BRPI0708429A2 - método para formar uma espuma absorvente seca, espuma absorvente seca, compósito, uso de uma espuma ou de um compósito, e, métodos para inibir a proliferação celular, para fixar um compósito ao tecido e para evitar a adesão de tecido a tecido adjacente - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA FORMAR UMA ESPUMA ABSORVENTE SECA, ESPUMA ABSORVENTE SECA, COMPóSITO, USO DE UMA ESPUMA OU DE UM COMPóSITO, E, METODOS PARA INIBIR A PROLIFERAçãO CELULAR, PARA FIXAR UM COMPóSITO AO TECIDO E PARA EVITAR A ADESãO DE TECIDO A TECIDO ADJACENTE A invenção refere-se a um método para formar uma espuma absorvente seca tendo uma rede de poros abertos e poros por preparação de uma dispersão aquosa compreendendo um biopolímero enzimaticamente biodegradável e um agente espumante e opcionalmente um ou mais de lons formadores de gel, um plastificante, um agente reticulante e um modificador de pH, formar, preparar ou misturar uma espuma a partir da dispersão aquosa e secar a espuma para formar uma espuma seca contendo poros abertos. Os compósitos geleificados feitos a partir das espumas são também providos. A invenção é particularmente utilizável ao prover espumas e compósitos para uso em aplicações biomédicas e como um anti-adesivo em regeneração de tecido e controle de feridas.

Description

"MÉTODO PARA FORMAR UMA ESPUMA ABSORVENTE SECA,ESPUMA ABSORVENTE SECA, COMPÓSITO, USO DE UMA ESPUMAOU DE UM COMPÓSITO, E, MÉTODOS PARA INIBIR APROLIFERAÇÃO CELULAR, PARA FIXAR UM COMPÓSITO AOTECIDO E PARA EVITAR A ADESÃO DE TECIDO A TECIDO ADJACENTE"

Este pedido reivindica o benefício de pedido provisório US no.60/777 869, depositado em Io. de março de 2006; pedido provisório US no.60/ 872 844, depositado em 5 de dezembro de 2006, e pedido provisório USno. 60/ 874. 174, depositado em 11 de dezembro de 2006.

Esta invenção é dirigida a uma espuma biodegradávelcompreendendo um biopolímero, um compósito compreendendo umbiopolímero e um método de preparação da espuma, um compósito e seususos. A espuma e compósito são particularmente utilizáveis em aplicaçõesbiomédicas, farmacêuticas, cuidado pessoal, e industrial.

As espumas feitas a partir de biopolímeros são conhecidas econhecidas para uso em muitas aplicações incluindo o controle de feridas,regeneração de tecidos, engenharia de tecido, e imobilização de células eoutros. As espumas de quitosana são conhecidas para uso no tratamento tantode feridas tópicas como internas. As propriedades antibacterianas ebioadesivas dos polímeros também as tornam um polímero apropriado para otratamento de feridas além de outras aplicações onde pode ser desejado que aespuma deva aderir a uma superfície de tecido. Muitos dos produtosdisponíveis hoje em dia para uso como uma matriz para a imobilização decélulas, ou cultura de células como uma armação anti-adesão, como umsistema para a liberação controlada são feito de produtos de mamíferos comocolágeno. Seria desejável substituir estes por produtos feitos de materiais nãode mamíferos e materiais de maior pureza.

Acido hialurônico ou hialuronato é um componente natural emorganismos de mamíferos e é enzimaticamente biodegradável porhialuronidasaes. O hialuronato de sódio é um glicosaminoglicano abundanteencontrado na matriz extracelular da pele, juntas, olhas e maior parte dosórgãos e tecidos de todos os animais superiores. HA não derivado de animaispode ser fermentado a partir de Streptococcus zooepidemicus.

US 5 840 777 (Eagles) descreve um método de formação deuma espuma de polissacarídeo que compreende a preparação de uma soluçãoaquosa incluindo um polissacarídeo solúvel e espumando mecanicamente asolução. A espuma pode ser feita por introdução de um gás. A espuma podeser seca ao ar após formação no entanto isto leva à espuma em uma regiãointerior a colapsar.

Os requerentes agora descobriram que uma espuma produzidaem um modo particular e compreendendo um polímero enzimaticamentebiodegradável provê uma excelente combinação de características incluindointegridade estrutural, resistência, flexibilidade e biodegradabilidade.

A invenção provê um método para formar uma espumaabsorvente seca tendo uma rede de poros aberta e poros por:

a. formação de uma espuma úmida a partir de uma dispersãoaquosa compreendendo um polissacarídeo; um agente espumante;opcionalmente um plastificante; opcionalmente um agente reticulante;opcionalmente íons formadores de gel; opcionalmente um ou mais aditivos; eágua;

b. misturação da espuma a partir da dispersão aquosa,opcionalmente por agitação mecânica;

c. moldagem ou conformação da espuma úmida eopcionalmente formação de uma espuma reticulada; e

d. secagem da espuma para formar uma espuma secaopcionalmente por secagem a ar e opcionalmente ainda moldagem,conformação, ou compressão da espuma seca.A invenção também provê um método para a formação de umaespuma absorvente seca compreendendo uma rede de poros abertos e íonsformadores de gel por:

a. formação de uma dispersão aquosa compreendendo umpolissacarídeo; um agente espumante; íons formadores de gel, opcionalmenteum plastificante; opcionalmente um modificador de pH; opcionalmente um oumais aditivos e água;

b. preparação de uma espuma a partir da dispersão aquosa; e

c) secagem da espuma para formar uma espuma seca de porosabertos contendo poros e íons formadores de gel;

em que a quantidade de íons formadores de gel adicionados irá saturar menosdo que 25% dos sítios de geleificação do polissacarídeo.

A invenção também provê um método para a formação de umaespuma absorvente seca compreendendo uma rede de poros abertos e íonsformadores de gel apropriados para a geleificação de uma solução depolissacarídeo subseqüentemente adicionada por:

a) formação de uma dispersão aquosa compreendendo umpolissacarídeo; um agente espumante; pelo menos um íon geleificante que nãogeleifica o polissacarídeo, opcionalmente um plastificante, opcionalmente ummodificador de pH, opcionalmente um ou mais aditivos e água;

b) formação de uma espuma a partir da dispersão aquosa; e

c) secagem da espuma para formar uma espuma seca contendoporos abertos e íons formadores de gel apropriados para a geleificação de umasolução de polissacarídeo subseqüentemente adicionada.

Em um aspecto preferido, a invenção provê um método para aformação de uma espuma absorvente seca tendo uma rede de poros abertos eporos por:

a) preparação de uma dispersão aquosa compreendendo umbiopolímero enzimaticamente biodegradável ou polissacarídeo e um agente4

espumante, preferivelmente um agente espumante biologicamente aceitável, eopcionalmente um ou mais dentre um plastificante, íons formadores de gel,um agente reticulante, e um modificador de pH;

b) formação, preparação ou misturação de uma espuma,preferivelmente uma espuma úmida, a partir da dispersão aquosa,

opcionalmente por agitação mecânica;

c) opcionalmente moldagem ou conformação da espuma eopcionalmente formação de uma espuma reticulada; e

d) secagem da espuma para formar uma espuma seca contendoporos abertos.

Por "biopolímero enzimaticamente biodegradável" significaum biopolímero que é capaz de degradar in vivo em um mamífero como umaconseqüência de ação enzimática.

De modõ apropriado, a espuma é seca por secagem ao ar. Aespuma seca pode ser moldada, conformada ou comprimida como desejadodurante ou após a secagem.

Preferivelmente, a espuma é formada por formação,preparação ou misturação da dispersão aquosa compreendendo umpolissacarídeo enzimaticamente biodegradável; íons formadores de gel, umagente espumante, e opcionalmente um ou mais dentre um plastificante, umagente reticulante, e um modificador de pH e a secagem da espuma paraformar uma espuma seca de poros abertos contendo poros.

Os íons formadores de gel apropriados para uso na presenteinvenção incluem íons monovalentes e polivalentes, preferivelmente íonsdivalentes e/ou trivalentes, ou uma mistura de íons. E uma exigência dainvenção que os íons formadores de gel sejam capazes de formar um gel como biopolímero enzimaticamente biodegradável. Onde os íons formam um salsolúvel com um biopolímero particular, estes íons são geralmente nãoconsiderados apropriados para fazer um gel ou espuma com este biopolímero.Os íons formadores de gel apropriados podem ser carregados de modopositivo ou negativo e ser monovalentes ou polivalentes. Os exemplosincluem por exemplo cálcio (2+), bário (2+), estrôncio (2+), ferro (2+), zinco(2+), cobre (2+), e alumínio (3+). Os cátions preferidos são cátions de metaldivalente, mais preferivelmente o cátion cálcio (2+). Um cátion pode não serconsiderado como um íon formador de gel apropriado para um biopolímeroem particular, se ele fornecer um sal solúvel, no entanto ele seria apropriadocom outro biopolímero desde que ele não forme um sal solúvel com estepolímero. Quando o sal de biopolímero enzimaticamente biodegradável épositivamente carregado, por exemplo, quitosana, íons formadores de gelnegativamente carregado, por exemplo fosfato pode ser empregado.

