BRPI0708206A2 - promotor, cassete de expressão, vetor, célula vegetal, planta transgênica, semente de planta, métodos para controlar uma infestação de nematóide parasìtico em plantas, e para conferir ou melhorar a reistência ao nematóide em um planta, e, uso de um promotor ou de um cassete de expressão ou de um vetor - Google Patents

Abstract

PROMOTOR, CASSETE DE EXPRESSãO, VETOR, CéLULA VEGETAL, PLANTA TRANSGêNICA, SEMENTE DE PLANTA, MéTODOS PARA CONTROLAR UMA INFESTAçãO DE NEMATóJDE PARASìTICO EM PLANTAS, E PARA CONFERIR OU MELHORAR A RESISTENCIA AO NEMATOIDE EM UM PLANTA, E, USO DE UM PROMOTOR OU DE UM CASSETE DE EXPRESSãO OU DE UM VETOR. A invenção fornece promotores de gene vegetal e elementos promotores essenciais, que são específicos de raiz e/ou induzidos pelos nematóides parasíticos. Os promotores da invenção são úteis para controlar a expressão de ácidos nucleicos de interesse em raízes de planta.

Description

"PROMOTOR, CASSETE DE EXPRESSÃO, VETOR, CÉLULA VEGETAL,PLANTA TRANSGÊNICA, SEMENTE DE PLANTA, MÉTODOS PARACONTROLAR UMA INFESTAÇÃO DE NEMATÓIDE PARASÍTICO EMPLANTAS, E PARA CONFERIR OU MELHORAR A RESISTÊNCIA AONEMATÓIDE EM UM PLANTA, E, USO DE UM PROMOTOR OU DE UMCASSETE DE EXPRESSÃO OU DE UM VETOR"

Esta invenção diz respeito a seqüências promotoras queregulam a transcrição de genes similares à Nodulina21 de Medicagotruncatula (MtN21). Os promotores de genes equivalentes à MtN21 dainvenção são úteis para controlar a transcrição de qualquer ácido nucleico deinteresse em raízes de planta. Em particular, os promotores da invençãopodem ser usados para controlar a transcrição de ácidos nucleicos que inibema reprodução de nematóides parasíticos de planta.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os nematóides parasíticos de planta são animais vermiformesmicroscópicos que se alimentam das raízes, folhas e hastes de mais do que2.000 cultivos, vegetais, frutas e plantas ornamentais, causando uma perda decultivo no mundo todo estimada em 100 bilhões de dólares. Um tipo comumde nematóide é o nematóide do nó de raiz (RKN), cuja alimentação causa asvesículas características nas raízes. Outros nematóides que se alimentam deraízes são os tipos cisto e lesão, que são mais específicos de hospedeiro.

Os nematóides estão presentes por todo os Estados Unidos, massão principalmente um problema em áreas quentes, úmidas do Sul e Oeste e emsolos arenosos. O nematóide do cisto da soja (SCN), Heterodera glycines, foiprimeiro descoberto nos Estados Unidos na Carolina do Norte em 1954. E apraga mais séria das plantas da soja. Algumas áreas são tão pesadamenteinfestadas pelo SCN que a produção de soja não é mais economicamentepossível sem medidas de controle. Embora a soja seja a principal cultivoeconômico atacado pelo SCN, o SCN infesta cerca de cinqüenta hospedeiros nototal, incluindo cultivos de campo, vegetais, ornamentais e ervas daninhas.

Os sinais do dano pelo nematóide incluem retardo dodesenvolvimento e amarelamento de folhas e murchação das plantas duranteos períodos quentes. Entretanto, os nematóides, incluindo o SCN, podemcausar perda de rendimento significante sem sintomas óbvios acima do solo.Além disso, as raízes infectadas com SCN são impedidas ou retardadas nocrescimento. A infestação por nematóide pode diminuir o número de nódulosque fixam nitrogênio nas raízes e pode tornar as raízes mais suscetíveis aosataques por outros patógenos vegetais transportados pelo solo.

O ciclo de vida do nematóide tem três estágios principais: ovo,jovem e adulto. O ciclo de vida varia entre as espécies de nematóides. Porexemplo, o ciclo de vida do SCN pode ser completado em 24 a 30 dias sobcondições ótimas, ao passo que outras espécies pode levar tanto tempo quantoum ano ou mais para completar o ciclo de vida. Quando a temperatura e osníveis de umidade se tornam adequados na primavera, jovens vermiformeschocam de ovos no solo. Estes jovens estão no único estágio de vida donematóide que pode infectar raízes da soja.

O ciclo de vida do SCN tem sido o objeto de muitos estudos eportanto podem ser usados como um exemplo para entender o ciclo de vidado nematóide. Depois de penetrar nas raízes da soja, os jovens SCN movem-se através da raiz até que contatem o tecido vascular, onde eles param ecomeçam a se alimentar. O nematóide injetam secreções que modificamcertas células da raiz e as transformam em sítios de alimentaçãoespecializados. As células da raiz são morfologicamente transformadas emsincícios multinucleados grandes (ou células gigantes no caso de RKN), quesão usados como uma fonte de nutrientes para os nematóides. Os nematóidesse alimentando ativamente roubam assim nutrientes essenciais da plantaresultando em perda de rendimento. Conforme os nematóides se alimentam,eles intumescem e eventualmente os nematóides fêmeas se tornam tãograndes que eles rompem o tecido da raiz e são expostos na superfície da raiz.

Depois de um período de alimentação, os nematóides SCNmachos, que não são intumescidos quando adultos, migram para fora da raizno solo e fertilizam as fêmeas adultas no formato de limão. Os machos entãomorrem, enquanto que as fêmeas permanecem ligadas ao sistema radicular econtinuam a se alimentar. Os ovos nas fêmeas intumescidas começam a sedesenvolver, inicialmente em uma massa ou saco de ovo fora do corpo, depoismais tarde dentro da cavidade corporal. Eventualmente a cavidade corporalinteira da fêmea adulta é enchida com ovos e o nematóide fêmea morre. E ocorpo cheio de ovos da fêmea morta que é aludido como o cisto. Os cistoseventualmente desalojam-se e são encontrados livres no solo. As paredes docisto tornam-se muito resistentes, fornecendo excelente proteção para osaproximadamente 200 a 400 ovos contidos dentro. Os ovos de SCNsobrevivem dentro do cisto até que condições de choco apropriadas ocorram.Embora muitos dos ovos possam chocar dentro do primeiro ano, muitostambém sobreviverão dentro dos cistos por vários anos.

Um nematóide pode mover-se através do solo apenas umaspoucas polegadas por ano por si só. Entretanto, a infestação pelo nematóidepode ser espalhada por distâncias substanciais em uma variedade de modos.Qualquer coisa que possa se mover no solo infestado é capaz de espalhar ainfestação, incluindo o maquinário da fazenda, veículos e ferramentas, vento,água, animais e os funcionários da fazenda. Partículas do tamanho desementes de solo freqüentemente contaminam a semente colhida.Conseqüentemente, a infestação de nematóide pode ser disseminada quandosemente contaminada de campos infestados é plantada em campos nãoinfestados. Existe ainda evidência de que certas espécies de nematóide podeser espalhadas pelos pássaros. Infelizmente, apenas algumas destas causaspode ser impedida.

Práticas tradicionais para controlar a infestação pelo nematóideincluem: manter os níveis de nutriente no solo e do pH do solo apropriados naregião infestada por nematóide; controlar outras doenças vegetais, assimcomo pragas de inseto e ervas daninhas; usar práticas de sanitização tais comoaragem, plantação e cultivo de campos infestados com SCN apenas depois detrabalhar nos campos não infestados; limpar o equipamento cuidadosamentecom água ou vapor em alta pressão depois de trabalhar nos camposinfestados; não usar sementes crescidas em áreas infestadas para plantar emcampos não infestados a menos que as sementes tenham sido apropriadamentelimpas; rotacionar os campos infestados e alternar cultivos hospedeiros comcultivos não hospedeiras; usando nematicidas; e plantar variedades de plantaresistentes.

Métodos foram propostos para a transformação genética deplantas de modo a conferir resistência aumentada aos nematóides parasíticosde planta. As Patentes U.S. 5.589.622 e 5.824.876 são direcionadas para aidentificação de genes vegetais especificamente expressados no ou adjacenteao sítio de alimentação da planta depois da ligação pelo nematóide. AsPatentes U.S. 5.589.622 e 5.824.876 divulgam oito promotores isolados deraízes de batata infectadas com Globodera rostochiensis: nenhum promotorindutível por nematóide de outras espécies vegetais são divulgados. Pretende-se que estes promotores sejam úteis para direcionar a expressão específica deproteínas ou enzimas tóxicas, ou a expressão de RNA de anti-sentido a umgene alvo ou aos genes celulares gerais.

A Patente U.S. 5.023.179 divulga um elemento realçador depromotor designado ASF-1, isolado do promotor CaMV, que pretende-se sejacapaz de realçar a expressão de gene vegetal em raízes.

A Patente U.S. 5.750.386 divulga um fragmento de deleção dopromotor específico de raiz RB7 de Nicotiana tabacum, que pretende-se sejaresponsivo a nematóide.

A Patente U.S. 5.837.876 divulga um promotor de geneespecífico de córtex de raiz isolados do tabaco e designado TobRD2.

A Patente U.S. 5.866.777 divulga um método de dois genespara retardar a formação de uma estrutura de alimentação de nematóide. Oprimeiro gene, barnase, está sob o controle de um promotor que direciona aexpressão pelo menos na estrutura de alimentação. O segundo gene, barstar,está sob o controle de um promotor que direciona a expressão em todas ascélulas da planta exceto da estrutura de alimentação. Os promotoresespecíficos do sítio de alimentação divulgados na Pat. U.S. N- 5.866.777incluem versões truncadas dos promotores Δ0.3TobRB7 e rolC.

A Patente U.S. 5.955.646 divulga regiões regulatóriasquiméricas com base nos promotores derivados dos genes da manopinasintase e octopina sintase de Agrobacterium tumefaciens, que pretende-sesejam indutíveis por nematóide.

A Patente U.S. 6.005.092 divulga o promotor da endo-1,4-13-glicanase (Ntcel7) da TV! tabacum.

As Patentes U.S. 6.262.344 e 6.395.963 divulgam promotoresisolados de Arabidopsis thaliana, que pretende-se sejam indutíveis pornematóide.

A Patente U.S. 6.448.471 divulga um promotor de A. thaliana,que é específico para sítios de alimentação de nematóide.

A Patente U.S. 6.593.513 divulga a transformação de plantascom barnase sob o controle do promotor do gene da endo-1,4-13-glicanase deA. thaliana (célula) para produzir plantas capazes de interromper o ataque denematóide.

A Patente U.S. 6.906.241 divulga o uso do promotor deNtce 17 em combinação com um ácido nucleico heterólogo que codifica umaproteína nematicida ou inseticida.

A Patente U.S. 7.078.589 divulga a clonagem e isolação dogene e promotor Pyk20 da soja, que pretende-se sejam induzidos pelainfecção por SCN e mostra atividade forte em tecidos vasculares.

A Publicação do Pedido de Patente U.S. 2003/0167507divulga o promotor da isoflavona sintase I da soja, que pretende-se sejaesoecífico de raiz e indutível em tecido vegetativo pelo ataque de parasita.

A Publicação do Pedido de Patente U.S. 2004/0078841divulga regiões promotoras dos promotores TUB-1, RPL16A e ARSKl deArabidopsis thaliana e do promotor PSMTa de Pisum sativum, todos os quaispretende-se sejam específicos de raiz.

A Publicação do Pedido de Patente U.S. 2004/0248304divulga a clonagem e isolação do gene e promotor Pyk20 da soja, quepretende-se sejam induzido pela infecção por SCN e mostra a atividade forteem tecidos vasculares.

A Publicação do Pedido de Patente U.S. 2004/0029167divulga uma seqüência de promotor de um gene da O-metiltransferase doácido cafeico de classe II do tabaco, que pretende-se seja indutível emresposta à lesão mecânica ou química ou à agressão por um agentepatogênico.

A Publicação do Pedido de Patente U.S. 2005/0262585divulga um promotor da fosforribosilformilglicinamidina ribonucleotídeosintase da soja e fragmentos de deleção deste, que pretende-se seja responsivoà infecção por nematóide.

A WO 94/10320 divulga o fragmento de promotorA0.3TobRB7 de tabaco e seu uso com uma variedade de genes para aexpressão específica de célula de alimentação de nematóide.

A WO 03/033651 divulga seqüências promotoras reguladaspor nematóide sintético designado SCP1, UCP3 e SUP.

A WO 2004/029222 e a sua contraparte US Publicação doPedido de Patente U.S. 2005/0070697 divulgam regiões regulatórias dosgenes da adenosina-5'-fosfato desaminase e inositol-5-fosfatase da soja, parao uso na melhora da resistência a nematóide em plantas.

Nenhum dos promotores específicos de raiz ou sítio dealimentação mencionados acima são correntemente em uso em sementecomercial contendo um transgene anti-nematóide. Embora a necessidadequanto a tais produtos tenha sido a muito reconhecida, ninguém até agora foibem sucedido em desenvolver plantas resistentes a nematóide através datecnologia de DNA recombinante. Uma necessidade continua a existir quantoa promotores específicos de raiz e/ou específicos de sítio de alimentação paracombinar com agentes que codificam transgenes tóxicos para os nematóidesparasíticos de planta.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Verificou-se que quando promotores de gene vegetalcompreendem certos elementos regulatórios conhecidos em orientaçãoespecífica em relação um ao outro, os promotores compartilham ascaracterísticas de serem indutíveis pelos nematóides. Conseqüentemente, ainvenção fornece promotores adequados para o uso em direcionar a expressãode um segundo ácido nucleico em raízes de planta, que são suscetíveis aoataque pelos nematóides. Os promotores da invenção são particularmenteúteis para a fabricação de plantas de cultivo agrícola resistentes à infestaçãopelos nematóides.

Em uma forma de realização, a invenção fornece um ácidonucleico isolado de Configuração de Promotor 1 em que o ácido nucleico temum filamento positivo e um filamento negativo e compreende, emcombinação e na ordem de 5' a 3', um elemento da classe P$MADS nofilamento positivo, um elemento da classe P$MYBS no filamento negativo eum elemento da classe P$DOFF no filamento positivo, em que o elemento daclasse P$MADS está dentro de cerca de 50 nucleotídeos do elemento daclasse P$MYBS, o elemento da classe P$MYBS está dentro de cerca de 50nucleotídeos do elemento da classe P$DOFF e o elemento da classe P$MADSestá dentro de cerca de 100 nucleotídeos do elemento da classe P$DOFF.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece umácido nucleico isolado de Configuração de Promotor 2, em que o ácidonucleico tem um filamento positivo e um filamento negativo e compreende,em combinação e na ordem de 5' a 3', um elemento da classe P$OPAQ nofilamento positivo, um primeiro elemento da classe P$AHPB no filamentonegativo, um elemento da classe P$MADS no filamento positivo, um segundoelemento da classe P$AHPB no filamento positivo e um elemento da classePSTBPF no filamento positivo, em que o elemento da classe PSOPAQ estádentro de cerca de 60 nucleotídeos do primeiro elemento da classe P$AHPB,o primeiro elemento da classe P$AHPB está dentro de cerca de 60nucleotídeos do elemento da classe P$MADS, o elemento da classe P$MADSestá dentro de cerca de 60 nucleotídeos do segundo elemento da classeP$AHPB, o segundo elemento da classe P$AHPB está dentro de cerca de 60nucleotídeos do elemento da classe PSTBPF e o elemento da classe PSOPAQestá dentro de cerca de 240 nucleotídeos do elemento da classe PSTBPF.

