trp Lys Tyr Lys15 10 15
Gly Lys Phe Trp20
<210> 12<211> 20<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<221> PEPTIDE<222> (1)..(20)
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideode a.a. 32 a 51 da proteína LALF, modificado porsubstituição do a.a. 33, 39, 43 e 51 por Alanina
<400> 12
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Gly Lys Phe Ala20
<210> 13<211> 21<212> PRT
<213> Limulus polyphemus<220>
<221> PEPTIDE<222> (1)..(21)
<223> Peptideo. de a.a. 32 a 52 da proteína LALF<400> 13
His Tyr Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Lys Tyr1 5 10 15
Lys Gly Lys' Phe Trp20
Claims (8)
1. Peptídeos com capacidade antitumoral e imunomoduladoraprovenientes da região 32-51 da proteína LALF, que não unem LPS, nemheparina, caracterizado pelo fato de que compreendem as seqüências deaminoácidos: SEQ. Id. No. 1 a 4 e da 8 a 12 e variantes homólogas dosmesmos.
2. Compostos químicos miméticos aos peptídeos de acordocom a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que têm efeito antitumoral enão se unam ao LPS, nem à heparina.
3. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de quecompreende um ou mais peptídeos e compostos químicos de acordo com asreivindicações 1 e 2, bem como excipientes ou veículos farmaceuticamenteaceitáveis.
4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um imunogene.
5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que o imunogene é selecionado do grupo queconsiste de um imunogene de natureza peptídica, gangliosídica, protéica,partículas semelhantes a vírus ou vesículas protéicas de origem bacteriana.
6. Uso dos peptídeos e compostos químicos de acordo com asreivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que na manufatura de umacomposição farmacêutica para o tratamento e/ou a prevenção de desordensimunológicas e câncer.
7. Uso de acordo a reivindicação 6, caracterizado pelo fato deque se emprega uma quantidade efetiva para estimular uma resposta imuneinata em humano.
8. Uso de acordo a reivindicação 6, caracterizado pelo fato deque se emprega para a inibição de metástase.
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| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 15/01/2019, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. |
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| B21F | Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time |
Free format text: REFERENTE A 14A ANUIDADE. |
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| B24J | Lapse because of non-payment of annual fees (definitively: art 78 iv lpi, resolution 113/2013 art. 12) |
Free format text: EM VIRTUDE DA EXTINCAO PUBLICADA NA RPI 2619 DE 16-03-2021 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDA A EXTINCAO DA PATENTE E SEUS CERTIFICADOS, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013. |