BRPI0708480A2 - processos e composições para aperfeiçoada atividade de enzima em plantas transgênicas - Google Patents

Abstract

PROCESSOS E COMPOSIçõES PARA A APERFEIçOADA ATIVIDADE D ENZIMA EM PLANTAS TRANSGêNICAS. Esta invenção refere-se a a composição e processos para aumento de atividade de enzima através de um amplo espectro fisiológico em plantas, células de plantas, tecidos e sementes são providos. Composições incluem plantas ou partes de plantas compreendendo dois ou mais polinucleotídeos codificando polipeptídeos que são ativos através de um espectro fisiológico mais amplo que quando qualquer polinucleotídeo e expresso sozinho. Vetores compreendendo estas moléculas de polinucleotídeos assim como células hospedeiras compreendendo os vetores são ainda providas. Composições também compreendem bactéria transformada, plantas, células de plantas, tecidos e sementes. Em adição, são providos processos para produção de plantas, células de plantas, tecidos e sementes de invenção. Processos para aumento de rendimento de planta e processos para conferir resistência a um herbicida em uma planta são ainda providos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSOSE COMPOSIÇÕES PARA APERFEIÇOADA ATIVIDADE DE ENZIMA EMPLANTAS TRANSGÊNICAS".

Pedidos de Patente Relacionados

É reivindicada prioridade para pedido de patente provisório U.S.No. 60/778 283, depositado em 2 de março de 2006, e para pedido de pa-tente provisório U.S. No. 60/891 977, depositado em 28 de fevereiro de2007, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se geralmente a biologia molecularde planta.

Antecedentes da Invenção

Variações diurnas e sazonais regulam crescimento de planta.Muitos dos efeitos de variação sazonal sobre metabolismo de planta, taiscomo os efeitos de mudança de temperatura, podem ser atribuídos a taxasenzimáticas alteradas. No caso de plantas transgênicas, a atividade catalíti-ca de uma enzima ainda pode ser influenciada pela fonte genética do trans-gene antes que a planta na qual ela é expressa (Oliver et al. (1993) Mol.Gen. Genet. 239:425-434).

Plantas transgênicas comercialmente disponíveis atuais são fei-tas tolerantes a herbicidas através de expressão de uma enzima simplescom uma estreita faixa funcional de ótima temperatura efetiva. Ver, Light etal. (1999) Weed Sei. 47:644-650; Light et al. (2001) Weed Sei. 49:543-548.Estas limitações sobre resistência a herbicida são bem documentadas e fo-ram consideradas nas formulações e procedimentos de aplicação de muitosherbicidas. Por exemplo, plantas tolerantes a glifosato abrigando a enzimaEPSP sintase CP4 não são inteiramente tolerantes de glifosato para a dura-ção da estação de crescimento. Se o glifosato é usado em um momento ru-im, as plantas sofrem e rendimentos caem.

Fenótipos de resistência também podem ser objetos de adicio-nais variações ambientais e/ou a regulação diferencial de um gene de resis-tência dentro de tecidos, órgãos, compartimentos celulares, etc., de plantas.Da mesma maneira, são necessários processos na técnica para aperfeiçoa-mento de transgenes de modo que as enzimas codificadas sejam funcionaisatravés de um mais amplo espectro de condições ambientais (por exemplo,temperatura, acidez de solo, etc.) e/ou condições fisiológicas (por exemplo,pH, concentração de um substrato de enzima ou co-fator, etc.). Para satisfa-zer esta necessidade, a presente invenção provê processos de expressãode duas ou mais enzimas que desempenham a mesma ou similar função emuma planta, onde as duas ou mais enzimas têm diferentes parâmetros ciné-ticos, para obter ótima atividade de enzima através de uma faixa de condi-ções ambientais e/ou fisiológicas.

Sumário da Invenção

A presente invenção provê processos e composições para aper-feiçoada atividade de enzima em plantas transgênicas. A invenção é útilquando aplicada a plantas tais como plantas de agricultura, incluindo ambas,monocotiledôneas e dicotiledôneas.

Em um aspecto da invenção, plantas transgênicas são providas,onde as plantas têm aperfeiçoada atividade de enzima. Por exemplo, umaplanta transgênica pode compreender pelo menos (a) um primeiro polinucle-otídeo heterólogo codificando um primeiro polipeptídeo capaz de conferiruma característica de interesse, e (b) um segundo polinucleotídeo heterólo-go codificando um segundo polipeptídeo capaz de conferir a dita caracterís-tica de interesse, onde o dito primeiro e segundo polinucleotídeos são esta-velmente expressos na dita planta, e onde a dita planta mostra a dita carac-terística de interesse sobre uma faixa mais ampla de uma condição fisiológi-ca ou ambiental comparada a uma planta compreendendo o dito primeiro ousegundo polinucleotídeo expresso sozinho e submetida à dita faixa de umacondição fisiológica ou ambiental. Como um outro exemplo, uma plantatransgênica da invenção pode compreender pelo menos (a) um primeiro po-linucleotídeo heterólogo codificando um primeiro polipeptídeo capaz de con-ferir resistência a herbicida, e (b) um segundo polinucleotídeo heterólogocodificando um segundo polipeptídeo capaz de conferir a dita resistência aherbicida, onde os ditos primeiro e segundo polinucleotídeos são estavel-mente expressos na dita planta, e onde a dita planta mostra a dita resistên-cia a herbicida sobre uma faixa mais ampla de uma condição fisiológica ouambiental quando comparada a uma planta compreendendo o dito primeiroou segundo polinucleotídeo expresso sozinho e submetida à dita faixa deuma condição fisiológica ou ambiental.

Em um outro aspecto da invenção, são providos processos parapreparação de plantas transgênicas com aperfeiçoada atividade de enzima,que pelo que confere uma característica de interesse para a planta. Por e-xemplo, um tal processo pode compreender introdução na dita planta de pe-lo menos (a) um primeiro polinucleotídeo heterólogo codificando um primeiropolipeptídeo capaz de conferir a dita características de interesse, e (b) umsegundo polipeptídeo heterólogo codificando um segundo polipeptídeo ca-paz de conferir a dita característica de interesse, onde os ditos primeiro esegundo polinucleotídeos são estavelmente expressos na dita planta, e ondea dita planta mostra a dita característica de interesse sobre um espectromais amplo de uma condição fisiológica ou ambiental comparada a umaplanta compreendendo o dito primeiro ou segundo polinucleotídeo expressosozinho e submetida ao dito espectro de uma condição fisiológica ou ambi-ental. Como um outro exemplo, um tal processo pode compreender (a) pro-vimento de uma planta transgênica compreendendo um primeiro polinucleo-tídeo heterólogo codificando um primeiro polipeptídeo capaz de conferir adita característica de interesse, e (b) introduzindo na dita planta pelo menosum segundo polinucleotídeo heterólogo codificando um segundo polipeptí-deo capaz de conferir a dita característica de interesse, onde os ditos primei-ro e segundo polinucleotídeos são estavelmente expressos na dita planta, eonde a dita planta mostra a dita característica de interesse sobre um espec-tro mais amplo de uma condição fisiológica ou ambiental comparada a umaplanta compreendendo o dito primeiro ou segundo polinucleotídeo expressosozinho e submetida ao dito espectro de uma condição fisiológica ou ambi-ental.

Para conferir resistência a herbicida para uma planta, um pro-cesso representativo da invenção compreende introdução na dita planta depelo menos (a) um primeiro polinucleotídeo heterólogo codificando um pri-meiro polipeptídeo capaz de conferir resistência ao dito herbicida e (b) umsegundo polipeptídeo heterólogo codificando um segundo polipeptídeo ca-paz de conferir resistência ao dito herbicida, onde os ditos primeiro e segun-do polinucleotídeos são estavelmente expressos na dita planta, e pelo que adita planta é resistente a herbicida sobre um espectro mais amplo de umacondição fisiológica ou ambiental comparada a uma planta compreendendoo dito primeiro ou segundo polinucleotídeo expresso sozinho e submetida aodito faixa de uma condição fisiológica ou ambiental. Em um adicional pro-cesso representativo para conferir resistência a herbicida a uma planta, oprocesso compreende (a) provimento de uma planta transgênica compreen-dendo um primeiro polinucleotídeo heterólogo codificando um primeiro poli-peptídeo capaz de conferir resistência ao dito herbicida, e (b) introdução nadita planta de pelo menos um segundo polinucleotídeo heterólogo codifican-do um segundo polipeptídeo capaz de conferir resistência ao dito herbicida,onde os ditos primeiro e segundo polinucleotídeos são estavelmente expres-sos na dita planta, e pelo que a dita planta é resistente a herbicida sobre umespectro mais amplo de uma condição fisiológica comparada a uma plantacompreendendo o dito primeiro ou segundo polinucleotídeo expresso sozi-nho e submetida à dita faixa de uma condição fisiológica ou ambiental.

Em um outro aspecto da invenção, são providos processos paraaumentar vigor ou rendimento de planta através de (a) provimento de umaplanta tendo propriedades enzimáticas aperfeiçoadas como aqui descrito; e(b) tratando a planta com uma quantidade efetiva do dito herbicida.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 é a atividade de enzimas EPSP sintase resistentes aglifosato derivadas de Brevundomonas vesicularis (GRG8, SEQ ID NO:2),Arthrobacter globiformis (GRG23, SEQ ID NO:4), Enterobacteriaceae sp.(GRG1, SEQ ID NO:6) e Sulfolobus solfataricus (GRG20, SEQ ID NO:8) a-través de um amplo espectro de temperaturas. Atividade de enzima EPSPsintase em cada temperatura é plotada como uma porcentagem da atividademáxima.

A Figura 2 é um gráfico mostrando a atividade de enzimas EPSPsintase resistentes a glifosato derivadas de Arthrobacter globiformis(GRG23, SEQ ID NO: 4) e Enterobacteriaceae sp. (GRG1, SEQ ID NO: 6)como uma função da concentração de sal, expressa em mM.

A Figura 3 mostra um gráfico mostrando a taxa de formação deproduto como uma função de concentração de substrato para uma plantaexpressando quantidades iguais de uma ou ambas de duas enzimas compropriedades complementares. A curava Έ1' representa a taxa de formaçãode produto a partir de uma planta expressando uma dita quantidade de en-zima 1, onde enzima 1 tem um Km para seu substrato de 5 μΜ e um kcat des'1. A curva Έ2' representa a taxa de formação de produto de uma plantaexpressando uma dita quantidade de E2, onde E2 tem um Km para seusubstrato de 30 μΜ e um kcat de 50 s"1. A curva Έ1 + E2' representa a taxade formação de produto a partir de uma planta expressando uma dita quan-tidade de ambas E1 e E2.

A Figura 4 é um gráfico mostrando a taxa de formação de produ-to como uma função de concentração de inibidor para uma planta expres-sando quantidades iguais de uma ou ambas de duas enzimas com proprie-dades complementares. A curva Έ1' representa a taxa de formação de pro-duto a partir de uma planta expressando uma dita quantidade de enzima 1,onde E1 tem um ki de 250 μΜ, um Km para seu substrato de 10 μΜ, e umkcat de 25 s"1. A curva Έ2' representa a taxa de formação de produto a partirde uma planta expressando a dita quantidade de E2, onde E2 tem um ki de50 μΜ, um Km para seu substrato de 10 μΜ, e um k^t de 50 s"1. A curva Έ1+ E2' representa a taxa de formação de produto de uma planta expressandoa dita quantidade de ambas E1 e E2 como uma função da concentração deinibidor. A concentração de substrato é fixada (neste caso, 20 μΜ).

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção provê processos de expressão de duas oumais enzimas que desempenham uma função similar ou idêntica em umaplanta, onde as duas ou mais enzimas têm diferentes parâmetros cinéticos,para obter ótima atividade de enzima através de uma faixa de condiçõesambientais e/ou fisiológicas. Por exemplo, um aumento em atividade de cer-tas enzimas metabólicas pode resultar em aumentado ou acelerado cresci-mento e desenvolvimento de planta. Similarmente, um aumento em atividadede uma enzima que confere resistência a herbicidas, insetos, ou doenças,aperfeiçoa mecanismos protetores de planta para permitir crescimento deplanta. Plantas, tecidos de plantas, e sementes de plantas preparadas atra-vés do processo mostrado também são providas

Composições

Composições da invenção incluem plantas ou partes de plantascompreendendo um primeiro polinucleotídeo heterólogo codificando um pri-meiro polipeptídeo e um segundo polinucleotídeo heterólogo codificando umsegundo polipeptídeo que desempenha a mesma ou similar função enzimá-tica como o primeiro polipeptídeo, e onde expressão do primeiro e segundopolinucleotídeos aumenta atividade de enzima do polipeptídeos sobre umafaixa mais ampla de condições ambientais e/ou fisiológicas que expressãode qualquer polinucleotídeo sozinho.

Condições ambientais e/ou fisiológicas relevantes incluemquaisquer condições que possam resultar em atividade variável de uma en-zima de interesse em uma planta. Os identificadores ambientais e fisiológi-cos hão são mutuamente exclusivos na medida em que mudanças no ambi-ente também podem afetar condições fisiológicas dentro de uma planta. Emadição, enzimas em diferentes órgãos de planta (por exemplo, folhas, brotos,caules, flores, frutos, tubérculos, rizomas), tecidos de planta (por exemplo,tecidos de derme, solo ou vascular), e/ou compartimentos celulares de plan-ta (por exemplo, citoplasma, cloroplasto, mitocôndria) são sujeitas a diferen-tes ambientes bioquímicos que impactam ótima atividade de enzima. Condi-ções representativas incluem temperatura, pH, concentração de um substra-to de enzima ou co-fator, concentração de sal, concentração de radicais Ii-vres ou doadores de radical livre, e concentração de um inibidor de enzimaou catalisador. A faixa de condições nas quais cada enzima individual é ativa(isto é, uma faixa de temperatura ou pH) pode ser exclusiva ou de sobrepo-sição. Para duas ou mais enzimas que são ativas em uma faixa de sobrepo-sição de uma condição ambiental e/ou fisiológica, a ótima atividade de enzi-ma (por exemplo, a porcentagem de atividade máxima) é diferente entre asenzimas individuais de modo que a atividade de enzima combinada é au-mentada sobre uma faixa mais ampla de condições comparada à atividadede enzima de qualquer uma das enzimas individuais.

Como aqui usado, um aumento em atividade de enzima incluiqualquer aumento significante de atividade ou função do polipeptídeo de in-teresse, por exemplo, um aumento na inibição ou estimulação de reaçõesbiológicas ou químicas dentro de uma célula ou organismo que pode condu-j zir a aperfeiçoada ou diminuída atividade metabólica, crescimento, ou de-senvolvimento. Ensaios para medir atividade de enzima são bem-conhecidosna técnica. Um aumento em atividade de enzima observado no sistema deexpressão de componentes múltiplos mostrado (isto é, plantas expressandodois ou mais polinucleotídeos codificando polipeptídeos com a mesma ousimilar função mas diferentes propriedades cinéticas) pode compreender umnível de atividade que é cerca de 1% ou maior que um nível de atividadeobservado com qualquer componente sozinho, por exemplo, um aumento de5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 80%, 100%, 120%, ou maior.Alternativamente, um aumento em atividade de enzima observado no siste-ma de expressão de múltiplos componentes mostrado pode compreenderum nível de atividade que é cerca de 2 vezes ou maior que o nível de ativi-dade observado com qualquer componente sozinho, por exemplo, cerca de5 vezes ou mais, ou cerca de 10 vezes ou mais, ou cerca de 25 vezes oumais, ou cerca de 50 vezes ou mais, ou cerca de 100 vezes ou mais, ou cer-ca de 200 vezes ou mais, ou cerca de 500 vezes ou mais, ou cerca de 1000vezes ou mais. Enzimas de um sistema de expressão de componentes múl-tiplos podem ser referidas como primeira e segunda enzimas (ou primeira,segunda, e terceira enzimas, etc.). As designações de uma enzima como a"primeira" enzima e uma outra enzima como uma "segunda" enzima são me-ramente arbitrárias, a significância das duas enzimas sendo as diferentespropriedades enzimáticas como aqui descrito.Uma faixa mais ampla de condições ambientais e/ou fisiológicas,como usado parra descrever condições nas quais uma enzima de interesseé ativa de acordo com os processos mostrados, refere-se a qualquer exten-são na faixa da condição, tanto acima como abaixo ou ambas, dentro daqual uma enzima desempenha sua função biológica. Por exemplo, expres-são de dois polinucleotídeos codificando um polipeptídeo de interesse, ondeo primeiro e o segundo polipeptídeos têm diferentes temperaturas ótimas,resultando em um aumento em atividade de enzima do polipeptídeo de inte-resse sobre uma faixa de temperatura que é pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65°C ou mais quequando qualquer dos polinucleotídeos é expresso sozinho. Em exemplosnão-limitantes, cada polipeptídeo empregado nos processos da invençãopode ter atividade de enzima com uma temperatura ótima dentro da faixa detemperatura de cerca de O0C a cerca de 10°C, de cerca de 10°C a cerca de20°C, de cerca de 20°C a cerca de 30°C, de cerca de 30°C a cerca de 40°C,de cerca de 40°C a cerca de 50°C, de cerca de 50°C a cerca de 60°C, ou decerca de 60°C a cerca de 70°C. Plantas expressando os dois ou mais poli-nucleotídeos codificando polipeptídeos com diferentes temperaturas ótimasterão um elevado nível de atividade de enzima baseado nas atividades com-binadas das enzimas quando a temperatura se altera por todo o dia ou estação.

Por exemplo, uma planta transgênica da invenção pode compre-ender uma planta expressando um primeiro polipeptídeo tendo uma ativida-de de enzima ótima dentro de uma faixa de temperatura de cerca de 5°C acerca de 35°C, ou uma planta expressando um segundo polipeptídeo tendoatividade de enzima ótima em uma temperatura maior como comparado aoprimeiro polipeptídeo e dentro de uma faixa de temperatura de cerca de20°C a cerca de 60°C. Como um outro exemplo, uma planta transgênica dainvenção pode compreender uma planta expressando um primeiro polipeptí-deo tendo uma atividade de enzima ótima dentro de faixa de temperatura decerca de 10°C a cerca de 30°C e um segundo polipeptídeo tendo uma ativi-dade de enzima ótima em uma temperatura maior comparado ao primeiropolipeptídeo e dentro de uma faixa de temperatura de cerca de 25°C a cercade 50°C. Plantas representativas tendo as características notadas acima in-cluem uma planta expressando um primeiro polipeptídeo tendo uma seqüên-cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e um segundo polipeptídeo tendo umaminoácido de SEQ ID NO: 4, 6, ou 8, e uma planta expressando um primei-ro polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, eum segundo polipeptídeo tendo um aminoácido de SEQ ID NO: 6 ou 8. VerFigura 1.

Um processo não-limitante de aumento de espectro de tempera-tura dentro do qual uma enzima desempenha sua função biológica é introdu-zir em um organismo um ou mais polinucleotídeos codificando uma enzimade interesse derivada de organismos psicrofílicos e/ou termofílicos. Orga-nismos psicrofílicos, tais como Bacillus globisporus e Shewanella sp., sãoorganismos que vicejam em temperaturas tão baixas quanto ou menoresque 0°C. Organismos termofílicos, tais como Bacillus cadotenax, Thermusthermophilus, e Aquifex aeolicus, vicejam em maiores temperaturas, tipica-mente acima de 120°C. Várias enzimas metabólicas foram isoladas de taisorganismos (ver, por exemplo, patente U.S. 6.727.084; 6.902.915;6.921.641). A patente U.S. 6 385 546 ainda descreve um processo para au-mentar a termofilicidade (por exemplo, a habilidade de funcionar em ou aci-ma de temperatura ótima para o polipeptídeo nativo) ou psicrofilicidade (porexemplo, a habilidade de funcionar na ou abaixo da temperatura ótima parao polipeptídeo nativo) de qualquer enzima através de alteração de resíduosde aminoácidos que afetam a estabilidade do polipeptídeo sem modificaçãoou afetação de sítios ativos ou Iigantes do polipeptídeo. A presente invençãoabrange tais modificações quando pretendida para aumentar a desejada ati-vidade de uma enzima através de introdução em uma planta de pelo menosdois polinucleotídeos codificando pelo menos dois polipeptídeos, onde ex-pressão dos pelo menos dois polinucleotídeos aumenta atividade de enzimaacima de um espectro mais amplo de temperaturas que expressão de qual-quer polinucleotídeo sozinho.

Para endereçar concentrações de substrato de enzima diferen-ciais dentro de uma planta, um sistema de expressão de dois componentesde acordo com a invenção pode compreender uma primeira enzima com umKm relativamente baixo para substrato, e uma constante de taxa catalíticarelativamente baixa ("número de quantidade processada; Kcat), e uma se-gunda enzima tendo um Km relativamente maior para substrato e uma cons-tante de taxa catalítica relativamente maior comparada com a primeira enzi-ma. Opcionalmente, a constante de inibição de enzima para um inibidorcompetitivo também pode variar entre a primeira e segunda enzimas. Plan-tas que expressam estavelmente polinucleotídeos codificando ambas enzi-mas mostrarão maiores níveis de atividade de enzima sobre um espectromais amplo de concentração de substrato que provido por qualquer enzimasozinha.