Em uma outra forma de realização a invenção fornece umácido nucleico isolado de Configuração de Promotor 3, em que o ácidonucleico tem um filamento positivo e um filamento negativo e compreende,em combinação e na ordem de 5' a 3', um elemento da classe PSTBPF nofilamento positivo, um primeiro elemento da classe PSAHPB no filamentopositivo, um elemento da classe PSMADS no filamento positivo, um primeiroelemento da classe PSDOFF no filamento positivo, um segundo elemento daclasse PSDOFF no filamento negativo e um segundo elemento da classePSAHPB no filamento positivo, em que o elemento da classe PSTBPF estádentro de cerca de 60 nucleotídeos do primeiro elemento da classe PSAHPB,o primeiro elemento da classe PSAHPB está dentro de cerca de 60nucleotídeos do elemento da classe PSMADS, o elemento da classe PSMADSestá dentro de cerca de 60 nucleotídeos do primeiro elemento da classeP$DOFF, o primeiro elemento da classe P$DOFF está dentro de cerca de 60nucleotídeos do segundo elemento da classe P$DOFF, o segundo elemento daclasse P$DOFF está dentro de cerca de 60 nucleotídeos do segundo elementoda classe P$AHPB e o elemento da classe P$TBPF está dentro de cerca de300 nucleotídeos do segundo elemento da classe P$AHPB.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece umpromotor que compreende um ácido nucleico isolado selecionado do grupoque consiste de um ácido nucleico tendo uma seqüência como apresentada naSEQ ID NO: 1; um ácido nucleico que hibridiza sob condições severas a umácido nucleico tendo uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO: 1; umácido nucleico que compreende os nucleotídeos de 1554 a 1887 de umaseqüência como apresentada na SEQ ID NO:l; um ácido nucleico quehibridiza sob condições severas a um ácido nucleico que compreende osnucleotídeos de 1554 a 1887 de uma seqüência como apresentada na SEQ IDNO: 1; um ácido nucleico tendo uma seqüência como apresentada na SEQ IDNO:2; um ácido nucleico que hibridiza sob condições severas a um ácidonucleico tendo uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO:2; um ácidonucleico que compreende os nucleotídeos de 1569 a 1902 de uma seqüênciacomo apresentada na SEQ ID NO:2; um ácido nucleico que hibridiza sobcondições severas a um ácido nucleico que compreende os nucleotídeos de1569 a 1902 de uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO:2; um ácidonucleico tendo uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO: 3; um ácidonucleico que hibridiza sob condições severas a um ácido nucleico tendo umaseqüência como apresentada na SEQ ID NO: 3; um ácido nucleico quecompreende os nucleotídeos de 364 a 697 de uma seqüência comoapresentada na SEQ ID NO: 3; e um ácido nucleico que hibridiza sobcondições severas a um ácido nucleico que compreende os nucleotídeos de364 a 697 de uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO: 3.

A invenção também é personificada em cassetes de expressãoe plantas trangênicas que compreendem os promotores da invenção e emmétodos de controlar a infestação de cultivos pelos nematóides parasíticos,em que os métodos utilizam construções de ácido nucleico recombinantes quecompreendem os promotores da invenção em associação operativa com umsegundo ácido nucleico que codifica um agente tóxico aos nematóidesparasíticos de planta.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

Figura IA: Seqüência da região promotora de Arabidopsisthaliana do local Atlg21890 (SEQ ID NO:l), a caixa TATA nas bases 1854-1860 está em letra minúscula, negrito e itálicos; a Figura IB é uma tabela declasses de elemento promotor presentes na Configuração de Promotor 1,

Configuração de Promotor 2 e Configuração de Promotor 3 que estão contidasdentro do promotor apresentado na SEQID NO: 1.

Figura 2: Seqüência da região promotora de A. thaliana dolocal At4g08290 (SEQ ID NO:2) a caixa TATA nas bases 1869-1875 está emnegrito.

Figura 3: Seqüência da região promotora de MtN21-3 deGlycine max (SEQ ID NO: 3), a caixa TATA nas bases 664-670 é parte deletra minúscula e está em negrito e sublinhado. Também incluído na Figura 3está uma tabela de classes de elemento promotor presentes na Configuraçãode Promotor 1, Configuração de Promotor 2 e Configuração de Promotor 3que estão contidas dentro do promotor apresentado na SEQ ID NO: 3.

Figura 4: Seqüências de cDNA de GmMtN21-2(GM50444087; SEQ ID NO: 4) e GmMtN21-l (GM50862200, SEQ ID NO: 5).

Figura 5: Seqüência de GmMtN21-3 (SEQ ID NO: 6).

Figura 6: Mapa de vetor binário pAW134qcz contendo opromotor de A. thaliana de local Atl g21890 (SEQ ID NO:l)

Figura 7: Mapa de vetor binário pAW219qcz contendo opromotor de A. thaliana de local At4g08290 (SEQID NO:2)

Figura 8: Mapa de vetor binário pAW223qcz contendo opromotor GmMtN21-3 (SEQ ID NO: 3).

Figura 9: Padrões de expressão de 3-glicuronidase de vetoresbinários pAW134qcz, pAW219qcz e pAW223qcz no ensaio de raiz pilosa dasoja apresentado no Exemplo 3. "DAI" significa dias depois da inoculaçãocom SCN. o seguinte índice de contagem foi usado: "-" para nenhumtingimento GUS5 "+" para tingimento GUS fraco, "++" para tingimento GUSforte. Uma média arredondada das 10 contagens foi usada para determinar onível de expressão GUS nos sincícios para esta linhagem. Além disso, o nívelde expressão GUS nas mesmas linhas para outros tecidos de raiz tais comocalo, ponta de raiz, vasculatura, cortical e primordial também foramregistrados usando o mesmo índice de contagem GUS de para nenhumtingimento, "+" para tingimento fraco, "++" para tingimento forte.

Figura 10: Localizações de classes de elemento promotor deConfiguração de Promotor 1, Configuração de Promotor 2 e Configuração dePromotor 3 no promotor de A. thaliana de local Atlg21890 (SEQ ID NO:l) eo promotor MtN21-3 de G. max (SEQ ID NO: 3).

Figura 11: Iniciadores de PCR usados para se obter ospromotores da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO: 3 e as deleções daSEQ ID NO: 1 no Exemplo 7.

Figuras 12A-12B: Alinhamento de seqüência de cDNAs dasoja GmMtN21-2 (GM50444087; SEQ ID NO: 4) e GmMtN21-l(GM50862200, SEQID NO: 5).

Figuras 13A, 13B, 13C: Alinhamento de seqüência defragmento ambulante de genoma GmMtN21-3 (SEQ ID NO: 6) e cDNA dasoja GmMtN21-2 (GM50444087; SEQ ID NO: 4). O códon de partida ATGde GmMtN21-2 (SEQ ID NO: 4) começa no par de base 74. Uma regiãopromotora putativa de 793 pares de base é descrita pela SEQ ID NO: 3 e éderivada das bases 126 a 916 de GmMtN21-3 (SEQ ID NO: 6).

Figuras 14A, 14B, 14C: Resultados de Genomatix DiAligncomparando as bases de 1318 a 1967 da SEQ ID NO:l (correspondendo àsbases de 1 a 650 de Atlg21890pr650bp), bases de 1298 a 1947 da SEQ IDN0:2 (correspondendo às bases de 1 a 650 de At4g08290pr650bp) e bases de142 a 791 da SEQ ID NO: 3 (correspondendo às bases de 1 a 650 deGm_MtN2 lpr650bp).

Figura 15: Configuração espacial de classes de elementopromotor encontrado na Configuração de Promotor 1, Configuração dePromotor 2 e Configuração de Promotor 3 (não na escala exata) incluindoseqüências de consenso de classe de elemento promotor. Na coluna intitulada"Elemento IUPAC de seqüência de consenso de filamento," as seguintesabreviações são utilizadas: A = adenina, C = citosina, G = guanina, T =timina, R = A ou G, Y = C ou T, M = A ou C, K = G ou T, W = A ou T5 S = C

OuGeN = A, C, G, ou Τ. A chave para as configurações é como segue:

Representação de classes de elemento promotor contidas nasbases de 1318 a 1967 da SEQ ID NO:l que compreende a Configuração dePromotor 1.

Representação de classes de elemento promotor contidas nasbases de 1318 a 1967 da SEQ ID NO:l que compreende a Configuração dePromotor 2.

Representação de classes de elemento promotor contidas nasbases de 1318 a 1967 da SEQ ID NO:l que compreende a Configuração dePromotor 3.

Figura 16: Padrões de expressão de β-glicuronidase de sítio dealimentação de vetores binários pAW134qcz, RTJ137, RTJ141, RTJ142,pAW329, RTJ133, RTJ134, RTJ135 e RTJ136 (Ver os Exemplos 7 e 8) noensaio da raiz pilosa da soja apresentada no Exemplo 9. O seguinte índice decontagem foi usado: "-" para nenhum tingimento, "+" para fingimento fraco,"++" para tingimento forte. Também, "+/-" indica que 1 linhagem das 12mostraram tingimento de GUS no sítio de alimentação em menos do que ouigual a 7 dos 10 sítios de alimentação observados. Porque apenas 1 linhagemmostrou atividade no sítio de alimentação, a contagem não é compatível comum padrão de expressão positivo verdadeiro e pode ser o resultado de umefeito posicionai. Uma média arredondada das 10 contagens foi usada paradeterminar o nível de expressão GUS nos sincícios para cada linhagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃOPREFERIDAS

A presente invenção pode ser entendida mais facilmente porreferência à seguinte descrição detalhada das formas de realização preferidasda invenção e os exemplos aqui incluídos. A menos que de outro modomencionado, os termos aqui usados devem ser entendidos de acordo com ouso convencional por aqueles de habilidade comum na técnica relevante.

Além das definições de termos fornecidas abaixo, as definições de termoscomuns na biologia molecular também podem ser encontradas em Rieger etal., 1991 Glossary of genetics: classical and molecular, 5a Ed., Berlin:Springer-Verlag; e em Current Protocols in Molecular Biology, F. M.Ausubel et al, Eds., Current Protocols, a joint venture between GreenePublishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento de 1998).

Deve ser entendido que como usados no relatório descritivo enas reivindicações, "um" ou "uma" podem significar um ou mais, dependendodo contexto em que os mesmos são usados. Assim, por exemplo, referência a"uma célula" pode significar que pelo menos uma célula pode ser utilizada.

Deve ser entendido que esta invenção não é limitada aos ácidos nucleicosespecíficos, tipos de célula específicos, células hospedeiras específicas,condições específicas ou métodos específicos, etc., visto que tal,naturalmente, pode variar e as numerosas modificações e variações nessesentido estarão evidentes àqueles habilitados na técnica. Também deve serentendido que a terminologia aqui usada é para o propósito de descreverapenas as formas de realização específicas e não é intencionada a serlimitante.

Por todo este pedido, várias publicações são dadas comoreferência. As divulgações de todas destas publicações e aquelas referênciascitadas dentro destas publicações em suas totalidades são por meio desteincorporadas por referência neste pedido de modo mais completo descrevem oestado da técnica à qual esta invenção pertence. As técnicas padrão paraclonagem, isolação de DNA, amplificação e purificação, para reaçõesenzimáticas envolvendo DNA ligase, DNA polimerase, endonucleases derestrição e outros e várias técnicas de separação são aquelas conhecidas ehabitualmente utilizadas por aqueles habilitados no ramo. Várias técnicaspadrão são descritas em Sambrook e Russell, 2001 Molecular Cloning,Terceira Edição, Cold Spring Harbor, Plainview, Nova Iorque; Sambrook etal., 1989 Molecular Cloning, Segunda Edição, Cold Spring HarborLaboratory, Plainview, Nova Iorque; Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, Nova Iorque; Wu (Ed.) 1993Meth. Enzymol. 218, Parte I; Wu (Ed.) 1979 Meth Enzymol. 68; Wu et al.,(Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 e 101; Grossman e Moldave (Eds.) 1980Meth. Enzymol. 65; Miller (Ed.) 1972 Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque; Old ePrimrose, 1981 Principies of Gene Manipulation, University of CalifórniaPress, Berkeley; Schleif e Wensink, 1982 Practical Methods in MolecularBiology; Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning Vol. I e II, IRL Press, Oxford, UK;Hames e Higgins (Eds.) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford,UK; e Setlow e Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principies andMethods, Vols. 1-4, Plenum Press, Nova Iorque.

Os promotores da invenção são ácidos nucleicos isolados. Umácido nucleico "isolado" como aqui usado é substancialmente livre de outrosmateriais celulares ou meio de cultura quando produzido pelas técnicasrecombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos quandoquimicamente sintetizados. Além disso, os ácidos nucleicos isolados dainvenção são substancialmente livres de flanqueadores (isto é, seqüênciaslocalizadas a 5' ou 3' destes) presentes no genoma nativo do organismo apartir do qual o ácido nucleico é derivado.

De acordo com a invenção, os promotores da presenteinvenção podem ser colocados em associação operativa com um segundoácido nucleico para a expressão específica de raiz e/ou indutível pornematóide do segundo ácido nucleico em plantas de modo a variar o fenótipodesta planta. Como aqui usado, os termos "em associação operativa,""operavelmente ligado," e "associado com" são intercambiáveis e significama ligação funcional de um promotor e uma segunda seqüência de ácidonucleico em um único fragmento de ácido nucleico em um tal modo que atranscrição do segundo ácido nucleico é iniciada e mediada pelo promotor. Nogeral, os ácidos nucleicos que estão em associação operativa são contíguos.

As seqüências de ácido nucleico secundárias incluem, porexemplo, uma matriz de leitura aberta, uma porção de uma matriz de leituraaberta, um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão, uma seqüênciade anti-sentido, uma seqüência que codifica uma seqüência de RNA defilamento duplo, um transgene e outros. Por exemplo, o ácido nucleicosecundário pode codificar um gene de resistência a inseto, um gene deresistência a doença bacteriana, um gene de resistência a doença fungica, umgene de resistência a doença viral, um gene de resistência a doença denematóide, um gene de resistência a herbicida, um gene que afete acomposição ou qualidade do grão, um gene de utilização de nutriente, umgene de redução de micotoxina, um gene de esterilidade masculina, um genede marcador selecionável, um gene de marcador triável, um gene de marcadorselecionável negativo, um gene de marcador selecionável positivo, um geneque afeta características agronômicas da planta (isto é, o rendimento), umgene de resistência ao estresse ambiental (como exemplificado pelos genesque comunicam resistência ou tolerância à seca, calor, resfriamento,congelamento, umidade excessiva, estresse de sal ou estresse oxidativo),genes que melhoram as propriedades ou quantidade de amido, quantidade equalidade de óleo, composição de aminoácido ou proteína e outros.

Preferivelmente, o ácido nucleico secundário codifica umRNA de filamento duplo ou ácido nucleico de anti-sentido que ésubstancialmente idêntico ou homólogo no todo ou em parte a um genevegetal requerido para a formação ou manutenção de um sítio de alimentação.O ácido nucleico secundário pode alternativamente codificar um agente queinterrompe o crescimento, desenvolvimento, e/ou reprodução dos nematóidesparasíticos de planta ("tóxico ao nematóide") para reduzir a destruição decultivo. Qualquer ácido nucleico que codifique um agente tóxico aonematóide para nematóides parasíticos de planta pode ser utilizado de acordocom a invenção. Por exemplo, o ácido nucleico secundário tóxico aonematóide pode codificar um RNA de filamento duplo que sejasubstancialmente idêntico a um gene alvo de um nematóide parasítico deplanta que é essencial para a sobrevivência, metamorfose ou reprodução donematóide. Como aqui usado, levando em consideração a substituição deuracila no lugar de timina quando da comparação de seqüências de RNA eDNA, os termos "substancialmente idêntico" e "correspondendo a" significaque a seqüência de nucleotídeo de um filamento do dsRNA é pelo menoscerca de 80 % a 90 % idêntico a 20 ou mais nucleotídeos contíguos do genealvo, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90 a 95 % idêntico a 20 oumais nucleotídeos contíguos do gene alvo e o mais preferivelmente pelomenos cerca de 95 a 99 % idêntico ou absolutamente idêntico a 20 ou maisnucleotídeos contíguos do gene alvo. Os genes alvos de nematóide parasíticode planta exemplares são apresentados, por exemplo, na Publicação do Pedidode Patente US co-pendente designado em comum Número 2005/188438, aquiincorporado por referência. O ácido nucleico secundário alternativamentepode codificar um RNA de filamento duplo, que é substancialmente idêntico aum gene vegetal requerido para manter um sítio de alimentação de nematóide.

Alternativamente, para o controle de nematóide, o ácidonucleico secundário colocado em associação operativa com os promotores dainvenção podem codificar uma proteína tóxica ao nematóide. Por exemplo,ácidos nucleicos que codificam toxinas microbianas ou fragmentos destes,toxinas ou fragmentos destas derivados de insetos tais como aqueles descritosnas Patentes U.S. 5.457.178, 5.695.954, 5.763.568, 5.959.182; e outros, sãoúteis nesta forma de realização da invenção.

