BRPI0708344B1 - Vetores adenovirais quiméricos e composição imunogênica - Google Patents

Vetores adenovirais quiméricos e composição imunogênica Download PDF

Info

Publication number
BRPI0708344B1
BRPI0708344B1 BRPI0708344-0A BRPI0708344A BRPI0708344B1 BR PI0708344 B1 BRPI0708344 B1 BR PI0708344B1 BR PI0708344 A BRPI0708344 A BR PI0708344A BR PI0708344 B1 BRPI0708344 B1 BR PI0708344B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
nucleic acid
tlr
agonist
vector
promoter
Prior art date
Application number
BRPI0708344-0A
Other languages
English (en)
Inventor
Sean N. Tucker
Original Assignee
Vaxart, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vaxart, Inc. filed Critical Vaxart, Inc.
Publication of BRPI0708344A2 publication Critical patent/BRPI0708344A2/pt
Publication of BRPI0708344A8 publication Critical patent/BRPI0708344A8/pt
Publication of BRPI0708344B1 publication Critical patent/BRPI0708344B1/pt
Publication of BRPI0708344B8 publication Critical patent/BRPI0708344B8/pt

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • C12N15/8613—Chimaeric vector systems comprising heterologous sequences for production of another viral vector
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

vetores adenovirais quiméricos. a presente invenção refere-se a vetores adenovirais quiméricos e métodos para uso dos vetores para induzir uma resposta imune a um antí-geno de interesse.

