RS54843B1 - Himerni adenovirusni vektori i dsrna kao tlr3 agonist - Google Patents

Himerni adenovirusni vektori i dsrna kao tlr3 agonist

Info

Publication number
RS54843B1
RS54843B1 RS20160431A RSP20160431A RS54843B1 RS 54843 B1 RS54843 B1 RS 54843B1 RS 20160431 A RS20160431 A RS 20160431A RS P20160431 A RSP20160431 A RS P20160431A RS 54843 B1 RS54843 B1 RS 54843B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
nucleic acid
tlr
vector
agonist
polypeptide
Prior art date
Application number
RS20160431A
Other languages
English (en)
Inventor
Sean N Tucker
Original Assignee
Vaxart Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vaxart Inc filed Critical Vaxart Inc
Publication of RS54843B1 publication Critical patent/RS54843B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • C12N15/8613—Chimaeric vector systems comprising heterologous sequences for production of another viral vector
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Himerni adenovirusni vektor ekspresije, navedeni vektor sadrži ekspresionu kasetu koja sadrži sledeće elemente:(a) prvi pokretač operativno vezan za nukleinsku kiselinu koja kodira toll-sličan receptor- 3 (TLR-3) agonist, naznačen time da je TLR-3 agonist heterologna dsRNA i naznačen time da nukleinska kiselina koja kodira TLR-3 agonist sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEK ID BR: 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, i 12; i(b) drugi pokretač operativno vezan za nukleinsku kiselinu koja kodira imunogeni heterologni polipeptid.Prijava sadrži još 11 patentnih zahteva.

Description

STANJE TEHNIKE
[00011 Vakcine su važna sredstva za prevenciju i/ili lečenje brojnih oboljenja i poremećaja (npr.,virusnih infekcija, bakterijskih infekcija, i kancera). Vakcine na bazi nukleinskih kiselina imaju nekoliko prednosti u odnosu na proteinske ili oslabljene-žive vakcine. Uvođenje nukleinske kiseline koja eksprimira antigen u ciljnoj ćeliji omogućava brz razvoj vakcine koja generiše imuni odgovor protiv antigena od interesa. Za proteinske vakcine efektivan i efikasan metod prečišćavanja proteina treba da se razvija svaki put kada se nova vakcina kreira. 2a proizvodnju živih vakcina metod slabljenja treba biti iđentifikovan tako da ne zaustavi u potpunosti rast patogena, a koji se ipak pokazao da je u potpunosti bezbedan za ljudsku upotrebu. Razvoj metoda prečišćavanja proteina i metodologija slabljenja su izuzetno vremenski dugotrajni procesi. Nasuprot tome, većina vakcina na bazi nukleinskih kiselina može biti proizvedena veoma brzo koriščenjem istih tehnika proizvodnje svaki put samo sa brzom promenom nukleinske kiseline koja kodira antigen od interesa. Adenovirus nesposoban za replikaciju je jedan sistem vakcine na bazi nukleinske kiseline koji je brz, predvidljiv i nije skup kada se izrađuje u visokom titru (Polo, J.M and Dubenskv, T.W., Jr. Drug Oiscov Todav, 7(13), 719-727(2002)).Međutim, efikasnost antigen- specifičnog odgovora koja prati primenu adenovirusnih vektora je veoma malo poznata u stanju tehnike. Dokument US65I1845 opisuje imunizaciju pomoću intranazalne primene adenovtrusnog vektora koji izražava antigen, praćenu jednom ili više intranazalnih ili intramuskularnih pojačivača primenom (ama) navedenog rekombinantnog adenovirusa. Dokument VVO2005014038 opisuje adjuvantni efekat dsRNA na mukozalni imunitet indukovan protiv subjedinice antigena ili inaktivisanog antigena patogena.Stoga, postoji potreba u tehnici za novim adenovirusnim vektorima koji mogu biti korišćeni da efikasno izazivaju imuni odgovor protiv antigena od interesa. Predmetni pronalazak zadovoljava ove i druge potrebe.
SUŠTINA PRONALASKA
|0002] Predmetni pronalazak u najširem smislu je definisan nezavisnim patentnim zahtevima.100031Jedna realizacija ovog pronalaska obezbeđuje himerni adenovirusni ekspresioni vektor, navedeni vektor sadrži ekspresionu kasetu koja se sastoji od sledećih elemenata: (a) prvi pokretač je operativno vezan za nukleinsku kiselinu koja kodira toli sličan receptor (TLR)-3 agonist, naznačen time daje TLR-3 agonist heterologna dsRNA i naznačen time da nukleinska kiselina koja kodira TLR-3 agonist sadrži sekvence izabrane iz grupe koja sadrži: SEK 1D BR-i: 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, i 12; i (b) drugi pokretač je operativno vezan za nukleinsku kiselinu koja kodira imunogeni heterologni polipeptid. U nekim izvođenjima, heterologni polipeptid je izabran od H1V omotač polipeptida (npr. gp4l, gpl20 ili gp 160) i influenza HA polipeptida.U nekim izvođenjima prvi i drugi pokretači su isti.U nekim izvođenjima prvi i drugi pokretači su različiti. U nekim izvođenjima pokretači su izabrani od beta aktin pokretača i CMV pokretača. Pronalazak takode obezbeđuje imunogene kompozicije koje sadrže ekspresioni vektor.
[0004|U daljem izvođenju pronalaska obezbeđen je himerni adenovirusni ekspresioni vektor, naznačeni vektor sadrži ekspresionu kasetu koja sadrži sledeće elemente:
(a) prvi pokretač operativno vezan za nukleinsku kiselinu kodira receptor toli sličan-3 (TLR-3) agonist, naznačen time daje TLR-3 agonist heterologna dsRNA; i (b) drugi pokretač operativno vezan za nukleinsku kiselinu kodira imunogeni heterologni polipeptid za upotrebu u postupku lečenja za izazivanje imunog odgovora, navedeni metod sadrži primenu imunogeno efikasne količine vektora subjektu sisara kao Sto je čovek, gde je imuni odgovor usmereri protiv heterolognog polipeptida, i gde je put primene izabran iz grupe koja se sastoji od oralne, intranazalne, mukozalne primene kao Što je vaginalna primena.Subjekt sisara je npr. glodar kao što je miš, pacov ili morsko prase ili primat kao što je šimpanza, rezus makaki, ili čovek. U nekim izvođenjima heterologni polipeptid je eksprimiran u ćeliji izabranoj od dendritske ćelije, mikroobavijene ćelije i ćelije crevnog epitela.[00051U daljem izvođenju predmetni pronalazak obezbeđuje imunogenc kompozicije, naznačena kompozicija sadrži: (a) himerni adenovirusni vektor ekspresije sadrži pokretač koji je operativno vezan na nukleinsku kiselinu koja
kodira imunogeni heterologni polipeptid;
(b) TLR-3 agonist. pri čemu je TLR-3 agonist heterologna dsRNA: i
(c) farmaceutski prihvatljiv nosač;
namenjena je za upotrebu u postupku lečenja za izazivanje imunog odgovora, naznačeni postupak obuhvata primenu irnunogeno efikasne količine kompozicije na subjektu sisara kao Sto je čovek, pri čemu je imuni odgovor usmeren protiv heterolognog polipeptida. pri čemu je put primene izabran iz grupe koja se sastoji od oralne, intranazalne, mukozalne primene kao što je vaginalna primena.Subjekt sisara je npr. glodar kao sto je miš. pacov ili morsko prase ili primat kao što je šimpanza. rezus makaki, ili čovek.
100061Pronalazak takođe otkriva izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu navedenu u SEK ID BR-i: 1, 2,6,7, 13, 14, 15. 16 ili 17.
KRATAK OPIS CRTEŽA
|0007|
Slika I ilustruje podatke pokazujući da je himerni adenovirusni vektor iz ovog pronalaska (tj DSI ) u kombinaciji sa TLR-3 agonistom efikasniji od standardnog adenovirusnog vektora (tj rAd5) u izazivanju antigen specifičnog imunog odgovora nakon oralne isporuke vektora. Slika 1A prikazuje podatke koji prikazuju titar antitela na H1V omotač proteina (t.j, gp 120) 3 nedelje nakon oralne isporuke adenovirusnog vektora. Slika IB ilustruje podatke koji prikazuju titar antitela na HIV omotač protein ( t.j. gp 120) 6 nedelja nakon oralne isporuke adenovirusnog vektora.
Slika 2 ilustruje podatke pokazujući da je himerni adenovirusni vektor iz pronalaska ( t, DSIb ili DSIc) u kombinaciji sa TLR-3 agonistom efikasniji u izazivanju antigen specifičnog imunog odgovora u odnosu na standardni adenovirusni vektor (tj. rAd5). Slika 2A ilustruje podatke prikazujući anti-GFP IgG titar 3 nedelje nakon oralne primene vektora. Slika 2B ilustruje podatke prikazujući CD8+ T ćelijski odgovor na GFP u 10 nedelji prateći primenu vektora u 0, 4 i 8 nedelji. Slika 2C ilustruje podatke prikazujući anti-HA titar antitela 3 nedelje nakon oralne primene vektora.
Slika 3 ilustruje podatke prikazujući da su himerni adenovirusni vektori iz pronalaska superiorni za izazivanje imunih odgovora kada se primenjuju ne-parenteralno.
Slika 3A ilustruje podatke prikazujući anti-gp 120 titar antitela 3 nedelje nakon intramuskulanie primene DSI. Slika 3 B ilustruje podatke prikazujući anti-HA titar antitela 3 nedelje nakon intranazalne primene DSIc.
Slika 4 ilustruje podatke prikazujući da izraženi TLR-3 liganđ agonisti mogu da indukuju aktivaciju ćelija koje predstavljaju antigen.
Slika 4A ilustruje podatke koji oslikavaju aktivaciju dendritskih ćelija od strane izražene dsRNA TLR-3 agonista luci. Slika 4B ilustruje podatke koji oslikavaju aktivaciju dendritske ćelije pomoću izražene dsRNA TLR-3 agonista luci i ml.
Slika 5 je grafička ilustracija himernih adenovirusnih vektora pronalaska, tj. himerni adenovirusni vektori koji sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju izražene ds RNA TLR-3 agoniste.
Slika 6 ilustruje podatke koji pokazuju da su himerni adenovirusni vektori iz pronalaska efikasni u izazivanju antigen specifičnog imunog odgovora nakon oralne primene. Slika 6 ilustruje podatke koji oslikavaju anti gp-120 titar antitela 3 nedelje nakon oralne primene himernog adenovirusa koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira dsRNA TLR-3 agonist luci.
Slika 7 ilustruje podatke prikazujući da TLR-7/8 imaju slabu efikasnost u izazivanju antigen specifičnog imunog odgovora.
Slika 8 ilustruje podatke prikazujući da su himerni adenovirusni vektori iz pronalaska efikasni u indukciji antigen specifičnog imunog odgovora nakon oralne primene. Slika 8A ilustruje podatke prikazujući titar anti-HA antitela
4 nedelje nakon oralne primene himernog adenovirusa koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira
dsRNA TLR-3 agonist luci.
Slika 8B ilustruje podatke prikazujući titar anti-HA antitela 4 nedelje ili 7 nedelja nakon primene himernog adenovirusa koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira dsRNA TLR-3 agonist luci. Slika 8C ilustruje podatke prikazujući titar anti-HA antitela 3 nedelje nakon oralne ili intranazalne primene himernog adenovirusa koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira dsRNA TLR-3 agonist luci.
KRATAK OPIS SEKVENCI
100081
SEK ID BR: I utvrđuje nukleotidnu sekvencu za himerni adenovirusni vektor DSI.
SEK ID BR: 2 utvrđuje nukleotidnu sekvencu za himerni adenovirusni vektor DS2.
SEK ID BR: 3 utvrđuje nukleotidnu sekvencu koja kodira TLR-3 agonist.
SEK ID BR: 4 utvrđuje nukleotidnu sekvencu koja kodira TLR-3 agonist.
SEK ID BR: 5 utvrđuje nukleotidnu sekvencu koja kodira TLR-3 agonist.
SEK ID BR: 6 utvrđuje nukleotidnu sekvencu za himerni adenovirusni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira grip HA i nukleinsku kiselinu koja kodira TLR-3 agonist (luc). pri čemu su grip 11A i I'LR-3 agonist u istoj orijentaciji.
SEK ID BR: 7 utvrđuje nukleotidnu sekvencu za himerni adenovirusni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira grip 1IA i nukleinsku kiselinu koja kodira TLR-3 agonist (Luc), pri čemu su grip HA i TLR-3 agonist u suprotnoj orijentaciji
SEK ID BR: 8 propisuje nukleotidnu sekvencu koja kodira kratku ukosnicu RNA TLR-3 agonista. Komplementarni detovi sekvence su prikazani velikim slovima i linker sekvenca je prikazana malim slovima. SEK ID BR: 9 propisuje nukleotidnu sekvencu koja kodira kratku ukosnicu RNA TLR-3 agonista (gl). Komplementarni delovi sekvence su prikazani velikim slovima i linker sekvenca je prikazana malim slovima. SEK ID BR: 10 propisuje nukleotidnu sekvencu koja kodira kratku ukosnicu RNA TLR-3 agonista (Luc). Komplementarni delovi sekvence su prikazani velikim slovima i linker sekvenca je prikazana malim slovima. SEK ID BR: I I propisuje nukleotidnu sekvencu koja kodira kratku ukosnicu RNA TLR-3 agonista (ml). Komplementarni delovi sekvence su prikazani velikim slovima i linker sekvenca je prikazana malim slovima. SEK ID BR: 12 propisuje nukleotidnu sekvencu koja kodira kratku ukosnica RNA TLR-3 agonista. Komplementarni delovi sekvence su prikazani velikim slovima i linker sekvenca je prikazana malim slovima. SEK ID BR: 13 utvrđuje nukleotidnu sekvencu za himerni adenovirusni vektor DSIc. Sekvenca sadrži nukleotid koji kodira HA (PR8/34).
SEK ID BR: 14 utvrđuje nukleotidnu sekvencu za himerni adenovirusni vektor DS2bcta-luc. Vektor sadrži sekvencu koja kodira TLR-3 agonist Luc pod kontrolom beta aktin pokretača. Vektor takođe sadrži otvorena klonirana mesta za ubacivanje sekvence nukleinske kiseline (a) koja kodira antigen od interesa.
SEK ID BR: 15 utvrđuje nukleotidnu sekvencu za himerni adenovirusni vektor DS2C-luc. Vektor sadrži sekvencu koja kodira TLR-3 agonist luc pod kontrolom CMV pokretača. Vektor takođe sadrži otvorena klonirana mesta za ubacivanje sekvence nukleinske kiseline (a) koja kodira antigen od interesa.
SEK ID BR: 16 utvrđuje nukleotidnu sekvencu za pshutlle vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira TLR-3 agonist luc pod kontrolom CMV pokretača i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira HA (avian grip) pod kontrolom posebnog CMV pokretača.
SEK ID BR: 17 utvrđuje nukleotidnu sekvenca za himerni adenovirusni vektor NI) I I 2(4. Nukleinska kiselina koja kodira heterologni antigen je prikazana boldiranim slovima i okružena je sa lokacijom CIA 1 prepoznatljivost na 5 'kraju i nije 1 mesta prepoznavanja na 3' kraju. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira TLR-3 agoniste je u kurzivu, sa sekvencom linkera u bold-u.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
|0009| Predmetni pronalazak je u najširem smislu de li nišan nezavisnim patentnim zaluevima.
i. Uvod
|0010|Predmetni pronalazak obezbeđuje nove himerne adenovirusne vektore koji se mogu aplikovati ne-parenteralno da bi se izazvao imuni odgovor protiv antigena od interesa. Himerni adenovirusni vektori iz pronalaska sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira heterologni polipeptid i nukleinsku kiselinu koja kodira TLR-3 agonist. Himerni adenovirusni vektori izazivaju snažne i efikasne imune odgovore specifične za heterolo<g>ni polipeptid. posebno kada se daju ne-parenteralnim putem primene (na primer. oralno, intranazalne ili mukozalno).
