BRPI0708791A2 - medicamentos e proteÍnas - Google Patents

Abstract

MEDICAMENTOS E PROTEÍNAS. A presente invenção refere-se ao uso de TGF-<225>s monoméricos, ou seus fragmentos ou derivados, como medicamentos. Estes medicamentos compreendem preferivelmente TGF-<225>3, ou fragmentos ou derivados dos mesmos. Os medicamentos providos podem ser usados na aceleração de feridas e/ou na inibição de cicatriz, na promoção de regeneração epitelial, ou na prevenção e/ou tratamento de distúrbios fibróticos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MEDICA-MENTOS E PROTEÍNAS".

A presente invenção refere-se ao fornecimento de novos medi-camentos. Em modalidades preferidas a invenção fornece medicamentosadequados para uso na aceleração de cura de feridas e/ou na prevenção,redução ou inibição de cicatriz. A invenção também fornece um método paraa aceleração de cura de feridas e/ou para a prevenção, redução ou inibiçãoda cicatriz.

O Fator de crescimento transformante-Betas (TGF-Bs) é umafamília de citocinas tendo diversas atividades biológicas. A família TGF-βcompreende cinco isoformas, TGF-B1, TGF-B2, TGF-B3, TGF-B4, e TGF-B5.

Os TGF-Bs tém utilidade em muitos contextos terapêuticos dife-rentes. Como resultado do potencial terapêutico de TGF-Bs há muito inte-resse na aplicação farmacêutica de membros da família TGF-B, particular-mente TGF-Bs 1-3.

TGF-B1, TGF-B2 e TGF-B3 são todos conhecidos para executarpapéis cruciais na regulação da resposta de cura de ferida. A atividade TGF-B pode influenciar a taxa de cura de ferida assim como a extensão da cica-triz que ocorre como resultado de cura.

TGF-B1 tem usos na prevenção e/ou no tratamento de esclero-derma, distúrbios de angiogênese, doença renal, osteoporose, doença ós-sea, glomerulonefrite e doença renal.

TGF-B2 pode ser usado no tratamento de glioma, câncer pulmo-nar de células não-pequenas, tumor de pâncreas, tumores sólidos, tumor decólon, tumor de ovário, degeneração macular relativa à idade, ferimento ocu-lar, osteoporose, retinopatia, úlceras, carcinoma, inflamação de boca e es-cleroderma.

TGF-B3 pode ser usado no tratamento de distúrbios fibróticos, fi-brose pulmonar, cirrose de fígado, escleroderma, distúrbios de angiogênese,reestenose, adesões, endometriose, doença isquêmica, fertilização in vitropor indução de osso e cartilagem, mucosite oral, doença renal, prevenção,redução ou inibição de cicatriz, melhora de reconexão neuronal no sistemanervoso periférico e central, prevenção, redução ou inibição de complicaçõesde cirurgia ocular (tal como a cirurgia de LASIK ou de PRK) ou cicatriz naparte traseira do olho (tal como cicatriz associada à vitreorretinopatia proliferativa).

Os membros da família TGF-β existem naturalmente sob a formade dímeros que compreendem duas cadeias de peptídeo. Dímeros TGF-Bativos têm um peso molecular de aproximadamente 25,4kDa. O fragmentodimérico ativo de TGF-β é estabilizado por interações hidrofóbicas e iônicas,que são adicionalmente reforçadas por uma ponte de dissulfeto de inter-subunidade. Aceita-se geralmente que a atividade biológica, e então toda aatividade terapêutica, de membros da família TGF-B seja extraída unicamen-te pelo dímero ativo.

Tendo em conta o que precede, reconhecer-se-á que há umanecessidade bem-estabelecida de fornecer medicamentos capazes de utili-zar as propriedades terapêuticas de membros da família TGF-B. Entretanto,apesar desta exigência bem-reconhecida para composições farmacêuticasque compreendem membros da família TGF-B existem muitos problemasconfirmados associados à fabricação de TGF-Bs para o uso terapêutico.

Uma das grandes desvantagens de usar TGF-Bs como agentesterapêuticos é que a fim de biologicamente produzir (e então terapeutica-mente) dímeros de proteína ativos usando um hospedeiro procariótico, arenaturação intensiva à forma dimérica biologicamente ativa é exigida. Aformação de dímero pode significativamente estender as linhas de tempo defabricação. Isto também tem implicações importantes em limitar o uso tera-pêutico de qualquer TGF-B.

É um objetivo da presente invenção, prevenir ou mitigar pelomenos alguns dos problemas associados às composições farmacêuticas datécnica anterior que compreendem TGF-Bs. Em particular, um objetivo decertas modalidades da presente invenção é prevenir ou mitigar problemasassociados ao uso de abordagens de fabricação de tempo intensivo usadaspara produzir dímeros biologicamente ativos destas proteínas.

Em um primeiro aspecto da invenção é fornecido um monômerode TGF-β, ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo, para uso comoum medicamento.

A invenção é baseada nas descobertas muito surpreendentesdos inventores em que TGF-Bs monoméricos podem exercer atividades bio-lógicas que eram anteriormente acreditadas serem fornecidas somente porproteínas de TGF-β diméricas. Estas descobertas tornam possível o uso deTGF-Bs monoméricos em medicamentos eficazes capazes de utilizar aspropriedades biológicas de um TGF-B3 selecionado. Como será imediata-mente apreciado nesta descoberta e, por conseguinte, a presente invenção,grandes expansões nas aplicações práticas em que TGF-Bs pode terapeuti-camente ser usado, através da redução de tempo e custo associados à fa-bricação de medicamentos adequados.

Os inventores acreditam que as vantagens de medicamentos deacordo com a invenção podem ser fornecidas por medicamentos compreen-dendo qualquer isoforma de TGF-B monomérico. Conseqüentemente, comexceção de onde o contexto exige de outra maneira, referências a TGF-B ouTGF-Bs podem ser tomadas para abranger qualquer forma monomérica bio-logicamente ativa de uma isoforma TGF-B tal como TGF-B1, 2, 3, 4 e 5. Mo-nômeros preferidos adequados para o uso nos medicamentos da invençãosão monômeros TGF-B do tipo selvagem (de qualquer isoforma desejada).

Preferivelmente, TGF-Bs monoméricos adequados para o uso de acordocom a presente invenção são selecionados do grupo consistindo em TGF-B1, TGF-B2 e TGF-B3. Mais preferivelmente o TGF-B monomérico é TGF-B3, e em um segundo aspecto da invenção é fornecido um monômero TGF-B3, ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo, para uso como ummedicamento. É preferido que os monômeros TGF-B a serem usados deacordo com a presente invenção sejam monômeros TGF-B humanos. É pre-ferido que TGF-Bs fornecidos em medicamentos de acordo com a presenteinvenção deve estar presente substancialmente na forma monomérica intei-ramente. TGF-Bs monoméricos adequados para uso nos medicamentos oumétodos da invenção podem preferivelmente ter um peso molecular de a-proximadamente 12kDa, e mais particularmente, de aproximadamente12.5kDa.

As seqüências de resíduo de aminoácido das formas humanasdas isoformas TGF-βΙ, TGF-B2 e TGF-B3 são mostradas como SeqüênciaID Ne 1, 2 e 3 respectivamente, e um TGF-β monomérico compreendendoquaisquer destas seqüências, ou um fragmento biologicamente ativo dequaisquer destas seqüências, constitui um monômero preferido para uso deacordo com a presente invenção. TGF-B3 monomérico (Seqüência ID N9 3)constitui um monômero particularmente preferido para uso de acordo com osvários aspectos da presente invenção.

Exceto onde o contexto exige de outra maneira, as referênciasno presente relatório descritivo para TGF-Bs monoméricos (incluindo refe-rências a isoformas particulares) devem ser tomadas também para abrangerfragmentos e derivados biologicamente ativos de tal TGF-Bs monoméricos.Os fragmentos biologicamente ativos deriváveis de Seqüência ID N9 1 a 3representam fragmentos preferidos para uso nos medicamentos da inven-ção, com fragmentos biologicamente ativos deriváveis a partir de SeqüênciaID N9 3 constituindo fragmentos particularmente preferidos. Os fragmentosbiologicamente ativos preferidos podem compreender a porção de ligaçãoreceptora da isoforma de TGF-β selecionada.

Derivados adequados de TGF-Bs monoméricos que podem serutilizados nos medicamentos ou métodos da invenção incluem: derivados depeptídeo terapeuticamente eficazes de TGF-Bs monoméricos (ou seus frag-mentos); fragmentos ou derivados terapeuticamente eficazes compreenden-do ou baseados no farmacóforo de TGF-Bs monoméricos (ou seus fragmen-tos); derivados de peptóide terapeuticamente eficazes de TGF-Bs monomé-ricos (ou seus fragmentos); derivados de D-aminoácidos terapeuticamenteeficazes de TGF-Bs monoméricos (ou seus fragmentos); peptidomiméticosterapeuticamente eficazes baseados em TGF-Bs monoméricos (ou seusfragmentos); análogos de peptídeo terapeuticamente eficazes de TGF-Bsmonoméricos (ou seus fragmentos); pseudopeptídeos terapeuticamente efi-cazes baseados em TGF-Bs monoméricos (ou seus fragmentos); peptídeosretro-inversos terapeuticamente eficazes baseados em TGF-Bs monoméri-cos (ou seus fragmentos); derivados de depsipeptídeos terapeuticamenteeficazes baseados em TGF-Bs monoméricos (ou seus fragmentos); deriva-dos de β-peptídeo terapeuticamente eficazes baseados em TGF-Bs mono-méricos (ou seus fragmentos); e derivados de retropeptóide terapeuticamen-te eficazes baseados em TGF-Bs monoméricos (ou seus fragmentos).

Os inventores verificaram que formas monoméricas de TGF-B3humano podem ser usadas da mesma maneira como TGF-B3 dimérico, porexemplo, para o tratamento de distúrbios fibróticos, escleroderma, distúrbiosde angiogênese, reestenose, adesões, endometriose, doença isquêmica,indução de ossos e cartilagens, fertilização in vitro, mucosite oral, doençarenal, prevenção, redução ou inibição de cicatriz, melhora de reconexão neu-ronal no sistema nervoso periférico e central, prevenção, redução ou inibiçãode complicações de cirurgia ocular (tal como cirurgia LASIK ou PRK), trata-mento de palato e lábio leporino, prevenção, redução ou inibição de cicatrize cura acelerada de tendões e ligamentos. Formas monoméricas de TGF-B3também são capazes de promover regeneração epitelial em locais de danoepitelial.

As descobertas dos inventores também indicam que formas mo-noméricas de TGF-B1 e TGF-B2 são capazes de exercer todas as atividadesterapêuticas associadas com as formas diméricas destes fatores de crescimento.

"Atividade biológica" no contexto da presente invenção é preferi-velmente medida in vivo. Os inventores descobriram que, de acordo com asdescobertas publicadas na técnica anterior, as formas monoméricas de TGF-Bs geralmente não exibem atividade biológica como avaliada por métodos invitro. Entretanto, no contraste direto às crenças da técnica anterior, os inven-tores descobriram muito surpreendentemente que formas monoméricas deTGF-Bs podem exercer atividade biológica e terapêutica in vivo. Conseqüen-temente, será reconhecido que para um TGF-B monomérico, ou um frag-mento ou um derivado do mesmo, ser julgado biologicamente ativo de acor-do com a presente invenção não é necessário que o TGF-B monoméricoexiba atividade biológica mensurável por ambos os meios in vitro e in vivo,mas meramente que exiba atividade biológica que possa ser medida in vitroou in vivo, e preferivelmente atividade que possa ser medida in vivo.

Adequadamente, a atividade biológica de TGF-Bs monoméricosadequados para uso de acordo com o primeiro aspecto da invenção podeser medida com referência à atividade biológica conhecida de dímeros dodado TGF-β. Na modalidade preferida, atividade biológica pode ser medidacom referência à habilidade de um monômero (tal como um monômero deSeqüência ID N- 3) de acelerar a cura da ferida e/ou de prevenir, reduzir ouinibir cicatriz.

À vista dos parágrafos precedentes, será reconhecido que osmedicamentos de acordo com o primeiro ou segundo aspecto da invençãosão particularmente adequados para uso na aceleração da cura da feridae/ou prevenção, redução ou inibição de cicatriz. Além disso, os medicamen-tos de acordo com o primeiro ou segundo aspecto da invenção são tambémparticularmente adequados para uso na promoção de reepitelialização.

Certamente, em um terceiro aspecto da invenção é fornecido ouso de um monômero TGF-B3, ou um fragmento biologicamente ativo domesmo, na preparação de um medicamento para uso na aceleração da curada ferida e/ou na inibição de cicatriz.

Em um quarto aspecto da invenção é fornecido o uso de um mo-nômero TGF-B3, ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo, na pre-paração de um medicamento para uso na promoção da regeneração epitelial.

Em um quinto aspecto da invenção é fornecido o uso de um mo-nômero TGF-B3, ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo na prepa-ração de um medicamento para uso na prevenção e/ou tratamento de umdistúrbio fibrótico. Os distúrbios fibróticos preferidos que podem ser preveni-dos e/ou tratados usando tais medicamentos podem ser selecionados a par-tir do grupo consistindo em fibrose de pulmão, fibrose de fígado, esclero-derma, fibrose de pele, fibrose de músculo, fibrose de radiação, fibrose derim e fibrose uterina.

Além disso, em um sexto aspecto da invenção é fornecido ummétodo de aceleração da cura de ferida e/ou inibição de cicatriz, o métodocompreendendo administrar a um paciente necessitando de tal tratamentouma quantidade terapeuticamente eficaz de um TGF-B3 monomérico, ou umfragmento do mesmo.

Em um sétimo aspecto da invenção é fornecido um método depromoção de regeneração epitelial, o método compreendendo administrar aum paciente necessitando de tal tratamento um uma quantidade terapeuti-camente eficaz de um TGF-B3 monomérico, ou um fragmento do mesmo.

Em um oitavo aspecto da invenção é fornecido um método deprevenção e/ou de tratamento de um distúrbio fibrótico, o método compreen-dendo administrar a um paciente necessitando de tal prevenção e/ou trata-mento uma quantidade terapeuticamente eficaz de um TGF-33 monomérico,ou um fragmento do mesmo. Os distúrbios fibróticos preferidos que podemser prevenidos e/ou tratados usando tais métodos podem ser selecionados apartir do grupo consistindo em fibrose de pulmão, fibrose de fígado, esclero-derma, fibrose de pele, fibrose de músculo, fibrose de radiação, fibrose derim e fibrose uterina.

Para as finalidades da presente invenção uma quantidade tera-peuticamente eficaz de um TGF-β monomérico, ou um fragmento do mes-mo, é uma quantidade suficiente para causar um exigido:

i) aceleração na cura da ferida e/ou inibição de cicatriz; ou

ii) promoção da regeneração epitelial; ou

iii) prevenção e/ou tratamento de um distúrbio fibrótico.

A extensão da aceleração da cura da ferida e/ou inibição de ci-catriz, ou regeneração epitelial, ou prevenção ou redução de fibrose que po-de ser exigida será aparente, e certamente pode prontamente ser determi-nada por um clínico responsável para o cuidado do paciente. Uma avaliaçãoadequada da extensão da aceleração da cura da ferida e/ou inibição de cica-triz, ou promoção da regeneração epitelial, ou prevenção ou redução de fi-brose pode ser determinada pelo clínico, e pode ser com referência aos mé-todos de medição sugeridos descritos aqui.

TGF-Bs monoméricos adequados e preferidos para uso de acor-do com a invenção podem ser selecionados com referência a qualquer outodas as considerações descritas aqui.

No caso onde se deseja efetuar a aceleração da cura da feridacom prevenção, redução ou inibição de cicatriz ou efetuar a prevenção outratamento de distúrbios fibróticos, por exemplo, fibrose pulmonar, cirrose defígado, escleroderma, glomerulonefrite, ou similares, geralmente será prefe-rido usar TGF-B3 monomérico ou um fragmento biologicamente ativo adequado.

Embora o uso de TGF-33 monomérico tenha benefícios particu-Iarmente notáveis, medicamentos compreendendo formas monoméricas deoutras isoformas de TGF-β também têm grande valor.

Por exemplo, medicamentos compreendendo TGF-BI monomé-rico, ou fragmentos biologicamente ativos do mesmo, podem ter usos naprevenção e/ou tratamento de cura de ferida não crônica, por exemplo, úlce-ras venosas, sintomas de pressão, úlceras diabéticas, distúrbios de angio-gênese, doença renal, osteoporose, doença óssea, glomerulonefrite e doen-ça renal. Como exemplo, TGF-31 dimérico do tipo selvagem, distribuído foimostrado em modelos animais para ser um estimulador poderoso de cresci-mento e regeneração óssea. Além disso, a administração de TGF-βΙ foimostrada para proteger tecidos de transtorno de reperfusão isquêmica, par-ticularmente no cérebro (seguido de derrame), e no coração (seguido de o-clusão da artéria coronária).

Medicamentos compreendendo TGF-B2 monomérico, ou frag-mentos biologicamente ativos do mesmo, podem ser usados no tratamentode glioma, câncer pulmonar de célula não-pequena, tumor de pâncreas, tu-mores sólidos, tumor de cólon, tumor de ovário, degeneração macular relati-va à idade, lesão ocular, osteoporose, retinopatia, úlceras, carcinoma, infla-mação de boca e escleroderma. Como exemplo, aplicação tópica de TGF-32dimérico do tipo selvagem foi mostrada em dois ensaios clínicos para acele-rar o fechamento das úlceras crônicas de perna associadas com estase ve-nosa; e distribuição local de TGF-332 humano recombinante em modelosanimais foi mostrada para promover recrescimento e regeneração óssea.Medicamentos compreendendo TGF-B3 monomérico, ou frag-mentos biologicamente ativos do mesmo, podem ser usados no tratamentode feridas (que incluem feridas crônicas tais como úlceras), escleroderma,distúrbios fibróticos, por exemplo, fibrose pulmonar, cirrose de fígado, fibrosede rim, etc., distúrbios de angiogênese, reestenose, adesões, endometriose,doença isquêmica, indução de osso e cartilagem, fertilização in vitro, mucosi-te oral e doença renal. Como exemplo, aplicação tópica de TGF-B3 diméricado tipo selvagem foi mostrada, em modelos animais e nos clínicos, para ace-lerar a taxa de cura de úlceras de pressão de não-cura, crônicas; reduzir aincidência, severidade, e duração de mucosite oral; e reduzir os efeitos cola-terais adversos de síndrome gastrointestinal de radiação resultante de danoa células do tronco causado por radioterapia e quimioterapia durante trata-mento contra câncer. As descobertas dos inventores indicam que TGF-B3monomérico pode ser usado em todos estes contextos a fim de causar asatividades terapêuticas conhecidas de TGF-33 dimérico.

A capacidade de determinados métodos e medicamentos da in-venção (tais como aqueles que utilizam monômeros TGF-β como prepara-dos na Seqüência ID N9 3) para acelerar a cura de feridas pode prontamenteser apreciada e/ou medida com referência às propriedades exibidas por feri-das tratadas. Para as presentes finalidades uma "ferida tratada" pode serconsiderada como sendo uma ferida exposta a uma quantidade terapeuti-camente eficaz de um medicamento da invenção, ou que recebeu tratamen-to de acordo com os métodos da invenção.

