BRPI0708771A2 - anticorpos anti-5t4 e usos dos mesmos - Google Patents

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Abstract

ANTICORPOS ANTI-5T4 E USOS DOS MESMOS. Anticorpos anti-5T4, conjugados de anticorpos anti-5T4 / fármaco, e métodos para preparar e usar os mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para"ANTICORPOS ANTI-5T4 E USOS DOS MESMOS".
Pedidos de Patente Relacionados
É reivindicada prioridade para o Pedido de Patente Provisóriodos Estados Unidos No. 60/891.248, arquivado em 23 de fevereiro de 2007,e para o Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. 60/781.346,arquivado em 10 de março de 2006, cada um dos quais é incorporado pormeio de referência em sua totalidade aqui, neste pedido de patente.
Campo da Invenção
A presente invenção de modo geral se refere a anticorpos anti-5T4 e conjugados de anticorpo / fármaco (isto é, imunoconjugados) para odiagnóstico e/ou tratamento de distúrbios neoplásicos ou malignos. Apresente invenção também se refere a ácidos nucléicos e polipeptídeos deregiões variáveis isolados para preparar anticorpos anti-5T4 e conjugados deanticorpo / fármaco.
Antecedentes da Invenção
A disponibilidade de anticorpos monoclonais de alta afinidadepossibilitou o desenvolvimento de imunoterapias direcionadas. De acordocom esta abordagem, um agente terapêutico é acoplado a um anticorpo comespecificidade de ligação para uma população celular alvo definida. Agentesterapêuticos que foram conjugados a anticorpos monoclonais incluemcitotoxinas, modificadores da resposta biológica, enzimas (por exemplo,ribonucleases), proteínas indutoras de apoptose e peptídeos, eradioisótopos. Conjugados de anticorpo / citotoxina são referidos de modogeral como imunocitotoxinas. Anticorpos acoplados a fármacos de baixopeso molecular tais como metotrexato são tipicamente denominadosconjugados de quimioanticorpo / fármaco. Conjugados descritos comoimunomoduladores contêm modificadores da resposta biológica tais comolinfocinas, fatores de crescimento, e fator de veneno de cobra ativador docomplemento (CVF). Anticorpos radiorrotulados incluem isótoposradioativos que podem ser usados para radioterapia bem como estudo porimagens.A liberação de fármacos mediada por anticorpos para célulastumorais aumenta a eficácia dos fármacos minimizando sua captação emtecidos normais. Vide, por exemplo, Reff et al. (2002) Câncer Control 9:152-66; Sievers (2000) Câncer Chemother. PharmacoL 46 Suppl:S18-22;Goldenberg (2001) Crit. Rev. Oncoi Hematol. 39:195-201. MYLOTARG®(gemtuzumab ozogamicin) é uma imunoterapia direcionada disponívelcomercialmente que age de acordo com este princípio e a qual é aprovadapara o tratamento de leucemia mielóide aguda em pacientes idosos. VideSievers et al. (1999) Blood 93: 3678-84. Neste caso, a molécula alvo é umanticorpo monoclonal anti-CD33 que é conjugado a caliqueamicina.
Não obstante, a imunoterapia direcionada a seres humanos temsido limitada, em parte devido a reações adversas a anticorpos monoclonaisnão-humanos. Provas clínicas anteriores usando anticorpos de roedoresrevelaram reações de anticorpos humanos anticamundongo (HAMA) eanticorpos humanos anti-rato (HARA), as quais resultam em rápido"clearance" de anticorpos. Desde então têm sido desenvolvidos anticorposmenos imunogênicos, inclusive anticorpos quiméricos, anticorposhumanizados, anticorpos PRIMATIZED®, e anticorpos humanos preparadosusando bibliotecas de display de fago ou camundongos transgênicos. VideMorrison et al. (1984) Proc. NatL Acad. Sei. USA 81:6851-5; Queen et al.(1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029-33; Newman et al. (1992)Biotechnology (NY) 10:1455-60; Green et al. (1994) Nat. Genet. 7:13-21; eMarks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-97. A evitação de uma reação deHAMA permite a administração de alta dose e de dose repetida para obteruma resposta terapêutica.
Anticorpos candidatos para direcionamento de fármacos incluemanticorpos que reconhecem antígenos oncofetais, isto é, antígenospresentes sobre células fetais e células neoplásicas, e os quais estãolargamente ausentes de células adultas normais. Vide, por exemplo,Magdelenat (1992) J. Immunol. Methods 150: 133-43. O antígeno oncofetal5T4 é uma glicoproteína transmembrana de 72 kDa altamente glicosiladacompreendendo um núcleo de 42 kDa não-glicosilado (Hole et al. (1988) Br.J. Câncer 57: 239-46, Hole et al. (1990) Int. J. Câncer 45: 179-84;Publicação Internacional PCT No. W089/07947; Patente dos EstadosUnidos No. 5.869.053). 5T4 inclui um domínio extracelular caracterizado porduas repetições ricas em Ieucina (LRRs) e uma região hidrofílicainterveniente, a qual é um sítio acessível parqa terapia direcionada (Myers etal. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9319-24).
5T4 humano é expressado em numerosos tipos de câncer,inclusive carcinomas da bexiga, de mama, de colo uterino, de endométrio,de pulmão, de esôfago, de ovário, de pâncreas, de estômago, e detestículos, e é essencialmente ausente de tecidos normais, exceto porsinciciotrofoblasto na placenta (vide, por exemplo, Southall et al. (1990) Br.J. Câncer 61: 89-95 (distribuição imunohistológica de antígeno 5T4 emtecidos normais e malignos); Mieke et al. (1997) Clin. Câncer Res. 3: 1923-1930 (molécula de baixa adesão intercelular 1 e alta expressão de 5T4 emcélulas tumorais correlacionam com reduzida sobrevida livre de doença empacientes de carcinoma colorretal); Starzynska et al. (1994) Br. J. Câncer 69:899-902 (importância prognostica de expressão de antígeno oncofetal 5T4em carcinoma colorretal); Starzynska et al. (1992) Br. J. Câncer 66: 867-869(expressão de antígeno 5T4 em carcinoma colorretal e gástrico); Jones et al.(1990) Br. J. Câncer 61: 96-100 (expressão de antígeno 5T4 em câncercervical); Connor e Stern (199) Int. J. Câncer 46: 1029-1034 (perda deexpressão de MHC classe I em carcinomas cervicais); Ali et al. (2001) OralOncology 37: 57-64 (padrão de expressão do antígeno oncofoetal 5T4 emmucosa oral normal, displásica e maligna); Publicação Internacional PCT No.W089/07947; Patente dos Estados Unidos No. 5.869.053). Por exemplo,tecidos reportados por não terem expressão de 5T4 incluem o fígado, pele,baço, timo, sistema nervoso central (SNC), glândula adrenal, e ovário.Tecidos reportados por terem expressão focai ou baixa expressão de 5T4incluem o fígado, pele, baço, linfonodo, amígdala, tiróide, próstata, evesículas seminais. Expressão difusa fraca-moderada de 5T4 foi reportadano rim, pulmão, pâncreas, faringe, e trato gastrointestinal. O único tecidoreportado por ter alta expressão de 5T4 é sinciciotrofoblasto; 5T4 tambémestava ausente do soro normal ou do soro de mulheres grávidas (isto é,níveis < 10 ng/ml). A superexpressão de 5T4 em tumores tem sidocorrelacionada com progressão de doença, e a avaliação da expressão de5T4 tem sido sugerida como uma abordagem útil para identificar pacientescom prognóstico de curto termo (Mulder et al. (1997) Clin. Câncer Res. 3:1923-30, Naganuma et al. (2002) Anticancer Res. 22: 1033-1038,Starzynska et al. (1994) Br. J. Câncer 69: 899-902, Starzynska et al. (1998)Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 10: 479-484, Wrigley et al. (1995) Int. J.GynecoL Câncer5: 269-274).
Foram descritos vários anticorpos anti-5T4, inclusive mAb5T4,também denominado o anticorpo H8, o qual reconhece um epitopoconformacional do antígeno 5T4 (Shaw et al. (2002) Biochem. J. 363: 137-45, Publicação Internacional PCT No. W098/55607), um anticorpomonoclonal de rato (Woods et al. (2002) Biochem. J. 366: 353-65), e umanticorpo monoclonal de camundongo denominado 5T4 (Patente dosEstados Unidos No. 5.869.053). Também foram descritos anticorpos anti-5T4 de cadeia única, bem como proteínas de fusão que incluem seqüênciasde anticorpos anti-5T4 fundidas a uma molécula terapêutica. Por exemplo,seqüências de anticorpos anti-5T4 fundidas ao domínio constante de IgGIhumana ou ao domínio extracelular de B7.1 murino induz citólise delinhagens de células tumorais expressando 5T4 (Myers et al. (2002) CâncerGene Ther. 9: 884-896, Shaw et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta. 1524:238-246; Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos No.2003/0018004). Similarmente, um anticorpo anti-5T4 de cadeia únicafundido a um superantígeno pode estimular citólise, dependente de célulasT, de células de carcinoma pulmonar de células não pequenas in vitro(Forsberg et al. (2001) Br. J. Câncer 85: 129-136). Uma prova clínica fase Iusando PNU-214936, um fragmento Fab murino do anticorpo monoclonal5T4 fundido a uma enterocitotoxina A estafilocóccica de superantígenomutado (SEA), apresentou limitada toxicidade e alguma resposta anti-tumoral (Cheng et al. (2004) J. Clin. Oncoi 22(4):602-9). Como umaabordagem terapêutica alternativa, vacinas de 5T4 recombinantes tambémsão sugeridas para o tratamento de cânceres (Mulryan et al. (2002) Mol.Câncer Ther. 1: 1129-37; Publicação do Pedido de Patente do Reino UnidoNos. 2.370.571 e 2.378.704; Publicação do Pedido de Patente EuropéiaNos. EP 1.160.323 e 1.152.060).
A presente invenção proporciona novos anticorpos anti-5T4,conjugados anti-5T4 / fármaco, métodos para produzir os anticorpos econjugados de anticorpo / fármaco descritos, e métodos para seu usodiagnóstico e terapêutico.
Sumário da Invenção
A presente invenção proporciona novos anticorpos anti-5T4,conjugados dos mesmos, e métodos para usar os mesmos. Também sãoproporcionados polipeptídeos anti-5T4 isolados e ácidos nucléicos isoladoscodificando os mesmos.
Anticorpos anti-5T4 da invenção incluem anticorpos que ligamespecificamente antígeno 5T4 humano, em que o anticorpo (a) compreendeum domínio de ligação antigênica de anticorpos A1, A2, ou A3 murinos; (b)compete para ligação de 5T4 com anticorpos Α1, A2, ou A3 murinos; (c) ligaum epitopo 5T4 ligado por anticorpos Α1, A2, ou A3; ou (d) compreende umfragmento de ligação de 5T4 de um anticorpo de (a) a (c). Os anticorposanti-5T4 da invenção podem ser quiméricos, humanizados, de cadeia única,um fragmento Fab, um fragmento F(ab)2, um fragmento Fv, tetraméricos,tetravalentes, multi-específicos, domínio-específico, um anticorpo de domínioúnico, uma proteína de fusão, ou um monoclonal murino. Por exemplo,anticorpos anti-5T4 humanizados da invenção incluem anticorposcompreendendo no mínimo uma região variável de cadeia pesada ou nomínimo uma região variável de cadeia leve, em que o anticorpo humanizadoou fragmento de anticorpo: (a) compreende um domínio de ligaçãoantigênica de anticorpos Α1, A2, ou A3 murinos; (b) compete para ligação de5T4 com anticorpos Α1, A2, ou A3 murinos; (c) liga um epitopo 5T4 ligadopor anticorpos Α1, A2, ou A3; ou (d) um fragmento de ligação de 5T4 de umanticorpo de (a) a (c).
Os anticorpos anti-5T4 da invenção têm uma afinidade deligação para antígeno 5T4 humano de no mínimo cerca de 1 χ 10 7 M a cercade 1 χ 10"12 M. Os anticorpos anti-5T4 e conjugados dos mesmos descritostambém podem apresentar ligação específica tendo por alvo célulasexpressando 5T4 in vivo.
Anticorpos anti-5T4 da invenção típicos incluem anticorposcompreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo (a)uma seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-138 de SEQ ID NO: 2; (b)uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 85% idêntica aos resíduos20-138 de SEQ ID NO: 2; (c) uma seqüência de aminoácidos dos resíduos19-135 de SEQ ID NO: 6; (d) uma seqüência de aminoácidos que é nomínimo 86% idêntica aos resíduos 19-135 de SEQ ID NO: 6; (e) umaseqüência de aminoácidos dos resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 10; (f) umaseqüência de aminoácidos que é no mínimo 91% idêntica aos resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 10; (g) uma seqüência de aminoácidos de qualquer umadas SEQ ID NOs: 49, 51, 52, 54, 56, 77, 78, 81, ou 82; (h) uma seqüência deaminoácidos que é no mínimo 91% idêntica a SEQ ID NO: 51; (i) umaseqüência de aminoácidos que é no mínimo 78% idêntica a SEQ ID NO: 54;(j) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 89% idêntica a SEQ IDNO: 77; (k) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 79% idêntica aSEQ ID NO: 78; (I) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 80%idêntica a SEQ ID NO: 81; ou (m) uma seqüência de aminoácidos que é nomínimo 78% idêntica a SEQ ID NO: 82.
Anticorpos anti-5T4 da invenção típicos incluem anticorposcompreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo (a) umaseqüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 4; (b) umaseqüência de aminoácidos que é no mínimo 94% idêntica aos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 4; (c) uma seqüência de aminoácidos dos resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 8; (d) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo96% idêntica aos resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 8; (e) uma seqüência deaminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 12; (f) uma seqüência deaminoácidos que é no mínimo 98% idêntica aos resíduos 21-127 de SEQ IDNO: 12; (g) uma seqüência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ IDNOs: 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 79, 80, 83, ou 84; (h) umaseqüência de aminoácidos que é no mínimo 83% idêntica a SEQ ID NO: 60;(i) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 93% idêntica a SEQ IDNO: 70; (j) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 85% idêntica aSEQ ID NO: 76; (k) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 85%idêntica a SEQ ID NO: 76; (I) uma seqüência de aminoácidos que é nomínimo 88% idêntica a SEQ ID NO: 79; (m) uma seqüência de aminoácidosque é no mínimo 84% idêntica a SEQ ID NO: 80; (n) uma seqüência deaminoácidos que é no mínimo 90% idêntica a SEQ ID NO: 83; ou (o) umaseqüência de aminoácidos que é no mínimo 91% idêntica a SEQ ID NO: 84.
Por exemplo, um anticorpo anti-5T4 pode compreender (a) umaregião variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência deaminoácidos dos resíduos 20-138 de SEQ ID NO: 2, e uma região variávelde cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos dosresíduos 21-127 de SEQ ID NO: 4; (b) uma região variável de cadeia pesadacompreendendo uma seqüência de aminoácidos derivada dos resíduos 19-135 de SEQ ID NO: 6, e uma região variável de cadeia leve compreendendouma seqüência de aminoácidos derivada dos resíduos 23-130 de SEQ IDNO: 8; ou (c) uma região variável de cadeia pesada compreendendo umaseqüência de aminoácidos derivada dos resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 10,e uma região variável de cadeia leve compreende uma seqüência deaminoácidos derivada dos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 12.
Anticorpos anti-5T4 quiméricos e humanizados da invençãopodem compreender regiões constantes derivadas de regiões constanteshumanas, tais como uma região constante de cadeia leve humana derivadade região constante de cadeia leve capa humana e uma região constante decadeia pesada humana derivada de uma região constante de cadeia pesadade IgGI humana ou de lgG4 humana.
Anticorpos anti-5T4 humanizados típicos da invenção incluemanticorpos compreendendo (a) regiões de cadeia principal (framework)compreendendo resíduos de uma região de cadeia principal de anticorpohumano; e (b) uma ou mais CDRs da região variável de cadeia leve de SEQID NO: 4, 8, ou 12, ou uma ou mais CDRs da região variável de cadeiapesada de SEQ ID NO: 2, 6, ou 10. Por exemplo, resíduos de uma regiãode cadeia principal de anticorpo humano podem compreender (a) umaregião de cadeia principal de cadeia leve de anticorpo humano de um clonede linhagem germinativa (germline) DPK24 subgrupo IV, um subgrupo VkIII(DPK23, DPK22, DPK20, DPK21), ou um clone de linhagem germinativasubgrupo VkI (DPK9, DPK1, 02, DPK7); (b) uma região de cadeia principalde cadeia pesada de anticorpo humano selecionada entre o grupoconsistindo em DP-21 (VH7), DP-54 (VH3-07), DP-47 (VH3-23), DP-53 (VH-74), DP-49 (VH3-30), DP-48 (VH3-13), DP-75, DP-8(VH1-2), DP-25, Vl-2b eVI-3 (VH1-03), DP-15 e V1-8 (VH1-08), DP-14 e V1-18 (VH1-18), DP-5 e V1-24P (VH1-24), DP-4 (VH1-45), DP-7 (VH1-46), DP-10, DA-6 e YAC-7 (VH1-69), DP-88 (VH1-e), DP-3 e DA-8 (VH1-f); (c) uma seqüência de consensode uma região de cadeia principal de cadeia pesada de (b); ou (d) umaregião de cadeia principal que é no mínimo 63% idêntica a uma região decadeia principal de (a) a (c).
Anticorpos anti-5T4 humanizados típicos da invenção tambémpodem incluir duas ou mais CDRs de SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8,10, ou 12, tais como duas ou todas as três CDRs da região variável decadeia leve de SEQ ID NO: 4, 8, ou 12, ou duas ou todas as três CDRs daregião variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 2, 6, ou 10, ou uma oumais CDRs ou a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 4, 8, ou 12 euma ou mais CDRs da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 2,6, ou 12, ou todas as três CDRs ou SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, ou 12.
Anticorpos anti-5T4 quiméricos e humanizados típicos incluemanticorpos compreendendo uma região variável de cadeia pesada seqüênciacompreendendo (a) uma seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-138 deSEQ ID NO: 2; (b) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 85%idêntica aos resíduos 20-138 de SEQ ID NO: 2; (c) uma seqüência deaminoácidos dos resíduos 19-135 de SEQ ID NO: 6; (d) uma seqüência deaminoácidos que é no mínimo 86% idêntica aos resíduos 19-135 de SEQ IDNO: 6; (e) uma seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-141 de SEQ IDNO: 10; (f) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 91% idênticaaos resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 10; (g) uma seqüência de aminoácidosdos resíduos 1-119 de SEQ ID NO: 49; (h) uma seqüência de aminoácidosque é no mínimo 90% idêntica aos resíduos 1-119 de SEQ ID NO: 49; ou (i)uma seqüência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesadahumanizada representada nas figuras 9A-9C.
Anticorpos anti-5T4 quiméricos e humanizados adicionais dainvenção incluem anticorpos compreendendo uma região variável de cadeiapesada codificados por um ácido nucléico compreendendo (a) umaseqüência de nucleotídeos de nucleotídeos 58-414 de SEQ ID NO: 1; (b)uma seqüência de nucleotídeos de nucleotídeos 55-405 de SEQ ID NO: 5(c) uma seqüência de nucleotídeos de nucleotídeos 58-423 de SEQ ID NO9; (d) uma seqüência de nucleotídeos de nucleotídeos 1-358 de SEQ ID NO48; (e) uma seqüência de nucleotídeos codificando uma região variável A1,A2, ou A3 humanizada representadas nas figuras 9A-9C; (f) uma seqüênciade nucleotídeos que é no mínimo 90% idênticas a seqüência denucleotídeos de qualquer um de (a) a (e); ou (g) um ácido nucléico queespecificamente hibridiza ao complemento de qualquer um de (a) a (e) sobcondições de hibridização estringentes.
Anticorpos anti-5T4 quiméricos e humanizados típicos incluemanticorpos compreendendo uma seqüência de região variável de cadeia levecompreendendo (a) uma seqüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 deSEQ ID NO: 4; (b) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 94%idêntica aos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 4; (c) uma seqüência deaminoácidos dos resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 8; (d) uma seqüência deaminoácidos que é no mínimo 96% idêntica aos resíduos 23-130 de SEQ IDNO: 8; (e) uma seqüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ IDNO: 12; (f) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 98% idênticaaos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 12; ou (g) uma seqüência deaminoácidos de uma região variável de cadeia leve A1, A2, ou A3humanizada representada nas figuras 9A-9C.
Também são proporcionados conjugados de anticorpo / fármacopara liberação de fármaco compreendendo (a) um anticorpo anti-5T4quimérico ou humanizado ou fragmento de anticorpo da invenção; e (b) umfármaco, o qual é diretamente ou indiretamente ligado ao anticorpo.Fármacos típicos incluem agentes terapêuticos, tais como citotoxinas,radioisótopos, agentes imunomoduladores, agentes antiangiogênicos,agentes antiproliferativos, agentes pró-apoptóticos, agentes quimioterápicos,e ácidos nucléicos terapêuticos. Uma citotoxina pode ser, por exemplo, umantibiótico, um inibidor da polimerização de tubulina, um agente alquilante,um inibidor da síntese de proteína, um inibidor da quinase protéica, uminibidor de fosfatase, um inibidor da topoisomerase, ou uma enzima.Citotoxinas antibióticas, tais como caliqueamicina, caliqueamicina, N-acetil-D-caliqueamicina, ou derivados das mesmas tais como dimetil hidrazida deN-acetij-D-caliqueamicina, são particularmente úteis para terapias anti-cancerígenas.
Os conjugados de anticorpo anti-5T4 / fármaco descritos podemincluir um Iigante para ligar o anticorpo ao fármaco. Ligantes representativosincluem ácido 4-(4'acetilfenóxi)butanóico (AcBut), ácido 3-acetilfenil acídico(AcPac), e ácido 4-mercapto-4-metil-pentanóico (Amide). Os conjugados deanticorpo / fármaco também podem incluir polietileno glicol ou outrosagentes para reforçar a incorporação de fármaco.
Para liberação de um fármaco para células expressando 5T4, apresente invenção proporciona métodos por meio dos quais as células sãocontactadas com um conjugado de anticorpo / fármaco compreendendo (i)um anticorpo anti-5T4 quimérico ou humanizado, e (ii) um fármaco o qual éligado ao anticorpo anti-5T4 humanizado diretamente ou indiretamente. Deacordo com os métodos descritos, o fármaco é internalizado dentro dacélula-alvo. Métodos terapêuticos também são descritos aqui, neste pedidode patente, os quais compreendem administrar ao sujeito tendo um câncer5T4-positivo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado deanticorpo anti-5T4 / fármaco compreendendo (i) um anticorpo anti-5T4quimérico ou humanizado ou fragmento de anticorpo, e (ii) um agenteterapêutico o qual é ligado ao anticorpo anti-5T4 humanizado ou fragmentode anticorpo diretamente ou indiretamente. As terapias anti-5T4 da invençãopodem ser combinadas com qualquer outra terapia conhecida para efeitoaprimorado. Um segundo agente terapêutico pode ser administrado emcombinação com um conjugado de anticorpo anti-5T4 / fármacosimultaneamente ou consecutivamente em qualquer ordem.
Também são proporcionados ácidos nucléicos isoladoscodificando regiões variáveis anti-5T4 humanizadas, as quais são úteis paraprodução dos anticorpos anti-5T4 humanizados descritos. Ácidos nucléicostípicos codificando uma região variável de cadeia pesada anti-5T4humanizada incluem (a) uma seqüência de nucleotídeos de nucleotídeos58-414 de SEQ ID NO: 1; (b) uma seqüência de nucleotídeos denucleotídeos 55-405 de SEQ ID NO: 5; (c) uma seqüência de nucleotídeosde nucleotídeos 58-423 de SEQ ID NO: 9; (d) uma seqüência denucleotídeos codificando qualquer uma das SEQ ID NOs: 48, 50, 53, ou 55;(e) uma seqüência de nucleotídeos que é 89% idêntica a SEQ ID NO: 50quando a cobertura da busca é de 100%; (f) uma seqüência de nucleotídeosque é 82% idêntica a SEQ ID NO: 53 quando a cobertura da busca é de100%; ou (g) um ácido nucléico que especificamente hibridiza aocomplemento de qualquer um de (a) a (d) sob condições de hibridizaçãoestringentes. Ácidos nucléicos típicos codificando uma região variável decadeia leve anti-5T4 humanizada incluem (a) a seqüência de nucleotídeosde nucleotídeos 61-381 de SEQ ID NO: 3; (b) uma seqüência denucleotídeos de nucleotídeos 67-390 de SEQ ID NO: 7; (c) uma seqüênciade nucleotídeos de nucleotídeos 61-381 de SEQ ID NO: 11; (d) umaseqüência de nucleotídeos codificando uma região variável de cadeia leveΑ1, A2, ou A3 humanizada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 57, 59, 61,63, 65, 67, 69, 71, 73, ou 75; (e) uma seqüência de nucleotídeos que é 84%idêntica a SEQ ID NO: 59 quando a cobertura da busca é de 100%; (f) umaseqüência de nucleotídeos que é 86% idêntica a SEQ ID NO: 69 quando acobertura da busca é de 100%; (g) uma seqüência de nucleotídeos que é85% idêntica a SEQ ID NO: 75 quando a cobertura da busca é de 100%; ou(h) um ácido nucléico que especificamente hibridiza ao complemento dequalquer um de (a) a (d) sob condições de hibridização estringentes.Breve Descrição dos Desenhos
As figuras 1A-1C mostra as seqüências de nucleotídeos eaminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve deanticorpos anti-5T4 murinos Α1, A2, e A3. As seqüências de aminoácidossão anotadas para identificar regiões determinantes de complementaridade(CDRs) sublinhando e as seqüência líder por duplo-sublinhado.
A figura 2 é um Western blot preparado usando Iisados celularesCT26/5T4 e sondado com os anticorpos indicados.
As figuras 3A-3B são gráficos de linha que apresentam curvasde resposta e cinética de ligação para duas preparações independentes deanticorpos H8 e A1. As preparações foram essencialmente equivalentes.
As figuras 4A-4C são gráficos de linha que mostram modulaçãode anticorpos H8, Α1, A2, e A3 por células MDAMB435/5T4. Os níveis deanticorpo na superfície celular declinam com o tempo (figuras 4A, 4C(sólido)), enquanto os níveis de anticorpo no sobrenadante permanecemconstantes (figuras 4B, 4C (aberto)). MCF, fluorescência celular média; supt,sobrenadante.
A figura 5 é um diagrama esquemático do constructo de Fc de5T4 de ectodomínio humano, o constructo de Fc de 5T4 de ectodomínio decamundongo, e os constructos de quimeras de 5T4 humana / decamundongo. Estes constructos foram usados para mapeamento de epitopoconforme descrito no Exemplo 4.
As figuras 6A-6B mostram resultados gráficos de ligaçãocompetitiva de H8 humanizado e cada um dos anticorpos indicados paraproteína de fusão Fc de ectodomínio 5T4 humano. HuH8, anticorpo H8humanizado; ChiAI, anticorpo A1 quimérico; ChiAI+C67F, anticorpo A1quimérico portando mutação C67F; ChiA2, anticorpo A2 quimérico; muA2,anticorpo A2 murino; ChiA3, anticorpo A3 quimérico; ChiA3+C91Y, anticorpoA3 quimérico portando mutação C91Y, muA3, anticorpo A3 murino; NenhumAb1 nenhum anticorpo (controle).
A figura 7 é um diagrama linear mostrando os epitopos 5T4humanos ligados por H8, A1, A2, e A3. Os resíduos indicados são resíduosdo antígeno 5T4 descrito por Myers et al. (1994) J. BioL Chem.269(12):9319-9324, também disponíveis como No. de Acesso do GenBankZ29083 (SEQ ID NO: 87). LRR, repetição rica em leucina.
A figura 8 mostra os resultados de ensaios esferóides realizadosconforme descrito no Exemplo 6. Conjugados de anti-5T4 / caliqueamicinapreparados usando os anticorpos A1 e A3 inibiram significativamente ocrescimento de células expressando 5T4 (MDAMB435/5T4) comparadascélulas com controle (MDAMB435/neo). CMA-676, conjugado de anti-CD33caliqueamicina; huH8-AcBut-CalichDMH, anticorpo H8 humanizadoconjugado a caliqueamicina usando ácido 4-(4'-acetilfenóxi)butanóico(AcBut); CalichDMH, caliqueamicina não conjugada; A1 -AcBut-CaIichDMH,A1 anticorpo conjugado a caliqueamicina usando ácido 4-(4'-acetilfenóxi)butanóico (AcBut); A3-AcBut-CalichDMH, A3 anticorpoconjugado a caliqueamicina usando ácido 4-(4'-acetilfenóxi)butanóico(AcBut).
As figuras 9A-9H mostram nucleotídeo e seqüências deaminoácidos da região variável de cadeia pesada versão 1 A1 humanizada(SEQ ID NOs: 48-49); seqüências de aminoácidos de região variável decadeia pesada A1 humanizada (huA1 VH) versões 1.2 e 2.0; seqüências deaminoácidos de região variável de cadeia leve A1 humanizada (huA1 VL)versões 1.0, 2.0, e 3.0; seqüências de aminoácidos de região variável decadeia pesada A2 humanizada versões 1.0 e 2.0 (huA2 VH); seqüências deaminoácidos de região variável de cadeia leve A2 humanizada versões 1.0 e2.0 (huA2 VL); seqüências de aminoácidos de região variável de cadeiapesada A3 humanizada versões 1.0 e 2.0 (huA3 VH); e seqüências deaminoácidos de região variável de cadeia leve A3 humanizada versões 1.0 e2.0 (huA32 VL). CDRs são sublinhadas.
As figuras 10A-10B mostram seqüências de cadeia principal deregião variável de cadeia pesada humana típicas que podem ser usadaspara preparar anticorpos anti-5T4 humanizados. A figura 10A é umalinhamento de seqüências de região variável de cadeia pesada humana desubgrupo I (SEQ ID NOs: 14-24) e as seqüências de cadeia principal deconsenso derivadas das mesmas (SEQ ID NOs: 25-27). A figura 10B mostraas seqüências de genes de linhagem germinativa humana dos subgruposVH 7 e VH 3 (SEQ ID NOs: 88-93).
A figura 11 é um alinhamento de seqüências de região variávelde cadeia leve humana do subgrupo VkIII (SEQ ID NOs: 29-34).Seqüências encerradas em caixa, CDRs.