As plantas de cultivo e os nematóides patogênicoscorrespondentes são listados no Index of Plant Disease in the United States(U.S. Dept. of Agriculture Handbook N2 165, 1960); Distribution of Plant-Parasitic Nematode Species in North America (Society of Nematologists,1985); e Fungi on Plants e Plant Products in the United States (AmericanPhytopathological Society, 1989). Por exemplo, os nematóides parasíticos deplanta que são alvejados pela presente invenção incluem, sem limitação,nematóides císticos e nematóides do nó da raiz. Os nematóides parasíticos deplanta específicos que são alvejados pela presente invenção incluem, semlimitação, Heterodera glycines, Heterodera sehaehtii, Heterodera avenae,Heterodera oryzae, Heterodera cajani, Heterodera trifolii, Globoderapallida, G. rostochiensis, ou Globodera tabacum, Meloidogyne incógnita, M.arenaria, M. hapla, M. javanica, M. naasi, M. exígua, Ditilenchus dipsaci,Ditilenchus angustus, Radopholus similis, Radopholus citrophilus,Helicotilenchus multicinctus, Pratilenchus eoffeae, Pratilenchus brachyurus,Pratilenchus vulnus, Paratilenehus curvitatus, Paratilenehus zeae,Rotilenchulus reniformis, Paratriehodorus anemones, Paratrichodorusminor, Paratrichodorus christiei, Anguina tritici, Bidera avenae, Subanguinaradicicola, Hoplolaimus seinhorsti, Hoplolaimus Columbus, Hoplolaimusgaleatus, Tilenchulus semipenetrans, Hemicycliophora arenaria,Rhadinaphelenehus eoeophilus, Belonolaimus longieaudatus, Triehodorusprimitivus, Naeoabbus aberrans, Aphelenehiodes besseyi, Hemicrieonemoideskanayaensis, Tilenchorhynchus elaytoni, Xiphinema amerieanum,Cacopaurus pestis e outros.

Os cultivos que podem ser protegidas pelas construções deácido nucleico contendo os promotores da presente invenção incluem, semlimitação, soja (G. max), batata (,Solanum tuberosum), amendoins (Araehishypogaea), algodão (Gossypium hirsutum), mandioca (Manihot eseulenta),café {Cofea spp.), coco (Cocos nueifera), abacaxi CAnanas eomosus), árvorescítricas (Citrus spp.), banana (Musa spp.), milho (Zea mays), colza --incluindo canola (Brassiea spp.), girassol, sorgo, trigo, aveia, centeio, cevada,arroz, beterrabas -- incluindo beterrabas açucareiras e vegetais tais comofeijões verdes (Phaseolus vulgaris), feijões lima (Phaseolus limensis) eervilhas (Lathyrus spp.), tabaco (Nieotiana tabaeum) e outros.

Os pedidos de Patente U.S. designados em comum intitulados"MtN21-like Gene Induced by Nematodes," USSN 60/743.340, depositado namesma data como a USSN 60/743.341, ambas as quais são aqui incorporadaspor referência, divulga e reivindica um gene da soja designado Glyeine maxMtN-21, que é induzido nas células de alimentação formadas depois dainfecção por nematóide (Ver as SEQ ID NOs: 4 a 6). Os promotores deArabidopsis da invenção (SEQ ID NOsil e 2) representam regiões promotorasde ortólogos de Arabidopsis da seqüência codificadora de MtN-21 da soja eforam isolados a partir do DNA genômico de Arabidopsis como divulgado noExemplo 1. O promotor MtN-21 da soja desta invenção (SEQ ID NO: 3) foiisolado do DNA genômico da soja como divulgado no Exemplo 2. Comodemonstrado no Exemplo 3, quando colocado em associação operativa comum gene repórter GUS5 os promotores de Arabidopsis e soja da invenção sãosupra-regulados nas raízes pilosas da soja infectadas pelos nematóides.

A invenção é assim personificada em um promotor quecompreende uma seqüência de ácido nucleico isolada como apresentada naSEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO: 3, ou fragmentos de promotormínimos da SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO: 3 que são capazesde direcionar a expressão específica de raiz e/ou indutível por nematóide deum ácido nucleico secundário. Os fragmentos promotores mínimosespecíficos da invenção incluem, sem limitação, um ácido nucleico quecompreende os nucleotídeos de 1554 a 1887 de uma seqüência comoapresentada na SEQ ID NO:l; um ácido nucleico que compreende osnucleotídeos de 1569 a 1902 de uma seqüência como apresentada na SEQ IDNO:2; e um ácido nucleico que compreende os nucleotídeos de 364 a 697 deuma seqüência como apresentada na SEQ ID NO: 3. Os métodos aquidivulgados podem ser utilizados para isolar fragmentos mínimos adicionais daSEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO: 3 que são capazes de mediar aexpressão específica de raiz e/ou indutível por nematóide de um ácidonucleico secundário.

Alternativamente, o promotor da invenção compreende umácido nucleico isolado que hibridiza sob condições severas a um ácidonucleico tendo uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO:l, SEQ IDNO:2, ou SEQ ID NO: 3. As condições de hibridização severas como aquiusadas são bem conhecidas, incluindo, por exemplo, 400 mM de NaCl, 40mM de PIPES pH 6,4, 1 mM de EDTA, 60 °C de hibridização por 12 a 16horas; seguido pela lavagem em 0,1 SSC e 0,1 % de SDS emaproximadamente 65 °C por cerca de 15 a 60 minutos. A invenção é aindapersonificada em um ácido nucleico isolado que hibridiza sob condiçõesseveras a um ácido nucleico que compreende os nucleotídeos de 1554 a 1887de uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO:l; um ácido nucleico quehibridiza sob condições severas a um ácido nucleico que compreende osnucleotídeos de 1569 a 1902 de uma seqüência como apresentada na SEQ IDNO:2; e um ácido nucleico que hibridiza sob condições severas a um ácidonucleico que compreende os nucleotídeos de 364 a 697 de uma seqüênciacomo apresentada na SEQ ID NO: 3.

Além dos promotores que compreendem as seqüênciasisoladas específicas apresentadas nas SEQ ID NOs:l a 3 e as regiõespromotoras mínimas nestas contidas e promotores que hibridizam sobcondições severas a promotores que compreendem as seqüências específicasapresentadas nas SEQ ID Nos:l a 3, a presente invenção abrange qualquerácido nucleico isolado de Configuração de Promotor 1, Configuração dePromotor 2 e Configuração de Promotor 3 aqui descrita. O termo"Configuração de Promotor" é aqui usado para descrever uma combinaçãoespecífica de classes de elemento promotor múltiplas dispostas na direção 5' a3' dentro de uma seqüência promotora, em que cada classe de elementopromotor está em uma orientação espacial específica em relação às outrasclasses de elemento promotor. Os elementos promotores podem seridentificados de numerosos modos familiares a uma pessoa de habilidade natécnica. Um tal método utiliza o algoritmo Genomatix CoreSearch®(Genomatix Software GmbH, Munich, Alemanha). A convenção denomeação CoreSearch utiliza "P" para denotar um elemento promotor combase em planta e um "U" para identificar um elemento promotor definido pelousuário. Estes identificadores amplos são separados do tipo de elemento porum "$". A classe do elemento segue o "$"; por exemplo, "OPAQ", "MADS", ou MYB S".

Como indicado na Figura 15, a classe de elemento promotorP$MADS é designada como "Elemento 1" e exemplificada pelo descritor deelemento P$AGL2.01, que tem a seqüência de consensoTNCCAWAWWTRGNAA (SEQ ID NO:17), ver Huang H., et ai. (1996)Plant Cell 8: 81-94. A classe de elemento promotor P$MYBS indicada naFigura 15 como "Elemento 2" é exemplificada pelo descritor de elementoPSOSMYBS.Ol, que tem a seqüência de consenso SWSKTATCCATNYM(SEQ ID NO: 18), ver Toyofuku K., et al. (1998) FEBS Lett. 428:275-280;

Morita A., et al. (1998) FEBS Lett. 423: 81-85; Gubler F. et al. (1992) PlantCell 4:1435-1441; Lanahan M.B., et al. (1992) Plant Cell 4:203-211; HuttlyA. K., et al. Mol. Gen. Genet. (1988) 214:232-240; Isabel-LaMoneda I., et al.(2003) Plant J. 33: 329-340; e Lu C. A., et al. (2002) Plant Cell 14:1963-1980. A classe de elemento promotor P$DOFF exemplificada pelo descritorde elemento P$PBF.01, que tem a seqüência de consenso WNWAAAGNG(SEQ ID NO: 19) e é indicada na Figura 15 como "Elemento 3", verYanagisawa S., et al. Plant J. 17:209-214 (1999). A classe de elementopromotor PSOPAQ exemplificada pelo descritor de elemento P$02.02, quetem a seqüência de consenso CCACGT (SEQ ID N0:20) e é designada na

Figura 15 como "Elemento 4", ver Cord Neto G., et al (1995) Plant. Mol.Biol. 27:1015-1029; Vincentz M., et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34: 879-889;Hwang Y. S., et al. (2004) Plant Cell Physiol. 45:1509-1518. A classe deelemento P$AHPB é exemplificada pelo descritor de elemento PSWUS.01,que tem a seqüência de consenso TTAATG (SEQ ID NO:21) e é designada na

Figura 15 como "Elemento 5," ver Hong R. L., et al. (2003) Plant Cell15:1296-1309; Lohmann J. U., et al (2001) Cell 105: 793-803. A classe deelemento PSMADS é exemplificada pelo descritor de elementoPSMADSB.01, que tem a seqüência de consenso WNCYAAAAATGSMAA(SEQ ED NO:22) e é designada "Elemento 6" na Figura 15, ver Riechmann J.L., et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 3134-3141; Hill Τ. A., et al. (1998)Development 125:1711-1721. A classe de elemento PSAHPB é exemplificadapelo descritor de elemento PSATHB 1.01, que tem a seqüência de consensoCAATTATT (SEQ ED NO:23) e é designada na Figura 15 como "Elemento7," ver Sessa G., et al. (1993) EMBO J. 12: 3507-3517. A classe de elementoP$TBPF é exemplificada pelo descritor de elemento P$TATA.01, que tem aseqüência de consenso YNMTATAAATANA (SEQ ID NO:24) e é designadana Figura 15 como "Elemento 8" ver Gidoni D., et al. (1989) Mol. Gen.Genet. 215: 337-344; Yang H., et al. (2000) Plant Mol. Biol. 44: 635-647;Chiron H., et al. (2000) Plant Physiol. 124: 865-872; Guerineau F., et al.(2003) J. Exp. Bot. 54:1153-1162; Haralampidis K., et al. (2002) PlantPhysiol. 129:1138-1149; Ishizaka T., et al (2003) Genes Genet. Syst. 78:191-194; Hasegawa K., et al. (2003) Plant J. 33:1063-1072. A classe de elementoP$AHPB é exemplificada pelo descritor de elemento P$ATHB9.01, que tem aseqüência de consenso GTAATGATTRC (SEQ ID NO:25) e é designadacomo "Elemento 9" na Figura 15, ver Sessa G., et al. (1998) Plant Mol. Biol.38: 609-622. A classe de elemento P$DOFF designada como "Elemento 10"na Figura 15 é exemplificada pelo descritor de elemento P$DC)F2.01, que tema seqüência de consenso WAAAGC (SEQ ID NO:26), ver Yanagisawa S., etal. (1999) Plant J. 17:209-214. A classe de elemento P$AHPB éexemplificada pelo descritor de elemento P$ATHB9.01, que tem a seqüênciade consenso GTAATGATTRC (SEQ ID NO:27) e é designada "Elemento11" na Figura 15, ver Sessa G., et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38: 609-622.

Os promotores de Configuração de Promotor 1 são ácidosnucleicos isolados tendo um filamento positivo e um filamento negativo e quecompreende, em combinação e na ordem de 5' a 3', um elemento da classeP$MADS no filamento positivo, um elemento da classe P$MYBS nofilamento negativo e um elemento da classe P$DOFF no filamento positivo,em que o elemento da classe P$MADS está dentro de cerca de 50nucleotídeos do elemento da classe P$MYBS, o elemento da classe PSMYBSestá dentro de cerca de 50 nucleotídeos do elemento da classe P$DOFF e oelemento da classe P$MADS está dentro de cerca de 100 nucleotídeos doelemento da classe P$DOFF.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece umpromotor de planta que compreende um ácido nucleico tendo um filamentopositivo e um filamento negativo, o ácido nucleico compreendendo, emcombinação e na ordem de 5' a 3', um elemento da classe P$MADS nofilamento positivo, um elemento da classe P$MYBS no filamento negativo eum elemento da classe P$DOFF no filamento positivo, em que o promotor éinduzido em raízes de uma planta pelos nematóides parasíticos de planta.

Os promotores de Configuração de Promotor 2 são ácidosnucleicos isolados tendo um filamento positivo e um filamento negativo e quecompreende, em combinação e na ordem de 5' a 3', um elemento da classeP$OPAQ no filamento positivo, um primeiro elemento da classe P$AHPB nofilamento negativo, um elemento da classe P$MADS no filamento positivo,um segundo elemento da classe P$AHPB no filamento positivo e umelemento da classe P$TBPF no filamento positivo, em que o elemento daclasse P$OPAQ está dentro de cerca de 60 nucleotídeos do primeiro elementoda classe P$AHPB, o primeiro elemento da classe P$AHPB está dentro decerca de 60 nucleotídeos do elemento da classe P$MADS, o elemento daclasse P$MADS está dentro de cerca de 60 nucleotídeos do segundo elementoda classe P$AHPB, o segundo elemento da classe P$AHPB está dentro decerca de 60 nucleotídeos do elemento da classe P$TBPF e o elemento daclasse P$OPAQ está dentro de cerca de 240 nucleotídeos do elemento daclasse P$TBPF.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece umpromotor de planta que compreende um ácido nucleico tendo um filamentopositivo e um filamento negativo, o ácido nucleico compreendendo, emcombinação e na ordem de 5' a 3', um elemento da classe P$OPAQ nofilamento positivo, um primeiro elemento da classe P$AHPB no filamentonegativo, um elemento da classe P$MADS no filamento positivo, um segundoelemento da classe P$AHPB no filamento positivo e um elemento da classeP$TBPF no filamento positivo, em que o promotor é induzido em raízes deuma planta pelos nematóides parasíticos de planta.

Os promotores de Configuração de Promotor 3 são ácidosnucleicos isolados tendo um filamento positivo e um filamento negativo e quecomoreende, em combinação e na ordem de 5' a 3', um elemento da classeP$TBPF no filamento positivo, um primeiro elemento da classe P$AHPB nofilamento positivo, um elemento da classe P$MADS no filamento positivo,um primeiro elemento da classe P$DOFF no filamento positivo, um segundoelemento da classe P$DOFF no filamento negativo e um segundo elemento daclasse P$AHPB no filamento positivo, em que o elemento da classe P$TBPFestá dentro de cerca de 60 nucleotídeos do primeiro elemento da classeP$AHPB, o primeiro elemento da classe P$AHPB está dentro de cerca de 60nucleotídeos do elemento da classe P$MADS, o elemento da classe P$MADSestá dentro de cerca de 60 nucleotídeos do primeiro elemento da classePSDOFF, o primeiro elemento da classe PSDOFF está dentro de cerca de 60nucleotídeos do segundo elemento da classe PSDOFF, o segundo elemento daclasse PSDOFF está dentro de cerca de 60 nucleotídeos do segundo elementoda classe PSAHPB e o elemento da classe PSTBPF está dentro de cerca de300 nucleotídeos do segundo elemento da classe PSAHPB.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece umpromotor de planta que compreende um ácido nucleico tendo um filamentopositivo e um filamento negativo, o ácido nucleico compreendendo, emcombinação e na ordem de 5' a 3', um elemento da classe PSTBPF nofilamento positivo, um primeiro elemento da classe PSAHPB no filamentopositivo, um elemento da classe PSMADS no filamento positivo, um primeiroelemento da classe PSDOFF no filamento positivo, um segundo elemento daclasse PSDOFF no filamento negativo e um segundo elemento da classePSAHPB no filamento positivo, em que o promotor é induzido em raízes deuma planta pelos nematóides parasíticos de planta.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece umpromotor de planta que compreende um ácido nucleico tendo um filamentopositivo e um filamento negativo, o ácido nucleico compreendendo, emcombinação e na ordem de 5' a 3' no mesmo filamento, um ou maiselementos da classe P$MADS e pelo menos um elemento da classe P$TBPF,em que o promotor é induzido em raízes de uma planta pelos nematóidesparasíticos de planta. Em uma outra forma de realização, a invenção forneceum promotor de planta que compreende um ácido nucleico tendo umfilamento positivo e um filamento negativo, o ácido nucleico compreendendo,em combinação e na ordem de 5' a 3' no mesmo filamento, um elemento daclasse P$MADS seguido por um elemento da classe P$TBPF seguido por umsegundo elemento da classe P$MADS, em que podem haver outros elementosinterpostos e o promotor é induzido em raízes de uma planta pelos nematóidesparasíticos de planta. Já em uma outra forma de realização, a invençãofornece um promotor de planta que compreende um ácido nucleico tendo umfilamento positivo e um filamento negativo, o ácido nucleico compreendendo,em combinação e na ordem de 5' a 3' no mesmo filamento, um primeiroelemento da classe P$MADS seguido dentro de cerca de 100 nucleotídeos porum elemento da classe P$TBPF seguido dentro cerca de 200 nucleotídeos porum segundo elemento da classe P$MADS, o primeiro elemento da classeP$MADS está dentro de cerca de 300 nucleotídeos do segundo elemento daclasse P$MADS e em que podem haver outros elementos interpostos e opromotor é induzido em raízes de uma planta pelos nematóides parasíticos deplanta.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece umpromotor de planta que compreende um ácido nucleico tendo um filamentopositivo e um filamento negativo, o ácido nucleico compreendendo, emcombinação e na ordem de 5' a 3' no mesmo filamento, um primeiroelemento da classe P$MADS tendo o descritor de elemento P$MADSB.01,um elemento da classe PSTBPF tendo o descritor de elemento p$TATA.01 eum segundo elemento da classe P$MADS tendo o descritor de elementoP$AGL2.01, em que podem haver outros elementos interpostos e o promotoré induzido em raízes de uma planta pelos nematóides parasíticos de planta. Jáem uma outra forma de realização, a invenção fornece um promotor de plantaque compreende um ácido nucleico tendo um filamento positivo e umfilamento negativo, o ácido nucleico compreendendo, em combinação e naordem de 5' a 3' no mesmo filamento, um primeiro elemento da classeP$MADS tendo o descritor de elemento P$MADSB.01, seguido dentro decerca de 100 nucleotídeos por um elemento da classe P$TBPF tendo odescritor de elemento p$TATA.01 e seguido dentro de cerca de 200nucleotídeos por um segundo elemento da classe PSMADS tendo o descritorde elemento P$AGL2.01, o primeiro elemento da classe P$MADS dentro decerca de 300 nucleotídeos do segundo elemento da classe P$MADS, e em quepodem haver outros elementos interpostos e o promotor é induzido em raízesde uma planta pelos nematóides parasíticos de planta.