A aceleração da cura de feridas tratadas pode ser ilustrada poruma taxa aumentada de epitelialização em comparação às feridas de contro-le. Assim os métodos e medicamentos da invenção promovem uma reconsti-tuição mais rápida de uma camada epitelial funcional sobre uma área feridado que, de outra maneira, seria o caso.

Alternativa ou adicionalmente, a cura acelerada de feridas trata-das pode ser ilustrada pela largura diminuída comparada às feridas de con-trole em pontos de tempo comparáveis. Será apreciado que esta redução nalargura da ferida assegura que haja uma taxa relativamente mais rápida defechamento da ferida (uma vez que há menos largura da ferida a ser fecha-da) e esteja indicativo da capacidade de tais medicamentos de acelerar aresposta de cura. Feridas mais estreitas podem resultar em cicatrizes maisestreitas que sejam esteticamente preferíveis a cicatrizes mais largas

Conseqüentemente, a cura acelerada da ferida no contexto dapresente invenção deve ser tomada para abranger todo o aumento na taxade cura de uma ferida tratada em comparação à taxa de cura que ocorre emferidas de controle tratadas ou não tratadas. Preferivelmente a aceleraçãoda cura da ferida pode ser avaliada em relação à comparação da taxa dereepitelialização alcançada em feridas tratadas e de controle, ou à compara-ção da largura relativa de feridas tratadas e de controle em pontos de tempocomparáveis. Mais preferivelmente a cura acelerada da ferida pode ser defi-nida como compreendendo ambas uma taxa aumentada de reepitelializaçãoe uma redução de largura de ferida comparada a feridas de controle em pon-tos de tempo comparáveis.

Preferivelmente a promoção da cura acelerada da ferida podecausar uma taxa de cura da ferida que é de pelo menos 5%, 10%, 20% ou30% maior do que a taxa de cura que ocorre em uma ferida de controle ounão tratada. Mais preferivelmente a promoção da cura acelerada da feridapode causar uma taxa de cura que é de pelo menos 40%, 50% ou 60% mai-or do que a cura em uma ferida de controle. É ainda mais preferível que apromoção da cura acelerada da ferida pode causar uma taxa de cura que éde pelo menos 70%, 80%, ou 90% maior do que aquela que ocorre em feri-das de controle, e mais preferivelmente a promoção da cura acelerada daferida pode causar uma taxa de cura que é de pelo menos 100% maior doque a taxa que ocorre em feridas de controle.

Existe uma larga escala de distúrbios de cura de ferida que sãocaracterizados, ou pelo menos caracterizados parcialmente, por falha, atrasoou retardo inapropriado da resposta de cura da ferida normal. A capacidadede determinados métodos e medicamentos da invenção de promover a curaacelerada da ferida são, assim, de utilidade na prevenção ou tratamento detais distúrbios.Uma vez que determinados métodos e medicamentos da inven-ção são capazes de causar a aceleração da cura da ferida através da pro-moção de uma resposta de reepitelialização estimulada (que aumenta, des-se modo, a taxa na qual a ferida se fecha) se apreciado que estes métodos emedicamentos da invenção são particularmente vantajosos para tratamentodas feridas de pacientes que podem, de outra maneira, tender para reepiteli-alização defeituosa, atrasada ou, de outra maneira, prejudicadas. Por exem-plo, é bem-conhecido que feridas cutâneas na velhice exibem uma respostade reepitelialização menos vigorosa do que aquelas de indivíduos jovens. Hátambém muitas outras circunstâncias ou distúrbios em que a cura da ferida éassociada à reepitelialização atrasada ou de outra maneira prejudicada. Porexemplo, pacientes que sofrem de diabetes, pacientes com polifármaco (porexemplo, em conseqüência da idade avançada), mulheres com pós-menopausa, pacientes suscetíveis a transtornos de pressão (por exemplo,paraplégicos), pacientes com doença venosa, pacientes clinicamente obe-sos, pacientes que recebem quimioterapia, pacientes que recebem radiote-rapia, pacientes que recebem tratamento esteróide, ou pacientes imuno-comprometidos podem todos sofrer de cura de ferida com reepitelializaçãoprejudicada. Em muitos casos a falta de uma resposta de reepitelializaçãoapropriada contribui para o desenvolvimento de infecções no local da ferida,que pode, por sua vez, contribuir para a formação de feridas crônicas taiscomo úlceras. Conseqüentemente, será apreciado que tais pacientes sãoparticularmente prováveis de serem beneficiados de métodos ou medica-mentos adequados da invenção.

Feridas crônicas são talvez o exemplo mais importante de dis-túrbios associados a uma resposta atrasada de cura da ferida. Uma feridapode ser definida como crônica se não mostra nenhuma tendência de curadentro de oito semanas a partir da formação quando sujeita a tratamentoterapêutico (convencional) apropriado. Exemplos bem-conhecidos de feridascrônicas incluem úlceras venosas, úlceras diabéticas e úlceras decubitus,porém as feridas crônicas podem surgir de outros transtornos agudos nor-mais a qualquer hora. Feridas tipicamente crônicas podem surgir como re-sultado de infecção do local da ferida, tratamento inadequado da ferida, oucomo uma conclusão de transtorno de tecido progressivo causado por doen-ça vascular metabólica, arterial ou venosa, pressão, dano de radiação, outumor.

Será apreciado que métodos e medicamentos da invenção ca-pazes de acelerar a cura da ferida podem ser utilizados no tratamento deferidas crônicas existentes a fim de promover sua cura. Tais métodos e me-dicamentos podem promover a reepitelialização de feridas crônicas, dessemodo, causando cura e fechamento do distúrbio. Métodos e medicamentospreferidos da invenção (tais como aqueles utilizando TGF-β monoméricoscompreendendo Seqüência ID Nq 3) podem também inibir cicatriz associadacom cura de ferida. A prevenção de cicatriz em tais contextos pode ser parti-cularmente vantajosa, uma vez que feridas crônicas tipicamente se esten-dem sobre porções relativamente grandes do corpo do paciente.

Além disso, ou alternativamente, para seu uso no tratamento deferidas crônicas existentes, métodos e medicamentos adequados da inven-ção podem ser usados para prevenir feridas agudas em pacientes predis-postos à cura de ferida enfraquecida desenvolvendo-se em feridas crônicas.

Uma vez que métodos e medicamentos adequados da invenção são capa-zes de promover cobertura epitelial do local danificado, eles são capazes dereduzir a probabilidade de uma ferida tratada se tornar infectada. Similar-mente, esta promoção de reepitelialização pode beneficiar o tratamento deferidas crônicas que surgem como resultado de outras condições tais comodiabetes ou doença venosa.

Um grupo adicional de pacientes que podem derivar benefícioparticular dos métodos e medicamentos da invenção é aqueles em que osistema imunológico é comprometido (por exemplo, pacientes que se sub-metem à quimioterapia ou à radioterapia, ou aqueles que sofrem de infecçãopor HIV). É bem-reconhecido que feridas de pacientes imunocomprometidos,que podem não ser capazes de montar uma resposta inflamatória normalapós ferimento, tendem a ser associadas com resultados de cura fracos.

Tais pacientes podem tirar proveito do tratamento com métodos e medica-mentos adequados da invenção.

A capacidade de medicamentos e métodos da invenção utilizarTGF-Bs monomérico compreendendo Seqüência ID N9 3 para promover curade ferida ao prevenir, reduzir ou inibir cicatriz é também de uso em mais con-textos clínicos gerais. Os exemplos destes benefícios adicionais podem serconsiderados com referência à cura de feridas pela intenção primária, se-cundária ou terciária, como descrito abaixo.

Para as finalidades da presente invenção, curar pela intençãoprimária pode ser considerado para envolver o fechamento por meios cirúr-gicos (tais como suturas, tiras ou grampos adesivos) de bordas opostas deuma ferida. Cura pela intenção primária é empregada tipicamente no trata-mento de incisões cirúrgicas ou em outras feridas limpas, e é associada comníveis mínimos de perda de tecido. A pessoa versada reconhecerá que umavez que medicamentos ou métodos adequados de acordo com a invenção(tal como aqueles que utilizam monômeros compreendendo Seqüência ID N-3) são capazes de reduzir a largura da ferida, eles também facilitam a junçãode bordas opostas da ferida, e assim pode ser benéfico na cura de feridapela intenção primária. Além disso, tais métodos ou medicamentos podem(como descrito mais abaixo) levar à prevenção, redução ou inibição de cica-triz que pode de outra maneira ocorrer em tal cura. Os inventores acreditamque o tratamento, desse modo, pode ter um impacto na aparência macros-cópica e microscópica das cicatrizes formadas das feridas tratadas; macros-copicamente as cicatrizes podem ser menos visíveis e misturam-se com apele circunvizinha, microscopicamente as cicatrizes podem exibir uma rege-neração de uma estrutura de pele mais normal.

Para as finalidades da presente invenção, curar pela intençãosecundária pode ser considerado para constituir o fechamento das feridaspelo processo de cura da ferida, sem intervenção cirúrgica direta. As feridasa serem curadas pela intenção secundária podem ser sujeitas a cuidadocontínuo (por exemplo, o curativo e o recurativo da ferida assim como a apli-cação de medicamentos adequados), mas são os processos naturais deformação do tecido de granulação e reepitelialização que causam o fecha-mento da ferida. Será apreciado que, uma vez que os medicamentos e mé-todos preferidos da invenção (tais como aqueles que utilizam os monômerosque compreendem Seqüência ID N9 3) podem aumentar a taxa de reepitelia-lização e diminuir cicatriz subseqüente em comparação àquelas que ocorremem feridas de controle, eles têm utilidade na promoção de cura de ferida porintenção secundária.

Cura pela intenção terciária pode ser considerada para compre-ender o fechamento cirúrgico de uma ferida que foi deixada previamente a-berta para permitir pelo menos a formação parcial do tecido de granulação ereepitelialização. As propriedades de métodos e medicamentos preferidos dainvenção que os fazem adequados para uso na cura pela intenção primáriaou secundária são também benéficas no contexto de promover a cura daferida pela intenção terciária.

O uso de métodos e medicamentos preferidos da invenção utili-zando monômeros que compreendem Seqüência ID N- 3 para estimular re-epitelialização (como parte de sua promoção de cura acelerada da ferida)enquanto inibir cicatriz for também particularmente eficaz no tratamento deferidas associadas a procedimentos de enxerto. O tratamento usando taismétodos e medicamentos da invenção é benéfico para ambos em um localdoador de enxerto (onde pode ajudar no restabelecimento de uma camadaepitelial funcional ao prevenir, reduzir ou inibir a formação de cicatriz), etambém em locais de destinos de enxerto (onde os efeitos anticicatriz dotratamento inibem a formação de cicatriz, enquanto a cura acelerada promo-ve integração do tecido enxertado). Os inventores acreditam que os métodose os medicamentos da invenção conferem vantagens nos contextos de peleque utilizam enxerto, pele artificial, ou substitutos da pele.

Os inventores verificaram que os métodos e medicamentos dainvenção que utilizam monômeros compreendendo Seqüência ID N9 3 po-dem promover a cura acelerada da ferida com inibição de cicatriz enquantoquando administrados antes do ferimento, ou uma vez que uma ferida já te-nha sido formada.

Os inventores verificaram que métodos ou medicamentos da in-venção que utilizam TGF-B3s monoméricos, tais como aqueles que compre-endem Seqüência ID Ne 3, são capazes de promover a regeneração epiteli-al. A promoção da regeneração epitelial dentro do contexto da presente in-venção pode ser compreendida para abranger qualquer aumento na taxa daregeneração epitelial em comparação à regeneração que ocorre em um epi-télio de controle tratado ou não tratado.

A taxa de regeneração epitelial fixada usando métodos ou medi-camentos adequados de acordo com a invenção pode prontamente sercomparada com aquela que ocorre no epitélio de controle tratado ou nãotratado usando qualquer modelo adequado de regeneração epitelial conhe-cido na técnica. Por exemplo, a taxa na qual os locais de dano epitelial expe-rimental tendo regeneração de áreas conhecidas podem ser comparadosusando modelos in vivo bem-conhecidos em camundongos, ratos, coelhosou porcos tais como aqueles descritos em Tomlinson e Ferguson (2003),Davidson e outros (1991) e Paddock e outros (2003).

Sem desejar limitar-se por qualquer hipótese, os inventores a-creditam que a promoção da regeneração epitelial alcançada por formasmonoméricas de TGF-B3 é mediada pela promoção dos monômeros de mi-gração de células epiteliais. As células epiteliais (a migração de que foi pro-movida) podem desse modo repovoar e regenerar mais rapidamente o epité-lio danificado do que ocorre na ausência de tratamento.

Será apreciado que a promoção de regeneração epitelial usandomonômeros compreendendo Seqüência ID N- 3 pode ser de uso para induzirreepitelialização eficaz nos contextos em que a resposta de reepitelializaçãoé prejudicada, inibida, retardada ou, de outra maneira, defeituosa. A promo-ção de regeneração epitelial pode também ser efetuada para acelerar a taxade respostas de regeneração epitelial defeituosa ou normal em pacientesque sofrem de dano epitelial.

Há muitos contextos em que a resposta de reepitelialização docorpo pode ser defeituosa. Por exemplo, reepitelialização defeituosa na peleé associada com condições tais como pênfigo, doença de Hailey-Hailey(pênfigo benigno familiar), necrólise epidérmica tóxica (TEN)/síndrome deLyell, epidermólise bolhosa, Ieishmaniose cutânea e ceratose actínica. Ree-pitelialização defeituosa dos pulmões pode ser associada com fibrose pul-monar idiopática (IPF) ou doença de pulmão intersticial. Reepitelializaçãodefeituosa do olho pode ser associada com condições tais como deficiênciade célula tronco Iimbal parcial ou erosões córneas. Reepitelialização defeitu-osa de cólon ou trato gastrointestinal pode ser associada com condições taiscomo fissura anal crônica (fissura in ano), colite ulcerosa ou doença deCrohn, e outros distúrbios inflamatórios de intestino.

Como foi exposto acima, determinados métodos ou medicamen-tos de acordo com a presente invenção (e particularmente aqueles que utili-zam monômeros que compreendem Seqüência ID N9 3) podem prevenir,reduzir ou, de outra maneira, inibir cicatriz. Esta inibição de cicatriz pode serefetuada em qualquer local do corpo e em qualquer tecido ou órgão, incluin-do a pele, o olho, os nervos, os tendões, os ligamentos, o músculo, e a cavi-dade oral (incluindo os lábios e o palato), assim como órgãos internos (taiscomo o fígado, o coração, o cérebro, a cavidade abdominal, a cavidade pél-vica, a cavidade torácica, a intestinos e o tecido reprodutivo). Na pele, o tra-tamento pode melhorar a aparência macroscópica e microscópica de cicatri-zes; macroscopicamente as cicatrizes podem ser menos visíveis e misturam-se com a pele circunvizinha, microscopicamente as fibras de colágeno den-tro da cicatriz podem ter a morfologia e a organização que é mais similaràquelas na pele circunvizinha. A prevenção, redução ou inibição de cicatrizdentro do contexto da presente invenção deve ser compreendida para a-branger qualquer grau de prevenção, redução ou inibição de cicatriz emcomparação ao nível da cicatriz que ocorre em uma ferida de controle trata-da ou não tratada (como definido em outra parte no relatório descritivo). Ex-ceto onde o contexto exige, de outra maneira, referências à "prevenção","redução" ou "inibição" de cicatriza podem ser tomadas para serem meca-nismos equivalentes que são todos manifestados em atividade anticicatriz.

A prevenção, redução ou inibição de métodos de utilização decicatriz cutânea alcançada usando métodos e medicamentos da invençãopode ser avaliada e/ou medida com referência à aparência microscópica ou,preferivelmente, macroscópica de uma cicatriz tratada em comparação àaparência de uma cicatriz não tratada. Mais preferivelmente a prevenção,redução ou inibição de cicatriz pode ser avaliada com referência à aparênciamacroscópica e microscópica de uma cicatriz tratada. Para as presentes fi-nalidades uma "cicatriz tratada" pode ser definida como uma cicatriz formadana cura de uma ferida tratada, visto que uma "cura não tratada" pode serdefinida como a cicatriz formada na cura de uma ferida não tratada, ou umaferida tratada com placebo ou cuidado padrão. Cicatrizes de comparaçãoadequadas podem preferivelmente ser combinadas com cicatriz tratada comreferência à idade, local, tamanho e paciente da cicatriz.

Em consideração à aparência macroscópica de uma cicatriz re-sultando de uma ferida tratada, a extensão da cicatriz, e então a magnitudede qualquer prevenção, inibição ou redução de cicatriz alcançada, pode seravaliada com referência a qualquer de vários parâmetros.

Parâmetros adequados para a avaliação macroscópica de cica-trizes podem incluir:

i) Cor da cicatriz. Como notado acima, as cicatrizes podem tipi-camente ser hipopigmentada ou hiperpigmentada no que diz respeito à pelecircunvizinha. A inibição ou a redução de cicatriz pode ser demonstradaquando a pigmentação de uma cicatriz tratada se aproxima mais daquela dapele não cicatrizada do que a pigmentação de uma cicatriz não tratada. Simi-larmente, as cicatrizes podem ser mais vermelhas do que a pele circunvizi-nha. Neste caso a inibição ou a redução de cicatriz pode ser demonstradaquando o vermelhidão de uma cicatriz tratada se desvanece mais cedo, oumais completamente, ou assemelha-se mais proximamente à aparência dapele circunvizinha, comparada a uma cicatriz não tratada.

ii) Altura da cicatriz. As cicatrizes podem tipicamente ser altasou baixas em comparação à pele circunvizinha. A inibição ou a redução decicatriz pode ser demonstrada quando a altura de uma cicatriz tratada seaproxima mais daquela da pele não cicatrizada (isto é nem está mais altanem mais baixa) do que a altura de uma cicatriz não tratada.

iii) Textura de superfície da cicatriz. As cicatrizes podem ter su-perfícies que são relativamente mais lisas do que a pele circunvizinha (quecausa uma cicatriz com uma aparência "lustrada") ou que são mais ásperasdo que a pele circunvizinha. A inibição ou a redução de cicatriz pode serdemonstrada quando a textura de superfície de uma cicatriz tratada se apro-xima mais daquela da pele não cicatrizada do que a textura de superfície deuma cicatriz não tratada.

iv) Rigidez da cicatriz. A composição e a estrutura anormais dascicatrizes significam que é normalmente mais dura do que a pele não danifi-cada que cerca a cicatriz. Neste caso, a inibição ou a redução de cicatrizpode ser demonstrada quando a rigidez de uma cicatriz tratada se aproximamais daquela da pele não cicatrizada do que a rigidez de uma cicatriz nãotratada.

Uma cicatriz tratada demonstrará preferivelmente prevenção, i-nibição ou redução de cicatriz como avaliada com referência a pelo menosum dos parâmetros para avaliação macroscópica exposta acima. Mais prefe-rivelmente uma cicatriz tratada pode demonstrar cicatriz prevenida, inibidaou reduzida com referência a pelo menos dois dos parâmetros, mais preferi-velmente a pelo menos três dos parâmetros, e mais preferivelmente todos osquatro destes parâmetros. Uma avaliação total de cicatriz pode ser feita u-sando, por exemplo, uma Escala Analógica Visual ou uma escala de avalia-ção digital.

