BRPI0708825A2

BRPI0708825A2 - extratos e mÉtodos que compreendem espÉcies de ganoderma

Info

Publication number: BRPI0708825A2
Application number: BRPI0708825-6A
Authority: BR
Inventors: Robert T Gow; Dan Li; George W Sypert; Randall S Alberte
Original assignee: Herbalscience Singapore Pte Ltd
Priority date: 2006-03-23
Filing date: 2007-03-23
Publication date: 2011-06-14
Also published as: WO2007109801A2; CA2643785A1; MX2008012066A; CN101410129A; KR20090018886A; EP2012808A4; AU2007227383A1; US20080112966A1; JP2009531330A; EP2012808A2; WO2007109801A3; IL193832A0

Abstract

EXTRATOS E MÉTODOS QUE COMPREENDEM ESPÉCIES DE GANODERMA. A presente invenção está relacionada aos extratos de material de planta de espécies de ganoderma preparados por extrações supercríticas de CO~ 2~.

Description

EXTRATOS E MÉTODOS QUE COMPREENDEM ESPÉCIES DE GANODERMA

PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício de prioridade parao Pedido Provisório de Patente U.S. número de série60/785.125, depositado em 23 de março de 2006, que é aquiincorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção está relacionada a extratos de espécies deganoderma, métodos de sua preparação com o uso de etapas deextrações seqüenciais e métodos de tratamento destas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Cogumelos são considerados um tipo especial dealimento, particularmente uma "iguaria" por causa de suatextura e seu sabor únicos. No entanto, somente após oinício do século 20, quando foram obtidos antibióticos domofo, penicilina, o valor medicinal potencial dos fungosatraiu a comunidade científica ocidental. Foi demonstradoque as propriedades químicas, biológicas e bioquímicas dosconstituintes químicos dos corpos de frutificação decogumelo são numerosas, com muitos benefícios fisiológicose médicos. Os cogumelos superiores basidiomicetos têm sidousados como remédios herbais por todo o mundo por milharesde anos, particularmente na Ásia.

As espécies de ganoderma, particularmente G. Iucidum(uLingzhi" na China e "Reishi" ou "Mannentake" no Japão) eG. tsuage, têm sido amplamente usadas para a promoção dasaúde e longevidade na China, Japão e outros paísesasiáticos. Entre os cogumelos cultivados, espécies deganoderma são únicas, pelo fato de que o valorfarmacêutico, e não nutricional, é o principal. Uma amplavariedade de produtos de G. Iucidum está disponível emvárias formas, tais como pós, suplementos dietéticos ebebidas. Esses produtos são produzidos a partir dediferentes partes do cogumelo, incluindo micélios, corpo defrutificação e esporos. No entanto, o teor de constituintequímico desses produtos é suspeito, em função da grandevariação nos constituintes químicos do material de matéria-prima de espécies de ganoderma. Como muitas plantas, osconstituintes químicos no material de planta dependem demuitas variáveis, incluindo variação genética, métodos decultivo, temperatura, pH, umidade, meio de crescimento,substratos usados, apenas para listar algumas dasvariáveis.

As espécies ganoderma, família ganodermataceae, sãofungos basidiomicetos poliporos que possuem um basidiósporode parede dupla. Ao todo, foram atribuídas 219 espéciesdentro da família ao gênero ganoderma, das quais G. Iucidumé a espécie típica. Em função da alta plasticidadefenotípica, acredita-se que as características morfológicaspara a sistemática do ganoderma sejam de valor limitado naidentificação de espécies de ganoderma para matéria-primapara produtos de extração. Mais recentemente, foram usadasabordagens bioquímicas (constituintes de triterpeno),genéticas (estudos de emparceiramento) e moleculares (rDNApolimorfismos) na taxonomia de ganoderma.

Embora os remédios chineses tradicionais (TCM) sejamusados por seu suposto valor medicinal, os TCM sãoconsiderados um nutricêutico, e são categorizados como umsuplemento nutricional ou dietético nos Estados Unidos,como definido pelo "Dietary Supplement Health and EducationAct" (DSHEA) . Uma das questões centrais para qualquerterapia é a dose eficaz que produz uma ação terapêuticadesejada, efeitos colaterais danosos. Espécies de ganodermatêm sido usadas como um fungo medicinal por mais de 2.000anos. No entanto, não há concordância sobre formulações,composições de constituintes químicos ou diretrizespadronizadas em relação à sua dosagem, composição química eformulação. Dosagens recomendadas variavam de 0,5 g a 30gramas de extratos comerciais secos de corpo defrutificação de G. Iucidum por dia. Não há relatos detoxicidade significativa com níveis muito elevados deconsumo humano. Foram relatados desconforto digestivo leveocasional e erupção cutânea em indivíduos sensíveis. A dosetóxica (TD) e a dose letal (LD) são muito elevadas, comdosagens de até 5 g/kg de administração a camundongos por30 dias e 38 g/kg injetados como uma única doseintraperitoneal em animais de laboratório sendo bemtoleradas. Portanto, os produtos de extração de espécies deganoderma não possuem limitações significativas quanto aouso clínico. É importe a determinação da dose eficaz e devalidação (ED) e a confirmação científica dos benefíciospara a saúde dos constituintes químicos de espécies deganoderma.

Como a maioria dos cogumelos, espécies de ganodermasão compostas por cerca de 90% de água por peso. Com basena literatura científica, um resumo dos constituintesquímicos de G. Iucidum por percentual do peso de massa secoestá listado nas Tabelas 1 e 2. Uma das características docorpo de frutificação de G. Iucidum é seu gosto amargo quevaria em grau, dependendo da cepa, método de cultivo, idadee de vários outros fatores. Os constituintes químicos queformam esse gosto amargo são os triterpenos, e eles têmsido usados como um marcador para avaliação farmacológicados produtos de extração. Os dois outros constituintesquímicos fisiológica e medicamente ativos principaisconhecidos das espécies de ganoderma são os triterpenos eos polissacarídeos.

Tabela 1. Constituintes químicos de G. Iucidum com base naliteratura.

Bioativos principais * % do peso seco

Compostos químicos voláteis/de óleo essencial 2-8%

Terpenóides *

Triterpenos* (T) (>100 triterpenóides do tipolanostano altamente oxigenados)

Ácidos ganodéricos (GA) A, B, C, Cl, C2, D.... T

Ácidos lucidênicos (LA) A, B, C, C2, D, Di, Κ, E,El, F, G, Η, I, J, K

Ácidos ganolucídicos (GLA) C,DGanoderióis (G)Lucidona (LC) A, DLucidumóis (LCM) A, BGanodermenonol (G)Ganodermadiol (GD)Ganodermatriol (GT)Ganodermanondiol (GDD)Ganodermanontriol (GDT)

EsteróidesVitaminasFenóisNucleotídeosProteínas (Pr) 7-8%

Glocoprotexnas

Carboidratos 26-28%

Polissacarídeos * (P)

(Heteropolímeros-glicose, xilose, manose, galactose,fucose etc.)

(β-D-glucanas, particularmente β-(1—»3)-D-glucanas)

Ganoderans A, B & C

Fibra 32-59%

Cinza 8-10%

Minerais 10,2%

Germânio (Ge) (489 pg/g)

Tabela 2. Composição química do corpo da matéria-prima defruta de ganoderma lucidum usada na presente invenção.

Substâncias químicas * Cogiimelo GL

Voláteis (%) 1,2

Triterpenóide (%) 0,9

Polissacarídeo (%) 1,59

Proteína (%)

* O óleo volátil foi estimado pelo maior rendimento deextração de CO2 a 70°C e 50 MPa. Os triterpenóides foramestimados por extração máxima de metanol. O polissacarídeoe a proteína foram estimados por extrato aquoso.

Os terpenos são uma classe de compostos de ocorrêncianatural. Seus esqueletos de carbono são compostos porunidades de isopreno C5. Muitos são alcanos, mas podemconter outros grupos funcionais, e muitos são cíclicos.Verificou-se que alguns dos terpenos botânicos possuempropriedades como, por exemplo, atividade antiinflamatória,anticâncer, hipolipidêmica e outras atividades que promovema saúde. Os triterpenos são uma subclasse dos terpenos, epossuem um esqueleto básico de C30. Nas espécies deganoderma, a estrutura química dos triterpenos se baseia emlanostano, um metabólito de lanosterol cuja biossíntese sebaseia na ciclização de esqualeno. A extração dostriterpenos de espécies de ganoderma é geralmente feita porextração de solvente com o uso de metanol, etanol, acetona,clorofórmio, éter, ou uma mistura desses solventes. Foirelatado que mais de 100 triterpenos com composição químicae configuração molecular conhecidas ocorrem em espécies deganoderma. Dentre eles, a maioria é considerada exclusivadas espécies de ganoderma. A grande maioria dos triterpenosde ganoderma é de ácidos ganodéricos e lucidênicos, masoutros triterpenos, por exemplo, ácidos ganoderais,ganoderióis e ganodérmicos, também foram identificados.

Há relatos de que polissacarídeos botânicos dediversas plantas possuem efeitos de aumento do sistemaimune, antiinflamatórios, antiúlcera, antivirais eanticâncer. As espécies de ganoderma são notáveis porproduzirem diversos polissacarídeos de alto peso molecular.Esses poliglicanos são encontrados em todas as partes docogumelo, bem como em todos os estágios de desenvolvimento.Os polissacarídeos de espécies de ganoderma foram extraídosdo corpo da fruta, micélios e esporos. Além disso, exo-polissacarídeos são produzidos por micélios crescidos emfermentadores. A glicose é o principal açúcar empolissacarídeos de espécies de ganoderma. Espécies deganoderma, no entanto, são heteropolímeros que tambémcontêm xilose, manose e fucose em diferentes configurações,incluindo polissacarídeos beta ligados em 1-3, 1-4, 1-6 ealfa-D (ou L)-. Polissacarídeos são normalmente extraídoscom água quente seguida por precipitação com álcool. Elestambém podem ser extraídos com água quente e base alcalina.Etapas de purificação complexas podem resultar em compostospolissacarídicos purificados como, por exemplo, o polímerode glicose GL-I (glicose 98%) . Compostos polissacarídicosque foram isolados e parcialmente caracterizados deespécies de ganoderma incluem as Ganoderans A, B e C. Maisrecentemente, foram isolados outros compostospolissacarídicos de espécies de ganoderma. Alguns dessescompostos polissacarídicos demonstraram ter atividades deestimulação imunológica e anticâncer significativas.

Também há relatos de que proteínas de espécies deganoderma, que estão em menores quantidades do que outrosfungos, também contribuem para a atividade medicinal dosconstituintes químicos de espécies de ganoderma. Porexemplo, proteínas de espécies de ganoderma podem exibiratividade imunossupressora.

Nas substâncias botânicas medicinalmente maisvaliosas, o óleo volátil e os constituintes químicos doóleo essencial contribuem significativamente para abioatividade dos constituintes químicos da planta. Noentanto, esses constituintes químicos do Ganoderma parecemter sido ignorados na literatura científica.

A combinação de supostos benefícios para a saúde, semtoxicidade, torna os constituintes químicos de espécies deganoderma desejáveis para o desenvolvimento de extraçõesterapêuticas eficazes. Embora extratos de espécies deganoderma venham sendo usados por milhares de anos comotratamento para várias enfermidades, somente nos últimosanos foram realizados estudos científicos objetivos deextratos e constituintes químicos de espécies de ganoderma.Para resumir brevemente os benefícios terapêuticos dosconstituintes químicos de espécies de ganoderma, estudoscientíficos laboratoriais e clínicos recentes demonstraramos seguintes efeitos terapêuticos de vários compostosquímicos, frações químicas e produtos de extraçãogrosseiros de espécies de ganoderma, particularmente G.lucidum, incluindo os seguintes: reforço imunológico (P,Pr, extrato aquoso - para abreviação, veja a Tabela 1) [1-4] : imunossupressão, anti-rejeição de transplantes,distúrbios autoimunes (Pr) [5,6]: antiinflamatórios,antiartrite, anti-reumatóide, anti-lúpus eritematoso,antialérgicos (T, GA, extrato de acetato de etila, extratoalcoólico, extrato aquoso) [7-10] ; antioxidante (Τ, P-T+Patuam sinergicamente, extrato de solvente orgânico, extratoaquoso) [9,11,12]; antiagregação plaquetária (GA, extratohidrossolúvel) [13, 14]; hipoglicêmicos, antidiabéticos (P-Ganoderans A, B e C, extrato) [9,15]; anti-hipertensivos(extrato hidrossolúvel, insolúvel em etanol, extrato bruto)[16,17]; antihipercolesterolemia (triterpenos, extratobruto) [18] ; prevenção de doenças cardiovasculares (Τ, P,extrato bruto) [5-18] ; hepatoproteção (T, GA, P, extratosaquosos e água-éter) [19,20]; terapia antiviral, anti-herpes simples, anti-HIV, anti-herpes zoster, anti-hepatiteB (polissacarídeos ligados à P-proteína, T, extratoshidrossolúveis e solúveis em álcool) [21-24]; atividadeantibacteriana (Τ, P, extratos hidrossolúveis e solúveis emálcool) [9,25]; e prevenção e tratamento do câncer (Ρ, T,extrato em água quente e álcool ) [9, 26-28].Há necessidade de extratos de ganoderma inéditos ereprodutíveis que combinem constituintes químicos de óleoessencial purificado, triterpeno, proteína e

polissacarídeo, que possam ser produzidos com quantidadespadronizadas e confiáveis desses constituintes químicosfisiológica e medicamente benéficos de espécies deganoderma que atuam sinergicamente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção está relacionada aum extrato de espécies de ganoderma que compreende umafração que possui um cromatograma de espectrometria demassa por Análise Direta em Tempo Real (DART) de qualqueruma das Figuras 6 a 29. Em uma modalidade adicional, oextrato compreende um composto selecionado do grupo queconsiste em um óleo essencial, um triterpeno, umpolissacarídeo, e combinações destes.