Um sal ou combinação de sais que provê os íons formadoresde gel desejados ou mistura de íons formadores de gel pode ser usado comoos íons formadores de gel. Os íons formadores de gel podem ser incorporadosna espuma ou durante a preparação ou subseqüentemente adicionados àespuma, se aplicável, antes da adição do líquido com o polissacarídeo. Assoluções de lavagem típicas para a espuma de polissacarídeo tem cerca de 30mM a cerca de 200 mM, mais preferivelmente de 50 a 100 mM, de um salgeleificante solúvel em água, como cloreto de cálcio, cloreto de bário, oucloreto de estrôncio. De modo apropriado, a taxa de geleificação pode sercontrolada para retardar a geleificação por uso de sais pouco solúveis sobcondições de pH em que eles são lentamente solubilizados, ou por uso de íonsformadores de gel solúveis em combinação com seqüestrantes. A lavagem ouembebimento pode ser usada para modificar as propriedades do compósitoonde os íons formadores de gel adicionais podem ser adicionados parareforçar ou endurecer o compósito e também controlar a proliferação celular,enquanto outros tratamentos como seqüestrantes ou íons não formadores de gelpodem ser usados para enfraquecer ou dissolver o compósito.

Os géis de alginato podem ser dissolvidos por adição de umagente de recuperação, por exemplo uma solução aquosa de citrato, EDTA ouhexametafosfato. Os tratamentos de lavagem para uso com células vivaspodem ser isotônicos. As propriedades do compósito podemconseqüentemente ser adaptadas sob medida como desejado.

Os íons formadores de gel podem ser capazes de formar umgel com o polímero da espuma e/ou polissacarídeo solúvel. Os íonsformadores de gel podem formar ligações entre a espuma e o polissacarídeosolúvel. Preferivelmente, os "íons formadores de gel" na espuma sãodonatáveis para o polissacarídeo e estão presentes na espuma em um nívelcomo que pelo menos alguns dos sítios de geleificação do polissacarídeo sãoocupados quando do contato com o componente líquido para a espuma. Demodo apropriado, os íons formadores de gel podem estar presentes na espumaem um nível sub-estequiométrico, estequiométrico ou super- estequiométrico,com relação aos sítios na espuma para a ligação dos íons formadores de geldesde que suficientes íons formadores de gel estejam presentes para ocuparpelo menos alguns dos sítios de geleificação no polissacarídeo a seradicionado.

Em uma forma de realização preferida, os íons formadores degel estão presentes na espuma e podem ser incorporados na mesma durante aprodução da espuma ou após ser formada mas desejavelmente antes dequalquer adição de outro polissacarídeo para formar um compósito de espumageleificada. Preferivelmente, os íons formadores de gel são apropriados para aformação de um gel com um polissacarídeo subseqüentemente adicionado àespuma. De modo apropriado, a quantidade de íons formadores de geladicionados irá saturar até 200% dos sítios de geleificação do polissacarídeo,por exemplo menos do que 25% dos sítios.

As espumas da presente invenção têm redes de poros abertos.De modo apropriado, os poros na rede de poros abertos são de 5 a 1000mícrons, preferivelmente de 25 a 500 mícrons. A espuma é preferivelmentecapaz de absorver um componente líquido adicionado contendo umpolissacarídeo em seus poros. De modo apropriado, a espuma tem porosabertos em pelo menos uma superfície e desejavelmente tem pelo menos umaporção de poros interconectados para permitir o transporte dentro da espumade um componente líquido adicionado à espuma, por exemplo uma solução depolissacarídeo e/ou efetivamente aumenta o volume do líquido que pode serabsorvido. A espuma é de modo apropriado intumescível e preferivelmentepode absorver até 30 vezes seu peso, mais preferivelmente de 1 a 20 vezes seupeso de um líquido, por exemplo uma solução fisiológica aquosa ou umasolução de polissacarídeo. A espuma pode ter uma distribuição homogênea ouheterogênea de tamanhos de poros. Nem todos os poros são requeridos paraabsorver o componente líquido.

O biopolímero enzimaticamente biodegradável épreferivelmente selecionado dentre um polissacarídeo, preferivelmentequitosana e ácido hialurônico. Ao empregar um biopolímero que éenzimaticamente biodegradável, uma espuma de acordo com a invenção ecompósitos compreendendo a espuma podem ser empregados com vantagemem controle de feridas, como um bioadesivo e/ou em outras aplicações nocorpo humano ou animal. A degradação enzimática permite que a espuma sejaprojetada em tal modo que o produto pode desempenhar sua função e entãoser removido do corpo através de degradação. Os biopolímeros que não sãoenzimaticamente biodegradáveis ou devido à suas características intrínsecasou devido à ausência de enzimas apropriadas no meio em que a espuma deveser empregada podem levar mais tempo para degradar por outros mecanismospor exemplo hidrólise, a um nível onde eles podem ser excretados.

Em uma forma de realização especialmente preferida, obiopolímero compreende quitosana. A quitosana é um polissacarídeo linearcompreendendo β (1->4) ligado 2-acetamido-2-desóxi-D-glucopiranose(GlcNAc) e 2- amino-2-desóxi-D- glucopiranose (GlcN). A quitosana éderivado N-desacetilado de quitina, que consiste quase que completamente deβ (1-->4) ligado 2-acetamido-2-desóxi-D- glucopiranose (GlcNAc).

Comercialmente, a quitosana é feita por N-desacetilação alcalina de quitina. Oprocesso de desacetilação heterogêneo combinado com a remoção decomponente insolúvel resulta em um produto de quitosana que possui umadistribuição aleatória de unidades de GlcNAc e GlcN ao longo da cadeia dopolímero. O grupo amino em quitosana tem um valor pKa aparente de cercade 6,5 e um pH abaixo deste valor, o grupo amino livre será protonizado demodo que o sal de quitosana dissolvido em solução irá transportar uma cargapositiva. Conseqüentemente, quitosana é capaz de reagir com componentesnegativamente carregados, isto sendo uma função direta da densidade decarga positiva da quitosana.

Com vantagem, a natureza catiônica de quitosana provê umapropriedade bioadesiva. Além disso, quitosana pode precipitar célulasvermelhas do sangue devido à sua carga negativa proporcionando benefíciosna formação de coágulos sangüíneos e na redução do nível de fibrina durantea cicatrização assim reduzindo a formação de tecido de cicatriz. A quitosanapode ser degradada por lisozima e outras enzimas relacionadas ocorrendo emum corpo de mamífero, por exemplo no corpo humano. Em uso, a quitosanaem uma espuma da presente invenção será degradada de modo apropriado porlisozima encontrada em mamíferos em saliva, lágrimas, soro do sangue, efluido intersticial. Um compósito tendo uma espuma de quitosana pode serempregado com vantagem em controle de feridas, como um bioadesivo e emoutras aplicações no corpo humano ou animal.

Como quitosana é também conhecida para abrir as junçõesfirmes entre as células presentes, por exemplo em superfícies mucosais e pelecomo células epiteliais, a presente invenção é particularmente utilizável paraaplicações de liberação farmacêutica e vacina. A espuma de quitosanatambém pode ser usada como uma matriz para a imobilização de células,como uma armação anti-adesão e como um sistema para a liberaçãocontrolada. As espumas de quitosana pode prover matrizes apropriadas para ocrescimento celular ou aplicações em cultura de células / tecido (in vitro) ou como tecido.

A degradação enzimática permite que a espuma seja projetadaem tal modo que o produto pode realizar sua função e então ser removido docorpo através da degradação. Os produtos de degradação de quitosana sãoglucosamina e N-acetilglucosamina que são não tóxicos em mamíferos. Ataxa de biodegradação de espumas de quitosana implantadas pela lisozimapode ser modificada por variação do grau de desacetilação de quitosanaporque a acetilação protege o polímero da degradação enzimática. Asquitosanas com maiores graus de desacetilação são também mais resistentes àdes-polimerização aleatória por hidrólise ácida devido a um efeito protetor dacarga positiva.

As quitosanas apropriadas para uso na presente invençãopodem estar na forma da base de quitosana, um sal de quitosana solúvel emágua, ou uma quitosana modificada. A base de quitosana pode requerer diluiro ácido para dissolver, por exemplo, ácido acético a 1% em peso. A quitosanaé solúvel em meio aquoso em pH ácido, onde o polissacarídeo será altamentepositivamente carregado. As quitosanas de peso molecular elevado com umadistribuição aleatória de unidades de monômero e um grau de desacetilação(DA) entre 40 e 60% são solúveis em pH neutro. As quitosanas mostramaumentada solubilidade em maiores valores de pH com diminuído DA.Também, por des-polimerização de quitosanas com DA acima de 60%, suasolubilidade em água em valores de pH neutros pode ser aumentada.