Parâmetros adequados para avaliação microscópica de cicatri-zes podem incluir:

i) Espessura de fibras de matriz extracelular (ECM). Cicatrizestipicamente contêm fibras mais finas de ECM do que são encontradas napele circunvizinha. Esta propriedade é ainda mais pronunciada no caso dequelóide e de cicatrizes hipertróficas. A inibição ou a redução de cicatriz po-de ser demonstrada quando a espessura de fibras de ECM em uma cicatriztratada se aproxima mais da espessura de fibras de ECM encontradas napele não cicatrizada do que a espessura de fibras encontradas em uma cica-triz não tratada.

ii) Orientação de fibras de ECM. Fibras de ECM encontradasem cicatrizes tendem a exibir um maior grau de alinhamento uma com asoutras do que aquelas encontradas na pele não tratada (que têm uma orien-tação aleatória denominada freqüentemente como "cesta de basquete"). AECM de cicatrizes patológicas tais como quelóides e de cicatrizes hipertrófi-cas pode exibir orientações ainda mais anômalas, formando freqüentementegrandes "redemoinhos" ou "cápsulas" de moléculas de ECM. Conseqüente-mente, a inibição ou a redução de cicatriz pode ser demonstrada quando aorientação de fibras de ECM em uma cicatriz tratada se aproxima mais daorientação de fibras de ECM encontradas na pele não cicatrizada do que aorientação de tais fibras encontradas em uma cicatriz não tratada.

iii) Composição de ECM da cicatriz. A composição de moléculasde ECM presentes em cicatrizes mostra diferenças daquela encontrada napele normal, com uma redução na quantidade de elastina presente em ECMde cicatrizes. Assim a inibição ou a redução de cicatriz pode ser demonstra-da quando a composição de fibras de ECM na derme de uma cicatriz tratadase aproxima mais da composição de tais fibras encontradas na pele não tra-tada do que a composição encontrada em uma cicatriz não tratada.

iv) Celularidade da cicatriz. As cicatrizes tendem a conter relati-vamente menos células do que a pele não cicatrizada. Conseqüentemente,será apreciado que a inibição ou a redução de cicatriz pode ser demonstradaquando a celularidade de uma cicatriz tratada se aproxima mais da celulari-dade da pele não cicatrizada do que a celularidade de uma cicatriz não tra-tada.

Uma cicatriz tratada demonstrará preferivelmente prevenção, re-dução ou inibição de cicatriz como avaliada com referência a pelo menos umdos parâmetros para avaliação microscópica exposta acima. Mais preferi-velmente uma cicatriz tratada, pode demonstrar prevenção, redução ou inibi-ção de cicatriz com referência a pelo menos dois dos parâmetros, mais pre-ferivelmente pelo menos três dos parâmetros, e mais preferivelmente todosos quatro destes parâmetros.

Prevenção, redução ou inibição de cicatriz de uma ferida tratadapode adicionalmente ser avaliada com referência a parâmetros adequadosusados na:

i) Avaliação clínica macroscópica de cicatrizes, particularmenteavaliação de cicatrizes sobre um sujeito;

ii) Avaliação de imagens fotográficas de cicatrizes;

iii) Avaliação de moldes de silicone ou de moldes de gesso po-sitivo feitos de moldes de silicone de cicatrizes; e

iv) Avaliação microscópica de cicatrizes, por exemplo, por análi-se histológica da estrutura microscópica de cicatrizes.

Será apreciado que prevenção, redução ou inibição de cicatrizde uma ferida tratada pode ser indicada pela melhoria de um ou mais de taisparâmetros adequados, e que no caso de prevenção, redução ou inibiçãocomo avaliado com referência a um número de parâmetros que estes parâ-metros podem ser combinados de esquemas diferentes de avaliação (porexemplo, redução, inibição ou melhoria em pelo menos um parâmetro usadona avaliação macroscópica e em pelo menos um parâmetro usado na avali-ação microscópica).

Prevenção, redução ou inibição de cicatriz pode ser demonstra-da por uma melhoria em um ou mais parâmetros que indicam que uma cica-triz tratada se aproxima mais da pele não cicatrizada com referência aos pa-râmetros selecionados do que uma cicatriz não tratada ou de controle.

Parâmetros adequados para a medição e avaliação clínicas decicatrizes podem ser selecionados baseados em uma variedade de medi-ções ou avaliações que incluem aquelas descritas por Beausang e outros(1998) e Van Zuijlen e outros (2002).

Tipicamente, parâmetros adequados podem incluir:

1. Avaliação com relação à classificação de cicatriz da Escala Analógica Vi-sual (VAS).

Prevenção, redução ou inibição de cicatriz pode ser demonstra-da por uma redução na classificação de VAS de uma cicatriz tratada quandocomparada a uma cicatriz de controle. Uma VAS adequada para o uso naavaliação de cicatrizes pode ser baseada no método descrito por Beausange outros (1998).2. Altura de cicatriz. largura de cicatriz, perímetro de cicatriz. área de cicatrizou volume de cicatriz.

A altura e a largura de cicatrizes podem ser medidas diretamentesobre o sujeito, por exemplo, por uso de dispositivos de medição manuaistais como compassos de calibre. Largura de cicatriz, perímetro e área po-dem ser medidos sobre o sujeito ou por análise da imagem de fotografias dacicatriz. A pessoa versada também estará ciente de métodos e dispositivosnão-invasivos adicionais que podem ser usados para investigar parâmetrosadequados, incluindo molde de silicone, ultra-som, profilimetria tridimensio-nal óptica e Formação de Imagem de Ressonância Magnética de alta resolução.

Prevenção, redução ou inibição de cicatriz pode ser demonstra-da por uma redução na altura, largura, área ou volume, ou qualquer combi-nação dos mesmos, de uma cicatriz tratada em comparação a uma cicatriznão tratada.

3. Aparência e/ou cor de cicatriz comparadas à pele não cicatrizada circunvizinha.

Aparência ou cor de uma cicatriz tratada pode ser comparadaàquela da pele não cicatrizada circunvizinha, e as diferenças (eventualmen-te) comparadas com a diferença entre a aparência e cor de cicatrizes nãotratadas e pele não cicatrizadas. Tal comparação pode ser feita com baseem uma avaliação visual das respectivas cicatrizes e pele não cicatrizada. Aaparência de uma cicatriz pode ser comparada com a pele não cicatrizadacom referência a se a cicatriz é mais clara ou mais escura do que a pele nãocicatrizada. As respectivas cores das cicatrizes e da pele podem perfeita-mente ser combinadas a outra, ligeiramente descombinada, obviamentedescombinada ou rudemente descombinada.

Alternativa ou adicionalmente à avaliação visual, há um númerode dispositivos colorimétricos não-invasivos que podem fornecer dados comrelação à pigmentação de cicatrizes e pele não cicatrizada, assim como overmelhidão da pele (que pode ser um indicador do grau de vascularidadepresente na cicatriz ou na pele). Exemplos de tais dispositivos incluem o Mi-nolta Chronameter CR-200/300; Labscan 600; Dr. Lange Micro Color; Espec-trômetro Derma; Medidor de fluxo de laser Doppler; e espaço de Análise in-tracutânea Espectrofotométrico (SIA).

Prevenção, redução ou inibição de cicatriz pode ser demonstra-da por uma magnitude menor de diferença entre a aparência ou cor de cica-trizes tratadas e pele não cicatrizada do que entre cicatrizes não tratadas epele não cicatrizadas.

4. Distorção de cicatriz e desempenho mecânico.Distorção de cicatriz pode ser avaliada pela comparação visualde uma cicatriz e de uma pele não cicatrizada. Uma comparação adequadapode classificar uma cicatriz selecionada como a causa de nenhuma distor-ção, distorção suave, distorção moderada ou distorção severa.

O desempenho mecânico de cicatrizes pode ser avaliado usandoum número de métodos e dispositivos não-invasivos baseados em sucção,pressão, torção, tensão e acústica. Exemplos adequados incluídos nos dis-positivos conhecidos capazes de uso na avaliação do desempenho mecâni-co de cicatrizes incluem Indentômetro, Cutômetro, Reviscômetro, análiseViscoelástica de pele, Dermaflex, Durômetro, Medidor de Torque Dérmico,Elastômetro.

Prevenção, redução ou inibição de cicatriz pode ser demonstra-da por uma redução na distorção causada por cicatrizes tratadas em compa-ração àquela causada por cicatrizes não tratadas. Será apreciado tambémque prevenção, redução ou inibição de cicatriz pode ser demonstrada pelodesempenho mecânico da pele não tratada que é mais similar àquele decicatrizes tratadas do que de cicatrizes não tratadas.

5. Contorno de cicatriz e textura de cicatriz.Contorno de cicatriz pode ser investigado por meios de avaliaçãovisual. Parâmetros adequados para considerar em tal avaliação incluem seuma cicatriz é ou não nivelada com a pele circunvizinha, ligeiramente pre-sumida, ligeiramente penetrada, hipertrófica ou quelóide. A textura de umacicatriz pode ser avaliada com referência à aparência de cicatriz, e esta podetambém ser comprometida por uma avaliação visual se a cicatriz for, por e-xemplo, opaca ou brilhante ou tem uma aparência áspera ou lisa em compa-ração à pele não cicatrizada.

A textura de cicatriz pode adicionalmente ser avaliada com refe-rência a se a cicatriz tem a mesma textura que a pele não cicatrizada (textu-ra normal), é apenas palpável, firme ou dura comparada à pele não cicatri-zada. A textura de cicatrizes pode também ser avaliada com referência àescala de Hamilton (descrita em Crowe e outros, 1998).

Além das técnicas expostas acima, há um número de dispositi-vos profilimétricos não-invasivos que usam métodos óticos ou mecânicospara avaliação do contorno da cicatriz e/ou textura. Tais avaliações podemser realizadas no corpo do sujeito ou, por exemplo, em impressões de moldede silicone de cicatrizes, ou moldes de gesso positivo feitos de tais impressões.

Prevenção, redução ou inibição de cicatriz pode ser demonstra-da caso cicatrizes tratadas tiverem perfis e texturas de cicatriz mais compa-ráveis à pele não cicatrizada do que cicatrizes não tratadas.

Avaliações Fotográficas.

Painel de Posição Independente.

Avaliação fotográfica de cicatrizes tratadas e não tratadas podeser executada por um painel de posição independente de assessores queusam fotografias calibradas e padronizadas das cicatrizes. As cicatrizes po-dem ser avaliadas por um painel de posição independente para fornecer da-dos categóricos de classificação (por exemplo, que uma dada cicatriz tratadaé "melhor", "pior" ou "indiferente" quando comparada a uma cicatriz não tra-tada) e aos dados quantitativos usando uma Escala Analógica Visual (VAS)baseada no método descrito por Beausang e outros (1998). A captação des-tes dados pode preparar o uso de software adequado e/ou sistemas eletrô-nicos como descritos no pedido de patente co-pendente da requerente.

Painel de Perito

Avaliação fotográfica de cicatrizes tratadas e não tratadas podealternativa ou adicionalmente ser executada por um painel dos assessoresde perito que usam fotografias calibradas e padronizadas das cicatrizes aserem avaliadas. O painel de peritos pode preferivelmente consistir nos indi-víduos adequados versados na técnica tal como cirurgiões plásticos e cien-tistas de fundamentos adequados.

Tal avaliação pode fornecer dados categóricos, como descritosacima ou com relação à comparação de um curso de tempo de imagens decicatrizes tratadas e não tratadas selecionadas.

Avaliações adequadas a serem feitas podem incluir:

Identificação da melhor cicatriz, que para as finalidades da pre-sente invenção pode ser considerada a cicatriz que mais se assemelha àpele circunvizinha. Mais uma vez a melhor cicatriz foi identificada a magnitu-de da diferença entre cicatrizes pode ser considerada, por exemplo, é a dife-rença entre cicatrizes pequenas ou óbvias. Parâmetros adicionais que po-dem ser considerados incluem o tempo mais anterior depois que a formaçãoda cicatriz em que uma diferença entre cicatrizes pode ser detectada, o tem-po após formação em que a diferença entre cicatrizes é a mais óbvia (oualternativamente a descoberta que a diferença continua após o último pontode tempo avaliado), assim como considerar se a melhor cicatriz permaneceou não consistentemente melhor.

A consideração pode também ser dada para se uma cicatriz forconsistentemente mais vermelha do que a outra, e se o vermelhidão se des-vanece sobre os pontos de tempo considerados (ou continua após o últimoponto de tempo) e se, assim, em qual tempo após a formação da cicatriz.Um painel de perito pode também considerar em qual tempo após formaçãoqualquer diferença no vermelhidão se torna detectável, assim como apósformação do tempo em que a diferença no vermelhidão é mais óbvia.

Um painel de perito pode também considerar se uma de uma ci-catriz tratada ou não tratada é ou não consistentemente mais branca do quea outra, ou mais branca do que a pele não cicatrizada. Caso uma diferençana brancura seja detectável a consideração pode ser dada ao tempo após aformação da cicatriz em que a diferença pode ser detectada, ao tempo emque a diferença é mais óbvia, e ao tempo em que a diferença desaparece.

Um parâmetro adicional que pode ser avaliado por um painel deperito é a textura de cicatrizes tratadas e não tratadas. Na comparação decicatrizes tratadas e não tratadas o painel de perito pode considerar qual dascicatrizes tem a melhor textura de pele, o tempo mais anterior após a forma-ção da cicatriz em que qualquer diferença presente pode ser detectada, otempo após formação em que qualquer diferença é mais óbvia, e o tempoem que qualquer diferença desaparece.

A comparação de cicatrizes tratadas e não tratadas pode adicio-nalmente avaliar qual das cicatrizes é a mais estreita, e qual das cicatrizes éa mais curta. A consideração pode também ser dada à forma da cicatriz e àproporção da margem da cicatriz que é distinguível da pele circunvizinha.Como anteriormente descrito as avaliações visuais e avaliações de cor apresença, grau e localização de hiperpigmentação podem também ser con-siderados.

Como notado acima, uma das maneiras em que a qualidade decicatrizes tratadas e não tratadas pode ser comparada é por avaliação mi-croscópica. A avaliação microscópica da qualidade da cicatriz pode tipica-mente ser realizada usando seções histológicas de cicatrizes. O processo demicroscopicamente avaliar e medir cicatrizes pode levar em consideraçãodados categóricos baseados nos seguintes parâmetros adequados:

1. Restituição epidérmica. Atenção particular pode ser dada aograu de restauração de cadeias de rede, e à espessura da epiderme restau-rada.

2. Angiogênese e Inflamação. Consideração pode ser dada aonúmero de vasos sangüíneos presentes, ao tamanho dos vasos sangüíneospresentes e à evidência de inflamação, incluindo uma avaliação de qualquernível de inflamação presente.

3. Organização do colágeno. Na avaliação à referência de orga-nização do colágeno pode ser feita à orientação das fibras de colágeno pre-sentes na cicatriz, à densidade de tais fibras e à espessura da fibra de colá-geno na derme de papila e reticular.

4. A avaliação da escala analógica visual (VAS) da organizaçãode colágeno para a derme de papila e para a derme reticular pode tambémfornecer um índice útil de qualidade da cicatriz.

5. Outras características que podem ser levadas em considera-ção ao avaliar a qualidade microscópica das cicatrizes incluem elevação oudepressão da cicatriz relativa à pele não cicatrizada circunvizinha, e a proe-minência ou visibilidade da cicatriz na interface cutânea normal.

6. Será visto que as avaliações descritas acima permitem a ge-ração de dados de classificação de cicatriz que podem não fornecer umaindicação se uma cicatriz tratada é melhor, pior ou indiferente comparada auma cicatriz de controle, não tratada ou a outra cicatriz para comparaçãoadequada.

Além dos dados categóricos, dados quantitativos (preferivelmen-te em relação aos parâmetros acima) podem ser gerados usando análise deimagem em combinação com técnicas adequadas de visualização. Exem-plos de técnicas adequadas de visualização que podem ser empregadaspara avaliar a qualidade da cicatriz são colorações histológicas específicasou de imunorrotulagem, onde o grau da coloração ou rotulagem presentepode ser quantitativamente determinado por análise de imagem.

Dados quantitativos podem ser produzidos útil e prontamentecom relação aos seguintes parâmetros:

1. Largura, altura, elevação, volume e área de cicatriz.

2. Espessura e cobertura epitelial (por exemplo, a área da epi-derme presente em uma cicatriz ou a proporção de uma ferida com cobertu-ra epidérmica).

3. Número, tamanho, área (isto é seção transversal) e Iocaliza-ção de vasos sangüíneos.

4. Grau de inflamação, número, localização e populações/tiposde células inflamatórias presentes.

5. Organização de colágeno, espessura da fibra de colágeno,densidade da fibra de colágeno.

Prevenção, redução ou inibição de cicatriz pode ser demonstra-da por uma mudança em quaisquer dos parâmetros considerados acima talque uma cicatriz tratada se assemelha mais à pele não cicatrizada do queuma cicatriz de controle ou não tratada (ou outro comparador adequado).

As avaliações e os parâmetros discutidos são adequados paracomparações dos efeitos de peptídeos ou medicamentos da invenção emcomparação a controle, placebo ou tratamento de cuidado padrão em ani-mais ou seres humanos. Testes estatísticos adequados podem ser usadospara analisar conjuntos de dados gerados de tratamentos diferentes a fim deinvestigar o significado dos resultados.

Preferivelmente prevenção, redução ou inibição de cicatriz podeser demonstrada com referência a mais de um parâmetro. Mais preferivel-mente prevenção, redução ou inibição de cicatriz pode ser demonstrada comreferência (isto é observado no sujeito) a um parâmetro clínico e a um parâ-metro fotográfico. Ainda mais preferivelmente prevenção, redução ou inibi-ção de cicatriz pode ser demonstrada com referência a um parâmetro clíni-co, a um parâmetro fotográfico, e também a um parâmetro de avaliação mi-croscópico (por exemplo, um parâmetro histológico). Mais preferivelmenteprevenção, redução ou inibição de cicatriz pode ser demonstrada com refe-rência a uma classificação clínica de VAS1 índice e classificação de VAS depainel de posição externa (a partir de imagens fotográficas) e índice de VASmicroscópica da derme reticular.

O uso de métodos e medicamento adequados da invenção é ca-paz de ocasionar uma melhora rápida na aparência cosmética de uma áreaferida então tratada. Considerações cosméticas são importantes em várioscontextos clínicos, particularmente quando as feridas são formadas em lo-cais proeminentes do corpo tais como a face, o pescoço e as mãos. Conse-qüentemente a inibição de cicatriz (que pode preferivelmente ser em combi-nação com a cura acelerada da ferida) em tais locais onde se deseja melho-rar a aparência cosmética da cicatriz formada representa uma modalidadepreferida da invenção.

Além de seu impacto cosmético, a cicatriz da pele é responsávelpor um número de efeitos deletérios que afligem aqueles que sofrem de talcicatrização. Por exemplo, a cicatriz da pele pode ser associada com a redu-ção da função física e mecânica, particularmente no caso de cicatrizes con-tráteis (tais como cicatrizes hipertróficas) e/ou situações em que as cicatrizessão formadas através das junções. Nestes casos as propriedades mecâni-cas alteradas da pele cicatrizada, ao contrário da pele não cicatrizada, e osefeitos da contração da cicatriz podem levar ao movimento dramaticamenterestrito de uma junção (articulação) assim que efetuado. Conseqüentemente,é uma modalidade preferida que os medicamentos e métodos adequados dainvenção sejam usados para prevenir, reduzir ou inibir cicatriz de junções decobertura de feridas do corpo (preferivelmente também acelerando a cura detais feridas). Em outra modalidade preferida os medicamentos e métodosadequados da invenção podem ser usados para promover a cura aceleradada ferida e/ou prevenir, reduzir ou inibir cicatriz de feridas em maior risco deformar uma cicatriz contrátil.