Em uma modalidade adicional, o óleo essencial éselecionado do grupo que consiste em ácido 9,12-octadecadienóico, ácido linoelaídico, ácido n-hexadecanóico, ácido octoanóico, ácido tetradecanóico,ácido pentadecanóico, ácido 9-octadecenóico, ácidooctadecanóico, ácido 2-propenóico, éster tridecílico, 1-undecanol, 1-dodecanol, 1-tetradecanol, 1-hexadecanol, 1-heptadecanol, 1-eicosanol, e combinações destes. Em umamodalidade adicional, a quantidade de óleo essencial émaior do que 8% por peso. Em uma modalidade adicional, aquantidade de óleo essencial é de 25% a 90% por peso. Emuma modalidade adicional, a quantidade de óleo essencial éde 50% a 90% por peso. Em uma modalidade adicional, aquantidade de óleo essencial é de 75% a 90% por peso.Em uma modalidade adicional, o triterpeno éselecionado do grupo que consiste em ácido ganodérico,ácido lucidênico, ácido ganolucídico, ganoderiol, lucidona,lucidumol, ganodermenonol, ganodermadiol, ganodermatriol,ganodermanondiol, ganodermanontriol, e combinações destes.Em uma modalidade adicional, a quantidade de triterpeno émaior do que 2% por peso. Em uma modalidade adicional, aquantidade de triterpeno é de 25% a 90% por peso. Em umamodalidade adicional, a quantidade de triterpeno é de 50% a90% por peso. Em uma modalidade adicional, a quantidade detriterpeno é de 75% a 90% por peso.

Em uma modalidade adicional, o polissacarídeo éselecionado do grupo que consiste em glicose, arabinose,galactose, ramnose, xilose, ácido urônico e combinaçõesdestes. Em uma modalidade adicional, a quantidade depolissacarídeo é maior do que 15% por peso. Em umamodalidade adicional, a quantidade de polissacarídeo é de25% a 90% por peso. Em uma modalidade adicional, aquantidade de polissacarídeo é de 50% a 90% por peso. Emuma modalidade adicional, a quantidade de polissacarídeo éde 75% a 90% por peso.

Em uma modalidade adicional, o extrato compreende umóleo essencial de 2% a 99% por peso, um triterpeno de 5% a88% por peso e um polissacarídeo de 2% a 95% por peso.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um alimento ou medicamento que compreende um extrato deespécies de ganoderma da presente invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um método de preparação de um extrato de espécies deganoderma que possui pelo menos uma característicapredeterminada, que compreende a extração seqüencial de ummaterial de planta de espécies de ganoderma para gerar umafração de óleo essencial, uma fração de triterpeno e umafração de polissacarideo por: a) extração de um material deplanta de espécies de ganoderma por extração de dióxido decarbono supercrítico para gerar uma fração de óleoessencial e um primeiro resíduo; b) extração do primeiroresíduo da etapa (a) por extração alcoólica para gerar afração de triterpeno e um segundo resíduo; e c) extração dosegundo resíduo da etapa (b) por extração com água eprecipitação do polissacarideo com álcool para gerar afração de polissacarideo.

Em uma modalidade adicional, a etapa (a) compreende:1) carregamento em um vaso de extração de material deplanta triturado de espécies de ganoderma; 2) adição dedióxido de carbono sob condições supercríticas; 3) contatodo material de planta de espécies de ganoderma e do dióxidode carbono por um período de tempo; e 4) coleta de umafração de óleo essencial em um vaso de coleta. Em umamodalidade adicional, o método ainda compreende a etapa dealteração das proporções de composto químico de óleoessencial por fracionamento da fraçao de óleo essencial comum sistema de separação fracionária supercrítica de dióxidode carbono. Em uma modalidade adicional, as condiçõessupercríticas compreendem 6 MPa a 80 MPa de pressão a 35°Ca 90°C. Em uma modalidade adicional, as condiçõessupercríticas compreendem 6 MPa a 50 MPa de pressão a 400Ca 8 0°C. Em uma modalidade adicional, o tempo é de 3 0minutos a 2,5 horas. Em uma modalidade adicional, o tempo éde 1 hora.Em uma modalidade adicional, a etapa (b) compreende:1) contato do primeiro resíduo da etapa (a) com um solventealcoólico por um período de tempo suficiente para extrairconstituintes químicos de triterpeno; 2) purificação dosconstituintes químicos de triterpeno com o uso de processosde extração de solvente 1íquido-líquido. Em uma modalidadeadicional, um solvente é clorofórmio e o outro solvente éuma solução aquosa saturada de NaHCO3. Em uma modalidadeadicional, o solvente alcoólico é etanol. Em uma modalidadeadicional, a etapa (1) é realizada a 30°C a 100°C. Em umamodalidade adicional, a etapa (1) é realizada a 60°C a100°C. Em uma modalidade adicional, o tempo é de 1-10horas. Em uma modalidade adicional, o tempo é de 1-5 horas.Em uma modalidade adicional, o tempo é de 2 horas.

Em uma modalidade adicional, a etapa (c) compreende:1) contato do material de planta de espécies de ganodermaou do segundo resíduo da etapa (b) com água, por um períodode tempo suficiente para extrair polissacarídeos; e 2)precipitação dos polissacarídeos da solução de água porprecipitação com álcool. Em uma modalidade adicional, aágua está a 70°C a 90°C. Em uma modalidade adicional, aágua está a 80°C a 90°C. Em uma modalidade adicional, otempo é de 1-5 horas. Em uma modalidade adicional, o tempoé de 2-4 horas. Em uma modalidade adicional, o tempo é de 2horas. Em uma modalidade adicional, o álcool é etanol.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de ganoderma preparado pelosmétodos da presente invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de ganoderma que compreendeergosterol, ácido ganolucídico A de 25 a 35% por peso doergosterol, ácido ganolucídico B de 10 a 20% por peso doergosterol, e ácido ganodérico H de 3 0 a 4 0% por peso doergosterol.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de ganoderma que compreende ácidoganodérico H e ácido ganolucídico A de 25 a 35% por peso doácido ganodérico H.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de ganoderma que compreende ácidoganodérico H, ácido lucidênico B de 5 a 15% por peso doácido ganodérico H, ácidos lucidênicos A/N de 1 a 10% porpeso do ácido ganodérico H, e ácido ganolucídico A de 35 a45% por peso do ácido ganodérico H.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de ganoderma que compreende ácidoganodérico H e ganoderal de 5 a 15% por peso do ácidoganodérico H.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de ganoderma que compreende ácidoganodérico H, ácido ganolucídico A de 35 a 45% por peso doácido ganodérico H, ácido ganolucídico B de 10 a 20% porpeso do ácido ganodérico H, e cerevisterol de 30 a 40% porpeso do ácido ganodérico H.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de ganoderma que compreende ácidoganodérico H, ácido ganolucídico B de 10 a 20% por peso doácido ganodérico H, e ganoderal de 5 a 15% por peso doácido ganodérico H.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de ganoderma que compreende ácidoganodérico H, ácido ganolucídico B de 10 a 20% por peso doácido ganodérico H, metoxicerevisterol de 20 a 30% por pesodo ácido ganodérico H, e cerevisterol de 20 a 30% por pesodo ácido ganodérico H.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de ganoderma que compreendeergosterol, ácido ganolucídico A de 30 a 40% por peso doergosterol, ácido ganolucídico B de 5 a 15% por peso doergosterol, e ácido ganodérico H de 65 a 75% por peso doergosterol.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de ganoderma que compreende ácidoganodérico H, ácido ganolucídico B de 30 a 40% por peso doácido ganodérico H, metoxicerevisterol de 40 a 50% por pesodo ácido ganodérico H, e cerevisterol de 35 a 45% por pesodo ácido ganodérico H.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de ganoderma que compreendeergosterol, ácidos ganolucídicos A/B de 1 a 10% por peso doergosterol, ganoderiol F de 1 a 10% por peso do ergosterol,e lanosterol de 50 a 60% por peso do ergosterol.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de ganoderma que compreende ácidoganodérico H, ácido ganolucídico A de 60 a 70% por peso doácido ganodérico H, ácido ganolucídico B de 25 a 35% porpeso do ácido ganodérico H, e ácidos lucidênicos A/N de 10a 20% por peso do ácido ganodérico H.

As extrações da presente invenção são úteis nofornecimento de efeitos fisiológi cos e médicos que incluem,sem limitação, aumento imunológico, imunossupressão e anti-rejeição de transplantes, atividade antioxidante, atividadeantiinflamatória, atividade antiartrite, anti-reumatóide,anti-doença autoimune, atividade antialérgica,antiagregação plaquetária, hipoglicêmica e anti-diabetes,atividade anti-hipertensiva, antihipercolesterolemia,prevenção de doença cardiovascular e acidente vascularcerebral, atividade antimutagênica (prevenção do câncer),atividade anticarcinogênica (terapia do câncer), atividadeantiviral, anti-HIV, anti-herpes simples, anti-herpeszoster, anti-hepatite B, atividade antibacteriana ehepatoprotetora e tratamento para cirrose.

Essas modalidades da especificação, outras modalidadese seus recursos e características, ficarão evidentes apartir da descrição, desenhos e reivindicações que serãoapresentados a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 descreve um método exemplar para apreparação da fração de óleo essencial.

A Figura 2 descreve um método exemplar para realizar aextração por lixiviação de etanol.

A Figura 3 descreve um método exemplar parapurificação da fração de triterpeno.

A Figura 4 descreve um método exemplar parapurificação da fração de triterpeno.

A Figura 5 descreve um método exemplar para o processode lixiviação de água e precipitação de polissacarideo.

A Figura 6 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara fração de polissacarideo de ganoderma da etapa 6 dospresentes métodos (modo íon positivo).A Figura 7 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara fração de polissacarídeo de ganoderma da etapa 6 dospresentes métodos (modo íon negativo).

A Figura 8 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara ganoderma extrato da fruta jovem de lingzhi vermelho(modo íon positivo).

A Figura 9 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o óleo essencial de ganoderma extraído por métodos deSCCO2 a 40°C e 30 MPa (modo íon positivo).

A Figura 10 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o óleo essencial de ganoderma extraído por métodos deSCCO2 a 40°C e 50 MPa (modo íon positivo).

A Figura 11 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o óleo essencial de ganoderma extraído por métodos deSCCO2 a 700C e 50 MPa (modo íon positivo).

A Figura 12 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o óleo essencial de ganoderma extraído por métodos deSCCO2 a 800C e 10 MPa (modo íon positivo).

A Figura 13 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o óleo essencial de ganoderma extraído por métodos deSCCO2 a 800C e 30 MPa (modo íon positivo) .

A Figura 14 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o óleo essencial de ganoderma extraído por métodos deSCCO2 a 40°C e 30 MPa (modo íon positivo).

A Figura 15 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o óleo essencial de ganoderma extraído por métodos deSCCO2 a 700C e 50 MPa (modo íon positivo) .

A Figura 16 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o óleo essencial de ganoderma extraído por métodos deSCCO2 a 700C e 10 MPa (modo íon positivo).A Figura 17 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o extrato bruto de etanol de ganoderma (triterpenóidebruto) da fruta jovem de lingzhi vermelho (modo íonpositivo).

A Figura 18 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara final triterpenóide da fruta jovem de lingzhi vermelho(modo íon positivo).

A Figura 19 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara ganoderma extrato da fruta jovem de lingzhi vermelho(modo íon negativo).

A Figura 20 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o óleo essencial de ganoderma extraído por métodos deSCCO2 a 40°C e 30 MPa (modo íon negativo).

A Figura 21 descreve o Espectro de Massa Ac cuTOF-DARTpara o óleo essencial de ganoderma extraído por métodos deSCCO2 a 40°C e 50 MPa (modo íon negativo).

A Figura 22 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o óleo essencial de ganoderma extraído por métodos deSCCO2 a 70°C e 50 MPa (modo íon negativo).

A Figura 23 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DART

para o óleo essencial de ganoderma extraído por métodos deSCCO2 a 80°C e 10 MPa (modo íon negativo).

A Figura 24 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o óleo essencial de ganoderma extraído por métodos deSCCO2 a 80°C e 30 MPa (modo íon negativo) .

A Figura 25 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o óleo essencial de ganoderma extraído por métodos deSCCO2 a 40°C e 30 MPa (modo íon negativo) .

A Figura 2 6 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o óleo essencial de ganoderma extraído por métodos deSCCO2 a 700C e 50 MPa (modo íon negativo).

A Figura 27 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o óleo essencial de ganoderma extraído por métodos deSCCO2 a 700C e 10 MPa (modo íon negativo).

A Figura 28 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o extrato bruto de etanol de ganoderma (triterpenóidebruto) da fruta jovem de lingzhi vermelho (modo íonnegativo).

A Figura 29 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara triterpenóide final da fruta jovem de lingzhi vermelho(modo íon negativo).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições

Os artigos "um" e "uma" são aqui usados para sereferir a um ou a mais de um (ou seja, a pelo menos um) dosobjetos gramaticais do artigo. Como exemplo, "um elemento"significa um elemento ou mais de um elemento.

0 termo "espécies de ganoderma" também é usado deforma intercambiável com lingzhi, reichi ou mannentake, esignifica essas plantas, clones, variantes e cepas etc.

