BRPI0708576A2 - composição compreedendo células-tronco embriÈnicas humanas e seus derivados, métodos de uso e métodos de preparação - Google Patents

Abstract

COMPOSIçõES COMPREENDENDO CéLULAS TRONCO EMBRIONICAS HUMANAS E SEUS DERIVADOS, MéTODOS DE USO E MéTODOS DE PREPARAçãO. A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo preparação de células tronco embriónicas humanas (hES) e seus derivados e métodos para seu transplante no corpo humano, em que transplante resulta na reversão clínica dos sintomas, cura, estabilização ou parada de degeneração de uma ampla variedade de condições, doenças e distúrbios médicos atualmente incuráveis e terminais. A invenção refere-se ainda a novos processos de preparação de novas linhagens de célula tronco que são livres de produtos animais, células nutrientes, fatores de crescimento, fator inibidor de leucemia, combinações minerais suplementares, suplementos de aminoácido, suplementos de vitamina, fator de crescimento de fibroblasto, fator steel associado à membrana, fator steel solúvel e meios condicionados. A presente invenção refere-se ainda ao isolamento, cultura, manutenção, expansão, diferenciação, armazenamento e preservação de tais células tronco.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO CÉLULAS-TRONCO EMBRIÔNICAS HUMANAS E SEUS DERIVADOS, MÉTODOS DE USO E MÉTODOS DE PREPARAÇÃO".

Antecedentes da Invenção

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a composições farmacêuticascompreendendo células-tronco embriônicas humanas (hES) ou seus deriva-dos, as ditas células-tronco sendo livres de produtos animais, células nutri-entes, fatores de crescimento, fator inibidor de leucemia, combinações mine-rais suplementares, suplementos de aminoácido, suplementos de vitamina,fator de crescimento de fibroblasto, fator steel associado à membrana, fatorsteel solúvel e meios condicionados, para uso no tratamento de doenças,condições ou distúrbios atualmente incuráveis, terminais e médicos. Maisparticularmente, a invenção refere-se a métodos de tratamento de distúrbiosclínicos e condições terminais ou atualmente incuráveis usando células hESatravés de um protocolo de transplante. A invenção refere-se ainda a novosprocessos de preparação de novas linhagens de célula-tronco que são livresde produtos animais, células nutrientes, fatores de crescimento, fator inibidorde leucemia, combinações minerais suplementares, suplementos de amino-ácido, suplementos de vitamina, fator de crescimento de fibroblasto, fatorsteel associado à membrana, fator steel solúvel e meios condicionados.

A presente invenção refere-se ainda ao isolamento, cultura, manutenção,expansão, diferenciação, armazenamento e preservação de tais células-tronco.

Técnica Anterior

Um grande número de distúrbios, condições e doenças médicashumanas ou são atualmente incuráveis através das terapias de fármaco,cirurgia ou métodos de transplante existentes ou eles sãoterminais.

Células-tronco têm a capacidade de se dividir para gerar células"filhas" que retêm as propriedades da célula-tronco, ou para produzir filhasque começam a se diferenciar em um tipo de célula mais especializado ouproduzir uma célula filha de cada tipo. Células-tronco são então centrais pa-ra crescimento e desenvolvimento humano normais, e através de suas ca-racterísticas intrínsecas são também fontes potenciais de novas células paraa regeneração de tecido doente ou danificado. Células-tronco estão presen-tes em todos os estágios de desenvolvimento, e em muitos (possivelmente amaioria) tecidos do adulto. Células-tronco de tecidos diferentes, e de está-gios diferentes de desenvolvimento, variam em termos do número e tipo decélulas às quais elas normalmente dão origem. As principais classes de cé-lulas-tronco de acordo com esta classificação são células-tronco embriôni-10 cas, células-tronco somáticas e células germinativas embriônicas.

Nos primeiros estágios após fertilização (até o oitavo estágio decélula), todas as células do embrião são totipotentes (isto é, elas têm a ca-pacidade de se desenvolver em todo tipo de célula necessário para desen-volvimento integral, incluindo tecidos extra-embriônicos tal como a placentae o cordão umbilical). Após cerca de dois a cinco dias o estágio de blastócitoé atingido. Dentro desta bola de 50-100 células está a massa de célula inter-na, que vai se desenvolver no embrião propriamente dito. A massa de célulainterna compreende cerca de um quarto de todas as células neste estágio dedesenvolvimento e uma classe única de células-tronco; as células-tronco embriônicas. As células-tronco embriônicas têm a capacidade inata ou po-tencial de se diferenciar em cada um dos 200 ou mais tipos de célula do cor-po e são descritas como pluripotentes. A capacidade das células hES emcontribuir para todos os tipos de tecido em desenvolvimento não foi aindacompletamente estabelecida, mas elas podem cultivadas durante períodosde tempo longos em cultura e expandidas em número sem mudar seus ge-nótipos ou fenótipos celulares, e mantêm seu estado pluripotente sob essascondições.

Além do estágio de blastócito, células-tronco compreendem umaproporção decrescente de células no embrião, feto e corpo adulto. Muitos senão a maioria dos tecidos no feto e adulto contêm células-tronco, que, emsua localização normal, têm o potencial de diferenciar em um número limita-do de tipos de célula específicos a fim de regenerar o tecido onde elas nor-malmente residem. Essas células-tronco (células-tronco somáticas) são mul-tipotentes e podem ter um potencial mais restrito do que as células-troncoembriônicas pelo fato de que elas normalmente dão origem a alguns masnão todos os tipos de célula do corpo humano. As principais fontes de célu-las-tronco somáticas são a medula óssea do feto e adulto e sangue do cor-dão.

Células-tronco embriônicas servem como um excelente sistemain vitro para estudo de eventos de diferenciação celular, avaliação de fárma-co e como uma fonte primária de células diferenciadas especializadas paraaplicações terapêuticas regenerativas futuras.

As células-tronco embriônicas, sendo pluripotentes, têm o po-tencial desenvolvimental para dar origem a qualquer tipo de célula diferenci-ada. Então, uma doença que resulta da falha ou desregulagem, ou genéticaou adquirida, de tipos de célula específicos é potencialmente tratável através de transplante de células hES ou seus derivados através de substituição dascélulas defeituosas e regeneração do órgão ou tecido afetado e também a-través da estimulação do tecido inativo e do que está morrendo.

O transplante de células hES ou seus derivados no corpo hu-mano foi sugerido ter o potencial como um meio para se dirigir a necessida-des médicas não-satisfeitas.

Tem sido amplamente considerado que o transplante de célulashEs vai revolucionar o tratamento de uma ampla variedade de doenças,condições e distúrbio mas, até agora, estudos têm sido restritos a estudospré-clínicos em camundongos e primatas. É questionável se os resultados observados em modelos animais são verdadeiramente representativos doseventos que aconteceriam quando do transplante de tais células no humano.Ainda, sem uso clínico do conceito, as composições farmacêuticas, protoco-los, vias de administração e dosagens para administração das células-troncopermanecem não-definidos ou não-testados. Ainda, embora células-troncohumanas derivadas de fontes outras que não um embrião ou xenotransplan-te de células, tecidos e órgãos de outras espécies tenham sido usados naclínica; essas tentativas têm sido amplamente mal-sucedidas ou apresentamuma variedade de efeitos colaterais debilitantes.

A presente invenção provê o transplante de uma composiçãofarmacêutica compreendendo células hES e/ou seus derivados em seresseres humanos sofrendo de uma variedade de condições, doenças ou dis-túrbios atualmente incuráveis ou terminais.

A Patente U.S. Ne 5.453.457 descreve uma composição com-preendendo células pluripotentes de mamífero não-murino derivadas de umacélula germinativa primordial e incluindo fator de crescimento de fibroblastobásico, fator steel associado à membrana, fator steel solúvel e fator inibidorde leucemia.

A Patente U.S. Ne 6.800.480 reivindica uma composição com-preendendo células hES não-diferenciadas se proliferando em uma matrizextracelular.

O Pedido de Patente US Nq 2003/0017587 descreve expansãoin vitro de células-tronco embriônicas não-diferenciadas obtidas de um fetoabortado ou blastócitos de estágio de clivagem frescos ou congelados usan-do um meio de cultura que não requer células nutrientes. Uma vez isoladas,as células-tronco embriônicas são introduzidas em um meio de cultura decélula suplementado com fatores de crescimento, soro bovino fetal, fator de crescimento neuronal, fator inibidor de leucemia, fator de crescimento defibroblasto, fator steel associado à membrana, fator steel solúvel ou meioscondicionados que não são desejáveis em vista de efeitos colaterais poten-ciais quando do transplante em um paciente. Também, o dito pedido de pa-tente não menciona o protocolo a ser usado para o tratamento de distúrbiosgenéticos ou clínicos exceto que o paciente requer uma dose de cada tipode célula.

O Pedido de Patente US N2 2004/0071665 provê um método te-rapêutico empregando células-tronco de mamífero para tratamento de cardi-opatologia. O exemplo provê células-tronco embriônicas diferenciadas paraformar um agrupamento cardiomiogênico, culturadas em células nutrientes eentão injetadas em três locais do coração de um camundongo tendo infartodo miocárdio.O Pedido de Patente US Ne 2004/0107453 descreve um métodopara obtenção, manutenção e diferenciação de células-tronco adultas e seuuso em tratamento terapêutico.

O Pedido de Patente US 2005/0124003 descreve um métodopara obtenção, manutenção e diferenciação de células-tronco fetais e seuuso em tratamento terapêutico.

Em particular, e de relevância particular para a presente inven-ção, transplante de células-tronco embriônicas em modelos de camundongode lesão ao cordão espinhal (SCI) demonstrou claramente seu potencial fu-turo como uma primeira linha de tratamento de SCI aguda (McDonald e ou-tros (1999) Nature Med. 5:1410; Kerr e outros (2003) J. Neurosci. 23:5131;Roy e outros (2004) Nature Biotechnology, 22:297; Hori e outros (2003)Stem Cells, 21:405; Harper (2004) Proc. NatL Acad. Sei. 101:7123). Apesarda eficácia demonstrada em modelos de animais, ceticismo com relação aproblemas de rejeição de enxerto versus hospedeiro, a necessidade poten-cial de administração durante a vida de imunossupressores e formação detumor e teratoma retardaram autorizações para reproduzir segurança e efi-cácia pré-clínicas em testes humanos experimentais. Um problema adicionaldirecionado ao planejamento de estudos clínicos e de relevância particularpara a presente invenção é que, até agora, não há protocolos ou programasde administração estabelecidos, não há quaisquer estudos de o que seriauma dose terapeuticamente eficaz ou composição farmacêutica ativa ouquais tipos de célula ou combinações de célula devem ser usados.

É então um objeto da presente invenção desenvolver composi-ções farmacêuticas que compreendem células hES e seus derivados quesão livres de produtos animais, células nutrientes, fatores de crescimento,fator inibidor de leucemia, combinações minerais suplementares, suplemen-tos de aminoácido, suplementos de vitamina, fator de crescimento de fibro-blasto, fator steel associado à membrana, fator steel solúvel e meios condi-cionados suspensões em uma solução, carreador ou matriz biocompatível,então adequadas para uso humano.

Ainda outro objeto da presente invenção é desenvolver um pro-tocolo para o tratamento de distúrbios atualmente incuráveis ou terminais.

Ainda um objeto adicional da presente invenção é desenvolverum protocolo para o tratamento de SCI (Lesão ao Cordão Espinhal).

As composições da presente invenção são simples de preparar,seguras, de custo eficaz, eficientes, facilmente transportáveis, escaláveis,têm boa vida de prateleira e são livres de efeitos colaterais tal como reaçõesde anticorpo-antígeno, enervações aberrantes, tumorigenicidade, formaçãode teratoma ou rejeição enxerto hospedeiro. Também a presente invençãorequer apenas um embrião e então o fornecimento contínuo de embriõeshumanos não é requerido. Também, o protocolo para tratamento de acordocom a presente invenção não requer o uso de imunossupressores, e não édependente de tipagem de HLA, não é dependente da raça, gênero ou idadedo indivíduo tratado para o tratamento eficaz das doenças, condições oudistúrbios, é sem regressão e é sem a necessidade de treinamento prévio natécnica de administração. Tratamento de indivíduos com as composiçõesfarmacêuticas de acordo com a prática da presente invenção é então possí-vel em qualquer instalação clínica adequadamente equipada em todo omundo.

A fim de transplantar células-tronco embriônicas humanas emhumanos para propósitos terapêuticos é importante que tais células sejamlivres de contaminação tal como bactérias, vírus, príons ou viróides. A ado-ção de práticas de laboratório operacionais padrão tal como práticas de fa-bricação boas e clínicas boas reduz o risco de tais contaminações para umnível aceitável.

Riscos para o paciente existem, no entanto, através das meto-dologias de cultura de célula existentes.

Um risco principal é que componentes do meio de cultura de cé-lula, retidos no produto farmacêutico para administração a indivíduos huma-nos, sejam administrados e então representem um risco ao paciente atravésde efeitos colaterais até agora não-antecipados que não puderam ser ante-cipados através de estudos de "segurança" em teste de animal.

Eliminação de tal risco é então desejável.As características de uma fonte de cultura de célula-tronco em-briônica para administração a indivíduos humanos foram identificadas comotendo o design que segue: ela é capaz de proliferação por um período detempo prolongado sem diferenciação, mantém um cariótipo onde todas ascaracterísticas do doador são retidas fielmente durante a cultura, mantém opotencial para diferenciar em derivados do endoderma, mesoderma e ecto-derma através da cultura, não vai diferenciar quando culturada na ausênciade fatores exógenos, não vai dar origem a teratomas, não será imunogênica,não vai formar conexões aberrantes e tecido ectópico, vai agir sobre o tecidodanificado e não dividir continuamente in vivo exceto se elas foram progra-madas para fazer isso em um ciclo de vida natural. Não deve haver qualquercontaminante presente na metodologia de cultura e na linhagem de célularevelada na invenção.

O principal impulso de pesquisa até agora tem sido desenvolver condições de cultura que satisfaçam essas necessidades, mas, até agora,nenhuma de tais condições esteve próxima ou validada através de testesclínicos. Em particular, a pesquisa até agora focou na eliminação da neces-sidade de células nutrientes de camundongo como uma matriz para o cres-cimento e desdiferenciação de uma cultura de célula-tronco embriônica. Orecurso parcial de provisão de fatores de crescimento desconhecidos atra-vés da remoção de células nutrientes e a suplementação de "meios condi-cionados" também revelou um risco inaceitável no meio de cultura ideal. Cé-lulas-tronco embriônicas culturadas na presença de meio condicionado nu-tridor ainda retêm um risco inerente de contaminação e então um risco ina-ceitável durante o transplante em seres humanos.

Um fator adicional no planejamento de condições de cultura decélulas-tronco embriônicas humanas destinadas para administração a sereshumanos é a questão de suplementos exógenos residuais nos meios quepodem estar presentes na composição farmacêutica administrada, mas quesão essenciais durante a fase de expansão celular.

Esses incluem fator de crescimento de fibroblasto, fator inibidorde leucemia, fator steel associado à membrana, fator steel solúvel, soro, al-buminas ou suplementos de albumina, suplementos de aminoácido, suple-mentos de vitamina, transferrinas ou suplementos de transferrina, antioxi-dantes, insulina ou substitutos de insulina, precursores de colágeno ou subs-titutos de precursor de colágeno, elementos traço, resíduos de "meios condi-cionados", produtos animais, células nutrientes, fatores de crescimento,combinações minerais suplementares, suplementos de aminoácido e suple-mentos de vitamina.

Resíduos de tais suplementos adicionais são vistos como riscosdesnecessários para a segurança de pacientes durante o transplante de cé-lulas-tronco embriônicas humanas em tais indivíduos. Ainda, a suplementa-ção de tais fatores no meio de cultura aumenta o risco de contaminação doambiente e aumenta o custo futuro de terapia de célula-tronco e então limitasua aplicabilidade em uma faixa ampla de doenças, condições ou distúrbiosmédicos.

Várias abordagens foram adotadas para reduzir esses riscos in-cluindo: Patente U.S. e Pedido N5S 5.843.780; 5.690.926; 6.642.048;6.800.480; 5.166.065; 6.200.806; 5.453.357; 6.090.622; 6.562.619;6.921.632, 2006/0073587 e 2002/076747.

No entanto, nenhuma dessas abordagens oferece um sistemapara a produção de um produto farmacêutico contendo células-troncoembriônicas humanas e seus derivados que é livre de fatores potencialmen-te contaminantes que poderiam afetar a eficácia e segurança de células-tronco embriônicas humanas e seus derivados quando da administração aseres humanos.

É então outro objetivo da invenção desenvolver um sistema decultura de célula simplificado para a expansão de células hES e seus deriva-dos em um estado substancialmente não-diferenciado a fim de produzir umproduto farmacêutico que seja pronto para uso em uma ampla variedade dedistúrbios médicos.

Mais particularmente, é um objetivo da invenção prover umatécnica de cultura que produza uma linhagem de célula-tronco livre de pro-dutos animais, células nutrientes, fatores de crescimento, fator inibidor deleucemia, combinações minerais suplementares, suplementos de aminoáci-do, suplementos de vitamina, fator de crescimento de fibroblasto, fator steelassociado à membrana, fator steel solúvel e meios condicionados.

Sumário da Invenção

A presente invenção provê composições farmacêuticas compre-endendo células hES e/ou seus derivados e o uso de células hES e seusderivados em tratamento de uma ampla variedade de condições, doenças edistúrbios onde as células-tronco são introduzidas no corpo humano atravésde uma variedade de vias de administração, aplicações tópicas ou inserçãointralesional.

A presente invenção provê ainda um método para tratamento deum indivíduo sofrendo de uma doença, distúrbio ou condição terminal ouatualmente incurável compreendendo um programa de administração deuma quantidade terapeuticamente eficaz de células hES ou seus derivadosatravés de injeção intramuscular, intravenosa, caudal, intravítrea, intrastria-tal, intraparenquimal, intratecal, epidural, retrobulbar, subcutânea, intracardí-aca, intracística, intra-articular ou intratecal, infusão por cateter epidural, in-fusão por cateter de bloqueio aracnóide, infusão intravenosa, via neubiliza-dor, via spray, via vias intravaginais, via gotas para olho e ouvido locais e umprograma para administração as células hES e seus derivados topicamenteou intralesionalmente.

É preferível usar células hES ou seus derivados que são livresde produtos animais, células nutrientes, fatores de crescimento, fator inibidorde leucemia, combinações minerais suplementares, suplementos de vitami-na, suplementos de aminoácido, fator de crescimento de fibroblasto, fatorsteel associado à membrana, fator steel solúvel e meios condicionados, pa-ra evitar quaisquer chances de contaminação e possibilidades de efeitos co-laterais negativos. As células hES e seus derivados podem ser obtidos atra-vés de qualquer metodologia de cultura de célula conhecida e aprovada, queseja livre de célula nutriente e livre de contaminação de qualquer fonte e se-gura para transplante humano. Derivados de hES incluem células diferenci-adas adicionais do corpo humano.A presente invenção provê ainda composições farmacêuticaspara o tratamento de doenças, distúrbios ou condições terminais ou atual-mente incuráveis compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficazde células hES e/ou seus derivados, onde as ditas células hES ou seus deri-vados são livres de produtos animais, células nutrientes, fatores de cresci-mento, fator inibidor de leucemia, combinações minerais suplementares, su-plementos de aminoácido, suplementos de vitamina, fator de crescimento defibroblasto, fator steel associado à membrana, fator steel solúvel e meioscondicionados, suspensos em uma solução biocompatível farmaceutica-mente aceitável ou qualquer outro veículo carreador.

A presente invenção também inclui células hES e/ou seus deri-vados livres de produtos animais, células nutrientes, fatores de crescimento,fator inibidor de leucemia, combinações minerais suplementares, suplemen-tos de aminoácido, suplementos de vitamina, fator de crescimento de fibro-blasto, fator steel associado à membrana, fator steel solúvel e meios condi-cionados, aprisionados em um material ou matriz biocompatível. O materialou matriz biocompatível pode ser selecionado de biopolímeros, incluindopolipeptídeos ou proteínas, polissacarídeos, incluindo fibronectina, váriostipos de colágeno, laminina, queratina, fibrina, fibrinogênio, ácido hialurônico,sulfato de heparina, sulfato de condroitina, agarose ou gelatina.

As composições da presente invenção podem estar em umaforma de fármaco pronto para uso onde as células-tronco têm viabilidadeadequada, isto é, elas têm uma viabilidade alta o suficiente para serem úteisem um ou mais métodos da presente invenção. Em uma modalidade, as cé-lulas-tronco têm uma viabilidade de mais do que cerca de 40%, por exemplo,maior do que cerca de 50%, 60%, 70% ou 80%. A composição pode aindaincluir um agente antimicrobiano, agente antibacteriano, produto hormonalou outro agente farmacêutico.

A fim de preparar as composições, cerca de 750.000 a cerca de160 milhões de células hES e/ou um ou mais de seus derivados tal comoprogenitores de célula-tronco hematopoiética, progenitores de célula-tronconeuronal, progenitores de célula-tronco mesenquimal, progenitores de célu-la-tronco de produção de insulina, progenitores de célula-tronco de hepatóci-to, progenitores de célula-tronco cardíaca, progenitores de célula-tronco epi-telial ou suas misturas são suspensas em cerca de 0,25 ml a cerca de 100ml de um veículo carreador. Em uma modalidade, cerca de 750.000 a cercade 80 milhões de células hES são suspensas em cerca de 0,25 ml a cercade 10 ml do veículo carreador. Enriquecimento de tipos progenitores de célu-la-tronco diferenciada específica em uma população é uma prioridade, em-bora uma proporção de células-tronco não-diferenciadas vá permanecer nacomposição. Em uma modalidade, a porção de células-tronco não-diferenciadas não será mais do que cerca de 80% da população de célulastotal. Em outra modalidade, a porção de células-tronco não-diferenciadasnão será mais do que cerca de 40% da população de células total.

Doenças e outros distúrbios ou condições terminais que podemser tratados ou melhorados de acordo com a presente invenção incluem,sem limitação, câncer, distúrbio hepático e rim, distúrbios do sistema nervo-so, distúrbios de pele, distúrbios auto-imunes, distúrbios genéticos, distúr-bios do olho, distúrbios músculo-esqueletais, distúrbios de fertilidade e re-produtivos e distúrbios cardiovasculares e sem limitação incluem LeucemiaMielóide Aguda, Adenocarcinoma, Artrite, Astrocitoma, Atrofia do Nervo Au-ditivo, Autismo, Distúrbios Auto Imunes, Mal de Alzheimer, Espondilite An-quilósante, Distrofia Muscular de Becker, Dano Cerebral, Queimaduras, Aci-dente vascular cerebral, Paralisia Cerebral, Coma, Úlceras Corneanas, Re-jeição de Enxerto Corneano, Degeneração Córtico-Basal do Sistema Nervo-so, Doença da Artéria Coronária, Diabetes, Demência, Síndrome de Down,Distrofia Muscular de Duchenne, Doença Renal de Estágio Terminal, Parali-sia de Erb, Distrofia Muscular Fascio Escapular, Distúrbios de Fertilidade,Ataxia de Friedereich, Falência Cardíaca, Carcinoma Hepato Celular, Doen-ça do Neurônio Espino Motor Hereditária, Coréia de Huntington, Doença deKrabbe, Distrofia Tipo Cintura, Cirrose Hepática, Degeneração Macular, Re-tardo Mental, Esclerose Múltipla, Doença do Neurônio Motor, Infarto do Mio-cárdio, Síndrome Nefrótica, Doença de Niemann Pick, Ulceração Não-cicatrizante da Pele, Atrofia Olivo-Ponto Cerebelar1 Atrofia do Nervo Ótico,Doença de Parkinson, Encefalopatia Pós-Choque Elétrico, EncefalopatiaPós-Vacina da Raiva, Úlceras de Pressão, Paralisia Supranuclear Progressi-va, Psoríase, Pthysis Bulbi, Cardiomiopatia Restritiva, Retinite Pigmentosa,Bloqueio de Ramo Direito, Sarcoidose, Bradieardia Sinusal, Distrofia Muscu-lar Espinhal, Ataxia Espino Cerebelar, Síndrome de Steven Johnson, LúpusEritematoso Sistêmico, Trombocitopenia, Talassemia, Colite Ulcerativa, Es-tado Vegetativo, Fibrose Cística, Doença Pulmonar Intersticial, Azoospermia,Falência Ovariana Primária, Úlceras Aftosas, Desequilíbrio Hormonal, Oste-oartrite, Síndrome de Horner e Osteogênese Imperfeita, Canalopatia e Hipo-gamaglobulinemia.