A extensão de formação da cicatriz, e então a extensão de preju-ízo cosmético ou outro prejuízo que pode ser causada pela cicatriz, podetambém ser influenciada por fatores tais como a tensão do local em que aferida é formada. Por exemplo, sabe-se que a pele sob tensão relativamenteelevada (tal como aquela que se estende sobre o peito, ou associada comas linhas de tensão) pode ser inclinada para formação de cicatrizes maisseveras do que em outros locais do corpo. Assim em uma modalidade prefe-rida medicamentos e métodos adequados da invenção podem ser usadospara promover a cura acelerada da ferida e/ou para prevenir, reduzir ou inibircicatriz de feridas situadas em locais de tensão elevada da pele. Há muitosprocedimentos cirúrgicos que podem ser usados na revisão da cicatriz parapermitir o realinhamento de feridas e cicatriz tal que elas são sujeitas à ten-são reduzida. Provavelmente o mais conhecido destes é "Z-plastia" em duasabas de pele em forma de V são transpostas para permitir rotação de umalinha de tensão. Assim em uma modalidade mais preferida tais medicamen-tos e métodos da invenção são usados para promover a cura acelerada daferida e/ou prevenir, reduzir ou inibir cicatriz de feridas durante a revisão ci-rúrgica de cicatrizes desfiguradas.

Cicatrização patológica pode ter mais efeitos prejudiciais pro-nunciados do que os que surgem mesmo em conseqüência de cicatriz nor-mal relativamente severa. Exemplos comuns de cicatrizes patológicas inclu-em quelóides e cicatrizes hipertróficas. É reconhecido que determinados ti-pos de ferida, ou determinados indivíduos podem ser predispostos à forma-ção de cicatriz patológica. Por exemplo, indivíduos de heranças afro-caribenhos, japonesa ou mongolóides, ou daquelas que têm uma históriafamiliar de cicatriz patológica podem ser considerados para estar em maiorrisco de formação de quelóide ou cicatriz hipertrófica. Feridas em crianças, eparticularmente feridas de queimadura em crianças, são associadas tambémcom formação de cicatriz hipertrófica aumentada. Conseqüentemente é umamodalidade preferida da invenção que medicamentos e métodos adequadossejam usados para promover a cura acelerada da ferida e/ou prevenir, redu-zir ou inibir cicatriz de feridas em que há um risco aumentado de formaçãode cicatriz patológica.

Embora indivíduos já sujeitos à cicatriz patológica sofram deuma predisposição à formação de cicatriz excessiva adicional é freqüente anecessidade clínica de revisar cirurgicamente quelóides ou cicatrizes hiper-tróficas, com um risco presente de conseqüente formação de cicatriz patoló-gica. Assim é uma modalidade preferida adicional da invenção que os medi-camentos e métodos adequados sejam usados para promover a cura acele-rada da ferida e/ou prevenir, reduzir ou inibir cicatriz de feridas produzidaspor revisão cirúrgica de cicatrizes patológicas.

É reconhecido que feridas resultantes de ferimentos de queima-duras (que para as finalidades da presente invenção podem ser tomadostambém para abranger ferimentos de queimadura que envolvem líquidos ougases quentes) podem se estender sobre grandes áreas de um indivíduoentão afligido. Conseqüentemente, as queimaduras podem causar a forma-ção de cicatriz cobrindo uma grande proporção do corpo de um paciente,desse modo, aumentando o risco de que a cicatriz formada cobrirá áreas deimportância cosmética elevada (tais como a face, o pescoço, os braços ouas mãos) ou de importância mecânica (particularmente as regiões cobrindoou que cercam as junções). Os ferimentos de queimaduras causados porlíquidos quentes freqüentemente são sofridos por crianças (por exemplo,como resultado de frigideiras derramadas, chaleiras ou similares) e, devidoao tamanho do corpo relativamente menor das crianças, são particularmenteprováveis de causar dano extensivo sobre uma proporção elevada da áreado corpo. É uma modalidade preferida adicional da invenção que os medi-camentos e métodos adequados sejam usados para promover a cura acele-rada da ferida e/ou prevenir, reduzir ou inibir cicatriz de feridas produzidaspor ferimentos de queimaduras.

Como notado acima, a cura da ferida em resposta aos ferimen-tos de queimaduras é associada freqüentemente aos resultados de cicatrizadversos, tais como a formação de cicatrizes hipertróficas. Uma conseqüên-cia adicional do tamanho relativamente grande dos ferimentos de queimadu-ras é que são particularmente suscetíveis a complicações tais como infecçãoe dessecação que surgem devido à falta de uma camada epitelial funcional.

Tendo em vista o que precede será apreciado que os métodos e medica-mentos adequados da invenção podem ser usados no tratamento de feri-mentos de queimadura para reduzir o nível de cicatriz que ocorre em conse-qüência de ferida e/ou aceleração da reconstituição de uma barreira epitelialfuncional.

Os inventores verificaram que métodos e medicamentos da in-venção que utilizam monômeros tais como aqueles que compreendem Se-qüência ID Ns 3 são capazes de promover reepitelialização. Conseqüente-mente tais métodos e medicamentos são particularmente efetivos no trata-mento de todos os ferimentos envolvendo dano à camada epitelial. Tais fe-rimentos são exemplificados, mas não limitados a, ferimentos na pele, emque a epiderme é danificada. Será, entretanto, apreciado que tais métodos emedicamentos da invenção são também aplicáveis a outros tipos de feridasem que o epitélio é danificado, tais como ferimentos envolvendo o epitéliorespiratório, epitélio digestivo, ou epitélio envolvendo tecidos ou órgãos in-ternos (tal como o epitélio do peritôneo).

A cura de feridas que envolvem o peritôneo (a cobertura epitelialdos órgãos internos, e/ou o interior da cavidade do corpo) pode freqüente-mente causar adesões. Tais adesões são uma conclusão comum da cirurgiaenvolvendo tecidos ginecológicos ou intestinais. Os inventores acreditamque a capacidade dos métodos e medicamentos da invenção (utilizando mo-nômeros adequados tais como aqueles que compreendem Seqüência ID N93) para acelerar a regeneração do peritôneo ao reduzir cicatriz pode reduzira incidência de anexos impróprios de porções de um peritôneo a outro, edesse modo, reduzir a ocorrência de adesões. Conseqüentemente, o uso detais métodos e medicamentos da invenção para prevenir a formação de ade-sões intestinais ou ginecológicas representa uma modalidade preferida dainvenção. Certamente o uso de tais métodos ou medicamentos da invençãona cura de todas as feridas que envolvem o peritôneo é uma modalidadepreferida.

Os métodos ou medicamentos da invenção podem ser usadosprofilaticamente, por exemplo, nos locais onde nenhuma ferida existe, masonde uma ferida que, de outra maneira, daria surgimento a uma cicatriz ouferida crônica deve ser formada. Como exemplo os medicamentos de acordocom a invenção podem ser administrados aos locais que estão sob ferimentocomo um resultado de procedimentos eletivos (tais como cirurgia), ou aoslocais que se acredita estarem sob risco elevado de ferimento. Pode ser pre-ferido que os medicamentos da invenção sejam administrados ao local apro-ximadamente na época do ferimento, ou imediatamente antes da formaçãode uma ferida (por exemplo, no período até seis horas antes de se ferir) ouos medicamentos podem ser administrados em uma hora mais anterior aoferimento (por exemplo, até 48 horas antes que uma ferida esteja formada).A pessoa versada apreciará que os tempos os mais preferidos de adminis-tração antes da formação de uma ferida serão determinados com referênciaa um número de fatores, incluindo a formulação e a via de administração domedicamento selecionado, a dosagem do medicamento a ser administrado,o tamanho e a natureza da ferida a ser formada, e o status biológico do pa-ciente (que pode determinado com referência aos fatores tais como a idade,saúde, e predisposição do paciente às complicações de cura ou cicatriz ad-versa). O uso profilático de métodos e medicamentos de acordo com a in-venção é uma modalidade preferida da invenção, e é particularmente prefe-rido na promoção da cura e/ou prevenção acelerada da ferida, redução ouinibição de cicatriz no contexto de feridas cirúrgicas.

Os métodos e medicamentos da invenção também são capazesde promover cura acelerada e/ou cicatriz inibida da ferida se administradosdepois que uma ferida foi formada. É preferido que tal administração devaocorrer o mais cedo possível após a formação da ferida, mas os agentes dainvenção são capazes de promover a cura acelerada da ferida e/ou prevenir,reduzir ou inibir cicatriz a qualquer hora acima até que o processo de curaesteja terminado (isto é mesmo em caso de uma ferida já parcialmente cura-da os métodos e medicamentos da invenção podem ser usados para promo-ver a cura acelerada da ferida e/ou para prevenir, reduzir ou inibir cicatriz emrelação à porção não-curada restante). Será apreciado que a "janela" naqual os métodos e medicamentos da invenção podem ser usados para pro-mover cura acelerada e/ou prevenir, reduzir ou inibir cicatriz da ferida é de-pendente da natureza da ferida em questão (que inclui o grau de dano ocor-reu, e o tamanho da área ferida). Assim no caso de uma grande ferida osmétodos e medicamentos da invenção podem ser administrados relativa-mente tarde na resposta de cura ainda poder promover a cura aceleradae/ou prevenir, reduzir ou inibir cicatriz da ferida. Os métodos e medicamen-tos da invenção podem, por exemplo, preferivelmente ser administradosdentro das primeiras 24 horas depois que uma ferida é formada, mas podemainda promover a cura acelerada da ferida e/ou prevenir, reduzir ou inibircicatriz se administrados até dez, ou mais dias após o ferimento.

Os métodos e medicamentos da invenção podem ser adminis-trados em uma ou mais ocasiões como necessário a fim de promover a curaacelerada da ferida e/ou prevenir, reduzir ou inibir cicatriz. Por exemplo, te-rapeuticamente as quantidades eficazes dos medicamentos podem ser ad-ministradas a uma ferida tão freqüentemente quanto necessário até que oprocesso de cura esteja terminado. Como exemplo, os medicamentos dainvenção podem ser administrados diariamente ou duas vezes por dia a umaferida por pelo menos os primeiros três dias que seguem à formação da feri-da. Os inventores verificaram que as dietas envolvendo duas administraçõesde medicamentos da invenção, a primeira antes da formação de uma feridae a segunda após o ferimento, são particularmente benéficos na redução deformação da cicatriz. Preferivelmente tais dietas podem envolver uma primei-ra administração imediatamente antes da formação de uma ferida e umasegunda administração 24 horas após o ferimento.

Mais preferivelmente, os métodos ou medicamentos da invençãopodem ser ambos administrados antes e depois da formação de uma ferida.Os inventores verificaram que a administração de medicamentos da inven-ção imediatamente antes da formação de uma ferida, seguida pela adminis-tração diária de tais agentes nos dias que seguem o ferimento, é particular-mente eficaz em promover a cura acelerada de ferida e/ou prevenir, reduzirou inibir cicatriz.

Para as finalidades do presente relatório descritivo "agente" ou"agente da invenção" significa TGF-β monomérico biológica ou terapeutica-mente ativo. Tais agentes podem preferivelmente ser TGF-Bs de tipo selva-gem, e mais preferivelmente podem ser TGF-Bs monoméricos capazes depromover a cura acelerada da ferida e/ou inibir cicatriz, de que um exemplopreferido compreende os monômeros preparados em Seqüência ID Nq 3.Será apreciado que todos tais agentes podem ser incorporados em medica-mentos de acordo com a invenção, e podem ser usados nos métodos ouusos da invenção.

Será apreciado que a quantidade de um medicamento da inven-ção que deve ser aplicada a uma ferida depende de vários fatores tais comoa atividade biológica e a biodisponibilidade do agente presente no medica-mento, que depende, por sua vez, entre outros fatores, da natureza do agen-te e do modo de administração do medicamento. Outros fatores para deter-minar uma quantidade terapêutica adequada de um medicamento podemincluir:

A) A meia-vida do agente no sujeito sendo tratado.

Β) A condição específica a ser tratada (por exemplo, ferida agu-da ou feridas crônicas).

C) A idade do sujeito.A freqüência da administração será influenciada também pelosfatores acima mencionados e particularmente pela meia-vida do agente es-colhido dentro do sujeito sendo tratado.

Geralmente quando medicamentos de acordo com a invençãosão usados para tratar feridas existentes o medicamento deve ser adminis-trado assim que a ferida ocorrer (ou no caso de feridas que não são imedia-tamente aparentes como aquelas em local interno no corpo, assim que aferida for diagnosticada). A terapia com métodos ou medicamentos de acor-do com a invenção deve continuar até que o processo de cura esteja acele-rado, e/ou cicatriz prevenida, reduzida ou inibida, a uma satisfação do clínico.

A freqüência da administração dependerá da meia-vida biológicado agente usado. Tipicamente um creme ou uma pomada contendo um a-gente da invenção deve ser administrado a um tecido alvo tal que a concen-tração do agente em uma ferida seja mantida em nível adequado para terum efeito terapêutico. Isto pode exigir administração diária ou mesmo diver-sas vezes ao dia.

Medicamentos da invenção podem ser administrados por qual-quer via adequada capaz de alcançar o efeito desejado de promover a curada ferida e/ou prevenir, reduzir ou inibir cicatriz, mas é preferido que os me-dicamentos sejam administrados localmente em um local da ferida.

Os inventores verificaram que a promoção da cura de ferida ace-lerada e/ou prevenção, redução ou inibição de cicatriz pode ser efetuadapela administração de um agente da invenção por injeção no local da ferida.

Por exemplo, no caso das feridas cutâneas, os agentes da invenção podemser administrados por meio de injeção intradérmica. Assim um medicamentopreferido de acordo com a invenção compreende uma solução injetável deum agente da invenção (por exemplo, para injeção em torno das margens deum local de dano epitelial ou de um local que provavelmente deve ser danifi-cado). Formulações adequadas para o uso nesta modalidade da invençãosão consideradas abaixo.

Alternativa ou adicionalmente, os medicamentos da invençãopodem também ser administrados em uma forma tópica para promover acura acelerada da ferida e/ou prevenir, reduzir ou inibir cicatriz. Tal adminis-tração pode ser efetuada como parte do cuidado inicial e/ou de continuaçãopara a área ferida.

Os inventores descobriram que a promoção da cura aceleradada ferida e/ou prevenção, redução ou inibição de cicatriz é particularmentemelhorada pela aplicação tópica de um agente da invenção para uma ferida(ou, no caso de aplicação profilática, a um tecido ou local onde uma feridadeve ser formada).

Composições ou medicamentos contendo agentes da invençãopodem tomar um número de formas diferentes dependendo, em particular damaneira em que devem ser usadas. Assim, por exemplo, podem ser sob aforma de um líquido, pomada, creme, gel, hidrogel, pó ou aerossol. Todastais composições são adequadas para o tratamento tópico a uma ferida, quesão meios preferidos de administrar agentes da invenção a um sujeito (pes-soa ou animal) necessitando de tratamento.

Os agentes da invenção podem ser fornecidos em uma ataduraou curativo estéril, que possam ser usados para cobrir uma ferida ou outrolocal de dano epitelial a ser tratado.

Será apreciado que o veículo de uma composição compreen-dendo agentes da invenção deve ser um que seja bem-tolerado pelo pacien-te e permita a liberação do agente à ferida. Tal veículo é preferivelmente bi-odegradável, biossolúvel, biorreabsorvível e/ou não-inflamatório.

Medicamentos e composições compreendendo agentes da in-venção podem ser usados de várias maneiras. Assim, por exemplo, umacomposição pode ser aplicada na e/ou em volta de uma ferida a fim de pro-mover a cura acelerada da ferida e/ou prevenir, reduzir ou inibir cicatriz. Se acomposição deve ser aplicada a uma ferida "existente", então o veículo far-maceuticamente aceitável será um que seja relativamente "suave" isto é umveículo que seja biocompatível, biodegradável, biossolúvel e não-inflama-tório.

Um agente da invenção, ou um ácido nucléico codificando talagente (como considerado mais abaixo), pode ser incorporado dentro de umdispositivo de liberação lenta ou prolongada. Tais dispositivos podem, porexemplo, ser colocados sobre ou introduzidos sob a pele e o agente ou áci-do nucléico pode ser liberado durante dias, semanas ou mesmo meses. Taldispositivo pode ser particularmente útil para pacientes (tais como aquelesque sofrem de feridas crônicas) que requerem promoção em longo prazo dacura acelerada da ferida e/ou prevenção, redução ou inibição de cicatriz. Osdispositivos podem ser particularmente vantajosos quando usados para aadministração de um agente ou de um ácido nucléico que normalmente exi-giria administração freqüente (por exemplo, pelo menos administração diáriapor outras vias).

As doses diárias de um agente da invenção podem ser dadascomo uma única administração (por exemplo, uma aplicação diária de umaformulação tópica ou de uma injeção diária). Alternativamente, o agente dainvenção pode exigir a administração duas ou mais vezes durante um dia.Em uma alternativa adicional, um dispositivo de liberação lenta pode ser u-sado para fornecer doses ideais de um agente da invenção a um pacientesem a necessidade de administrar doses repetidas.

Em uma modalidade um veículo farmacêutico para administra-ção de um agente da invenção pode ser um líquido e uma composição far-maceuticamente adequada, seria sob a forma de uma solução. Em outramodalidade, o veículo farmaceuticamente aceitável é um sólido e uma com-posição adequada é sob a forma de um pó ou comprimidos. Em uma moda-lidade adicional o agente da invenção pode ser formulado como uma partede um emplastro transdérmico farmaceuticamente aceitável.

Um veículo sólido pode incluir uma ou mais substâncias que po-dem também atuar como agentes flavorizantes, lubrificantes, solubilizantes,agentes de suspensão, preenchedores, agentes deslizantes, bandagem decompressão, aglutinantes ou agentes de desintegração em comprimido; po-de também ser um material de encapsulamento. Em pós, o veículo é um só-lido finamente dividido que está misturado com o agente finamente divididoda invenção. Em comprimidos, o agente da invenção é misturado com umveículo tendo as propriedades necessárias de compressão em proporçõesadequadas, e comprimido na forma e no tamanho desejados. Os pós e com-primidos contêm preferivelmente até 99% do agente da invenção. Veículossólidos adequados incluem, por exemplo, fosfato de cálcio, estearato demagnésio, talco, açúcares, lactose, dextrina, amido, gelatina, celulose, poli-vinilpirrolidina, ceras de baixa fusão e resinas de troca iônica.