Geralmente, quitosana requer um meio ácido para dissolução.Por dissolver quitosana em um ácido apropriado, o sal de quitosana é obtidoquando da secagem. Os sais de quitosana apropriados incluem cloreto dequitosana, glutamato de quitosana, lactato de quitosana, maleato de quitosana,maleato de quitosana, malonato de quitosana, succinato de quitosana, formatode quitosana, aspartato de quitosana, acetato de quitosana, propionato dequitosana, nitrato de quitosana, nicotinato de quitosana, e adipato dequitosana. Por exemplo, glutamato de quitosana é quitosana convertida naforma de sal glutamato por dissolução da quitosana em ácido glutâmico. Oácido glutâmico está presente em uma quantidade estequiométrica para onúmero de unidades GlcN. O cloreto de quitosana contém uma quantidadeestequiométrica de cloridrato par ao número de unidades de GlcN.

Os sais de quitosana são solúveis em água e o pH de umasolução a 1% de sal quitosana está tipicamente entre 4 e 6. As propriedadesfuncionais de quitosana são influenciadas pelo grau de desacetilação e o pesomolecular e a distribuição de peso molecular. De modo apropriado, o grau deacetilação está na faixa de 40% a 100%, preferivelmente 50% a 100%. Emalgumas formas de realização, o grau de acetilação é preferivelmente 80 a99%, mais preferivelmente 80 a 95%. Os pesos moleculares apropriados estãona faixa de 10 kDa a 1000 kDa.

As quitosanas modificadas apropriadas contém porçõescovalentemente ligadas à quitosana, por exemplo quitosana copulada compeptídeo. As quitosanas modificadas podem ser adaptadas sob medida sobmedida por seleção de porções e sua concentração na quitosana modificada demodo a adicionar, modificar ou alterar as propriedades ou funcionalidades daquitosana como capacidade de reticulação, solubilidade, taxa debiodegradabilidade da capacidade de ligar, por exemplo células específicas,farmacêuticos ou peptídeos.

Um outro biopolímero preferido compreende ácido hialurônico(HA), sais do mesmo e hialuronato modificado. O ácido hialurônico de umafonte não animal é preferido para uso na presente invenção. O ácidohialurônico é um copolímero linear compósito de (β-1,4) ligado D-glucuronato (D) e (β-1,3)-N-acetil-D- glucosamina (Ν). A estrutura helicoidalde hialuronato pode coletar aproximadamente 1000 vezes seu peso em água.Estas características dão à molécula propriedades físico-químicas vantajosasassim como funções biológicas distintas e é desejável usar como um bloco deconstrução para os materiais biocompatíveis e biointerativos na liberação defármacos, engenharia de tecidos e visco suplementação.

Os hialuronatos modificados apropriados incluem os contendoporções covalentemente ligadas aos hialuronatos e podem incluir por exemplohialuronatos copulados em peptídeos. Um hialuronato modificado preferidode modo apropriado tem um grupo carboxila covalentemente modificado e/ougrupo hidroxila nas unidades de monômero DeN respectivamente. Oshialuronatos modificados podem ser adaptados sob medida por seleção deporções e sua concentração nos hialuronatos modificados para adicionar,modificar ou alterar as propriedades ou funcionalidades dos hialuronatoscomo capacidade de reticulação, solubilidade, taxa de biodegradabílidade ou acapacidade de ligar, por exemplo, células específicas, farmacêuticos oupeptídeos.

O ácido hialurônico desempenha, como se pensa, um papelimportante nos estágios iniciais de cicatrização de tecido conectivo ecicatrização de feridas fetais sem cicatriz e regula a mobilidade, adesão eproliferação de células e é especialmente utilizável em aplicações deengenharia de tecidos e regeneração de tecidos.

O agente espumante é preferivelmente biologicamenteaceitável assim permitindo o uso com relação ao corpo humano ou animal empor exemplo controle de feridas, como um bioadesivo ou em outras aplicaçõesno corpo humano ou animal. Em uma forma de realização preferida, o agenteespumante compreende um agente espumante polimérico que produz de modoapropriado uma espuma úmida resistente ao colapso de espuma. O agenteespumante pode ser um material único ou uma mistura de materiais queajudam na espumação. Os agentes espumantes que não são biologicamenteaceitáveis não são geralmente apropriados para uso em espumas para uso emaplicações médicas. Em uma forma de realização especialmente preferida, aespuma é substancialmente isenta de tensoativos não poliméricos e outrosagentes espumantes não biologicamente aceitáveis.

Os agentes espumantes poliméricos como hidrocolóides, sãogeralmente preferidos para aplicações biológicas porque eles geralmente nãoIixiviam da espuma resultante como os tensoativos. Os exemplos dehidrocolóides apropriados incluem metil celulose, hidroxipropil metilcelulose, (HPMC), hidróxi propil celulose, (HPC), hidroxi etil celulose,(HEC), alginatos de albumina e glicol, como alginato de propileno glicol.Para algumas aplicações, pode ser vantajoso adicionar um polissacarídeoadicional, por exemplo um derivado de celulose, como carboximetil celulose,além do agente espumante. O agente espumante polimérico é preferivelmentesolúvel em água de modo que uma espuma homogênea é produzida. Osagentes espumantes solúveis em água especialmente preferidos incluemalbumina e hidroxi propil metil celulose, como eles produzem bolhaspequenas que resultam em poros finos na espuma.

Quando as espumas reticuladas secas contendo níveis elevadosde cálcio são embebidas em água, a estrutura da espuma tipicamente nãorompe devido ao nível elevado de reticulação da espuma. No entanto, oscomponentes solúveis na espuma, incluindo agente espumante solúvel emágua, como hidroxipropil metil celulose, podem difundir da espuma. Estaperda de agente espumante pode ser reduzida ou evitada em, por, umaaplicação de cicatrização de feridas, pelo uso de um agente espumante quenão é solúvel sob condições de uso. Alguns agentes espumantes formam géisna temperatura do corpo, por exemplo metil celulose forma géis acima de35°C. Quando usando uma espuma que compreende metil celulose como oagente espumante em uma aplicação em que a espuma está na temperatura docorpo, a metil celulose pode permanecer no estado geleificado e permanecerna espuma e contribuir para a resistência no estado úmido da espuma.

Quando um agente espumante polimérico como hidroxi propilmetil celulose é usado, a concentração do agente espumante polimérico nadispersão aquosa é tipicamente cerca de 0,5% em peso a cerca de 6% empeso, preferivelmente cerca de 1% em peso a cerca de 4% em peso, maispreferivelmente cerca de 1,5 a cerca de 2% em peso. Isto produz uma espumaque compreende cerca de 3% em peso a cerca de 37% em peso,preferivelmente cerca de 6% em peso a cerca dè 25% em peso, maispreferivelmente cerca de 6% a cerca de 12,5% em peso, do agente espumantepolimérico, excluindo água e qualquer aditivo ou aditivos que possam estarpresentes na espuma.

O polímero enzimaticamente biodegradável pode serpreparado de modo que ele irá dissolver após hidratação ou a espuma pode serpreparada para permanecer estruturalmente intacta quando hidratada porreticulação. Por exemplo, uma espuma de quitosana não reticulada pode serpreparada por dissolução de um sal de quitosana (como PROTASAN UP CL)em água ou em uma solução de sal. Uma espuma úmida pode ser preparadausando um misturador, por exemplo um misturador de cozinha equipado comum batedor de metal para aerar uma solução aquosa do polímeroenzimaticamente biodegradável junto com outros ingredientes comoplastificantes por exemplo, glicerina e/ou sorbitol ou um agente espumantepor exemplo hidroximetil celulose, e albumina. A estrutura de poro daespuma é estabilizada pelo agente espumante e a estrutura congelada porsecagem da espuma, em temperatura ambiente ou elevada por exemplo emum forno. A espuma também pode ser preparada por técnicas de secagem porcongelamento.

A espuma pode ser reticulada. A reticulação pode ser obtidapor adição de um componente iônico ao biopolímero ou por uso de um agentede reticulação covalente. O biopolímero na espuma pode ser reticulável demodo iônico ou covalente mas não precisa ser reticulável. SE a espuma forusada para fazer um compósito por adição de um polissacarídeo solúvel àespuma, de modo apropriado a espuma ou um componente da espuma, porexemplo íons formadores de gel, é reticulável com o polissacarídeo solúvel. Areticulação pode ser obtida por adição de um componente iônica aobiopolímero ou por uso de um agente de reticulação covalente. Uma soluçãoaquosa de um íon pode ser adicionada à espuma de biopolímero que é aeradade modo apropriado antes da moldagem. A adição do componente iônicocausa, de modo apropriado, a formação de um gel e este pode ser moldado.

Alternativamente, o componente iônico pode ser adicionado à espuma úmidade modo apropriado após a espuma ser moldada em um molde por exemplopor pulverização, antes da secagem.

Quando um biopolímero positivamente carregado éempregado, por exemplo quitosana, um componente iônico negativamentecarregado, por exemplo tripolifosfato ou citrato de sódio, podem serempregados para efetuar a reticulação. Em uma forma de realização preferida,β- glicerofosfato pode ser adicionado a um biopolímero positivamentecarregado na solução úmida antes da etapa de misturação e a geleificaçãopode ser induzida após moldagem por aumento da temperatura. Outros íonsmultivalentes como molibdatos podem ser usados para reticular as espumasde quitosana. Os reticuladores descritos em Berger et al, (2004) "Structureand interactions in covalently and ionically crosslinked chitosan hydrogels forbiomedical applications" European Journal of Pharmaceutics, 57, 19-34,também podem ser utilizáveis na produção de espumas de quitosana.