Mais especificamente, a presente invenção provê um método detratamento de SCI de um indivíduos compreendendo:

(a) administração de cerca de 750.000 a cerca de 80 milhões decélulas hES e/ou seus derivados através de injeção subcutânea;

(b) repetição da etapa (a) após um período predeterminado e emseguida administração de células hES e/ou seus derivados através de inje-ção intramuscular;

(c) administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz decélulas hES e/ou seus derivados, onde as ditas células compreendem pro-genitores de célula-tronco neuronal e progenitores de célula-tronco hemato-poiética, através de injeção intravenosa ou infusão;

(d) administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz decélulas hES e/ou seus derivados, onde as ditas células compreendem pro-genitores de célula-tronco neuronal, através de injeção epidural e repetiçãoda dita dose após um período predeterminado dependendo da condição doindivíduo conforme avaliado através de exame clínico e/ou neurológico;

(e) administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz decélulas hES e/ou seus derivados, onde as ditas células compreendem pro-genitores de célula-tronco neuronal, através de injeção caudal;

(f) administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz decélulas hES e/ou seus derivados, onde as ditas células compreendem pro-genitores de célula-tronco neuronal através de injeção intratecal ou um cate-ter de bloqueio subaraquinóide;

(g) administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz decélulas hES e/ou seus derivados, onde as ditas células compreendem pro-genitores de célula-tronco neuronal através de injeção epidural ou cateterepidural;

(h) administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz decélulas hES e/ou seus derivados através de injeção espinhal profunda emqualquer lado da espinha; e

(i) administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz decélulas hES e/ou seus derivados através de infusão intravenosa;

onde as etapas (a) e (b) são realizadas primeiro e as etapas res-tantes podem ser realizadas em qualquer ordem. Em uma modalidade, aetapa (f) é repetida seguida pela etapa (g), pelo menos uma vez, até que oindivíduo exiba sinais clínicos de recuperação da dita SCI.

A invenção também provê um método para tratamento de umindivíduo com uma doença, distúrbio ou condição compreendendo adminis-trar uma quantidade terapeuticamente eficaz de células hES e/ou seus deri-vados culturados em meios livres de produtos animais, células nutrientes,meios condicionados, fatores de crescimento, fator inibidor de leucemia, fa-tor de crescimento de fibroblasto, fator steel associado à membrana e fatorsteel solúvel, através de injeção intramuscular ou injeção intravenosa ou in-jeção epidural ou cateter epidural ou injeção retrobulbar ou injeção subcutâ-nea ou injeção intracardíaca ou injeção intracística ou injeção intratecal ouatravés de aplicação tópica ou aplicação intralesional. Em uma modalidade,a doença, distúrbio ou condição é uma doença, distúrbio ou condição termi-nal ou atualmente incurável.

A invenção também provê um método para tratamento de dis-túrbios do sistema nervoso desenvolvimentais, degenerativos, familiares etraumáticos e ataque cerebrovascular compreendendo administração decerca de 750.000 a cerca de 160 milhões de células hES e/ou seus deriva-dos, onde as ditas células compreendem progenitores de célula-tronco neu-ronal e progenitores de célula-tronco hematopoiética sozinhos ou em combi-nação, através de injeção intravenosa, injeção subcutânea, injeção intra-muscular, injeção intratecal, infusão por cateter epidural e infusão por cateterde bloqueio subaraquinóide.

A invenção também provê um método para tratamento de dis-túrbios de pele compreendendo administração de cerca de 750.000 a cercade 160 milhões de células hES e/ou seus derivados, onde as ditas célulascompreendem progenitores de célula-tronco hematopoiética, através de inje-ção subcutânea ou intravenosa.

A invenção também provê um método de tratamento de úlcerasde leito compreendendo administração de cerca de 750.000 a cerca de 160milhões de células hES e/ou seus derivados através de aplicação local outópica e através de injeção intramuscular.

A invenção também provê um método para tratamento de dis-túrbios auto-imunes compreendendo administração de cerca de 750.000 acerca de 160 milhões de células hES e/ou seus derivados, onde as ditas cé-lulas compreendem progenitores de célula-tronco hematopoiética, através deinjeção intramuscular, ou injeção intravenosa, ou injeção subcutânea, ouinjeção intra-articular ou infusão intravenosa ou suas combinações.

A invenção também provê um método para tratamento de dis-turbos genéticos compreendendo administração de cerca de 750.000 a cer-ca de 160 milhões de células hES e/ou seus derivados, onde as ditas célulascompreendem progenitores de célula-tronco neuronal e progenitores de cé-lula-tronco hematopoiética sozinhos ou em combinação, através de injeçãointravenosa, injeção subcutânea, injeção intramuscular, injeção intratecal,infusão por cateter epidural ou infusão por cateter de bloqueio subaraquinói-de ou suas combinações.

A invenção também provê um método para tratamento de gan-grena compreendendo administração de cerca de 750.000 a cerca de 160milhões de células hES e/ou seus derivados através de injeção intravenosa,injeção intramuscular ou aplicação local na junção de tecido viável e mortoou suas combinações.

A invenção também provê um método para tratamento de condi-ções associadas com envelhecimento compreendendo administração decerca de 750.000 a cerca de 160 milhões de células hES e/ou seus deriva-dos através de injeção intravenosa, injeção subcutânea, injeção intramuscu-Iar ou aplicação local em suspensão ou misturados em um carreador bio-compatível tal como um gel, ungüento, matriz, pasta ou spray aerossol.

A invenção também provê um método para tratamento de Dia-betes Mellitus compreendendo administração de cerca de 750.000 a cercade 160 milhões de células hES e/ou seus derivados, onde as ditas célulascompreendem células progenitoras de produção de insulina, através de inje-ção intravenosa ou intramuscular ou suas combinações.

A invenção também provê um método para tratamento de Dis-túrbios Cardiovasculares compreendendo administração de cerca de750.000 a cerca de 160 milhões de células hES e/ou seus derivados, ondeas ditas células compreendem progenitores de célula-tronco hematopoiética,através de injeção intravenosa, injeção subcutânea, injeção intramuscular,injeção intracardíaca, angiografia ou injeção direta durante cirurgia.

A invenção também provê um método para tratamento de Dis-túrbios hepáticos e Rim compreendendo administração de cerca de 750.000a cerca de 160 milhões de células hES e/ou seus derivados, onde as ditascélulas compreendem progenitores de célula-tronco hematopoiética, proge-nitores de célula-tronco de produção de albumina e progenitores de célula-tronco de produção de bilirrubina, através de injeção intravenosa, injeçãosubcutânea, injeção intramuscular, infusão intravenosa ou injeção local.

A invenção também provê um método para o tratamento de Dis-túrbios de Fertilidade e Reprodutores compreendendo administração de cer-ca de 750.000 a cerca de 160 milhões de células hES e/ou seus derivados,onde as ditas células compreendem progenitores de célula-tronco hemato-poiética, através de injeção intramuscular, injeção intratesticular ou atravésde injeção na pele subcutânea próximo ao epidídimo.

A invenção também provê um método para o tratamento de Dis-túrbios Músculo-esqueletais compreendendo administração de cerca de750.000 a cerca de 160 milhões de células hES e/ou seus derivados, ondeas ditas células compreendem progenitores de célula-tronco neuronal e pro-genitores de célula-tronco hematopoiética sozinhos ou em combinação, a-través de injeção intravenosa, injeção subcutânea, injeção intramuscular ouinfusão por cateter intravenosa.

A invenção também provê um método para o tratamento de Dis-túrbios do Olho compreendendo administração de cerca de 750.000 a cercade 160 milhões de células hES e/ou seus derivados, onde as ditas célulascompreendem progenitores de célula-tronco neuronal, progenitores de célu-la-tronco hematopoiética e progenitores de célula-tronco mesenquimal sozi-nhos ou em combinação, através de injeção intravenosa local, injeção sub-cutânea, injeção intramuscular, injeção retrobulbar, injeção ihtravítrea ouaplicação tópica. Em uma modalidade, cerca de 750.000 a cerca de 160 mi-lhões de células hES e/ou seus derivados compreendendo progenitores decélula-tronco neuronal são administradas através de injeção retrobulbar. Em outra modalidade, cerca de 750.000 a cerca de 160 milhões de células hESe/ou seus derivados compreendendo progenitores de célula-tronco neuronalsão administradas através de injeção intravítrea. Em outra modalidade, cer-ca de 750.000 a cerca de 160 milhões de células hES e/ou seus derivadoscompreendendo progenitores de célula-tronco mesenquimal são aplicadas alentes de contato para colocação no olho para o tratamento de abrasão cor-neana (por exemplo, a lente de contato é culturada com as células hES e/ouseus derivados para revestir a lente de contato com células e a lente é entãoposta no olho por cerca de 24 horas).

A invenção também provê um método para tratamento de Dis-túrbios do Pulmão compreendendo a administração de 750.000 a 160 mi-lhões de células hES e/ou seus derivados onde as ditas células compreen-dem progenitores de célula-tronco hematopoiética sozinhos ou em combina-ção com progenitores de célula-tronco neuronal através de injeção intramus-cular, injeção intravenosa, spray ou nebulizador. Em uma modalidade,750.000 a 160 milhões de progenitores de célula-tronco hematopoiética sãoadministrados através do nebulizador onde 2 ml de solução solução salinanormal são adicionados. Em outra modalidade, 750.000 a 160 milhões deprogenitores de célula-tronco hematopoiética são administrados através despray (baforada).

A invenção também provê um método para o tratamento de Dis-túrbios Hormonais compreendendo a administração de 750.000 a 160 mi-Ihões de células hES e/ou seus derivados onde as ditas células compreen-dem células-tronco hematopoiéticas e neuronais através de vias intramuscu-Iar e intravenosa.

A invenção também provê um método para o tratamento de IJI-ceras Aftosas e outras úlceras compreendendo a administração de 750.000a 160 milhões de células hEs e/ou seus derivados onde as ditas célulascompreendem células-tronco hematopoiéticas e neuronais em combinaçãoou sozinhas através de vias intramuscular e intravenosa.

A invenção também provê um método para o tratamento de Os-teoartrite da junta do joelho e quadril compreendendo a administração de15 750.000 a 160 milhões de células hES e/ou seus derivados através de inje-ção intramuscular, intravenosa ou intra-articular. Em uma modalidade,750.000 a 160 milhões de progenitores de célula-tronco hematopoiética sãoadministradas intra-articularmente.

A presente invenção provê uma metodologia de cultura de célulaque é aplicável à cultura de células hES e seus derivados que pode ser usa-da para transplante em seres humanos sem quaisquer efeitos colaterais talcomo formação de teratoma, formação de tumor, problemas antigenicidadeou rejeição enxerto-versus-hospedeiro.

O planejamento da metodologia de cultura é especificamentepara a produção de células hES e seus derivados de viabilidade suficiente ede características apropriadas para atividade terapeuticamente ótima apóstransplante em seres humanos.

Em uma modalidade preferida, a metodologia de cultura de célu-la é usada para o crescimento, expansão, diferenciação e armazenamentode células hES. Ainda, a invenção refere-se a composições prontas parainjetar compreendendo células hES e/ou seus derivados que são armazena-dos em condições de armazenamento que são adequadas para transplantedireto quando do descongelamento.

Em contraste com as metodologias de cultura de célula existen-tes para a manutenção de células hES em um estado substancialmente não-diferenciado, o meio de cultura não contém suplementos tal como fator decrescimento de fibroblasto básico, fator de inibição de leucemia, fator steelassociado à membrana, fator steel solúvel, soro, albuminas ou suplementosde albumina, suplementos de aminoácido, suplementos de vitamina, trans-ferrina ou suplementos de transferrina, antioxidantes, insulina ou substitutosde insulina, precursores de colágeno ou substitutos de precursor de coláge-no, elementos traço, resíduos de "meios condicionados", produtos animais,I células nutrientes, fatores de crescimento, combinações minerais suplemen-tares, suplementos de aminoácido e suplementos de vitamina.

Em contraste adicional com outras metodologias de cultura decélula para a expansão de células hES, a prática da presente invenção nãoleva à formação de corpos embrióides, deste modo evitando a necessidadede operação cirúrgica. Vale a pena notar que neste ponto o produto da in-venção sendo um produto totalmente humano, xenotransplante (por exem-plo, teste animal) pode não ser necessário. O caso da primeira gestação defertilização in vitro (IVF) é um exemplo de resultado.

Diferente de outras metodologias de cultura de célula, as técni-cas de cultura de célula da presente invenção permitem expansão quaseilimitada de células hES sem diferenciação significante. Uma vantagem prin-cipal da presente invenção é que um único embrião é suficiente para proverquantidades terapeuticamente eficazes de células hES e/ou seus derivadospara tratar vários pacientes. Então, não há necessidade de procura repetidade embriões humanos e muitas das questões éticas associadas com o usode embriões humanos podem ser evitadas.

Uma vantagem adicional dos métodos da presente invenção éque as células hES e seus derivados são produtos universalmente aceitáveisem termos imunológicos, então nenhuma reação cruzada de pacientes ecélulas é requerida e nenhuma imunossupressão é necessária.

Um aspecto da invenção refere-se a métodos para isolamentode células hES compreendendo:

(a) coleta de um embrião de 2 a 7 dias de vida em meio essen-cial mínimo,

(b) isolamento de células hES do embrião através de meios me-cânicos.

Um aspecto da invenção refere-se a um método de expansão decélulas-tronco embriônicas humanas livres de produtos animais, células nu-trientes, fatores de crescimento, fator inibidor de leucemia, combinações mi-nerais suplementares, suplementos de aminoácido, suplementos de vitami-na, fator de crescimento de fibroblasto, fator steel associado à membrana,fator steel solúvel e meios condicionados, compreendendo as etapas de:

(a) introdução de células-tronco embriônicas humanas no meiocelular consistindo em meio essencial mínimo, progestina e um agonista deβ-gonadotropia coriônica humana (PhCG); e

(b) incubação das células-tronco em uma temperatura de cercade 34°C a cerca de 38°C em um ambiente de cerca de 3,5% a cerca de 6%de dióxido de carbono por cerca de 12 horas a cerca de 48 horas.

Outro aspecto da invenção refere-se a métodos de cultivo de cé-lulas hES de modo que elas estão em um estágio anterior ao estágio parci-almente diferenciado e são livres de produtos animais, células nutrientes,fatores de crescimento, fator inibidor de leucemia, combinações mineraissuplementares, suplementos de aminoácido, suplementos de vitamina, fatorde crescimento de fibroblasto, fator steel associado à membrana, fator steelsolúvel e meios condicionados, compreendendo as etapas de:

(a) introdução de células hES em um meio de cultura de célulaconsistindo em meio essencial mínimo; e

(b) incubação das células-tronco em uma temperatura de cercade 34°C a cerca de 38°C em um ambiente de cerca de 3,5% a cerca de 6%de dióxido de carbono por cerca de 12 horas a cerca de 48 horas.

Outro aspecto da invenção refere-se a um processo de prepara-ção de uma preparação de célula-tronco embriônica humana pronta parauso para transplante humano compreendendo:(a) obtenção de células-tronco embriônicas humanas livres deprodutos animais, células nutrientes, fatores de crescimento, fator inibidor deleucemia, combinações minerais suplementares, suplementos de aminoáci-do, suplementos de vitamina, fator de crescimento de fibroblasto, fator steelassociado à membrana, fator steel solúvel e meios condicionados,

(b) centrifugação das ditas células-tronco para se obter um pélete, e

(c) suspensão do pélete em uma solução biocompatível.

Outro aspecto da invenção refere-se a um método de armaze-namento de uma célula-tronco embriônica humana em uma condição viávelcompreendendo:

(a) obter as células-tronco preparadas através do métodos dapresente invenção,

(b) adicionar um agente de criopreservação, e

(c) congelar as células a-4 a-80°C.

O propósito de cultivo de células hES de acordo com a prática dapresente invenção é a ausência de tais suplementos para reduzir o risco deintrodução de contaminações bacterianas, fúngicas, virais ou outras na cultura.Isto reduz o risco de infecção e variabilidade nas características das células.

Um propósito adicional da presente invenção é prover métodossimples, de custo eficaz, escaláveis para a produção e expansão de célulashES e seus derivados em uma forma que é livre de quaisquer resíduos decontaminação e é segura para uso em seres humanos.

O propósito da presente invenção é então prover produtos far-macêuticos onde o risco de administração de toda co-contaminação é redu-zido, e onde contaminação residual de fatores suplementares é eliminada.

Um propósito adicional da presente invenção é prover uma me-todologia de cultura de célula que reduz o risco de aberrações cromossômi-cas ou instabilidade genética.

Um propósito adicional da presente invenção é prover uma me-todologia de cultura de célula que reduz o risco de formação de teratoma empacientes onde a dita cultura é transplantada.Um propósito adicional da presente invenção é prover uma me-todologia de cultura de célula quer reduz o risco de formação de tumor empacientes onde a dita cultura é transplantada.

Um propósito adicional da presente invenção é prover uma me-todologia de cultura de célula que reduz o risco de problemas de antigenici-dade ou problemas de rejeição de enxerto versus hospedeiro em pacientesonde a dita cultura é transplantada.

A presente invenção especificamente provê composições com-preendendo células hES e seus derivados e um meio biocompatível que es-tão em uma forma que está de acordo com padrões reguladores internacio-nais de segurança e qualidade, e então em uma forma que é pronta parainjeção em pacientes humanos para propósitos terapêuticos.

A presente invenção também provê um produto de fabricaçãocompreendendo uma suspensão de células hES e/ou seus derivados sus-pensos em uma solução biocompatível e contidos em um recipiente paraarmazenamento, transporte ou transplante diretamente em um ser humano.

A presente invenção também provê um método para a expansãode células hES e seus derivados.

A presente invenção também provê um método para a expansãode células hES e seus derivados e inibição de sua diferenciação.

A presente invenção também provê um método para o cultivo decélulas hES e seus derivados que os torna terapeuticamente eficazes quan-do do transplante em um humano que está sofrendo de uma doença, condi-ção ou distúrbio.

Descrição Detalhada da InvençãoDefinições

Na descrição e exemplos que seguem, vários termos são usa-dos aqui. A fim de prover uma compreensão clara e consistente do relatórioe reivindicações, incluindo o escopo a ser dado tais termos, as definiçõesque seguem são providas.

Pode ser notado que os termos usados para geralmente descre-ver a presente invenção são usados de uma maneira a manter seu significa-do comum conforme compreendido por um versado comum na técnica.

"Célula-tronco embriônica" refere-se a células pluripotentes deseres humanos (isto é, células hES). Em uma modalidade, as células hESsão isoladas de um embrião em estágio pré-blastócito. Em outra modalida-de, as células hES são preparadas através de desdiferenciação de célulaspelo menos parcialmente diferenciadas (por exemplo, células multipotentes)e são totipotentes em prática. Métodos de preparação de células hES sãobem conhecidos e ensinados, por exemplo, nas Patentes U.S. Nqs5.843.780, 6.200.806, 7,029.913, 5.453.357, 5.690.926, 6.642.048,6.800.480, 5.166.065. 6.090.622, 6.562.619, 6.921.632 e 5.914.268, PedidoI Publicado U.S. N2 2005/0176707 e Pedido Internacional Ne W02001085917.

"Células-tronco fetais" refere-se a células-tronco derivadas dotecido fetal, isto é, tecidos de um ser humano em desenvolvimento após im-plante do embrião no útero.

"Multipotente" refere-se a células-tronco que podem produzirapenas células de uma família de células intimamente relacionada.

"Pluripotente" refere-se a células-tronco que são as descenden-tes de células totipotentes e podem se desenvolver em qualquer tipo excetocélulas-tronco totipotentes.

"Totipotente" refere-se a células-tronco que são produzidas apartir da fusão de uma célula de ovo e esperma. Células produzidas pelasprimeiras divisões da célula de ovo fertilizado são também totipotentes. Es-sas células podem se desenvolver em qualquer tipo de célula sem exceção.

"Quantidade terapeuticamente eficaz" é usada no relatório paradescrever concentrações ou quantidades de componentes tal como células-tronco embriônicas, células neuroprogenitoras, células neuronais, progenito-res de célula-tronco hematopoiética, progenitores de célula-tronco cardíacaou qualquer derivado de células-tronco, ou outros agentes e suas misturasque são eficazes para produção de um resultado pretendido dentro do con-texto de prática de um ou mais aspectos da presente invenção.

Os termos "transplantando" e "transplante" são usados no relató-rio sinonimamente para descrever o processo através do qual células-troncoembriônicas e/ou seus derivados de acordo com a presente invenção sãoaplicados ao local dentro do corpo humano onde as células são pretendidasexibir um efeito favorável em conexão com o tratamento ou melhora de umadoença, distúrbio ou condição descrito aqui incluindo, sem limitação, reparode dano ao sistema nervoso central de um indivíduo, tratamento de uma do-ença neurodegenerativa ou tratamento dos efeitos de dano ao nervo causa-do por derrame, doença cardiovascular, um ataque cardíaco ou lesão físicaou trauma ou dano genético ou insulto ambiental ao cérebro e/ou cordãoespinhal ou órgãos causados por, por exemplo, um acidente ou outra ativi-dade, dano ao fígado, distúrbio auto-imune, disfunção sexual ou reprodutiva,degeneração de várias partes do olho, dano ao rim, etc.

"Solução biocompatível" é usada no relatório para se referir asoluções onde células hES e/ou seus derivados são suspensos para uso noprotocolo para transplante ou para quaisquer outros usos subseqüentes.

Tais soluções biocompatíveis incluem solução solução salina e podem aindacompreender outros ingredientes tal como preservativos, antimicrobianos esimilar e outros agentes farmacêuticos.

"Carreador biocompatível" é usado no relatório para se referir acarreadores sólidos, soluções e misturas onde as células hES e/ou seus de-rivados são suspensos para uso no protocolo para tratamento tópico, trans-plante ou para quaisquer outros usos subseqüentes. Tais carreadores bio-compatíveis incluem géis, unguentos, pastas e sprays aerossóis.

"Recipiente biocompatível" é usado no relatório para se referir arecipientes (por exemplo, recipientes de cultura de célula ou armazenamen-to) onde as células hES e/ou seus derivados são postos e que não previnemas células de serem usadas em transplante, isto é, não contaminam as célu-las com componentes que não podem ser administrados a indivíduos.

Exemplos de materiais de recipiente biocompatíveis incluem sem limitaçãovidro, aço inoxidável e poliestireno.

Uma "progestina" é qualquer hormônio natural ou sintético tendoatividade do tipo progesterona, isto é, tendo pelo menos 25% da atividade deprogesterona em um de qualquer ensaio conhecido para atividade biológica.Exemplos incluem sem limitação progesterona, didrogesterona, medroxipro-gesterona, noretisterona, levonorgestrel, norgestrel, gestodeno e drospire-nona. Exemplos de outras progestinas são revelados nas Patentes U.S. Nes7.091.234. 7.084.151, 7.081.457, 7.071.205, 6.562.857, 6.319.911,6.245.757, 6.043.235 e 6.028.064.

"Agonistas de gonadotropina coriônica β-humana (PhCG)" sãodefinidos como qualquer PhCG de ocorrência natural ou sintética ou frag-mento ou derivado dela tendo pelo menos 25% da atividade de PhCG natu-ral em um de qualquer ensaio conhecido para atividade biológica. Exemplosde agonistas de PhCG incluem sem limitação PhCG e aqueles revelados nasPatentes U.S. Ngs 6.635.445, 6.585.982, 6.583.Í09, 6.469.139 e 5.997.871.

"Meio essencial mínimo" é usado no relatório para se referir aum meio de cultura de célula compreendendo aminoácidos, sais, glicose evitaminas. Exemplos incluem RPMI, DMEM, EMEM e GMEM.

"Nebulização" significa a administração de um fármaco ou subs-tância aos pulmões através do nebulizador.

Intra-articular significa administração ao espaço intra-articular.

Retrobulbar significa administração ao espaço retrobulbar.

Infusão intravenosa significa administração à veia usando umfluido iv compreendendo o produto ou fármaco.

Injeção "epidural" ou infusão por cateter significa administraçãoà região fora da dura mater das meninges.

Injeção "intratecal" ou infusão por cateter significa administraçãoà camada mais interna das meninges, isto é, a matéria araquinóide no fluidocérebro espinhal, que está em contínuo com o cérebro.

Injeção "caudal" significa administração através da membranasacral, que está aproximadamente três centímetros acima da ponta do cóc-cix que é contínuo com o espaço epidural.

"Injeção espinhal profunda" significa injeção nos músculos espi-nhais eretores em qualquer lado da espinha.

Injeção "intramuscular" significa administração entre as folhas domúsculo.Injeção "intravenosa" significa administração dentro de uma veia.

"SCI aguda" significa até três meses após a data da SCI.

"SCI subaguda" significa de três meses após a data da SCI aténove meses após a data da lesão.

"SCI crônica" mais de nove meses após a data da SCI.

"Derivados" de células hES incluem células-tronco multipoten-tes, células-tronco pluripotentes, células-tronco adultas e células-tronco es-pecíficas de tecido e não incluem células completamente diferenciadas.

Exemplos de células-tronco específicas de tecido podem ser encontrados natabela que segue.