A invenção também é personificada em cassetes de expressãoque compreendem os promotores da invenção. "Cassete de expressão" nestecontexto deve ser entendido amplamente como compreendendo todas asseqüências contidas no cassete que possam influenciar a transcrição de umácido nucleico de interesse e, se aplicável, a sua tradução. Além dospromotores da invenção, o cassete de expressão da invenção podecompreender ainda elementos reguladores que melhorem a função dopromotor, elementos genéticos que permitam a transcrição e/ou tradução emorganismos procarióticos e/ou eucarióticos e elementos reguladores a jusante(na direção 3') tais como uma seqüência de terminação de transcrição e umaseqüência de poliadenilação. Os vários componentes do cassete de expressãoda invenção são seqüencial e operavelmente ligados entre si.

Conseqüentemente, um cassete de expressão da invenção podecompreender um ácido nucleico isolado selecionado do grupo que consiste deum ácido nucleico tendo uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO:l;um ácido nucleico que hibridiza sob condições severas a um ácido nucleicotendo uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO: 1; um ácido nucleicoque compreende os nucleotídeos de 1554 a 1887 de uma seqüência comoapresentada na SEQ ID NO: 1; um ácido nucleico que hibridiza sob condiçõesseveras a um ácido nucleico que compreende os nucleotídeos de 1554 a 1887de uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO:l; um ácido nucleicotendo uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO:2; um ácido nucleicoque hibridiza sob condições severas a um ácido nucleico tendo uma seqüênciacomo apresentada na SEQ ID NO:2; um ácido nucleico que compreende osnucleotídeos de 1569 a 1902 de uma seqüência como apresentada na SEQ IDNO:2; um ácido nucleico que hibridiza sob condições severas a um ácidonucleico que compreende os nucleotídeos de 1569 a 1902 de uma seqüênciacomo apresentada na SEQ ID NO:2; um ácido nucleico tendo uma seqüênciacomo apresentada na SEQ ID NO: 3; um ácido nucleico que hibridiza sobcondições severas a um ácido nucleico tendo uma seqüência comoapresentada na SEQ ID NO: 3; um ácido nucleico que compreende osnucleotídeos de 364 a 697 de uma seqüência como apresentada na SEQ IDNO: 3; um ácido nucleico que hibridiza sob condições severas a um ácidonucleico que compreende os nucleotídeos de 364 a 697 de uma seqüênciacomo apresentada na SEQ ID NO: 3; um ácido nucleico de Configuração dePromotor 1; um ácido nucleico de Configuração de Promotor 2; e um ácidonucleico de Configuração de Promotor 3. Alternativamente, um cassete deexpressão da invenção compreende um promotor selecionado do grupo queconsiste de (a) um ácido nucleico isolado tendo um filamento positivo e umfilamento negativo, o ácido nucleico compreendendo, em combinação e naordem de 5' a 3', um elemento da classe P$MADS no filamento positivo, umelemento da classe P$MYBS no filamento negativo e um elemento da classeP$DOFF no filamento positivo; (b) um ácido nucleico isolado tendo umfilamento positivo e um filamento negativo, o ácido nucleico compreendendo,em combinação e na ordem de 5' a 3', um elemento da classe P$OPAQ nofilamento positivo, um primeiro elemento da classe P$AHPB no filamentonegativo, um elemento da classe P$MADS no filamento positivo, um segundoelemento da classe P$AHPB no filamento positivo e um elemento da classeP$TBPF no filamento positivo; e (c) um promotor de planta isolado tendo umfilamento positivo e um filamento negativo, o promotor compreendendo, emcombinação e na ordem de 5' a 3', um elemento da classe P$TBPF nofilamento positivo, um primeiro elemento da classe P$AHPB no filamentopositivo, um elemento da classe P$MADS no filamento positivo, um primeiroelemento da classe P$DOFF no filamento positivo, um segundo elemento daclasse P$DOFF no filamento negativo e um segundo elemento da classePSAHPB no filamento positivo; em que o promotor é induzido em raízes deuma planta pelos nematóides parasíticos de planta.

Alternativamente, um cassete de expressão da invençãocompreende um promotor que compreende um ácido nucleico isolado tendoum filamento positivo e um filamento negativo, o ácido nucleicocompreendendo, em combinação e na ordem de 5' a 3' no mesmo filamento,um ou mais elementos da classe P$MADS e pelo menos um elemento daclasse P$TBPF, em que o promotor é induzido em raízes de uma planta pelosnematóides parasíticos de planta. Em uma outra forma de realização, umcassete de expressão da invenção compreende um promotor que compreendeum ácido nucleico isolado tendo um filamento positivo e um filamentonegativo, o ácido nucleico compreendendo, em combinação e na ordem de 5'a 3' no mesmo filamento, um elemento da classe P$MADS seguido por umelemento da classe P$TBPF seguido por um segundo elemento da classeP$MADS, em que podem haver outros elementos interpostos e o promotor éinduzido em raízes de uma planta pelos nematóides parasíticos de planta. Jáem uma outra forma de realização, um cassete de expressão da invençãocompreende um promotor que compreende um ácido nucleico isolado tendoum filamento positivo e um filamento negativo, o ácido nucleicocompreendendo, em combinação e na ordem de 5' a 3' no mesmo filamento,um primeiro elemento da classe PSMADS seguido dentro de cerca de 100nucleotídeos por um elemento da classe P$TBPF seguido dentro de cerca de200 nucleotídeos por um segundo elemento da classe P$MADS, o primeiroelemento da classe P$MADS dentro de cerca de 300 nucleotídeos do segundoelemento da classe P$MADS e em que podem haver outros elementosinterpostos e o promotor é induzido em raízes de uma planta pelos nematóidesparasíticos de planta.

Em uma outra forma de realização, um cassete de expressão dainvenção compreende um promotor que compreende um ácido nucleicoisolado tendo um filamento positivo e um filamento negativo, o ácidonucleico compreendendo, em combinação e na ordem de 5' a 3' no mesmofilamento, um elemento da classe P$MADS tendo o descritor de elementoP$MADSB.01, um elemento da classe P$TBPF tendo o descritor de elementop$TATA.01 e um elemento da classe P$MADS tendo o descritor de elementoPSAGL2.01, em que podem haver outros elementos interpostos e o promotoré induzido em raízes de uma planta pelos nematóides parasíticos de planta. Jáem uma outra forma de realização, um cassete de expressão da invençãocompreende um promotor que compreende um ácido nucleico isolado quecompreende, em combinação e na ordem de 5' a 3' no mesmo filamento, umelemento da classe P$MADS tendo o descritor de elemento P$MADSB.01,seguido dentro de cerca de 100 nucleotídeos por um elemento da classeP$TBPF tendo o descritor de elemento p$TATA.01 e seguido dentro de cercade 200 nucleotídeos por um elemento da classe P$MADS tendo o descritor deelemento P$AGL2.01, o primeiro elemento da classe P$MADS dentro decerca de 300 nucleotídeos do segundo elemento da classe P$MADS, em quepodem haver outros elementos interpostos e o promotor é induzido em raízesde uma planta pelos nematóides parasíticos de planta.

Elementos genéticos específicos que podem ser opcionalmenteincluídos no cassete de expressão da invenção incluem, sem limitação,origens de replicação para permitir a replicação em bactérias, por exemplo, aregião ORI de pBR322 ou a P15A ori; ou elementos requeridos para atransferência de TDNA de Agrobacterium, tais como, por exemplo, a bordaesquerda e/ou direita do T-DNA. Outros componentes do cassete deexpressão da invenção podem incluir, sem limitação, elementos reguladoresadicionais tais como, por exemplo, realçadores, introns, poliligadores, sítiosde clonagem múltipla, operadores, sítios de ligação de repressor, sítios deligação de fator de transcrição e outros. Os realçadores exemplares incluemelementos do promotor CaMV 35S, genes da octopina sintase (Ellis et al.,1987), o gene I da actina do arroz, o gene da álcool desidrogenase do milho(Callis 1987), o gene enrugado I do milho (Vasil 1989), elemento TMVÔmega (Gallie 1989) e promotores de eucariotas não vegetais (por exemplo,levedura; Ma 1988). As seqüências de intron de planta exemplares incluemintrons de Adhl, bronze 1, actinal, actina 2 (WO 00/760067), ou o intron dasacarose sintase; ver: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling e Walbot,Eds., Springer, Nova Iorque (1994).

As seqüências líder virais também podem realçar a transcriçãode ácidos nucleicos de interesse pelo cassete de expressão da invenção. Porexemplo, as seqüências líder do Vírus Mosaico do Tabaco (TMV), VírusMosqueado Clorótico do Milho (MCMV) e Vírus Mosaico da Alfafa (AMV)mostraram ser eficazes em realçar a expressão. Outros líderes conhecidos natécnica incluem mas não são limitados a: líderes de Picornavírus, porexemplo, (o líder do vírus da Encefalomiocardite (EMCV); líderes dePotivírus, líder do Vírus Cáustico do Tabaco (TEV); líder de MDMV (VírusMosaico Anão do Milho); líder da proteína de ligação da cadeia pesada daimunoglobulina humana (BiP), líder não traduzido do nRNA da proteína derevestimento do vírus mosaico da alfafa (AMV RNA 4).

O cassete de expressão da invenção também podecompreender um elemento de terminação de transcrição ou sinal depoliadenilação. Os elementos de terminação de transcrição exemplaresincluem aqueles do gene da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens(Bevan 1983), o terminador para o transcrito T7 do gene da octopina sintasede Agrobacterium tumefaciens e a extremidade 3' dos genes I ou II doinibidor da protease de batata ou tomate.

Um ácido nucleico secundário a ser transcrito em RNA, e,opcionalmente, expressado como uma proteína é inserido no cassete deexpressão da invenção para a transformação em um organismo. De acordocom a invenção, a seqüência do ácido nucleico secundário é colocada ajusante (isto é, na direção 3') do promotor da invenção e a montante doselementos de terminação de transcrição, em ligação covalente com isso.Preferivelmente, a distância entre a seqüência do ácido nucleico secundário eo promotor da invenção não é maior do que 200 pares de base, maispreferivelmente não maior do que 100 pares de base, o mais preferivelmentenão maior do que 50 pares de base.

Um cassete de expressão da invenção também pode sermontado pela inserção de um promotor da invenção no genoma da planta. Talinserção resultará em uma ligação operável a uma seqüência de ácidonucleico de interesse nativa para o genoma. Tais inserções permitirão que oácido nucleico de interesse seja expressada ou supra-expressadapreferencialmente no tecido de raiz, depois da indução pelos nematóides,como o resultado das propriedades que regulam a transcrição do promotor dainvenção. A inserção pode ser direcionada ou ao acaso. Preferivelmente ainserção é direcionada e realizada, por exemplo, pela recombinaçãohomóloga. Por este procedimento um promotor natural pode ser substituídopelo promotor da invenção, modificando deste modo o perfil de expressão deum gene endógeno. O promotor também pode ser inserido em um modo, queo mRNA de anti-sentido de um gene endógeno seja expressado, induzindodeste modo o silenciamento do gene.

O cassete de expressão da invenção pode ser inserido em umvetor recombinante, plasmídeo, cosmídeo, YAC (cromossoma artificial delevedura), BAC (cromossoma artificial bacteriano), ou qualquer outro vetoradequado para a transformação na célula hospedeira. As células hospedeiraspreferidas são células bacterianas e células vegetais. Quando a célulahospedeira é uma célula vegetal, o cassete de expressão ou vetor podemtornar-se inseridos no genoma da célula vegetal transformada.Alternativamente, o cassete de expressão ou vetor podem ser mantidosextracromossomicamente. O cassete de expressão ou vetor da invenção podeestar presente no núcleo, cloroplasto, mitocôndria, e/ou plastídeo das célulasda planta. Preferivelmente, o cassete de expressão ou vetor da invenção sãoinseridos no DNA cromossômico do núcleo da célula vegetal.

O cassete de expressão da invenção pode ser transformado emuma planta para fornecer uma planta transgênica que compreende um ácidonucleico secundário em associação operativa com um promotor de planta dainvenção. A planta transgênica desta forma de realização compreende umpromotor que compreende uma seqüência de ácido nucleico comoapresentada na SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3, um fragmentode promotor mínimo da SEQ ID NO:l, um fragmento de promotor mínimo daSEQ ID NO:2, ou um fragmento de promotor mínimo da SEQ ID NO: 3.Alternativamente, a planta transgênica da invenção compreende um ácidonucleico que hibridiza sob condições severas a um promotor que compreendeuma seqüência de ácido nucleico como apresentada na SEQ ED NO:l, SEQID NO:2, SEQ ID NO: 3, um fragmento de promotor mínimo da SEQ IDNO: 1, um fragmento de promotor mínimo da SEQ ID NO:2, ou um fragmentode promotor mínimo da SEQ ID NO: 3. Em uma outra forma de realização, aplanta transgênica compreende um promotor de Configuração de Promotor 1,Configuração de Promotor 2, ou Configuração de Promotor 3.

As plantas trangênicas da invenção são fabricadas usandométodos de transformação conhecidos por aqueles de habilidade na técnica dabiotecnologia vegetal. Qualquer método pode ser usado para transformar ovetor de expressão recombinante em células vegetais para produzir as plantastrangênicas da invenção. Os métodos adequados para transformar outransfectar células hospedeiras incluindo células vegetais podem serencontrados, por exemplo, em Sambrook et ai. supra e em outros manuais delaboratório tais como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44,Agrobacterium protocols, Ed: Gartland e Davey, Humana Press, Totowa,Nova Jérsei.

Os métodos gerais para transformar plantas dicotiledôneastambém são divulgados, por exemplo, nas Patentes U.S. 4.940.838; 5.464.763e outras. Os métodos para transformar plantas dicotiledôneas específicas, porexemplo, algodão, são apresentados nas Patentes U.S. 5.004.863; 5.159.135; e5.846.797. Os métodos de transformação de soja são apresentados nasPatentes U.S. 4.992.375, 5.416.011, 5.569.834, 5.824.877, 6.384.301 e na EP0301749B1. Outros métodos de transformação de planta são divulgados, porexemplo, nas Patentes U.S. 4.945.050, 5.188.958, 5.596.131, 5.981.840 eoutras.

As plantas trangênicas da invenção podem ser cruzadas complantas trangênicas similares ou com plantas que carecem do promotor dainvenção e ácido nucleico secundário, usando métodos conhecidos decruzamento de planta, para preparar semente. A semente é depois plantadapara obter uma planta transgênica fértil cruzada que compreende o ácidonucleico de interesse e o promotor da invenção. A planta pode ser umamonocotiledônea ou uma dicotiledônea. A planta transgênica fértil cruzadapode ter o cassete de expressão particular herdado através de um precursorfeminino ou através de um precursor masculino. A segunda planta pode seruma planta congênita. O transgênico fértil cruzado pode ser um híbrido.Também incluído dentro da presente invenção estão as sementes de qualqueruma destas plantas trangênicas férteis cruzadas.