A reticulação do polímero enzimaticamente biodegradávelpode ser obtida usando um agente de reticulação covalente conhecido na arte,ore um epóxido.

Como desejado, uma película de biopolímero pode sermoldada também na espuma como um material de forro.Os plastificantes apropriados e outros ingredientes ou aditivosincluem os descritos em WO 2005023323 (Gaserod), cujas descrição éincorporada por referência aqui.Os modificadores de pH apropriados sãoselecionados de acordo com a natureza da espuma, por exemplo quitosana épositivamente carregada e o hialuronato é negativamente carregado.

A presente invenção é particularmente apropriada para uso emaplicações biomédicas. Estas aplicações podem incluir a liberação de produtosfarmacêuticos ou aplicação tópica ou ser para uso externo, por exemplo paracrescimento de tecido, regeneração de tecido ou aplicações em feridas ou parauso interno como implantes ou controle de feridas internas. O biopolímeropode ser usado em diferentes níveis de pureza dependendo da aplicação. Osmateriais de quitosana e alginato ultra puros são biocompatíveis e tem umapureza suficiente para permitir o implante em um mamífero, preferivelmenteem um humano.

A invenção ainda inclui combinações de composições deespuma, por exemplo uma espuma de alginato fixada em uma espuma debiopolímero enzimaticamente biodegradável por exemplo por adição de umaespuma de biopolímero seca ou úmida para uma espuma de alginatogeleificada úmida e então secando. A estrutura de espuma de alginato /espuma de biopolímero provê, de modo apropriado, propriedades melhoradascomo resistência mecânica. Em uma forma de realização preferida, umcompósito compreendendo uma espuma de quitosana e uma espuma dealginato geleificada pode ser empregada para transportar as células para usoem aplicações biomédicas.

As espumas de acordo com a invenção são flexíveis, elaspodem ser cortadas em forma desejada e ser comprimidas. As propriedades daespuma podem ser variadas por vários parâmetros incluindo a quantidade dear incorporado, o tipo de biopolímero, o peso molecular e a composição dobiopolímero, concentração, a quantidade de reticulação e não reticulação, e aespessura da espuma. O biopolímero empregado na espuma é biocompatível.Ao variar a quantidade de reticulação e porosidade, a integridade da espuma ea degradação da espuma podem ser controladas, o que torna a espumautilizável para muitas aplicações.

Em uma forma de realização preferida, a espuma contém íonsformadores de gel adicionados apropriado para a geleificação de uma soluçãode polissacarídeo subseqüentemente adicionada que é absorvida nos poros daestrutura de poros abertos da espuma. Os íons formadores de gel podemcompreender íons monovalentes e polivalentes, tipicamente íons divalentese/ou trivalentes, ou uma mistura de íons capazes de geleificar o polissacarídeona solução de polissacarídeo adicionada. Os íons formadores de gel parapolissacarídeos específicos são bem conhecidos da literatura. Para alginatos,os cátions polivalentes apropriados incluem por exemplo cálcio (2+), bário(2+), estrôncio (2+), ferro (2+), zinco (2+), cobre (2+), e alumínio (3+). Oscátions preferidos são cátions de metal divalente, mais preferivelmente ocátion cálcio (2+). Os íons formadores de gel adicionados podem serincorporados por uso de uma solução de sal apropriada durante a fabricaçãoda espuma ou podem ser adicionados durante ou subseqüente à fabricação daespuma por exemplo por pulverização ou embebimento de uma solução desal.

Em um outro aspecto, a invenção provê um método depreparação de compósitos estéreis tendo, por exemplo, células, fármacos ouparticulados imobilizados em géis dentro de uma espuma seca estéril deacordo com a invenção. Os compósitos são formados de modo apropriado pormisturação de uma solução de polissacarídeo (como solução de alginatoestéril) compreendendo um polissacarídeo solúvel tendo sítios de geleificaçãoe um componente funcional como células, fármacos e particulados paraformar um componente líquido, adicionando o componente líquido a umaespuma de acordo com a invenção (como uma espuma de quitosana seca,estéril) tendo uma rede de poros abertos e poros contendo íons formadores degel incorporados, e reagindo os sítios de geleificação do polissacarídeosolúvel com os íons formadores de gel para formar um gel que imobiliza ascélulas, fármacos ou particulados dentro dos poros.

De modo apropriado, a espuma, o compósito ou umdispositivo contendo o compósito é esterilizada, preferivelmente porirradiação γ, Ε-feixe, óxido de etileno, autoclavagem ou contato da espumacom álcool antes da adição do componente líquido ou contatando com gasesNOx, esterilização com plasma de gás hidrogênio. A esterilização não deveser empregada se ela afetar de modo adverso o compósito, ou um componentefuncional contido no compósito.

As aplicações para o compósito estéril incluem imobilizaçãodas células e/ou proliferação das células para aplicações de cultura de tecidoin vitro ou in vivo, terapia celular e órgãos artificiais, um sistema dedistribuição usado in vivo para a liberação controlada, para o controle deferidas, ou como uma camada anti-adesão in vivo. Os polissacarídeos ultrapuros possuindo um teor baixo de endotoxinas e um perfil de segurançadocumentado são usados, ou para a espuma ou como o polissacarídeo solúvel,ou ambos, como apropriado, dependendo de qual estrutura se destina aimplantar em animais e humanos vivos. Por um teor baixo de endotoxina,significa-se que o teor de endotoxina não deve exceder, por exemplo, o teorde endotoxina recomendado pelo US Food and Drug Administration, para umdispositivo implantável. As diretrizes regulatórias atuais estabelecem que odispositivo não pode liberar mais do que 350 unidades de endotoxina (EU)para o paciente. Os polissacarídeos ultrapuros possuindo um baixo teor deendotoxinas por exemplo menos que 350 EU/g,. preferivelmente menos que100 EU/g, podem ser usados, ou para a espuma ou como o polissacarídeosolúvel, ou ambos, como apropriado, dependendo de se a estrutura é destinadaa implante em animais e humanos vivos. Por exemplo, quando alginatos sãousados para implante dentro do corpo humano, os alginatos de modoapropriado tem um teor de endotoxina de menos do que 100 EU/g. Em umaforma de realização preferida, o compósito tem um teor de endotoxina menordo que 10 EU/g.

As células imobilizadas no compósito podem ser implantadasem animais em que o gel atua como uma barreira imune e evita a detecçãopelo sistema imune, assim permitindo o implante de xenoenxertos. De modoapropriado, estrôncio pode ser usado como íons formadores de gel quando ascélulas animais são desejadas para implante (xenoenxertos) porque quandousando este tipo de órgão artificial, é importante que as células não cresçamfora do compósito implantado e se tornem expostas ao sistema imune. Ocompósito também pode ser usado para estabelecer xenoenxertos de células,tumor e tecido em animais para, por exemplo, pesquisa de câncer. Aimobilização de agregados multicelulares, como ilhotas de Langerhans, nocompósito, permite que referidos agregados multicelulares sejam implantadosem animais ou humanos sem rejeição imune e estes agregados de célulasimplantadas podem então funcionar como um órgão artificial produzindo, porexemplo, insulina.

As culturas de células podem ser usadas para fabricar muitosmateriais biológicos, por exemplo enzimas, hormônios, imunobiológicos(como anticorpos monoclonais, interleucinas, linfocinas) e agentes anticâncer.As células podem ser cultivadas em compósitos de acordo com a invençãopara aumentar o número total de células. Por exemplo, as células isoladas deum paciente podem ser cultivadas em um compósito da invenção paraaumentar o número de células, as células podem então ser recuperadas docompósito e usadas em aplicações de engenharia de tecidos. As culturas decélulas em um compósito de acordo com a invenção podem ser tambémusadas para explorar, caracterizar e especificar a diferenciação celular e ocrescimento para produzir tecido como estruturas. Por exemplo, as células sãoafetadas pelo estresse externo e modificar a elasticidade dos materiais deespuma ou compósito (gel/ espuma) pode influenciar a expressão dos genes.

As espumas e compósitos de acordo com a invenção podemser usados no tratamento de corpo humano ou animal para evitar a adesãoentre tecidos. As intervenções cirúrgicas podem causar conglutinação oucrescimento junto de tecidos, por exemplo entre os músculos, entre músculose tendões ou nervos ou outros tecidos. Para evitar este crescimento de tecidosindesejado, uma camada anti-adesão pode ser inserida entre os músculos,músculos e tendões ou nervos para cobrir a ferida e evitar a formação deaderências pós-operativas durante o processo de cicatrização.