<table>table see original document page 26</column></row><table><table>table see original document page 27</column></row><table><table>table see original document page 28</column></row><table>

A presente invenção refere-se a composições farmacêuticascompreendendo células hES e/ou seus derivados, as ditas células-troncosendo livres de produtos animais, células nutrientes, fatores de crescimento,fator inibidor de leucemia, combinações minerais suplementares, suplemen-tos de aminoácido, suplementos de vitamina, fator de crescimento de fibro-blasto, fator steel associado à membrana, fator steel solúvel e meios condi-cionados, para uso no tratamento clínico de doenças, condições ou distúr-bios atualmente incuráveis ou terminais. Em outra modalidade, a invençãorefere-se a um método de tratamento de condições atualmente incuráveis outerminais usando células hES e/ou seus derivados através de um protocolode transplante.

A frase "livre de produtos animais, células nutrientes, fatores decrescimento, fator inibidor de leucemia, combinações minerais suplementa-res, suplementos de aminoácido, suplementos de vitamina, fator de cresci-mento de fibroblasto, fator steel associado à membrana, fator steel solúvel emeios condicionados" não exclui as quantidades traço de progestina e ago-nista de PhCG que podem estar presentes na composição farmacêutica co-mo um resultado dos métodos de cultura da presente invenção. O termo"produtos animais" refere-se a qualquer produto não-humano.

Em outra modalidade, o processo da presente invenção provêum método simples, seguro, amplamente aplicável reproduzível e eficientepara transplante de uma composição farmacêutica compreendendo célulashES e/ou seus derivados em uma forma pronta para uso e sendo livre decélulas nutrientes e qualquer outra contaminação. Essas células podem serderivadas de qualquer metodologia de cultura e transplantadas no corpohumano sem importar o antecedente genético do paciente, idade, raça e gê-nero e sem reação anticorpo-antígeno ou rejeição enxerto-hospedeiro, sema formação de teratomas ou tumores, ou outros efeitos colaterais debilitan-tes, sem o resultado de enervações aberrantes e sem a necessidade de ad-ministração de imunossupressores para o tratamento de uma variedade dedoenças, condições e distúrbios.

Em contraste com outros métodos conhecidos, as células hESusadas na preparação das composições farmacêuticas da presente inven-ção são culturadas em um meio de cultura que é livre de produtos animais,células nutrientes, fatores de crescimento, fator inibidor de leucemia, combi-nações minerais suplementares, suplementos de aminoácido, suplementosde vitamina, fator de crescimento de fibroblasto, fator steel associado àmembrana, fator steel solúvel e meios condicionados, e então não têmqualquer tipo de contaminação que possa interferir com a segurança ou efi-cácia do uso clínico pretendido.

De acordo com a prática da invenção, células hES e/ou seus de-rivados são introduzidos no corpo humano através de injeção intramuscular,intravenosa, caudal, intravítrea, intrastriatal, intraparenquimal, intratecal, epi-dural, retrobulbar, subcutânea, oral, intracardíaca, intracística, intra-articularou intratecal ou cateter epidural, cateter de bloqueio subaraquinóide, infusão-intravenosa, através de nebulizador, através de spray, através de vias intra-vaginais e/ou através de gotas para o olho e ouvido. Em outra modalidade,as células hES e/ou seus derivados são administrados topicamente ou intra-lesionalmente.

Cada via de administração usa um volume particular para inje-ção e então uma faixa específica de células das soluções de estoque de cé-lulas hES e/ou seus derivados conforme indicado na Tabela 1. Onde tipos decélula são indicados (por exemplo, nas tabelas de programa de injeção abai-xo), o tipo de célula indicado é o tipo que está predominantemente presentena população de célula.

TABELA 1

<table>table see original document page 30</column></row><table>

Entre o laboratório e o último ponto de uso, seja ele um clínicoou outro lugar, as composições farmacêuticas devem ser mantidas em ar-mazenamento frio. Em uma modalidade, as composições farmacêuticas sãoarmazenadas em cerca de +4 a cerca de -160°C. Em outra modalidade, ascomposições farmacêuticas são armazenadas em cerca de -15 a cerca de -72°C, por exemplo, cerca de -20 a cerca de -40°C.

Em uma modalidade, as células hES usadas na presente inven-ção são isoladas de um embrião excedente, descartado de um ciclo de ferti-lização in vitro natural e doado através de consentimento informado. Emuma modalidade alternativa, células-tronco fetais pluripotentes, tal como a-quelas descritas no Pedido Publicado U.S. N9 2005/0124003 isoladas devilosidades coriônicas, fluido amniótico e/ou placenta, são usadas na presen-te invenção.

A presente invenção provê um método para tratamento de umavariedade de doenças, condições e distúrbios incluindo, mas não limitado a,câncer, derrame, distúrbios genéticos, distúrbios hepáticos, distúrbios dosistema nervoso, distúrbios vasculares, doenças e distúrbios de pele, distúr-bios auto-imunes, distúrbios do olho, distúrbio do rim, distúrbios cardíacos,ή distúrbios múscolo-esqueletais, distúrbios reprodutivos e de fertilidade e ar-trite usando células hES e/ou seus derivados.

Exemplos não-limitantes de cânceres que podem ser tratadosde acordo com a presente invenção incluem tumor do cordão espinhal, cân-cer de mama, câncer de próstata, linfoma, câncer de pele, câncer pancreáti-co, câncer de colo, melanoma, melanoma maligno, câncer ovariano, câncercerebral, carcinoma de cérebro primário, câncer da cabeça-pescoço, glioma,glioblastoma, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer pulmonar de célulanão-pequena, carcinoma de cabeça ou pescoço, carcinoma de mama, carci-noma ovariano, câncer cervical, lesões metastáticas, carcinoma de pulmão,carcinoma de pulmão de célula pequena, tumor de Wilm, carcinoma cervical,carcinoma testicular, carcinoma de bexiga, carcinoma pancreático, carcino-ma de estômago, carcinoma de colo, carcinoma prostático, carcinoma geni-tourinário, carcinoma da tireóide, carcinoma esofageal, mieloma, mielomamúltiplo, carcinoma adrenal, carcinoma de célula renal, carcinoma endome-trial, carcinoma do córtex adrenal, insulinoma pancreático maligno, carcino-ma carcinóide maligno, cariocarcinoma, hipercalcemia maligna, hiperplasiacervical, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica,leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crônica, leucemia granulocí-tica crônica, leucemia granulocítica aguda, leucemia de célula pilosa, neuro-blastoma, rabdomiossarcoma, sarcoma de Kaposi, policitemia vera, trombo-citose essencial, doença de Hodgkin, linfoma de não-Hodgkin, sarcoma detecido mole, sarcoma osteogênico, macroglobulinemia primária e retinoblas-toma.

Em uma modalidade, as células hES não são tratadas com umagente de diferenciação uma vez que, sendo embriônicas, as células sãoprogramadas, e uma vez administradas ao indivíduo, as células migram parao local da lesão. No local, as células diferenciam em resposta a sinais dediferenciação in vivo. No local da lesão, as células hES e seus derivados nãoproliferam indefinidamente, deste modo necessitando de um programa deinjeções repetidas. O fato de que as células hES e seus derivados não proli-feram indefinidamente elimina a possibilidade de tumorigenicidade e forma-ção de teratoma.

Após tratamento com células hES e/ou seus derivados de acor-do com a prática da presente invenção, o paciente deve descansar e adotarum regime severo de abstinência de ingestão de qualquer substância talcomo álcool ou tabaco que pode prejudicar funcionamento celular e impediro processo de degeneração disparado pela migração das células hES eseus derivados para o local da lesão. O paciente deve evitar tomar quais-quer medicações que sejam conhecidas ser prejudiciais durante a gravidez,uma vez que as medicações podem ter efeitos adversos sobre as célulastransplantadas.

Uso de células hES e seus derivados no tratamento de SCI

No momento não há quaisquer curas eficazes para o tratamentode SCI incluindo Dano ao Cordão Espinhal Agudo, Dano ao Cordão EspinhalSubagudo ou Dano ao Cordão Espinhal Crônico, que freqüentemente resultaem paraplegia, tetraplegia e quadriplegia. O transplante de células hES parao tratamento de SCI apresenta uma oportunidade única de se endereçar auma necessidade médica não-satisfeita e drasticamente melhorar a vida demilhões de pessoas em todo o mundo que sofrem de conseqüências de SCI.Ganho novamente de funções perdidas dos sistemas nervosos central e au-tônomo através de transplante de células hES e seus derivados em um es-tado substancialmente progenitor vai permitir a recuperação de cursos pa-rassimpáticos, simpáticos, motores, autônomos e sensórios através da repo-sição de função de célula perdida, regeneração de células neurais perdidas,remoção das barreiras físicas tal como tecido de cicatriz, bloqueio de cursosde sinalização de inibição e a liberação de fatores neurotróficos dos progeni-tores de célula hES transplantadas.

Dentre os benefícios de restauração de função neurológica atra-vés do transplante de células hES de acordo com a prática da presente in-venção estão: uma melhora na função motora e sensória, a qualidade devida geral, redução no sistema de apoio geralmente provido por parentes,diminuição na dependência de outras composições farmacêuticas e outrosdispositivos e auxiliares médicos, melhora no estado mental e psicológico etambém em independência econômica. Há uma redução em custos de equi-pamento médico e auxiliares de incapacidade e dependência de medicaçãoatravés de uma recuperação das funções parassimpática, simpática, sensó-ria e motora. Há um aumento na auto-suficiência, melhora no estado social,estado marital e habilidade em exercer direitos reprodutores, com apenasum número limitado de visitas clínicas por ano para tratamento. Tratamentoatravés da administração de células hES e seus derivados de acordo com apresente invenção não leva a problemas de antigenicidade, formação detumor, formação de teratoma ou conexões neurais aberrantes.

Também, administração de células hES e seus derivados espe-cialmente a indivíduos SCI resulta na cura de úlceras de leito, redução emsua necessidade de hipertensivos ou antidepressivos, restauração da sen-sação e controle da bexiga, restauração da sensação do intestino e sensa-ção de dor e toque; restauração de reflexos perdidos; redução em sintomasde suores frios; redução na sensação de tontura; normalização da pressãosangüínea e normalização de respiração com envolvimento diafragmáticocompleto.

Um procedimento para administração de células hES a pacien-tes sofrendo de Dano ao Cordão Espinhal Subagudo ou Dano ao CordãoEspinhal Crônico e para os quais mecanismos de recuperação naturais fa-lharam é dado em detalhes abaixo. Um procedimento diferente para o trata-mento de SCI Aguda como uma primeira linha de tratamento dentro de trêsmeses da lesão de acordo com a prática da presente invenção é tambémprovido em detalhes abaixo.

A dosagem terapeuticamente eficaz, o programa de administra-ção e via de administração de células hES a serem administradas dependemprincipalmente de três fatores; a saber tipo de distúrbio, estado clínico dopaciente e a severidade dos sintomas presentes. Durante a prática da pre-sente invenção foi verificado que dosagens e programas terapeuticamenteeficazes não são dependentes da idade, gênero, peso do corpo ou raça. Oprotocolo para cada paciente é individualmente estabelecido com base emum processo progressivo de avaliação do paciente.

Em uma modalidade da prática da presente invenção, umacomposição farmacêutica contendo células hES e/ou seus derivados é ad-ministrada a um indivíduo que está sofrendo de um distúrbio ou condiçãoterminal atualmente incurável ou outro distúrbio clínico conforme referidoacima através de uma série de injeções a fim de tratar o distúrbio.

Várias modalidades para o tratamento de distúrbios clínicos econdições terminais de acordo com a presente invenção serão agora descri-tas com referência aos exemplos que seguem.

Tratamento, dosagem, programa, vias de administração, avalia-ção e acompanhamento de pacientes sofrendo de SCI

Em uma modalidade, células hES e/ou seus derivados são ad-ministrados a um indivíduo que sofreu de uma SCI há mais de três meses(SCI Subaguda ou Crônica) através de uma série de injeções a fim de trataro distúrbio. Em outra modalidade, os derivados de hES são células-troncoprogenitoras hematopoiéticas. Em outra modalidade, derivados de hES sãocélulas-tronco progenitoras neuronais.Dose de Teste

Em uma modalidade, cerca de 750.000 a cerca de 80 milhõesde células hES e/ou seus derivados, onde as ditas células compreendemcélulas-tronco progenitoras hematopoiéticas e células-tronco progenitorasneuronais, diluídas em solução solução salina normal estéril para um volumefinal de cerca de 0,25 a cerca de 1,0 ml são testadas quanto à contaminaçãoe viabilidade e quanto à contagem usando protocolos padrão e em seguidasão administrados através de injeção subcutânea como uma dose de testeno antebraço. Observações são feitas para checar quanto a choque anafilá-tico, dor ou inflamação no local da injeção, coceira generalizada, rubor oufebre após cinco minutos, dez minutos, quinze minutos, trinta minutos, umahora e vinte e quatro horas. Em uma modalidade, a proporção de célulashEs para células-tronco progenitoras hematopoiéticas e células-tronco pro-genitoras neuronais varia de a partir de cerca de 4:1 a cerca de 1:4. Em ou-tra modalidade, a proporção é cerca de 1:1.

Dose de Iniciação

O protocolo confere a administração de uma injeção inicial sub-cutânea, intramuscular e/ou intravenosa de uma composição farmacêuticacontendo cerca de 750.000 a cerca de 80 milhões de células hES e/ou seusderivados, onde as ditas células compreendem células-tronco progenitorashematopoiéticas e células-tronco progenitoras neuronais, ressuspensas emum volume de cerca de 0,25 ml a cerca de 1,0 ml de solução solução salinanormal estéril. A injeção inicial é administrada através de uma injeção deuma composição farmacêutica contendo o mesmo número de células hES eseus derivados diariamente por uma semana a 10 dias.

Injeção epidural e cateter epidural

Cerca de 750.000 a 80 milhões de células hES e/ou seus deri-vados, onde as ditas células compreendem células-tronco progenitoras neu-ronais, suspensas em um volume de 2 ml de solução solução salina normalestéril e diluídas mais para 5 ml a 40 ml de solução solução salina normalestéril, são administradas através de injeção epidural ou cateter epidural a-cima ou abaixo do local da lesão duas vezes por dia durante um período detrês dias consecutivos, sete a dez dias após a primeira injeção inicial. Admi-nistração através de injeção epidural/cateter epidural é repetida acima ouabaixo do local da lesão de acordo com o progresso clínico na melhora desintomas apresentados pelo paciente e a opinião do médico. Foi tambémobservado que se o paciente for deitado de costas após a injeção epidural,melhora sensória é substancial e se ele foi deixado na posição de face parabaixo, a melhora motora é substancial. Em ambos casos, o paciente tem queter as pernas mantidas em uma posição elevada.

Intratecal

Cerca de 750.000 a 11 milhões de células hES e/ou seus deri-vádos, onde as ditas células compreendem progenitores de célula-tronconeuronal, suspensas em 2 ml de solução solução salina normal e diluídasmais por 2 ml de solução solução salina normal estéril para um volume totalde 4 ml, são administradas através de injeção intratecal acima ou abaixo dolocal de lesão em períodos de dois, cinco, oito, doze, dezessete e vinte edois meses após o início das injeções iniciais.

Em uma modalidade, o tratamento de SCI é continuado atravésda administração de células através de injeção epidural através de cateteracima ou abaixo do local da lesão, por exemplo, quinze dias após a lesão.Em uma modalidade, uma suspensão de cerca de 750.000 a 80 milhões decélulas hES e/ou seus derivados, onde as ditas células compreendem pro-genitores de célula-tronco neuronal, em um volume de 2 ml de solução solu-ção salina normal estéril e então diluídas mais em 15 ml a 40 ml de soluçãosolução salina normal estéril é injetada. Este tratamento pode ser repetidoum mês e meio depois.

Injeção espinhal profunda

De acordo com o progresso observado em reversão de sintoma,injeções de reforço adicionais da composição farmacêutica podem ser admi-nistradas compreendendo cerca de 750.000 a cerca de 80 milhões de célu-las hES e/ou seus derivados, onde as ditas células compreendem ambascélulas-tronco hematopoiéticas e células-tronco progenitoras neuronais,suspensas em um volume de 0,25 ml a 1,0 ml de solução solução salinanormal estéril. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é adminis-trada através de injeção espinhal profunda na parte traseira da espinha se-manalmente ou semana-sim-semana-não. Este tratamento vai fortalecer osmúsculos das costas e aumentar a reabilitação física uma vez o pacientetendo novamente ganho mobilidade.Injeção caudal

De acordo com a prática da presente invenção, uma composi-ção farmacêutica de cerca de 750.000 a cerca de 80 milhões de células hESe/ou seus derivados,onde as ditas células compreendem progenitores decélula-tronco neuronal, ressuspensos em 2 ml de solução solução salina ediluídos em 10 ml sozinhos ou em combinação com até 20 ml de DEPOME-DROL (acetato de metilprednisolona) são administrados através de injeçãocaudal. Este tratamento vai fortalecer os músculos da região lombar e permi-tir ganho novamente de força sensória e motora nas áreas lombar e sacral.

Em adição a transplante em progresso de células hES, a recu-peração do paciente é auxiliada pela fisioterapia diária e uma reeducaçãoem seu uso de função motora perdida e instrução em manter um estilo devida saudável que promova processos de função celular e regeneração celular.

Administração local

Em adição ao tratamento direto de SCI usando células hES e/ouseus derivados de acordo com a prática da presente invenção, úlceras deleito que surgem como um resultado de imobilização a longo prazo do paci-ente podem ser tratadas rapidamente e eficazmente através da aplicaçãotópica de uma composição farmacêutica contendo células hES e/ou seusderivados.

Tratamento de úlceras de leito pode ser conseguido através daaplicação tópica de uma composição farmacêutica contendo cerca de750.000 a cerca de 160 milhões de células hES e/ou seus derivados, ondeas ditas células compreendem células progenitoras hematopoiéticas. Dosesde carregamento ou iniciais são dadas através de injeções intravenosa eintramuscular para permitir cicatrização interna bem como promover neovas-cularização. Alternativamente, as células hES e seus derivados são ressus-pensos em 2 ml de solução solução salina, diluídos com 2 a 4 ml de soluçãosolução salina e aplicados intralesionalmente.

Infusão intravenosa

De acordo com a prática da presente invenção, uma composi-ção farmacêutica compreendendo 750.000 a 80 milhões de células hES e/ouseus derivados, onde as ditas células compreendem células-tronco hemato-poiéticas e neuronais, é ressuspensa em 100 ml de solução solução salinanormal e administrada através da via intravenosa. Este tratamento asseguraum fluxo contínuo de células tronco para o corpo e pode ser especialmenteútil se as outras vias diretas não foram acessíveis devido a qualquer razão,por exemplo, uma úlcera de leito no local, paciente muito debilitado, etc.Protocolo para tratamento de SCI Aguda

Intervenção rápida no tratamento de SCI Aguda aumenta bas-tante as chances de sobrevivência do paciente. Ainda, intervenção rápida notratamento de qualquer doença, condição ou distúrbio incurável através deprática da presente invenção aumenta as chances de recuperação. Em umamodalidade adicional da presente invenção, pacientes sofrendo de SCI Agu-da por menos do que três meses após lesão espinhal podem ser tambémtratados com sucesso conforme descrito em detalhes abaixo. Uma composi-ção farmacêutica de células hES e/ou seus derivados junto com um progra-ma de fisioterapia, reabilitação e reeducação eficaz de acordo com a práticada presente invenção é uma primeira linha de tratamento eficaz para SCIAguda.

Tratamento de SCI Aguda compreende todas as etapas usadaspara tratamento de SCI Subaguda e Crônica mais duas etapas adicionais.Durante a intervenção inicial para SCI imediatamente após a lesão aconte-cer (por exemplo, cirurgia), células hES e/ou seus derivados são administra-dos diretamente ao local da lesão. Tratamento de acompanhamento com-preende duas injeções intratecais e uma injeção epidural dentro de três me-ses da lesão.

Avaliação e observações clínicas

Para pacientes que perderam a função motora em suas pernaspor um período de tempo prolongado, enquanto sendo tratados de acordocom a presente invenção, programas para sua reeducação em andar e outraterapia física devem ser implementados conforme a função motora retornapara suas pernas. Como uma primeira etapa em tais programas, o uso deandadores e caliper provou ser eficaz na reeducação. Um programa adicio-nal de musculação dos braços e corpo superior deve ser implementado a fimde que o paciente seja capaz de apoiar o peso do seu corpo sem auxílio noandar. Os programas de reeducação podem ser reduzidos conforme o tra-tamento contínuo e a condição do paciente melhora.

Em adição à redução na necessidade de apoio de dispositivomédico e terapia física, por causa das melhoras nos sintomas simpáticos eparassimpáticos do paciente, através de tratamento de acordo com a práticada presente invenção, há uma redução na necessidade de medicações, inclu-indo medicação de flutuação de pressão sangüínea, medicação de depres-são, medicação de úlcera de leito, medicação e dispositivos médicos paracomplicações do intestino e bexiga, medicações e bombas antiespasticidade.

Em adição à redução na necessidade de medicações para o tra-tamento de sintomas diretamente ou indiretamente associados com a SCI, éobservado que diabéticos com SCI e tratados de acordo com a presente in-venção mostram uma redução na necessidade de suas medicações antidia-béticas.

Avaliação clínica da progressão na melhora dos sintomas apre-sentados pelo paciente sofrendo de SCI e tratados de acordo com a presen-te invenção é monitorada regularmente durante o curso do tratamento e a-pós remissão. Vários parâmetros fisiológicos, simpáticos, parassimpáticos,motores, autônomos e psicológicos são avaliados a fim de avaliar a eficáciada técnica na reversão dos sintomas de SCI e esses são descritos em deta-lhes abaixo.

Um exame dos registros dos médicos de consulta, incluindodescrição de sintoma, local de categorização de lesão, progressão de sinto-ma, intervenção clínica, tratamentos e história geral da lesão é feito. Combase neste exame e em um exame completo do paciente, incluindo uma I-magem de Ressonância Magnética (MRI), Eletromiografia (EMG), varredurada Velocidade de Condução do Nervo (NCV) e outro exame neurológico einvestigações incluindo um exame neurológico para avaliar a extensão dodano e obter um registro da lesão antes do tratamento, metodologias para adescrição semiquantitativa de melhora após transplante de acordo com aspráticas da presente invenção são feitas e são descritas em detalhes abaixo.

Parâmetros simpáticos e bem-estar neurológico incluindo o es-tado mental do paciente, seja deprimido ou outro, características comporta-mentais, função do nervo craniano e comportamento geral como parte deuma avaliação psicológica são registrados.

Uma avaliação de sinais e sintomas ligados ao dano neurológicono local da lesão e funcionamento do sistema nervoso autônomo é feita. Istoinclui um exame neurológico, teste da habilidade em sentir pressão profun-da, sensação de toque, sensação, equilíbrio, habilidade em sentir dor, habili-dade em sentir mudança em temperatura, movimentos involuntários, pre-sença de suores frios, tontura, pressão sangüínea, dificuldade em respirar,postura anormal enquanto deitado e habilidade em se sentar sem auxílio.

Uma avaliação de funcionamento de bexiga e intestino é feita.Isto inclui controle da bexiga, corrente da bexiga e sensação de bexiga chei-a, controle do intestino, tempo para evacuação do intestino e sensação nointestino.

Uma avaliação da função motora do corpo superior é feita a fimde avaliar a extensão de dano ao sistema nervoso central. Isto inclui movi-mento do ombro, movimento do pulso e dedo, reflexos do tendão e resistênciade movimento do membro, atrofia muscular e ação de agarrar com a mão.

Uma avaliação da função motora do corpo inferior é feita a fimde avaliar a extensão de dano ao sistema nervoso central. Isto inclui movi-mento da cintura, movimento do joelho, movimento do dedo, reflexos do ten-dão e resistência do membro, atrofia muscular e resposta plantar. Um exameneurológico detalhado é também conduzido em intervalos regulares duranteo tratamento a fim de monitorar o progresso de enervação do membro.

Para auxiliar recuperação do paciente durante o curso de visitasclínicas, técnicas de terapia física padrão são usadas a fim de tonificar o pa-ciente conforme a função motora retorna, de modo que eles podem recupe-rar o uso de seus membros e juntas e se tornar mais móveis.

Prova de regeneração neural é demonstrada através da restau-ração de função neurológica e avaliação neurológica. Exemplos para o pro-tocolo de tratamento para SCI foram providos como estudos de caso no pre-sente pedido.