Como aqui usado, o termo "um ou mais compostos" visasignificar menos um composto, por exemplo, 1-heptadecanol(um constituinte químico lipídico solúvel do óleo essencialde espécies de ganoderma) ou ácido ganodérico (umtriterpeno hidrossolúvel e solúvel em etanol de espécies deganoderma) ou uma molécula de polissacarídeo hidrossolúvelou solúvel em etanol de espécies de ganoderma como, porexemplo, sem limitação, Ganoderan A, ou representa mais deum composto, por exemplo, 1-heptadecanol e ácido ganodéricoA. Como conhecido na técnica, o termo "composto" nãosignifica uma única molécula, mas múltiplos ou moles de umou mais composto. Como conhecido na técnica, o termo"composto" significa um constituinte químico específico quepossui propriedades químicas e físicas distintas, enquanto"compostos" referem-se a um ou mais constituintes químicos.

Como aqui usado, o termo "fração" significa a extraçãoque compreende um grupo específico de compostos químicoscaracterizados por certas propriedades físico-químicas oupropriedades físicas ou químicas.

Como aqui usado, o termo fração de óleo essencialcompreende compostos lipossolúveis, não hidrossolúveis,obtidos ou derivados de espécies de ganoderma que incluem,sem limitação, os compostos químicos classificados como 1-heptadecanol, ácido 2-propenóico, éster tridecílico, ácidon-hexadecanóico, (Z)-9-octadecen-l-ol, 1-eicosanol, (Z,Z)-ácido 9,12-octadecadienóico e ácido linoelaídico.

Como aqui usado, o termo "fração de triterpeno"compreende os compostos de triterpeno hidrossolúveis esolúveis em etanol obtidos ou derivados de espécies deganoderma, que compreendem ainda, sem limitação, compostoscomo, por exemplo, ácidos ganodéricos, ácidos lucidênicos,ácidos ganolucídicos, ganoderióis, lucidona eganodermatriol.

Como aqui usado, o termo "fração de polissacarídeo"compreende compostos polissacarídicos hidrossolúveis einsolúveis em etanol obtidos ou derivados de espécies deganoderma.

Outros constituintes químicos de espécies de ganodermatambém podem estar presentes nessas frações de extração.

Como aqui usado, o termo fração "purificada" significauma fração que compreende um grupo específico de compostoscaracterizados por certas propriedades físico-químicas oupropriedades físicas ou químicas que estão concentradas amais de 50% dos constituintes químicos da fração. Em outraspalavras, uma fração purificada compreende menos de 50% decompostos químicos constituintes que não são caracterizadospor certas propriedades físico-químicas ou propriedadesfísicas ou químicas desejadas que definem a fração.

Como aqui usado, o termo "perfil" refere-se àsproporções por percentual de peso de massa dos compostosquímicos dentro de uma fração de extração ou às proporçõesdo percentual do peso de massa de cada um dos trêsconstituintes químicos da fração de espécies de ganodermaem uma extração final de espécies de ganoderma.

Como aqui usado, "matéria-prima" refere-se geralmentea uma matéria-prima de planta que compreende plantasinteiras isoladamente ou em combinação uma em ou maispartes constituintes ou estágios de uma planta quecompreende corpos de frutas, micélios e esporos, em que aplanta ou as partes constituintes podem compreendermaterial que é bruto, seco, cozido, aquecido ou de algumoutro modo submetido a processamento físico para facilitaro processamento, que pode ainda compreender material queesteja intacto, cortado, picado, cortado em cubos,triturado, moído ou de algum outro modo processado paraafetar o tamanho e a integridade física do material deplanta. Ocasionalmente, o termo "matéria-prima" pode serusado para caracterizar um produto de extração que deve serusado como fonte de alimentação para processos de extraçãoadicionais.Como aqui usado, o termo "constituintes de espécies deganoderma" significa compostos químicos encontrados emespécies de ganoderma e inclui todos os compostos químicosidentificados acima, além de outros compostos encontradosem espécies de ganoderma, incluindo, sem limitação, osconstituintes químicos do óleo essencial, triterpenos,proteínas e polissacarídeos.Extrações

A presente invenção compreende extrações quecompreendem uma ou mais frações de constituintes químicosencontradas em ganoderma e em espécies relacionadas. Ainvenção também compreende produtos passíveis de ingestãoque compreendem as extrações que compreendem extrações deganoderma e de espécies relacionadas aqui ensinadas. Porexemplo, a presente invenção compreende extrações quecompreendem um comprimido de dissolução rápida, quecompreende um extrato de ganoderma ou de espéciesrelacionadas, em que pelo menos uma de uma fração de óleoessencial, uma subfração de óleo essencial, uma fração detriterpeno ou uma fração de polissacarídeo foisubstancialmente aumentada na quantidade do percentual dopeso em relação à quantidade do percentual de pesoencontrada no material de planta nativo ou àquelaatualmente encontrada em extratos conhecidos de espécies deganode rma.

Fração de óleo essencial

Óleo essencial de ganoderma com pureza acima de 95%foi extraído por técnicas de extração de dióxido de carbonosupercrítico (SCCO2) . Constatou-se que o maior rendimentode extração era de 1,22% em uma temperatura de 70 0C epressão de 50 MPa. Foi identificado um total de 75compostos com o uso de análise por cromatografia a gás-espectroscopia de massa (GC-MS). Os principais compostosencontrados no óleo essencial de ganoderma são ácidosgraxos C11-C20. Os mais abundantes são ácido graxo C18,ácido 9,12-octadecadienóico (Z,Z)-(CAS: 60-33-3) (composto59) e ácido linoelaídico, (E,Z)-Isomero (composto 60),ambos estereoisômeros. Ácido linoelaídico, (Ε,Z)-Isômero, éum ácido graxo duplamente insaturado que ocorre amplamenteem glicosídeos de plantas. Ele é um ácido graxo essencialna nutrição de mamíferos e é usado na biossíntese deprostaglandinas e de membranas celulares.

O segundo composto mais abundante é o ácido n-hexadecanóico de ácido graxo saturado (CAS: 57-10-3)(composto 46). Outros ácidos graxos incluem: ácidooctoanóico (C8H1602, CAS: 124-07-2), ácido tetradecanóico(C14H2802, CAS: 544-63-8), ácido pentadecanóico (C15H30O2,CAS: 1002-84-2), 9-Octadecenóico (Ci8H34O2, CAS: 112-80-1) eácido octadecanóico (C18H36O2, CAS: 57-11-4).

O segundo grupo principal de compostos são os alcoóis,que incluem: 1-undecanol (C11H24O, CAS: 112-42-5), 1-dodecanol (C12H26O, CAS: 112-53-8), 1-tetradecanol (C14H30O,CAS: 112-72-1), I-Hexadecanol (C16H34O, CAS: 36653-82-4), 1-Heptadecanol (C17H36O, CAS: 1454-85-9) e I-Eicosanol(C20H42O, CAS: 629-96-9) e outros. Esses alcoóis alifáticospermanecem inalterados e não se transformaram em ésteres.

Com o uso da extração de dióxido de carbonosupercrítico, foi definido o perfil da química do óleoessencial de ganoderma, e os resultados resumidos sãomostrados na Tabela 3.Tabela 3. Perfil químico do óleo essencial de ganodermaobtido em diferentes condições de SCCO2.

<table>table see original document page 24</column></row><table>

0 perfil dos ácidos graxos pode ser definido entre 54%e 85%. Nos ácidos graxos totais, o composto 59, ácido 9,12-octadecadienóico (Z,Z), e o composto 60, ácidolinoelaídico, são responsáveis por 75%-95% por peso demassa. 0 perfil dos alcoóis pode ser definido entre 10% e36%. Com relação aos compostos menores presentes no óleoessencial de ganoderma, o perfil dos ésteres pode serdefinido entre 2,5% e 6%, e dos aldeídos definido entre0,37% e 2,55%. Concentrações maiores de ácidos graxos podemser obtidas com uma pressão maior, e concentrações maioresde alcoóis graxos podem ser obtidas em uma pressão menor de10 MPa e uma temperatura maior de 80°C.

Fração de triterpeno

Os triterpenos de ganoderma foram extraídos com o usode etanol, e purificados por purificação líquido-líquidoutilizando-se a mudança de solubilidade entre ácidos detriterpeno e seus sais por mudança de pH. Na fraçãopurificada final de triterpeno, a pureza total dostriterpenos aumentou para 87,5% de 0,6% na matéria-prima e19,9% em extratos brutos de etanol. Três padrões dereferência de HPLC de triterpeno comercialmentedisponíveis, ácido ganodérico A, ácido ganodérico F eganodermadiol, só constituíam aproximadamente 4% nostriterpenos totais de ganoderma.Fração de polissacarídeo

Os polissacarídeos de ganoderma foram extraídos porágua destilada, e precipitados por etanol 60-80%. 0rendimento foi de l,5%-2%. A pureza de polissacarídeos combase em padrões de referência de dextrana é de 50%-80%,dependendo dos diferentes pesos moleculares da dextrana. 0peso molecular médio de polissacarídeo-glicoproteínaprecipitado foi de 953.377, que é composto por diferentespesos moleculares de polissacarídeos e glicoproteínas deganoderma, nos quais 51% eram polissacarídeos eglicoproteínas com pesos moleculares elevados de 1,6 M. Ospolissacarídeos-glicoproteínas precipitados também foramcaracterizados por espectro de massa Accu-TOF DART. Osespectros são mostrados nas Figuras 6 e 7.

Uma modalidade dessas extrações compreendeconcentrações predeterminadas das frações extraídas epurificadas de constituintes químicos, em que os perfis(proporções) de concentração da fração de óleoessencial/fração de triterpeno, fração de óleoessencial/fração de polissacarídeo e fração detriterpeno/fração de polissacarídeo de espécies deganoderma (% do peso seco) são maiores ou menores do queaqueles encontrados no material seco de planta natural ouem produtos convencionais de extração de espécies deganoderma. A alteração dos relacionamentos de concentração(perfis químicos) dos constituintes químicos benéficos dasespécies de ganoderma individuais permite a formulação deprodutos únicos ou inéditos de extrato de espécies deganoderma projetados para condições ou enfermidades humanasespecíficas. Por exemplo, uma extração de ganoderma inéditae poderosa para reforço imunológico poderia ter uma fraçãopurificada maior de polissacarídeo e uma fração reduzida deóleo essencial e da fração de triterpeno por % de peso demassa do que aquela encontrada no material de planta nativoou produtos de extração convencionais conhecidos deganoderma. Em contraste, uma nova extração de ganodermapara atividade antiviral e atividade antigripal poderia teruma fração purificada maior de triterpeno e de uma fraçãopurificada de polissacarídeo e uma fração reduzida de óleoessencial por % de peso de massa do que aquela encontradano material de planta nativo ou produtos de extraçãoconvencionais conhecidos de ganoderma. Outro exemplo de umnovo perfil de extração de ganoderma para atividadeantiinflamatória poderia ter um perfil de extração com umafração purificada maior de óleo essencial, da fraçãopurificada de triterpeno e da fração purificada depolissacarídeo do que aquele encontrado em material deplanta nativo de ganoderma ou em produtos de extraçãoconvencionais conhecidos de ganoderma.

Uma modalidade adicional da invenção consiste emextrações que compreendem novas subfrações dosconstituintes químicos do óleo essencial, em que aconcentração de grupos químicos específicos como, porexemplo, sem limitação, alcoóis ou ácidos graxos, possuemsuas respectivas concentrações de aumentadas paradiminuídas em novos produtos de extração.Extrações em relação ao ganoderma natural

As modalidades compreendem extrações de ganoderma eespécies relacionadas que possuem pelo menos umaconcentração de um óleo essencial, de triterpeno ou depolissacarídeo que seja em uma quantidade acima daquelaencontrada no material de planta nativo de ganoderma e deespécies relacionadas ou em produtos de extratos atualmentedisponíveis de espécies de ganoderma. As modalidades tambémcompreendem extrações nas quais uma ou mais das frações,incluindo óleos essenciais, triterpenos ou polissacarídeos,são encontradas em uma concentração que é maior do queaquela encontrada no material de planta nativo de espéciesde ganoderma. As modalidades também compreendem extraçõesnas quais uma ou mais das frações, incluindo óleosessenciais, triterpenos ou polissacarídeos, são encontradasem uma concentração que é menor do que aquela encontrada emespécies nativas de ganoderma. Quantidades conhecidas dasfrações do constituinte químico bioativo das espécies deganoderma (Tabela 1) são usadas como um exemplo da presenteinvenção. Por exemplo, as extrações da presente invençãocompreendem frações nas quais a concentração de óleosessenciais é de 0,001 a 80 vezes a concentração de espéciesnativas de ganoderma e/ou frações nas quais a concentraçãode triterpenos é de 0,001 a 100 vezes a concentração deespécies nativas de ganoderma e/ou frações nas quais aconcentração de polissacarídeos é de 0,001 a 70 vezes aconcentração de espécies nativas de ganoderma. Extrações dapresente invenção compreendem frações nas quais aconcentração de óleos essenciais é de 0,01 a 80 vezes aconcentração de espécies nativas de ganoderma e/ou fraçõesnas quais a concentração de triterpenos é de 0,01 a 100vezes a concentração de espécies nativas de ganoderma e/oufrações nas quais a concentração de polissacarídeos é de0,01 a 70 vezes a concentração de espécies nativas deganoderma. Além disso, as extrações da presente invençãocompreendem subfrações dos constituintes químicos do óleoessencial que possuem pelo menos um ou mais dos compostosquímicos presentes no óleo essencial do material de plantanativo que está em uma quantidade maior ou menor do queaquela encontrada em constituintes químicos do óleoessencial do material de planta nativo de ganoderma. Porexemplo, o éster, ácido 2-propenóico, éster tridecílico,podem ter sua faixa de concentração de 0,22-2,53% por pesode massa de uma subfração de óleo essencial, dependendo dascondições de extração por SCCO2, uma faixa de aumento de 12vezes na concentração. Em contraste, ácido graxo, ácido n-hexadecanóico, pode ter sua faixa de concentração de 4,00-9,86 por peso de massa em uma subfração de óleo essencial,uma faixa de aumento de 2,5 vezes na concentração. Alémdisso, as proporções desses dois compostos do óleoessencial podem variar de 1/15-1/3. Como documentado naTabela 3, diferentes subfrações de óleo essencial podemconter constituintes químicos e proporções de constituintesquímicos amplamente diferentes. As extrações da presenteinvenção compreendem frações nas quais a concentração decompostos químicos específicos nessas novas subfrações deóleo essencial está aumentada em cerca de 1,1 a cerca de 6vezes, ou diminuída em cerca de 0,1 a cerca de 6 vezesaquela concentração encontrada nos constituintes químicosdo óleo essencial de ganoderma nativo.