[00111Pronalazak se zasniva na neočekivanom otkriću da je primena dsRNA TLR-3 agonista kao efikasnih adjuvanasa kada se daju zajedno sa virusnim vektorima. U stvari, upotreba dsRNA kao adjuvansa za virusne vektore bi bila suprotno saglasna obzirom da je najveća predložena korisnost dsRNA mimetičke poli !:C bila kao antivirusnog sredstva (Nemes, et al. Proc Soc E.\p Biol Med.( 1969) 132:776: Schafer. et al. Nature.(1970) 226:449; Fen je et al. Nature ( 1970) 226: 171].
II. Definicije
100121 Izraz "Himerni" ili "rekombinantni" kako se ovde koristili vezi. npr, sa nukleinskom kiselinom, proteinom, ili vektorom, ukazuje da je nukleinska kiselina, protein ili vektor, mođillkovana uvođenjem hcterologne nukleinske kiseline ili proteina ili menjanjem prirodne nukleinske kiseline ili proteina. Tako. na primer. himerni i i rekombinantni vektori obuhvataju sekvence nukleinskih kiselina koje se ne nalaze unutar prirodnih (ne-himernih ili ne-rekombinantnih) oblika vektora. Himerni adenovirusni vektor ekspresije se odnosi na adenovirusni vektor ekspresije koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira heterologni polipeptid.
10013) Izraz "ekspresioni vektor" je sastavljen od nukleinske kiseline, generisan rekombinanitio ili sintetički, sa nizom specifikovanth elemenata nukleinske kiseline koje dozvoljavaju transkripciju određene nukleinske kiseline u ćeliji domaćina. Ekspresioni vektor može biti deo plazmida, virusa, ili fragment nukleinske kiseline. Tipično, ekspresioni vektor sadrži nukleinsku kiselinu koja će biti transkribovana operativnim vezivanjem za pokretač.
|00I4|Izrazi "pokretač" i "sekvenca za kontrolu ekspresije" se ovde koriste da označe niz kontrolnih sekvenci nukleinskih kiselina koje usmeravaju transkripciju nukleinske kiseline. Kako se ovde koristi, pokretač uključuje neophodne sekvence nukleinske kiseline u blizini startnog položaja transkripcije, kao takva, u slučaju polimeraze II tipa pokretača, TATA element. Pokretač takođe opciono uključuje dislalne pojačivače ili represor elemente koji mogu da se nalaze koliko nekoliko hiljada baznih parova od početka mesta transkripcije. Pokretači uključuju konstitutivne i indukovane pokretače. Izraz "konstitutivni" pokretač jc pokretač koji je aktivan u većini okolnih i razvojnih uslova. Izraz "indukovani" pokretač je pokretač koji je aktivan pod okolnim ili razvojnim propisima. Izraz "operativno vezan" se odnosi na funkcionalnu vezu između kontrolne sekvence ekspresije nukleinske kiseline (kao što je pokretač, ili transkripcioni niz faktora vezivanja) i druge sekvence nukleinske kiseline, pri čemu sekvenca kontrole ekspresije upravlja transkripciju nukleinske kiseline odgovarajući drugoj sekvenci.
|00I5|Izrazi "TLR agonist" ili "Toll-slični receptor agonist". kako se ovde koristi odnosi se na jedinjenje koje se vezuje i podstiče receptore Toll-slične uključujući, npr TLR-2. TLR-3. TLR- 6. TI R-7. ili T1..R-8. TLR agonisti se razmatraju u Mackichan. I AVI Izveštaj. 9: 1-5 (2005) i Abreu et al. J Immunol. 174 (8). 4453-4460 (2005). Agonisti indukuju signal transdukcije prateći vezivanje za njihov receptor.
|0016|Izrazi "TLR-3 agonist" ili "Toll-slični receptor 3 agonist" kako se ovde koristi odnosi se na jedinjenje koje se vezuje i stimulise TLR-3. TLR-3 agonisti su identifikovani, uključujući dvostruku RNK. virusno izvedenu dsRNA, nekoliko hemijski sintetizovanih analoga za dvolančanu RNK uključujući poliinozin-policitidilik kiselinu (poli l:C) - poliadenilnu-poliuridilik kiselinu (poli A: U) i poli !: poli C. i antitela (ili unakrsno vezana antitela) na TLR-3 koji dovode do IFN-beta proizvodnje (Matsumoto. M. et al. Biochem Biophvs Res Comnum 24: 1364 (2002). de Bouteiller, et al. J Biol Chem 18: 38133-45 (2005)]. TLR-3 agonisti takođe uključuju i/raženu dsRNA (npr dsRNA kodirana nukleinskom kiselinom koja sadrži sekvencu navedenu u SEK ID BR: 3, 7. 8. 9, 10, I I. ili 12).
1001T|Izrazi "TLR-7/8 agonist" ili "Toll-slični receptor 7/8 agonist" kako se ovde koristi odnosi se na jedinjenje koje se vezuje i podstiče ili TL.R-7 ili TLR-8 receptore; ovi receptori prepoznaju nekoliko istih Uganda.
Nekoliko TLR-7/8 agonista je identifikovano kao virusne jednolančane RNK. imikimod
loksoribin. poliuridilik kiselina ili rezikvimod.
|0018| Termin "heterologni" kada se koristi u odnosu na delove nukleinske kiseline označava da tuikleinska kiselina sadrži dve ili više podsekvence koje se ne nalaze u istom odnosu jedna prema drugoj u prirodi. Na primer, nukleinska kiselina se obično rekombinantno proizvodi, ima dve ili više sekvenci iz nesrodnih gena aranžiranih da izgrade novu funkcionalnu nukleinsku kiselinu, npr pokretač iz jednog izvora i kodirajući region iz drugog izvora. Slično, heterologni protein pokazuje da protein sadrži dve ili više podsekvenci koje se ne nalaze u istom međusobnom odnosu u prirodi (npr, fuzioni protein).
|00I9| Izrazi "nukleinska kiselina" i "polinukleotid" su ovde korišceni naizmenično da označe deoksiribonukleotide ili ribonukleotiđe i polimere bilo u jedno- ili đvo-lančanom obliku. Izraz obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže poznate nukleotidne analoge ili modifikovane osnove ostataka ili veza. koji su sintetički, prirodni i neprirodni, koji imaju slične osobine vezivanja kao referentna nukleinska kiselina, i koji se tnetabolisu na sličan način do referentnih nukleotida. Primeri takvih analoga uključuju, bez ograničenja, fosforolioate. fosforamidate. metil fosfonate. hiralne-metil fosfonate, 2-O-metil ribonukleotiđe, peptide-nukleinskih kiselina (PNAS).
100201 Ukoliko nije drugačije naznačeno, određena sekvenca nukleinske kiseline takođe obuhvata njihove konzervativno modifikovane varijante (npr degenerate kodona supstitucije) i komplementarne sekvence. kao i sekvence eksplicitno naznačene. Konkretno, degenerat kodon supstitucije može bili postignut generisanjem sekvenci u kojima je treća pozicija jednog ili više izabranih (ili svih) kodona supstituisana sa mešovitim-bazom i ili deoksiinozin ostacima (Batzer et ai. Nucleic Acid Res. 19: 508 I (1991); Ohtsuka i ah, J. Biol. Chem. 260: 2605-2608
(1985); Rossolini et al Mol.Ccll Probes 8: 91-98 (1994)).
Izraz nukleinska kiselina se koristi naizmenično sa genom. cDNA. mRNA. oligonukleotidom i polinukleotidom.. |0021| Antigen- odnosi se na protein ili deo polipeptidnog lanca koji se može prepoznati od strane T ćelijskih receptora i/ ili antitela. Tipično, antigeni su izvedeni iz bakterijskih, virusnih ili gljivičnih proteina.
(00221 "Imunogeno efektivna doza ili količina" kompozicije predmetnog pronalaska je količina koja izaziva ili modulira imuni odgovor specifičan za heterologni polipeptid. Imuni odgovori uključuju humoralne imune odgovore i ćelijama-posredovane imune odgovore. Imunogeni preparat se može koristiti terapeutski ili protllaktički za lečenje ili prevenciju bolesti u bilo kom stadijumu..
[00231 "Humoralni imuni odgovori" su posredovani slobodnim će lij skini komponentama krvi, tj, plazme ili seruma; prenos seruma ili plazme od jedne osobe na drugu prenosi imunitet.
100241 "Ćelijski posredovani imuni odgovori" su posredovani od strane antigen specifičnih litnfocita: prenos antigen specifičnih limfocita od jedne osobe na drugu prenosi imunitet.
100251 Izrazi "terapeutska doza" ili "terapeutski efikasna količina" ili "efikasna količina" liimerićnog adenovirusnog vektora ili kompozicija koja sadrži himerni adenovirusni vektor je količina vektora ili kompozicije koja sadrži vektor koji sprečava, ublažava, smanjuje ili ograničava ozbiljnost simptoma bolesti i poremećaja povezanih sa izvorom heterolognog polipeptida (npr virus, bakterija, parazit, ili kancei).
|0026| Antitelo- odnosi se na polipeptid kodiran od strane gena imutioglobulina ili fragmente koji se specifično vezuju i prepoznaju antigen. Prepoznati geni imunoglobulina uključuju kapa. lambda. alfa. gama, delta, epsilon. ili mu konstantni region gena. kao i mnoštvo imunoglobulin varijabilnih gena u regionu. Laki lanci su klasifikovani kao kapa ili lambda. Teški lanci su klasifikovani kao gama. mu. alta. delta, ili epsilon. koji zauzvrat detinišu klase imunoglobulina. IgG. IgM, IgA. IgD i IgE. respektivno.
|0027|T ćelije- odnose se na određenu klasu limfocita koje ekspriiniraju specifičan receptor (T ćelijski receptor) koju kodira porodica gena. Prepoznati geni T ćelijskih receptora uključuju alfa, beta. delta, gama loci, i T ćelijski receptori tipično (ali ne uvek) prepoznaju kombinaciju MHC plus kratki peptid.
10028| Adaptivni imuni odgovor- odnosi se na T ćeliju i''ili antiieloin prepoznavanje antigena.
|0029] Ćelije koje predstavljaju antigen (APC) - kako se ovde koristi, odnose se na ćelije koje su u stanju da predstave imunogene peptide ili njihove fragmente za T ćelije da bi se aktivirao ili pojačao imuni odgovor. APC ćelije uključuju dendritske ćelije, makrofage. B ćelije, monocite i druge ćelije koje se mogu konstruisati da budu efikasni APC. Takve ćelije mogu, ali ne moraju, biti genetski modifikovane da bi povećale kapacitet za predstavljanje antigena, da poboljšaju aktiviranje i/ili održavanje T ćelijskog odgovora , da imaju anti-tumorske efekte same po sebi i Ili da su imunološki kompatibilne sa prijemnikom (tj. uparen 11LA haplotip). APC može biti izolovana iz bilo kojih od različitih biološki)) tečnosti i organa uključujući koštanu srž. perifernu krv, tumor i peritumoralna tkiva, i mogu biti autologne. alogene. singene ili ksenogene ćelije. APC obično koriste receptor od glavnih histokompatabilnih (MHC) lokusa da predstave kratke polipeptiđe T ćelijama.
j0030|Adjuvans- je nespecifični pojačivač imunog odgovora. Pogodni adjuvansi abuhvatajti. na primer. toksin kolere, monofosforil lipid A (MPL), Freutid-ov kompletni adjuvans. Freund-ov nekompletni adjuvans. Kvil A. i AI(OH). Adjuvansi mogu biti one supstance koje izazivaju aktivaciju APC-a i pojačano izlaganje T ćelija preko sporednih signalnih molekula kao sto su Toll-slični receptori. Primeri Toli- sličnih receptora ukljućujti receptore koji prepoznaju dvolančanu RNA, bakterijsku flagellu, LPS. CpG DNA i bakterijski lipopeptid (revijski prikazano nedavno u [ Abreu et al. J Immunol. 174 (8). 4453-4460 (2005) |).
|003l11 zrazi"polipeptid". "peptid" i "protein" su ovde naizmenično korišceni da označe polimer milino kiselinskih ostataka. Izrazi se primenjuju na ainino kiselinske polimere u kojima je jedan ili više amino kiselinski ostatak veštački hemijski mimetik odgovarajuće prirodne amino kiseline, kao i da se javljaju prirodni amino kiselinski polimeri i ne- prirodni amino kiselinski polimeri.
|0032|lzraz "aminokiselina" se odnosi na prirodne i sintetičke amino kiseline, kao analoge amino kiselina i tnimetike amino kiselina koji funkcionišu na način sličan kao prirodne amino kiseline. Prirodne amino kiseline su one koje su kodirane genetskim kodom, kao i one amino kiseline koje su kasnije modifikovane. npr hidroksiprolin, y-karboksiglutamat, i O-fosfoserin. Analozi amino kiselina odnose se na jedinjenja koja imaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao i prirodna amino kiselina, odnosno kao i y ugljenik koji je vezan za vodonik. karboksilnu grupu, amino grupu i R grupu, npr homoserin, norleucin. metionin stilfbksid. metionin metil sulfonijum, Takvi analozi imaju modifikovane R grupe (npr. norleucin) ili modifikovanti osnovu peptida. ali zadržavaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodna amino kiselina. Mimičke amino kiseline se odnose na hemijska jedinjenja koja imaju strukturu koja se razlikuje od opšte hemijske strukture amino kiseline, ali ona funkcioniše na način koji je sličan kao prirodna amino kiselina.
[0033| Amino kiseline mogu biti upućene ovde bilo preko njihova uobičajeno poznata tri slovna simbola ili od strane jednog slovnog simbola preporučenog od strane IUPAC-IUB Biohemijske Nomenklaturne Komisije. Nukleotidi. takođe. mogu biti upućeni svojim opšteprihvaćenim jednim slovom koda.
|0034| "Konzervativno modifikovane varijante" odnose se i na amino kiselinu i na sekvence nukleinske kiseline. U pogledu određenih sekvenci nukleinske kiseline, konzervativno modifikovane varijante se odnose na one nukleinske kiseline koje kodiraju identične ili suštinski identične amino kiselinske sekvence. ili gde nukleinska kiselina ne kodira sekvencu amino kiseline, do suštinski identične sekvence. Zbog degeneracije genetskog koda. veliki broj funkcionalno identičnih nukleinskih kiselina kodira bilo koji dati protein. Na primer, kodoni GCA. GCC. GCG i GCU svi kodiraju ainino kiselinu alanin. Tako. na svakoj poziciji gde je alanin specifikovan kodonom, kodon može biti izmenjen na bilo koji od odgovarajućih kodona opisanih bez. promene kodiranog polipeptida. Takve varijacije nukleinskih kiselina su "tihe varijacije," koje su jedna vrsta konzervativno mođilikovanih varijacija. Svaka sekvenca nukleinske kiseline ovde koja kodira polipeptid takođe opisuje svaku moguću tihu varijaciju nukleinske kiseline. Stručnjak će prepoznati da svaki kodon u nukleinskoj kiselini (osim AUG. koji je uobičajeno jedini kodon za metionin, i TGG, koji je uobičajeno jedini kodon za triptofan) može biti modifikovan da se dobije funkcionalno identični molekul. Shodno tome, svaka tiha varijacija nukleinske kiseline koji kodira polipeptid je implicitno u svakoj opisanoj sekvenci.
100351 Za amino kiselinske sekvence. prosečan stručnjak će prepoznati da individualne supstitucije, brisanja ili dodavanja na nukleinsku kiselinu, peptid. polipeptid, ili proteinske sekvence koja dalje menjaju. dodaju ili brišu jednu amino kiselinu ili mali procenat amino kiseline u kodiranoj sekvenci je "konzervativno modifikovana varijanta" gde izmene rezultiraju u supstituciji aminokiseline sa hemijski sličnom amino kiselinom. Stolovi konzervativne supstitucije pružaju funkcionalno slične amino kiseline koje su dobro poznate u tehnici. Takve konzervativno modifikovane varijante su u dodatku i ne isključuju polimorfne varijante, medjuvrsne homologe. i atele pronalaska.