Description

REFERÊNCIAS CRUZADAS A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS
[0001] O presente pedido de patente reivindica prioridade ao Pedi do de Patente Provisório USUS 60/778.026, depositado em 28 de fevereiro de 2006, Pedido de Patente Provisório US 60/801.645, depositado em 19 de maio de 2006, Pedido de Patente Provisório US 60/802.992, depositado em 22 de maio de 2006, Pedido de Patente Provisório US 60/821.492, depositado em 4 de agosto de 2006, Pedido de Patente Provisório US 60/846.658, depositado em 22 de setembro de 2006, e Pedido de Patente Provisório US 60/848.195, depositado em 28 de setembro de 2006), as descrições dos quais são, desse modo, incorporadas por referência em sua totalidade para todas as propostas.
DECLARAÇÃO AOS DIREITOS A INVENÇÃO FEITA SOB PESQUISA E DESENVOLVIMENTO FEDERALMENTE PATROCINADOS
[0002] Não aplicável.
Antecedentes da Invenção
[0003] As vacinas são um meio importante para prevenir e/ou tratar um número de doenças e enfermidades (por exemplo, infecção viral, infecção bacterial, e câncer). As vacinas baseadas em ácido nucléico têm várias vantagens sobre vacinas de proteína ou vacinas vivas atenuadas. A introdução de um ácido nucléico que expressa um antígeno em uma célula-alvo permite rápido desenvolvimento de vacina que gera uma resposta imune contra um antígeno de interesse. Para vacinas de proteína, um método eficaz e eficiente de purificação de proteína necessita ser desenvolvido cada vez que uma nova vacina é criada. Para vacinas vivas, um método de atenuação necessita ser identificado que não cessa completamente o crescimento da patogenia, ainda se comprovando ser completamente seguro em seres humanos. O desenvol- vimento de metodologias de purificação e atenuação são processos de consumo de tempo extremo. Em contraste, muitas vacinas baseadas em ácido nucléico podem ser fabricadas muito rapidamente usando-se as mesmas técnicas de fabricação cada vez com apenas uma mudança rápida no ácido nucléico que codifica o antígeno de interesse. A re- plicação incompetente do adenovírus é um sistema de vacina baseado em ácido que é rápida, prognóstica e não-custosamente feita em alta titulação [Polo, J.M. e Dubensky, T. W., Jr., Drug Discov Today, 7(13), 719-727 (2002)]. Contudo, a eficiência da resposta específica de antí- geno em seguida a administração de vetores adenovirais conhecido na técnica é baixa. Desse modo, existe uma necessidade na técnica de novos vetores adenovirais que possam ser usados para induzir eficientemente uma resposta imune contra um antígeno de interesse. A presente invenção satisfaz estas e outras necessidades.
Sumário da Invenção
[0004] A presente invenção se refere a vetores adenovirais quimé ricos compreendendo ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo heterólogo, e métodos para indução de uma resposta imune contra o polipeptídeo heterólogo.
[0005] Uma concretização da invenção proporciona vetores de ex pressão adenovirais quiméricos compreendendo um cassete de expressão compreendendo (a) um primeiro promotor operavelmente ligado a um ácido nucléico que codifica um agonista de receptor-3 (TLR-3) do tipo toll; e (b) um segundo promotor operavelmente ligado a um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo heterólogo. Em algumas concretizações, o ácido nucléico que codifica o agonista TLR compreende uma seqüência selecionada a partir de SEQ ID N°s: 3, 7, 8, 9, 10, 11 e 12. Em algumas concretizações, o polipeptídeo heterólo- go é selecionado de um polipeptídeo envelope de HIV (por exemplo, gp41, gp120 e gp160), e polipeptídeo de gripe HA. Em algumas con- cretizações, o primeiro promotor e o segundo promotor são os mesmos. Em algumas concretizações, as primeira e segunda concretizações são diferentes. Em algumas concretizações, os promotores são selecionados a partir do promotor beta actinae o promotor de CVM. A invenção também proporciona composições imunogênicas compreendendo o vetor de expressão.
[0006] Uma concretização adicional da invenção proporciona mé todos de indução de uma resposta imune contra o polipeptídeo heteró- logo pela administração de uma quantidade imunologicamente eficaz das composições a um indivíduo mamífero (por exemplo, um roedor, tal como um camundongo, um rato, ou porquinho-da-índia, ou um primata, tal como um chipanzé, uma macaca rhesus, ou um ser humano). Em algumas concretizações, o vetor é administrado via qualquer via não-parenteral (por exemplo, oral, intranasal e mucosalmente). Em algumas concretizações, o polipeptídeo heterólogo é expresso em uma célula selecionada a partir de uma célula dendrítica, uma célula de microdobra, e uma célula epitelial intestinal.
[0007] Uma concretização adicional da invenção proporciona composições imunogênicas compreendendo: (a) um vetor de expressão adenoviral quimérico compreendendo um promotor operavelmente ligado a um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo heterólogo; (b) um agonista TLR-3 (por exemplo, um dsRNA). Em algumas concretizações, o agonista TLR-3 é codificado por um ácido nucléico. A invenção também proporciona métodos de indução de uma resposta imune pela administração das composições a um indivíduo mamífero (por exemplo, um roedor, tal como um camundongo, um rato, ou um porquinho-da-índia,ou um primata, tal como um chipanzé, uma macaca rhesus, ou um humano), via qualquer via não-parenteral (por exemplo, oral, intranasal, ou mucosal).
[0008] Outra concretização da invenção proporciona um ácido nu- cléico isolado compreendendo a seqüência colocada em SEQ ID N°s: 1, 2, 6, 7, 13, 14, 15, 16 ou 17.
Breve Descrição dos Desenhos
[0009] A Figura 1 ilustra dados demonstrando que um vetor ade noviral quimérico da invenção (isto é, DS1), em combinação com um agonista TLR-3, é mais eficaz do que um vetor adenoviral padrão (isto é, rAd5) na indução de uma resposta imune específica de antígeno em seguida a distribuição do vetor oral. A Figura 1A ilustra dados representando a titulação de anticorpo para proteína envelope de HIV (isto é, gp120) em 3 semanas em seguida a distribuição oral dos vetores adenovirais. A Figura 1B ilustram dados representando a titulação de anticorpo para proteína envelope de HIV (isto é, gp120) em 6 semanas em seguida a distribuição oral dos vetores adenovirais.
[00010] A Figura 2 ilustra dados demonstrando que um vetor adenoviral quimérico da invenção (isto é, DS1b ou DS1c), em combinação com um agonista TLR-3, é mais eficaz na indução de uma resposta imune específica de antígeno do que um vetor adenoviral padrão (isto é, rAd5). A Figura 2A ilustram dados representando a titulação de anti- GFP IgG em 3 semanas em seguida a distribuição oral dos vetores. A Figura 2B ilustram dados representando a resposta de CD8+ célula T para GFP em 10 semanas em seguida a administração do vetor em 0, 4 e 8 semanas. A Figura 2C ilustra dados representando a titulação de anticorpo anti-HA em 3 semanas em seguida a administração oral dos vetores.
[00011] A Figura 3 ilustra dados demonstrando que os vetores ade- novirais quiméricos da invenção são superiores para indução de respostas imunes quando administrados não-parenteralmente. A Figura 3A ilustram dados representando a titulação de anticorpo anti-gp 120 3 semanas em seguida a administração intramuscular de DS1. A Figura 3B ilustra dados representando a titulação de anticorpo anti-HA três semanas em seguida a administração intranasal de DS1c.
[00012] A Figura 4 ilustra dados demonstrando que os agonistas TLR-3 ligante expressos podem induzir ativação de células apresentandoantígeno. A Figura 4A ilustra dados representando ativação de célula dendrítica pelo dsRNA TLR-3 agonista luc1 expresso. A Figura 4B ilustra dados representando a ativação de célula dendrítica pelos dsRNA TLR-3 agonistas luc1 e m1.
[00013] A Figura 5 é uma ilustração gráfica dos vetores adenovirais quiméricos da invenção, isto é, vetores adenovirais quiméricos com-preendendoácidos nucléicos que codificam agonistas ds RNA TLR-3.
[00014] A Figura 6 ilustra dados demonstrando que os vetores ade- novirais quiméricos da invenção são eficazes na indução de uma resposta imune específica de antígeno em seguida a distribuição oral. A Figura 6 ilustra dados representando titulação de anticorpo anti-gp120 3 semanas em seguida a administração oral de um adenoviral quimérico compreendendo seqüência de ácido nucléico que codifica o dsR- NA TLR-3 agonista luc1.
[00015] A Figura 7 ilustra dados demonstrando que agonistas TLR- 7/8 têm eficiência pobre na indução de uma resposta imune específica de antígeno.
[00016] A Figura 8 ilustra dados demonstrando que os vetores ade- novirais quiméricos da invenção são eficazes na indução de uma resposta imune específica de antígeno em seguida a distribuição oral. A Figura 8A ilustra dados representando titulação de anticorpo anti-HA 4 semanas em seguida a administração oral de um adenoviral quimérico compreendendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica o dsR- NA TLR-3 agonista luc1.
[00017] A Figura 8B ilustra dados representando a titulação de anticorpo anti-HA 4 semanas ou 7 semanas em seguida a administração de um adenoviral quimérico compreendendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica o dsRNA TLR-3 agonista luc1. A Figura 8C ilustra dados representando titulação de anticorpo anti-HA 3 semanas em seguida a administração oral ou administração intranasal de um adenoviral quimérico compreendendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica o dsRNA TLR-3 agonista luc1.
Breve Descrição das Seqüências
[00018] SEQ ID N°:1 coloca a seqüência de nucleotídeo para o vetor adenoviral quimérico DS1.
[00019] SEQ ID N°:2 coloca a seqüência de nucleotídeo para o vetor adenoviral quimérico DS2.
[00020] SEQ ID N°:3 coloca uma seqüência de nucleotídeo que codifica um agonista TLR-3.
[00021] SEQ ID N°:4 coloca uma seqüência de nucleotídeo que codifica um agonista TLR-3.
[00022] SEQ ID N°:5 coloca uma seqüência de nucleotídeo que codifica um agonista TLR-3.
[00023] SEQ ID N°:6 coloca uma seqüência de nucleotídeo para um vetor adenoviral quimérico compreendendo um ácido nucléico que codifica HA de gripe e um ácido nucléico que codifica um agonista TLR-3 (luc), no qual o HA de gripe e o agonista TLR-3 estão na mesma orientação.
[00024] SEQ ID N°:7 coloca uma seqüência de nucleotídeo para um vetor adenoviral quimérico compreendendo um ácido nucléico que codifica HA de gripe e um ácido nucléico que codifica um agonista TLR-3 (luc), no qual o HA de gripe e o agonista TLR-3 estão na orientação oposta.
[00025] SEQ ID N°:8 coloca uma seqüência de nucleotídeo que codifica um agonistico RNA TLR-3 em forma de grampo de cabelo curto. Porções complementares da seqüência são mostradas em letras maiúsculas e a seqüência articuladora é mostrada em letras de caso inferiores.
[00026] SEQ ID N°:9 coloca uma seqüência de nucleotídeo que co- difica um agonistico RNA TLR-3 em forma de grampo de cabelo curto (g1). Porções complementares da seqüência são mostradas em letras maiúsculas e a seqüência articuladora é mostrada em letras de caso inferiores.
[00027] SEQ ID N°:10 coloca uma seqüência de nucleotídeo que codifica um agonistico RNA TLR-3 em forma de grampo de cabelo curto (luc). Porções complementares da seqüência são mostradas em letras maiúsculas e a seqüência articuladora é mostrada em letras de caso inferiores.
[00028] SEQ ID N°:11 coloca uma seqüência de nucleotídeo que codifica um agonistico RNA TLR-3 em forma de grampo de cabelo curto (m1). Porções complementares da seqüência são mostradas em letras maiúsculas e a seqüência articuladora é mostrada em letras de caso inferiores.
[00029] SEQ ID N°:12 coloca uma seqüência de nucleotídeo que codifica um agonistico RNA TLR-3 em forma de grampo de cabelo curto. Porções complementares da seqüência são mostradas em letras maiúsculas e a seqüência articuladora é mostrada em letras de caso inferiores.
[00030] SEQ ID N°:13 coloca a seqüência de nucleotídeo para o vetor adenoviral quimérico DS1c. A seqüência compreende um nucleo- tídeo que codifica HA(PR8/34).
[00031] SEQ ID N°:14 coloca a seqüência de nucleotídeo para o vetor adenoviral quimérico DS2beta-luc. O vetor compreende uma se- qüência que codifica o agonista TLR-3 luc sob o controle do promotor beta actin. O vetor também compreende locais de clonagem abertos para inserção de seqüência(s) de ácido nucléico que codificam o antí- geno de interesse.
[00032] SEQ ID N°:15 coloca a seqüência de nucleotídeo para o vetor adenoviral quimérico DS2beta-luc. O vetor compreende uma se- qüência que codifica o agonista TLR-3 luc sob o controle do promotor de CMV. O vetor também compreende locais de clonagem abertos para inserção de seqüência(s) de ácido nucléico que codificam o antíge- no de interesse.
[00033] SEQ ID N°:16 coloca a seqüência de nucleotídeo para o vetor pShuttle compreendendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica o agonista TLR-3 luc sob o controle do promotor de CMV e uma seqüência de ácido nucléico que codifica HA (gripe aviária) sob o controle de um promotor de CMV separado.
[00034] SEQ ID N°:17 coloca a seqüência de nucleotídeo para o vetor adenoviral quimérico ND1.1 214. O ácido nucléico que codifica o antígeno heterólogo está em um texto em negrito, e é flanqueado por um local de reconhecimento ClaI na extremidade 5’, e um local de reconhecimento Not 1 na extremidade 3’. A seqüência de ácido nucléico que codifica os agonistas TLR-3 está em itálico, com a seqüência arti- culadora em negrito.
Descrição Detalhada da Invenção I. Introdução
[00035] A presente invenção proporciona novos vetores adenovirais quiméricos que podem ser administrados não-parenteralmente para induzir uma resposta imune contra um antígeno de interesse. Os vetores adenovirais quiméricos da invenção compreendem um ácido nu- cléico que codifica um polipeptídeo heterólogo, e um ácido nucléico que codifica um agonista TLR-3. Os vetores adenovirais quiméricos induzem respostas imunes fortes e eficazes específicas para o poli- peptídeo heterólogo, particularmente quando aplicado via uma via não- parenteral (por exemplo, oral, intranasal, ou mucosamente).
[00036] A invenção é baseada na descoberta surpreendente que a administração de agonistas dsRNA TLR-3 são adjuvantes específicos quando administrados em conjunto com vetores virais. De fato, o uso de dsRNA como um adjuvante para vetores virais seria contra- intuitivo, considerando-se que a maior utilidade proposta do dsRNA mimético poli I:C era um agente antiviral [Nemes, et al., Proc. Soc Exp Biol Med. (1969) 132:776; Schafer et al, Nature (1970) 226:449; Fenje, et al., Nature (1970) 226:171].
II. Definições
[00037] O termo "quimérico" ou "recombinante", conforme aqui usado, com referência a, por exemplo, um ácido nucléico, proteína, ou vetor, indica que o ácido nucléico, proteína ou vetor, foi modificado pela introdução de um ácido nucléico ou proteína heteróloga, ou a alteração de um ácido nucléico ou proteína nativa. Desse modo, por exemplo, vetores quiméricos e recombinantes incluem seqüências de ácido nu- cléico que não são encontradas dentro da forma nativa (não-quimérica ou não-recombinante) do vetor. Um vetor de expressão adenoviral quimérico se refere a um vetor de expressão adenoviral compreendendo uma seqüência ácido nucléico que codifica um polipeptídeo he- terólogo.
[00038] Um "vetor de expressão" é um constructo de ácido nucléi- co, gerado recombinante ou sinteticamente, com uma série de elementos de ácido nucléico específicos que permitem transcrição de um ácido nucléico particular em uma célula hospedeira. O vetor de expressão pode ser parte de um plasmídeo, vírus, ou fragmento de ácido nucléi- co. Tipicamente, o vetor de expressão inclui um ácido nucléico a ser transcrito operavelmente ligado a um promotor.
[00039] Os termos "promotor" e "seqüência de controle de expressão" são aqui usados para se referir a uma série de seqüências de controle de ácido nucléico que direcionam transcrição de uma ácido nucléico. Conforme aqui usado, um promotor inclui seqüências de ácido nucléico necessárias perto do local de partida de transcrição, tais como, no caso de um promotor tipo polimerase II, um elemento TATA. Um promotor também inclui opcionalmente elementos intensificadores ou repressores distais, que podem estar localizados tanto quanto vários milhares de pares de base a partir do local de partida de transcrição. Os promotores incluem promotores constitutivos e inducíveis. Um promotor "constitutivo"é um promotor que é ativo sob muitas condições ambientais e de desenvolvimento. Um promotor "inducível" é um promotor que é ativo sob regulação ambiental e de desenvolvimento. O termo "operavelmente ligado" se refere a uma ligação funcional entre uma seqüência de controle de expressão de ácido nucléico (tal como um promotor, uma série de locais de ligação de fator de transcrição), e uma segunda seqüência de ácido nucléico, no qual a seqüên- cia de controle de expressão direciona transcrição do ácido nucléico correspondente à segunda seqüência.
[00040] O termo "agonista de TLR" ou "agonista de receptor do tipo Toll", conforme aqui usado, se refere a um composto que liga e estimula um receptor do tipo Toll, incluindo, por exemplo, TLR-2, TLR-3, TRL-6, TLR-7, ou TLR-8. Os agonistas de TLR são revistos em Ma- cKichan, IAVI Report. 9:1-5 (2005) e Abreu et al., J. Immunol, 174(8), 4453-4460 (2005). Os agonistas incluem transdução de sinal em seguida a ligação a seu receptor.
[00041] O termo "agonista de TLR-3" ou "agonista de receptor 3 do tipo Troll", conforme aqui usado, se refere a um composto que liga e estimula o TLR-3. Os agonistas TLR-3 foram identificados incluindo RNA de filamento duplo, dsRNA viralmente derivado, vários análogos quimicamente sintetizados para RNA de filamento duplo incluindo ácido (poli I:C), poliinosina-policitidílico - ácido (poli A:U) poliadenílico po- liuridílico e (poli I:poli C, e anticorpos (ou reticulação de anticorpos) para TLR-3 que conduz a produção de IFN-beta [Matsumoto, M, et al., Biochem Biophys Res Commum 24:1364 (2002), de Bouteiller, et al., J Biol Chem 18:38133-45 (2005)]. Os agonistas TLR-3 também incluem dsRNA expresso (por exemplo, dsRNA codificado por um ácido nucléi- co compreendendo um seqüência colocada em SEQ ID NOS: 3, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12).
[00042] O termo "agonista TLR-7/8" ou agonista 7/8 receptor do tipo Toll", conforme aqui usado, se refere a um composto que liga e estimula os receptores TLR-7 ou TLR-8; este receptores reconhecem vários dos mesmos ligantes. Vários agonistas TLR-7/8 foram identificados tais como um RNA viral de trançado simples, imiquimod, loxrribina, ácido poliuridílico, ou resiquimod.
[00043] O termo "heterólogo"quando usado com referência a porções de um ácido nucléico indica que o ácido nucléico compreende duas ou mais subseqüências que não são encontradas no mesmo relacionamento uma em relação à outra na natureza. Por exemplo, o ácido nucléico é típica e recombinantemente produzido, tendo duas ou mais seqüências de genes não-relacionadas para produzir um novo ácido nucléico funcional, por exemplo, um promotor de uma fonte, e uma região de codificação de outra fonte. Similarmente, uma proteína heteróloga indica que a proteína compreende duas ou mais subse- qüências que não são encontradas no mesmo relacionamento uma em relação à outra na natureza (por exemplo, uma proteína de fusão).
[00044] Os termos "ácido nucléico"e "polinucleotídeo" são usados permutavelmente aqui para se referirem a deoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos e polímeros destes na forma de filamento simples ou duplo. O termo envolve ácidos nucléicos contendo análogos de nu- cleotídeo conhecidos, ou resíduos de estruturas principais modificadas ou ligações, que são sintéticas, que ocorrem naturalmente, e não ocorrem naturalmente, que têm propriedades de ligação similares como o ácido nucléico de referência, e que são metabolizados em uma maneira similar aos nucleotídeos de referência. Exemplos de tais análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metila, fosfonatos de quiral-metila, ribonucleotídeos de 2-O-metila, áci-dospeptídeo-nucléico (PNAs).
[00045] A menos que de outro modo indicado, uma seqüência de ácido nucléico particular também envolve variantes conservativamente modificadas desta (por exemplo, substituições de códon degeneradas) e seqüências complementares, bem, como a seqüência explicitamente indicada. Especificamente, substituições de códon degeneradas podem ser alcançadas pela geração de seqüências nas quais a terceira posição de um ou mais (ou todos) códons é substituída com base de mistura e/ou resíduos de deoxinosina (Batzer et al., Nucleic Acid REs. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). O termo ácido nu- cléico é usado permutavelmente com gene, cDNA, mRNA, oligonucle- otídeo, e polinucleotídeo.
[00046] Antígeno se refere a uma proteína ou parte de uma cadeia de polipeptídeo que pode ser reconhecida por receptores de célula T e/ou anticorpos. Tipicamente, os antígenos são derivados de proteínas bacteriais, virais ou fungais.
[00047] Uma "dose ou quantidade imunologicamente eficaz" das composições da presente invenção é uma quantidade que induz ou modula uma resposta imune específica para o polipeptídeo heterólogo. As respostas imunes incluem respostas imunes humorais e respostas imunes mediadas por célula. Uma composição imunogênica pode ser usada terapêutica ou profilaticamente para tratar ou prevenir doença em qualquer estágio.