Veículos líquidos podem ser usados para preparar soluções,suspensões, emulsões, xaropes, elixires e composições pressurizadas. Oagente da invenção pode ser dissolvido ou suspenso em um veículo líquidofarmaceuticamente aceitável tal como água, um solvente orgânico, uma mis-tura de ambos ou óleos ou gorduras farmaceuticamente aceitáveis. O veícu-lo líquido pode conter outros aditivos farmaceuticamente adequados taiscomo solubilizantes, emulsificantes, tampões, conservantes, adoçantes, a -gentes flavorizantes, agentes de suspensão, agentes de espessamento, co-res, reguladores de viscosidade, estabilizantes ou osmo-reguladores. Exem-plos adequados de veículos líquidos para administração oral e parenteralincluem água (que contêm parcialmente aditivos como acima, por exemplo,derivados da celulose, preferivelmente solução carboximetil celulose de só-dio), álcoois (incluindo álcoois monoídricos e álcoois poliídricos, por exem-pio, glicóis) e seus derivados, e óleos (por exemplo, óleo de coco fracionadoe óleo de amendoim). Pode ser geralmente preferido que os medicamentosou métodos da invenção utilizem formulações em que TGF-Bs monoméricos,tal como TGF-B3, sejam fornecidos na ausência de álcoois. Tais formula-ções sem álcool podem particularmente ser preferidas para uso em locais deferida (ou locais onde as feridas devem ser formadas) devido a sua naturezarelativamente "suave". Para administração parenteral, o veículo pode tam-bém ser um éster oleoso tal como oleato de etila e miristato de isopropila.Veículos líquidos estéreis são úteis em composições na forma líquida estérilpara administração parenteral. O veículo líquido para composições pressuri-zadas pode ser hidrocarboneto halogenado ou outro propulsor farmaceuti-camente aceitável.

Composições farmacêuticas líquidas que são soluções estéreisou suspensões podem ser utilizadas por, por exemplo, injeção intramuscular,intratecal, epidural, intraperitoneal, intradérmica, intra-estromal (córnea) ou asubcutânea. Soluções estéreis podem também ser administradas intraveno-samente. O agente da invenção pode ser preparado como uma composiçãosólida estéril que pode ser dissolvida ou suspensa na hora da administraçãousando a água estéril, a solução salina, ou o outro meio injetável estéril ade-quado. Pretende-se incluir aos veículos aglutinantes inertes e necessários,agentes de suspensão, lubrificantes e conservantes

Na situação em que se deseja administrar um agente da inven-ção por meio da ingestão oral, será apreciado que o agente escolhido serápreferivelmente um agente tendo um grau elevado de resistência à degrada-ção. Por exemplo, o agente da invenção pode ser protegido (por exemplo,usando as técnicas descritas acima) de modo que sua taxa de degradaçãono trato digestivo seja reduzida.

Composições de agentes da invenção são adequadas para serusadas para promover a cura acelerada da ferida e/ou inibir cicatriz na cór-nea. Feridas de córnea podem resultar do trauma ao olho que surge comoresultado de ferimento acidental (como considerado acima) ou como resulta-do de operações cirúrgicas (por exemplo, cirurgia a laser na córnea). Nestecaso um medicamento preferido da invenção pode ser sob a forma de umcolírio.

Agentes da invenção podem ser usados em uma escala de feri-das "internas" (isto é, feridas que ocorrem dentro do corpo, em vez de emuma superfície externa). Assim, por exemplo, os medicamentos de acordocom a invenção podem ser formulados para inalação para uso em feridasque surgem nos pulmões ou em outro epitélio respiratório.

Procedimentos conhecidos tais como aqueles empregados con-vencionalmente pela indústria farmacêutica (por exemplo, experimentos invivo, ensaios clínicos etc.), podem ser usados para estabelecer formulaçõesespecíficas de composições compreendendo agentes da invenção e paradietas terapêuticas precisas para administração de tais composições (taiscomo doses diárias do agente ativo e a freqüência da administração).Uma dose diária adequada de um agente de acordo com a in-venção capaz de promover a cura acelerada da ferida e/ou prevenir, reduzirou inibir cicatriz depende de uma escala de fatores que incluem (mas nãolimitados a) a natureza do tecido ferido, área e/ou profundidade da ferida aser tratada, a severidade da ferida, e a presença ou a ausência de fatorespredispostos à cicatriz patológica ou à formação crônica da ferida.

Como exemplo, a quantidade de um agente ativo que pode seradministrado a uma ferida ou local de dano epitelial em uma única incidênciade tratamento pode preferivelmente estar na região de 50-200ng/cm linearde ferida ou cm2 de dano epitelial (se administrado por injeção), ou 100-300ng/cm linear de ferida ou cm2 de dano epitelial (se administrado topica-mente).

Para exemplo adicional, a quantidade preferida de um agente a-tivo a ser administrado diariamente a uma ferida ou local de dano epitelialpode estar na região de 50ng/cm linear de ferida ou cm2 de dano epitelial (seadministrado por injeção), ou em 100ng/cm linear de ferida ou cm2 de danoepitelial (se administrado topicamente).

Como exemplo, a quantidade total de um agente ativo que podeser administrado por injeção local a uma ferida ou local de dano epitelial po-de ser preferivelmente na região de 50ng/100ML por centímetro linear de fe-rida ou cm2 de dano epitelial, dado uma vez por dia por até três dias, dessemodo, fornecendo uma dose total de 150ng/cm linear de ferida ou cm2 dedano epitelial.

No caso de tratamento tópico às feridas ou locais agudos de da-no epitelial, uma quantidade adequada de um agente ativo pode preferivel-mente estar na região de 100ng/linear de ferida ou cm2 ou dano epitelial,dado uma vez por dia por até 3 dias, desse modo, fornecendo uma dose to-tal de 300ng/cm linear de ferida ou cm2 de dano epitelial.

Sem diminuir do acima, a quantidade de um agente, de acordocom a invenção, exigida para o tratamento de feridas ou outros locais dedano epitelial estará tipicamente dentro da escala de 1 pg a 1 mg do agenteadministrado por centímetro linear de ferida ou dano epitelial por 24 horas,embora esta figura possa ser modificada para cima ou para baixo em res-posta aos fatores esboçados acima. O agente pode preferivelmente ser for-necido sob a forma de uma solução de lpg/ΙΟΟμΙ- -1 mg/1 OOpL do agente, e100μL de tal solução administrada por centímetro linear de ferida ou danoepitelial durante um período de 24 horas.

O agente pode mais preferivelmente ser administrado como umasolução de 10pg/100pL - 100pg/100pL com 100μΙ_ de tal solução adminis-trada por centímetro linear de ferida ou dano epitelial durante um período de24 horas.

Mais preferivelmente o agente pode ser administrado como umasolução de 1ng/100pL - lOOOng/lOOML com 100μΙ_ de tal solução adminis-trada por centímetro linear de ferida ou dano epitelial durante um período de24 horas.

Geralmente, as composições compreendendo agentes da inven-ção devem ser formuladas tal que quando administradas a uma ferida umaconcentração do agente entre de 0,79pM e 0,79mM por centímetro linear deferida ou dano epitelial seja alcançada. Preferivelmente o agente pode serfornecido em concentrações entre 7,9pM e 0,079mM por centímetro linear.

Um agente da invenção (tal como o peptídeo de Seqüência ID N-3) pode ser administrado em uma concentração entre 0,79pM e 0,79mM.Preferivelmente um agente da invenção pode ser administrado em uma con-centração entre 7,9pM e 0,079mM. Mais preferivelmente um agente da in-venção pode ser administrado em uma concentração entre 0,79nM e0,79μΜ.

Puramente como exemplo, uma solução injetável contendo entre10pg/100μL- e 100μg/100μL de um agente da invenção (tal como o peptídeode Seqüência ID Ng 3) é adequada para que a aplicação promova a curaacelerada da ferida da derme e/ou inibição de cicatriz quando administradacomo uma injeção intradérmica e dosada com 100μΙ_ por cm linear de mar-gem de ferida.

No caso de um peptídeo monomérico de Seqüência ID N5 3, do-sagens preferidas para administração a uma ferida podem ser na região de1 ng/100 uL - 1000ng/100uL, e 100μL de tal solução administrada por cm li-near de margem de ferida.

Os agentes da invenção podem ser usados para promover a cu-ra acelerada da ferida e/ou prevenir, reduzir ou inibir cicatriz como um mono-terapia (por exemplo, com o uso dos medicamentos da invenção sozinhos).Alternativamente, os métodos ou medicamentos da invenção podem ser u-sados em combinação com outros compostos ou tratamentos para a promo-ção da cura da ferida ou inibição da cicatriz. Tratamentos adequados quepodem ser usados como parte de tais terapias de combinação serão conhe-cidos por aqueles versados na técnica.

Os inventores verificaram que os medicamentos de acordo coma presente invenção, e particularmente aqueles que compreendem peptí-deos de Seqüência ID N- 3 podem vantajosamente ser formulados na pre-sença de um açúcar. Este açúcar pode ser um açúcar de redução ou não-redução e/ou um fosfato ou do fosfonato derivado do mesmo. Exemplos detais açúcares podem ser selecionados de, mas não são limitados a, o grupocompreendendo maltose, manose, trehalose, arabinose, manitol, sacarose,frutose, dextrose e glicose. Os açúcares preferidos podem ser selecionadosdo grupo consistindo em maltose e trehalose. Os medicamentos da inven-ção, e particularmente aqueles de acordo com esta modalidade da invenção,podem preferivelmente ter um pH entre 5 e 7.

Será apreciado que peptídeos TGF-β monomérico podem repre-sentar agentes favoráveis a ser administrados pelas técnicas que envolvemexpressão celular de seqüências de ácido nucléico que codificam tais molé-culas. Tais métodos de expressão celular são particularmente adequadospara uso médico em que os efeitos terapêuticos dos peptídeos são exigidosdurante um período prolongado, por exemplo, nos contextos onde é desejá-vel aumentar durante um período de tempo uma resposta de cura de feridade outra maneira defeituosa. É particularmente preferido que monômerosTGF-β a serem administrados via expressão celular compreendam peptí-deos definidos por Seqüência ID Ns 3.

Muitos métodos conhecidos de administrar agentes de peptídeoda invenção aos tecidos tais como feridas têm a desvantagem que pode serdifícil alcançar níveis sustentados de agente da invenção no local do trata-mento durante o curso mesmo de alguns dias porque os agentes de peptí-deo podem ter meia-vida curta in vivo. As meias-vidas dos agentes podemser curtas por várias razões que incluem:

(i) Degradação por proteases e similares.

(ii) Afastamento por proteínas de ligação.

(iii) Ligação e inibição de atividade de agente por moléculas dematriz extracelular.

Além disso, agentes usados para promover a cura acelerada daferida e/ou prevenção, redução ou inibição de cicatriz precisam ser adminis-trados em um veículo adequado e são freqüentemente fornecidos como umacomposição que compreende o agente e o veículo. Como discutido, tais veí-culos são preferivelmente não-inflamatórios, biocompatíveis, biorreabsorví-veis e não devem degradar ou inativar o agente (no armazenamento ou nouso). Entretanto, pode freqüentemente ser difícil fornecer um veículo satisfa-tório para entregar agentes a um tecido com uma ferida a ser tratada.

Uma maneira conveniente em que estes problemas podem serprevenidos ou mitigados é fornecer uma quantidade terapeuticamente eficazde um agente da invenção em uma área a ser tratada por meio da terapia degene.

Devido à degeneração do código genético, é claro que as se-qüências de ácido nucléico que codificam os agentes adequados para o usode acordo com a invenção podem ser variadas ou mudadas sem substanci-almente afetar a seqüência do produto codificado, desse modo, fornecendouma variação funcional da mesma. As seqüências de ácidos nucléicos pos-síveis que podem ser usadas para codificar peptídeos definidos por Seqüên-cia ID Ne 1 a 3 serão prontamente aparentes à pessoa versada, e exemplosadequados são fornecidos como Seqüência ID Ns 4 a 7 respectivamente.

Sistemas de distribuição de terapia de gene são altamente ade-quados para alcançar níveis sustentados de um agente da invenção em umaferida durante um período mais longo de tempo do que é possível para amaioria de sistemas de entrega convencionais. Os agentes da invenção a-dequados para promover cura acelerada da ferida e/ou cicatriz inibida po-dem continuamente ser expressos de células em um local da ferida que foitransformada com a molécula de DNA descrita no nono aspecto da inven-cão. Conseqüentemente, mesmo se o agente da invenção tivesse muito umameia-vida muito curta in vivo, quantidades terapeuticamente eficazes do a-gente podem continuamente ser expressas do tecido tratado.

Além disso, os sistemas de entrega de terapia de gene podemser usados para fornecer a molécula de DNA (e desse modo, o agente dainvenção) sem a necessidade de usar veículos farmaceuticamente conven-cionais tais como aqueles exigidos em pomadas ou cremes que entram emcontato com a ferida.

Um sistema de entrega de terapia de gene adequado é preferi-velmente tal que a molécula de DNA é capaz de ser expressa (quando o sis-tema de entrega é administrado a um paciente) para produzir um peptídeodefinido pelo grupo compreendendo Seqüência ID Nq 1 a 3. A molécula deDNA pode estar contida dentro de um vetor adequado para formar um vetorrecombinante. O vetor pode, por exemplo, ser um plasmídeo, cosmídeo oufago. Tais vetores recombinantes são altamente úteis em sistemas de entre-ga de terapia de gene da invenção para células de transformação com molé-culas de DNA adequadas.

Vetores recombinantes podem também incluir outros elementosfuncionais. Por exemplo, os vetores recombinantes podem ser projetados talque o vetor replicará de forma autônoma no núcleo da célula. Neste caso, oselementos que induzem a réplica de DNA podem ser exigidos no vetor re-combinante. Alternativamente o vetor recombinante pode ser projetado talque o vetor e a molécula de DNA recombinante integram no genoma de umacélula. Neste caso as seqüências de DNA que favorecem a integração-alvo(por exemplo, por recombinação homóloga) são desejáveis. Os vetores re-combinantes podem também ter codificação de DNA para genes que podemser usados como marcadores selecionáveis no processo de clonagem.

O vetor recombinante pode também adicionalmente compreen-der um promotor ou regulador para controlar a expressão do gene conformeexigido.

A molécula de DNA pode (mas não necessariamente) ser umaque se torne incorporada no DNA de células do sujeito sendo tratado. Célu-Ias não diferenciadas podem ser estavelmente transformadas levando a pro-dução de células filhas geneticamente modificadas. Quando este for o caso,regulação de expressão no sujeito pode ser exigida, por exemplo, com fato-res de transcrição específicos, ativadores de gene ou mais preferivelmentecom promotores induzíveis que transcrevem o gene em resposta a um sinalespecificamente encontrado em uma ferida. Alternativamente, o sistema deentrega pode ser projetado para favorecer a transformação instável ou tran-siente de células diferenciadas no sujeito que está sendo tratado. Neste e-xemplo, a regulação de expressão pode ser menos importante porque a ex-pressão da molécula de DNA parará quando as células transformadas mor-rerem ou pararem de expressar a proteína (idealmente quando a promoçãoda cura acelerada da ferida com cicatriz reduzida for efetuada).

O sistema de entrega pode fornecer a molécula de DNA a umsujeito sem ele ser incorporado em um vetor. Por exemplo, a molécula deDNA pode ser incorporada dentro de uma partícula de Iipossoma ou vírus.

Alternativamente, a molécula de DNA "nua" pode ser introduzida em umacélula do sujeito por meios adequados, por exemplo, absorção endocitóticadireta.

A molécula de DNA pode ser transferida às células de um sujeitoa ser tratado por transfecção, infecção, microinjeçãò, fusão de célula, fusãode protoplasto ou bombardeio balístico. Por exemplo, transferência pode serpor transfecção balística com partículas de ouro revestidas, Iipossomas con-tendo a molécula de DNA, vetores virais (por exemplo, adenovírus) e meiosde fornecer absorção de DNA direta (por exemplo, endocitose) por aplicaçãode DNA de plasmídeo diretamente a uma ferida tópica ou por injeção.

A expressão celular do agente da invenção pode ser por célulasna borda da área não danificada que cerca a ferida, ou pode alternativamen-te ser por células introduzidas terapeuticamente na ferida (por exemplo, cé-lulas cultivadas endógenas ou exógenas envolvidas na resposta de cura daferida).

Será apreciado que células que devem ser introduzidas terapeu-ticamente para promover cura acelerada da ferida e/ou prevenção, reduçãoou inibição de cicatriz podem ser manipuladas ex vivo tal que expressam osníveis aumentados de um agente da invenção, e então introduzidas na áreaferida. Tais células podem preferivelmente ser células cultivadas ex vivo pa-ra uso na preparação ou fabricação de pele artificial Ou de substituição depele para ser usada na promoção da cura da ferida. As células podem maispreferivelmente ser células autólogas, embora será apreciado que todas ascélulas adequadas podem ser usadas.

Conseqüentemente, em um décimo sétimo aspecto da invenção,é fornecido um medicamento que compreende células induzidas para ex-pressar um agente da presente invenção. Tais células podem preferivelmen-te expressar um TGF-B3 monomérico.

A indução de expressão celular de um agente da invenção podeser efetuada por meios de incorporação nas células de ácidos nucléicoscausando a expressão de agentes adequados para uso de acordo com ainvenção.

A invenção será agora adicionalmente descrita como exemplocom referência aos seguintes protocolos e estudos experimentais, e às figu-ras nas quais:

A Figura 1 ilustra os resultados de comparação de formas mo-noméricas e diméricas de TGF-B3 por SDS-PAGE sob condições reduzidase não-reduzidas;

A Figura 2 apresenta o modelo usado para posicionar feridas in-cisionais em ratos experimentais;

A Figura 3 resume tratamentos administrados em locais de feridade animais experimentais;

A Figura 4 mostra os resultados da avaliação, três dias após oferimento, da aparência das feridas experimentais tratadas com TGF-B3 mo-nomérico ou dimérico;A Figura 5 resume tratamentos administrados em locais de feri-das de animais experimentais;

A Figura 6 mostra os resultados da avaliação, 70 dias após o fe-rimento, da aparência das cicatrizes experimentais tratadas com TGF-B3monomérico ou dimérico;

A Figura 7 mostra imagens macroscópicas representativas mos-trando a aparência de cicatrizes experimentais 70 dias após o ferimento;

A Figura 8 imagens microscópicas representativas mostrando aestrutura de cicatrizes experimentais 70 dias após o ferimento;

A Figura 9 ilustra a produção de monômeros TGF-B3 por célulasde hospedeiro transformadas com sucesso;

A Figura 10 ilustra a geração de TGF-B3 dimérico e monoméricosob condições de redobramento da proteína experimental; e

A Figura 11 ilustra o isolamento de proteínas de TGF-B3 porcromatografia de interação hidrofóbica/ultrafiltração.

Informação com relação às seqüências de aminoácido ou ácidonucléico de importância é fornecida na seção "Informação de Seqüência"(incluindo seqüências de aminoácido dos fragmentos ativos de isoformasTGF-β humanas adequados para uso de acordo com a invenção, assim co-mo as seqüências de moléculas de DNA que codificam peptídeos completosdas isoformas TGF-β, e o DNA que codifica o fragmento ativo de TGF-B3 detipo selvagem; e as seqüências de DNA de iniciadores usados na geraçãode cDNA codificando isoformas TGF-β humanas adequadas para o uso deacordo com a invenção).

PROTOCOLOS E EXEMPLOS.

1. METODOLOGIAS PARA A PRODUÇÃO. REDOBRAMENTO, E PURIFI-CAÇÃO DE PROTEÍNAS DE TGF-β MONOMÉRICO.

1.1 Seqüências de Nucleotídeo

Seqüências de DNA codificando proteínas de TGF-β completassão mostradas como Seqüência ID N9 4 a 6. Proteínas de TGF-β completasconsistem em um peptídeo de sinal (mostrado em itálico), pró-peptídeo(mostrado em negrito) assim como o fragmento ativo (mostrado em textonormal). Codificação de seqüência de nucleotídeos para fragmentos ativosde TGF-33 de tipo selvagem é mostrada em Seqüência ID N2 7.

