BRPI0708354A2 - antìgeno vacinal quimérico contra o virús da peste suìna clássica e composição de vacina capaz de produzir uma resposta imune protetora contra o vìrus da peste suìna clássica - Google Patents

Abstract

ANTìGENO VACINAL QUIMERICO CONTRA O VìRUS DA PESTE SUìNA CLáSSICA E COMPOSIçãO DE VACINA CAPAZ DE PRODUZIR UMA RESPOSTA IMUNE PROTETORA CONTRA O VìRUS DA PESTE SUINA CLáSSICA A presente invenção descreve antígenos vacinais quiméricos contra o vírus que causa a doença da peste suma clássica (VPPC). Os referidos antígenos vacinais estão baseados em subunidades virais que estão acopladas a moléculas protéicas estimuladoras do sistema imune, tanto celular como humoral. Os antígenos quiméricos podem ser produzidos em sistemas de expressão que garantem um correto dobramento tridimensional das moléculas quiméricas que constituem a base da presente invenção. As composições vacinais que contêm os referidos antígenos quiméricos induzem uma resposta imune potente e temporã nos porcos vacinados, conferindo-lhes uma proteção total contra o VPPC. Além disso, as composições vacinais resultantes previnem a transmissão viral das mães a sua descendência. Os antígenos quiméricos, bem como as composições vacinais resultantes são aplicáveis à esfera da saúde animal, como vacinas para uso preventivo em suínos.

Description

"ANTÍGENO VACINAL QUIMÉRICO CONTRA O VÍRUS DA PESTESUÍNA CLÁSSICA E COMPOSIÇÃO DE VACINA CAPAZ DEPRODUZIR UMA RESPOSTA IMUNE PROTETORA CONTRA O VÍRUSDA PESTE SUÍNA CLÁSSICA"

Campo da técnica

A presente invenção se refere ao campo da saúde animal,particularmente com novos antígenos quiméricos que compreendemsubunidades virais do vírus que causa a doença da Peste Suína Clássica(VPPC) acoplados à moléculas protéicas estimuladoras do sistema imunecelular e humoral, e desenvolvem nos porcos uma resposta imune potente erápida contra o referido vírus.

Estado da técnica Anterior

A Peste Suína Clássica (PPC), também conhecida como cólerasuína por seu caráter altamente infeccioso e sua ampla distribuição mundial, éconsiderada a doença mais importante do porco, daí sua inclusão na lista dedoenças notificáveis da Organização Internacional de Saúde Animal. O agenteetiológico desta doença, o VPPC, é um vírus do gênero Pestivirus da famíliaFlaviviridae. Sabe-se que é um vírus envolto, de um diâmetro de 40 a 60 nm,e simetria hexagonal, com ácido ribonucléico (RNA) de simples cadeia comomaterial genético (Kümmerer et al. (2000) The genetic basis forcytopathogenicity of pestiviruses. Vet. Microbiol. 77:117-128; Moennig et al.(2003) Clinicai signs and epidemiology of classical swine fever: a review ofnew knowledge. Vet. Journal 165:11-20.)

A PPC é uma doença altamente contagiosa, em sua formaaguda se apresenta com febre, degeneração dos vasos capilares, necrose dosórgãos internos e morte. Os primeiros signos clínicos aparecem depois de umperíodo de incubação de 2 a 6 dias, produzindo-se inicialmente febre, reduçãodos movimentos e diminuição do apetite, que vão se agravando nos diasseguintes e a temperatura pode atingir os 42°C. Desenvolve-se, além disso,uma leucopenia com valores da série branca menores de 8000/mm3 de sangue.Os porcos desenvolvem também conjuntivites, constipação seguida pordiarréias, vômitos, descoordenação de movimentos, convulsões e paresiasmusculares na fase terminal. Evidencia-se uma coloração vermelha da peleestendida em todo o abdômen, focinho, orelhas, e parte interna das patas. Namaioria dos casos fatais a histopatologia do cérebro mostra uma encefalitenão supurativa com abundante vascularização. (Moennig et al. (2002) Clinicaisings and epidemiology of classical swine fever: A review of newKnowledge. Vet Journal 161:1-10).

O VPPC se comporta como um imunossupressor durante ainfecção (Susa et al. (1992) Pathogenesis of classical swine fever: B-lymphocyte deficiency caused by hog cholera virus. J. Virol. 66:1171-1175) ecomeça-se a detectar os anticorpos neutralizantes nas semanas 2 e 3, depoisda infecção (Laevens et al. (1998) An experimental infection with a classicalswine fever virus in weaner pigs. II. The use of serological data to estimatethe day of virus introduction in natural outbreaks. Vet Q. 20: 46-49). O estadoterminal da infecção está associado com uma marcada diminuição delinfócitos B no sistema circulatório, assim como em tecidos linfóides (Susa etal. (1992) Pathogenesis of classical swine fever: B-Iymphocyte deficiencycaused by hog cholera virus. J. Virol. 66:1171-1175). A maioria dos porcosdoentes morrem entre 10 e 20 dias posteriores à infecção, com umamortalidade superior a 95%. As lesões pós mortem características da PPCcorrespondem à diátese hemorrágica com petéquias na maioria dos sistemasde órgãos. Estas são mais constantes nos rins, bexiga urinária e gânglioslinfáticos, embora também possam aparecer no baço, laringe, pele, mucosas eserosas (Mouwen et al. (1983) Atlas of Veterinary Pathology. Bunge, Utrecht,Países Baixos).

Outra forma clínica de apresentação da doença é a infecçãotransplacentária, na qual o vírus é capaz de atravessar a placenta das porcasgestantes e infectar o feto. As conseqüências desta infecção podem serabortos, crias mortas ao nascer, mumifícacões, malformações, nascimento deporcos débeis e afecções na diferenciação de órgãos. Das porcas reprodutoras,em dependência do tempo de gestação em que ocorre a infecção, podemnascer crias imunotolerantes ao vírus, pois pode ocorrer uma infecção atravésda mãe (transmissão vertical). As crias permanecem infectadas e virêmicasaté sua morte, o que gera um foco estável de disseminação do vírus napopulação (Moennig et al. (2003) Clinicai signs and epidemiology of classicalswine fever: a review of new knowledge. Vet. Journal 165:11-20). Amortalidade associada à PPC constitui um problema econômico para os paísesafetados, influindo na deterioração da situação econômica e social das naçõesem via de desenvolvimento. Por estas razões em países com uma altadensidade suína e uma elevada prevalência do vírus, faz-se imprescindívelaplicar programas de controle baseados na vacinação. Em paísesdesenvolvidos cuja produção suína é majoritariamente subsidiada pelo estado,como Europa, Estados Unidos e Canadá, aplica-se o método de erradicaçãopor sacrifício. No entanto, os custos são muito elevados e estes países sãosusceptíveis ainda a possíveis re-emergências.

A União Européia (UE) é considerada como uma zona de altorisco de re-emergência da doença devido à alta densidade da população suína,à política de não vacinação e a sua proximidade geográfica com os países deEuropa do Leste, onde a doença é enzoótica. Um dos problemas que seassociaram à re-emergência da doença nesta região, é a presença de porcosselvagens com infecções endêmicas de PPC (Laddomada (2000) Incidenceand control of CSF in wild boar in Europe. Vet. Microbiol, 73:121-30). Estasre-emergências ocorreram apesar dos sólidos programas de controle queforam implementadas dentro da UE, que incluem o sacrifício sanitário de todaa população contagiada e a restrição do comércio de porcos de áreas afetadasa zonas livres da doença (vão Oirschot (2003) Vaccinology of classical swinefever: from Iab to field. Vet. Microbiol, 96:367-384). Urge, por tanto, anecessidade de desenvolver vacinas que induzam uma resposta imune rápida esegura que garanta a proteção ante a infecção e a transmissão viral.