Tratamento de Distúrbios Desenvolvimentais do Sistema Nervoso

Células hES e/ou seus derivados de acordo com a prática dapresente invenção são administrados em uma quantidade de cerca de750.000 a cerca de 160 milhões de células para o tratamento de distúrbiosdesenvolvimentais tal como Autismo e Retardo Mental. Em outra modalida-de, cerca de 750.000 a cerca de 80 milhões de célula são administradas a- través de vias intramuscular ou intravenosa após uma dose de teste. A via intratecal pode também ser usada. Em uma modalidade adicional, transplan-te intracraniano pode ser também usado. As células hES e/ou seus deriva-dos são predominantemente células progenitoras neuronais. Em outra mo-dalidade, células progenitoras hematopoiéticas e neuronais são administra-is das através de via intravenosa ou intramuscular. Este tratamento continuadurante um período de um ano começando com injeções diárias através devia intramuscular ou intravenosa por um período de 3 meses. Então asmesmas injeções continuam uma vez por semana pelos próximos 3-6 mesese então uma vez a cada duas semanas pelos próximos 3 meses e então uma vez por mês de acordo com as observações do médico. A injeção intra-tecal é incluída no protocolo apenas 6-8 meses após o início do tratamento eentão apenas se o paciente não estiver mostrando nenhuma resposta àsinjeções intramusculares e intravenosas. Em outra modalidade da presenteinvenção, 750.000 a 80 milhões de células hES e/ou seus derivados sãoressuspensos em 100 ml de solução solução salina normal e administradasatravés de infusão intravenosa.

EXEMPLO 1:

Um paciente diagnosticado com Autismo com tremores não-controlados, estado de hiperatividade, quaisquer habilidades sociais, ne-nhum contato no olho, movimentos de tremor (pin rolling), incapacidade emseguir instruções, nenhuma vontade de aprender, mostrou melhora após aadministração de uma composição farmacêutica compreendendo célulashES e seus derivados incluindo progenitores de célula-tronco neuronal eprogenitores de célula-tronco hematopoiética.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabe-la 2. Para esta tabela e todas as tabelas seguintes com relação a programasde injeção, o indicador de tipo de célula "neuronal" refere-se a uma popula-ção de células hES que foram parcialmente diferenciadas em um meio (porexemplo, DMEM) que promove diferenciação em células-tronco progenitorasneurais. A população de célula compreende células hES e células-troncoque são predominantemente células-tronco progenitoras neuronais. O indi-cador "não-neuronal" refere-se a uma população de célula de células hESque foram parcialmente diferenciadas em um meio (por exemplo, RPMI) quepromove diferenciação em células-tronco progenitoras outras que não célu-las-tronco progenitoras neuronais. A população de célula compreende célu-las hES e várias células-tronco que são predominantemente células-troncoprogenitoras não-neuronais.

TABELA 2

<table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44</column></row><table>Tratamento de Distúrbios do Sistema Nervoso Degenerativos

Células hES e/ou seus derivados, onde as ditas células compre-endem progenitores de célula-tronco neuronal e progenitores de célula-tronco hematopoiética de acordo com a prática da presente invenção, sãoadministrados em uma quantidade de cerca de 750.000 a cerca de 160 mi-lhões de células para o tratamento de Distúrbios do Sistema Nervoso Dege-nerativo incluindo, mas não limitado a, Degeneração Cortico-Basal, AtrofiaOlivo Ponto Cerebelar, Mal de Alzheimer, Doença de Parkinson, EscleroseMúltipla, Demência, Atrofia do Nervo Auditivo e Doença do Neurônio Motor.

Em outra modalidade, cerca de 750.000 a cerca de 80 milhões de célulassão administradas.

Embora protocolos de administração possam ser variados parase adequar ao paciente em particular, um protocolo típico para o tratamentode distúrbios do sistema nervoso degenerativo em crianças compreende in-jeções intramusculares e intravenosas diárias no primeiro mês, injeções trêsvezes por semana durante 2-4 meses, injeções semanalmente nos meses 5e 6 e reforços semanais nos meses 9-12. Para adultos, um protocolo típicoenvolve injeções intramusculares e intravenosas diárias junto com adminis-tração através de cateter epidural, punção lombar, via intratecal ou caudal.

Isto é seguido por duas infusões intravenosas com um espaço mínimo depelo menos 7 dias. Finalmente, injeções de reforço são administradas umavez por mês por 6 meses e então uma vez a cada 2 meses por pelo menos 6meses. Tratamento pode ser continuado por períodos mais longos e podeainda durar toda a vida como as doenças são progressivas.

No caso de distúrbios progressivos e degenerativos, obstruçãoou estabilização da progressão da doença através de intervenção rápida deacordo com a prática da presente invenção permite uma autodependênciaaumentada do paciente. É apenas após o efeito de estabilização que algu-mas melhoras podem ser vistas.

EXEMPLO 2:

Um paciente sofrendo de uma história de dois anos de esclerosemúltipla progressiva repetitiva tomando SOLUMEDROL (metilprednisolona)diariamente era incapaz de andar, não tinha nenhum controle da bexiga ouintestino e sofria freqüentemente de distúrbios respiratórios.

Continuando o tratamento de acordo com a presente invenção,a condição do indivíduo melhorou, o paciente era capaz de andar e houveuma restauração do controle da bexiga e intestino e o uso de SOLUME-DROL foi reduzido. O MRI mostrou uma melhora de 50%.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabela 3.

TABELA 3

<table>table see original document page 46</column></row><table><table>table see original document page 47</column></row><table><table>table see original document page 48</column></row><table><table>table see original document page 49</column></row><table>

EXEMPLO 3:

Um homem de 60 anos de idade apresentou ALS (doença doneurônio motor) dois anos atrás com deterioração rápida nos braços e mãos.Havia tremores e fasciculações contínuos em seus braços, mãos e língua.

Ele não podia supinar e pronar braço esquerdo, ou levantá-lo acima de suacabeça. Seu braço direito podia ser levantado com um puxão e ele tinhamãos esqueletais.

1 ano e meio após tratamento, suas mãos se recuperaram daestrutura esqueletal com regeneração de músculos hipotenar e tenar de am-bas mãos. Supinação e pronação são possíveis com ambos braços. Elesentia a mesma dificuldade em engolir, que não piorou deste então. Não hánenhuma deterioração com suas pernas, respiração e fala.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabe-la 4.

TABELA 4:

<table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table><table>table see original document page 51</column></row><table><table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 0</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page 58</column></row><table>

EXEMPLO 4:

O paciente foi diagnosticado sofrer de doença de Parkinson.O paciente não respondeu ao tratamento padrão e sua condição piorou con-forme o tempo passava. Ele tinha uma marcha arrastada típica. Tremoresunilaterais estavam presentes no braço direito e ele era psicologicamente mui-to deprimido. Ele não podia abrir os olhos. Desde que o tratamento começou,o paciente tem mostrado melhora gradualmente e após um ano de tratamentocom células hES o paciente melhorou bastante. A marcha é normal, os tremo-res na mão são mínimos e psicologicamente ele está otimista. Ele abre osolhos completamente. Ele pode assinar e escrever agora, o que era impossí-vel no início no tratamento. Ele é menos dependente dos outros agora.

O programa de injeções para este paciente é mostrado η Tabela 5.

TABELA 5 _

<table>table see original document page 59</column></row><table><table>table see original document page 60</column></row><table><table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table><table>table see original document page 64</column></row><table><table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table>O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabela 6.

TABELA 6

<table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table>

EXEMPLO 6:

Uma garotinha de 3 anos de idade foi levada para a clínica comPC e parecia e se comportava como um bebê de um mês sem nenhum con-trole do pescoço, choro fraco, nenhuma resposta e incapacidade de sugar amamadeira. Ela era absolutamente mole.

Após um ano e meio de tratamento ela tinha crescido e pareciauma criança de 2 anos. Ela tinha controle do pescoço, reconhece seus pais,engatinha na cama, come comida normal, sorri em reconhecimento e sentacom apoio, e deu alguns passos com sua mãe a segurando. Sua marcha émarcha em tesoura e ela também começou a chamar seus pais.

O programa de injeções para esta paciente é mostrado na Tabela 7.TABELA 7

<table>table see original document page 71</column></row><table><table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table><table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table>

EXEMPLO 8:

Uma criança de oito anos de idade foi diagnosticada com parali-sia cerebral e com retardo mental severo e era incapaz de andar sozinha.Ela não podia identificar objetos e tinha um alcance de atenção muito baixo.Havia muita baba e ela mantinha a boca aberta.

Seguindo tratamento, ela não está babando, seu alcance deatenção melhorou e ela parece mais alerta. Ela está andando com apoio mí-nimo.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabe-la 8.

TABELA 8

<table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table><table>table see original document page 79</column></row><table><table>table see original document page 80</column></row><table>

Tratamento de Trauma do Sistema Nervoso

Células hES e/ou seus derivados, onde as ditas células compre-endem progenitores de célula-tronco neuronal e progenitores de célula-tronco hematopoiética de acordo com a prática da presente invenção, sãoadministrados em uma quantidade de cerca de 750.000 a cerca de 160 mi-lhões de células para o tratamento de Trauma do Sistema Nervoso, incluin-do, mas não limitado a, Dano Cerebral, Coma e Estado Vegetativo. Em outramodalidade, cerca de 750.000 a cerca de 80 milhões de células são adminis-tradas.

Embora protocolos de administração possam ser variados parase adequar ao paciente particular, um protocolo típico para o tratamento detrauma do sistema nervoso compreende injeções intramusculares e intrave-nosas diárias pelos dois primeiros meses junto com injeções intratecais eepidurais.

Tratamento de Acidente vascular cerebral ou Derrame

Células hES e/ou seus derivados, onde as ditas células compre-endem progenitores de célula-tronco neuronal e progenitores de célula-tronco hematopoiética de acordo com a prática da presente invenção, sãoadministrados em uma quantidade de cerca de 750.000 a cerca de 160 mi-Ihões de células para tratamento de acidente vascular cerebral ou derrame.

Em outra modalidade, cerca de 750.000 a cerca de 80 milhões de célulassão administradas.

Embora protocolos de administração possam ser variados parase adequar ao paciente particular, um protocolo típico para o tratamento deacidente vascular cerebral compreende injeções intramusculares e intrave-nosas diárias por duas semanas e infusão intravenosa por 3 dias em segui-da durante o primeiro mês, infusão intravenosa por 2 dias a cada 15 diasdurante os meses 2 e 3, infusão intravenosa por 2 dias e uma injeção intra-tecal durante o mês 5, e infusão intravenosa por 4 dias seguido por injeçãointramuscular por 4 dias durante os meses 8, 10 e 12.

EXEMPLO 9:

Um paciente diagnosticado com Acidente vascular cerebral ouDerrame sofria de hemiparese lateral direita com baba, dificuldade em engo-li Iir e incapacidade de falar ou andar. Ainda, o paciente tinha câncer do colo.Após o tratamento de acordo com a presente invenção, o paciente mostrousinais de melhora uma vez que a fala e atividades motoras melhoraram, aespinha ficou reta e hemiparese foi curada.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabela 9.

TABELA 9

<table>table see original document page 81</column></row><table><table>table see original document page 82</column></row><table><table>table see original document page 83</column></row><table>

EXEMPLO 9:

Um homem de 82 anos de idade sofreu um derrame cerebral há 5anos atrás e apresentava hemiparesia lateral direita, com assimetria faciale fala não-compreensível. Ele andava com uma bengala e uma grande co-xeadura e não era capaz de comer com sua mão direita devido à dificuldade:em coordenação. Ele não podia se sentar ou levantar sozinho e arrastava os!pés ao andar. Havia baba de saliva e ele não podia também engolir bem.

Dois meses após tratamento ele era capaz de andar sem apoio,ise senta e levanta sozinho, come com sua mão direita, não tem fala não-;compreensível e nenhuma assimetria facial. Ele é capaz de se levantar de|uma cadeira. Ele está dobrando o joelho afetado ao andar enquanto man-jtendo equilíbrio.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabela 10.

TABELA 10

<table>table see original document page 83</column></row><table><table>table see original document page 84</column></row><table><table>table see original document page 85</column></row><table>

Tratamento de Distúrbios do Sistema Nervoso Familiar

Células hES e/ou seus derivados, onde as ditas células compre-endem progenitores de célula-tronco neuronal e progenitores de célula-tronco hematopoiética de acordo com a prática da presente invenção, sãoadministrados em uma quantidade de cerca de 750.000 a cerca de 160 mi-lhões de células a indivíduos para o tratamento de Distúrbios do SistemaNervoso Familiar, incluindo, mas não limitado a, Atrofia Olivo Ponto Cerebrale Coréia de Huntington. Em outra modalidade, cerca de 750.00 a cerca de80 milhões de células são administradas. As vias de administração são in-tramuscular e intravenosa junto com infusão intratecal, de cateter epidural eintravenosa. Isto poderia continuar provavelmente por toda a vida da pessoamas o primeiro ano seria um programa intensivo como segue - injeções in-tramuscular e intravenosa diárias por pelo menos três meses tempo duranteo qual infusão intratecal, de cateter epidural e intravenosa é também admi-nistrada. O mesmo conjunto de injeções é administrado após um intervalo deum mês e meio durante um período de 21 dias. As injeções intramuscular eintravenosa são continuadas e então reduzidas para três vezes por semana,duas vezes por semana, uma vez por semana, uma vez a cada duas sema-nas e então mensalmente dependendo da condição dos pacientes. A injeçãointratecal pode ser repetida em um intervalo de 4-6 meses como pode o ca-teter epidural. Infusões intravenosas podem ser dadas a cada duas sema-nas, a camada mês ou a cada dois meses.

EXEMPLO 10:

Um paciente diagnosticado com Ataxia Espino Cerebelar Espo-rádica com incapacidade em se virar na cama, andar ou mudar sua posiçãoenquanto sentado, tinha dificuldade em falar, tinha tremores e incapacidadeem levantar o pescoço.

Após o tratamento com célula-tronco de acordo com a prática dapresente invenção, melhoras em todos os sintomas foram notadas e o paci-ente era capaz de se equilibrar e andar alguns passos. A fala se tornou coe-rentè.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na TabeIa 11

TABELA 11

<table>table see original document page 83</column></row><table><table>table see original document page 87</column></row><table><table>table see original document page 88</column></row><table>

EXEMPLO 11:

Uma paciente com Atrofia Olivo Ponto Cerebral familiar foi diag-nosticado na John Hopkins University. Seu pai, irmã gêmea e irmão eramafligidos pela mesma doença. Ela podia apenas falar em expiração, era pre-sa a uma cadeira de rodas com contínuo gotejamento de urina e tinha quefazer evacuação manual de fezes. Ela tinha tremores por todo o corpo e nãopodia se equilibrar sozinha mesmo enquanto sentada. Haveria hipotensãopostural severa.

Após 2 anos de tratamento a paciente vai ao banheiro para suasfunções corporais, fala bem, não tem tremores e é capaz de andar com a-poio. Não tem havido nenhuma deterioração desde então embora sua irmãgêmea esteja acamada com a mesma doença. Não há nenhuma hipotensãopostural e ela definitivamente não deteriorou.Tratamento de Distúrbios de Pele

Células hES e/ou seus derivados, onde as ditas células compre-endem progenitores de célula-tronco hematopoiética de acordo com a práti-ca da presente invenção, são administrados através de injeção subcutâneaou intravenosa ou através de aplicação local ou tópica em uma quantidadede cerca de 750.000 a cerca de 160 milhões de células para o tratamento deDistúrbios de pele, incluindo, mas não limitado a, Úlceras de não-cicatrização, Psoríase, Úlceras de pressão e Sarcoidose. No caso de distúr-bios de pele, células hES podem também ser usadas topicamente para trataro distúrbio ou dano à pele. Em outra modalidade, cerca de 750.000 a cercade 80 milhões de células são administradas.

Em uma modalidade, as células hES ou células de pele diferen-ciadas e extrato embrionário podem ser misturados com um carreador bio-compatível, tal como um gel, unguento ou pasta, e aplicados à pele ou tecidomucosal danificado para acelerar cicatrização bem como cicatrizar feridasresistentes à cicatrização, tal como úlceras diabéticas ou decubitosas. Alter-nativamente, as células podem ser providas em uma suspensão ou emulsão.Em uma modalidade, o carreador também contém agentes antimicrobianos,analgésicos ou outros agentes farmacêuticos.

Alternativamente, em uma modalidade diferente, células hESsão cultivadas em um substrato poroso artificial estéril tal como musselina eaplicadas diretamente à ferida. Após 12-24 horas a musselina é removida e

ι as células-tronco continuam a crescer, cicatrizando a ferida. Aplicada intrale-;

l sionalmente, as células hES diferenciam e eventualmente substituem as cé-

25 lulas danificadas.EXEMPLO 12:

Uma idosa de 70 anos de idade sofreu uma lesão de queimadu-ra em seu tornozelo esquerdo que não cicatrizou apesar de terapia conven-cional. Após aplicação de células hES no local da queimadura, sua ferida30 começou a cicatrizar e três anos mais tarde a pele está absolutamente óti-ma.Tratamento de Distúrbios Auto-imunes

Células hEs e/ou seus derivados, onde as ditas células compre-endem progenitores de célula-tronco hematopoiética de acordo com a práti-ca da presente invenção, são administrados através de injeção intramuscu-lar, injeção intravenosa, injeção subcutânea, injeção intra-articular ou infusãointravenosa ou suas combinações em uma quantidade de cerca de 750.000a cerca de 160 milhões de células para o tratamento de Distúrbios Auto-imunes incluindo, mas não limitado a, Lúpus Eritematoso Sistêmico, Espon-dilite Anquilosante, Cardiomiopatia, Sarcoidose, Artrite e Colite Ulcerativa.

Em outra modalidade, cerca de 750.000 a cerca de 80 milhões de célulassão administradas. A administração das células hES é altamente eficaz nãoapenas no tratamento de distúrbios auto-imunes mas também na restaura-ção de um sistema imune suprimido. Como uma alternativa para tratamentocom imunossupressores ou como um método para "preparar" pacientes paratransplante de órgão ou outra intervenção médica, células hES e seus deri-vados podem ser usados para permitir aceitação do órgão através da redu-ção nos processos de rejeição hospedeiro-enxerto.

Embora protocolos de administração possam ser variados parase adequar ao paciente particular, um protocolo típico para o tratamento dedistúrbios autoimunes compreende injeções diárias pelos primeiros 2 meses,alternar injeções diárias junto com infusão intravenosa durante o mês 3, inje-ções semanais junto com uma infusão intravenosa contínua de 2 dias a cada15 dias durante os meses 5-7 e 10-12, e injeções de reforço a cada 3 mesespor um ano e então a cada 6 meses por um ano.

EXEMPLO 13:

Uma paciente sofrendo de psoríase nos últimos 26 anos estavapresa a uma cadeira de rodas com hipertensão, diabetes mellitus e artritepsoriática com úlceras grandes na perna que eram não-cicatrizantes e nãocondescendentes a enxerto de pele.

Após receber terapia por 6 meses ela não tinha quaisquer úlce-ras e nenhuma artrite. O diabetes e a hipertensão dela estavam sob contro-le. Ela começou a andar sozinha e começou todas as atividades e está re-cebendo reforço durante o 1 ano que passou. Ela diz que ela andou pelaprimeira vez nos últimos 26 anos e é capaz de fazer todas suas tarefas do-mésticas sozinha.

Tratamento com célula-tronco foi feito localmente às úlceras eas úlceras cicatrizaram. Também após o tratamento quaisquer úlceras adi-cionais foram detectadas. A escamosidade e coceira da pele e o inchaço daspernas foram também reduzidos. A condição diabética foi curada com pres-são sangüínea controlada que levou a uma redução na medicação.

O programa de injeções para esta paciente é mostrado na TabeIa 12.

TABELA 12

<table>table see original document page 91</column></row><table><table>table see original document page 92</column></row><table>

Tratamento de Distúrbios Sangüíneos

Ainda outra modalidade do método de acordo com a prática dapresente invenção está no tratamento de Distúrbios Sangüíneos tal comoTrombocitopenia, Talassemia, Leucemia Mielóide Aguda através de injeçãointravenosa de células hES e/ou seus derivados, onde as ditas células com-preendem células progenitoras de célula-tronco hematopoiética. Células sãoadministradas por 10 dias a 14 dias e então repetidas como uma injeção se-manalmente para condições benignas. Para condições malignas, as injeçõessão dadas diariamente por 40 dias e então repetidas se houver um relapso.

Tratamento de Distúrbios Genéticos

Outra modalidade de métodos de transplante de célula hES deacordo com a prática da presente invenção está no tratamento de DistúrbiosGenéticos incluindo, mas não limitado a, Síndrome de Down, Ataxia de Frie-dereich, Coréia de Huntington, Síndrome de Asperger e Atrofia Espinomus-cular.

Os sintomas de distúrbios genéticos são manifestados por retar-do mental, disfunção músculo-esqueletal e falência de órgão em combinaçãoou sozinho e resultam em debilitação incurável séria e expectativa de vidareduzida. No caso de pacientes sofrendo de um distúrbio genético, célulashES são administradas ao paciente de acordo com a prática da presenteinvenção e, uma vez administradas, diferenciam para prover o paciente comuma população de células expressando o produto de gene em falta ou com-prometido com uma restauração seguinte de homeostase intracelular.

Embora protocolos de administração possam ser variados parase adequarem ao paciente particular, um protocolo típico para o tratamentode Distúrbios Genéticos compreende injeções intramuscular e intravenosadiárias pelo primeiro mês, injeções em dia alternado durante o mês 2, inje-ções duas vezes por semana durante o mês 3, injeções uma vez por sema-na durante os meses 5, 7, 9, 11 e 12 e injeções de reforço a cada 3 mesespor um ano. Também infusões intravenosas são dadas a cada 15 dias.

EXEMPLO 14:

Uma paciente com síndrome de Down não mostrou nenhumaresposta a comandos verbais, não era capaz de subir e descer escadas etinha baixo peso corporal como um resultado de dificuldades para comer.

A paciente era incapaz de comer, mostrava uma base larga típica e sofria detosses e resfriados freqüentes. Os olhos eram mongolóides.

Continuando o tratamento de acordo com a presente invenção,a paciente é capaz de compreender e realizar comandos verbais, começou afalar e começou a subir e descer escadas. Testes de DQ mostrou a idademental estar 1 ano atrás da sua idade cronológica contra 2 anos e 6 mesesatrás dentro de um espaço de menos de um ano. Socialmente, ela vai à es-colha e brinca com outras crianças. Ela também se alimenta sozinha.

O programa de injeções para esta paciente é mostrado na Tabela 13.TABELA 13

<table>table see original document page 94</column></row><table><table>table see original document page 95</column></row><table><table>table see original document page 96</column></row><table>

EXEMPLO 15:

Uma menina de 3 anos de idade foi diagnosticada com síndro-me de Down. Ela não era capaz de falar, compreender ou subir e descerescadas. Ela não comia sozinha e sua fala limitada a uma palavra não eramuito clara.

Após 8 meses de tratamento ela compreende tudo, fala senten-ças de três palavras e reconhece cores, formatos e tamanhos. Ela é capazde subir e descer escadas sozinha e começou a comer sozinha.

O programa de injeções para esta paciente é mostrado na Tabela 14.

TABELA 14

<table>table see original document page 97</column></row><table><table>table see original document page 98</column></row><table><table>table see original document page 99</column></row><table><table>table see original document page 100</column></row><table><table>table see original document page 101</column></row><table>

EXEMPLO 16:

Um menino de 13 anos de idade sofria de um defeito genético:com falta de concentração, explosões freqüentes e prejuízo à visão. Ele ti-nha visão túnel total. Ele tinha dificuldade em sentar em classe e ver o qua-.dro negro mesmo que ele estivesse sentado na primeira fileira. Ele tinhamarcos atrasados e se ele lesse alguma coisa ele teria que ler três vezespara se lembrar do que tinha lido. Ele também tinha dificuldades em localizaritens em uma sala.

Desde que começou com as células hES sua visão melhorou eele senta duas fileiras atrás na sala de aula e pode ver o quadro negro muitomelhor. Ele é capaz de lembrar muito mais e seu tempo de resposta a co-mandos verbais melhorou. Ele não tem explosões tanto quanto antes e suamedicação foi reduzida. Relatórios do oftalmologista mostram que as áreasmortas na periferia foram restauradas.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabela 15.

TABELA 15

<table>table see original document page 101</column></row><table><table>table see original document page 102</column></row><table><table>table see original document page 103</column></row><table><table>table see original document page 104</column></row><table><table>table see original document page 101</column></row><table>

EXEMPLO 17:

O paciente é um homem de 32 anos sofrendo de ataxia de Fre-drick e cuja irmã morreu da doença. Ele não podia ficar de pé, tinha fala fra-ca, dificuldade em engolir, era preso a uma cadeira de rodas e precisava deassistência para ir ao banheiro. Ele foi anteriormente tratado na Alemanha eEstados Unidos sem quaisquer resultados. Seu coração estava dilatando efuncionamento a 15 a 20%.

Desde o início com as células hES ele apresentou melhora. Ele écapaz de falar muito mais claro e não tem quaisquer dificuldades em engolir.Seu coração melhorou com todas as dimensões retornando ao normal e ca-pacidade de funcionamento até 58 a 60%. Não houve nenhuma deterioração.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabe-la 16.