Por exemplo, a segunda enzima pode ter uma afinidade parasubstrato que é pelo menos cerca de 2 vezes maior que aquela da primeiraenzima, por exemplo, pelo menos cerca de 5 vezes maior, ou pelo menoscerca de 10 vezes maior, ou pelo menos cerca de 20 vezes maior, ou pelomenos cerca de 50 vezes maior, ou pelo menos cerca de 100 vezes maior,ou pelo menos cerca de 200 vezes maior, ou pelo menos cerca de 500 ve-zes maior, ou pelo menos cerca de 1000 vezes maior, ou mais. Como e-xemplos adicionais, a primeira enzima pode ter um Km para substrato decerca de 1-100 μΜ, e a segunda enzima pode ter um Km maior para subs-trato de cerca de 30-300 μΜ; ou a primeira enzima pode ter um Km parasubstrato de cerca de 1-100 μΜ, e a segunda enzima pode ter um Km maiorpara substrato de cerca de 50-500 μΜ. Ainda como exemplos, a primeiraenzima pode ter um Km para substrato de cerca de 1-10 μΜ, e uma segundaenzima pode ter um Km maior para substrato de cerca de 5-50 μΜ; ou aprimeira enzima pode ter um Km para substrato de cerca de 5-10 μΜ, e asegunda enzima pode ter um maior Km para substrato de cerca de 10-50μΜ; ou a primeira enzima pode ter um Km para substrato de cerca de 5-10μΜ, e a segunda enzima pode ter um maior Km para substrato de cerca de15-30 μΜ. Valores de Km relevantes dependerão da particular enzima esubstrato de interesse, e pares de enzimas tendo valores de Km diferentescomo aqui descrito podem ser facilmente identificados por aqueles versadosna técnica.

Similarmente, a segunda enzima pode ter uma maior taxa catalí-tica que é aumentada por pelo menos cerca de 2 vezes maior que aquela daprimeira enzima, por exemplo, pelo menos cerca de 5 vezes maior, ou pelomenos cerca de 10 vezes maior, ou pelo menos cerca de 20 vezes maior, oupelo menos cerca de 50 vezes maior, ou pelo menos cerca de 100 vezesmaior, ou pelo menos cerca de 200 vezes maior, ou pelo menos cerca de500 vezes maior, ou pelo menos cerca de 1000 vezes maior, ou mais. Valo-res de Kcat relevantes dependerão da particular enzima e substrato de inte-resse, e pares de enzimas tendo os valores de Kcat diferentes como aquidescritos podem ser facilmente identificados por aqueles versados na técnica.

Como um exemplo específico, dois ou mais polinucleotídeos co-dificando uma EPSP sintase podem ser usados para conferir resistência aherbicida através de uma faixa mais ampla de condições de substrato quequalquer EPSP sozinha. EPSP sintase está envolvida na penúltima etapa nocaminho de ácido shikimico para a bio-síntese de aminoácidos aromáticos emuitos metabólitos secundários, incluindo tetraidrofolato, ubiquinona, e vita-mina K (Gruys et al. (1999) Inhibitors of Tryptophan. Phenvalanine. and T-yrosine Biosynthesis as Herbicides, Dekker, New York). EPSP synthaseconverts phosphoenolpyruvic acid (PEP) and 3-phosphoshikimic acid (S3P)to 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimic acid (Amrhein et al. (1980) Plant Physiol.66:830-834). Para obter ótima atividade EPSP, um sistema de expressão dedois componentes de acordo com a invenção pode compreender uma pri-meira enzima EPSP com um Km substancialmente baixo para PEP (por e-xemplo, menos que cerca de 1 μΜ) e um Ki alto para glifosato (por exemplo,200 μΜ), e uma segunda enzima EPSP com um Km mais modesto paraPEP (por exemplo, cerca de 40 μΜ) e um Ki maior para glifosato (por exem-plo, maior que cerca de 2 mM). Plantas que expressam estavelmente polinu-cleotídeos codificando ambas EPSP sintases mostrarão altos níveis de ativi-dade de EPSP sintase sobre um espectro mais amplo de concentração desubstrato que provido por qualquer enzima sozinha.

Por exemplo, expressão de dois polinucleotídeos codificando umpolipeptídeo de interesse, onde o primeiro e segundo polipeptídeo têm dife-rentes Km e Kcat, pode resultar em um aumento em atividade de enzima dopolipeptídeo de interesse sobre uma faixa de concentração de substrato queé pelo menos 2 vezes maior que quando qualquer dos polinucleotídeos éexpresso sozinho, por exemplo, pelo menos cerca de 5 vezes maior, ou pelomenos 10 vezes maior, ou pelo menos cerca de 25 vezes maior, ou pelomenos cerca de 50 vezes maior, ou pelo menos cerca de 100 vezes maior.Similarmente, o sistema de expressão de componente múltiplo da invençãosimilarmente prove a ampliação de uma faixa efetiva de atividade de enzimalimitada por concentração de um co-fator, concentração de radicais livres oudoadores de radicais livres, concentração de um inibidor de enzima ou cata-lisador, ou taxa catalítica máxima.

Atividade de enzima também pode ser regulada por pH diferen-cial em partes de planta, tecidos de planta, e compartimentos celulares deplanta. Em particular bombas H+/K+ e/ou H7Na+ mantêm um maior pH nocloroplasto estroma (aproximadamente pH 8,0) quando comparado ao cito-plasma (aproximadamente pH 7,0-7,5). Alcalinização do cloroplasto estromaé induzida por luz e permite função eficiente de enzimas de ciclo de reduçãode carbono fotossintética. Ver Wu et al. (1992) Plant Physiol. 98:666-672.Para expressão de enzimas heterólogas em cloroplasto, enzimas tendo ati-vidade ótima em pH elevado serão mais efetivas em conferir a característicade interesse. Vários polipeptídeos conferindo resistência a herbicida são co-dificados no cloroplasto (por exemplo, a proteína conferindo resistência aatrazina), ou são codificados no genoma nuclear mas funcionam dentro decloroplastos (por exemplo, enol piruvil shikimate fosfato sintase, que confereresistência a glifosato) ou mitocôndria (por exemplo, aril acil amidase, queconfere resistência a propanil). Ver, Della-Cioppa et al. (1986) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 83,6873-6877; Daniell et al. (1981) Weed Res. 21, 171-177;Gaynor et al. (1983) Plant Physiol. 72, 80-85. Além disso,enzimas com vari-ados pHs ótimos são úteis em diferentes compartimentos e podem conferirpropriedades superiores a plantas. Por exemplo, é conhecido na técnica quea toxidez de herbicidas glufosinato é devido, pelo menos em parte, a inibiçãode glutamina sintases ('GS's) em ambos, citoplasma e cloroplastos. Assim,desenvolvimento de plantas expressando múltiplas GS's resistentes a glufo-sinato com diferentes pHs ótimos (isto é, otimizadas para o pH ambiente decitoplasma e alternativamente cloroplasto) pode conferir superior resistênciaa glufosinato através de obtenção de máxima taxa de reação em cada com-partimento celular. Outras enzimas também podem se beneficiar de expres-são em múltiplos compartimentos celulares, e assim fazer uso da invenção.

O sistema de expressão de multienzimas da presente invençãoprovê aperfeiçoada atividade de enzima sobre uma faixa mais ampla detemperaturas comparado às enzimas individuais do sistema de expressãocombinada. O pH ótimo das duas ou mais enzimas de um sistema de ex-pressão de múltiplas enzimas pode variar como aqui descrito acima comrelação a dobrar ou diferenças de porcentagens de uma condição ambientale/ou fisiológica. Por exemplo, uma planta transgênica preparada como aquidescrito pode compreender um primeiro polipeptídeo tendo atividade de en-zima ótima dentro de uma faixa de pH de cerca pH 4,0 a cerca de pH 6,5, eum segundo polipeptídeo tendo uma atividade de enzima ótima em um pHmaior como comparado ao primeiro polipeptídeo e dentro da faixa de cercade pH 6,0 a cerca de pH 8,5. Uma planta representativa tendo aperfeiçoadaatividade de enzima sobre uma faixa de pH mais ampla pode compreenderuma planta expressando um primeiro polipeptídeo tendo uma seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO: 4, e um segundo polipeptídeo tendo um amino-ácido de SEQ ID NO: 6. Ver Tabela I.

Adicionais exemplos incluem uma planta expressando um pri-meiro polipeptídeo tendo ótima atividade de enzima dentro de uma faixa depH de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 5,5, e um segundo polipeptídeo tendouma ótima atividade de enzima em um maior pH como comparado ao primei-ro polipeptídeo; uma planta expressando um primeiro polipeptídeo tendo ó-tima atividade de enzima dentro de uma faixa de pH de cerca de pH 5,5 acerca de pH 6,0, e um segundo polipeptídeo tendo ótima atividade de enzi-ma em um maior pH como comparado ao primeiro polipeptídeo; uma plantaexpressando um primeiro polipeptídeo tendo ótima atividade de enzima den-tro de uma faixa de pH de cerca de pH 6,0 a cerca de pH 6,5, e um segundopolipeptídeo tendo ótima atividade de enzima em um pH maior como compa-rado ao primeiro polipeptídeo; uma planta expressando um primeiro polipep-tídeo tendo ótima atividade de enzima dentro de uma faixa de pH de cercade pH 6,5 a cerca de pH 7,0, e um segundo polipeptídeo tendo ótima ativi-dade de enzima em um maior pH como comparado ao primeiro polipeptídeo;uma planta expressando um primeiro polipeptídeo tendo ótima atividade deenzima dentro de uma faixa de pH de cerca de pH 7,0 a cerca de pH 7,5, eum segundo polipeptídeo tendo ótima atividade de enzima em um pH maiorcomo comparado ao primeiro polipeptídeo; uma planta expressando um pri-meiro polipeptídeo tendo ótima atividade de enzima dentro de uma faixa depH de cerca de pH 7,5 a cerca de pH 8,0, e um segundo polipeptídeo tendouma atividade de enzima ótima em um pH maior como comparado ao primei-ro polipeptídeo; e uma planta expressando um primeiro polipeptídeo tendoótima atividade de enzima dentro de uma faixa de pH de cerca de pH 8,0 acerca de pH 8,5, e um segundo polipeptídeo tendo ótima atividade de enzi-ma em um pH maior como comparado ao primeiro polipeptídeo.

Atividade de enzima também pode ser fortemente afetada porconcentração de sal. É conhecido na técnica que células de plantas em dife-rentes tecidos de plantas são submetidas a grandes variações em concen-tração de sal. Estas condições podem variar com condições ambientais. Porexemplo, células de estorna têm níveis de sal intracelulares amplamente va-riáveis dependendo de condições ambientais. Assim, os processos de ex-pressão multi - enzimas da invenção são úteis para geração de plantas comaperfeiçoada atividade de enzima sobre uma faixa mais ampla de concen-trações de sal fisiológico que uma enzima simples sozinha. Por exemplo,plantas transgênicas da invenção podem compreender um primeiro polipep-tídeo tendo ótima atividade de enzima dentro de uma faixa de concentraçãode sal de cerca de 50 mM a 150 mM, e um dito segundo polipeptídeo tendoótima atividade de enzima em uma maior concentração de sal como compa-rado ao primeiro polipeptídeo e dentro de uma faixa de cerca de 100 mM a200 mM. Uma planta representativa tendo aperfeiçoada atividade de enzimasobre uma faixa mais ampla de pH pode compreender uma planta expres-sando um primeiro polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos deSEQ ID NO. 4, e um segundo polipeptídeo tendo um aminoácido de SEQ IDNO. 6. Ver Tabela Il e Figura 2. Exemplos adicionais incluem plantas ex-pressando um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, onde a se-gunda enzima tem atividade ótima em uma concentração de sal que é pelomenos 2 vezes maior que uma concentração de sal na qual a primeira enzi-ma mostra atividade ótima, por exemplo, pelo menos cerca de 5 vezes mai-or, ou pelo menos cerca de 10 vezes maior, ou pelo menos cerca de 20 ve-zes maior, ou pelo menos cerca de 50 vezes maior, ou pelo menos cerca de100 vezes maior, ou pelo menos cerca de 200 vezes maior, ou pelo menoscerca de 500 vezes maior, ou pelo menos cerca de 1000 maior.

Também pode ser vantajoso expressar genes de resistência aherbicida em ambos, citoplasma e organelas. Por exemplo, plantas de arroztêm uma robusta capacidade para utilização de nitrogênio quando glutaminasintetase (GS) é expressa em ambos citoplasma e cloroplasto. Ver Sun et al.(2005) J. Plant Physiol. Mol. Biol. 31(5):492-498. GES é o alvo para o herbi-cida glufosinato, sugerindo que mecanismos para tolerância a glufosinatoserão mais efetivos se realizados em ambos compartimentos subcelulares.Os processos mostrados no presente pedido de patente podem ser usadospara expressarem otimamente um primeiro e segundo poli9nucleotídeos co-dificando primeiro e segundo polipeptídeos tendo atividades ótimas nos dife-rentes pH's e/ou ambientes do cloroplasto e citoplasma, respectivamente.

A expressão de genes conferindo características de interesseem cloroplastos, ou em cloroplastos assim como citoplasma, também é útilem outros exemplos, incluindo por exemplo, para aperfeiçoar produção deaminoácidos essenciais em grãos (ver, por exemplo, patentes U.S. 7 026527 e 7 071 383); para regular caminhos fotossintéticos, para regular síntesede lipídeos e hormônios reguladores de crescimento de planta; para aperfei-çoar habilidade de planta responder a condições de tensão como radiaçãoultravioleta AB, temperaturas extremas, infecção e/ou altas doses de irradia-ção; (ver, por exemplo, patente U.S. 6 781 034); para modular alocação decarbono e síntese de amido (ver por exemplo, patente U.S. 6 716 474). Vertambém Mullet1 J.E. (1988) Ann. Ver. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 39:475-502.

Os processos da presente invenção ainda podem ser combinadoscom processos de alvejamento de proteínas para as desejadas localizaçõessub-celulares, tais como citoplasma, cloroplastos, e mitocôndrias. Assim, umpolipeptídeo heterólogo, que é otimizado como aqui mostrado para elevadaatividade no ambiente alcalino do estroma de cloroplasto, ainda pode com-preender um peptídeo de trânsito de cloroplasto, como é conhecido na técni-ca. Ver, por exemplo, patente U.S. 6.130.366 e exposição intitulada "Polynu-cleotide Constructs" aqui abaixo. Alternativamente, os polinucleotídeos codi-ficando polipeptídeos de interesse podem ser estavelmente integrados emum genoma de organela. Por exemplo, técnicas representativas para trans-formação de cloroplastossão descritas na patente U.S. 6 642 053. Polinucle-otídeo expressos em organelas de planta também podem compreenderpromotores com específica e/ou elevada expressão em organelas, por e-xemplo, como descrito na patente U.S. 4 710 461 e 5 391 725. Ver também,exposição intitulada "Construções de Polinucleotídeo" aqui abaixo.

I.A. Características

Processos e composições podem ser usados para ampliação defaixa de condições ambientais e/ou fisiológicas nas quais qualquer enzimade interesse seja ativa. Características desejadas representativas incluemaperfeiçoado rendimento de colheita; resistência a inseto; tolerância a herbi-cidas de amplo espectro; resistência a doenças causadas por vírus, bacté-rias, fungos, e vermes; e aperfeiçoamento de mecanismos para proteção apartir de tensões ambientais como calor, frio, seca e alta concentração desal. Características adicionais desejadas incluem características de rendi-mento que beneficiam consumidores, por exemplo, alimentos nutricional-mente aperfeiçoados que contêm mais amido ou proteína, mais vitaminas,mais antioxidantes, e/ou menos ácidos graxos; alimentos com sabor aperfei-çoado, aumentada vida de prateleira, e melhores características de amadu-recimento; árvores que tornam isto possível produzem papel com menosdano ambiental; tabaco livre de nicotina; flores ornamentais como novas co-res, fragrâncias, e aumentada longevidade; etc. Ainda, características dese-jáveis que podem ser usadas de acordo com a invenção incluem produtosde gene produzidos em plantas como um meio para fabricação, por exem-plo, de proteínas terapêuticas para tratamento de doença e vacinação; fibrastêxteis; plásticos biodegradáveis; óleos para uso em tintas, detergentes, elubrificantes; etc. Atividade de enzima relevante para qualquer uma das ca-racterísticas notadas acima, ou qualquer outra desejável característica deplanta, pode ser otimizada através de seleção de múltiplos polinucleotídeostendo diferentes propriedades cinéticas, como aqui descrito.

Em um aspecto da invenção, o polinucleotídeo de interesse codi-fica um polipeptídeo capaz de conferir resistência a herbicida, isto é, umahabilidade para tolerar uma maior concentração de um herbicida, ou paratolerar uma certa concentração de um herbicida por um período de tempomais longo que plantas que não são tolerantes ou resistentes ao herbicida.Técnicas para medição de atividade de resistência a herbicida são bem-conhecidas. Ver, por exemplo, patentes U.S.4.535.060 e 5.188.642, cadauma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

Herbicidas para os quais vários transgenes resistentes ou tole-rantes foram identificados incluem, mas não são limitados a, os seguintes:

(a) Um herbicida de interesse inclui um que inibe o ponto decrescimento ou meristema, tal como imidazolinona ou uma sulfonil uréia.Polinucleotídeos exemplares que proporcionam resistência a herbicida paraesta classe de herbicidas incluem enzimas ALS e AHAS mutantes comodescrito, por exemplo, por Lee et al. (1988) EMBO J. 7:1241, e Miki et al.(1990) Theor. Appl. Genet. 80: 449, respectivamente. Ver também, patentesU.S. Nos. 5.198.599; 5.605.011; 5.013.659; 5.141.870; 5.767.361;5.731.180; 5.304.732; 4.761.373; 5.331.107; 5.928.937; e 5.378.824; e PCTInternational Publication No. WO 96/33270, cada uma das quais é aqui in-corporada por referência.(b) Adicionais herbicidas de interesse incluem glifosato (resis-tência proporcionada por genes 5-enol piruvil-3-fosfikimate síntese (EPSPsintase) mutante e aroA). Ver, por exemplo, patente U.S. 4 940 835, quemostra o polinucleotídeo de uma forma de EPSP sintase que pode conferirresistência a glifosato. Patente U.S. 5 627 061 também descreve genes codi-ficando enzimas EPSP sintase. Ver também patentes U.S. Nos. 6,566,5876,338,961; 6,248,876 B1; 6,040,497; 5,804,425; 5,633,435; 5,145,7834,971,908; 5,312,910; 5,188,642; 4,940,835; 5,866,775; 6,225,114 B16,130,366; 5,310,667; 4,535,060; 4,769,061; 5,633,448; 5,510,471; RE36,449; RE 37,287 E; e 5,491,288; PCT International Publication No. WO01/66704; European Patent Application Publication Nos. EP1173581A eEP1173580A; e patente EP1173582, cada uma das quais é aqui incorporadapor referência. Adicionais polinucleotídeos EPSP representativos são comomostrados em SEQ ID NOs. 1, 3, 5, e 7, que codificam polipeptídeos EPSPmostrados como SEQ ID Nos. 2, 4, 6, e 8, respectivamente.

Resistência a glifosato é também proporcionada a plantas queexpressam um gene codificando uma enzima glifosato óxidoredutase comodescrito mais inteiramente nas patentes U.S. 5 776 760 e 5 463 175, quesão aqui incorporadas por referência. Em adição, resistência a glifosato podeser proporcionada a plantas através da superexpressão de polinucleotídeoscodificando glifosato N-acetil transferase. Ver, por exemplo, publicação depedido de patente U.S. 20040082770 e publicação internacional PCT WO01/46227. Uma molécula de DNA codificando um gene aroA mutante, quetambém confere resistência a glifosato, pode ser obtida sob American TypeCulture Collection (ATCC) Accession No. 39256, e o polinucleotídeo do genemutante é mostrado na patente U.S. 4 769 061.

EPSP sintases foram isoladas de plantas, bactérias, e fungos, incluin-do E. coli (Duncan et al. (1984) FEBS Lett. 170:59-63), Staphylococcus au-reus (Horsburgh et al. (1996) Microbiology 142(Part 10):2943-2950), Strepto-coccus pneumoniae (Du et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267(1 ):222-227) eSalmonella typhi (Chatfield et al. (1990) Nucleic Aeids Res. 18(20):6133).Seqüências de EPSP sintase foram caracterizadas e resíduos freqüente-mente conservados nesta classe de polipeptídeos foram identificados. Porexemplo, Lys-22, Arg-124, Asp-313, Arg-344, Arg-386, e Lys-411, são resí-duos conservados da EPSP sintase de E. coli (Schõnbrunn et al. (2001)Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 98:1376-1380). Adicionais resíduos que influ-enciam atividade de EPSP também incluem Arg-100, Asp-242, e Asp-384(Selvapandiyan et al. (1995) FEBS Letters 374:253-256). Arg-27 foi mostra-da ligar-se a S3P (Shuttleworth et al. (1999) Biochemistry 38:296-302).

EPSP sintase é o alvo do herbicida glifosato, isto é, qualquer formaherbicida de N-fosfono metil glicina (incluindo qualquer sal da mesma) eseus derivados ativos que resultam na produção do anion glifosato na plan-ai ta. Inibição de EPSP sintase por glifosato foi mostrada proceder através deformação de um complexo ternário de EPSP sintase - S3P - glifosato e aligação é ordenada com glifosato ligando-se à enzima somente após a for-mação de um complexo binário de EPSP sintase - S3P. Ligação de glifosatoa EPSP sintase foi mostrada ser competitiva com PEP e não-competitivacom relação a S3P (Kisohore et al. (1988) Ann. Ver. Biochem. 57:627-663).Através de ligação a EPSP sintase, glifosato fecha o caminho de ácido shi-kímico, pelo que conduzindo a uma supressão de biossíntese de aminoácidoaromático e morte ou severa redução de crescimento da planta.