A figura 12 é um alinhamento de seqüências de região variávelde cadeia leve humana do subgrupo VkI (SEQ ID NOs: 35-44). Seqüênciasencerradas em caixa, CDRs.
A figura 13 mostra seqüências de linhagem germinativa humanaadicionais dos subgrupos Vk 1 e Vk IV, as quais têm regiões de cadeiaprincipal que podem ser usadas para preparar anticorpos anti-5T4humanizados (SEQ ID NOs: 94-99).
A figura 14 mostra as seqüências de aminoácidos de regiõesconstantes humanas típicas que podem ser usadas para preparar anticorposanti-5T4 quiméricos e humanizados (SEQ ID NOs: 45-47).
A figura 15 mostra as seqüências de aminoácidos de umantígeno 5T4 de macaco cynomologous de extensão total e um antígeno5T4 de sagüi de cauda preta parcial. Seqüências sublinhadas, seqüênciaslíder. Para cada seqüência, o ectodomínio 5T4 inclui os aminoácidos 30-356.
Descrição Detalhada da Invenção
I. Anticorpos Anti-5T4
A presente invenção proporciona novos anticorpos murinos queligam antígeno 5T4 humano e que são úteis para desenvolver imunoterapiasdirecionadas. O antígeno 5T4 humano é uma fosfoproteína não glicosiladade 72 kDa encontrada sobre a superfície de células de trofoblasto enumerosos tipos de células cancerígenas Vide Hole et al. (1988) Br. J.Câncer 57: 239-46, Hole et al. (1990) Int. J. Câncer 45: 179-184; Publicaçãode Patente Internacional PCT No. W089/07947; Patente dos EstadosUnidos No. 5.869.053.Os anticorpos anti-5T4 murinos da invenção são designados A1,A2, e A3, e foram preparados conforme descrito no Exemplo 1. Tambémsão proporcionados anticorpos anti-5T4 derivados de A1, A2, e A3, e osquais especificamente ligam a antígeno 5T4 humano. Por exemplo,anticorpos anti-5T4 da invenção incluem anticorpos compreendendoresíduos ligando antígeno dos anticorpos A1, A2, e A3; anticorpos quecompetem para ligação a antígeno 5T4 com anticorpos A1, A2, ou A3; eanticorpos que ligam ao mesmo epitopo 5T4 que os anticorpos Α1, A2, ou A3.
Em particular, os anticorpos A1, A2, e A3 descritoscompreendem cada um sítio de ligação antigênica que reconhece um únicoeppitope sobre o antígeno 5T4 humano. Cada um destes anticorpostambém liga a um epitopo distinto daquele ligado por H8, e cada um de A1,A2, e A3 falha em competir com o anticorpo H8 para ligação a 5T4 humano.Vide os Exemplos 4 a 5 e as figuras 6 a 7. Por conseguinte, a presenteinvenção proporciona anticorpos que ligam especificamente aos resíduos30-163 de 5T4 humano (por exemplo, A3), anticorpos que ligamespecificamente aos resíduos 224-276 de 5T4 humano (por exemplo, A1), eanticorpos que ligam especificamente aos resíduos 224-355 de 5T4 humano(por exemplo, A2). Também são proporcionados antígenos 5T4 humanoscompreendendo epitopos ligados por um anticorpo A1, A2, ou A3. Porexemplo, a invenção proporciona fragmentos antigênicos 5T4compreendendo os resíduos 30-163, 224-276, e 224-355 de um antígeno5T4 nativo ou de extensão total.
Ligação específica dos anticorpos anti-5T4 descritos se refere auma ligação preferencial de um anticorpo a antígeno 5T4 humano em umaamostra heterogênea compreendendo múltiplos antígenos diferentes.Tipicamente, ocorre ligação específica se a afinidade de ligação for nomínimo cerca de 10"7 M ou maior, tal como no mínimo cerca de 10"8 M oumaior, inclusive no mínimo cerca de 10'9 M ou maior, no mínimo cerca de 10"11 M ou maior, ou no mínimo cerca de 1012 M ou maior. Por exemplo,ligação específica de um anticorpo da invenção a um antígeno 5T4 humanoinclui ligação na faixa de no mínimo cerca de 1 χ 10" Ma cerca de 1 χ 10"Μ, tal como dentro da faixa de cerca de 1 χ 10'8 M a cerca de 1 χ 10"12 Μ, oudentro da faixa de cerca de 1 χ 10"8 M a cerca de 1 χ 10"11 Μ, ou dentro dafaixa de cerca de 1 χ 10"8 M a cerca de 1 χ 10"10 Μ, ou dentro da faixa decerca de 1 χ 10'9 M a cerca de 1 χ 10"10 Μ. Ligação específica também serefere a direcionamento seletivo de um anticorpo anti-5T4 para célulasexpressando 5T4 depois da administração do anticorpo a um sujeito.
Os anticorpos anti-5T4 da invenção podem ter uma estruturatetramérica (por exemplo, similar a anticorpos que ocorrem naturalmente),ou podem compreender qualquer outra estrutura tendo no mínimo umaregião variável de cadeia leve de imunoglobulina ou no mínimo uma regiãode cadeia pesada de imunoglobulina, ou fragmentos de ligação de 5T4 dasmesmas (por exemplo, fragmentos Fab, Fab modificado, F(ab')2 ou Fv.Também são incluídos anticorpos de domínio únicos, nos quais uma ou maisregiões determinantes de complementaridade (CDRs), porém menos detodas as seis CDRs, constituem uma região de ligação de antígeno. Ainvenção também engloba anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados,anticorpos superhumanizados, diabodies, anticorpos de cadeia única,anticorpos tetravalentes, e/ou anticorpos multiespecíficos (por exemplo,anticorpos biespecíficos). Estes descritores de anticorpos não sãomutuamente exclusivos.
Anticorpos que ocorrem naturalmente são glicoproteínastetraméricas (H2L2) de cerca de 150.000 daltons, compostas de duascadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. As duascadeias pesadas são encadeadas uma à outra por ligações dissulfeto e cadacadeia pesada é encadeada a uma cadeia leve por uma ligação dissulfeto.Cada uma das cadeias leve e pesada é adicionalmente caracterizada poruma região variável de terminal amino e uma região constante. As regiõesvariáveis incluem seqüências que diferem extensivamente entre anticorpos eessencialmente determinam a afinidade de ligação e especificidade de umanticorpo em particular para seu antígeno particular. As regiões variáveis decada uma das cadeias leve e pesada alinham para formar o domínio deligação de antígeno.
Anticorpos quiméricos compreendem seqüências de no mínimoduas espécies diferentes. Como um exemplo, técnicas de clonagemrecombinante podem ser usadas para incluir regiões variáveis, as quaiscontêm os sítios de ligação antigênica, de um anticorpo não humano (isto é,um anticorpo preparado em uma espécie não humana imunizada com oantígeno) e regiões constantes derivadas de uma imunoglobulina humana.
Anticorpos anti-5T4 quiméricos da invenção incluem anticorposcompreendendo regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve dosanticorpos A1, A2, e A3, isto é, (a) uma região variável de cadeia pesadatendo uma seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-138 de SEQ ID NO: 2e uma região variável de cadeia leve tendo uma seqüência de aminoácidosdos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 4; (b) uma seqüência de aminoácidosde cadeia pesada dos resíduos 19-135 de SEQ ID NO: 6 e uma seqüênciade aminoácidos de cadeia leve dos resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 8; e (c)uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada dos resíduos 20-141 deSEQ ID NO: 10 e uma seqüência de aminoácidos de cadeia leve dosresíduos 21-127 de SEQ ID NO: 12. Anticorpos anti-5T4 humanizadostípicos podem incluir uma região variável de cadeia pesada exposta comoaminoácidos 1-119 de SEQ ID NO: 49, ou qualquer uma da região variávelde cadeia pesada humanizada representada nas figuras 9A-9C, e umaregião variável de cadeia leve humanizada, também representada nasfiguras 9A-9C. A preparação de anticorpos anti-5T4 quiméricos ehumanizados típicos da invenção é descrita no Exemplo 7.
Anticorpos anti-5T4 da invenção também podem compreenderuma região variável de cadeia pesada e/ou de cadeia leve compreendendouma seqüência de aminoácidos que é derivada de ou essencialmente similaràs regiões variáveis Α1, A2, ou A3, ou essencialmente similar às regiõesvariáveis Α1, A2, e A3 humanizadas. Com respeito a regiões variáveis decadeia pesada e de cadeia leve essencialmente idênticas, as seqüênciasessencialmente idênticas são no mínimo cerca de 90% idênticas àsseqüências de regiões variáveis de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-12 ouàs regiões variáveis Α1, A2, e A3 humanizadas representadas nas figuras9A-9C, tais como no mínimo 91% idênticas, ou no mínimo 92% idênticas, ouno mínimo 93% idênticas, ou no mínimo 94% idênticas, ou no mínimo 95%idênticas, ou no mínimo 96% idênticas, ou no mínimo 97% idênticas, ou nomínimo 98% idênticas, ou no mínimo 99% idênticas.
Anticorpos anti-5T4 quiméricos típicos da invenção, isto é,anticorpos que ligam especificamente ao antígeno 5T4, também incluem osanticorpos tendo (a) uma seqüência de aminoácidos de região variável decadeia pesada exposta como resíduos 20-138 de SEQ ID NO: 2, resíduos19-135 de SEQ ID NO: 6, resíduos 20-141 de SEQ ID N0:10, ou qualqueruma das regiões variáveis de cadeia pesada A1, A2, ou A3 humanizadasrepresentadas nas figuras 9A-9C; (b) uma seqüência de aminoácidos deregião variável de cadeia pesada que é no mínimo 85% idêntica aosresíduos 20-138 de SEQ ID NO: 2; (c) uma seqüência de aminoácidos deregião variável de cadeia pesada que é no mínimo 86% idêntica aosresíduos 19-135 de SEQ ID NO: 6; (d) uma seqüência de aminoácidos deregião variável de cadeia pesada que é no mínimo 91% idêntica aosresíduos 20-141 de SEQ ID NO: 10; (e) uma seqüência de aminoácidos deregião variável de cadeia pesada que é no mínimo 90% idêntica aosresíduos 1-119 de SEQ ID NO: 49; ou (f) uma seqüência de aminoácidos deregião variável de cadeia pesada derivada de qualquer uma das regiõesvariáveis Α1, A2, ou A3 humanizadas representadas nas figuras 9A-9C.
Uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-5T4quimérico ou humanizado, a qual especificamente liga ao antígeno 5T4,pode ser codificada por (a) um ácido nucléico compreendendo umaseqüência de nucleotídeos de nucleotídeos 58-414 de SEQ ID NO: 1,nucleotídeos 55-405 de SEQ ID NO: 5, nucleotídeos 58-423 de SEQ ID NO:9, nucleotídeos 1-358 de SEQ ID NO: 48; ou um ácido nucléico codificandouma região variável de cadeia pesada A1, A2, ou A3 humanizadarepresentadas nas figuras 9A-9C; (b) um ácido nucléico compreendendouma seqüência de nucleotídeos que é no mínimo 90% idêntica a um ácidonucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeos de nucleotídeos58-414 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 55-405 de SEQ ID NO: 5, ounucleotídeos 58-423 de SEQ ID NO: 9. Por exemplo, uma região variável decadeia pesada de um anticorpo anti-5T4 quimérico pode ser codificada porum ácido nucléico que é no mínimo 98% idêntica aos nucleotídeos 58-414de SEQ ID NO: 1, um ácido nucléico compreendendo uma seqüência denucleotídeos que é no mínimo 98% idêntica aos nucleotídeos 55-405 deSEQ ID NO: 5, ou um ácido nucléico compreendendo uma seqüência denucleotídeos que é no mínimo 89% idêntica aos nucleotídeos 1-358 de SEQID NO: 48. Uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-5T4quimérico também pode ser codificada por um ácido nucléico queespecificamente hibridiza ao complemento de um ácido nucléicocompreendendo uma seqüência de nucleotídeos de nucleotídeos 58-414 deSEQ ID NO: 1, nucleotídeos 55-405 de SEQ ID NO: 5, nucleotídeos 58-423de SEQ ID NO: 9, ou nucleotídeos 1-358 de SEQ ID NO: 48, sob condiçõesde hibridização estringentes, por exemplo, condições de lavagem final de0,1 X SSC a 65eC.
Anticorpos anti-5T4 quiméricos típicos da invenção incluemadicionalmente os anticorpos tendo (a) uma seqüência de aminoácidos deregião variável de cadeia leve exposta como resíduos 21-127 de SEQ IDNO: 4, resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 8, resíduos 21-127 de SEQ ID NO:12, ou resíduos de uma região variável de cadeia leve A1, A2, ou A3humanizada representada nas figuras 9A-9C; ou (b) uma seqüência deaminoácidos de região variável de cadeia leve que é no mínimo 90% idênticaaos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 4, resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 8,ou resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 12. Por exemplo, uma seqüência deaminoácidos de região variável de cadeia leve pode compreender (a) umaseqüência de aminoácidos de região variável de cadeia leve que é nomínimo 94% idêntica aos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 4; (b) umaseqüência de aminoácidos de região variável de cadeia leve que é nomínimo 96% idêntica aos resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 8; (c) umaseqüência de aminoácidos de região variável de cadeia leve que é nomínimo 98% idêntica aos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 12; (d) ou umaseqüência de aminoácidos de região variável de cadeia leve derivada dequalquer uma das regiões variáveis de cadeia leve A1, A2, ou A3humanizadas representadas nas figuras 9A-9C.
Uma região variável de cadeia leve de um anticorpo anti-5T4quimérico, a qual especificamente liga a antígeno 5T4, pode ser codificadapor (a) um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeosde nucleotídeos 61-381 de SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 67-390 de SEQ IDNO: 7, nucleotídeos 61-381 de SEQ ID NO: 11, ou nucleotídeos codificandoqualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve A1, A2, ou A3humanizadas representadas nas figuras 9A-9C; ou (b) um ácido nucléicocompreendendo uma seqüência de nucleotídeos que é no mínimo 90%idêntica aos nucleotídeos 61-381 de SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 67-390 deSEQ ID NO: 7, ou nucleotídeos 61-381 de SEQ ID NO: 11. Por exemplo,uma região variável de cadeia leve de um anticorpo anti-5T4 quimérico podeser codificada por um ácido nucléico compreendendo (a) uma seqüência denucleotídeos que é no mínimo 97% idêntica aos nucleotídeos 61-381 deSEQ ID NO: 3; (b) uma seqüência de nucleotídeos que é no mínimo 98%idêntica aos nucleotídeos 67-390 de SEQ ID NO: 7; ou (c) uma seqüência denucleotídeos que é no mínimo 99% idêntica aos nucleotídeos 61-381 deSEQ ID NO: 11. Uma região variável de cadeia leve de um anticorpo anti-5T4 quimérico, a qual especificamente liga ao antígeno 5T4, também podeser codificada por um ácido nucléico que especificamente hibridiza aocomplemento de um ácido nucléico compreendendo uma seqüência denucleotídeos de nucleotídeos 61-381 de SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 67-390de SEQ ID NO: 7, ou nucleotídeos 61 -381 de SEQ ID NO: 11, sob condiçõesde hibridização estringentes, por exemplo, condições de lavagem final de0,1 X SSC a 65-C.
Anticorpos humanizados são um tipo de anticorpo quimérico emque resíduos de regiões variáveis responsáveis por ligação de antígeno (istoé, resíduos de uma regiões determinantes de complementaridade, regiõesdeterminantes de complementaridade abreviadas, ou quaisquer outrosresíduos que participam em ligação de antígeno) são derivadas de umaespécie não humana, enquanto os resíduos de regiões variáveisremanescentes (isto é, resíduos das regiões de cadeia principal) e regiõesconstantes são derivadas, no mínimo em parte, de seqüências de anticorposhumanos. Um subgrupo de resíduos de região de cadeia principal eresíduos de região constante de um anticorpo humanizado pode serderivado de fontes não humanas. Regiões variáveis de um anticorpohumanizado também são descritas como humanizadas (isto é, uma regiãovariável de cadeia leve ou pesada humanizada). A espécie não humana étipicamente a espécie usada para imunização com antígeno, tal comocamundongo, rato, coelho, primata não humano, ou outra espécie mamíferanão humana. Anticorpos humanizados são tipicamente menos imunogênicosdo que anticorpos quiméricos tradicionais e apresentam aprimoradaestabilidade depois de administração a humanos. Vide, por exemplo,Benincosa et al. (2000) J. PharmacoL Exp. Ther. 292:810-6; Kalofonos et al.(1994) Eur. J. Câncer 30A:1842-50; Subramanian et al. (1998) Pediatr.Infect. Dis. J. 17:110-5.
Regiões determinantes de complementaridade (CDRs) sãoregiões variáveis de resíduos de anticorpo que participam na ligação deantígeno. Vários sistemas de numeração para identificar CDRs estão emuso comum. A definição de Kabat se baseia em variabilidade de seqüência,e a definição de Chothia se baseia na localização das regiões de laçoestrutural. A definição AbM é um meio-termo entre as abordagens de Kabate de Chothia. As CDRs da região variável de cadeia leve são ligadas pelosresíduos nas posições 24 e 34 (CDR1-L), 50 e 56 (CDR2-L), e 89 e 97(CDR3-L) de acordo com o algoritmo de Kabat, Chothia, ou AbM. De acordocom a definição de Kabat, as CDRs da região variável de cadeia pesada sãoligadas pelos resíduos nas posições 31 e 35B (CDR1-H), 50 e 65 (CDR2-H),e 95 e 102 (CDR3-H) (numeração de acordo com Kabat). De acordo com adefinição de Chothia, as CDRs da região variável de cadeia pesada sãoligadas pelos resíduos nas posições 26 e 32 (CDR1 -H), 52 e 56 (CDR2-H), e95 e 102 (CDR3-H) (numeração de acordo com Chothia). De acordo com adefinição AbM, as CDRs da região variável de cadeia pesada são ligadaspelos resíduos nas posições 26 e 35B (CDR1-H), 50 e 58 (CDR2-H), e 95 e102 (CDR3-H) (numeração de acordo com Kabat). Vide Martin et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 9268-9272; Martin et al. (1991) MethodsEnzymoL 203: 121-153; Pedersen et al. (1992) Immunomethods 1: 126; eRees et al. (1996) In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction,Oxford University Press1 Oxford, pp. 141-172.
Regiões determinantes de especificidade (SDRs) são resíduosdentro de CDRs que interagem diretamente com antígeno. As SDRscorrespondem a resíduos hipervariáveis. Vide (Padlan et al. (1995) FASEBJ. 9: 133-139).
Resíduos de cadeia principal são os resíduos de regiõesvariáveis de anticorpo diferentes de resíduos hipervariáveis ou de CDRs.Resíduos de cadeia principal podem ser derivados de um anticorpo humanoque ocorre naturalmente, tal como um cadeia principal humano que éessencialmente similar a uma região de cadeia principal dos anticorpos A1,A2, ou A3. Também podem ser usadas seqüências de cadeia principalartificiais que representam um consenso entre seqüências individuais. Aoselecionar uma região de cadeia principal para humanização, seqüênciasque são amplamente representadas em seres humanos podem serpreferenciais em relação a seqüências menos populosas. Mutaçõesadicionais das seqüências aceitadoras de cadeia principal humano podemser feitas para restaurar resíduos murinos que se acredita que estejamenvolvidos em contatos de antígenos e/ou resíduos envolvidos naintegridade estrutural do sítio de ligaçõa de antígeno, ou para melhorar aexpressão de anticorpos. Uma previsão de estrutura de peptídeo pode serusada para analisar as seqüências de regiões variáveis pesada e levehumanizadas para identificar e evitar sítios de modificação de proteína pós-translacional pelo design de humanização.
Anticorpos humanizados podem ser preparados usandoqualquer um de uma variedade de métodos inclusive folheamento(veneering), enxertação de regiões determinantes de complementaridade(CDRs), enxertação de CDRs abreviadas, enxertação de regiõesdeterminantes de especificidade (SDRs), e montagem de Frankenstein,conforme descrito abaixo. Anticorpos humanizados também incluemanticorpos superhumanizados, nos quais uma ou mais alterações foramintroduzidas nas CDRs. Por exemplo, resíduos humanos podem sersubstituídos por resíduos não humanos nas CDRs. Estas abordagens geraispodem ser combinadas com técnicas de mutagênese e síntese de rotinapara produzir um anticorpo anti-5T4 de qualquer seqüência desejada.
Folheamento se baseia no conceito de reduzir seqüências deaminoácidos potencialmente imunogênicas em um roedor ou outro anticorponão humano recapeando o exterior acessível de solvente do anticorpo comseqüências de aminoácidos humanas. Deste modo, anticorpos folheados{veneered) parecem menos estranhos às células humanas do que oanticorpo não humano não modificado. Vide Padlan (1991) Mol. Immunol.28:489-98. Um anticorpo não humano é folheado identificando resíduos deregião de cadeia principal exterior expostos no anticorpo não humano, osquais são diferentes daqueles nas mesmas posições em regiões de cadeiaprincipal de um anticorpo humano, e substituição dos resíduos identificadoscom aminoácidos que tipicamente ocupam estas mesmas posições emanticorpos humanos.
A enxertação de CDRs é realizada substituindo uma ou maisCDRs de um anticorpo aceitador (por exemplo, um anticorpo humano ououtro anticorpo compreendendo resíduos de cadeia principal desejados) comCDRs de um anticorpo doador (por exemplo, um anticorpo não humano).Anticorpos aceitadores podem ser selecionados com base na similaridadede resíduos de cadeia principal entre um anticorpo aceitador candidato e umanticorpo doador. Por exemplo, de acordo com a abordagem deFrankenstein, regiões de cadeia principal humanas são identificadas comotendo substancial homologia de seqüência para cada região de cadeiaprincipal do anticorpo não humano relevante, e CDRs do anticorpo nãohumano são emxertados sobre o composto das diferentes regiões de cadeiaprincipal humanas. Um método relacionado também útil para preparação deanticorpos da invenção é descrito na Publicação do Pedido de Patente dosEstados Unidos No. 2003/0040606.
Enxerto de CDRs abreviadas é uma abordagem relacionada.CDRs abreviadas incluem os resíduos determinantes de especificidade eaminoácidos adjacentes, inclusive aqueles nas posições 27d-34, 50-55 e 89-96 na cadeia leve, e nas posições 31-35b, 50-58, e 95-101 na cadeia pesada(convenção de numeração de (Kabat et al. (1987)). Vide (Padlan et al.(1995) FASEB J. 9: 133-9). Enxertação de resíduos determinantes deespecificidade (SDRs) parte da premissa do entendimento de que aespecificidade de ligação e afinidade de um sítio de combinação deanticorpos é determinada pelos resíduos mais altamente variáveis dentro decada uma das regiões determinantes de complementaridade (CDRs).Análise das estruturas tridimensionais de complexos de anticorpo-antígeno,combinada com análise dos dados de seqüências de aminoácidosdisponíveis podem ser usadas para variabilidade da seqüência modelo combase em dissimilaridade estrutural de resíduos aminoácidos que ocorrem emcada posição dentro da CDR. SDRs são identificadas como seqüências depolipeptídeos minimamente imunogênicas consistindo em resíduos decontato. Vide Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-139.
Em geral, cadeias principais aceitador humano são selecionadascom base em que são essencialmente similares às regiões de cadeiaprincipal dos anticorpos doadores, ou os quais são mais similares aseqüência de consenso da subfamília de regiões variáveis. Depois deenxertação, podem ser feitas alterações adicionais nas seqüências doadorae/ou aceitadora para otimizar ligação de anticorpos, funcionalidade, uso decódon, níveis de expressão, e etc, inclusive introdução de resíduos não-humanos nas regiões de cadeia principal. Vide, por exemplo, a Publicaçãode Patente Internacional PCT No. WO 91/09967.
Para enxertação de CDRs sobre uma região de cadeia principalvariável de cadeia pesada, seqüências de cadeia principal úteis podem serderivadas de um DP-21 (VH7), DP-54 (VH3-07), DP-47 (VH3-23), DP-53(VH-74), DP-49 (VH3-30), DP-48 (VH3-13), DP-75, DP-8(VH1-2), DP-25, Vl-2b e VI-3 (VH1-03), DP-15 e V1-8 (VH1-08), DP-14 e V1-18 (VH1-18), DP-5e V1-24P (VH1-24), DP-4 (VH1-45), DP-7 (VH1-46), DP-10, DA-6 e YAC-7(VH1-69), DP-88 (VH1-e), DP-3 e DA-8 (VH1-f). Regiões variáveis decadeia pesada típicas contendo resíduos de cadeia principal parahumanização são expostas como SEQ ID NOs: 13-24 e 88-93. Cadeiasprincipais típicos que representam um consenso de resíduos de cadeiaprincipal VH1 são expostos como SEQ ID NOs: 25-27. Vide também asfiguras 10A-10B.
Para enxertação de CDRs sobre uma região de cadeia principalvariável de cadeia leve, seqüências de cadeia principal úteis podem serderivadas de um clone de linhagem germinativa DPK24 subgrupo IV, umsubgrupo VkIII (DPK23, DPK22, DPK20, DPK21), ou um clone de linhagemgerminativa subgrupo VkI (DPK9, DPK1, 02, DPK7). Regiões variáveis decadeia leve típicas contendo resíduos de cadeia principal para humanizaçãosão expostas como SEQ ID NOs: 28-34, 35-44, e 94-99. Vide as figuras 11a 14.
Anticorpos anti-5T4 humanizados típicos da invenção incluemanticorpos tendo uma ou mais CDRs de um anticorpo anti-5T4 não humanoselecionado entre CDRs de uma região variável de cadeia pesada dequalquer uma das SEQ ID NOs: 2, 6, ou 10, ou uma região variável decadeia leve de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 8, ou 12. Por exemplo,anticorpos anti-5T4 humanizados podem compreender duas ou mais CDRsselecionadas entre CDRs de uma região variável de cadeia pesada dequalquer uma das SEQ ID NOs: 2, 6, ou 10, ou uma região variável decadeia leve de qualquer um de SEQ ID NOs:4, 8, ou 12. Anticorpos anti-5T4 humanizados também podem compreender uma cadeia pesadacompreendendo uma região variável tendo duas ou três CDRs de qualqueruma das SEQ ID NOs: 2, 6, ou 10, e uma cadeia leve compreendendo umaregião variável tendo duas ou três CDRs de qualquer uma das SEQ ID NOs:4, 8, ou 12.
Anticorpos humanizados anti-5T4 da invenção podem serconstruídos em que a região variável de uma primeira cadeia (isto é, aregião variável de cadeia leve ou a região variável de cadeia pesada) éhumanizada, e em que a região variável da segunda cadeia não éhumanizada (isto é, uma região variável de um anticorpo produzida em umaespécie não humana). Estes anticorpos são um tipo de anticorpohumanizado referido como anticorpos semi-humanizados. Anticorpos anti-5T4 não humanos que podem ser usados para preparar anticorpos semi-humanizados incluem os anticorpos A1, A2, e A3, conforme descrito aqui,neste pedido de patente, bem como o anticorpo H8 descrito na Publicaçãode Patente Internacional PCT No. WO 98/55607 e em Forsberg et al. (1997)J. Biol. Chem. 272(19): 124430-12436, ou o anticorpo monoclonal de ratodescrito em Woods et al. (2002) Biochem. J. 366: 353-65). Por exemplo, umanticorpo anti-5T4 semi-humanizado pode compreender uma região variávelde cadeia pesada exposta como aminoácidos 1-119 de SEQ ID NO: 49 ouaminoácidos de uma região variável de cadeia pesada A1, A2, ou A3humanizada representada nas figuras 9A-9C, e uma região variável decadeia leve de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 8, ou 12.
As regiões constantes de anticorpos anti-5T4 quiméricos ehumanizados podem ser derivadas de regiões constantes de qualquer um deIgA, IgD, IgE, IgG, IgM, quaisquer isótipos dos mesmos (por exemplo,isótipos IgGI, lgG2, lgG3, ou lgG4 de IgG), bem como versões mutadas dosmesmos. A escolha de um isótipo humano e modificação de aminoácidosparticulares no isótipo pode reforçar ou eliminar ativação de mecanismos dedefesa do hospedeiro e alterar a biodistribuição de anticorpos. Vide (Reff etal. (2002) Câncer Control 9: 152-66). Regiões constantes típicas úteis parapreparar anticorpos quiméricos e humanizados da invenção são expostascomo SEQ ID NOs: 45-47. Regiões constantes de cadeia leve lâmdahumana, incluídas versões de variantes ou mutantes, também podem serusadas. Para clonagem de seqüências codificando regiões constantes deimunoglobulina, podem ser eliminadas seqüências intrônicas.
Anticorpos anti-5T4 quiméricos e humanizados podem serconstruídos usando técnicas padrão conhecidas na técnica. Por exemplo,regiões variáveis podem ser preparadas recozendo juntos oligonucleotídeosem sobreposição codificando as regiões variáveis e ligando estes em umvetor de expressão contendo uma região constante de anticorpo humano.Vide, por exemplo, Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratorv Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York e asPatentes dos Estados Unidos Nos. 4.196.265; 4.946.778; 5.091.513;
5.132.405; 5.260.203; 5.677.427; 5.892.019; 5.985.279; 6.054.561.Anticorpos tetravalentes (H4L4) compreendendo dois anticorpos tetraméricosintactos, inclusive homodímeros e heterodímeros, podem ser preparados,por exemplo, conforme descrito na Publicação de Patente Internacional PCTNo. WO 02/096948. Dímeros de anticorpos também podem ser preparadosatravés de introdução de um ou mais resíduos cisteína na região constantedo anticorpo, o que promove formação de ligação dissulfeto intercadeia, poruso de reticuladores heterobifuncionaos (Wolff et al. (1993) Câncer Res. 53:2560-5), ou por produção recombinante para incluir uma região constantedupla (Stevenson et al. (1989) Anticancer Drug Des. 3: 219-30). Fragmentosde anticorpos de ligação antigênica da invenção podem ser preparados, porexemplo, por expressão de seqüências de anticorpos truncadas, ou pordigestão pós-translação de anticorpos de extensão total.