[0036| Sleđećih osam grupa gde svaka od njih sadrži ainino kiseline koje su konzervativne supstitucije jedna za drugu:
1) Alanin (A), Glicin (G):
2) Asparaginska kiselina (D), Glutaminska kiselina (F);
3) Asparagin (N), Glutamin (Q):
4) Arginin (I), Lizin (K); 5) Izoleucin (I), Leucin (L). Metionin (M), Valin (V); 6) Fenilalanin (F), Tirozin (Y), Triptofan (W);
7) Serin (S), Treonin (TJ; i
8) Cistein (C). Metionin (M)
(videti, npr, Creighton. Proteins (1984)).
|0037| Izraz "selektivno (ili specifično) hibridizuje" odnosi se na vezivanje, dupleks. ili hibridizaciju molekula samo na određenu nukleotidnu sekvencu pod strogim uslovima hibridizacijc kada je ta sekvenca prisutna u kompleksnoj smeši (npr ukupna celijska ili biblioteka DNA ili RNA).
|0038| Izraz "strogi uslovi hibridizacijc" odnosi se na uslove pod kojima će se proba hibridizovati do svojih ciljnih podsekvenci, obično u kompleksnoj smeši nukleinske kiseline, ali bez drugih sekvenci. Strogi uslovi su zavisni od sekvence i biće različiti u različitim okolnostima. Duže sekvence se hibridizuju specifično na višim temperaturama. Opširan vodič za hibridizaciju nukleinskih kiselina se nalazi u Tijssen. Tehnike u biohemiji i molekularnoj Biologiji-hibridizacija sa nukleinskim sondama, "Pregled principa hibridizacije i strategije proba za nukleinske kiseline"
(1993). Generalno, strogi uslovi se biraju da budu oko 5-10 °C nižoj temperaturi od termalne tačke topljenja i za specifičnu sekvencu pri definisanoj jonskoj jačini Ph. Trn je temperatura (ispod deilnisane jonske jačine, pH i nukleinske koncentracije ) pri kojoj 50°/« proba komplementarno cilju hibridizuje sa ciljnom sekvencom u ravnoteži (kao što su ciljne sekvence prisutne u višku, na Fm. 50% proba je zauzelo u ravnoteži). Strogi uslovi će biti oni, u kojima je koncentracija soli manja od oko 1.0 M natrijum jona. obično oko 0.01 do 1.0 ivi natrijum jona (ili drugih soli), na pl l 7.0 do 8.3 i temperatura je najmanje oko 30 C za kratke probe (npr 10 do 50 nukleotida) i najmanje oko 60°C za dugačke probe (npr, više od 50 nukleotida). Strogi uslovi se takođe mogu postići dodavanjem sredstava za destabilizaciju kao što je formamid. Za selektivnu ili specifičnu hibridizaciju. pozitivni signal je najmanje dva puta jači od pozadine, opciono 10 puta jači od pozadine hibridizacije. Primeri strogih usiova hibridizacije mogu biti sledeći: 50% formaniida. 5\ SSC. i 1% SDS. inkubacija na 42'C. ili. 5\ SSC, 1% SDS. inkubacija na 65 ° C, sa ispiranjem u 0.2.\SSC. i 0.\% SDS na 65 C. 100391 Nukleinske kiseline koje ne hibridizuju međusobno pod strogim uslovima su još uvek suštinski identične ako su polipeptidi koje one kodiraju suštinski identični.Ovo se dešava, na primer. kada se kreira kopija nukleinske kiseline korišćenjem maksimalnog kodona degeneracije koju dozvoljava genetski kod. U takvim slučajevima, nukleinske kiseline obično hibridizuju pod umereno strogim uslovima hibridizacije. Primeri "umoreno strogih usiova hibridizacije" uključuju hibridizaciju u putem od 40% formamida. IM NaCI. 1% SDS na 37 "' C, i ispiranje u lx SSC na 45° C. Pozitivna hibridizacija je najmanje dvaput pozadine. Stručnjaci će lako prepoznati da alternativna hibridizacija i uslovi ispiranja mogu biti korišćeni da obezbede uslove slične strogosti. |0040| "Antitelo" odnosi se na polipeptid koji sadrži okvirni region od imunoglobulinskog gena ili fragmente koji se specifično vezuju i prepoznaju antigen. Imtinoglobulin geni za prepoznavanje uključuju kapa, lambda. alfa. gama. delta, epsilon, ili mu konstantni region gena, kao i mnoštvo imunoglobulin varijabilnih gena u regionu. Laki lanci su klasifikovani kao kapa ili lambda. Teški lanci su klasifikovani kao gama. MU. alfa. delta, ili epsilon. koji zauzvrat definišu klase imunoglobulina. IgG. IgM. IgA, IgD i IgF. respektivno. |004l | Primerna imunoglobulinska (antitelo) strukturalna jedinica sadrži tetramer. Svaki tetramer se sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, svaki par ima jedan "laki" (oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac (oko 50-70 kDa). N-završetak svakog lanca definiše varijabilni region od oko 100 do 110 ili više aminokiselina prvenstveno odgovornih za prepoznavanje antigena. Izrazi varijabilni laki lanac (VI.) i varijabilni teški lanac (VII) se odnose na ove lake i teške lance, respektivno. |0042j Izraz "specifično (ili selektivno) vezuje" na antitelo ili "specifično (ili selektivno) inumoreaktivno sa" kada se odnosi na protein ili peptid. odnosi se na vezivnu reakciju koja je odlučujuća za prisustvo proteina u heterogenoj populaciji proteina i drugih biologa, "lako. pod određenim uslovima inuinoanalize. naznačena antitela se vezuju za određeni protein najmanje dva puta jače od pozadine i suštinski ne vezuju se. u značajnoj količini, za druge proteine prisutne u uzorku. Specifično vezivanje antitela pod takvim uslovima može zahtevati antitelo koje je izabrano zbog svoje specifičnosti za određeni protein. Na primer. poliklonalna antitela povećana do fuzionih proteina mogu biti izabrana za dobijanje samo onih poliklonskih antitela koja su specifično imunoreaktivna sa fuzionim proteinom, a ne sa individualnim komponentama fuzionih proteina. Ovaj i/bor se može postići oduzimanjem antitela koja unakrsno reaguju sa pojedinačnim antigenima. Mnoštvo formata imunoanaliza može biti korišćeno za izbor antitela specifično imunoreaktivnog sa određenim proteinom. Na primer, čvrste faze ELISA imunoodređivanja se rutinski koriste za odabir antitela specifično imunoreaktivnog sa proteinom (vidi, npr, Harlov &Lane. Anlibodies, A Laboratorv Manual (1988), za opis formata imunoanaliza i usiova koji se mogu koristiti za utvrđivanje specifične imunoreaktivnosti) Tipično specifična ili selektivna reakcija će biti najmanje dva puta pozadinski signal ili šum i još tipičnije više od 10 do 100 puta jači od pozadine. [ 00431 Po I i n u k leot i d i mogu da sadrže nativnu sekvencu (tj. endogenu sekvencu koja kodira pojedinačan polipeptid ili dsRNA ili njen deo), ili mogu da sadrže varijantu takve sekvence. Varijante polinukleotida mogu da sadrže jednu ili više supstitucija, adicija, brisanja i / ili umetanja tako da aktivnost TLR-3 agonista kodirane dsRNA nije umanjena, u odnosu na dsRNA koja ne sadrži supstitucije, adicije, brisanja i ■ ili umetanja. Varijante poželjno pokazuju najmanje oko 50%. 55%. 60%. 65%. 70%. 75%. 80%, 85%. 90%. 91%, 92%. 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98%. 99%. sa polinukleotidnom sekvencom koja kodira prirodni polipeptid ili deo istog ili sekvencu polinukleotida koja kodira dsRNA sa aktivnošću TLR-3 agonista. |00441Izrazi "identičan" ili procentualno "identitet" u kontekstu dve ili više nukleinskih kiselina (na primer. dsRNA koja je TLR-3 agonist) ili polipeptidne sekvence. odnose se na dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje su iste ili imaju određeni procenat amino kiselinskih ostataka ili nukleotida koji su isti (odnosno 50%. 55%. 60%. 65%. 70%, 75%. 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%. 94%. 95%. 96%. 97%. 98%. 99%, ili više identičnosti određenog regiona), kada se porede i poravnaju za maksimalnu komunikaciju preko prozora za poređenje. ili označenom regionu mereno korišćenjem jedne od sledećih sekvenci poređenja algoritama ili pomoću ručnog usklađivanja i vizuelne inspekcije. Za takve sekvence se onda kaže da su "suštinski identične". Ova definicija se takođe odnosi na kompliment ispitivane sekvence. Opciono, identitet postoji preko regiona koji je najmanje oko 10 do oko 100. oko 20 do oko 75. oko 30 do oko 50 aminokiselina ili nukleotida u dužini. |0045|Za poređenje sekvence. obično jedna sekvenca služi kao referentna sekvenca. sa kojom se ispitivane sekvence porede. Kada se koristi algoritam za poređenje sekvenci, test i referentne sekvence se unose u kompjuter, koordinate podsekvenci su označene, ako je potrebno, i parametri algoritamskog programa sekvenci su označeni. Standardni programski parametri mogu biti korišćeni. ili alternativni parametri mogu bili imenovani. Algoritam za poređenje sekvenci zatim izračunava procenat identičnosti za ispitivane sekvence u odnosu na referentnu sekvencu. na osnovu programskih parametara. |0046|"Poredbeni prozor", kako se ovde koristi, uključuje referencu na segment bilo kog broja susednih mesta od oko 10 do oko 500. oko 25 do oko 200. 50 do oko 150, u kojima sekvenca može biti poređena u odnosu na referentnu sekvencu istog broja susednih mesta nakon što su dve sekvence optimalno usklađene. Metode poravnavanja sekvenci za poređenje su dobro poznate u tehnici. Optimalno usklađivanje sekvenci za poređenje može se sprovesti, na primer. algoritmom lokalne homologije od Smith & Vaterman. Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981). pomoću algoritma homologije poravnavanja od Needleman&VV'unsch. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970). po traženju metoda sličnosti od Pcarson & Lipman, Proc. Nat '1. Acad. Sci. USA85:2444 (1988). kompjuterizovaitom implementacijama ovih algoritama (CAP. BESTFIT. FASTA. i TFASTA u VVisconsin Genetics Sofhvare Package. Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, VV1), ili pomoću ručnog usklađivanja i vizuelne inspekcije (videti, na primer. Tekući protokoli u molekularnoj biologiji (Ausubel i dr.. eds. 1995 dodatak)). |0047|Jedan primer korisnog algoritma je GOMILA. GOMILA kreira poravnavanje višestrukih sekvenci iz grupe srodnih sekvenci korišćenjem naprednih, podešavanja rasporeda parova da pokaže odnos i procenat identičnosti sekvence. Takođe skicira drvo ili denđogram koji pokazuje odnose klastera koji se koriste za kreiranje poravnanja. GOMILA koristi pojednostavljenje progresivne metode poravnanja u Feng &Doolittle..1. Mol. Fvol. 35: 351-360
(1987). Korišćeni metod je sličan postupku koji je opisao Iliggins &Sharp. CABIOS 5: 151-153 (1989). Program može uskladiti do 300 sekvenci, svaki od maksimalne dužine 5.000 nukleotida ili aminokiselina. Postupak višestrukog usklađivanja počinje sa parnim poravnanjem dve najsličnije sekvence. proizvodeći klasler dve poravnate sekvence, Ova grupa je zatim usklađena sa sledećom najviše srodnom sekvencom ili klasterom usklađenih sekvenci. Dva skupa sekvenci su usklađena jednostavnim produženjem parnog poravnavanja dve pojedinačne sekvence. Konačno poravnjanje se postiže nizom progresivnih, parnih poravnjanja. Program je vođen određivanjem specifičnih sekvenci i njihovih amino kiselina ili nukleotidnih koordinata za regione poređenja sekvenci i određivanje parametara programa. Koristeći GOMILU, referentna sekvenca se poredi u odnosu na druge test sekvence za utvrđivanje odnosa procentnog identiteta sekvenci korišćenjem sledećih parametara: standardna težina razmaka
(3.00). standardna težina dužine razmaka (0.10). i težine razmaka na kraju. COMIL.Asc može dobiti iz GCG analize sekvence softverskog paketa, npr verzija 7.0 (Devereau\ et al. Nuc. Acids Res. 12: 387-395 (1984).
[0048| Drugi primer algoritma koji je pogodan za određivanje procenta identičnosti sekvence i sličnosti sekvence su BLAST i BLAST 2.0 algoritmi, koji su opisani u Altschul et al.. Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977) i Altschul et al., J Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). respektivno. Softver/a izvođenje BLAST analize je javno dostupan preko Nacionalnog Centra za Biotehnološke Informacije (http://www.ncbi.nlin.nih.gov/). Ovaj algoritam obuhvata prvo identifikaciju visokog bodovanja parova sekvenci (HSP) identifikovanjem kratkih reči dužine VV u ispitivanoj sekvenci. koja ili odgovara ili zadovoljava neke pozitivne-vrednosti praga rezultata T kada je usklađen sa rečju iste dužine u bazi podataka sekvence. T se odnosi na prag susednog zbira reči (Altschul et al, supra). Ove početne susedne reči pregledano debiju kao seme za pokretanje pretrage da nadu duži HSP koji ih sadrže. Pogodci reči su produženi u oba smera duž svake sekvence za koliko se kumulativni rezultat poravnanja može povećali.
Kumulativni rezultati se obračunavaju primenom. za sekvence nukleotida. parametra .V1 (nagradni rezultat za par odgovarajućih ostataka, uvek>0) i N (kazna za rezultat za parno neodgovaranje ostataka; uvek <0). /.a sekvence amino kiseline, matrica bodovanja se koristi za izračunavanje kumulativne ocene. Proširenje pogodaka reči u svakom pravcu se zaustavlja kada; rezultat kumulativnog poravnanja padne po količini X od svoje maksimalne ostvarene vrednosti; kumulativni rezultat ide na nulu ili niže, zbog akumulacije jednog ili više negativnih rezultata ostataka poravnanja; ili kraj bilo koje sekvence se ne postigne. Parametri BLAST algoritma V, T i X određuju osjetljivost i brzinu poravnjanja. Program BLASTN (za nukleotidne sekvence) koristi kao zadanu reč (VV) od I I, očekivanje (E) ili 10, M - 5, N = -4 i poređenje oba lanca. Za sekvence amino kiseline. BLASTP program koristi kao zadanu dužinu reći od 3, i očekivanje (E) od 10. i BLOSUM62 tablicu sumiranja (vidi Henikoff & Henikoff. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)) poravnanja (8) od 50. očekivanje (E) od 10. M = 5, N 4. i poređenje oba lanca.
|0049|BLAST algoritam izvodi statističku analizu sličnosti između dve sekvence (vidi, npr, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Jedna mera sličnosti koju obezbeđuje BLAST' algoritam je najmanja suma verovatnoće (P(N)), koja daje indikaciju verovatnoče kojom bi se tiparivanje između dve nukleotidne ili amino kiselinske sekvence dogodilo slučajno. Na primer, nukleinska kiselina se smatra sličnom sa referentnom sekvencom ako je najmanja suma verovatnoće u poređenju test nukleinske kiseline do referentne nukleinske kiseline manja od oko 0,2, još poželjnije manja od oko 0.01. a najpoželjnije mania od oko 0.001.