Polipeptídeos EPSP sintase resistentes a glifosato foram identificadose usados para aumentar tolerância a glifosato em plantas. Polipeptídeos deresistência glifosato conferem à célula uma habilidade para tolerar uma mai-or concentração de glifosato que células que não expressam o polipeptídeo,ou para tolerar uma certa concentração de glifosato por um maior tempo quecélulas que não expressam o polipeptídeo. Tolerância refere-se a uma habi-lidade para sobreviver, ou para realizar funções celulares essenciais comosíntese de proteína e respiração em uma maneira que não seja facilmentediscernível a partir de células não-tratadas. Um exemplo de uma EPSP sin-tase resistente a glifosato ocorrendo naturalmente inclui o gene bacterianode Agrobacterium tumefacians linhagem CP4que tem sido usado para confe-rir resistência a herbicida sobre células de plantas seguindo expressão emplantas. Polipeptídeos EPSP sintase de mutação foram identificados atravésdê mutagênese randômica e seleção para resistência a herbicida, incluindouma EPSP sintase mutante de Salmonella typhimurium linhagem CT7 queconfere resistência a glifosato em células bacterianas, e confere resistênciaglifosato sobre células plantas (patente U.S., Nos. 4 535060;4 769 061; e 5094 945 e pedido de patente U.S. 60/669 686 e 20040177399). Estas enzi-mas contêm substituições de aminoácidos em seus sítios ativos que previ-nem a ligação de glifosato sem afetar ligação por PEP ou S3P. Mutaçõesque ocorrem na região de articulação entre os dois domínios globulares deEPSP sintase foram mostradas alterarem a afinidade de ligação de glifosatomas não PEP (He et al. (2003) Biosci. Biotechnol. Biochem. 67(6):1405-1409). Por isso, tais enzimas têm alta atividade catalítica, mesmo na presen-ça de glifosato.

Em um aspecto da invenção, a presente invenção provê plantastransgênicas tendo dois ou mais polipeptídeos conferindo resistência a glifo-sato, por exemplo, dois ou mais polipeptídeos EPSP sintase resistentes aglifosato, onde as plantas têm uma aumentada resistência a glifosato e/ouaumentado rendimento sobre uma faixa mais ampla de condições ambien-tais e/ou fisiológicas que quando somente um dos polipeptídeos é expressona planta. Por exemplo, plantas expressando dois ou mais polipeptídeosEPSP sintase têm um espectro de temperatura mais amplo de resistência aglifosato ou aumentado rendimento de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 20, ou 25, 35, 45, 55, 65°C ou maior que quando qualquerum dos polipeptídeos EPSP sintase é expresso sozinho. Também são provi-das plantas expressando dois ou mais polipeptídeos EPSP sintase, onde pelo menos um dos dois polipeptídeos EPSP sintase é ativo entre cerca de0°C a cerca de 10°C, cerca de 10°C a cerca de 20°C, cerca de 20°C a cercade 30°C, cerca de 30°C a cerca de 40°C, cerca de 40°C a cerca de 50°C,cerca de 50°C a cerca de 60°C, ou cerca de 60°C a cerca de 70°C.

Uma variedade de técnicas podem ser usadas para ensaiar atividadeEPSP sintase. Por exemplo, Lewendon et al. (1983) Biochem J. 213:187-91descreve dois ensaios que acoplam a reação de EPSP sintase com outrasenzimas que produziram produtos detectáveis. Na direção dianteira, EPSPpede ser acoplada com corismate sintase, a enzima no caminho de ácidoshikimate que converte EPSP a corismate; quando EPSP sintase produzEPSP1 corismate sintase pode converter EPSP a corismate que pode serdetectado em 275 nm. Uma vez que EPSP sintase também pode procederna direção reversa, atividade também pode ser ensaiada com acoplamento apiruvato cinase e Iactato desidrogenase que oxidam NADH na ruptura depiruvato, permitindo a detecção de perda de NADH em 340 nm que corres-ponde a evolução de piruvato através de EPSP sintase. Atividade de EPSPsintase também pode ser ensaiada através de medição de um aumento emresistência de uma planta a glifosato quando EPSP sintase resistente a gli-fosato está presente, ou através de medição de um aumento em rendimentode planta quando EPSP sintase sensível e/ou tolerante a glifosato é expres-sa.

Um aumento em atividade de EPSP sintase sensível ou tolerante aglifosato através de uma faixa mais ampla de temperaturas (tais como aque-las que atravessam a noite e dia em muitos climas, e aquelas que se esten-dem além de típicas estações de crescimento em alguns climas) resultaráem uma aumentada produção de componentes metabólicos necessáriospara crescimento e desenvolvimento e, portanto, aperfeiçoam rendimento deplanta. Seqüências de EPSP sintase derivada de plantas (ambas, monocoti-ledôneas e dicotiledôneas) e outros microorganismos (como bactérias, fun-gos ou leveduras) também são incluídas nesta invenção. Por exemplo, en-zimas EPSP sintase tolerantes a glifosato derivadas de Brevundomonas ve-sicularis, Arthrobacter globiformis] Enterobacteriaceae sp.; e Sulfolobus sol-fataricus são enzimaticamente ativas em temperaturas variáveis. Plantasresistentes a glifosato representativas da invenção incluem plantas expres-sando polipeptídeos EPSP sintase tolerantes a glifosato derivados de pelomenos Brevundomonas vesicularis e Arthrobacter globiformis; Brevundomo-nas vesicularis e Enterobaeteriaeeae sp.; Brevundomonas vesicularis e Sul-folobus solfataricus; Arthrobacter globiformis e Enterobacteriaceae sp.; Art-hrobacter globiformis e Sulfolobus solfataricus; ou Enterobacteriaceae sp. eSulfolobus solfataricus. Adicionais plantas da invenção expressam polipeptí-d®os EPSP sintase tolerantes a glifosato derivados de pelo menos Brevun-domonas vesicularis, Arthrobacter globiformis, e Enterobacteriaceae sp.·,Brevundomonas vesicularis, Enterobaeteriaeeae sp. e Sulfolobus solfatari-eus; Arthrobacter globiformis, Enterobaeteriaceae sp., e Sulfolobus solfatari-eus; ou Brevundomonas vesicularis, Arthrobacter globiformis, e Sulfolobussolfataricus. Ainda adicionais plantas da invenção expressam polipeptídeosEPSP sintase tolerantes a glifosato derivados de pelo menos Brevundomo-nas vesicularis, Arthrobacter globiformis, Enterobacteriaceae sp., e Sulfolo-bus solfataricus. É contemplado que outros polipeptídeos EPSP sintase tole-rantes a glifosato podem ser usados na presente invenção em adição àque-les descritos acima, ou em qualquer combinação com qualquer número dospolipeptídeos descritos acima de modo que EPSP sintase seja ativa atravésde uma faixa mais ampla de condições ambientais e/ou fisiológicas que ex-pressão de qualquer polipeptídeo EPSP sintase sozinho.

Como ainda discutido em detalhes abaixo, variantes de quaisquer en-zimas EPSP sintase conhecidas ou aquelas aqui mostradas podem ser em-pregadas nos processos e composições da invenção. Variantes funcionaisde EPSP sintase que são tolerantes a glifosato são conhecidas. Ver, por e-xemplo,, Kishore and Shah (1988) Ann. Rev. Biochem. 57:627-63; Wang etal. (2003) J. Plant Res. 116:455-60; e Eschenburg et al. (2002) Planta216:129-35.

(c) Um herbicida que inibe fotossíntese, tal como uma triazina (genespsbA e gs+) e uma benzonitrila (gene nitrilase) também é de interesse. Przi-billa et al. (1991) Plant Cell 3:169 descreve a transformação de Chlamydo-monas com plasmídeos codificando genes psbA mutantes. Polinucleotídeospara genes nitrilase são mostrados na patente U.S. 4 810 648 e moléculasde DNA contendo estes genes são disponíveis sob ATCC Accession Nos.53435, 67441, e 67442. Clonagem e expressão de DNA codificando umaglutationa S-transferase são descritos por Hayes et al. (1992) Biochem. J.285:173.

(d) Ácido Acetohidróxi sintase, que foi verificada fabricar plantas queexpressam esta enzima resistente a múltiplos tipos de herbicidas, foi intro-dueida em uma variedade de plantas (ver, por exemplo, Hattori et al. (1995)Mol. Gen. Genet. 246:419). Outros genes que conferem resistência a herbi-cidas incluem: um gene codificando um polipeptídeo quimérico de citocromode rato P4507A1 e NADPH - citocromo P450 óxidoredutase de levedura(Shiota et al. (1994) Plant Physiol. 106:17), genes para glutationa redutase esuperóxido dismutase (Aono et al. (1995) Plant Cell Physiol. 36:1687), e ge-nes para várias fosfotransferases (Datta et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:619).

(e) Protoporfirinogeno oxidase (protox) é necessária para produção declorofila, que é necessária para sobrevivência de todas as plantas. A enzimaprotox serve como o alvo para uma variedade de compostos herbicidas. Es-tes herbicidas também inibem o crescimento de todas as espécies diferentesde plantas presentes, causando sua total destruição. O desenvolvimento deplantas contendo atividade protox alterada que são resistentes a estes her-bicidas é descrito nas patentes U.S. 6,084,155; 6,288,306; 6,282,837; e5,767,373; e PCT International Publication No. WO 01/12825.

(f) Adicionais herbicidas de interesse incluem compostos fosfonocomo glufosinato (resistência provida por genes fosfinotricina acetil transfe-rase (PAT) e Streptomices hygroscopicus fosfinotricina acetil transferase(bar)). A publicação de pedido de patente EP 0333033A e patente U.S. 4975 374 mostram polinucleotídeos de genes glutamina sintetase que confe-rem resistência a herbicidas como L-fosfinotricina. O polinucleotídeo de umgene fosfinotricina acetil transferase é provido nas patentes EP 0242246 e0242236. De Greef et al. (1989) BioTechnoIogy 7:61 descreve a produção deplantas transgênicas que expressam genes bar quiméricos codificando ativi-dade de fosfinotricina acetil transferase. Ver também patente U.S. 5,969,213;5,489,520; 5,550,318; 5,874,265; 5,919,675; 5,561,236; 5,648,477;5,646,024; 6,177,616; e 5,879,903, que são aqui incorporadas por referência.

(e) Adicionais herbicidas são ácidos piridinóxi ou fenóxi propiôni-cos e cicloexonas (resistência conferida por genes ACCase codificando -inibidor). Polinucleotídeos exemplares conferindo resistência para ácidosfefióxi propiônicos e cicloexonas, tais como sethoxydim e haloxyfope, genesAccl -S1, Accl-S2 e Acc1-S3 descritos por Marshall et al. (1992) Theor. Ap-pl. Genet. 83:435.

I.B. Variantes de Polinucleotídeos e Polipeptídeos

A presente invenção ainda contempla variantes e fragmentosdos polinucleotídeos e polipeptídeos de resistência a herbicida aqui descri-tos. Vários processos podem ser empregados para modificação de váriospolipeptídeos que conferem resistência a um herbicida de modo que o novopolipeptídeo terá uma desejada atividade em uma diferente temperatura óti-ma. Por exemplo, embaralhamento de gene ou procedimentos PGR sexuais(por exemplo, Smith (1994) Nature 370:324-25; Patentes U.S. Nos.5,837,458; 5,830,721; 5,811,238; e 5,733,731, cada uma das quais é aquiincorporada por referência) podem ser usados para identificar adicionais po-linucleotídeos que codificam polipeptídeos que desempenham funções simi-lares àquelas aqui descritas (por exemplo, polipeptídeos que conferem resis-tência a herbicida em temperaturas ótimas variáveis). Embaralhamento degenes envolve fragmentação randômica de vários DNAs mutantes seguidapor sua remontagem através de PCR em moléculas de inteiro comprimento.Exemplos de vários procedimentos de embaralhamento de genes incluem,mas não são limitados a, montagem seguindo tratamento com DNase, oprocesso de extensão escalonada (STEP), e recombinação in vitro de inicia-ção randômica. No processo mediado por DNase, segmentos de DNA isola-dos de uma reunião de mutantes positivos são clivados em fragmentos ran-dômicos com DNaseI e submetidos a múltiplos roundes de PCR sem inicia-dor adicionado. Os comprimentos de fragmentos randômicos abordam aque-le do segmento não-clivado quando os ciclos de PCR procedem, resultandoem mutações em diferentes clones tornando-se misturadas e acumulando-seem algumas das seqüências resultantes. Múltiplas ciclos de seleção e emba-ralhamento conduziram ao aperfeiçoamento funcional de várias enzimas(Stemmer (1994) Nature 370:398-91; Stemmer (1994) Proc. NatL Acad. Sei.USA 91:10747-51; Crameri et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-19; Zhanget al. (1997) Proc. NatL Acad. Sei. USA 94:4504-09; e Crameri et al. (1997)NBt. Biotechnol. 15:436-38). Tais procedimentos podem ser realizados, porexemplo, sobre polinucleotídeos derivados de organismos criofílicos e/outermofílicos para geração de polipeptídeos que são ativos em menores emaiores faixas de temperaturas, assim como aqueles que conferem umadesejada atividade de enzima (isto é, resistência a herbicida).

Fragmentos ou porções biologicamente ativas incluem fragmen-tos de polipeptídeos compreendendo uma porção de uma seqüência de a-minoácidos codificando um polipeptídeo e que retém atividade biológica (istoé, resistência a herbicida ou atividade de EPSP sintase tal como rendimentoaumentado e/ou resistência a glifosato). Um fragmento de um polinucleotí-deo pode codificar uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo, oupode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridiza-ção ou iniciador de PCR usando processos mostrados aqui em outro lugar.Polinucleotídeos que são fragmentos de um polinucleotídeo compreendempelo menos cerca de 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550,600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250,1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850,1900, 1950 nucleotídeos contíguos, ou até o número de nucleotídeos pre-sentes em um polinucleotídeo de inteiro comprimento aqui mostrado depen-dendo do uso pretendido. Nucleotídeos contíguos são imediatamente adja-centes uns aos outros.

Fragmentos de um polinucleotídeo podem codificar fragmentosde polipeptídeos que retêm a atividade biológica do polipeptídeo de inteirocomprimento (por exemplo, resistência a herbicida ou atividade EPSP sinta-se tal como aumentado rendimento e/ou resistência a glifosato). Por exem-plo, um fragmento retém uma atividade biológica do polipeptídeo de inteirocomprimento se ele tem pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de50%, pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80% da atividadedo polipeptídeo de inteiro comprimento.

Um fragmento de um polinucleotídeo que codifica uma porçãobiologicamente ativa de um polipeptídeo da invenção pode codificar pelomenos cerca de 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350,400 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentesem um polipeptídeo de inteiro comprimento da invenção.

A invenção também abrange polinucleotídeos variantes, incluin-do variantes ocorrendo naturalmente assim como variantes produzidas re-combinantemente. Por exemplo, variantes dos polipeptídeos EPSP sintaseaqui mostrados incluem polipeptídeos que diferem conservativamente devidoà degenerescência do código genético, assim como aqueles que são sufici-entemente idênticos. Polipeptídeos suficientemente idênticos refere-se a po-lipeptídeos tendo uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos cercade 60% ou 65% de identidade de seqüência, cerca de 70% ou 75% de iden-tidade de seqüência, cerca de 80 ou 85% de identidade de seqüência, cercade 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidadede seqüência comparado a uma seqüência referência usando um dos pro-gramas de alinhamento usando parâmetros padrões. Aquele versado natécnica reconhece que estes valores podem ser apropriadamente ajustadospara determinação de correspondente identidade de polipeptídeos codifica-dos por dois polinucleotídeos levando em conta degenerescência de códon,similaridade de aminoácidos, posicionamento de quadro de leitura, e seme-lhantes. Substituições de aminoácidos que são feitas para aumentarem atermofilicidade psicrofilicidade, ou estabilidade térmica de uma enzima tam-bém são abrangidas pela presente invenção.

Para determinar a porcentagem de identidade de duas seqüên-cias de aminoácidos ou de dois polinucleotídeos, as seqüências são alinha-das para ótimos propósitos de comparação. A porcentagem de identidadeentre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticascompartilhadas pelas seqüências (isto é, porcentagem de identidade = nú-mero posições idênticas / número total de posições (por exemplo, posiçõesde sobreposição χ 100). As duas seqüências podem ser do mesmo compri-mento. A porcentagem de identidade entre duas seqüências pode ser de-terminada usando técnicas similares àquelas descritas abaixo, com ou sempermissão de folgas. No cálculo de porcentagem de identidade, emparelha-mentos tipicamente exatos são contados.A determinação de porcentagem de identidade entre duas se-qüências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. Um exemplonão-limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação deduas seqüências é o algoritmo de Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. A-cad. Sei. USA 87:2264, modificado como em Karlin and Altschul (1993) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877. Um tal algoritmo é incorporado nos pro-gramas BLASTN e BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403.Buscas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o programaBLASTN, escore = 100, comprimento de palavra = 12, para obter polinueleo-tídeos homólogos a polinucleotídeos codificando resistência a herbicida usa-dos nos processos da invenção. Buscas de polipeptídeo BLAST podem seraperfeiçoadas com o programa BLASTX, escore = 50, comprimento de pala-vra = 3, para obter seqüências aminoácidos homólogas a moléculas de poli-peptídeos expressas usando os processos da invenção. Para obter alinha-mentos com folgas para propósitos de comparação, Gapped BLAST podeser utilizado como descrito com Altschul et ai. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389. Alternativamente, PSI-BIast pode ser usado para realizar uma bus-ca repetida que detecta relações distantes entre moléculas. Ver Altschul etal., (1997) supra. Quando utilizando programas BLAST, Gapped BLAST, ePSI-Blast, os parâmetros default dos respectivos programas (por exemplo,BLASTX, e BLASTN) podem ser usados.

Ver www.ncbi.nlm.nih.gov. Um outro exemplo de um algoritmomatemático utilizado para comparação de seqüências é o algoritmo CIustaIW(Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). CIustaIW comparaseqüências e alinha a totalidade dos aminoácidos ou seqüência de DNA1 eassim pode prover dados sobre a conservação de seqüência da inteira se-qüência de aminoácidos. O algoritmo CIustaIW é usado em vários pacotesde software de análise de DNA / aminoácido comercialmente disponíveis, talcomo o módulo ALIGNX do vetor NTi Program Suíte (Informax, Inc.). Apósalinhamento de seqüências de aminoácidos com ClustalW, a porcentagemde identidade de aminoácidos pode ser avaliada. Um exemplo não-limitantede um programa de software útil para análise de alinhamentos ClustalW éGENEDOC. GENEDOC (Karl Nicholas) permite avaliação de similaridade deaminoácido (ou DNA) e identidade entre múltiplos polipeptídeos. Um outroexemplo não-limitante de um algoritmo matemático utilizado para a compa-ração de seqüências é o algoritmo de Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11 - 17. Um tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), que éparte do pacote de software de alinhamento de seqüência GCG. Quandoutilizando o programa ALIGN para comparação de seqüências de aminoáci-dos, uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de compri-mento de folga de 12, e uma penalidade de folga de 4 podem ser usadas.

A menos que de outro modo estabelecido, GAP Version 10, queusa o algoritmo de Needleman and Wunsch (1970) supra, será usado paradeterminar identidade ou similaridade de seqüência usando os seguintesparâmetros: % de identidade e % de similaridade para uma seqüência denucleotídeos usando Peso de Folga de 50 e Peso de Comprimento de 3, e amatriz de escore nwsgapdna.cmp; % de identidade ou % de similaridadepara uma seqüência de aminoácidos usando peso de Folga de 8 e peso decomprimento de 2, e o programa de escore BLOSUM62. Programas equiva-lentes também podem ser usados, incluindo qualquer programa de compa-ração de seqüência que, para quaisquer duas seqüências em questão, geraum alinhamento tendo idênticos emparelhamentos de resíduo de nucleotídeoe uma idêntica porcentagem de identidade de seqüência quando comparadoao correspondente alinhamento gerado por GAP Version 10.

Variantes de polinucleotídeos ocorrendo naturalmente podemser identificadas usando técnicas de biologia molecular bem-conhecidas, taiscomo reação de cadeia polimerase (PCR) e técnicas de hibridização comoesboçado abaixo. Polinucleotídeos variantes também incluem polinucleotí-deos derivados sinteticamente que foram gerados, por exemplo, através deuso de mutagênese direcionada a sítio mas que ainda codificará o polipeptí-deo tendo a desejada atividade biológica. Polipeptídeos variantes abrangi-dos pela presente invenção são biologicamente ativos, isto é eles retêm adesejada atividade biológica do polipeptídeo nativo, isto é, atividade de resis-tência a herbicida ou atividade de EPSP sintase tal como aumentado rendi-mento e/ou resistência a glifosato. Variantes biologicamente ativas têm pelomenos cerca de 30% da atividade do polipeptídeo nativo, por exemplo, pelomenos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%. Processospara medição de atividade de enzima são específicos para enzimas indivi-duais de interesse.