Variantes de anticorpos anti-5T4 da invenção, isto é, osanticorpos Α1, A2, e A3 bem como versões quiméricas e humanizadas dosmesmos, podem ser prontamente preparados para incluir várias alterações,substituições, inserções, e eliminações. Por exemplo, anticorpo seqüênciaspodem ser otimizadas para uso de códon no tipo celular usado paraexpressão de anticorpos. Para aumentar a meia-vida sérica do anticorpo,pode ser incorporado um epitopo de ligação de receptor de salvamento,caso já não presente, na seqüência de cadeia pesada do anticorpo. Vide aPatente dos Estados Unidos No. 5.739.277. Modificações adicionais parareforçar a estabilidade de anticorpo incluem modificação de lgG4 parasubstituir a serina no resíduo 241 com prolina. Vide Angal et al. (1993) MoiImmunol. 30: 105-108. Outras alterações úteis incluem substituiçõesconforme requerido para otimizar a eficiência em conjugar o anticorpo comum fármaco. Por exemplo, um anticorpo pode ser modificado em seutérmino carboxila para incluir aminoácidos para fixação de fármaco, porexemplo, um ou mais resíduos cisteína podem ser adicionados. As regiõesconstantes podem ser modificadas para introduzir sítios para ligação decarboidratos ou outras porções.
Variantes de anticorpos anti-5T4 da invenção podem serproduzidas usando técnicas recombinantes de rotina, inclusive mutagênesesítio-direcionada, ou clonagem de recombinação. Um repertório diversificadode anticorpos anti-5T4 pode ser preparado através de arranjo genético emétodos de conversão genética em animais não-humanos transgênicos(Publicação de Patente dos Estados Unidos No. 2003/0017534), os quaissão então testados para atividades relevantes usando provas funcionais.
Em modalidades particulares da invenção, variantes anti-5T4 são obtidasusando um protocolo de maturação por afinidade para CDRs mutantes(Yang et al. (1995) J. Mol. Biol. 254: 392-403), shuffling de cadeia (Marks etal. (1992) Biotechnology (NY) 10: 779-783), uso de cepas mutadoras de E.coli (Low et al. (1996) J. Mol. Biol 260: 359-368), DNA shuffling (Patten et al.(1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8: 724-733), display de fago (Thompson et al.(1996) J. Mol. Biol. 256: 77-88), e PCR sexual (Crameri et al. (1998) Nature391: 288-291). Para aplicações de imunoterapia, provas funcionaisrelevantes incluem ligação específica a antígeno 5T4 humano, internalizaçãode anticorpo, e direcionamento para um ou mais sítios tumorais quandoadministradas a um animal portando tumor, conforme descrito abaixo aqui,neste pedido de patente.
A presente invenção proporciona adicionalmente células elinhagens celulares expressando anticorpos anti-5T4 da invenção. Célulashospedeiras típicas incluem células de mamíferos e humanas, tais comocélulas CHO, células HEK-293, células HeLa, células CV-1, e células COS.Métodos para gerar uma linhagem celular estável depois de transformaçãode um constructo heterólogo em uma célula hospedeira são conhecidos natécnica. Células hospedeiras não mamíferas típicas incluem células deinseto (Potter et al. (1993) Int. Rev. Immunol. 10(2-3):103-112). Anticorpostambém podem ser produzidos em animais transgênicos (Houdebine (2002)Curr. Opin. Biotechnol. 13(6):625-629) e plantas transgênicas (Schillberg etal. (2003) Cell Moi Life Sei. 60(3):433-45).II. Ácidos Nucléicos Anti-5T4 e Polipeptídeos
A presente invenção proporciona adicionalmente ácidosnucléicos isolados codificando regiões variáveis de cadeia pesada e deadeia leve anti-5T4, e polipeptídeos isolados codificados pelos ácidosnucléicos descritos. Ácidos nucléicos e polipeptídeos da invenção incluemas seqüências de nucleotídeos e aminoácidos das regiões variáveis Α1, A2,e A3, regiões variáveis Α1, A2, e A3 humanizadas, e variantes das mesmas.Os ácidos nucléicos e polipeptídeos isolados podem ser usados parapreparar anticorpos anti-5T4 quiméricos e humanizados.
II.A. Ácidos Nucléicos Anti-5T4
Ácidos nucléicos são desoxirribonucleotídeos ouribonucleotídeos e polímeros dos mesmos em forma de filamento único, defilamento duplo, ou triplexada. A menos que especificamente limitado,ácidos nucléicos podem conter análogos conhecidos de nucleotídeosnaturais que têm propriedades similares ao ácido nucléico natural dereferência. Ácidos nucléicos incluem genes, cDNAs, mRNAs, e cRNAs.Ácidos nucléicos podem ser sintetizados, ou podem ser derivados dequalquer fonte biológica, inclusive qualquer organismo. Métodos típicos paraclonar ácidos nucléicos que codificam anticorpos anti-5T4 são descritos nos
Exemplos 1 e 7.
Ácidos nucléicos típicos da invenção compreendem a seqüênciade nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, e 48.Em particular, ácidos nucléicos codificando as regiões variáveis de cadeiapesada A1, A2, e A3 compreendem nucleotídeos 58-41 de SEQ ID NO: 1,nucleotídeos 55-405 de SEQ ID NO: 5, e nucleotídeos 58-423 de SEQ IDNO: 9, respectivamente, os quais codificam regiões variáveis de cadeiapesada tendo as seqüências de aminoácidos expostas como resíduos 20-138 de SEQ ID NO: 2, resíduos 19-135 de SEQ ID NO: 6, e resíduos 20-141de SEQ ID NO: 10, respectivamente. Um ácido nucléico codificando umaregião variável de cadeia pesada A1 humanizada compreende nucleotídeos1-358 de SEQ ID NO: 48. Ácidos nucléicos codificando as regiões variáveisde cadeia leve A1, A2, e A3 compreendem os nucleotídeos 61-381 de SEQID NO: 3, nucleotídeos 67-390 de SEQ ID NO: 7, e nucleotídeos 61-381 deSEQ ID NO: 11, respectivamente, os quais codificam regiões variáveis decadeia pesada tendo as seqüências de aminoácidos expostas comoresíduos 21-127 de SEQ ID NO: 4, resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 8, eresíduos 21-127 de SEQ ID NO: 12, respectivamente. Ácidos nucléicosadicionais da invenção compreendem nucleotídeos codificando as regiõesvariáveis Α1, A2, e A3 humanizadas representadas nas figuras 9A-9C.
Ácidos nucléicos da invenção também podem compreender umaseqüência de nucleotídeos que é essencialmente idêntica a qualquer umadas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, e 48, inclusive seqüências denucleotídeos que são no mínimo 90% idênticas às seqüências codificandoregião variável de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, e 11, talcomo no mínimo cerca de 91% idênticas ou no mínimo 92% idênticas, taiscomo no mínimo 93% idênticas, ou no mínimo 94% idênticas, ou no mínimo95% idênticas, ou no mínimo 96% idênticas, ou no mínimo 97% idênticas, ouno mínimo 98% idênticas, ou no mínimo 99% idênticas. Por exemplo, ácidosnucléicos da invenção podem compreender (a) uma seqüência denucleotídeos que é no mínimo 98% idêntica a seqüência codificando regiãovariável de SEQ ID NO: 1; (b) uma seqüência de nucleotídeos que é nomínimo 97% idêntica a seqüência codificando região variável de SEQ ID NO:3; (c) uma seqüência de nucleotídeos que é no mínimo 98% idêntica aseqüência codificando região variável de SEQ ID NO: 5; (d) uma seqüênciade nucleotídeos que é no mínimo 98% idêntica a seqüência codificandoregião variável de SEQ ID NO: 7; (e) uma seqüência de nucleotídeos que éno mínimo 99% idêntica a seqüência codificando região variável de SEQ IDNO: 11; ou (f) uma seqüência de nucleotídeos que é no mínimo 89% idênticaa seqüência codificando região variável de SEQ ID NO: 48. Seqüências sãocomparadas para máxima correspondência usando um algoritmo decomparação de seqüência usando a seqüência codificando região variávelde extensão total de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 48, ouseqüências de nucleotídeos codificando seqüências de regiões variáveis A1,Α2, e Α3 humanizadas representadas nas figuras 9A-9H como a seqüênciade pergunta (busca), conforme descrito abaixo aqui, neste pedido depatente, ou por inspeção visual. Vide também o Exemplo 1 e a Tabela 1, e o
Exemplo 7 e a Tabela 11.
Seqüências essencialmente idênticas podem ser seqüênciaspolimórficas, isto é, seqüências alternativas ou alelos em uma população.Uma diferença alélica pode ser tão pequena quanto um par de bases.Seqüências essencialmente idênticas também podem compreenderseqüências mutagenizadas, inclusive seqüências compreendendo mutaçõessilenciosas. Uma mutação pode compreender uma ou mais alterações deresíduos, uma eliminação de um ou mais resíduos, ou uma inserção de umou mais resíduos adicionais.
Ácidos nucléicos essencialmente idênticos são adicionalmenteidentificados como ácidos nucléicos que hibridizam especificamente a ouhibridizam essencialmente à extensão total de qualquer uma das SEQ IDNOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, ou 48; a extensão total de uma seqüência codificandoregião variável de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, ou 48; ouseqüências de nucleotídeos codificando seqüências de regiões variáveis A1,A2, e A3 humanizadas representadas nas figuras 9A-9H, sob condiçõesestringentes. No contexto de hibridização de ácido nucléico, duasseqüências de ácido nucléico sendo comparadas podem ser designadasuma sonda e um alvo. Uma sonda é uma molécula de ácido nucléico dereferência, e um alvo é uma molécula de ácido nucléico de ensaio,freqüentemente encontrada dentro de uma população heterogênea demoléculas de ácido nucléico. Uma seqüência alvo é sinônima com umaseqüência de ensaio.
Para estudos de hibridização, sondas úteis são complementaresa ou simulam no mínimo uma seqüência de cerca de 14 a 40 nucleotídeosde uma molécula de ácido nucléico da presente invenção.Preferencialmente, sondas compreendem 14 a 20 nucleotídeos, ou aindamais caso desejado, tal como 30, 40, 50, 60, 100, 200, 300, ou 500nucleotídeos ou até a total extensão de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3,5, 7, 9, 11, ou 48; a total extensão de uma seqüência codificando regiãovariável de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, ou 48; ouseqüências de nucleotídeos codificando seqüências de regiões variáveis A1,A2, e A3 humanizadas representadas nas figuras 9A-9C. Os fragmentosreferidos podem ser prontamente preparados, por exemplo, por síntesequímica do fragmento, por aplicação de tecnologia de amplificação de ácidonucléico, ou introduzindo seqüências selecionadas em vetoresrecombinantes para produção recombinante.
Hibridização específica se refere à ligação, dúplice, ouhibridização de uma molécula somente para uma seqüência de nucleotídeosem particular sob condições estringentes quando esta seqüência estápresente em uma mistura complexa de ácido nucléico (por exemplo, DNA ouRNA celular total). Hibridização específica pode conciliar combinaçõesinadequadas entre a sonda e a seqüência alvo dependendo da estringênciadas condições de hibridização.
Condições de hibridização estringentes e condições de lavagemde hibridização estringentes no contexto de experimentos de hibridização deácido nucléico tais como análise Southern e Northern blot são tantoseqüência- quanto ambiente-dependentes. Seqüências mais longashibridizam especificamente em maiores temperaturas. Um guia extensivopara a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen (1993)Laboratorv Techniaues in Biochemistrv and Molecular Bioloav-Hvbridizationwith Nucleic Acid Probes, part I chapter 2, Elsevier, New York, New York.Geralmente, condições de lavagem e de hibridização altamente estringentessão selecionadas para serem cerca de 5eC menores do que o ponto defusão térmica (Tm) para a seqüência específico em uma força iônica e pHdefinidos. Tipicamente, sob condições estringentes uma sonda hibridizaráespecificamente a sua subseqüência alvo, mas não a outras seqüências.
A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual50% da seqüência alvo hibridiza a uma sonda perfeitamente combinada.Condições muito estringentes são selecionadas para serem iguais à Tm parauma sonda particular. Um exemplo de condições de hibridizaçãoestringentes para análise Southern ou Northern Blot de ácidos nucléicoscomplementares tendo mais de cerca de 100 resíduos complementares éhibridização de um dia para o outro em 50% de formamida com 1 mg deheparina a 42-C. Um exemplo de condições de lavagem altamenteestringentes é 15 minutos em 0,1 X SSC a 65-C. Um exemplo de condiçõesde lavagem estringentes é 15 minutos em 0,2X tampão SSC a 65-C. VideSambrook et al., eds (1989) Molecular Clonina: A Laboratorv Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, para umadescrição de tampão SSC. Freqüentemente, uma lavagem de altaestringência é precedida por uma lavagem de baixa estringência pararemover sinal de sonda de pano de fundo. Um exemplo de condições delavagem de média estringência para um dúplex de mais de cerca de 100nucleotídeos, é 15 minutos em 1X SSC a 45-C. Um exemplo de lavagem debaixa estringência para um dúplex de mais de cerca de 100 nucleotídeos, éminutos em 4X a 6X SSC a 40-C. Para sondas curtas (por exemplo,cerca de 10 a 50 nucleotídeos), condições estringentes tipicamenteenvolvem concentrações de sal de menos de cerca de 1 M de íons Na+,tipicamente cerca de 0,01 a 1 M de concentração de íons Na+ (ou outrossais) em pH 7.0 a 8.3, e a temperatura é tipicamente no mínimo cerca de30-C. Condições estringentes também podem ser obtidas com a adição deagentes desestabilizantes tais como formamida. Em geral, uma proporçãode sinal para ruído de 2 vezes (ou superior) a observada para uma sondanão relacionada no ensaio de hibridização particular indica detecção de umahibridização específica.
Os seguintes são exemplos de condições de hibridização elavagem que podem ser usados para identificar seqüências de nucleotídeosque são essencialmente idênticas às seqüências de nucleotídeos dereferência da presente invenção: uma sonda seqüência de nucleotídeospreferencialmente hibridiza a uma seqüência de nucleotídeos alvo em 7% dedodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°Cseguido por lavagem em 2X SSC, 0,1% de SDS a 50°C; maispreferencialmente, uma sonda e seqüência alvo hibridizam em 7% dedodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°Cseguido por lavagem em 1X SSC, 0,1% de SDS a 50°C; maispreferencialmente, uma sonda e seqüência alvo hibridizam em 7% dedodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°Cseguido por lavagem em 0,5X SSC, 0,1% de SDS a 50°C; maispreferencialmente, uma sonda e seqüência alvo hibridizam em 7% dedodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°Cseguido por lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% de SDS a 50°C; maispreferencialmente, uma sonda e seqüência alvo hibridizam em 7% dedodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°Cseguido por lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% de SDS a 65°C.
Uma indicação adicional de que duas seqüências de ácidonucléico são essencialmente idênticas é que proteínas codificadas pelosácidos nucléicos são essencialmente idênticas, partilham uma estruturatridimensional global, ou são equivalentes biologicamente funcionais. Estestermos são adicionalmente definidos abaixo aqui, neste pedido de patente.Moléculas de ácidos nucléicos que não hibridizam umas às outras sobcondições estringentes são ainda essencialmente idênticas se as proteínascorrespondentes são essencialmente idênticas. Isto pode ocorrer, porexemplo, quando duas seqüências de nucleotídeos compreendem variantesconservativamente substituídas conforme permitido pelo código genético.
Variantes conservativamente substituídas são seqüências deácido nucléico tendo substituições de códons degenerados em que a terceiraposição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída comresíduos de base mista e/ou deoxiinosina. Vide Batzer et al. (1991) NucleicAcids Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Bioi Chem. 260:2605-2608; eRossolini et al. (1994) Mol Cell Probes 8:91 -98.
Ácidos nucléicos da invenção também compreendem ácidosnucléicos complementares a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9,11, 48, ou seqüências de nucleotídeos codificando seqüências de regiõesvariáveis A1, A2, e A3 humanizadas representadas nas figuras 9A-9C, esubseqüências e seqüências alongadas de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9,11, 48,ou seqüências de nucleotídeos codificando seqüências de regiões variáveisΑ1, A2, e A3 humanizadas representadas nas figuras 9A-9C, e seqüênciascomplementares das mesmas. Seqüências complementares são duasseqüências de nucleotídeos que compreendem seqüências de nucleotídeosantiparalelas capazes de pareamento uma com a outra na formação depontes de hidrogênio entre pares de bases. Conforme usado aqui, nestepedido de patente, o termo seqüências complementares significa seqüênciasde nucleotídeos as quais são essencialmente complementares, conformepode ser avaliado pelos mesmos métodos de comparação de nucleotídeosdeterminados abaixo, ou é definido como sendo capaz de hibridizar aosegmento de ácido nucléico em questão sob condições relativamenteestringentes tais como as descritas aqui, neste pedido de patente. Umexemplo particular de um segmento de ácido nucléico complementar é umoligonucleotídeo anti-sentido.
Uma subseqüência é uma seqüência de ácido nucléico quecompreende uma parte de uma seqüência de ácido nucléico mais longa.Uma subseqüência típica é uma sonda, descrita acima aqui, neste pedido depatente, ou um iniciador. O termo iniciador conforme usado aqui, nestepedido de patente, se refere a uma seqüência contígua compreendendocerca de 8 ou mais desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos,preferencialmente 10 a 20 nucleotídeos, e mais preferencialmente 20 a 30nucleotídeos de uma molécula de ácido nucléico selecionada. Osiniciadores da invenção englobam oligonucleotídeos de suficiente extensão eseqüência apropriada de modo a proporcionar iniciação de polimerizaçãosobre uma molécula de ácido nucléico da presente invenção.
Uma seqüência alongada compreende nucleotídeos adicionais(ou outras moléculas análogas) incorporados no ácido nucléico. Porexemplo, uma polimerase (por exemplo, uma DNA polimerase) podeadicionar seqüências no término 3' da molécula de ácido nucléico. Alémdisso, a seqüência de nucleotídeos pode ser combinada com outrasseqüências de DNA, tais como promotores, regiões de promotores,reforçadores, sinais de poliadenilação, seqüências intrônicas, sítiosenzimáticos de restrição adicionais, múltiplos sítios de clonagem, e outrossegmentos codificantes. Portanto, a invenção também proporciona vetorescompreendendo os ácidos nucléicos descritos, inclusive vetores paraexpressão recombinante, em que um ácido nucléico da invenção éencadeado operativamente a um promotor funcional. Quando encadeadooperativamente a um ácido nucléico, um promotor está em combinaçãofuncional com o ácido nucléico de tal modo que a transcrição do ácidonucléico é controlada e regulada pela região promotora. Vetores se referema ácidos nucléicos capazes de replicação em uma célula hospedeira, taiscomo plasmídeos, cosmídeos, e vetores virais.
Ácidos nucléicos da presente invenção podem ser clonados,sintetizados, alterados, mutagenizados, ou combinações dos mesmos.Técnicas de clonagem molecular e de DNA recombinante de rotina usadaspara isolar ácidos nucléicos são conhecidas na técnica. Mutagênese sítio-específica para criar alterações, eliminações, ou pequenas inserções depares de bases também é conhecida na técnica. Vide, por exemplo,Sambrook et al. (eds.) (1989) Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual. ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Silhavy etal. (1984) Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, New York; Glover & Hames (1995) DNA Cloninq:A Practical Approach, 2nd ed. IRL Press at Oxford University Press,Oxford/New York; Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Bioloqy,3rd ed. Wiley, New York.
II.B. Polipeptídeos Anti-5T4
A presente invenção também proporciona polipeptídeos anti-5T4
isolados. Polipeptídeos e proteínas se referem cada a um compostoconstituído de uma cadeia única de aminoácidos unida por ligaçõespeptídicas. Polipeptídeos de regiões variáveis de cadeia pesada típicos sãoexpostos como resíduos 20-138 de SEQ ID NO: 2, resíduos 19-135 de SEQID NO: 6, resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 10, e resíduos 1-119 de SEQ IDNO: 49. Polipeptídeos de regiões variáveis de cadeia leve típicos sãoexpostos como resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 4, resíduos 23-130 de SEQID NO: 8, e resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 12. Polipeptídeos adicionaisda invenção compreendem aminoácidos das regiões variáveis Α1, A2, e A3humanizadas representadas nas figuras 9A-9C.
Polipeptídeos adicionais da invenção incluem polipeptídeos deregiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve que sãoessencialmente similares aos polipeptídeos anti-5T4 descritos, tal como nomínimo cerca de 90% idênticas às regiões variáveis de SEQ ID NOs: 2, 4, 6,8, 10, 12, e 49, por exemplo, no mínimo cerca de 91% idênticas, no mínimo92% idênticas, no mínimo 93% idênticas, no mínimo 94% idênticas, nomínimo 95% idênticas, no mínimo 96% idênticas, no mínimo 97% idênticas,no mínimo 98% idênticas, ou no mínimo 99% idênticas. As seqüências sãocomparadas para máxima correspondência usando um algoritmo decomparação de seqüência usando a seqüência de extensão total dequalquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 49, ou qualquer uma dasregiões variáveis Α1, A2, ou A3 humanizadas representadas nas figuras 9A-9C como a seqüência de pergunta, ou a seqüência de região variável damesma, ou por inspeção visual. A invenção engloba adicionalmentepolipeptídeos codificados por qualquer um dos ácidos nucléicos descritosaqui, neste pedido de patente.
Por exemplo, polipeptídeos típicos da invenção incluem (a)polipeptídeos tendo uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 85%similar aos resíduos 20-138 de SEQ ID NO: 2; (b) polipeptídeos tendo umaseqüência de aminoácidos que é no mínimo 94% similar aos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 4; (c) polipeptídeos tendo uma seqüência deaminoácidos que é no mínimo 86% similar aos resíduos 19-135 de SEQ IDNO: 6; (d) polipeptídeos tendo uma seqüência de aminoácidos que é nomínimo 96% similar aos resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 8; (e) polipeptídeostendo uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 91% similar aosresíduos 20-141 de SEQ ID NO: 10; (f) polipeptídeos tendo uma seqüênciade aminoácidos que é no mínimo 98% similar aos resíduos 21-127 de SEQID NO: 12; e (g) polipeptídeos tendo uma seqüência de aminoácidos que éno mínimo 90% similar aos resíduos 1-119 de SEQ ID NO: 49. Vide oExemplo 1 e a Tabela 2, e o Exemplo 7 e a Tabela 11.
Polipeptídeos da invenção podem compreender aminoácidosque ocorrem naturalmente, aminoácidos sintéticos, aminoácidosgeneticamente codificados, aminoácidos não geneticamente codificados, ecombinações dos mesmos. Polipeptídeos podem incluir tanto aminoácidosde forma-L quanto de forma-D.
Aminoácidos não geneticamente codificados típicos incluem masnão estão limitados a ácido 2-aminoadípico; ácido 3-aminoadípico; ácido β-aminopropiônico; ácido 2-aminobutírico; ácido 4-aminobutírico (ácidopiperidínico); ácido 6-aminocapróico; ácido 2-aminoheptanóico; ácido 2-aminoisobutírico; ácido 3-aminoisobutírico; ácido 2-aminopimélico; ácido 2,4-diaminobutírico; desmosina; ácido 2,2'-diaminopimélico; ácido 2,3-diaminopropiônico; N-etilglicina; N-etilasparagina; hidroxilisina; alo-hidroxilisina; 3-hidroxiprolina; 4-hidroxiprolina; isodesmosina; allo-isoleucina; N-metilglicina (sarcosina); N-metilisoleucina; N-metilvalina; norvalina;norleucina; e ornitina.
Aminoácidos derivados típicos incluem, por exemplo, asmoléculas nas quais grupos amino livres foram derivados para formarcloridratos de amina, grupos p-tolueno sulfonila, grupos carbobenzóxi,grupos t-butiloxicarbonila, grupos cloroacetila ou grupos formila. Gruposcarboxila livres podem ser derivados para formar sais, metil e ésteres etílicosou outros tipos de ésteres ou hidrazidas. Grupos oxidrila livres podem serderivados para formar derivados de O-acila ou O-alquila. O nitrogênio doimidazol de histidina pode ser derivado para formar N-im-benzilhistidina.
A presente invenção também proporciona fragmentos de umpolipeptídeo anti-5T4 da invenção, por exemplo, fragmentos constituindo umsítio de ligação de antígeno 5T4. Seqüências de polipeptídeos que são maislongas do que as seqüências descritas também são proporcionadas. Porexemplo, um ou mais aminoácidos podem ser adicionados ao N-término ouC-término de um polipeptídeo de anticorpo. Os aminoácidos adicionaisreferidos podem ser empregados em uma variedade de aplicações, inclusivemas não limitadas a aplicações de purificação. Métodos para prepararproteínas alongadas são conhecidos na técnica.
Polipeptídeos anti-5T4 da invenção incluem proteínascompreendendo aminoácidos que são variantes conservativamentesubstituídas de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, ou 49.
Uma variante conservativamente substituída se refere a um polipeptídeocompreendendo um aminoácido no qual um ou mais resíduos foramsubstituídos conservativamente com um resíduo funcionalmente similar.
Exemplos de substituições conservativas incluem a substituiçãode um resíduo não polar (hidrofóbico) tal como isoleucina, valina, Ieucina oumetionina por outro; a substituição de um resíduo polar (hidrofílico) por outrotal como entre arginina e lisina, entre glutamina e asparagina, entre glicina eserina; a substituição de um resíduo básico tal como lisina, arginina ouhistidina por outro; ou a substituição de um resíduo acidífero, tal como ácidoaspártico ou ácido glutâmico por outro.
Polipeptídeos isolados da invenção podem ser purificados ecaracterizados usando uma variedade de técnicas de rotina que sãoconhecidas do profissional versado. Vide, por exemplo, Schrõder & Lübke(1965) The Peptides. Academic Press, New York; Bodanszky (1993)Principies of Peptide Svnthesis, 2nd rev. ed. Springer-Verlag, Berlin/ NewYork; Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology. 3rd ed.Wiley, New York.
II.C. Comparações de Seqüências de Nucleotídeos e Aminoácidos
Os termos idênticos ou a percentagem de identidade no contextode duas ou mais seqüências de nucleotídeos ou proteínas, se referem aduas ou mais seqüências ou subseqüências que são as mesmas ou têmuma percentagem especificada de resíduos aminoácidos ou nucleotídeosque são os mesmos, quando comparados e alinhados para máximacorrespondência, conforme medido usando um dos algoritmos decomparação de seqüência descritos aqui, neste pedido de patente, ou porinspeção visual.
O termo substancialmente idêntico com respetio a umaseqüência de nucleotídeo ou proteína significa que uma seqüência particularvaria da seqüência de uma seqüência que ocorre naturalmente por uma oumais eliminações, substituições, ou adições, cujo efeito final é conservar afunção biológica de um polipeptídeo ou ácido nucléico anti-5T4.
Para comparação de duas ou mais seqüências, tipicamente umaseqüência age como uma seqüência de referência à qual uma ou maisseqüências de ensaio são comparadas. Ao usar um algoritmo decomparação de seqüência, seqüências de ensaio e de referência sãointroduzidas em um programa de computador, coordenadas desubseqüências são designadas caso necessário, e são selecionadosparâmetros do programa de algoritmo de seqüências. O algoritmo decomparação de seqüências calcula então a percentagem de identidade deseqüência para a uma ou mais seqüências de ensaio designadas em relaçãoa seqüência de referência, com base nos parâmetros do programaselecionado.
Alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode serconduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith &Waterman (1981) Adv. AppL Math 2:482-489, pelo algoritmo de alinhamentode homologia de Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, pelapesquisa para método de similaridade de Pearson & Lipman (1988) Proc.NatL Acad. Sei. USA 85:2444-2448, por implementações computadorizadasdestes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA in the WisconsinGenetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison,Wisconsin), ou por inspeção visual. Vide, de modo geral, Ausubel (ed.)(1995) Short Protocols in Molecular Bioloqy, 3rd ed. Wiley, New York.
Um algoritmo preferencial para determinar a percentagem deidentidade de seqüência e similaridade de seqüência é o algoritmo BLAST, oqual é descrito em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Oprograma para realizar análises BLAST está disponível publicamente atravésda National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Os parâmetros do algoritmo BLASTdeterminam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. Paracomparação de duas seqüências de nucleotídeos, os parâmetros default deBLASTn são ajustados em W = 11 (extensão de palavra) e E = 10(expectativa), e também incluem uso de um filtro de baixa complexidadepara mascarar resíduos da seqüência de pergunta tendo baixacomplexidade composicional. Para comparação de duas seqüências deaminoácidos, os parâmetros default do programa BLASTp são ajustados emW = 3 (extensão de palavra), E = 10 (expectativa), uso da matriz declassificação BLOSUM62, custos de gap de existência = 11 e extensão = 1,e uso de um filtro de baixa complexidade para mascarar resíduos daseqüência de pergunta tendo baixa complexidade composicional. Vide o
Exemplo 1.
III. Conjugados de Anticorpo Anti-5T4 / Fármaco
A presente invenção proporciona adicionalmente conjugados deanticorpo / fármaco compreendendo um anticorpo anti-5T4 da invenção.Também são proporcionados métodos para preparar os conjugados deanticorpo / fármaco, de tal modo que o fármaco seja ligado ao anticorpo oudiretamente ou indiretamente. Os conjugados de anticorpo / fármaco dainvenção têm a fórmula geral 5T4Ab(-X-W)mem que:
5T4Ab é um anticorpo anti-5T4 ou fragmento de anticorpoconforme descrito aqui, neste pedido de patente;
X é um Iigante que compreende um produto de qualquer gruporeativo que pode reagir com um anticorpo anti-5T4 ou fragmento deanticorpo;
W é um fármaco;
m é a carga média para um produto de conjugação purificado
(por exemplo, m de tal modo que o fármaco constitua cerca de 3 a 10% doconjugado em peso); e
(-X-W)m é um fármaco derivado.
Também são proporcionados métodos para preparar conjugadosde anticorpo / fármaco da invenção. Como um exemplo, um conjugado deanticorpo / fármaco da fórmula 5T4Ab(-X-W)m pode ser preparado (a)adicionando o derivado de fármaco ao anticorpo anti-5T4 em que o fármacoé 3 a 10% em peso do anticorpo anti-5T4; (b) incubando o derivado defármaco e o anticorpo anti-5T4 em uma solução tamponada não nucleofílica,compatível com proteína, tendo um pH em uma faixa de cerca de 7 a 9 paraproduzir um conjugado de anticorpo / fármaco, em que a soluçãocompromete adicionalmente (i) um co-solvente orgânico adequado, e (ii) eum ou mais aditivos compreendendo no mínimo um ácido biliar ou seu sal, eem que a incubação é conduzida em uma temperatura variando de cerca de30°C a cerca de 35°C por um período de tempo variando de cerca de 15minutos a cerca de 24 horas; e (c) submetendo o conjugado produzido na10 etapa (b) a um processo de separação cromatográfica para separarconjugados de anticorpo / fármaco com uma carga na faixa de 3 a 10% empeso de fármaco e com baixa fração conjugada (LCF) de anticorpo anti-5T4não conjugado, derivado de fármaco, e conjugados agregados.III.A. Fármacos
Um fármaco é qualquer substância tendo atividade biológica oudetectável, por exemplo, agentes terapêuticos, etiquetas detectáveis,agentes de ligação, e etc., e pró-fármacos, os quais são metabolizados paraum agente ativo in vivo. Um fármaco também pode ser um derivado defármaco, em que um fármaco foi funcionalizado para possibilitar conjugaçãocom um anticorpo da invenção. De modo geral, estes tipos de conjugadossão referidos como imunoconjugados.