[00048] "Respostas imunes humorais"são mediadas por componentes livres de célula do sangue, isto é, plasma ou soro; transferência do soro ou plasma de um indivíduo para outra imunidade de transferências.
[00049] "Respostas imunes mediadas por célula" são mediadas por linfócitos específicos de antígeno; transferência dos linfócitos específicos de antígeno de um indivíduo para outra imunidade de transferências.
[00050] Uma "dose terapêutica"ou "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" de um vetor adenoviral quimérico, ou uma composição compreendendo um vetor adenoviral quimérico, é uma quantidade do vetor ou composição compreendendo o vetor que previne, alivia, abate, ou reduz a severidade de sintomas de doenças e enfermidades associadas com a fonte do polipeptídeo heterólogo (por exemplo, um vírus, uma bactéria, um parasita, ou um câncer).
[00051] Anticorpo se refere a um polipeptídeo codificado por um gene de imunoglobulina ou fragmentos deste que se liga especificamente e reconhece um antígeno. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem genes de região constante kappa, lâmbda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, bem como genes de região variável de imu- noglobulina miríade. As cadeias leves são classificadas como ou kappa ou lâmbda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, que, por sua vez, define as classes de imuno- globulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
[00052] Células T se referem a uma classe particular de linfócitos que expressam um receptor específico (receptor de célula T) codificado por uma família de genes. Os genes de receptor de célula T reconhecidos incluem receptores alfa, beta, delta, e gama, de loci, e os receptores de célula T (mas não universalmente) tipicamente reconhecem uma combinação de MHC mais um peptídeo curto.
[00053] Resposta imune adaptativa se refere a reconhecimento de célula T/de anticorpo de antígeno.
[00054] Células de apresentação de antígeno (APCs), conforme aqui usadas, se referem a células que são capazes de apresentar pep- tídeos imunogênicos ou fragmentos destes de células T para ativar ou aumentar uma resposta imune. APCs incluem células dendríticas, células B, monócito e outras células que podem ser projetadas para serem APCs eficientes. Tais células podem, mas não necessitam, serem geneticamente modificadas para aumentar a capacidade de apresentação de antígeno, para aperfeiçoar a ativação e/ou manutenção da resposta de célula T, para ter efeitos antitumor por si, e/ou para ser imunologicamente compatível com o recebedor (isto é, halotipo HLA equiparado). APCs podem ser isolados de qualquer de uma variedade de fluidos biológicos e órgãos incluindo tutano de osso, sangue periférico, tumor e tecidos peritumorais, e podem ser células autólogas, alo- genéicas, singenéicas ou xenogenéicas. APCs tipicamente utilizam um receptor a partir do local de maior histocompatibilidade (MHC) para apresentar polipeptídeos curtos para células T.
[00055] Adjuvante é um intensificador de resposta imune não- específica. Adjuvantes adequados incluem, por exemplo, toxina de cólera, monosfofil lipídeo A (MLP), Adjuvante Completo de Freund, Adjuvante Incompleto de Freund, Quil A, e Al(OH). Os adjuvantes podem também ser aquelas substâncias que causam ativação de APC e apresentação aumentada de células T através de moléculas de sinalização secundárias. Exemplos de receptores similares a Troll que reconhecem RNA de filamento duplo, flagelante bacterial, LPS, CpG DNA, e lipopeptídeo bacterial (Revisto recentemente em [Abreu et al., J. Immunol, 174(8), 4453-4460 (2005)].
[00056] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo"e "proteína" são usados permutavelmente aqui para se referirem a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácido nos quais um ou mais resíduos de aminoácido é um mimético químico artificial de um aminoácido que ocorre naturalmente correspondente, bem como a polímeros de aminoácido que ocorrem naturalmente, e polímeros de aminoácido que não ocorrem naturalmente.
[00057] O termo "aminoácido"se refere a aminoácidos que ocorrem naturalmente e sintéticos, bem como análogos de aminoácido e mimé- ticos de aminoácido que funcionam em uma maneira similar aos ami- noácidos que ocorrem naturalmente. Os aminoácidos que ocorrem naturalmentesão aqueles codificados pelo código genético, bem como aqueles aminoácidos que são mais tarde modificados, por exemplo, hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, e O-fofoserina. Análogos de amino- ácido se referem a compostos que têm a mesma estrutura quimérica básica como um aminoácido que ocorre naturalmente, isto é, um y carbono que é ligado a um hidrogênio, um grupo carboxi, um grupo amino, e um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, metionina metil sulfônio. Tais análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina), ou suportes de peptídeo modificados, mas retêm a mesma estrutura química básica como um aminoácido que ocorre naturalmente. Miméticos de aminoácido se referem a com-postosquímicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona em uma maneira similar a um aminoácido que ocorre naturalmente.
[00058] Os aminoácidos podem ser referidos aqui por, ou seus símbolos de três letras comumente conhecidos, ou por símbolos de uma letra recomendados pela IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Os nucleotídeos, do mesmo modo, podem ser referidos por seus códigos de letra simples comumente aceitos.
[00059] "Variantes conservativamente modificadas" se aplicam a ambas seqüências de aminoácido e de ácido nucléico. Com relação a seqüências de ácido nucléico particulares, variantes conservativamen- te modificadas se referem aqueles ácidos nucléicos que codificam se- qüências de aminoácido idênticas, ou essencialmente idênticas, ou onde o ácido nucléico não codifica uma seqüência de aminoácido, para seqüências essencialmente idênticas. Devido à degeneração do có- digo genético, um grande número de ácidos nucléicos funcionalmente idênticos codifica qualquer dada proteína. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU todos codificam o aminoácido alanina. Desse modo, em toda posição onde uma alanina é especificada por um có- don, o códon pode ser alterado para qualquer dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucléico são "variações mudas", que são uma espécie de variações conservativamente modificadas. Toda seqüência de ácido nu- cléico aqui que codifica um polipeptídeo também descreve toda variação muda possível do ácido nucléico. Um versado no assunto reconhecerá que cada códon em um ácido nucléico (exceto AUG, que é ordinariamente o único códon para metionina, e TGG, que é ordinariamente o único códon para triptofan), pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Conseqüentemente, cada variação muda de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo é implicada em cada seqüência descrita.
[00060] Como para seqüências de aminoácido, um versado reconhecerá que substituições individuais, retiradas ou adições a um acido nucléico, peptídeo, polipeptídeo, ou seqüência de proteína que alteram, adicionam ou retira um aminoácido simples ou em uma percentagem pequena de aminoácidos na seqüência codificada é uma "variante conservativamente modificada", onde a alteração resulta na substituição de uma aminoácido com um aminoácido quimicamente similar. Tabelas de substituição conservativa proporcionando aminoácidos funcionalmente similares são bem-conhecidas na técnica. Tais variantes conservativamente modificadas são em adição a e não excluem variantes polimórficas, homólogos inter-espécie, e alelos da invenção.
[00061] Os seguintes oito grupos cada contém aminoácidos que são substituições conservativas para uma outra: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Aspargina (N), Glutmina (Q); 4) Arginina I, Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofan (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M); (vide, por exemplo, Creighton, Proteins (1984)).
[00062] A frase "seletivamente (ou especificamente) hidrolisa para" se refere à ligação, duplexação, ou hibridização de uma molécula somente a uma seqüência de nucleotídeo particular sob condições de hibridização estringentes quando esta seqüência está presente em uma mistura complexa (por exemplo, DNA ou RNA celular total ou de biblioteca).
[00063] A frase "condições de hibridização estringentes" se refere a condições sob as quais uma sonda hibridizará para sua seqüência- alvo, tipicamente em uma mistura de complexo de ácido nucléico, mas não para outras seqüências. As condições estringentes são dependentes da seqüência, e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Se- qüências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. Um guia extensivo à hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Visão geral de princípios de hibridização e a estratégia de ensaios de ácido nucléico"(1993). Geralmente,condições estringentes são selecionadas para serem cerca de 5-10°C mais baixas do que o ponto de fusão térmico I para a se- qüência específica em um resistência iônica definida Ph. A Tm é a temperatura (sob resistência iônica definida, Ph, e concentração nu- cléica) na qual 50% das sondas complementares ao alvo hidrolisam para a seqüência-alvo em equilíbrio (à medida que as seqüências de alvo estão presentes em excesso, em Tm, 50% das sondas estão ocupadas em equilíbrio). As condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é menos do que cerca de 1,0 M de íon sódio, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon sódio (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos), e pelo menos cerca de 60°C para sondas grandes (por exemplo, maior do que 50 nucleotídeos). As condições estringentes podem também serem alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes, tal como formamida. Para hibridização seletiva ou específica, um sinal positivoé pelo menos duas vezes antecedente, opcionalmente 10 vezes antecedente a hibridização. Condições de hibridização estringentes exemplares podem ser conforme se segue: 50% de formamida, e 1% de SDS, incubando a 42°C, ou, 5xSSC, 1% de SDS, incubando a 65°C, com lavagem em 0,2xSSC, e 0,1% de SDS a 65°C.
[00064] Os ácidos nucléicos que não hidrolisam um ao outro sob condições estringentes são ainda substancialmente idênticos se os polipeptídeos que eles codificam são substancialmente idênticos. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucléico é criada usando-se a degeneração de códon máxima permitida pelo código genético. Em tais casos, os ácidos nucléicos tipicamente hibridizam sob condições de hibridização moderadamente estringentes. "Condições de hibridização moderadamente estringentes" exemplares incluem uma hibridização em um tampão de 40% de formamida, 1M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem em 1XSSC a 45°C. Uma hibridi- zação positiva é pelo menos duas vezes antecedente. Aqueles versados na técnica reconhecerão prontamente que hibridização alternativa e condições de lavagem podem ser utilizadas para proporcionar condições de estringência similares.
[00065] "Anticorpo" se refere a um polipeptídeo compreendendo uma região de estrutura de um gene de imunoglobulina ou fragmentos deste que liga especificamente e reconhece um antígeno. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem genes de região constante kappa, lâmbda, alfa, gama, delta, épsilon, e mu, bem como os genes de região variável de imunoglobulina miríades. As cadeias leves são classificadas como, ou kappa ou lâmbda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon, que, por sua vez, definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
[00066] Uma unidade estrutural (anticorpo) de imunoglobulina exemplar compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 5070 kDa). O terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento do antígeno. Os termos cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável (VH) se referem àquelas cadeias leves e pesadas, respectivamente.
[00067] A frase "ligar especificamente (ou seletivamente)" a um anticorpo ou "especificamente (ou seletivamente) imunorreativo com", quando se referindo a uma proteína ou peptídeo, se refere a um reação de ligação que é determinativa da presença da proteína em uma população heterogênea de proteínas e outras biologias. Desse modo, sob condições de imunoensaio designadas, os anticorpos especificados se ligam a um proteína particular pelo menos duas vezes de fundo e não se liga substancialmente em uma quantidade significante a outrasproteínas presentes na amostra. Ligações específicas a um anticorpo sob tais condições podem requerer um anticorpo que é selecionado para sua especificidade para uma proteína particular. Por exemplo, anticorpos policlonais ocorridos de proteínas de fusão podem ser selecionados para obter somente aqueles anticorpos policlonais que são especificamente imunorreativos com proteína de fusão, e não com componentes individuais das proteínas de fusão. Esta seleção pode ser alcançada pela subtração de anticorpos que reagem em cruzamento com os antígenos individuais. Uma variedade de formato de imunoensaio pode ser usada para selecionar anticorpos especificamente imunorreativos com uma proteína particular. Por exemplo, imu- noensaios ELISA de fase sólida são rotineiramente usados para selecionar anticorpos especificamente imunorreativos com uma proteína (vide, por exemplo, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988), para uma descrição de formatos de imunoensaio, e condições que podem ser usadas para determinar imunorreatividade específica). Tipicamente uma reação específica ou seletiva será pelo menos duas vezes sinal ou ruído de fundo, mais tipicamente mais do que 10 a 100 vezes de fundo.
[00068] Os polinucleotídeos podem compreender uma seqüência nativa (isto é, uma seqüência endógena que codifica um polipeptídeo individual, ou dsRNA, ou uma porção deste), ou pode compreender uma variante de tal seqüência. As variantes de polinucleotídeo podem conter uma ou mais substituições, retiradas, e/ou inserções, tais que a atividade biológica do polipeptídeo codificado não é diminuída, relativo a um polipeptídeo compreendendo antígenos nativos. As variantes de polinucleotídeo podem conter uma ou mais substituições, adições, retiradas, e/ou inserções, tal que a atividade de agonista de TLR-3 do dsRNA codificado não é diminuída, relativa a um dsRNA que não contém substituições, adições, retiradas, e/ou inserções. As variantes preferivelmente exibem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, para uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um polipep- tídeo nativo ou uma porção deste, ou para um seqüência de polinucle- otídeo que codifica um dsRNA com atividade agonística de TLR-3.
[00069] Os termos "idêntico"ou "identidade" por cento, no contexto de dois ou mais ácidos nucléicos (por exemplo, um dsRNA que é um agonista de TLR-3), ou seqüências de polipeptídeo, se referem a duas ou mais seqüências ou subseqüências que são as mesmas, ou têm uma percentagem especificada de resíduos de aminoácido ou nucleo- tídeos que são as mesmas (isto é, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade sobre uma região especificada), quando comparada e alinhada para correspondência máxima sobre uma janela de comparação, ou região designada conforme medida usando um dos seguintes algoritmos de comparação de seqüência, ou por alinhamento manual e inspeção visual. Tais seqüências são, em seguida, referidas para serem "substancialmente idênticas". Esta definição também se refere ao cumprimento de uma seqüência de um teste. Opcionalmente, a identidade existe sobre uma região que é pelo menos 10 a cerca de 100, cerca de 20 a cerca de 75, cerca de 30 a cerca de 50 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento.
[00070] Para comparação de seqüência, tipicamente uma seqüên- cia age como uma seqüência de referência, a cujas seqüências de teste são comparadas. Quando se usa um algoritmo de comparação de seqüência, as seqüências de teste e de referência são admitidas em um computador, coordenadas de subseqüência são designadas, se necessário, e parâmetros de programa de algoritmo de seqüência são designados. O algoritmo de comparação de seqüência em seguida calcula a percentagem de identidades de seqüência para as seqüên- cias de teste relativo à seqüência de referência, baseado nos parâmetros do programa.
[00071] Uma "janela de comparação", conforme aqui usado, inclui referência a um segmento de qualquer um do número de posições contíguas de cerca de 10 a cerca de 500, cerca de 25 a cerca de 200, 50 a cerca de 150, em que um seqüência pode ser comparada a uma seqüência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas seqüências serem otimamente alinhadas. Os métodos de alinhamento de seqüência para comparação são bem-conhecidos na técnica. O alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela pesquisa para método de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA. 85-2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manual e inspeção visual (vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 suplemento)).
[00072] Um exemplo de um algoritmo útil é PILEUP. PILEUP cria um alinhamento de seqüência múltiplo de um grupo de seqüências relacionadas usando alinhamentos em pares progressivos para mostrar relacionamento e percentagem de identidade de seqüência. Ele também assinala uma árvore ou dendograma mostrando os relacionamentos de agrupamento usados para criar o alinhamento. PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987). O método usado é similar ao método descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5:15-153 (1989). O programa pode alinhar até 300 seqüências, cada uma de um comprimento máximo de 5.000 nucleotídeos ou aminoácidos. O procedimento de alinhamentomúltiplo começa com o alinhamento de par das duas seqüências mais similares, produzindo um grupo de duas seqüências alinhadas. Este grupo é, em seguida, alinhado à próxima seqüência mais relacio- nada, ou grupo de seqüências alinhadas. Dois grupos de seqüências são alinhados por uma extensão simples do alinhamento de par de du-asseqüências individuais. O alinhamento final é alcançado por uma série de alinhamentos de par progressivo. O programa é operado pela designação de seqüências específicas e suas coordenadas de aminoácido ou nucleotídeo para regiões de comparação de seqüência, e pela designação dos parâmetros do programa. Usando-se PILEUP, uma se- qüência de referência é comparada a outras seqüências de teste para determinar a percentagem do relacionamento de identidade de seqüên- cia usando-se os seguintes parâmetros: peso de intervalo padrão (3.00), peso de comprimento de intervalo padrão (0.10), e folgas terminais pesadas. PILEUP pode ser obtido a partir de acondicionamento de software de análise de seqüência de GCG, por exemplo, versão 7.0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984).
[00073] Outro exemplo de algoritmo que é adequado para determinar percentagem de identidade de seqüência e similaridade de seqüência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) e Atschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. O software para realização de análise de BLAST é publicamente disponível através do Centro Nacional de Informação de Biotecnologia (http://www.ncbi.n1m.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiro identificação de pares de seqüência de alta classificação (HSPs) por identificação de palavras curtas de comprimento W na seqüência de consulta, que ou se equipara ou satisfaz alguma contagem T de limite de valor positivo quando alinhada com uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüência de base de dados. T é referido como o limite de contagem de palavra vizinha (Altschul et al, supra). Estes ataques de palavra vizinha inicial agem como sementes para iniciação de pesquisas para encontrar HSPs mais longos contendo-as. Os ataques de palavra são extendidos em ambas as direções ao longo de cada seqüên- cia tanto quanto a contagem de alinhamento cumulativo pode ser aumentada. Contagens cumulativas são calculadas usando, para seqüências de nucleotídeo, os parâmetros M (contagem de recompensa de um par de resíduo de equiparação; sempre >0) e N (contagem de penalidade para resíduos de desequiparação; sempre <0). Para seqüências de aminoáci- do, uma matriz de classificação é usada para calcular a contagem cumulativa. A extensão dos ataques de palavra em cada direção é cessada quando: a contagem de alinhamento cumulativo declina pela quantidade X de seu valor máximo alcançado; a contagem cumulativa vai à zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de classificação negativa; ou a extremidade de sua seqüência é alcançada. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X determinam à sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLAST (para seqüências de nucleotídeo) usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expansão (E) ou 10, M=5, N=4, e uma comparação de ambas as resistências. Para seqüência de aminoácido, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento de palavra de 3, e expressão (E) de 10, e alinhamentos de matriz de classificação BLOSUM62 (B) (vide Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4, e uma comparação de ambas resistências.