O técnico versado ainda aprecia que mudanças podem ser in-troduzidas através de mutação nos polipeptídeos da invenção pelo que con-duzindo a mudanças na seqüência de aminoácidos dos polipeptídeos codifi-cados, sem alteração de atividade biológica dos polipeptídeos. Assim, poli-nucleotídeos isolados variantes podem ser criados através de introdução deuma ou mais substituições, adições ou supressões de nucleotídeos no cor-respondente polinucleotídeo aqui mostrado, de modo que uma ou maissubstituições, adições ou supressões de aminoácidos sejam introduzidas nopolipeptídeo codificado. Mutações podem ser introduzidas através de técni-cas padrões, como mutagênese direcionada a sítio e mutagênese mediadapor PCR, ou técnicas de embaralhamento, que são ainda descritas em deta-lhes aqui em outro local. Tais polinucleotídeos variantes também são abran-gidos pela presente invenção.

Por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos po-dem ser feitas em um ou mais resíduos de aminoácidos não-essenciais, istoé, um resíduo que pode ser alterado a partir da seqüência nativa de um poli-peptídeo sem alterar a atividade biológica. Em contraste, um resíduo de a-minoácido essencial é requerido para atividade biológica. Uma substituiçãoconservativa de aminoácidos é uma na qual o resíduo de aminoácido ésubstituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar.Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foramdefinidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias late-rais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas(por exemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadeias laterais polaresnão-carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treoni-na, tirosina, cisteína), cadeias laterais não-polares (por exemplo, alanina,valina, leucina, isoleucina, prolina, fenil alanina, metionina, triptofano), cadei-as laterais beta-ramifiçadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e ca-deias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenil alanina, triptofano, his-tidina). Substituições de aminoácidos podem ser feitas em regiões não-conservadas que retêm função. Em geral, tais substituições não podem serfeitas para resíduos de aminoácidos conservados, ou para resíduos de ami-noácidos residindo dentro de um motivo conservado, onde tais resíduos sãoessenciais para atividade de polipeptídeo. Entretanto, aqueles versados natécnica podem entender que variantes funcionais podem ter menores altera-ções conservadas ou não-conservadas nos resíduos conservados.

Alternativamente, polinucleotídeos variantes podem ser fabrica-dos através de introdução de mutações randomicamente ao longo de todaou parte da seqüência codificante, tal como através de mutagênese de satu-ração, e os resultantes mutantes podem ser selecionados para a habilidadepara conferir atividade de resistência a herbicida para identificar mutantesque retêm atividade. Seguindo mutagênese, o polipeptídeo codificado podeser expresso recombinantemente, e a atividade do polipeptídeo pode serdeterminada usando técnicas de ensaio padrões.

I.C. Constructos de Expressão

Os polinucleotídeos empregados nos processos e composiçõesda invenção podem ser modificados para obter ou aperfeiçoar expressão emcélulas de plantas. Os polinucleotídeos da invenção podem ser providos emcassetes de expressão para expressão na planta de interesse. Cassetes deexpressão incluem um constructo de DNA que é capaz de resultar na ex-pressão de um polinucleotídeo em uma célula de planta. O cassete podeincluir na direção 5'-3' de transcrição, uma região de iniciação transcricional(isto é, promotor) operavelmente ligada a um ou mais polinucleotídeos deinteresse, e uma região de terminação transcricional e de tradução (isto é,região de terminação) funcional em plantas. O cassete adicionalmente podeconter pelo menos um adicional polinucleotídeo a ser introduzido no orga-nismo, tal como um gene marcador selecionável ou o segundo polinucleotí-deo de interesse com diferente temperatura ótima para atividade. Alternati-vãmente, o adicional polinucleotídeo(s) pode ser provido sobre múltiploscassetes de expressão. Um tal cassete de expressão é provido com umapluralidade de sítios de restrição para inserção do polinucleotídeo(s) paraestar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras.

Um polinucleotídeo ou polipeptídeo heterólogo é um que não éendógeno para a célula ou não é endógeno para a localização no genomanativo no qual ele está presente, e foi adicionado à célula através de infec-ção, transfecção, micro-injeção, eletroporação, microprojeção, ou semelhan-tes. Para expressão de um polinucleotídeo heterólogo, tal polinucleotídeo éoperavelmente ligado a uma seqüência promotora que inicia e media suatranscrição. É reconhecido que polinucleotídeos ligados operavelmente po-dem ou não serem contíguos. Onde usado para referência a ligação de duasregiões codificando polipeptídeo, polipeptídeos ligados operavelmente sãoexpressos no mesmo quadro de leitura.

O promotor pode ser qualquer seqüência de polinucleotídeosque mostra atividade transcricional nas células de planta, partes de plantasou plantas escolhidas. O promotor pode ser nativo ou análogo, ou estranhoou heterólogo, para a planta hospedeira e/ou para a seqüência de DNA dainvenção. Onde o promotor é nativo ou endógeno para a planta hospedeira,é pretendido que o promotor seja encontrado na planta nativa na qual opromotor é introduzido. Onde o promotor é estranho ou heterólogo para aseqüência de DNA da invenção, o promotor não é o promotor nativo ou ocor-rendo naturalmente para a seqüência de DNA ligada operavelmente da in-venção. O promotor pode ser induzível ou constitutivo. Ele pode estar ocor-rendo naturalmente, pode ser composto por porções de vários promotoresocorrendo naturalmente, ou pode ser parcial ou totalmente sintético. Orien-tação para o desenho de promotores é provida por estudos de estrutura depromotor, tal como aquele de Harley and Reynolds (1987) Nucleic AcidsRes. 15:2343-61. Também, a localização do promotor em relação ao iníciode transcrição pode ser otimizada. Ver, por exemplo, Roberts, et al. (1979)Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:760-4. Muitos promotores apropriados parauso em plantas são bem-conhecidos na técnica.Por exemplo, apropriados promotores constitutivos para uso emplantas incluem: os promotores de vírus de plantas, tal como o promotorcaulimovírus de estria clorótica de amendoim (PC1SV) (patente U.S. 5 850019); o promotor 35S de vírus mosaico de couve-flor (CaMV) (Odell et al.(1985) Nature 313:810-812); promotores de genes metil transferase de vírusChlorella (patente U.S. 5 563 328) e o promotor transcrito de inteiro compri-mento de vírus mosaico de escrofulária (FMV) (patente U.S. 5 378 619); ospromotores de genes tais como actina de arroz (McEIroy et al. (1990) PlantCell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last etal. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBOJ. 3:2723-2730); histona H3 de milho (Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet.231:276-285 e Atanassova et al. (1992) Plant J. 2(3):291-300); ALS3 deBrassica napus (PCT International Publication WO 97/41228); e promotoresde vários genes de Agrobacterium (ver patentes U.S. 4 771 002; 5 102 796;5 182 200; e 5 428 147).

Apropriados promotores induzíveis para uso em plantas incluem:o promotor do sistema ACE1 que responde a cobre (Mett et al. (1993) Proc.Natl. Aead. Sei. USA 90:4567-4571); o promotor do gene In2 de milho queresponde a seguradores de herbicida benzenossulfonamida (Hershey et al.(1991) Mol. Gen. Genetics 227:229-237 e Gatz et al. (1994) Mol. Gen. Gene-ties 243:32-38); e o promotor do repressor Tet de Tn10 (Gatz et al., (1991)Mol. Gen. Genet. 227:229-237). Um outro promotor induzível para uso emplantas é um que responde a um agente de indução ao qual plantas nor-malmente não respondem. Um promotor induzível exemplar deste tipo é opromotor induzível de um gene de hormônio esteróide, a atividade transcri-cional do qual é induzida por um hormônio glucocorticosteróide (Schena etal. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10421) ou a recente aplicação deum ativador de transcrição quimérico, XVE, para uso em um sistema de ex-pressão em planta induzível baseado em receptor de estrogênio ativado porestradiol (Zuo et al. (2000) Plant J., 24:265-273). Outros promotores induzí-veis para uso em plantas são descritos em EP332104, publicação interna-cional de PCT WO 93/21334 e WO 97/06269. Promotores compostos porporções de outros promotores e promotores parcial ou totalmente sintéticostambém podem ser usados. Ver, por exemplo, Ni et al. (1995) Plant J. 7:661-676 e publicação Internacional PCT WO 95/14098 descrevendo tais promo-tores para uso em plantas.

O promotor pode incluir, ou ser modificado para incluir, um oumais elementos aperfeiçoadores. Promotores contendo elementos aperfei-çoadores provêm altos níveis de transcrição comparados a promotores quenão incluem os mesmos. Apropriados elementos aperfeiçoadores para usoem plantas incluem o elemento aperfeiçoador PC1SV (patente U.S. 5 850019), o elemento aperfeiçoador 35S CaMV (patentes U.S. 5 106 739 e 5 164316) e o elemento aperfeiçoador FMV (Maiti et al. (1997) Transgenic Res.6:143-156). Ver também publicação internacional PCTWO 96/23898.

Freqüentemente, tais constructos podem conter regiões não-traduzidas 5' e 3'. Tais construções podem conter uma 'seqüência sinal1 ou'seqüência líder' para facilitar transporte co-traducional ou pós-traducional dopeptídeo de interesse para certas estruturas intracelulares como o cloroplas-to (ou outro plastídeo), retículo endoplásmico, ou aparelho de Golgi, ou paraser secretado. Por exemplo, a constructo pode ser engenheirado para conterum peptídeo sinal para facilitar transferência do peptídeo para o retículo en-doplásmico. Uma seqüência sinal é conhecida ou suspeita resultar emtransporte de peptídeo co-traducional ou pós-traducional através de mem-brana de célula. Em eucariotes, isto tipicamente envolve secreção no apare-lho de Golgi, com alguma resultante glicosilação. Uma seqüência líder refe-re-se a qualquer seqüência que, quando traduzida, resulta em uma seqüên-cia de aminoácidos suficiente para disparar transporte co-traducional da ca-deia de peptídeo para uma organela sub-celular. Assim, esta inclui seqüên-cias líderes alvejando transporte e/ou glicosilação através de passagem noreticulo endoplásmico, passagem para vacúolos, plastídeos incluindo cloro-plastos, mitocôndria, e semelhantes. Cassetes de expressão de planta tam-bém podem conter um intron, de modo que ARNm processando o intron érequerido para expressão.Uma região não-traduzida 3' é um polinucleotídeo localizado ajusante de uma seqüência codificante. Seqüências sinais de poliadenilação eoutras seqüências codificando sinais reguladores capazes de afetarem aadição de tratos ácido poliadenílico à extremidade 3' do precursor ARNmsão regiões não-traduzidas 3'. Uma região não-traduzida 5' é um polinucleo-tídeo localizado a montante de uma seqüência codificante.

Outros elementos não-traduzidos a montante ou a jusante inclu-em aperfeiçoadores. Aperfeiçoadores são polinucleotídeos que atuam paraaumento de expressão de uma região promotora. Aperfeiçoadores são bem-conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados a, região aperfeiço-adora SV40 e o elemento aperfeiçoador 35S.

A região de terminação pode ser nativa com a região de inicia-ção transcricional, pode ser nativa com a seqüência da presente invenção,ou pode ser derivada de uma outra fonte. Convenientes regiões de termina-ção são disponíveis do plasmídeo-Ti de A. tumefaciens, tais como as regiõesde terminação octopina sintase e nopalina sintase. Ver também Guerineau etal. (1991) MoL Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671 -674;Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Bailas etal. (1989) Nu-cleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res.15:9627-9639.

Onde apropriado, o(s) polinucleotídeo(s) pode(m) ser otimiza-do(s) para expressão aumentada na célula hospedeira transformada. Ouseja, as seqüências podem ser sintetizadas usando códons preferidos porcélulas hospedeiras para expressão aperfeiçoada, ou podem ser sintetiza-das usando códons em uma freqüência de utilização de códon preferida porhospedeiro. Geralmente, o teor GC do polinucleotídeo será aumentado. Ver,por exemplo, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para umadiscussão de utilização de códon preferida por hospedeiro. São conhecidosprocessos na técnica para síntese de polinucleotídeos preferidos por hospe-deiro. Ver, por exemplo, patentes U.S. 6 320 100; 6 075 185; 5 380 831; e 5436 391, pedido de patente publicado U.S. 20040005600 e 20010003849, eMurray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, aqui incorporado porreferência.

Em um aspecto da invenção, polinucleotídeos de interesse sãoalvejados para o cloroplasto para expressão. Desta maneira, onde o polinu-cleotídeo de interesse não é diretamente inserido no cloroplasto, o cassetede expressão adicionalmente pode conter um polinucleotídeo codificando umpeptídeo de trânsito para direcionar o nucleotídeo de interesse para os clo-roplastos. Tais peptídeos de trânsito são conhecidos na técnica. Ver, porexemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant MoL Biol. Rep. 9:104-126; Clark etal. (1989) J. BioL Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) PlantPhysiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Rés. Commun.196:1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

Os polinucleotídeos de interesse a serem alvejados para o clo-roplasto podem ser otimizados para expressão no cloroplasto para levar emconta diferenças em utilização de códon entre o núcleo de planta e esta or-ganela. Desta maneira, os polinucleotídeos de interesse podem ser sinteti-zados usando códons preferidos por cloroplastos. Ver, por exemplo, patenteU.S. 5 380 831, aqui incorporada por referência.

Este cassete de expressão em planta pode ser inserido em umvetor de transformação de planta, que permite a transformação de DNA emuma célula. Uma tal molécula pode consistir em um ou mais cassetes deexpressão, e pode ser organizada em mais de um vetor de molécula deDNA. Por exemplo, vetores binários são vetores de transformação de plantaque utilizam dois vetores de DNA não-contíguos para codificarem todas asfunções eis- e trans-atuantes para transformação de células de planta (Hel-Iens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Vetores sãoconstructos de polinucleotídeos projetados para transferência entre diferen-tes células hospedeiras. Vetores de expressão são um tipo de vetor tendouma habilidade de incorporar, integrar e expressar seqüências ou fragmen-tos de DNA heterólogos em uma célula estranha.

O vetor de transformação de planta compreende um ou maisvetores DNA para obtenção de transformação de planta. Por exemplo, éuma prática comum na técnica utilizar vetores de transformação de plantaque compreendem mais de um segmento de DNA contíguo. Estes vetoressão freqüentemente referidos na técnica como vetores binários. Vetores bi-nários assim como outros vetores com plasmídeos auxiliares são mais fre-qüentemente usados para transformação mediada com Agrobacterium, ondeo tamanho e complexidade de segmentos de DNA necessários para obter-seeficiente transformação é bem grande, e é vantajoso separar funções sobreseparadas moléculas de DNA. Vetores binários tipicamente contêm um vetorplasmídeo que contém as seqüências atuando eis requeridas para transfe-rência de DNA-T (tal como margem esquerda e margem direita), um marca-dor selecionável que é engenheirado para ser capaz de expressão em umacélula de planta, e um polinucleotídeo de interesse (isto é, um polinucleotí-deo engenheirado para ser capaz de expressão em uma célula de plantapara a qual geração de plantas transgênicas é desejada). Também presen-tes sobre este vetor plasmídeo são seqüências requeridas para replicaçãobacteriana. As seqüências de atuação eis são arranjadas em uma maneiraque permita eficiente transferência e expressão em células de planta. Porexemplo, a seqüência marcadora selecionável e a seqüência de interesseestão localizadas entre as bordas esquerda e direita. Freqüentemente umsegundo vetor plasmídeo contém os fatores atuantes - trans que mediamtransferência de DNA-T de Agrobacterium para células de planta. Este plas-mídeo freqüentemente contém as funções de virulência (genes Vir) quepermitem infecção de células de plantas por Agrobacterium, e transferênciade DNA por clivagem em seqüências de borda e transferência de DNA me-diada - vir, como entendido na técnica (Hellens and Mullineaux (2000)Trends in Plant Science, 5:446-451). Vários tipos de linhagens de Agrobacte-rium (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) podem serusados para transformação de planta. O segundo vetor plasmídeo não é ne-cessário para introdução de polinucleotídeos em plantas através de outrosprocessos como micro projeção, micro injeção, eletroporação, poletileno gli-col, etc.

A presente invenção ainda provê plantas transgênicas compre-endendo mais de um dos polinucleotídeos da invenção para elevar a ativida-de da desejada enzima acima de um amplo espectro de temperaturas. Aque-les versados na técnica reconhecerão que várias diferentes estratégias po-dem ser utilizadas para geração de uma tal planta ou parte de planta incluin-do, mas não limitado ao seguinte:

Enzima fundida. Neste aspecto da invenção, o primeiro polinu-cleotídeo está posicionado no vetor de planta diretamente a jusante de pelomenos o segundo polinucleotídeo sob a direção de um promotor simples.Alternativamente, o primeiro e pelo menos o segundo polinucleotídeos po-dem ser separados e colocados sob a direção de diferentes promotores den-tro de um constructo simples.

Dois ou mais polinucleotídeos, um constructo. Neste vetor deexpressão, ambos, o primeiro e pelo menos o segundo polinucleotídeos sãocolocados sob o controle de promotores separados, em um constructo deplasmídeo simples. Isto permite a expressão de cada polinucleotídeo comouma entidade separada; entretanto, o tandem pode comportar-se na progê-nie de planta como um Iocus simples.

Dois ou mais polinucleotídeos, um promotor. O promotor de ví-rus de estria de milho é um promotor bi-funcional capaz de expressar genesem duas direções. Usando este promotor, transcrição pode ser iniciada so-bre fitas opostas no vetor e em direções opostas. Por isso, cada polinucleo-tídeo pode ser expresso a partir de um promotor simples.

Dois ou mais polinucleotídeos, dois ou mais constructos. Emuma outra abordagem, duas ou mais construções vetores separados sãofabricados, cada uma contendo um dos polinucleotídeos sob a direção dediferentes promotores. Esta abordagem requer que a planta seja duplamentetransformada.

Células modificadas de acordo com a presente invenção sãocontempladas em cada estágio da invenção. Esta invenção ainda contemplaa introdução de pelo menos um polinucleotídeo cuja atividade de enzima éótima dentro de uma faixa de temperatura que se estende além daquela daenzima nativa e pelo que amplia a faixa de temperatura na qual a enzima éativa na célula.

Células hospedeiras são úteis para fabricação, estocagem, re-produção ou manipulação de construções de polinucleotídeo da invenção.Células hospedeiras contempladas são células eucarióticas, tais como célu-las de planta ou levedura. Células hospedeiras procarióticas contendo cons-truções e/ou vetores de acordo com a invenção também são contempladas(isto é, E. coli).

I.D. Plantas e Partes de Plantas

Como aqui usado, uma planta refere-se a uma planta integral,um órgão de planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), uma semente,uma célula de planta, um propágulo, um embrião, e progênie dos mesmos.Células de plantas podem ser diferenciadas ou não-diferenciadas (por e-xemplo, calo, suspensão de células em cultura, protoplastos, células de fo-lhas, células de raiz, células de floema, pólen). A presente invenção podeser usada para introdução de polinucleotídeos em qualquer espécie de plan-ta, incluindo, mas não limitado a, monocotiledôneas, e dicotiledôneas. E-xemplos de plantas de interesse incluem, mas não são limitados a, milho,sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, tabaco, algodão, arroz,soja, beterraba - sacarina, cana-de-açúcar, tabaco, cevada e colza, Brassicasp., alfafa, centeio, painço, açafrão, amendoins, bata doce, mandioca, café,coco, abacaxi, árvores cítricas, cacau, chá, banana, abacate, figo, goiaba,manga, oliva, papaia, caju, macadame, amêndoa, aveias, vegetais, orna-mentais e coníferas.

Vegetais incluem, mas não são limitados a, tomates, alface, fei-jões verdes, feijões lima, ervilhas, e membros do gênero Curcumis tais comopepino, cantalupo, e melão moscado. Ornamentais incluem, mas não sãolimitados a, azálea, hidrângea, hibiscos, rosas, tulipas, narciso dos prados,petúnias, violetas, poinsétia, e crisântemo. Plantas de colheita também sãode interesse, incluindo, por exemplo, milho, sorgo, trigo, girassol, tomate,crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba - sacarina, ca-na-de-açúcar, tabaco, cevada, colza, etc.Esta invenção é apropriada para qualquer membro da família deplanta monocotiledônea incluindo, mas não limitado a, milho, arroz, cevada,aveias, trigo, sorgo, centeio, cana-de-açúcar, abacaxi, inhames, cebola, ba-nana, coco, e tâmaras.