A invenção é ainda personificada em um cultivo quecompreende uma pluralidade das plantas trangênicas da invenção, plantadasjuntas em um campo agrícola.

As plantas trangênicas da invenção podem ser usadas em ummétodo para controlar a infestação de um cultivo por um nematóide parasítico deplanta, que compreende a etapa de cultivar o dito cultivo de sementes quecompreendem um cassete de expressão que compreende um promotor de plantada invenção em associação operativa com um ácido nucleico secundário quecodifica um agente que rompe o crescimento, desenvolvimento e/ou reproduçãodo dito nematóide parasítico de planta, em que o cassete de expressão éestavelmente integrado nos genomas das sementes. Tais agentes interruptorestóxicos ao nematóide incluem, sem limitação, um RNA de filamento duplo que ésubstancialmente idêntico a um gene alvo de um nematóide parasítico de plantaque é essencial para a sobrevivência, metamorfose ou reprodução do nematóide;um RNA de filamento duplo que é substancialmente idêntico a um gene vegetalrequerido para manter um sítio de alimentação de nematóide; uma toxinamicrobiana; uma toxina derivada de um inseto e outros.

Os seguintes exemplos não são intencionados a limitar oescopo das reivindicações para a invenção, mas são ao invés intencionados aserem exemplares de certas formas de realização. Quaisquer variações nosmétodos exemplificados que ocorrem ao técnico habilitado são intencionadosa cair dentro do escopo da presente invenção.

Exemplo 1: Clonagem de promotores de gene exportador demedicamento/metabólito de planta de Arabidopsis

O DNA genômico de Arabidopsis (ecotipo Columbia) foiextraído usando o Qiagen DNAeasy Plant Minikit (Qiagen). As regiões deDNA genômico de 1.967 pares de base (SEQ ID NO:l) e 1.950 pares de base(SEQ ID NO:2) (seqüências promotoras putativas) diretamente a montante docódon ATG incluindo a região não traduzida 5' correspondendo aos genesexportadores de metabólito vegetal de Arabidopsis com identificadores delocal, Atlg21890 e At4g08290 respectivamente, foram clonados usandoprotocolo de amplificação de PCR padrão. Para isto, aproximadamente 0,1 μgde DNA genômico de Arabidopsis foi usado como o padrão de DNA nareação de PCR. Os iniciadores usados para a amplificação pela PCR dasseqüências promotoras de Arabidopsis são mostrados na Figura 11 e foramplanejados com base na Base de Dados de Seqüência Genômica deArabidopsis (TAIR). As seqüências iniciadoras descritas pelas SEQ ID NO: 7e SEQ ID NO: 9 contêm o sítio de restrição de PstI para facilidade declonagem. As seqüências iniciadoras descritas pela SEQ ID NO: 8 e SEQ IDNO: 10 contiveram o sítio AscI para a facilidade de clonagem. As seqüênciasiniciadoras descritas pela SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 foram usadas paraamplificar a região promotora de Arabidopsis local Atlg21890. As seqüênciasiniciadoras descritas pelas SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10 foram usadas paraamplificar a região promotora de Arabidopsis local At4g08290.

A mistura de reação de amplificação conteve o seguinte:2,5 μmde 10X Tampão Hot Start; 0,15 μΐ de Taq DNA polimerase Hot Start; 0,5 μΐde dNTPs a 10 mM; 0,5 μΐ de iniciador A a 10 μΜ; 0,5 μΐ de iniciador BalOμΜ; 1,0 μΐ de DNA genômico de Arabidopsis (aproximadamente 100 ng);19,85 μΐ de água. Termociclador: T3 Thermocycler Biometra, Alemanha foiusado para a amplificação usando o seguinte ajuste: 1 ciclo com 900 segundosa 94 °C; 5 ciclos com 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 52 0C e 120segundos a 72 °C; 30 ciclos com 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 62 0C e120 segundos a 72 0C; 1 ciclo com 300 segundos a 72 °C.

O tamanho do fragmento de DNA amplificado para cadaproduto de PCR foi verificado pela eletroforese em gel de agarose padrão e oDNA extraído do gel pelo Kit de Extração em Gel Qiagen (Qiagen, Hilden,Alemanha). Os fragmentos purificados foram TOPO clonados em pCR2.1usando o kit de clonagem TOPO TA seguindo as instruções do fabricante(Invitrogen). Os fragmentos clonados foram seqüenciados usando umseqüenciador automatizado da Applied Biosystem 373A (ABI) e verificadosserem a seqüência esperada usando-se o alinhamento de seqüência clustalWda ferramenta de análise de seqüência Vector NTI. Os fragmentos de DNA de1.967 pares de base e 1.950 pares de base correspondendo às regiõespromotoras de Atlg21890 e At4g08290 são mostrados como a SEQ ID NO:le SEQ ID NO:2. Os sítios de restrição introduzidos nos iniciadores parafacilitar a clonagem não estão incluídos nas seqüências.

Exemplo 2: Clonagem de promotores do gene exportador de metabólitoequivalente a MtN21 da soja

Como descrito mais completamente no pedido de patente USdesignado em comum, USSN 60/743.340, aqui incorporado por referência emsua totalidade, dois polinucleotídeos que codificam homólogos de MtN21 dasoja, GmMtN21-l (GM50862200, SEQ ID NO: 5) e GmMtN21-2(GM50444087, SEQ ID NO: 4) foram identificados como sendo supra-regulados em sincícios de raízes de soja infectados com SCN5 usando ummétodo de bioinformática. A Figura 4 representa as seqüências de GmMtN21-1 e GmMtN21-2. A seqüência de cDNA de GmMtN21-2 (SEQ ID NO: 4) foideterminada ser de tamanho natural visto que existe um códon de parada TAGcomeçando no par de base 59 a montante e na mesma matriz como o códon departida ATG da matriz de leitura aberta Mtn21 codificada que começa no parde base 74. O alinhamento das seqüências de GmMtN21-2 (designadaGM50444087, SEQ ID NO: 4) e GmMtN21-l (designada GM50862200, SEQID NO: 5) mostrado na Figura 12 indica que GmMtN21-l é provável ser umaseqüência parcial perdendo aproximadamente 200 aminoácidos naextremidade de terminal N.

Para clonar a seqüência promotora de GmMtN21, o Universal

Genome Walking Kit (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, Calif.) foi usadode acordo com as instruções do fabricante. Para isto, o DNA genômico dasoja (ιGlycine max, Resnik) foi extraído usando o Qiagen DNAeasy PlantMinikit (Qiagen). O procedimento consistiu de duas amplificações pela PCR,usando um iniciador adaptador e um iniciador específico de gene para cadareação de amplificação. As seqüências de iniciadores usados para isolar ospromotores da invenção são mostrados na Figura 11. Os iniciadoresespecíficos de gene que alvejam GmMtN21-2 (SEQ ID NO: 4) foram oiniciador primário, GmMtN21-2 GW (SEQ ID NO:l 1) e o iniciador abrigado,GmMtN21 -2GWnest (SEQ ID NO: 12). Os iniciadores adaptadores usadosforam GmMtN21-2GW APl (SEQ ID N0:13) e GmMtN21-2GW AP2 (SEQID NO: 14). Usando este protocolo, diversos clones foram isolados eseqüenciados.

O produto clonado mais longo foi identificado como ρAWl21(SEQ ID NO: 6). Um alinhamento de seqüência de pAW121 com GmMtN21-2 indicou que este clone é altamente homólogo mas não idêntico aGmMtN21-2 (SEQ ID NO: 4) como mostrado na Figura 5. Portanto, aseqüência pAW 121 foi provável ser derivada de um homólogo de GmMtN21 -2 e foi denominado GmMtN21-3. O alinhamento também revelou queρAWl21 continha um intron de 122 pares de base na região codificadora donucleotídeo 1101 ao 1223 e uma seqüência promotora de 791 pares de base amontante do ATG a partir do nucleotídeo 126 ao 916 (ver Figura 13). Estaregião promotora foi clonada de pAW121 usando técnicas de PCR padrão eos iniciadores GmMtN21-3 promFor (SEQ ID NO: 15) e GmMtN21-3promRev (SEQ ID NO: 16). GmMtN21-3promFor e GmMtN21-3promRevcarregaram os sítios de restrição de enzima para PstI e AscI respectivamentepara a facilidade da clonagem direcional. O promotor GmMtN21-3 e asseqüências 5'UTR, sem os sítios de restrição usados para a clonagem, sãomostrados como SEQ ID NO: 3. A seqüência de nucleotídeo 1 a 697representa a seqüência promotora inteira com a região promotora de núcleotranspondo os nucleotídeos 364 a 697. O sinal TATA transpõem osnucleotídeos 664 a 670 e a seqüência líder não traduzida 5' do mRNA dosnucleotídeos 697 a 791.

Exemplo 3: A construção de vetor binário para a transformação e geração deraízes pilosas transgênicas

Para avaliar a atividade de expressão dos promotores clonados,os fragmentos de gene correspondendo aos nucleotídeos 1 a 1967 da SEQ IDNO:l, nucleotídeos 1 a 1947 da SEQ ID NO:2 e nucleotídeos 1 a 791 da SEQID NO: 3 foram clonados a montante de um gene repórter GUS (β-glicuronidase bacteriana ou gene GUS (Jefferson (1987) EMBO J. 6, 3901-3907) para criar os vetores binários pAW134qcz, pAW219qcz e pAW223qcz,respectivamente, como mostrado nas Figuras 6 até 8. O marcador de seleçãode planta nos vetores binários foi um gene AHAS mutado de A. thaliana queconferiu tolerância ao herbicida ARSENAL (imazapyr, BASF Corporation,Florham Park, NJ). O marcador selecionável mutado AHAS foi direcionadopelo promotor AHAS de Arabidopsis.

O nematóide do cisto da soja pode ser propagado em explantesda raiz de soja normal. Entretanto, esta técnica requer o estabelecimentocontínuo de explantes de raiz porque estes órgãos têm um períododeterminante de cultivo em cultura. Ao contrário, as raízes pilosas da sojageradas infectando-se cotilédones de soja com A. rhizogenes exibem25 crescimento indeterminado em cultura de tecido fornecendo um explante deraiz de alternativo a normal para a propagação monoxênica e estudo denematóide cístico de soja (Cho et ai., (1998) Plant Sei. 138, 53-65). O A.rhizogenes pode transferir o T-DNA de vetores binários em trans, permitindodeste modo a produção de raízes pilosas transgênicas contendo genesestranhos inseridos no plasmídeo de T-DNA. Este método foi usado paraproduzir raízes transgênicas em diversas espécies vegetais (Christey, (1997)Doran, Ρ. M. (ed) Hairy roots: culture and application, Harwood, Amsterdam,pp. 99-111). As raízes pilosas transgênicas podem ser depois usadas paraestudar o efeito da expressão de transgene em qualquer fenótipo dado.

No presente exemplo, vetores binários pAW134qcz,pAW219qcz e pAW223qcz foram transformados em A. rhizogenes cepa K599pela eletroporação (Cho et al., supra). O Agrobacterium transformado foiusado para induzir a formação de raiz pilosa da soja usando o seguinteprotocolo. Aproximadamente cinco dias antes da inoculação de A. rhizogenes,as sementes de soja cultivar Williams 82 (suscetíveis ao SCN) foramesterilizadas com 10 % de alvejante por 10 minutos e germinadas em 1 % deágar a 25 0C com iluminação de 16 horas/dia. Aproximadamente três diasantes da inoculação com A. rhizogenes, um estoque congelado de A.rhizogenes Cepa K599 contendo o vetor binário foi riscado em placas de LB+ canamicina (50 μg/ml) e incubadas a 28 0C no escuro. Aproximadamenteum dia antes da inoculação com A. rhizogenes, uma colônia foi escolhida daplaca e inoculada em LB + canamicina líquidos (50 μg/ml). A cultura foiagitada a 28 0C por aproximadamente 16 horas. A concentração de A.rhizogenes na cultura líquida foi ajustada até OD6oo = 1A

Os cotilédones foram excisados das mudas de soja e o ladoadaxial foi ferido diversas vezes com um bisturi. 15 μΐ de suspensão de A.rhizogenes foram inoculados na superfície ferida e o cotilédone foi colocadocom o lado adaxial para cima em uma placa com ágar a 1 % por 3 dias a 250C sob iluminação de 16 horas/dia. Os cotilédones foram depois transferidossobre placas de MS contendo 500 μ^πύ de Carbenicilina (para suprimir A.rhizogenes) e 1 μΜ de ARSENAL. Depois de cultivar os cotilédones no meiode seleção por 2 semanas, as raízes pilosas foram induzidas a partir do sítio deferimento. As raízes resistentes ao ARSENAL e que cresceram no meio deseleção foram colhidas e transferidas sobre meio de seleção fresco da mesmacomposição e incubadas a 25 0C no escuro. Duas semanas depois de colher asraízes pilosas e cultivá-las em meio de seleção, as raízes pilosas foramsubcultivadas em meio MS contendo Carbenicilina 500 mas não ARSENAL.

Exemplo 4: Detecção da atividade de promotor em raízes pilosas da soja

Como apresentado no Exemplo 3, os promotores da invençãoforam colocados em associação operativa com o gene repórter GUS paradeterminar a sua atividade de expressão. A atividade de β-glicuronidase dogene GUS pode ser detectada em planta por meio de uma substânciacromogênica tal como ácido 5-bromo-4-cloro-3-indoil-6-D-glicurônico (x-Gluc) em uma reação de tingimento de atividade (Jefferson, supra).

Para estudar a atividade do promotor das SEQ ID NOs :1 a 3 napresença e ausência de infecção por nematóide, diversas linhagenstransgênicas independentes foram geradas da transformação compAW134qcz, pAW219qcz e pAW223qcz. Aproximadamente três semanasdepois do subcultivo, as linhagens de raiz pilosa transgênicas em MS, foraminoculadas com J2 descontaminado na superfície de SCN linhagem 3 ao nívelde 2000 J2/placa. Em 7 e 12 dias depois da inoculação (DAI), as raízes foramcolhidas pela remoção das placas de ágar e suavemente enxaguadas commudanças na água e tingidas em solução de tingimento de GUS contendo X-Gluc (2 mg/l) a 37 0C por 16 horas. Em cada ponto de tempo depois dainoculação, uma placa de controle não inoculada de cada linhagem tambémfoi tingida em solução de tingimento de GUS. Depois do tingimento comGUS, as raízes foram tingidas em ácido fuchsínico e depois distinguido paravisualizar os nematóides, que foram tingidos de vermelho. As raízes foramdepois observadas sob um microscópio para a detecção da expressão de GUS.

Para cada linhagem transgênica, 10 sincícios aleatoriamenteescolhidos foram observados e contados quanto a intensidade da expressão deGUS em 7 e 12 dias depois da infecção (DAI). O seguinte índice de contagemfoi usado: "-" para nenhum tingimento de GUS5 "+" para tingimento de GUSfraco e "++" para tingimento de GUS forte. Uma média arredondada das 10contagens foi usada para determinar o nível de expressão de GUS nossincícios para esta linhagem. Além disso, o nível de expressão de GUS nasmesmas linhagens para outros tecidos de raiz tais como calo, ponta de raiz,vasculatura, cortical e primordial também foram registrados usando o mesmoíndice de contagem de GUS de "-", "+" e "++". Os resultados para aslinhagens transformadas com pAW134qcz, pAW219qcz e pAW223qcz sãoapresentados na Figura 9.

De modo a definir mais precisamente a região promotora deAtlg21890 (SEQ ID NO:1), fragmentos mais curtos da seqüência a montanteforam testados. Ambas as seqüências de aproximadamente 1000 pares de basee 500 pares de base foram capazes de conferir a expressão induzida emnematóide nos sincícios, indicando que todos dos elementos regulatóriosrequeridos são encontrados dentro da região de 500 pares de base a montantedo códon de partida. Estes resultados são compatíveis com os resultados daanálise de promotor usando Genomatix apresentado no Exemplo 6.

Os resultados do tingimento GUS indica que para a maioriadas linhagens testadas, o fragmento de promotor em pAW134 mostrou aexpressão de GUS de intermediária a forte nos sincícios em 7 DAI e 12 DAI.Ao contrário, a expressão de GUS em outras partes da raiz tais como pontasde raiz e córtex de raiz não foi detectada ou muito fraca. Houve, entretanto,alguma expressão do promotor no tecido vascular nas amostras tantoinoculadas com nematóide quanto não inoculadas de controle.