[00074] O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas seqüências (vide, por exemplo, Karlin & Al- tschul, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993). Uma medida de similaridade provida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade pela qual uma equiparação entre duas seqüências de nucleotídeo ou aminoácido ocorreria por chance. Por exemplo, um ácido nucléico é considerado similar a uma seqüência de referência se a probabilidade de soma menor em uma comparação do ácido nucléico de teste para o ácido nucléi- co de referência é menor do que 0,2, mais preferivelmente menor do que 0,0,1 e, mais preferivelmente, menor do que cerca de 0,001. III. Composições da Presente Invenção
[00075] A invenção proporciona composições compreendendo vetores adenovirais quiméricos. Em algumas concretizações, os vetores adenovirais quiméricos da invenção compreendem um primeiro promotor operavelmente ligado a um ácido nucléico que codifica um polipep- tídeo heterólogo, e um segundo promotor operavelmente ligado a um ácido nucléico que codifica um agonista TLR-3. Os primeiro e segundo promotores podem ser os mesmos ou diferentes. Em algumas concretizações, os primeiro e segundo promotores são independentemente selecionados de: o promotor beta actinae o promotor de CMV.
[00076] Em algumas concretizações, o vetor adenoviral quimérico compreende o genoma adenoviral (menos o genes E1 e E3), e um ácido nucléico que codifica um gene que ativa IRF-3 e outras moléculas de sinalização a jusante de TLR-3. O vetor quimérico pode ser administrado a uma célula que expressa gene Ad’s, E1 tal que adenoví- rus recombinante (rAd) é produzido pela célula. Este rAd pode ser colhido e é capaz de uma etapa simples de infecção que distribuirá a composição transgênica para outra célula dentro de um mamífero de modo a induzir respostas imunes ao polipeptídeo heterólogo.
A. Vetores Adenovirais Adequados
[00077] Em algumas concretizações, o vetor adenoviral é adenoví- rus 5, incluindo, por exemplo, Ad5 com retiradas das regiões E1/E3, e Ad5 com uma retirada da região E4. Outros vetores adenovirais adequados incluem cepas 2, cepas oralmente testadas 4 e 7, adenovírus entéricos 40 e 41, e outras cepas (por exemplo, Ad34) que são suficientes para distribuição de um antígeno e indução de uma resposta imune adaptativa ao antígeno transgene [Lubeck et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86(17), 6763-6767 (1989); Shen et al., J. Virol, 75(9), 42974307 (2001); Bailey et al., Virology, 202(2), 695-706 (1994)]. Em algu- mas concretizações, o vetor adenoviral é um vetor adenoviral incompetente de replicação, vivo (tais como rAd5 retirado E1 e E3), vetor adenoviral atenuado e vivo (tais como vírus de retirada E1B55K), ou um vetor adenoviral vivo com uma replicação tipo selvagem.
[00078] As seqüências de controle transcricionais e translacionais nos vetores de expressão a serem usadas na transformação de células vertebradas in vivo podem ser providas por fontes virais. Por exemplo, promotores comumente usados e intensificadores são derivados, por exemplo, de beta actin, adenovírus, vírus simian (SV40), e citomegalovírus humano (CMV). Por exemplo, vetores que permitem expressão de proteínas sob a direção do promotor de CMV, promotor anterior SV40, promotor posterior SV40, promotor metalotionein, promotor de vírus de tumor mamário de murina, promotor de vírus de sarcoma de Rous, promotor transdutor, ou outros promotores mostrados eficazes para expressão em células mamíferas, são adequados. Promotor genômico viral adicional, seqüências de controle e/ou de sinal podem ser usadas, provido que tais seqüências de controle são compatíveis com a célula hospedeira escolhida.
B. Polipeptídeos Heterólogos
[00079] Os ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos heterólo- gos adequados podem ser derivados de antígenos, tais como, por exemplo, antígenos virais, antígenos bacteriais, antígenos de câncer, antígenos fungais, ou antígenos parasitas.
[00080] Os antígenos virais podem ser derivados de, por exemplo, vírus de imunodeficiência humana (por exemplo, gag (p55 e p160), pol, env (gp120 e gp41), conforme colocado em Shiver et al., Nature 415(6869):331 (2002); as seqüências genômicas de HIV colocadas nos Acessos no Banco de Gene N°s EF363127; EF363126; EF363125; EF363124; EF363123; EF363122; EF192592; e EF192591; as se- qüências gag de HIV colocadas nos Acessos no Banco de Gene N°s EF396891; EF396890; EF396889; EF396888; EF396887; EF396886; EF396885; EF396884; EF396883; EF396882; EF396882; EF396881; EF396880; EF396879; EF396878; EF396877; EF396876; EF39687; EF396874; EF396873; e EF396872; as seqüências pol de HIV colocadas nos Acessos no Banco de Gene N°s EF396810; EF396809; EF396808; EF396807; EF396806; EF396805; EF396804; EF396803; EF396802; EF396801; EF396800; EF396799; EF396798; EF396797; EF396796; EF396795; EF396794; EF396793; EF396792; e EF396791; e as seqüências env de HIV colocadas nos Acessos no Banco de Gene N°s 9: EF367234; EF367233; EF367232; EF367231; EF367230; EF367229; EF367228; EF367227; EF367226; EF367225; EF367224 e EF367223, vírus papilloma humano (por exemplo, proteína L1 capsid, conforme descrita em, por exemplo, Donnelly et al., J Infect Dis. 173:314 (1996), e as seqüências colocadas nos Acessos no Banco de Gene N°s EF362755; EF362754; NC_001694; NC_001693; NC_001691; NC_001690; NC_005134; NC_001458; NC_001457; NC_001354; NC_001352; NC_001526; e X94164), vírus Epstein Barr, vírus simplex d herpes, vírus da herpes humano, rinovírus, cocksacki- evírus, enterovírus, hepatite A, B, C e E (por exemplo, antígeno de superfície de hepatite B conforme descrito em, por exemplo, Lubeck et al, PNAS USA 86:6763 (1989), e as seqüências colocadas nos Acessos no Banco de Gene N°s AB236481; AB236471; AB206501; AB206489; AB206487; AB221788; AB221777; AB221773; AR933671; AR933670; AB236514; AB236513; AB236512; AB236511; AB236510; AB236509; AB236508; AB236507); hepatite C NS5 (vide, por exemplo, Acessos no Banco de Gene N°s X59609; DQ911563; S71627; S70787; S70786; S70341; S6220; S70790; S70789; S70788; e AB204642)), vírus mumps, vírus rubella, vírus measles, poliovírus, vírus smallpox, vírus rabies, e vírus Variella-zoster. O antígeno da gripe inclui, por exemplo, hemaglutinin (HA), proteína matriz 1 (M1), e nu- cleoproteína (NP) (vide, por exemplo, Donnelly, et al, Vaccine 15:865 (1997) e as seqüências de HA de gripe colocadas no Acesso no Banco de Genes N°s AB294219; AB294217; AB294215; AB294213; EF102944; EF102943; EF102942; EF102941; EF102940; EF102939; EF102938; EF102937; EF102936; EF102935; EF102934; EF102933; DQ643982; DQ464354; CY019432; CY019424; CY019416; CY019408; CY019400; CY019392; CY019384; CY019376; CY019368; CY019360; CY019352; EF124794; EF110519; EF110518; EF165066; EF165065; EF165064; e EF165063; as seqüências de M1 de gripe colocadas nos Acessos no Banco de Gene N°s AB292791; CY019980; CY019972; CY019964; CY019956; CY019948; CY019940; CY019628; CY019652; CY019644; CY019932; CY019924; CY019916; CY019908; CY019900; CY019892; CY019884; CY019876; CY019868; CY019860; e as seqüências de NP de gripe colocadas nos Acessos no Banco de Gene N°s AB292790; CY019461; CY019974; CY019966; CY019958; CY019950; CY019942; CY019630; CY019654; CY019934; CY019926; CY019918; CY019910; CY019902; CY019894; CY019886; CY019878; CY019870; e CY019862.
[00081] Antígenos virais adequados também incluem, por exemplo, proteínas não-estruturais virais. O termo "Proteína não-estrutural viral", conforme aqui usado, se refere a proteínas codificadas por ácido nu- cléico viral que não codifica para polipeptídeos estruturais, tais como aqueles que produzem capsid ou a proteína que circunda um vírus. As proteínas não-estruturais incluem aquelas que promovem replicação de ácido nucléico viral e expressão de gene viral tais como, por exemplo,proteínas não-estruturais , 2, 3 e 4 (NS1, NS2, NS3 e NS4, respectivamente) de encefalite Eqüina Venezuelana (VEE), EEE, ou vírus Semiliki Forest [Dubensky et al., J Virol, 70(1), 508-519 (1996); Petrakova et al J Virol 2005 79(12): 7595-608; Patente dos Estados Unidos N°s 5.185.440; 5.739.026; 6.566.093; e 5.814.482. Vários exemplos representativos de alfavírus adequados incluem Aura (ATCC VR-368), vírus Bebaru (ATCC VR-600, ATCC VR-1240), Cabassou (Acesso no Banco de Genes N°s AF398387, ATCC VR-922), vírus chikungunya (ATCC VR-64, ATCC VR-1241), vírus de encefalomielite eqüina do oeste (Acesso no Banco de Genes N°s AY705241, AY705240, ATCC VR-65, ATCC VR-1242), Fort Morgan (ATCC VR-924), vírus Getah (ATCC VR-369, ATCC VR-1243), Kyzylagach (ATCC VR-927), Mayaro (ATCC VR-66), vírus Mayaro (ATCC VR-1277), Middleburg (ATCC VR- 370), vírus Mucambo (ATCC VR-580, ATCC VR-1244), Ndumu (ATCC VR-371), vírus Pixuna (ATCC VR-372, ATCC VR-1245), vírus Ross River (ATCC VR-373), ATCC VR-1246), SemLiki Forest (Acesso no Banco de Genes N°s AJ251359, ATCC VR-67, ATCC VR-1247), vírus Sindbis (Acesso no Banco de Genes N°s J02363, ATCC VR-68, ATCC VR-1248), Tonate (ATCC VR-925), Triniti (ATCC VR-469), Una (ATCC VR-374), encefalomielite eqüina venezuelana (ATCC VR-69), vírus de encefalomielite eqüina venezuelana (Acesso no Banco de Genes N°s AY986475, AY973944, NC 001449, ATCC VR-923), ATCC VR-1250, ATCC VR-1249, ATCC VR-532), encefalomielite eqüina do oeste (ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252), Wha- toroa (ATCC VR-926), e Y-62-33 (ATCC VR-375).
[00082] Os antígenos bacteriais podem ser derivados de, por exemplo, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Helicobacter pylori, Streptococcus bovis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Corynebacterium diphtheriae, Borrelia burgdorfi, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, salmonella typhi, Vibrio chloerae, Haemophilus influenza, Bordetella pertussis, Yersinia pestis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, Mycoplasm sp., Nisseria ransducer s, Legionella pneumophila, Rickettsia typhi, Chlamydia trachomatis, e Shigella dy- senteriae, Vibrio cholera (por exemplo, Cholera toxin subunidade B conforme colocada no Acesso no Banco de Genes N°s U25679; A09803; EF158842; X76391; AF390572; cholera toxin-pilus co- regulado (TCP), conforme descrito em Wu et al., Infection and Immunity Vol. 69(12):7695 (2001), e conforme colocado no Acesso no Banco de Gene N°s NC_002505 e AE004169); Helicobacter pylorii (VacA, conforme colocado no Acesso no Banco de Gene N°s AY848858; AF042737; AF042736; AF042735; AF042734; NC_000921; CagA, conforme colocado no Acesso no Banco de Gene N°s AF043490; AF043489; AF043488; AF043487; NAP conforme colocado no Acesso no Banco de Gene N°s AF284121; AF284120; AF284119; AF284118; AF284117; AF284116; AB045143; AB045142; AF227081; AF227080; AF227079; AF227078; AF227077; AF227076; AF227075; AF227074; Hsp ou catalase, conforme colocado no Acesso no Banco de Gene N°s NC_000921; urease, conforme colocado no Acesso no Banco de Gene N°s AM417610; AM417609; AM417608; AM417607; AM417606; AM417605; AM417604; AM417603; AM417602; AM417601; e AM417600; antígenos de E. coli, conforme colocado no Acesso no Banco de Gene N°s NC_000913; U00096; NC_002655; BA000007; AE014075; incluindo antígenos finbrial de E. coli conforme colocado no Acesso no Banco de Gene N°s AB214865; AB214864; AB214863; AB214862; enteroxina instável a calor conforme colocado no Acesso no Banco de Gene N°s X83966; V00275; X83966; J01646; V00275; M35581; M17873; M17874; K01995; M61015; M178894; M17101; K00433.
[00083] Antígenos de parasita podem ser derivados de, por exemplo,Giardia lamblia, Leishmania sp., Trypanosoma sp., Trichomonas sp., Plasmodium sl. (por exemplo, antígenos de proteína de superfície P. falciparum, tais como seqüências pfs25, conforme colocado no Acesso no Banco de Gene N°s XM_001347551; AF193769; AF179423; AF154117; e AF030628, seqüências pfs28, conforme colocado no Acesso no Banco de Gene N°s L25843, seqüências pfs45, conforme colocado no Acesso no Banco de Gene N°s EF158081; EF158079; EF158078; EF158076; EF158075; e EF158085, seqüências pfs84, pfs48/45, conforme colocadas no Acesso no Banco de Gene N°s AF356146; AF356145; AF356144; AF356143; AF356142; AF356141; AF356139; AF356138; AF356137; AF356136; AF356135; AF356134; AF356133; AF356132; AF356131; AF356130; AF356129; AF356128; AF356127; seqüências pfs 230, conforme colocadas no Acesso no Banco de Gene N°s NC_000910; XM_001349564; AE001393; L22219; L08135; e AF269242, antígenos P. virax, tais como seqüências Pvs25, conforme colocadas no Acesso no Banco de Gene N°s DQ641509; DQ641508; DQ641507; AY639971; AY639970; AY639969; AY639968; AY639967; AY639966; e AY639965; e seqüências Pvs28, conforme colocadas no Acesso no Banco de Gene N°s AB033364; AB033363; AB033362; AB033361; AB033360; AB033359; AB033358; AB033357; AB033356; AB033355; AB033354; AB033353; AB033352; AB033351; AB033350; AB033349; AB033348; AB033347; AB033346; e AB033345), Schistosoma sp., Mycobacterium tuberculosis (por exem-plo,seqüências Ag85, conforme colocadas no Acesso no Banco de Gene N°s AX253506; AX253504; AX253502; e AX211309; MPT64, ESAT-6, CFP10, R8307, MTB-32 MTB-39, CSP, LSA-1, LSA-3, EXP1, SSP1, SSP-2, SALSA, STARP, GLURP, MSP-1, MSP-2, MSP-3, MSP- 4, MSP-5, MSP-8, MSP-9, AMA-1, proteína de membrana integral tipo 1, RESA, EBA-175, e seqüências DBA conforme colocadas no Acesso no Banco de Gene N°s BX842572; BX842573; BX842574; BX842575; BX842576; BX842577; BX842578; BX842579; BX842580; BX842581; BX842582; BX842583; BX842584; e NC_000962, seqüências HSP65, conforme colocadas no Acesso no Banco de Gene N°s AY299175; AY299174; AY299144; AF547886; e AF547885).
[00084] Antígenos de câncer incluem, por exemplo, antígenos expressos, por exemplo, em câncer de cólon, câncer de estômago, câncerpancreático, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de próstata,câncer de seio, câncer de pele (por exemplo, melanoma), leucemia, linfoma, ou mieloma, antígenos de câncer exemplares incluem, por exemplo, HPV L1, HPV L2, HPV E1, HPV E2, fosfatase alcalina placental, AFP, BRCA1, Her2/neu, CA 15-3, CA 19-9, CA-125, CEA, Hcg, ativador de plasminogêneo tipo uroquinase (Upa), inibidor de ati- vador de plasminogêneo.
[00085]Antígenos fungais podem ser derivados de, por exemplo, Tinea pedis, Tinea corporus, Tinea crusis, Tinea unguium, Cladopo- rium carionii, Coccidioides immitis, Cândida sp., Aspergillus fumigatus, e Pneumocytis carinii.
[00086] Os ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos imunogê- nicos são tipicamente produzidos por métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, Ausubel, et al, ed. (2001) Current Protocols in Molecular Biology). Por exemplo, as seqüências de DNA que codificam o polipeptídeo imunogênico podem ser montadas de fragmentos de cDNA e ligantes de oligonucleotídeo curtos, ou de uma série de oligo- nucleotídeos, ou amplificadas de cDNA usando iniciadores apropriados para proporcionar um gene sintético que é capaz de ser inserido em um vetor de expressão recombinante (isto é, um vetor de plasmí- deo, ou um vetor viral), e expresso em uma unidade transcricional re- combinante. Uma vez que o ácido nucléico que codifica um polipeptí- deo imunogênico é produzido, ele pode ser inserido em um vetor de expressão recombinante que é adequado para expressão in vivo ou ex-vivo.
[00087] Os vetores de expressão recombinantes contêm uma se- qüência de DNA que codifica um polipeptídeo imunogênico operavel- mente ligado a elementos regulatórios transcricionais ou translacionais adequados derivados de genes de mamíferos ou virais. Tais elemen-tosregulatórios incluem um promotor transcricional, uma seqüência operadora opcional para controlar transcrição, uma seqüência que codifica locais de ligação ribossomal de mRNA adequados, e seqüências que controlam a terminação de transcrição e translação. Uma origem de replicação e um marcador selecionável para facilitar reconhecimento de transformantes podem adicionalmente serem incorporados. Os genes utilizados nos vetores de expressão recombinantes podem ser divididos entre mais do que um vírus, tal que os produtos de gene estão em dois vetores diferentes, e os vetores são usados para co- transdução para proporcionar todos os produtos de gene em trans. Existem razões que dividem os produtos de gene, tais como limitações de tamanho para inserção, ou toxicidade dos produtos de gene combinados para as linhas de célula produzirem vírus.
C. Agonistas TLR
[00088] De acordo com os métodos da invenção, os agoníticos TLR são usados para aumentar a resposta imune ao polipeptídeo heterólo- go. Em algumas concretizações, os agoníticos TLR-3 aqui descritos podem ser distribuídos simultaneamente com o vetor de expressão que codifica um antígeno de interesse, ou distribuídos separadamente (isto é, temporariamente ou espacilmente) a partir do vetor de expressão que codifica um antígeno de interesse. Por exemplo, o vetor de expressão pode ser administrado via uma via não-paralela (por exemplo, oralmente, intranasalmente, ou mucosamente), enquanto o ago- nista TLR é distribuído por uma via parenteral (por exemplo, intramuscular, intraperitoneal, ou subcutaneamente).
I. Agonistas TLR
[00089] Em uma concretização preferida da presente invenção, um agonítico TLR-3 é usado para estimular reconhecimento imune de um antígeno de interesse. Os agonistas TLR-3 incluem, por exemplo, RNA em forma de grampo de cabelo curto, RNA viralmente derivado, segmentos curtos de RNA que podem formar filamentos duplos, ou RNA em forma de grampo de cabelo curto, e RNA de interferência curto (siRNA). Em uma concretização da invenção, o agonista TLR-3 é dsRNA viralmente derivado, tal como, por exemplo, um ds-RNA derivado de um vírus Sindbis, ou intermediários virais de dsRNA [Alexo- poulou et al., Nature 413:732-8(2001). Em algumas concretizações, o agonista TLR-3 é um RNA em forma de grampo de cabelo curto. Se- qüências de RNA em forma de grampo de cabelo curto tipicamente compreendem duas seqüências complementares unidas por uma se- qüência ligante. A seqüência ligante particular não é um aspecto crítico da invenção. Qualquer seqüência ligante apropriada pode ser usada, considerando-se que ela não interfira com a ligação das duas seqüên- cias complementares para formar um dsRNA.
[00090] Em algumas concretizações, o RNA em forma de grampo de cabelo curto compreende uma seqüência colocada em SEQ ID N°s: 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 ou 12, uma seqüência com identidade substancial para uma seqüência colocada em SEQ ID N°s: 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 ou 12, ou uma variante de uma seqüência colocada em SEQ ID N°s: 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 ou 12. Em certas concretizações, dsRNA que é um ago- nista TLR-3 que não codifica um polipeptídeo particular, mas produz uma citoquina pró-inflamatória (por exemplo, IL-6, IL-8, TLF-alfa, IFN- alfa, IFN-beta) quando contactado com uma célula respondedora (por exemplo, uma célula dendrítica, um célula mononuclear de sangue periférico, ou um macrófago) in vitro, ou in-vivo. Em alguns casos, o ácido nucléico que codifica o agonista TLR-3 (por exemplo, um dsRNA expresso) e o vetor adenoviral quimérico compreendendo um ácido nucléico que codifica um antígeno heterólogo são administrados na mesma formulação. Em outros casos, Em alguns casos, o ácido nu- cléico que codifica o agonista TLR-3 e o vetor adenoviral quimérico compreendendo um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo hete- rólogo são administrados em formulações diferentes. Quando o ácido nucléico que codifica o agonista TLR-3 e o vetor adenoviral quimérico compreendendo um ácido nucléico que codifica um antígeno heterólo- go são administrados em formulações diferentes, sua administração pode ser simultânea ou seqüencial. Por exemplo, o ácido nucléico que codifica o agonista TLR-3 pode ser administrado primeiro, seguido pelo vetor adenoviral quimérico (por exemplo, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ou 24 horas, 2, 4, 6, 8 ou 10 dias mais tarde). Alternativamente, o vetor adenoviral pode ser administrado primeiro, seguido pelo ácido nucléico que codifica o agonista TLR-3 (por exemplo, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ou 24 horas, 2, 4, 6, 8 ou 10 dias mais tarde). Em algumas concretiza-ções, o ácido nucléico que codifica o agonista TLR-3 e o ácido nucléi- co que codifica o antígeno heterólogo estão sob o controle do mesmo promotor. Em outras concretizações, o ácido nucléico que codifica o agonista TLR-3 e o ácido nucléico que codifica o antígeno heterólogo estão sob o controle de promotores diferentes.
[00091] Sete análogos quimicamente sintetizados para RNA de filamento duplo são comercialmente disponíveis. Estes incluem poliinosina ácido policitidílico (poli I:C), ácido poliadenílico:poliuridílico (poli A:U), e poli I:poli C. Anticorpos (ou reticulação de anticorpos) para TLR-3 podem também conduzir a IFN-beta, ou produção de citoquina pró-inflamatória [Matsumoto et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 24:1364(2002), de Bouteiller et al, J. Biol. Chem. 18:38133-45 (2005). Segmentos de siRNA comercialmente disponíveis de qualquer seqüência podem também serem obtidos através de fontes, tal como Invitrogen.