II. Processos

A presente invenção provê processos para conferir uma caracte-rística de interesse para uma planta através de introdução em uma plantapelo menos (a) um primeiro polinucleotídeo heterólogo codificando um pri-meiro polipeptídeo capaz de conferir a dita característica de interesse, e (b)um segundo polinucleotídeo heterólogo codificando um segundo polipeptí-deo capaz de conferir a dita característica de interesse, onde os ditos primei-ro e segundo polinucleotídeos são estavelmente expressos na dita planta, eonde a dita planta mostra a dita característica de interesse sobre um espec-tro mais amplo de uma condição fisiológica ou ambiental comparada a umplanta compreendendo tanto o dito primeiro como o segundo polinucleotídeoexpresso sozinho e submetida ao dito espectro de condição fisiológica ouambiental. Em outros aspectos da invenção, um segundo polinucleotídeoheterólogo é introduzido em uma planta que já abriga um primeiro polinucle-otídeo heterólogo. Da mesma maneira, um processo para conferir uma ca-racterística de interesse também pode compreender (a) provimento de umaplanta transgênica compreendendo um primeiro polinucleotídeo heterólogocodificando um primeiro polipeptídeo capaz de conferir a dita característicade interesse, e (b) introdução na dita planta de pelo menos um segundo po-linucleotídeo heterólogo codificando um segundo polipeptídeo capaz de con-ferir a dita característica de interesse, onde os ditos primeiro e segundo poli-nucleotídeos são estavelmente expressos na dita planta, e onde a dita plantamostra a dita característica de interesse sobre um espectro mais amplo deuma condição fisiológica ou ambiental comparada a uma planta compreen-dendo tanto o dito primeiro como segundo polinucleotídeo expresso sozinhoe submetida ao dito espectro de uma condição fisiológica ou ambiental. Ca-racterísticas relevantes de interesse são descritas acima, incluindo por e-xemplo, resistência a herbicida e rendimento de planta.Em um tal processo, pelo menos dois polinucleotídeos codifi-cando polipeptídeos que conferem resistência a um herbicida de interessesão introduzidos em uma planta, onde expressão dos pelo menos dois poli-nucleotídeos aumenta atividade de enzima sobre um espectro mais amplode temperaturas que expressão de qualquer um dos polinucleotídeos sozi-nho. Como aqui discutido em outro ponto, vários polinucleotídeos podem serempregados no processo incluindo, mas não limitado a, seqüências EPSPque conferem resistência a glifosato.

Os processos mostrados também podem ser usados para aper-feiçoamento de rendimento de planta, isto é, a qualidade e/ou quantidade debiomassa produzida pela planta. Biomassa é uma quantidade ou peso men-surável de um produto planta. Um aumento em produção de biomassa équalquer aperfeiçoamento no rendimento do produto planta medido. Aumen-to de rendimento de planta tem várias aplicações comerciais. Por exemplo,aumento de biomassa de folha de planta pode aumentar o rendimento devegetais folhosos para consumo humano ou animal. Adicionalmente, aumen-to de biomassa de folha pode ser usado para aumentar produção de produ-tos industriais ou farmacêuticos derivados de planta. Um aumento em ren-dimento pode compreender qualquer aumento estatisticamente significanteincluindo, mas não limitado a, pelo menos um aumento de 1%, pelo menosum aumento de 3%, pelo menos um aumento de 5%, pelo menos um au-mento de 10%, pelo menos um aumento de 20%, pelo menos um aumentode 30%, pelo menos um aumento de 50%, pelo menos um aumento de 70%,pelo menos um aumento de 100% ou um aumento maior.

Plantas produzidas usando os processos mostrados podem sertratadas com uma concentração efetiva de um herbicida, onde a aplicaçãode herbicida resulta em aperfeiçoado rendimento de planta. Uma concentra-ção efetiva é uma concentração que permite o rendimento aumentado naplanta. Tais concentrações efetivas para herbicidas de interesse são geral-mente conhecidas na técnica. O herbicida pode ser aplicado tanto pré- comopós-emergência de acordo com técnicas usuais para aplicação de herbicidaa campos compreendendo colheitas que foram tornadas resistentes ao her-bicida.

II.A. Transformação de Planta

Processos da invenção envolvem introdução de um ou mais po-linucleotídeos em uma planta através de apresentação de polinucleotídeo àplanta em uma maneira tal que o polinucleotídeo ganha acesso ao interior deuma célula da planta. Os processos da invenção não requerem que um par-ticular processo para introdução de um polinucleotídeo em uma planta sejausado, somente que o polinucleotídeo ganhe acesso ao interior de pelo me-nos uma célula da planta.

Introdução de um polinucleotídeo em células de planta é realiza-da através de uma de várias técnicas conhecidas, incluindo mas não limitadoa, eletroporação ou transformação química (ver, por exemplo, Ausubel, ed.(1994) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.,Indianapolis, Indiana. Marcadores conferindo resistência a substâncias tóxi-cas são úteis na identificação de células transformadas (tendo tomado e ex-presso a seqüência polinucleotídeo teste) de células não-transformadas da-quelas não contendo ou não expressando a seqüência polinucleotídeo tes-te). Em um aspecto da invenção, genes são úteis como um marcador paraavaliar introdução de DNA em células de planta. Plantas transgênicas, plan-tas transformadas, ou plantas estavelmente transformadas, ou células, teci-dos ou semente de qualquer uma das anteriores, referem-se a plantas queincorporaram ou integraram polinucleotídeos exógenos na célula de planta.Transformação estável refere-se a introdução de um constructo de polinu-cleotídeo em uma planta de modo que ela se integra no genoma da planta eé capaz de ser herdada por sua progênie.

Em geral, processos de transformação de planta envolvemtransferência de DNA heterólogo em células de planta alvo (por exemplo,embriões imaturos ou maduros, culturas em suspensão, calo não-diferenciado, protoplastos, etc.), seguido por aplicação de um nível limitemáximo de apropriada seleção (dependendo do gene marcador estável) pa-ra recuperar as células de planta transformadas de um grupo de uma massade células não-transformadas. Explantes são tipicamente transferidos paraum suprimento recente do mesmo meio e cultivado normalmente. Subse-qüentemente, a células transformadas são diferenciadas em brotos apóscolocação sobre meio de regeneração suplementado com um nível máximolimite de agente de seleção (isto é, temperatura e/ou herbicida). Os brotossão então transferidos para um meio seletivo de formação de raízes pararecuperação de brotos com raízes ou plântulas. A plântula transgênica entãocresce em planta madura e produz sementes férteis (por exemplo, Hiei et al.(1994) Plant J. 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14:745-750).Uma descrição genérica das técnicas e processos para geração de plantastransgênicas é encontrada em Ayres and Park (1994) CRC Crit. Ver. PlantSei. 13:219-239, e Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Umavez que o material transformado contém muitas células, ambas célulastransformadas e não-transformadas estão presentes em qualquer peça decalo ou tecido ou grupo de células alvo submetido. A habilidade para matarcélulas não-transformadas e permitir células transformadas proliferarem re-sulta em culturas de planta transformada. Freqüentemente, a habilidade pararemover células não-transformadas é uma limitação para rápida recuperaçãode células de planta transformadas e geração bem-sucedida de plantastransgênicas. Então processos moleculares e bioquímicos podem ser usa-dos para confirmação de presença do nucleotídeo(s) integrado de interesseno genoma de planta transgênica.

Geração de plantas transgênicas pode ser realizada através deum de vários processos, incluindo mas não limitado a, introdução de DNAheterólogo através de Agrobacterium em células de planta (transformaçãomediada por Agrobacterium), bombardeio de células de planta com DNAestranho heterólogo aderido a partícula, e vários outros processos mediados- diretos não-partícula (por exemplo, Hiei et al. (1994) Plant J. 6:271-282;Ishida et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14:745-750; Ayres and Park (1994) CRCCrit. fíev. Plant Sei. 13:219-239; Bommineni and Jauhar (1997) Maydica42:107-120) para transferir AND.

Existem três processos comuns para transformar células deplanta com Agrobacterium. O primeiro processo é co-cultura de Agrobacteri-um com protoplastos isolados cultivados. Este processo requer um sistemade cultura estabelecido que permita cultura de protoplastos e regeneraçãode planta a partir de protoplastos cultivados. O segundo processo é trans-formação de células ou tecidos com Agrobacterium. Este processo requer(a) que as células ou tecidos de planta possam ser transformadas por Agro-bacterium e (b) que as células ou tecidos transformados possam ser introdu-zidos para regeneração em plantas integrais. O terceiro processo é trans-formação de sementes, ápices, ou meristemas com Agrobacterium. Esteprocesso requer micro - propagação.

Eficiência de transformação através de Agrobacterium pode seraperfeiçoada através de uso de um número de processos conhecidos natécnica. Por exemplo, a inclusão de uma molécula de resposta de ferimentonatural como aceto siringona (AS) à cultura de Agrobacterium foi mostradaaperfeiçoar eficiência de transformação com Agrobacterium tumefaciens(Shahla et al. (1987) Plant Molec. Biol. 8:291-298). Alternativamente, eficiên-cia de transformação pode ser aperfeiçoada através de ferimento de tecidoalvo a ser transformado. Ferimento de tecido de planta pode ser obtido, porexemplo, através de puncionamento, maceração, bombardeio com micropro-jéteis, etc. Ver, por exemplo, Bidney et al. (1992) Plant Molec. Biol. 18:301-313.

Em um outro aspecto da invenção, as células de planta sãotransfectadas com vetores via bombardeio de partículas (isto é, com umapistola de gene). Processos de transferência de gene mediada com partícu-las são conhecidos na técnica, são comercialmente disponíveis, e incluem,mas não são limitados a, o instrumento de liberação de gene acionado comgás descrito em McCabe, patente U.S. 5 584 807, o inteiro conteúdo da qualé aqui incorporado por referência. Este processo envolve revestimento deseqüência de polinucleotídeo de interesse sobre partículas de metal pesado,e aceleração de partículas revestidas sob a pressão de gás comprimido paraliberação para o tecido alvo.

Outros processos de bombardeio de partículas também são dis-poníveis para a introdução de seqüências de polinucleotídeos heterólogasem células de planta. Geralmente, estes processos envolvem deposição deseqüência de polinucleotídeos de interesse sobre a superfície de pequenaspartículas densas de um material tal como ouro, platina ou tungstênio. Aspartículas revestidas são elas próprias então revestidas sobre uma superfí-cie rígida, tal como uma placa de metal, ou sobre uma folha carreadora fa-bricada de um material frágil tal como mylar. A folha revestida é então acele-rada na direção de tecido biológico alvo. O uso da folha plana gera um espa-Ihamento uniforme de partículas aceleradas que maximiza o número de célu-las recebendo partículas sob condições uniformes, resultando na introduçãoda amostra de polinucleotídeo no tecido alvo.

Específicos sinais de iniciação também podem ser usados paraobtenção de tradução mais eficiente de seqüências codificando o polipeptí-deo de interesse. Tais sinais incluem o códon de iniciação ATG e seqüên-cias adjacentes. Em casos onde seqüências codificando o polipeptídeo deinteresse, seu códon de iniciação, e seqüências a montante são inseridos noapropriado vetor de expressão, nenhum adicional sinal de controle traducio-nal ou transericional pode ser necessário. Entretanto, em casos onde so-mente seqüência codificante, ou uma sua porção, é inserida, sinais controlestraducionais exógenos incluindo o códon de iniciação ATG devem ser provi-dos. Além disso, o códon de iniciação deve estar no correto quadro de leiturapara assegurar tradução da inserção inteira. Elementos traducionais exóge-nos e códons de iniciação podem ser de várias origens, naturais e sintéticas.A eficiência de expressão pode ser aperfeiçoada através de inclusão de a-perfeiçoadores que são apropriados para o particular sistema de célula queé usado, tais como aqueles descritos na literatura (Scharf et al. (1994) Re-sults Probl. Cell Differ. 20:125).

As células que foram transformadas podem ser desenvolvidasem plantas de acordo com maneiras convencionais. Ver, por exemplo, Mc-Cormick et al. (1986) Plant Cell Rep. 5:81-84. Estas plantas então podem sercrescidas, e polinizadas com a mesma linhagem transformada ou diferenteslinhagens, e o resultante híbrido tendo expressão constitutiva da desejadacaracterística fenotípica identificada. Duas ou mais gerações podem ser de-senvolvidas para assegurar que expressão da desejada característica feno-típica seja estavelmente mantida e herdada e então sementes colhidas paraassegurar que expressão da desejada característica fenotípica foi obtida.Desta maneira, a presente invenção provê semente transformada (tambémreferida como semente transgênica) tendo um polinucleotídeo da invenção,por exemplo, um cassete de expressão da invenção, estavelmente incorpo-rado em seu genoma.

Plantas transgênicas da invenção podem ser homozigoto paraos polinucleotídeos adicionados; isto é, uma planta transgênica que contémduas seqüências adicionadas, uma seqüência no mesmo Iocus sobre cadacromossoma de um par de cromossomas. Uma planta transgênica homozi-goto pode ser obtida através de emparelhamento sexual (selfing) de umaplanta transgênica segregante independente que contém a seqüências adi-cionadas de acordo com a invenção, germinando algumas das sementesproduzidas e analisando as resultantes plantas produzidas para aperfeiçoa-da atividade de enzima (isto é, resistência a herbicida) e/ou aumentado ren-dimento de planta em relação a uma planta transgênica segregante inde-pendente ou um controle (nativa, não-transgênica).

É para ser entendido que duas plantas transgênicas diferentestambém podem ser unidas para produção de descendência que contém doispolinucleotídeos exógenos, adicionados, segregando independentemente.Auto fecundação de progênie apropriada pode produzir plantas que são ho-mozigoto para todos polinucleotídeos exógenos, adiei onados, que codificamum polipeptídeo da presente invenção. Retro-cruzamento para uma plantaparente e cruzamento com uma planta não-transgênica também são con-templados.

II. B. Avaliação de Plantas Transformadas

Seguindo introdução de DNA em células de plantas, a transfor-mação ou integração do polinucleotídeo no genoma de planta é confirmadaatravés de vários processos tal como análise de polinucleotídeos, polipeptí-deos e metabólitos associados com a seqüência integrada.

Análises PCR é um processo rápido para selecionar células, te-cido ou brotos para a presença de gene incorporado no estágio inicial antesde transplante no solo (Sambrook and Russell (2001) Molecular Clonina: ALaboratorv Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Har-bor, New York. PCR é realizada usando iniciadores oligonucleotídeos espe-cíficos para o nucleotídeo de interesse ou fundo de vetor Agrobacterium, etc.

Introdução de DNA pode ser confirmada por análises Southernblot de DNA genômico (Sambrook and Russell (2001) supra). Em geral, DNAtotal é extraído da célula ou organismo, digerido com apropriadas enzimasde restrição, fracionado em um gel de agarose e transferido para uma mem-brana de nitrocelulose ou náilon A membrana ou mancha é então sondadacom, por exemplo, fragmento de DNA alvo marcado com 32P para confirmara integração de DNA introduzido no genoma de planta de acordo com técni-cas padrões (Sambrook and Russell (2001) supra).

Em análises Northern, RNA é isolado de específicos tecidos dacélula ou organismo, fracionado em um gel de agarose formaldeído, e man-chado sobre um filtro de nylon de acordo com procedimentos padrões quesão rotineiramente usados na técnica (Sambrook and Russell (2001) supra).Expressão de RNA codificado pelo polinucleotídeo da presente invenção éentão testada através de hibridização de filtro para uma sonda radioativaderivada da seqüência de interesse, através de processos conhecidos natécnica (Sambrook and Russell (2001) supra).

Ensaios de Western blot e bioquímicos e semelhantes podemser realizados sobre as plantas transgênicas para determinar a presença depolipeptídeo codificado pelo nucleotídeo(s) de interesse através de procedi-mentos padrões (Sambrook and Russell, 2001) usando anticorpos que ligamum ou mais epítopos presentes sobre o polipeptídeo de resistência a herbi-cida.

Exemplos

Exemplo 1

EPSP Sintases para Resistência Glifosato

A seqüência codificando DNA e a seqüência de aminoácidos doquadro de leitura aberto grg8 são providas no pedido de patente provisórioU.S. 60/640 195 depositado em 29 de dezembro de 2004, aqui mostradascomo SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 deste pedido de patente, respectiva-mente.

A seqüência codificando DNA e a seqüência de aminoácidos doquadro de leitura aberto grg23 são providas no pedido de patente provisóriaU.S. 60/741 166, depositado em 1 de dezembro de 2005, e mostradas comoSEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 deste pedido de patente, respectivamente.

A seqüência codificando DNA e seqüência de aminoácidos doquadro de leitura aberto grg1 são providas no pedido de patente provisórioU.S. 10/739 610, depositado em 18 de dezembro de 2003, e mostradas co-mo SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 deste pedido de patente, respectivamente.

A seqüência codificando DNA e seqüência de aminoácidos doquadro de leitura aberto grg20 são mostradas como SEQ ID NO: 7 e SEQ IDNO: 8 deste pedido de patente, respectivamente. Estas EPSPS são descri-tas na técnica como de Sulfolobus solfataricus (American Type Culture Gol-lection Accession No. 35092D). O pedido de patente provisória U.S. 60/658320, depositado em 12 de janeiro de 2006, descreve a descoberta de seuuso como conferindo resistência a herbicida e ensina domínios anunciadoresde tal resistência.

Exemplo 2

Atividade de EPSP Sintase Para Determinação de Temperatura Ótima

Enzimas EPSP sintase resistentes a glifosato individuais foramsuperexpressas em E. coli e purificadas para homogeneidade através deprocessos padrão. Para medir atividade de enzima, cada enzima foi diluídapara uma apropriada concentração de ensaio em tampão contendo HEPES(50 mM, pH 7) e KCI 50 mM, e então incubada por 15 minutos a 10, 20, 30,40, 50 ou 60°C. Seguindo incubação, cada enzima foi aquecida para 90°Cpor 1 minutos para desnaturar a enzima, e então resfriada para 4°C. O fosfa-to gerado por cada reação foi então adicionado a um segundo ensaio con-tendo inosina, nucleosídeo purina fosforilase, xantina oxidase, raiz forte pe-roxidase, e o substrato fluorescente Amplex Red (ver, pedido de patenteprovisório U.S. 60/741 166, depositado em 1 de dezembro de 2005). Se-guindo incubação por 15 minutos em temperatura ambiente, produto fluores-cente foi quantificado usando um espectrofluorômetro Gemini XPS (Molecu-lar Devices Corporation of Sunnyvale, Califórnia). Formação de produtoEPSP sintase foi feita gráfico como uma porcentagem da temperatura querendeu atividade máxima, como mostrado na Figura 1.

Exemplo 3

Atividade EPSP Sintase Para Determinação de pH Ótimo

Enzimas EPSP sintase resistentes a glifosato individuais foramsuperexpressas em E. coli e purificadas para homogeneidade através deprocessos padrão. Para medir atividade de enzima, cada enzima foi diluídapara uma apropriada concentração de ensaio em tampão contendo HEPES(50 mM, pH 7) e KCI 50 mM, e então incubada por 15 minutos com tampõescalibrados para pHs variando de pH 6,0 a pH 8,0. Seguindo incubação, cadaenzima foi aquecida a 90°C por 1 minuto para desnaturar a enzima, e entãoresfriada para 4°C. O fosfato gerado por cada reação foi então adicionado aum segundo ensaio contendo inosina, nucleosídeo purina fosforilase, xantinaoxidase, raiz forte peroxidase, e o substrato fluorescente Amplex Red (ver,pedido de patente provisório 60/741 166, depositado em 1 de dezembro de2005). Seguindo incubação por 15 minutos em temperatura ambiente, produ-to fluorescente foi quantificado usando um espectrofluorômetro Gemini XPS(Molecular Devices Corporation of Sunnyvale, Califórnia). Formação de pro-duto de EPSP sintase foi feita gráfico como uma porcentagem da temperatu-ra que rendeu máxima atividade, como mostrado na Figura 2 e Tabela 1 a-baixo. GRG23 tem um pH ótimo em, ou abaixo de 6, enquanto GRG1 obtématividade máxima em pH 7,0. Em pH 7,5, GRG1 tem uma maior porcenta-gem de atividade que GRG23. Assim, uma célula de planta expressandoambos GRG1 e GRG23 terá aperfeiçoada atividade em uma faixa de pH en-tre pH 6,0 e pH 7,5 como comparada a uma célula de planta expressandoGRG1 ou GRG2 sozinho.Tabela 1

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Exemplo 4

Atividade EPSP Sintase Para Determinação de Ótima Concentração de SalEnzimas EPSP sintase resistentes a glifosato individuais foram

superexpressas em E. coli e purificadas para homogeneidade através deprocessos padrão. Para medir atividade de enzima, cada enzima foi diluídapara uma apropriada concentração de ensaio em tampão contendo HEPES(50 mM, pH 7) e KCI 50 mM, e então incubada por 15 minutos com tampõessuplementados com várias quantidades de KCI variando de 50 mM a 200mM. Seguindo incubação, cada enzima foi aquecida para 90°C por 1 minutopara desnaturar a enzima, e então resfriada para 4°C. O fosfato gerado porcada reação foi então adicionado a um segundo ensaio contendo inosina,nucleosídeo purina fosforilase, xantina oxidase, raiz forte peroxidase, e osubstrato fluorescente Amplex Red (ver pedido de patente provisória U.S.60/741 166, depositado em 1 de dezembro de 2005). Seguindo incubaçãopor 15 minutos em temperatura ambiente, produto fluorescente foi quantifi-cado usando um espectrofluorômetro Gemini XPS (Molecular Devices Cor-poration of Sunnyvale, Califórnia). Formação de produto EPSP sintase foifeita gráfico como uma porcentagem da concentração de KCI que rendeuatividade máxima, como mostrado na Tabela 2 abaixo. GRG23 tem atividademáxima em uma concentração de KCI menor que GRG1. Por isso, umaplanta expressando ambos GRG1 e GRG2 terá uma atividade de enzimamaior sobre uma mais ampla faixa de concentrações de sal comparada auma planta expressando GRG1 ou GRG2 sozinho.