1.2 Geração de cDNA

O RNA total de uma ferida humana incisional (tomada no dia 5após o ferimento) foi tratado com "DNA livre" (Ambion) para remover qual-quer contaminação por DNA. Usando o RNA total como um modelo, o cDNApara cada uma das três isoformas TGF-β de mamíferos, isto é, TGF-B1,TGF-32 e TGF-B3 foi gerado por reação em cadeia de Polimerase-Transcriptase reversa (RT-PCR). A mistura principal de RT-PCR foi prepara-da a partir de Kit de Reagente de núcleo QRT-PCR Brilliant®, 1 etapa (Stra-tagene). Um micrograma de RNA foi adicionado a 50 μΙ_ de uma soluçãocontendo: Um tampão QRT-PCR de uma etapa, 0,2mM de dNTPs, 3,5mMde MgCI2, 1pL de transcriptase reversa Stratascript, 2,5 unidades de TaqPo-limerase, 0,4μΙ_ Iniciador sentido (Figura 1), 0,4μΜ de iniciador anti-sentido,(como mostrado na Informação de Seqüência). A reação foi colocada em umciclizador térmico (Hybaid PCR Expresses) e realizada sob as seguintescondições: 30 min a 45°C, 10 min a 95°C, então 40 ciclos de 95°C por 30s,65°C por 1 min e 72°C por 1 min. A etapa final de 72°C por 10 min. Amos-tras PCR foram realizadas sobre 2% (p/v) de géis agarose para verificar ta- manho de faixa e purificadas usando Wizard PCR Prep Kit (Promega).

1.3 Construção de Plasm ídeo

O vetor pET-3d usado é derivado do vetor pBR322 e contém umpromotor T7 sob controle de LacUV 5 e um gene marcador resistente à am-picilina.

Os três fragmentos de DNA de isoformas TGF-β (gerados na se-ção 1.2) foram subclonados em vetores pET-3d nos locais Hl Bam e Nco I(5'—3' respectivamente). As ligações resultantes foram então transformadasem células XL10 Gold (Stratagene) e análise de colônia PCR foi realizadapara localizar clones contendo uma inserção. Os clones finais foram cresci-dos seu DNA de plasmídeo extraído na água usando Kit Qiaprep®Spin Mini-prep (Qiagen). Os plasmídeos foram seqüenciados e verificados usando ini-ciador promotor T7 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3") e iniciador ter-minai T7 (5'-GTC AGT TAT TGC TCA GCG G-3').

1.4 Transformação e Clonagem

10 μL (50 ng por μΙ) da codificação de DNA de plasmídeo paracada uma das isoformas TGF-β (da seção 1.3) foram adicionados a 1mL decélulas de E.coli BL21 (DE3) Singles™ pLysS (Novagen) competentes frias(4°C). Após 20 min as células foram aquecidas chocadas por incubação por30s a 42°C em banho de água. 100μΙ_ de meio Psi foram adicionados à mis-tura de célula/plasmídeo e agitados a 37°C por 90 min. Alíquotas de 50μL e100μL foram plaqueadas em placas ágar LB contendo 100 μg/mL de ampici-Iina (Sigma) e incubados por 18 horas a 37°C. Colônias únicas foram culti-vadas e estoques de células congeladas geradas e armazenadas a -80°C.DNA de plasmídeo foi analisado a partir de estoques de células para verificartransformação correta.

1.5 Expressão

Ampolas de células de E.coli congeladas que transformadas comcada uma das isoformas TGF-β (da seção 1.4) foram recuperadas e inocu-Iadas em frascos Erlenmeyer com defletores, contendo 100mL de meios LBe 100μg/mL de Ampicilina. Os frascos foram incubados com agitação, duran-te a noite a 37°C. 5mL desta cultura durante a noite foram adicionados a umfrasco de Erlenmeyer de 2 litros (500mL de meios LB /amp) e incubadoscom agitação a 37°C. 2mL de amostras de caldo foram tomados de hora emhora para rastrear o crescimento e a expressão de isoforma TGF-μ (pós-indução). O crescimento foi determinado medindo a absorbância em um es-pectrofômetro, em um comprimento de onda de 600nm. Quando a absor-bância mediu 0,6 Abs as células foram induzidas para expressar as isofor-mas TGF-β pela adição de isopropil β-D-Tiogalctopiranosida (IPTG, Sigma)para uma concentração final de 1 mM. As culturas foram incubadas paraumas 4 horas adicionais. Os 0,5mL de amostras de caldo de caldo forampeletizados por centrifugação (10min 10,000 rpm em um Sorvall Biofuge) e osobrenadante descarregado. O pélete foi ressuspenso em 50μί de tampãode amostra de dodecil sulfato de sódio (SDS) - poliacrilamida gel-electrofo-rese (PAGE) e aquecido por 10 minutos em banho de água a 95°C. Amos-tras de 10μΙ_ foram carregadas em SDS-PAGE. SDS-PAGE e coloração Co-omassie Blue foram realizados (como descrito em A.T Andrews, 1986) u-sando um HoefertDMighty Small SE 245 Dual Gel Caster (Amersham). Osgéis eram de 1mm de espessura e continham 15% (v/v) de gel de poliacrilamida.

1.6 Colheita da célula e isolamento de corpos de inclusão

As células da seção 1.5 foram peletizadas centrifugando em5000g por 10 min a 4°C em um centrifugador Hettich Rotina 46R com umRotor 4315. O rompimento da célula e a recuperação de cada uma (corposde inclusão) das isoformas TGF-β insolúveis foram realizados a 4°C. As cé-lulas foram suspensas em 50mL de IOOmM Tris/HCI (Sigma), 10mM EDTA(Sigma) pH 8,3 e foram interrompidas pelo sonicação usando um Sanjo So-niprep 150. 0,2% (p/p) Triton X-100 (Sigma) foi adicionado à suspensão eagitado por uma hora. A suspensão foi centrifugada em 12.OOOg por 40 min.Os péletes foram ressuspensos em 50mL de 100mMTris/HCI, 10mM EDTApH 8,3 à temperatura ambiente antes de ser centrifugada por 40 min em15.000g.

1.7 Solubilização de Corpos de Inclusão

Os péletes da seção 1.6 foram ressuspensos em 40mL de 8M deUréia 1% (p/p) DL-DitioteitroI (DTT) e interrompidos em um homogeneizadorHeidolph Diax 900. A suspensão foi coberta e deixada em agitação por 1hora para solubilizar os corpos de inclusão e reduzir isoformas TGF-β a suasformas monoméricas desnaturadas. As suspensões foram centrifugadas em12.OOOg por 30 min a 40SC. Os sobrenadantes foram dialisados para trocartampões a partir de 8M de Uréia (ICN biomédica) a 10% (v/v) de ácido acéti-co. As proteínas de E.coli que foram solúveis em 8M de uréia se precipita-ram da solução quando o tampão foi trocado para ácido acético 10% (v/v).1% (p/v) DTT (Sigma) foi adicionado às suspensões, coberto e deixado emagitação por 30 min para reduzir qualquer ligação de dissulfeto que possa terse formado entre monômeros TGF-β a troca de tampão. As suspensões fo-ram centrifugadas para separar as proteínas solúveis e não-solúveis. Asamostras foram tomadas da solubilização de uréia e etapas de troca de tam-pão (material solúvel e não-solúvel de ácido acético), e então analisadasusando SDS-PAGE.

1.8 Ultrafiltracão

O material de ácido acético 10% (v/v) da seção 1.7 se submeteuà ultrafiltração com uma membrana 10kDa em um Vivoflow50 (Vivascience).A finalidade disto era reduzir o volume de suspensão de ácido acético 10%(v/v) para 3mL e remover as proteínas de baixo peso molecular.

1.9 Redobramento e purificação

As proteínas de TGF-B 1, 2 e 3 solubilizadas foram primeiramen-te concentradas por ultrafiltração e então realizadas através de uma colunade cromatografia de tamanho de exclusão (SEC). As frações de SEC con-tendo proteína TGF-β foram então associadas e liofilizadas. As proteínas deTGF-B 1, 2 e 3, monoméricas, liofilizadas foram solubilizadas em 8M de u-réia contendo 10mM DTT até que uma concentração final de 10mg/mL sejaalcançada. Soluções de proteína de TGF-B 1, 2 e 3 foram adicionadas gota-a-gota, enquanto agita-se a solução de redobramento (1M 3-(piridino)-1-propano sulfonato (NDSB-201), 20% (v/v) Dimetil sulfoxida (DMSO1 Sigma),2% (p/v) 3-(3-colamidopropil) dimetilamônio-1-propanossulfonato (CHAPS),1M NaCI (Sigma), 1% (p/v) reduziram glutationa (GSH, Sigma), 0,05M Triz-ma®Base (Sigma) pH 9,3) até que concentrações finais de proteínas deTGF-B 1, 2 e 3 0,2mg/mL foram alcançadas. É importante que o pH sejamantido dentro de uma escala de 9,2-9,4 usando NaOH/HCI concentrado. Asolução foi coberta com o Parapelícula, que foi puncionada para permitir aoxidação das proteínas monoméricas e deixadas em agitação a 8°C. Após144 horas a solução foi centrifugada em 15.000g por 40 minutos para remo-ver o precipitado formado e o pH foi ajustado a pH 3,5 com ácido acéticoglacial.

1.10 Purificação de Proteínas Monoméricas de Redobramento

O material de TGF-B redobrado resultante foi então adicional-mente purificado usando técnicas cromatográficas padrão seguidas por con-centração das frações relevantes (isto é, contendo proteínas monoméricasde TGF-B) por ultrafiltração antes da caracterização.2. METODOLOGIA IN VITRO E IN VIVO PARA A CARACTERIZAÇÃO EAVALIAÇÃO DE ATIVIDADE BIOLÓGICA DE PROTEÍNAS DE TGF-B3MONOMÉRICO.

As proteínas de TGF-β monomérico foram caracterizadas e ava-liadas para atividade biológica via vários métodos incluindo: SDS-PAGE;análise da seqüência de aminoácido (por LCMS); ensaio da atividade bioló-gica in vivo (usando modelos de rato de cura de ferida cutânea e cicatrizdescritas abaixo).

2.1 CARACTERIZAÇÃO IN VITRO DE MONÔMEROS TGF-B3.

2.1.1 Análise SDS-PAGE de redução e não-reducão de TGF-B3 monoméricopurificado

2.1.1.1 Método

Monômeros de TGF-B3 purificados de tipo selvagem foram ava-liados por SDS-PAGE para determinar pureza e massa molecular. 3pg demonômeros de TGF-B3 purificados (amostras reduzidas não-reduzidas),controle positivo de TGF-B3 3pg (reduzido e não-reduzido) e padrões de pe-so molecular 10pL Invitrogen Mark 12 foram carregados em um gel de polia-crilamida (10%-20% (v/v) gradiente de acrilamida). Uma vez que a eletrofo-rese estava completa o gel foi colorido com Coomassie Blue.

2.1.1.2 Resultados

Os resultados de análise de SDS-PAGE de não-redução e redu-ção são mostrados na figura 1, e ilustram que TGF-B3 dimérico funciona àsposições esperadas sobre o gel (~13kDa para reduzido como monômeros e25kDa para as amostras de não-redução). O TGF-β monomérico funcionali-zado à posição esperada de ~13kDa (12,5kDa teórico) sobre o gel para a-mostras reduzidas e não-reduzidas. Nenhuma faixa adicional de proteína foidetectada por coloração Coomassie Blue, que tem uma sensibilidade de a-proximadamente 1pg de proteína.

2.1.2 Análise de Seqüência de Aminoácido

2.1.2.1 Método

50 microlitros de TGF-B3 monomérico purificado foram secadosa vácuo e então ressuspensos em 20μΙ de uma solução contendo 50mM deNH4HCO3 e 10% (v/v)de acetonitrila. 20μς de Tripsina de classe seqüencia-da (Promega) ressuspensa em 10μΙ de tampão de ressuspensão fornecidopor Kit (Promega) para dar uma concentração de Tripsina de 2pg/pl. Isto foientão diluído em 50mM de NH4HCO3 e 10% (v/v) de acetonitrila para daruma concentração final de tripsina de 0,2pg/W. A digestão foi realizada du-rante a noite pela adição de tripsina em uma razão de 1:20 (p/p) de TGF-B3monomérico. A digestão foi esfriada bruscamente pela adição de ácido fór-mico (FIuka) a uma concentração final de 0,1% (v/v). As amostras foram en-tão diluídas a lpmol/μΙ os peptídeos foram então analisados por um proces-so de nanofluxo RP-LCMS (último sistema, Dionex online para um Q-ToF2,Micromassa). A cromatografia foi realizada em uma coluna C18 de 75 pm(empacotamento LC) utilizando um gradiente de 45 min a partir de 5% deacetonitrila para 55% de acetonitrila (Romil). A análise MS toma a forma deanálise dependente de dados onde os instrumentos mediram o m/z de íonsde peptídeo eluindo a partir de LC e selecionando íons apropriados para a-nálise MSMS onde decomposição induzida de forma colidida foi empregadapara fragmentar íons de peptídeo para renderizar informação de seqüência.

2.1.2.2 Resultados

A análise de seqüência de aminoácido confirmou que o monô-mero TGF-B3 de "tipo selvagem" teve a seqüência de aminoácido esperada(correspondendo à Seqüência ID N- 3).

2 AVALIAÇÃO IN VIVO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE MONÔMEROS DETGF-B3.

Os dados na literatura demonstraram que TGF-Bs diméricos in-eluindo TGF-B3, aceleram a cura cutânea e reduzem cicatriz seguida de fe-rida ou ferimento (Shah, M e outros 1995). O seguinte exemplo investigou osefeitos biológicos de TGF-63 monomérico na cura de ferida incisional (3 diaspós-ferida) e em cicatriz (70 dias pós-ferida) em ratos machos adultos.2.2.1 O Efeito de Proteínas de TGF-B3 mutantes e de "tipo selvagem" naCura da Ferida (Ferida Incisional Dia 3).

2.2.1.1 Método

Ratos machos (Sprague Dawley) foram anestesiados com Halo-thane e suas partes traseiras raspadas. Posições de ferida foram marcadasusando um modelo proprietário padrão com tinta de marcação da pele comomostrado na figura 2. Amostras foram diluídas em tampão de veículo estérilcontendo 0,25M de Maltose (Sigma), 0,002% (v/v) de ácido acético e 0,33%(v/v) de álcool isopropílico a concentrações esboçadas na tabela da figura 3.Todas as amostras forma esterilizadas em filtro e livres de endotoxina. Qua-tro ratos foram usados para cada grupo de tratamento. 100pL de amostra decada grupo de tratamento (figura 3) foram injetados intradermicamente nasposições marcadas A e B da ferida (exceto os ratos que não recebem ne-nhum tratamento "naíve"). Nas posições de ferida AeB incisões longas de1cm de espessura foram feitas com uma lâmina de bisturi N5 11. Todos osanimais foram enjaulados separadamente. Após 24 horas os animais rece-beram uma segunda dose da amostra. Após 3 dias as feridas foram fotogra-fadas e analisadas usando um sistema de Contagem Analógica Visual ma·croscópico (modificado de Beausang, E e outros 1998). A análise estatísticados dados foi executada usando testes de Mann Whitney U/Student T. Umvalor de p<0,05 foi considerado significativo.

2.2.1.2 Resultados

Feridas incisionais foram examinadas após 3 dias usando o sis-tema VAS macroscópico (vide figura 4). Nesta escala de dez pontos um ín-dice de 0 representa uma ferida bem-curada e um índice de 10 representauma ferida muito mal curada. Os dados mostram que:

Tratamento com 50ng/100pL ou 100ng/100pL de TGF-B3 mo-nomérico de "tipo selvagem" diminui o índice de VAS (isto é, melhora a apa-rência macroscópica das feridas) comparada a ambos sem tratamento (con-trole "naíve") e tratamento de placebo. Tratamento com dose de100ng/100pL melhorou significativamente (p<0,01) a aparência de feridascomparada a nenhum tratamento. É surpreendente notar que TGF-β mono-mérico de tipo selvagem mostrou maior eficiência do que a forma dimérica..2.2 O Efeito de Proteínas de TGF-B3 Monomérico de "Tipo Selvagem" emcicatriz (Ferida Incisional dia 70).

2.2.2.1 MétodoRatos machos (Sprague Dawley) foram anestesiados com Halo-thane e as suas partes traseiras raspadas. Posições de ferida foram marca-das usando um modelo padronizado com tinta de marcação da pele comomostrado na figura 5. Amostras foram diluídas em tampão de veículo estérilcontendo 0,25M de Maltose (Sigma), 0,002% (v/v) de ácido acético e 0,33%(v/v) de álcool isopropílico a concentrações esboçadas na tabela da figura 5.

Todas as amostras foram esterilizadas por filtro e livres de endotoxina. Qua-tro ratos foram usados para cada grupo de tratamento. 10OpL da amostra decada grupo de tratamento (figura 5) foram injetados intradermicamente nasposições marcadas A e B da ferida (exceto os ratos que não recebem ne-nhum tratamento - "naíve"). Nas posições de ferida AeBa incisões longasde 1 cm de espessura foram feitas com uma lâmina de bisturi Nq 11. Todosos animais foram enjaulados separadamente. Após 24 horas os animais re-ceberam uma segunda dose da amostra. Após 70 dias as cicatrizes foramfotografadas e analisadas usando um sistema de Contagem Analógica Visu-al macroscópico (modificado de Beausang, E e outros 1998). Exemplos re-presentativos da aparência macroscópica de cicatrizes produzidas comodescrito acima são mostrados na figura 7.

Após análise macroscópica, as feridas foram cortadas e coloca-das em 10% de salina tamponada antes de serem processadas para avalia-ção histológica em blocos de cera. Os blocos de cera foram cortados emseções seriais de 5 pm e colocados em lâminas. As lâminas foram coloridascom Massons Trichrome e analisadas. A análise estatística dos dados foiexecutada usando testes de Mann Whitney U/Student T. Um valor de p<0,05foi considerado significativo. Exemplos representativos da aparência micros-cópica de cicatrizes foram mostrados na figura 8.

2.2.2.2 Avaliação de Feridas Incisionais do dia 70 usando VAS Macroscópiço

Feridas incisionais foram examinadas após 70 dias usando umsistema VAS macroscópico. Um índice de 10 indica uma cicatriz ruim e umíndice de 0 é pele normal. Os resultados da análise VAS das feridas do dia70 são resumidos na figura 6. Isto mostra que:TGF-33 monomérico de "tipo selvagem" (em doses deSOng/lOOpL e 100ng/100pL) reduziu cicatriz, comparado às feridas ingênuase tratadas com placebo. Para a dose de 100ng/100pL esta redução é esta-tisticamente significativa comparada a feridas tratadas com placebo(p<0,01).

TGF-B3 dimérico em SOng/lOOpL reduziu cicatriz comparado aferidas ingênuas e tratadas com placebo. Esta redução é estatisticamentecomparada a feridas tratadas com placebo (p<0,01).