TABELA 16

<table>table see original document page 106</column></row><table><table>table see original document page 107</column></row><table><table>table see original document page 108</column></row><table><table>table see original document page 109</column></row><table><table>table see original document page 110</column></row><table>

Tratamento de Distúrbios do Olho

Outro uso de transplante de célula hES de acordo com a práticada presente invenção é no tratamento de Distúrbios do olho incluindo, masnão limitado a, Atrofia do Nervo Óptico, Degeneração Macular, Dano ao O-lho, Rejeição de Enxerto Corneano e Retinite Pigmentosa através da injeçãodireta de progenitores neuronais e células hES de acordo com a prática dapresente invenção à porção retrobulbar do olho, área superficial do olho e acâmara interna do olho.

Embora protocolos de administração possam ser variados para·se adequarem ao paciente particular, um protocolo típico para o tratamentode Distúrbios do Olho compreende 10 dias de injeções intramuscular e intra-venosa seguido por uma injeção retrobulbar ou intravítrea, 15 dias de inje-ções intramusculares e intravenosas seguido por uma injeção retrobulbar, 2infusões intravenosas e uma injeção retrobulbar após 2 meses. Um total de4 injeções retrobulbares é dado durante um período de 8 meses a um anoantes dos resultados serem vistos mas em alguns casos os resultados sãoj, vistos mais cedo. Vias intravítreas podem ser usadas. Também a córneapode ser reparada através do uso de lentes de contato nas quais as células-tronco foram cultivadas. Também gotas para o olho compreendendo as célu-las-tronco podem ser usadas.

EXEMPLO 18:

Um paciente diagnosticado com Atrofia do Nervo Óptico tinhacondições que incluíam dificuldade em ler letras pequenas e não ser capazde ver objetos postos distantes. Também as cores azul escuro e violeta nãoeram visíveis. Visão era zero com percepção de luz e agora é 6/24.

Continuando a terapia de célula-tronco de acordo com a presen-te invenção, isto é, células hES e seus derivados incluindo progenitores decélula-tronco neuronal administrados através de injeção retrobulbar e célulashES e seus derivados incluindo progenitores de célula-tronco neuronal eprogenitores de célula-tronco hematopoiética de acordo com a prática da presente invenção são administrados através de injeção intravenosa local ouinjeção subcutânea ou injeção intramuscular, injeção intravítrea ou aplicaçãotópica em uma quantidade de cerca de 750.000 a cerca de 160 milhões decélulas, o paciente mostrou melhoras significantes. Ele é capaz de ler time epode ver quadros de avisos bem como assistir televisão a uma distância.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabe-la 17.TABELA 17

<table>table see original document page 112</column></row><table>

Tratamento de Distúrbios de Fígado e Rim

Ainda outro uso de transplante de hES de acordo com a práticada presente invenção é no tratamento de Distúrbios de Fígado e Distúrbiosde Rim incluindo, mas não limitado a, Nefrose Renal de Estágio Terminal eSíndrome Nefrótica, através de transplante de acordo com a prática da pre-sente invenção. As vias de administração são intravenosa, intramuscular eatravés de infusão intravenosa.

EXEMPLO 19:

Um paciente diagnosticado com síndrome nefrótica exibia níveisde uréia, creatina e proteína P elevados. A diferenciação corticomedular nãofoi mantida e o corpo estava inchado. Células hES e seus derivados incluin-do progenitores de célula-tronco hematopoiética, progenitores de célula-tronco de produção de albumina e progenitores de célula-tronco de produçãode bilirrubina de acordo com a prática da presente invenção foram adminis-trados através de injeção intravenosa ou injeção subcutânea ou injeção in-tramuscular ou infusão intravenosa em uma quantidade de cerca de 750.000a cerca de 160 milhões de células. Após o tratamento com células-tronco, ocorpo estava menos inchado e a diferenciação corticomedular foi restaurada.

Os níveis de uréia, creatina e proteína P também normalizaram.O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabe-la 18.

TABELA 18

<table>table see original document page 113</column></row><table>

Tratamento de Distúrbios Músculo-esqueletais

Outro uso de transplante de célula hES de acordo com a práticada presente invenção é no tratamento de Distúrbios Músculo-esqueletaisincluindo, mas não limitado a, Artrite, Distrofia Muscular de Duchenne, Dis-trofia Muscular da Cintura, Atrofia Muscular Espinhal e Atrofia Muscular deBecker.

Embora protocolos de administração possam ser variados parase adequarem ao paciente particular, um protocolo típico para o tratamentode Distúrbios Músculo Esqueletais compreende injeções intramusculares ouintravenosas diárias durante o primeiro mês, injeções duas vezes por sema-na durante os meses 3, 5, 6 e 7, injeções semanais durante os meses 9-12 einjeções de reforço a cada 3 meses. Infusões intravenosas são dadas a cada10 a 15 dias e injeções musculares espinhais profundas são dadas a cada15 a 30 dias.

EXEMPLO 20:

A história do caso de um paciente diagnosticado com DistrofiaMuscular de Duchenne mostrou sintomas tal como falta de interesse, coxase face inchadas e sinal de Gower positivo, com níveis altos de creatina fos-focinase (CPK) em 10.000 unidades.

Após o tratamento do paciente com células hES e seus deriva-dos incluindo progenitores de célula-tronco neuronal e progenitores de célu-la-tronco hematopoiética sozinhos ou em combinação através de injeçãointravenosa ou injeção subcutânea ou injeção intramuscular ou infusão porcateter intravenosa ou infusão por cateter epidural ou infusão por cateter debloqueio subaraquinóide por um período predeterminado, os níveis de CPKcaíram drasticamente para 1198 unidades e sinal de Gower era negativo.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabela 19.

TABELA 19

<table>table see original document page 114</column></row><table><table>table see original document page 115</column></row><table><table>table see original document page 116</column></row><table><table>table see original document page 117</column></row><table><table>table see original document page 118</column></row><table><table>table see original document page 119</column></row><table>

EXEMPLO 21:

Um menino de 14 anos de idade diagnosticado com um caso deDMD estava acamado sem nenhuma força nas mãos e pernas e com atrofiamuscular. Ele também tinha escoliose.

Após 8 meses de terapia ele tinha desenvolvido músculo no bí-ceps, tríceps e braqui-radiais e é capaz de levantar seus braços até o níveldo cotovelo. Ele ganhou peso e está crescendo sem qualquer escoliose es-pinhal associada. Seus níveis de CPK1 que indicam a taxa de colapso mus-cular, foram reduzidos.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabela 20.

TABELA 20

<table>table see original document page 119</column></row><table><table>table see original document page 120</column></row><table><table>table see original document page 121</column></row><table><table>table see original document page 122</column></row><table><table>table see original document page 123</column></row><table><table>table see original document page 124</column></row><table><table>table see original document page 125</column></row><table><table>table see original document page 126</column></row><table><table>table see original document page 127</column></row><table><table>table see original document page 128</column></row><table><table>table see original document page 129</column></row><table>

EXEMPLO 22:

Um menino de 8 anos de idade preso a uma cadeira de rodasdevido à DMD não era capaz de andar ou ficar de pé. Após 6 meses de tra-tamento seu nível de CPK tinha reduzido. Ele não deteriorou e é capaz demover seus braços. Ele começou a andar com apoio mínimo.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabe-la 21.

TABELA 21

<table>table see original document page 130</column></row><table><table>table see original document page 131</column></row><table><table>table see original document page 132</column></row><table><table>table see original document page 133</column></row><table><table>table see original document page 134</column></row><table>

EXEMPLO 23:

Um menino de 10 anos de idade diagnosticado com DMD queera capaz de dar alguns passos com apoio foi levado para terapia. Ele nãoera capaz de se virar sozinho na cama ou sentar sozinho. Ele podia levantaros braços até 30s até o nível do cotovelo. Seguindo alguns meses de trata-mento, seu nível de CPK começou a cair e ele é capaz de se virar sozinho epode levantar uma caneca de água acima de sua cabeça para o banho. Elenão perdeu peso.

O programa de injeção para este paciente é mostrado na Tabela 22.

TABELA 22

<table>table see original document page 134</column></row><table><table>table see original document page 135</column></row><table><table>table see original document page 136</column></row><table><table>table see original document page 137</column></row><table><table>table see original document page 138</column></row><table><table>table see original document page 139</column></row><table>

Tratamento de Doenças e Distúrbios Cardíacos

Outro uso de transplante de células hES de acordo com a práti-ca da presente invenção é no tratamento de Doenças e Distúrbios Cardíacosincluindo, mas não limitado a, Cardiomiopatia Restritiva, Falência Cardíaca,Bradicardia Sinusal e Doença da Artéria Coronária. Alguma porção das célu-las diferenciadas é incorporada ao tecido cardíaco do paciente, reproduzindoe reparando músculo danificado.

Embora protocolos de administração possam ser variados para seadequarem ao paciente particular, um protocolo típico para o tratamento deDoenças e Distúrbios Cardíacos compreende injeções intramusculares e intra-venosas dia-sim-dia-não por duas semanas e então a cada 3 dias pelas próxi-mas duas semanas, e injeções intramusculares uma vez por mês junto cominfusões intravenosas durante os meses 3, 6, 10 e 12. Injeções intracardíacasem torno da área danificada podem ser dadas durante cirurgia de bypass.

EXEMPLO 23:

Um paciente diagnosticado com Síndrome da Corda Sinusalcom Bradicardia Sinusal foi aconselhado a ter um marca-passo implantado.

O paciente foi tratado de acordo com a prática da presente invenção onde ascélulas hES e seus derivados incluindo progenitores de célula-tronco hema-topoiética através de injeção intravenosa ou injeção subcutânea ou injeçãointramuscular ou injeção intracardíaca ou durante angiografia foram adminis-trados em uma quantidade de cerca de 750.000 a cerca de 160 milhões decélulas. O paciente mostrou sinais de melhora após sofrer o tratamento comcélulas hES e a necessidade de um marca-passo foi eliminada.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabela 22.

TABELA 22

<table>table see original document page 140</column></row><table><table>table see original document page 141</column></row><table>

Tratamento de Células Cancerosas e Tecidos Oncogênicos

Alternativamente, células hES podem ser administradas de a-cordo com a prática da presente invenção para suplementar tratamento dequimioterapia convencional de pacientes com câncer. Em quimioterapia con-vencional, agentes citotóxicos são administrados para destruir células cance-rosas. No entanto, agentes citotóxicos não distinguem entre células normaise células cancerosas, e podem destruir as células não-cancerosas do paci-ente, incluindo as células do sistema imune do paciente. Como uma conse-qüência, enquanto sofrendo quimioterapia, e por algum período depois daquimioterapia parar, pacientes com câncer são suscetíveis à infecção devidoao seu sistema imune comprometido. Através da administração de células-tronco hematopoiéticas, células-tronco neuronais e células hES a pacientessofrendo quimioterapia alguma porção das células injetadas vai diferenciarem um novo sistema imune, substituindo células sangüíneas brancas, célu-Las sangüíneas vermelhas, plaquetas e outras células destruídas pela quimi-oterapia. Também, regeneração de medula óssea aplástica como um resul-tado de radioterapia e quimioterapia, através da regulagem da mecânica demitose, e restauração de cursos de comunicação celular normais reforçam osistema imune e param mitose desregulada adicional. As células hES e/ou seus derivados podem ser administrados através de injeção intravenosa ouintramuscular ou administração direta no tumor. Essas células também agemsobre curso hedgehog e o controlam de modo a permitir a parada da multi-plicação excessiva.EXEMPLO 24:

Um paciente informado com adenocarcinoma de grau Ill sofreutratamento de quimioterapia e cirurgia sem sucesso. Por causa do início demetástases hepáticas múltiplas com aparecimento nodular e nós celíacos eretropancreáticos, o paciente precisou de cuidado de apoio.

Células hES e seus derivados de acordo com a prática da pre-sente invenção foram administrados em uma quantidade de cerca de750.000 a cerca de 160 milhões de células ao paciente que resultou em me-lhoras notáveis incluindo restauração de um fígado uniformemente hetero-gêneo que era anteriormente nodular e uma área ecogênica aumentada nosnós linfáticos.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabela 23.

TABELA 23

<table>table see original document page 142</column></row><table><table>table see original document page 143</column></row><table><table>table see original document page 144</column></row><table>

Tratamento de Úlceras Aftosas/Líquen Plano

Ainda outro uso de células hES e/ou seus derivados está no tra-tamento de qualquer úlcera nas áreas mucosais do corpo, tal como uma úl-cera aftosa da boca. As células são administradas intravenosa, intramuscu-lar e localmente. Injeções diárias são dadas intramuscularmente ou intrave-nosamente pelos primeiros 4 meses e infusão intravenosa a cada 15-30 di-as. Aplicação local diretamente ou através de mistura com um gel é tambémfeita.

EXEMPLO 25:

Uma senhora de 65 anos de idade foi com a língua cheia de te-cido necrótico e úlceras aftosas que eram dolorosas. Ela tinha dificuldadeem comer e engolir e falar. Uma vez recebendo as células hES ela está me-lhor; achando mais fácil engolir e falar e abrindo a boca melhor. Ela tambémmostra recuperação com as úlceras e tecido necrótico.

Tratamento de Osteoartrite, Artrite, Juntas Anquilosantes

Ainda outro uso de células hES e/ou seus derivados é no trata-mento de Osteoartrite, Artrite e Juntas Anquilosantes. Injeções intramuscula-res diárias são dadas para preparação χ 10 dias. Injeção intra-articular de750.000 a 80 milhões de células hES misturadas com salumendrol é dada erepetida 1 Vz a 3 meses depois.

Tratamento de Lesão do Plexo Braquial

Ainda outro uso das células hES e/ou seus derivados é no tra-tamento de Lesões ao Plexo Braquial onde o braço afetado é paralisado. Ascélulas são administradas intramuscularmente, intravenosamente e no plexobraquial e repetidas a cada 1 Vz mês por um ano ou até o braço estar me-lhor. Infusões intravenosas são também usadas.

EXEMPLO 26:

O paciente é um homem de 26 anos de idade que sofreu umaLesão do Plexo Braquial mão (esq.) e perdeu a função dela nos últimos 7-8anos. Com tratamento com células-tronco sua mão esquerda melhorou mui-to com mais força motora até o cotovelo e pulsos. Ele é capaz de mover seupulso e a mão não é tão flácida quanto antes. Ele é também capaz de moverseu braço para cima.

Tratamento de Distúrbios Reprodutivos

Outro uso de transplante de célula hES de acordo com práticada presente invenção é o tratamento de Distúrbios Reprodutivos, através darestauração da fertilidade de pacientes sofrendo de atrofia testicular, falênciaovariana e azoospermia.

EXEMPLO 27:

Tratamento de um paciente azooespermático com células hEs eseus derivados incluindo progenitores de célula-tronco hematopoiética atra-vés de injeção intramuscular de acordo com a prática da presente invençãoresultou na produção de espermatozóides. Também, injeções intravenosas eintramusculares foram usadas bem como injeções diretas nos testículos etambém injeção subcutânea próximo ao epidídimo foram usadas.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabe-la 24.TABELA 24

<table>table see original document page 146</column></row><table>

Regeneração de Tecido

Células hES podem ser administradas de acordo com a práticada presente invenção para a indução de regeneração de tecido, incluindo,mas não limitado a, regeneração de músculo, o tratamento de cirrose hepá-tica, e na formação de vasos sangüíneos (neovascularização) que é eficazno tratamento de doenças degenerativas e no tratamento de úlceras não-cicatrizantes.Tratamento de Diabetes

Outra modalidade para a invenção é o uso de células hES e/ouseus derivados, onde as ditas células compreendem células progenitoras deprodução de insulina, no tratamento de Diabetes. Pacientes diabéticos estão4 vezes sob mais risco de sofrer um ataque cardíaco ou derrame e tambémtêm um risco aumentado de degeneração e falência múltipla de órgão, inclu-indo os rins, olhos, sistema nervoso e imunidade geral. Ao tratar diabetesatravés do transplante de células hES produtoras de insulina, e restauraçãode produção de insulina no corpo, há uma redução na necessidade de insu-lina e uma redução nos efeitos colaterais debilitantes.

Embora protocolos de administração possam ser variados parase adequarem ao paciente particular, um protocolo típico para o tratamentodo Diabetes compreende injeções intramusculares e intravenosas duas ve-zes por semana durante o primeiro mês e injeções uma vez por semana du-rante os meses 3, 6, 11 e 12. Infusões intravenosas podem ser também da-das durante o mês 6.

EXEMPLO 28:

O paciente é um homem de 70 anos de idade com diabetes eque sofreu hipercetoacidose e estava tomando 52 unidades de insulina e umhipoglicêmico oral. Dentro de 6 meses de terapia ele estava sem todos osmedicamentos e insulina e está agora atualmente sendo capaz de manterseu açúcar no sangue em uma dieta normal durante o último 1 Vz ano. Elerecebe injeções de reforço.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabe-la 25.

TABELA 25

<table>table see original document page 147</column></row><table><table>table see original document page 148</column></row><table>EXEMPLO 29:

Um homem de 54 anos de idade apresentado com diabetes mel-Iitus incontrolado durante os últimos três anos e estava tomando insulina 42unidades junto com um hipoglicêmico oral. Seu açúcar no sangue em jejumera 200 mg/dl e seu açúcar pós-prandial era 280 mg/dl com todas as medi-cações.

Após tomar as células hES por três semanas ele parou de tomarinsulina e está com uma dose reduzida de fármacos hipoglicêmicos. Ele estáse sentindo muito melhor e é mais alerta.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabe-La 26.

TABELA 26

<table>table see original document page 149</column></row><table>

EXEMPLO 30:

Uma mulher de 45 anos de idade tinha angina e era diabética.Ela estava tomando insulina e um hipoglicêmico oral e tinha sofrido angio-plastia.

Três meses depois de receber tratamento com células hES elaparou com a insulina e está sob uma dose reduzida de hipoglicêmico oral.Seus registros de açúcar no sangue e medicações estão mostrando níveisde açúcar no sangue bem controlados.

O programa de injeções para esta paciente é mostrado na TabeIa 27.

TABELA 27

<table>table see original document page 150</column></row><table><table>table see original document page 151</column></row><table>Tratamento de Doença Pulmonar Intersticial

EXEMPLO 31:

Uma senhora de meia-idade foi para a clínica sofrendo de ILD(doença pulmonar intersticial). Ela estava em um estágio terminal com SPO2a 69% em descanso. Agora com o tratamento com células hES sua doençaparou de progredir. A paciente está se sentindo muito melhor no geral e atémesmo sua respiração melhorou. O tratamento está continuando. Há sonsde respiração que podem ser ouvidos em auscultação e seus testes de fun-ção pulmonar geral mostram melhora.

O programa de injeções para esta paciente é mostrado na TabeIa 28.

TABELA 28

<table>table see original document page 152</column></row><table><table>table see original document page 153</column></row><table><table>table see original document page 154</column></row><table><table>table see original document page 155</column></row><table><table>table see original document page 156</column></row><table><table>table see original document page 157</column></row><table><table>table see original document page 158</column></row><table><table>table see original document page 159</column></row><table><table>table see original document page 160</column></row><table>

Desenvolvimento de Novo Fármaco

Ainda outro uso de células hES é para o desenvolvimento e tes-te de novos fármacos. Por exemplo, células hES podem ser culturadas deacordo com a prática da presente invenção e usadas como um substratopara teste dos alvos, modo de ação, absorção, metabolismo, excreção, toxi-dez e segurança de novas entidades químicas, candidatos a fármaco e no-vos agentes farmacêuticos durante pesquisa e desenvolvimento farmacêuti-cos. Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a métodos parateste do efeito de um composto sobre células hES e/ou seus derivados,compreendendo cultura das células hES e/ou seus derivados obtidos atravésdos métodos da presente invenção na presença do composto e determina-ção do efeito do composto sobre as células.EXEMPLO 32:

Os efeitos dos antibióticos tetraciclina e ceftriaxona sobre célu-las hES culturadas foi analisado junto com o soro do paciente. Esses fárma-cos foram introduzidos separadamente bem como juntos em concentraçõesdiferentes e os efeitos estudados sobre as células-tronco. Finalmente a doseda medicação e a eficácia dos fármacos foram determinadas.

Aplicação de Fármaco

Outro uso para células hES e/ou seus derivados é levar fárma-cos para o local de uma lesão ou doença para aplicação localizada. CélulashES e/ou seus derivados podem ser incubados na presença de um fármacode modo que as células absorvem o fármaco. As células carregadas podemser então aplicadas localmente ao local de tratamento onde o fármaco vaidifundir das células e tratamento da lesão ou doença vai suceder. Em outramodalidade, as células carregadas podem ser aplicadas a um local outroque não a área danificada ou doente se a área danificada ou doente for ina-dequada para aplicação direta do fármaco (por exemplo, a área está muitodanificada para injeção direta do fármaco). Este método de aplicação defármaco permite o uso de fármacos que seriam tóxicos se administrados sis-tematicamente a um indivíduo. O método também permite que concentra-ções mais altas do fármaco sejam administradas ao local do que pode serpossível pelas outras vias de administração. Em uma modalidade adicional,células hES e/ou seus derivados podem ser carregados com um ou maisfármacos que vão intensificar o tratamento produzido pelo transplante daspróprias células. Exemplos não-limitantes incluem carregar células com a-gentes anti-hipertensivos para tratamento de doença cardíaca, carregar célu-las com agentes quimioterapêuticos para tratamento de pacientes com cân-cer e carregar células com fatores neurotróficos para tratamento de SCI. Emuma modalidade, a presente invenção refere-se a métodos para aplicaçãode um fármaco a um indivíduo compreendendo cultura de células hES e/ouseus derivados obtidos através dos métodos da presente invenção na pre-sença do fármaco, onde as células absorvem o fármaco, e administraçãodas células a um local no indivíduo, onde o fármaco é liberado.Em um aspecto da invenção, as metodologias de cultura da pre-sente invenção permitem a exposição das células hES e/ou seus derivadosaos fármacos e outros agentes ativos in vitro antes do transplante, conformecomparado com administração dos fármacos ou agentes ativos diretamenteaos pacientes. Exposição das células in vitro vantajosamente provê os efei-tos positivos dos fármacos (por exemplo, os efeitos neurotróficos de ácidovalpróico) enquanto evitando toxidez de administração sistêmica do fármaco.

Tratamento de Lesão ao Cordão Espinhal: Estudos de Caso

Tratamento clínico usando células hES e seus derivados paraSCI mostrou resultados notáveis. Dada a natureza da prática da presenteinvenção, e que todos os pacientes eram voluntários incuráveis, e que suacondição era SCI crônica ASIA A, e então além do estágio no qual proces-sos de regeneração neural naturais são possíveis, testes controlados duplo-cego ou de placebo não foram realizados, em respeito ao juramento do Mé-dico. Os resultados do protocolo são demonstrados através dos exemplosdetalhados providos como estudos de caso abaixo.

ESTUDO DE CASO 1

A prática da presente invenção resultou na reversão dos sinto-mas de SCI em um indivíduo sofrendo de SCI através de transplante de cé-lulas hES de acordo com o protocolo aqui descrito.

ReRo 1.3.4/000/220905/a, um indivíduo de 29 anos de idade comuma fratura C6-C7 e deslocamento foi declarado intratável por práticas médi-cas diferentes. O indivíduo não tinha nenhuma sensação da área mamáriainterna para baixo, e era incapaz de sentar sozinho, não tinha nenhum contro-Ie da bexiga ou intestino, não era capaz de mover seus braços e dedos e nãotinha nenhuma força ou tônus em suas pernas. O indivíduo tinha desenvolvidoúlceras de leito bilaterais não-cicatrizantes durante um período de três anos.Administração de células hES e seus derivados de acordo com as práticas dapresente invenção foi iniciada sob essas condições como segue.

Uma composição farmacêutica contendo aproximadamente cer-ca de 750.000 a cerca de 80 milhões de células hES e seus derivados inclu-indo progenitores de célula-tronco hematopoiética e progenitores de célula-tronco neuronal· foi diluída em solução solução salina normal estéril para umvolume final de 0,25 a 1,0 ml, cariotipada, testada quanto à contaminação,viabilidade e contagem usando protocolos padrão e então administrada atra-vés de injeção subcutânea no antebraço. O indivíduo foi observado quanto achoque anafilático, dor ou inflamação no local da injeção, coceira generali-zada, rubor ou febre após cinco minutos, dez minutos, quinze minutos, trintaminutos, uma hora e vinte e quatro horas.

Tratamento do indivíduo foi através de administração de uma in-jeção de preparação subcutânea de uma composição farmacêutica contendo750.000 a 80 milhões de células hEs e seus derivados, onde as ditas célulascompreendem progenitores de célula-tronco hematopoiética e progenitoresde célula-tronco neuronal, ressuspensos em um volume de 0,25 ml a 1,0 mlde solução solução salina normal estéril. Uma injeção de preparação adicio-nal carregando o mesmo número de células-tronco hematopoiéticas e célu-las-tronco neuronais ressuspensas em 0,25 ml a 1,0 ml de solução soluçãosalina normal foi administrada através de injeção intramuscular. Uma injeçãode preparação final de 750.000 a 80 milhões de progenitores de célula-tronco neuronal ressuspensos em um volume de 0,25 ml a 1,0 ml de soluçãosolução salina normal estéril foi administrada através de injeção intravenosa.