Por exemplo, as extrações da presente invençãocompreendem frações nas quais a concentração dosconstituintes químicos do óleo essencial é de 0,001 a 100vezes a concentração de material de planta nativo deganoderma e/ou frações nas quais a concentração detriterpenos é de 0,0001 a 100 vezes a concentração dematerial de planta nativo de ganoderma e/ou a depolissacarídeos é de 0,001 a 100 vezes a concentração dematerial de planta nativo de ganoderma. Na produção de umaextração combinada, podem ser usados de cerca de 0,001 mg acerca de 200 mg de uma fração de óleo essencial.

Adicionalmente, podem ser usados de cerca de 0,001 mg acerca de 500 mg de uma fração de triterpeno. Além disso,podem ser usados de cerca de 0,001 mg a cerca de 500 mg dafração hidrossolúvel e insolúvel em etanol depolissacarídeo.

Métodos de extração

Os métodos da presente invenção compreendem ofornecimento de novas extrações de ganoderma para otratamento e a prevenção de distúrbios humanos. Porexemplo, uma nova extração de espécies de ganoderma paraatividade de reforço imunológico pode ter uma concentraçãoaumentada da fração de polissacarídeo e concentraçõesreduzidas da fração de óleo essencial e de triterpeno, por% do peso, do que aquelas encontradas no material de plantanativo de espécies de ganoderma ou em produtos de extraçãoconvencionais conhecidos. Uma nova extração de espécies deganoderma para a prevenção e o tratamento de doenças viraispode ter uma fração aumentada de triterpeno e depolissacarídeo e uma fração reduzida de óleo essencial, por% do peso, do que aquelas encontradas no material de plantanativo de espécies de ganoderma ou em produtos de extraçãoconvencionais conhecidos. Outro exemplo de uma novaextração de espécies de ganoderma para a prevenção e otratamento de câncer compreende uma fração que possui umaconcentração aumentada da fração de triterpeno, uma fraçãoaumentada de polissacarídeo e uma fração aumentada de óleoessencial do que aquelas encontradas no material de plantanativo de espécies de ganoderma ou em produtos de extraçãoconvencionais conhecidos.

Modalidades adicionais compreendem extrações quecompreendem perfis alterados (distribuição de proporção)dos constituintes químicos das espécies de ganoderma emrelação àqueles encontrados no material de planta nativo ouem produtos de extratos atualmente disponíveis de espéciesde ganoderma. Por exemplo, a fração de óleo essencial podeestar aumentada ou diminuída em relação às concentrações detriterpeno e/ou polissacarídeo. Similarmente, ostriterpenos ou polissacarídeos podem estar aumentados oudiminuídos em relação às outras frações constituintes doextrato para permitir extrações com novo perfil deconstituintes químicos para efeitos biológicos específicos.

Os métodos a seguir, da forma ensinada, podem serusados individualmente ou em combinação com o método oumétodos revelados conhecidos por aqueles habilitados natécnica.

0 material de partida para extração é o material deplanta de uma ou mais espécies de ganoderma. O material deplanta pode ser qualquer porção da planta, embora o corpoda fruta ou os micélios sejam o material de partida maispreferido.

O material de planta de espécies de ganoderma pode sersubmetido a etapas de pré-extração para fazer com que omaterial fique em qualquer forma em particular, e qualquerforma que seja útil para extração é contemplada pelapresente invenção. Tais etapas de pré-extração incluem, semlimitação, aquela em que o material é picado, triturado,fragmentado, moldo, pulverizado, cortado ou rasgado, e omaterial de partida, antes das etapas de pré-extração, ématerial de planta seco ou fresco. Uma etapa de pré-extração preferida compreende moagem e/ou pulverização domaterial de planta de espécies de ganoderma em um pó fino.O material de partida ou material após as etapas de pré-extração pode ser seco ou pode receber a adição de umidade.Após o material de planta de espécies de ganoderma estar emuma forma adequada à extração, os métodos de extração sãocontemplados pela presente invenção.

A Tabela 4 lista as frações dos principaisconstituintes químicos bioativos benéficos, e alguns doscompostos químicos bioativos principais encontrados namatéria-prima de espécies de ganoderma usada na presenteinvenção.<table>table see original document page 32</column></row><table><table>table see original document page 33</column></row><table><table>table see original document page 34</column></row><table><table>table see original document page 35</column></row><table><table>table see original document page 36</column></row><table><table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 40</column></row><table>Os métodos de extração da presente invençãocompreendem processos aqui revelados. Em geral, os métodosda presente invenção compreendem, em parte, métodos nosquais o material de planta de espécies de ganoderma éextraído com a utilização de extração supercrítica delíquidos (SFE) com dióxido de carbono como solvente(SCCO2) , que é seguida por uma ou mais etapas de extraçãode solvente como, por exemplo, sem limitação, processos deextração aquosos, hidroalcoólicos e adsorventes porpolímero de afinidade. Outros métodos adicionaiscontemplados pela presente invenção compreendem a extraçãode material de planta de espécies de ganoderma com o uso deoutros solventes orgânicos, substâncias químicasrefrigerantes, gases compressíveis, sonificação, extraçãode líquido por pressão, cromatografia contra corrente dealta velocidade, polímeros moleculares impressos, e outrosmétodos de extração conhecidos. Tais técnicas sãoconhecidas por aqueles habilitados na técnica. Em umaspecto, as extrações da presente invenção podem serpreparadas por um método que compreende as etapasrepresentadas esquematicamente nas Figuras 1-5.

A invenção inclui processos para uma concentração(purificação) e definição do perfil do óleo essencial e deoutros compostos solúveis em lipídeos de material de plantade ganoderma com a utilização da tecnologia SCCO2. Ainvenção inclui o fracionamento dos constituintes químicossolúveis em lipídeos de ganoderma em, por exemplo, umafração de óleo essencial de alta pureza (concentraçãoelevada do constituinte químico de óleo essencial). Alémdisso, a invenção inclui um processo de SCCO2 no qual osconstituintes químicos individuais dentro de uma fração deextração podem ter suas proporções ou seus perfis deconstituintes químicos alterados. Por exemplo, a separaçãofracionada por SCCO2 dos constituintes químicos dentro deuma fração de óleo essencial permite a extraçãopreferencial de certos compostos do óleo essencial emrelação aos outros compostos do óleo essencial, de talforma que uma subfração do extrato de óleo essencial podeser produzida com uma concentração de certos compostosmaior do que a concentração de outros compostos.

A extração dos constituintes químicos do óleoessencial das espécies de ganoderma com SCCO2, comoensinada na presente invenção, elimina o uso de solventesorgânicos tóxicos e fornece o fracionamento simultâneo dosextratos. 0 dióxido de carbono é um produto biológiconatural e seguro e um ingrediente em muitos alimentos ebebidas.

Um diagrama esquemático dos métodos de extração dosconstituintes químicos biologicamente ativos de Ligusticumé ilustrado nas Figuras 1-5. 0 processo de extração ocorretipicamente, sem limitação, em 4 etapas. Para referência notexto, quando o número em negrito aparece entre colchetes[χ] , os números se referem aos números nas Figuras 1-5. Osmétodos analíticos usados no processo de extração sãoapresentados na seção de Exemplificação.

Etapa 1: Extração supercrítica de líquidos de dióxido decarbono do óleo essencial de Ganoderma

Em função da natureza hidrofóbica do óleo essencial,solventes não polares, incluindo, sem limitação, SCCO2,hexano, éter de petróleo e acetato de etila, podem serusados para esse processo de extração. Na medida em quealguns dos componentes do óleo essencial são voláteis, adestilação a vapor também pode ser usada como um processode extração.

Uma descrição generalizada da extração dosconstituintes químicos do óleo essencial do rizoma dasespécies de ganoderma com o uso de SCCO2 é representada naforma de diagrama na Figura I-Etapas IA e IB. A matéria-prima [10] é corpo seco e moído da fruta de espécies deganoderma (trama de aproximadamente 140) . 0 solvente deextração [210] é dióxido de carbono puro. 0 etanol pode serusado como um co-solvente. A matéria-prima é carregada emum vaso de extração SFE [2 0]. Após limpeza e teste quanto apossíveis vazamentos, o processo compreende fluxo de CO2liqüefeito a partir de um vaso de armazenamento através deum refrigerador até uma bomba de CO2. 0 CO2 é comprimidoaté a pressão desejada e flui através da matéria-prima novaso de extração, onde a pressão e a temperatura sãomantidas no nível desejado. As pressões para a extraçãovariam de cerca de 6 MPa a 80 MPa, e a temperatura varia decerca de 350C a cerca de 90°C. As extrações de SCCO2 aquiensinadas são realizadas preferivelmente em pressões depelo menos 10 MPa, e uma temperatura de pelo menos 350C e,mais preferivelmente, em uma pressão de cerca de 6 MPa a 50MPa, e em uma temperatura de cerca de 40°C a cerca de 80°C.0 tempo para extração para um único estágio de extraçãovaria de cerca de 3 0 minutos a cerca de 2,5 horas, a cercade 1 hora. A proporção de solvente em relação à alimentaçãoé tipicamente de cerca de 60 a 1 para cada uma dasextrações de SCCO2. 0 CO2 é reciclado. Os constituintesquímicos extraídos, purificados e com perfil definido doóleo essencial [30] são então coletados em um coletor ouseparador, salvos em uma garrafa de vidro que protege daluz e armazenados em um refrigerador escuro a 4 °C. 0material da matéria-prima de ganoderma [10] pode serextraído em um processo de uma etapa (Figura 1, Etapa IA)em que a fração extraída e purificada de óleo essencial doganoderma [30] resultante é coletada em um sistema coletorde SFE ou SCCO2 [20] , ou em múltiplos estágios (Figura 1,Etapa 1B) em que as subfrações extraídas, purificadas e comperfil definido de óleo essencial de ganoderma [50, 60, 70,80] são coletadas separada e seqüencialmente, em um sistemacoletor de SFE [20] . Alternativamente, como em um sistemade SFE fracionado, o material de matéria-prima de ganodermaextraído por SCCO2 pode ser segregado em vasos coletores(separadores), de tal forma que dentro de cada coletor hajauma extração (perfil) com percentagem relativa diferente doconstituinte químico de óleo essencial em cada uma dassubfrações purificadas de óleo essencial coletada. 0resíduo (restante) [40] é coletado, salvo e usado paraprocessamento posterior para a obtenção de fraçõespurificadas de polissacarídeos e de triterpenos dasespécies de ganoderma. Uma modalidade da invençãocompreende a extração do material de matéria-prima deespécies de ganoderma com o uso de extração por SCCO2 emmultiestágios em uma pressão de 6 MPa a 50 MPa, e em umatemperatura entre 35°C e 90°C, e a coleta do material deganoderma extraído após cada estágio. Uma segundamodalidade da invenção compreende a extração do material dematéria-prima de espécies de ganoderma com o uso deextração por SCCO2 por fracionamento, em pressões de 6 MPaa 50 MPa e em uma temperatura entre 35°C e 90°C, e a coletado material de ganoderma extraído em diferentes vasoscoletores em condições predeterminadas (pressão,temperatura e densidade) e em intervalos predeterminados(tempos). As subfrações purificadas de óleo essencial deganoderma extraídas resultantes de cada um dos extratoresmultiestágios ou em diferentes vasos coletores (sistemafracionado) podem ser recuperadas e usadasindependentemente, ou podem ser combinadas para formar umaou mais extrações de óleo essencial de ganoderma quecompreendem uma concentração predeterminada do constituintequímico de óleo essencial que é maior ou menor do queaquela encontrada no material da planta nativa ou emprodutos de extração de ganoderma convencionais.

Tipicamente, o rendimento total da fração de óleo essencialde espécies de ganoderma com o uso de uma extração máximapor SCCO2 em uma única etapa é de cerca de 1,8% (> 95% dosconstituintes químicos do óleo essencial) por % do peso,possuindo uma pureza do constituinte químico de óleoessencial de mais de 95% por peso de massa do extrato.Exemplos e os resultados desses processos de extração sãoencontrados abaixo e nas Tabelas 5 e 6. O procedimento podeser encontrado no Exemplo 1.<table>table see original document page 46</column></row><table><table>table see original document page 47</column></row><table><table>table see original document page 48</column></row><table><table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table>O efeito de temperatura sobre o rendimento total daextração depende da pressão do sistema; em uma pressãoreduzida de 10 MPai o rendimento da extração diminui àmedida que a temperatura é aumentada. Esse achado éatribuído à grande mudança da densidade quando a pressão émanipulada próximo ao ponto crítico do solvente (adensidade de CO2 a 40°C é 0,64 g/cm3, e a densidade de CO2 a80°C é de 0,227 g/cm3) . Em pressões maiores de 30 MPa e 50MPa, por outro lado, o rendimento da extração é aumentado àmedida que a temperatura é aumentada. Esse achado éatribuído ao efeito da temperatura sobre a pressão do vaporde soluto, na medida em que a densidade do CO2 não mudamuito pela temperatura.