Desenvolveram-se vacinas contra o VPPC baseadas em víruscompleto: vacinas com vírus inativo com cristal violeta ou formalina (Birontet al. (1988) Classical swine fever and related infections. Liess Β. M. Edit.Martinus Nijhoff Publishing, Boston: 181- 200), vacinas com vírus atenuadosmediante passes em coelho como a cepa Sinlak (Baibikov et al. RU 2182495)e a cepa chinesa Lapinizada (Dahle et al. (1995) Assesment of safety andprotective avaliei of a cell culture modified strain C vaccine of hogcholera/classical swine fever virus. Berl- Munch. Tierarztl. Wsch., 108: 20 -25), ou vacinas com vírus atenuados em cultivos celulares de coelho,porquinho-da-índia e porco (Kachiku et al. JP 73001484; Terpstra et al.(1990) Development and properties of a cell culture produced vaccine for hogcholera based on the Chinese strain. Ditsh. tierarztl. Wsch. 97: 77-79). Estestipos de vacinas constituem um risco pela possibilidade de conter frações devírus ativo que, inoculadas em animais susceptíveis, produziriam novos surtosde PPC. Além disso, são necessárias repetidas imunizações para conseguir aresposta imunológica protetora porque a inativação altera as propriedadesimunogênicas do vírus.

No caso específico das vacinas vivas com virulência atenuadatêm, potencialmente, o risco de que ocorra uma atenuação parcial ou de queocorra uma reversão à virulência, em qualquer destes casos se produzirãopartículas virais patogênicas que, inoculadas em animais susceptíveis,provocam a infecção, a doença clínica e a disseminação da doença nosrebanhos. Isto acarreta um risco maior para as porcas gestantes pois o víruspode passar para os fetos, que são altamente susceptíveis e as crias infectadasdisseminam a doença.

Existem vacinas baseadas em cepas de VPPC quedemonstraram estar atenuadas como são a cepa chinesa C, a cepa PAV 250, acepa Thiverval e a cepa IFFA/A-49 (Bjorlund. H.JV. et al. (1998) Molecularcharacterization of the 3'noncoding of classical swine fever vírus vaccinestrains. Virus Genes 16: 307-312; Launais et al. (1978) Hog Cholera Viras:Active immunization of piglets with the Thiverval strain in the presence andabsence of calostral passive immunity. Vet. Microbiology 3: 31-43). Estascepas somente são usadas em países onde a doença é enzoótica, porque têmcomo inconveniente não permitirem diferenciar os animais vacinados dosinfectados com o vírus nativo. Os animais vacinados com estas cepasproduzem respostas idênticas, nas provas sorológicas, que os animaisenfermos. Os anticorpos específicos anti-VPPC que são gerados com asvacinas baseadas em vírus atenuados interferem com o diagnóstico deinfecção da PPC. O diagnóstico é realizado mediante imunodetecção do vírusinfectivo nas amídalas e a cepa viral vacinai se multiplica precisamente nasamídalas. Por estas causas, as cepas atenuadas não são idôneas para seremutilizadas nos programas de erradicação. Outro exemplo é a vacinação com acepa LK-VNIIWM e hiperimunização adicional com a cepa purificada Shi-Myng, formulada com adjuvante de Freund, em 40-45 lugares é impraticávelem uma campanha de vacinação onde se devem vacinar centenas de animaisdiariamente (Balashova et al. RU2183972).

A imunização com estas vacinas, que contêm o víruscompleto, interfere também com o diagnóstico diferencial entre infecçõescausadas pelo VPPC e as causadas por outros integrantes do gênero Pestivirusque podem infectar o porco, como são os vírus da diarréia viral bovina (eminglês "Bovine Virus Diarrhoea Vírus", abreviado BVDV) e o vírus dadoença da fronteira (em inglês "Border Diseases Viras", abreviado BDV),(Dahle et al. (1991) Clinicai Post mortem and virological findings aftersimultaneous inoculation of pigs with hog cholera and BVD viras. J. Med.Vet. 38: 764- 772).Para evadir os inconvenientes das vacinas baseadas em víruscompletos resulta idôneo utilizar vacinas totalmente inócuas, como asvariantes baseadas em subunidades, ou em proteínas virais obtidas por viarecombinante. Estas variantes devem proteger os rebanhos da reintrodução decepas virulentas, e, além disso, permitir a diferenciação entre os animaisvacinados e os infectados, por métodos sorológicos simples. Neste sentidodesenvolveu-se vacinas baseadas em subunidades virais. As vacinas quecontêm somente uma proteína do vírus, como a glicoproteína E2 doenvoltório viral (Bouma et al. (2000) Duration of the onset of the herdimmunity induced by the e2 subunit vaccine against classical swine fevervirus. Vaccine 18:1374-1381), são seguras, pois seu emprego não implicarisco algum de reversão à virulência e não interferem com o diagnóstico.Estas permitem diferenciar entre animais infectados e vacinados, pois osanticorpos que são gerados são reativos somente contra um segmento viral.Por isso, resultam idôneas para um programa de erradicação da PPC.

Desenvolveu-se vacinas recombinantes que expressam aproteína E2 em procariontes e vacinas baseadas em peptídeos sintéticos dareferida proteína (Chen et al. WO 200232453). Nestes casos a proteína não églicosilada, por isso afeta sua imunogenicidade e capacidade protetora. Outroscandidatos vacinais utilizam vetores virais para a expressão do geneheterólogo da E2 em células eucariotas como são os vírus da pseudorabiasuína (Peeters et al. (1997). Biologycally safe, non-transmissible pseudorabiesvirus vetor vaccine protects pigs against both Aujeszky's disease and classicalswine fever. J. Gene. Virol. 78: 3311-3315), o vírus da varíola suína (Gibbs etal. US6217882) e o adenovírus suíno (Nagy et al. W0200183737). Nestescasos, os anticorpos gerados por infecções naturais contra vírus da mesmaespécie que os vetores virais neutralizam a infecção com o vetor e portantoafetam a indução de resposta imune contra o VPPC. Além disso, os vetoresbaseados no vírus da pseudorabia suína e o da varíola suína não podem seraplicados nos países declarados livres destes vírus, por problemasregulatórios. Também foi usado o vírus vaccinia como vetor mas asregulações da Organização Mundial da Saúde impedem seu uso (Meyers et al.EP 1087014).

As vacinas baseadas em ácido desoxirribonucléico (DNA) nupara a expressão da proteína E2 nos miócitos e osteócitos têm o inconvenientede requererem altas concentrações de DNA para induzir a uma resposta, poisa transfecção com DNA nu é muito ineficiente. Este tipo de vacina está sujeitaa fortes controles regulatórios que dificultam sua aplicação de forma expedita(Audonnet et al. WO 200152888).

O uso do sistema de expressão em células de inseto, mediadopor Baculovirus, para a produção da E2 como vacina resultou uma alternativaviável (Van-Rijn et al. (1999). An experimental marker vaccine andaccompanying serological diagnostic teste both based on envelopedglycoprotein E2 of classical swine fever virus. Vaccine, 17: 433-440;Kretzdom et al. US 20040028701). Neste sistema a proteína recombinante seexpressa em sua forma glicosilada, o que incrementa sua imunogenicidade emrelação às variantes aglicosiladas. Não se produzem anticorpos contra obaculovirus, pois este se inativa e não resulta patogênico para o porco. Noentanto, a resposta efetiva frente à infecção é induzida depois de três semanaspós-vacinação e não há uma proteção completa frente à infecção intrauterina.

Portanto, um importante problema na prevenção da PPC é quenão existem até a data vacinas por subunidades que, ao mesmo tempo em quepermitam um diagnóstico diferencial entre os animais vacinados e osinfectados, sejam capazes de produzir uma proteção rápida depois davacinação, e que eliminem a transmissão trasplacentária de gestantes para suadescendência.

Explicação da invenção

A presente invenção resolve o problema anteriormentemencionado, proporcionando antígenos quiméricos de interesse vacinai quecompreendem subunidades virais acopladas a moléculas estimuladoras dosistema imune, o que propicia o desenvolvimento de uma resposta rápida queprotege os porcos da infecção pelo VPPC. Outra vantagem da soluçãoproposta é que elimina a transmissão do vírus das porcas gestantes quecontraem a PPC para suas crias, devido ao efeito imunopotenciador dasmoléculas que são encontradas fazendo parte dos antígenos quiméricos, juntoaos antígenos virais.