Tratamento direto da SCI de acordo com a prática da presenteinvenção foi realizado através de ressuspensão de uma composição farma-cêutica compreendendo 750.000 a 80 milhões de células hES e seus deriva-dos, onde as ditas células compreendem progenitores de célula-tronco neu-ronal, ressuspensos em um volume de 2 ml de solução solução salina nor-mal estéril e diluídos mais para 15 ml a 40 ml de solução solução salinanormal estéril e administrados através de injeção epidural no local, abaixo dolocal e acima do local da lesão sete dias após a primeiro injeção de prepara-ção. Tratamento através da administração de injeção epidural foi repetidoapós um mês e meio de preparação, quatro meses após preparação e seismeses após preparação.

Em adição à administração epidural, o indivíduo foi tratado atra-vés de injeção intratecal de uma composição farmacêutica compreendendo750.000 a 11 milhões de células hES e seus derivados, onde as ditas célulascompreendem progenitores de célula-tronco hematopoiética e progenitoresde célula-tronco neuronal ressuspensos em 2 ml de solução solução salinanormal estéril e cinco meses após o início do tratamento.

Ainda, o indivíduo foi tratado com uma injeção epidural de umacomposição farmacêutica compreendendo 750.000 a 80 milhões de célulashES e seus derivados, onde as ditas células compreendem progenitores decélula-tronco neuronal, ressuspensos em 2 ml de solução solução salinanormal estéril e diluídos mais para um volume final de 4 ml, duas vezes dia-riamente por três dias consecutivos.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabe-la 29.

TABELA 29

<table>table see original document page 164</column></row><table><table>table see original document page 165</column></row><table><table>table see original document page 166</column></row><table>

O bem-estar neurológico do indivíduo foi avaliado em intervalos

regulares após o início do tratamento, e uma melhora notável do estadoI mental e higiene geral do indivíduo foi observada após duas semanas con-forme mostrado na TABELA 30.

TABELA 30

<table>table see original document page 166</column></row><table>

Sinais e sintomas típicos de dano ao sistema nervoso autônomocomo um resultado de uma fratura de C6-C7 foram avaliados durante o cur-so de tratamento. Uma melhora notável e progressiva em todos os parâme-tros testados, incluindo a habilidade em sentir pressão profunda, sensaçãode toque, sensação, equilíbrio, habilidade em sentir dor, habilidade em sentirmudança em temperatura, movimentos involuntários, presença de suoresfrios, tontura, pressão sangüínea, dificuldade em respirar, postura anormalenquanto deitando e habilidade em sentar sem auxílio, foram observadosconforme mostrado na Tabela 31.TABELA 31

<table>table see original document page 167</column></row><table>

TABELA 31 (continuação)

<table>table see original document page 167</column></row><table>Disfunção da bexiga e intestino é geralmente associada comdano neurológico como resultado de SCI. Este dano resulta em controle dabexiga prejudicado, corrente da bexiga e sensação de bexiga cheia, controledo intestino, tempo para evacuação do intestino e sensação no intestino.

Durante o curso do tratamento, melhoras notáveis e progressivas em todosos parâmetros testados foram observadas como um resultado do tratamentoconforme mostrado na TABELA 32.

TABELA 32

<table>table see original document page 168</column></row><table>

Mudanças na função motora do corpo superior, como evidênciade regeneração neural no sítio da lesão C6-C7 foram avaliadas durante ocurso do tratamento. Melhoras notáveis e progressivas em movimento doombro, movimento de pulso e dedo, forças nos dedos, reflexos de tendão,resistência do movimento do membro, atrofia muscular e ação de segurarcom a mão foram observadas conforme mostrado na Tabela 33.

TABELA 33

<table>table see original document page 168</column></row><table><table>table see original document page 169</column></row><table>

S = ombro; FA = antebraço; W = pulso; F = dedos; L = esquerdo; R = direitoForça: 0 é pobre, 4 é boaAtrofia: 0 é boa, 4 é pobre

Mudanças na função motora do corpo inferior, como evidênciade regeneração neural no sítio da lesão C6-C7, foram avaliadas durante ocurso do tratamento, incluindo movimento do quadril, movimento do joelho,movimento do dedo do pé, reflexos de tendão, resistência dos membros,atrofia muscular e resposta plantar. Embora não houvesse nenhuma melho-ra em nenhum dos parâmetros testados durante o curso do estudo, apóstrês meses de tratamento, o indivíduo era capaz de ficar de pé com o auxíliode um andador conforme mostrado na TABELA 34.

TABELA 34

<table>table see original document page 169</column></row><table>

ESTUDO DE CASO 2

ReRo 1.3.4/001/051004/a001, um indivíduo de vinte e dois anosde idade sofria de SCI paraplégica pós-traumática como um resultado deuma fratura D6-D7 após uma queda de do telhado do segundo andar. O in-divíduo entrou em coma por dois dias após a queda e voltou à consciência,mas desenvolveu paralisia bilateral com perda sensória e motora total dametade inferior do corpo da região intermamária até os pés, e era incapaz delevantar os pés ou pernas e era incapaz de sentar sem auxílio ou se levantarpara uma posição sentada. O indivíduo estava permanentemente acamado,tinha perdido controle da bexiga e intestino e era totalmente dependente doapoio de sua família embora seus membros superiores não tivessem sidoafetados.

Administração de uma composição farmacêutica compreenden-do células hES e seus derivados de acordo com a prática da presente inven-ção foi iniciada após cinco meses da lesão. No período de cinco meses, oindivíduo ganhou novamente controle da bexiga e intestino, e habilidade emsentar sem apoio, e escorregar para cima e para baixo levantando o quadril.Percepção sensória restaurada para o nível perineal. O indivíduo pode selevantar para um andador sem auxílio, e pode ficar de pé com facilidade noandador sem a necessidade de apoio do joelho. O tratamento resultou nahabilidade do indivíduo em andar usando um andador com o apoio de umsuporte para joelho e volta a trabalhar, isto é, ele ganhou novamente um es-tilo de vida regular.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabe-la 35.

TABELA 35

<table>table see original document page 170</column></row><table><table>table see original document page 171</column></row><table><table>table see original document page 172</column></row><table>

ESTUDO DE CASO 3

ReRo 1.3.4/002/040205/α, um indivíduo de quarenta anos deidade sofria de SCI quadriplégica como um resultado de uma lesão C5-C6 erigidez e dor no pescoço. O indivíduo sofreu cirurgia após seis meses e ficouquadriplégico desde então. O indivíduo sentia uma sensação de queda etontura se feito sentar com apoio, e tinha sensação da borda superior da es-cápula para cima, com perda total de força em todos os quatro membros eperda de função da bexiga e intestino imediatamente após cirurgia.

Administração de uma composição farmacêutica compreenden-do células hES e seus derivados de acordo com a prática da presente inven-ção foi iniciada nove meses após cirurgia. Como um resultado do tratamentocom células hES, o indivíduo é capaz de sentar confortavelmente sem a ne-cessidade de apoio, e é capaz de se mover e dobrar para o lado enquantosentando em uma cadeira com suas pernas abaixadas confortavelmente.

O indivíduo recuperou uma melhora notável de seu controle de seu corposuperior. O indivíduo teve melhora substancial em seu bem-estar psicológicogeral através de mobilidade aumentada e independência e atividades. Ele écapaz de ficar de pé com o apoio com força nos membros inferiores, controlao movimento do dedo do pé e não deixa cair o pulso. Tratamento está acon-tecendo de acordo com as melhoras da condição do indivíduo.ESTUDO DE CASO 4

ReRo 1.3.4/003/260902/β, um indivíduo de trinta e sete anos deidade que sofreu lesão espinhal com dano cerebral dezessete anos atrásapós um acidente de carro e ficou confinado a uma cadeira de rodas. O indi-víduo sofria também de hemiplegia lateral direita, incapacidade em falar, pa-ralisia facial, uma perda total de memória e nenhum controle da bexiga.

O indivíduo foi administrado com composição farmacêuticacompreendendo células hES e seus derivados de acordo com a prática dapresente invenção por um ano e dois meses que resultou na capacidade emandar com o auxílio de um andador, falando algumas palavras, pescoço es-ticado, remoção de paralisia facial e melhora de memória.

ESTUDO DE CASO 5

ReRo 1.3.4/004/030505/a, um indivíduo de cinqüenta e seis a-nos de idade que sofria de fratura pós-traumática na C5-C8 com retrovulsãoda vértebra fraturada causando contusão do cordão espinhal e hemorragiaepidural anterior associada e estava paraplégico. O indivíduo era incapaz demover ambos membros inferiores e sofria dor aguda nas costas.

A administração de uma composição farmacêutica compreen-dendo células hES e seus derivados de acordo com a prática da presenteinvenção foi realizada por um período de um ano que resultou em recupera-ção de alguma força em ambas pernas, percepção sensória tal como vibra-ção nas pernas e habilidade de ficar de pé com o auxílio de andador sem dornas costas. O indivíduo pode andar com o auxílio dò andador, recuperoucontrole e sensação da bexiga e superou episódios de suores frios e tontura.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabe-la 36.TABELA 36

<table>table see original document page 174</column></row><table><table>table see original document page 175</column></row><table><table>table see original document page 176</column></row><table><table>table see original document page 177</column></row><table>

ESTUDO DE CASO 6

ReRo 1.3.4/005/130705/β, um indivíduo de vinte e cinco anos deidade que foi diagnosticado com distúrbio Potts Spine no nível D6 com para-plegia do membro inferior sofreu cirurgia três vezes com uma descompres-são anterior do cordão espinhal. O indivíduo estava em cadeiras de roda,não podia sentar sem apoio, com paralisia flácida das pernas, não tinha ne-nhum controle do intestino e evacuava enquanto deitado e não tinha nenhu-ma sensação na bexiga.

O indivíduo foi administrado com uma composição farmacêuticacompreendendo células hES e seus derivados de acordo com a prática dapresente invenção, onze anos e seis meses após a lesão. O protocolo detratamento seguido durante o primeiro ano resultou no fortalecimento dascostas, habilidade em sentar sem apoio e sensação de peso nas pernas.

O indivíduo também recuperou dor nas costas durante menstruação e dormenstural. Sensações nas coxas, pernas e recuperação da sensação e con-trole da bexiga foram observadas. O indivíduo é capaz de andar com o auxí-lio de um andador com boa restauração de movimento em ambas pernas.

Tratamento está em andamento.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na TabeIa 37.TABELA 37

<table>table see original document page 178</column></row><table><table>table see original document page 179</column></row><table>

ESTUDO DE CASO 7

ReRo 1.3.4/006/22080/α, um indivíduo de trinta anos de idadesofrendo de uma SCI paraplégica C6-C7 era incapaz de mover os membrosinferiores e não tinha nenhum controle do intestino ou sensação do intestino.O indivíduo tinha sensação de pressão boa e profunda apenas da regiãomamária interna para cima. Então, o indivíduo tinha dificuldade em sentar.As mãos do indivíduo tinham muito pouca força, com movimento de dedomuito fraco e o indivíduo tinha dificuldade em respirar.

O indivíduo foi tratado de acordo com a prática da presente in-venção através da administração de uma composição farmacêutica compre-endendo células hES e seus derivados cerca de três meses após a lesão.

O indivíduo recuperou a habilidade em se sentar sem apoio, não sofre quais-quer tonturas, pode sentir pressão na virilha, tem sensação no lado médio docotovelo e sente dor nas pernas se o paciente tentar se mover. O indivíduorespira facilmente, tem sensação na bexiga e intestino, tem sensação empernas e pode agora ficar de pé por alguns minutos com apoio. O indivíduotambém tem mais força e movimento nos dedos. Tratamento está sob an-damento.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabela 38.

TABELA 38

<table>table see original document page 180</column></row><table><table>table see original document page 181</column></row><table>

ESTUDO DE CASO 8

ReRo 1.3.4/007/221005/β, um indivíduo de vinte e seis anos deidade, paraplégico como resultado de SCI na D6, era incapaz de mover am-bos membros inferiores, embora capaz de se sentar sem apoio. O indivíduonão tinha nenhum controle da bexiga ou intestino, e tinha sensação apenasda área mamária interna para cima.

O indivíduo foi administrado com uma composição farmacêuticacompreendendo células hES e seus derivados de acordo com a prática dapresente invenção cerca de dez meses após a lesão. O indivíduo recuperoua sensação na lateral do corpo e até a região umbilical bilateralmente daárea axilar até o ilíaco. O indivíduo pode andar com o auxílio de um andadore um caliper com força motora nas pernas.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabe-la 39.TABELA 39

<table>table see original document page 182</column></row><table><table>table see original document page 183</column></row><table>

ESTUDO DE CASO 9

ReRo 1.3.4/008/151005/β, um indivíduo de vinte e sete anos deidade sofria com quadriplegia traumática e tinha grande dificuldade em falare respirar, com pescoço rígido. As pernas do indivíduo foram paralisadas e oindivíduo não tinha nenhum movimento do dedo e nenhuma sensação noresto do corpo.

O tratamento através da administração de uma composição far-macêutica compreendendo células hES e seus derivados de acordo com aprática da presente invenção foi iniciado cerca de dois anos após a lesão.O indivíduo sentiu uma melhora no movimento do pescoço, facilidade emfalar e melhora no controle de tom de voz. O indivíduo sentiu respirar sermenos incômodo e função motora retornou com algum movimento do dedo.

As pernas se tornaram menos espásticas e o indivíduo era capaz de sentarsem auxílio. Movimentos dos dedos dos pés também reiniciaram e o indiví-duo pode mover os ombros.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabela 40.TABELA 40

<table>table see original document page 184</column></row><table><table>table see original document page 185</column></row><table>

ESTUDO DECASO 10

ReRo 1.3.4/009/300106/α, um indivíduo de vinte e cinco anosteve um acidente de carro e perdeu sua habilidade em se sentar sem apoio,a espinha estava prestes a entortar, o indivíduo tinha perdido controle dabexiga e intestino e o indivíduo sofria uma perda total de força nas pernas.

O indivíduo foi tratado através da administração de uma compo-sição farmacêutica compreendendo células hES e seus derivados de acordocom a prática da presente invenção cerca de dois anos após a lesão. O indi-víduo mostrou melhora rápida e pode se sentar sem apoio. O indivíduo nãosofre quaisquer tonturas, tem movimentos em ambos pés, recuperou a sen-sação nas pontas dos dedos e pode sentir calafrio pela espinha.

ESTUDO DECASO 11

ReRo 1.3.4/010/020206/β, um indivíduo de vinte e seis anos deidade com uma SCI na D12-L1 como um resultado de acidente de carro eraincapaz de ficar de pé com os joelhos sendo contraídos. O indivíduo era ca-paz de se sentar sem apoio e tinha sensações normais nos membros. O in-divíduo não tinha nenhum controle da bexiga e intestino e tinha espasticida-de aumentada.

O indivíduo foi tratado cerca de doze anos após a lesão atravésda administração de uma composição farmacêutica compreendendo célulashES e seus derivados de acordo com a prática da presente invenção. O indi-víduo teve recuperação notável em função motora da perna com espastici-dade menor, exibia a perna direita completamente estendida e um retorno deforça na perna esquerda. O indivíduo recuperou a habilidade em ficar de pée andar com o auxílio de calipers e um andador. Sensações da bexiga e in-testino também retornaram no indivíduo.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabe-la 41.

TABELA 41

<table>table see original document page 186</column></row><table><table>table see original document page 187</column></row><table>ESTUDO DE CASO 12

O paciente era um homem de 26 anos de idade com paraplegiaapós uma lesão entre D6-D8. Ele sofreu um acidente de carro traumático emsetembro de 2004. Ele estava totalmente acamado sem nenhuma sensaçãoabaixo do peito, nem controle da bexiga ou intestino, e nenhuma sensaçãoou força motora do peito para baixo. Ele tinha uma úlcera de leito muito pro-funda na parte inferior das costas onde seu sacro podia ser visto.

O paciente começou com células hES em 27 de abril de 2006.Por causa da úlcera de leito ele não podia sofrer quaisquer procedimentosO/T e recebeu dosagens diárias de células intravenosamente e intramuscu-larmente, e eventualmente tinha células hES aplicadas diretamente em suaúlcera de leito. Ele também recebeu infusões intravenosas.

No 11s dia de tratamento ele podia ficar de pé com caliperscompleto (da cintura até o tornozelo) e um andador e deu 2 passos. Confor-me o tempo passava sua força no músculo aumentou e após 4 meses elepodia dar até 100 passos e podia ficar de pé por até 20 minutos. Ele é capazde sentir suas pernas e movê-las também. Ele é também capaz de sentirintestino e bexiga cheios e é capaz de andar agora com apenas um suportede joelho e o andador para apoio. Sua úlcera de leito cicatrizou e ele reini-ciou seus estudos.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na Tabela 42.

TABELA 42

<table>table see original document page 188</column></row><table><table>table see original document page 189</column></row><table><table>table see original document page 190</column></row><table><table>table see original document page 191</column></row><table><table>table see original document page 192</column></row><table><table>table see original document page 193</column></row><table><table>table see original document page 194</column></row><table><table>table see original document page 195</column></row><table>

ESTUDO DE CASO 13

O paciente é um homem de 22 anos de idade que sofreu um a-cidente de cavalo em junho de 2006 e está paraplégico em T-12, L-1. Elenão tinha nenhuma força abaixo da cintura, nenhum controle do intestino oubexiga e nenhuma sensação abaixo da cintura.O paciente começou tratamento em setembro de 2006 admitidopor 6 semanas. Ele respondeu a células hES e dentro de uma semana eleera capaz de ficar de pé e andar alguns passos com calipers completo (cin-tura até o tornozelo) e andador. Ele tinha progredido e está no suporte dejoelho com o qual ele pode ficar de pé por até 30 minutos com um andador.

Ele agora tem sensação completa e controle do intestino e bexiga. Ele tam-bém tem bom equilíbrio com a bengala e também as muletas. Ele é capazde subir e descer escadas com o calipere as muletas.

O programa de injeções para este paciente é mostrado na TabeIa 43.

TABELA 43

<table>table see original document page 196</column></row><table><table>table see original document page 197</column></row><table><table>table see original document page 198</column></row><table>

ESTUDO DE CASO 14

A paciente é uma mulher de 26 anos de idade paraplégica trau-mática em T-12, L-1 que sofreu um acidente de carro em setembro de 2004.

Ela não tinha nenhuma sensação abaixo do peito e ela não tinha nenhumcontrole do intestino ou bexiga. Não havia nenhuma força motora em ne-nhuma perna e ela estava de cadeira de rodas.

A paciente começou com células hES em março de 2006. Elaera capaz de ficar de pé e andar alguns passos com calipers completo (cin-tura até tornozelo) e andador após 9 dias e continuou a progredir. Seu esta-do atual é que ela pode andar continuamente com calipere andador e tam-bém ficar de pé usando o suporte de joelho. Sensações do intestino e bexigaforam recuperadas com controle e sem o uso de qualquer caracterização ousupositório. Sensação melhorou para os níveis de tornozelo.

O programa de injeção para este paciente é mostrado na Tabela44.

TABELA 44

<table>table see original document page 199</column></row><table><table>table see original document page 200</column></row><table><table>table see original document page 201</column></row><table>

Metodologia de cultura de célula-tronco embriônica

As células hES usadas como o material de partida para as li-nhagens de célula desenvolvidas sob a presente invenção são derivadas deum embrião de 2 a 7 dias de vida antes de seu implante no útero, por exem-pio, um embrião de 2 a 4 dias, pro exemplo, um embrião de 3 dias.

Para isolamento do embrião, os óvulos são coletados com con-sentimento de doadores humanos que estão em um ciclo de IVF regular. Osóvulos são fertilizados pelo esperma e culturados através de métodos con-vencionais para se obter os embriões. Embriões extras são incubados porperíodos variáveis para desenvolvimento da linhagem celular.

O embrião é suspenso em uma pequena quantidade de meioessencial mínimo (por exemplo, RPMI, por exemplo, RPMI 1640 com 2,2 g/Lde bicarbonato de sódio) e as células hES são isoladas do embrião atravésde meios mecânicos (por exemplo, agitação). Mais meio é adicionado àscélulas isoladas junto com uma progestina e um agonista de phCG. Em umamodalidade, progesterona (16-64 μΙ de 250 mg/ml) e phCG (16-64 μΙ de5000 iu/ml) são adicionadas. As células isoladas são culturadas por 12-48horas, por exemplo, 24 horas, em uma temperatura entre 34-38°C, em umambiente de 3,5-6% de dióxido de carbono.

Em uma modalidade, as células hES são culturadas sob condi-ções anaeróbicas ou substancialmente anaeróbicas a fim de expandir ascélulas enquanto prevenindo diferenciação. "Substancialmente anaeróbica" édefinida como menos do que cerca de 10% de O2, menos do que 8%, 6%,4%, 2% ou 1% de O2. Condições com pouco oxigênio podem ser criadasusando incubadoras de célula multigás (CO2, O2, N2) onde o nível de oxigê-nio pode ser melhor ajustado entre 0% e 20% substituindo o ar ambientecom gás nitrogênio. Exemplos de incubadoras multigás incluem a série Fi-sher 11-730, a série Napco 7000, a série Sanyo COM, o Jouan IG750 e oHeraeus Heracell 150. Em outra modalidade, as células são culturadas emuma incubadora de CO2 e o nível de oxigênio é controlado pelo formato eposição do frasco onde as células estão contidas. Por exemplo, quando umfrasco de cultura de célula é mantido em uma posição vertical, muito do meiode cultura no frasco é substancialmente anaeróbico. Em contraste, quando ofrasco de cultura de célula é mantido em uma posição horizontal, o meio decultura é substancialmente aeróbico. O nível de oxigênio no meio de culturapode ser variado entre substancialmente anaeróbico e substancialmente ae-róbico alterando o formato e/ou posição do frasco de cultura de célula dentroda incubadora ou a quantidade de meio no frasco (por exemplo, a quantida-de de parte vazia).

Durante o estágio de expansão, frascos podem ser mantidos emuma posição vertical ao invés de horizontal. Em uma modalidade, incubaçãoé realizada em um recipiente de cultura onde o volume é quase completa-mente ocupado pelo meio e o recipiente é mantido em uma posição vertical.Como uma conseqüência, uma proporção substancial das células não adereàs paredes do frasco de cultura e o meio de cultura é substancialmente ana-eróbico.

Sob tais condições de crescimento, ciclos de duplicação ou re-plicação de célula estão em seu máximo, e processos de diferenciação celu-lar são substancialmente inibidos. Ciclos de replicação celular durante ex-pansão prosseguiram por 12-48 horas, por exemplo, 24 horas.

Para passagem ou recultura das células hES, a suspensão decélula é centrifugada, o pélete de célula é ressuspenso em uma pequenaquantidade de meio de cultura fresco compreendendo progesterona e phCG,as células são separadas em alíquota e meio fresco adicional sem progeste-rona e PhCG é adicionada. Em uma modalidade, a razão da alíquota de cé-lulas-tronco incubadas para o meio de célula fresco é cerca de 1:3,5 a cercade 1:35 volume/volume. As células são reincubadas a 34-38°C em uma in-cubadora revestida com água suplementada com uma atmosfera de 3,5-6%de dióxido de carbono sob condições substancialmente anaeróbicas por 12 a48 horas, por exemplo, 24 horas. Neste ponto as células podem ser passa-das para expansão continuada ou armazenadas para uso futuro.

Células hES culturadas sob tais condições permanecem emuma forma amplamente não-diferenciada conforme determinado pela ativi-dade de fosfatase alcalina e a ausência de quaisquer marcadores caracterís-ticos de especialização ou diferenciação celular. No entanto, pode ser nota-do que nenhuma população de célula é obtida que seja completamente dife-renciada ou completamente não-diferenciada. A população de célula é umamistura de linhagens de célula diferenciada e não-diferenciada, com umarazão variando de a partir de cerca de 4:1 a cerca de 10:1 de células não-diferenciadas para diferenciadas.

Para armazenamento das células hES expandidas, por exemplo,em um congelador profundo ou em nitrogênio líquido, um agente de criopre-servação, incluindo, mas não limitado a, 0,2-2% (p/v) de sulfóxido de dimetila(DMSO), pode ser adicionado ao meio de cultura. O nível de DMSO usado émenos do que tipicamente usado para criopreservação (por exemplo, 2-84μL/0,5 ml tubo) para evitar indução de diferenciação ou dano às células. A razão da quantidade de agente de criopreservação para aquele de meio decultura contendo células-tronco pode variar de a partir de cerca de 1:500 acerca de 16:1000. Outros agentes de criopreservação incluem sem limitaçãoglicerol, propanodiol, butanodiol, etanol, glicose, D-glicose, sucrose, trealose,manitol, paparavina, formamida, probucol, curcumina, polivinilpirrolidona,polietileno glicol, sulfato de condroitina, glicosaminoglicano dimetil sulfóxido,glutamina e piruvato de sódio. A temperatura de congelamento para a sus-pensão de célula pode ser variada de a partir de cerca de -15 a cerca de -80°C, por exemplo, cerca de -15 a cerca de -40°C. Em contraste com outrastécnicas para o armazenamento de células-tronco embriônicas humanas eseus derivados, não há nenhuma necessidade de congelamento rápido ouarmazenamento em "canudos". Após armazenamento, as células podem serpreparadas para expansão continuada ou para diferenciação através de co-leta das células através de centrifugação e ressuspensão do pélete de célulaem meio fresco.