Agentes terapêuticos são composições que podem ser usadaspara tratar ou prevenir uma condição em um sujeito que necessite dosmesmos. Agentes terapêuticos úteis na invenção incluem agentesanticancerígenos, isto é, agentes tendo atividade anticancerígena em célulasexpressando 5T4 tais como células cancerígenas de carcinoma pulmonarescamoso / adenomatoso (carcinoma pulmonar de células não pequenas),carcinoma de mama invasivo, carcinoma colorretal, carcinoma gástrico,carcinoma cervical escamoso, adenocarcinoma endometrial invasivo,carcinoma de pâncreas invasivo, carcinoma de ovário, carcinoma vesicalescamoso, e coriocarcinoma.
Fármacos terapêuticos típicos incluem citotoxinas, radioisótopos,agentes quimioterápicos, agentes imunomoduladores, agentesantiangiogênicos, agentes antiproliferativos, agentes pró-apoptóticos, eenzimas citostáticas e citolíticas (por exemplo, RNAses). Um fármacotambém pode incluir um ácido nucléico terapêutico, tal como um genecodificando um agente imunomodulador, um agente anti-angiogênico, umagente antiproliferativo, ou um agente pró-apoptótico. Estes termos defármacos não são mutualmente exclusivos, e portanto podem ser descritosum agente terapêutico usando um ou mais dos termos mencionados acima.Por exemplo, radioisótopos selecionados também são citotoxinas. Agentesterapêuticos podem ser preparados como sais farmaceuticamenteaceitáveis, ácidos ou derivados de quaisquer dos acima. Geralmente,conjugados tendo um radioisótopo como o fármaco são referidos comoradioimunoconjugados e aqueles tendo um agente quimioterápico como ofármaco são referidos como quimioimunoconjugados.
Exemplos de fármacos adequados para uso emimunoconjugados incluem os taxanos, maitansinas, CC-1065 e asduocarmicinas, as caliqueamicinas e outras enediinas, e as auristatinas.Outros exemplos incluem os antifolatos, vinca alcalóides, e as antraciclinas.Toxinas de plantas, outras proteínas bioativas, enzimas (isto é, ADEPT),radioisótopos, fotossensibilizantes (isto é, para terapia fotodinâmica) tambémpodem ser usados em imunoconjugados. Além disso, conjugados podemser preparados usando veículos secundários como o agente citotóxico, taiscomo Iipossomas ou polímeros, por exemplo,.
O termo citotoxina de modo geral se refere a um agente queinibe ou previne a função de células e/ou resulta em destruição de células.Citotoxinas típicas incluem antibióticos, inibidores de polimerização detubulina, agentes alquilantes que ligam a e rompem DNA, e agentes quequebram a síntese de proteína ou a função de proteínas celulares essenciaistais como quinases protéicas, fosfatases, topoisomerases, enzimas, eciclinas. Citotoxinas típicas incluem, mas não estão limitadas a,doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, aclarrubicina, zorrubicina,mitoxantrona, epirrubicina, carubicina, nogalamicina, menogaril,pitarrubicina, valrubicina, citarabina, gencitabina, trifluridina, ancitabina,enocitabina, azacitidina, doxifluridina, pentostatina, broxuridina, capecitabina,cladribina, decitabina, floxuridina, fludarabina, gougerotina, puromicina,tegafur, tiazofurin, adriamicina, cisplatina, carboplatina, ciclofosfamida,dacarbazina, vinblastina, vincristina, mitoxantrona, bleomicina,mecloretamina, prednisona, procarbazina, metotrexato, flurouracilas,etoposídeo, taxol, análogos de taxol, platinas tais como cis-platina e carbo-platina, mitomicina, tiotepa, taxanos, vincristina, daunorrubicina, epirrubicina,actinomicina, authramicina, azaserinas, bleomicinas, tamoxifeno,idarrubicina, dolastatinas / auristatinas, hemiasterlinas, esperamicinas emaitansinóides.
Em modalidades particulares da invenção, uma citotoxina é umantibiótico tal como uma caliqueamicina, também denominado o complexoLL-E33288, por exemplo, gama-caliqueamicina (γι) ou N-acetil gama-.5 caliqueamicina. Vide a Patente dos Estados Unidos N- 4.970.198.Exemplos adicionais de caliqueamicinas adequadas para uso na preparaçãode conjugados de anticorpo / fármaco da invenção são descritos nasPatentes dos Estados Unidos N- 4.671.958; 5.053.394; 5.037.651;5.079.233; e 5.108.912, os quais são incorporados aqui, a este pedido depatente, em sua totalidade. Estes compostos contêm um trissulfeto demetila que pode ser reagido com tióis apropriados para formar dissulfetos,ao mesmo tempo introduzindo um grupo funcional tal como uma hidrazida ououtro grupo funcional que é útil para conjugar caliqueamicina a um anticorpoanti-5T4. Também podem ser usados análogos dissulfeto decaliqueamicina, por exemplo, análogos descritos nas Patentes dos EstadosUnidos N— 5.606.040 e 5.770.710, as quais são incorporadas aqui, a estepedido de patente, em sua totalidade.
Para aplicações em radioterapia, um anticorpo anti-5T4 dainvenção pode compreender um radioisótopo de alta energia. O isótopopode ser diretamente ligado ao anticorpo, por exemplo, em um resíduocisteína presente no anticorpo, ou um quelador pode ser usado para mediara ligação do anticorpo e o radioisótopo. Radioisótopos adequados pararadioterapia incluem mas não estão limitados a α-emissores, β-emissores, eelétrons Auger. Para aplicações em diagnóstico, radioisótopos úteis incluememissores de pósitrons e γ-emissores. Um anticorpo anti-5T4 da invençãopode ser adicionalmente iodado, por exemplo, sobre um resíduo tirosina doanticorpo, para facilitar detecção ou efeito terapêutico do anticorpo.
Radioisótopos típicos que podem ser conjugados a um anticorpoanti-5T4 incluem 18flúor, 64cobre, 65cobre, 67gálio, 68gálio, 77bromo, 80mbromo,95rutênio, 97rutênio, 103rutênio, 105rutênio, 99mtecnécio, 107mercúrio,203mercúrio, 123iodo, 124iodo, 125iodo, 126iodo, 131 iodo, 133iodo, 111índio,113índio, 99mrênio, 105rênio, 101rênio, 186rênio, 188rênio, 121mtelúrio, "tecnécio,122mtelúrio, 125mtelúrio, 165túlio, 167túlio, 168túlio, 90Itrio, e formas de nitreto ouóxido derivadas dos mesmos. Outros radioisótopos adequados incluem alfaemissores, tais como 213bismuto, 213Chumbo, e 225actínio.
Conjugados de anticorpo / fármaco da invenção podem incluirimunomoduladores, isto é, agentes que provocam uma reação imune,inclusive reações imunes humorais (por exemplo, produção de anticorposantígeno-específicos) e reações imunes mediadas por células (por exemplo,proliferação de linfócitos). Agentes imunomoduladores típicos includemcitocinas, xantinas, interleucinas, interferons, e fatores de crescimento (porexemplo, TNF, CSF, GM-CSF e G-CSF), e hormônios tais como estrogênios(dietilstilbestrol, estradiol), androgênios (testosterona, HALOTESTIN®(fluoximesterona)), progestinas (MEGACE® (acetato de megestrol),PROVERA® (acetato de medroxiprogesterona)), e corticosteróides(prednisona, dexametasona, hidrocortisona).
Agentes imunomoduladores úteis na invenção também incluemanti-hormônios que bloqueiam a ação hormonal sobre tumores e agentesimunossupressores que suprimem a produção de citocina, regulam parabaixo expressão de auto-antígeno, ou mascaram antígenos MHC. Anti-hormônios típicos incluem antiestrogênios inclusive, por exemplo,tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazóis inibidores de aromatase, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY 117018, onapnstone, etoremifeno; e antiandrogênios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida,leuprolida, e goserelin; e agentes anti-adrenais. Agentes imunossupressorestípicos incluem pirimidinas 2-amino-6-aril-5-substituídas, azatioprina,ciclofosfamida, bromocriptina, danazol, dapsone, glutaraldeído, anticorposantiidiotípicos para antígenos MHC e fragmentos de MHC, ciclosporina A,5 esteróides tais como glicocorticosteróides, citocina ou antagonistas dereceptores de citocina (por exemplo, anticorpos antiinterferon, anticorposanti-IL10, anticorpos anti-TNFa, anticorpos anti-IL2), estreptoquinase, TGFp,rapamicina, receptores de células T, fragmentos de receptores de células T,e anticorpos receptores de células T.
Fármacos adicionais úteis na invenção incluem agentesantiangiogênicos que inibem a formação de vasos sangüíneos, por exemplo,inibidores de farnesiltransferase, inibidores de COX-2, inibidores de VEGF,inibidores de bFGF, inibidores de esteróide sulfatase (por exemplo, 2-metoxiestradiol bis-sulfamato (2-MeOE2bisMATE)), interleukin-24,thrombospondin, proteínas metaloespondina, interferons classe I,interleucina 12, protamina, angiostatina, laminina, endostatina, e fragmentosde prolactina.
Agentes antiproliferativos e agentes pró-apoptóticos incluemativadores de PPAR-gama (por exemplo, ciclopentenona prostaglandinas(cyPGs)), retinóides, triterpinóides (por exemplo, cicloartano, lupano, ursano,oleanano, friedelano, damarano, cucurbitacina, e limonóide triterpenóides),inibidores de EGF receptor (por exemplo, HER4), rampamicina,CALCITRIOL® (1,25-diidroxicolecalciferol (vitamina D)), inibidores dearomatase (FEMARA® (Ietrozone)), inibidores de telomerase, queladores deferro (por exemplo, 3-aminopiridina-2-carboxaldeído tiosemicarbazona(Triapine)), apoptina (proteína viral 3 - VP3 do vírus da anemia do frango),inibidores de Bcl-2 e Bcl-X(L), TNF-alfa, FAS ligante, Iigante indutor deapoptose relacionada com TNF (TRAIL/Apo2L), ativadores de TNF-alfa /FAS ligante / ligante indutor de apoptose relacionada com sinalização deTNF (TRAIL/Apo2L), e inibidores de sinalização do caminho de sobrevidaPI3K-Akt (por exemplo, UCN-01 e geldanamicina).
Agentes quimioterápicos típicos incluem agentes alquilantes taiscomo tiotepa e cuclosfosfamida; sulfonatos de alquila tais como bussulfan,improssulfan e pipossulfan; aziidinas tais como benzodopa, carboquone,meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas inclusivealtretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamidae trimetilolomelamina; mostardas de nitrogênio tais como clorambucil,clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina,cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina,prednimustina, trofosfarnida, mostarda de uracila; nitrosuréias tais comocarmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina;antibióticos tais como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina,bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina,carzinofilina, chromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorubicina,idarrubicina, marcellomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina,olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina,rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex,zinostatina, zorrubicina; anti-metabólitos tais como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico tais como denopterina,metotrexato, pteropterin, trimetrexato; análogos de purina tais comofludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidinatais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina,dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-EU; androgênios taiscomo calusterone, propionato de dromostanolone, epitiostanol, mepitiostano,testolactona; antiadrenal tal como arninoglutetimida, mitotane, trilostano;reabastecedores de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona;glicosídeo de aldofosfarnida; ácido arninolevulínico; ansacrina; bestrabucil;bisantrena; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquone; elfornitina;acetato de eliptínio; etoglucid; nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinan;lonidamine; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrine; pentostatin;fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina;razoxane; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2, 2', 2' -triclorotrietilamina; uretan; vindesina; dacarbazina; manomustina;mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosine; arabinosídeo (Ara-C);ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, por exemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology of Princeton, New Jersey) e doxetaxel(TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer of Antony, França); ciorambucil;
gencitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platinatais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16);ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina;novantrone; teniposídeo; daunomicina; aininopterin; xeloda; ibandronate;CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO);ácido retinóico; esperamicinas; e capecitabina.
Agentes terapêuticos adicionais que podem ser conjugados aanticorpos anti-5T4 e usado de acordo com os métodos terapêuticos dapresente invenção incluem agentes fotossensibilizantes (Publicação dePatente dos Estados Unidos No. 2002/0197262 e Patente dos EstadosUnidos No. 5.952.329) para terapia fotodinâmica; partículas magnéticas paratermoterapia (Publicação de Patente dos Estados Unidos No.2003/0032995); agentes de ligação, tais como peptídeos, ligantes, Iigantesde adesão celular, e etc., e pró-fármacos tais como pró-fármacos contendofosfato, pró-fármacos contendo tiofosfato, pró-fármacos contendo sulfato,pró-fármacos contendo peptídeo, pró-fármacos contendo β-lactama, pró-fármacos contendo fenoxiacetamida substituída ou pró-fármacos contendofenilacetamida substituída, 5-fluorocitosina e outros pró-fármacos de 5-fluorouridina que podem ser convertidas para o fármaco livre de citotóxico mais ativo.
Para métodos diagnósticos usando anticorpos anti-5T4, umfármaco pode compreender uma etiqueta detectável usado para detectar apresença de células expressando 5T4 in vitro ou in vivo. Radioisótopos quesão detectáveis in vivo, tais como as etiquetas que são detectáveis usandocintigrafia, estudo por imagens de ressonância magnética, ou ultrassom,podem ser usados em aplicações diagnosticas clínicas. Etiquetascintigráficas úteis incluem emissores de pósitrons e γ-emissores. Agentes decontraste típicos para estudo por imagens de fonte magnética são íonsparamagnéticos ou superparamagnéticos (por exemplo, ferro, cobre,manganês, cromo, érbio, európio, disprósio, hólmio e gadolínio), partículasde oxido de ferro, e agentes de contraste solúveis em água. Para detecçãoultrassônica, gases ou líquidos podem ser capturados em partículasinorgânicas porosas que são liberadas como agentes de contraste demicrobolhas. Para detecção in vitro, etiquetas detectáveis úteis incluemfluoróforos, epitopos detectáveis ou agentes de ligação, e etiquetasradioativas.
III.B. Moléculas Liqantes
Fármacos são conjugados a anticorpos anti-5T4 quiméricos ehumanizados da invenção ou diretamente ou indiretamente através de umamolécula ligante. A molécula Iigante pode ser estável ou hidrolisável, pormeio do que é liberada depois do ingresso celular. Os principaismecanismos pelos quais o fármaco é clivado do anticorpo incluem hidról.iseno pH acidífero dos Iisossomas (hidrazonas, acetais, e amidas semelhantesa cis-aconitato), clivagem de peptídeo por enzimas lisossômicas (ascatepsinas e outras enzimas lisossômicas), e redução de dissulfetos. Emconseqüência destes mecanismos variáveis para clivagem, mecanismos deligação do fármaco ao anticorpo também variam amplamente e pode serusado qualquer ligante adequado. Preferencialmente, o método deconjugação produz uma amostra com mínima fração de baixo conjugado(LCF, a fração de anticorpo principalmente não conjugado), isto é, menos decerca de 10%.
Um exemplo de um procedimento de conjugação adequado sebaseia na conjugação de hidrazidas e outros nucleófilos aos aldeídosgerados por oxidação dos carboidratos que ocorrem naturalmente sobreanticorpos. Conjugados contendo hidrazona podem ser preparados comgrupos carbonila introduzidos que proporcionam as propriedades deliberação de fármaco desejadas. Também podem ser preparadosconjugados com um ligante que tem um dissulfeto em uma extremidade,uma cadeia alquila no meio, e um derivado de hidrazina na outraextremidade. As antraciclinas são um exemplo de citotoxinas que podemser conjugadas a anticorpos usando esta tecnologia.
Ligantes contendo grupos funcionais diferentes de hidrazonastêm o potencial de serem clivados no meio acidífero dos lisossomas. Porexemplo, conjugados podem ser preparados a partir de Iigantes reativos comtiol que contêm um sítio diferente de uma hidrazona que é clivávelintracelularmente, tais como ésteres, amidas, e acetais / cetais.Camptotecina é um agente citotóxico que pode ser conjugado usando estesligantes. Também podem ser usados cetais preparados a partir de umacetona de anel de 5 a 7 membros e que tem um dos oxigênios fixado aoagente citotóxico e o outro a um Iigante para fixação de anticorpo. Asantraciclines também são um exemplo de uma citotoxina adequada para usocom estes ligantes.
Outro exemplo de uma classe de ligantes sensíveis ao pH sãoos cis-aconitatos, os quais têm um ácido carboxílico justaposta a umaligação amida. O ácido carboxílico acelera hidrólise de amida noslisossomas acidíferos. Também podem ser usados ligantes que obtêm umaaceleração de índice de tipo de hidrólise similar com vários outros tipos deestruturas. Os maitansinóides são um exemplo de uma citotoxina que podeser conjugada com ligantes fixados a C-9.
Outro método de liberação potencial para conjugados defármaco é a hidrólise enzimática de peptídeos pelas enzimas lisossômicas.Em um exemplo, um peptídeo é fixado através de uma ligação amida aálcool para-aminobenzílico e em seguida um carbamato ou carbonato éproduzido entre o álcool benzílico e o agente citotóxico. Clivagem dopeptídeo leva ao colapso, ou auto-imolação, do carbamato ou carbonato deaminobenzila. Os agentes citotóxicos exemplificados com esta estratégiaincluem antraciclinas, taxanos, mitomicina C, e as auristatinas. Em umexemplo, um fenol também pode ser liberado por colapso do Iigante ao invésdo carbamato. Em outra variação, redução de dissulfeto é usada para iniciari 30 o colapso de um para-mercaptobenzil carbamato ou carbonato.
Muitos dos agentes citotóxicos conjugados a anticorpos têmpouca, ou nenhuma, solubilidade em água e que podem limitar carga defármaco sobre o conjugado devido a agregação do conjugado. Umaabordagem para superar isto é adicionar grupos solublizantes ao ligante.Podem ser usados conjugados preparados com um ligante consistindo emPEG e um dipeptídeo, inclusive aqueles tendo um PEG di-ácido, tiol-ácido,ou maleimida-ácido fixado ao anticorpo, um espaçador dipeptídico, e umaligação amida à amina de uma antraciclina ou um análogo de duocarmicina.Outro exemplo é um conjugado preparado com um dissulfeto ligantecontendo PEGIigado a um agente citotóxico e amida ligada a um anticorpo.Abordagens que incorporam grupos PEG podem ser benéficas na superaçãode agregação e limites em carga de fármaco.
Ligantes típicos preferenciais para preparação de conjugados deanticorpo / fármaco da invenção incluem Iigantes da fórmula:(CO - Alk1 - Sp1 - Ar - Sp2 - Alk2 - C(Z1) = Q - Sp)
em que
Alk1 e Alk2 são de modo independente uma ligação ou cadeiaalquileno (CrCi0) ramificada ou não-ramifiçada;
Sp1 é uma ligação, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'-, -N(CH2CH2)2N-, ou -X-Ar1-Y-(CH2)n-Z em que X, Y, e Z são de modoindependente uma ligação, -NR'-, -S-, ou -O-, com a condição de quequando η = 0, então no mínimo um de Y e Z deve ser uma ligação e Ar' é1,2-, 1,3-, ou 1,4-fenileno opcionalmente substituído por um, dois, ou trêsgrupos de (CrC5) alquila, (CrC4) alcóxi, (Ci-C4) tioalcóxi, halogênio,nitro, -COOR', -CONHR', -(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR', ou -S(CH2)nCONHR', com a condição de que quando Alk1é uma ligação, Sp1 é uma ligação;
η é um inteiro de O a 5;
R' é uma cadeia (C1-C5) ramificada ou não-ramif içadaopcionalmente substituída por um ou dois grupos de -OH, (C1-C4) alcóxi,(C1-C4) tioalcóxi, halogênio, nitro, (C1-C3) dialquilamino, ou (C1-C3) trialquilamônio -A" onde A" é um ânion farmaceuticamente aceitávelcompletando um sal;
Ar é 1,2-, 1,3-, ou 1,4-fenileno opcionalmente substituído por um,dois, ou três grupos de (CrC6) alquil, (CrC5) alcóxi, (C1-C4) tioalcóxi,halogênio, nitro, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR', ou -S(CH2)nCONHR' em que η e R' são conforme definidoacima ou um 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6-, ou 2,7-naftilidenoou
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com cada naftilideno ou fenotiazina opcionalmente substituídos com um,dois, três, ou quatro grupos de (CrC6) alquil, (CrC5) alcóxi, (CrC4) tioalcóxi,halogênio, nitro, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', ou -S(CH2)nCONHR1 em que η e R' são conforme definido acima, com acondição de que quando Ar é fenotiazina, Sp1 é uma ligação somenteconectada a nitrogênio;
Sp2 é uma ligação, -S-, ou -O-, com a condição de que quandoAlk2 é uma ligação, Sp2 é uma ligação;
Z1 é H1 (CrC5) alquila, ou fenila opcionalmente substituído porum, dois, ou três grupos de (C1-C5) alquila, (C1-C5) alcóxi, (C1-C4) tioalcóxi,halogênio, nitro, -COOR', -ONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR', ou -S(CH2)nCONHR' em que η e R' são conforme definidoacima;
Spé um radical (C1-Ci8) divalente ou trivalente de cadeia reta ouramificada, radical arila ou heteroarila divalente ou trivalente, radical (C3-C18)cicloalquila ou heterocicloalquila divalente ou trivalente, radical divalente outrivalente aril- ou heteroaril-arila (C1-C18) divalente ou trivalente, radicalcicloalquil- ou heterocicloalquil-alquila (C1-C18) divalente ou trivalente ouradical alquil insaturado (C2-C18) divalente ou trivalente, em que heteroarila épreferencialmente furila, tienila, N-metilpirrolila, piridinila, N-metilimidazolila,oxazolila, pirimidinila, quinolila, isoquinolila, N-metilcarbazoíla,aminocurmarinila, ou fenazinila e em que se Sp for um radical trivalente, Sppode ser adicionalmente substituído por grupos (C1-C5) dialquilamino inferior,(C1-C5) alcóxi inferior, hidróxi, ou (C1-C5) alquiltio inferior; eQ é =NHNCO-, =NHNCS-, =NHNC0NH-, =NHNCSNH-, ou=NHO-.
Preferencialmente, Alk1 é uma ramificada ou não ramificada (C1-C-io) cadeia alquileno; Sp1 é uma ligação, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, ou -NR1 em que R1 é conforme definido acima, com a condição de que quandoAlk1 é uma ligação, Sp1 é uma ligação;
Ar é 1,2-, 1,3-, ou 1,4-fenileno opcionalmente substituído por um,dois, ou três grupos de (C1-C6) alquila, (CrC5) alcóxi, (CrC4) tioalcóxi,halogênio, nitro, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR', ou -S(CH2)nCONHR' em que η e R' são conforme definidosacima, ou Ar é um 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6-, ou 2,7-naftilideno cada um opcionalmente substituído por um, dois, três, ou quatrogrupos de (CrC6) alquil, (C1-C5) alcóxi, (C1-C4) tioalcóxi, halogênio, nitro, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR', ou -S(CH2)nCONHR'.
Z1 é (C1-C5) alquila, ou fenila opcionalmente substituída por um,dois, ou três grupos de (C1-C5) alquil, (C1-C4) alcóxi, (C1-C4) tioalcóxi,halogênio, nitro, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR', -O(CH2)nCONHR', ou -S(CH2)nCONHR'; Alk2 e Sp2 são juntos uma ligação; eSp e Q são conforme imediatamente definidos acima.
A Patente dos Estados Unidos Ns 5.773.001, incorporada aqui, aeste pedido de patente, em sua totalidade, revela Iigantes que podem serusados com fármacos nucleofílicos, particularmente hidrazidas e nucleófilosrelacionados, preparados a partir das caliqueamicinas. Estes Iigantes sãoespecialmente úteis nos casos onde melhor atividade é obtida quando aligação formada entre o fármaco e o Iigante é hidrolisável. Estes Iigantescontêm dois grupos funcionais, inclusive (1) um grupo para reação com umanticorpo (por exemplo, ácido carboxílico), e (2) um grupo carbonila (porexemplo, um aldeído ou uma cetona) para reação com um fármaco. Osgrupos carbonila podem reagir com um grupo hidrazida sobre o fármacopara formar uma ligação hidrazona. Esta ligação é hidrolisável,possibilitando a liberação do agente terapêutico a partir do conjugado depoisde ligação às células alvo.
Como um exemplo, um anticorpo anti-5T4 pode ser conjugado aum fármaco citotóxico (1) adicionando o derivado de fármaco citotóxico aoanticorpo anti-5T4 em que o fármaco citotóxico é 4,5% a 11% em peso doveículo proteináceo; (2) incubando o derivado de fármaco citotóxico eanticorpo anti-5T4 em uma solução tamponada não nucleofílica, compatívelcom proteína tendo um pH na faixa de cerca de 7 a 9 para produzir umconjugado de fármaco citotóxico monomérico / anticorpo, em que a soluçãocompreende adicoinalmente (a) um co-solvente orgânico adequado, e (b) umaditivo compreendendo no mínimo um ácido C6-C18 carboxílico ou seu sal, eem que a incubação é conduzida em uma temperatura variando de cerca de30 °C a cerca de 35QC por um período de tempo variando de cerca de 15minutos a 24 horas; e (3) submetendo o conjugado produzido na etapa (2) aum processo de separação cromatográfica para separar conjugados monoméricos com uma carga na faixa de 3% a 10 % em peso de fármacocitotóxico e com baixa fração conjugada (LCF) abaixo de 10 por cento deanticorpo não conjugado, derivado de fármaco citotóxico, e conjugadosagregados.
A separação cromatográfica da etapa (3) pode incluir processos tais comocromatografia por exclusão de tamanho (SEC), uItrafiItração / diafiltração,HPLC1 FPLC, ou cromatografia Sephacryl S-200. A separaçãocromatográfica também pode ser realizada por cromatografia por interaçãohidrofóbica (HIC) usando meio cromatográfico Phenyl Sepharose 6 FastFlow, meio cromatográfico Butyl Sepharose 4 Fast Flow, meiocromatográfico Octyl Sepharose 4 Fast Flow, meio cromatográfico ToyopearlEther-650M, meio Macro-Prep Methyl HIC ou meio Macro-Prep t-Butyl HIC.
Métodos típicos para preparar conjugados de anticorpo anti-5T4fármaco incluem os descritos para preparação de CMC-544 na Publicaçãodo Pedido de Patente dos Estados Unidos publicado co-pendente No. 2004-082764A1 e no Pedido de Patente No. 10/699.874, os quais sãoincorporados aqui, a este pedido de patente, em sua totalidade. Pode serrealizada conjugação usando as seguintes condições: 10 mg/ml deanticorpo, 8,5% (em peso/ peso) de derivado de caliqueamicina, 37,5 mM dedecanoato de sódio, 9% (em v/v) de etanol, 50 mM de HEPES (Ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(4-butanossulfônico)), pH 8.5, 329C, 1 hora.Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) pode ser realizada usandouma resina de butil sefarose FF, 0,65 M de tampão de carga de fosfato depotássio, 0,49 M de tampão de lavagem de fosfato de potássio, e 4 mM detampão de elutriação de fosfato de potássio. Pode ser realizada permuta detampão por cromatografia de exclusão de tamanho, ultrafiltração /diafiltração, ou outros meios adequados. O conjugado de anticorpo /fármaco pode ser formulado em 1,5% de Dextran-40, 0,9% de sacarose,0,01% de TWEEN® 80, 20 mM de Tris / 50 mM de NaCI, pH 8.0. Tambémpode ser usada uma solução de formulação alternativa contendo 5% desacarose, 0,01% de TWEEN® 80, 20 mM de Tris /10 mM de NaCI, pH 8.0.Ciclos de liofilização são ajustados com base na formulação. Aconcentração da massa formulada pode ser 0,5 mg de conjugado/ml. Cadafrasco pode conter 1 mg de conjugado, isto é, 2 ml de enchimento. Outrosvolumes de enchimento podem ser preparados conforme desejado, porexemplo, 5 ml de enchimento.
Outros métodos típicos incluem os descritos para CMD-193,também descritos na Publicação do Pedido de Patente dos Estados UnidosNq 20060002942. Pode ser realizada conjugação usando as seguintescondições: 10 mg/ml de anticorpo, 7% (em peso/ peso) de derivado decaliqueamicina, 10 mM de deoxicolato, 50 mM de HEPBS (Ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(4-butanossulfônico)), 9% (em v/v) de etanol, pH 8.2,329C, 1 hora. A reação pode ser diluída 10 vezes com 0,66 M de fosfato depotássio pH 8.56, e pode ser realizada HIC usando uma resina de butilsepharose FF, 0,60 M de tampão de carga de fosfato de potássio e tampãode lavagem, e 20 mM de Tris / 25 mM de tampão de elutriação de NaCI.Pode ser realizada permuta de tampão usando ultrafiltração / diafiltraçãocom uma membrana de celulose regenerada. O conjugado pode serdiafiltrado contra 20 mM de Tris /10 mM de NaCI pH 8.0 (10 diavolumes). Oconjugado de anticorpo / fármaco pode ser formulado em 5% de sacarose,0,01% de TWEEN® 80, 20 mM de Tris / 10 mM de NaCI1 pH 8.0. Aconcentração do conjugado em massa depois da formulação pode ser 1 mg/ml, e o enchimento do frasco pode ser 5 mg/ frasco, isto é, 5 ml deenchimento, ou outros volumes de enchimento podem ser preparadosconforme desejado.