Particularmente, a invenção se refere a antígenos quiméricoscontra a PPC que têm como base a proteína E2 do envoltório do VPPC.Utiliza-se como imunogênio o segmento extracelular da glicoproteína E2, àque se encontra unida a uma proteína estimuladora do sistema imune(chamado no contexto desta invenção "adjuvante molecular") para favorecer aestimulação de uma resposta imune celular rápida, assim como altos títulos deanticorpos neutralizantes contra o VPPC.

Em uma realização particular da invenção, a proteínaestimuladora do sistema imune é o interferón alfa ou o segmento extracelularda molécula CD154. Em uma realização preferida, o interferón alfa ou osegmento extracelular da molécula CD 154 podem provir de qualquermamífero.

Os antígenos vacinais da presente invenção, baseados emproteínas quiméricas, garantem uma proteção nos porcos vacinados a partir daprimeira semana posterior à vacinação, quando são enfrentados a uma ameaçacom 10^5 DL50 (Dose de vírus que causa a morte do 50% dos animaisinfectados pelo VPPC). A referida proteção está mediada por uma forteresposta imune de tipo celular contra o VPPC, que se encontra diretamenterelacionada com a combinação dos elementos que conformam o antígenoquimérico. Também se observa um encurtamento no tempo o que induz osanticorpos neutralizantes, os que aparecem a partir da segunda semanaposterior à vacinação. Isto contribui para incrementar a proteção contra oVPPC nos porcos vacinados. Os animais vacinados não apresentamevidências da doença clínica, nem se pôde isolar VPPC dos fluidos corporaisem nenhum dos dias posteriores à confrontação com o referido vírus.

Os antígenos quiméricos E2-adjuvante molecular permitemdeter a transmissão vertical do VPPC das mães para os fetos. Estas proteínasinduzem uma proteção rápida em porcas gestantes, que impede odesenvolvimento da doença clínica e não permite a multiplicação viral, tantonas mães quanto nos fetos, depois de uma ameaça com IO5 DL50 do VPPC.

Em uma realização preferida, o antígeno vacinai quimérico secaracteriza por conter essencialmente a seqüência aminoacídica do segmentoextracelular da glicoproteína E2 do VPPC, que aparece na Listagem deSeqüências como Identificação de Seqüência (Id. Sec.) No. 1; e o segmentoextracelular de molécula CD154 de porco identificado na Listagem deSeqüências como Id Sec. No. 2. O antígeno vacinai quimérico compreendeessencialmente as referidas seqüências aminoacídicas, mas pode compreendero segmento extracelular da E2 de qualquer isolamento do VPPC.

Outro aspecto da presente invenção é que os antígenosvacinais quiméricos podem ser obtidos por via recombinante, sintética oumediante a conjugação química. Em uma realização particular da invenção,gerou-se uma variante baseada em uma proteína quimérica contendo a E2his(segmento extracelular da E2 fiisionado a uma fila de seis histidinas) e umadjuvante molecular, como proteína de fusão. Para isso, adicionou-se noextremo C-terminal da E2his um peptídeo espaçador composto por quatrounidades repetidas de Gly4Ser (4G4S) e uma molécula estimuladora dosistema imune. A incorporação do peptídeo 4G4S tem a função de trazer umdeterminado grau de relaxamento à cadeia polipeptídica. Isto garante ocorreto dobramento tridimensional da estrutura protéica para obter asproteínas fiisionadas com uma conformação tridimensional, similar à nativa.Um dos antígenos vacinais objeto desta invenção possui fusionado em seuextremo C-terminal o domínio extracelular da molécula CDl 54 suína, comoadjuvante molecular (E2his-CD154).

Até o presente momento, não se tinham explorado os sistemasde expressão em animais como biorreatores para a produção de candidatosvacinais recombinantes contra o VPPC. No entanto, a capacidade da glândulamamária para expressar proteínas recombinantes glicosiladas e com umcorreto dobramento de sua estrutura tridimensional, constitui um sistema deexpressão adequado para produzir a glicoproteína E2 com uma elevadaimunogenicidade e capacidade protetora. O sistema de expressão transientena glândula mamária de ruminantes, mediado por vetores adenovirais,constitui uma ferramenta para obter altos níveis de expressão de proteínasrecombinantes de forma rápida e simples (Toledo et al., WO 2004/034780).Este método resulta muito útil para a produção de E2 recombinante com o fimde aplicar programas de vacinação dirigidos à erradicação da PPC.

Em uma materialização da invenção, os antígenos vacinaisobjeto desta invenção são expressos nas células epiteliais mamárias demamíferos geneticamente modificados, durante o processo de lactação e sãosecretados no leite. As moléculas quiméricas recombinantes são produzidasno leite de mamíferos transgênicos ou mediante a transformação direta doepitélio glandular mamário, de mamíferos não transgênicos, com o empregode vetores adenovirais. Em outra materialização da invenção os antígenosvacinais quiméricos são produzidos em fermentos modificadosgeneticamente. Os referidos antígenos são obtidos no meio de cultivo dosfermentos transformados com os genes quiméricos e seqüências reguladorasque permitem a expressão e secreção das proteínas recombinantes por meiode cultivo.

A proteína E2 do VPPC nativa é disposta formandohomodímeros no envoltório viral, estabilizados por pontes dissulfetocatenarias. Isto determina que os anticorpos neutralizantes e protetores sãogerados contra epítopos conformacionais presentes no homodímero. Osantígenos vacinais desenvolvidos durante a presente invenção são produzidosem sistemas de expressão que permitem o correto dobramento destasproteínas recombinantes. O desenho das construções genéticas garante quenão se altere a conformação tridimensional das proteínas de fusão. Osantígenos vacinais recombinantes descritos são facilmente purificadosmediante um simples passo cromatográfico de afinidade com íons metálicos.

O desenho das construções genéticas, a utilização de sistemasde expressão adequados e a relativa simplicidade do procedimento depurificação utilizado, fazem com que os antígenos vacinais contra o VPPC,descritos na presente invenção, conservem as propriedades antigênicas eimunogênicas similares à proteína E2 viral. A imunização com as moléculasquiméricas, produzidas em sistemas de expressão como Pichia pastoris ou aglândula mamária de cabra, conduz a uma reposta imune potente e rápida. Osegmento extracelular da E2 forma homodímeros que contribuem os epítoposconformacionais para a geração de anticorpos neutralizantes e protetores. Osegmento proveniente de CDl 54 atua como adjuvante molecular que estimulao sistema imune dos porcos vacinados, produzindo uma resposta imunecelular que protege os animais do VPPC a partir da primeira semana posteriorà vacinação. A combinação de ambas moléculas na proteína quimérica, quecontém um peptídeo espaçador, garante o correto dobramento de cadamolécula de forma independente. Os sistemas de expressão utilizadospermitem que as proteínas recombinantes se expressem em sua formaglicosilada, o que favorece também a obtenção das moléculas com a estruturatridimensional adequada.

Outro aspecto da presente invenção são as composiçõesvacinais capazes de produzir uma resposta imune protetora contra o VPPC,que se caracterizam por compreender os antígenos quiméricos anteriormentedescritos e que contêm o segmento extracelular da E2 e um adjuvantemolecular. As referidas composições vacinais podem ser administradas aosanimais por rota sistêmica ou mucosal, com o objetivo de prevenir a PPC, eevitar assim as quantas perdas materiais e econômicas que ocorrem depois dainfecção da massa suína com o VPPC.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1. Análise mediante SDS-PAGE da expressão da E2hisem células PK-15 transduzidas com o vetor adenoviral Ad-E2his-sec emcondições redutoras. (A) SDS-PAGE, Raia 1: meio de cultivo de célulastransdúcidas, Raia 2: meio de cultivo de células não tratadas, PPM: padrão depeso molecular. (B) imuno-identificação da E2his mediante "Western-blotting" utilizando um anticorpo monoclonal dirigido contra a fila de His,Raia 1: meio de cultivo de células transdúcidas, Raia 2: meio de cultivo decélulas não tratadas, Raia 3: controle positivo para a fila de histidina, PPM:padrão de importância molecular. (C) imuno-identificação da E2his mediante"Western-blotting" utilizando um soro policlonal de porcos infectados com oVPPC, Raia 1: meio de cultivo de células não tratadas, Raia 2: meio decultivo de células transdúcidas com o Ad-E2his, PPM: padrão de importânciamolecular.