Exemplo 5: Análise PLACE de promotores

Os resultados de análise PLACE indicam uma caixa TATAlocalizada do par de base 1854 até o par de base 1860 da SEQ ID NO:l comomostrado na Figura 1. Em conseqüência, a região não traduzida 5' começa emtorno do par de base 1887. O website TAIR também prognostica o começo daregião não traduzida 5' no par de base 1887. A seqüência descrita pela SEQID NO:l termina em 0 par de base antes do códon de início ATG. A região denúcleo potencial do promotor descrito pela SEQ ID NO:l é das bases 1554 a 1887.

Os resultados da análise de PLACE indicam uma caixa TATAlocalizada do par de base 1869 ao par de base 1875 da SEQ ID N0:2 comomostrado na Figura 2. Em conseqüência, a região não traduzida 5' começa emtorno do par de base 1902. O website TAIR prognostica o começo da regiãonão traduzida 5' no par de base 1766. A seqüência descrita pela SEQ ID NO:2termina 0 par de base antes do códon de início ATG. A região de núcleopotencial do promotor descrito pela SEQ ID NO:2 é das bases 1569 a 1902.

Os resultados de PLACE indicam uma caixa TATA localizadado par de base 664 ao par de base 670 da SEQ ID NO: 3 como mostrado naFigura 3. Em conseqüência, a região não traduzida 5' começa em torno do parde base 697. A região de núcleo potencial do promotor descrito pela SEQ IDNO: 3 é das bases 364 a 697.

Exemplo 6. Identificação de Configuração de Promotor 1, Configuração dePromotor 2 e Configuração de Promotor 3

Genomatix é uma aplicação de software de análise deseqüência de promotor contendo os algoritmos DiAlign e FrameWorker(Genomatrix, Munich, Alemanha). DiAlign é uma ferramenta de alinhamentode seqüência múltipla e FrameWorker pode escanear um conjunto deseqüências de DNA quanto a sítios de ligação de fator de transcriçãocorrelacionados com a orientação e distância (classes de elemento promotor).

Os 650 pares de base a 3' da SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2 eSEQ ID NO: 3 foram usados para as duas análises Genomatix descritasacima. Isto corresponde às bases de 1318 a 1967 da SEQ ID NO:l, bases1298 a 1947 da SEQ ID NO:2 e bases 142 a 791 da SEQ ID NO: 3.Para determinar se houve homologia de seqüência entre asbases de 1318 a 1967 da SEQ ID NO:l, bases de 1298 a 1947 da SEQ IDNO:2 e bases de 142 a 791 da SEQ ID NO: 3 o programa Genomatix DiAlignfoi usado. O resultado desta análise é mostrado na Figura 14. Esta análisemostra que as bases de 1318 a 1967 da SEQ ID NO:l é mais similar às basesde 142 a 791 da SEQ ID NO: 3 (24 % de identidade de seqüência). Por causadisto, as bases de 1318 a 1967 da SEQ ID NO:l foram comparadas com asbases de 142 a 791 da SEQ ID NO: 3 usando o algoritmo GenomatixFrameWorker para determinar uma configuração comum de classes deelemento promotor de planta usando os parâmetros padrão. Os modelos deConfiguração de Promotor Múltipla foram identificados nesta análise.

Uma análise adicional foi feita expandindo a distância entreelementos promotores de 50 pares de base (padrão) para 60 pares de base.Esta segunda análise também produziu modelos de Configuração de Promotormúltipla. A Configuração de Promotor I5 Configuração de Promotor 2 eConfiguração de Promotor 3 foram geradas que compreendem 3, 5 e 6elementos promotores, respectivamente, como resumido na Figura 10. Omodelo contendo três classes de elemento promotor foi designadoConfiguração de Promotor 1. O modelo contendo cinco classes de elementopromotor foi designado Configuração de Promotor 2. O modelo contendo seisclasses de elemento promotor foi designado Configuração de Promotor 3. Aslocalizações de classes de elemento promotor contidas nas seqüênciaspromotoras da SEQ ID NO:l e SEQ ID NO: 3 são mostradas na Figura 1 eFigura 3, respectivamente. Além disso, a Figura 15 mostra a orientaçãoespacial comum das classes de elemento promotor em todas as trêsConfigurações de Promotor.

Exemplo 7: Deleções de clonagem de promotor Atlg21890 (SEQ ID NO:l)

De modo a definir ainda mais a região promotora deAtlg21890 (SEQ ID NO:l), um total de oito construções contendofragmentos de deleção de promotor de promotor Atl g21890 local de A.thaliana (SEQ ID NO:l) foram geradas. Todas as construções de deleção depromotor estão contidas na mesma cadeia principal de vetor comopAW134qcz mostrado na Figura 6. Os resultados destas construções foramusados para determinar se os elementos descritos na Configuração dePromotor 1, Configuração de Promotor 2 e Configuração de Promotor 3 (VerFigura 15) são necessários para direcionar a expressão no sítio de alimentaçãode SCN. Uma vista geral de construções de deleção de promotor é descrita naFigura 16. Um fragmento de promotor de 650 pares de base contendo as basesde 1318 a 1967 de promotor Atlg21890 local de A. thaliana (SEQ ID NO:l)contendo os elementos promotores de 1 até 11 descritos na Figura 15 foigerado e é representado pela construção RTJ137. Esta região promotora foiusada para gerar as configurações de promotor descritas na Figura 15 usandoo software Genomatix. Um fragmento de promotor de 635 pares de baseincluindo as bases de 1318 a 1637 e as bases de 1653 a 1967 contendo oselementos promotores I5 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10 e 11 de promotor Atlg21890local de A. thaliana (SEQ ID NO:l) foi gerado e é representado pelaconstrução RTJ141. Um fragmento promotor de 629 pares de base incluindoas bases de 1318 a 1713 e as bases 1735 a 1967 contendo os elementospromotores 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 de promotor Atlg21890 local de A.thaliana (SEQ ID NO:l) foi gerado e é representado pela construção RTJ142.Um fragmento de promotor de 442 pares de base incluindo as bases de 1526 a1967 de promotor Atlg21890 local de A. thaliana (SEQ ID NO:l) e contendoelementos promotores 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 descritos na Figura 15 foigerado e é representado pela construção pAW329. Um fragmento depromotor de 412 pares de base incluindo bases de 1556 a 1967 de promotorAtlg21890 local de A. thaliana (SEQ ID NO:l) e contendo elementospromotores 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 é representado pela construção RTJ133.Um fragmento de promotor de 365 pares de base incluindo as bases de 1603 a1967 de promotor Atlg21890 local de A. thaliana (SEQ ID NO:l) e contendoelementos promotores 1, 2, 3, 8, 9, 10 e 11 é representado pela construçãoRTJ134. Um fragmento de promotor de 315 pares de base incluindo as basesde 1653 a 1967 de promotor Atlg21890 local de A. thaliana (SEQ ID NO:l)e contendo elementos promotores 1, 2, 3, 9, 10 e 11 é representado pelaconstrução RTJl35. Um fragmento de promotor de 258 pares de baseincluindo as bases de 1710 a 1967 de promotor Atl g21890 local de A.thaliana (SEQ ID NO:l) e contendo os elementos promotores 1, 2, 3, 10 e 11é representado pela construção RTJ136. Em resumo, dois fragmentos dedeleção de promotor contidos nas construções RTJ141 e RTJ142 foramderivados pela remoção de um único elemento em cada uma das construçõespara determinar se cada elemento é necessário para a atividade de promotorno sítio de alimentação de SCN. Seis construções de deleção de promotor(RTJ137, pAW329, RTJ133, RTJ134, RTJ135 e RTJ136) foram derivadaspela geração de truncagens 5' de promotor Atlg21890 local de A. thaliana(SEQ ID NO:l) como descrito.

A síntese de DNA foi utilizada para gerar os dois fragmentosde deleção de promotor contidos nas RTJ141 e RTJ142. Os fragmentos dedeleção de promotor são idênticos a RTJ137 exceto que eles perderam umúnico elemento promotor como descrito acima. PstI e AscI foramintroduzidos nos fragmentos de síntese para a facilidade de clonagem.

Para gerar as seis truncagens 5' de promotor Atlg21890 localde A. thaliana (SEQ ID NO:l) o DNA plasmídico de pAW134qcz foiextraído da E. coli usando o Qiagen Plasmid miniprep kit (Qiagen). Osfragmentos de deleção de promotor do promotor Atl g21890 local de A.thaliana (SEQ ID NO:l) contidos no pAW134qcz foram amplificados usandoo protocolo de amplificação pela PCR padrão. Para isto, aproximadamente 0,1μg de DNA plasmídico pAW134qcz (descrito na Figura 6) foi usado como opadrão de DNA na reação de PCR. Os iniciadores usados para a amplificaçãopela PCR das seqüências promotoras de Arabidopsis são mostrados na Figura11 e foram designados com base na seqüência promotora do promotorAtlg21890 local de A. thaliana (SEQ ID NO:l) contida no pAW134qcz. Asseqüências iniciadoras descritas pela SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33 contêm osítio de restrição PstI para a facilidade de clonagem. A seqüência iniciadoradescrita pela SEQ ID NO: 34 recoze a jusante do sítio AscI em pAW134qcztal que o sítio AscI estará contido no fragmento amplificado para a facilidadede clonagem. As seqüências iniciadoras descritas pelas SEQ ID NO:28 e SEQID NO: 34 foram usadas para amplificar a região de deleção de promotor de650 pares de base do promotor Atlg21890 local de Arabidopsis contida nopAW134qcz usada para gerar RTJ137. As seqüências iniciadoras descritaspelas SEQ ID NO:29 e SEQ ID NO: 34 foram usadas para amplificar a regiãode deleção de promotor de 442 pares de base de promotor Atl g21890 local deArabidopsis contida no pAW134qcz usados para gerar pAW329. Asseqüências iniciadoras descritas pela SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 34 foramusadas para amplificar a região de deleção de promotor de 412 pares de basedo promotor Atlg21890 local de Arabidopsis contida no pAW134qcz usadapara gerar RTJ133. As seqüências iniciadoras descritas pelas SEQ ID NO: 31e SEQ ID NO: 34 foram usadas para amplificar a região de deleção depromotor de 365 pares de base do promotor Atlg21890 local de Arabidopsiscontida no pAW134qcz usada para gerar RTJ134. As seqüências iniciadorasdescritas pelas SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 34 foram usadas paraamplificar a região de deleção de promotor de 315 pares de base do promotorAtlg21890 local de Arabidopsis contida no pAW134qcz usada para gerarRTJl35. As seqüências iniciadoras descritas pela SEQ ID NO: 33 e SEQ IDNO: 34 foram usadas para amplificar a região de deleção de promotor de 258pares de base do promotor Atl g21890 local de Arabidopsis contida nopAW134qcz usada para gerar RTJ 136.A mistura de reação de amplificação conteve o seguinte:2,5 μlde tampão 10X Pfu Turbo; 0,5 μl de Pfu Turbo DNA polimerase; 0,5 μldNTPs a 10 mM; 0,5 μl de iniciador A a 10 μΜ; 0,5 μl de iniciador B a 10μΜ; 1,0 μl de DNA plasmídico pAW134qcz (aproximadamente 100 ng);

19,50 μl de água. Termociclador: T3 Thermociclor Biometra, Alemanha foiusado para a amplificação usando o seguinte ajuste: 1 ciclo com 60 segundos a94 °C; 32 ciclos com 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 52°C e 120segundos a 72°C; 1 ciclo com 300 segundos a 72 °C.

O tamanho do fragmento de DNA amplificado para cadaproduto de PCR foi verificado pela eletroforese em gel de agarose padrão e oDNA extraído do gel pelo Kit de Extração em Gel Qiagen (Qiagen, Hilden,Alemanha). Os fragmentos purificados foram digeridos com PstI e AscIseguindo as instruções do fabricante (New England Biolabs). Os fragmentosdigeridos foram purificados usando o kit de purificação pela PCR Qiagen(Qiagen). A região de deleção de promotor de 650 pares de base do promotorAtlg21890 amplificada usando os iniciadores SEQ ID NO:28 e SEQ ID NO:34 é representada pelas bases de 1318 a 1967 da SEQ ID NO:l. a região dedeleção de promotor de 442 pares de base do promotor Atl g21890amplificada usando os iniciadores SEQ ID NO:29 e SEQ ID NO: 34 érepresentada pelas bases de 1526 a 1967 da SEQ ID NO:l. a região dedeleção de promotor de 412 pares de base do promotor Atlg21890amplificada usando os iniciadores SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 34 érepresentada pelas bases de 1556 a 1967 da SEQ ID NO:l. a região dedeleção de promotor de 365 pares de base do promotor Atlg21890amplificada usando os iniciadores SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 34 érepresentada pelas bases de 1603 a 1967 da SEQ ID NO:l. A região dedeleção de promotor de 315 pares de base do promotor Atl g21890amplificada usando os iniciadores SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 34 érepresentada pelas bases de 1653 a 1967 da SEQ ID NO:l. a região dedeleção de promotor de 258 pares de base do promotor Atlg21890amplificada usando os iniciadores SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34 érepresentada pelas bases de 1710 a 1967 da SEQ ID NO:l. Os sítios derestrição introduzidos nos iniciadores para facilitar a clonagem não sãoincluídos nas seqüências designadas.

Exemplo 8: Deleções do promotor Atlg21890 de construção de vetor bináriopara a transformação e geração de raízes pilosas transgênicas

Para avaliar a atividade de expressão das deleções de promotorclonado derivado de pAW134qcz, fragmentos de gene correspondendo aosnucleotídeos de 1318 a 1967, de 1526 a 1967, de 1556 a 1967, de 1603 a1967, de 1653 a 1967 e de 1710 a 1967 da SEQ ID NO:l foram clonados amontante de um gene repórter GUS (β-glicuronidase bacteriana ou gene GUS(Jefferson (1987) EMBO J. 6, 3901-3907) para criar os vetores bináriosRTJ137, pAW329, RTJ133, RTJ134, RTJ135, RTJ136, respectivamente. Paraavaliar a atividade de expressão das deleções de promotor clonado derivadode pAW134qcz, o fragmento de gene sintetizado correspondendo aosnucleotídeos de 1318 a 1637 e bases de 1653 a 1967 da SEQ ID NO:l foiclonado a montante de um gene repórter GUS de β-glicuronidase ou geneGUS (Jefferson (1987) EMBO J. 6, 3901-3907) para criar o vetor binárioRTJ141. Para avaliar a atividade de expressão das deleções de promotorclonado derivado de pAW134qcz, o fragmento de gene sintetizadocorrespondendo aos nucleotídeos de 1318 a 1713 e bases de 1735 a 1967 daSEQ ID NO:l foi clonado a montante de um gene repórter GUS (β-glicuronidase bacteriana ou gene GUS (Jefferson (1987) EMBO J. 6, 3901-3907) para criar o vetor binário RTJ142. O marcador de seleção de planta nosvetores binários foi um gene AHAS mutado de A. thaliana que conferiutolerância ao herbicida ARSENAL (imazapyr, BASF Corporation, FlorhamPark, NJ). O marcador selecionável de AHAS mutado foi direcionado pelopromotor AHAS de Arabidopsis.O nematóide cístico da soja pode ser propagado em explantesde raiz de soja normais. Entretanto, esta técnica requer o estabelecimentocontínuo de explantes de raiz porque estes órgãos têm um períododeterminante de crescimento em cultura. Ao contrário, as raízes pilosas dasoja geradas pela infecção de cotilédones de soja com A. rhizogenes exibemcrescimento indeterminado em cultura de tecido fornecendo uma alternativapara os explantes de raiz normal para a propagação monoxênica e estudo denematóide cístico da soja (Cho et ai, (1998) Plant Sei. 138, 53-65). O A.rhizogenes pode transferir o T-DNA de vetores binários em trans, permitindodeste modo a produção de raízes pilosas transgênicas contendo genesestranhos inseridos no plasmídeo de T-DNA. Este método foi usado paraproduzir raízes transgênicas em diversas espécies vegetais (Christey, (1997)Doran, Ρ. M. (ed) Hairy Roots: culture and application, Harwood,Amsterdam, pp. 99-111). As raízes pilosas transgênicas podem ser depoisusadas para estudar o efeito da expressão de transgene em qualquer fenótipodado.

No presente exemplo, os vetores binários RTJ137, pAW329,RTJ133, RTJ134, RTJ135, RTJ136, RTJ141 e RTJ142 foram transformadosem A. rhizogenes cepa K599 pela eletroporação (Cho et al, supra). AAgrobacterium transformada foi usada para induzir a formação de raiz pilosana soja usando o seguinte protocolo. Aproximadamente cinco dias antes dainoculação com A. rhizogenes, sementes de soja cultivar Williams 82(suscetíveis a SCN) foram esterilizadas com 10 % de alvejante por 10 minutose germinadas em ágar a 1 % a 25 0C com iluminação de 16 horas/dia.