J. Agonistas TLR7/8
[00092] Em algumas concretizações, os agonistas TLR são agonis- tas TLR7/8. Ligantes TRL7/8 são tipicamente RNA derivado viralmente de filamento duplo. Devido aos receptores serem expressos em com- partimentos intracelulares, tais como o endossoma, nem todos os segmentos curtos de RNA dispararão a cascata de sinalização de TLR7/8 porque eles necessitam alcançar o compartimento correto. Alguns ligantes que foram mostrados não disparar esta adição exógena são ácido poliuridílico, resiquimod, e imiquimod [Westwood, et al., Vaccine 24:1736-1745(2006)].
IV. Composições Farmacêuticas
[00093] Composições farmacêuticas compreendendo os vetores aqui descritos podem também conter outros compostos, que podem ser biologicamente ativos ou inativos. Polipeptídeos podem, mas não necessitam, serem conjugados a outras macromoléculas conforme descrito, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos N°s 4.372.945 e 4.474.757. As composições farmacêuticas podem geralmente serem usadas para proposta profilática e terapêutica. As composições farmacêuticas podem ser compostas de métodos para proteger contra degradação do estômago, tal que o vetor adenoviral quimérico administrado pode alcançar as localizações desejadas. Para o ambiente oral, vários destes são disponíveis, incluindo os sistemas de liberação Eu- dragit e TimeClock, bem como outros métodos especificamente designados para adenovírus [Lubeck et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86(17), 6763-6767 (1989); Chourasia e Jain, J. Pharm. Sci, 6(1), 33-66 (2003)]. Existem também vários métodos já descritos para microen- capsulamento de DNA e fármacos para distribuição oral (vide, por exemplo, Publicação de Patente dos Estados Unidos N° 2004043952). Em algumas concretizações, o sistema Eudragit será usado para distribuir o vetor adenoviral quimérico ao intestino delgado inferior. Contudo, a distribuição para outros locais do intestino delgado deve também operar.
[00094] Conforme notado acima, os vetores adenovirais quiméricos na invenção podem ser distribuídos usando-se quaisquer sistemas de distribuição conhecidos àqueles versados na técnica. Numerosas técnicas de distribuição de gene são bem-conhecidas na técnica, tais como aquelas descritas por Rolland (1998) Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, e referências aqui citadas.
[00095] Será aparente que composições imunogênicas podem conter sais farmaceuticamente aceitáveis dos polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos heterólogos (por exemplo, polipeptídeos imuno- gênicos). Tais sais podem ser preparados de bases não-tóxicas farma- ceuticamente aceitáveis, incluindo bases orgânicas (por exemplo, sais de aminas primária, secundária e terciária, e aminoácidos básicos), e bases inorgânicas (por exemplo, sais de sódio, potássio, lítio, amônia, cálcio e magnésio). Alguns exemplos particulares de sais incluem solução salina tamponada por fosfato, e solução salina para injeção.
[00096] Qualquer veículo adequado conhecido àqueles versados na técnica pode ser empregado nas composições farmacêuticas desta invenção. Veículos adequados incluem, por exemplo, água, solução salina, álcool, uma gordura, um cera, um tampão, um veículo sólido, tais como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glicose, sacarose, e carbonato de magnésio, ou microesferas biodegradáveis (por exemplo, polilactto poliglicolato). Mi- croesferas biodegradáveis adequadas são descritas, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos N°s 4.897.268; 5.075.109; 5.928.647; 5.811.128; 5.820.883. O polipeptídeo imunogênico e/ou vírus veículo podem ser encapsulados dentro da microesfera biodegradável, ou associados com a superfície da microesfera.
[00097] Tais composições podem também compreender tampões (por exemplo, solução salina tamponada neutra, ou solução salina tamponada por fosfato), carboidratos (por exemplo, glicose, manose, sacarose e dextranos), manitol, proteínas, polipeptídeos ou aminoáci- dos, tais como glicina, antioxidantes, bacteriostats, agentes quelatan- tes, tais como EDTA ou glutationina, adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio), solutos que tornam a formulação isotônica, hipotônica ou fracamente hipertônica com o sangue de um recipiente, agentes de suspensão, agentes de espessamento e/ou conservantes. Alternativamente, as composições da presente invenção podem ser formuladas como um liofilisato. Os compostos podem também ser encapsulados dentro dos lipossomas usando-se tecnologia bem-conhecida.
[00098] Em algumas concretizações da presente invenção, as composições compreendem adicionalmente um adjuvante. Adjuvantes adequados incluem, por exemplo, os compostos de lipídeos e não- lipídeos, cholera toxin (CT), CT subunidade B, CT derivativo CTK63, enterotoxina instável a calor de E. coli (LT), derivado de LT LTK63, Al(OH)3, e ácidos orgânicos poliiônicos conforme descritos em, por exemplo, WO 04/020592, Anderson e Crowle, Infect. Immun. 31(1):413-418 (1981), Roterman et al., J. Physiol. Pharmacol., 44(3):212-32 (1993), Arora e Crowle, J. Reticuloendothel. 24(3):271- 86(1978), e Crowle e May, Infect. Immun. 38(3):932-7 (1982)). Ácidos orgânicos poliiônicos adequados incluem, por exemplo, 6,6’-[3,3’- dimetil[1,1’-bifenil]-4,4’-diil]bis(azo)bis[ácido 4-amino-5-hidróxi-1,3- naftaleno-dissulfônico](Evans Blue) e 3,3’-[1,1’bifenil]-4,4’- diilbis(azo)bis[ácido 4-amino-1-naftalenossulfônico] (Congo Red). Será apreciado por aqueles versados na técnica que os ácidos orgânicos poliiônicos podem ser usados para qualquer método de vacinação genética em conjunto com qualquer tipo de administração.
[00099] Outros adjuvantes adequados incluem imunomoduladores tópicos, tais como, membros da família imidazoquinolina, tais como, por exemplo, imidaquimod e resiquimod (vide, por exemplo, Hengge et al., Lancet Infect. Dis. 1(3):189-98 (2001). Agonistas TLR-3 expressos (por exemplo, dsRNA) e agonistas TLR-7 (por exemplo, ssRNA), podemtambém serem usados com a invenção.
[000100] Adjuvantes adequados adicionais são comercialmente disponíveis como, por exemplo, adjuvantes baseado em alum adicionais (por exemplo, Alhydrogel, Rehydragel, fosfato de alumínio, Algammu- lin); adjuvantes baseado em óleo (Adjuvante Incompleto e Adjuvante Completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Mich), Specol, RIBI, TiterMax, Montanide ISA 50 ou Seppic MONTANIDE ISA 720); adjuvantes baseados em copolímero de bloco não-iônico, citoquinas (por exemplo, GM-CSF ou Flat3 ligante); Adjuvante Merck 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa); sais de cálcio, ferro ou zinco; uma suspensão insolúvel de tirosina acilatada; açúcares acilatados; polissacarídeos cationicamente ou anionicamente derivatizados; polifosfozenos; microesferas biodegradáveis; monofosforil lipídeo A e Quil A. Citoquinas, tais como GM- CFS ou interleukin-2, -7, ou -12, são também adjuvantes adequados. Hemocianins (por exemplo, hemocianin de lapa) e hemoeritrins podem também serem usados na invenção. Adjuvante de polissacarídeo tais como, por exemplo, chitin, chitosan, e chitin deacetilado são também adequados como adjuvantes. Outros adjuvantes adequados incluem muramil dipeptídeo (MDP, N acetilmuramil L alanil D isoglutamina) peptidoglicans bacteriais e seus derivados (por exemplo, threonil-MDP, e MTPPE). BCG e esqueleto de parede de célula de BCG (CWS) podemtambém serem usados como adjuvantes na invenção, com ou sem trehalose dimicolato. Trehalose dimicolato pode ser usado (vide, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos N° 4.579.945). Endotoxins detoxificados são também úteis como adjuvantes apenas, ou em combinação com outros adjuvantes (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N°s 4.866.034; 4.435.386; 4.505.899; 4.436.727; 4.436.728; 4.505.900; e 4.520.019. Os saponins QS21, QS17, QS7 são também úteis como adjuvantes (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N°s 5.057.540; EP 0362 279; WO 96/33739; e WO 96/11711). Outros adjuvantes adequados incluem Montanide ISA 720 (Seppic, França), SAF (Chiron Calif, United States), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), a série SBAS de adjuvantes (por exemplo, SBAS-2, SBAS-4 ou SBAS-6 ou variantes destes, disponíveis de SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica), Detox, Hamilton, Mont.), e RC-529 (Co- rixa, Hamilton, Mont).
[000101] Superantígenos são também contemplados para uso como adjuvantes na presente invenção. Superantígenos incluem Staphylococcus exoproteínas,tais como α, β, Y e Δ enterotoxins de S.aureus e S. epidermidis, e α, β, Y e Δ exotoxins E. coli. Staphylococcus enterotoxins comum são conhecidos como staphylococcal entetotoxin A (SEA) e staphylococcal enterotoxin B (SEB), com enterotoxins através de E (SEE) sendo descritas (Rott et al., 1992). Streptococcus pyogenes B (SEB), Clostridium perfringes enterotoxin (Bowness et al., 1992), proteína associada a membrana citoplástmica (CAP) de S. pyogenes (Sato et al., 1994) e toxin de síndrome de choque térmico 1 (TSST 1) de S. aureus (Schwab et al., 1993) são superantígenos úteis adicionais.
[000102] Dentro das composições farmacêuticas aqui providas, a composição adjuvante pode ser designada para induzir, por exemplo, uma resposta imune predominantemente do tipo Th1 ou Th2. Altos níveis de citoquinas tipo Th1 (por exemplo, IFN-gama, TNF-alfa, IL-2 e IL-3) tendem a favorecer a indução de respostas imunes mediadas de célula para um antígeno administrado. Em contraste, altos níveis de citoquinas tipo Th2 (por exemplo, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tendem a favorecer a indução de repostas imunes humorais. Seguindo distribuição oral de uma composição compreendendo um polipeptídeo imunogêni- co conforme provido aqui, uma resposta imune que inclui respostas tipo Th1 e Th2 será tipicamente induzida.
[000103] As composições aqui descritas podem ser administradas como parte de uma formulação de liberação sustentada (isto é, uma formulação tal como uma cápsula ou esponja que efetua uma liberação lenta de composto em seguida a administração). Tais formulações podem geralmente ser preparadas usando-se tecnologias conhecidas (vide, por exemplo, Coombes et al (1996) Vaccine 14:1429-1438). Formulações de liberação sustentada podem conter um polipeptídeo, polinucleotídeo ou anticorpo disperso em uma matriz transportadora, e/ou contidas dentro de um reservatório circundado por uma membrana de controle de taxa.
[000104] Os veículos para uso dentro de tais formulações são bio- compatíveis, e podem ser biodegradáveis; preferivelmente as formulações proporcionam um nível relativamente constante de liberação de componente ativo. Tais veículos incluem micropartículas de po- li(lactídeo-co-glicolídeo), bem como poliacrilato, látex, amido, celulose e dextrano. Outros veículos de liberação retardada incluem biovetores supramoleculares, que compreendem um núcleo hidrofílico não-líquido (por exemplo, um polissacarídeo reticulado ou oligossacarídeo) e, opcionalmente, uma camada externa compreendendo um composto anfi- fílico (vide, por exemplo, WO94/20078; WO94/23701 e WO96/06638). A quantidade de composto ativo contida dentro de uma formulação de liberação sustentada depende do local de implantação, da taxa e da duração esperada de liberação e da natureza da condição a ser tratada ou prevenida.
[000105] As composições farmacêuticas podem ser apresentadas em recipientes de dose única ou de dose múltipla, tais como ampolas vedadas ou frascos. Tais recipientes são preferivelmente hermeticamente vedados para preservar a esterilidade da formulação até uso. Em geral, formulações podem ser armazenadas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos. Alternativamente, uma composição farmacêutica pode ser armazenada por uma condição secada por armazenamento requerendo somente a adição de um veículo liquido estéril imediatamente antes do uso.
V. Usos Terapêuticos da Invenção
[000106] Um aspecto da presente invenção envolve o uso das composições imunogênicas aqui descritas para induzir uma resposta imune especifica de antígeno de um indivíduo ou paciente com uma doença tal como, por exemplo, uma infecção viral, infecção bacterial, uma infecção parasítica, uma infecção fungal, ou câncer. Conforme aqui usado, um "indivíduo" ou um "paciente" se refere a qualquer animal de sangue quente, tal como, por exemplo, um roedor, um felino, um canino, ou um primata, preferivelmente um ser humano. As composições imunogênicas podem ser usadas em qualquer estagio da doença, isto é, no pré-cancer, câncer, ou estados metastáticos, ou para prevenir doença. Por exemplo, as composições aqui descritas podem ser usa-das para tratar uma doença viral, tal como HIV, ou hepatite, ou a prevenção ou tratamento de câncer. Dentro de tais métodos as composições farmacêuticas são tipicamente administradas a um paciente. O paciente pode ou não pode ser afligido com a doença ou enfermidade (por exemplo, uma infecção viral, uma infecção bacterial, ou câncer). Conseqüentemente, as composições farmacêuticas acima podem ser usadas para prevenir o desenvolvimento de uma doença ou enfermidade (por exemplo, uma infecção viral, uma infecção bacterial ou câncer), ou tratar um paciente afligido com a doença ou enfermidade (por exemplo, uma infecção viral, uma infecção bacterial ou câncer). A doença ou enfermidade pode ser diagnosticada usando-se critérios geralmente aceitos na técnica. Por exemplo, a infecção viral pode ser diagnosticada pela medição da titulação viral em uma amostra do paciente, a infecção bacterial pode ser diagnosticada pela detecção da bactéria em uma amostra do paciente, e o câncer pode ser diagnosticado pela detecção da presença de um tumor maligno. As composi ções farmacêuticas podem ser administradas, ou antes, ou, em seguida a remoção cirúrgica de tumores primários e/ou tratamento, tal como administração de radioterapia ou fármacos quimioterapêuticos convencionais.
[000107] A imunoterapia é tipicamente imunoterapia ativa, em que o tratamento ocorre na estimulação in vivo do sistema imune hospedeiro endógeno para reagir contra, por exemplo, tumores ou células bacterial ou viralmente infectadas, com a administração de agentes de modificação de resposta imune (composições compreendendo ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos imunogênicos conforme aqui providos).
[000108] A freqüência de administração das composições profiláticas ou terapêuticas aqui descritas, bem como a dosagem, variará de indivíduo para indivíduo, e pode ser prontamente estabelecida usando-se técnicas padrão. Freqüentemente entre 1 e 10 doses podem ser administradas sobre um período de 51 semanas. Tipicamente 3 doses são administradas, em intervalos de um mês, mais tipicamente 2-3 doses são administradas todo 2-3 meses, é possível que os intervalos sejam mais de uma vez por ano para certas terapias. Vacinações em grupo podem ser dadas periodicamente em seguida. Protocolos alternados podem ser apropriados para pacientes individuais e doenças e enfermidades particulares. Uma dose adequada é uma quantidade de um composto que, quando administrada conforme descrito acima, é capaz de promover, por exemplo, uma resposta imune antitumor, antiviral ou antibacterial, e é pelo menos 10-50% do nível basal (isto é, não tratado). Tal resposta pode ser monitorada pela medição dos anticorpos antitumor em um paciente, ou por geração dependente de vacina de células T citolíticas capazes de matar, por exemplo, as células tumo- rais do paciente, as células viralmente infectadas do paciente, ou as células bacterialmente infectadas do paciente in vitro. Tais vacinas devemtambém serem capazes de causar uma resposta imune que con- duz a um efeito clínico aperfeiçoado (por exemplo, remissões mais freqüentes, sobrevivência livre de doença completa ou parcial ou mais longa) em pacientes vacinados, conforme comparado a pacientes não vacinados. Tipicamente a quantidade das titulações virais estará entre 1,0 X 104 pfu/animal e 1,0 X 1015 pfu/animal. Os tamanhos da dose adequados variarão com o tamanho do paciente, mas tipicamente variará de cerca d 0,01 mL a cerca de 10 mL, mais tipicamente de cerca de 0,025 mL a cerca de 7,5 mL, mais tipicamente de cerca de 0,05 mL a cerca de 5 mL. Aqueles versados na técnica apreciarão que o tamanho da dose pode ser ajustado baseado no paciente particular, ou na doença particular ou enfermidade sendo tratada. Para a administração oral, o vetor adenoviral quimérico pode ser convenientemente formulado em uma pílula.
[000109] Em geral, uma dosagem apropriada e regime de tratamento proporciona o(s) composto(s) em uma quantidade suficiente para pro-porcionarbenefício terapêutico e/ou profilático. Tal resposta pode ser monitorada pelo estabelecimento de um efeito clínico aperfeiçoado (por exemplo, remissões mais freqüentes, sobrevivência livre de doença completa ou parcial ou mais longa) em pacientes tratados, conforme comparado a pacientes não tratados. Tais respostas imunes podem geralmente serem avaliadas usando-se proliferação padrão, cito- toxicidade ou ensaios de citoquina descritos acima, que podem ser realizados usando-se amostras obtidas de um paciente antes e após tratamento.
[000110] Por exemplo, a detecção de imunocomplexos formados en-trepolipeptídeos imunogênicos e anticorpos no fluido corpóreo que são específicos para polipeptídeos imunogênicos, pode ser usada para monitorar a eficiência de terapia, que envolve um polipeptídeo inuno- gênico particular, para uma doença ou enfermidade em que o polipep- tídeo inumogênico é associado. As amostras de fluido corpóreo toma- das de um indivíduo antes e subseqüente a iniciação de terapia podem ser analisadas para os imunocomplexos pelas metodologias descritas acima. Brevemente, o número de imunocomplexos detectado em ambas as amostras é comparado. Uma mudança substancial no número de imunocomplexos na segunda amostra (iniciação de pós-terapia), relativa à primeira amostra (pré-terapia), reflete terapia bem-sucedida. A. Administração das Composições da Presente Invenção
[000111] De acordo com os métodos da presente invenção, uma composição compreendendo o vetor adenoviral quimérico é administrada por qualquer via não-parenteral (por exemplo, oral, intranasal ou mucosalmente via, por exemplo, a vagina, pulmões, glândulas salivares, cavidades nasais, intestino delgado, cólon, reto, amídala, ou emplastros de Peyer). A composição pode ser administrada sozinha, ou com um adjuvante conforme descrito acima. Em algumas concretizações, os adjuvantes são codificados por uma seqüência de ácido nu- cléico (por exemplo, um ácido nucléico que codifica IL-2, GM-CSF, IL- 12, ou flagellin bacterial). Em algumas concretizações da presente in-venção, o adjuvante é administrado ao mesmo tempo, conforme a composição. Em outras concretizações da presente invenção, o adjuvante é administrado após a composição, por exemplo, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 60 ou 72 horas após administração da composição.
B. Detecção de uma Resposta Imune a Antígenos de Interesse
[000112] Uma resposta imune ao polipeptídeo heterólogo pode ser detectada usando-se qualquer meio conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, detecção de ativação específica de células T CD4+ ou CD8+, ou pela detecção da presença de anticorpos que se ligam especificamente ao polipeptídeo.
[000113] A ativação específica de células T CD4+ ou CD8+ associada com uma resposta imune mediada por mucosal, humoral ou célula, pode ser detectada em uma variedade de modos. Os métodos de de- tecção de ativação de célula T específica incluem, mas não estão limitados a, detecção da proliferação de células T, a produção de citoqui- nas (por exemplo, linfoquinas), ou a geração de atividade citolítica (isto é, geração de células T citotóxicas específicas para o polipeptídeo imunogênico). Para células T CD4+, um método preferido para detecção de ativação de célula T específica é a detecção da proliferação de células T. Para células T CD4+, um método preferido para detecção de ativação de célula T específica é a detecção da proliferação de células T. Para células T CD8+, um método preferido para detecção de ativação de célula T específica é a detecção da geração de atividade citolí- tica usando-se ensaios de liberação de 51Cr (vide, por exemplo, Bros- sat e Bevan, Blood 90(4):1594-1599 (1997) e Lenz et al., J. Exp. Med. 192(8):1135-1142 (2000)). A detecção da proliferação de células T pode ser efetuada por uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, a proliferação de célula T pode ser detectada pela medição da taxa de síntese de DNA. As células T que foram estimuladas a proliferarem exibem uma taxa aumentada de síntese de DNA. Um modo típico de medir a taxa de síntese de DNA é, por exemplo, por culturas de pulso-etiquetamento de células T com timidina tritiatada, um precursor de nucleosídeo que é incorporado em um DNA recentemente sintetizado. A quantidade de timidina tritiatada incorporada pode ser modos para detectar proliferação de célula T incluem medição do aumento na produção de interleu- kin-2(IL-2), fluxo de Ca2+, ou percepção de corante, tal como 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il))-2,5-difeniltetrazolium. Alternativamente, a síntese de linfoquinas (por exemplo, interferon-gama) pode ser medida, ou o número relativo de células T que pode responder ao polipeptídeo imuno- gênico pode ser quantificado.