Figura 2. Análise das condições de expressão da E2his e aE2his-CD154 em células PK-15 transdúcidas com os vetores adenovirais Ad-E2his-sec e Ad-E2hisCD154-sec. As proteínas presentes no meio de cultivose separaram mediante SDS-PAGE em condições não redutoras. A imuno-identificação das moléculas de interesse foi realizada mediante "Western-blotting" utilizando um anticorpo monoclonal contra a proteína E2 do VPPC(AcM-lG6). Raia 1: meio de cultivo de células transdúcidas com o vetor Ad-E2his-sec, Raia 2: meio de cultivo de células transdúcidas com o vetor Ad-E2hisCD154-sec, PPM: padrão de importância molecular.

Figura 3. Cinética de expressão da E2his no leite de cabrastransdúcidas com o vetor Ad-E2his-sec. As proteínas presentes nas amostrasde soro de leite correspondentes a cada dia de ordenha são separadas medianteSDS-PAGE em condições não redutoras. A imuno-identificação da E2his foirealizada mediante "Western-blotting" com o AcM-1G6. Carril PK: controlepositivo de E2his expressa no meio de cultivo de células PK-15 transdúcidascom o vetor Ad-E2his-sec, Raia C-: soro de leite proveniente de cabras nãotratadas, Raias 1-8: soros de leite das cabras transduzida com o vetoradenoviral Ad-E2his-sec, correspondentes a cada um dos 8 dias de ordenhaposteriores à infusão adenoviral.

Figura 4. Cinética de expressão da E2his-CD154 no leite decabras transdúcidas com o vetor Ad-E2hisCD154-sec. As proteínas presentesnas mostras de soro de leite correspondentes a cada dia de ordenha sãoseparadas mediante SDS-PAGE em condições não redutoras. A imuno-identificação da molécula de E2his-CD154 foi realizada mediante "Western-blotting" com o AcM-1G6. Raias 1-5: soros de leite das cabras transduzidascom o vetor adenoviral Ad- E2hisCD154-sec, correspondentes a cada um dos5 dias de ordenha posteriores à infusão adenoviral, Raia C-: soro de leiteproveniente de cabras não tratadas, Raia PK: controle positivo de E2his-CD154 expressa no meio de cultivo de células PK-15 transdúcidas com ovetor Ad-E2hisCD154-sec.

Figura 5. Análise da pureza e identidade da E2his separadaem SDS-PAGE em condições não redutoras. A proteína foi expressa no leitede cabras transdúcidas com o vetor Ad-E2his-sec e a purificação foi realizadamediante cromatografía de afinidade com íons metálicos. (A) SDS-PAGE dosdiferentes passos de purificação. (B) imuno-identificação mediante "Western-blotting" com o AcM- 1G6. Raia 1: controle positivo de E2his expresso nomeio de cultivo de células PK-15 transdúcidas com o vetor Ad-E2his-sec,Raia 2: soro de leite proveniente de cabras não tratadas, Raia 3: soro de leitedas cabras transduzidas com o vetor adenoviral Ad-E2his-sec tomado comomaterial inicial da cromatografía, Raia 4: material não unido à matriz, Raia 5:lavagem com 20 mM de imidazol, Raia 6: lavagem com 50 mM de imidazol,Raia 7: eluição a 200 mM de imidazol.

Figura 6. Comparação do reconhecimento antigênico de duasisoformas do antígeno vacinai E2his pelos anticorpos presentes no soro deporcos infectados com uma cepa virulenta do VPPC. A E2his purificada apartir do leite de cabras, transformadas com o vetor adenoviral Ad-E2his-sec,foi analisada mediante eletroforese e "Western-blotting" em condiçõesredutoras (monômero) e condições não redutoras (homodímero). (A) SDS-PAGE. (B) "Western-blotting" utilizando um soro policlonal de porcosenfermos, Raia 1: E2his separada em condições não redutoras, Raia 2: E2hisseparada em condições redutoras.

Figura 7. Cinética de anticorpos neutralizantes obtidos emdois grupos de porcos vacinados com uma única dose do antígeno vacinaiE2his, os títulos de anticorpos foram determinados mediante um ensaio deneutralização da peroxidase. O grupo A foi inoculado com uma dose de 30μg/animal e o grupo B com uma dose de 50 ^diàvcml. Ambos grupos foramatacados com IO5 DL50 três semanas depois da vacinação. Os resultadosforam mostrados como a média geométrica do inverso dos títulos.

Figura 8. Ensaio de linfoproliferação de linfócitos de porcoisolados no dia 5 posterior à vacinação com os antígenos E2-CD154 (GruposD e E) e E2his (Grupo F). Os resultados foram expressos em índices deestimulação (IE), definido como a relação entre os valores de contagens porminuto (cpm) do cultivo estimulado e os valores de cpm do cultivo controlenão tratado. A resposta linfoproliferativa que induziu um IE > 2 foiconsiderada como positiva. Avaliou-se a proliferação nos diferentes cultivostratados com o VPPC, assim como a inibição da proliferação nos cultivostratados com o VPPC e um AcM contra o domínio CD4 suíno.

Figura 9. Ensaio de atividade antiviral induzida pelos sorosdos porcos vacinados com os antígenos E2-CD154 (Grupos D e E) e E2his(Grupo F), em células PK-15. Os resultados foram expressos como a mediageométrica do inverso do título.

Figura 10. Cinética de anticorpos neutralizantes obtidos emdois grupos de porcos vacinados com uma dose de 50 μg/animal com osantígenos E2-CD154 (Grupo H) e E2his (Grupo I), os títulos de anticorposforam determinados mediante um ensaio de neutralização da peroxidase. Osresultados foram mostrados como a média geométrica do inverso dos títulos.

Exposição detalhada de modos de realização / Exemplos

Exemplo 1: Obtenção dos segmentos genéticos que codificam para osdomínios extracelulares da E2 do VPPC e do CD154 suíno, e clonagem doplasmídeo pMOS- E2his-CD154.

O segmento do gene que codifica para a porção extracelular daE2, de 363 aminoácidos foi obtido mediante amplificação por transcriçãoreversa e reação em cadeia da polimerase (TR-RCP), a partir do genoma viraldo isolamento cubano "Margarida" do VPPC anotados na base de dados doCentro Nacional de Informação em Biotecnologia dos Estados Unidos (eminglês "National Center for Biotechnology Information", abreviado NCBI),número de acesso AJ704817. No oligo 3', incluiu-se a seqüência codificantepara uma fila de 6 histidinas, para permitir a fácil purificação do antígeno.

A seqüência nucleotídica codificante para o domínioextracelular do CD154 suíno, de 210 aminoácidos foi obtida mediante síntesequímica tomando como padrão de seqüência o gene do CDl 54 de porco iiSUSscrofcT anotados na base de dados do NCBI (AB040443). No extremo 5' dofragmento codificante para a referida molécula foi incluído em uma regiãoque codifica para um peptídeo composto por quatro unidades repetidas deGly-Gly-Gly-Gly-Ser (4G4S). Mediante uma subclonagem no plasmídeopMOS-BLUE (Amersham, EEUU) inseriu-se a seqüência sintetizada (4G4S-CDl 54) imediatamente depois da fila de 6 histidinas na seqüência codificanteda E2his. Obteve-se o plasmídeo pMOS- E2his-CD154.

Exemplo 2: Construção das variantes de E2his e E2his-CD154 secretáveispara células de mamíferos.

A seqüência correspondente à E2his obtida por TR-RCP foiinserida nos lugares BgI Il - EcoR V do plasmídeo pAEC-SPT (Herrera et al.(2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 279:548-551). Obteve-se o vetorresultante PE2his-sec que contém a seqüência codificante para a E2hisprecedida pelo sinal de secreção do ativador tissular do plasminogêniohumano (em inglês, "human tissue Plasminogen Activator", abreviado htPA)e sob o controle transcripcional do promotor imediato rápido docitomegalovírus humano (PCMV).

A seqüência correspondente à E2his-CD154, subclonada novetor pMOS-BLUE, foi inserida nos lugares sensíveis a corte com asendonucleases de restrição BgI W-Sal I do plasmídeo pAEC-SPT. Obteve-seo vetor resultante PE2hisCD154- sec que contém a seqüência codificante paraa E2his-CD154 precedida pelo sinal de secreção do htPA e sob o controletranscripcional do promotor PCMV.