Em uma modalidade particular da invenção, o Iigante empregadoé ácido 4-(4-acetilfenóxi) butanóico (AcBut). Conjugados de anticorpo /fármaco são preparados reagindo β-caliqueamicina, γ-caliqueamicina ou N-acetil γ-caliqueamicina, ou derivados dos mesmos, com 3-mercapto-3-metilbutanoil hidrazida, o Iigante de AcBut, e um anticorpo anti-5T4 da invenção.Vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos No. 5.773.001. EsteIigante produz conjugados que são essencialmente estáveis na circulação,liberando uma estimativa de 2% do NAc-gama DMH por dia, e o qual libera oNAc-gama DMH prontametne nos Iisossomas acidíferos. Em outrasmodalidades da invenção, conjugados de anticorpo / fármaco sãopreparados usando ácido 3-acetilfenil acidífero (AcPac) ou ácido 4-mercapto-4-metil-pentanóico (Amide) como a molécula ligante.
Ligantes úteis para conjugação de radioisótopos incluemdietileno triamina pentaacetato (DTPA)-isotiocianato, cloridrato desuccinimidil 6-hidrazínio nicotinato (SHNH), e hexametilpropileno aminaoxima (HMPAO) (Bakker et al. (1990) J. Nucl. Med. 31: 1501-1509,Chattopadhyay et al. (2001) Nucl. Med. BioL 28: 741-744, Dewanjee et al.(1994) J. Nucl. Med. 35: 1054-63, Krenning et al. (1989) Lancet 1: 242-244,Sagiuchi et al. (2001) Ann. Nucl. Med. 15: 267-270); Patente dos EstadosUnidos No. 6.024.938). Alternativamente, uma molécula de direcionamentopode ser derivada de modo que um radioisótopo pode ser ligado diretamentea esta (Yoo et al. (1997) J. Nucl. Med. 38: 294-300). Métodos de iodaçãotambém são conhecidos na técnica, e protocolos típicos podem serencontrados, por exemplo, em Krenning et al. (1989) Lancet 1:242-4 e emBakker et al. (1990) J. Nucl. Med. 31:1501 -9.
Para aumentar adicionalmente o número de moléculas defármaco por conjugado de anticorpo / fármaco, o fármaco pode serconjugado a polietileno glicol (PEG), inclusive polímeros e monômeros depolietileno glicol retos ou ramificados. Um monômero de PEG é da fórmula:-(CH2CH2O)-. Fármacos e/ou análogos peptídicos podem ser ligados a PEGdiretamente ou indiretamente, isto é, através de grupos espaçadoresapropriados tais como açúcares. Uma composição de PEG / anticorpo /fármaco também podem incluir porções adicionais lipofílicas e/ou hidrofílicaspara facilitar a estabilidade do fármaco e a liberação a um sítio alvo in vivo.Métodos típicos para preparar composições contendo PEG podem serencontrados nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.461.603; 6.309.633; e5.648.095, entre outros locais.
Por exemplo, para aumentar a quantidade de caliqueamicina emconjugados de anticorpo e caliqueamicina, o anticorpo é conjugado a PEGantes de conjugação com caliqueamicina, por exemplo, usando PEG-SPA,PEG-SBA, ou PEG-bis-maleimida. Conjugados de anticorpo / fármacopreparados usando PEG podem apresentar reduzida afinidade de ligaçãopara o antígeno alvo, mas ainda são eficazes como um resultado doaumento da carga de fármaco. Aditivos tais como deoxicolato e decanoatopodem ser usados para produzir alguns conjugados de anticorpo /caliqueamicina com baixos níveis de anticorpo não conjugado e baixosníveis de agregado.
A natureza hidrofóbica de muitos fármacos, inclusivecaliqueamicinas, pode resultar em agregação de conjugados de anticorpo /fármaco. Para produzir conjugados de anticorpo monomérico / fármaco comcarga de fármaco superior / produção e reduzida agregação, a reação deconjugação pode ser realizada em uma solução tamponada não nucleofílica,compatível com proteína contendo (i) propileno glicol como um co-solvente e(ii) um aditivo compreendendo no mínimo um ácido C6-Cie carboxílico.Ácidos úteis incluem ácidos C7 a Ci2, tais como ácido octanóico ou ácidocaprílico, ou seus sais. Outros co-solventes orgânicos compatíveis comproteína diferentes de propileno glicol, tais como etileno glicol, etanol, DMF,DMSO, e etc., também podem ser usados. Alguns ou todo o co-solventeorgânico é usado para transferir o fármaco para a mistura de conjugação.Tampões úteis para a preparação de conjugados de anticorpo / fármacousando ésteres N-hidroxissuccinimida (OSu) ou outros ésterescomparavelmente ativados incluem salina tamponada com fosfato (PBS) eácido Ν-2-hidroxietil piperazina-N'-2-etanossulfônico (tampão HEPES). Asolução tamponada usado em reações de conjugação deve careceressencialmente de aminas livres e nucleófilos. Como outra abordagem, asreações de conjugação podem ser realizadas em uma solução tamponadanão nucleofílica, compatível com proteína contendo t-butanol sem os aditivosadicionais. Vide, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nos.5.712.374 e 5.714.586. Métodos adicionais para conjugação e conjugadoscontendo caliqueamicina são descritos nas Patentes dos Estados UnidosNos. 5.739.116 e 5.877.296.
Condições de reação ótimas para formação de um conjugadomonomérico pode ser determinado empiricamente por variação de variáveisda reação tais como temperatura, pH, absorção de derivado decaliqueamicina, e concentração de aditivo. Quantidades típicas de propilenoglicol variam de 10% a 60%, por exemplo, 10% a 40%, ou cerca de 30% porvolume da solução total. Quantidades típicas de um aditivo compreendendono mínimo um ácido C6-Ci8 carboxílico ou sua faixa de sal de 20 mM a 100mM, tal como de 40 mM a 90 mM, ou cerca de 60 mM a 90 mM. Aconcentração do ácido C6-Cie carboxílico ou seu sal pode ser aumentadapara 150 a 300 mM e o co-solvente diminuído para 1% a 10%. Emmodalidades típicas da invenção, o ácido carboxílico é ácido octanóico,ácido decanóico, ou os sais correspondentes. Por exemplo, 200 mM deácido caprílico pode ser usado com 5% de propileno glicol ou etanol. Areação de conjugação pode ser realizada em temperatura ligeiramenteelevada (30 a 35°C) e pH (8.2 a 8.7). A concentração de anticorpo podevariar de 1 a 15 mg/ml e a concentração de um derivado de caliqueamicina,por exemplo, N-Acetil gama-caliqueamicina DMH AcBut OSu éster podevariar de cerca de 4,5% a 11% em peso do anticorpo. Condiçõesadequadas para conjugação de outros fármacos podem ser determinado poraqueles versados na técnica sem indevida experimentação.111.0. Purificação de Conjugados de Anticorpo / Fármaco
Depois de conjugação, os conjugados monoméricos podem serseparados de reagentes não conjugados e/ou formas agregadas dosconjugados por métodos convencionais, por exemplo, cromatografia porexclusão de tamanho (SEC), cromatografia por interação hidrofóbica (HIC),cromatografia por permuta iônica (IEC), ou cromatofocalização (CF). Osconjugados purificados são monoméricos, e geralmente contêm de 3% a10% de fármaco em peso. Conjugados de anticorpo / fármaco tambémpodem ser purificados usando cromatografia por interação hidrofóbica (HIC),a qual oferece algumas vantagens em relação a SEC inclusive (1) umacapacidade para reduzir de modo eficaz o teor de LCF bem como agregado;(2) conciliação de grandes volumes de reação; e (3) mínima diluição doproduto. Meios de HIC de alta capacidade adequados para uso em escalade produção incluem meio cromatográfico Phenyl Sepharose 6 Fast Flow,meio cromatográfico Butyl Sepharose 4 Fast Flow, meio cromatográficoOctyl Sepharose 4 Fast Flow, meio cromatográfico Toyopearl Ether-650M,meio Macro-Prep Methyl HIC ou meio Macro-Prep t-Butyl HIC. Ultrafiltraçãodiafiltração também podem ser usadas para permuta de tampão.
Em um processo de purificação típico, são realizadas múltiplasetapas, inclusive uma etapa de remoção de células centrífugas, uma etapade captura por afinidade de Proteína A seguida por uma ou duas etapas depolimento cromatográfico ortogonal, uma etapa de filtração de vírus, e umaetapa de filtração de fluxo tangencial para concentração e formulação. Oprocesso de purificação preferencialmente produz produto com menos de5% de agregado, menos de 20 ppm de Proteína A, menos de 50 ppm deproteína celular hospedeira, e recuperação global de mais de 50%.
Uma preparação anti-5T4 / caliqueamicina típica contémpredominantemente (-95%) anticorpo conjugado contendo 5 a 7 mois decaliqueamicina por mol de anticorpo. O conjugado foi preparadoreprodutivelmente em escala laboratorial (10 a 200 mg). A carga de fármaco,a qual é expressada como pg de caliqueamicina / mg de anticorpomonoclonal, é determinada dividindo a concentração de caliqueamicina(pg/mL) pela concentração de anticorpo (mg/mL). Estes valores sãodeterminados medindo a absorvência de UV da solução de conjugado em280 nm e 310 nm. É importante observar que esta é uma carga média e quea carga real é uma distribuição quase-gaussiana centrada no valor de cargamédio, isto é, parte do anticorpo é carregado acima da média e parte doanticorpo é carregado abaixo da média. Anticorpo não conjugado (baixafração conjugada), o qual pode ser medido usando HIC-HPLC analítica(hydrophobic interaction high-performance Iiquid chromatography), é apopulação de anticorpo que tem pouca ou nenhuma caliqueamicinaconjugada. Este valor é uma medida da distribuição de caliqueamicina noanticorpo e não afeta de modo geral a quantidade de caliqueamicina dosada.Caliqueamicina não conjugada, a qual pode ser medida usando ELISA, serefere à quantidade de caliqueamicina que não é conjugada ao anticorpo e éexpressada em termos de percentagem de caliqueamicina total. Ensaios decarga de fármaco não se diferenciam entre caliqueamicina não conjugada econjugada. A quantidade de caliqueamicina não conjugada não é detectávelou desprezível ao usar ensaios de carga de fármaco, e portanto estesensaios medem de modo eficaz a quantidade de caliqueamicina conjugada.
Métodos analíticos podem ser usados para testar para liberaçãoe experimentação de estabilidade de conjugados de anti-5T4 caliqueamicinahumanizados. Os conjugados podem ser avaliados para identidade (IEF),potência (carga de proteína total e caliqueamicina total), pureza(caliqueamicina não conjugada, baixo teor de anticorpo conjugado, teor deagregao e SDS-PAGE Reduced), e imunoafinidade (ELISA de ligaçãoantigênica). Podem ser usados ensaios adicionais de conhecimentodaqueles versados na técnica. Usando estes ensaios, pode ser mantida aconsistência lote a lote ba fabricação comercial.
III.D. Farmacocinética de Conjugados de Anticorpo / Fármaco
A farmacocinética de imunoconjugados orientados para 5T4pode ser avaliada e comparada com a farmacocinética de caliqueamicinanão-conjugada em vários animais. Por exemplo, isto pode ser feito depoisde uma única administração de bolus intravenoso em camundongos nudefêmeas, ratos Sprague-Dawley machos, e macacos cynomologus fêmeas. Afarmacocinética de um anticorpo anti-5T4 é de modo geral caracterizada porbaixo "clearance", baixa volume de distribuição, e longa meia-vida terminalaparente em várias espécies. Espera-se que as concentrações séricas dederivados de caliqueamicina não conjugados estejam abaixo do limite dequantificação. Espera-se que o perfil de toxicidade para estes conjugadosem estudos de variação de toxicidade de única dose seja similar ao obtidopara outros conjugados de anticorpo / caliqueamicina em dosescomparáveis.
IV. Ensaios Funcionais para Caracterização de Anticorpos Anti-5T4 eConjugados de Anticorpo / Fármaco
A presente invenção descreve adicionalmente ensaios in vitro ein vivo para caracterizar atividades de um anticorpo anti-5T4, inclusiveatividade de ligação de 5T4, internalização celular depois de ligação aantígeno 5T4 apresentado sobre uma superfície celular, e direcionamentopara células expressando 5T4 em um sujeito. Quando conjugados a umacitotoxina, os anticorpos descritos da invenção podem provocar atividadeanticancerígena, inclusive inibição do crescimento de células cancerígenasexpressando 5T4 e/ou indução de morte celular em células expressando5T4. Anticorpos anti-5T4 da invenção podem compreender uma ou maisdas atividades precedentes.
Técnicas para detectar ligação de anticorpos anti-5T4 a antígeno5T4 são conhecidas na técnica, inclusive, por exemplo, ensaios BIACORE®conforme descrito no Exemplo 2. Técnicas típicas adicionais incluemcentrifugação, cromatografia por afinidade e outros métodos imunoquímicos.Vide, por exemplo, Manson (1992) Immunochemical Protocols, HumanaPress, Totowa, New Jersey, United States of America; Ishikawa (1999)Ultrasensitive e Rapid Enzvme Immunoassav, Elsevier, Amsterdam/NewYork. Ensaios de ligação de antígeno podem ser realizados usandoantígeno 5T4 isolado ou células expressando 5T4. Vide o Exemplo 2.
A especificidade de ligação de anticorpos anti-5T4 pode seradiconalmente descrita por definição de um epitopo de ligação, isto é,identificação de resíduos, inclusive resíduos não-adjacentes que participemem ligação de antígeno, e/ou definição de resíduos que influenciam a ligaçãode antígeno. Vide os Exemplos 4-5.
Internalização de anticorpos anti-5T4 e conjugados de anticorpo/ fármaco por células expressando 5T4 pode ser testada observando aquantidade de anticorpos ou conjugados ligados à superfície das célulasexpressando 5T4 com o tempo. Técnicas típicas para avaliar a localizaçãona membrana de anticorpos e conjugados de anticorpo / fármaco sãodescritas no Exemplo 3.
Ensaios funcionais também incluem métodos para avaliar aatividade anticancerígena de conjugados de anticorpo / fármaco, porexemplo, uma capacidade para destruir células cancerígenas existentes, oupara retardar ou prevenir o crescimento de células cancerígenas. Cânceresvisados por conjugados de anticorpo / fármaco da invenção incluem tantotumores primários quanto metastizados e carcinomas de qualquer tecido emum sujeito, inclusive carcinomas e malignidades hematopoiéticas tais comoleucemias e linfomas.
Anticorpos anti-5T4 tendo atividade inibitória do crescimentopodem eliminar células expressando 5T4 ou prevenir ou reduzir aproliferação de células expressando 5T4. Métodos típicos para rápidaavaliação in vitro de inibição do crescimento celular são descritos em Joneset al. (2001) J. Immunol. Methods 254:85-98.
Anticorpos anti-5T4 também podem compreender umacapacidade de induzir morte celular, por exemplo, morte celular programadacaracterizada por degradação do DNA nuclear, degeneração e condensaçãonuclear, perda de integridade da membrana, e fagocitose. Ensaios típicospara avaliar célula são descritos em Hoves et al. (2003) Methods 31:127-34;Peng et al. (2002) Chin. Med. Sei. J. 17:17-21; Yasuhara et al. (2003) J.
Histochem. Cytochem. 51:873-885.
Por exemplo, para avaliar a citotoxicidade de conjugados deanticorpo anti-5T4 / caliqueamicina in vitro, células MDAMB435/5T4 (célulasde carcinoma de mama humano superexpressando antígeno 5T4 humano) ecélulas MDAMB435/neo (células controle) são cultivadas na presença deconjugados de anticorpo e caliqueamicina ou caliqueamicina livre,essencialmente conforme descrito por Boghaert et al. (2004), Clin. CâncerRes., 10: 4538-4549. A citotoxicidade de cada agente é reportada comoED50 (ng/ml), a qual é a quantidade de caliqueamicina administrada comoconjugado ou como fármaco livre que causa 50% de redução de uma culturacelular em relação a um controle não tratado. O número de células emcultura é determinado usando um corante vital (MTS) depois de exposiçãoao fármaco. Vide também o Exemplo 6.
A citotoxicidade de conjugados de anticorpo / caliqueamicinatambém pode ser avaliada usando células MDAMB435/5T4 eMDAMB435/neo cultivadas em uma maneira adequada para crescimento deesferóide. As células são cultivadas na presença de conjugados deanticorpo / caliqueamicina ou caliqueamicina livre, e depois de exposição aofármaco, as dimensões de cada esferóide foram determinadas. A eficiênciade cada agente para inibir o crescimento de esferóide é reportada comoED50 (ng/ml), isto é, a quantidade de caliqueamicina administrada comoconjugado ou como fármaco livre que causa 50% de inibição do crescimentode esferóide em relação a um controle não tratado. Vide o Exemplo 6.
Para avaliar a citotoxicidade de conjugados de anticorpo anti-5T4 / caliqueamicina in vivo, são preparados tumores em camundongos nuspor injeção subcutânea de células MDAMB435/5T4 (células de carcinoma demama humano superexpressando antígeno 5T4 humano), células NCI-H157(células de câncer pulmonar de células não pequenas), células PC14PE6(células de câncer pulmonar de células não pequenas humano), ou célulasN87 (células de carcinoma gástrico humano). Conjugados de anticorpo /caliqueamicina e compostos controle são administrados a camundongosportando tumor, por exemplo, por injeção intraperitoneal em um total de 3doses administradas em intervalos de 4 dias, por exemplo, nos dias 1, 5, e 9.
Resultados terapêuticos mensuráveis incluem inibição de crescimento decélulas tumorais.
Para avaliar adicionalmente a capacidade de direcionamento deconjugados de anticorpo anti-5T4 / caliqueamicina, pode ser usado ummodelo ortotópico para células de câncer de células não pequenas e decélulas pequenas, essencialmente conforme descrito por Onn et al. (2003)Clin. CancerRes. 9(15):5532-5539. Em resumo, células de adenocarcinomapulmonar humano (PC14PE6) são injetadas em veias da cauda decamundongos nus, as quais então migram para formar tumores no pulmão.Os tumores podem aparecer como nódulos sólidos no parênquima pulmonare causar efusões pleurais hemorrágicas contendo células tumoraissuspendidas. Compostos controle e conjugados de anticorpo /caliqueamicina são administrados a camundongos portando tumor, porexemplo, por injeção intraperitoneal iniciando em 6 dias depois de injeção decélulas tumorais por um total de 3 doses administradas em intervalos de 4dias, por exemplo, nos dias 6, 10, e 14. Resultados terapêuticosmensuráveis incluem efusões pleurais reduzidas e aumento da sobrevida.V. Usos de Anticorpos Anti-5T4 e Coniuaados de Anticorpo / Fármaco
Os anticorpos anti-5T4 e conjugados de anticorpo / fármaco dainvenção são úteis tanto in vitro quanto in vivo para aplicações relacionadascom células expressando 5T4. Cânceres expressando 5T4 incluemcarcinoma pulmonar escamoso / adenomatoso (carcinoma pulmonar decéluas não pequenas), carcinoma de mama invasivo, carcinoma colorretal,carcinoma gástrico, carcinoma cervical escamoso, adenocarcinomaendometrial invasivo, carcinoma de pâncreas invasivo, carcinoma de ovário,carcinoma vesical escamoso, e coriocarcinoma. 5T4 é detectado em altosníveis sobre carcinomas dos brônquios, de mama, de cólon, de reto, deestômago, do colo uterino, de endométrio, de pâncreas, de ovários, córion, ede vesículas seminais.V.A. Aplicações In Vitro
A presente invenção proporciona métodos in vitro usandoanticorpos anti-5T4. Por exemplo, os anticorpos descritos podem serusados, ou sozinhos ou em combinação com agentes citotóxicos ou outrosfármacos para especificamente ligar células cancerígenas 5T4-positivas paraexaurir as células referidas de uma amostra celular. Também sãoproporcionados métodos para induzir apoptose e/ou inibição de proliferaçãocelular contactando células expressando 5T4 com um conjugado deanticorpo / fármaco compreendendo um anticorpo anti-5T4 conjugado a umacitotoxina. Métodos in vitro típicos são descritos acima aqui, neste pedido depatente, sob o título de "Ensaios Funcionais para Caracterização deAnticorpos Anti-5T4 e Conjugados de Anticorpo / Fármaco."
Anticorpos anti-5T4 da invenção também têm utilidade nadetecção de células 5T4-positivas in vitro com base em sua capacidade paraligar especificamente antígeno 5T4. Um método para detectar célulasexpressando 5T4 pode compreender: (a) preparar uma amostra biológicacompreendendo células; (b) contactar um anticorpo anti-5T4 com a amostrabiológica in vitro; e (c) detectar ligação de anticorpo anti-5T4. Para facilitar adetecção, o anticorpo pode ser conjugado a uma etiqueta.
V.B. Detecção e Diagnóstico In Vivo
Anticorpos anti-5T4 da invenção também podem ser usadospara métodos de detecção in vivo, por exemplo, como úteis paradiagnóstico, para proporcionar assistência intraoperativa, ou paradeterminação de dose. Depois da administração de um anticorpo anti-5T4marcado a um sujeito, e depois de um tempo suficiente para ligação, abiodistribuição de células expressando 5T4 ligadas pelo anticorpo pode servisualizada. Os métodos diagnósticos descritos podem ser usados emcombinação com métodos de tratamento. Além disso, anticorpos anti-5T4da invenção podem ser administrados para o propósito duplo de detecção eterapia.
Métodos de detecção não invasivos típicos incluem cintigrafia(por exemplo, SPECT (Tomografia Computadorizada por Emissão de ÚnicoFóton), PET (Tomografia por Emissão de Pósitrons), estudos por imagensde câmera gama, e varredura retilinear), estudos por imagens deressonância magnética (por exemplo, estudos por imagens de ressonânciamagnética de convenção, estudos por imagens de transferência demagnetização (MTI), espectroscopia de ressonância magnética de prótons(MRS), estudos por imagens de difusão ponderada (DWI) e estudos porimagens de MR funccional (fMRI)), e ultrassom.V.C. Aplicações Terapêuticas
A presente invenção adicionalmente se refere a métodos ecomposições úteis para induzir citólise de células cancerígenas expressando5T4 em um sujeito. Os conjugados de anticorpo anti-5T4 / fármaco dainvenção são úteis para inibir o crescimento de células cancerosas e célulasde um distúrbio proliferativo não neoplásico, tal como hiperplasia,metaplasia, ou mais particularmente, displasia (para revisão de semelhantescondições de crescimento anormal, vide DeVita, Jr. et a. (2001), Câncer:Principies e Practice, 6th edition, Lippincott Williams & Wilkins.
Cânceres adequados para direcionamento usando conjugadosde anticorpo anti-5T4 / fármaco incluem tumores primários e metastáticosexpressando 5T4 em mama, cólon, reto, pulmão, orofaringe, hipofaringe,esôfago, estômago, pâncreas, fígado, vesícula biliar, dutos biliares, intestinodelgado, trato urinário inclusive rim, bexiga e urotélio, trato genital feminino,colo uterino, útero, ovários, trato genital masculino, próstata, vesículasseminais, testículos, uma glândula endócrina, glândula tiróide, glândulaadrenal, glândula pituitária, pele, osso, tecidos moles, vasos sangüíneos,cérebro, nervos, olhos, meninges. Outros cânceres relevantes sãoIeucemias e Iinfomas expressando 5T4 (por exemplo, Iinfoma de Hodgkin1S eIinfoma não Hodgkin), inclusive leucemia ou Iinfoma indolente, agressivo, debaixo grau, de grau intermediário, ou de alto grau.
Em particular, sabe-se que 5T4 é expressado em células decarcinoma pulmonar escamoso / adenomatoso (carcinoma pulmonar decélulas não pequenas), carcinoma de mama invasivo, carcinoma colorretal,carcinoma gástrico, carcinoma cervical escamoso, adenocarcinomaendometrial invasivo, carcinoma de pâncreas invasivo, carcinoma de ovário,carcinoma vesical escamoso, e coriocarcinoma. 5T4 é detectado em altosníveis sobre carcinomas de brônquios, mama, cólon, reto, estômago, colouterino, endométrio, pâncreas, ovários, córion e vesículas seminais. Adistribuição superficial celular do antígeno 5T4 pode ser homogênea ouheterogênea. Em carcinoma colorretal, carcinoma gástrico, e carcinomaovariano, a expressão de 5T4 é diretamente relacionada com a progressãoda doença. Em carcinoma de mama, se observa aumentada intensidade decoloração de 5T4 sobre nódulos metastáticos, no entanto, a expressão de5T4 não é correlacionada com o estágio da doença. Os cânceres tambémpodem expressar o antígeno de carboidrato Y de Lewis1 inclusivecarcinomas de mama, cólon, gástrico, de esôfago, pancreático, duodenal,pulmonar, de bexiga e renal e tumores neuroendócrinos de células de ilhotase gástricos. Vide a Patente dos Estados Unidos Ne 6.310.185.
Portanto, pacientes a serem tratados com os conjugados anti-5T4 / fármaco da invenção podem ser selecionados com base na expressãode biomarcador, inclusive mas não limitada na expressão elevada deantígeno 5T4, resultando em uma população de pacientes selecionada paraexpressão alvo enriquecida ao invés de origem ou histologia do tumor. Aexpressão alvo pode ser medida como uma função do número de célulascorando combinada com a intensidade da coloração celular. Por exemplo,classificação de alta expressão de 5T4 inclui os pacientes com mais de 30%(isto é, 40%, 50% ou 60%) das células testadas por coloraçãoimunohistoquímica positiva para 5T4 em um nível de 3+ (em uma escala de1 a 4), enquanto expressão moderada do 5T4 pode incluir os pacientes commais de 20% das células corando em 1 + a 2+.
Biomarcadores diferentes da expressão de antígeno 5T4também podem ser usados para seleção de paciente, inclusivecaracterização do tumor com base na resistência multi-fármaco (MDR), porexemplo. Quase 50 por cento dos cânceres humanos são ou completamenteresistentes a quimioterapia ou respondem somente transitoriamente, depoisda qual não são mais afetados por fármacos anticancerígenos comumenteusados. Este fenômeno é referido como MDR e é inerentementeexpressado por alguns tipos de tumor, ao passo que outros adquirem MDRdepois de exposição a tratamento por quimioterapia. A P-glicoproteína debomba de efluxo de fármaco media uma maioria da MDR associada comquimioterápicos citotóxicos. Análise fenotípica e funcional de mecanismosde MDR presentes em amostras de tumor de pacientes com câncer pode serconduzida de modo a liberar um ou mais mecanismos de MDR específicoscom resistência a quimioterapia em tipos tumorais específicos.
Crescimento de câncer ou proliferação anormal se refere aqualquer um de uma série de índices que sugerem alteração dentro decélulas para uma forma de câncer ou estado de doença mais desenvolvidos.A inibição do crescimento de células cancerígenas ou células de umdistúrbio proliferativo não neoplásico pode ser testada por métodosconhecidos na técnica, tais como crescimento tumoral retardado e inibiçãode metástase. Outros índices para medir a inibição do crescimentocancerígeno incluem uma redução na sobrevida de células cancerígenas,uma redução no volume tumoral ou morfologia (por exemplo, conformedeterminado usando tomografia computadorizada (CT), sonografia, ou outrométodo de estudo por imagens), destruição da vasculatura tumoral,performance aprimorada em ensaio de pele de hipersensibividade retardada,um aumento na ativida\de de linfócitos T citolíticos, e uma redução nosníveis de antígenos tumor-específicos.
Apesar de não pretender ser limitado por qualquer modo deoperação único, tanto direcionamento orientado por antígeno quantodirecionamento passivo de conjugados de anticorpo anti-5T4 / fármacopodem contribuir para a eficácia antitumoral. Direcionamento orientado porantígeno se refere ao movimento preferencial e/ou acumulação de umpeptídeo ou análogo peptídico em um tecido-alvo (isto é, um tecidocompreendendo células expressando 5T4 e sítio pretendido paraacumulação de um conjugado anti-5T4 / fármaco) comparado com um tecidocontrole (isto é, um tecido suspeito de carecer essencialmente de célulasexpressando 5T4 e ligação e/ou acumulação de um conjugado anti-5T4 /fármaco administrado). A localização preferencial de um conjugado deanticorpo / fármaco é geralmente tal que uma quantidade de conjugado deanticorpo / fármaco em um tecido-alvo é cerca de 2 vezes maior do que umaquantidade de conjugado de anticorpo / fármaco em um tecido controle, talcomo uma quantidade que é de cerca de 5 vezes ou maior, ou cerca de 10vezes ou maior.O direcionamento passivo se refere de modo geral aseqüestração de anticorpos ou conjugados de anticorpo / fármaco em umsítio tumoral devido a alterações locais na vasculatura. Por exemplo,conjugados anti-5T4 / fármaco podem deixar a vasculatura no sítio tumoral,a qual é fenestrada devido a aumento da produção de VEGF, ligar a célulasexpressando 5T4 e dar início a internalização do conjugado anti-5T4 /fármaco. Drenagem venosa e linfática pobre do tumor também resulta emseqüestração de conjugados anti-5T4 / fármaco não ligados. Anticorposconjugados a fármacos com Iigantes instáveis em ácido podem liberar ofármaco, o qual em seguida se difunde para dentro de células tumorais. Osefeitos anti-tumorais de direcionamento passivo não são permanentes ou tãopotentes quanto aqueles induzidos por direcionamento orientado porantígeno, mas podem contribuir para eficácia total.V.D. Formulações
Anticorpos anti-5T4 e conjugados anti-5T4 / fármaco dainvenção são prontamente preparados e formulados para uso clínico seguroe eficaz. Formulações adequadas para administração a um sujeito incluemsoluções para injeção estéreis aquosas e não-aquosas as quais podemconter anti-oxidantes, tampões, bacteriostatos, agentes antibacterianos eantifúngicos (por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, etimerossal), solutos que tornam a formulação isotônica com os fluidoscorporais do receptor pretendido (por exemplo, açúcares, sais, e poliálcoois),agentes de suspensão e agentes espessantes. Solventes adequadosincluem água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, epolietileno glicol líquido), e misturas dos mesmos. As formulações podemser apresentadas em recipientes de dose unitária ou multidose, por exemplo,ampolas e frascos vedados, e podem ser armazenadas em uma condiçãocongelada ou secada por congelamento (IiofiIizada) requerendo somente aadição de veículo líquido estéril imediatamente antes do uso paraadministração a um sujeito ou para radiorrótulo subseqüente com um isótopoapropriado para a aplicação pretendida. Anticorpos anti-5T4 e conjugadosde anticorpo / fármaco da invenção são preferencialmente formulados comouma dose eficaz, descrita abaixo.