Diferenciação parcial das células hES expandidas (por exemplo,células hES após expansão ou recém-isoladas ou armazenamento de célu-las previamente expandidas) é realizada através de sedimentação da sus-pensão de célula em uma centrífuga (por exemplo, entre cerca de 700-1400rpm por 5-12 minutos), removendo e descartando o sobrenadante, e ressus-pendendo as células em uma pequena quantidade de meio fresco (por e-xemplo, RPMI) contendo uma progestina e um agonista de phCG. As célulassão então separadas em alíquotas e meio de cultura adicional (por exemplo,meio essencial mínimo tal como RPMI ou DMEM, por exemplo, DMEM livrede ácido glutâmico 1X ou DMEM com 4,5 g/L de glicose e 3,7 g/L de bicar-bonato de sódio) sem progestina ou βΙπΟΘ é adicionado. As células são cul-turadas sob condições substancialmente aeróbicas (por exemplo, em umfrasco em uma posição horizontal) por 12 a 48 horas, por exemplo 24 horas."Substancialmente aeróbica" é definido como pelo menos cerca de 15% deO2, por exemplo, pelo menos cerca de 18% ou 20% de O2. Sob condiçõessubstancialmente aeróbicas as células hES vão começar a diferenciar.

O curso de diferenciação para as células hES é dependente do meio de cul-tura usado durante o estágio de diferenciação. Para produzir células progeni-toras neuronais, as células hES são culturadas em DMEM ou seu equivalen-te. Para produzir células progenitoras outras que não progenitoras neuro-nais, as células hES são culturadas em RPMI ou seu equivalente. Após ociclo de replicação de 12-48 horas, as células podem ser coletadas e res-suspensas em meio fresco para continuarem a diferenciação. Em geral, oestágio de diferenciação não deve durar mais do que 48-72 horas uma vezque diferenciação adicional além deste tempo produz células que não sãoadequadas para transplante usando os métodos da presente invenção.

Uma vez as células sendo parcialmente diferenciadas, as célu-Ias podem ou ser armazenadas para uso futuro através da adição de umcriopreservante e armazenamento das células a -15 a cerca de -80°C con-forme descrito acima ou preparando as células para uso nos métodos dainvenção. Para preparar as células para uso, as células são separadas emalíquota, meio fresco é adicionado (por exemplo, DMEM ou RPIM conformeapropriado) e as células são culturadas por 12-48 horas, por exemplo, 24horas, sob condições substancialmente anaeróbicas para prevenir diferenci-ação adicional. As células são então separadas em alíquotas em meio frescopara expansão continuada ou coletadas através de centrifugação e ressus-pensas em uma solução biocompatível (por exemplo, solução solução sali-na) em preparação para transplante. Neste ponto as células podem sertransplantadas para pacientes ou armazenadas a +4°C a -80°C para trans-plante futuro. Armazenamento pode ser em um recipiente adequado incluin-do, mas não limitado a, tubos de teste, frascos, seringas, etc, que podemfacilitar transporte ou uso clínico. Em uma modalidade, as células ressus-pensas em solução biocompatível são armazenadas em uma forma prontapara uso (por exemplo, em uma seringa pré-cheia). Quando necessário, alí-quotas de células são descongeladas naturalmente sem a necessidade debanhos de água ou incubadoras.

Sob as condições de armazenamento descritas em uma soluçãobiocompatível, viabilidade de célula de >40% é observada após novo des-congelamento mesmo após seis meses de armazenamento, sem quaisqueralterações genotípicas (instabilidade genética) ou fenotípicas tal como aneu-plóide ou heteroplóide.

Em cada estágio de expansão, diferenciação e armazenamento,uma alíquota das células é testada quanto à viabilidade através de exclusãode azul tripano e exame microscópico. Uma alíquota da cultura de célula étambém testada quanto à contaminação microbiológica. Uma alíquota adi-cional da suspensão de célula é também posta em um hemocitômetro e e-xaminada microscopicamente a fim de determinar a densidade celular. Umaalíquota adicional é também obtida para teste de atividade de fosfatase alca-Iina como um marcador para o estado de diferenciação da cultura de célula.

Durante armazenamento, as células podem ser testadas umavez por mês quanto ao seu cariótipo, para testar instabilidade genética sur-gindo como um resultado da metodologia de cultura.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Para isolamento de embriões, óvulos foram coletados com con-sentimento de um doador humano que sofreu um ciclo IVF regular, que pro-duziu 8 folículos. Os óvulos foram fertilizados pelo esperma e culturados a-través de métodos convencionais para obter os embriões. Três dos embriõesforam transplantados no doador. Os embriões extras foram incubados porperíodos variáveis para desenvolvimento de uma linhagem de célula hES.

O embrião, ou intacto ou em condição em pedaços, foi suspensoem meio de cultura. Ainda, 84 μΙ de progesterona (250 mg/ml) e 84 μΙ dePhCG (5000 ui/ml) foram adicionados. Os meios com as células embriônicasforam testados quanto a qualquer contaminação, e qualquer embrião infec-tado foi descartado. As células dos embriões nesta forma foram usadas paraexpansão e armazenamento.

Após um dia de incubação, 1 ml dos meios contendo célula em-briônica foi introduzido em 40 ml de meio de cultura (DMEM ou RPMI) emum recipiente de 50 ml junto com progesterona e phCG. O meio de culturajunto com as células-tronco foi incubado em uma posição horizontal em tem-peratura ambiente em um ambiente contendo dióxido de carbono. A Tabela45 mostra algumas das condições experimentais seguidas por este método.

TABELA 45

<table>table see original document page 207</column></row><table>TABELA 46

<table>table see original document page 208</column></row><table>

FF = Fluido folicular aspirado junto com o óvulo durante o ciclo de IVF, 16-84μ";

A = progesterona; B = PhCG

Após 24 horas de incubação, números iguais de células nuclea-das (parcialmente diferenciadas) e células do branco (não-diferenciadas)foram observados. Alíquotas de cerca de 0,5 ml foram obtidas para armaze-namento neste estágio. Após 48 horas de incubação, células em formatooblongo com alguns filamentos foram observadas com meios DMEM. Noentanto, quando meios RPMI foram usados, muitas células nucleadas comformatos variados foram observadas. O volume do recipiente foi verificadoestar cheio até a marca de 37 ml após a incubação de 48 horas. Alíquotasde 0,5 ml foram obtidas para armazenamento neste estágio. Após 72 horasde incubação em DMEM, filamentos longos de célula reticuladas igual a te-cido nervoso foram observados. A incubação nos meios RPMI produziu al-gumas células de tamanho pequeno e algumas células se acumulando emtorno de uma célula central. Alíquotas de 0,5 ml foram obtidas para armaze-namento neste estágio.

Uma alíquota das células embriônicas cultivadas em meios con-tendo cultura foi introduzida em mais meio de célula (RPMI ou DMEM) comoutros componentes de teste, em um recipiente estéril (Tarsons steriflask).As células-tronco foram incubadas em temperatura ambiente em um ambi-ente de dióxido de carbono em posição horizontal por vários períodos detempo variando de 18 horas a 5 dias. Após 24 horas de incubação, alíquotasde cerca de 0,5 ml foram novamente introduzidas em mais meios de culturae reincubadas. Alíquotas foram obtidas para preparar composições prontaspara uso bem como para armazenamento após estágios de incubação dife-rentes. A Tabela 46 mostra algumas condições experimentais seguidas porexpansão de células hES.

Exemplo 2

O embrião, ou intacto ou em condição em pedaços, foi suspensoem meios de cultura. Ainda, 84 μΙ de progesterona e 84 μΙ de PhCG foramadicionados. Os meios com as células embriônicas foram testadas quanto aqualquer contaminação, e qualquer embrião infectado foi descartado. As cé-lulas dos embriões nesta forma foram usadas para expansão e armazena-mento.

Após um dia de incubação, 1 ml dos meios contendo célula em-briônica foi introduzido em 46 ml de meio de cultura de célula (DMEM ouRPMI) em um recipiente de 50 ml junto com progesterona e phCG. As célu-las-tronco foram incubadas em uma posição vertical em temperatura ambi-ente em um ambiente de dióxido de carbono. A Tabela 47 mostra algumasdas variáveis de exemplo de trabalho usadas para este experimento.TABELA 47

<table>table see original document page 210</column></row><table>TABELA 48

<table>table see original document page 211</column></row><table>

Após 24 horas de incubação, células nucleadas (parcialmentediferenciadas) e células branco (não-diferenciadas) foram observadas emuma razão de cerca de 1:4. Após 48 horas de incubação, células nucleadase células branco na razão de 1:2 foram observadas. Alíquotas de 0,5 ml fo-ram obtidas para armazenamento no estágio de 24 horas e 48 horas.

0,5 ml das células embriônicas cultivadas em meios contendocultura foi introduzido em 46 ml de meio de célula (RPMI ou DMEM) comoutros componentes de teste, em um recipiente estéril de 50 ml (Tarsonssteriflask). As células-tronco foram incubadas em uma posição horizontal emtemperatura ambiente em um ambiente contendo dióxido de carbono. Após24 horas de incubação, alíquotas de 0,5 ml foram novamente introduzidasem 46 ml de meios de cultura e reincubadas. A Tabela 48 mostra algumascondições experimentais seguido por expansão de células hES.

Alíquotas foram obtidas para preparação de composições pron-tas para uso bem como para armazenamento após o estágio de incubaçãode 24 horas.

Exemplo 3: Armazenamento

Para armazenamento, células hES foram obtidas em um tubo dearmazenamento de 0,5 ml e um agente de criopreservação tal como DMSO a0,2% em uma quantidade de 16 μΙ foi adicionado e após agitação suave foramarmazenadas a -20°C. As células foram descongeladas naturalmente parafazer composições prontas para uso ou para expansão futura. A viabilidadedas células descongeladas foi testada e 64% a 84% das células foram verifi-cadas ser viáveis. As células armazenadas foram testadas quanto à contami-nação bem como viabilidade após intervalos regulares. A Tabela 49 mostra osparâmetros reais seguidos para armazenamento em cinco experimentos dife-rentes bem como a viabilidade das células após descongelamento.

TABELA 49

<table>table see original document page 212</column></row><table>

Exemplo 4

Vários testes foram realizados para checagem de qualquer con-taminação ou infecção ou anormalidade nas células embriônicas em váriosintervalos dos estágios de expansão e armazenamento e para identificar osderivados de hES que estavam presentes em cada cultura. Os testes diferen-tes incluíam aqueles para HIV, HbSAg (para hepatite), PCR convencional parateste Koch (para tuberculose), análise cromossomal pelo método CG de ligaçãode giemsa, Bilirrubina pelo método Jendrasiik e Grof e Albumina usando o mé-todo de ligação de BCG Dye (para células progenitoras do fígado), insulina a-través do método CLIA (para células progenitoras pancreáticas), neurofilamentoatravés do método imunoistoquímica (para células progenitoras neuronais),teste de CD34 através de método imunoistoquímico ((para células progenitorashematopoiéticas), Fosfatase Alcalina através do método PNPP (para célulasnão-diferenciadas), testes histopatológicos (para identificação de célula atravésde morfologia), etc. A condição de cultura foi testada através do método de pla-ca de cultura manual e sensibilidade manual e identificação com versatrek/AP1foi realizada para infecção fúngica. Todos os testes foram realizados e a con-tagem de célula e viabilidade das células foram checadas em cada estágio. ATabela 50 provê os resultados de alguns dos testes.

Exemplo 5:

15 ml de suspensão de célula-tronco foram obtidos e centrifuga-dos a 1000 rpm por 7 minutos. O sobrenadante foi descartado. 2 a 15 ml desolução solução salina foram adicionados ao pélete e as células-tronco en-tão suspensas. A suspensão foi checada quanto à contaminação microbia-na. Um teste de viabilidade foi também feito.

Exemplo 6: Armazenamento de células hES em forma pronta para uso

Recipientes (seringa, tubo de teste, frasco) cheios com a sus-pensão de célula hES transplantável foram rotulados e armazenados a-20°C. A cadeia fria foi mantida até o estágio de transplante. A suspensão foidescongelada naturalmente imediatamente antes do transplante.

TABELA 50

<table>table see original document page 213</column></row><table><table>table see original document page 214</column></row><table><table>table see original document page 215</column></row><table>

Linhagens de Célula

Subculturas foram repetidas mais de 100 vezes para estabele-cer células hES da presente invenção. Ainda, as subculturas foram testadasquanto a qualquer contaminação/infecção em cada estágio de expansão a-dicional ou armazenamento. As linhagens de célula hES foram verificadasser estáveis e sem qualquer anormalidade durante cinco anos de ciclos desubcultura.

A presente invenção não deve ser limitada em escopo pelasmodalidades específicas e exemplos, que são pretendidos como ilustraçõesde vários aspectos da invenção e quaisquer modalidades que sejam funcio-nalmente equivalentes estão dentro do escopo da presente invenção. Aque-les versados na técnica saberão, ou serão capazes de averiguar usando nãomais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes para as modali-dades específicas da invenção descrita aqui. Esses e outros equivalentespretendem ser compreendidos pelas reivindicações que seguem. Todas aspatentes, pedidos de patente e publicações citados aqui são incorporados atítulo de referência em sua totalidade.

Claims (116)

1. Composição farmacêutica para o tratamento de doenças, dis-túrbios ou condições compreendendo uma quantidade terapêutica eficaz decélulas-tronco embriônicas humanas (hES) e/ou seus derivados, em que asditas células hES e/ou seus derivados são livres de produtos animais, célu-las nutrientes, fatores de crescimento, fator de inibição de leucemia, fator decrescimento de fibroblasto, fator steel associado à membrana ou fator steelsolúvel ou meios condicionados, em que as ditas células hES e/ou seus de-rivados são suspensos em uma solução biocompatível farmaceuticamenteaceitável.

2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,em que a dita composição está em uma forma pronta para uso.

3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2,em que a dita forma pronta para uso é uma seringa pré-cheia.

4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2,em que as células-tronco têm viabilidade suficiente para serem terapeutica-mente eficazes.

5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4,em que a viabilidade das células-tronco é maior do que 40%.

6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,em que a dita solução biocompatível é solução salina.

7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,em que a dita solução biocompatível compreende ainda um agente antimi-crobiano, agente antibacteriano ou outro agente farmacêutico.

8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,em que a composição compreende uma quantidade terapeuticamente eficazde progenitores de célula-tronco hematopoiética.

9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,em que a composição compreende uma quantidade terapeuticamente eficazde progenitores de célula-tronco neuronal.

10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,em que a composição compreende uma quantidade terapeuticamente eficazde progenitores de célula-tronco hematopoiética e progenitores de célula-tronco neuronal.

11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,em que a composição compreende uma quantidade terapeuticamente eficazde progenitores de célula-tronco mesenquimal.

12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,em que a composição compreende uma quantidade terapeuticamente eficazde progenitores de célula-tronco de produção de insulina.

13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,em que a composição compreende uma quantidade terapeuticamente eficazde progenitores de célula-tronco hepatocítica.

14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,em que a composição compreende uma quantidade terapeuticamente eficazde progenitores de célula-tronco cardíaca.

15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,em que a composição compreende uma quantidade terapeuticamente eficazde progenitores de célula-tronco epitelial.

16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8,em que a quantidade terapeuticamente eficaz de progenitores de célula-tronco hematopoiética na composição é cerca de 750.000 a cerca de 160milhões de células.

17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 9,em que a quantidade terapeuticamente eficaz de células-tronco neuronais nacomposição é cerca de 750.000 a cerca de 160 milhões de células.

18. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,em que a quantidade terapeuticamente eficaz de células hES e/ou seus de-rivados é cerca de 750.000 a cerca de 160 milhões de células em cerca de-0,25 ml a cerca de 100 ml da solução biocompatível.

19. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,em que a quantidade terapeuticamente eficaz de células hES e/ou seus de-rivados é 750.000 a cerca de 80 milhões de células em cerca de 0,25 ml acerca de 10 ml da solução biocompatível.

20. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,em que as doenças, distúrbios ou condições são selecionados do grupo con-sistindo em câncer, derrame, distúrbios genéticos, distúrbios hepáticos, dis-túrbios desenvolvimentais, distúrbios degenerativos, distúrbios familiares oudistúrbios traumáticos do sistema nervoso, distúrbios vasculares, doenças edistúrbios de pele, distúrbios auto-imunes, distúrbios do olho, distúrbios re-nais, distúrbios cardíacos, distúrbios músculo-esqueletais, distúrbios repro-dutores e de fertilidade, e artrite e distúrbios sangüíneos.

21. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,em que as doenças, distúrbios ou condições são selecionados do grupo con-sistindo em Leucemia Mielóide Aguda, Adenocarcinoma, Artrite, Astrocitoma,Atrofia do Nervo Auditivo, Autismo, Distúrbios Auto Imunes, Mal de Alzhei-mer, Espondilite Anquilosante1 Distrofia Muscular de Becker, Dano Cerebral,Queimaduras, Acidente vascular cerebral, Paralisia Cerebral, Coma, ÚlcerasCorneanas, Rejeição de Enxerto Corneano, Degeneração Córtico-Basal doSistema Nervoso, Doença da Artéria Coronária, Diabetes, Demência, Sin-drome de Down, Distrofia Muscular de Duchenne, Doença Renal de EstágioTerminal, Paralisia de Erb, Distrofia Muscular Fascio Escapular, Distúrbiosde Fertilidade, Ataxia de Friedereich, Falência Cardíaca, Carcinoma HepatoCelular, Doença do Neurônio Espino Motor Hereditária, Coréia de Hunting-ton, Doença de Krabbe, Distrofia Tipo Cintura, Cirrose Hepática, Degenera-ção Macular, Retardo Mental, Esclerose Múltipla, Doença do Neurônio Mo-tor, Infarto do Miocárdio, Síndrome Nefrótica, Doença de Niemann Pick, Ul-ceração Não-cicatrizante da Pele, Atrofia Olivo-Ponto Cerebelar, Atrofia doNervo Ótico, Doença de Parkinson, Encefalopatia Pós-Choque Elétrico, En-cefalopatia Pós-Vacina da Raiva, Úlceras de Pressão, Paralisia Supranucle-ar Progressiva, Psoríase, Pthysis Bulbi, Cardiomiopatia Restritiva, RetinitePigmentosa, Bloqueio de Ramo Direito, Sarcoidose, Bradicardia Sinusal,Tumor do Cordão Espinhal, Distrofia Muscular Espinhal, Ataxia Espino Ce-rebelar, Síndrome de Steven Johnson, Lúpus Eritematoso Sistêmico, Trom-bocitopenia, Talassemia, Colite Ulcerativa, Estado Vegetativo, Fibrose Císti-ca, Doença Pulmonar Intersticia!, Azoospermia, Falência Ovariana Primária,Úlceras Aftosas, Desequilíbrio Hormonal, Osteoartrite1 Síndrome de HornereOsteogênese Imperfeita, Canalopatia e Hipogamaglobulinemia.

22. Composição de matéria compreendendo células hES e/ouseus derivados, as ditas células hES e/ou seus derivados sendo livres de5 produtos animais, células nutrientes, fatores de crescimento, fator de inibiçãode leucemia, fator de crescimento de fibroblasto, fator steel associado àmembrana e/ou fator steel solúvel ou meios condicionados, em que as ditascélulas hES e/ou seus derivados são aprisionados em uma estrutura ou ma-triz seletivamente permeável, biocompatível.

23. Composição de matéria de acordo com a reivindicação 22,em que as células hES e/ou seus derivados compreendem progenitores decélula-tronco hematopoiética.

24. Composição de matéria de acordo com a reivindicação 22,em que as células hES e/ou seus derivados compreendem progenitores decélula-tronco neuronal.

25. Composição de matéria de acordo com a reivindicação 22,em que as células hES e/ou seus derivados compreendem uma combinaçãode progenitores de células-tronco hematopoiéticas e célula-tronco neuronal.

26. Composição de matéria de acordo com a reivindicação 22,em que a estrutura ou matriz seletivamente permeável, biocompatível, é se-lecionada do grupo consistindo em biopolímeros, polipeptídeos, proteínas,polissacarídeos, fibronectina, colágeno, laminina, queratina, fibrina, fibrino-gênio, ácido hialurônico, sulfato de heparina, sulfato de condroitina, agarosee gelatina.

27. Composição de matéria de acordo com a reivindicação 22,em que as células hES e/ou seus derivados são aprisionados em uma mistu-ra de agarose e colágeno ou uma mistura de agarose e gelatina.

28. Método para isolamento de células hES compreendendo:a) coleta de um embrião de 2 a 7 dias de vida em meio essencialmínimo.b) isolamento de células hES do embrião através de meios me-cânicos.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o ditoembrião é um embrião de 2 dias de vida.

30. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o ditomeio mecânico é agitação.

31. Método de expansão de células hES livres de produtos ani-mais, células nutrientes, fatores de crescimento, fator inibidor de leucemia,combinações minerais suplementares, suplementos de aminoácido, suple-mentos de vitamina, fator de crescimento de fibroblasto, fator steel associa-do à membrana, fator steel solúvel e meios condicionados, compreendendoas etapas de:(a) introdução de células hES em um meio de cultura de célulaconsistindo em meio essencial mínimo, um agonista de progestina e um degonadotropina coriônica β-humana (PhCG); e(b) incubação das células-tronco em uma temperatura de cercade 34°C a cerca de 38°C em um ambiente de cerca de 3,5% a cerca de 6%de dióxido de carbono por cerca de 12 horas a cerca de 48 horas.

32. Método de expansão de células hES de acordo com a reivin-dicação 31, em que o dito meio de cultura celular é RPMI.

33. Método de expansão de células hES de acordo com a reivin-dicação 31, compreendendo ainda:(c) obtenção de uma alíquota de células-tronco incubadas daetapa (b) em que a dita alíquota contém pelo menos uma célula-tronco,(d) ressuspensão das células no meio de cultura celular juntocom progesterona e PhCG para a alíquota,(e) diluição das células em meio de cultura sem agonista de pro-gestina e phCG, e(f) incubação das células em uma temperatura de cerca de 34°Ca cerca de 38°C em um ambiente de cerca de 3,5% a cerca de 6% de dióxi-do de carbono por cerca de 12 horas a cerca de 48 horas.

34. Método de expansão de células hES de acordo com a reivin-dicação 31, em que a dita incubação é realizada em uma incubadora de cul-tura de célula revestida com água.

35. Método de expansão de células hES de acordo com a reivin-dicação 31, em que as ditas células-tronco em meio de cultura são incuba-das em um recipiente biocompatível sob condições substancialmente anae-róbicas.

36. Método de expansão de células hES de acordo com a reivin-dicação 35, em que as ditas células-tronco não diferenciam em proliferação.

37. Método de expansão de células hES de acordo com a reivin-dicação 31, em que as células hES usadas são isoladas de um embrião de 3dias de vida através de meios mecânicos.

38. Método de expansão de células hES de acordo com a reivin-dicação 31 compreendendo ainda a etapa de teste das células-tronco ex-pandidas quanto a qualquer contaminação.

39. Método de expansão de células hES de acordo com a reivin-dicação 31, em que o dito processo de cultura é realizado em recipientesbiocompatíveis.

40. Método de expansão de células hES de acordo com a rei-vindicação 31, em que a razão da alíquota de células-tronco incubadas parameio celular é cerca de 1:3,5 a cerca de 1:35.

41. Método de expansão de células hES de acordo com a rei-vindicação 31, em que a dita incubação é realizada em ambiente substanci-almente anaeróbico.

42. Método de expansão de células hES de acordo com a rei-vindicação 31, em que a dita incubação é realizada em recipiente biocompa-tível em que o volume é quase completamente ocupado pelo meio e o reci-piente é mantido em uma posição vertical.

43. Método de parcialmente diferenciar células hES livres deprodutos animais, células nutrientes, fatores de crescimento, fator inibidor deleucemia, combinações minerais suplementares, suplementos de amihoáci-do, suplementos de vitamina, fator de crescimento de fibroblasto, fator steelassociado à membrana, fator steel solúvel e meios condicionados compre-endendo as etapas de:(a) introdução de células hES em um meio de cultura consistin-do em meio essencial mínimo; e(b) incubação das células-tronco em uma temperatura de cercade 34°C a cerca de 38°C em um ambiente de cerca de 3,5% a cerca de 6%de dióxido de carbono por cerca de 12 horas a cerca de 48 horas.

44. Método de parcialmente diferenciar células hES de acordocom a reivindicação 43, em que o dito meio de cultura celular é RPMI ouDMEM.

45. Método de parcialmente diferenciar células hES de acordocom a reivindicação 43, em que a dita incubação é realizada em uma incu-badora de cultura de célula revestida com água.