Exemplo 3: Construção dos vetores adenovirais recombinantes, contendoas seqüências codificantes para a E2his e a E2his-CD154 secretáveis.

Os vetores adenovirais com replicação defectiva (Ad-ΔΕΙ,ΔΕ3) foram construídos baseados no sistema AdEasy (AdEasy™-VectorSystem, Quantum Biotechnologies, EEUU). Como vetor de transferênciaempregou-se o plasmídeo pAdTrack-CMV.

A seqüência codificante para a E2his, com o sinal de secreçãodo htPA (E2his- sec), foi extraída do plasmídeo PE2his-sec mediante digestãoenzimática com as endonucleases de restrição Nco I-EcoR V e se inseriu nolugar sensível a corte com a endonuclease de restrição EeoR V presente novetor de transferência adenoviral pAdTrack. Obteve-se o plasmídeo pAdT-E2his-sec onde a variante secretável da E2his se encontra sob o controletranscripcional do promotor PCMV.

A seqüência codificante para a E2his-CD154 secretável foiextraída do plasmídeo PE2his-CD154-sec mediante digestão enzimática comas endonucleases de restrição Neo I e Sal I e se inseriu nos lugares sensíveis acorte com as endonucleases de restrição Kpn I -Xho I do vetor pAdTrack.Obteve-se o plasmídeo recombinante pAdT-E2hlsCD154-sec onde a variantesecretável da E2his-CD154 se encontra sob o controle transcripcional dopromotor PCMV.

Para gerar os genomas adenovirais recombinantes linealizou-se os vetores de transferência adenoviral pAdT-E2his-sec e ρ AdT-E2hisCD154-sec mediante digestão enzimática com a endonuclease derestrição Pme I. Cada um dos vetores lineares em separado foi co-eletroporado com o vetor pAdEASY-1 na cepa de Escherichia eoli BJ5183.Por recombinação de homólogos obtive-se os genomas recombinantes dosdois vetores adenovirais recombinantes pAd-E2his-sec e o pAd-E2hisCD154-sec contendo um a seqüência codificante para a E2his-sec e o outro aseqüência codificante para a molécula de E2his-CD154-sec, em ambos casossob o controle do PCMV. Os genomas adenovirais recombinantes foramentão digeridos com a endonuclease Pae I e transfectados em separado nalinha celular complementar HEK-293A onde foram obtidos os vírionsinfectivos. Geraram-se 2 vetores virais: Ad-E2his-sec e Ad-E2hisCD154-sec.

Os vetores foram amplificados de forma independente na linha celular HEK-293A, até obter títulos de 1x1012 unidades formadoras de colônias (UFC)/ml.Os vírions amplificados foram purificados mediante uma dupla centrifugaçãoem gradiente de CsCI, foram dialisados contra buffer de armazenamento (10mM Tris pH 8.0, 2 mM MgCl2, 4% sacarose) e se conservaram a -70°C.

A capacidade dos vetores adenovirais Ad-E2his-sec e Ad-E2hisCD154-sec para transformar células de mamíferos e mediar a expressãoe secreção das moléculas de E2his e E2his-CD154 por meio de cultivo foicorroborada mediante a infecção da linha celular suína PK15 com os vetoresadenovirais. As mostras de proteínas presentes no meio de cultivo das célulasinfectadas foram separadas mediante eletroforeses em gel desnaturalizante depoliacrilamida (em inglês "Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gellectrophoresis", abreviado SDS-PAGE) em condições não redutoras e foramanalisadas mediante "Western-blotting" com um anticorpo monoclonal contraa E2 do VPPC (aE2-lG6) (Fig. 1 e 2). Ao analisar os tamanhos molecularesda E2his e E2his-CD154 comprovou-se que se correspondiam com isoformasdiméricas e triméricas das proteínas. Na mostra da Raia 1, Figura 2,observam-se as duas bandas correspondentes ao dímero (180 kDa) e aisoforma trimérica da E2-CD154, de aproximadamente 270 kDa.Exemplo 4: Transdução in situ do epitélio glandular mamário de cabraspara a produção das variantes de E2his e E2his-CD154 no leite.

Para a transformação do epitélio mamário com os cassetes deexpressão das moléculas de E2his e E2his-CD154 se utilizaram os vetoresadenovirais recombinantes Ad-E2his-sec e Ad-E2hisCD154-sec. Em amboscasos os vetores foram inoculados na glândula mamária de cabras lactantesmediante a infusão direta da teta através do canal do mamilo. Os vetoresadenovirais infectaram as células epiteliais secretoras que conformam oepitélio mamário o que produziu a expressão das proteínas recombinantes.

Empregaram-se cabras no segundo mês da lactância natural,com uma produção média de 1 litro de leite por dia. Para efetuar a transduçãoadenoviral os animais foram inicialmente ordenhados até eliminar o leite dastetas, posteriormente infundiu-se solução salina isosmôtica às cisternasmediante infusão direta através do canal do mamilo, realizando massagenssuaves da teta para garantir a lavagem total da glândula mamária. Eliminou-sea solução salina mediante uma ordenha exaustiva da teta e repetiu-se oprocedimento. Posteriormente infundiu-se o inóculo adenoviral a um título de109 UFC/ML em solução salina, contendo 36 mM de EGTA. O volumeinfundido em cada teta foi variável, e garantiu-se o enchimento total dascisternas, em dependência da capacidade da teta. Depois da infusão, aplicou-se massagens à teta para facilitar que o inóculo adenoviral fosse distribuído demodo homogênea na glândula e chegasse até as células epiteliais secretorasdos alvéolos. A solução infundida foi removida 24 h depois medianteordenha. As glândulas mamárias foram lavadas novamente mediante a infusãode solução salina com o objetivo de eliminar os vetores adenoviraisremanescentes na cisterna e os condutos mamários.

Decorridas 24 h, começou-se a coletar o leite dos animaistransformados mediante ordenha manual. Realizaram-se duas ordenhas diáriasa intervalos de 12 h. O leite coletado foi armazenado a -70°C. Tomaram-semostras de cada ordenha para analisar a cinética de expressão das proteínasrecombinantes E2his e E2his- CD154 ao leite (Fig. 3 e 4). Comprovou-se queos tamanhos moleculares das proteínas recombinantes correspondiam-se comisoformas diméricas e triméricas. Obteve-se uma média de expressão de 1.03g/L da E2his nos dias 2-8 posteriores à inoculação, com um rendimentomédio de 5.22 g por cada animal. Para a molécula recombinante E2his-CD154, obteve-se uma média de expressão de 0.73 g/L, com um rendimentomédio de 3.04 g por animal.

Exemplo 5: Purificação dos antígenos E2his e E2his-CD154 a partir doleite de cabras.

As amostras de leite de cada um dos dias de ordenha quecontinham os antígenos vacinais recombinantes E2his e E2his-CD154,respectivamente foram misturados e centrifugados a 15000 g, durante 30 mina 4°C. Posteriormente, separou-se a fase solúvel (soro) e eliminou-se a fasesólida que continha majoritariamente gorduras. Ao soro foi adicionado umasolução tampão de separação (10 mM Tris-HCI, 10 mM CaCl2) em umaproporção soro-solução tampão de 1:4. A mistura foi incubada em gelodurante 30 min e posteriormente foi centrifugada a 15 000 g durante 30 min, a4°C.

Os sobrenadantes e os precipitados foram analisados medianteSDS-PAGE e "Western- blotting", e se pôde determinar que umaporcentagem majoritária das referidas proteínas recombinantes encontrava-sena fase solúvel e que o precipitado continha majoritariamente caseínas. Asfrações de. soro que continham os antígenos recombinantes de interesse(E2his e E2his-CD154) clarificaram-se mediante filtragem seriada commembranas de 0.8 μΜ e 0.4 μΜ (Milliporo) e foram aplicados em uma colunade purificação XK16 (Amersham, EEUU) empacotada com uma matriz deagarosa Ni-NTA (Qiagen, EEUU). Realizou-se dois passos de lavagem comtampão fosfato 100 mM e imidazol 20 mM (primeira lavagem) e fosfato 100mM e imidazol 50 mM (segunda lavagem). Na continuação, a proteína deinteresse foi extraída com tampão fosfato 100 mM, 200 mM imidazol, pH 7.2.O pico correspondente à fração pura foi dialisado contra tampão fosfato (Fig.5).