3. DESENVOLVIMENTO DE CONDIÇÕES PREFERIDAS PARA A PRO-DUCÁO DE MONÔMEROS BIOLOGICAMENTE ATIVOS.

Os inventores investigaram se métodos melhorados de gerarmonômeros TGF-β biologicamente ativos, corretamente dobrados poderiamou não ser estabelecidos. O seguinte exemplo é ilustrativo da aplicação dosmétodos da invenção ao redobramento monomérico de TGF-B3.

Um estudo foi estabelecido para selecionar reagentes de redo-bramento (vide 3.12). Os métodos de purificar os monômeros corretamenteredobrados foram então investigados (3.13).

Estes estudos levaram os inventores a achar que os métodosmelhorados de biologicamente gerar monômeros TGF-B3 corretamente do-brados podem ser estabelecidos seguindo um método compreendendo adi-ção solubilizada, fator de crescimento monomérico não dobrado para umasolução contendo:

(i) ácido 2-(cilcohexilamino)-etanossulfônico (CHES) ou umanálogo funcional do mesmo; e

(ii) sistema redox de sulfidrila/dissulfeto de baixo peso molecu-lar; e

incubar o fator de crescimento na solução até o fator de cresci-mento biologicamente ativo dimérico ser formado.

EXPERIMENTO:

3.1 Geração de cDNA

O RNA total de uma ferida incisional humana (tomada no dia 5pós-ferida) foi tratado com o DNA-Livre (Ambion) para remover qualquerDNA de contaminação. Usando o RNA total como um modelo, cDNA deTGF-B3 foi gerado por reação em cadeia de Polimerase-Transciptase Re-versa (RT-PCR). A mistura de RT-PCR principal foi preparada de Kit de Re-agente de Núcleo Brilliant® QRT-PCR, 1 etapa (Stratagene). Um microorga-nismo de RNA foi adicionado a 50μΙ_ de uma solução contendo: tampãoQRT-PCR de Uma etapa, 0,2mM dNTPs, 3,5 mM de MgCI2, 1pL transcripta-se reversa StrataScript, 2,5 unidade de Taq polimerase, 0,4μΜ de iniciadorsenso (5' GAT ATA CCA TGG CTT TGG ACA CCA ATT ACT ACT GC 3'),0,4μΜ iniciador senso (5'-CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCA GCT ACATTT ACA AGA C 3')· A reação foi colocada em um ciclizador térmico (HybaidPCR Expresso) e funcionalizada sob as seguintes condições: 30 min a 45°C,10 min a 95°C, então 40 ciclos de 95°C por 30s, 65°C por 1 min e 72°C por 1min. A etapa final de 72°C por 10 min. Amostras PCR foram funcionalizadasem 2% (p/p) de gel agarose para verificar tamanho de faixa e purificadasusando Wizard PCR Prep Kit (Promega).

3.2 Clonagem de Vetor e Transformação de Célula de Hospedeiro

O vetor de pET-24d é derivado a partir do vetor pBR322 e con-tém um promotor T7 sob controle LacUV5 e um gene marcador resistente deCanamicina.

Os fragmentos de cDNA de TGF-B3 (gerados na seção 1.1) fo-ram digeridos com o 0,75μ1_ de Ncol (New England Biolabs) e 0,75μΙ_ deBamHI (New England Biolabs) com tampão 1 X BamHI (New England Bio-labs) em uma reação de 15μΙ_ (Nuclease Free Water, Novagen) a 37°C por 4horas. Um microlitro de plasmídeo pET-24d (Novagen) foi digerido da mes-ma maneira. O cDNA digerido e o grande fragmento de plasmídeo eram gelagarose purificado e recuperado usando o Kit de extração de DNA SpinPrepGel (Novagen).

Os fragmentos de plasmídeo e cDNA purificados foram ligadosusando o Kit de Iigase T4 (Novagen). O cDNA/plasmídeo ligado foi transfor-mado em HMS174 (DE3) (kit de transformação Novagen HMS174 (DE3)).

Os transformantes foram selecionados por laminação nas placas ágar decaldo de Luria (LB) contendo 50μg/mL de Canamicina (Invitrogen). Três cio-nes foram selecionados para restrição de digestão e/ou expressão.3.3 Seleção de Clone para Expressão de Produto

Os clones foram crescidos em culturas de frasco de agitação decaldo "Terrific" de meia resistência (6g/L de fitona petona (Becton Dickin-son), 12g/L de extrato de fermento (Becton Dickinson), 2g/L de glicerol (JTBaker), 1,16g/L de fosfato de potássio monobásico (JT Baker), 6,25g/L defosfato de potássio dibásico (JT Baker), QS para 1 litro com água destilada)e induzidos na fase exponencial em OD6oo entre 0,65 e 0,85 com 1mM deisopropil beta-D-tiogalactopiranosida (IPTG). As amostras de p.ós-induçãoforam tomadas 3 horas após a adição de IPTG e analisadas por eletroforesede gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) para indução eexpressão de produto. Os clones 1-4 alíquota de amostra de pré/pós-indução e padrões de peso molecular Mark 12 (faixa de peso molecular de2,5-200kDa - Invitogen) foram funcionalizados sobre gel NuPAGE@ Novex12% Bis-Tris, 1,0mm (Invitrogen) por aproximadamente 40-50 minutos em120milliAmps e 200 volts e então coloridos com Coomassie Blue. Uma prote-ína cujo tamanho está entre 6 e 14,4kDa (isto é, monômero TGF-B3) é indu-zida claramente em cada uma destas culturas (vide figura 9) com o clone 2expressando a grande quantidade de proteína TGF-B3.

3.4 Estoque de Célula Congelada

Os clones 1 -4 foram crescidos em frascos de agitação em CaldoTerrific de meia resistência para um OD6oo de aproximadamente 1 e arma-zenados como estoques de glicerol pela adição de glicerol a 20% (v/v).1,2mL de caldo foi dosado em criovasos de 12 χ 2mL (que continham 0,3mLde glicerol) e então armazenado a -70°C.

3.5 Confirmação de Seqüência de Gene de TGF-Beta 3

As amostras das culturas usadas para estoques de célula conge-lada foram tomadas antes da adição de glicerol e usadas para a isolamentode plasmídeo usando um Qiagen MiniPrep Kit. O plasmídeo isolado foi se-qüenciado e verificado usando um iniciador promotor T7 (5'- TAA TAC GACTCA CTA TAG GG-3') e um iniciador terminal T7 (5'- GCT AGT TAT TGCTCA GCG G-3').3.6 Cultura de Semente

Como o clone 2 expressou a quantidade mais elevada de proteína TGF-Beta 3 uma ampola de estoque congelado (da seção 3.4) foi recupe-rada e inoculada em um frasco de Erlenmeyer com defletores de 2 Litros,contendo 500mL de meio HySoy (12g/L Hy-Soy (Quest International), 24g/Lde extrato de levedura (Becton Dickinson), 10g/L de NaCI (Sigma), 10g/L deglicerol (Sigma) e 50pg/mL de canamicina. O frasco foi incubado com agita-ção a 37°C e 200rpm e amostrado periodicamente para medir OD550. Quan-do o OD da cultura alcançou 3,21 U/mL (após 7 horas) o caldo de célula foiusado para semear um fermentador 150L (100 litros de volume de funcio-namento).

3.7 Fermentação

Novecentos mililitros de caldo célula (da seção 3.6) foram usa-dos para inocular 150L de fermentador (WHE) contendo 90L de Meios deCultura em Batelada (0,6g/L K2HPO4, 0,4g/L KH2HPO4, 1,25g/L NH4SO4,12g/L HY-Soy, 24g/L de extrato de levedura, 10g/L de glicerol). Os parâme-tros de funcionamento de fermentação foram controlados como segue: pontode ajuste de temperatura, 37°C; ponto de ajuste de pH, 7,0 (mantidos usan-do 4N de hidróxido de amônio e 4N de ácido fosfórico), e; oxigênio dissolvido(DO) inicialmente calibrado a 100%. A pressão da cabeça do vaso era 48,19kPa (0,4914 kgf/cm2), e a agitação e o fluxo de ar eram 200-400rpm com umvolume de ar por volume de meio por minuto (vvm ou slpm), respectivamen-te. DO foi mantido acima de 20% ajustando os parâmetros do ponto de ajus-te de fermentação na seguinte prioridade: Agitação (máximo de 400rpm),aeração (máximo de 1,5 vvm), suplemento de oxigênio (máximo 33,3 lpm), econtrapressão 82,61 kPa (máximo de 0,8424 kgf/cm2). Espumação foi con-trolada com Pluronic L-61 (25% v/v). Quando o OD da cultura alcançou10U/mL uma alimentação de glicerol (50% v/v) foi iniciada em uma taxa defluxo de 45mL/min. Quando o OD alcançou 40 U/mL, as células foram indu-zidas com a adição de IPTG à concentração final de 0,2mM.

3.8 Colheita

Após 4 horas de pós-indução, o fermentador foi refrigerado a10°C e o fluxo de ar e a agitação foram reduzidos a 0,3wm e IOOrpm res-pectivamente. A espuma e os controles de pH foram terminados e a contra-pressão foi ajustada a 20,65 kPa (0,2106 kgf/cm2). A cultura foi colhida porcentrifugação contínua com um centrifugador contínuo Westfalia CSA 8 a10°C. O centrifugador foi operado em 15,000 rpm e uma taxa de fluxo de 3litros por minuto e pastas fluidas celulares colhidas.

3.9 Lise de célula e Recuperação de IB

A pasta celular de fermentação (da seção 3.8) foi diluída em 1:5com Tampão Lysis (6,1 g/L de TrizmaBase (Tris), 3,7g/L de ácido etilenodia-minatetraacético (EDTA), 58,44L de NaCI e 10g/L de Triton X-100, pH 8,0) eressuspensa usando um homogeneizador manual. A pasta celular ressus-pensa foi passada duas vezes através de um homogeneizador de alta pres-são (parâmetros: pressão, 68,84 kPa (0,702 kgf/cm2); taxa de fluxo,450mL/min; e temperatura, 15°C). O Iisato celular homogeneizado foi entãocentrifugado (centrifugador de cubeta, rotor de ângulo fixo) em 5,OOOxg porminutos a 4°C. O sobrenadante foi descarregado deixando TGF-B3 (cor-pos de inclusão) insolúvel. O pélete do corpo de inclusão (IB) foi ressuspen-so em Tampão Wash (6,1 g/L Tris e 3,72g/L EDTA, pH 8,0) usando um ho-mogeneizador manual e centrifugado (5,000 xg por 20 minutos a 4°C).3.10 Solubilizacão de Corpo de Inclusão

O sedimento da seção 3.9 foi diluído em 1:10 com Tampão deSolubilização (6,1 g/L Tris, 15,4g/L DL-ditiotreitol (DTT) e Uréia 360,4g/L, pH8,0) e ressuspenso usando um homogeneizador manual. A suspensão foicoberta e deixada em agitação por 60-75 minutos, na temperatura ambientepara solubilizar os corpos de inclusão e reduzir TGF-33 para sua forma mo-nomérica. O pH do pélete ressuspenso foi ajustado ao pH 9,4-9,6 com Na-OH/ácido acético antes da incubação por uma segunda vez por 60-75 minu-tos.

3.11 Clarificacão/Ultrafiltracão e Diafiltracão

O material solubilizado da seção 3.10 foi clarificado, concentradoe diafiltrado em um sistema de Filtração de Fluxo Tangencial (TFF) (millipo-re). Clarificação e concentração iniciais foram alcançadas com uma mem-brana TFF de clarificação pré-condicionada (Millipore Pellicon IOOOkDa, Ce-lulose Regenerada, filtro V). O TGF-B3 clarificado foi coletado no permeato.Comutando a uma membrana de UItrafiItração/DiafiItração (UF/DF) (MilliporePellicon 5kDa, Celulose Regenerada, filtro C), o TGF-G3 foi então lavado em6 diavolumes de Tampão de Solubilização (6,1 g/L Tris, 15,4g/L DTT e360,4g/L de uréia, pH 9,5).3.12 Matriz de Peneira de Redobramento 13.12.1 Metodologia.

O conteúdo de proteína de TGF-B3 no material clarificado da se-ção 1.12 foi quantificado usando o Ensaio de Proteína RC DC™ (BioRad)juntamente com SDS-PAGE, Coloração Coomassie Blue e densitometria. Omaterial TGF-Beta 3 foi diluído em uma série de tampões de redobramento(vide tabelas 1 e 2). Amostras de 1mL foram tomadas diariamente sobreuma linha de tempo de 6 dias e analisadas sob condições de não-reduçãousando SDS-PAGE. As alíquotas de amostra e padrões de peso molecularMark 12 (2,5-200kDa faixa de peso molecular - Invitrogen) foram funcionali-zados sobre Géis NuPAGE® Novex 12% Bis-Tris, 1,0mm (Invitrogen) poraproximadamente 40-50 minutos em 120 milliAmps e 200 volts. As amostrasde proteína foram então eletroforeticamente transferidas à membrana denitrocelulose (Invitrogen) usando um aparelho Absorção Novex (Invitrogen).A membrana foi bloqueada com 5% (p/v) de pó de leite desnatado, 1 % (v/v)monolaurato polioxietilenossorbitano (Tween 20; Sigma) em salina tampona-da de fosfato (PBS). A membrana foi lavada (PBS, 0,1% (v/v) Tween 20) eincubada por 1 hora em anticorpo primário (anti-TGF-B3, MAB643 (sistemasdo R&D) diluída em 1:500 em PBS e 0,1 (v/v) Tween 20). Depois da incuba-ção com o anticorpo primário, a nitrocelulose foi lavada tampão de lavagem(PBS, 1% (v/v) Tween 20). A nitrocelulose foi então incubada por uma 1 horaadicional no anticorpo secundário (anti-camundongo cobaia 1gG conjugadocom fosfatase alcalina (Abcam P0397) diluída em 1:2000 com PBS, 0,1%(v/v) Tween 20). A membrana foi novamente lavada (PBS, 1% (v/v) Tween20 antes de se desenvolver-se com Substrato Estabilizado Azul Ocidentalpara fosfatase alcalina (Promega).O anticorpo MAB 643 detecta espécies de TGF-Beta 3 monomé-rico e dimérico corretamente redobrado.

3.12.2 Resultados

As tabelas 1 e 2 resumem os resultados obtidos testando redo-bramento de TGF-B3 sob 50 condições experimentais diferentes

Os inventores estabeleceram que as condições descritas abaixo(isto é, condições experimentais 12, 19, 36, 37, 42, 43 e 44) produziramTGF-Beta 3 dimérico corretamente redobrado.

1. 0,7M de ácido 2-etanossulfônico (ciclohexilamino) (CHES),2mM reduziu glutationa (GSH), 0,4mM de glutationa oxidada (GSSG),0,12mg/ml_ de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C (condição experimental 12).

2. 30mM de Taurodeoxicolato, 0,7M de CHES, 2mM de GSH,0,4mM de GSSG, 0,12mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C (condição ex-perimental 19).

3. 1M de NDSB-201, 2nM de glutationa reduzida (GSH), 2mM deglutationa oxidada (GSSG), 0,12mg/ml_ de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C(condição experimental 36).

4. 0,7M de CHES, 2mM de glutationa reduzida (GSH), 2nM deglutationa oxidada (GSSG), 0,12mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C(condição experimental 37).

5. 30mM de Taurodeoxicolato mais 1M de NDSB-221, 2mM deglutationa reduzida (GSH), 2mM de glutationa oxidada (GSSG), 0,12mg/mLde TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C (condição experimental 42).

6. 30mM de Taurodeoxicolato mais 0,7M de CHES, 2mM de glu-tationa reduzida (GSH), 2mM de glutationa oxidada (GSSG), 0,12mg/mL deTGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C (condição experimental 43).

7. 30mM de Taurodeoxicolato, 0,7M de CHES, 2mM de GSH,2mM de GSSG, 0,12mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9,5 a 2-8°C (condição expe-rimental 44).

Como exemplo a figura 10 ilustra a eficácia da condição experi-mental 12.<table>table see original document page 63</column></row><table><table>table see original document page 64</column></row><table>Tabela 2.

<table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table>3.13 Ultrafiltracão/Cromatoqrafia de Interação Hidrofóbica

A solução de redobramento selecionada foi concentrada em 5dobras por ultrafiltração (a membrana era uma peneira de folha plana Milli-pore Pellicon 5kDa, 0,1 m2, Regenerated Cellulose). O pH do material de re-dobramento concentrado foi então ajustado a um pH de 2,5-2,8 usando áci-do acético glacial antes de ser diluído em 1:1 em Tampão de Diluição(2,72g/L de acetato de sódio, 264,28g/L de sulfato de amônio 100g/L de áci-do acético, e 210,7g/L de cloridrato de arginina pH 3,3). Uma Coluna de Flu-xo Rápido 4 de butil sefarose (Amersham, 16cm Bed Heiht) foi equilibradacom quatro volumes de coluna de Tampão A (2,72g/L de acetato de sódio,132,14g/L de sulfato de amônio e 100g/L de ácido acético pH 3,3). O materi-al de redobramento foi filtrado através da membrana de 0,22μΜ (filtro Milli-pore Millipak) antes de ser carregado na coluna de butil Sefarose em umataxa de fluxo de 10Ocm/h (esta taxa de fluxo foi usada durante todo o proce-dimento). A coluna foi então lavada em Tampão A para quatro volumes decoluna. As proteínas de TGF-Beta 3 eluídas da coluna usando Tampão B(2.72g/L de acetato do sódio, 100g/L de ácido acético e 300g/L de álcooletílico pH 3,3). O primeiro pico, que contém proteínas de TGF-β 3 em ambasas formas monoméricas e diméricas, foi associado (vide figura 11), antes daseparação das proteínas monoméricas.Informação de SeqüênciaTGF-B-1 (Seqüência ID N9 1)

ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCSTGF-B-2 (Seqüência ID Nq 2)

ALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCSTGF-B-3 (Seqüência ID N9 3)

ALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCSTGF-Beta 1 completo de codificação de DNA (Seqüência ID N94), mostrando peptídeo de sinal (mostrado em itálico), pró-peptídeo (mostra-do em negrito) assim como o fragmento ativo (mostrado em texto normal)

atgccgccct ccgggctgcg gctgctgctg ctgctgctac cgctgctgtg gctactggtg ctgacgcctg gccggccggc cgcgggacta tccacctgca agactatcga catggagctg gtgaagcgga agcgcatcga ggccatccgc ggccagatcc tgtccaagct gcggctcgcc agccccccga gccaggggga ggtgccgccc ggcccgctgc ccgaggccgt gctcgccctg tacaacagca cccgcgaccg ggtggccggg gagagtgcag aaccggagcc cgagcctgag gccgactact acgccaagga ggtcacccgc gtgctaatgg tggaaaccca caacgaaatc tatgacaagt tcaagcagag tacacacagc atatatatgt tcttcaacac atcagagctc cgagaagcgg tacctgaacc cgtgttgctc tcccgggcag agctgcgtct gctgaggctc aagttaaaag tggagcagca cgtggagctg taccagaaat acagcaacaa ttcctggcga tacctcagca accggctgct ggcacccagc gactcgccag agtggttatc ttttgatgtc accggagttg tgcggcagtg gttgagccgt ggaggggaaa ttgagggctt tcgccttagc gcccactgct cctgtgacag cagggataac acactgcaag tggacatcaa cgggttcact accggccgcc gaggtgacct ggccaccatt catggcatga accggccttt cctgcttctc atggccaccc cgctggagag ggcccagcat ctgcaaagct cccggcaccg ccgagccctg gacaccaact attgcttcag ctccacggag aagaactgct gcgtgcggca gctgtacatt gacttccgca aggacctcgg ctggaagtgg atccacgagc ccaagggcta ccatgccaac ttctgcctcg ggccctgccc ctacatttgg agcctggaca cgcagtacag caaggtcctg gccctgtaca accagcataa cccgggcgcc tcggcggcgc cgtgctgcgt gccgcaggcg ctggagccgc tgcccathgt gtactacgtg ggccgcaagc ccaaggtgga gcagctgtcc aacatgatcg tgcgctcctg caagtgcagc tga