46. Método de parcialmente diferenciar células hES de acordocom a reivindicação 43, em que as ditas células-tronco em meio de culturasão incubadas em um recipiente biocompatível sob condições substancial-mente aeróbicas.

47. Método de parcialmente diferenciar células hES de acordocom a reivindicação 46, em que as ditas células-tronco diferenciam em proli-feração.

48. Método de parcialmente diferenciar células hES de acordocom a reivindicação 43, compreendendo ainda a etapa de teste das células-tronco expandidas quanto a qualquer contaminação.

49. Método de parcialmente diferenciar células hES de acordocom a reivindicação 43, em que o dito processo de cultura é realizado emrecipientes biocompatíveis.

50. Método de parcialmente diferenciar células hES de acordocom a reivindicação 43, em que a razão da alíquota de células-tronco incu-badas para o meio celular é cerca de 1:3,5 a cerca de 1:35.

51. Método de parcialmente diferenciar células hES de acordocom a reivindicação 43, em que a dita incubação é realizada em ambientesubstancialmente aeróbico.

52. Método de parcialmente diferenciar células hES de acordocom a reivindicação 51, em que a dita incubação é realizada em recipientebiocompatível e o recipiente é mantido em uma posição horizontal.

53. Processo de preparação de uma preparação pronta para usode células hES e/ou seus derivados para transplante humano compreenden-do:(a) obtenção de células hES livres de produtos animais, célulasnutrientes, fatores de crescimento, fator inibidor de leucemia, combinaçõesminerais suplementares, suplementos de aminoácido, suplementos de vita-mina, fator de crescimento de fibroblasto, fator steel associado à membrana,fator steel solúvel e meios condicionados,(b) centrifugação das ditas células-tronco para obter um pélete,e(c) suspensão do pélete em uma solução biocompatível.

54. Processo de preparação de uma preparação pronta para usode células hES e/ou seus derivados para transplante humano de acordo coma reivindicação 53, compreendendo ainda:(d) armazenamento da preparação em cerca de -15°C a cercade -72°C,(e) descongelamento da preparação armazenada naturalmenteantes do transplante, em que a viabilidade das células é pelo menos 40% nodescongelamento.

55. Processo de preparação de uma preparação pronta para usode células hES e/ou seus derivados para transplante humano de acordo coma reivindicação 53 ou 54, compreendendo ainda teste da preparação quantoa qualquer contaminação antes do transplante.

56. Processo de preparação de uma preparação pronta para usode células hES e/ou seus derivados para transplante humano de acordo coma reivindicação 53, em que as células hES e/ou seus derivados obtidos em(a) são produzidos através dos métodos de acordo com a reivindicação 31ou 45.

57. Método de armazenamento de uma preparação de célulashES e/ou seus derivados em uma condição viável compreendendo:(a) obtenção da preparação de células hES e/ou seus derivadospreparados através do método de acordo com a reivindicação 31 ou 45,(b) adição de um agente de criopreservação, e(c) congelamento das células em cerca de -15 a cerca de -72°C.

58. Método de armazenamento de uma preparação de célulashES e/ou seus derivados de acordo com a reivindicação 57, em que a razãodá quantidade do dito agente de criopreservação para aquela do meio decultura é de a partir de cerca de 1:5000 a cerca de 16:1000.

59. Método de armazenamento de uma preparação de célulashES e/ou seus derivados de acordo com a reivindicação 57, em que o ditoarmazenamento é em um recipiente biocompatível.

60. Método de armazenamento de uma preparação de célulashES e/ou seus derivados de acordo com a reivindicação 57, em que as célu-las são congeladas em cerca de -18 a cerca de -20°C.

61. Método de tratamento de uma doença, distúrbio ou condiçãoem um indivíduo compreendendo administrar ao dito indivíduo uma quanti-dade terapeuticamente eficaz de células hES e/ou seus derivados, as ditascélulas sendo livres de produtos animais, células nutrientes, fatores de cres-cimento, fator inibidor de leucemia, fator de crescimento de fibroblasto oumeios condicionados.

62. Método de acordo com a reivindicação 61, em que as célu-las hES e/ou seus derivados são produzidos através do método de acordocom a reivindicação 31 ou 45.

63. Método de acordo com a reivindicação 61, em que a doença,distúrbio ou condição é selecionado do grupo consistindo em câncer, derra-me, distúrbios genéticos, distúrbios hepáticos, distúrbios desenvolvimentais,distúrbios degenerativos, distúrbios familiares ou distúrbios traumáticos dosistema nervoso, distúrbios vasculares, doenças e distúrbios de pele, distúr-bios auto-imunes, distúrbios do olho, distúrbios renais, distúrbios cardíacos,distúrbios músculo-esqueletais, distúrbios reprodutores e de fertilidade, artri-te e distúrbios sangüíneos.

64. Método de acordo com a reivindicação 63, em que os distúr-bios do sistema nervoso são distúrbios do sistema nervoso desenvolvimen-tais selecionados do grupo consistindo em Autismo, Paralisia Cerebral, Para-Iisia de Erb, Retardo Mental e Paralisia Supranuclear Progressiva.

65. Método de acordo com a reivindicação 63, em que os distúr-bios do sistema nervoso central são distúrbios do sistema nervoso degene-rativos selecionados do grupo consistindo em Mal de Alzheimer, Degenera-ção Corticobasal, Surdez (Atrofia do Nervo Auditivo), Demência, Ataxia deFriedereich, Doença do Neurônio Motor, Esclerose Múltipla, Atrofia OlivoPonto Cerebelar, Doença de Parkinson e Ataxa Espino Cerebelar.

66. Método de acordo com a reivindicação 63, em que os distúr-bios do sistema nervoso central são traumas do sistema nervoso seleciona-dos do grupo consistindo em Dano Cerebral, Coma, Encefalopatia Pós-Choque Elétrico, Encefalopatia Pós-Vacina Contra a Raiva, Dano ou Lesãoao Cordão Espinhal e Estado Vegetativo.

67. Método de acordo com a reivindicação 63, em que os distúr-bios do sistema nervoso são Acidente vascular cerebral ou Derrame.

68. Método de acordo com a reivindicação 63, em que os distúr-bios do sistema nervoso são condições familiares selecionadas do grupoconsistindo em Doença do Neurônio Espino Motor Hereditária e Coréia deHuntington.

69. Método de acordo com a reivindicação 63, em que os distúr-bios hepáticos e renais são selecionados do grupo consistindo em CirroseHepática, Doença Renal de Estágio Terminal, Síndrome Nefrótica e Doençade Niemann Pick.

70. Método de acordo com a reivindicação 63, em que os distúr-bios de pele são selecionados do grupo consistindo em Artrite, Arteriosclero-se, Queimaduras, Úlceras de Não-cicatrização, Úlceras de Pressão, Psoría-se, Lúpus Eritematoso Sistêmico e Sarcoidose.

71. Método de acordo com a reivindicação 63, em que os distúr-bios auto-imunes são selecionados do grupo consistindo em Trombocitope-nia, Lúpus Eritematoso Sistêmico, Sarcoidose e Colite Ulcerativa.

72. Método de acordo com a reivindicação 63, em que os distúr-bios genéticos são selecionados do grupo consistindo em Síndrome deDown, Espondilite Anquilosante, Talassemia e Coréia de Huntington.

73. Método de acordo com a reivindicação 63, em que os distúr-bios dos olhos são selecionados do grupo consistindo em Atrofia do NervoÓtico, Pthysis Bulbi, Degeneração Macular, Retinite Pigmentosa1 AbrasãoCorneana, Rejeição de Enxerto Corneano e Úlceras Corneanas.

74. Método de acordo com a reivindicação 63, em que os distúr-bios músculo-esqueletais são selecionados do grupo consistindo em Distro-fia Muscular de Duchenne, Distrofia Muscular Fascio Escapular, Distrofia doTipo Cintura, Atrofia Muscular Espinhal e Distrofia Muscular de Becker.

75. Método de acordo com a reivindicação 63, em que os distúr-bios cardíacos são selecionados do grupo consistindo em Infarto do Miocár-dio, Bloqueio de Ramo Direito, Cardiomiopatia Restritiva, Falência Cardíaca,Bradicardia Sinusal e Doença da Artéria Coronária.

76. Método de acordo com a reivindicação 63, em que os esta-dos oncológicos são selecionados do grupo consistindo em Leucemia Mié-lóide Aguda, Adenocarcinoma da Glândula Adrenal, Astrocitoma, CarcinomaHepatocelular e Tumor do Cordão Espinhal.

77. Método de acordo com a reivindicação 63, em que a doençaé Diabetes Mellitus.

78. Método para tratamento de um indivíduo com uma doença,distúrbio ou condição compreendendo administrar uma quantidade terapeu-ticamente eficaz de células hES e/ou seus derivados culturados em meioslivres de produtos animais, células nutrientes, meios condicionados, fatoresde crescimento, fator de inibição de leucemia, fator de crescimento de fibro-blasto, fator steel associado à membrana ou fator steel solúvel, através deinjeção intramuscular ou injeção intravenosa ou injeção epidural ou cateterepidural ou injeção retrobulbar ou injeção subcutânea ou injeção intracardía-ca ou injeção intracística ou injeção intratecal ou através de aplicação tópicaou aplicação intralesional ou infusão intravenosa ou através de nebulizadorou através de spray ou vias intravaginais ou através de gotas para o olho eouvido locais.

79. Método de acordo com a reivindicação 78, em que as célu-las hES e/ou seus derivados são produzidos através do método de acordocom a reivindicação 31 ou 45.

80. Método para tratamento de um indivíduo com uma doença,distúrbio ou condição de acordo com a reivindicação 78, em que a quantida-de terapeuticamente eficaz de células hES e/ou seus derivados é cerca de-750.000 a cerca de 160 milhões de células.

81. Método para tratamento de um indivíduo com uma doença,distúrbio ou condição de acordo com a reivindicação 78, em que as célulashES e/ou seus derivados compreendem progenitores de célula-tronco hema-topoiética, progenitores de célula-tronco neuronal, progenitores de célula-tronco mesenquimal, progenitores de célula-tronco epitelial, progenitores decélula-tronco renal, progenitores de célula-tronco cardíaca ou progenitoresde célula-tronco hepática ou suas combinações.

82. Método para tratamento de um indivíduo com uma doença,distúrbio ou condição de acordo com a reivindicação 78, em que a doença éselecionada do grupo consistindo em câncer, derrame, distúrbios genéticos,distúrbios hepáticos, distúrbios desenvolvimentais, distúrbios degenerativos,distúrbios familiares ou distúrbios traumáticos do sistema nervoso, distúrbiosvasculares, doenças e distúrbios de pele, distúrbios auto-imunes, distúrbiosdo olho, distúrbios renais, distúrbios cardíacos, distúrbios músculo-esqueletais, distúrbios reprodutores e de fertilidade, artrite e distúrbios san-güíneos.

83. Método para tratamento de um indivíduo com uma doença,distúrbio ou condição de acordo com a reivindicação 78. em que a doença,distúrbio ou condição é selecionado do grupo consistindo em Leucemia Mie-lóide Aguda, Adenocarcinoma, Artrite, Astrocitoma, Atrofia do Nervo Auditi-vo, Autismo, Distúrbios Auto-Imunes, Mal de Alzheimer, Espondilite Anquilo-sante, Distrofia Muscular de Becker, Dano Cerebral, Queimaduras, Acidentevascular cerebral, Paralisia Cerebral, Coma, Úlceras Corneanas, Rejeiçãode Enxerto Corneano, Degeneração Córtico-Basal do Sistema Nervoso, Do-ença da Artéria Coronária, Diabetes, Demência, Síndrome de Down, Distro-fia Muscular de Duchenne, Doença Renal de Estágio Terminal, Paralisia deErb, Distrofia Muscular Fascio Escapular, Distúrbios de Fertilidade, Ataxia deFriedereich, Falência Cardíaca, Carcinoma Hepato Celular, Doença do Neu-rônio Espino Motor Hereditária, Coréia de Huntington, Doença de Krabbe,Distrofia Tipo Cintura, Cirrose Hepática, Degeneração Macular, RetardoMental, Esclerose Múltipla, Doença do Neurônio Motor, Infarto do Miocárdio,Síndrome Nefrótica, Doença de Niemann Pick, Ulceração Não-cicatrizanteda Pele, Atrofia Olivo-Ponto Cerebelar, Atrofia do Nervo Ótico, Doença deParkinson, Encefalopatia Pós-Choque Elétrico, Encefalopatia Pós-Vacina daRaiva, Úlceras de Pressão, Paralisia Supranuclear Progressiva, Psoríase,Pthysis Bulbi, Cardiomiopatia Restritiva, Retinite Pigmentosa, Bloqueio deRamo Direito, Sarcoidose, Bradicardia Sinusal, Tumor do Cordão Espinhal,Distrofia Muscular Espinhal, Ataxia Espino Cerebelar, Síndrome de StevenJohnson, Lúpus Eritematoso Sistêmico, Trombocitopenia, Talassemia, ColiteUlcerativa, Estado Vegetativo, Fibrose Cística, Doença Pulmonar Intersticial,Azoospermia1 Falência Ovariana Primária, Úlceras Aftosas, DesequilíbrioHormonal, Osteoartrite, Síndrome de Horner e Osteogênese Imperfeita, Ca-nalopatia e Hipogamaglobulinemia.

84. Método para tratamento de um indivíduo com uma doença,distúrbio ou condição de acordo com a reivindicação 78, em que a adminis-tração de células hES e/ou seus derivados não causa tumores, teratomas oumudanças cromossomais.

85. Método para o tratamento de Lesão ao Cordão Espinhal(CSI) de um indivíduo compreendendo:(a) administração de cerca de 750.000 a cerca de 80 milhões decélulas hES e/ou seus derivados através de injeção subcutânea;(b) repetição da etapa (a) após um período predeterminado e emseguida administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de célu-las hES e/ou seus derivados através de injeção intramuscular;(c) administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz decélulas hES e/ou seus derivados, em que as ditas células compreendemprogenitores de célula-tronco neuronal e progenitores de célula-tronco he-matopoiética, através de injeção intravenosa ou infusão;(d) administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz decélulas hES e/ou seus derivados, em que as ditas células compreendemprogenitores de célula-tronco neuronal, através de injeção epidural e repeti-ção da dita dose após um período predeterminado dependendo da condiçãodo indivíduo conforme avaliado através de exame clínico e/ou neurológico;(e) administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz decélulas hES e/ou seus derivados, em que as ditas células compreendemprogenitores de célula-tronco neuronal, através de injeção caudal;(f) administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz decélulas hES e/ou seus derivados, em que as ditas células compreendemprogenitores de célula-tronco neuronal através de injeção intratecal ou umcateter de bloqueio araquinóide;(g) administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz decélulas hES e/ou seus derivados, em que as ditas células compreendemprogenitores de célula-tronco neuronal através de injeção epidural ou cateterepidural;(h) administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz decélulas hES e/ou seus derivados através de injeção espinhal profunda emqualquer lado da espinha; e(i) administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz decélulas hES e/ou seus derivados através de infusão intravenosa;em que as etapas (a) e (b) são realizadas primeiro e as etapasrestantes podem ser realizadas em qualquer ordem.

86. Método de acordo com a reivindicação 85, compreendendoainda a etapa (f) seguido pela etapa (g), até que o indivíduo exiba sinais clí-nicos de recuperação do dito SCI.

87. Método de acordo com a reivindicação 85, em que as célu-las hES e/ou seus derivados são produzidos através do método de acordocom a reivindicação 31 ou 45.

88. Método de tratamento de SCI de acordo com a reivindicação-85, em que cerca de 750.000 a cerca de 80 milhões de células hES e/ouseus derivados, em que as células compreendem progenitores de célula-tronco hematopoiética e progenitores de célula-tronco neuronal, são suspen-sas em 0,25 a 1,0 ml de uma solução biocompatível na etapa (a) e na etapa (b).

89. Método de tratamento de SCI de acordo com a reivindicação-85, em que cerca de 750.000 a cerca de 11 milhões de células hES e/ouseus derivados, em que as ditas células compreendem progenitores de célu-la-tronco hematopoiética e progenitores de célula-tronco neuronal, são sus-pensas em 2,0 a 4,0 ml de uma solução biocompatível na etapa (f).

90. Método de tratamento de SCI de acordo com a reivindicação-85, em que cerca de 750.000 a cerca de 80 milhões de células hES e/ouseus derivados, em que as ditas células compreendem progenitores de célu-la-tronco hematopoiética e progenitores de célula-tronco neuronal, são sus-pensas em 15 a 40 ml de uma solução biocompatível na etapa (g).

91. Método de acordo com a reivindicação 85, em que o dito tra-tamento de indivíduos com SCI resulta na melhora de úlceras de leito.

92. Método para o tratamento de distúrbios do sistema nervosodesenvolvimentais, degenerativos, familiares e traumáticos e ataque cere-brovascular compreendendo administrar cerca de 750.000 a cerca de 160milhões de células hES e/ou seus derivados, em que as ditas células com-preendem progenitores de célula-troco neuronal e/ou progenitores de célula-tronco hematopoiética, através de injeção intravenosa, injeção subcutânea,injeção intramuscular, injeção intratecal, infusão de cateter epidural ou infu-são de cateter de bloqueio aracnóide.

93. Método para tratamento de distúrbios de pele compreenden-do administrar cerca de 750.000 a cerca de 160 milhões de células hES e/ouseus derivados, em que as ditas células compreendem progenitores de célu-la-tronco hematopoiética, através de injeção subcutânea ou intravenosa.

94. Método para tratamento de acordo com a reivindicação 93,em que as ditas células hES e/ou progenitores são misturados em um carre-ador biocompatível a ser aplicado à pele danificada.

95. [Claim missing on original document]

96. [Claim missing on original document]

97. [Claim missing on original document]

98. Método para tratamento de acordo com a reivindicação 94,em que o dito carreador biocompatível é um gel, unguento, pasta ou sprayaerossol.95. Método para tratamento de úlceras de leito compreendendoadministrar cerca de 750.000 a cerca de 80 milhões de células hES e/ouseus derivados através de aplicação local ou tópica e através de injeção in-tramuscular.96. Método para tratamento de distúrbios auto-imunes compre-endendo administrar cerca de 750.000 a cerca de 160 milhões de célulashES e/ou seus derivados através de injeção intramuscular, injeção intrave-nosa, injeção subcutânea, injeção intra-articular ou infusão intravenosa ousuas combinações.97. Método para tratamento de distúrbios genéticos compreen-dendo administrar cerca de 750.000 a cerca de 160 milhões de células hESe/ou seus derivados, em que as ditas células compreendem progenitores decélula-tronco neuronal e/ou progenitores de célula-tronco hematopoiética,através de injeção intravenosa, injeção subcutânea, injeção intramuscular,injeção intratecal, infusão de cateter epidural ou infusão de cateter de blo-queio aracnóide ou suas combinações.98. Método para tratamento de gangrena compreendendo admi-nistrar cerca de 750.000 a cerca de 160 milhões de células hES e/ou seusderivados através de injeção intravenosa, injeção intramuscular ou aplicaçãolocal na junção de tecido viável e morto ou suas combinações.

99. Método para tratamento de condições associadas com enve-lhecimento compreendendo administrar cerca de 750.000 a cerca de 160milhões de células hES e/ou seus derivados através de injeção intravenosa,injeção subcutânea, injeção intramuscular, aplicação local em suspensão oumisturada em um carreador biocompatível.

100. Método para tratamento de acordo com a reivindicação-102, em que o dito carreador biocompatível é um gel, unguento, pasta ouspray aerossol.

101. Método para o tratamento de Diabetes Mellitus compreen-dendo administração de cerca de 750.000 a cerca de 160 milhões de célulasprogenitoras de produção de insulina embriônicas humanas através de inje-ção intravenosa ou intramuscular ou ambas.

102. Método para tratamento de Distúrbios Cardiovascularescompreendendo administrar cerca de 750.000 a cerca de 160 milhões decélulas hES e/ou seus derivados, em que as ditas células compreendem pro-genitores de célula-tronco hematopoiética, através de injeção intravenosa,injeção subcutânea, injeção intramuscular, injeção intracardíaca, angiografia,ou injeção direta, ou suas combinações.

103. Método de tratamento de Distúrbios Cardiovasculares deacordo com a reivindicação 103, em que a dita administração é durante an-giografia.

104. Método para tratamento de Distúrbios Hepáticos e Renaiscompreendendo administração de cerca de 750.000 a cerca de 160 milhõesde células hES e/ou seus derivados, em que as ditas células compreendemprogenitores de célula-tronco hematopoiética, progenitores de célula-troncode produção de albumina e progenitores de célula-tronco de produção debilirrubina, através de injeção intravenosa, injeção subcutânea, injeção in-tramuscular, infusão intravenosa, ou injeção local, ou suas combinações.

105. Método para o tratamento de Distúrbios de Fertilidade eReprodutivos compreendendo administrar cerca de 750.000 a cerca de 160milhões de células hES e/o seus derivados, em que as ditas células compre-endem progenitores de célula-tronco hematopoiética, através de injeção in-tramuscular local, injeção intratesticular ou através de injeção de pele subcu-tânea próximo ao epidídimo, ou suas combinações.

106. Método para o tratamento de Distúrbios Músculo-esqueletais compreendendo administrar administração de cerca de 750.000a cerca de 160 milhões de células hES e/ou seus derivados, em que as ditascélulas compreendem progenitores de célula-tronco neuronal e/ou progenito-res de célula-tronco hematopoiética, através de injeção intravenosa, injeçãosubcutânea, injeção intramuscular, ou infusão de cateter intravenoso, ou su-as combinações.

107. Método para o tratamento de Distúrbios do Olho compre-endendo administrar cerca de 750.000 a cerca de 160 milhões de célulashES e/ou seus derivados, em que as ditas células compreendem progenito-res de célula-tronco neuronal, progenitores de célula-tronco hematopoiéticae/ou progenitores de célula-tronco mesenquimal, através de injeção intrave-nosa local, injeção subcutânea, injeção intramuscular, injeção retrobulbar,injeção intravítrea ou aplicação tópica, ou suas combinações.

108. Método para o tratamento de Distúrbios do Olho de acordocom a reivindicação 107, em que cerca de 750.000 a cerca de 160 milhõesde células hES e/ou seus derivados, em que as ditas células compreendemprogenitores de célula-tronco neuronal, são administradas através de injeçãoretrobulbar.

109. Método para o tratamento de Distúrbios do Olho de acordocom a reivindicação 107, em que cerca de 750.000 a cerca de 160 milhõesde células hES e/ou seus derivados, em que as ditas células compreendemprogenitores de célula tronco neuronal, são administradas através de injeçãointravítrea.

110. Método para o tratamento de Distúrbios do Olho de acordocom a reivindicação 107, em que cerca de 750.000 a cerca de 160 milhõesde células hES e/ou seus derivados, em que as ditas células compreendemprogenitores de célula-tronco mesenquimal, são aplicadas a lentes de conta-to para o tratamento de abrasão da córnea.

111. Método para o tratamento de Distúrbios Pulmonares com-preendendo administrar cerca de 750.000 a cerca de 160 milhões de célulashES e/ou seus derivados, em que as ditas células compreendem progenito-res de célula-tronco neuronal e/ou progenitores de célula-tronco hematopoié-tica, através de injeção intramuscular, injeção intravenosa, spray ou nebuli-zador, ou suas combinações.

112. Método para o tratamento de Distúrbios Hormonais com-preendendo administrar cerca de 750.000 a cerca de 160 milhões de célulashES e/ou seus derivados, em que as ditas células compreendem progenito-res de célula-tronco neuronal e/ou progenitores de célula-tronco hematopoié-tica, através de injeção intramuscular ou injeção intravenosa, ou suas com-binações.

113. Método para o tratamento de Úlceras Aftosas compreen-dendo administrar cerca de 750.000 a cerca de 160 milhões de células hESe/ou seus derivados, em que as ditas células compreendem progenitores decélula-tronco neuronal e/ou progenitores de célula-tronco hematopoiética,através de injeção intramuscular ou injeção intravenosa, ou suas combinações.

114. Método para o tratamento de Osteoartrite do joelho e juntado quadril compreendendo administrar cerca de 750.000 a cerca de 160 mi-lhões de células hES e/ou seus derivados, em que as ditas células compre-endem progenitores de célula-tronco neuronal e/ou progenitores de célula-tronco hematopoiética, através de injeção intramuscular, injeção intravenosa,ou injeção intra-articular, ou suas combinações.

115. Método para teste do efeito de um composto sobre célulashES e/ou seus derivados compreendendo cultura de células hES e/ou seusderivados obtidos através do método como definido na reivindicação 31 ou-45, na presença do composto e determinação do efeito do composto sobreas células.

116. Método para aplicação de um fármaco a um indivíduo com-preendendo cultura de células hES e/ou seus derivados obtidos através dométodo de acordo com a reivindicação 31 ou 45, na presença do fármaco,em que as células absorvem o fármaco, e administração das células a umsítio no indivíduo, em que o fármaco é aplicado.