[000114] As respostas imunes de anticorpo (Respostas imunes hu- morais aka ou respostas de célula B), incluindo respostas de anticorpo mucosal, podem ser detectadas usando-se imunoensaios conhecidos na técnica [Tucker et al., Mol. Therapy, 8, 392-399 (2003); Tucker et al., Vaccine, 22, 2500-2504 (2004)]. Imunoensaios adequados incluem a técnica de imunoensaio de intercalamento de anticorpo monoclonal duplo de David et al(Patente dos Estados Unidos N° 4.376.110); ensaios de intercalamento de anticorpo monoclonal-policlonal (Wide et al., em Kirkham e Hunter, eds., Radioimmuneassay Methods, E e S. Livingstone, Edinburgh (1970)); o método de " western blot" de Gordon et al. (Patente dos Estados Unidos N° 4.452.901); imunoprecipitação de ligante etiquetado (Brown et al (1980) J. Biol. Chem. 255:49804983); ensaios imunoabsorventes ligado por enzima (ELISA) conforme descrito, por exemplo, por Raines et al. (1982) J. Biol. Chem. 257:5154-5160; técnicas imunocitoquímicas, incluindo o uso de fluoro- cromos (Brooks et al. (1980) Clin. Exp. Immunol. 39:477); e neutralização de atividade (Bowen-Pope et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2396-2400). Em adição aos imunoensaios descritos acima, um número de outros imunoensaios são disponíveis, incluindo aqueles descritos nas Patentes dos Estados Unidos N°s 3.817.827; 3.850.752; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; e 4.098.876.
Exemplos
[000115] Os seguintes exemplos são pretendidos para ilustrarem, mas não limitarem a presente invenção.
Exemplo 1: Construção de um Vetor Adenoviral Quimérico (DS1)
[000116] Para demonstrar que agonistas TLR-3 podem aperfeiçoar respostas imunes adaptativas a antígenos expressos de interesse, vários vetores adenovirais quiméricos diferentes foram construídos, que compreendem seqüências de ácido nucléico que codificam vários an- tígenos diferentes de interesse. Neste exemplo, o ácido nucléico que codifica gp 120 (a partir do Programa de Reagente de Referência NIH AIDS) foi colocado sob controle de um promotor de CMV com um pe- queno intron imediatamente a montante do códon de partida no vetor de lançadeira (pShuttle, Qbiogene). Uma calda poli A de bGH foi colocada a jusante do ácido nucléico que codifica gp120. A seqüência de vetor é colocada em SEQ ID N°:1. A recombinação homóloga com o vetor pAd (Qbiogene) foi realizada para gerar um vetor capaz de produzir Ad recombinante (E1/E2 retirado), que contém o ácido nucléico que codifica gp120. DS1 foi gerado pela transferência do constructo de expressão pAd-CMV-gp120 nova em 293 células. As titulações foram medidas por métodos padrões.
Exemplo 2: DS1 (vetor mais agonista TLR-3) é superior a rAd5 padrão para indução de uma resposta imune específica de antígeno
[000117] Para determinar se a adição de agonista TLR-3 podia aperfeiçoar respostas imunes adaptativas, 10x107 PFU de ou rAd-CMV- gp120 mais 5 ug/mL de poli I:C (DSI), ou rAd-CMV-gap-120 somente (rAd5), foram administrados a animais por administração oral nas semanas 0 e 3. Ambos os vetores expressam HIV gp120 sob controle do promotor de CVM e usam adenovírus tipo 5 retirado de recombinante E1/E3. Titulações de anticorpo a gp120 foram medidas no plasma 3 e 6 semanas após a administração inicial por anti-gp120 IgG ELISA, conforme descrito em Tucker, et al., Mol. Ther 8:392 (2004)). Conforme mostrado na Figura 1, DSI se portou significantemente melhor do que rAd5 na indução de respostas de anticorpo para gp120 ambos em 3 e 6 semanas pós administração oral inicial. Em particular, a titulação de anticorpo média para gp120 foi 100 vezes melhor com o grupo DSI do que com o grupo rAd5 na semana 6. Parece também que o grupo DSI foi agrupado por re-administração na semana 4 em que a titulação média aumentou mais do que 20 vezes entre as semanas 3 e 6 onde o grupo rAd5 mostrou somente um leve aumento na titulação de anticorpo média. Os resultados demonstraram que a adição de um agonista TLR-3 pode aperfeiçoar grandemente respostas de anticorpo media- das por Ad5 a antígenos de interesse em seguida a administração oral de um vetor adenovírus quimérico compreendendo um ácido nucléico que codifica o antígeno de interesse. Como um controle positivo para o ensaio, soro de um animal injetado subcutaneamente com gp120 mais Adjuvante Completo de Freund foi também medido no anti-gp120 ELISA na semana 3. Os animais não-tratados e animais administrados com o análogo dsRNA somente (dsRNA) serviram como controles negativo e antecedentes respectivamente para a ELISA. Cada grupo contém 6 animais.
Exemplo 3: Construção de Um Segundo Vetor Adenoviral Quimérico (DS1b) e um Terceiro Vetor Adenoviral Quimérico (DS1c)
[000118] Um ácido nucléico que codifica proteína fluorescente verde (GFP) foi inserido em pShuttle-CMV (Qbiogene) usando-se digestões de enzima de restrição padrão. O plasmídeo pShuttleCMV-GFP foi combinado por recombinação homóloga com o vetor pAd(Qbiogene), conforme descrito antes, de modo a gerar um vetor capaz de produzir recombinante Ad(E1/E3 retirado) compreendendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica GFP. Um ácido nucléico que codifica he- maglutinin (HA) de gripe A/PR/8/34 foi clonado e colocado no vetor pShuttle-CMV (Qbiogene) (SEQ ID N°:13). O plasmídeo pShuttleCVM- HA (PR/8) foi combinado por recombinação homóloga com o vetor pAd(Qbiogene), conforme descrito antes, de modo a gerar um vetor capaz de produzir recombinante Ad(E1/E3 retirado) compreendendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica HA. O recombinante Ad foi gerado por transfecção do novo constructo de expressão de pAd- CMV-GFP e pAd-CMV-HA em 239 células. As titulações foram medidas por métodos padrões.
Exemplo 4: DS1b (Ad-CMV-GFP mais agonista LTR-3) e DS1c (Ad- CMV-HA mais agonista TLR-3) é superior a rAd5 padrão para indução de uma resposta imune específica de antígeno.
[000119] 1,0x107 PFU de ou Ad-CMV-GFP mais 5 ug/mL de poli I:C (DS1b), ou Ad-CMV-GFP (rAd5), foram administrados a animais por administração oral na semana 0. Ambos os vírus expressam o GFP sob controle do promotor de CVM e usam adenovírus tipo 5 retirado de recombinante E1/E3. Titulações de anticorpo para GFP foram medidas no plasma 3 semanas após a administração de vírus inicial por anti- GFP IgG ELISA. Conforme mostrado na Figura 2, o grupo DS1b se portou significantemente melhor do que rAd5 na indução de respostas de anticorpo para GFP em 3 semanas pós administração oral inicial.
[000120] As respostas de célula T CD8+ para GFP foram medidas por tratamento de manchamento de esplenócitos. Os animais foram vacinados nas semanas 0, 4, 8, e os baços foram colhidos na semana 10. Os esplenócitos foram manchados com CD8-FITC, e o tetrâmero que reconhece o epítope imunodominante para GFP em Balb/c camundongos. Os resultados mostram que administração oral do vetor DS1b foi estatisticamente melhor do que rAd sozinho na indução de células CD8 de tetrâmero (Figura 2b).
[000121] 1,0x107 PFU de ou Ad-CMV-HA mais 5 ug/mL de poli I:C (DS1c), ou Ad-CMV-HA (rAd5), foram administrados a animais por administração oral na semana 0. Ambos os vírus expressam HA sob controle do promotor de CVM e usam adenovírus tipo 5 retirado de re- combinante E1/E3. Titulações de anticorpo para HA foram medidas no plasma 3 semanas após a administração de vírus inicial por anti- PR8/34 IgG ELISA. O procedimento para medição de respostas de anticorpo é similar àquele descrito antes, com a exceção que as placas de ELISA foram revestidas com 5 ug/mL de lisato A/PR8/34 total (Advanced Biotechnology Incorporated, Gaithersburg, MD). Conforme mostrado na Figura 2C, o grupo DS1c se portou significantemente melhor (aproximadamente 100 vezes melhor) do que rAd5 na indução de respostas de anticorpo para gripe em 3 semanas pós administração oral inicial. Os resultados destes estudos demonstraram também que a aproximação de usar-se agonista TLR-3 junto com um vetor adenoviral recombinante quimérico pode ser geralmente aplicada a antígenos he- terólogos diferentes múltiplos, com um aperfeiçoamento de 100 vezes na titulação de anticorpo.
Exemplo 5: As Vias Não-Parenterais de Distribuição São Superiores a Vias Parenterais
[000122] A distribuição intramuscular foi testada por injeção diretamente de 1,0x107 pfu de pAd-CMV-gp120 (DS10+/-poli I:C em 5 ug/mL nos quadrícepes de animais. Titulações de IgG de soro de plasma para GFP foram medidas conforme descrito acima. Cada grupo continha 6 animais. Conforme mostrado na Figura 3A, titulações de anticorpo significantes em gp120 foram observadas em 3 semanas pós administração no grupo com agonista TLR-3 (i.m. rAd+PI). (Figura 3A).
[000123] A administração intranasal foi testada por administração de 20 ul de 1,1x106 pfu de DS1c+/5 ug/mL de poli I:C na cavidade nasal de camundongos. Os camundongos foram levemente anestesiados com isoflurano antes da administração do vírus formulado em solução salina estéril. Os resultados mostram que o rAd-CMV-HA mais poli I:C (DS1c) tinham titulações de anticorpo levemente mais altas comparadas a animais dado o padrão rAd-CMV-HA. Os resultados são plota- dos como animais individuais para os grupos DS1c (N=6) e rAd (N=5). Animais não-tratados (N=4) são usados para controles negativos.
Exemplo 6: Construção de um agonista TLR-3 expresso.
[000124] Um segmento curto de 45 bp de DNA foi sintetizado por ordenação de oligos de DNA que quando recozidos juntos formam um segmento de 45 bp designado para produzir um grampo de cabelo de RNA de filamento duplo (GAAACGATATGGGCTGAATACGGA- TCCGTATTCAGCCCATATCGTTTC) (SEQ ID N°:10). Este segmento curto (denominado luc1) foi clonado no plasmídeo pSK contendo o promotor beta actinahumano e uma cauda A poli BGH. Este plasmídeo é denominado pSkluc1.
Exemplo 7: As funções pSK-luc1 em culturas de célula dendrítica similars a poli I:C, os efeitos de poli I:C e rAd são aditivos.
[000125] Para determinar se o agonista TLR-3 expresso do Exemplo 6 acima pode funcionar como um indutor de citoquinas pró- inflamatórias e maturação de célula dendrítica similares a poli I:C li- gante de TLR-3, um agonista dsTLR-3 expresso foi testado em culturas de célula dendrítica. Tutanos de osso de fêmures de camundongos Balb/c foram cultivados com ligante ftl-3 (200 ng/m), 5% de soro, em meio DMEM de modo a produzir culturas de célula dendrítica primária. Cinco dias após as culturas de tutano de osso primária serem assentadas, 293 células foram transfectadas com, ou pSk-luc1, pSK-beta 2 (um segmento longo de beta galactosidase que forma um grampo de cabelo de 200 bp), ou pcDNA3 (vetor de expressão vazio). No dia 6, as células transfectadas foram tratadas por irradiação UV (20 segundos a 40 kL/cm2) para causar apoptose, e estas células foram dadas para as células dendríticas. Ou poli I:C (1 ug/mL), rAd (1 pfu/célula), rAd + poli I:C, células transfectadas pSK-luc1, células transfectadas pSK-bera2, ou células transfectadas pcDNA3, foram dados para as células dendríticas, e cultivadas durante toda a noite. Conforme mostrado na Figura 4A, células transfectadas pSK-luc1 podem aperfeiçoar significantemente ativação de célula dendrítica conforme medida pelo camundongo IL-6 ELISA. Os resultados deste experimento também mostram que a combinação de rAd mais ligante de TLR-3 (poli I:C) juntos pode aperfeiçoar grandemente a atividade da célula dendrítica.
[000126] Ligantes adicionais também foram testados. O agonista TLR-3 colocado em SEQ ID N°:11 (mL) também forma um grampo de cabelo de dsRNA de aproximadamente o mesmo tamanho como luc1. Estes foram produzidos por sobreposição de oligonucleotídeos e reco- zimento dos mesmos juntos antes de clonagem no vetor pSK sob controle do promotor beta actinahumano. Os vetores foram transfectados em 293 células e dados às células dendríticas primárias, conforme descrito antes. Conforme mostrado na Figura 4B, estes ligantes adicionais podem ativar células dendríticas similares àquelas do ligante luc1 (Figura 4B). Exemplo 8: Construção de um Quarto Vetor Adenoviral Quimérico (DS2) e vetores de clonagem rápida (DS2beta-luc e DS2C-luc). Um ácido nucléico que codifica gp120 (do Programa de Reagente de Pesquisa e Referência de NIH AIDS) foi colocado sob controle de um promotor de CVM com um pequeno intron imediatamente a montante do códon de partida no vetor de lançadeira (pShuttleCMV, Qbiogene). Uma cauda poli A de bGH foi colocada a jusante do ácido nucléico que codifica gp120. O agonista dsRNA TLR-3 luc1 sob o controle do promotor beta actinahumano e poli A (descrito no exemplo 5 acima) foi inserido no vetor gp120 pShuttle, tal que ambos o ácido nucléico que codifica gp120 e o ácido nucléico que codifica agonista TLR-3 estavam contidos em um vetor simples sob o controle de dois promotores separados. A orientação da expressão do ácido nucléico que codifica o an- tígeno de interresse e a expressão do agonista TLR-3 é ilustrada na Figura 5.
[000127] Dois vetores de lançadeira genéricos denominados DS2beta-luc (SEQ ID N°:14) e DS2-luc (SEQ ID N°:15) foram também construídos tal que o ácido nucléico que codifica qualquer antígeno de interesse podia ser inserido sob o promotor de CMV e, ou o promotor beta actinahumano ou o promotor de CMV, é usado para acionar expressão de um agonista dsRNA TLR-3. Em particular, o vetor DS2-luc tem um local Kpn 1 único que um ácido nucléico que codifica um antí- geno de interesse pode facilmente ser clonado. A proposta destes vetores é produzir construção de vetor subseqüente mais fácil porque um ácido nucléico que codifica qualquer antígeno de interesse podia ser inserido no local de clonagem para manufaturar rapidamente um vetor capaz de induzir anticorpo e respostas de célula T contra o antígeno de interesse. Recombinação homóloga de DS2 com o vetor pAd (Qbi- ogene) foi realizada como antes de modo a gerar um vetor capaz de produzir recombinante Ad (E1/E3 retirado) que continha um ácido nu- cléico que codifica GFP e um ácido nucléico que codifica o agonista dsRNA TLR-3 luc1. O recombinante Ad foi gerado por transfecção do novo constructo de expressão de pAd-betaactin-luc1-CMV-gp120 em 293 células. As titulações foram medidas por métodos padrões.
Exemplo 9: Indução de uma reposta imune específica de antígeno em seguida a distribuição oral de DS2.
[000128] 1,0x107 PFU de, ou pAd-CMV-gp120 mais o agonista TLR- 3 luc1 (DS2), ou pAd-CMV-gp120 (rAd5), foram administrados a animais por administração oral na semana. Ambos os vírus expressam gp120 sob controle do promotor de CVM e usam adenovírus tipo 5 retirado de recombinante E1/E3. Titulações de anticorpo para gp120 foram medidas no plasma 3 semanas após a administração de vírus por anti- gp120 IgG ELISA. O protocolo ELISA foi descrito antes (Tucker, et al, Mol. Therapy 8:392 (2004)). Os resultados demonstraram que DS2 pode induzir aproximadamente um aperfeiçoamento de 2 log na titulação de anticorpos para gp120, o antígeno heterólogo usado no experimento. O vetor DS2 compreende uma seqüência de ácido nucléico que codifica expressão de gp120 e uma seqüência de ácido nucléico que codifica expressão de um agonista dsRNA TLR03. Como um controle positivo para o ensaio, soro de dois animais injetados subcutaneamente com 10 microgramas de proteína de gp120 mais Adjuvante Completo de Freund, foi também medido no anti-gp120 ELISA. Os animais não- tratados serviram como controles negativos para ELISA. Cada grupo continha 6 animais. Os resultados são ilustrados na Figura 6.
Exemplo 10: Indução de um resposta imune específica de antígeno em seguida a distribuição oral de DS3.
[000129] 1,0x107 PFU de, ou pAd-CMV-HA de gripe (de A/PR/8/34) mais o ácido poliuridílico ligante TLR7/8 (DS3), ou pAd-CMV-HA (rAd5), foram administrados a animais por administração oral na semana 0. Ambos os vírus expressam HA de gripe sob controle do promotor de CVM e usam adenovírus tipo 5 retirado de recombinante E1/E3. Titulações de anticorpo para HA foram medidas no plasma 3 semanas após a administração de vírus por HA de anti-gripe IgG ELISA. Cada grupo continha 6 animais. Os resultados são ilustrados na Figura 7.
Exemplo 11: Construção de um quinto, sexto e sétimo vetor adenoviral quimérico para, e (DS2b, DS2b e ND1.1 214).
[000130] O gene de HA de gripe (A/Indo/5/2005) foi sintetizado por CelTek (Nashville, TN), e colocado no vetor pShuttleCMV (Qbiogene) que tinha um promotor de CMV com um pequeno intron imediatamente a montante do códon de partida no vetor de lançadeira. O luc1 DNA com promotor beta actinahumano e poli A (descrito no exemplo 5) foram colocados no vetor a jusante do antígeno, na orientação mostrada na figura 5 para DS2b. A seqüência de luc1 é (GAAACGATATGGG- CTGAATACGGATCCGTATTCAGCCCATATCGTTTC) (SEQ ID N°:10), e o vetor pShuttle completado é colocado em SEQ ID N°:6. Uma orientação alternativa de luc1 com promotor em um vetor de lançadeira é descrita como SEQ ID N°:7, e é designada DS2b-for. Nós também construímos outro vetor pShuttle (denominado DS2bC-HA) (SEQ ID N°:16) que compreende dois promotores separados que acionam expressão do agonista TLR-3 luc1 e HA de gripe acima descrito. A recom- binação homóloga com o vetor pAd (Qbiogene) foi realizada como antes de modo a gerar vetores capazes de produzir recombinante Ad (E1/E3 retirado) que continha o ácido nucléico que codifica HA e o agonista TLR-3 luc1 sob promotores separados. O recombinante Ad foi gerado por transfecção do novo constructo pAd em 293 células. As titulações foram medidas por métodos padrões. O vetor pAD completado contendo DS2C-luc foi denominado ND1.1 214 e depositado no depósito de patente ATCC em 22 de fevereiro de 2007 (Manassus, VA). A seqüên- cia de ácido nucléico deste vetor adenoviral quimérico é colocada em SEQ ID N°:17. O ácido nucléico que codifica o antígeno heterólogo está no texto em negrito, e é flanqueado por um local de reconhecimento Cla I na extremidade 5’, e um local de reconhecimento Not I na extremidade 3’. A seqüência de ácido nucléico que codifica os agonistas TLR-3 está em itálico, com a seqüência ligadora em negrito. Uma seqüência de ácido nucléico que codifica qualquer antígeno de interesse, e uma se- qüência de ácido nucléico que codifica qualquer agonista TLR-3 expresso, podem ser inseridas no vetor adenoviral quimérico.
Exemplo 12: Indução de uma resposta imune específica de antígeno em seguida a distribuição oral de DS2b.
[000131] 1,0x107 PFU de, ou pAd-CMV-HA mais os agonistas TLR-3 luc1 na orientação reversa (DS2b-for), ou orientação de avanço (DS2b), ou pAd-CMV-HA (rAd5), foram administrados a animais por administração oral na semana 0. Estes vírus expressam HA de gripe de antígeno sob controle do promotor de CVM, e usam adenovírus tipo 5 retirado de recombinante E1/E3. Titulações de anticorpo para HA foram medidas no plasma 3 semanas após a administração de vírus por HA de anti-HA IgG ELISA. Os resultados demonstraram que o vetor DS2b induziu respostas de anticorpo para proteína HA maior do que o vetor rAd padrão (rAd5). O vetor DS2b contém rAd5 que expressa HA, bem como expressa um agonista de receptor 3 do tipo toll (TLR-3), um grampo de cabelo de RNA de filamento duplo, demonstrando que o uso do ligante de dsRNA pode aperfeiçoar respostas imunes adaptativas a antígenos de interesse. Conforme mostrado na Figura 8A e Figura 6, dsRNA expresso pode aperfeiçoar respostas imunes adaptativas a antígenos heterólogos diferentes múltiplos. Os animais não-tratados serviram como controle negativo para ELISA. Cada grupo continha 6 animais.
[000132] Os vetores na orientação oposta (DS2for) foram examinados para respostas de anticorpo em seguida, ou a administração oral, ou intramuscular de 1,0x107 pfu de vírus por animal nas semanas 0 e 5. As respostas de anticorpo para HA foram medidas nas semanas 4 e 7 pós administração inicial. Conforme mostrado na Figura 8B, o vetor de orientação oposta pode também induzir respostas de anticorpo substanciais para antígenos heterólogos. Os vetores DS1b e DS1bfor induzem respostas similares para HA no ponto de tempo de semana 4. Significantemente, o efeito de agrupamento da resposta de anticorpo foi demonstrado com o vetor DS1for, e mostrou que doses múltiplas podiam ser usadas para aumentar as respostas de anticorpo ao antígeno heterólogo. Outro exemplo de potencial da aproximação de vetor adenoviral quimérico foi demonstradotambém. O vetor ND1. 1 214 foi dado a animais por administração oral (1,0 x 107 pfu) ou intranasal (3x106 pfu), e as respostas de anticorpo ao antígeno heterólogo foram medidas na semana 3. Conforme mostrado na Figura 8C, respostas de anticorpo substanciais para HA foram medidas em seguida a administração oral, bem além dos valores típicos de uma administração oral simples de vetor rAd.
[000133] Todas as publicações, publicações de patente, patentes, pedidos de N°s de Acesso no Banco de Genes citados neste relatório descritivo são aqui incorporados por referência em sua totalidade para todas as propostas como se cada publicação individual, publicação de patente, ou patentes, fossem especificamente e individualmente indicadas para serem incorporados por referência.