TGF-Beta 2 completo de codificação de DNA (Seqüência ID N95), mostrando peptídeo de sinal (mostrado em itálico), pró-peptídeo (mostra-do em negrito) assim como o fragmento ativo (mostrado em texto normal)ctgtctacct gcagcacact cgatatggac cagttcatgc gcaagaggat cgaggcgaxccgcgggcaga tcctgagcaa gctgaagctc accagtcccc cagaagacta tcctgagcccgaggaagtcc ccccggaggt gatttccatc tacaacagca ccagggactt gctccaggagaaggcgagcc ggagggcggc cgcctgcgag cgcgagagga gcgacgaaga gtactacgccaaggaggttt acaaaataga catgccgccc ttcttcccct ccgaagccat cccgcccactttctacagac cctacttcag aattgttcga tttgacgtct cagcaatgga gaagaatgcttccaatttgg tgaaagcaga gttcagagtc tttcgtttgc agaacccaaa agccagagtgcctgaacaac ggattgagct atatcagatt ctcaagtcca aagatttaac atctccaacccagcgctaca tcgacagcaa agttgtgaaa acaagagcag aaggcgaatg gctctccttcgatgtaactg atgctgttca tgaatggctt caccataaag acaggaacct gggatttaaaataagcttac actgtccctg ctgcactttt gtaccatcta ataattacat catcccaaataaaagtgaag aactagaagc aagatttgca ggtattgatg gcacctccac atataccagtggtgatcaga aaactataaa gtccactagg aaaaaaaaca gtgggaagac cccacatctcctgctaatgt tattgccctc ctacagactt gagtcacaac agaccaaccg gcggaagaagcgtgctttgg atgcggccta ttgctttaga aatgtgcagg ataattgctg cctacgtccactttacattg atttcaagag ggatctaggg tggaaatgga tacacgaacc caaagggtacaatgccaact tctgtgctgg agcatgcccg tatttatgga gttcagacac tcagcacagcagggtcctga gcttatataa taccataaat ccagaagcat ctgcttctcc ttgctgcgtgtcccaagatt tagaacctct aaccattctc tactacattg gcaaaacacc caagattgaacagctttcta atatgattgt aaagtcttgc aaatgcagct aa

TGF-Beta 3 completo de codificação de DNA (Seqüência ID Ng6), mostrando peptídeo de sinal (mostrado em itálico), pró-peptídeo (mostra-do em negrito) assim como o fragmento ativo (mostrado em texto normal)

atgaagatgc acttgcaaag ggctctggtg gtcctggccc tgctgaactt tgccacggtc 60agcctctctc tgtccacttg caccaccttg gacttcggcc acatcaagaa gaagagggtg 120gaagccatta ggggacagat cttgagcaag ctcaggctca ccagcccccc tgagccaacg 180gtgatgaccc acgtccccta tcaggtcctg gccctttaca acagcacccg ggagctgctg 240gaggagatgc atggggagag ggaggaaggc tgcacccagg aaaacaccga gtcggaatac 300tatgccaaag aaatccataa attcgacatg atccaggggc tggcggagca caacgaactg 360gctgtctgcc ctaaaggaat tacctccaag gttttccgct tcaatgtgtc ctcagtggag 420aaaaatagaa ccaacctatt ccgagcagaa ttccgggtct tgcgggtgcc caaccccagc 480tctaagcgga atgagcagag gatcgagctc ttccagatcc ttcggccaga tgagcacatt 540gccaaacagc gctatatcgg tggcaagaat ctgcccacac ggggcactgc cgagtggctg 600tcctttgatg tcactgacac tgtgcgtgag tggctgttga gaagagagtc caacttaggt 660ctagaaatca gcattcactg tccatgtcac acctttcagc ccaatggaga tatcctggaa 720aacattcacg aggtgatgga aatcaaattc aaaggcgtgg acaatgagga tgaccatggc 780cgtggagatc tggggcgcct caagaagcag aaggatcacc acaaccctca tctaatcctc 840atgatgattc ccccacaccg gctcgacaac ccgggccagg ggggtcagag gaagaagcgg 900gctttggaca ccaattactg cttccgcaac ttggaggaga actgctgtgt gcgccccctc 960tacattgact tccgacagga tctgggctgg aagtgggtcc atgaacctaa gggctactat 1020gccaacttct gctcaggccc ttgcccatac ctccgcagtg cagacacaac ccacagcacg 1080gtgctgggac tgtacaacac tctgaaccct gaagcatctg cctcgccttg ctgcgtgccc 1140caggacctgg agcccctgac catcctgtac tatgttggga ggacccccaa agtggagcag 1200ctctccaaca tggtggtgaa gtcttgtaaa tgtagctga

Seqüência ID N9 7 - Fragmento ativo de decodificacão de DNAde TGF-β humano de tipo selvagem

GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC TGCTGT GTG CGC CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGGAAG TGG GTC CAT GAA CCT AAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGC TCAGGC CCT TGC CCA TAC CTC CGC AGT GCA GAC ACA ACC CAC AGC ACGGTG CTG GGA CTG TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCA TCT GCC TCGCCT TGC TGC GTG CCC CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC TATGTT GGG AGG ACC CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTGAAG TCT TGT AAA TGT AGC

Iniciadores senso e anti-senso para a geração de cDNA de TGF-Beta 1. TGF-Beta 2 e TGF-Beta 3:

TGF-Beta 1

Iniciador Senso -5'GTT ACA CCA TGG CCC TGG ACA CCA ACT ATT 3'Iniciador anti-senso - 3' CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCA GCT GCACTT 5'

TGF-Beta 2

Iniciador Senso -5' GTT ACA CCA TGG CTT TGG ATG CGG CCT ATTInieiador anti-senso -3' CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCA GCT GCA TTT G 5'TGF-Beta 3

Inieiador senso - 5" GAT ATA CCA TGG CTT TGG ACA CCA ATT ACT ACT GC 3'Inieiador anti-senso - 5' CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCA GCT ACA TTTACA AGA C 3'.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Renovo LimitedFerguson, MarkMellors, PhilLaverty, HughOccleston, NickO'Kane, SharonAtkinson, Emma<120> MEDICAMENTOS E PROTEÍNAS<130> P90083PWO<150> GB0604966.2<151> 2006-03-11<160> 15

<170> Versão de Patente 3.3<210> 1<211> 112<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 1

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys1 5 10 15

vai Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp

20 25 3O

Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys35 40 45

Pro Tyr Ile Trp ser Leu Asp Thr Gln Tyr ser Lys Val Leu Ala Leu

50 55 60

Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro65 70 75 80

Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro

85 90 95Lys Val Glu Gln Leu ser Asn Met Ile Val Arg ser Cys Lys Cys Ser100 105 110

<210> 2<211> 112<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 2

Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys1 5 10 15

Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp

20 25 BO

Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Tyr Leu Trp Ser ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu 50 55 60

Tyr Asn Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser65 70 75 80

Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro85 90 95

Lys Ile Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys ser

100 105 110

<210> 3<211> 112<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 3

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys1 5 10 15

vai Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30

Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys35 40 45Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu

50 55 60

Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala ser Ala ser Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro

85 90 95

Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys ser100 105 110

<210> 4<211> 1173<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 4

atgccgccct ccgggctgcg gctgctgctg ctgctgctac cgctgctgtg gctactggtg 60

ctgacgcctg gccggccggc cgcgggacta tccacctgca agactatcga catggagctg 120

gtgaagcgga agcgcatcga ggccatccgc ggccagatcc tgtccaagct gcggctcgcc 180

agccccccga gccaggggga ggtgccgccc ggcccgctgc ccgaggccgt gctcgccctg 240

tacaacagca cccgcgaccg ggtggccggg gagagtgcag aaccggagcc cgagcctgag 300

gccgactact acgccaagga ggtcacccgc gtgctaatgg tggaaaccca caacgaaatc 360

tatgacaagt tcaagcagag tacacacagc atatatatgt tcttcaacac atcagagctc 420

cgagaagcgg tacctgaacc cgtgttgctc tcccgggcag agctgcgtct gctgaggctc 480

aagttaaaag tggagcagca cgtggagctg taccagaaat acagcaacaa ttcctggcga 540

tacctcagca accggctgct ggcacccagc gactcgccag agtggttatc ttttgatgtc 600

accggagttg tgcggcagtg gttgagccgt ggaggggaaa ttgagggctt tcgccttagc 660

gcccactgct cctgtgacag cagggataac acactgcaag tggacatcaa cgggttcact 720

accggccgcc gaggtgacct ggccaccatt catggcatga accggccttt cctgcttctc 780

atggccaccc cgctggagag ggcccagcat ctgcaaagct cccggcaccg ccgagccctg 840

gacaccaact attgcttcag ctccacggag aagaactgct gcgtgcggca gctgtacatt 900

gacttccgca aggacctcgg ctggaagtgg atccacgagc ccaagggcta ccatgccaac 960

ttctgcctcg ggccctgccc ctacatttgg agcctggaca cgcagtacag caaggtcctg 1020

gccctgtaca accagcataa cccgggcgcc tcggcggcgc cgtgctgcgt gccgcaggcg 1080

ctggagccgc tgcccathgt gtactacgtg ggccgcaagc ccaaggtgga gcagctgtcc 1140aacatgatcg tgcgctcctg caagtgcagc tga 1173

<210> 5<211> 1182<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 5

ctgtctacct gcagcacact cgatatggac cagttcatgc gcaagaggat cgaggcgatc 60 cgcgggcaga tcctgagcaa gctgaagctc accagtcccc cagaagacta tcctgagccc 120 gaggaagtcc ccccggaggt gatttccatc tacaacagca ccagggactt gctccaggag 180 aaggcgagcc ggagggcggc cgcctgcgag cgcgagagga gcgacgaaga gtactacgcc 240 aaggaggttt acaaaataga catgccgccc ttcttcccct ccgaagccat cccgcccact 300 ttctacagac cctacttcag aattgttcga tttgacgtct cagcaatgga gaagaatgct 360 tccaatttgg tgaaagcaga gttcagagtc tttcgtttgc agaacccaaa agccagagtg 420 cctgaacaac ggattgagct atatcagatt ctcaagtcca aagatttaac atctccaacc 480 cagcgctaca tcgacagcaa agttgtgaaa acaagagcag aaggcgaatg gctctccttc 540 gatgtaactg atgctgttca tgaatggctt caccataaag acaggaacct gggatttaaa 600 ataagcttac actgtccctg ctgcactttt gtaccatcta ataattacat catcccaaat 660 aaaagtgaag aactagaagc aagatttgca ggtattgatg gcacctccac atataccagt 720 ggtgatcaga aaactataaa gtccactagg aaaaaaaaca gtgggaagac cccacatctc 780 ctgctaatgt tattgccctc ctacagactt gagtcacaac agaccaaccg gcggaagaag 840 cgtgctttgg atgcggccta ttgctttaga aatgtgcagg ataattgctg cctacgtcca 900 ctttacattg atttcaagag ggatctaggg tggaaatgga tacacgaacc caaagggtac 960 aatgccaact tctgtgctgg agcatgcccg tatttatgga gttcagacac tcagcacagc 1020 agggtcctga gcttatataa taccataaat ccagaagcat ctgcttctcc ttgctgcgtg 1080 tcccaagatt tagaacctct aaccattctc tactacattg gcaaaacacc caagattgaa 1140 cagctttcta atatgattgt aaagtcttgc aaatgcagct aa 1182

<210> 6<211> 1239<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 6

atgaagatgc acttgcaaag ggctctggtg gtcctggccc tgctgaactt tgccacggtc 60agcctctctc tgtccacttg caccaccttg gaagccatta ggggacagat cttgagcaag gtgatgaccc acgtccccta tcaggtcctg gaggagatgc atggggagag ggaggaaggc tatgccaaag aaatccataa attcgacatg gctgtctgcc ctaaaggaat tacctccaag aaaaatagaa ccaacctatt ccgagcagaa tctaagcgga atgagcagag gatcgagctc gccaaacagc gctatatcgg tggcaagaat tcctttgatg tcactgacac tgtgcgtgag ctagaaatca gcattcactg tccatgtcac aacattcacg aggtgatgga aatcaaattc cgtggagatc tggggcgcct caagaagcag atgatgattc ccccacaccg gctcgacaac gctttggaca ccaattactg cttccgcaac tacattgact tccgacagga tctgggctgg gccaacttct gctcaggccc ttgcccatac gtgctgggac tgtacaacac tctgaaccct caggacctgg agcccctgac catcctgtac ctctccaaca tggtggtgaa gtcttgtaaa

<210> 7<211> 336<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 7

gctttggaca ccaattactg cttccgcaactacattgact tccgacagga tctgggctgggccaacttct gctcaggccc ttgcccatacgtgctgggac tgtacaacac tctgaaccctcaggacctgg agcccctgac catcctgtacctctccaaca tggtggtgaa gtcttgtaaa<210> 8

gacttcggcc acatcaagaa gaagagggtg 120ctcaggctca ccagcccccc tgagccaacg 180gccctttaca acagcacccg ggagctgctg 240tgcacccagg aaaacaccga gtcggaatac 300atccaggggc tggcggagca caacgaactg 360gttttccgct tcaatgtgtc ctcagtggag 420ttccgggtct tgcgggtgcc caaccccagc 480ttccagatcc ttcggccagá tgagcacatt 540ctgcccacac ggggcactgc cgagtggctg 600tggctgttga gaagagagtc caacttaggt 660acctttcagc ccaatggaga tatcctggaa 720aaaggcgtgg acaatgagga tgaccatggc 780aaggatcacc acaaccctca tctaatcctc 840ccgggccagg ggggtcagag gaagaagcgg 900ttggaggaga actgctgtgt gcgccccctc 960aagtgggtcc atgaacctaa gggctactat 1020ctccgcagtg cagacacaac ccacagcacg 1080gaagcatctg cctcgccttg ctgcgtgccc 1140tatgttggga ggacccccaa agtggagcag 1200tgtagctga 1239ttggaggaga actgctgtgt gcgccccctc 60aagtgggtcc atgaacctaa gggctactat 120ctccgcagtg cagacacaac ccacagcacg 180gaagcatctg cctcgccttg ctgcgtgccc 240tatgttggga ggacccccaa agtggagcag 300tgtagc 336<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Iniciador sentido para TGF-beta 1

<400> 8

gttacaccat ggccctggac accaactatt 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Iniciador anti-sentido para TGF-beta 1

<400> 9

cagccggatc cggtcgactc agctgcactt 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador sentido para TGF-beta 2

<400> 10

gttacaccat ggctttggat gcggcctatt 30

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Iniciador anti-sentido para TGF-beta 2

<400> 11

cagccggatc cggtcgactc agctgcattt g 31

<210> 12<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> iniciador sentido para TGF-beta 3

<400> 12

gatataccat ggctttggac accaattact actgc 35

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> iniciador anti-sentido para TGF-beta 3

<400> 13

cagccggatc cggtcgactc agctacattt acaagac 37

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> T7 Iniciador promotor

<400> 14

taatacgact cactataggg 20

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> T7 iniciador de terminação

<400> 15

gctagttatt gctcagcgg 19

Claims (23)

1. Monômero TGF-β, ou um derivado ou fragmento biologica-mente ativo do mesmo, para uso como um medicamento.

2. Monômero TGF-33, ou um derivado ou fragmento biologica-mente ativo do mesmo, para uso como um medicamento.

3. Uso como definido na reivindicação 1 ou 2, em que o monô-mero TGF-β tem um peso molecular de aproximadamente 12kDa.

4. Uso como definido na reivindicação 2 ou 3, na preparação deum medicamento para uso na aceleração de cura de ferida e/ou na inibiçãode cicatriz.

5. Uso como definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 4,em que o monômero TGF-B3, ou fragmento ou derivado do mesmo, é ummonômero TGF-B3 de tipo selvagem compreendendo Seqüência ID Ns 3, ouum derivado ou fragmento biologicamente ativo do mesmo.

6. Uso de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que a ferida éuma ferida dérmica.

7. Uso de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que a ferida éuma ferida nos olhos.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7,em que a ferida é uma ferida aguda.

9. Uso de acordo com a reivindicação 8, em que a ferida é umaqueimadura.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7,em que a ferida é uma ferida crônica.

11. Uso de acordo com a reivindicação 2 ou 3, na preparação deum medicamento para uso na promoção de regeneração epitelial.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, em que o epitéliocompreende a epiderme.

13. Uso de acordo com a reivindicação 11, em que o epitéliocompreende um epitélio dos olhos.

14. Uso de acordo com a reivindicação 2 ou 3, na preparação deum medicamento para uso na prevenção e/ou tratamento de um distúrbiofibrótico.

15. Uso de acordo com a reivindicação 14, em que o distúrbio fi-brótico é selecionado a partir do grupo consistindo em fibrose pulmonar, fi-brose de fígado, escleroderma, fibrose de pele, fibrose muscular, fibrose deradiação, fibrose de rim, fibrose ocular, e fibrose uterina.

16. Uso como definido em qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, em que o monômero, ou fragmento ou derivado biologica-mente ativo do mesmo, é provido em uma concentração entre 0,78pM e 0,78mM.

17. Uso como definido em qualquer uma das reivindicações pre-cedentes, em que o medicamento tem um pH de aproximadamente 5 a 7.

18. Uso como definido em qualquer uma das reivindicações pre-cedentes, em que o medicamento é substancialmente livre de álcool.

19. Uso como definido em qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, em que o monômero TGF-β, ou fragmento ou derivado biolo-gicamente ativo do mesmo, é dobrado em sua forma biologicamente ativapor um método compreendendo adicionar TGF-β monomérica não dobra-da, solubilizada (ou fragmento ou derivado do mesmo) a uma solução con-tendo:(i) ácido 2-(ciclohexilamino)-etanossulfônico (CHES) ou um aná-logo funcional do mesmo; e(ii) sistema redox de sulfidrila/bissulfeto de baixo peso molecular;eincubar o TGF-β na solução até TGF-β monomérico biologica-mente ativo dimérico ser formado.

20. Método de acelerar cura de ferida e/ou inibir cicatriz, o méto-do compreendendo administrar a um paciente necessitando de tal tratamen-to uma quantidade terapeuticamente eficaz de um TGF-β monomérico ouum derivado ou fragmento biologicamente ativo do mesmo.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, o monômero deTGF-B3, ou fragmento, é um monômero de TGF-B3 de tipo selvagem com-preendendo Seqüência ID N- 3, ou um derivado ou fragmento biologicamen-te ativo do mesmo.

22. Método de acordo com a reivindicação 20 ou 21, em que aferida é uma ferida dérmica.

23. Método de acordo com a reivindicação 20 ou 21, em que aferida é uma ferida do olho.