Na faixa de experimentos investigada, pode-se observarclaramente que, para o sistema de cogumelo de ganoderma, adensidade e a pressão não parecem ter um efeito muitogrande sobre o rendimento da extração. No entanto, atemperatura possui um efeito substancial. Tanto a pressãoquanto a temperatura possuem um efeito sobre a cinética deextração. Um aumento da temperatura promove um aumento dapressão de vapor dos compostos, o que favorece a extração.Adicionalmente, o aumento no coeficiente de difusão e adiminuição da viscosidade do solvente também ajudam aextração de compostos da matriz porosa herbácea à medidaque a temperatura e pressão são aumentadas até um valormais elevado. Em conclusão, devem ser usadas temperatura epressão elevadas para uma extração por SCCO2 máxima, tantodo ponto de vista da cinética quanto do rendimento.

Como pode ser observado a partir das Tabelas 4 e 5, osprincipais compostos encontrados na matéria-prima do corpoda fruta de espécies de ganoderma são ácidos graxos Cll-C20. Os mais abundantes são os ácidos graxos C18 de álcoolsuperior, ácido 9,12-octadecadienóico (Z,Z)- e ácidolinoelaídico (E,Z)-. Ambos são estereoisômeros. 0 isômero5 (Ε,Z)- de ácido linoelaídico é um ácido graxo duplamenteinsaturado que ocorre amplamente em glicosídeos de plantas.0 segundo grupo principal de compostos encontrados nasfrações de óleo essencial é formado pelos alcoóis. Os maisabundantes desses compostos são os alcoóis C17, C18 e C2010 superiores. Esses alcoóis alifáticos permaneceraminalterados com a extração, e não se transformaram emésteres. Uma pureza elevada de compostos oleosos voláteisestá presente na fração do extrato de óleo essencial porSCCO2 de material de matéria-prima de espécies de15 ganoderma. Além disso, frações do extrato de óleo essencialde espécies de ganoderma podem ter seu perfil definido compelo uso de SCCO2 (Tabela 3) . Por exemplo, podem serobtidas concentrações maiores dos alcoóis em temperaturasde extração maiores como, por exemplo, 80°C, e pressões20 menores como, por exemplo, 10 MPa. Em contraste,concentrações maiores de isômeros de ácido graxo C18 podemser obtidas em temperaturas de 40-70°C e uma pressãoelevada, por exemplo, 50 MPa.

0 rendimento da extração por SCCO2 de espécies de25 ganoderma foi de cerca de 0,6-1,2% por peso de massa damatéria-prima em temperaturas de 40-80°C e pressões de 100-50 MPa, com uma proporção de solvente/alimentação (S/F) de180 (Tabela 6).

Tabela 6. Influência da temperatura e da pressão sobre o3 0 rendimento da extração por SCCO2 de óleo essencial (por %de peso de massa da matéria-prima) em diferentes tempos deextração.

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Etapa 2. Processo de lixiviação de etanol para extração dafração bruta de triterpenóide.

Em um aspecto, a presente invenção compreende aextração e concentração dos compostos ativos de triterpeno.Uma descrição generalizada dessa etapa é representada naforma de diagrama na Figura 2-Etapa 2. Esse processo deextração da Etapa 2 é um processo de lixiviação desolvente. A matéria-prima para esse processo de extração éa matéria-prima de espécies nativas de ganoderma [10] ou oresíduo [40] após a extração por SCCO2 dos constituintesquímicos do óleo essencial. 0 solvente de extração [220]pode ser etanol aquoso, etanol ou outro álcool. Nessemétodo, o resíduo de espécies de ganoderma e o solvente deextração são carregados em um vaso de extração [100] eaquecidos e agitados. Eles podem ser aquecidos até 90°C, acerca de 80°C, a cerca de 70°C, a cerca de 600C ou a cercade 60-80°C. A extração é realizada por cerca de 1-10 horas,por cerca de 1-6 horas, por cerca de 1-3 horas ou por cercade 2 horas. 0 extrato fluido resultante é centrifugado[120]. O filtrado (sobrenadante) é coletado como produto[120], medido quanto ao volume e peso de massa seco do teorsólido. O material sólido do resíduo da extração [130] éretido e salvo para processamento posterior (veja Etapa 4).A extração pode ser repetida quantas vezes foremnecessárias ou desejadas. Ela pode ser repetida 2 ou maisvezes, 3 ou mais vezes, 4 ou mais vezes etc. Por exemplo, aFigura I-Etapa 2 mostra um processo em três estágios, noqual o segundo estágio e o terceiro estágio usam os mesmosmétodos e condições. Um exemplo dessa etapa de extração éencontrado no Exemplo 2, e os resultados nas Tabelas 7-9.<table>table see original document page 55</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table>Etapa 3. Purificação da fração de triterpeno.

Uma descrição generalizada da extração e purificaçãoda fração de triterpeno dos extratos brutos de triterpenode espécies de ganoderma é representada na forma dediagrama na Figura 3-Etapa 3 (Apêndice 1). A matéria-prima[120] é o extrato bruto de triterpeno do processo delixiviação de etanol em três estágios da Etapa 2. Ossolventes são clorofórmio [230] e solução aquosa saturadade bicarbonato de sódio (NaHCO2) (10%) [240] . Nesse método,a matéria-prima de extrato bruto de triterpeno [120] e oprimeiro solvente de extração [230] são carregados em umvaso de extração [100] e agitados para dissolver a fraçãobruta de triterpeno no solvente. 0 solvente de clorofórmioé introduzido em um sistema separador [320]. A seguir, osegundo solvente de extração [240] é adicionado à soluçãono sistema separador, misturado, expelido e permite-se quefique em repouso para separação do solvente baseado em água(camada superior) do solvente de clorofórmio (camadainferior). A camada da solução baseada em água é coletada[400], medida quanto ao volume e peso de massa seco do teorsólido. A solução de clorofórmio do resíduo (camadainferior) [340] pode ser retida para estágios adicionais deextração por NaHCO2. A extração por NaHCO2 pode serrepetida quantas vezes forem necessárias ou desejadas. Elapode ser repetida 2 ou mais vezes, 3 ou mais vezes, 4 oumais vezes etc. Por exemplo, a Figura 3-Etapa 3A mostra umprocesso de NaHCO2 em três estágios, em que o segundoestágio e o terceiro estágio usam os mesmos métodos econdições. As soluções baseadas em água coletadas de cadaestágio de extração [400+410+420] são combinadas [430]. Asolução combinada é acidifiçada. 0 ácido é HCl [250]. 0 pHfinal da solução pode ser de cerca de 3-5 ou de cerca de 4.A solução acidificada é então extraída [340] com o solventeclorofórmio [2 60] com o uso de um sistema separador desolvente [320] . A camada de solução de clorofórmio, quecontém os triterpenóides desejados, é coletada e salva[450] . O processo de extração de clorofórmio pode serrepetido quantas vezes foram necessárias ou desejadas. Porexemplo, a Figura 3-Etapa 3B mostra um processo declorofórmio em dois estágios, em que o segundo estágio usaos mesmos métodos e condições. 0 resíduo baseado em águaapós o término da extração é descartado. 0 solventeclorofórmio multiestágios [480] é evaporado sob pressãoreduzida com o uso de evaporação rotatória e reciclado[390] . A fração purificada de triterpeno é seca [395] ,removendo o clorofórmio restante, e salva como uma fraçãopurificada de triterpeno [500]. Um exemplo dessa etapa deextração pode ser encontrado no Exemplo 3, e os resultadosna Tabela 4.

0 rendimento total da fração purificada de triterpenofoi de 0,6% por peso de massa com base na matéria-primaoriginal de ganoderma com uma pureza de triterpeno de cercade 88%, um aumento de 4 vezes em termos de pureza emrelação à fração bruta de triterpeno do extrato. Dessaforma, o rendimento de triterpenóide foi de mais de 65% dostriterpenóides presentes na matéria-prima original deganoderma. Os cromatogramas de HPLC revelam numerosos picosdesconhecidos que são esperados, considerando que mais de13 0 triterpenos altamente oxigenados e compostos3 0 relacionados foram isolados do material de planta de G.lucidum. A concentração total dos três padrões dereferência, ácido ganodérico A, ácido ganodérico F eganodermatriol, foi de cerca de 4%, o que apóia aimportância do ensaio de triterpenóide total para ocontrole de qualidade no processamento comercial de umafração purificada de triterpeno.

Etapa 4. Processo de lixiviação aquosa e precipitação depolissacar£deo

A fração de polissacarídeo do extrato dosconstituintes químicos de espécies de ganoderma foidefinida na literatura científica como a "fração deextração hidrossolúvel, insolúvel em etanol". Uma descriçãogeneralizada da extração da fração de polissacarídeo deextratos de espécies de ganoderma com o uso de processos delixiviação de solvente aquoso e precipitação por etanol érepresentada na forma de diagrama na Figura 4-Etapa 4. Amatéria-prima [10] ou [120] é o pó do material de plantanativo de espécies de ganoderma ou o resíduo sólido doprocesso de extração por lixiviação de etanol da Etapa 2.

Essa matéria-prima é extraída por lixiviação em doisestágios. O solvente é água destilada [270]. Nesse método,a matéria-prima de espécies de ganoderma [10] ou [12 0] e osolvente de extração [270] são carregados em um vaso deextração [700] e aquecidos e agitados. Eles podem seraquecidos até 100°C, a cerca de 60°C ou a cerca de 70-80°C.A extração é realizada por cerca de 1-5 horas, por cerca de2-4 horas ou por cerca de 2 horas. A extração pode serrepetida quantas vezes forem necessárias ou desejadas. Assoluções de extração em multiestágios [700+720] sãocombinadas, e o caldo é filtrado [610], centrifugado [620],e o sobrenadante coletado e evaporado [630] para removerágua até um aumento de cerca de 8 vezes na concentração dassubstâncias químicas em solução [640]. Etanol anidro [280]é então usado para reconstituir o volume original dasolução, o que torna a concentração final de etanol aetanol 60-80%. É observado um grande precipitado [650]. Asolução é centrifugada [660], decantada [670], e osobrenadante do resíduo [750] pode ser salvo paraprocessamento posterior ou descartado. 0 produtoprecipitado [740] após secagem [680] é a fração purificadade polissacarídeo [7 60] que pode ser analisada quanto aospolissacarídeos com o uso do método colorimétrico usandoDextrana de peso molecular de 5.000, 50.000 e 410.000 comopadrões de referência. A pureza da fração de polissacarídeoextraída com o uso de 3 dextranas com pesos molecularesdiferentes como padrões é de cerca de 80, 59 e 52%,respectivamente, com um rendimento total de 2% por % depeso de massa da matéria-prima nativa original deganoderma. A combinação das medidas de pureza dos 3 padrõesde dextrana indica um nível de pureza muito elevado de maisde 95%. A principal impureza parece ser as proteínas deIectina desejadas (3% por peso de massa), que também contêmpropriedades bioativas benéficas. Os métodos da presenteinvenção são ainda ensinados no Exemplo 4. Os resultadossão mostrados na Tabela 10. Além disso, a espectrometria demassa AccuTOF-DART foi usada para refinar o perfil dospesos moleculares dos compostos que compreendem a fraçãopurificada de polissacarídeo. Os resultados são mostradosnas Figuras 6 e 7.<table>table see original document page 61</column></row><table>O rendimento do polissacarídeo de ganoderma foi decerca de 2% por peso de massa com base na matéria-prima deplanta original de ganoderma. A pureza da fração depolissacarídeo foi de 520-800 mg/g, equivalente ao padrãode dextrana, indicando uma pureza de > 90% de constituintesquímicos de polissacarídeo de ganoderma na fração. Com baseno grande número e na variedade de abordagensexperimentais, é bem razoável concluir que 2% de rendimentoé quase 100% dos polissacarídeos hidrossolúveis-insolúveisem etanol nas espécies naturais de material de matéria-prima de ganoderma. Além disso, a principal impureza nafração parece ser as proteínas de lectina desejadas queconstituem cerca de 3% do peso de massa da fraçãopurificada de polissacarídeo.

São conhecidos muitos métodos na técnica para remoçãode álcool de solução. Caso se deseje manter o álcool parareciclagem, o álcool pode ser removido das soluções, apósextração, por destilação sob pressão atmosférica normal oupressões atmosféricas reduzidas. O álcool pode serreutilizado. Além disso, também há muitos métodosconhecidos na técnica para remoção de água de soluções,tanto soluções aquosas quanto soluções das quais o álcoolfoi removido. Tais métodos incluem, sem limitação, secagempor spray das soluções aquosas em um veículo adequado como,por exemplo, sem limitação, carbonato de magnésio oumaltodextrina ou, alternativamente, o líquido pode serlevado até a secura por liofilização ou secagem por janelarefrativa.

Pureza das extrações

Na realização dos métodos de extração descritospreviamente, verificou-se que 50-99% do rendimento por pesode massa dos constituintes químicos do óleo essencial quepossuem acima de 95% de pureza dos constituintes químicosdo óleo essencial na matéria-prima original de casca secade ganoderma das espécies de ganoderma podem ser extraídosna fração do extrato de SCCO2 de óleo essencial (Etapa IA).Utilizando-se os métodos ensinados na Etapa IB (Processosde extração e fracionamento de SCCO2) , o rendimento de óleoessencial seria reduzido em função do fracionamento dosconstituintes químicos do óleo essencial em subfraçõesaltamente purificadas (>90%) do óleo essencial. Além disso,o processo de extração e fracionamento de SCCO2, comoensinado nesta invenção, permite que as proporções (perfis)dos compostos químicos individuais que compreendem a fraçãodo constituinte químico de óleo essencial sejam alteradasde tal forma que possam ser criados perfis únicos dasubfração de óleo essencial para fins medicinaisespecíficos. Por exemplo, a concentração dos constituintesquímicos alcoólicos do óleo essencial pode ser aumentada,enquanto se reduz simultaneamente a concentração doscompostos de ácido graxo ou vice-versa.