As espumas e compósitos da presente invenção podem serformulados para uso como uma camada anti-adesão por seleção de materiaispor exemplo uma espuma de hialuronato no compósito e íons geleificantesque retardam ou evitam o crescimento celular e a intrusão na camada anti-adesão assim evitando a adesão entre os tecidos durante a cicatrização. Aespuma é engenheirada de modo apropriado a partir de materiaisbiodegradáveis que dissolvem á medida que a ferida cicatriza (por variaçãoapropriada da quantidade de íons reticulantes, tipo de polímero, concentraçãode polímero) e são degradadas ou excretadas do corpo.

Dependendo das propriedades de formulação, a espuma oucompósito pode ser formulado para degradar durante vários períodos detempo e assim liberar materiais imobilizados como agentes terapêuticos ouagentes de regeneração de tecido. Um uso preferido da invenção é no reparode tecido em que material orgânico ou inorgânico pode ser imobilizado dentrodo compósito e atuar como uma armação para a regeneração do tecido. Um talexemplo deve ser a inclusão de hidroxiapatita no gel dentro da espuma eentão implantado em ou fixado a um defeito do osso a fim de induzir aregeneração do osso na espuma ou compósito espuma / gel. Outro tal exemplodeve ser a inclusão de substâncias atraentes de células ou quimiotáticas dentrodo compósito seguido por implante do compósito em um sítio de dano aotecido a fim de promover a regeneração do tecido.

A rigidez do compósito e do gel em que células estãoimobilizadas são fatores importantes para o comportamento celular uma vezque parece que as propriedades mecânicas do gel regulam a proliferação e adiferenciação foi observada com base no tipo celular. A rigidez do gel (comocaracterizada, por exemplo, por módulo elástico) em que a célula éimobilizada determina a grandeza da força gerada do exoesqueleto e aextensão de disseminação celular que se segue. As propriedades do gel sãovariadas por concentração de polissacarídeo, saturação de íons formadores degel, e tipo de íons formadores de gel. Em adição, polissacarídeos podem serquimicamente modificados adicionando seqüências de peptídeo para adesãocelular, tal como as seqüências de peptídeo de adesão celular, tal como otripeptídeo de RGD.

Quando compósitos devem serem usados como aplicações dedistribuição controlada, por exemplo de fármacos, fatores de crescimento,nutracêuticos, aromas ou fragrâncias, as propriedades mecânicas e químicaspodem ser modificadas para liberação adequada no ambiente desejado.

As espumas secas da presente invenção podem geralmenteconter um teor de água, em uma base de porcentagem de peso, de menos de40% por peso de todos os componentes na espuma seca, maisespecificamente, menos de 35%, menos de 30%, menos de 25%, menos de20%, menos de 15%, menos de 10%, menos de 5%, menos de 3%, menos de2%, menos de 1%, de todos componentes na espuma seca.

As espumas absorventes secas são capazes de absorverqualquer líquido, por exemplo, água, fluidos corporais, etc.

Glossário

Albumina Albumina Bovina, Fração V, aproximadamente 99% (A-3059)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,CaCl2CaCO3

GDLGlicerina

HanksHPMC

Na2HPO4trifosfato de Na

PRONOVA UP MVGPRONOVA UP LVG

PRONOVA SLG 20

Steinheim, Alemanha )

cloreto de cálcio diidratado (1,02382,1000) (MerckKgaA, Darmstadt, Alemanha )HuberCAL 500 Elite, Carbonato de cálcio, tamanhode partícula ~ 4.2 μηι (Huber Engineered Materials,Hamina, Finlândia)

Glucono δ-lactona (Roquette, Alessandria, Itália )Glicerina, Ph. Eur. (VWR Prolabo, Leuven,Bélgica)

Solução de sal balanceada de Hank; (H8264)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,Alemanha )

Pharmacoat 603, Tipo de substituição 2910,

hipromelose USP, (hidroxipropilmetilcelulose)

(Shin-Etsu Chemical Co. Ltd., Japão)

Fosfato de hidrogênio dissódico, art: 30427 (Riedel-

de Haen, Seelze, Alemanha)

Trifosfato de sódio pentabásico (T5883-500G)

(Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,

Alemanha )

Alginato de sódio, lote: 701-256-11, viscosidade

(1% em peso de solução aquosa a 20°C) = 385 mPas

(NovaMatrix, Oslo, Noruega

Alginato de sódio, lote: FP-502-04, viscosidade (1%

em peso de solução aquosa a 20°C) = 50 mPas

(NovaMatrix, Oslo, Noruega

Alginato de sódio estéril, lote: Ch.-B.221105,

viscosidade (1% em peso de solução aquosa a 20°C)

= 36 mPas (NovaMatrix, Oslo, Noruega)PROTASAN CL 210 (214) Cloreto de quitosana, lote: 708-783-01,desacetilação:94,5%, pH = 5.3, viscosidade de 1%de solução aquosa a 20°C = 77 mPas (NovaMatrix,Oslo, Noruega)

PROTASAN UP CL 213 Cloreto de quitosana ultrapuro, lote: FP-104-02, viscosidade (1% em peso de solução aquosa a20°C) = 74 mPas, grau de desacetilação = 86%(NovaMatrix, Oslo, Noruega)

Hialunorato de sódio Tipo Parma 80, lote: 17053P, peso molecular:

1,08*106 g/moles (NovaMatrix para Kibun Food

Kemifa Co., Ltd., Kamogawa, Japão)

Sorbitol especial 70% de solução de sorbitol (SPI Polyols, New

Castle, DE, USA)

Sorbitol D(-)sorbitol para bioquímica, seco, 100% (Merck,

KGaA, Darmstadt Alemanha )

Exemplos

Exemplo 1

Este exemplo apresenta um método de produzir espumas dequitosana e suas características relacionadas à densidade e absorção.

Uma solução aquosa contendo 4% de sal de quitosana foipreparada usando PROTASAN CL 210 (214). 77,0 g Água de MQ e 14,Og desorbitol (seco) foram adicionadas ao recipiente de mistura e o sorbitol foramdissolvidas gentilmente girando o recipiente. 100 g da solução de quitosana,6,Og de glicerina e 3,0 g HPMC foram adicionadas ao mesmo recipiente demistura. A dispersão foi combinada com um misturador de cozinha Hobartequipado com um batedor de metal em velocidade média por um minuto paragarantir homogeneidade. A mistura continuou em velocidade rápida de 2,5minutos. A densidade no estado úmido foi medida para ser 0,23 g/ml(determinada do peso da espuma úmida necessário para encher um recipientede 100 ml). A espuma úmida foi moldada em moldes de 2 mm e 4 mm dealtura revestidos com Teflon e então colocados em uma estufa de secagem a80°C durante 30 minutos e 60 minutos, respectivamente.

Outra espuma foi feita pelo procedimento como acima, mas aespuma úmida foi moldada em um molde de 8 mm de profundidade. Aespuma foi seca a 80°C durante 1 hora e então 3 horas a 40°C

As espumas secas resultantes eram macias e flexíveis com umarede de poros abertos. Quando água foi adicionada à espuma ela foiimediatamente absorvida e a espuma expandiu significantemente. A espumahidratada conservou seu formato, mas foi relativamente fraca em que aespuma úmida não poderia ser transferida em um pedaço ao se elevar amesma em canto. A compósito da espuma seca antes da hidratação não afetouvisivelmente a faixa de absorvência da espuma ou capacidade de absorção.

Para medir a capacidade de absorção, pedaços de espumaforam cortados em 3,5 cm por 3,5 cm com o uso de um escalpelo. Um pedaçode espuma foi pesado e colocado em uma malha (diâmetro de 0,71 mm) esolução de sal balanceada de Hank, como uma solução fisiológica de modelo,foi adicionada usando uma pipeta. Líquido em excesso foi adicionado e asespumas tornaram-se transparentes. Quando nenhum pingo do pedaço deespuma foi observado, o peso da espuma úmida foi medido. A densidade noestado seco e a capacidade de absorção de três espumas diferentes forammedidas, e os resultados são apresentados na tabela 1.

Tabela 1: Densidade no estado seco e capacidade de absorção de uma soluçãofisiológica de modelo de espumas de quitosana de espessura diferente (n=3, ±desvio padrão).

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Exemplo 2Este exemplo apresenta um material de espuma de duascamadas feito compreendendo espuma de alginato como a primeira camada eespuma de quitosana como uma segunda camada presa à espuma de alginato.Esse tipo de compósito pode ser usado para modificar a integridade,resistência, biodegradação e capacidade de absorção da espuma de quitosana.

Uma espuma de alginato foi feita primeiro preparando umasolução aquosa contendo 4% de alginato (PRONOVA UP MVG). 111,2 g dasolução de alginato foi transferida para um recipiente de mistura. Ao mesmorecipiente, 6,0 g de glicerina, 18,Og de sorbitol especial, 3,0 g de HPMC,0,85g de CaC03 (suficiente para saturar os resíduos gulurônicos no alginatocom 125%) e 33,3 g de água de MQ foram adicionados. A dispersão foimisturada com um misturador de cozinha Hobart equipado com um batedorde metal em velocidade média de 1 minuto e 30 segundos para garantirhomogeneidade. A mistura continuou em alta velocidade durante 7 minutosantes de uma solução de GDL recém misturada de 2,69 g de GDL e 25,0 g deágua de MQ ser adicionada. A mistura continuou em alta velocidade durante1 minuto, que resultou em uma espuma com uma densidade no estado úmidode 0,23 g/ml. A espuma úmida foi moldada em moldes de 4 mm e 2 mm dealtura revestidos com protetor de banco de Versi-Dry com o lado depolietileno no sentido da espuma (Nalgene Nunc International, NY, USA) efoi mantida descoberta durante 60 minutos em temperatura ambiente.