Tabela 2

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Exemplo 5

Transformação de Planta Através de Bombardeio Com Partículas

Espigas de milho são colhidas melhores 8-12 dias após poliniza-ção. Embriões são isolados das espigas, e aqueles embriões de 0,8-1,5 mmem tamanho são usados para transformação. Embriões são revestidos "scu-tellum" para cima sobre apropriados meios de incubação. Meios DN62A5Ssão uns de tais meios e são preparados como se segue: combinar 3,98 g/Lsais N6; 1 mUL (de estoque 1000x) vitaminas N6; L-asparagina 800 mg/L;mio-inositol 100 mg/L; L-prolina 1,4 g/L; casamino ácidos 100 mg/L; sacaro-se 50 g/L; 1 mL/L (de estoque 1 mg/mL) 2,4-D); ajustar para pH 5,8 comKOH 1 N / KCI 1N; adicionar gelrite (Sigma) em uma concentração de 3 g/L;após autoclavagem e resfriamento para 50°C, 2 mUL de uma solução esto-que 5 mg/mL de Nitrato de Prata (Phytotechnology Labs) são adicionados emeios são vertidos em placas. Meios e sais outros que não DN62A5S tam-bém são apropriados e são conhecidos na técnica. Embriões são encubadospor toda noite a 25°C no escuro. Embriões também podem ser incubadospor tempos variáveis suficientes para obtenção de transformação de planta.

Os resultantes explantes são transferidos para quadrados detela (30-40 por placa), transferidos sobre meios osmóticos por cerca de 30-45 minutos, então transferidos para uma placa radiante (ver, por exemplo,publicação internacional PCT WO 0138514 e patente U.S. 5 240 842).Construções de DNA projetados para expressarem uma primeirae segunda EPSP sintase com variáveis cinéticas ótimas em células de plan-ta são aceleradas em tecido de planta usando um acelerador de feixe aeros-sol, usando condições essencialmente como descrito em publicação interna-cional PCT WO 01/38514. Após radiantes, embriões são incubados por cer-ca de 30 minutos sobre meios osmóticos, e colocados sobre meios de incu-bação por toda noite a 25°C no escuro. É tomado cuidado para evitar danifi-car indevidamente explantes radiantes, por exemplo, através de incubaçãode embriões por pelo menos 24 horas antes de transferência para meios derecuperação. Embriões são então espalhados sobre meios de período derecuperação, por cerca de 5 dias, 25°C no escuro, e então transferidos parameios de seleção. Explantes são incubados em meios de seleção por atéoito semanas, dependendo da natureza e características da particular sele-ção utilizada. Após o período de seleção, o calo resultante é transferido parameios de maturação de embrião, até a formação de embriões somáticosmaduros ser observada. Os resultantes embriões somáticos maduros sãoentão colocados sob luz baixa e o processo de regeneração é iniciado atra-vés de processos conhecidos na técnica. Os resultantes brotos são deixadosenraizar sobre meios de formação de raízes, e as resultantes plantas sãotransferidas para potes de planta e propagadas como plantas transgênicas.As plantas são ensaiadas para aperfeiçoada resistência a glifosato sobreuma faixa mais ampla de uma condição fisiológica ou ambiental (por exem-plo, temperatura, pH, concentração de um substrato para os ditos primeiro esegundo polipeptídeos, concentração de um co-fator para o dito primeiro esegundo polipeptídeos, concentração de radicais livres ou doadores de radi-cais livres, concentração de um inibidor do dito primeiro e segundo polipeptí-deos, ou concentração de um catalisador dos ditos primeiro e segundo poli-peptídeos) que quando somente uma seqüência ESP simples é expressa.

Alternativamente, as plantas podem ser ensaiadas para aumento em rendi-mento quando comparadas a expressão de somente uma das seqüências deEPSP sintase.Exemplo 6

Transformação de Células de Planta Através de Transformação Mediada PorAgrobacterium

Espigas são coletadas 8-12 dias após polinização. Embriões sãoisolados das espigas, e aqueles embriões de cerca de 0,8-1,5 mm em tama-nho são usados para transformação. Embriões são revestidos com lado deescutelo para cima sobre apropriados meios de incubação, e incubados portoda noite a 25°C no escuro. Embriões também podem ser incubado portempos variáveis como suficientes para obtenção de transformação de plan-ta. Embriões são contactados com uma linhagem de Agrobacterium conten-do os apropriados vetores tendo duas seqüências de EPSP sintase que sãocapazes de conferirem resistência a glifosato e tendo cinética ótima variávelpara transferência mediada plamídeo Ti por cerca de 5-10 minutos, e entãorevestidos sobre meios de co-cultivo por cerca de 3 dias (25°C no escuro).Após co-cultivo, explantes são transferidos para meios de período de recu-peração por cerca de cinco dias (a 25°C no escuro). Explantes são incuba-dos em meios de seleção por até oito semanas, dependendo da natureza ecaracterísticas da particular seleção utilizada. Após o período de seleção, ocalo resultante é transferido para meios de maturação de embrião, até aformação de embriões somáticos maduros ser observada. Os resultantesembriões somáticos maduros são então colocados sob luz baixa, e o pro-cesso de regeneração é iniciado como conhecido na técnica. Os resultantesbrotos são deixados enraizarem sobre meios de formação de raiz, e as re-sultantes plantas são transferidas para potes de plantas e propagadas comoplantas transgênicas. As plantas são ensaiadas para áperfeiçoada resistên-cia a glifosato sobre uma faixa mais ampla de uma condição fisiológica ouambiental (por exemplo, temperatura, pH, concentração de um substratopara o dito primeiro e segundo polipeptídeos, concentração de um co-fatorpara o dito primeiro e segundo polipeptídeos, concentração de radicais livresou doadores de radicais livres, concentração de um inibidor dos ditos primei-ro e segundo polipeptídeos, ou concentração de um catalisador dos ditosprimeiro e segundo polipeptídeos) que quando somente uma seqüênciaEPSP sozinha é expressa. Alternativamente, as plantas podem ser ensaia-das para aumentado rendimento quando comparadas a expressão de so-mente uma das seqüências de EPSP sintase.

Todas as publicações e pedidos de patente mencionados no re-latório descritivo são indicativos do nível de conhecimento daqueles versa-dos na técnica à qual esta invenção pertence. Todas as publicações e pedi-dos de patente são aqui incorporados por referência na mesma extensãocomo se cada publicação individual ou pedido de patente fosse específica eindividualmente indicado para ser incorporado por referência.

Embora a invenção anterior tenha sido descrita em alguns deta-lhes por meio de ilustração e exemplo para propósitos de clareza de enten-dimento, certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro doescopo das reivindicações apostas. Muitas modificações das invenções aquimostradas serão visíveis para aqueles versados na técnica à qual estas in-venções pertencem tendo o benefício dos ensinamentos apresentados nasdescrições anteriores e os desenhos associados. Por isso, é para ser enten-dido que as invenções não são limitadas aos específicos exemplos mostra-dos e que modificações e outros exemplos são pretendidos serem incluídosdentro do escopo das reivindicações apostas. Embora termos específicossejam aqui empregados, eles são usados somente em um sentido genéricoe descritivo e não para propósitos de limitação.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Athenix CorporationKoziel, Michael G.Schouten, Laura CooperVande Berg, Brian

<120> PROCESSOS E COMPOSIÇÕES PARA APERFEIÇOADA ATIVIDADEDE ENZIMA EM PLANTAS TRANSGÊNICAS

<130> 025394-0360149

<140> PCT/US2007/063132<141> 2007-03-02

<150> 60/891977<151> 2007-02-28

<150> 60/778283<151> 2006-03-02

<160> 8

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 2000

<212> DNA

<213> Brevundimonas vesicularis<220>

<221> RFGIÃO nnniFICANTF

<222> (296)..(1555)

<400> 1

ggtttcgtcg aattgcagca gtcgctggag cggaccgaaa acgaaatcca gatgtcgcgc 60

cgctattaca acggtgccgc acgcgatctg aacgtcaagg tcgagacctt cccgaacaat 120

ctcattgccg gccccttcgg cttcgtcaag aaggcctatt tcgagatcac caacgaggcc 180

gatcgcgccg ttcccacggt caagttctaa gattttcgct atcggttttt catgcaaggc 240

ggtaaaggat ggccgaccgc cggccatcgg ccgttttcct gactgaccaa agagaatgat 300

gatgggtaga gccaaactca cgattatccc gccgggcaag cctttgaccg gacgcgccat 360

gccgccggga tcgaagtcga tcaccaaccg cgcattgctg ctcgccggcc tcgccaaggg 420

cacgagccgg ctaaccggtg cgctgaagag cgacgatacc cgctatatgg ccgaagcgct 480

gcgtgcgatg ggtgtaacga tcgacgagcc cgacgacacc acgttcatcg tcaaaggcag 540

cggcaagctg cagccgccgg cagccccgct tttcctcggc aatgccggca cggcaacgcg 600

cttcctgacg gcggccgcgg cactggtgga cggcaaggtc atcgtcgacg gcgatgccca 660tatgcgoaag cggecgatcg gaccgccagt egaegegttg cgetcgctcg geatcgatge 720

ctcggctgaa accggctgcc cgccagtcac gatcaacggc accggccgct tcgaggcaag 780

ccgcgtgcag atcgatggcg gcctgtccag ccagtatgtc tcggcgctcc tgatgatggc 840

cgccggcggc gatcgcgctg togatgtcga gcttctcggc gaacatatcg gcgctctcgg 900

ctatatcgac ctgaccgttg cogccatgcg cgctttcggc gcgaaggttg agcgtgtgag 960

cccggtcgcc tggegegtcg agcccaccgg ctatcatgcg gccgacttcg tgatcgagcc 1020

ggatgcctct gctgcgacct atetctgggc cgccgaagtt ctgagcggcg gcaagatcça 1080

tctcggcacg ecggcggaae agttctcgca accggatgcg aaagcctatg atctgattcc 1140

gaaattcccg cotctgcctg ctgtcatcga cggctcgceg atgcaggacg ccatcccgac 1200

gctcgecgtt ctcgccgctt tcaacgaeat geetgtgcgc ttcgtcggta tegaaaaect 1260

gcgcgtcaag gaatgcgatc gtatccgcgc gctctcgagc ggoctatccc gcatcgttcc 1320

gaacctcggc acggaagagg gcgacgatct catcatcgcc tccgatccga gccttgccgg 1380

caaaatcctg accgcagaga togatagctt tgccgatcac cgcatcgcca tgagcittgc 144Q

gctggccggc ctgaagatcg gcggoattac cattctcgac cccgaotgcg tcgccaagac 1500

áttcccgtcc tactggaatg tgctgtcttc gctgggggtc gcctacgaag actgacgctc 1560

tgctcctata gsggcccgsg cgeggattta ttcttgacgc aaagcggcgc cggcascggc 1620

gccgcaggca tcttttgggg gaatgatgac acggctctgc gggtttttgc tggccctgtg 1680

cctgatgetfc tgtgcaacgg cggtgacggc cgccgagctc atcagcaatt ttgatcaggc 1740

aattgcgttg catcgtgatg gctccatgcg ggtcgtcgaa acgatttccg tcaatgccga 1800

ggggcgcgat atccgccgcg gcetctcccg cgatttcccg ctgaccttca tcgacgegaa 1860

aggccgtgaa agcgaggttg attttgcggt cgtctccgcc gagcgcgacg gcgagccgga 1920

agaatggcgt atcgaacgca teaaeggcgg tgagcgcatc tatatcggca atgcgcaaac -1960

atttctggat agcggtcctc 2000

<210> 2<211> 419<212> PRT

<213> Brevundimonas vesicularis<400> 2

Ket Met Met Gly Arg Ala Lys Leu 1Ehr Xle Ile Pro Pro Gly Lys Pxo15 10 15Leu Hir Gly Aia Met Pre Pro Gly ser Lys ser Ile Thr Asn Arg20 25 30

Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu Ala Lys Gly Thr Ser Arg Leu Thx Gly35 40 45

Ala Leu Lys Ser Asp Asp Tbr Arg Tyr Mec Ala Glu Ala Leu Arg Ala50 55 60

Met Gly Val Thr Ile Asp Glu ?ro Asp Asp Thr Thr filie Ile Val Lys65 70 75 BO

Gly Ser Gly Lys Leu Gln Pro Pro Ala Ala Pro Leu Phe Leu Gly Asn85 90 95

Ala Gly Thr Ala Thr Arg Phe Leu Thr Ala Ala Ala Ala Leu Val Aep100 105 110

Gly Lys vai Ile Val Asp Gly Asp Ala Bis Met Argr Lys Arg Pro Ile

115 120 125

Gly Pro Leu Val Asp Ala Leu Arg Ser Leu Gly Ile Asp Ala Ser Ala130 135 140

Glu Thr Gly Cys Pro Pro Val Thr Ile Asn Gly Thr Gly Arg Phe Glu145 150 155 160

Ala Ser Arg vai Gln Ile Asp Gly Gly Leu Ser Ser Gla Tyr vai Ser165 170 175

Ala Leu Leu Met Met Ala Ala Gly Gly Asp Arg Ala Val Asp Val Glu180 185 190

Leu Leu Gly Glu His Ile Gly Ala Leu Gly Tyr Ile Asp Leu Thr V®1195 200 205

Ala Ala Het Arg Ala Phe Gly Ala Lys Val Glu Arg Val Sex Pro Vel210 215 220

Ala Trp Arg Val Glu Pro Thr Gly Tyr Kis Ala Ala Asp Phe vai He225 230 235 240Glu Pro Asp Ala Ser Ala Ala I1Mr 'íyr Leu l'rp Ala Ala Glu Val Leu245 250 255

Ser Gly Gly Lys Ile Asp Leu Gly Thr Pro Ala Glu Gln Phe Ser Gln260 265 270

Pro Asp Ala, Lys Ala Tyr Asp Leu Ile Ser Lys Phe Pro His Leu Pxo275 2S0 285

Ala vai Ile Asp Gly ser Gln Met Gln Asp Ale Xle Pro Ttir Leu Ale290 295 300

Val Leu Ala Ala Phe Asn Glu Ifet Pro vai Arg Phe vai Gly Ile Glu305 310 315 320

Asn Leu Arg Vai Lys Glu Cys Asp Arg lie Arg Ala Leu Ser Ser Gly325 330 335

Leu Ser Arg Ile Val Pro Asn Leu Gly Thr Glu Glu Gly Aap Asp Leu340 345 350

Ile He Ala Ser Asp Pro Ser Leu Ala Gly Lys Ile Lea Thr Ala Glu355 360 365

Ile Asp Ser Phe Ala Asp His Arg Ile Ala Met Ser Phe Ala Leu Ala370 375 380

Gly Leu Lys Ile Gly Gly Ile Thr Ile Leu Asp Pro Asp Cys Val Ala385 390 395 4Ô0

Lys Thr Phe Pro Ser Tyr Trp Asn Val Leu Ser Ser Leu Gly Val Ala405 410 415

Tyr Glu Asp

<210* 3

<211> 1892

<212> DNA

<213> Arthrobacter giobiforrais<220>

<221> C0DING_REGI0N

<222> (109)(1426)

<223> Strain ATXSlS 08<22ϋ>

<221> misc_£eatxire<222» <1801)..(1801)<223* η = a, c, g, or t

<400> 3

gggaccacat gctgetectg atttcaggge tgctgccggt atggaccagg gtccagegag 60ggacggcacg catccgggcc cttatcggac caacgccaac agcggtcggt ggccttggag 120

cggggccagc acggccgatc açgtagacte tttggagctc cgctcgaaag gatcaccacg 180

gaaactgatc gactagtgat cccaggatcg aaaagcatca ccaaccgggc tttgcttttg 240

gctgccgcag cgaagggcac gtcggtcctg gtgagaccat tggtcagcgc cgatacctca 300

gcattcaaaa etgcaattca ggccctcggt gccaacgtct cagccgacgg tgacaattgg 360.

gtcgttgaag gcctgggtca ggcaccccac ctcgacgccg acatctggtg cgaggatgca 420

ggtaccgtgg cccggttcct ccctccattc gtcgccgcag gacaggggaa gttcaccgtc 480

gacggaagcg agcagctgcg gcggcgcccg cttcggcccc tggtcgacgg catccgccac 540

ctgggcgccc gcgtctcctc cgagcagctg cccctaacaa ttgaagcgag cgggctggca 600

ggcggggagt acgaaattga agcccatcag agcagccagt tcgcctccgg cccgaccaCg 660

gecgecccgt acgcgcgaca aggcctgcgt gtgcggatac caaatcocgt gagccagcce 720

tacctcacga tgacactgcg gatgatgagg gacttcggcc ttgagaccag caccgacgga 780

gccaccgtca gcgtccctcc cgggcgctac acagcccggc ggtatgaaat cgaaccogac 840

gcgtcaactg cgtcgtactt cgccgccgct tccgccgtct ctggccgaag cttcgaetCc 900

cagggccttg gcacagacag catccaaggc gacacgtcat tcttcaatgt acttgggcgg 960

ctcggtgcag aggtccactg ggcacccaac tcggtcacca tatccggacc ggaaaggctg 1020

aacggogaca ttgaagtgga tatgggcgag atatcggaca ccttcatgac actcgcggcg 1080

attgcccctc tagccgatgg acccatcacg ataaccaaca ttggccatgc acggtfcgaag 1140

gaatccgacc gcatctcggc gatggaaacc aacctgcgaa cgctcggtgt acaaaccgac 1200

gtcggacacg actggatgcg aatctacccc tctaccccgc acggcggcag agtcaattgc 1260

caccgggacc acaggatcgc catggcgttt tcaatcctgg gactgcgagt ggacgggatt 1320

accctcgacg accctcaatg tgtcgggaag acctttcctg gcttcttcga ecaccctgga 1380

cgccttttcc ccgaaaaggc gcttacgctc cccggetagt gacttcctct ccggeggacg 1440

ctaggcatcg gaaaacgaat cctgacatga ccgacctcct cgcgtcacgg cgcgtctgcc 1500ggtacceaag cattctgcct tegcogctte cgcggcceet catgcttcct ggccgcccag 1560

attttcatcc gggatgttgc ctgaccttga gcagggcaat cagctgttca gcactgtcaa 1620

tggtgtgggc cctgaaggcg gcttcgatgg ctgccacgtc ggcggctctc atcgctgtca 1680

cgacacgcag atgcgcttca taggcacgtt caggatccgc cctcgtcgcc tgatcctgag 1740

ccaaggcaat agttagatgt gcctccgttg gcggccagag ccgaagcaat aaggagtttt 1800

ncgaggccac ccagattccc cgggtggaag gegatacggg cttcatgctg aaccatgggg 1860

tccggatgga ogtgactttt caaetctgcc ca 1892

<21ô> 4<211> 436<212» PRT<213> Arthrobacter globiformis<220> <221> VARIANT<222> (1).►(436)<223> Strain ATX21308<400> 4

Ket Ala Leu Glu Arg Gly Gln Kis Gly Arg Ser Arg Arg Leu Pbe Gly

1 5 10 15

Ala Ser Leu Glu Arg He Thr Met Glu Thr Asp Arg Leu Val Tle Pro20 25 30

Gly Ser Lys Ser Ile Tbr Asn Arg Ala Leu Leu Leu Ala Ala Ala Ala35 40 45

Lya Glv Thr Ser Val Leu Val Arg Pro Leru Val Ser Ala Asp Thr Ser50 55 60

Ala Phe Lys Thr Ala Ile Gln Ala Leu Gly Ala Asn Val Ser Ala Asp65 70 75 80

Gly Asp Asn Trp Val Val Glu Gly Leu Gly Gln Ala Pro His Leu Asp85 SO 95

Ala Asp Ile Trp Cye Glu Asp Ala Gly Bsr Val Als Arg Phe Leu Pro100 105 110

Pro Phe vai Ala Ala Gly Gln Gly Lys Phe Thr Val Asp Gly Ser Glu115 120 125Gln Leu Arg Arg Arg Pro Leu Arg Pro Leu Val Asp Gly Ile Arg Kis130 135 140

Leu Gly Ala Arg Val Ser Ser Glu Gln Leu Prc Leu Thr Ile Glu Ala145 150 155 160

Ser Gly Leu Ala Gly Gly Glu Tyr Glu Ile Glu Ale His Gla ser ser165 170 175

Gln Phe Alo Ser Gly Leu Xle Met Ala Ala Pro Tyr Ale Arg Gln Gly180 185 190

teu Arg vai Arg He Pro Asn Pro Val Ser Gln Pro Tyr Leu Thr Met195 200 205

Thr Leu Arg Met Met Arg Asp Phe Gly Leu Glu Thr Ser líir Asp Gly210 215 220

Ala Thr Val Ser Val Pro Pro Gly Arg Tyr Thr Ala Arg Arg Tyr Glu225 230 235 240

Ile Glu Pro Asp Ala Ser Tbr Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Ala Ser Ala245 250 255

Val ser Gly Arg ser Phe Glu Phe Glit Gly Leu Gly Thr Asp ser Ile260 265 270

Gln Gly Asp Thr Ser Phe Phe Asn Val Leu Gly Arg Leu Gly Ala Glu275 280 285

Val His Trp Ala Pro Asn Ser vai Thr Ile Ser Gly Pro Glu Arg Leu290 295 300

Asn Gly Asp He Glu Val Asp Met Gly Glu Ile Ser Asp Thr Phe Met305 310 315 320

Ifar Leu Ala Ala Ile Ala Pro Leu Ala Asp Gly Pro Ile 1Ehr Ile Thx325 330 335

Asn Ile Gly His Ala Arg Leu Lys Glu Ser Asp Arg Ile Sex Ala Met340 345 350Glu Thr Asn Leu Arg fhr Leu Gly Val Gin Thr Asp Val Gly His Asp355 360 365