Utilizando-se os métodos ensinados na Etapa 2 destainvenção, é obtida uma fração bruta de triterpeno porlixiviação de etanol com um rendimento de 3% de por peso demassa da matéria-prima original de espécies de ganodermaque possui uma concentração de 20% de constituintesquímicos de triterpeno. Isso ainda eqüivale a um rendimentode cerca de 66% dos constituintes químicos relacionados aotriterpeno encontrados no material de planta nativo deespécies de ganoderma.Utilizando-se os métodos ensinados na Etapa 3 destainvenção (Purificação da fração de triterpeno) , podem serobtidas frações de triterpeno com purezas de mais de 85%por % de massa seca do extrato. É possível extrair quase100% dos triterpenos da matéria-prima do extrato delixiviação hidroalcoólica. Isso eqüivale a cerca de 66% dorendimento dos constituintes químicos ácidos de triterpenoencontrados no material de planta nativo de espécies deganoderma.

Utilizando-se os métodos ensinados na Etapa 4 destainvenção, é obtida uma fração purificada de polissacarídeocom um rendimento de 1,5-2,0% do peso de massa da matéria-prima original de espécies de ganoderma que possui umapureza de polissacarídeo de mais de 90%. O rendimento depolissacarídeo é de quase 100% dos polissacarídeoshidrossolúveis-insolúveis em etanol presentes no materialda matéria-prima nativa de espécies de ganoderma. Osprincipais constituintes químicos não polissacarídicosnessa fração parecem ser proteínas de lectina queconstituem cerca de 3% por peso de massa da fração depolissacarídeo. Essas proteínas parecem agir sinergicamentecom os polissacarídeos, aumentando a bioatividade benéficada fração.

Finalmente, os métodos ensinados na presente invençãopermitem que a purificação (concentração) das novas fraçõesdo constituinte químico de óleo essencial, das novasfrações ou subfrações de óleo essencial, de uma nova fraçãode triterpeno e de uma nova fração de polissacarídeo deespécies de ganoderma seja de até 99% por peso de massa dosconstituintes químicos desejados nas frações de óleoessencial, de até 87% por peso de massa na fração detriterpeno e de até 95% por peso de massa na fração depolissacarídeo. Os ambientes de extração específicos, astaxas de extração, os solventes e a tecnologia de extraçãousados dependem do perfil do constituinte químico departida do material-fonte e do nível de purificaçãodesejado nos produtos finais de extração. Os métodosespecíficos ensinados na presente invenção podem serfacilmente determinados por aqueles habilitados na técnica com o uso de experimentação rotineira típica para ajuste deum processo às variações da amostra nos atributos demateriais de partida que são processados até um materialfinal que possua os atributos específicos. Por exemplo, emum lote específico de material de planta de espécies deganoderma, as concentrações iniciais dos constituintesquímicos do óleo essencial, os triterpenos e ospolissacarídeos são determinados com a utilização demétodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica, comoensinado na presente invenção. Aqueles habilitados natécnica podem determinar a quantidade de mudança a partirda concentração inicial dos constituintes químicos do óleoessencial, por exemplo, até quantidades ou distribuições(perfil) predeterminadas de constituintes químicos do óleoessencial para o produto final da extração com a utilizaçãodos métodos de extração, como aqui revelados, para alcançara concentração e/ou o perfil químico desejado no produto deextração final de espécies de ganoderma.

Alimento e medicamentos

Como uma forma de alimentos da presente invenção, elespodem ser formulados em quaisquer formas opcionais, porexemplo, em forma de grânulos, em forma de grãos, em formade pasta, em forma de gel, em forma sólida ou em formalíquida. Nessas formas, vários tipos de substânciasconvencionalmente conhecidas por aqueles habilitados natécnica que podem ser adicionadas aos alimentos, porexemplo, um ligante, um desintegrante, um espessante, umdispersante, um agente promotor de reabsorção, um agenteflavorizante, um tampão, um tensoativo, um auxílio paradissolução, um conservante, um emulsificante, um agente deisotonicidade, um estabilizante ou um controlador do pHetc., podem estar opcionalmente presentes. Uma quantidadedo extrato de elderberry a ser adicionada aos alimentos nãoé especificamente limitada e, por exemplo, ela pode ser decerca de 10 mg a 5 g, preferivelmente 50 mg a 2 g por diacomo uma quantidade ingerida por um adulto com peso decerca de 60 kg.

Em particular, quando é utilizado como alimentos parapreservação da saúde, alimentos funcionais etc., prefere-seque contenha o ingrediente eficaz da presente invenção emuma quantidade tal que os efeitos predeterminados dapresente invenção sejam suficientemente mostrados.

Os medicamentos da presente invenção podem seropcionalmente preparados de acordo com os métodosconvencionalmente conhecidos, por exemplo, como um agentesólido, por exemplo, um comprimido, um grânulo, pó, umacápsula etc., ou como um agente líquido, por exemplo, umainjeção etc. Para esses medicamentos, podem ser formuladosquaisquer materiais geralmente usados como, por exemplo, umligante, um desintegrante, um espessante, um dispersante,um agente promotor de reabsorção, um agente flavorizante,um tampão, um tensoativo, um auxílio para dissolução, umconservante, um emulsificante, um agente de isotonicidade,um estabilizante ou um controlador do pH.

Uma quantidade de administração do ingrediente eficaz(ganoderma extrato) nos medicamentos pode variar,dependendo do tipo, da forma do agente, da idade, do pesocorporal ou de um sintoma a ser aplicado a um paciente, esemelhantes; por exemplo, quando ele é administradooralmente, ele é administrado uma ou várias vezes por diapara um adulto que pesa cerca de 60 kg, e administrado emuma quantidade de cerca de 10 mg a 5 g, preferivelmentecerca de 50 mg a 2 g por dia. 0 ingrediente eficaz pode serum ou vários componentes do extrato de ganoderma.

As novas extrações de espécies de ganoderma podem seradministradas diariamente, por uma ou mais vezes, para otratamento eficaz de condições agudas ou crônicas. Ummétodo da presente invenção compreende a administração pelomenos uma vez por dia de uma extração que compreendecompostos de constituintes de espécies de ganoderma. Osmétodos também compreendem a administração dessas extraçõesmais de uma vez por dia, mais de duas vezes por dia, maisde três vezes por dia, e em uma faixa de 1 a 15 vezes pordia. Essa administração pode ser continuamente, como emtodos os dias por um período de dias, semanas, meses ouanos, ou pode ocorre em momentos específicos para tratar ouevitar condições específicas. Por exemplo, uma pessoa podereceber a administração de extratos de espécies deganoderma pelo menos uma vez ao dia por anos para reforçaro sistema imunológico ou para evitar doença cardiovasculare acidente vascular cerebral, ou para evitar ou tratardistúrbios inflamatórios e artrite, ou para tratarhipertensão, ou para evitar ou tratar o resfriado comum,influenza, ou outras doenças virais, ou para evitar outratar doenças bacterianas, ou para tratar diabetes melito,ou para tratar hipercolesterolemia, ou para evitar outratar câncer.

A descrição anterior inclui o melhor modo atualmentecontemplado para realização da presente invenção. Essadescrição tem a finalidade de ilustrar os princípios geraisda invenção, e não deve ser considerada em um sentidolimitante. Esta invenção é ainda ilustrada pelos exemplos aseguir, que não devem ser considerados, de forma alguma,como imposição de limitações ao escopo desta. Pelocontrário, deve-se entender claramente que podem serutilizadas várias outras modalidades, modificações eequivalentes destas, as quais, após leitura da descriçãoaqui apresentada, podem, elas mesmas, ser sugeridas poraqueles habilitados na técnica, sem se afastar do espíritoda presente invenção.

Todos os termos aqui utilizados devem serinterpretados no seu sentido normalmente aceito por aqueleshabilitados na técnica. Todas as patentes e pedidos depatentes ou referências aqui citados são incorporados porreferência em suas totalidades.

Exemplificação

Materiais e métodosProdutos botânicos

Cogumelos vermelhos ganoderma lucidum (GL) secos foramobtidos comercialmente. A concentração dos compostos ativosna matéria-prima foi medida internamente, e está listada naTabela 11.

Tabela 11. Composição química de cogumelos ganodermalucidum.

Substâncias químicas Peso %

Óleo essencial 1 1,2

Triterpenóide 2 0,9

Polissacarídeo-glicoproteína 3 1,59

1 Óleo essencial foi estimado pelo maior rendimento deextração por SCCO2 a 70°C e 50 MPa.

2 Triterpenóide foi estimado pelo método de extração.

3 Polissacarídeo-glicoproteína foi estimado porextrato aquoso.

Solventes orgânicos

Acetona (CAS: 67-64-1), > 99,5%, reagente ACS(179124); acetonitrila (CAS: 7505-8), para HPLC, grau degradiente > 99,9% (GC) (000687); hexano (CAS#: 110-54-3),95+%, grau espectrofotométrico (248878); acetato de etila(CAS#: 141-78-6), 99,5+%, grau de ACS (319902); etanol(CAS: 64-17-5), desnaturado com isopropanol 4,8% (02853);etanol (CAS: 64-17-5), absoluto, (02883); metanol (CAS#:67-56-1), 99,93%, grau de ACS HPLC, (4391993); Clorofórmio(CAS#: 67-66-3), > 99,0% (GC) e água (CAS#: 7732-18-5),grau de HPLC, (953 04). Todos foram adquiridos de Sigma-Aldrich.

Ácidos e bases

Ácido acético (64-19-7), 99,7+%, reagente ACS(320099); ácido clorídrico (7647-010), padrão volumétricosolução 1,0 N em água (318949); bicarbonato de sódio (S263-1, Lote #: 037406) foi adquirido de Fisher Co. Bradfordreagente (Número do produto B 6916) foi adquirido de Sigma.Padrões químicos de referência

Albumina sérica (9048-46-8), pó de fração V dealbumina bovina (BSA) de cultura de células testadas(A9418) foi adquirido de Sigma; ácido ganodérico A (Lote #:07057-022), ácido ganodérico F (Lote #: 07068-037) eganodermatriol (Lote #: 07060-128) foram adquiridos deSigma. Padrões de dextrana 5.000 (00269), 50.000 (00891) e410.000 (00895) certificados de acordo com DIN foramadquiridos de Fluka. As estruturas desses padrões sãomostradas nas Tabela 12.

Tabela 12. Estrutura química de padrões de referência detriterpenõide para ganoderma Iucidum.

<table>table see original document page 70</column></row><table>

Método de HPLC

Sistema cromatográfico: sistema de cromatografialíquida de alto rendimento Shimadzu LC-10AVP equipado combomba LC10ADVP com detector de arranjo de fotodiodo SPD-M1OAVP.

Os produtos de extração de etanol obtidos forammedidos em uma coluna de fase reversa Júpiter Cl8 (250 χ4,6 mm I.D., 5μ, 3 00 A) (Phenomenex, Código do produto:00G-4053-EO, N0 de série: 2217520-3, Lote N°: 5243-17). 0volume de injeção foi de 10 μΐ, e a taxa de fluxo da fasemóvel foi de 1 ml/min. A temperatura da coluna foi de 25°C.A fase móvel consistiu em A (ácido acético aquoso 2,5%,v/v) e B (acetonitrila). 0 gradiente foi programado daseguinte forma: com os primeiros 12 minutos, B mantém a3 0%, 12 - 3 0 min, solvente B aumentado linearmente de 3 0% a65%, e 30-40 min, B mantém a 65%, e depois 40-45 min, Blinearmente de 65% a 85%.

Soluções de estoque de metanol da lista de 3 padrõesna Tabela 12 foram preparadas dissolvendo-se quantidadespesadas de compostos-padrão em etanol a 5 mg/ml. A soluçãomista do padrão de referência foi então diluída, etapa poretapa, para gerar uma série de soluções em concentraçõesfinais de 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05 mg/ml, respectivamente.Todas as soluções de estoque e soluções de trabalho foramusadas em até 7 dias, e armazenadas 4 0C mais frias etrazidas até a temperatura ambiente antes de seremutilizadas. As soluções foram usadas para identificar equantificar os compostos em extratos de ganoderma lucidum.Os tempos de retenção de ácido ganodérico A, ácidoganodérico F e ganodermatriol foram de cerca de 13,33,21,63 e 34,42 min, respectivamente. Foi encontrado umajuste linear variando de 0,01 a 20 pg. As equações deregressão e os coeficientes de correlação foram osseguintes: ácido ganodérico A: área de pico = 790.642 χ C(pg) - 23.406, R2 = 0,9994 (N = 6); Ácido ganodérico F:área de pico = 513.374 χ C (pg) - 12.458, R2 = 0,9999 (Ν =6) ; ganodermatriol: área de pico = 753.902 χ C (pg) -29.095, R2 = 0,9997 (N = 6). Os resultados de HPLC sãomostrados na Tabela 13. Os teores dos padrões de referênciaem cada amostra foram calculados por interpolação a partirdas curvas de calibração correspondentes, com base na áreade pico.<table>table see original document page 73</column></row><table>Análise por GC-MS

A análise por GC-MS foi realizada no sistema ShimadzuGCMS-QP2010. O sistema inclui cromatografia a gás de altorendimento, interface GC/MS direta acoplada, fonte iônicade impacto de elétrons (EI) com controle independente datemperatura, filtro de massa quádruplo etc. O sistema écontrolado com o software de solução de GCMS Ver. 2 paraaquisição de dados e análise pós-execução. A separação foirealizada em uma coluna capilar de sílica fundida AgilentJ&W DB-5 (30 m χ 0,25 mm i.d., 0,25 μm de espessura dapelícula) (catálogo: 1225032, N0 de série: US5285774H) como uso do seguinte programa de temperatura: a temperaturainicial foi de 60°C, mantida por 2 min, e depois aumentadaaté 120°C em uma taxa de 4°C/min, mantida por 15 min, edepois aumentada até 200°C em uma taxa de 4°C/min, mantidapor 15 min, e depois aumentada até 240°C em uma taxa de4°C/min, mantida por 15 min, com um tempo de execução totalde 92 minutos. A temperatura de injeção da amostra foi de250°C, e 1 μl de amostra foi injetado por um auto-injetorem modo splitless em 1 minuto. O gás transportador foihélio e taxa de fluxo foi controlada por pressão a 60 kPa.Sob essa pressão, a taxa de fluxo foi de 1,03 ml/min, e avelocidade linear foi de 37,1 cm/min. A temperatura dafonte iônica de MS foi de 230°C e a temperatura dainterface GC/MS foi de 250°C. O detector de MS foiescaneado entre m/z de 50 e 500, em uma velocidade devarredura de 1.000 AMU/segundo. A temperatura de corte dosolvente foi de 3,5 min.