III. Kompozicije prema predstavljenom pronalasku
|0050|Pronalazak obezbeđuje preparate koji sadrže himerne adenovirusne vektore. U nekim realizacijama, himerni adenovirusni vektori iz pronalaska sadrže prvi pokretač operativno vezan za nukleinsku kiselinu koja kodira heterologni polipeptid i drugi pokretač operativno vezan za nukleinsku kiselinu koja kodira TI.R3 agonist. Prvi i drugi pokretač mogu biti isti ili različiti. U nekim izvođenjima, prvi i drugi pokretači su nezavisno odabrani od: pokretača beta aktin i CMV pokretača.
|00S1jU nekim realizacijama pronalaska, himerni adenovirusni vektor sadrži adenovirusni genom (minus El i E3 gene) i nukleinsku kiselinu koja kodira gen koji aktivira IRE- 3 i druge signalne molekule nishodno od TLR-3. Himerni vektor može da se primeni na ćeliju koja eksprimira El gen tako da se rekombinantni adenovirtis (rAd) proizvodi od strane ćelije. Ovaj rAd može sakupljen i sposoban za pojedinačni krug infekcije koja će isporučiti transgenu kompoziciju u drugu ćeliju unutar sisara kako bi se pokrenuli imuni odgovori do heterolognog polipeptida,
A.Pogodni virusnivektori
100521U nekim izvođenjima, adenovirusni vektor je adenovirus 5. uključujući, na primer. Ad5 sa brisanjem regiona EI/E3 i Ad5 sa brisanjem E4 regiona. Drugi pogodni adenovirusni vektori uključuju sojeve 2. oralno testirane sojeve 4 i 7. adenoviruse trbušnog tifusa 40 i 41 i druge sojeve (npr Ađ34) koji su dovoljni za isporuku antigena i izazivanje adaptivnog imunog odgovora na transgeni antigen [Lubeck et al, Proc Natl Acad Sci USA, 86 (17). 6763-6767
(1989); Shen et al. J. Virol. 75 (9), 4297-4307 (2001): Bailci et al, Virologv. 202 (2), 695-706 (1994)1. U nekim realizacijama, adenovirusni vektor je živ, nesposoban za replikaciju adenovirusni vektor (poput El i E3 izbrisan rAdS), živi i oslabljeni adenovirusni vektor (poput brisanih virusa El B55K). ili živi adenovirusni vektor sa divljim tipom replikacije. (00531 Transkripcije i prevođenja kontrolnih sekvenci n ekspresionim vektorima koje se koriste n transformaciji ćelija kičmenjaka in vivo mogu se obezbediti virusnim izvorima. Na primer. obično korišćeni pokretači i pojačivači su izvedeni, na primer, od beta aktina, adenovirusa, majmunskog virusa (SV40), i humanog citomegalovirusa (CMV). Na primer, vektori koji dozvoljavaju ekspresiju proteina pod upravom CMV pokretača, SV40 ranog pokretača, SV40 kasnijeg pokretača, metalotionein pokretača, mišjeg mlečnog tumorskog virusa pokretača, Rous sarkoma virusa pokretača, promotera pretvarača ili drugih pokretača su se pokazali efikasnim za ekspresiju u ćelijama sisara kao pogodnim. Dalje virusni genomski promotor, kontrola i ili signalne sekvence mogu se koristiti, obezbeđujući takve kontrolne sekvence koje sti kompatibilne sa odabranom ćelijom domaćina.
B.HeterologniPolipeptidi
|0054|Nukleinske kiseline koje kodiraju pogodne heterologne polipeptide mogu biti izvedene iz antigena, kao što su, na primer. virusni antigeni, bakterijski antigeni, antigeni karcinoma, gljivični antigeni ili parazitski antigeni. 100551 Virusni antigeni mogu biti izvedeni iz. na primer. virusa humane imunodeficijencije (npr<g>ag (p55 i p160). pol, env (gpl20 i gp4l) kao što je dalje izneto u Shiver et al. Nature 4 15 (6869): 331 (2002):. 14IV genomski set sekvenci navedenih u GenBank Accession Nos. EF363127: EF363126: EF563I25: EI'365124; EF363123; EF363I22; EFI92592: i EFI92591; HIV gag set sekvenci navedenih u GenBank Accession Nos. EF39689I: EF396890; EF396889; EF396888; EF396887; EF396886; F.F396885: EF396884; EF396883; EF396882; EF39688I; EF396880; EF396879; EF396878; EF396877: EF396876: EF39687; EF396874; EF396873; i EF396872: H!V pol sekvence navedene u GenBank Accession Nos. EF3968I0: EF396809: EF396808: EF396807: EF396806; EF396805: EF396804; EF396803; EF396802; EF39680I: EF396800: EF396799: EF396798: EF396797: EF396796: EF396795; EF396794; BF396793; EF396792; i EF39679I, i HIV env sekvence navedene u GenBank Accession Nos. 9: EF367234: EF367233; C1-367232: EF367231; F.F367230: EF367229: FF567228: El367227; EF367226: EF367225; EF367224; i EF367223. humani papiloma virus (npr kapsid protein El kao što je opisano u, npr. Donnellv et al J Infect Dis 173:314 (1996) i sekvence navedene u GenBank Accession Nos. FF362755: EF362754; NC 001694; NC_OOI693: NC_00I69|; NC_OOI690: NC 005134: NC 001458; NCO0I457; NC_001354; NC_001352; NC_001526; i X94I64), Epštajn Bar virus, herpes simpleks virus, humani herpes virus, rinovirusi, koksakievirusi, enterovirusi. hepatitis A, B. C. i E (npr površinski antigen hepatitisa B kao što je opisano u npr, Lubeck et al.. PNAS USA 86:6763 (1989) i sekvence navedene u GenBank Accession Nos. AB236481; AB236471; AB20650I; AB2064S9; AB206487; AB22I788: AB22I777: AB22I773; AR93367I; AR933670: AB2365I4; AB2365I3; AB2365I2; AB2365I 1; AB2365I0: AB236509; AB236508; AB236507): hepatitisa C NS5 (videti. npr Genbank Accession Nos. X59609: DQ91 1563; S7I627; S70787; S70786: S7034I; S62220: S70790: S70789; S70788; i AB204642)), virus zauški. rubeola. virus malih boginja, poliovirus. virus malih boginja, virus besnila. a Varičela-zoster virus. Antigeni influence uključuju, npr hemagluttinin (HA), matriks protein I (Ml), i nukleoprotein (NP) (vidi, npr, Donnellv, et al, Vaccine 15: 865 (1997) i inlluenza HA sekvence navedene u GenBank Accession nos. AB2942I9; AB294217: AB2942I5: AB2942I3; EF102944: EF102943: EFI02942: EFI0294 I: EF102940; EFI02939; EFI02938; KF102937; EF102936: EFI02935: EFI02934; EFI02933; D0643982; D0464354; CY0I9432; CY0I9424: CY0I94I6; CY01940S; CY019400: CY0I9392: CY0!9384; CV019376; CY019368: CY019360; CY0I9352; EF124794: EFI 10519: EFI 10518: EFI65066; RF165065: EF165064: i EF 165063; inlluenza Ml sekvence navedene u GenBank Accession Nos. AB29279I: CY0I9980: CY019972; CY()I9964: CY019956; CY019948; CY01994(); CY0I9628: CY0I9652; CY0I9644; CV0I9932; CV0I9924; CY0I99I6: CY0I9908; CY019900; CY19892: CY0I98S4: CY0I9876: CY019868; CY0I986(): i influenca NP sekvence navedene u GenBank Accession Nos. AB292790; CY01946I: CY0I9974; CY0I9966; CY019958; CY0I9950; CV0I9942; CY019630: CY019654; CY019646; CY0I9934: CY019926; CY0199I8 CY()I9910; CY019902; CY019894; CY0I9S86: CY0I9878; CY0I9870: iCYOI9862.
|0056|Pogodni virusni antigeni takođe obuhvataju, na primer. virusne nestrukturne proteine, Izraz "virusni nestrukturni protein" kako se ovde koristi odnosi se na protein koji kodira virusna nukleinska kiselina koja ne kodira strukturne polipeptide. kao što su oni koji čine kapsid ili protein koji okružuje virus.
Nestrukturni proteini uključuju one proteine koji stimulišu virusnu repiikaciju nukleinske kiseline i ekspresiju virusnog gena kao što su, na primer. nestrukturni proteini 1. 2. 3. i 4 (NSI. NS2. NS3 i NS4. respektivno) iz Venecuelanskog konjskog eneefalitisa (virus VEE). EEE ili Semliki šumski virus [Dtibenskv et al. J Virol, 70 ( I), 508-519 (1996); PetraUova et al J Virol 2005 79 (12): 7597-608; U.S. Patent Nos.5,1 85.440; 5.739.026; 6.566.093; i 5.814.482. Nekoliko reprezentativnih primera pogodnih alfavirusa uključuju Aura (ATCC VR-368), Bebaru virus (ATCC VR-600, ATCC VR-1240), Cabassou (Genbank Accession Nos. AF398387. ATCC VR-922), Čikungunia virus (ATCC VR-64, ATCC VR-I24I). Eastern konjski encefalomijelitis virus (Genbank Accession Nos. AY705241, AV705240. ATCC VR-65. A I CC VR-1242). Fort Morgan (ATCC VR-924). Getah virus (ATCC VR-369, ATCC VR-1243). Kyzylagach (Al CC VR-927). Mayaro (ATCC VR -66). Mavaro virus (ATCC VR-1277). Middleburg (ATCC VR-370), Mucambo virus (ATCC VR-580, ATCC VR-1244). Nđumu (ATCC VR-371). Pi\una virus (ATCC VR-372 . ATCC VR-1245). Ross River virus (ATCC VR-373, ATCC VR-1246). Semliki Forest (Genbank Accession Nos.
AJ251359, ATCC VR-67, ATCC VR-1247), Sindbis virus (Genbank Accession Nos .102363. ATCC VR-68. ATCC VR-1248), Tonate (ATCC VR-925). Triniti (ATCC VR-4Ć9). Una (ATCC VR-374). Venecuelanski konjski encefalomijelitis (ATCC VR-69), Venecuelanski konjski encefalomijelitis virus (Genbank Accession Nos. AY986475, AY973944, NC 001449, ATCC VR-923. ATCC VR-1250 ATCC VR-1249. A ICC VR-532). Zapadni konjski encefalomijelitis (ATCC VR-70, ATCC VR-1251. ATCC VR-622, ATCC VR-1252 ). VVhataroa (ATCC VR-926), i Y-62-33 (ATCC VR-375).
|0057J Bakterijski antigeni mogu biti izvedeni iz, naprimer. Staphvlocnccits uureus. SiapMococcus epidermis,
Helicobacter priori, Streplococcus hovis. Streptococcus progencs. Streptococcus pneimtoniae. Lisferia
monocvlogenes, Mycohcicierimn tuberculosis. Mvcohadcrium leprae. Corvnehactcrium diphtheriue. Burrelia
burgdorferi, Bacillits anthracis. Bacillits cereus. Closiridium bvtulinum. Claslridium difficile. Salmonella Ivphi.
Vibrio cholerae, Haemophilus injhtenzae. Bordeieilu pertmsis. Versinia pestis. Neisseria gonorrhoeae. Treponenui
pallidum, Mycoplasm sp., Neisseria ransducer s, Leghrtella pneumophd' a. Rickettsiu ivphi, Chlamvdia irachomalis i
Shigella dysenteriae, Vibrio cholera( npr Kolera toksin podjedinice B kao sekvenca GenBank Accession Nos. U25679; A09803: EFI 58842; X76391: AF390572: kolera toksin-koregulisani pilus (TCP) kao stoje opisano u Wu et al. Infection and Immunitv Vol. 69 (12): 7695 (2001) i kao što je navedeno u GenBank Accession Nos. NC 002505 i AE004169);Helicobacter pvlorii(VacA kako je navedeno u GenBank Accession Nos. AY848858; AF042737; AF042736; AF042735; AF042734: NC 00092I: CagA kako je navedeno u GenBank Accession Nos. AF043490; AF043489; AF043488; AF043487; NAP kako je navedeno u GenBank Accession Nos. AF2S4I2I; AF284I20: AF284I19; AF2841I8; AF284117; AF284I16; AB045I43; AB045142; AF22708I: AF227080; AF227079: AF227078; AF227077; AF227076: AF227075; AF227074: FISP ili katalaze kao što je navedeno u GenBank Accession No. NC 000921; Ureaze kako je navedeno u GenBank Accession Nos. AM4I76I0; AM417609: AM4I7608; AM4I7607; AM4I7606; AM4I7605: AM4I7604: AM4I7603: AM4I7602: AM4I760I: i AM4I7600;E. col i antigenikao sekvenca GenBank Accession Nos. NC 0009I3: U00096: NC.002655: BA000007; AE014075; uključujućiE. col ifimbrial antigene predviđene GenBank Accession Nos. AB214865; AB214864; AB214863; AB214862; £colitermo-labilan enterotoksin kao sekvenca GenBank Accession Nos. X83966; V00275; X83966;J0I646; V00275; M3558I; Ml 7873; Ml 7874; KO 1995: M6I0I5; M I 7894; M 17101:K00433.
100581Parazitski antigeni mogu biti izvedeni od, na primer.Giardia lamhiia. Luislnmmia sp.. Trvpanosoma sp.. Trichomonas sp., Plasmodium sp.(NprP. Jddptmtmpovršinski protein antigena kao što pfs25 sekvence kako je izloženo u GenBank Accession Nos. XM 001347551: X()7802; AFI93769; AF179423: AF 154 117; i AF030628. pfs28 sekvence kako je izloženo u GenBank Accession No. L25843, pfs45 sekvence kao sto je izloženo u GenBank Accession Nos. EFI58081; EF158079; EFI58078; EFI58076; EFI58075; i EFI 58085, pfs84. PFS 48/45 sekvence kao što je izloženo u GenBank Accession Nos. AF356146: AF356145; AF356I44; AF356143; AF356I42; AF356I4I; AF356140; AF356139; AF356138; AF356137; AF356I36; AF356135: AF356I34; AF356I33; AF356132; AF35613I: AF356I30; AF356129: AF356I28: AF356I27. pfs 230 sekvence kao što je izloženo u GenBank Accession Nos. NC_0009IO: XM_001349564; AE00I393: 1.22219; L08I35: i AF269242.P. vivasantigeni poput Pvs25 sekvence kaoStoje izloženo u GenBank Accession Nos. DQ64 1509; DO64I508; DO641507; AY639972; AY63997I; AY639970: AY639969; AY639968: AY639967; AY639966; i AY639965; i Pvs28 sekvence kao što je izloženo u GenBank Accession Nos. AB033364; AB033363: AB033362; AB033361; AB033360; AB033359; AB033358: AB033357: AB033356; B033355; AB033354; AB033353; AB033352; AB033351; AB033350; AB033349; AB033348: AĐ033347; AB033346: iAB033345). Schistosoma sp. Mveobucteriitm titbevculosis(npr Ag85 sekvence kako je izloženo u GenBank Accession Nos. AX253506; AX253504; AX253502; i AX2I 1309; MPT64, ESAT-6, CFP10, R8307. MTB-32 MTB-39. CSP. LSA-I. LSA-3,
EXPI, SSP-2, SAl.SA, STARP, GLURP. MSP-1. MSP-2. MSP-3 . MSP-4. MSP-5. MSP-8. MSP-9. AMA-1 Tip I integralni membranski protein, RESA. EBA-175. i DBA sekvence kako je izloženo u GenBank Accession Nos. BX842572; BX842573: BX842574: BX842575: BX842576; BX842577: BX842578: BX842579; BX842580; BX84258I; BX842582; BX842583; BX842584 i NC 000962. HSP65 sekvence kako je izloženo u GenBank Accession Nos, AY299175; AY299174; AY299144: AF547886; i AE547885).
|00591 Antigeni kancera obuhvataju, na primer. antigene izražene, na primer. u kaučem debelog creva. kanceru želudca, kanceru pankreasa, kanceru pluća, kanceru jajnika, kanceru prostate, kanceru dojke, kanceru kože (npr melanom), leukemiji, limfomu ili mijelomu. primeri antigeni kancera uključuju, na primer. HPV LI. HPV L2, HPV El, HPV E2, placentalna alkalna fosfataza. AFP. BRCAI. Her2/neu. CA 15-3. CA 19-9. CA-125. CEA, Hcg, urokinaze tipa plazminogen akti vator (UPA). inhibitor aktivatora plazminogena.
[0060|Gljivični antigeni mogu biti izvedeni od. na primer.Tinea pedis. Tinea corponis, Tinea eruris, Tinea
unguium, Cladosporium caru' mii. Coccidioides iininitis, Candidu sp.. Aspergilhts fnmigalus i l' neumocvslis carinii.
[00611Nukleinske kiseline koje kodiraju imunogene polipeptide. su tipično proizvedene metodama rekombinantne DNA (videti, npr, Ausubel, et al. ed. (2001) Current Protocols in Molecular Biologv). Na primer. DNA sekvence koje kodiraju imunogeni polipeptid mogu biti okupljene od cDNA fragmenata i kratkih oligonukleotidnih veza. ili iz niza oligonukleotida, ili pojačane od cDNA korišćenjem odgovarajućih kapislida da obezbede sintetički gen koji je sposoban da bude umetnut u rekombinantni ekspresioni vektor (tj vektor plazmid ili virusni vektor) i izražen u rckombinantnu transkripcionu jedinicu. Kada je nukleinska kiselina koja kodira imunogeni polipeptid proizvedena, može biti ubačena u rekombinantni ekspresioni vektor koji je pogodan zain vivo ili t:\- vivoekspresiju.