Então, a espuma úmida de quitosana foi adicionada no topodas espumas de alginato úmidas geleificadas como camadas de 2 mm e 4 mm(aumentando a altura do molde) para o topo das espumas de alginatogeleificadas de 2 mm e 4 mm de espessura, respectivamente. A espuma dequitosana foi feita como descrito no Exemplo 1 exceto que 18,0 g de sorbitolespecial foram usados em vez de sorbitol seco e 73,0 g de água de MQ foramadicionados a essa espuma. O tempo de mistura em velocidade média foi de 2minutos e então 3 minutos de misturação em alta velocidade, que resultou emuma espuma com uma densidade no estado úmido de 0,22 g/ml. Os moldescom espumas de duas camadas foram então colocados em uma estufa desecagem a 80°C durante 1,5 horas antes de serem transferidas para um forno a37°C e a secagem continuou durante a noite.

As espumas secas resultantes eram macias e flexíveis com umarede de poros abertos. Os poros na parte de espuma de alginato forammenores que na espuma feita de quitosana. Não foi possível separar os doistipos de espuma após secagem. Cada camada de espuma absorveu águainstantaneamente (o tempo de absorção da primeira gota foi menos de 1segundo para a espuma de quitosana e cerca de 3 segundos para a espuma dealginato) e elas permaneceram juntas após hidratação.

A parte de alginato hidratado da espuma hidratada tinha umaresistência à tração elevada considerando que a parte de quitosana hidratadaera muito fraca. Pedaços da espuma de quitosana hidratada romperam-sequando um dedo foi empurrado contra o lado da espuma de quitosana ouquando a espuma de quitosana foi esticada empurrando contra o ladocontrário (espuma de alginato). A falha não foi deslaminação.Exemplo 3

Este exemplo descreve um método para reticular uma espumade quitosana para torná-la mais estável relacionada à biodegradação e proveruma maior integridade no estado úmido.

Uma espuma de quitosana foi feita como descrito no Exemplo2 exceto que os tempos de mistura foram 1,5 minutos e 4,5 minutos emvelocidade média e alta respectivamente. A densidade de espuma úmidaresultante foi 0,20 g/ml. A espuma úmida foi moldada em moldes de 2 mm e4 mm de profundidade. Então, uma solução de trifosfato de Na 100 mMcarregada em uma garrafa de pulverização com o bico ajustado para dargotículas finas. A solução de trifosfato de Na foi pulverizada nas espumasúmidas em cerca de 50 ml e 100 ml para a 2 mm e a 4 mm respectivamente.As espumas úmidas absorveram um pouco da solução pulverizada, assim, aadição foi realizada várias vezes com menos de um minuto entre cada adição.As espumas úmidas foram então secas em uma estufa de secagem a 80°Cdurante 1 hora e 2 horas para as espumas moldadas em moldes de 2 mm e 4mm, respectivamente.

As espumas secas eram macias, flexíveis e tinham uma rede deporos abertos. As espumas absorveram água instantaneamente e elasdeformaram menos após hidratação e foram mais fortes que espumas dequitosana não reticuladas no Exemplo 1.Exemplo 4

Este exemplo descreve a preparação de uma espuma dequitosana que contém íons cálcio. O cálcio imobilizado na espuma dequitosana induziu a geleificação in situ de uma solução de alginato quandoesta foi absorvida pela espuma de quitosana seca. Tais estruturas podem serúteis em aplicações biomédicas para imobilização celular ou para proverliberação controlada de fármacos imobilizados, enzimas, hormônios, etc.

Uma espuma de quitosana foi feita compreendendo as mesmasquantidades e ingredientes como no Exemplo 2 exceto que 2,35 g de água deMQ foram substituídos com 2,35 g de CaCl2*2H20 (80 mM). Uma espumaúmida com uma densidade no estado úmido de 0,20 g/ml foi feita misturandoa velocidade média e alta durante 1,5 minutos e 6 minutos respectivamente. Aespuma úmida foi moldada em moldes de 2 mm e 4 mm de altura, comodescrito anteriormente. Então elas foram colocadas em uma estufa desecagem a 80°C durante 1,5 horas. As espumas secas eram macias e flexíveiscom uma rede de poros abertos e uma densidade no estado seco de 0,039 ±

o #

0,001 g/cm . A espuma absorveu água instantaneamente e teve integridade noestado úmido similar às espumas de mesma espessura no Exemplo 1. Essaespuma expandiu menos quando a solução de Hanks foi adicionada a essaespuma comparada com as espumas do Exemplo 1. A capacidade de absorçãode solução de Hanks para essa espuma foi medida para ser 16,8 ±1,9 g/g deespuma (valor médio de três amostras ± desvio padrão). Os poros dessaespuma foram um pouco maiores que os da espuma de espessura de 4 mm doExemplo 1, isso pode ser descrito por uma maior coalescência devido àviscosidade diminuída da quitosana devido à resistência iônica da solução.

Discos de espuma, a partir da espuma moldada em bandejas de4 mm de altura, foram estampados com o uso de um furador de cortiça, comum diâmetro de 2,1 cm. Um disco de espuma seca foi colocado em umreômetro de alta resolução Bohlin CVO 120 entre as placas serrilhadas(PP25). Então 500 μΐ de uma solução de alginato a 1% (PRONOVA UPLVG) foram adicionados com o uso de uma pipeta. O teor de cálcio no discode espuma é suficiente para saturar os resíduos geleificados do alginatoadicionado por 96%. Após um minuto a solução de alginato é absorvida e aespuma está perto de estar completamente hidratada. A placa superior foiabaixada para um calibre de 1.000 mm e medidas do módulo elástico, G',foram iniciadas. A freqüência, força e temperatura foram fixadas a 1 Hz,0,001 e 20°C, respectivamente. Os resultados são apresentados na tabela 2.Tabela 2: O módulo elástico, G', como uma função de tempo para espumas dequitosana adicionadas com solução de alginato e água (n=3).

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O valor elevado de G' para os discos de espuma adicionadoscom solução de alginato e o aumento em G' durante os minutos logo apósadição, confirma a doação de íons formadores de gel à solução de alginatoadicionado da espuma de quitosana.Exemplo 5

Este exemplo mostra que uma espuma de quitosana contendoíons geleificantes terão a habilidade de induzir a formação de gel de umasolução de quitosana externamente adicionada in situ.

Discos de espuma (diâmetro = 2,1 cm) foram estampados como uso de um furador de cortiça da espuma moldada no molde de 4 mm dealtura, apresentado no Exemplo 3. Um disco de espuma foi então colocado naplaca serrilhada no mesmo reômetro como usado no exemplo anterior. Odisco foi então adicionado com excesso de solução de ou água MQ ou umasolução de quitosana 1,0% (PROTASAN UP CL 213). A placa superior(PP25) foi abaixada para um calibre de 500 μηι e uma varredura de tensão foirealizada com uma tensão de cisalhamento aplicada de 0,5 Pa a 50 Pa. Asmedidas de oscilação foram iniciadas cerca de três minutos após adição desolução. A freqüências foi ajustada 1 Hz. A varredura foi realizada duas vezespara cada adesivo de espuma. O módulo elástico, G', lido na regiãoviscoelástica linear (Gun )eo ângulo de fase são apresentados na Tabela 3.Tabela 3: G'^ e ângulo de fase medido para espumas de quitosana reticuladasadicionadas com água e solução de quitosana.

Solução adicionada

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Com base em ambos os módulos elásticos e o ângulo de fase,os resultados indicam na tabela as propriedades mais semelhantes a gel daespuma após a adição de solução de quitosana.Exemplo 6

Este exemplo mostra como o tempo de mistura e quantidadede ar incorporada nas espumas de quitosana afeta as propriedades de espumadiferentes.