Quantificação rápida de triterpenõides pelo método deespectrometria por ultravioleta (UV)Instrumento: Espectrofotômetro Shimazu UV-Vis (UV 1700com sonda UV: N0 de série: A1102421982LP)Padrões

Fazer a solução de padrão de triterpenóide de ácidoganodérico F em uma concentração de 0,2 mg/ml embicarbonato de sódio saturado (NaHCO3) . Diluir a soluçãoaté 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 mg/ml com bicarbonato desódio saturado. Gravar a absorbância a 257 nm. Osresultados são mostrados na Tabela 14.

Tabela 14. Quantificação rápida de triterpenóide total pelométodo de espectrometria por UV com o uso do ácidoganodérico F como padrões.

<table>table see original document page 75</column></row><table>

Análise de polissacarídeo (Dubois 1956)

Instrumento:

Espectrofotômetro Shimazu UV-Vis (UV 1700 com sondaUV: N0 de série: Al 102421982LP).Padrão:

0 método calorimétrico foi usado para análise depolissacarídeo. Fazer soluções de destoque de 0,1 mg/ml dedextrana (PM = 5.000, 50.000 e 410.000) em água destilada.Retirar 0,08, 0,16, 0,24, 0,32, 0,40 ml da solução deestoque e completar o volume até 0,4 ml com água destilada.A seguir, adicionar em 0,2 ml solução de fenol 5% e 1 ml deácido sulfúrico concentrado. Permitir que as misturasfiquem em repouso por 10 minutos, antes de realizar avarredura por UV. A absorbância máxima foi encontrada a 488nm. Depois, ajustar o comprimento de onda em 4 88 nm e medira absorbância para cada amostra. Os resultados sãomostrados na Tabela 15. Foram obtidas as curvas decalibração-padrão para cada uma das soluções de dextrana daseguinte forma: Dextrana 5 K, Absorbância = 0,01919 +0,027782 C (pg) , R2 = 0,97 (N = 5); Dextrana 50 K,Absorbância = 0,0075714 + 0,032196 C (pg) , R2 = 0,96 (N =5); e Dextrana 410 K, Absorbância = 0,03481 + 0,036293 C(pg) , R2 = 0, 98 (N = 5) .<table>table see original document page 77</column></row><table>Análise do peso molecular do polissacarideo

A análise do peso molecular do polissacarideo foifeita em um sistema de HPLC equipado com um detector deíndice de refração RID-10A. A taxa de fluxo foi ajustada em0,6 ml/min. As análises foram efetuadas usando uma colunaI.D. TSK-GEL G4000PWxl de 300 χ 7,8 mm (tamanho departícula de 10 μπι, tamanho de poro de 3 00 Á, TosohCorporation, Minato-ku, Tokyo, Japão. N0 de Catálogo:08022, Coluna N0 H3463). A fase móvel foi água destilada, eo volume de injeção foi de 10 μΐ. A temperatura da colunafoi de 350C e a temperatura da célula RID foi de 40°C. 0tempo de análise foi de 40 minutos.

Foram preparadas soluções de estoque com águadestilada de diferentes pesos moleculares de padrões dedextrana dissolvendo-se quantidades pesadas de compostos-padrão em água destilada em uma concentração de 5 mg/ml. Ostempos de retenção de dextrana 5 k, dextrana 25 k, dextrana50 k, dextrana 270 k e dextrana 410 k foram de cerca de15,70, 13,82, 12,93, 11,08 e 10,76 min, respectivamente,mostrados na Tabela 16. Foi obtido um ajuste de curvalinear por tabulação do tempo de retenção (eixo X) vs. LogPM (eixo Υ). A equação de regressão foi: Log (PM) = 9,669 -0,3817 χ Rt (R2 = 0,99859). 0 peso molecular desconhecidodas amostras pode ser calculado pela equação acimaconhecendo-se o tempo de retenção da amostra.<table>table see original document page 79</column></row><table>Espectrometria de massa por análise direta em tempo real(DART)

Instrumentos

Espectrômetro de massa por tempo de vôo JOEL AccuTOFDART LC (Joel USA, Inc., Peabody, Massachusetts, EUA). Essatecnologia de espectrômetro de massa por tempo de vôo (TOF)não exige nenhuma preparação da amostra e gera massas comprecisões de até 0,00001 unidade de massa.Métodos para análise da fração

Os ajustes do instrumento utilizados para capturar eanalisar as frações são os seguintes: para o modocatiônico, a voltagem da agulha de DART é de 3.000 V,elemento de aquecimento a 250°C, Eletrodo 1 a 100 V,Eletrodo 2 a 250 V e fluxo de gás hélio de 7,45litros/minuto (l/min). Para o espectrômetro de massa, oorifício 1 é de 10 V, a lente em anel é de 5 V e o orifício2 é de 3 V. A voltagem dos picos é ajustada em 600 V a fimde gerar poder de resolução começando a aproximadamente 60m/z, gerando ainda resolução suficiente em faixas de massasmaiores. A voltagem do detector de placa de microcanal(MCP) é ajustada em 2.450 V. Foram realizadas calibraçõesem cada manhã, antes da introdução da amostra, com o uso deum padrão de solução de cafeína 0,5 M (Sigma-Alrich Co.,St. Louis, EUA). As tolerâncias de calibração são mantidas<5 mmu.

As amostras são introduzidas no plasma de hélio deDART com pinças estéreis, assegurando que uma área desuperfície máxima da amostra seja exposta ao feixe deplasma de hélio. Para introduzir a amostra no feixe, éempregado um movimento de varredura. Esse movimento permiteque a amostra seja exposta repetidamente para frente e paratrás por aproximadamente 0,5 seg/varredura, e evita apirólise da amostra. Esse movimento é repetido até que sejaobservado um sinal de Corrente Iônica Total (TIC) nodetector, e então a amostra é removida, permitindo anormalização basal/de fundo.

Para o modo aniônico, DART e AccuTOF MS são mudadospara o modo ion negativo. A voltagem da agulha é de 3.000V, elemento de aquecimento 250°C, Eletrodo 1 a 100 V,Eletrodo 2 a 250 V e fluxo de gás hélio a 7,45 l/min. Parao espectrômetro de massa, o orifício 1 é —20 V, a lente emanel é de -13 V e o orifício 2 é de -5 V. A voltagem dopico é de 2 00 V. A voltagem de MCP é ajustada a 2.4 50 V. Asamostras são introduzidas exatamente da mesma forma que nomodo catiônico. Toda a análise de dados é realizada com autilização do software MassCenterMain Suite fornecido com oinstrumento.

Exemplo 1

Exemplo da Etapa IA: extração e purificação máximas por SFEem uma única etapa de fração de óleo essencial do ganoderma.

Foram feitos experimentos com a utilização de um SFT250 adquirido de Supercritical Fluid Technologies, Inc.(Newark, DE), que é projetado para pressões e temperaturasde até 69 MPa e 200 °C, respectivamente. Esse aparelhopermite extrações simples e eficientes em condiçõessupercríticas com flexibilidade para operar em modosdinâmicos ou estáticos. Esse aparelho consiste em trêsmódulos principais; um forno, uma bomba e controle, e ummódulo de coleta. O forno possui uma coluna pré-aquecida eum vaso de extração de 100 ml. O módulo da bomba é equipadocom uma bomba acionada por ar comprimido com capacidade defluxo constante de 3 00 ml/min. O módulo de coleta é umfrasco de vidro de 4 0 ml, lacrado com tampas e septos paraa recuperação de produtos extraídos. O equipamento éfornecido com válvulas micrométricas e um medidor de fluxo.A pressão e a temperatura do vaso de extração sãomonitoradas e controladas em um intervalo de ± 0,3 MPa e ±1°C.

Cinco gramas de pó de fruta Lingzhi jovem vermelhamoído com tamanho acima de IO5 μπι medido por peneiramentocom o uso de uma tela (de trama 14 0) foram carregados em umvaso de extração de 100 ml para cada experimento. Uma lã defibra de vidro foi colocada nas duas extremidades da colunapara evitar qualquer possível transporte de materialsólido. 0 forno foi pré-aquecido até a temperaturadesejada, antes de o vaso comprimido ser carregado. Após ovaso ter sido conectado ao forno, o sistema de extração foitestado quanto a vazamentos por pressurização do sistemacom CO2 (~ 5,860 MPa/g) , e depurado. O sistema foi fechadoe pressurizado até a pressão de extração desejada com o usoda bomba de líquido movida a ar. 0 sistema foi entãodeixado para equilíbrio por ~ 3 min. Um frasco de coleta deamostra (4 0 ml) foi pesado e conectado à entrada de coletade amostras. A extração foi iniciada por fluxo de CO2 emuma taxa de ~ 5 SLPM (10 g/min) , que é controlado por umaválvula metrificada. 0 rendimento foi definido como sendo aproporção de peso de total exata a ser alimentada dematerial bruto. O rendimento foi definido como apercentagem de peso do óleo extraído com relação à cargainicial do material bruto no extrator. Foi adotado umdesign de extração completa, variando a temperatura de 40 -80°C e de 10 - 50 MPa.

Exemplo 2

Exemplo da Etapa 2: extração por lixiviação de etanol dafração bruta de triterpeno.

Um exemplo típico de uma extração de solvente em 3estágios dos constituintes químicos de triterpeno deespécies de ganoderma é o seguinte: a matéria-prima eracomposta por 25 gramas de resíduo de SFE do corpo moído dafruta de espécies de ganoderma da extração por SCCO2 daEtapa 1 do óleo essencial (40°C, 30 MPa) . O solvente foi500 ml de etanol. Nesse método, o material de matéria-primae 500 ml de etanol foram carregados separadamente em umvaso de extração de 1.000 ml e misturados em um banho deágua aquecida a 70°C por 2 horas. A solução de extração foifiltrada com a utilização de papel de filtro Fisherbrand P4que possui um tamanho de retenção de partículas de 4-8 pm,centrifugada a 2.000 rpm por 10 minutos. O filtrado

(sobrenadante) foi coletado para cálculo do rendimento e

análise por HPLC. O resíduo particulado do Estágio 1 foiextraído por 2 horas (Estágio 2) e o resíduo do Estágio 2foi extraído por 2 horas utilizando-se os métodosmencionados anteriormente. Os extratos líquidos dosobrenadante das extrações em 3 estágios foram combinados,e o etanol evaporado e reciclado usando evaporaçãorotatória com pressão reduzida. 0 extrato foi seco a vácuoa 50 °C por 12 horas. O extrato bruto seco da fração detriterpeno foi medido para equilíbrio de massa e teor total

de triterpeno usando um ensaio de triterpenóide total eanalisado usando HPLC. 0 resíduo final da extração em 3estágios foi coletado e salvo para extração posterior (vejaabaixo).

0 rendimento total do extrato bruto de triterpeno doprocesso de lixiviação de etanol em 3 estágios foi de cercade 3% por peso de massa com base na matéria-prima originalde espécies de ganoderma, com uma pureza total detriterpenóide de cerca de 20%. Para se obter uma maiorpureza dos constituintes químicos de triterpeno, énecessário processamento adicional (veja Exemplo 3).

Exemplo 3

Exemplo da Etapa 3: purificação da fração de triterpeno

Um exemplo experimental típico de purificação dostriterpenos na fração bruta de lixiviação de etanol é oseguinte: 1 g da fração bruta de triterpeno por lixiviaçãode etanol da Etapa 2 foi dissolvido em 50 ml de clorofórmioe agitado por 5 minutos em um vaso de extração emtemperatura ambiente. Essa solução transparente foiderramada em um funil separador de 200 ml. Sãoacrescentados 4 0 ml de solução aquosa saturada de NaHCO3(10%) à solução de clorofórmio. Essa mistura foi agitadavigorosamente por 15 segundos, a pressão liberada, eagitada vigorosamente uma segunda vez por 15 segundos.Menos de 3 0 segundos da mistura total foram suficientespara permitir que os solutos se equilibrem entre a fase declorofórmio e a fase de solução baseada em água. Deve-seter um cuidado especial para liberar a pressão, na medidaem que um grande volume de CO2 era produzido durante esseprocesso. Permite-se que o funil separador fique em repousoaté que as duas camadas de solução se tornem nitidamenteseparadas (cerca de 30 minutos). O registro do funilseparador é então aberto, permitindo que a camada inferiorde clorofórmio seja drenada no frasco separado e salva paraduas extrações de solvente de NaHCO3 adicionais. A soluçãobaseada em água restante é derramada do topo do funil esalva. Foram efetuados dois estágios adicionais de NaHCO3extraídos da solução de clorofórmio usando os mesmosmétodos. As soluções do extrato de NaHCO3 em três estágios(120 ml) foram combinadas e acidifiçadas usando 6 N HCl atéum pH de 4 (cerca de 3 ml) . A solução acidif içada foiderramada em um funil separador de 200 ml limpo. Foramintroduzidos 50 ml de clorofórmio no funil separador emdois estágios para extrair os compostos de triterpeno dasolução acidifiçada baseada em água. Os métodos foram comodescritos acima, em temperatura ambiente. As duas camadasde clorofórmio foram coletadas, combinadas e salvas. Asolução baseada em água restante foi descartada. A soluçãocombinada de clorofórmio contendo os constituintes químicospurificados de triterpeno foi evaporada sob pressãoreduzida usando evaporação rotatória, e o clorofórmioreciclado. A fração purificada de triterpeno da extraçãofoi seca no forno a 50°C, removendo o clorofórmio restante.O rendimento foi calculado por equilíbrio de massa, teortotal de triterpeno, usando um ensaio espectrometria UVpara triterpenóide total, e analisado com a utilização deHPLC.