Como um exemplo, um anticorpo anti-5T4 ou conjugado anti-5T4/ fármaco formulação típico compreende uma formulação multi-dose de 40mg/ml anticorpo ou conjugado de anticorpo / fármaco, 25 mM de acetato,150 mM de trealose, 0,9% de álcool benzílico, 0,02% de polissorbato 20 empH 5.0, e a qual tem uma vida de armazenamento mínima de dois anos dearmazenamento em 2 a 85C. Como outro exemplo, uma formulação deanticorpo anti-5T4 ou conjugado anti-5T4 / fármaco pode compreender 10mg/ml de anticorpo ou conjugado de anticorpo / fármaco em 9,0 mg/ml decloreto de sódio, 7,35 mg/ml de diidrato de citrato de sódio, 0,7 mg/ml depolissorbato 80, e água estéril, pH 6.5. Formulações típicas de umconjugado de anti-5T4 / caliqueamicina para administração a modelos decamundongo experimentais incluem 2 μg ou 4 μg de caliqueamicina (vide osExemplos 3, 4, e 7), os quais podem ser escalados por conseguinte paraadministração a seres humanos.
Uma formulação Iiofilizada estável de um anticorpo anti-5T4 ouconjugado de anticorpo / fármaco pode ser preparada (a) dissolvendo umconjugado de anticorpo / fármaco para uma concentração final de 0,5 a 2mg/ml em uma solução compreendendo um crioprotetor em umaconcentração de 1,5% a 5% em peso, um agente de massa polimérico emuma concentração de 0,5 a 1,5% em peso, de eletrólitos em umaconcentração de 0,01 M a 0,1 M, um agente de facilitação de solubilidadeem uma concentração de 0,005% a 0,05% em peso, agente detamponamento em uma concentração de 5 a 50 mM de tal modo que o pHfinal da solução é 7.8 a 8.2, e água; (b) dispensar a solução acima dentro defrascos em uma temperatura de +5°C a +10°C; (c) congelar a solução emuma temperatura de congelamento de -35°C a -50°C; (d) submeter a soluçãocongelada a uma etapa de secagem por congelamento inicial em umapressão de secagem primária de 20 a 80 micra em uma temperatura dearmazenamento em -10°C a -40°C por 24 a 78 horas; e (e) submeter oproduto secado por congelamento da etapa (d) a uma etapa de secagemsecundária em uma pressão de secagem de 20 a 80 micra em umatemperatura de armazenamento de +10°C a + 35°C por 15 a 30 horas.
Crioprotetores típicos úteis para liofilização do crioprotetorincluem alditol, manitol, sorbitol, inositol, polietileno glicol, ácido aldônico,ácido urônico, ácido aldárico, aldoses, cetoses, açúcares de amino, alditóis,inositóis, gliceraldeídos, arabinose, lixose, pentose, ribose, xilose, galactose,glicose, hexose, idose, manose, talose, heptose, glucose, fructose, ácidoglucônico, sorbitol, lactose, manitol, metil α-glucopiranosídeo, maltose, ácidoisoascórbico, ácido ascórbico, lactona, sorbose, ácido glucárico, eritrose,treose, arabinose, alose, altrose, gulose, idose, talose, eritrulose, ribulose,xilulose, psicose, tagatose, ácido glucurônico, ácido glucônico, ácidoglucárico, ácido galacturônico, ácido manurônico, glucosamina,galactosamina, sacarose, trealose, ácido neuramínico, arabinanos,fructanos, tucanos, galactanos, galacturonanos, glucanos, mananos, xilanos,levano, fucoidano, carrageena, galactocarolose, pectinas, ácidos pécticos,amilose, pululano, glicogênio, amilopectina, celulose, dextrano, pustulano,quitina, agarose, queratina, condroitina, dermatano, ácido hialurônico, ácidoalgínico, goma xantano, amido, sacarose, glucose, lactose, trealose, etilenoglicol, polietileno glicol, polipropileno glicol, glicerol e pentaeritritol.
Por exemplo, a sacarose crioprotetora pode ser usada em umaconcentração de 1,5% em peso, o agente de volume polimérico Dextran 40ou hidroxietil amido 40 pode ser usado em uma concentração de 0,9% empeso, o eletrólito usado na solução de liofilização é cloreto de sódio, o qualestá presente em uma concentração de 0,05M, e o agente detamponamento trometamina pode ser usado em uma concentração de0,02M. Um agente de facilitação da solubilidade (por exemplo, umtensoativo tal como Polissorbato 80) também pode ser usado durante oprocesso de liofilização. Geralmente este agente de facilitação dasolubilidade é um tensoativo. Etapas típicas para preparação de umaformulação Iiofilizada incluem congelar os frascos em uma temperatura de -45 °C; a solução congelada é submetida a uma etapa de secagem porcongelamento inicial em uma pressão de secagem primária de 60 micra eem uma temperatura de armazenamento de -30°C por 60 horas; e submetero produto secado por congelamento a uma etapa de secagem secundáriaem uma pressão de secagem de 60 micra em uma temperatura dearmazenamento de +25°C por 24 horas.
Anticorpos anti-5T4 e conjugados de anticorpo / fármaco sãoformulados em um veículo farmaceuticamente aceitável, por exemplo,macromoléculas grandes lentamente metabolizadas tais como proteínas,polipeptídeos, lipossomas, polissacarídeos, ácido polilácticos, ácidospoliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos epartículas virais inativas. Sais farmaceuticamente aceitáveis também podemser usados, por exemplo, sais de ácidos minerais, tais como cloridratos,bromidratos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, tais comoacetatos, propionatos, malonatos e benzoatos. As formulações podemconter adicionalmente líquidos tais como água, solução salina, glicerol, eetanol, e/ou substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ouemulsificantes ou substâncias de tamponamento de pH, podem estarpresentes em semelhantes composições. Os veículos referidos possibilitamque as composições sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drágeas,cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastaqs semi-fluidas e suspensões, paraingestão pelo paciente.V.E. Dose e Administração
Anticorpos anti-5T4 e conjugados anti-5T4 / fármaco dainvenção podem ser administrados por via parenteral, por exemplo, atravésde administração intravascular, subcutânea, intraperitoneal, ouintramuscular. Para liberação de composições a caminhos pulmonares, ascomposições podem ser administradas como um aerossol ou spray grosso,isto é, administração transnasal. Pode ser usada administração Intratecal,intra medular, ou intraventricular para tratamento de cânceres do sistemanervoso central (CNS) e cânceres relacionados com o sistema nervosocentral. Anticorpos anti-5T4 e conjugados anti-5T4 / fármaco tambémpodem ser administrados por via transdérmica, por via transcutânea,topicamente, por via enteral, por via intravaginal, por via sublingual ou porvia retal. A administração intravenosa pode ser usada rotineiramente naclínica. Um método de liberação é selecionado com base em consideraçõestais como a condição e o sítio a ser tratado, o tipo de formulação deanticorpo, e a eficácia terapêutica da composição.
A presente invenção proporciona que uma quantidade eficaz deum anticorpo anti-5T4 e conjugado anti-5T4 / fármaco é administrada a umsujeito, isto é, uma quantidade de um anticorpo anti-5T4 ou conjugado anti-5T4 / fármaco suficiente para provocar uma resposta biológica desejada.Por exemplo, quando administrada a um sujeito portando câncer, umaquantidade eficaz compreende uma quantidade suficiente para provocaratividade anticancerígena, inclusive citólise de células cancerígenas, inibiçãoda proliferação de células cancerígenas, indução de apoptose de célulascancerígenas, redução de antígenos de células cancerígenas, crescimentotumoral retardado, e/ou inibição de metástase. O encolhimento do tumor ébem aceito como um marcador substituto clínico para eficácia. Outromarcador bem aceito para eficácia é sobrevida livre de progressão.Conjugados de anti-5T4 / caliqueamicina de modo geral demonstram nomínimo uma melhora de 25% em parâmetros chave de eficácia, tais comomelhora na sobrevida média, tempo para progressão tumoral, e taxa deresposta global.
De modo geral, uma dose eficaz será na faixa de cerca de 0,01mg/m2 a cerca de 50 mg/m2, tal como a partir de cerca de 0,1 mg/m2 a cercade 20 mg/m2, ou cerca de 15 mg/m2, cuja dose é calculada com base naquantidade de anticorpo anti-5T4. Uma dose eficaz de um conjugado anti-5T4 / fármaco também podem ser calculada com base em uma quantidadedo fármaco conjugado. Por exemplo, doses típicas de um conjugado deanti-5T4 / caliqueamicina para administração a modelos de camundongoexperimentais incluem 2 μg ou 4 μg de caliqueamicina, as quais podem serescaladas por conseguinte para administração a humanos. Por exemplo,conjugados de anti-5T4 / caliqueamicina da invenção podem seradministrados a pacientes humanos uma vez a cada 3 semanas por até 6ciclos. Para um anticorpo anti-5T4 radiorrotulado, uma dose eficaz étipicamente na faixa de cerca de 1 mCi a cerca de 300 mCi, normalmentecerca de 5 mCi a 100 mCi, dependendo do radioisótopo e da afinidade deligação do anticorpo.
Para detecção de células 5T4-positivas usando os anticorposanti-5T4 descritos, uma quantidade detectável de uma composição dainvenção é administrada a um sujeito, isto é, uma dose de um anticorpo anti-5T4 de tal modo que a presença do anticorpo pode ser determinado in vitroou in vivo. Para estudo por imagens cintigráficas usando radioisótopos,doses típicas de um radioisótopo podem incluir uma atividade de cerca de 10pCi a 50 mCi, ou cerca de 100 pCi a 25 mCi, ou cerca de 500 pCi a 20 mCi,ou cerca de 1 mCi a 10 mCi, ou cerca de 10 mCi.
Níveis de dosagem reais de ingredientes ativos em umacomposição da invenção podem ser variados de modo a administrar umaquantidade da composição que é eficaz para obter o resultado diagnósticoou terapêutico desejado. Os regimes de administração também podem servariados. Pode ser usada uma única injeção ou múltiplas injeções. O nívelde dosagem e regime selecionados dependerão de uma variedade defatores inclusive a atividade e estabilidade (isto é, meia-vida) da composiçãoterapêutica, formulação, a via de administração, combinação com outrosfármacos ou tratamentos, a doença ou distúrbio a ser detectado e/ou tratado,e a condição física e histórico médico anterior do sujeito sendo tratado.
Para anticorpos anti-5T4 e conjugados anti-5T4 / fármaco dainvenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmentequer em ensaios de cultura celular ou em modelos animais, tais comoroedores, coelhos, cães, porcos, e/ou ou primatas. O modelo animaltambém pode ser usado para determinar a faixa de concentração e via deadministração apropriadas. Semelhante informação pode ser então usadapara determinar doses úteis e vias para administração em seres humanos.Tipicamente, uma dose mínima é administrada, e a dose é escalada naausência de citotoxicidade dose-limitante. A determinação e o ajuste deuma dose ou quantidade eficaz, bem como avaliação de quando e comofazer semelhantes ajustes, são conhecidas por aqueles de conhecimentogeral da técnica de medicina.Para terapias de combinação, anticorpos anti-5T4, conjugadosanti-5T4 / fármaco, e/ou terapêuticos adicionais ou agentes diagnósticos sãoadministrados dentro de qualquer frame de tempo adequado paraperformance da terapia ou diagnóstico pretendidos. Portanto, os agentesúnicos podem ser administrados essencialmente simultaneamente (isto é,como uma única formulação ou dentro de minutos ou horas) ouconsecutivamente em qualquer ordem. Por exemplo, tratamentos deagentes únicos podem ser administrados dentro de cerca de 1 ano um dooutro, tal como dentro de cerca de 10, 8, 6, 4, ou 2 meses, ou dentro de 4, 3,2 ou 1 semana(s), ou dentro de cerca de 5, 4, 3, 2 ou 1 dia(s).
Para orientação adicional referente a formulação, dose, regimede administração, e resultados terapêuticos mensuráveis, vide Berkow et al.(2000) The Merck Manual of Medicai Information, Merck & Co., Inc.,Whitehouse Station, New Jersey; Ebadi (1998) CRC Desk Reference ofClinical Pharmacoloqy. CRC Press, Boca Raton, Florida; Gennaro (2000)Reminqton: The Science and Practice of Pharmacv, Lippincott, Williams &Wilkins, Philadelphia, Pennsylvania; Katzung (2001) Basic & ClinicaiPharmacoloqy. Lange Medicai Books / McGraw-HiII Medicai Pub. Div., NewYork; Hardman et al. (2001) Goodman & GiIman1S the Pharmacolooical Basisof Therapeutics, The McGraw-HiII Companies, Columbus, Ohio; Speight &Holford (1997) Averv1S Druo Treatment: A Guide to the Properties, Choices,Therapeutic Use and Economic Value of Druas in Disease Management,Lippincott, Williams, & Wilkins, Philadelphia, Pennsylvania.
V.F. Terapias de Combinação
Os anticorpos anti-5T4 e conjugados anti-5T4 / fármacodescritos podem ser administrados como um tratamento inicial, ou paratratamento de condições que não são responsivas a terapias convencionais.Além disso, os anticorpos anti-5T4 e conjugados anti-5T4 / fármaco podemser usados em combinação com outras terapias (por exemplo, excisãocirúrgica, radiação, fármacos anticancerígenos adicionais e etc.) para destemodo provocar efeitos terapêuticos aditivos ou potencializados e/ou reduzir ahepatocitotoxicidade de alguns agentes anticancerígenos. Anticorpos anti-5Τ4 e conjugados anti-5T4 / fármaco da invenção podem ser co-administrados ou co-formulados com agentes adicionais, ou formulados paraadministração consecutiva com agentes adicionais em qualquer ordem.
Agentes típicos úteis para terapia de combinação incluemquaisquer dos fármacos descritos acima aqui, neste pedido de patente,como úteis para preparação de conjugados anti-5T4 / fármaco. Anticorposanti-5T4 e conjugados anti-5T4 / fármaco da invenção também podem serusados em combinação com outros anticorpos terapêuticos e conjugados deanticorpo / fármaco, incluindo anticorpos anti-5T4 diferentes dos anticorposanti-5T4 descritos, bem como anticorpos e conjugados tendo por alvo umantígeno diferente. Anticorpos típicos, os quais podem ser usados sozinhosou como um conjugado de anticorpo / fármaco, incluem anticorpos anti-CD19, anticorpos anti-CD20 (por exemplo, RITUXAN®, ZEVALIN®,BEXXAR®), anticorpos anti-CD22, anticorpos anti-CD33 (por exemplo,MYLOTARG®), conjugados de anticorpo anti-CD33 / fármaco, anticorposanti-Lewis Y (por exemplo, Hu3S193, Mthu3S193, AGmthu3S193),anticorpos anti-HER-2 (por exemplo, HERCEPTIN® (trastuzumab), MDX-210, OMNITARG® (pertuzumab, rhuMAb 2C4)), anticorpos anti-CD52 (porexemplo, CAMPATH®), anticorpos anti-EGFR (por exemplo, ERBITUX®(cetuximab), ABX-EGF (panitumumab)), anticorpos anti-VEGF (por exemplo,AVASTIN® (bevacizumab)), anticorpos do complexo anti-DNA / histona (porexemplo, ch-TNT-1/b), anticorpos anti-CEA (por exemplo, CEA-Cide, YMB-1003) hLM609, anticorpos anti-CD47 (por exemplo, 6H9), anticorpos anti-VEGFR2 (ou receptor contendo domínio de inserção de quinase, KDR) (porexemplo, IMC-1C11), anticorpos anti-Ep-CAM (por exemplo, ING-1),anticorpos anti-FAP (por exemplo, sibrotuzumab), anticorpos anti-DR4 (porexemplo, TRAIL-R), anticorpos anti-receptores de progesterona (porexemplo, 2C5), anticorpos anti-CA19.9 (por exemplo, GIVAREX®) eanticorpos antifibrina (por exemplo, MH-1).
Conjugados de anticorpos anti-5T4 / fármacos também podemser administrados junto com uma ou mais combinações de agentescitotóxicos como parte de um regime de tratamento. Preparações citotóxicasúteis para estes fins incluem CHOPP (ciclofosfamida, doxorrubicina,vincristina, prednisona e procarbazina); CHOP (ciclofosfamida,doxorrubicina, vincristina, e prednisona); COP (ciclofosfamida, vincristina,prednisona); CAP-BOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, procarbazina,bleomicina, vincristina e prednisona); m-BACOD (metotrexato, bleomicina,doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona, e leucovorin;ProMACE-MOPP (prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida,etoposídeo, leucovorin, mecloetamina, vincristina, prednisona eprocarbazina); ProMACE-CytaBOM (prednisona, metotrexato, doxorrubicina,ciclofosfamida, etoposídeo, leucovorin, citarabina, bleomicina e vincristina);MACOP-B (metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina,prednisona, bleomicina e leucovorin); MOPP (mecloetamina, vincristina,prednisona e procarbazina); ABVD (adriamicina / doxorrubicina, bleomicina,vinblastina e dacarbazina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona eprocarbazina) alternando com ABV (adriamicina / doxorrubicina, bleomicina,vinblastina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona e procarbazina)alternando com ABVD (adriamicina / doxorrubicina, bleomicina, vinblastina edacarbazina); ChIVPP (clorambucil, vinblastina, procarbazina, prednisona);IMVP-16 (ifosfamida, metotrexato, etoposídeo); MIME (metil-gag, ifosfamida,metotrexato, etoposídeo); DHAP (dexametasona, high-dose citaribina ecisplatina); ESHAP (etoposídeo, metilpredisolona, HD citarabina, ecisplatina); CEPP(B) (ciclofosfamida, etoposídeo, procarbazina, prednisona ebleomicina); CAMP (lomustina, mitoxantrona, citarabina e prednisona); eCVP-1 (ciclofosfamida, vincristina e prednisona); DHAP (cisplatina, alta dosede citarabina e dexametasona); CAP (ciclofosfamida, doxorrubicina,cisplatina); PV (cisplatina, vinblastina ou vindesina); CE (carboplatina,etoposídeo); EP (etoposídeo, cisplatina); MVP (mitomicina, vinblastina ouvindesina, cisplatina); PFL (cisplatina, 5-flurouracil, leucovorin); IM(ifosfamida, mitomicina); IE (ifosfamida, etoposídeo); IP (ifosfamida,cisplatina); MIP (mitomicina, ifosfamida, cisplatina); ICE (ifosfamida,carboplatina, etoposídeo); PIE (cisplatina, ifosfamida, etoposídeo); Viorelbinae cisplatina; Carboplatina e paclitaxel; CAV (ciclofosfamida, doxorrubicina,vincristina); CAE (ciclofosfamida, doxorrubicina, etoposídeo); CAVE(ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, etoposídeo); EP (etoposídeo,cisplatina); e CMCcV (ciclofosfamida, metotrexato, lomustina, vincristina).
Anticorpos anti-5T4 e conjugados anti-5T4 / caliqueamicinapodem ser usados em combinação com fármacos anticancerígenossistêmicos, tais como epitilones (BMS-247550, Epo-906), reformulações detaxanos (Abraxane, Xyotax), inibidores de microtubulina (MST-997, TTí-237),ou com citotoxinas orientadas tais como CMD-193 e SGN-15. Agentesanticancerígenos úteis adicionais incluem TAXOTERE®, TARCEVA®,GEMZAR® (gemcitabine), 5-FU, AVASTIN®, ERBITUX®, TROVAX®,anatumomab mafenatox, letrazol, docetaxel, e antraciclinas.
Para terapias de combinação, um anticorpo anti-5T4, conjugadoanti-5T4 / fármaco, e/ou um ou mais agentes terapêuticos ou diagnósticosadicionais são administrados dentro de qualquer frame de tempo adequadospara performance da terapia ou diagnóstico pretendido. Portanto, os únicosagentes podem ser administrados substancialmente simultaneamente (istoé, como uma única formulação ou dentro de minutos ou horas) ouconsecutivamente em qualquer ordem. Por exemplo, tratamentos com únicoagente podem ser administrados dentro de cerca de 1 ano um do outro, talcomo dentro de cerca de 10, 8, 6, 4, ou 2 meses, ou dentro de 4, 3, 2 ou 1semana(s), ou dentro de cerca de 5, 4, 3, 2 ou 1 dia(s). A administração deum anticorpo anti-5T4 ou conjugado anti-5T4 / caliqueamicina emcombinação com um segundo agente terapêutico preferencialmente provocaum maior efeito do que a administração de um e outro sozinho.
Exemplos
Os seguintes exemplos foram incluídos para ilustrar modos dainvenção. Alguns aspectos dos seguintes exemplos são descritos emtermos de técnicas e procedimentos encontrados ou contemplados pelospresentes co-inventores funcionam bem na prática da invenção. Estesexemplos ilustram práticas laboratoriais de rotina dos co-inventores. À luzda presente descoberta e do nível geral de conhecimento na técnica,aqueles versados reconhecerão que se pretende que os seguintes exemplossejam exemplares somente e que numerosas alterações, modificações, ealterações podem ser empregadas sem se afastar do âmbito da invenção.Exemplo 1
Anticorpos Anti-5T4 Murinos
Anticorpos anti-5T4 foram preparados em camundongos usandoantígeno 5T4 humano e métodos de rotina para imunização. Linhagenscelulares de hibridoma produzindo os anticorpos A1, A2, e A3 foramproduzidas por fusão de células B individuais com células de mieloma.
As regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve deanticorpos anti-5T4 A1, A2, e A3 foram clonadas usando o sistema desíntese de cDNA SMART® (Clontech Laboratories Inc. of Mountain View,Califórnia) seguido por amplificação por PCR. O cDNA foi sintetizado apartir de 1 μg de RNA total isolado de células de hibridoma Α1, A2, ou A3,usando oligo(dT) e o SMART® IIA oligo (Clontech Laboratories Inc.) comtranscriptase reversa POWERSCRIPT™ (Clontech Laboratories Inc.). 0cDNA foi em seguida amplificado por PCR usando um iniciador o qualrecoze a seqüência SMART® IIA oligo e iniciador específico de regiãoconstante de camundongo (cadeia capa de camundongo para a cadeia leve,lgG2a de camundongo para a cadeia pesada A1, lgG2b de camundongopara a cadeia pesada A2, e IgGI de camundongo para a cadeia pesada A3)com polimerase VENT® (New England Biolabs Inc. of Ipswich1Massachusetts). Produtos de PCR de região variável de cadeia pesada e decadeia leve foram subclonados no vetor de expressão pED6 e a seqüênciade ácido nucléico foi determinada. Este método é vantajoso em que não érequerido conhecimento anterior da seqüência de DNA. Além disso, aseqüência de DNA resultante não é alterada por uso de iniciadores de PCRdegenerados.
As seqüências de nucleotídeos das regiões variáveis de cadeiapesada A1, A2, e A3 são expostas como nucleotídeos 58-414 de SEQ IDNO: 1, nucleotídeos 55-405 de SEQ ID NO: 5, e nucleotídeos 58-423 deSEQ ID NO: 9, respectivamente. As seqüências de aminoácidos das regiõesvariáveis de cadeia pesada Α1, A2, e A3 são expostas como resíduos 20-138 de SEQ ID NO: 2, resíduos 19-135 de SEQ ID NO: 6, e resíduos 20-141de SEQ ID NO: 10, respectivamente. As seqüências de nucleotídeos dasregiões variáveis de cadeia leve A1, A2, e A3 são expostas comonucleotídeos 61-381 de SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 67-390 de SEQ ID NO:7, e nucleotídeos 61-381 de SEQ ID NO: 11, respectivamente. Asseqüências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve Α1, A2, eA3 expostas como resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 4, resíduos 23-130 deSEQ ID NO: 8, e resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 12, respectivamente.Vide também as figuras 1A-1C.
Para avaliar a inovação das seqüências de regiões variáveisanti-5T4 Α1, A2, e A3, estudos BLASTp (para seqüências de pergunta deproteína) foram conduzidos usando parâmetros default de Expect=10, WordSize=3, um filtro de baixa complexidade, e a matriz BLOSUM62, permitindocustos de gap de existência = 11, e extensão = 1. Estudos BLASTn (para' ~ seqüências de pergunta de nucleotídeo) foram conduzidos usandoparâmetros default de Expect=10, Word Size=11, e um filtro de baixacomplexidade. Os resultados de estudos BLAST são reportados como umalista de seqüências relaciondas com a seqüência de pergunta, classificadosem ordem de valor de E, a qual é um indicador da importância estatística decombinações identificadas no banco de dados. Seqüências o maisintimamente relacionadas com as seqüências de regiões variáveis usadaspara análise BLAST são identificadas na Tabela 1 (BLASTn) e na Tabela 2(BLASTp).
Tabela 1
<table>table see original document page 81</column></row><table><table>table see original document page 82</column></row><table>
Tabela 2
<table>table see original document page 82</column></row><table><table>table see original document page 83</column></row><table>
Exemplo 2
Especificidade de Ligação e Afinidade de Anticorpos Anti-5T4 Murinos
Para avaliar a especificidade de ligação e a afinidade dosanticorpos Α1, A2, e A3, foi realizada análise BIACORE® usando antígeno5T4 humano imobilizadao sobre um chip CM5. Tecnologia BIACORE®utiliza alterações no índice refrativo na camada superficial na ligação doanticorpo ao antígeno 5T4 imobilizado sobre a camada. É detectada ligaçãopor ressonância de plasmon superficial (SPR) de luz a laser refratando apartir da superfície. Análise da cinética de sinal on rate e off rate permitediscriminação entre interações não específicas e específicas. O anticorpoanti-5T4 H8 foi usado como um controle. H8 é um anticorpo de IgGI decamundongo monoclonal gerado por hibridoma descrito na Publicação dePatente Internacional PCT No. WO 98/55607 e em Forsberg et al. (1997) J.Biol. Chem. 272(19): 124430-12436.
Tabela 3
<table>table see original document page 83</column></row><table>
Os resultados do BIACORE® mostram que anticorpos H8 e A1têm maior afinidade para 5T4 quando comparados com os anticorpos A2 eA3. A2 é um anticorpo de afinidade relativamente baixa. Cisteínasincomuns estão presentes no resíduo 67 da região variável de cadeiapesada A1 e resíduo 91 da região variável de cadeia pesada A3. Asubstituição destes resíduos com fenilalanina (A1) ou tirosina (A3) nãoalterou os níveis de expressão ou as propriedades de ligação de anticorpos.
A afinidade de ligação dos anticorpos H8, Α1, A2, e A3 tambémfoi testada por Western blotting usando Iisados celulares CT26/5T4, os quaisidentificaram forte ligação por H8, A1, e A3. Vide a figura 2.
A capacidade dos anticorpos H8, A1, A2, e A3 para ligar célulasexpressando antígeno 5T4 foi testada usando classificação celular ativadapor fluorescência (FACS) de células PC14PE6. Todos os anticorposapresentaram ligação específica\ a células PC14PE6 expressando 5T4, noentanto, o nível de ligação de A2 foi significativamente menor do que oobservado para H8, A1, e A3. Vide a Tabela 4.
Tabela 4
Resultados da Análise FACS _
<table>table see original document page 84</column></row><table>
Para avaliar a variabilidade potencial na produção de anticorpos,foram testadas duas preparações independentes de A1 e H8. Aspropriedades de ligação e cinéticas de cada anticorpo, quando comparadasentre cada preparação, não foram significativamente diferentes. Vide asfiguras 3A e 3B.
Exemplo 3
Internalização de Anticorpos Anti-5T4 Murinos por Células Expressando 5T4Para avaliar a internalização de anticorpos na ligação a antígeno5T4, a quantidade de anticorpos H8 e A1 detectados na superfície celularversus no sobrenadante foi determinada como uma função do tempo.Células MDAMB435/5T4 não enzimaticamente dissociadas (células decâncer de mama humano) foram expostas a anticorpos anti-5T4 por 1 hora a4°C. As células foram lavadas e incubadas em meios a 37°C por 4 horas ou24 horas. A quantidade de anticorpo ligado a membranas celulares versusanticorpo não ligado (isto é, presença no sobrenadante) foi determinadausando FACS. O desaparecimento de anticorpos contra 5T4 da superfíciede células MDAMB435/5T4 demonstra modulação do complexo de antígeno5T4 / anticorpo na superfície celular, a qual pode indicar internalização e/oudissociação. Vide as figuras 4A a 4C.Exemplo 4
Mapeamento de Epitopos Usando Quimeras 5T4
Para identificar os epitopos aos quais cada um dos anticorpos ofthe A1, A2, A3, e H8 ligam, foram realizados ensaios ELISA usando (1)constructos de Fc de ectodomínio 5T4 com seqüências eliminadas oumutadas, e (2) constructos de quimera 5T4 expressados transitoriamente emcélulas COS-1. O ectodomínio inclui a região de amino-terminal, duasrepetições ricas em leucina, e a região hidrofílica interveniente. Proteínas defusão contendo um ectodomínio 5T4 e algumas regiões constantes Fc deIgGI humana foram preparadas usando 5T4 de camundongo (aminoácidos1-361), 5T4 de rato (aminoácidos 1-361), 5T4 de macaco cynomologous(aminoácidos 1-355), 5T4 de chimpanzé (aminoácidos 1-355), e sagüi decauda preta (aminoácidos 1-355). Os constructos de quimera 5T4 sãorepresentados na figura 5. Os resultados de ligação são resumidos naTabela 5, a qual indica ligação específica, ligação parcial, ou falta de ligação,por cada um dos anticorpos H8, Α1, A2, e A3. Anticorpos H8 humanizados eΑ1, A2, e A3 quiméricos apresentaram propriedades de ligação similares aH8, Α1, A2, e A3 murinos respectivamente.
Com base nestes resultados, foi determinado que anticorpo H8humanizado liga a 5T4 humano entre os resíduos 173 e 252. H8humanizado liga a 5T4 com ou sem glicosilação N-encadeada no resíduo344, a qual confirma que ligação de H8 humanizado a 5T4 humano não éproximal a membrana. O anticorpo A1 tem um primeiro contacto com 5T4humano entre os resíduos 173 e 252 e um segundo contacto com 5T4humano entre os resíduos 282 e 361. O anticorpo A2 liga 5T4 humano entreos resíduos 282 e 361. O anticorpo A3 liga a primeira região de repetiçãorica em leucina de 5T4 humano entre os resíduos 83 a 163. Os epitoposligados por cada anticorpo são representadis na figura 7.Tabela 5
Resultados de Mapeamento de Epitopos Usando Fusões de Fc deEctodomínio 5T4
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Com base na diferente ligação observada a ectodomínios 5T4de humano e macaco cynomologous, foram feitas mutações direcionadaspara distinguir resíduos que participam em ligação de anticorpos. A ligaçãode anticorpo H8 humanizado foi testada a cada um dos ectodomínios 5T4mutados notados na Tabela 6 abaixo, isto é, ectodomínios 5T4 humanos queincluem um resíduo de macaco cynomologous na posição indicada. Estesresultados mostraram que os resíduos 213 e 214 de antígeno 5T4 humanosão requeridos para o epitopo ligado por H8 humanizado.Tabela 6
Resultados de Mapeamento de Epitopos Usando Fusão de Ectodomínio 5T4Humano/Fc Com Muatcoes Direcionadas
<table>table see original document page 87</column></row><table>
(+) ligação; (-) nenhuma ligação; (+/-) ligação parcial
Além de ensaios de ligação direta, foram realizados ensaios deligação competitiva usando anticorpo H8 humanizado biotinilado e cada umdos anticorpos Α1, A2, ou A3. Não foi observada inibição de ligação a 5T4humano, corroborando que cada um de Α1, A2, e A3 liga a um 5T4 epitopoque é distinto daquele ligado pelo anticorpo H8. Vide as figuras 6A-6.