100621 Rekombinantni ekspresioni-vektori sadrže DNA sekvencu koja kodira imunogeni polipeptid operativno vezan za pogodne transkripcione ili translacione regulatorne elemente izvedene od sisara ili virusnih gena. Takvi regulatorni elementi uključuju pokretač transkripcije, opcioni niz operatera za kontrolu transkripcije, sekvencu koja kodira odgovarajuća mRNA mesta za vezivanje ribozoma i sekvence koje kontrolišu završetak transkripcije i prevoda. Mesto početka replikacije i selektivni marker za olakšavanje prepoznavanja transformanata mogu biti dodatno inkorporirani. Geni korišćeni u rekombinantnim ekspresionim vektorima se mogu podeliti između više od jednog virusa tako da su genski produkti na dva različita vektora, a vektori se koriste za kotratisdukciju da obezbede sve proizvode gena u trans položaju. Mogu postojati razlozi da se podele proizvodi gena kao što su ograničenja veličina za umetanja, ili toksičnost kombinovanih genskih proizvoda na virusne proizvedene ćelijske linije.
C. TLR-3 Agonisti
100631 U predmetnom pronalasku, TLR-3 agonist koji je heterologna dsRNA se koristi da stimuliše imuno prepoznavanja antigena od interesa. TLR-3 agonisti uključuju, na primer. kratku ukosnicu RNA. virusno izvedenu RNA. kratke segmente RNA koji mogu da formiraju duple niti ili kratku ukosnicu RNA. i kratku posredovanu RNK (siRNA). U jednom izvođenju ovog pronalaska. TLR-3 agonist je virusno izvedena dsRNA. kao što je na primer. dsRNA izvedena iz Sindbis virus ili dsRNA virusnih intermedijera [Alexopoulou et al. Nature 413: 732-8 (2001)]. U nekim izvođenjima, TLR-3 agonisti su kratka ukosnica RNA. Sekvence kratke ukosnice RNA obično sadrže dve komplementarne sekvence spojene od sekvence linkera. Posebna linker sekvenca nije kritičan aspekt pronalaska. Bilo koja odgovarajuća linker sekvenca se može koristiti sve dok ne ometa vezivanje dve komplementarne sekvence za fo r m i ra n j e d s RN A.
|0064|U nekim izvođenjima, kratka ukosnica RNA sadrži sekvencu navedenu u SEK ID BR: 3. 4. 5. 8. 9, 10. II. ili 12, sekvence sa značajnim identitetom prema sekvenci u SEK 1DBR: 3,4. 5. 8.9. 10, 11 ili 12. ili varijanta sekvence navedene u SEK ID BR: 3, 4, 5, 8. 9, 10, 11, ili 12. U nekim rešenjima. dsRNA koja je TLR-3 agonist ne kodira određeni polipeptid, ali proizvodi pro-inflamatornc citokine (npr 11.-6. IL-8, TNF-alfa. IFN-alfa. IFN-beta) u kontaktu sa ćelijom odgovora (npr dendritiska ćelija, periferne krvi mononttklearne ćelija, ili rnakrofage)in vitro ili in vivo.U nekim slučajevima, nukleinska kiselina koja kodira TLR-3 agonist (npr izražena dsRNA) i himerni adenovirusni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira heterologni antigen se primenjuju u istoj formulaciji. U drugim slučajevima nukleinska kiselina koja kodira TLR-3 agonist i nukleinska kiselinu koja kodira heterologni polipeptid su pod kontrolom različitih pokretača.
|0065| Nekoliko hemijski sintetizovanih analoga do dvostrukog lanca RNA su komercijalno dostupni. Ovo uključuje poliinozin-policitidilićnu kiselinu (poli I: C), poliadenilne: poliuridiličnu kiselinu (poli A: U), i poli Irpoli C. Antitela
(ili unakrsno povezana antitela) za TLR-3 takođe mogu dovesti do produkcije 1FN beta ili pro-inflamalornih citokina [Matsumoto et al. Biochem. Biophvs. Res. Common. 24: 1364 (2002). de Bouteiller et al. J Biol. Chcm. 18: 38133-45 (2005)]. Komercijalno dostupni siRNA segmenti svake sekvence se takođe mogu dobiti preko izvora, kao što je Invitrogen.
IV. Farmaceutske kompozicije
|0066|Farmaceutske kompozicije koje sadrže vektore ovde opisane mogu takođe sadržati druga jedinjenja. koja mogu biti biološki aktivna ili neaktivna. Polipeptidi mogu. ali ne moraju, bili konjugovani do drugih makromolekula kao što je opisano, na primer. u U.S. Pat. Br. 4.372.945 i 4.474,757. Farmaceutske kompozicije mogu generalno da se koriste za protilaktičke i terapeutske svrhe. Farmaceutske kompozicije mogu biti sastavljene od metoda za zaštitu protiv degradacije u stomaku tako da primenjen himerni adenovirusni vektor može stići do željene lokacije. Za oralno okruženje, nekoliko njih je dostupno uključujući Eudragit i vremenske sat sisteme za oslobađanje, kao i druge metode posebno dizajnirane za adenovirus [Lubeck et al. Proc Natl Acad Sci USA. 86 (17). 6763-6767 (1989); Chourasia and Jain. J. Pharm Pharm Sci. 6 (I), 33-66 (2003)). Postoji nekoliko metoda koje su već opisane za mikroinkapsulaciju DNA i lekova za oralnu primenu Ivideti. na primer. U.S. Patentnoj publikaciji No.2004043952). U nekim izvođenjima. Budragit sistem će se koristiti za isporuku himeričnog adenovirusnog vektora prema donjem tankom crevu. Međutim, isporuka prema drugim lokacijama tankog creva bi trebala takođe da limkcioniše.
J00671Kako je gore napomenuto, himerni adenovirusni vektori pronalaska mogu biti isporučeni korišćenjem bilo sistema isporuke koji su poznati prosečnom stručnjaku iz oblasti tehnike. Brojne tehnike za isporuku gena su dobro poznate u stanju tehnike, kao što su one opisane ti Rolland (1998) Crit. Rev Therap. Drug Carrier Svstems 15: 143-198, i referencama ovde citiranim.
|00681Biće očigledno da imunogcne kompozicije mogu da sadrže farmaceutski prihvatljive soli polinukleotida koje kodiraju hctcrologne polipeptide (npr imunogene polipeptide). Takve soli mogu biti pripremljene od farmaceutski prihvatljivih netoksičnih baza, uključujući organske baze (npr. soli primarnih, sekundarnih i tercijarnih amina i baznih aminokiselina) i neorganskih baza (npr, natrijum. kalijum. litijum. amonijum. soli kalcijuma i magnezijuma). Neki posebni primeri soli uključuju fosfatu i puferovani slani rastvor i slani rastvor za injekciju.
10069JBilo koji pogodni nosači poznati prosečnom stručnjaku u stanju tehnike mogu biti uključeni u farmaceutskim kompozicijama iz ovog pronalaska. Pogodni nosači uključuju, na primer, vodu. slani rastvor, alkohol, mast, vosak, pufer, čvrsti nosač, kao Sto je manitol, laktoza. škrob, magnezijum stearat. natrijum saharin. talk, celuloza, glukoza, saharoza, i magnezijuma karbonatilibiorazgradive mikrosfere (npr polilaktat poliglikolal). Pogodne biorazgradive mikrosfere su opisane, na primer, u U.S. Pat. Nos. I. 897.268; 5.075.109; 5.928,647: 5,811,128; 5,820.883, Imunogeni polipeptid i/ili nosač virusa mogu biti inkapsulirani unutar biorazgradive mikrosfere ili su u vezi sa površ i nom m ikros fera.
|0070|Takve kompozicije mogu takođe da sadrže pufere (npr neutralni puferovani slani rastvor ili fostatno puferovani slani rastvor), ugljene hidrate (npr. glukozu, manozu, saharozu ili dekstrane). manitol. proteine, polipeptide ili amino kiseline kao Sto su glicin. antioksidanse. bakteriostate. helirajućaća sredstva kao Sto je EDTA ili glutation, adjuvanse (npr aluminijum hidroksid). rastvorene supstance koji čine formulaciju izotoničnom, hipotoničnom ili slabo hipertoničnom sa krvlju primaoca, sredstva za suspendovanje. sredstva za zgušnjavanje i/ ili konzervanse. Alternativno, kompozicije prema prikazanom pronalasku mogu biti formulisane kao liofilizat. Jedinjenja takođe mogu biti inkapsulirana unutar lipozomima korišćenjem dobro poznate tehnologije.
100711U nekim ostvarenjima, kompozicije dalje sadrže adjuvans. Pogodni adjuvansi uključuju, na primer, lipide i ne-lipidna jedinjenja. kolera toksin (CT). CT podjedinice B. CT derivat (TK63. E. coli termolabilni enterotoksin (LT). LT derivat LTK63, AI (OM) 3, i polijonske organske kiseline kao što je opisano u npr, VVO04/020592. Anderson and Crovvle, Infect. Immun. 31(1): 413-418 (1981). Roterman et al..1. Phvsiol. Pharmacol. 44 (3): 213-32
(1993), Arora and Crowle J. Rcticuloendothel. 24 (3): 271-86 (1978). and Crovvle and Mav. Infect. Immun. 38(3): 932-7 (1982)). Pogodne polijonske organske kiseline uključuju na primer. 6.6,-[3.3'-demitil [I. r-bifenil]-4.4'- dtil] bis (azo) bis [4-amino-5-hidroksi-l.3-naftalen-disulfonsku kiselinu] (Evans Blue) i 3.3'- [1, l'bifenil]-4.4'-diilbis (azo) bis [4-amino-l-natfalensulfonsku kiselinu] (Kongo crveno). Ovo će biti cenjeno od strane stručnjaka u stanju tehnike da se polijonske organske kiseline mogu koristiti za bilo koju metodu genetičke vakcinacije u vezi sa bilo kojim tipom primene. |0072| Drugi pogodni adjuvansi uključuju lokalne imunomodnlatore kao što su. članovi imidazohinolinske porodice kao što je na primer. imikuimod i rezikvimod (videti, npr Hengge et al. Lancet Infect. Dis. I (3): 189-98 (2001). Izraženi TLR-3 agonisti (nprdsRNA) i TLR-7 agonisti (npr ssRNA) takode mogu biti korišćeni. |0073] Dodatni pogodni adjuvansi su komercijalno dostupni kao. na primer. dodatni adjuvansi na bazi aluminijuma (npr Alhidrogel, Rehidragel, aluminijum fosfat, Algammulin); pomoćna sredstva na bazi ulja (Freund-ov nekompletni adjuvans i kompletni adjuvans (Difco Laboratories. Detroit. Mich.). Spekol. RIBI. TiterMaks. Montanide ISA50 ili Seppic Montanide ISA 720): nejonski blok kopolitneri bazirani adjuvansi. citokini (npr GM-CSF ili FIat3-ligand); Merck Ađjuvant 65 (Merck and Companv. Inc.. Rahvvav. N. J.): AS-2 (SmithKIine Beecham Philadelphia, Pa.); soli kalcijuma, gvožđa ili cinka; nerastvorna suspenzija acilovanog tirozina; acilovani šećeri; katjonski ili anjonski derivatizovani polisaliaridi; polifosfazeni; biorazgradive mikrosfere: monofosforil lipid A i Kui! A. Citokini, kao što GM- CSF ili interleukin-2. -7. ili -12. su takode pogodni adjuvansi. Hemocijanini (npr hemocijanin iz prilepka) i hemoeritrini se mogu takođe koristiti u pronalasku. Polisaharidni adjuvansi poput, na primer. hitina, hitozana i deacetilovanog hitina su takođe pogodni kao adjuvansi. Drugi pogodni adjuvansi uključuju muramil dipeptid (MDP, N acetilmuramil L alati i l D izoglutamin) bakterijske peplidoglikane i njihove derivate (npr treonil-MDP i MTPPE). EiCG i BCG ćclijskog zida skeleta (CWS) se takode mogu koristiti kao adjuvansi u pronalasku, sa ili bez trehaloze dimikolat. Trehaloza dimikolat može se koristiti (videti. npr.. U.S. Patent No. 4,579,945). Detoksifikovani endotoksint su takođe korisni kao samostalni adjuvansi ili u kombinaciji sa drugim adjuvansimafvideti, n.pr., U.S. Pat. Nos 4,866,034.; 4,435.386; 4.505.899: 4.436.727: 4,436.728: 4,505.900; i 4.520.019. Saponini OS2I. OS17. QS7 su takođe korisni kao adjuvansi (videti. na primer. U.S. Patent No. 5.057,540;. EP 0362 279. WO 96/33739 i WO 96/11711). Drugi pogodni adjuvansi uključuju Montanide ISA 720 (Seppic, Francuska), SAF (Chiron, Calif.. United States). 1SCOMS (CSL). MF-59 (Chiron). SBAS serija ađjuvanasa (npr, SBAS-2, SBAS- 4 ili SBAS-6 ili njihove varijante, na raspolaganju od Smilhkline Beecham. Ri\eiisart, Belgija), Deiox (Corka, Hamilton, Mont.). i RC-529 (Cori\a, Hamilton, Mont). Superantigeni su takođe razmatrani za upotrebu kao adjuvansi u predmetnom pronalasku. Superantigeni uključuju Staphvlococcus e.\oproteine, kao što je a. [3. y, i Aenterotoksini iz.S. cnireus i S. epidermidis,i a, fi, v, i A E. coli exotoksine. Uobičajeni statilokokni enterotoksini su poznati kao stafilokokni enterotoksin A (SEA) i statilokokni enterotoksin B (SEB), sa enterotoksinima do E (SEE) koji su opisani (Rott et al., I992).Streptococcus pvogencs 8(SEB).Ciostridium perfringensenterotoksin (Bovvness et al.. 1992), cttoplazmatski membrana-asocirani protein (CAP) iz ,S'.pvageiu'. s(Sato et al, 1994) i sindrom toksičnog šoka toksin I (TSST I) iz,S<*>.aureiis(Schvvab et al.. 1993) su dodatno korisni superantigeni. |0075|Unutar farmaceutskih kompozicija koje su ovde obezbeđene. kompozicija adjuvansa može biti dizajnirana da indukuje, na primer. imuni odgovor pretežnolipa Thl ili Th2. Visoki nivoi Thl-tipa citokina (npr IFN-gama, TNF-alfa, IL-2 i II.-12) imaju tendenciju da favorizuju indukciju ćelijski posredovanih imunih odgovora na primenjeni antigen. Nasuprot tome, visoki nivoi Th2-lipa citokina (npr IL-4. lL-5. IL-6 i IL-I0) imaju tendenciju da favorizuju indukciju humoralnih imunih odgovora. Nakon oralne primene preparata koji sadrži imunogeni polipeptid kao što je ovde obezbeđeno, imuni odgovor koji uključuje Thl- i Th2-tip odgovora biće tipično izazvan. ]0076] Kompozicije koje su ovde opisane mogu da se primenjuju kao deo formulacije sa odloženim oslobađanjem (tj. formulacija kao što je kapsula ili sunđer koje vrše sporo oslobađanje jedinjenja nakon primene). Takve formulacije mogu generalno biti pripremljene korišćenjem dobro poznate tehnologije (videti. npr, Coombes et al.( l996) Vaccine 14: 1429-1438). Formulacije sa odloženim oslobađanjem mogu da sadrže polipeptid. polinukleotid ili antitelo dispergovana u matriksu nosača i/ili sadržana unutar rezervoara koji je okružen sa brzinom kontrolisanom membranom. |0077| Nosači za upotrebu unutar takvih formulacija su biokompatibilni. i mogu takođe biti biodegradabilni: poželjno formulacija obezbeđuje relativno konstantan nivo oslobađanja aktivne komponente. Takvi nosači uključuju mikročestice poli (laktid-ko-glikolida). kao i poliakrilate. lateks. škrob, celulozu i dekstran. Ostali nosači sa odloženim oslobađanjem uključuju suprainolekulame bio vektore, koji sadrže ne-tečno hidrofilno jezgro (npr unakrsno vezan polisaharid ili oligosaharid) i. opciono. spoljašnji sloj koji sadrži amtifilno jedinjenje (vidi. npr WO 94/20078; WO 94/23701 i WO 96/06638). Količina aktivnog jedinjenja sadržanog u formulaciji sa odloženim oslobađanjem zavisi od mesta implantacije, brzine i očekivanog vremena oslobađanja i prirode stanja koje se leči Ili sprečava. (0078J Farmaceutske kompozicije mogu biti predstavljene u jednodoznim ili višedoznim pakovanjima. kao što su zatvorene ampule ili bočice. Takvi kontejneri su poželjno hermetički zatvoreni da bi se očuvala sterilnost formulacije do upotrebe. Generalno, formulacije mogu da se čuvaju kao suspenzije, rastvori ili emulzije u uljanim ili vodenim nosačima. Alternativno, farmaceutski preparat se može čuvati u stanju liofilizita koji zahteva samo dodavanje sterilnog tečnog nosača neposredno pre upotrebe.