Exemplo 4

Exemplo da Etapa 4: extração da fração de polissacarídeo

Um exemplo experimental típico de extração de solventee precipitação dos constituintes químicos hidrossolúveis,insolúveis em etanol, da fração purificada depolissacarídeo de espécies de ganoderma é o seguinte: amatéria-prima foi o resíduo sólido dos 25 g da extração porSFE da Etapa 1 e da extração por lixiviação de etanol daEtapa 2. A matéria-prima foi extraída usando 500 ml de águadestilada por duas horas a 70°C em dois estágios. As duassoluções de extração foram combinadas, e o caldo foifiltrado com a utilização de papel de filtro Fisherbrand P4(tamanho de poro de 4-8 μm) e centrifugadas a 2.000 rpm por20 minutos. O sobrenadante foi coletado. A evaporaçãorotatória foi usada para concentrar a solução transparentedo extrato do sobrenadante de 1.00 0 ml em 200 ml. A seguir,600 ou 800 ml de etanol anidro foram adicionados paraconstituir uma concentração final de etanol de 60 ou 80%.

Permitiu-se que a solução ficasse em repouso por 1 hora, efoi observado um precipitado. A solução de extração foicentrifugada a 2.000 rpm por 20 minutos e o sobrenadantedecantado, e salvo para processamento posterior oudescartado. O equilíbrio de massa foi realizado antes edepois da precipitação, para calcular o rendimento depolissacarídeos e proteínas. O precipitado foi coletado eseco em um forno a 50°C por 12 horas. A fração depolissacarídeo seca foi pesada e dissolvida em água paraanálise da pureza de polissacarídeo e proteína com autilização de um método colorimétrico com dextrana comopadrões de referência e o ensaio de proteína de Bradford,respectivamente.

Exemplo 5

Os ingredientes a seguir são misturados para a formulação:Extrato de corpo da fruta de G. Iucidum

150,0 mg

Fração de óleo essencial (10 mg, 6,6% do peso seco)Fração de polifenólico (120 mg, 80% do peso seco)Polissacarídeos (40 mg, 26,6% do peso seco)

Esteviosídeo (Extrato de estévia)

12,5 mg

Carboximetilcelulose

35,5 mg

Lactose

77,0 mg

Total

275,0 mg

0 novo extrato de espécies de ganoderma compreende umafração de óleo essencial, uma fração de triterpeno e umafração de polissacarídeo por % de peso de massa acimadaquela encontrada no material de planta natural deespécies de ganoderma ou em produtos de extraçãoconvencionais. As formulações podem ser feitas em qualquerforma de dosagem oral, e administradas diariamente ou ematé 15 vezes por dia, como necessário, para os efeitosfisiológicos, psicológicos e médicos (reforço imunológico,diabetes melito, antiagregação plaquetária e anti-trombose,prevenção e tratamento de doenças cardiovasculares ecerebrovasculares, anti-aterosclerose, anti-

hipercolesterolemia, anti-hipertensão, antiinflamatórios,antialérgica, anti-artrite, anti-reumáticos, anti-doençasautoimunes, antivirais incluindo, sem limitação, oresfriado comum, influenza, HIV, herpes simples, herpeszoster e hepatite B, antibacterianos e prevenção e terapiado câncer).

Os ingredientes a seguir foram misturados para aseguinte formulação:

Exemplo 6

Extrato do corpo da fruta de G. Iucidum

150,0 mgFração de óleo essencial (30 mg, 20% do peso seco)

Fração de polifenólico (60 mg, 40% do peso seco)

Polissacarídeos (60,0 mg, 40% do peso seco)Vitamina C 15,0 mg

Sucralose 35,0 mg

Pó de feijão-mungo 10:1 50,0 mg

Sabor moca 4 0,0 mg

Sabor chocolate 10,0 mg

Total 300,0 mg

Os novos extratos de espécies de ganoderma compreendemum óleo essencial, triterpeno e frações de constituintequímico de polissacarídeo por % de peso de massa acimadaquela encontrada no material de planta natural ou emprodutos de extração convencionais. A formulação pode serfeita em qualquer forma de dosagem oral, e administrada comsegurança até 15 vezes por dia, como necessário para osefeitos fisiológicos, psicológicos e médicos desejados(veja Exemplo 1, acima).

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Claims

1. Extrato de espécies de ganoderma, caracterizado porcompreender uma fração que possui um cromatograma deespectrometria de massa por Análise Direta em Tempo Real(DART) de qualquer uma das Figuras 6 a 29.

2. Extrato de espécies de ganoderma, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o extratocompreende um composto selecionado do grupo que consiste emum óleo essencial, um triterpeno, um polissacarídeo, ecombinações destes.

3. Extrato de espécies de ganoderma, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o óleoessencial é selecionado do grupo que consiste em ácido9,12-octadecadienóico, ácido linoelaidico, ácido n-hexadecanóico, ácido octoanóico, ácido tetradecanóico,ácido pentadecanóico, ácido 9-octadecenóico, ácidooctadecanóico, ácido 2-propenóico, éster tridecílico, 1-undecanol, 1-dodecanol, 1-tetradecanol, 1-hexadecanol, 1-heptadecanol, 1-eicosanol, e combinàções destes.

4. Extrato de espécies de ganoderma, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que otriterpeno é selecionado do grupo que consiste em ácidoganodérico, ácido lucidênico, ácido ganolucidico,ganoderiol, lucidona, lucidumol, ganodermenonol,ganodermadiol, ganodermatriol, ganodermanondiol,ganodermanontriol, e combinações destes.

5. Extrato de espécies de ganoderma, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que opolissacarídeo é selecionado do grupo que consiste emglicose, arabinose, galactose, ramnose, xilose, ácidourônico, e combinações destes.

6. Extrato de espécies de ganoderma, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de óleo essencial é maior do que 8% por peso.

7. Extrato de espécies de ganoderma, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de óleo essencial é de 25% a 90% por peso.

8. Extrato de espécies de ganoderma, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de óleo essencial é de 50% a 90% por peso.

9. Extrato de espécies de ganoderma, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de óleo essencial é de 75% a 90% por peso.

10. Extrato de espécies de ganoderma, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de triterpeno é maior do que 2% por peso.

11. Extrato de espécies de ganoderma, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de triterpeno é de 25% a 90% por peso.

12. Extrato de espécies de ganoderma, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de triterpeno é de 50% a 90% por peso.

13. Extrato de espécies de ganoderma, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de triterpeno é de 75% a 90% por peso.

14. Extrato de espécies de ganoderma, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de polissacarídeo é maior do que 15% por peso.

15. Extrato de espécies de ganoderma, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de polissacarídeo é de 25% a 90% por peso.

16. Extrato de espécies de ganoderma, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de polissacarídeo é de 50% a 90% por peso.

17. Extrato de espécies de ganoderma, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de polissacarídeo é de 75% a 90% por peso.

18. Extrato de espécies de ganoderma, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o extratocompreende um óleo essencial de 2% a 99% por peso, umtriterpeno de 5% a 88% por peso, e um polissacarídeo de 2%a 95% por peso.

19. Alimento ou medicamento, caracterizado porcompreender o extrato de espécies de ganoderma dareivindicação 1.

20. Método de preparação de um extrato de espécies deganoderma que possui pelo menos uma característicapredeterminada, caracterizado por compreender a extraçãoseqüencial de um material de planta de espécies deganoderma para gerar uma fração de óleo essencial, umafração de triterpeno, e uma fração de polissacarídeo por:a) extração de um material de planta de espécies deganoderma por extração supercrítica de dióxido de carbonopara gerar uma fração de óleo essencial e um primeiroresíduo;b) extração do primeiro resíduo da etapa (a) porextração alcoólica para gerar a fração de triterpeno e umsegundo resíduo; ec) extração do segundo resíduo da etapa (b) porextração com água e precipitação do polissacarídeo comálcool para gerar a fração de polissacarídeo.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende:- 1) carregamento em um vaso de extração de material deplanta triturado de espécies de ganoderma;- 2) adição de dióxido de carbono sob condiçõessupercrlticas;- 3) contato do material de planta de espécies deganoderma e do dióxido de carbono por um período de tempo;e- 4) coleta de uma fração de óleo essencial em um vasode coleta.

22. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado ainda por compreender a etapa de alteraçãodas proporções de composto químico de óleo essencial porfracionamento da fração de óleo essencial com um sistema deseparação fracionária supercrítico de dióxido de carbono.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que as condições supercríticascompreendem 6 MPa a 80 MPa de pressão a 35°C a 90°C.

24. Método, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que as condições supercríticascompreendem 6 MPa a 50 MPa de pressão a 40°C a 80°C.

25. Método, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que o tempo é de 3 0 minutosa 2,5 horas.

26. Método, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que o tempo é de 1 hora.

27. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a etapa b) compreende:-1) contato do primeiro resíduo da etapa (a) comsolvente alcoólico por um período de tempo suficiente paraextrair constituintes químicos de triterpeno;-2) purificação dos constituintes químicos detriterpeno com o uso de processos de extração de solventelíquido-líquido.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que um solvente é clorofórmio eo outro solvente é uma solução aquosa saturada de NaHCO3.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que o solvente alcoólico éetanol.

30. Método, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que a etapa (1) é realizada a30°C a 100°C.

31. Método, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que a etapa (1) é realizada a60°C a 100°C.

32. Método, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que o tempo é de 1-10 horas.

33. Método, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que o tempo é de 1-5 horas.

34. Método, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que o tempo é de 2 horas.

35. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende:-1) contato do material de planta de espécies deganoderma ou do segundo resíduo da etapa (b) com água porum período de tempo suficiente para extrairpolissacarídeos; e-2) precipitação do polissacarideo da solução de águapor precipitação cora álcool.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que a água está a 70°C a 90°C.

37. Método, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que a água está a 80°C a 90°C.

38. Método, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que o tempo é de 1-5 horas.

39. Método, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que o tempo é de 2-4 horas.

40. Método, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que o tempo é de 2 horas.

41. Método, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que o álcool é etanol.

42. Extrato de espécies de ganoderma, caracterizadopor ser preparado pelo método da reivindicação 20.

43. Extrato de espécies de ganoderma, caracterizadopor compreender ergosterol, ácido ganolucidico A a 25 a 35%por peso do ergosterol, ácido ganolucidico B de 10 a 20%por peso do ergosterol, e ácido ganodérico H de 30 a 40%por peso do ergosterol.

44. Extrato de espécies de ganoderma, caracterizadopor compreender ácido ganodérico H e ácido ganolucidico Ade 25 a 35% por peso do ácido ganodérico H.

45. Extrato de espécies de ganoderma, caracterizadopor compreender ácido ganodérico H, ácido lucidênico B de 5a 15% por peso do ácido ganodérico H, ácidos lucidênicosA/N de 1 a 10% por peso do ácido ganodérico H, e ácidoganolucidico A de 35 a 45% por peso do ácido ganodérico H.

46. Extrato de espécies de ganoderma, caracterizadopor compreender ácido ganodérico H e ganoderal de 5 a 15%por peso do ácido ganodérico H.

47. Extrato de espécies de ganoderma, caracterizadopor compreender ácido ganodérico H, ácido ganolucídico A de- 35 a 4 5% por peso do ácido ganodérico H, ácido ganolucídicoB de 10 a 20% por peso do ácido ganodérico H, ecerevisterol de 30 a 40% por peso do ácido ganodérico H.

48. Extrato de espécies de ganoderma, caracterizadopor compreender ácido ganodérico H, ácido ganolucídico B de- 10 a 20% por peso do ácido ganodérico H, e ganoderal de 5 a- 15% por peso do ácido ganodérico H.

49. Extrato de espécies de ganoderma, caracterizadopor compreender ácido ganodérico H, ácido ganolucídico B de- 10 a 20% por peso do ácido ganodérico H, metoxicerevisterolde 20 a 30% por peso do ácido ganodérico H, e cerevisterolde 20 a 30% por peso do ácido ganodérico H.

50. Extrato de espécies de ganoderma, caracterizadopor compreender ergosterol, ácido ganolucídico A de 3 0 a- 40% por peso do ergosterol, ácido ganolucídico B de 5 a 15%por peso do ergosterol, e ácido ganodérico H de 65 a 75%por peso do ergosterol.

51. Extrato de espécies de ganoderma, caracterizadopor compreender ácido ganodérico H, ácido ganolucídico B de- 30 a 40% por peso do ácido ganodérico H, metoxicerevisterolde 40 a 50% por peso do ácido ganodérico H, e cerevisterolde 3 5 a 4 5% por peso do ácido ganodérico H.

52. Extrato de espécies de ganoderma, caracterizadopor compreender ergosterol, ácidos ganolucídicos A/B de 1 a- 10% por peso do ergosterol, ganoderiol F de 1 a 10% porpeso do ergosterol, e lanosterol de 50 a 60% por peso doergosterol.

53. Extrato de espécies de ganoderma, caracterizadopor compreender ácido ganodérico H, ácido ganolucídico A de-60 a 70% por peso do ácido ganodérico H, ácido ganolucídicoB de 25 a 35% por peso do ácido ganodérico H, e ácidoslucidênicos A/N de 10 a 20% por peso do ácido ganodérico H.