Exemplo 5
Mapeamento de Epitopos Usando BIACORE®
Também foi realizado mapeamento de epitopos dos anticorposH8, Α1, A2, e A3 usando BIACORE® usando um chip CM5 com antígeno5T4 humano ligado. O chip foi saturado com anticorpo H8, Α1, A2, ou A3, euma primeira resposta foi medida. O chip foi em seguida saturado com umsegundo anticorpo de entre os anticorpos H8, Α1, A2, e A3, e uma segundaresposta foi medida. Para múltiplos experimentos, o chip foi regenerado pordissociação dos anticorpos ligados em 10 mM de glicina, pH 1.5, seguida poruma lavagem tampão. Os resultados são resumidos na Tabela 7 abaixo. Aspercentagens mostradas são as unidades de resposta medidas na ligaçãopor um segundo anticorpo diretamente ao chip CM5 divididas pelas unidadesde resposta medidas na ligação do segundo anticorpo a um chip CM5saturado com um primeiro anticorpo. Estes resultados mostram que H8, A1,A2, e A3 ligam cada um epitopo distinto em 5T4 humano. Os epitoposligados pelos anticorpos H8 e A3 estão estericamente próximos um do outrode tal modo que a taxa de associação com antígeno é reduzida quando étestada a ligação de H8 na presença de A3, e vice versa. Resultadossimilares foram obtidos usando os anticorpos H8, Α1, A2, e A3 quiméricos ehumanizados, os quais foram preparados conforme descrito no Exemplo 7nas partes que se seguem. Vide a Tabela 8.
Tabela 7
Resultados de Provas de Competição Usando BIACORE® --
Percentagem de Resposta de Segundo Anticorpo Depois de Saturação ComPrimeiro Anticorpo_
<table>table see original document page 88</column></row><table>
Tabela 8
Resultados de Provas de Competição Usando BIACORE® --Percentagem Segundo Anticorpo Ligado Depois de Saturação Com Primeiro
<table>table see original document page 88</column></row><table><table>table see original document page 89</column></row><table>
Os resultados combinados de estudos de mapeamento deepitopos conforme determinado usando constructos quiméricos (vide oExemplo 4) e BIACORE® são apresentados na figura 7.
Exemplo 6
Eficácia de Conjugados de Anti-5T4 / Caliqueamicina
Foi usado um tingimento com corante vital (MTS) paradeterminar o número de células sobreviventes depois de exposição a váriostratamentos. MTS (kit de assay de proliferação celular não radioativo) foiadquirido da Promega (Madison, Wisconsin) e usado de acordo com asespecificações do fabricante. Para cada linhagem celular foi estabelecidauma curva de calibração (número de células versus densidade ótica depoisde 2 horas) para estimar uma densidade de semeadura inicial apropriada.Em seguida as células foram semeadas em placas de 96 multicavidades emuma densidade de 750 a 5.000 células por cavidade. Imediatamente depoisda semeadura, as células foram expostas a várias concentrações decaliqueamicina <0, 0,01, 0,05, 0,1, 1, 10, 100 e 500 ng de equivalentes decaliqueamicina/ ml), CMA-676 e conjugados de caliqueamicina de anticorposanti-5T4. Depois de determinação do número de células sobreviventes a 96horas de exposição ao fármaco, a ED50 foi calculada com base nosparâmetros de regressão logística derivados das curvas de dose-resposta.
A ED50 foi definida como a concentração de fármaco (CalichDMH) quecausou uma redução de 50% do número de células depois de 96 horas deexposição ao fármaco. Um equivalente de caliqueamicina (eq. de cal.) é aconcentração de caliqueamicina dada ou como uma substância pura oucomo um conjugado. Dependendo da quantidade de caliqueamicina ligadaao anticorpo (carga de fármaco de anticorpo), equivalentes decaliqueamicina os quais são diferentes podem indicar diferentesconcentrações de proteína.
Os resultados de ensaios de MTS sáo mostrados na Tabela 9.Conjugados de anticorpo / caliqueamicina preparados usando os ensaios A1e A3 anti-5T4 essencialmente reduziram a viabilidade de célulasMDAMB435/5T4. Valores de seletividade foram calculados comparando aatividade específica do conjugado com a atividade não específica. Isto é,CalichDMH múltiplo para as células expressando 5T4 foram divididos pelosvalores múltiplos de CaIichDMN para células não expressando 5T4. Quandoé usado um anticorpo não específico, por exemplo, hp67.6 (CMA-676), osvalores múltiplos de CaIichDMH são aproximadamente os mesmos de modoque a seletividade é 1.
Tabela 9
<table>table see original document page 90</column></row><table><table>table see original document page 91</column></row><table>
A citotoxicidade de conjugados de anti-5T4 / caliqueamicinatambém foi testada usando uma cultura de células esferóides tridimensionalque se aproxima mais intitamente de um ambiente celular in vivo.Esferóides foram preparados essencialmente de acordo com Yuhas et al.(1977) CancerRes. 37:3639-3643. Em resumo, 105 células em 5 ml de meiode cultura foram semeadas sobre placas de 60 mm de cultura de células depoliestireno previamente revestidas com 5 ml de 0,65 % de cultura de tecidograu agar em meio de cultura (Sigma of St. Louis, Missouri). As placas foramincubadas por 5 a 6 dias a 37 9C e em 5% de CO2 em ar. Esferóides comum diâmetro de 0,2 mm foram selecionados e colocados em uma placamulticavidades de 24 cavidades. Cada cavidade continha 0,5 ml derevestimento inferior de agar, 1 esferóide, e 1 ml de revestimento superior demeio de cultura. Os esferóides foram em seguida expostos a váriasconcentrações de caliqueamicina (O, 0,091, 0,365, 1,46, 5,86, 23,44, 93,75 e375 ng de equivalentes de caliqueamicina / ml), CMA-676 e conjugados deanti-5T4 / caliqueamicina preparados usando os anticorpos anti-5T4 A1 e A3e um Iigante AcBut. Ambos os conjugados de anti-5T4 / caliqueamicinainibiram significativamente o crescimento de células MDAMB435/5T4. Videa figura 8.Exemplo 7
Preparação e Propriedades de Ligação de Anticorpos Anti-5T4 Quiméricos eHumanizados
Anticorpos H8, Α1, A2, e A3 quiméricos foram construídos tendoseqüências de regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve H8murinas e regiões constantes de cadeia pesada lgG4 humana e regiõesconstantes de cadeia leve capa humana. A cisteína presente na posição 67da região variável de cadeia pesada A1 foi opcionalmente trocada parafenilalanina, e a cisteína presente na posição 91 da região variável de cadeiapesada A3 foi opcionalmente trocada para tirosina. Estas variantes sãoexpostas na SEQ ID NO: 2 (A1 VH) e SEQ ID NO: 10 (A3 VH). A presençaou ausência de seqüências intrônicas e a substituição de resíduos cisteínanão afetam a expressão de anticorpos. Para clonagem de seqüênciascodificando regiões constantes de IgG, seqüências intrônicas foramopcionalmente eliminadas.
H8 humanizado foi preparado conforme descrito na Publicaçãode Patente Internacional PCT No. WO 2006/031653. Anticorpos A1humanizados foram preparados por enxertação de CDR conforme descritoadicionalmente abaixo aqui, neste pedido de patente. As CDRs dosanticorpos A1, A2, e A3 murinos foram identificadas usando a definiçãoAbM, a qual se baseia em variabilidade de seqüência bem como alocalização das regiões de laço estrutural. Em geral, cadeias principaisaceitadoras humanas foram selecionadas com base em que sãoessencialmente similares às regiões de cadeia principal dos anticorposmurinos, ou os quais foram mais similares a seqüência de consenso dasubfamília de regiões variáveis. Também foi levada em consideração arepresentação dos Ioci de cadeia principal em seres humanos, de tal modoque seqüências amplamente representadas foram preferenciais de modogeral em relação a seqüências menos populosas. Mutações adicionais dasseqüências aceitadoras de cadeia principal humanas foram feitas pararestaurar resíduos murinos que se acreditava estarem envolvidos emcontactos de antígeno e/ou resíduos envolvidos na integridade estrutural dosítio de ligação antigênica. A seqüência de aminoácidos também pode serotimizada para preferência de códons de células CHO e para remover sítiosenzimáticos de restrição. Pode ser usado um programa de previsão deestrutura de peptídeo para analisar as seqüências de regiões variáveispesadas e leves humanizadas para identificar e evitar sítios de modificaçãode proteína pós-translacional introduzidos pelo design de humanização.
Uma região variável de cadeia pesada A1 humanizada (A1 VHversão 1.0) foi construída para incluir as CDRs de A1 murino enxertadassobre uma região de cadeia principal de DP-21 humana (subgrupo VH7, No.de Acesso CAA43346, SEQ ID NO: 88), a qual contém uma mutação decadeia principal (S82A) e uma retromutação (E46K). Foram preparadasvariantes removendo a retromutação (A1 VH versões 1.1 e 1.2). Umasegunda região variável de cadeia pesada A1 humanizada foi preparadaenxertando CDRs A1 sobre uma região de cadeia principal de linhagemgerminativa DP-54 humana (A1 VH versão 2.0). Foram feitas seis (6)retromutações para produzir A1 VH versão 2.1. Conforme descritoadicionalmente abaixo, ambas as regiões variáveis de cadeia pesada A1conservaram propriedades de ligação de 5T4. As regiões de cadeiaprincipal DP-21 e DP-54 apresentarm 63% de identidade das seqüência deaminoácidos por sua extensão, indicando que numerosas alterações deaminoácidos podem ser feitas ao mesmo tempo que preservando aespecificidade de ligação do anticorpo, inclusive a capacidade para ligar aum epitopo em particular. A similaridade de regiões variáveis de cadeiapesada A1 humanizadas é mostrada na Tabela 10. Seqüências denucleotídeos típicas codificando regiões variáveis de cadeia pesada A1humanizadas são expostas como SEQ ID NOs: 48, 50, 53, e 55.Seqüências de aminoácidos típicas de regiões variáveis de cadeia pesadaA1 humanizadas são expostas como SEQ ID NOs: 49, 51, 52, 54, e 56.
Vide também as figuras 9A-9B.
Uma região variável de cadeia leve A1 humanizada foiconstruída para incluir as CDRs de A1 murino enxertadas sobre regiões decadeia principal de linhagem germinativa humana DPK24 (subgrupo VKIV),DPK9 (subgrupo VKI) , e DPK23 (subgrupo VKIII). Depois de incorporaçãode uma retromutação (backmutation) S67Y em cadeias principais de regiãovariável de cadeia leve A1 humanizada preparadas com cada uma destascadeias principais demonstraram ligação de 5T4. Vide abaixo, inclusive aTabela 13. A região de cadeia principal DPK24 apresenta 74% e 73% deidentidade das seqüência de aminoácidos por sua extensão com DPK9 eDPK23, respectivamente. A região de cadeia principal DPK9 apresenta 74%de identidade das seqüência de aminoácidos por sua extensão com DPK23.A similaridade das regiões variáveis de cadeia leve A1 humanizadas émostrada na Tabela 10. As múltiplas versões de regiões de cadeia principalvariáveis de cadeia leve humanizadas demonstram que numerosasalterações de aminoácidos podem ser feitas ao mesmo tempo quepreservando a especificidade de ligação do anticorpo, inclusive a capacidadepara ligar a um epitopo particular. Seqüências de nucleotídeos típicascodificando regiões variáveis de cadeia leve A1 humanizadas sãodeterminadasexpostas como SEQ ID NOs: 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73,e 75. Seqüências de aminoácidos típicas de regiões variáveis de cadeialeve A1 humanizadas são expostas como SEQ ID NOs: 58, 60, 62, 64, 66,68, 70, 72, 74, e 76. Vide também as figuras 9C-9F.
Tabela 10
Relação de Anticorpos A1 Humanizados
<table>table see original document page 94</column></row><table><table>table see original document page 95</column></row><table>
Anticorpos A2 e A3 humanizados foram desenhados usandouma estratégia similar. Seqüências de aminoácidos típicas de regiõesvariáveis de cadeia pesada A2 humanizadas e regiões variáveis de cadeialeve A2 humanizadas são expostas ID NOs: 77-78 e SEQ ID NOs: 79-80,respectivamente. Vide também a figura 9G. Seqüências de aminoácidostípicas de regiões variáveis de cadeia pesada A3 humanizadas e regiõesvariáveis de cadeia leve A3 humanizadas são expostas como SEQ ID NOs:81-82 e SEQ ID NOs: 83-84, respectivamente. Vide também a figura 9H.
Para avaliar a inovação de regiões variáveis de cadeia pesada ede cadeia leve Α1, A2, e A3 humanizadas, foi realizada análise BLASTn eBLASTp conforme descrito no Exemplo 1. Os resultados são apresentadosna Tabela 11.
Tabela 11
<table>table see original document page 95</column></row><table>Continuação...
<table>table see original document page 96</column></row><table>Continuação...
<table>table see original document page 97</column></row><table>
* Quando Cobertura da busca = 100%
As figuras 10A-10B mostram seqüências de regiões variáveis decadeia pesada adicionais que podem ser usadas como cadeias principaispara preparação de anticorpos anti-5T4 A1, A2, e A3 humanizados. Asfiguras 11-13 mostram seqüências de regiões variáveis de cadeia leveadicionais que podem ser usadas como uma cadeia principal parapreparação de anticorpos anti-5T4 A1, A2, e A3 humanizados. A figura 14mostra regiões constantes típicas que podem ser usadas para a preparaçãode anticorpos anti-5T4 Α1, A2, e A3 quiméricos e humanizados.
Para avaliar a especificidade de ligação e a afinidade dosanticorpos H8, Α1, A2, e A3 quiméricos e humanizados, foi realizada análiseBIACORE® usando antígeno 5T4 humano imobilizado sobre um chip CM5.Vide o Exemplo 2. Os resultados para anticorpos Α1, A2, e A3 quiméricossão mostrados na Tabela 12 abaixo.
Tabela 12
Resultados do Ensaio BIACORE®
<table>table see original document page 98</column></row><table>
Em geral, quimerização / humanização aumenta a afinidade deH8, Α1, A2, e A3 a 5T4 humano. Comparar a Tabela 3. O aumento nasafinidades de ligação pareceu resultar essencialmente de uma dissociaçãomais lenta do anticorpo e antígeno ao invés de uma associação mais rápida.Os anticorpos A2 e A3 quiméricos apresentaram as propriedades de ligaçãomais aprimoradas depois de quimerização.
Todas as regiões variáveis de cadeia pesada A1 humanizadasmantiveram propriedades de ligação de 5T4. Além disso, a remoção daretromutação K46 de região variável de cadeia pesada A1 humanizada nãoafetou as propriedades de ligação de 5T4. Regiões variáveis de cadeia leveA1 humanizadas apresentaram propriedades de ligação de 5T4comprometidas. Regiões variáveis de cadeia leve A1 humanizadasconstruídas usando cadeias principais DPK9 e DPK23 ligaram 5T4 commaior afinidade do que algumas regiões variáveis de cadeia leve A1humanizadas construídas usando cadeias principais DPK24. Retromutaçõesforam incorporadas para restaurar e/ou otimizar ligação de 5T4. Asubstituição do resíduo serina na posição 67 com um resíduo tirosina,conforme visto na região de cadeia principal A1 murina, restauraramcompletamente propriedades de ligação de antígeno 5T4. Vide a Tabela 13.
Tabela 13
<table>table see original document page 99</column></row><table>
huA1, A1 humanizadov, versão
Exemplo 8
Reatividade Cruzada entre Espécies de Anticorpos Anti-5T4
A reatividade cruzada de espécies de anticorpos anti-5T4descritos aqui, neste pedido de patente, foi ensaiada para determinarespécies relevantes para estudos de eficácia in vivo e análise de toxicologia.Também foi usada correlação da atividade de ligação e relação dosdiferentes ectodomínios 5T4 para descrever adicionalmente o epitopo ligadopor cada anticorpo. Ensaios de ligação foram realizados usandoectodomínios 5T4 de várias espécies fundidos a Fc de IgGI humana. Apercentagem de identidade de cada região de ectodomínio a 5T4 humano émostrada na Tabela 14.
Tabela 14
Relação de 5T4 de Diferentes Espécies
<table>table see original document page 100</column></row><table>
a Contém 6 repetições diretas de aminoácido dentro do domínio hidrofílico
As seqüências de extensão total ou parcial de 5T4 de humano,camundongo, rato, cão, e vaca foram descritas previamente como Nos. deAcesso do GenBank Z29083 (humana, SEQ ID NO: 87), AJ012160(camundongo), BC087011 (rato), XM539020 (cão), e XM593502 (vaca).
Uma seqüência parcial virtual de 5T4 de chimpanzé foi gerada usando umalinhamento de mRNA e seqüências genômicas. Ácidos nucléicoscodificando proteínas 5T4 foram isolados de macaco cynomologous e sagüide cauda preta. As seqüências de aminoácidos destes antígenos 5T4adicionais são mostradas na figura 15 e também são expostas como SEQ IDNO: 86 (macaco cynomologous) e SEQ ID NO: 85 (sagüi de cauda preta).
Para avaliar a inovação de seqüências de macacocynomologous e sagüi de cauda preta, foram realizadas análises BLASTconforme descrito no Exemplo 2. Ao usar a seqüência de aminoácidos 5T4de sagüi de cauda preta de extensão total como uma seqüência depergunta, a seqüência objeto mais próxima foi identificada como 5T4humana (No. de Acesso no GenBank NP_006661.1), com 94% deidentidade (302/320 aminoácidos). As seqüências também diferiram notérmino carboxila, com aminoácidos 1-19 de SEQ ID NO: 85 não alinhandocom a seqüência objeto mais próxima. Ao usar a seqüência de aminoácidos5T4 de macaco cynomologous de extensão total como uma seqüência depergunta, a seqüência objeto não virtual mais próxima foi identificada comoum precursor de glicoproteína de trofoblasto também de macacocynomologous (No. de Acesso no GenBank BAE00432.1), com 99% deidentidade (364/366 aminoácidos). As seqüências também diferiram notérmino carboxila, com aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO: 86 não alinhandocom a seqüência objeto não virtual mais próxima.
Para testar a ligação de anticorpos anti-5T4, ectodomínio5T4/proteínas de fusão de Fc foram transfectadas transitoriamente emcélulas COS-1, e foram realizados ensaios ELISA. Anticorpos lgG4 e IgGIhumanos não relevantes foram usados como controles. A reatividade deespécies cruzadas de anticorpos anti-5T4 é resumida na Tabela 15.
Tabela 15
<table>table see original document page 101</column></row><table>
huH8 γ4, anticorpo H8 humanizado tendo regiões constantes de lgG4huH8 γ1, anticorpo H8 humanizado tendo regiões constantes de IgGIChiAI γ4, anticorpo A1 quimérico tendo regiões constantes de lgG4ChiA2 γ4, anticorpo A2 quimérico tendo regiões constantes de lgG4ChiA3 γ4, anticorpo A3 quimérico tendo regiões constantes de lgG4(+/-), ligação parcial(-), nenhuma ligaçãoListagem de Seqüência
<110> WYETH
Boghaert, ErwinDamle, NitinHamann, PhilipKhandke, KiranKunz, ArthurMarquette, KimberlyTchistiakova, LioudmilaGill, DavinderSreekumar, Kodangattil
<120> ANTICORPOS ANTI-5T4 E OSOS DOS MESMOS<130> 040000-0359813<140><141>
<150> 60/891,248<151> 2007-02-23<150> 60/781,346<151> 2006-03-10<160> 99
<170> PatentIn versão 3.4
<210> 1
<211> 414
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc_feature<222> (1). . (57)<223> seqüência líder<220>
<221> misc_feature<222> (58)..(414)<223> região variável de cadeia pesada<220>
<221> misc_difference<222> (260).. (260)<223> η é g ou t<400> 1
atggattggc tgtggaactt gctattcctg atggcagctg cccaaagtat ccaagcacag 60
atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 120tgcaaggctt ctggatatac cttcacaaac tttggaatga actgggtgaa gcagggtcca 180ggagagggtt taaagtggat gggctggata aacaccaaca ctggagagcc aagatatgct 240gaagagttca agggacggtn tgccttttct ttggaaacca ctgccagcac tgcctatttg 300cagatcaaca acctcaaaaa tgaggacacg gctacatatt tctgtgcaag agactgggac 360ggtgcctact tctttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 414
<210> 2<211> 138
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> seqüência líder<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(138)
<223> região variável de cadeia pesada<220>
<221> MI-SC_FEATURE
<222> (45)..(54)
<223> CDRl
<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (69).. (85)<223> CDR2<220>
<221> MUTAGEN<222> (87)..(87)
<223> Xaa é cisteína (C) ou fenilalanina (F) ; esta é posição 67numeração de acordo com Kabat
<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (118)..(127)<223> CDR3<400> 2
Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser1 5 10 IB
Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Phe Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Gly Pro Gly Glu Gly Leu
50 55 60
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala65 70 75 80
Glu Glu Phe Lys Gly Arg Xaa Ala Phe Ser Leu Glu Thr Thr Ala Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Trp Asp Gly Ala Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 3<211> 381<212> DNA60120180
<213> Mus musculus<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<223> seqüência líder<220>
<221> misc_feature
<222> (61)..(381)
<223> região variável de cadeia leve
<400> 3
atgaagtcac agacccaggt cttcgtattt ctactgctct gtgtgtctgg tgctcatgggagtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgttt cagcaggaga cagggtgaccataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cttggtacca acagaagccagggcagtctc ctaaactgtt gataaacttt gcaaccaatc gctacactgg agtccctaat 240cgcttcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgtgcaggct 300gaagacctgg cactttattt ctgtcagcag gattatagct ctccgtggac gttcggtgga 360ggcaccaagc tggaaatcaa a 381
<210> 4<211> 127<212> PRT
<213> Mus musculus<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (1) .. (20)<223> seqüência líder<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (21).. (127)
<223> região variável de cadeia leve
<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (44)..(54)<223> CDRl<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (70)..(76)<223> CDR2<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (109) . . (117)<223> CDR3<400> 4
Met Lys Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser1 5 10 15
Gly Ala His Gly Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu
20 25 30
Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Asn Phe Ala Thr Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asn65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser
85 90 95
Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr
100 105 HO
Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys115 120 125
<210> 5
<211> 405
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc_feature<222> (1)..(54)
<223> seqüência líder
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(405)
<223> região variável de cadeia pesada
<400> 5
atggaatgga ggatctttct cttcatcctg tcaggaactg caggtgtcca ctcccaggtt 60cagctgcagc agtctagacc tgagctggtg aagcctgggg cttcagtgaa gatgtcctgc 120aaggcttctg gatacacttt cactgactat gttataagct gggtgaagca gagaactgga 180cagggccttg agtggattgg agagatttat cctggaagta atagtattta ttacaatgag 240aagttcaagg gcagggccac actgactgca gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag 300ctcagcagcc tgacatctga ggactctgcg gtctatttct gtgcaatggg gggtaactac 3 60ggctttgact attggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 405
<210> 6
<211> 135
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1) .. (18)
<223> seqüência líder
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19).. (135)
<223> região variável de cadeia pesada
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(53)
<223> CDRl
<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (68)..(84)
<223> CDR2
<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (117)..(124)<223> CDR3<400> 6
Met Glu Trp Arg Ile Phe Leu Phe Ile Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val1 5 10 15
His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Arg Pro Glu Leu Val Lys Pro
20 25 30
Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
35 40 45
Asp Tyr Val Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Asn Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu65 70 75 80
Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr
85 90 95
Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
100 105 110
Phe Cys Ala Met Gly Gly Asn Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser130 135
<210> 7<211> 390<212> DNA<213> Mus musculus<220>
<221> misc_feature<222> (1)..(66)<223> seqüência líder<220>
<221> misc_feature<222> (67)..(390)<223> região variável de cadeia leve<400> 7
atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtcc 60
agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctct aggggaacgg 120gtcaccttga cctgcactgc cagctcaagt gtaaattcca attacttaca ctggtaccag 180cagaagccag gatcctcccc caaactctgg atttatagca catccaacct ggcttctgga 240gtcccagctc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctcac aatcagcagc 300atggaggctg aagatgctgc cacttattac tgccaccagt atcatcgttc cccgctcacg 360ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa 390
<210> 8<211> 130<212> PRT<213> Mus musculus<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (1) . . (22)
<223> seqüência líder<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (23)..(130)<223> região variável de cadeia leve<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (46)..(56)<223> CDRl<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (73).. (79)<223> CDR2<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (112)..(120)<223> CDR3<400> 8
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser15 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
20 25 30
Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser
35 40 45
Ser Ser Val Asn Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly65 70 75 80
Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His
100 105 110
Gln Tyr His Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu115 120 125
Leu Lys130<210> 9<211> 423<212> DNA<213> Mus musculus<220>
<221> misc_feature<222> (1) .. (57)<223> seqüência líder<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(423)
<223> região variável de cadeia pesada
<220>
<221> misc_difference<222> (347)..(347)<223> négoua<400> 9
atgctgttgg ggctgaagtg ggttttcttt gttgtttttt atcaaggtgt gcattgtgag 60
gtgcagcttg ttgagtctgg tggaggattg gtgcagccta aagggtcatt gaaactctca 120tgtgcagcct ctggattcac cttcaatacc tacgccatga actgggtccg ccaggctcca 180ggaaagggtt tggaatgggt tgctcgcata agaagtaaaa gtaataatta tgcaacatat 240tatgccgatt cagtgaaaga caggttcacc atctccagag atgattcaca aagcatgctc 300tatctgcaaa tgaacaactt gaaaactgaa gacacagcca tgtattnctg tgtgagacag 360tgggattacg acgtcagggc tatgaactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420tca 423
<210> 10<211> 141<212> PRT
<213> Mus musculus<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> seqüência líder<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(141)
<223> região variável de cadeia pesada
<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (45).. (54)<223> CDRl<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (69)..(87)<223> CDR2<220>
<221> MUTAGEN<222> (116)..(116)
<223> Xaa é cisteína (C) ou tirosina (Y) ; esta é posição 91 comnumeração de acordo com Kabat
<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (120)..(130)<223> CDR3<400> 10
Met Leu Leu Gly Leu Lys Trp Val Phe Phe Val Val Phe Tyr Gln Gly1 5 10 15
Val His Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85 90 95
Gln Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Met Tyr Xaa Cys Val Arg Gln Trp Asp Tyr Asp Val Arg Ala Met
115 120 125
Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser130 135 140
<210> 11<211> 381<212> DNA<213> Mus musculus<220>
<221> misc_feature<222> (1) .. (60)<223> seqüência líder<220>
<221> misc_feature<222> (61).. (381)<223> região variável de cadeia leve
<400> 11
atggagacac attctcaggt ctttgtatac atgttgctgt ggttgtctgg tgttgaagga 60gacattgtga tgacccagtc tcacatattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 120atcacctgca aggccagtca ggatgtggat actgctgtag cctggtatca acagaaacca 180gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggctcactgg agtccctgat 240cgcttcacag gcagtggatc tgggacggat ttcactctca ccattagcaa tgtgcagtct 300gaagacttgg cagattattt ctgtcagcaa tatagcagct atccgtacac gttcggaggg 360gggaccaagc tggaaataaa a 381
<210> 12<211> 127<212> PRT<213> Mus musculus<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (1)..(20)<223> seqüência líder<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (21).. (127)<223> região variável de cadeia leve<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (44)..(54)<223> CDRl<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (70)..(76)<223> CDR2<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (109)..(117)<223> CDR3<400> 12
Met Glu Thr His Ser Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser1 5 10 15
Gly Val Glu Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Ile Phe Met Ser
20 25 30
Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Asp Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Leu Thr Gly Val Pro Asp65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser
100 105 110
Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 13<211> 98<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg
<210> 14
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg
<210> 15<211> 98<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met15 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 16<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
30 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg
<210> 17
<211> 98<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg<210> 18<211> 98<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 18Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Thr<210> 19<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Arg
20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Thr Pro Phe Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Arg Ser Met Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg<210> 20<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Gln Val Gln Leu1
Ser Val Lys Val20
Tyr Met His Trp35
Gly Ile Ile Asn50
Gln Gly Arg Val65
Met Glu Leu Ser
Ala Arg<210> 21<211> 98<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 21
Gln Met Gln Leu Val1 5
Ser Val Lys Val Ser20
Ala Val Gln Trp Val35
Gly Trp Ile Val Val50
Gln Glu Arg Val Thr65
Val5
Ser
Val
Pro
Thr
Ser85
Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
10 15
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
40 45
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
55 60
Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr70 75 80
Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys90 95
Gln Ser Gly Pro Glu10
Cys Lys Ala Ser Gly25
Arg Gln Ala Arg Gly40
Gly Ser Gly Asn Thr55
Ile Thr Arg Asp Met70
Val Lys Lys Pro Gly Thr15
Phe Thr Phe Thr Ser Ser30
Gln Arg Leu Glu Trp Ile45
Asn Tyr Ala Gln Lys Phe60
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Ala
<210> 22<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Gln Val -Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg<210> 23<211> 98<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 24
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Thr<210> 25<211> 30<212> PRT<213> artificial<220>
<223> seqüência de consenso de cadeia principal (framework) 1 de regiãovariável de cadeia pesada VHl humana<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30
<210> 26<211> 14<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> seqüência de consenso de cadeia principal 2 de região variávelcadeia pesada VHl humana<400> 26
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 27
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> seqüência de consenso de cadeia principal 3 de região variávelcadeia pesada VHl humana<400> 27
Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg20 25 30
<210> 28
<211> 101
<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 28
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro100
<210> 29
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro85 90 95Thr Val
<210> 30
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro85 90 95
Thr Val
<210> 31
<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro85 90 95
<210> 32<211> 95<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 32
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro
85 90 95
<210> 33<211> 96<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 33
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
30 20 25 30
Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Ser Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp His Asn Leu Pro
85 90 95
<210> 34<211> 96<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 34
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Leu Pro85 90 95
<210> 35
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro85 90 95
<210> 36<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro85 90 95
<210> 37<211> 95<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Sèr Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro
85 90 95
<210> 38
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro85 90 95
<210> 39
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro85 90 95
<210> 40
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> ' 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro85 90 95
<210> 41<211> 95<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro85 90 95
<210> 42
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro85 90 95
<210> 43<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Sér Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser85 90 95
<210> 44
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln -Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser85 90 95
<210> 45<211> 327<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 45
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
10 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
20 100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val130 135 140
25 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp30 180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu195 200 205Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys325
<210> 46
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys325 330
<210> 47<211> 330<212> PRT.<213> Homo sapiens<400> 47
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys325 330
<210> 48<211> 357<212> DNA<213> Artificial<220>
<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 48