Aproximadamente três dias antes da inoculação com A. rhizogenes, umestoque congelado de A. rhizogenes Cepa K599 contendo o vetor binário foiriscado em placas de LB + canamicina (50 μg/ml) e incubado a 28 0C noescuro. Aproximadamente um dia antes da inoculação com A. rhizogenes,uma colônia foi escolhida da placa e inoculada em LB + canamicina líquida(50 μ§/πι1). A cultura foi agitada a 28 0C por aproximadamente 16 horas. Aconcentração de A. rhizogenes na cultura líquida foi ajustada na OD6oo = 1A

Os cotilédones foram excisados das mudas de soja e o ladoadaxial foi ferido diversas vezes com um bisturi. 15 μΐ de suspensão de A.rhizogenes foram inoculados na superfície ferida e o cotilédone foi colocadocom o lado adaxial para cima em uma placa de ágar a 1 % por 3 dias a 25 0Csob iluminação de 16 horas/dia. Os cotilédones foram depois transferidossobre placas MS contendo 500 μ§/πι\ de Carbenicilina (para suprimir A.rhizogenes) e 1 μΜ de ARSENAL. Depois de cultivar os cotilédones em meiode seleção por 2 semanas, raízes pilosas foram induzidas a partir do local deferimento. As raízes resistentes ao ARSENAL e cultivadas no meio deseleção foram colhidas e transferidas sobre meio de seleção fresco da mesmacomposição e incubadas a 25 0C no escuro. Duas semanas depois de colher asraízes pilosas e cultivá-las em meio de seleção, as raízes pilosas foramsubcultivadas em meio MS contendo Carbenicilina 500 μ^/πά mas nãoARSENAL.

Exemplo 9: Detecção da atividade de deleção de promotor em raízes pilosasda soja

Como apresentado no Exemplo 8, os promotores da invençãoforam colocados em associação operativa com o gene repórter GUS paradeterminar a sua atividade de expressão. A atividade de β-glicuronidase dogene GUS pode ser detectada na planta por meio de uma substânciacromogênica tal como o ácido 5-bromo-4-cloro-3-indoil-R-D-glicurônico (x-Gluc) em uma reação de tingimento de atividade (Jefferson, supra).

Para estudar a atividade de deleção de promotor da SEQ IDNO:l na presença e ausência de infecção por nematóide, diversas linhagenstransgênicas independentes foram geradas a partir da transformação compAW134qcz, RTJ137, pAW329, RTJ133, RTJ134, RTJ135, RTJ136, RTJ141e RTJ142. Aproximadamente três semanas depois de subcultivar, as linhas deraiz pilosa transgênica em MS, foram inoculadas com J2 descontaminado nasuperfície de SCN raça 3 ao nível de 2000 J2/placa. Em 12 dias depois dainoculação (DAI), as raízes foram colhidas pela remoção das placas de ágar esuavemente enxaguadas com mudanças na água e tingidas em solução detingimento de GUS contendo X-Gluc (2 mg/l) a 37°C por 16 horas. Em cadaponto de tempo depois da inoculação, uma placa de controle não inoculada decada linhagem também foi tingida em solução de tingimento de GUS. Asraízes foram depois observadas sob um microscópio para a detecção daexpressão de GUS.

Para cada linhagem transgênica, 10 sincícios aleatoriamenteescolhidos foram observados e contados quanto a intensidade de expressão deGUS em 12 Dias depois da infecção (DAI). O seguinte índice de contagem foiusado: "-" para nenhum tingimento, "+" para tingimento fraco, "++" paratingimento forte. O seguinte índice de contagem foi usados: "-"para nenhumtingimento, "+" para tingimento fraco, "++" para tingimento forte. Também,"+/-" indica que 1 linhagem das 12 mostraram tingimento de GUS no sítio dealimentação em menos do que ou igual a 7 dos 10 sítios de alimentaçãoobservados. Porque apenas 1 linhagem mostrou atividade no sítio dealimentação, a contagem não é compatível com um padrão de expressãopositivo verdadeiro e pode ser o resultado de um efeito posicionai. Umamédia arredondada das 10 contagens foi usada para determinar o nível deexpressão de GUS nos sincícios para cada linhagem.

Além disso, o nível de expressão de GUS nas mesmaslinhagens para outros tecidos de raiz tais como calo, ponta de raiz,vasculatura, cortical e primordial também foi conduzido para as linhagenstransformadas com pAW134qcz, RTJ137, pAW329, RTJ133, RTJ134,RTJ135, RTJ136, RTJ141 e RTJ142. Em todas as construções de deleção depromotor a expressão nos tecidos da ponta de raiz, vasculares e corticaisforam compatíveis com o promotor de "tamanho natural" contido nopAW134qcz e representado pela SEQ ID NO:l.

Com respeito à expressão de sincícios, as seqüênciaspromotoras com 650, 442 e 412 pares de base contidas no RTJ137, pAW329e RTJl33, respectivamente, foram capazes de conferir a expressão induzidapor nematóide em sincícios comparáveis com o promotor de 1967 pares debase contido no pAW134qcz. Isto indica que todos os elementos reguladoresrequeridos são encontrados dentro do promotor de 412 pares de base contidono RTJ133 incluindo os elementos promotores 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 comodescrito na Figura 16. Em particular, as seqüências promotoras de 635 e 639pares de base contidas no RTJ141 e RTJ142, respectivamente, não foramcapazes de conferir a expressão induzida por nematóide em sincícios,indicando que o elemento promotor 8 e elemento promotor 1 são necessáriospara a expressão induzida por SCN no sítio de alimentação. Além disso, asseqüências promotoras de 365, 315 e 258 pares de base contidas no RTJ134,RTJl35 e RTJl36, respectivamente, não mostraram nenhuma expressão nosítio de alimentação (RTJ134) ou expressão muito reduzida no sítio dealimentação (RTJ135 e RTJ136) comparadas com o promotor de 412 pares debase totalmente funcional contido no RTJ133. Estes resultados indicam que oelemento promotor 6 é necessário para a atividade de promotor. Em resumo,estes resultados indicam que a análise de Genomatix apresentada no Exemplo6 identificou elementos múltiplos necessários para este promotor direcionar atranscrição induzida por nematóide no sítio de alimentação.LISTAGEM DR SEQÜÊNCIAS

<110> BASF Plant Science GmbH

<120> PROMOTORES DE GENE EXPORTADOR DE METABÓLITO DE PLANTA<130> PF57655 (15140)

<150> 60/743341<151> 2006-02-23

<160> 34

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 1967

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana<220>

<221> promotor

<222> (1) .· (1887)

<4 00> 1 4. 4. 4. 4-4-

cagacaaaga attattggaa aacaatgaga atttttgacg gtggtttgtt ataatgtatt

attaaataac atgàtaatgg aaattacttt gttttagtta aaggaaaatt aatttgttgt

ttaataaact agtggtaggt aggaatagtt aaaatgtaag tatcaaagtt ttttgaattt

aagattaaga ttctcgaaat tcagttatta gcatacaaat gacataaatt atgaaaaaat

aaattaaaat aatgtcatac agatccagat gaaaatgtat aatgtatata catttgataa

aaatgaaaat gtattttcgg gttctcagtt tgttttgtga aatatcaata cacaatgtta

aaaaagaatc ggcttctttc agcttatgat attcattaat tttccacaca ccatttttca

aagggaaata gcaaaaaaaa ttaaaattaa aacagccagc taaattaatc agtgaaatca

tccaaactgt tttacaaaga cattttttcg gccaaatcaa ataaaaaaat cgattgttat

tgacagtctt tgtgatctta ttggttacgt tatacccacc tgtgcactcc acttttaagt

actacttcgt ctctaaatat ggtacggact aacttgaaat tagcctattg atttgcttag

aaattgataa atctttggac gagatggtgt ccactcttta aatcaccaca atgtccccta

tctattttcc gcgacaagat gaataagaat atgcactaaa cttaaccatc attcgcttat

acactatatt tattaaatca gctttctcat cgcctaaaat tcaatatttt tgggtccatt

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601201802403003604204805406006607207808409009601020ttgatgctgc aaaaaggata attatcaccc acgtacatta ctcatatgaa tataaaaggt 1080gcataatttt tttttttttt tttgtaatgt tttatgtata tacacatata gtataccaat 1140 tttttaacaa aacaaattac atatagataa caaagaggtg aatagtttcg atcgtgaata 1200ttcaggttga tactaattag ttctcctttt gtagattcga caagtgtgat gagtggataa 1260aaaaatggat gacgtcttga gtggattgta catatacaaa tagataatgt aagtgcatgc 1320tttttgattc ttcgaaacta tttggttata actttcggat atacttataa caaaaaaaaa 1380aacctttcgg atatacatgg ttcggcttgg acgtacaggt ctatataata atttgatata 1440tattggtaca tttcatttat atactcttta ttggtacgat acattttgat tcgttatcaa 1500tatattaata ccacattgac gagaacattc tcattagtga tcgtagatta ataatctagc 1560catcttaata agcaaaatat ataatccaaa aaatgcgaca ttattttaca tacgcaagtg 1620ttcacaacca atagtccaat atataaatta attaagtagg tatgtaatat aaccaaggaa 1680attacgatct aatccagttt tgattaccta gaacaagacc atagttagcc acacataatg 1740gatacgtgct tgacaacaat taaaaaccta tatttttaaa agtgatgctt aaatagccaa 1800 tggattgaaa tgtgcactcg catatattgc tttttgtgtc agcacaattt ggctatataa 1860gcaagtactc tcttgtagta atcattcaca gtcataacta attaagtaca tttgaataca 1920tcaaatacca agaaagagaa atttagagag aaagagaaag agataaa 1967

<210> 2<211> 1947<212> DNA<213> Arabidopsis thaliana

<220><221> promotor<222> (1)..(1902)<400> 2

cactaatata agacatggca cgtttgcatt atgcttccta tattaccgac taaattagtg 60attgtcacaa gtagccgaca acttttggac ttaattagca acagacttat tgcttcagta 120agaaaccaac agataagcga tgggcataaa tggtatgtgg ctttttcatc ctgttttcat 180gttttgaacg tcaagaaaaa aaattaataa gggatttttg aatccatccc gtacgtttta 240tatttataaa tagtttagat aaaccttaat tcctcaacta aatactagtt tcttggcatc 300ttataaagaa actatatgca tttttatccc taataatata gtctgtagcg tatttgcctc 360catatattat cgccatatta tcatagactg catctcattt agggcgaatg taatcatagt 420ttttgtaaag aattgaacta cctcttcgcc ttttttttta tataagacaa ttctttagtt 480tctatctatg gtttaatttg tattttgacg tgtatggtac taattaagat tatgctatgt 540tttgagtttt agttgaataa aatttaattt gtaataattc taaaacaata aaaagtttag 600tgtaattttt tttaactaga acggattaag agttaggact gatgttagaa tcgcagttttttttttatgg aatgacgtaa aagaattctt taataatctt acttggcaat attaaatggaacaacttaaa aggactagac aatattattg gcgtgatatc caaataatta cggtttaacaaagaataaaa tggggaaacc ctttggtata ttggttatct aagagttcat taatatttatatacattaag aggttagagt ttcgaggtca agatattatg tttatttaaa aatttgcagattaatagaga caagtgtgta ggagatctcc aacgatattc aattataacc gttcgtcagaattctacgca gatagaacgt cgttaggtca tagatcattg aaagtgtcta tcaaaagcatggagattaaa aaagaaaaaa gatttggaga aagaagtgac ttttgtcctg gatctattaagagtcgaaag aaatcgtccg ttatacaatc gtgtatataa caattctcat aatttacaatttataatacc gaaaaaatat aaaacaaaaa aaaaatattt taaatagaac gaatcagcctcaacaaaaac cttttttgaa aatggaaaag cttaggctgc tttaacacgc ccaatctcacacatacatat tctctgtttt cttctttcct ttttgtaaaa gggtttgcta attctctgctttgttttttt tttgtttatt aattctttac atttcctaca aagaaaaaga caagcatgaataactaacag cggttatact ggaaatccga agtcttttcc acgtgctttc tgatgaacatttaacataaa acgttcggac tcttcgtgac acttaaacca aacatacacg tacgtagctaacaatagacg tgtagatttt aggtttacgt gtttttcaag ttgggcaaga acaaaaaaaaagagagccta tgacgtgtgc aacaggataa tagtgttagc aaaagaaatc atcagagccattatatgata ttgtttgctt ttcaattcca tgaacgaacc cataccaatc caaaacagcaattatcatct ttctttattg aacaaacgta tctcattggt cgtgtcctaa taaataatta 1740tatttcatat acatgtatat actttatagt ttttgttttt ccttttgcta ctctacatgactctcgatcg agggaaaaaa ctagttctca tgtttatcca aaactctata tcacctttttgatgttttta tataagaaga cttgttcatc catactctft caataacctt gacagaaaaaaaaaataaac acaaaatttc aataacc

<210> 3

<211> 791

<212> DNA

<213> Glycine max

<220>

<221> promotor<222> (1)..(697)

660720780840900960102010801140120012601320138014401500156016201680

1800186019201947

<4 00> 3

ggttacagta ccaattctga aaaaacttaa tgtttagata aactttttta aaaaaaatactattcgactt gtttaaagtt aatgatatga aataaaattt tctatgaatt actttttgag

60120taaaaccata tatgtgtaca gcaaagtttg agaataattt atctcgatgg gaagaagaaaaaaatgaaag tatgaaataa gatggatgat tggataaact aaaagagatg aaaaaatatatatataaatt attacaaaaa aaaaaaatca tacaagaatg acattactga agcaaattcgctttcacatg aaaagtatgc agtgtaaaga tataaaagta aaccattatt tttgtcactaaaaaatggat acagaaaacc gaacattaaa acatgatcat tcattcacca ^^aaaa^aagatgatta atttaaataa aaaaatcata ttagataagt gatcaaaata ttagatagtataaattaatt cacgtaacat acacgcatta atcgcgcttc ttgaatgatt agtcagcaattaaaccgtgc taatttcttt tctcaccttc taatcttacc gctgccggga acgtgtaaattaagtagcat tgtaaagcag ctttttggat tataaatatt attaaatata ctcacgggttgggtataaat attaagatgg ccagcattgg tttcgcaggg agttgcagat aaacaaaatctagcaggagc aaattcactt ctaagataca catattaagt tcaccagaga gagagagagacattaatcaa g

<210> 4<211> 1435<212> DNA<213> Glycine max

<4 00> 4 . .

cacacaagca aattcacttc tctgttctga cacacatatt aagttcccga gaaagatcta

gagagtaatt aagatgggta cgtggttcac aaatgcaagg ccgtatctgc tgttagtggc

agttcaattt gggtctgctg gcatgttcat atttgcgatg gatgctataa agaagggtat

gagccattac gtgttcatcg tctatcgtaa tgccatcgcc tctgtatctc ttgctccctt

cgcatttgtt cttgaaagga aagttaggcc caagatgact ttccgggtat tttcagagat

tatggcactg gctttcttcg aaataatact ggaccagtgc ttcgccctct tgggcatgaa

attcacgtcg gcatctttcc tatctgctgt tatgaáctcc gctccctctg ttacttttgt

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agtgattggc acagtaataa catttggagg caccttgctt atggcactgt acaaaggacc

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agaaactggt aaccattggg tcatagggac attgttcctc ctcattggtt gtgctggctt

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180240300360420480540600660720780791

60120180240300360420480540600660720780840900960ctgcatcatc ttatctgaac aactcttcct 5 tggaagtatt attggagcaa tagttgtggt 1020tcttgggctt tatctagttg tgtggggaaa agctaaagaa cgtagaggtc tgatgacacc 1080gtcccctgca gaaaataact ttccagaaga ccaacgacag ctaccggtca cagctccaag 1140gaatgatagc attaacaata ataataaggc ttaattagtc catcgccatg atgaaaaaag 1200tgatgtggaa ggcacaatat atcaagaaga gaaagtcagc ----- 1260ggctttgttt aattagacat tgttgtagca ttccatacaa atgatctaag gtcaatgtca 1320tgcacattac taataccatg aaattggtgg gataagtggc atgacgattg atgaaattca 1380tcatatatat aattaattag tggtcacttt gagctgcaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1435<210> 5 <211> 871 <212> DNA <213> Glycine max <400> 5 ttcaaagctc tattgttgca atcttcgcag aacgccacca ccctcatgct tggtcccttg 60gttgggatac acgactcttt gctcctgctt acgcgggaat agttacatct ggagttcagt 120attacataca aggcatggtc tcaaaaatta tgggcccagt tattgtgact gcttttaatc 180ccctgcgtat gatcattgtt acggccttgg cctgcatcat cttatccgag caactcttcc 240ttggaagtat tattggagca gtagttgtgg ttcttgggct ttatctagtt gtgtggggaa 300aagctaaaga acgcagaggt attatgacac cgtcccctgc agaaaataac tttccggaag 360accaacgaca gctaccagtc atagctccaa ggaatgataa cattaatact aataaggctt 420aattagtcct tcgccatgtt gaaaaaactg atgtggaagg cacaatatat caagaagaga 480gagtcagtaa aatttaagta taggcctagg ctttgtttaa ttagacattg gtgtagcatt 540ccgtacaagt gatctcaggt caatgtcatg cacattacta ataccatgaa atgggtggga 600taagtggcat gacgattggt gaaattcatc atatatataa ttaattagtg atcaattaga 660gctgcatcat tgttcttgag ttgaatgaac taatgtgctt ccgagtcatc atagagtaat 720tatttacaca gttctgggct aatttgcttt catattccac ttttaagtat tccaattcag 780ggctataaaa aaaatgtatt ccatttaagc taaggttgga gattttaata caagtctaaa 840catatatttt tagcaaaaaa aaaaaaaaaa a 871