Claims (12)

1. Vetor de expressão adenoviral quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende um cassete de expressão compreendendo os seguintes elementos: (a) um primeiro promotor operavelmente ligado a um ácido nucléico que codifica um agonista de receptor do tipo toll - 3 (TLR-3), em que o agonista de TLR-3 é dsRNA heterólogo e em que o ácido nucleico que codifica o agonista de TLR-3 compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 e 12; e (b) um segundo promotor operavelmente ligado a um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo heterólogo imunogênico.
2. Vetor de expressão adenoviral quimérico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro promotor e o segundo promotor são os mesmos, opcionalmente, em que o primeiro promotor e o segundo promotor são cada um promotor de CMV.
3. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão como definido na reivindicação 1 ou 2, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
4. Vetor de expressão adenoviral quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende um cassete de expressão que compreende os seguintes elementos: (a) um primeiro promotor operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica um agonista do receptor do tipo toll - 3 (TLR-3), em que o agonista de TLR-3 é dsRNA heterólogo; e (b) um segundo promotor operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo heterólogo imunogênico, para uso em um método de tratamento para induzir uma resposta imune, referido método compreendendo administrar uma quantidade imu- nologicamente eficaz do vetor como definido na reivindicação 1, a um indivíduo mamífero, tal como um humano, no qual a resposta imune é dirigida contra os polipeptídeos heterólogos, e no qual a via de administração é selecionada a partir do grupo consistindo em oral, intranasal e mucosal, tal como vaginal.
5. Vetor para uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo heterólogo é expresso em uma célula selecionada a partir do grupo consistindo em uma célula dendrítica, uma célula de microdobra, e uma célula epitelial intestinal.
6. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dsRNA heterólogo é RNA curto em grampo (shRNA).
7. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreendendo: (a) um vetor de expressão adenoviral quimérico compreendendo um promotor operavelmente ligado a um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo heterólogo imunogênico; (b) um agonista de TLR-3, em que o agonista de TLR-3 é dsRNA heterólogo; e (c) um veículo farmaceuticamente aceitável, para uso em um método de tratamento para induzir uma resposta imune, o referido método compreendendo administrar uma quantidade imunologicamente eficaz do vetor como definido na reivindicação 1, a um indivíduo mamífero, tal como um humano, no qual a resposta imune é dirigida contra os polipeptídeos heterólogos, e no qual a via de administração é selecionada a partir do grupo consistindo em oral, intranasal e mucosal, tal como vaginal.
8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o promotor é um promotor de CMV.
9. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o agonista de TLR-3 é um ácido nucléico compreendendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 e 12.
10. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo heterólogo é expresso em uma célula selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula den- drítica, uma célula de microdobra e uma célula epitelial intestinal.
11. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o dsRNA heterólogo é RNA curto em grampo (shRNA).
12. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, vetor de acordo com a reivindicação 4, ou composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo heterólogo é: (a) um polipeptídeo env de HIV, tal como um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em gp41, gpl20 e gpl60; (b) um polipeptídeo HA de influenza; (c) um antígeno do vírus herpes simplex (HSV); ou (d) um antígeno do vírus de papiloma humano (HPV).
BRPI0708344A 2006-02-28 2007-02-28 vetores adenovirais quiméricos e composição imunogênica BRPI0708344B8 (pt)