Espumas de quitosana foram preparadas como descrito noExemplo 1 exceto que tempos de misturação diferentes foram usados paraobter densidades de espuma diferentes. Todos os ingredientes de espuma paracriar uma espuma úmida foram misturados em velocidade média durante 1,5minutos. Então a mistura a alta velocidade foi continuada durante 1 minutocom uma densidade no estado úmido resultante de 0,45 g/ml. Cerca da metadedas espuma foram moldadas em moldes de 4 mm e 2 mm de altura. Então aespuma restante foi misturada a alta velocidade por um minuto adicional. Adensidade no estado úmido resultante foi de 0,29 g/ml e o resto da espuma foimoldado como acima. Um procedimento similar como acima foi repetidoexceto para os tempos de mistura a alta velocidade foram primeiro de 45segundos e segundo de 4 minutos e 45 segundos. As densidades no estadoúmido foram de 0,52 g/ml e 0,18 g/ml respectivamente. As duas espumas commaiores densidades no estado úmido obtiveram uma película fina criada nasuperfície contra o molde. Isso é devido à coalescência dos poros à medidaque a espuma seca se aproxima mais lentamente do fundo. A densidade deespuma seca foi determinada estampando discos, da espuma moldada nomolde de 4 mm de altura, com um diâmetro de 1 cm com o uso de um furadorde cortiça e pesando os mesmos. As densidades e espessura medidas por umcalibrador das espumas diferentes estão apresentadas na tabela 4. As espumasforam também caracterizadas por seu módulo elástico, Ciin, com as mesmasconfigurações de reômetro descritas como no Exemplo 5 exceto a faixa detensão aplicada foi 0,5 Pa a 18 Pa, e que três varreduras para cada pedaço deespuma foram realizadas, Os resultados estão incluídos na tabela 4,apresentando os valores médios das duas últimas varreduras para três espumasdiferentes com um diâmetro de 1 cm. Os pedaços de espuma foram mantidosem 2 ml de solução de Hanks cerca de cinco minutos antes de seremtransferidos para o reômetro. A resistência à tração das espumas secas foimedida com o uso de um analisador de textura SMS e garras de tração A/TG.A força requerida para esticar a espuma a 0,5 mm/s até ruptura foi lida e aforça e distância máximas no estado esticado quando ela se rompeu sãodescritas na tabela 4.

Os pedaços de espumas foram cortados em forma de osso como uso de um escalpelo com as dimensões; 3,15 cm de comprimento, 1,75 cmde largura nas extremidades e 1,25 cm de largura no centro, o início seestreitando em 1 cm a partir das extremidades. A espuma foi cortada nessaforma para assegurar a ruptura no meio da espuma e não onde ela foi presacom as pinças. Foi usada aproximadamente 0,3 cm a partir de cadaextremidade do pedaço de espuma para prender a mesma com as garras.Tabela 4: Espumas de quitosana de densidade diferente e suas propriedades,(n = 3, ± SEM) (A espuma com densidade no estado úmido de 0,23 g/ml é a

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A tabela mostra que as espumas com as maiores densidades noestado úmido colapsaram principalmente devido à coalescência. Também foiobservado que as espumas tiveram aumento de tamanho de poro aumentandoa densidade no estado úmido. A resistência à tração e o módulo elásticodecresceram por quantidades aumentadas de ar. Também a elasticidade dosmateriais apresentada à medida que a extensão do material poderia seresticada antes dele romper diminui por diminuição da densidade no estadoúmido. Os três materiais menos densos apresentaram cerca da mesmaelasticidade.

Exemplo 7

Este exemplo descreve a preparação de espuma com o uso deum agente espumante alternativo ao usado nos exemplos anteriores.

Uma espuma de quitosana foi feita com os mesmosingredientes como descrito no Exemplo 1, exceto uma solução de albuminaaquosa (0,25 g/ml) substituiu HPMC como o agente espumante. Asquantidades de solução de quitosana e plastificantes foram iguais como noExemplo 1, e a essa mistura 75,0 g de água de MQ e 5,0 g de solução dealbumina foram adicionadas. A misturação começou em velocidade média porum minuto e continuou em alta velocidade por seis minutos. Então 2 ml dealbumina foram adicionados e mistura continuou em alta velocidade por doisminutos. A adição de 2 ml de solução de albumina e dois minutos foi repetidaoutras seis vezes até 19 ml de solução de albumina foi adicionada. A espumaresultante apresentou uma densidade no estado úmido de 0.34 g/ml. Asespumas secas no molde de 2 mm e 4 mm de altura foram secas 1 hora e 2horas respectivamente a 80°C.

A densidade no estado seco da espuma moldada no molde de 4mm de altura foi medida, como descrito no Exemplo 6, como sendo de 21,3mg/cm ± 0,2 mg/cm . A resistência à tração e elasticidade descritas peladistância esticada antes da ruptura, medida como descrito no Exemplo 6foram respectivamente de 104 g ± 5 g e 33,4 mm ± 0,8 mm.

Exemplo 8

Este exemplo descreve a preparação de um espuma de ácidohialurônico (HA) com íons de cálcio incorporados. Também a capacidade deespumas para doar esses íons para induzir a formação de gel a partir de umasolução de alginato adicionada externamente é mostrada.

Uma solução aquosa contendo 2,5% de HA foi preparada ecolocada a parte. 49,65 g de água MQ, 2,35 g de CaCl2*2H20 e 10,5 g desorbitol (seco) foram adicionados ao recipiente de misturação e osingredientes secos foram dissolvidos girando gentilmente o recipiente. 130 gda solução de HA, 4,5 g de glicerina e 3,0 g de HPMC foram adicionadas aomesmo recipiente de misturação. A dispersão foi então misturada com ummisturador de cozinha equipado com um batedor de metal em velocidademédia por dois minutos para garantir homogeneidade. A mistura continuouem alta velocidade por 3 minutos e 50 segundos. A densidade no estadoúmido foi medida para ser 0,21 g/ml (determinada do peso da espuma úmidarequerida para encher um recipiente de 100 ml). A espuma úmida foi moldadaem molde de 2 mm e 4 mm de altura revestido com Teflon e colocado emuma estufa de secagem a 80°C durante 50 minutos.

Com o uso de um furador de cortiça, discos de espuma de(diâmetro = 2,1 cm) foram estampados a partir da espuma moldada no moldede 4 mm de altura. Uma solução de alginato a 1,0% e 0,5% foi preparada dePRONOVA SLG 20 (lote: 221105) por adição de água MQ. Um disco deespuma seca foi colocado em um reômetro de alta resolução Bohlin CVO 120entre placas serrilhadas (PP25). Então 350 μΐ da solução de alginato foramadicionados com o uso de uma pipeta. O teor de cálcio no disco de espuma ébastante para saturar os resíduos geleificados do alginato adicionados por124% e 248% para a solução a 1,0% e 0,5% respectivamente. Após umminuto, a solução de alginato foi absorvida e a espuma está perto de sercompletamente hidratada. A placa superior foi então abaixada para um calibrede 500 μm e medidas do módulo elástico, G', foram iniciadas. A freqüência,força e temperatura foram ajustadas para 1 Hz, 0,001 e 20°C respectivamente.Os resultados são apresentados na tabela 5.

Tabela 5: Módulo elástico, G', como uma função de tempo após adição deágua e soluções de alginato à espuma de HA com íons cálcio incorporados.

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O aumento de G' durante os minutos logo após a adição dasolução de alginato, confirma a doação de íons geleificantes e que uma reaçãode geleificação foi iniciada. A diferença no valor de G' entre as três soluçõesconfirma que um gel está sendo criado e que o gel mais forte é criado a partirda solução de alginato mais concentrada.

Exemplo 9

Este exemplo descreve a preparação de uma espuma de HAcom íons fosfato incorporados. Também a capacidade de espumas para doarestes íons de modo a induzir a geleificação de uma solução de quitosanaadicionada externamente é mostrada.

A espuma de HA foi feita como descrito no Exemplo 8, excetoque a fonte de cálcio foi substituída com 2,27 g de Na2HPO4 e a quantidadede água usada foi 49,7 g. O tempo de misturação em alta velocidade foi 3minutos, dando uma densidade no estado úmido de 0,17 g/ml. As espumasmoldadas em moldes de 2 mm e 4 mm foram mantidas na estufa de secagem a80°C durante 45 min e 75 min respectivamente.

Os mesmos parâmetros para medidas reológicas como descritono Exemplo A foram usados. Água e solução de quitosana a 1,0% foramadicionadas em quantidade em excesso. Os valores descrevendo o móduloelástico, G', e ângulo de fase foram nivelados nos valores apresentados natabela 6.

Tabela 6: Módulo elástico. G'. e ângulo de fase de espumas de HA reidratadascom íons fosfato incorporados.

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Os resultados indicam que a espuma adicionada com soluçãode quitosana obtém um comportamento mais similar a gel e é mais rígida quea espuma adicionada com água MQ.

Claims (38)

1. Método para formar uma espuma absorvente seca tendouma rede de poros abertos e poros, caracterizado pelo fato de ser por:a. formação de uma espuma úmida a partir de uma dispersãoaquosa compreendendo um polissacarídeo; um agente espumante;opcionalmente um plastificante; opcionalmente um agente reticulante;opcionalmente íons formadores de gel; opcionalmente um ou mais aditivos; eágua;b. misturação da espuma a partir da dispersão aquosa,opcionalmente por agitação mecânica;c. moldagem ou conformação da espuma úmida eopcionalmente formação de uma espuma reticulada; ed. secagem da espuma para formar uma espuma secaopcionalmente por secagem a ar e opcionalmente ainda moldagem,conformação, ou compressão da espuma seca.