V. Terapeutske upotrebe pronalaska
|00791 Jedan aspekt sadašnjeg pronalaska uključuje imunogenu kompoziciju za upotrebu u postupku lečenja izazivajući antigen specifičan imuni odgovor kod subjekta ili pacijenta sa oboljenjem kao sto je, na primer. virusna infekcija, bakterijska infekcija, parazitska infekcija, gljivična infekcija, ili kancer. Kao što se ovde koristi, izraz "subjekt" ili "pacijent" se odnosi na bilo koju toplokrvnu životinju, poput, na primer. glodara. mačke, psa ili primata, poželjno čoveka. Imunogene kompozicije se mogu koristiti za lečenje u bilo kojoj fazi bolesti, tj, u pre-kanceroznom, kanceroznom ili metastatskom stadijumu. ili za prevenciju bolesti. Na primer, kompozicije ovde opisane mogu da se koriste za lečenje virusnih bolesti kao što je FIIV ili hepatitis ili za prevenciju ili lečenje kancera. U takvim postupcima, farmaceutski preparati se tipično primenjuju na pacijentu. Pacijent može ili ne mora bili pogođen oboljenjem ili poremećajem (npr. virusne infekcije, bakterijske infekcije, ili kancer). Bolest ili poremećaj mogu biti dijagnostifikovane korišćenjem kriterij uma opšte prihvaćenih u tehnici. Na primer. virusna infekcija može biti dijagnostifikovana merenjem virusnoglitra u uzorku pacijenta, bakterijska infekcija se može dijagnostifikovati detektovanjem bakterije u uzorku pacijenta, i kancer se može dijagnostifikovati detekcijom prisustva malignog tumora. Farmaceutske kompozicije mogu biti primenjene ili pre ili nakon hirurškog odstranjivanja primarnog tumora i/ili lečenja kao što je primena radioterapije ili konvencionalnih hemoterapeutskih lekova.
100801 Imunoterapija je tipično aktivna imunoterapija. u kojoj se lečenje oslanja na in vivo stimulaciju endogenog imuno sistema domaćina da reaguje protiv, npr tumora ili bakterijske ili virusno inficirane ćelije, sa primenom imunih agenasa koji modifikuju odgovor (kompozicije koje sadrže nukleinske kiseline kodiraju imunogene polipeptide kao sto je ovde obezbeđeno).
[00811 Učestalost primene profilaktičkih ililerapeutskih kompozicija koje su ovde opisane, kao i doza će varirati od pojedinca do pojedinca koje mogu biti lako utvrđene korišćenjem standardnih tehnika. Cesto između I i 10 doza može biti prt'menjeno tokom perioda od 52 nedelje. Obično 3 doze se primenjuju. u intervalima od I meseca. tipičnije. 2-3 doze se primenjuju svaka 2-3 meseca. Moguće je da će intervali doziranja biti jednom godišnje za određene terapije. Pobuđivaći vakcinacije se mogu davati periodično nakon toga. Alternativni protokoli mogu biti pogodni za pojedinačne pacijente i pojedine bolesti i poremećaje. Pogodna doza je količina jedinjenja koja. kada se primenjuje kao Sto je prethodno opisano, je adekvatna da promoviše. npr anti-tumorski, anti -virusni ili antibakterijski, imuni odgovor, i najmanje je 10-50% iznad bazalnog (tj nelećenog) nivoa. Takav odgovor se može pratiti merenjem anti-tumorskih antitela kod pacijenta ili vakcina zavisne generacije citolitičkih T ćelija sposobnih za ubijanje, npr, tumorske ćelije pacijenta, virusno inficiranih ćelija pacijenta, ili bakterijski inficirane ćelije pacijenta in vitro.
Takve vakcine bi takođe trebalo da budu sposobne da uzrokuju imuni odgovor koji vodi do poboljšanja kliničkog ishoda (npr češće remisije, celokupno ili delimično ili duže preživljavanje uz odsustvo bolesti) kod vakcinisanih pacijenata u poredenju sa ne-vakcinisanim pacijentima. Tipično, količina virusnih ti tara će biti između 1.0x104 pfu/ životinji i 1.0x1015 PFU/životinji. Pogodne veličine doza će varirati u zavisnosti od srazmera pacijenta, ali će biti tipično u opsegu od oko 0,01 ml do oko 10 ml. tipičnije od oko 0.025 do oko 7.5 ml. najčešće od oko 0.05 do oko 5 ml. Stručnjaci iz ove oblasti tehnike će oceniti da veličina doza može bili podešena na osnovu određenog pacijenta ili određene bolesti ili poremećaja koji se leče. Za oralnu primenu. himerni adenovirusni vektor može pogodno biti formulisan u tabletu.
|0082j Uopšteno, odgovarajuća doza i režim lečenja obezbeđuju aktivno jedinjenje (a) u količini dovoljnoj da obezbedi terapeutsku i/ili profilaktičku korist. Takav odgovor se može pratiti uspostavljanjem poboljšanog kliničkog ishoda (npr češće remisije, celokupno ili delimično ili duže preživljavanje bez. bolesti) kod tretiranih pacijenata u poredenju sa netretiranim pacijenatima. Takvi imuni odgovori se generalno mogu evaluirati korišćenjem standardne proliferacije. citotoksičnosti ili citokin testova prethodno opisanih, koji se mogu izvoditi korišćenjem uzoraka dobijenih od pacijenta pre i posle tretmana.
|0083|Na primer. detekcija imunokompleksa formiranih između inumogeiiih polipeptida i antitela u lelesnoj tečnosti koja su specifična za imunogene polipeptide može se koristili za praćenje efikasnosti terapije, koja uključuje poseban imunogeni polipeptid. za bolesti ili poremećaje sa kojima je povezan imunogeni polipeptid. Uzorci telesne tečnosti uzrokovane od pojedinca pre i nakon započinjanja terapije mogu biti analizirani na imunokomplekse pomoću metodologija koje su gore opisane. Ukratko, broj imunokompleksa otkrivenih u oba uzorka se porede. Značajna promena u broju imunokompleksa u drugom uzorku (nakon terapije inicijacije) u odnosu na prvi uzorak (pre terapije) odražava uspešnost terapije,
A. Primena kompozicija prema predstavljenompronalasku
100841 Prema kompoziciji za upotrebu u postupcima predmetnog pronalaska, kompozicija koja sadrži himeričm adenovirusni vektor se primenjuje oralno, intranazalno, ili mukozalno preko, na primer sluznica vagine, pluća, pljuvačnih žlezdi, nosnih šupljina, tankog creva. debelog creva. rektuma. krajnika ili Pejer-ovih flastera). Kompozicija se može primeniti sama ili sa adjuvansima kao što je gore opisano. U nekim izvođenjima, adjuvansi su kodirani od strane sekvenci nukleinske kiseline (npr, nukleinska kiselina koja kodira II.-2. GM- CSF. IL- 12. bakterijski flagelin). U nekim izvođenjima, adjuvans se primenjuje u isto vreme kao i kompozicija. U drugim izvođenjima, adjuvans se primenjuje posle primene kompozicije, npr 6, 12, 18. 21, 36. 4S. 60 ili 72 sata nakon primene kompozicije.
B. Detekcija imunog odgovoranaantigenod interesa
100851Imuni odgovor na heterologni polipeptid može biti detektovan korišćenjem bilo kojih sredstava poznatih u tehnici uključujući, na primer detekciju specifične aktivacije CD4" ili CD8 1 ćelija ili detekciju prisustva antitela koja se specifično vezuju za polipeptid.
|0086| Specifična aktivacija CD4 ili CD8 T ćelija povezanih sa sluzokožnim. humoialnim ili ćelijski posredovanim imunološkim odgovorom može se detektovali na različite načine. Metode za detekciju specifične aktivacije T ćelija uključuju, ali nisu ograničene na. detekciju proliferacije I ćelija, proizvodnju citokina (npr, limfokina) ili generisanje citolitičke aktivnosti (tj generacija citotoksičnih T ćelija specifičnih za imunogeni polipeptid). Za CD4<+>T ćelije, poželjan metod za detekciju specifične aktivacije T ćelija je detekcija proliferacije T ćelija. Za CD8' T ćelije, poželjan melod za detekciju specifične aktivacije T ćelija je detekcija generacije citolitičke aktivnosti koristeći MCr tesl oslobađanja (videti. na primer. Brossart and Bevan. Blood 90 (4): 1594- 1599 (1997) i l.enz et at. I Exp. Med. 192(8): 1 135-1 142 (.2000)).
[0087] Detekcija proliferacije T ćelija može biti postignuta pomoću različitih poznatih tehnika. Na primer, proliferacija T ćelija se može detektovati merenjem brzine sinteze DNA. T ćelije koje su stimulisane da se razmnožavaju pokazuju povećanu brzinu sinteze DNA. Tipičan način da se izmeri brzina sinteze DNA je. na primer, ritmično-označavanje kultura T ćelija sa tricijum timidinom, nukleozidnim prekursorom koja je inkorporirana u novosintetisanu DNA. Količina inkorporiranog tricijum timidina može se odrediti pomoću tečnog scintilacionog spektrofotometra. Drugi načini za detekciju proliferacije I ćelija obuhvataju merenja povećanja produkcije interleukina-2 (1L-2). Ca ' fluks ili preuzimanje boje. kao šio je 3-(4,5-dimetilliazol-2-il)-2.5-difenilteliazolijum. Alternativno, sinteza limfokina (npr. interfeion-gama) se može izmeriti Ili relativni broj T ćelija koje mogu da odgovore na imunogeni polipeptid sc može kvantitikovati. 100881Antitela imunih odgovora (aka humoralni imuni odgovori ili odgovori li ćelija), uključujući sluzokožne odgovore antitelima koji se mogu detektovali korišćenjem imunoodredivanja poznatih u tehnici [Tueker et al. Mol Therapy. 8, 392-399 (2003); Tucker et al, Vaccine. 22. 2500-2504 (2004)]. Pogodna imuno testiranja uključuju dvostruko monoklonsko antitelo sendvič tehniku imuno određivanja prema David et al (U.S. Patent No. 4,376.110.); monoklonska-poliklonska antitela sendvič testove (VVick et al., in Kirkham and ilunter. Eds. Rađioimmunoassav Methods. E. i S, Eivingstone, Edinburgh (1970)): the "VVestern blot" metod prema Gordon el al (U.S.Pat.No. 4.452,901.); imunoprecipitacija obeleženog Uganda (Brovvn et al. (1980) J. Biol. Chem. 255: 4980-4983): enzimski povezani imunosorbent testovi (ELISA) kao što je opisano, na primer, prema Raines et al (1 982) J. Biol. Chem. 257: 5154-5160; imunocitohemijske tehnike, uključujući korišćenje fluorohroma (Brooks cl al. (1980) Clin. Exp. Imnumol. 39: 477); i neutralizacija aktivnosti (Bovven-Pope et al. (1984) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81:2396-2400). Pored imunoodredivanja gore opisanih, veliki broj drugih imunoloških testova je dostupan, uključujući one opisane u U.S. patentu Nos 3,817,827.; 3.850.752; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; i 4.098.876.
PRIMERI
100891 Sledeći primeri su namenjeni da ilustruju. ali ne ograničavaju pronalazak.
Pri mer 1: Konstrukcija himerićnog adenovirusnog vektora (DSI)
|0090|Da bi se pokazalo da TLR-3 agonisti mogu poboljšati adaptivne imune odgovore na izraženi antigen od interesa, nekoliko različitih himernih virusnih vektora je konstruirano da sadrže sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju nekoliko različitih antigena od interesa. U ovom primerti, nukleinska kiselina koja kodira gpl20 (od Nll-I AIDS Reagensa i Referenca Reagent Program) je stavljena pod kontrolom CMV pokretača sa malim intronom samo uzlazno od startnog kodona u Sati vektoru (pShuttle, Obiogene). Poli A rep od bGH je postavljen silazno od nukleinske kiseline koja kodira gp!20. Vektorska sekvenca je navedena u SEK ID BR I. Homologna rekombinacija sa vektorom pAd (Obiogene) je izvedena za generisanje vektora sposobnog da proizvodi rekombinantni Ad (EI/E3 obrisan) koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira gp 120. DSI je generisana putem transfekcije novog pAd- CMV-gp!20 ekspresije konstrukcije u 293 ćelije. Titri su mercni standardnim metodama.
Primer 2: DSI ( vektor plus TLR-3 ag onist) je superiorniji u od nosu na s tandardni rAd5 za, induk ciju antigen
specifičnog imuno g odgovora
|00911Da bi se odredilo da li dodavanje TLR-3 agonista može da poboljša adaptivne imune odgovore. 10x 10 PEU od bilo rAd-CMV-gpl20 plus 5 ug/ ml poli I: C (DSI) ili samog rAđ-CMV-gpl20 (iAd5) sti primenjivane na životinjama oralno, putem cevčice u toku nedelja 0 i 3. Oba vektora izražavaju HIV gpl2() pod kontrolom CMV promotera i koriste rekombinantni E1/E3 obrisan adenovirus tip 5. Meren je titar antitela na gpl20 u plazmi 3 i 6 nedelja nakon početne primene anti-gp120 IgG ELISA kako je opisano u (Tucker, et al. Mol. Ther 8:392 (2004)). Kao Sto je prikazano na Slici I, DSI ispoljava znatno bolji u odnosu na rAd5 izazvani odgovor antitela za protein gpl20 i u 3 i u 6 nedelji posle početne oralne primene. Posebno, prosečan titar antitela prema gp 120 je 100 puta bolji sa DSI grupom nego sa rAd5 grupom u 6 nedelji. Takođe izgleda da je DSI grupa bila pobuđena ponovnom primenom u 4 nedelji tako da je prosečan titar povećan više od 20 puta između 3 i 6 nedelje dok rAd5 grupa pokazuje samo blago povećanje srednjeg titra antitela. Rezultati pokazuju da dodavanje TLR-3 agonista može značajno da poboljša Ad5 posredovani odgovor antitela na antigene od interesa nakon oralne primene himernog adenovirusnog vektora koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antigen od interesa. Kao pozitivna kontrola u određivanju, serumi životinje ubrizgani su subkutano sa gpl20 plus kompletnim Freund-ov adjuvans je takođe meren u anti-gpI20 ELISA u 3 nedelji. Netretirane životinje i životinje kojima je primenjen sam dsRNA analog (dsRNA) služi kao negativna i pozadinska kontrola, u odnosu za ELISA. Svaka grupa sadrži 6 životinja.
Primer 3: I zgradnja dru<g>o<g>himerno<g>adenoviru snog vektora ( DSlb) i tre ćeg himernog adenov irusnog vektora
( DSIc)
(00921 Nukleinska kiselina koja kodira zeleni fluorescentni protein (GFP) je ubačena u pShuttle-CMV (Obiogene) korišćenjem standardnih rasporeda restrikcionih enzima. Plazmid pShuttleCMV-GEP je kombinovan od homologne rekombinacije sa vektorom pAd (Qbiogene) kako je opisano ranije u cilju stvaranja vektora sposobnog da proizvodi rekombinantni Ad (E1/E3 obrisan) koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira GFP. Nukleinska kiselina koja kodira hemaglutininin (HA) od influence A/ PR/ 8/34 je klonirana i smeštena u pShuttle-CMV vektor (Obiogene) (SEK ID BR: 13). Plazmid pShuttleCMV-HA (PR/8) je kombinovan homolognom rekombinacijom sa vektorom pAd (Obiogene) kao što je prethodno opisano u cilju stvaranja vektora sposobnog da proizvodi rekombinantni Ad (El/ E3 obrisan) koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline za kodiranje HA. Rekombinantni Ad je generisan putem transfekcije novog pAd-CMV-GFP i pAđ-CMV-HA izražene konstruisanjem u 293 ćelije. Titri su meren i standardnim metodama.