Applications Claiming Priority (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77802606P 2006-02-28 2006-02-28
US60/778,026 2006-02-28
US80164506P 2006-05-19 2006-05-19
US60/801,645 2006-05-19
US80299206P 2006-05-22 2006-05-22
US60/802,992 2006-05-22
US82149206P 2006-08-04 2006-08-04
US60/821,492 2006-08-04
US84665806P 2006-09-22 2006-09-22
US60/846,658 2006-09-22
US84819506P 2006-09-28 2006-09-28
US60/848,195 2006-09-28
PCT/US2007/005386 WO2007100908A2 (en) 2006-02-28 2007-02-28 Chimeric adenoviral vectors

Publications (4)

Publication Number Publication Date
BRPI0708344A2 BRPI0708344A2 (pt) 2011-05-24
BRPI0708344A8 BRPI0708344A8 (pt) 2016-05-31
BRPI0708344B1 true BRPI0708344B1 (pt) 2021-05-11
BRPI0708344B8 BRPI0708344B8 (pt) 2021-05-25

Family

ID=38459683

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0708344A BRPI0708344B8 (pt) 2006-02-28 2007-02-28 vetores adenovirais quiméricos e composição imunogênica

Country Status (23)

Country Link
US (3) US7879602B2 (pt)
EP (1) EP1996238B1 (pt)
JP (1) JP5016614B2 (pt)
KR (2) KR101105511B1 (pt)
CN (2) CN103122360A (pt)
AP (1) AP2844A (pt)
AU (1) AU2007220988B2 (pt)
BR (1) BRPI0708344B8 (pt)
CA (1) CA2638757C (pt)
DK (1) DK1996238T3 (pt)
EA (1) EA014757B1 (pt)
ES (1) ES2573456T3 (pt)
HR (1) HRP20160795T1 (pt)
HU (1) HUE030281T2 (pt)
IL (2) IL193684A (pt)
LT (1) LT1996238T (pt)
MY (1) MY154956A (pt)
NZ (1) NZ571010A (pt)
PL (1) PL1996238T3 (pt)
PT (1) PT1996238T (pt)
RS (1) RS54843B1 (pt)
SI (1) SI1996238T1 (pt)
WO (1) WO2007100908A2 (pt)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1996238T (pt) * 2006-02-28 2016-07-11 Vaxart Inc Vetores adenovíricos quiméricos e arncd como agonista de tlr3
WO2009073133A1 (en) * 2007-11-29 2009-06-11 Vaxinnate Corporation Compositions of toll-like receptor agonists and papillomavirus antigens and uses thereof
WO2010036293A1 (en) * 2008-09-24 2010-04-01 The Johns Hokins University Malaria vaccine
EP2459716B1 (en) * 2009-07-31 2016-08-17 Paxvax, Inc. Adenoviral-based vectors
WO2011034950A1 (en) * 2009-09-16 2011-03-24 Vaxart, Inc. Immunization strategy to prevent h1n1 infection
US9198959B2 (en) * 2011-02-22 2015-12-01 Regents Of The University Of Minnesota Adenovirus vaccine vector and methods of use
US10183069B2 (en) 2011-03-21 2019-01-22 Altimmune Inc. Rapid and prolonged immunologic-therapeutic
RU2677799C2 (ru) 2012-12-11 2019-01-21 Озивакс Сас Модифицированные суперспиральные белки с улучшенными свойствами
WO2015035128A1 (en) * 2013-09-06 2015-03-12 Vaxin Inc. Methods and compositions for viral vectored vaccines
EP3107568B1 (en) 2014-02-20 2024-03-27 Vaxart, Inc. Formulations for small intestinal delivery
EP3421046A1 (en) 2014-11-04 2019-01-02 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Therapeutic hpv16 vaccines
AU2016249798B2 (en) 2015-04-14 2022-05-26 Janssen Vaccines And Prevention B.V. Recombinant adenovirus expressing two transgenes with a bidirectional promoter
KR102678401B1 (ko) 2015-06-12 2024-06-26 박사르트, 인크. Rsv 및 노로바이러스 항원들의 소장 내의 전달을 위한 제형들
HK1252967A1 (zh) 2015-08-20 2019-06-06 Janssen Vaccines & Prevention B.V. 治疗性hpv18疫苗
GB201603577D0 (en) 2016-03-01 2016-04-13 Oxford Genetics Ltd Promoter
EP3452087A1 (en) 2016-05-02 2019-03-13 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Therapeutic hpv vaccine combinations
BR112018072865A2 (pt) 2016-05-12 2019-04-30 Janssen Vaccines & Prevention B.V. promotor bidirecional potente e equilibrado
US11001858B2 (en) 2016-06-20 2021-05-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and balanced bidirectional promoter
CA3045944A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Progenity, Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
US11205103B2 (en) 2016-12-09 2021-12-21 The Research Foundation for the State University Semisupervised autoencoder for sentiment analysis
WO2018112223A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a tlr modulator
WO2018127702A1 (en) * 2017-01-06 2018-07-12 Stabilitech Biopharma Ltd Virus
JP6721797B2 (ja) 2017-02-09 2020-07-15 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 異種遺伝子発現のための強力で短いプロモーター
WO2021168577A1 (en) * 2020-02-25 2021-09-02 Symvivo Corporation Gene delivery system
WO2021174024A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 First Wave Bio, Inc. Methods of treating iatrogenic autoimmune colitis
US20230210980A1 (en) * 2020-06-05 2023-07-06 Vaxart, Inc. Chimeric adenoviral vectors
EP4175640A1 (en) 2020-07-02 2023-05-10 VIIV Healthcare Company Method of achieving hiv viral remission using long-acting antiretroviral agents
KR20240027571A (ko) * 2021-02-01 2024-03-04 박사르트, 인크. 키메라 아데노바이러스 벡터들
AU2024333337A1 (en) 2023-08-25 2026-03-12 Assaad A. Eid Remote-controlled alteration/induction of cellular apoptosis and methods of use
CN119925586A (zh) * 2025-01-24 2025-05-06 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 一种内置核酸佐剂的新冠病毒b.1.1.529变异株口服疫苗及其制备方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6511845B1 (en) * 1992-08-07 2003-01-28 Alan R. Davis Methods for producing an immune response against HIV-1
US5676950A (en) * 1994-10-28 1997-10-14 University Of Florida Enterically administered recombinant poxvirus vaccines
US20020155127A1 (en) 2000-06-02 2002-10-24 Danher Wang Genetic vaccine against human immunodeficiency virus
US20020182223A1 (en) * 2000-06-02 2002-12-05 Lacount Douglas J. Method of rapidly generating double-stranded RNA and methods of use thereof
EP1327688A1 (en) * 2002-01-14 2003-07-16 Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs Adenoviruses with enhanced lytic potency
US20050239728A1 (en) * 2002-07-31 2005-10-27 Pachuk Catherine J Double stranded rna structures and constructs, and methods for generating and using the same
AU2004263037B2 (en) * 2003-08-11 2011-02-10 Japan As Represented By The Director-General Of National Institute Of Infectious Diseases Novel vaccine containing adjuvant capable of inducing mucosal immunity
GB0321615D0 (en) * 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
EP1586654A1 (en) * 2004-04-15 2005-10-19 Vereniging voor christelijk hoger onderwijs, wetenschappelijk onderzoek en patiëntenzorg Replication competent viruses capable of silencing virus inhibitory factor expression
JP2008506789A (ja) * 2004-07-18 2008-03-06 シーエスエル、リミテッド インターフェロン−ガンマ応答強化を誘発するための免疫刺激複合体及びオリゴヌクレオチド処方物
PT1996238T (pt) * 2006-02-28 2016-07-11 Vaxart Inc Vetores adenovíricos quiméricos e arncd como agonista de tlr3

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007100908A3 (en) 2008-11-27
CN103122360A (zh) 2013-05-29
BRPI0708344A8 (pt) 2016-05-31
EP1996238B1 (en) 2016-04-06
AP2844A (en) 2014-02-28
HUE030281T2 (en) 2017-05-29
KR20110132637A (ko) 2011-12-08
KR20080105120A (ko) 2008-12-03
EA014757B1 (ru) 2011-02-28
WO2007100908A2 (en) 2007-09-07
DK1996238T3 (da) 2016-08-01
IL229523A0 (en) 2013-12-31
AP2008004612A0 (en) 2008-10-31
CA2638757A1 (en) 2007-09-07
IL193684A (en) 2013-12-31
US20130164326A1 (en) 2013-06-27
US7879602B2 (en) 2011-02-01
JP2009533018A (ja) 2009-09-17
AU2007220988B2 (en) 2010-06-03
KR101273836B1 (ko) 2013-06-11
US8999946B2 (en) 2015-04-07
KR101105511B1 (ko) 2012-01-16
US20070269410A1 (en) 2007-11-22
ES2573456T3 (es) 2016-06-08
NZ571010A (en) 2010-11-26
PL1996238T3 (pl) 2016-12-30
LT1996238T (lt) 2016-09-12
EA200801907A1 (ru) 2009-02-27
CN101432291A (zh) 2009-05-13
PT1996238T (pt) 2016-07-11
IL193684A0 (en) 2011-08-01
MY154956A (en) 2015-08-28
AU2007220988A1 (en) 2007-09-07
BRPI0708344B8 (pt) 2021-05-25
IL229523A (en) 2016-08-31
EP1996238A2 (en) 2008-12-03
CN101432291B (zh) 2013-03-20
RS54843B1 (sr) 2016-10-31
US8222224B2 (en) 2012-07-17
CA2638757C (en) 2014-01-21
JP5016614B2 (ja) 2012-09-05
SI1996238T1 (sl) 2016-10-28
BRPI0708344A2 (pt) 2011-05-24
EP1996238A4 (en) 2011-08-24
HRP20160795T1 (hr) 2016-08-12
US20110081375A1 (en) 2011-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8222224B2 (en) Chimeric adenoviral vectors
CA2434546C (en) Induction of immune response by a replication-defective venezuelan equine encephalitis-sindbis chimeric virus replicon particle encoding an antigen
AU2018306614B2 (en) Methods and compositions for heterologous repRNA immunizations
US8617533B2 (en) Multi-antigenic alphavirus replicon particles and methods
ES2924400T3 (es) Mutantes por deleción de Brachyury, vectores que no son de levadura que codifican mutantes por deleción de Brachyury y su uso
JP2023534900A (ja) 自己増幅ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２ｒｎａワクチン
WO2021242793A2 (en) Nucleic acid artificial mini-proteome libraries
WO2025240698A1 (en) Improved adenoviral vectors for antigen delivery
ES2358887T3 (es) Inmunización de las mucosas con ácido nucleico.

Legal Events

Date Code Title Description
B15K Others concerning applications: alteration of classification

Free format text: AS CLASSIFICACOES ANTERIORES ERAM: C07H 21/00 , C07H 21/02 , C07H 21/04 , C12N 15/63 , A61K 48/00

Ipc: C12N 15/861 (2006.01), C12N 15/48 (2006.01), C12N

B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 28/02/2007, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME MEDIDA CAUTELAR DE 07/04/2021 - ADI 5.529/DF

B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 28/02/2007 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF

B09W Correction of the decision to grant [chapter 9.1.4 patent gazette]

Free format text: RETIFICA-SE O DEFERIMENTO NOTIFICADO NA RPI NO 2617 DE 02/03/2021.