2. Método para formar uma espuma absorvente secacompreendendo uma rede de poros abertos e íons formadores de gel,caracterizado pelo fato de ser por:e. formação de uma dispersão aquosa compreendendo umpolissacarídeo; um agente espumante; íons formadores de gel, opcionalmenteum plastificante; opcionalmente um modificador de pH; opcionalmente um oumais aditivos e água;f. preparação de uma espuma a partir da dispersão aquosa; eg. secagem da espuma para formar uma espuma seca de porosabertos contendo poros e íons formadores de gel;em que a quantidade de íons formadores de gel adicionados irásaturar menos do que 25% dos sítios de geleificação do polissacarídeo.

3. Método para formar uma espuma absorvente secacompreendendo uma rede de poros abertos e íons formadores de gelapropriados para a geleificação de uma solução de polissacarídeosubseqüentemente adicionada, caracterizado pelo fato de ser por:a) formação de uma dispersão aquosa compreendendo umpolissacarídeo; um agente espumante; pelo menos um íon geleificante que nãogeleifica o polissacarídeo, opcionalmente um plastificante, opcionalmente ummodificador de pH, opcionalmente um ou mais aditivos e água;b) formação de uma espuma a partir da dispersão aquosa; ec) secagem da espuma para formar uma espuma seca contendoporos abertos e íons formadores de gel apropriados para a geleificação de umasolução de polissacarídeo subseqüentemente adicionada.

4. Método para formar uma espuma absorvente seca tendouma rede de poros abertos e poros, caracterizado pelo fato de ser por:a) preparação de uma dispersão aquosa compreendendo umbiopolímero enzimaticamente biodegradável ou polissacarídeo e um agenteespumante, e opcionalmente um ou mais dentre íons formadores de gel, umplastificante, um agente reticulante, e um modificador de pH;b) formação, preparação ou misturação de uma espuma,preferivelmente uma espuma úmida, a partir da dispersão aquosa,opcionalmente por agitação mecânica;c) opcionalmente moldagem ou conformação da espuma eopcionalmente formação de uma espuma reticulada; ed) secagem da espuma para formar uma espuma seca contendoporos abertos.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo ou biopolímero éselecionado dentre quitosana, quitosana modificada, quitosana ultrapura,quitosana modificada ultrapura, hialuronatos, hialuronato ultrapuro,hialuronato modificado, hialuronato modificado ultrapuro ou misturas dosmesmos.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que o polissacarídeo ou biopolímero é quitosana, hialuronato ou umamistura dos mesmos.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que o polissacarídeo ou biopolímero compreende quitosana tendo umgrau de desacetilação de 40% a 100%.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 areivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo oubiopolímero compreende quitosana tendo um peso molecular de pelo menos 10kDa.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que a quitosana tem um peso molecular na faixa de 10 kDa à faixa de 1000 kda.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o agente espumante compreendeum agente espumante polimérico.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o agente espumante compreendeum agente espumante biologicamente aceitável para uso como o corpohumano ou animal.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o agente espumante compreendeum agente espumante biologicamente aceitável, polimérico, para uso no corpohumano ou animal, que é substancialmente livre de tensoativo não polimérico.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o agente espumante é selecionadodentre hidroxipropil metil celulose e albumina.l

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de compreender a reticulação da espuma.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a reticulação é iônica ou covalente.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que os íons formadores de gel sãoadicionados à espuma durante ou subseqüente à sua produção, referidos íonsformadores de gel sendo capazes de formar um gel com uma solução depolissacarídeo subseqüentemente adicionada.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de ainda compreender a etapa de adicionar uma solução depolissacarídeo à espuma compreendendo os íons formadores de gel paraformar um gel nos poros da espuma.

18. Espuma absorvente seca tendo uma rede de poros abertos,caracterizada pelo fato de compreender:i) um biopolímero enzimaticamente biodegradável selecionadodentre quitosana, quitosana modificada, quitosana ultrapura, quitosanamodificada ultrapura, hialuronato, hialuronato ultrapuro, hialuronatomodificado, hialuronato modificado ultrapuro ou misturas dos mesmos; eii) um agente espumante polimérico, biologicamente aceitável.

19. Espuma de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de compreender íons formadores de gel suficientes para geleificarum polissacarídeo subseqüentemente adicionado, preferivelmente solução dequitosana ou alginato.

20. Espuma de acordo com a reivindicação 18 oureivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o agente espumantepolimérico é selecionado dentre hidroxi propil metil celulose, e albumina, eopcionalmente um ou mais de outros agentes espumantes poliméricos.

21. Espuma de acordo com qualquer uma das reivindicações-18 a 20, caracterizada pelo fato de que ser enzimaticamente biodegradável.

22. Espuma de acordo com qualquer uma das reivindicações-18 a 21, caracterizada pelo fato de ter sido esterilizada por tratamento comálcool, óxido de etileno, irradiação gama, Ε-feixe, NOx ou autoclavagem.

23. Espuma de acordo com qualquer uma das reivindicações-18a 22, caracterizada pelo fato de que a estrutura de espuma absorvente secaé produzido por secagem por congelamento.

24. Espuma de acordo com qualquer uma das reivindicações-18 a 23, caracterizada pelo fato de que a estrutura absorvente é produzida porfiação de uma fibra de biopolímero e então tricotagem ou tecelagem ouformação de camadas das referidas fibras para formar um feltro.

25. Espuma de acordo com qualquer uma das reivindicações-18 a 24, caracterizada pelo fato de que a estrutura absorvente compreendeuma fibra tecida ou não tecida do biopolímero.

26. Espuma de acordo com qualquer uma das reivindicações-18 a 25, caracterizada pelo fato de compreender uma pluralidade de camadas,em que pelo menos uma camada compreende uma rede de poros abertos ecompreende íons formadores de gel apropriados para induzir a geleificação deuma solução de polissacarídeo adicionada.

27. Espuma de acordo com qualquer uma das reivindicações-18a 26, caracterizada pelo fato de compreender uma camada compreendendoquitosana, quitosana modificada, quitosana ultrapura, quitosana modificadaultrapura, hialuronato, hialuronato modificado, ou misturas dos mesmos, eaderida à camada, uma segunda camada compreendendo uma espuma dealginato.

28. Compósito caracterizado pelo fato de compreender umaespuma absorvente como definida em qualquer uma das reivindicações 18 a-27, em que a espuma compreende íons formadores de gel selecionados dentreíons formadores de gel cálcio, bário e estrôncio ou misturas dos mesmos, eum gel de polissacarídeo.

29. Compósito de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de que o gel de polissacarídeo compreende umalginato, uma pectina, um carragenano, um alginato modificado, um alginatocopulado a peptídeo, ou misturas.

30. Uso de uma espuma como definida em qualquer uma dasreivindicações 18 a 27, ou de um compósito como definido em qualquer umadas reivindicações 28 a 29, caracterizado pelo fato de ser como uma matrizpara a imobilização e/ou proliferação celular para uma aplicação em culturade tecido in vitro ou em uma aplicação de engenharia de tecido in vivo.

31. Uso de uma espuma como definida em qualquer uma dasreivindicações 18 a 27 ou de um compósito como definido em qualquer umadas reivindicações 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que a espuma oucompósito ainda compreende um agente terapêutico para prover umaliberação controlada in vivo ou tópica do agente ativo em um corpo humanoou animal.

32. Uso de uma espuma como definida em qualquer uma dasreivindicações 18 a 27 ou de um compósito como definido em qualquer umadas reivindicações 28 ou 29, caracterizado pelo fato de ser no controle de umaferida para prover um controle da ferida in vivo ou tópico.

33. Uso de uma espuma como definida em qualquer uma dasreivindicações 18 a 27 ou de um compósito como definido em qualquer umadas reivindicações 28 ou 29, caracterizado pelo fato de ser como uma barreiraantibacteriana.

34. Uso de uma espuma como definida em qualquer uma dasreivindicações 18 a 27 ou de um compósito como definido em qualquer umadas reivindicações 28 ou 29, caracterizado pelo fato de ser como um agentehemostático.

35. Uso de uma espuma como definida em qualquer uma dasreivindicações 18 a 27 ou de um compósito como definido em qualquer umadas reivindicações 28 ou 29, caracterizado pelo fato de ser como uma matrizpara a imobilização e/ou proliferação celular para aplicações em cultura detecido in vitro, e aplicações de engenharia de tecido in vivo.

36. Método para inibir a proliferação celular, caracterizadopelo fato de compreender formar uma espuma como definida em qualqueruma das reivindicações 18 a 27 ou um compósito como definido em qualqueruma das reivindicações 28 ou 29, em que a espuma ou o compósitocompreende íons estrôncio e células.

37. Método para fixar um compósito como definido emqualquer uma das reivindicações 28 ou 29 ao tecido, caracterizado pelo fatode se prender uma espuma como definida em qualquer uma dasreivindicações 18 a 27 ao referido tecido, referida espuma tendo poros abertose íons formadores de gel e adicionando um líquido compreendendo umpolissacarídeo solúvel e reagindo o polissacarídeo com os íons formadores degel.

38. Método para evitar a adesão de tecido a tecido adjacente,caracterizado pelo fato de compreender aplicar o tecido uma espuma comodefinida em qualquer uma das reivindicações 18 a 27 ou um compósito comodefinido em qualquer uma das reivindicações 28 ou 29, de modo que eleprovê uma barreira entre o tecido e o tecido adjacente.