O procedimento para a purificação da E2his e a E2his-CD154a partir do leite de cabra foi igual para ambos antígenos vacinais. As duasproteínas foram obtidas com um nível de pureza superior a 90%. A E2his foiobtida com um recobrado de 70% e no caso da E2his-CD154 obteve-se umrecobrado de 58%. As proteínas purificadas foram analisadas mediante SDS-PAGE e "Western-blotting" para determinar a formação de agregadosprotéicos. Pôde-se determinar que a isoforma dimérica (homodímero) daE2his produzida no leite é reconhecida mais eficientemente pelo soropoliclonal de porcos infectados com o VPPC, o que indica que estaconformação específica da molécula favorece um maior grau deantigenicidade da mesma (Fig. 6).

Exemplo 6: Construção dos vetores de expressão no fermentometilotrófíca Pichia pastoris.

O vetor de expressão em P. pastoris pPS 10 foi digerido com aendonuclease de restrição Nae I para incorporar as seqüências codificantes deinteresse para o extremo 3' do sinal de secreção da sacarose invertase (Suc2)de Saccharomyces eerevisiae.

A seqüência codificante para a E2his foi inserida no lugarsensível a corte com a endonuclease de restrição Nae I do plasmídeo pPSIO apartir da amplificação por RCP. A seqüência codificante para a moléculaE2his-CD154 foi extraída do plasmídeo pMOS-E2his-CD154, mediantedigestão enzimática com as endonucleases de restrição Sma I-EeoR V e seinseriu no lugar de restrição Nae I do plasmídeo pPSIO. Obtiveram-se osplasmídeos pPS-E2his e pPS-E2his-CD154 onde as seqüências codificantespara ambas moléculas se encontram acopladas ao sinal de secreção de Suc2de S. eerevisiae e sob o controle do promotor AOXl da enzima álcool oxidasedo fermento P. pastoris.

A partir dos plasmídeos pPS-E2his e pPS-E2his-CD154 segeraram clones da cepa MP36 de P. pastoris estavelmente transformados. Osplasmídeos recombinantes foram linearizados com a endonuclease derestrição Pvu II e foram eletroporados na cepa MP36 eletrocompetente. Estacepa é um mutante auxotrófico para a histidina, os transformantes adquiremum fenótipo His+, que permite sua seleção.

Os transformantes positivos, identificados mediante Dot Blot,foram analisados, além disso, mediante a técnica de Southern Blot paradeterminar o padrão de integração, que pode ser por substituição do geneAOXl de P. pastoris, gerando um fenótipo Mut -His+ (baixa utilização dometanol). A substituição genética de AOXl ocorre por entrecruzamentos daregião do promotor de AOXl e a região 3'AOXl presentes no genoma dofermento e no plasmídeo, como resultado elimina-se a região codificadora dogene AOX1. As cepas recombinantes com fenótipo Mut baseiam a produçãodo álcool oxidase (AOX) no gene AOX2 e sua taxa de crescimento emmetanol é baixa. Também se pode obter um padrão de integração porsubstituição, fenótipo Mut+-His+.

As seqüências codificantes para as variantes de E2his e E2his-CD154 estão sob a regulação do promotor AOX1, o qual é induzível pormetanol. P. pastoris secreta somente baixos níveis de proteínas próprias e seumeio de cultivo não necessita de suplementos protéicos, portanto, pode-seesperar que uma proteína heteróloga que se secrete, constitua a maioria dototal de proteínas no meio (até mais de 80%). A produção das proteínasrecombinantes foi realizada em fermentadores de 5 L. A indução da expressãofoi realizada mediante a adição de metanol ao cultivo durante 5 dias. Asproteínas recombinantes foram obtidas a partir do meio de cultivo dafermentação. A E2his foi secretada no meio de cultivo do fermentotransformada em níveis de 0.143 mg/ML. No caso da E2his-CD154 obtive-seníveis de expressão de 0.122 mg/ML.

Exemplo 7: Purificação dos antígenos E2his e E2his-CD154 a partir domeio de cultivo de Pichiapastoris.

O produto da fermentação foi centrifugado a 10 000 g durante30 min, a 4°C para separar a biomassa da fase líquida. O meio de cultivo foifiltrado em membranas de 0.8 μΜ e 0.2 μΜ (Milliporo) e aplicado em umacoluna de purificação XK16 (Amersham, EEUU) empacotada com umamatriz de agarosa Ni-NTA (Qiagen, EE. UU). Realizou-se um movimento delavagem com tampão fosfato 100 mM e 30 mM imidazol, pH 7.2, e emcontinuação a proteína de interesse foi extraída com tampão fosfato 100 mM,200 mM imidazol, pH 7.2. A fração pura foi dialisada contra 10 mM detampão fosfato. O procedimento para a purificação da E2his e a E2his-CD154a partir do sobrenadante da fermentação do fermento P. pastoris,geneticamente transformado, foi igual para ambos antígenos vacinais. As duasproteínas foram obtidas com um nível de pureza superior a 95%. A E2his foiobtida com um recobrado de 83% e no caso da E2his-CD154 obteve-se umrecobrado de 78%.Exemplo 8: Ensaio de proteção de porcos vacinados com a variante deE2his secretável.

Selecionaram-se 24 porcos sãos, de 20 kg de peso,sorologicamente negativos ao VPPC, procedentes de uma unidade semantecedentes da doença e sem vacinar nos 3 anos precedentes. Os porcosforam distribuídos em grupos de 8 animais cada um, em três quartosexperimentais (A, B, C) com água e ração ad limitum.

Aos animais do grupo A e grupo B foram aplicados umacomposição vacinai que continha o antígeno E2his, em uma dose única de 30μg (grupo A) e 50 μg (grupo B) por animal, e o grupo C foi imunizado complacebo. O antígeno vacinai foi formulado em uma emulsão de adjuvanteoleosa e foi inoculada mediante injeção de 2 mL por via intramuscular (IM)na altura do pescoço. O placebo constituído por adjuvante e solução salinafosfatada em uma proporção 1:1 (V/V), foi inoculado de forma similar. Osanimais foram confrontados com o VPPC mediante inoculação por via IMcom IO5 DL50 do isolamento "Margarita". A confrontação foi realizada naterceira semana posterior à imunização.

A inoculação com a composição vacinai baseada na E2his nãoprovocou reações adversas, já que não se observou nenhuma alteração dosparâmetros clínicos normais. A partir da segunda semana de imunização,obtive-se títulos de anticorpos neutralizantes, nos grupos vacinados,superiores a 1/50 (considerados protetores), e depois da terceira semana, antesdo ataque, elevaram-se os títulos até 1/1 600 - 1/6 400 (Fig. 7). Não seobservou diferenças na resposta entre ambos grupos vacinados (A e B). Osanimais vacinados não desenvolveram febre, nem sintomas clínicos dadoença, nem se obtiveram isolamentos virais a partir dos linfócitos nos diasposteriores ao ataque. O grupo placebo desenvolveu todos os sintomasclínicos da doença incluindo febre, hemorragias e encefalite não purulenta,obtive-se isolamentos virais a partir do quarto dias pós-ataque em todos osanimais placebo e até o dia do sacrifício. Demonstrou-se que a composição deE2his em dose de 30 μ§ administrado a porcos desmamados com o esquemaempregado protege dos sintomas clínicos e da infecção pelo VPPC.Exemplo 9: Ensaio de proteção vertical em porcas gestantes vacinadascom o antígeno E2his secretável.