<210> 6

<211> 1263

<212> DNA

<213> Glycine max

<4 00> 6

actatagggc acgcgtggtc gacggcccgg gctggtatca taattttatt tatttatttatttatttttg tgtctccatt ctattgtaaa aatgaaataa tgtaaaacga gttttgttattttatggtta cagtaccaat tctgaaaaaa cttaatgttt agataaactt ttttaaaaaaaatactattc gacttgttta aagttaatga tatgaaataa aattttctat gaattactttttgagtaaaa ccatatatgt gtacagcaaa gtttgagaat aatttatctc gatgggaagaagaaaaaaat gaaagtatga aataagatgg atgattggat aaactaaaag agatgaaaaaatatatatat aaattattac aaaaaaaaaa aatcatacaa gaatgacatt actgaagcaaattcgctttc acatgaaaag tatgcagtgt aaagatataa aagtaaacca ttatttttgtcactaaaaaa tggatacaga aaaccgaaca ttaaaacatg atcattcatt caccattttaaaattaagat gattaattta aataaaaaaa tcatattaga taagtgatca aaatattagatagtataaat taattcacgt aacatacacg cattaatcgc gcttcttgaa tgattagtcagcaattaaac cgtgctaatt tcttttctca ccttctaatc ttaccgctgc cgggaacgtgtaaattaagt agcattgtaa agcagctttt tggattataa atattattaa atatactcacgggttgggta taaatattaa gatggccagc attggtttcg cagggagttg cagataaacaaaatctagca ggagcaaatt cacttctaag atacacatat taagttcacc agagagagagagagacatta atcaagatgg gtacgtggtt cacaaatgca aggccgtatc tgctgttagtggcggttcaa tttggctcag caggcatgtt catatttgcg atggatgcta taaagaagggtatgagccat tacgtgttca tcgtctatcg taatgccatc gcctctgtat ctcttgctcccttcgcattc gttttagaaa ggtctcttcc ccttacttct catccatgca tgcatatacatcaaagtgta tatatatgta tatatatata tattcacctc tattaaatta aattaaaagaaatactattg tttaattttg caggaaaatt aggcccaaga tgactttccg ggtattttcagag

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> iniciador oligo

<4 00> 7

ctgcagcaga caaagaatta ttggaaaaca atgag

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> iniciador oligo

<400> 8

180240300360420480540600660720780840900960102010801140120012601263

35ggcgcgcctt tatctctttc tctttctctc taaatttctc

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial

<22υ>

<223> iniciador oligo

<400> 9

ctgcagcact aatataagac atggcacgtt tg

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> iniciador oligo

<400> 10

ggcgcgccgg ttattgaaat tttgtgttta tttttttttt ctg

<210> 11<211> 31<212> DNA<213> artificial<220> <223> iniciador oligo<400> 11

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<210> 12<211> 29<212> DNA<213> artificial<220> <223> iniciador oligo<400> 12

ctctgaaaat acccggaaag tcatcttgg

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> iniciador oligo

<400> 13

gtaatacgac tcactatagg gc<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> iniciador oligo

actatagggc acgcgtggt

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> iniciador oligo

<4 00> 15

ctgcagggtt acagtaccaa ttctg

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> iniciador oligo

<400> 16

ggcgcgccct tgattaatgt ctctctctc

<210> 17

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência de consenso

<220>

<221> misc_feature

<223> w é a, ou t

<220>

<221> misc_feature

<223> r é a, ou g

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> η é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> η é a, c, g, ou t<400> 17

tnccawawwt rgnaa

<210> 18

<211> 14

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência de consenso

<220>

<221> misc_feature

<223> w é a, ou t

<220>

<221> misc_feature

<223> k é g, ou t

<220>

<221> misc_feature

<223> s é c, ou g

<220>

<221> misc_feature

<223> y é c, ou t

<220>

<221> misc_feature

<223> m é a, ou c

<220>

<221> misc_feature

<222> (12).. (12)

<223> η é a, c, g, ou t

<4 00> 18swsktatcca tnym

<210> 19

<211> 9

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência de consenso

<220>

<221> misc_feature

<223> w é a, ou t

<220>

<221> misc_feature

<222> (2).. (2)

<223> η é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_feature

<222> (8) .. (8)<223> η é a, c, g, ou t

<400> 19wnwaaagng

<210> 20

<211> 6

<2i2> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência de consenso

<4 00> 20ccacgt

<210> 21

<211> 6

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência de consenso

<4 00> 21ttaatg

<210> 22

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência de consenso<220>

<221> misc_feature

<223> w é a, ou t

<220>

<221> misc_feature

<223> y é c, ou t

<220>

<221> misc_feature

<223> s é c, ou g

<220>

<221> misc_feature

<223> m é a, ou c

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> η é a, c, g, ou t

<4 00> 22wncyaaaaat gsmaa<210> 23

<211> 8

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência de consenso

<4υ0> 23caattatt

<210> 24

<211> 13

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência de consenso

<220>

<221> misc_feature

<223> y é c, ou t

<220>

<221> misc_feature

<223> m é a, ou c

<220>

<221> misc_feature

<222> (2) .. (2)

<223> η é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> η é a, c, g, ou t

<400> 24ynmtataaat ana

<210> 25

<211> 11

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência de

consenso

<220>

<221> misc_feature<223> r é a, ou g

<400> 25gtaatgattr c

<210> 26<211> 6<212> DNA<213> artificial

<220>

<223> seqüência de consenso<220>

<221> misc_feature

<223> w é a, ou t

<400> 26waaagc

<210> 27

<211> 11

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência de consenso

<220>

<221> misc_feature

<223> r é a, ou g

<400> 27gtaatgattr c

<210> 28

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> iniciador oligo

<400> 28

ccaactgcag tgctttttga ttcttcgaaa c

<210> 29

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> iniciador oligo

<4 00> 29

atgcctgcag cattctcatt agtgatcgta g

<210> 30

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> iniciador oligo<400> 30

atgcctgcag ctagccatct taataagc

<210> 31<211> 31<212> DNA<213> artificial<220> <223> iniciador<400> 31

atgcctgcag attttacata cgcaagtgtt

<210> 32<211> 31<212> DNA<213> artificial<220> <223> iniciador<400> 32

atgcctgcag taagtaggta tgtaatataa

<210> 33<211> 29<212> DNA<213> artificial<220> <223> iniciador<4 00> 33

atgcctgcag agaacaagac catagttag

<210> 34

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> iniciador oligo

<400> 34

ggacgtaaca tgtcgac

Claims (26)

1. Ácido nucleico isolado de Configuração de Promotor 1,caracterizado pelo fato de que tem um filamento positivo e um filamentonegativo e compreende, em combinação e na ordem de 5' a 3', um elementoda classe P$MADS no filamento positivo, um elemento da classe P$MYBSno filamento negativo, e um elemento da classe P$DOFF no filamentopositivo.

2. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o elemento da classe P$MADS está dentro decerca de 50 nucleotídeos do elemento da classe P$MYBS, o elemento daclasse P$MYBS está dentro de cerca de 50 nucleotídeos do elemento daclasse P$DOFF e o elemento da classe P$MADS está dentro de cerca de 100nucleotídeos do elemento da classe P$DOFF.

3. Ácido nucleico isolado de Configuração de Promotor 2,caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico tem um filamento positivo eum filamento negativo e compreende, em combinação e na ordem de 5' a 3',um elemento da classe P$OPAQ no filamento positivo, um primeiro elementoda classe P$AHPB no filamento negativo, um elemento da classe PSMADSno filamento positivo, um segundo elemento da classe P$AHPB no filamentopositivo, e um elemento da classe P$TBPF no filamento positivo.

4. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que o elemento da classe P$OPAQ está dentro decerca de 60 nucleotídeos do primeiro elemento da classe P$AHPB, o primeiroelemento da classe P$AHPB está dentro de cerca de 60 nucleotídeos doelemento da classe P$MADS, o elemento da classe P$MADS está dentro decerca de 60 nucleotídeos do segundo elemento da classe P$AHPB, o segundoelemento da classe P$AHPB está dentro de cerca de 60 nucleotídeos doelemento da classe P$TBPF e o elemento da classe P$OPAQ está dentro decerca de 240 nucleotídeos do elemento da classe PSTBPF.

5. Ácido nucleico isolado de Configuração de Promotor 3,caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico tem um filamento positivo eum filamento negativo, e compreende, em combinação e na ordem de 5' a 3',um elemento da classe P$TBPF no filamento positivo, um primeiro elementoda classe P$AHPB no filamento positivo, um elemento da classe P$MADS nofilamento positivo, um primeiro elemento da classe P$DOFF no filamentopositivo, um segundo elemento da classe P$DOFF no filamento negativo eum segundo elemento da classe P$AHPB no filamento positivo.

6. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que o elemento da classe P$TBPF está dentro decerca de 60 nucleotídeos do primeiro elemento da classe P$AHPB, o primeiroelemento da classe P$AHPB está dentro de cerca de 60 nucleotídeos doelemento da classe P$MADS, o elemento da classe P$MADS está dentro decerca de 60 nucleotídeos do primeiro elemento da classe P$DOFF, o primeiroelemento da classe P$DOFF está dentro de cerca de 60 nucleotídeos dosegundo elemento da classe P$DOFF, o segundo elemento da classe P$DOFFestá dentro de cerca de 60 nucleotídeos do segundo elemento da classeP$AHPB e o elemento da classe P$TBPF está dentro de cerca de 300nucleotídeos do segundo elemento da classe P$AHPB.

7. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que oácido nucleico tem um filamento positivo e um filamento negativo ecompreende, em combinação e na ordem de 5' a 3' no mesmo filamento, umprimeiro elemento da classe P$MADS, um elemento da classe P$TBPF e umsegundo elemento da classe P$MADS.

8. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o primeiro elemento da classe P$MADS estádentro de cerca de 100 nucleotídeos do elemento da classe P$TBPF, oelemento da classe PSTBPF está dentro de cerca de 200 nucleotídeos dosegundo elemento da classe P$MADS e o primeiro elemento da classeP$MADS está dentro de cerca de 300 nucleotídeos do segundo elemento daclasse P$MADS.

9. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que oácido nucleico tem um filamento positivo e um filamento negativo ecompreende, em combinação e na ordem de 5' a 3', um primeiro elemento daclasse P$MADS no filamento positivo, um primeiro elemento da classeP$AHPB no filamento positivo, um elemento da classe PSTBPF no filamentopositivo, um segundo elemento da classe P$AHPB no filamento positivo, umsegundo elemento da classe P$MADS no filamento positivo, um elemento daclasse P$MYBS no filamento negativo, um primeiro elemento da classeP$DOFF no filamento positivo, um segundo elemento da classe P$DOFF nofilamento negativo e um terceiro elemento da classe P$AHPB no filamentopositivo.

10. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que cada elemento da classe está dentro de cerca de-60 nucleotídeos do seguinte elemento da classe na ordem de 5' a 3' e oprimeiro elemento da classe P$MADS está dentro de cerca de 500nucleotídeos do terceiro elemento da classe P$AHPB.

11. Promotor, caracterizado pelo fato de que compreende umácido nucleico isolado selecionado do grupo que consiste de- um ácido nucleico tendo uma seqüência como apresentada naSEQ ID NO: 1;- um ácido nucleico que hibridiza sob condições severas a umácido nucleico tendo uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO:l;- um ácido nucleico que compreende os nucleotídeos de 1554a 1887 de uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO:l;- um ácido nucleico que hibridiza sob condições severas a umácido nucleico que compreende os nucleotídeos de 1554 a 1887 de umaseqüência como apresentada na SEQ ID NO:l;- um ácido nucleico tendo uma seqüência como apresentada naSEQ ID NO:2;- um ácido nucleico que hibridiza sob condições severas a umácido nucleico tendo uma seqüência como apresentada na SEQID NO:2;- um ácido nucleico que compreende os nucleotídeos de 1569a 1902 de uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO:2;- um ácido nucleico que hibridiza sob condições severas a umácido nucleico que compreende os nucleotídeos de 1569 a 1902 de umaseqüência como apresentada na SEQ ID NO:2;- um ácido nucleico tendo uma seqüência como apresentada naSEQ ID NO: 3;- um ácido nucleico que hibridiza sob condições severas a umácido nucleico tendo uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO: 3;- um ácido nucleico que compreende os nucleotídeos de 364 a-697 de uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO: 3; e- um ácido nucleico que hibridiza sob condições severas a umácido nucleico que compreende os nucleotídeos de 364 a 697 de umaseqüência como apresentada na SEQ ID NO: 3.

12. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de quecompreende o ácido nucleico como definido em qualquer uma dasreivindicações 1, 3, 5, 7, 9 e 11.

13. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácidonucleico isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 3, 5, 7, 9e 11.

14. Célula vegetal, caracterizada pelo fato de que compreendeo ácido nucleico isolado como definido em qualquer uma das reivindicações-1,3, 5,7,9 e 11.

15. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de quecompreende o cassete de expressão como definido na reivindicação 12.

16. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 15,caracterizada pelo fato de que a planta é uma monocotiledônea.

17. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 15,caracterizada pelo fato de que a planta é uma dicotiledônea.

18. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 15,caracterizada pelo fato de que a planta é selecionada do grupo que consiste desoja, batata, tomate, amendoins, algodão, mandioca, café, coco, abacaxi,árvores cítricas, banana, milho, colza, beterraba, girassol, sorgo, trigo, aveia,centeio, cevada, arroz, feijão verde, feijão lima, ervilha e tabaco.

19. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 15,caracterizada pelo fato de que a planta é uma planta inteira, uma célulavegetal, uma parte de planta ou uma semente de planta.

20. Semente de planta, caracterizada pelo fato de ser produzidapela planta transgênica como definida na reivindicação 15, que compreende oácido nucleico isolado.

21. Método para controlar uma infestação de nematóideparasítico em plantas, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa decultivar as ditas plantas a partir da semente que compreende um cassete deexpressão que compreende um ácido nucleico isolado como definido emqualquer uma das reivindicações 1, 3, 5, 7, 9 e 11 em associação operativacom um ácido nucleico secundário que codifica um agente que interrompe ometabolismo, crescimento e/ou reprodução do dito nematóide parasítico deplanta, que confere ou melhora a resistência da planta ao dito nematóideparasítico de planta, ou que é tóxico ao dito nematóide parasítico de planta,em que o cassete de expressão é estavelmente integrado no genoma dasemente.

22. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ácido nucleico quecodifica um agente que interrompe o metabolismo, crescimento e/oureprodução de um nematóide parasítico de planta, que confere ou melhora aresistência da planta a um nematóide parasítico de planta, ou que é tóxico aum nematóide parasítico de planta.

23. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de quecompreende o cassete de expressão como definido na reivindicação 12.

24. Método para conferir ou melhorar a resistência aonematóide em um planta, caracterizado pelo fato de que compreende a)preparar uma construção que compreenda um primeiro ácido nucleicocompreendendo a seqüência de ácido nucleico como definida em qualqueruma das reivindicações 1, 3, 5, 7, 9 e 11 operavelmente ligada a um ácidonucleico secundário, b) transformar uma célula vegetal com a construção dea) em que a primeira seqüência de nucleotídeo induz a transcrição da segundaseqüência de nucleotídeo em uma célula vegetal em resposta a um estímulo denematóide; e c) regenerar a célula vegetal transformada para produzir umaplanta transgênica tendo resistência ou resistência melhorada ao nematóide.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que o ácido nucleico secundário codifica um agente queinterrompe o metabolismo, crescimento e/ou reprodução de um nematóideparasítico de planta, que confere ou melhora a resistência da planta a umnematóide parasítico de planta, ou que é tóxico a um nematóide parasítico deplanta.

26. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que o primeiro ácido nucleico é um promotor específico de raize/ou específico de sítio de alimentação de nematóide.