Primer 4: DSIb fAd-CMV-GFP plus TLR-3 agonist} i DSIc (Ad-CMV-HA plus ll.R-3 agonist) je su periorniji u odnosu na standardne rAd 5 za indukciju anti<g>en specifično<g>imunog odgovora.
100931 1.x 107 PI-'U bilo od Ad-CMV-GFP plus 5 ug.'ml poli I: C (DSIb) ili Ad-CMV- GFP (rAd5) su davane životinjama oralno, putem cevčice u nedelji 0. Oba virusa eksprimiraju GFP pod kontrolom CMV promotera i koriste rekombinantni EI/E3 izbrisan adenovirus tipa 5. Meren i su titri antitela za GFP u plazmi 3 nedelje posle inicijalne primene virusa pomoću anti-GI P IgG 1:1.ISA. Kao što je prikazano na na slici 2. DSIb grupa se pokazala značajno bolja nego rAd5 u izazivanju odgovora antitela na GFP protein u 3 nedelji nakon početne oralne primene.
100941CD8" T ćelijski odgovori na GFP su mereni pomoću tetramer bojenja splenocila. Životinje su vakcinisane u nedeljama 0. 4. 8 i slezine su prikupljene u 10 nedelji. Splenociti su obojeni sa CD8-F1TC i tetramer koji prepoznaje imunodominantni epitop na GFP kod BAl.B.c miševa. Rezultati pokazuju daje oralna primenu DSIb vektora bila statistički bolja u odnosu na sam rAad u indukciji tetramer pozitivnih CDS ćelija (Slika 2b).
|0095| l.OMO'PFU bilo od Ad-CMV-HA plus 5 ugml poli I: C (DS I c) ili Ad-CMV-HA (rAđ5) su davane životinjama oralno, putem cevčice u 0 nedelji. Oba virusa izižavnju HA pod kontrolom CMV promotera i koriste rekombinantni E1/E3 obrisan adenovirus tip 5. Mereni su titri antitela na HA u plazmi 3 nedelje nakon početne primene virusa pomoću anti-PR8/34 IgG ELISA. Postupak za merenje odgovora antitela je sličan onome koji je prethodno opisan sa izuzetkom da su ELISA ploče obložene sa 5 ug/ ml celog A/PR8/34 lizata (Advanced Biotcchnolog) Incorporatcd. Gailhcrsburg. MD). Kao što je prikazano na slici 2C DSIc grupa pokazuje značajno bolji (približno 100 puta bolja) od rAd5 u izazivanju od<g>ovora antitela na influenzu u 3 nedelji nakon početne oralne primene. Rezultati ovih studija takode pokazuju da se pristup korišćenja FLR-3 agonista zajedno sa himernitn rekombinantnim adenovirusnim vektorom može generalno primeniti na višestruko različite heterolo<g>ne antigene, sa 100 strukim poboljšanjem titra antitela.
Primer 5 ne- parenteralni putevi isporuke su superiorniji u odnosu na parenteralne puteve
10096| Intramuskularna isporuka je testirana direktno ubrizgavanjem 1.0x10 PFU pAd-CMV-gpl20 (DSIO - - poli I: C na 5ug/ml u kvadricepse životinja. Mereni su plazma serum IgG titri na U F'P kako je opisano ranije. Svaka grupa je obuhvatala 6 životinja. Kao sto je prikazano na slici 3A. značajan titar antitela prema gpl2() je primećen u 3 nedelji nakon primene grupe sa TLR-3 agonistima (i.m. rAd >- PI). (Slika 3a).
|0097| Intranazalna primena je testirana davanjem 20 ul od l.lxl0<<>'PFLJ DSIc ■ - 5 ug, ml. poli l:C u nazalnu šupljinu miša. Miševi su lagano anestezirani izofluranom pre primene virusa formulisanog li sterilnom slanom rastvoru. Rezultati pokazuju daje rAđ-CMV-HA plus poli l:C (DSIc) imao nešto viši titar antitela u odnosu na životinje kojima je dat standardni rAd-CMV-I IA. Rezultati su ucrtani kao pojedinačne životinje za DSIc (N = 6) i rAd (N - 5) grupe, Netretirane životinje (N = 4) su kori Scene kao negativna kontrola.
P rimer 6. Konstr ukcija izražen og TLR3 a<g>onista.
|0098| Kratak 45 BP segment DNA je sintetizovan uređivanjem DNA oligo kada su zajedno udruženi formiraju 45 bp segment dizajniran da se napravi ukosnicu za dvo-lančanu
RNA(GAAACCATATGGGCTGAATACCGATCCGTATTCAGCCCA TA TCG TTTC)
(SEK ID NO: 10). Ovaj kratki segment (nazvan luci) kloniran je u plazmid pSK-koji sadrži p humani beta aktinski pokretač i BGH poli A rep. Ovaj plazmid se zove pSk- luci.
Primer 7. pSK- Iuc I funkcij e u kulturama dendritskih ćelija, kao što su poli I: C. efekti poli F C i rAd su dodatni.
|00991Da bi se odredilo da li bi izražen TLR-3 agonist iz Primera 6 gore naveden mogao da funkcioniše kao induktor pro-inflamatornih citokina i sazrevanja dendritskih ćelija poput TLR-3 liganda poli I: C. izražen dsRNA TLR-3 agonist je testiran u kulturi dendritskih ćelija. Koštana srž iz femura BALB c miševa su kullivisane sa flt-3 ligand-om (200 ng/ml), 5% seruma, u DMEM medij um u kako bi nastale primarne dendritske ćelijske kulture. Pet dana nakon sto su kulture primarne koštane srži postavljene. 293 ćelije su transfektovane sa bilo pSk-lucl. pSk-beta2 (dugi segment beta galaktozidaze koja formira 200 bp ukosnicu) ili pcDNA3 (prazan ekspresioni vektor). Šestoga
danu. transfeklovanc ćelije su tretirane UV zračenjem (20 sekundi na 40 kJ cm2) što prouzrokuje apoptozu i ove ćelije su dodate dendritskim ćelijama. Ili poli I: C (I ug mL). rAd (1 PFU ćeliji). rAd - poli I: C, pSK-luc 1 transtektovane ćelije. pSk-bela2 translektovane ćelije, ili pcDNA.3 transfeklovanc ćelije su dodate dendritskim ćelijama i kititivisane preko noći.
Kao Stoje prikazano na Slici 4A, pSK-lucI transtektovane ćelije mogu značajno poboljšali aktivaciju dendritskih ćelija mereno pomoću miš IL-6 ELISA. Rezultati ovog eksperimenta pokazuju da kombinacija rAd plus TI.R3 liganda (poli 1: C) zajedno značajno može da poboljša aktivnost dendritske ćelije.
101001 Dodatni ligandi su takode testirani. TLR-3 agonist naveden u SEK ID NO: I I (ml) takode formira dsRNA ukosnicu od približno iste veličine kao luci. Ove su napravljene preklapanjem uligonukleotida i kaljenjem zajedno pre kloniranja u pSK-vektor pod kontrolom pokretača humanog beta aklina. Vektori su translektovani u 293 ćelije i date primarnim dendritskim ćelijama kao Sto je opisano ranije. Kao što je prikazano na Slici 4B. ovi dodatni ligandi mogu aktivirati dendritske ćelije slične onoj iz liganda luci (Slika IB).
Primer 8. Konstrukcija četvrtog himernog adenovirusnog vektora (DS2) i brzihvekt ora z a klonir anje ( DS2beta-luc i
DS2C- luc).
101011Nukleinska kiselina koja kodira gpl20 (od NIH istraživanje AIDS-a i Referenca Reagent Program)) je stavljena pod kontrolu CMV pokretača sa malim intronom samo ushodno od start kodona u šali vektoru (pShuttleCMV, Obiogene). Poli A rep od bGII je postavljen nishodno od nukleinske kiseline koja kodira gpl20. dsRNA TLR-3 agonist luci pod kontrolom humanog beta aktin pokretača i poli A (opisanog prethodno u primeru 5) je ubačen u gpl20 pShuttle vektor tako da su i nukleinska kiselina koja kodira gpl20 i nukleinska kiselina koja kodira TLR-3 agonist sadržane u samom vektoru pod kontrolom dva odvojena pokretača. Orijentacija ekspresije nukleinske kiseline koja kodira antigen od interesa i ekspresija TLR-3 agonista je prikazana na slici 5.
|0102| Dva generička shuttle vektora nazvana DS2beta-luc (SEK ID BR: 14) i DS2C-luc (SRK ID BR:I5) su takođe konstruisana tako da nukleinska kiselina koja kodira bilo koji antigen od interesa može biti umetnula pod pokretačem CMV i ili humanog beta aktin pokretača ili se CMV pokretač koristi za vođenje ekspresije dsRNA TLR-3 agonista. Posebno, vektor DS2C-luc ima jedinstven Kpn I položaj u koji nukleinska kiselina koja kodira antigen od interesa može lako biti klonirana. Uloga ovih vektora je da naprave sledeću konstrukciju vektora mnogo lakše jer nukleinska kiselina koja kodira svaki antigen od interesa može biti umetnuta u mesto kloniranja da brzo proizvede vektor sposoban da izražava antitela i T ćelijske odgovore protiv antigena od interesa. Homologna rekombinacija na DS2 sa vektorom pAd (Qbiogcne) je izvedena kao ranije da bi se generisao vektor sposoban da proizvodi rekombinantni Ad (EI/E3 brisan) koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira GFP i nukleinsku kiselinu koja kodira dsRNA LR-3 agonist luci.
Rekombinantni Ad je generisan putem transfekcije novog pAd-belaaktin-lucl-CM V-gpl2() ekspresije konstruisane u 293 ćelije. Titri su mereni standardnim metodama.
P rimer 9: Indukcija antigen s pec ifičnog imunog odgovora nakon oralne isporuke f)S2.
101031 I.0xl0<7>PFU bilo od pAd-CMV-GPI20 plus TLR-3 agonist luci (DS2) ili pAd- CMV-gpl20 (rAd?) su primenjivane na životinjama oralno, putem cevčice na nedelju dana. Oba virusa ekspriniiraju gpl20 pod kontrolom CMV pokretača i koriste rekombinantni El ' E3 brisan adenovirus tipa 5. Izmeren titar antitela na gpl20 u plazmi 3 nedelje nakon primene virusa pomoću anti-gpl20 IgG ELISA. ELISA protokol je opisan ranije (Tucker. et al. Mol. Therapv 8: 392 (2004)). Rezultati pokazuju da DS2 može da inđukuje otprilike 2 log poboljšanja u litru antitela prema gp!20, heterologni antigen se koristi u eksperimentu. DS2 vektor sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira izraženi gpl20 i sekvencu nukleinske kiseline koja izražava dsRNA TLR-3 agonist. Kao pozitivna kontrola u određivanju, serumi dve životinje ubrizgani su subkutano sa 10 mikrograma gp!20 proteina plus kompletan Freund-ov adjuvans je takođe izmeren u anti-gpl20 ELISA. Neiretirane životinje služe kao negativna kontrola za ELISA. Svaka grupa je sadržala 6 životinja. Rezultati su ilustrovani na slici 6.
Primer 10: Indukcija anti gen speefičnog i munog odgovora nakon oralne isporuke DS3.
101041 lxl0<7>PFU bilo od pAd-CMV-intluenza HA (od A. PR.8'34) plus 11 R" 8 liiiand politiridilik kiselina (DS3) ili pAd-CMV-D (rAd5) su primenjivane na životinjama oralno hranjenjem pomoću cevčice u nedelji 0. Oba virusa izražavaju influenzu HA pod kontrolom CMV pokretača i upotreba rekombinantiiog El E3 brisanog adenovirusa tipa 5. Mereni su titri antitela na HA u plazmi 3 nedelje nakon primene virusa pomoću anti-influenza HA IgG ELISA. Svaka grupa je sadržala 6 životinja. Rezultati su ilustrovani na slici 7.
Primer I I: Konstrukcija pet og, šestog i sedmog himernog adenovirusnog vektora (DS2b. DS2b- za. i ND1. 1 214).
|0105J(ien influenze HA (A/ Indo/5/2005) je sintetisan pomoću CcITck (Nashville. IN) i stavljen u vektor pShuttleCMV (Obiogene) koji ima CMV pokretač sa malim intronom postavljenim samo ushodno od startnog kodona u šatl vektoru, luci DNA sa humanim beta aktin pokretačem i poli A (opisano<g>u primcrti 5) su postavljeni u vektor nishodno od antigena, u orijentaciji prikazanoj na slici 5 za DS2b. Redosled sekvenci luci je
(GAAACGATATGCGCTGAATACGGATCCGTATTCAGCCCATATCGTTTC)(SEKID BR: 10) i popunjen pShuttle vektor je naveden u SEK ID BR: 6. Alternativna orijentacija luci sa pokretačem u shuttle vektoru je opisana kao SEK ID BR; 7 i označena kao DS2b-za. Takode su konstruisali drugi pShuttle vektor (nazvan DS2bC-HA) (SEK ID NO: 16). koji sadrži dva odvojena CMV pokretača vodeći ekspresiju TLR-3 agonista luci i influenzu HA gore opisanih. Homologna rckombinacija sa vektorom pAd (Obiogene) je izvedena kao ranije u cilju stvaranja vektora sposobnih za proizvodnju rekombinantnog Ad (El E3 brisanog) koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira HA i TLR-3 agonist luci koji su pod odvojenim pokretačima. Rekombinantni Ad je generisan putem transfekcije novog pAd- konstruisanog u 293 ćelije. Titri su mereni standardnim metodama. Popunjen pAd vektor koji sadrži DS2C-luc je nazvan NDLI214 i deponovan u ATCC patentnom depozitu 22 februara 2007 (Manassus. VA). Sekvenca nukleinske kiseline ovog himeričnog adenovirusnog vektora je navedena u SEK ID BR: 17. Nukleinska kiselina koja kodira heterologni antigen je naznačena boldiranim tekstom i okružena sa CIA I meslom prepoznavanja na 5 'kraju i ne 1 mestom prepoznavanja na 3' kraju. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira TLR-3 agonist je označena kurzivom, sa sekvencom linkera naznačenom u bold-u. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira svaki antigen od interesa i sekvenca nukleinske kiseline koja kodira bilo koji pogodni izražen TLR-3 agonist može biti umetnuta unutar himeričnog adenovirusnog vektora.
Primer 12: Indukcija antigen specifičnog imunog odgovora nakon oralne isporuke DS2b.
|0106|I.OnIO<7>PFU bilo od pAd-CMV-HA plus TLR-3 agonisti luci u suprotnoj orijentaciji (DS2b) ili orijentaciji napred (DS2b-za). ili pAđ-CMV-HA (rAd5) su primenjivane na životinjima oralno, putem cevčice u nedelji 0. Ovi virusi izražavaju antigen influenze HA pod kontrolom CMV pokretača i koriste rekombinantni I I 13 brisani adenovirus tipa 5. Mereni su titri antitela prema HA u plazmi 3 nedelje posle primene virusa pomoću anti-HA IgG ELISA. Rezultati pokazuju da DS2b vektor izaziva odgovore antitela za protein HA veće od standardnog rAd vektora (rAd5). DS2b vektor sadrži rAd? koji izražava HA kao što izražava Toll-sličan receptor 3 agonist (TLR3). ukosnicu dvostrukog lanca RNA. pokazujući da upotreba kodirane dsRNA Ugandom može poboljšati adaptivni imuni odgovor na antigene od interesa. Kao što je prikazano na Slici 8A i Slici 6. izražena dsRNA može poboljšati adaptivne imune odgovore na više različitih heterolognih antigena. Netretirane životinje služe kao negativna kontrola za ELISA. Svaka grupa je sadržala 6 životinja.
|0107|Vektori u suprotnoj orijentaciji (DS2za) ispitani su za odgovore antitela praćenjem oralne ili intramuskularne primene 1.0x10 PFU virusa po životinji u 0 i 5 nedelji. Odgovori antitela na HA su mereni u 4 i 7 nedelji nakon početne primene. Kao što je prikazano na Slici 8B. suprotno orijentirani vektor može takode da indukuje značajne odgovore antitela na heterologne antigene. DSIb i DSIbza sektori indukuju slične odgovore na F1A u vremenskoj tački u 4 nedelji. Značajno, efeka! pojačavanja odgovora antitela je demonstriran sa DsIbza vektorom kojije pokazao da višestruke doze mogu biti korištene za povećanje odgovora antitela na heterologne antigene.