De uma unidade de cria sem antecedentes da doença, nemvacinação contra a PPC nos 3 anos precedentes, selecionaram-se 10 porcasreprodutoras, sorologicamente negativas à PPC. No momento posterior aodesmame lhes foi realizada a indução do cuidado por tratamento hormonal etrês dias mais tarde foram inseminadas. A um grupo de 5 porcas foi aplicado acomposição vacinai mencionada no Exemplo 7 (Grupo B), mediante injeçãode 2 mL (via IM) na altura do pescoço. A imunização foi realizada de formasimultânea à inseminação. O grupo de cinco porcas restantes foi tomado comogrupo controle negativo e lhes foi aplicado um placebo constituído por 2 mLde adjuvante e solução salina em uma proporção 1:1 (V/V). No grupopreviamente imunizado foi realizado uma segunda imunização 21 dias depois.As porcas foram estudadas mediante a medição da tríade clínica (temperatura,pulso cardíaco e freqüência respiratória) e foram realizadas extrações desangue semanais para hematologia e detecção de anticorpos neutralizantescontra o VPPC. Aos 2 meses de gestação as porcas foram transladadas para aunidade experimental, onde foram confrontadas com o VPPCl medianteinoculação por via IM com IO5 DL50 do isolamento "Margarita". A presençado VPPC em linfócitos foi analisada mediante isolamento viral das mostras desangue aos 3 e 5 dias após confrontação. Duas semanas depois as porcasforam sacrificadas e os fetos extraídos para análises virológica, morfológica eanatomo- patológica. Durante o curso do ensaio as porcas tiveram acesso àágua e ração ad libitum.

A vacina resultou inócua para as porcas gestantes, nos diasposteriores às imunizações não apresentaram abortos, nem alterações clínicase desenvolveram títulos de anticorpos neutralizantes específicos contra oVPPC de 1:50 a 1:51 200. Depois da confrontação nas porcas do grupovacinado não se observou febre, nem outros sinais clínicos próprios da PPC,também não se detectou leucopenia nem trombocitose. A análise dos fetosmediante morfometria e anatomia patológica permitiu determinar que os fetosprocedentes das mães vacinadas tinham um tamanho normal e nãoapresentavam lesões histopatológicas. Não se isolou o VPPC dos leucócitos, apartir das mostras de sangue das mães nas extrações posteriores àconfrontação. Tampouco foi isolado no sangue ou nos órgãos dos fetossacrificados.

As porcas do grupo placebo apresentaram febre e leucopeniadepois da confrontação, uma das porcas abortou aos 8 dias posteriores àconfrontação, por isso sacrificada aos 9 dias posteriores à confrontação.Nestes fetos e nos das outras quatro porcas do grupo placebo, que foramsacrificadas às 2 semanas posteriores à confrontação, observou-se um menortamanho, mumificação, esplenomegalia, numerosas petéquias em rins ebexiga, e focos de encefalite não purulenta. Isolou-se o VPPC de todos osórgãos e sangue dos fetos deste grupo.

A vacinação das porcas com a composição vacinai baseada emE2his impediu a transmissão do VPPC das mães para sua descendência.

Exemplo 10: Ensaio de proteção rápida em porcos vacinados com acomposição vacinai baseada em E2his-CD154 secretável.

Tomou-se quatro grupos de porcos (em condições idênticas aoExemplo 8) de 6 animais cada um e a cada animal foi aplicado a composiçãovacinai com as seguintes quantidades de antígeno: 50 μg de E2his-CD154(Grupo D), 80 μg de E2his- CDl54 (Grupo E), 50 μg de E2his (Grupo F).Tomou-se como placebo o Grupo G. Os antígenos foram formulados em umaemulsão de adjuvante oleoso e foram inoculados mediante injeção de 2 mLpor via IM. O grupo tomado como placebo foi inoculado somente comadjuvante. Realizou-se somente uma imunização. Os animais foramconfrontados com o VPPCl mediante inoculação por via IM com IO5 DL50do isolamento "Margarita". A confrontação foi realizada no dia 8 posterior àimunização. Realizou-se uma análise diária de sinais clínicos durante todo operíodo do experimento e uma extração de sangue semanal para análisehematológica e de anticorpos neutralizantes. Além disso, tomaram-seamostras de sangue nos dias 1, 3, 5 e 7 posteriores à vacinação para avaliar aresposta imunológica celular mediante um ensaio de linfoproliferação e umensaio de atividade antiviral em soro. Depois da vacinação foram registradossinais clínicos normais e não se observou respostas indesejadas no lugar deinoculação. Nos animais vacinados com o antígeno E2-CD154 (Grupos D eE) detectou-se um aumento da resposta dos linfócitos tanto ao mitogênio fito-hemaglutinina quanto ao VPPC durante o ensaio de linfoproliferação. Estaresposta foi bloqueada com um anticorpo monoclonal dirigido contra odomínio CD4, o que indica que a resposta imune esteve mediada porlinfócitos T (resposta tipo T cooperadora). As amostras de linfócitos deanimais dos grupos FeG (placebo) não responderam à estimulação nem como mitogênio nem ao VPPC durante o ensaio (Fig. 8).

Observou-se títulos elevados de interferón alfa nas mostras dosdias 3, 5 e 7 posteriores à vacinação com o antígeno E2-CD154 nos grupos De E, no entanto nos animais vacinados com o antígeno E2his (Grupo F) e ogrupo placebo (G) não se detectou incrementos nos níveis de interferón alfaem nenhum dos dias amostrados. Realizou-se um ensaio de atividade antiviralem células de rim de porco PK-15 contra o vírus da gastroenteritetransmissível suína. Nos grupos DeE foram obtidos títulos de atividadeantiviral de até 1/512, no entanto não se detectou proteção antiviral nasmostras dos animais imunizados com a E2his, nem no grupo placebo (Fig. 9).

Com estes experimentos, determinou-se que o antígeno E2acoplado à molécula CDl 54 potência uma resposta imune celular contra oVPPC que está relacionada com a atividade imunoestimuladora da moléculaCD154.

Exemplo 11: Comparação da cinética de anticorpos neutralizantes emporcos vacinados com doses únicas das composições vacinais que contêmE2his e E2his-CD154.

Tomaram-se três grupos de porcos de aproximadamente 20 kgde peso, sorologicamente negativos ao vírus PPC procedentes de uma unidadesem antecedentes da doença e sem vacinar nos 3 anos precedentes. Os porcosforam distribuídos em grupos de 6 animais, cada um com água e ração adlimitum.

A cada animal foi aplicado 50 μg de E2his-CD154 (Grupo H),50 μg de E2his (Grupo I) e foi tomado como placebo o Grupo J. Os antígenosforam formulados em uma emulsão de adjuvante oleoso e inoculadosmediante injeção de 2 mL por via IM. O grupo tomado como placebo foiinoculado somente com adjuvante. Realizou-se somente uma imunização eforam medidos os níveis de anticorpos neutralizantes desenvolvidos nosanimais nas 5 semanas posteriores à imunização mediante um ensaio deneutralização da peroxidase.

Nos dois grupos de porcos vacinados com as formulaçõescontendo os antígenos E2-CD154 e E2his (H e I) detectaram-se anticorposneutralizantes a partir da segunda semana de imunização, com títulossuperiores a 1/50 (considerados protetores). Nos animais do grupo placebonão foram detectados anticorpos em nenhuma das amostras tomadas durante oensaio. Na segunda semana posterior à imunização nos animais do Grupo H(antígeno E2-CD154) detectaram-se títulos de anticorpos neutralizantes muitosuperiores aos do grupo imunizado com o antígeno E2his, o que sugere umaestimulação superior da resposta humoral nos animais do Grupo H (Fig. 10).

Com este ensaio, conclui-se que a composição vacinai quecontém o antígeno de E2his-CD154 em uma dose de 50 μg é inócua,imunogênica e induz a uma resposta humoral mais rápida nos porcosvacinados quando comparada com a composição vacinai que contém oantígeno E2his.

Exemplo 12: Ensaio de proteção vertical em porcas gestantes vacinadascom a composição vacinai que contém E2his-CD154 secretável.