caggtgcagc tggtgcaatc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg cttctggata taccttcaca aactttggaa tgaactgggt gcgacaggcc 120cctggacaag ggcttaagtg gatgggatgg ataaacacca acactggaga gccaagatat 180gctgaagagt tcaagggacg gtttgtcttc tccttggaca cctctgtcag cactgcctat 240ctgcagatct ccagcctgaa ggctgaggac actgccgtgt attactgtgc cagagactgg 300gacggtgcct acttctttga ctactggggc caaggcaccc ttgtcacagt ctcctca 357
<210> 49<211> 119<212> PRT
<213> Artificial<220><223> derivada de seqüências humanas e de camundongo
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23) .. (35)
<223> CDRl
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50) . . (66)
<223> CDR2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(108)
<223> CDR3
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Trp Asp Gly Ala Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 357<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 50
caggtgcagc tggtgcaatc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg cttctggata taccttcaca aactttggaa tgaactgggt gcgacaggcc 120cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg ataaacacca acactggaga gccaagatat 180gctgaagagt tcaagggacg gtttgtcttc tccttggaca cctctgtcag cactgcctat 240ctgcagatct ccagcctgaa ggctgaggac actgccgtgt attactgtgc cagagactgg 300gacggtgcct acttctttga ctactggggc caaggcaccc ttgtcacagt ctcctca 357
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<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 51
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
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25 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Glu Glu Phe50 55 60
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<213> Artificial<220>
<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Asp Trp Asp Gly Ala Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
lis
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<213> Artificial
<220>
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tcctgtgcag cctctggata taccttcaca aactttggaa tgaactgggt ccgccaggct 120ccagggaagg ggctggagtg ggtggcctgg ataaacacca acaccggtga gccaagatat 180gctgaagagt tcaagggacg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac accgctgtgt attactgtgc cagagactgg 300gacggtgcct acttctttga ctactggggc caaggcaccc ttgtcacagt ctcctca 357
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<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
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<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 55
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggata taccttcaca aactttggaa tgaactgggt ccgccaggct 120ccagggaagg ggctgaagtg gatgggctgg ataaacacca acaccggtga gccaagatat 180gctgaagagt tcaagggacg attcaccatc tccctggaca acgccaagtc ctcagcctat 240ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac accgctgtgt attactgtgc cagagactgg 3 00gacggtgcct acttctttga ctactggggc caaggcaccc ttgtcacagt ctcctca 357
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<220>
<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe20 25 30
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<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 57
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105
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<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 59
Gly Ala Cys Ala Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys1 5 10 15
Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala Cys Thr Cys Cys Cys Thr
20 25 30
Gly Gly Cys Thr Gly Thr Gly Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Cys
35 40 45
Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala
50 55 60
Ala Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Ala Gly Thr Cys Ala65 70 75 80
Gly Ala Gly Thr Gly Thr Gly Ala Gly Thr Ala Ala Thr Gly Ala Thr
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100 105 110
Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys Cys
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Ala Gly Cys Gly Gly Ala Thr Ala Cys Gly Gly Cys Ala Cys Ala Gly
195 200 205
Ala Thr Thr Thr Cys Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr
210 215 220
Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys Thr225 230 235 240
Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Thr Thr Thr
245 250 255
Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly Ala
260 265 270
Thr Thr Ala Thr Ala Gly Cys Thr Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Gly
275 280 285
Ala Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Thr Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala
290 295 300
Cys Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala305 310 315 320
Ala
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<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 60
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Phe Ala Thr Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
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Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp
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<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 61
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<213> Artificial<220>
<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 62
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp20 25 30 '
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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180240300
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<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo
<400> 64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
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<220>
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atcacttgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtgg cttggtatca gcagaaacca 120
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp20 25 30
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<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 68
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
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<213> Artificial<22 0>
<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 69
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga cagagtcacc 60atcacttgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtgg cttggtatca gcagaaacca 120ggcaaagccc ctaagctcct gatctatttt gcaaccaatc gctacactgg agtcccatcc 180cgcttcagcg gcagcggata cggcacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcaacct 240gaagattttg caacttacta ctgtcagcag gattatagct ctccctggac cttcggtcag 300ggcaccaagg tggaaatcaa a 321
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<213> Artificial
<220>
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105
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<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 71
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtgg cttggtatca gcagaaacca 120ggcaaagccc ctaagctcct gatctatttt gcaaccaatc gctacactgg agtcccatcc 180cgcttcagcg gcagcggatc cggcacagat ttcactttca ccatcagcag cctgcaacct 240gaagattttg caacttacta ctgtcagcag gattatagct ctccctggac cttcggtcag 300ggcaccaagg tggaaatcaa a 321<210> 72
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105
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<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 73
gaaattgtga tgacacagtc tccagccacc ctgtccctgt ctccaggcga aagagccacc 60
ctctcctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtgg cttggtacca gcagaaacct 120gggcaggctc ccaggctgct gatctatttt gcaaccaatc gctacactgg catcccagcc 180cgcttctccg gcagcggctc cggcacagac ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag gattatagct ctccctggac cttcggtcag 300ggcaccaagg tggaaatcaa a 321
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<213> Artificial<220>
<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 74
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105
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<212> DNA
<213> Artificial<220>
<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo
<400> 75
gaaattgtga tgacacagtc tccagccacc ctgtccctgt ctccaggcga aagagccacc 60
ctctcctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtgg cttggtacca gcagaaacct 120gggcaggctc ccaggctgct gatctatttt gcaaccaatc gctacactgg catcccagcc 180
cgcttctccg gcagcggcta cggcacagac ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag gattatagct ctccctggac cttcggtcag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa a 321
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<211> 107<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 76
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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<213> Artificial
<220>
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50 55 60
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85 90 95
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100 105 HO
Val Thr Val Ser Ser
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<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 79<211> 108<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 79
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Asn Ser Asn
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Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105
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<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 80
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Asn Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105
<210> 81<211> 122<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 81
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp50 55 60Ser Val Lys Asp65
Leu Tyr Leu Gln
Tyr Cys Ala Arg100
Gly Gln Gly Thr
115<210> 82<211> 122<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Xle Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Gln Trp Asp Tyr Asp Val Arg Ala Met Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 83
Arg Phe Thr Ile Ser Arg70
Met Asn Ser Leu Lys Thr85 90
Gln Trp Asp Tyr Asp Val105
Leu Val Thr Val Ser Ser120
Asp Asp Ser Lys Asn Ser75 80
Glu Asp Thr Ala Val Tyr95
Arg Ala Met Asn Tyr Trp110<211> 107<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 83
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Leu Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105
<210> 84<211> 107<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> derivada de seqüências humanas e de camundongo<400> 84
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Leu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105
<210> 85<211> 367<212> PRT<213> marmosets<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (1) . . (29)<223> seqüência líder<220>
<221> mat_peptide<222> (30)..(367)
<223> peptídeo maduro - seqüência parcial<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (30)..(356)<223> ectodomínio<400> 85
Met Pro Gly Gly Cys Ser Arg Gly Pro Ala Ala Gly Asn Gly Arg Leu
-25 -20 -15
Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu Leu Gly Trp Val Ser Ser Ser
-10 -5 -1 1
Ser Pro Thr Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Pro Phe Leu5 10 15Ala Ser Ala Val Ser Ala Gln Pro Leu Leu Pro Gly Gln Cys Pro Ala20 25 30 35
Leu Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Asn Arg
40 45 50
Asn Leu Thr Glu Val Pro Thr Asp Leu Pro Pro Tyr Val Arg Asn Leu
55 60 65
Phe Leu Thr Gly Asn Gln Leu Ala Val Leu Pro Ala Gly Ala Phe Ala
70 75 80
Arg Val Pro Pro Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Asn Leu Ser Gly Ser
85 90 95
Arg Leu Glu Asp Val Gln Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Ser Leu100 105 110 115
Arg Gln Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Ala Val Leu Ser Pro Phe
120 125 130
Ala Phe Ser Gly Ser Asn Ala Ser Val Ser Ala Pro Ser Pro Leu Val
135 140 145
Glu Leu Ile Leu Asn His Ile Val Pro Pro Glu Asp Glu Arg Asn Asn
150 155 160
Arg Ser Phe Glu Gly Met Val Val Ala Ala Leu Arg Ala Gly Gly Ala
165 170 175
Leu His Gly Leu His Arg Leu Glu Leu Ala Ser Asn His Phe Leu Tyr180 185 190 195
Leu Pro Arg Asp Val Leu Ala Gln Leu Pro Ser Leu Arg His Leu Asp
200 205 210
Leu Ser Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr Tyr Val Ser Phe Arg Asn
215 220 225
Leu Thr His Leu Glu Ser Leu His Leu Glu Asp Asn Ala Leu Lys Val
230 235 240
Leu His Asn Gly Thr Leu Ala Glu Leu Gln Gly Leu Pro His Val Arg
245 250 255
Val Phe Leu Asp Asn Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys His Met Ala Asp260 265 270 275Met Val Ala Trp Leu Lys Glu Thr Glu Val Val Gln Gly Lys Tyr Gln
280 285 290
Leu Thr Cys Ala Phe Pro Glu Lys Met Arg Asn Arg Val Leu Leu Glu
295 300 305
Leu Asn Ser Ala Asp Leu Asp Cys Asp Pro Ile Leu Pro Pro Ser Leu
310 315 320
Gln Thr Ser Tyr Val Phe Leu Gly Ile Val Leu Ala Leu Ile Gly
325 330 335
<210> 86<211> 420<212> PRT
<213> Macaco Cynomologous<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (X) . . (29)<223> seqüência líder<220>
<221> mat_peptide<222> (30)..(420)<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (30) . . (356)<223> ectodomínio<400> 86
Met Pro Gly Gly Cys Ser Arg Gly Pro Ala Ala Gly Asp Gly Arg Leu
-25 -20 -15
Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu Leu Gly Trp Val Ser Ser Ser
-10 -5 -1 1
Ser Pro Thr Ser Ser Ala Ser Ser Phe Ser Ser Ser Ala Pro Phe Leu
5 10 15
Ala Ser Ala Ala Ser Ala Gln Pro Pro Leu Pro Asp Gln Cys Pro Ala20 25 30 35Leu Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Asn Arg
40 45 50
Asn Leu Thr Glu Val Pro Thr Asp Leu Pro Leu Tyr Val Arg Asn Leu
55 60 65
Phe Leu Thr Gly Asn Gln Leu Ala Val Leu Pro Ala Gly Ala Phe Ala
70 75 80
Arg Arg- Pro Pro Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Asn Leu Ser Gly Ser
85 90 95
Arg Leu Asp Glu Val Arg Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Ser Leu100 105 110 115
Arg Gln Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Ala Tyr Leu Ser Pro Phe
120 125 130
Ala Phe Ser Gly Ser Asn Ala Ser Ile Ser Ala Pro Ser Pro Leu Val
135 140 145
Glu Leu Ile Leu Asn His Ile Val Pro Pro Asp Asp Lys Arg Gln Asn
150 155 160
Arg Ser Phe Glu Gly Met Val Ala Ala Ala Leu Val Ala Gly Arg Ala
165 170 175
Leu Gln Gly Leu His Leu Leu Glu Leu Ala Ser Asn His Phe Leu Tyr180 185 190 195
Leu Pro Arg Asp Val Leu Ala Gln Leu Pro Ser Leu Arg Tyr Leu Asp
200 205 210
Leu Ser Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr Tyr Val Ser Phe Arg Asn
215 220 225
Leu Thr His Leu Glu Ser Leu His Leu Glu Asp Asn Ala Leu Lys Val
230 235 240
Leu His Asn Gly Thr Leu Ala Glu Leu Gln Gly Leu Pro His Val Arg
245 250 255
Val Phe Leu Asp Asn Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys His Met Ala Asp260 265 270 275
Met Val Thr Trp Leu Lys Gln Thr Glu Val Val Gln Gly Lys Asp Arg280 285 290Leu Thr Cys Ala Phe Pro Glu Lys Met Arg Asn Arg Val Leu Leu Glu
295 300 305
Leu Asn Ser Ala Asp Leu Asp Cys Asp Pro Ile Leu Pro Pro Ser Leu
310 315 320
Gln Thr Ser Tyr Val Phe Leu Gly Ile Val Leu Ala Leu Ile Gly Ala
325 330 335
Ile Phe Leu Leu Val Leu Tyr Leu Asn Arg Lys Gly Ile Lys Lys Trp340 345 350 355
Met His Asn Ile Arg Asp Ala Cys Arg Asp His Met Glu Gly Tyr His
360 365 370
Tyr Arg Tyr Glu Ile Asn Ala Asp Pro Arg Leu Thr Asn Leu Ser Ser
375 380 385
Asn Ser Asp Val
390<210> 87<211> 420<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 87
Met Pro Gly Gly Cys Ser Arg Gly Pro Ala Ala Gly Asp Gly Arg Leu1 5 10 15
Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu Leu Gly Trp Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Pro Thr Ser Ser Ala Ser Ser Phe Ser Ser Ser Ala Pro Phe Leu
35 40 45
Ala Ser Ala Val Ser Ala Gln Pro Pro Leu Pro Asp Gln Cys Pro Ala
50 55 60
Leu Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Asn Arg65 70 75 80
Asn Leu Thr Glu Val Pro Thr Asp Leu Pro Ala Tyr Val Arg Asn Leu
85 90 95
Phe Leu Thr Gly Asn Gln Leu Ala Val Leu Pro Ala Gly Ala Phe Ala100 105 110
Arg Arg Pro Pro Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Asn Leu Ser Gly Ser
115 120 125
Arg Leu Asp Glu Val Arg Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Ser Leu
130 135 140
Arg Gln Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Ala Asp Leu Ser Pro Phe145 150 155 160
Ala Phe Ser Gly Ser Asn Ala Ser Val Ser Ala Pro Ser Pro Leu Val
165 170 175
Glu Leu Ile Leu Asn His Ile Val Pro Pro Glu Asp Glu Arg Gln Asn
180 185 190
Arg Ser Phe Glu Gly Met Val Val Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg Ala
195 200 205
Leu Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu Leu Ala Ser Asn His Phe Leu Tyr
210 215 220
Leu Pro Arg Asp Val Leu Ala Gln Leu Pro Ser Leu Arg His Leu Asp225 230 235 240
Leu Ser Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr Tyr Val Ser Phe Arg Asn
245 250 255
Leu Thr His Leu Glu Ser Leu His Leu Glu Asp Asn Ala Leu Lys Val
260 265 270
Leu His Asn Gly Thr Leu Ala Glu Leu Gln Gly Leu Pro His Ile Arg
275 280 285
Val Phe Leu Asp Asn Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys His Met Ala Asp
290 295 300
Met Val Thr Trp Leu Lys Glu Thr Glu Val Val Gln Gly Lys Asp Arg305 310 315 320
Leu Thr Cys Ala Tyr Pro Glu Lys Met Arg Asn Arg Val Leu Leu Glu
325 330 335
Leu Asn Ser Ala Asp Leu Asp Cys Asp Pro Ile Leu Pro Pro Ser Leu
340 345 350
Gln Thr Ser Tyr Val Phe Leu Gly Ile Val Leu Ala Leu Ile Gly Ala355 360 365
Ile Phe Leu Leu Val Leu Tyr Leu Asn Arg Lys Gly Ile Lys Lys Trp
370 375 380
Met His Asn Ile Arg Asp Ala Cys Arg Asp His Met Glu Gly Tyr His385 390 395 400
Tyr Arg Tyr Glu Ile Asn Ala Asp Pro Arg Leu Thr Asn Leu Ser Ser405 410 415
Asn Ser Asp Val420
<210> 88
<211> 130
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 88
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Arg Gly Tyr Ser Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val115 120 125
Ser Ser130<210> 89
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 90
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 90
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Lys
<210> 91
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 91
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg
<210> 92
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 92
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg
<210> 93
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 93
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95
Arg
<210> 94
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 94Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 · 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro85 90 95
<210> 95
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 95
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro85 90 95
<210> 96<211> 95<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 96
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro
85 90 95
<210> 97
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 97
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro
85 90 95
<210> 98<211> 101<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 98
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro100
<210> 99
<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 99
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Leu Pro
85 90 95

Claims (47)

1. Anticorpo que especificamente liga antígeno 5T4 humano, emque o anticorpo:a) compreende um domínio de ligação antigênica de anticorposΑ1, A2, ou A3 murinos;b) compete para ligação de 5T4 com anticorpos Α1, A2, ou A3murinos;c) iga um epitopo 5T4 ligado por anticorpos Α1, A2, ou A3; oud) compreende um fragmento de ligação de 5T4 de um anticorpode (a) a (c).
2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que oanticorpo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpode cadeia única, um fragmento Fab, um fragmento F(ab)2, um fragmento Fv,um anticorpo tetramérico, um anticorpo tetravalente, um anticorpomultiespecífico, um anticorpo de domínio-específico, um anticorpo dedomínio único, ou uma proteína de fusão.
3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, o qual é umanticorpo monoclonal murino.
4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que oanticorpo tem um afinidade de ligação para antígeno 5T4 humano de nomínimo cerca de 1 χ 10"7 M a cerca de 1 χ IO12M.
5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que oanticorpo especificamente tem por alvo células expressando 5T4 in vivo.
6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que a regiãovariável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos dosresíduos 20-138 de SEQ ID NO: 2, resíduos 19-135 de SEQ ID NO: 6,resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 10, resíduos 1-119 de SEQ ID NO: 49; ouresíduos de uma região variável de cadeia pesada A1, A2, ou A3humanizada.
7. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que a regiãovariável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos dosresíduos 21-127 de SEQ ID NO: 4, resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 8,resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 12; ou resíduos de uma região variável decadeia leve Α1, A2, ou A3 humanizada.
8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que a regiãovariável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos dosresíduos 20-138 de SEQ ID NO: 2, e em que a região variável de cadeia levecompreende uma seqüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQID NO: 4.
9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que a regiãovariável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidosderivada dos resíduos 19-135 de SEQ ID NO: 6, e em que a região variávelde cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos derivada dosresíduos 23-130 de SEQ ID NO: 8.
10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que a regiãovariável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidosderivada dos resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 10, e em que a região variávelde cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos derivada dosresíduos 21 -127 de SEQ ID NO: 12.
11. Anticorpo de acordo com a reivindicação 2, o qual é umanticorpo anti-5T4 quimérico ou humanizado.
12. Anticorpo quimérico ou humanizado de acordo com areivindicação 11, o qual compreende regiões constantes derivadas deregiões constantes humanas.
13. Anticorpo quimérico ou humanizado de acordo com areivindicação 12, em que a região constante de cadeia leve humana éderivada de região constante de cadeia leve kappa humana.
14. Anticorpo quimérico ou humanizado ou fragmento deanticorpo de acordo com a reivindicação 12, em que a região constante decadeia pesada humana é derivada de uma região constante de cadeiapesada de IgGI, lgG2, lgG3, ou lgG4 humana.
15. Anticorpo quimérico ou humanizado ou fragmento deanticorpo de acordo com a reivindicação 14, em que a região constante decadeia pesada de lgG4 humana compreende prolina na posição 241.
16. Anticorpo quimérico ou humanizado de acordo com areivindicação 11, em que a região variável de no mínimo uma cadeia leve ouno mínimo uma cadeia pesada compreende:(a) regiões de estrutura compreendendo resíduos de um regiãode estrutura de anticorpo humano; e(b) uma ou mais CDRs da região variável de cadeia leve de SEQID NO: 4, 8, ou 12, ou uma ou mais CDRs da região variável de cadeiapesada de SEQ ID NO: 2, 6, ou 10.
17. Anticorpo quimérico ou humanizado de acordo com areivindicação 16, em que os resíduos humanos são resíduos de estruturahumana selecionados entre o grupo consistindo em:(a) uma região de estrutura de cadeia pesada de anticorpohumano selecionada entre o grupo consistindo em DP-21 (VH7), DP-54(VH3-07), DP-47 (VH3-23), DP-53 (VH-74), DP-49 (VH3-30), DP-48 (VH3--13), DP-75, DP-8(VH1-2), DP-25, VI-21D e VI-3 (VH1-03), DP-15 e V1-8(VH1-08), DP-14 e V1-18 (VH1-18), DP-5 e V1-24P (VH1-24), DP-4 (VH1-45), DP-7 (VH1-46), DP-10, DA-6 e YAC-7 (VH1-69), DP-88 (VH1-e), DP-3 eDA-8 (VH1-f);(b) uma região de estrutura de cadeia leve de anticorpo humanode um clone de linhagem germinativa DPK24 subgrupo IV, um V-Klllsubgrupo (DPK23, DPK22, DPK20, DPK 21), ou um clone de linhagemgerminativa Wl subgrupo (DPK9, DPK1, 02, DPK-7);(c) uma seqüência de consenso de uma região de estrutura decadeia pesada de (a); ou(d) uma região de estrutura que é no mínimo 63% idêntica a umaregião de estrutura de (a)-(c).
18. Anticorpo quimérico ou humanizado de acordo com areivindicação 16 compreendendo no mínimo duas CDRs de qualquer umadas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, ou 12.
19. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 18, emque a cadeia leve compreende um região variável compreendendo nomínimo duas de três CDRs de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 8, ou 12.
20. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 19, emque a cadeia leve compreende um região variável compreendendo trêsCDRs de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 8, ou 12.
21. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 16, emque a cadeia pesada compreende um região variável compreendendo nomínimo duas de três CDRs de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 6, ou 10.
22. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 21, emque a cadeia pesada compreende um região variável compreendendo trêsCDRs de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 6, ou 10.
23. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 16, oqual compreende as CDRs de SEQ ID NOs: 2 e 4, as CDRs de SEQ IDNOs: 6 e 8, ou as CDRs de SEQ ID NOs: 10 e 12.
24. Anticorpo quimérico ou humanizado de acordo com areivindicação 11, em que a região variável de cadeia pesada seqüênciacompreende:(a) uma seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-138 de SEQID NO: 2;(b) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 85%idêntica aos resíduos 20-138 de SEQ ID NO: 2;(c) uma seqüência de aminoácidos dos resíduos 19-135 de SEQID NO: 6;(d) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 86%idêntica aos resíduos 19-135 de SEQ ID NO: 6;(e) uma seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-141 de SEQID NO: 10;(f) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 91%idêntica aos resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 10;(g) uma seqüência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ IDNOs: 49, 51, 52, 54, 56, 77, 78, 81, ou 82;(h) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 91%idêntica a SEQ ID NO: 51;(i) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 78%idêntica a SEQ ID NO: 54;G) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 89%idêntica a SEQ ID NO: 77;(k) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 79%idêntica a SEQ ID NO: 78;(I) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 80%idêntica a SEQ ID NO: 81; ou(m) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 78%idêntica a SEQ ID NO: 82;
25. Anticorpo quimérico ou humanizado de acordo com areivindicação 11, em que a região variável de cadeia leve seqüênciacompreende:(a) uma seqüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQID NO: 4;(b) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 94%idêntica aos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 4;(c) uma seqüência de aminoácidos dos resíduos 23-130 de SEQID NO: 8;(d) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 96%idêntica aos resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 8;(e) uma seqüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQID NO: 12;(f) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 98%idêntica aos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 12;(g) uma seqüência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ IDNOs: 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 79, 80, 83, ou 84;(h) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 83%idêntica a SEQ ID NO: 60;(i) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 93%idêntica a SEQ ID NO: 70;(j) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 85%idêntica a SEQ ID NO: 76;(I) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 85%idêntica a SEQ ID NO: 76;(m) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 88%idêntica a SEQ ID NO: 79;(n) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 84%idêntica a SEQ ID NO: 80;(o) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 90%idêntica a SEQ ID NO: 83; ou(p) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 91%idêntica a SEQ ID NO: 84.
26. Conjugado de fármaco / anticorpo para liberação de fármacocompreendendo:(a) um anticorpo como definido na reivindicação 1; e(b) um fármaco, o qual é ligado diretamente ou indiretamente aoanticorpo.
27. Conjugado de fármaco / anticorpo de acordo com areivindicação 26, em que o fármaco é um agente terapêutico selecionadosentre o grupo consistindo em um citotoxina, um radioisótopo, um agenteimunomodulador, um agente antiangiogênico, um agente antiproliferativo,um agente pró-apoptótico, um agente quimioterápico, e um ácido nucléicoterapêutico.
28. Conjugado de fármaco / anticorpo de acordo com areivindicação 27, em que o agente terapêutico é um citotoxina.
29. Conjugado de fármaco / anticorpo de acordo com areivindicação 26, em que a citotoxina é um antibiótico, um inibidor depolimerização de tubulina, um agente alquilante, um inibidor da sínteseprotéica, um inibidor da quinase protéica, um inibidor da fosfatase, uminibidor da topoisomerase, ou um enzima.
30. Conjugado de fármaco / anticorpo de acordo com areivindicação 27, em que a citotoxina é um antibiótico.
31. Conjugado de fármaco / anticorpo de acordo com areivindicação 30, em que the antibiótico é caliqueamicina.
32. Conjugado de fármaco / anticorpo de acordo com areivindicação 31, em que a caliqueamicina é um derivado N-acetila ouanálogo dissulfeto de caliqueamicina.
33. Conjugado de fármaco / anticorpo de acordo com areivindicação 32, em que a caliqueamicina é N-acetil-D-caliqueamicina.
34. Conjugado de fármaco / anticorpo de acordo com areivindicação 26, em que o fármaco é ligado ao anticorpo através de umligante.
35. Conjugado de fármaco / anticorpo de acordo com areivindicação 34, em que o ligante é selecionado entre o grupo consistindoem ácido 4-(4'acetilfenóxi)butanóico (AcBut), ácido 3- acetilfenil acidífero(AcPac), ácido 4-mercapto-4-metil-pentanóico (Amide), e derivados dosmesmos.
36. Método para liberar um fármaco para células expressando 5T4 compreendendo contactar as células com um conjugado de fármaco /anticorpo compreendendo (i) um anticorpo anti-5T4 de acordo com areivindicação 1, e (ii) um fármaco o qual é ligado ao um anticorpo anti-5T4diretamente ou indiretamente.
37. Método de acordo com a reivindicação 36, em que o fármacoé internalizado em uma célula-alvo.
38. Método para tratar um sujeito tendo um câncer 5T4-positivo,o método referido compreendendo administrar ao sujeito uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um conjugado de fármaco / anticorpo anti-5T4compreendendo (i) um anticorpo anti-5T4 de acordo com a reivindicação 1, e(ii) um agente terapêutico o qual é ligado ao anticorpo anti-5T4 diretamenteou indiretamente.
39. Método de acordo com a reivindicação 38, em que oconjugado de fármaco / anticorpo anti-5T4 é um conjugado de anticorpo anti-5T4 / caliqueamicina, e compreendendo adicionalmente administrar umsegundo agente terapêutico, em que o conjugado de anti-5T4 /caliqueamicina e o segundo agente terapêutico são administradossimultaneamente ou consecutivamente em qualquer ordem.
40. Anticorpo que especificamente liga a um epitopo 5T4humano compreendendo os resíduos 173-252 e 276-355, excetuando osresíduos 213-214, de SEQ ID NO: 87.
41. Anticorpo que especificamente liga a um epitopo 5T4humano compreendendo os aminoácidos 276-355 de SEQ ID NO: 87.
42. Anticorpo que especificamente liga a um epitopo 5T4humano compreendendo os aminoácidos 83-163 de SEQ ID NO: 87.
43. Anticorpo que especificamente liga a 5T4 de macacocynomologous tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86.
44. Proteína 5T4 isolada compreendendo:(a) uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 ou 86; ou(b) uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo 95%idêntica a SEQ ID NO: 85.
45. Anticorpo que especificamente liga a proteína 5T4 isoladacomo definida na reivindicação 44.
46. Ácido nucléico isolado codificando uma região variável decadeia pesada anti-5T4 compreendendo:(a) uma seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 58-414 deSEQ ID NO: 1;(b) uma seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 55-404 deSEQ ID NO: 5;(c) uma seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 58-423 deSEQ ID NO: 9;(d) uma seqüência de nucleotídeos codificando qualquer umadas SEQ ID NOs: 48, 50, 53, ou 55;(e) uma seqüência de nucleotídeos que é 89% idêntica a SEQ IDNO: 50 quando a extensão de busca é 100%;(f) uma seqüência de nucleotídeos que é 82% idêntica a SEQ IDNO: 53 quando a extensão de busca é 100%; ou(g) um ácido nucléico que especificamente hibridiza aocomplemento de qualquer uma de (a)-(d) sob condições de hibridizaçãoestringentes.
47. Ácido nucléico isolado codificando uma região variável decadeia leve anti-5T4 compreendendo:(a) uma seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 61-381 deSEQ ID NO: 3;(b) uma seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 67-390 deSEQ ID NO: 7;(c) uma seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos 61-381 deSEQ ID NO: 11;(d) uma seqüência de nucleotídeos codificando uma regiãovariável de cadeia leve A1, A2, ou A3 humanizada de qualquer uma dasSEQ ID NOs: 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, ou 75;(e) uma seqüência de nucleotídeos que é 84% idêntica a SEQ IDNO: 59 quando a extensão de busca é 100%;(f) uma seqüência de nucleotídeos que é 86% idêntica a SEQ IDNO: 69 quando a extensão de busca é 100%;(g) uma seqüência de nucleotídeos que é 85% idêntica a SEQ IDNO: 75 quando a extensão de busca é 100%; ou(h) um ácido nucléico que especificamente hibridiza aocomplemento de qualquer uma de (a)-(d) sob condições de hibridizaçãoestringentes.
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