[0108|Drugi primer potencijala u pristupu himernog adenovirusnog vektora se pokazao kao dobar. Vektor NDL1 214 je primenjen životinjama oralno (L0xl07PFU) ili intranazalnom primenom (3xl()<<>'PFU) i odgovori antitela na heterologni antigen su mereni u 3 nedelji. Kao što je prikazano na Slici 8C. značajni od<g>ovori antitela na HA su izmereni posle oralne primene. koji su bili daleko izvan tipičnih vrednosti od pojedinačne oralne primene rAd vektora.

Claims (12)

1.Himerni adenovirusni vektor ekspresije, navedem \eklor sadrži ekspresionu kasetu koja sadrži sledece elemente: (a) prvi pokretne operativno vezan za nukleinsku kiselinu koja kodira toll-sliean receptor- 3 (TLR-3) agonist, naznačen time da je TLR-3 agonist heterologna dsRNA i naznačen time da nukleinska kiselina koja kodira TLR-3 agonist sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEK ID BR: 3, 4, 5, 8.9, 10. 11. i 12: i (b) drugi pokretač operativno vezan za nukleinsku kiselinu koja kodira imunogeni heterologni polipeptid.
2. Himerni adenovirusni ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 1. naznačen time da su prvi i drugi pokretač isti. opciono, naznačen time da su prvi pokretač i drugi pokretač svaki CMV pokretač.
3. Imunogena kompozicija sadrži ekspresioni vektor prema bilo kom od prethodno navedenih patentnih zahteva i farmaceutski prihvatljiv nosač.
4. Himerni adenovirusni vektor ekspresije, navedeni vektor sadrži ekspresionu kasetu koja sadrži siedeće elemente: (a) prvi pokretač operativno vezan za nukleinsku kiselim: koja kodiraloll-sličan receptor- 3 (TLR-3) agonist. naznačen time da je TLR-3 agonist heterologna dsRNA: i (b) drugi pokretač operativno vezan za nukleinsku kiselinu koja kodira imunogeni heterologni polipeptid za upotrebu u postupku lečenja za izazivanje imunog odgovora, pomenuti postupak se sastoji od primene imunogeno efikasne količine vektora subjektu sisara kao sto je čovek. naznačen lime da je imuni odgovor usmeren protiv heterolognog polipeptida i naznačen tune daje put primene odabran iz grupe koju čine: oralna, intranazalna. i mukozalna primenn kao što je\aginalna.
5. Vektor za upotrebu prema patentnom zahtevu 4. naznačen time da je heterologni polipeptid eksprimiran u ćeliji odabranoj iz grupe koju čine: dendritske ćelije, mikrosas ijene ćelije i inleslmalne cpitelne ćelije.
6. Vektor prema patentnom zahtevu I, naznačen time da je heterolo<g>na dsRNA kratka ukosnica RNA (shRNA).
7. Imunogena kompozicija, navedena kompozicija sadrži: (a) himerni adenovirusni vektor ekspresije sadrži pokretač koji je operativno povezan za nukleinsku kiselinu koja kodira imunogeni heterologni polipeptid: (b) TLR-3 agonist. naznačen time da je TLR-3 agonist heterologna dsRNA: i (c) farmaceutski prihvatljiv nosač: za upotrebu u postupku lečenja za izazivanje imunog odgovora, a pomenuti postupak se sastoji od primene imunogeno efikasne količine vektora subjektu sisara kao što je čovek. naznačen time da je imuni odgovor usmeren protiv helerolognog polipeptida i naznačenlime da je put primene odabran iz grupe koju čine: oralna, intranazalna. i mukozalna primena kao što je vaginalna.
8. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7. naznačenalimeda je pokretač CMV pokretač.
9. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7. naznačena time daje l'LR-3 agonist nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SLK II) BR: 3. 4. 5. Si. 9. 10, I ]. i 12;
10. Kompozicija za upotrebu prema patentnom /altte\u 7. naznačenalime da je heterologni polipeptid eksprimiran u ćeliji odabranoj iz grupe koju čine: dendritske ćelije. mikrosn\ijene ćelije, i iritestinalne epitelne ćelije.
11.Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7. naznačenalime da je heterologna dsRNA kratka ukosnica RNA (shRNA).
12. Vektor prema patentnom zahtevu I. vektor za upotrebu prema patentnom zahtevu 4. ili kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7. naznačeni time da je heterologni polipeptid: (a) HIV omotač polipeptid, kao što je polipeptid izabran iz grupe koju čine gp4 I, gp!20 i gpl60; (b) Inlluenza HA polipeptid; (c) Antigen herpes simplex virusa (HSV): ili (d) Antigen humanog papi loma virusa (HPV).
RS20160431A 2006-02-28 2007-02-28 Himerni adenovirusni vektori i dsrna kao tlr3 agonist RS54843B1 (sr)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77802606P 2006-02-28 2006-02-28
US80164506P 2006-05-19 2006-05-19
US80299206P 2006-05-22 2006-05-22
US82149206P 2006-08-04 2006-08-04
US84665806P 2006-09-22 2006-09-22
US84819506P 2006-09-28 2006-09-28
EP07752109.4A EP1996238B1 (en) 2006-02-28 2007-02-28 Chimeric Adenoviral Vectors and dsRNA as TLR3 Agonist
PCT/US2007/005386 WO2007100908A2 (en) 2006-02-28 2007-02-28 Chimeric adenoviral vectors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS54843B1 true RS54843B1 (sr) 2016-10-31

Family

ID=38459683

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20160431A RS54843B1 (sr) 2006-02-28 2007-02-28 Himerni adenovirusni vektori i dsrna kao tlr3 agonist

Country Status (23)

Country Link
US (3) US7879602B2 (sr)
EP (1) EP1996238B1 (sr)
JP (1) JP5016614B2 (sr)
KR (2) KR101273836B1 (sr)
CN (2) CN103122360A (sr)
AP (1) AP2844A (sr)
AU (1) AU2007220988B2 (sr)
BR (1) BRPI0708344B8 (sr)
CA (1) CA2638757C (sr)
DK (1) DK1996238T3 (sr)
EA (1) EA014757B1 (sr)
ES (1) ES2573456T3 (sr)
HR (1) HRP20160795T1 (sr)
HU (1) HUE030281T2 (sr)
IL (2) IL193684A (sr)
LT (1) LT1996238T (sr)
MY (1) MY154956A (sr)
NZ (1) NZ571010A (sr)
PL (1) PL1996238T3 (sr)
PT (1) PT1996238T (sr)
RS (1) RS54843B1 (sr)
SI (1) SI1996238T1 (sr)
WO (1) WO2007100908A2 (sr)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103122360A (zh) * 2006-02-28 2013-05-29 瓦克萨特公司 嵌合腺病毒载体
WO2009073133A1 (en) * 2007-11-29 2009-06-11 Vaxinnate Corporation Compositions of toll-like receptor agonists and papillomavirus antigens and uses thereof
US8501926B2 (en) * 2008-09-24 2013-08-06 The Johns Hopkins University Malaria vaccine
JP5903045B2 (ja) * 2009-07-31 2016-04-13 パックスバックス， インコーポレイテッド アデノウイルスに基づくベクター
JP2013505022A (ja) * 2009-09-16 2013-02-14 バクサート インコーポレーティッド Ｈ１ｎ１感染を予防するための免疫戦略の方法
US9198959B2 (en) * 2011-02-22 2015-12-01 Regents Of The University Of Minnesota Adenovirus vaccine vector and methods of use
US10183069B2 (en) 2011-03-21 2019-01-22 Altimmune Inc. Rapid and prolonged immunologic-therapeutic
EP2931896B1 (en) 2012-12-11 2019-01-16 Osivax SAS Modified coiled coil type proteins having improved properties
AU2014315124A1 (en) * 2013-09-06 2016-04-07 Altimmune Inc. Methods and compositions for viral vectored vaccines
DK3107568T3 (da) 2014-02-20 2024-06-03 Vaxart Inc Formuleringer til indgivelse til tyndtarmen
RS58080B1 (sr) 2014-11-04 2019-02-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Terapeutske vakcine protiv hpv16
JP6735288B2 (ja) 2015-04-14 2020-08-05 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 双方向性プロモーターを有する２つの導入遺伝子を発現する組換えアデノウイルス
EA201792512A1 (ru) 2015-06-12 2018-06-29 Вэксарт, Инк. Составы для доставки антигенов респираторного синтициального вируса и норовируса в тонкий кишечник
JP6470872B2 (ja) 2015-08-20 2019-02-13 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 治療用ｈｐｖ１８ワクチン
GB201603577D0 (en) * 2016-03-01 2016-04-13 Oxford Genetics Ltd Promoter
JP7053491B2 (ja) 2016-05-02 2022-04-12 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー 治療用ｈｐｖワクチン組み合わせ
CN109154000B (zh) 2016-05-12 2022-07-05 扬森疫苗与预防公司 有效和平衡的双向启动子
RU2745500C2 (ru) 2016-06-20 2021-03-25 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Эффективный и сбалансированный двунаправленный промотор
WO2018106945A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
US11205103B2 (en) 2016-12-09 2021-12-21 The Research Foundation for the State University Semisupervised autoencoder for sentiment analysis
US11426566B2 (en) 2016-12-14 2022-08-30 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a TLR modulator
CA3048313A1 (en) * 2017-01-06 2018-07-12 Stabilitech Biopharma Ltd Virus
US11034978B2 (en) 2017-02-09 2021-06-15 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and short promoter for expression of heterologous genes
WO2021168577A1 (en) * 2020-02-25 2021-09-02 Symvivo Corporation Gene delivery system
WO2021174024A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 First Wave Bio, Inc. Methods of treating iatrogenic autoimmune colitis
WO2022165360A2 (en) * 2021-02-01 2022-08-04 Vaxart, Inc. Chimeric adenoviral vectors
WO2021248017A2 (en) * 2020-06-05 2021-12-09 Vaxart, Inc. Chimeric adenoviral vectors
JP2023532717A (ja) 2020-07-02 2023-07-31 ヴィーブ ヘルスケア カンパニー 長期作用型抗レトロウイルス剤を用いたｈｉｖウイルス寛解の達成方法
WO2025046444A1 (en) 2023-08-25 2025-03-06 Frem Neemat G Remote-controlled alteration/induction of cellular apoptosis and methods of use
CN119925586A (zh) * 2025-01-24 2025-05-06 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 一种内置核酸佐剂的新冠病毒b.1.1.529变异株口服疫苗及其制备方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6511845B1 (en) * 1992-08-07 2003-01-28 Alan R. Davis Methods for producing an immune response against HIV-1
US5676950A (en) * 1994-10-28 1997-10-14 University Of Florida Enterically administered recombinant poxvirus vaccines
US20020155127A1 (en) 2000-06-02 2002-10-24 Danher Wang Genetic vaccine against human immunodeficiency virus
US20020182223A1 (en) * 2000-06-02 2002-12-05 Lacount Douglas J. Method of rapidly generating double-stranded RNA and methods of use thereof
EP1327688A1 (en) * 2002-01-14 2003-07-16 Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs Adenoviruses with enhanced lytic potency
EP1540004A4 (en) * 2002-07-31 2007-10-03 Nucleonics Inc DOUBLE-STRING RNA STRUCTURES AND CONSTRUCTS AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
CN1867355A (zh) * 2003-08-11 2006-11-22 财团法人阪大微生物病研究会 包含诱导粘膜免疫的佐剂的新型疫苗
GB0321615D0 (en) * 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
EP1586654A1 (en) * 2004-04-15 2005-10-19 Vereniging voor christelijk hoger onderwijs, wetenschappelijk onderzoek en patiëntenzorg Replication competent viruses capable of silencing virus inhibitory factor expression
US20060287263A1 (en) * 2004-07-18 2006-12-21 Csl Limited Methods and compositions for inducing antigen-specific immune responses
CN103122360A (zh) * 2006-02-28 2013-05-29 瓦克萨特公司 嵌合腺病毒载体

Also Published As

Publication number Publication date
CN101432291A (zh) 2009-05-13
EA014757B1 (ru) 2011-02-28
US20070269410A1 (en) 2007-11-22
KR101273836B1 (ko) 2013-06-11
MY154956A (en) 2015-08-28
US20130164326A1 (en) 2013-06-27
US20110081375A1 (en) 2011-04-07
EA200801907A1 (ru) 2009-02-27
US8222224B2 (en) 2012-07-17
IL229523A0 (en) 2013-12-31
AP2008004612A0 (en) 2008-10-31
IL229523A (en) 2016-08-31
WO2007100908A3 (en) 2008-11-27
JP5016614B2 (ja) 2012-09-05
WO2007100908A2 (en) 2007-09-07
EP1996238A4 (en) 2011-08-24
HRP20160795T1 (hr) 2016-08-12
IL193684A (en) 2013-12-31
AU2007220988A1 (en) 2007-09-07
US8999946B2 (en) 2015-04-07
EP1996238A2 (en) 2008-12-03
KR20110132637A (ko) 2011-12-08
BRPI0708344B1 (pt) 2021-05-11
BRPI0708344B8 (pt) 2021-05-25
BRPI0708344A8 (pt) 2016-05-31
DK1996238T3 (da) 2016-08-01
SI1996238T1 (sl) 2016-10-28
PT1996238T (pt) 2016-07-11
JP2009533018A (ja) 2009-09-17
US7879602B2 (en) 2011-02-01
LT1996238T (lt) 2016-09-12
CA2638757A1 (en) 2007-09-07
KR101105511B1 (ko) 2012-01-16
EP1996238B1 (en) 2016-04-06
KR20080105120A (ko) 2008-12-03
IL193684A0 (en) 2011-08-01
AU2007220988B2 (en) 2010-06-03
ES2573456T3 (es) 2016-06-08
HUE030281T2 (en) 2017-05-29
PL1996238T3 (pl) 2016-12-30
BRPI0708344A2 (pt) 2011-05-24
NZ571010A (en) 2010-11-26
CN101432291B (zh) 2013-03-20
AP2844A (en) 2014-02-28
CN103122360A (zh) 2013-05-29
CA2638757C (en) 2014-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8999946B2 (en) Chimeric adenoviral vectors
US11104916B2 (en) Compositions and methods for alphavirus vaccination
KR101790187B1 (ko) 신드비스 바이러스 외피 당단백질로 가성형태화된 렌티바이러스 벡터
KR20220143684A (ko) 신종 코로나바이러스 감염에 대한 mRNA 백신의 조성물 및 방법
JP2010138201A (ja) 核酸粘膜免疫
KR20150118131A (ko) 안정화된 사람 면역결핍 바이러스 (ｈｉｖ) 외피 (ｅｎｖ) 삼량체 백신 및 이의 사용 방법
KR20200037818A (ko) 이종성 repRNA 면역접종을 위한 방법 및 조성물
Ljungberg et al. Increased immunogenicity of a DNA-launched Venezuelan equine encephalitis virus-based replicon DNA vaccine
WO2021242793A2 (en) Nucleic acid artificial mini-proteome libraries
Rice et al. Heterologous saRNA prime, DNA dual-antigen boost SARS-CoV-2 vaccination elicits robust cellular immunogenicity and cross-variant neutralizing antibodies
JP7607749B2 (ja) 新規コロナウイルス組換えスパイクタンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、およびベクターを含む、コロナウイルス感染を予防または処置するためのワクチン
KR20240031420A (ko) Rsv 및 노로바이러스 항원들의 소장 내의 전달을 위한 제형들
Choi et al. Bolstering components of the immune response compromised by prior exposure to adenovirus: guided formulation development for a nasal Ebola vaccine
KR20240023600A (ko) 바이러스 질환을 위한 온도-제어가능한, 자기-복제 rna 백신
WO2025240698A1 (en) Improved adenoviral vectors for antigen delivery
RU2618918C2 (ru) Универсальная противогриппозная вакцина
JP2024537847A (ja) ＣＯＶＩＤ１９ ｍＲＮＡワクチン
ES2358887T3 (es) Inmunización de las mucosas con ácido nucleico.
HK1099046B (en) Chimeric type 5/type 11 or type 5/type 35 adenovirus vector for preventing infection with antihuman immunodeficiency virus