Selecionaram-se 10 porcas reprodutoras com idênticascondições de saúde e procedência das porcas utilizadas no Exemplo 8. Nomomento posterior ao desmame lhes foi induzido cuidado mediantetratamento hormonal. Três dias depois, as porcas foram inseminadas esimultaneamente, selecionou-se um grupo de 5 que foi vacinado com acomposição vacinai de E2his-CD154 a 80 μg/animal (composição utilizadano Exemplo 10 para o grupo E) mediante injeção de 2 mL, por via IM, naaltura do pescoço. O grupo de cinco porcas restantes foi tomado como grupocontrole negativo, já que lhes foi aplicado como placebo o adjuvante oleoso.As porcas foram monitoradas mediante a tomada da tríade clínica e extraçõesde sangue semanais para hematologia e detecção de anticorpos neutralizantescontra o VPPC. Aos 2 meses de gestação as porcas foram transladadas para aunidade experimental, onde foram confrontadas com o VPPC selvagemmediante inoculação por via IM com IO5 DL50 do isolamento "Margarita". Aviremia foi analisada por extração de sangue nos dias 3 e 5 posteriores àconfrontação viral. Duas semanas depois, as porcas foram sacrificadas e osfetos extraídos para análises virológica, morfológica e anatomo-patológica.Durante o experimento as porcas tiveram acesso à água e ração ad libitum.

A composição vacinai baseada em E2his-CD154, em uma sóimunização, resultou inócua para as porcas gestantes, pois nos dias posterioresnão foi apresentado casos de aborto, nem outro sinal clínico. Os animaisvacinados desenvolveram títulos de anticorpos neutralizantes específicoscontra VPPC de 1:50 a 1:16 000.

Depois da confrontação não foi observada febre, leucopenianem trombocitose no grupo das porcas vacinadas. Não tiveram abortos e asanálises de morfometria e anatomia patológica permitiram determinar que osfetos procedentes das mães vacinadas tinham um tamanho normal e nãoapresentavam lesões histopatológicas. Nas amostras de sangue tomadasdepois da confrontação, não foi isolado vírus dos leucócitos das mãesvacinadas, nem no sangue, nem os órgãos dos fetos sacrificados.

As porcas do grupo placebo apresentaram febre, leucopenia efalta de apetite depois da confrontação. Os fetos das porcas deste grupotinham um tamanho reduzido e apresentavam lesões histopatológicascompatíveis com a PPC, como esplenomegalia, petéquias em rins e bexiga,focos de necrose em intestino, numerosas hemorragias nos órgãos internos efocos de encefalite não purulenta. Isolou-se o VPPC de todos os órgãos esangue dos fetos deste grupo. A vacinação das porcas prenhes com acomposição vacinai E2his-CD154 no esquema avaliado, impediu atransmissão do VPPC das mães para sua descendência.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> CENTER FOR GENETIC ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY

<120> Antígenos vacinais quiméricos contra o vírus da peste suína

clássica.

<130> PPC-E2

<140>

<141>

<150> CU 2006- 0052

<151> 2006-02-28<160> 2

<170> PatentIn Ver. 2.1<210> 1<211> 363<212> PRT

<213> Vírus da febre suína clássica' < 2 2 0 >

<221> PEPTÍDEO<222> (1)..(363)

<223> Seqüência de Poli-PEPTÍDEO de 363 aa correspondente ao segmentoextracelular de E2 CSFV<4 00> 1

Lys Val Leu Arg Gly Gln Val Val Gln Gly Val Ile Trp Leu Leu Leu

15 10 15

Val Thr Gly Ala Gln Gly Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Phe Arg Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Ser Thr Asn Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Glu Gly Leu

35 40 45

Thr Thr Thr Trp Lys Asp Tyr Asp His Asn Leu Gln Leu Asp Asp Gly

50 55 60

Thr Ile Lys Ala Ile Cys Thr Ala Gly Ser Phe Lys Val Ile Ala Leu65 70 75 80

Asn Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Gly Ala Leu

85 90 95

Pro Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Ser Pro Ser

100 105 110

Ile Glu Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp

115 120 125

Thr Ser Pro Val Val Lys Gly Arg Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly

130 135 140

Ser Ala Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu145 150 155 160

Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr

165 170 175

Phe Arg Arg Glu Lys Pro Phe Pro His Arg Lys Asp Cys Val Thr Thr

180 185 190

Thr Val Glu Asn Glu Asp Leu Phe Tyr Cys Arg Leu Gly Gly Asn Trp

195 200 205

Thr Cys Val Lys Gly Glu Pro Val Ile Tyr Thr Gly Gly Leu Val Lys

210 215 220

Gln Cys Arg Trp Cys Gly Phe Asp Phe Asn Glu Pro Asp Gly Leu Pro225 230 235 240

His Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg

245 250 255

Ile Val Asp Ser Thr Asp Cys Asn Arg Asn Gly Val Val Ile Ser Thr

260 265 270

Glu Gly Ser His Glu Cys Leu Ile Gly Asn Thr Ser Val Lys Val His

275 280 285

Ala Leu Asp Glu Arg Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile

290 295 300

Val Ser Ser Glu Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr305 310 315 320

Thr Lys Thr Leu Arg Asn Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe

325 330 335

Gln Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp

340 345 350

Val Thr Asp His His Ser Asp Tyr Phe Thr Glu355 360

<210> 2<211> 210<212> PRT<213> Sus scrofa<220>

<221> PEPTÍDEO<222> (1)..(210)

<223> Domínio extracelular de CD154 suíno de 210 aa obtido tomando comoum padrão de seqüência o gene de CD154 de porco "Sus scrofa" (AB040443)<400> 2

Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe Ile Lys

15 10 15

Thr Ile Gln Arg Cys Lys Gln Gly Glu Gly Ser Leu Ser Leu Leu Asn

20 25 30

Cys Glu Glu Ile Arg Ser Gln Phe Glu Asp Leu Val Lys Gly Ile Met

35 40 45

Gln Ser Lys Glu Val Lys Lys Lys Glu Lys Ser Phe Glu Met His Lys

50 55 60

Gly Asp Gln Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser65 70 75 80

Ser Lys Thr Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Pro Lys Gly Tyr Tyr Thr

85 90 95

Leu Ser Thr Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Arg Gln Leu Ala Val

100 105 110

Lys Arg Gln Gly Ile Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser

115 120 125

Asn Arg Asp Ala Ala Gly Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu

130 135 140

Arg Ser Pro Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr145 150 155 160

His Ser Ser Ser Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly

165 170 175

Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp

180 185 190

Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu195 200 205

Lys Leu210

Claims (12)

1. Antigeno vacinal quimerico contra o virus da peste suinaclássica (VPPC) caracterizado pelo fato de que contém o segmentoextracelular da glicoproteína E2 do envoltório viral do VPPC e uma proteínaestimuladora do sistema imune, que atua como adjuvante molecular.

2. Antígeno vacinai quimérico de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que a proteína estimuladora do sistema imune é ointerferón alfa ou o segmento extracelular da molécula CD154.

3. Antígeno vacinai quimérico de acordo com a reivindicação-2, caracterizado pelo fato de que o interferón alfa ou o segmento extracelularda molécula CD154 podem provir de qualquer mamífero.

4. Antígeno vacinai quimérico de acordo com a reivindicação-3, caracterizado pelo fato de que contém essencialmente a seqüênciaaminoacídica do segmento extracelular da glicoproteína E2 do VPPC (Id. Sec.No. 1) e do segmento extracelular de molécula CD154 de porco (Id. Sec. No.-2)·

5. Antígeno vacinai quimérico de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que é obtido por via recombinante, sintética oumediante conjugação química.

6. Antígeno vacinai quimérico de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que é obtido a partir do leite de mamíferosgeneticamente modificados.

7. Antígeno vacinai quimérico de acordo com a reivindicação-6, caracterizado pelo fato de que é obtido a partir do leite de mamíferos nãotransgênicos mediante a transformação genética direta da glândula mamária.

8. Antígeno vacinai quimérico de acordo com a reivindicação-7, caracterizado pelo fato de que a transformação genética direta da glândulamamária se realiza mediante o emprego de vetores adenovirais.

9. Antígeno vacinai quimérico de acordo com a reivindicação-6, caracterizado pelo fato de que é obtido a partir do leite de mamíferostransgênicos.

10. Antígeno vacinai quimérico de acordo com a reivindicação-5, caracterizado pelo fato de que é obtido a partir de fermentos modificadosgeneticamente.

11. Composição de vacina capaz de produzir uma respostaimune protetora contra o vírus da peste suína clássica (VPPC), caracterizadapelo fato de que contém os antígenos quiméricos descritos nas reivindicações-1-10.

12. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que pode ser administrada aos animais por rotasistêmica ou mucosal.