Trp Met Arg Ile Tyr Pro Ser Thr Pro His Gly Cly Arg vai Asn Cys370 375 3Ô0

His Arg Asp His Arg Ile Ala Met Ala Fbe Ser Xle Leu Gly Leu Arg385 390 335 400

Val Asp Gly Ile fhr Leu Asp Asp Pro Gln Cys Val Gly Lys Thr Phe405 410 415

Pro Gly Phe Phe Asp Tyr Leu Gly Arg Leu Phe Pro Glu Lys Ala Leu420 425 430

Thr Leu Pro Gly435

<210> 5

<211> 1398

<212> CNA

<213> Enterobacter sp.<22C>

<221> RFfílÃQ HODIFiriANTF

<222> (103)..<1398)<400> 5

aaaaaaggaa atgaactatg tgttgctgga aaaagtaggg aagggagtgg tgaagagtat 60

tccactggtt caattagaaa aaatcattca aggattacca aagtgaaagt aaeaatecag 120

cccggagatc tgacbggaat tatccagtca cccgcttcaa aaagttcgat gcagcgagct 160

tgtgctgctg cactggttgc aaaaggaata agtgagatca ttaatcccgg tcatagcaat 240

gatgataaag ctgccaggga tattgtaagc cggcttggtg ccaggcttga agatcagcct 300

gatggttctt tgcagataac aagtgaaggc gtaaaacctg tcgctccttt tafctgectgc 360

ggtgaatctg gtttaagtat ccggatgttt actccgattg ttgcgttgag taaagaagag 420

gtgacgatca aaggatctgg aagccttgtt acaagaccaa tggatttctt tgatgaaatt 480

cttccgcatc tcggtgtaaa agttaaatet aaccagggta aattgcctct cgtt&z&c&g 540

gggccattga aaccagcaga cgttacggtt gatgggtcct taagccctca gttccttace .600

ggtttgttgc ttgcatatgc ggccgcacat gcaagcgatg ttgcgataaa agtaacgaat 660ctc«aaagcc gtccgtatat cgatctceca ctggatgtga tçaageggtt tggttcgaag 720actcccgaga atcgaaacta tgaagagttt tatttcaaag ccgggaatgt atatgatgae 780acgaaaatge aacgatacac cgtagaaggc gactggagcg gtggtgcttt tttaccggta 840gcgggggcta ttgccgggcc gatcacggta agaggtttgg atatagcttc gacgcaggct 900gataa«gog« tcgttcaggc tttgatgagt gcgaacgcag gtattgcgat tgatgcaaaa 960gagatcaaac ttcatcctgc tgatctcaat geatttgaat ttgatgctac tgattgcccg 1020gatctttttc cgccattggt tgctttggcg tcttattgca aaggagaaac aaogatcaaa 1080ggcgtaagca ggctggcgoa taaagaaagt gacagaggat tgacgctgca ggacgagttc 1140gggaaa&tgg gtgttgaaat ccaccttgag ggagatctga tgcgcgtgat cggagggaaa 1200ggcgtaaaag gagctgaagt tagttcaagg cacgateate gcattgegat ggettgcgcg 1260gtggctgctt taaaagctgt gggtgaaeca accatcgaac atgcagaagc ggtgaataaa 1320tectaccogg atttttacag cgatctteaa caacttggcg gtgttgtatc tttaaaccat 1380caatttaatt tctcatga 1398

<210> 6<211> 431<212> PHT

<213> Enterobacter sp.<400> 6

Ket Lys Val Thr He Gln Pro Gly Asp Leu Thr Gly Ile Leu Gln Ser15 10 15

Pro Ald Ser Lys Ser Ser Bet Gln Arg Ala cys Ala Ala Ala Leu Val20 2S 30

Alô Lys Gly Ue Ser Glw Ile He Asn Pro Gly Kis Ser Asn Asp Asp3S 40 45

Lys Ala Ala Arg Asp He vai Ser Arg Leu Gly Ala Arg Leu Glu Asp50 55 60

Gln Pro Asp Gly Ser Leu Gln Ile Tbr Ser Gln Gly Val Lys Pxo Vsl65 70 75 SO

Ala Pro Phe Ile Asp Cys Gly Glu Ser Gly Leu Ser Ile Arg Met Phe85 90 95Hir Pre Ile Val Aia ,Leu Ser Lys Glu Giu Val Tisr Ile Lys Gly ser100 105 110

Gly Ser Leu vai Thr Arg Pro Met Asp Phe Phe Asp Glu Ile Leu Pro115 120 125

His Leu Gly vai Lys vai Lys Ser Asn Gln Gly Lys Leu Pro Leu Val130 135 140

Ile Gln Gly Pro Leu Lys Pro Ala Asp Val Tlir Val Asp Gly Ser Leu145 150 155 160

Ser Ser Gln Phe leu Thr Gly Leu Leu Leu Ala Tyr Ala Ala Ala Asp165 170 175

Ala Ser Aap Val Ala Ile Lya Val Thr Asn Leu Lys Ser Arg Pro Tyr180 185 190

Ile Asp Leu Thr Leu Asp vai Met Lys Arg PJie Gly Leu Lys Thr Pro195 200 205

Glu Asn Arçr Asn Tyr Glu Glu ?he Tyr Phe Lys Ala Gly Asn Val Tyr210 215 220

Asp Glu Thr Lys Wet Gln Arg Tyr Thr Val Glu Gly Asp Trp Ser Gly225 230 235 240

Gly Ala Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Ile Ala Gly Pro lie Thr Val245 250 255

Arg Gly Leu Asp lie Ala Ser Thr Gln Ala Asp Lys Ala lie Val Gln260 265 270

Ala Leu Ket Seir Ais. Asn Aia Gly Jle Aiq JTl© Asp Als Lys Glu Xle275 2S0 285

Lye Leu His Pro Ala Asp Leu Asn Ala Phe Glu Phe Asp AIa Thx Asp290 295 300

CTys Pro Asp Leu Phe Pro Pro Leu Val Ala Leu Ala Ser Tyr Cys Lys305 310 315 320Gly Glu Thr Lys Ile Lys Gly Val Ser Arg Lev Ala Kie Lys Glu Ser325 330 335

Asp Arg Gly Leu Thr Leu Gln Asp Glu Pbe Gly Lys Met Gly Val Glu340 345 350

Ile His Leu Glu Gly Asp Leu Met Arg Val Ile Gly Gly Lys Gly Val355 360 365

Lys Gly Ale Glu vai ser ser Arg His Asp His Arg Ile Ala Met Alá370 375 350

Cys Ala Val Ala Ala Leu Lys Ala Val Gly Glu Thr Thr Ile Glu His385 390 395 400

Ala Glu Ala Val Asn Lys Ser Tyr Pro Asp Phe Tyr Ser Asp Leu Lys405 410 415

Gln Leu Gly Gly Val Val Ser Leu Asn His Gln Phe Asn Phe Ser420 425 430

<210s> 7

<211> 13066

<212> ENa

<213> Sulfolobus solfataricus<220>

<221> RFfilÃn HODIFinANTF

<222> (10578)..(11822)

<400> 7

ctgcagtatt tctoactgtc attaaoscgt ttggttttgt aectctcatc tttottecaa 60tctcaaactc tttgccttct actttgcttt caattgacat tccttctggc aaatttacat 120catoaacttt taaacttctt ataaatagtt ctgcatcctt atattccget gagattcttô 180aetctatcac caattttaat caatccttct ttctttactg acggaataaa aaatctacta 240gtgaaaagtc tatcattgtc tctgattact atcattttat ctctccttat tttttgtaac 300tgtaacaata ttatttgtgc taagagagga geagtgagat tagatgtctc aacaatetaa 360tatgactgtt tattttcaat agaattgatt gagaatccct tggagagagt ttgcctaaat 420ctactaatta atgçctctgç ataagaggat gacaggacaa actgtaagat ctcatcactg 480ccaatagtat caaacgaata aattaaagag aatgccaact ctaatatatc ataatceaga 540taaaaaaatc tatccgtaat tatatcatcc ctagtgaatt ttggattttc Ettcacaata 600gtagaaatta ttctgaaaag taatgtattt agctgactct cactcaaacc ttctaatttc 660

gatatctcac tagcgtttac ctctcttatg agacttatgg cattttctct attgccagac 720

atgecaggta tataaggatc tagagaaaac attaacgata aaaaggctgg taaagcttta 780

tatgeaggaa ttttcagatt tttttcgeta gtcatatcaa atetctccat ttcccttett 840

gtctctaatr cccattcgga aagtgatctt ctgtccaata ttgtagacgt tataaCecaa 900

ctaacaattg gcaagacatc ttcagcagtt ataggrtaaat atgaacaaaa ggaatcctga 960

cccaagaaat attttttctt attatccatt atccatttcc cgttagcgtc aagtctaatt 1020

tgtgtttcac attcttctgg aatgaacgaa agagtgaaag aattcttagt atttttggaa 1080

ataataaatg aaaataggat aggctcteta gaatagtacg cagataaaca caaattatcc 1140

ttagaataca cattcctaac tacttccctt atttcttgat tattcggctc tcctaagaat 1200

acttccatta ctatctcttt agaatttctt ttgaccattt tttaagctct tcaaagctca 1260

tatccttaaa gaaaatagat ccaagcaagt ttgatataat atagttcaat cttgtagcea 1320

agacgtaaga gggatttaaa aatattgata acgctaettc tcccactatt gctgcagatg 1380

gtatcggtat taatatagat acttggtata aaaaagagat aaaaattgac aagaaaetat 1440

tatgtgttac ataataaaaa taacctccat ataaggeaaa actaaatata tcaaccatga 1500

tataaattac aaaatcctCt gfcggttcctt gctcaaggta atatttaaat tceatataat 1560

ctgtaacaar tcgttccatt tfcaactatct taaagataaa ttgttcaatt teatttecet 1620

tatcatgttg caagtaaaaa tacgacaatg ctcctatcca tccagctatg ttaaataata 1680

cgactagaar gaatacaaat tctaatgggt taaaaaagaa tggcagcagt aaaatatagc 1740

ccaaacataí tgcgagcaca tctatggatc ctataagaat agagtagcta aacgcttgcc 1600

ttaagtttac cccatatttg ttgtaaacta aacttctaac caattcttgt ccagcccatc 1860

caggtactaa taaacctacg aagttaccta gtaatcttgc tcttaacgtt atafcctactc 1920

tacgcttaat tagtaatgaa tcctbaaatg atgagacgaa attctgggca gtatacçtta 1980

aaagaaaaat cagaaagaat ttgggatctt cttgtaaaac atatattata ttaatcttaa 2040

atatgtatgc atagactatg atcaetataa acggaagaaa aatagctgca atgtatttct 2100

tatccattat cttccccttt tctcaaaaea teeaataeta ggatagcaca aagttacaet 2160

cccaagattt ttaaacactt tgggctcetc taactcagga attttcatat tagttctaaa 2220

tattccacar ttaggtttac ttatcttttg atatagaaaa ggatacteat ttagaacgca 2280tgtcttacat tgtgagttct tctcgatgtttatatagaafc aatgaataat cçggattçccaagtgtagct gttaattcta ctattagtggaatttcgtct tgatctgaat agtcaataaatatcagttta gcagaaccgt attcaccattttttactata gcatcattta acaatagcttgtaatcctta tcagaaatta gcctctcgacattaattttg attgaagaat ttataagcgatttgcctaea tcattttcat eaaataaatgatctgcatet actatagtta ectctttaacagtacctaaa gctccacagc ctgeaattaatcctaatcct aaaactatta gttgcctsgaaatctttaaa aataagtgtt gcctactaaaaggtggaggg agtgatggaa ctccaat&tcagctgaaaag gcaagaagaa atgtaataaagggatcgtcc ctaagtagea tagagatattggattcaagc ttagtgaata aagactggcttctttatgcc gttttagctg eaaaaggttaagatataacg ggattattac aagggcatccgactggtagt ttagggeaag gtttgagcttggccaacggc actggaagag tatatgtcataetatgggag gctatgecgc atgeegtagc.agagatgaac aatttccagc ttgatggttcacctaaggta tgggaagcag taggttggaatagtattact aatgeagtta acgaggc&tataagactgta agaggaaagg ggtttcctcctccagatgat gcaaggaaat atttacccaaacctagggga. taagaacaag gatctagtcggagcgctata ctttagagag aagtttaagg

aattctctca atttttaatt ctctageatc 2340

tctcaagtga ctaagcatta agttaacttg 2400

agtagttcca ataacatcac atgaatfcccc 2460

acaagataaa caggaggttt gactagggfcc 2520

asttcctcca tatattagga tttttcctaa 2580

gtagtacaag ctgtetaaeg catcgaacac 2640

gttctcctcg tcgagtatat ctataatata 2700

tattttttta gegcaaaett cagctttagg 2760

gaccctatgt agattagtee tatctaccac 2820

tcctagccta gctagc&act etgeaacggc 2880

tatctttaac tcattteacc tctgtcgaat 2940

atatctttcc acaagattat aatgtagaat 3000

agtggggatt gatattgttc caatggaaaa 3060

aategaggaa ttggacaagt taagacaagc 3120

aatgctattt tatgatcaaa caatacetgc 3180

aactacgtta atattcaage âtataaggac 3240

tattttaagt aaaggccatg cagcgccagc 3300

cataaaagaa gaggaaecet ggagaataca 3360

agaaactttt attcccggtg fcagatafcgtc 3420

tggaatoggt gttgctactg gtataaegat 3480

aatgggtgat ggtgaacagg atgagggaga 3540

tagaaateEt geteacttaa ttgcatttat 3600

aacagatgag ataaaaccaa agaacttctt 3660

agtattaaac tgcgatgggc atgatttcat 3720taaggcaagc aagcccgtag caatactcgc ' 3780

aatagaaaat acccataaac agaggtccag 3840

tgcgtgeaac cttcggaagg ctattagcãg 3900

tgataactgc agatgtagga gactcfcscca 3960

atagatactt taatgtaggc atagcagagc 4020aagatatggt gaattttgct gctggettgg ctgctgtagg aaaaaagccc gctatagtta 4080

actttggaac gttcttaatg agagegcggg agcagataag aaatagtata gctagaetga 4140

atctagaogt caagatgttt gcaacacaca ccggatacag tgaccacggt gatggctcga 4200

gtcateaagt tctcgaagat atagcgctaa tgcgtgtatt accaaacatg aaagtagtag 4260

taccagcaga tcctaaggat attgaaagaa gcttaccagt tataattaat gaggaaeggg 4320

gtccattgta ttataggata ggtagagaat attcaccacc aatcactata ggacaagaat 4360

acgaattcaa gattggtaaa gcttatgtga ttaaggatgg gagtgacfcta gccataatag 4440

gagcaggogt tgttttgtgg gatgcactaa aggcggctga agaattagag aaattaggaa 4500

ttagogtagc agttataaat ttattctcaa taaagcctat tgacgaaaat acaataçaat 4560

attatgctag aaaggctggt aagataatta ctattgagga acatagcata tatggaggta . 4620

ttggttctgc cgttgcagag- gttacggcta ggcgttatcc agtacccata agattcgtag 4680

gtgctacgac ttttggaaga tctgctagaa gccaaaggga tctactagat tactataata 4740

taaactataa aacaattata agggaggcaa ttgatttatt gaagtagatg actgaagaaa 4800

taacacggct gagggaagaa atagataagg tagacgagca gttagtaaag ttactctcat 4860

atagattaga attatctaga aaaataggga aagctaagtc gaattctaat ataagtgtta 4920

ctgacgagaa Cagggaaatg aaagttagag aaaaatggat tgctáacgca aaaaagtata 4980

atattccaaa tagtctggtt gaatctatat tgcctttgat ttcttcttac tctaaactag 5040

ttcagattaa cccaggagag aaagaaagag tagtaatata tggatatggc ggaatggcta 5100

aatcgatcgr ttctattctt tcattagctg ggcatgaagt atcgattact ggaagagatt 5160

tõagtaaagc ggagatgtta gctaatcaat ttaaatgtgt aagtatgtcc ttattaeaag 5220

caatagattg gggggatata attatatttg caatacctcc tagtgcaata ttaaateatt 5260

ccgabgaatt attttcaaag gcacttaaag ataagattgt tatggatatt agttcfctcta 5340

aatttaaaat atttggcttc ctagaagaat tatctaggaa actagagttt aggtafcattt 5400

ctacacatcc acttttcggt cctattgaat accctattgg agagagagtt gtaattatac 5460

cttccaaaac tagttctaat gatgatgtca tgaaggtgga gaatttctgg aggaaasgtg . 5520

gtttagtacc cgtcataact gatgttgaaa ctcatgaaaa ageaatgget attgrttcaag 5580

ttctaacgca ttattatctt ctgggtttet caaacgcaat tgetacttta tcgtcagagc 5640

taggtgtaga ttacagtaat ttccatacta caaactttag agaattaaac aagaccttaa 5700agcgggttaa agatctaaaa aatgtaatta ctgaaataca aaatcaaaac ccttactctt 5760ataaagttag aaatataggt ttagaggagc ttaaaaaaat taaagaagaa ctagaaçgag 5820

gtaaatagaa tgacctcata tgtccttaag gatagagctg attactctat actaauagaa 5880

aagctaaatg aaaactcagc atctttcaag atattaaacc catatggtaa aaacttaata 5940

ttagcatggc cagatcagaa cgtgaaaggt atcattgata atagtataga aatggctgtg 6000

gaagtaaaga aaagctatgt attagetggt aatgattgga aaaagcaacc aacagtggta 6060

oatgtaaaag atgtogaaat tggoagcaaa aoggtoatag tagctgeagg tccttgtgca 6120

gtagaaaatg aageacaegt ccttactect gctaaggctg taaeaagggc tggagceCce 6160

ttacttagag gaggggctta caaacccagg acaagtccat attccttcca aggtctcgga 6240

gaagaaggsg tgaaaatctt gaggagagta ggagatgaag taggcttaec catcgccaca 6300

gaaataatgg atacaagaga ttccaatata tttagccaat atgttgatac gatacagatt 6360

ggagccagaa ecgcacagaa cttctcttta ttgaaggaag ttggaaagtt aggtaaecca 6420

gtactactta agcgaggtat gggaaataca gtagaggaac ggcttcaagc tgcagagtac 6480

attttaccag agggaaatgg caatacagta ttatgçgaaa gaggaataag aaçatctgaa 6540

aagtcaacta ggtttacgtt agatataggt gggatggtag ctgctaaact aatgacacat 6600

t-bgcccatet gtgctgatcc aagtcatcct gcgggaaaaa gagaattggt acactcttta 6660

gcactagetg cagtcgctgc tggtgcggat atgttattaa ttgaagttca tccacatcca 6720

gaaaaggcat taagtgattc agagcaacaa cttacaccgg aatcattcga agttccaatg 6780

aatcga.atta gaacgctagc tsgagcttta gggagagatg catgagggaa atcttagaag 6840

atatttgttg ctctgaagto agagtagtag toggagaggg atcactttca aaattatcta 6900

agattaaaga caataacgct gcagttatct atteaagaaa aattagtata gcagacaaaa 6960

ttôataaata tttaceaaat geat&cttca tcccaattaa tgatggtgae agtacceaag 7020

aattatctag tgtaatatct ttagtagaaa agctatttga aaagaatttc gatagggggg 7080

attatettat aggtgttggt ggtggaacgg taactgatgt agetggttcc tcagcatcta 7140

tatatttaag aggattaaat ctgataaacg taccaacgac cttottaggc atggtcgatg 7200

cagcaatagg gggtaagaat ggagtaaatt tcaataatat aaagaactta attggascat 7260

tctatcaacc aagcatgata atttccg&tt tagaattttt ggaaactcta ccaatagaag 7320

aactaaagaa gggattagct gaagtaatta aatatggctt aactttagat aaagaattat 7380

atgattactt gtctttaaat aaggagaaga tactaaataa agataaacaa gcattagaaç 7440ôtataatctt tagatctaca cttgataaaectaaaggaat acgaatagtt ctaaatttcggatcctcttr taatgttcea catggccacgagatggcgga agagttaggt tatgeagaggtacagattta tggtttacct tacgatatattagcattaaa tgctattaat atggataaaattcctactag aataggtagc tggaaaaaagtbgccgaaca atgcttgaag aaataaattaaaacataaag tacacgctat ccccttatataaatgcagtt tatctagttt ttgatctcgagatatbggaa attgcagaag gactbaatgtata,tttggat. aatactgsta cgcactcçacaaaaagtggt totaacactg attatttegcgaatgtatct ggctacgaat gttacatatattttgcgtta tctgaattag gatgctctagggcttatgag ttagctgaat tattaaataatfcgcaacatt acaaataata tacttactgtagaggactgt gttaaaaaat ctgatcctgttgagttaatt. aaaaatgcta aaaaatatggagtgaatcaa gctgtagaag cggagaagatgattatagag tatctttatg ccagggaactttggagagag ccatggtcct gcagtaggtgcattaactgt tgaagatata aagttcgaattttctggaag gagagaaaaa gatgagccggctaccggatc tccaatagca gttatagtacaogagattaa atataaacca agaccaggaegatatgaaaa ttgggattat aggggaggtggagttatagc tggngcagta gctaagaagt

taagtattgt aaaagaagat gagagagaga 7500

gccatacgat aggtcatgct atagaegctg 7560

ctatctctgt aggaatggtt tgtgàggcta 7620

aaggagtagt agaagatgtg tcatggetat 7680

ctcaaataga tgceccagta gatcttaaac 7740

aacataggaa agatgtaatt ttgataccgt 7800

ttgaagttcc fcctagatacc gtaaaggggt 7860

tgatactaag ttattcggtc taataggtaa 7920

tcataatttc tcatfctagaa cactaggaat 7580

cgaaatgaaa ttcaagcgta gtattagtgg 8040

tacgataccg tataaggatg aagtaatgaa 8100

gagaattcaa gctgfcaaáta caatafcataa 8160

aataaaaaat cttgtaagaa agaagatcaa 8220

tggggetgga ggtgcagcaa aagcagcagc 8280

tattagtatt gtgaatagaa caaaaccaag 8340

gaacggttat aecgcgtcae tcaaagagaa 8400

caatagcact cctaattctt ctgtagtccc 8460

tatagaattt gtttatagac cagttgagac 8520

tatacaatat ataaacggtc tagaaatttt 8580

atggtttaat aagagtgtgg cagatgaaaa 8640

cgtttggtaa actatttaga ataaccactt 8700

tagtcataga cggtgttcct gccggfcttac 8760

tagaatttag aagaccaggt agactatacg 8820

aaatattaag tgggatcttt aataatagaa 6880

gaaatactga tgtaatatca agtttttatg 8940

atgcagacct tecatctatá atgaaátatg 9000

gaagagcaag tgctagagaa actgtaagta 9060

tacttatgct aacagatact tggataçctg · 9120gccatcttag aagtttaggc ceagaagagt tgagtgaaga ggtaacatct gaggaggfctc 9180

tatgctcaaa atatagccca gtaagagcta gtaaaaaaga ccttgaggaa aaatatgaag 9240

cattaataaa gaaagctact caagaagggg atagctatgg cggaatagct gaagtaatag $300

ccaagaatcc accaataggt ttaggagaac cagtctttga taagatgaaa gcfcgaattgg · 9360

ctaaagcaat aatgtcgatc cctgctgtga tgggcttcga gtatggttta ggttttattg 9420

ctagtaaaat gaaaggaagt gaggctaatg acgagattat aagaaagaat aatagaattg 9480

gctggaagta caattocgct ggaggcattt taggtggttt aacaaatgrgt gaagatctta 9540

tagtgagatg tgcatttaaa cetactagct cgattagaaa gççteaaaag accatagatt 9600

taaggaactt agaggagagt tatatttcag taattggcag acacgaccca gctgtagcaa 9660

ttaggggagt tactgttgta gaatcaatgg tagegttaac eatagtagae catgcaatgc 9720

gtgcaggagc tattccacta gttaaactta cagaggacca agctaataca atacagcaac 9780

gttgggagag gtatgtgaaa tcatgcaagc ctatggagga gtctcaatcg taaacgcact 9840

aceatcttgg tatggctcat ctatggcaat caatttgaag gtaaaagrtag aaattagaga 9900

aggtaagaga gtttattctc aagagagtga actaattaag accattctta attaccttaa 9960

agaaaaatat, tcaataccgg atattgaagt tgatattgaa tctgaacttc cacaaasgag 10020

tggactasaa agcagtagtg cagtttctgt ageeetaata gcggagattg caaagcaata 1:0080

tgatctaagg aatattaacc ctccaatatt atctgcgata ctttcactga aagctggagt 10140

gtcatatacc ggggcacttg etgatgcegt tgcatcatat tgtggaggaa tagcafctcac 10200

ttataataag atgtttagaa tagtaaagtt agagaatctt; gaggataatt tatcgatcct 10260

catattagcc aogggaggga gacaaaaace tgttaateta aaegagetaa gaaaacacag 10320

tcacgtcttt gaagaaattt ttaagatagc acttaagget tacttgactg ctatgaegat 103 80

gaatggaata ttgattgeta atattttegg ctattcetta gaaccaatag aaactgcact 10440

gaaaaaagga gcgttagctg cogggactag tggaaatggg ccttcatatt ttgcagttte 10500

taagaatgga geagaaggtc cgatatacga aagtettaag aastttggag atgttattat 10560

agttaggcct gfcaagtcttg attgtaaaga tttatccatc aaagattagt ggaecaetaa 10620

aagctcctca atcaaaaagt ctagctatta ggttaatttt tctttcactt ttcacfcagag 10680

tatatcttca taaçttagtt ctatcggaag atgttataga cgctataaaa ccagtaagag 10740

cattaggagfc aaaggtaaaa aacaattctg aatttatacc tccagagaaa ttagaaatta 10800

aggagaggtt tataaaatta aaaggttccg ctactactct tagaatgctt atcccaatat 10860tagccgcaât aggcggagaa gtgacaattg õtgcagatgs gagtttaaga aggagacctt 10920taaacagaat cgtacaagca ttaagtaact acggtatatc ctCttcttct tacagtttgc 10980ctttgactat cacgggaaag ttaagtagta atgagataaa gatttctggt gaCgagagCa 11040gtcaatatat ttctggctta atatacgcac ttcatattct aaatggcggt agtatcgaaa UlOOtattgccccc catttcatct aaaagttata ttctgcttac aatagattta tttaagagat 11160ttggttctga tgttaagttt tatggtagta agattcatgt taatcccaat aatttggtcg 11220aatttcaagg cgaagtggcg ggagattatg gtttagcctc. gttttacgcg ctttctgcat 11280tagttagtgg tggaggaatt acaataacta atttgtggga gccgaaggaa tattttggtg 11340atcatagtat tgttaaaata tttagtgaga tgggcgcttc cagtgaatat aaagacçgta 11400gatggtttgt caaggctaaa gataaatatt ctcccataaa aattgatata gafcgacgcac 11460ctgacctggc tatgacaatt gogggattat ctgcaatagc ggagggaaca agtgaaatta 11520tagggatcga aogattgagg attaaggeaa gtgatagaat tgaaagtata aggaaaatct 11580taggattata tggtgtaggt agtgeagtaa agtetaattc tattctgata ttcggaetta 11640acaagggtat gttaaactct ccagttacag actgtttgaa tgatcacaga gttgcCatga 11700tgtcgtcagc cttagcttta gtgaatggtg gggtaattac atcagctgaa tgtgtaggta 11760aaagtaatcc taattactgg caagatttat tatcactaae tgcgaagatt tcCatteaaε 11820gagaceatta attgtagctt cattaccaat taaaaagata gaagacttaa aacttataga 11880aaatttttta gatgcagatc taatagaact aagacttgat tatctaagag aaagagaagt 11940cagtttgata tctgactatt atgaattttt agataaatat aaaaagaagt taacagtaac 12000gttaagagat aaaggggagg gaggaataaa tcaattagcg gatgaattaa agaCaaaaaC 12060tttaaatgaa ctctacgaga gacaatatct gtatgatata gaggtttcat Ctcttcaaaa 12120atatgatata ccatacgata ataggatagt ttctgtccac tattttaatt atcttccaac 12180tctagagaag ataaaggaaa ttgttagcaa gttttccgaa aaagcgttca gcgttaagat 12240tgcagttcct agtctaaaag- gatataagga ggtactctta cctcttcttg aatatgaaaa 12300cgtaaccgta attccaatga gtsataattc tttagagagg atcgcagtgg gtctactggg 12360ctxaaagtta gtttattcgt acgcaattga acctttagca caagggcaac tttactataa 12420aaaagttatc cagattttta attatattaa cgatataaca acttcatctt cagttactcg 12480aactctgtat acttttatag- gctttttgga agetcccttt ttaggttctc cactatetat 12540agaa&aatga gaaaagtgac attgacatac taattcttct ttcatgetaa cgccacatct 12600

tgaaagatca caacctaaat gcgggcattt attatcaaaa acaaaaaatc tatctactcc 12660

tagataaaaa acgactaatt cacgtccatt aggcagtata atttttctct tttcaccagt 12720

cttaaaatca gttctactta tccttafcsta ctccacgact ttaattatga gccaacggag 12780

aaattaaagc aaactatgtg ttaagcataa aaataagact cttatataat aacetaactt 12840

taatagagtt atfcgctctaa aaggtaatgc caaaattctt ccttataggt catttaatct 12900

tgatôotcaa atggcaagat ttaaacataa taggtgtaga ataataaaaa ctgctcaaaa 12960

gattatgaac aaaceattta taagattggg agceaaataa gtagattaga ggaaatcgaa 13020

gatgttagaa ataagtgagg atcttaaage aaagcttgat tataga 13066

<210> 8<211> 414<212> PRT

<213> Sulfolobus solfafcaricus<400> 8

Met Ile Val Lys lie Tyr Pro Ser Lys Ile Ser Gly Ile Ile Lys Ala15 10 15

Pro Gln ser Lys ser Leu Ala Ile Arg Leu He Phe Le« ser Leu Phe20 .25 30

Thr Arg Val Tyr Leu His Asn Lea Val Leu Ser GId Asp vai Ile Asp35 4C 45

Alo Ile Lys Ser Val Arg Ala Leu Gly vai Lys vai Lys Asa Asn Ser50 55 60

Glu Phe Ile Pro Pro Glu Lys Leu Glu Ile Lys Glu Arg Phe Ile Lys65 70 75 80

Leu Lys Gly Ser Ala Thr Thr Leu Arg Met Leu He Pro Ile Leu Ala85 90 95

Ala Ile Gly Gly Glu Val Thr Ile Asp Ala Asp Glu Ser Leu Arg Arg100 105 110

Arg Pro Leu Asn Arg Ile Val Gln Ala Leu Ser Asji Tyr Gly Ile Ser115 120 125Phe Ser ser Tyr ser Leu Pre Leu Thr lie Thr Gly Lys Leu ser ser130 135 140

Asn Glu Ile Lys Ile Ser Gly Asp Glu Ser Ser Gln Tyr Ile Ser Gly145 150 155 160

Leu Ile Tyr Ala Leu His Xle Leu Asn Gly Gly Ser Ile Glu Ile Leu165 170 175

Pro Pro Ile Ser Ser Lys Ser Tyr Ile Leu Leu Tbr Ile Asp Leu Phe180 185 190

Lys Arg Phe Gly Ser Asp Val Lys Phe Tyr Gly Ser Lys Ile His Vel195 2C0 205

Asn Pro Asn Asn Leu Val Glu Phe Gln Gly Ghi Val Ala Gly Asp Tyr210 215 220

Gly Leu Ala Ser Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Leu vai Ser Gly Gly Gly225 230 235 240

He Thr He Thr Asn Leu Trp Glu Pro Lys Glu Tyr Phe Gly Asp Kie245 250 255

Ser Ile Val Lys Ile Phe Ser Glu Met Gly Ala Ser Ser Glu Tyr Lys260 265 270

Asp Gly Arg Trp Phe Val Lys Ala Lys Asp Lys Tyr Ser Pro lie Lys275 280 285

lie Asp Ile Asp Asp Ala Pro Asp Leu Ala Met Thr Ile Ala Gly Leu290 295 300

Sex Ala Ile Ala Glu Gly Thr Ser Glu Ile Ile Gly Ile Glu Arg Leu305 310 315 320

Arg Ile Lys Glu Ser Asp Arg Ile Glu Ser Ile Arg Lys Xle Leu Gly325 330 335

Leu Tyr Gly Val Gly Ser Glu Vel Lys Tyr Asn Ser He Leu Ile Phe340 345 350Gly Xle Asn Lys Gly Met Leu Asn Ser Fro Val Tbr Asp Cys Leu Asn355 360 365

Asp His Arg Val Ala Met Met Ser Ser Ala Leu Ala Leu Val Asn Gly370 375 3&0

Gly Val Xle Hir Ser Ala Glu Cys Val Gly Lys Ser Asn Pro Asn Tyr385 390 395 400

Trp Gln Asp Leu teu ser Leu Asn Ala Lys Ile Ser lie Glu405 410

Claims (37)

1. Planta compreendendo pelo menos (a) um primeiro polinucle-otídeo heterólogo codificando um primeiro polipeptídeo capaz de conferiruma característica de interesse, e (b) um segundo polinucleotídeo heterólo-go codificando um polipeptídeo capaz de conferir a dita característica de in-teresse, onde os ditos primeiro e segundo polinucleotídeos são estavelmenteexpressos na dita planta, e onde a dita planta mostra a dita característica déinteresse sobre uma faixa mais ampla de uma condição fisiológica ou ambi-ental comparada a uma planta compreendendo o dito primeiro ou segundopolinucleotídeo expresso sozinho e sujeito à dita faixa de condição fisiológicaou ambiental.

2. Planta de acordo com a reivindicação 1, onde a dita caracte-rística de interesse é resistência a um herbicida.

3. Planta de acordo com a reivindicação 1, onde a dita caracte-rística de interesse é rendimento.

4. Planta de acordo com a reivindicação 2, onde o dito primeiro eo dito segundo polinucleotídeo conferem resistência a glifosato.

5. Planta de acordo com a reivindicação 4, onde o dito primeiro edito segundo polinucleotídeo codificam um primeiro e um segundo polipeptí-deo EPSP sintase.

6. Planta de acordo com a reivindicação 5, onde a dita primeiraou segunda EPSP sintase é de uma planta.

7. Planta de acordo com a reivindicação 5, onde dito primeiro ousegundo EPSP sintase é de uma bactéria.

8. Planta de acordo com a reivindicação 5, onde o dito primeiroou dito segundo polipeptídeo EPSP compreende uma seqüência de aminoá-cidos de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, ou 8.

9. Planta de acordo com a reivindicação 5, onde o dito primeiro esegundo polipeptídeo EPSP cada um compreende uma seqüência de ami-noácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, ou 8.

10. Planta de acordo com a reivindicação 9, onde o dito primeiropolipeptídeo EPSP sintase compreende uma seqüência de aminoácidos deSEQ ID NO: 2 ou 4 e o segundo polipeptídeo EPSP sintase compreendeuma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou 8.

11. Planta de acordo com a reivindicação 1, onde a dita condi-ção fisiológica ou ambiental é temperatura.

12. Planta de acordo com a reivindicação 11, onde o dito primei-ro polipeptídeo tem atividade de enzima ótima dentro de uma faixa de tem-peratura de cerca de 5°C a cerca de 40°C.

13. Planta de acordo com a reivindicação 11, onde o dito segun-do polipeptídeo tem atividade de enzima ótima em uma maior temperaturacomparado com o dito primeiro polipeptídeo e dentro de uma faixa de tempe-ratura de cerca de 20°C a cerca de 60°C.

14. Planta de acordo com a reivindicação 13, onde o dito primei-ro polipeptídeo tem atividade de enzima ótima dentro de uma faixa de tem-peratura de cerca de 10°C a cerca de 30°C e o dito segundo polipeptídeotem uma atividade ótima de enzima em uma maior temperatura como com-parado ao dito primeiro polipeptídeo e dentro de uma faixa de temperaturade cerca de 25°C a cerca de 50°C.

15. Planta de acordo com a reivindicação 14, onde o dito primei-ro polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:- 2, e o dito segundo polipeptídeo compreende um aminoácido de SEQ ID NO:- 4, 6, ou 8.

16. Planta de acordo com a reivindicação 14, onde o dito primei-ro polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:- 4, e o dito segundo polipeptídeo compreende um aminoácido de SEQ ID NO:- 6 ou 8.

17. Planta de acordo com a reivindicação 11, onde expressãodos ditos primeiro e segundo polipeptídeos confere a dita característica deinteresse de cerca de 5°C a cerca de 60°C.

18. Planta de acordo com a reivindicação 1, onde a dita condi-ção fisiológica ou ambiental é pH.

19. Planta de acordo com a reivindicação 18, onde o dito primei-ro polipeptídeo tem atividade de enzima ótima dentro de uma faixa de pH decerca de pH 4,0 a cerca de pH 6,5, e onde o dito segundo polipeptídeo tematividade de enzima ótima em um pH maior comparado ao dito primeiro poli-peptídeo e dentro de uma faixa de cerca de pH 6,0 a cerca de pH 8,5.

20. Planta de acordo com a reivindicação 19, onde o dito primei-ro polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, e o dito segundo polipeptídeo compreende um aminoácido de SEQ ID NO: 6.

21. Planta de acordo com a reivindicação 1, onde a dita condi-ção fisiológica ou ambiental é concentração de sal.

22. Planta de acordo com a reivindicação 21, onde o dito primei-ro polipeptídeo tem atividade ótima de enzima dentro de uma faixa de con-centração de sal de cerca de 50 mM a 150 mM, e onde o dito segundo poli-peptídeo tem uma atividade ótima de enzima em uma maior concentraçãode sal comparado ao dito primeiro polipeptídeo e dentro de uma faixa decerca de 100 mM a 200 mM.

23. Planta de acordo com a reivindicação 21, onde o dito primei-ro polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:- 4, e o dito segundo polipeptídeo compreende um aminoácido de SEQ ID NO: 6.

24. Planta de acordo com a reivindicação 1, onde a dita condi-ção fisiológica ou ambiental é concentração de um substrato ou concentra-ção de um co-fator para os ditos primeiro e segundo polipeptídeos.

25. Planta de acordo com a reivindicação 24, onde o dito primei-ro polipeptídeo tem (a) uma afinidade para substrato ou co-fator que é pelomenos cerca de 2 vezes maior que uma afinidade para o dito substrato ouco-fator pelo dito segundo polipeptídeo, e (b) uma atividade catalítica que épelo menos cerca de 2 vezes maior que unia atividade catalítica do dito se-gundo polipeptídeo.

26. Planta de acordo com a reivindicação 25, onde o dito primei-ro polipeptídeo tem uma afinidade para um substrato ou co-fator que é pelomenos cerca de 5 vezes maior que uma afinidade para o dito substrato ouco-fator pelo dito segundo polipeptídeo.

27. Planta de acordo com a reivindicação 25, onde o dito primei-ro polipeptídeo tem uma afinidade para o substrato ou co-fator que é pelomenos cerca de 10 vezes maior que uma afinidade para o dito substrato ouco-fator pelo dito segundo polipeptídeo.

28. Planta de acordo com a reivindicação 25, onde o dito primei-ro polipeptídeo tem uma atividade catalítica que é pelo menos cerca de 5vezes maior que uma atividade catalítica do dito segundo polipeptídeo.

29. Planta de acordo com a reivindicação 25, onde o dito primei-ro polipeptídeo tem uma atividade catalítica que é pelo menos cerca de 10vezes maior que uma atividade catalítica do dito segundo polipeptídeo.

30. Planta de acordo com a reivindicação 25, onde o dito primei-ro polipeptídeo tem (a) uma afinidade por um substrato ou co-fator que épelo menos cerca de 10 vezes maior que uma afinidade para dito substratoou co-fator pelo dito segundo polipeptídeo, e (b) uma atividade catalítica queé pelo menos cerca de 10 vezes maior que uma atividade catalítica do ditosegundo polipeptídeo.

31. Planta de acordo com a reivindicação 1, onde o dito primeiropolipeptídeo tem ótima atividade de enzima em citoplasma, e o dito segundopeptídeo tem ótima atividade de enzima em cloroplastos.

32. Planta de acordo com a reivindicação 1, onde a dita planta émonocotiledônea.

33. Planta de acordo com a reivindicação 1, onde a dita planta édicotiledônea.

34. Semente transformada da planta como definida na reivindi-cação 1.

35. Processo de conferir uma característica de interesse parauma planta, o dito processo compreendendo introdução na dita planta depelo menos (a) um primeiro polinucleotídeo heterólogo codificando um pri-meiro polipeptídeo capaz de conferir a dita característica de interesse,e (b)um segundo polinucleotídeo heterólogo codificando um segundo polipeptí-deo capaz de conferir a dita característica de interesse, onde os ditos primei-ro e segundo polinucleotídeos são estavelmente expressos na dita planta, eonde a dita planta mostra a dita característica de interesse sobre um espec-tro mais amplo de uma condição fisiológica ou ambiental comparada a umaplanta compreendendo os ditos primeiro e segundo polinucleotídeos expres-sos sozinhos e sujeita ao dito espectro de uma condição fisiológica ou ambiental.

36. Processo de conferir uma característica de interesse a umaplanta, o dito processo compreendendo (a) provimento de uma planta trans-gênica compreendendo um primeiro polinucleotídeo heterólogo codificandoum primeiro polipeptídeo capaz de conferir a dita característica de interesse,e (b) introdução na dita planta de pelo menos um segundo polinucleotídeoheterólogo codificando um segundo polipeptídeo capaz de conferir a ditacaracterística de interesse, onde os ditos primeiro e segundo polinucleotí-deos são estavelmente expressos na dita planta, e onde a dita planta mostraa dita característica de interesse sobre uma espectro mais amplo de umacondição fisiológica ou ambiental como comparada a uma planta compreen-dendo tanto o primeiro como o segundo polinucleotídeo expresso sozinho esujeita ao dito espectro de uma condição fisiológica òu ambiental.

37. Processo de aumento de vigor ou rendimento de uma plantacompreendendo:(a) provimento de uma planta de acordo com a reivindicação 2; e,(b) tratamento da planta com uma quantidade efetiva do dito herbicida parapelo que aumentar o vigor ou rendimento de planta.