BRPI0709053A2

BRPI0709053A2 - extratos e métodos que compreendem espécies de chá verde

Info

Publication number: BRPI0709053A2
Application number: BRPI0709053-6A
Authority: BR
Inventors: Robert T Gow; George W Sypert; Dan Li; Randall S Alberte
Original assignee: Herbalscience Singapore Pte Ltd
Priority date: 2006-03-23
Filing date: 2007-03-23
Publication date: 2011-06-28
Also published as: CA2643860A1; EP2010196A4; WO2007109802A2; IL193798A0; JP2009531162A; MX2008012065A; US20080113044A1; EP2010196A2; AU2007227384A1; WO2007109802A3; CN101454015A; KR20090010172A

Abstract

EXTRATOS E MéTODOS QUE COMPREENDEM ESPéCIES DE CHá VERDE. A presente invenção está relacionada aos extratos de material de planta de espécies de chá verde preparados por métodos de extrações supercríticas de CO~ 2~.

Description

EXTRATOS E MÉTODOS QUE COMPREENDEM ESPECIES DE CHA VERDE

PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício de prioridade parao Pedido Provisório de Patente U.S. número de série60/785.178, depositado em 23 de março de 2006, que é aquiincorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção está relacionada a extratos de espécies dechá verde, métodos de sua preparação com o uso de etapas deextrações seqüenciais, e métodos de tratamento destes.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

O chá tem origem no sul da China há aproximadamente4.000 anos, e é consumido por mais de dois terços dapopulação do mundo. O chá tem um odor atrativo, um saborexcelente e efeitos saudáveis que o tornam a bebida maispopular no mundo, atrás somente da água. Há 3.000 A.C., ochá era usado pelos chineses como uma bebida medicinal. Ouso médico do chá foi registrado na antiga farmacopéiachinesa "Ben Cao Gang Mo", escrita durante a Dinastia Ming(século XVI). A fonte do chá é a planta Camellia sinensis.

Literalmente centenas de chás são produzidas atualmente dasfolhas de C. sinensis e são geralmente classificados emtrês categorias principais: chá verde não fermentado,oolong parcialmente fermentado e chá preto completamentefermentado.

Camellia sinensis, um membro da família Theaceae, é umarbusto ou uma árvore perene que pode crescer até umaaltura de 9,144 metros. No entanto, ela é normalmentepodada até uma altura de 0,5-1,5 metro no cultivo de folhasde chá. A planta é altamente ramificada com folhas verde-escuras, pilosas, oblongas-ovaladas, cultivadas epreferencialmente colhidas como galhos jovens. As folhasmais velhas são geralmente consideradas como sendo dequalidade inferior.

Embora tanto o chá verde quanto o preto sejamderivados da planta Camellia sinensis, é o processamentodas folhas que diferencia os dois tipos de chá. No caso doschás pretos, após as folhas serem colhidas, permite-se queelas sequem e depois se enrolem. Deixa-se que as folhasfermentem, convertendo os polifenóis do chá (catequinas) emflobafenos e formando anéis aromáticos. A fermentaçãoocorre à medida que as enzimas da folha, incluindo oxidatode polifenol, reagem com os polifenóis do chá,particularmente as catequinas [1] . No caso da produção dechá verde, não se permite que folhas jovens oxidem. Em vezdisso, as folhas são cozidas no vapor, o que inativa asenzimas oxidativas, preservando, dessa forma, as catequinasdo chá.

Os constituintes químicos da folha de chá verdeincluem os polifenóis, metilxantinas, aminoácidos, ácidosorgânicos, carboidratos, proteínas, lignina, lipídeos,clorofila e outros pigmentos, cinza e óleos essenciais;veja a Tabela 1 [2,3] . Do ponto de vista comercial ebiológico, os polifenóis e a cafeína têm sidotradicionalmente considerados mais importantes do que osoutros constituintes. No entanto, demonstrou-serecentemente que outros constituintes químicos como, porexemplo, teanina, os óleos essenciais e os polissacarídeoshidrossolúveis-insolúveis em etanol possuem efeitosbenéficos biologicamente importantes (veja resumo abaixo).Tabela 1. Constituintes químicos principais das folhas dechá verde.

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* Toxicidade

O chá verde contém 30-42% de polifenóis por % de massado peso seco. A maioria desses polifenóis, os quais também,conforme constatado, possuem a atividade biologicamentemais benéfica, são os flavonóis conhecidos como"catequinas". As catequinas principais incluem asseguintes: (-)-epigalocatequina-3-gaiato (EGCG), (-)-epigalocatequina (EGC), gaiato de (-)-catequina (CG) eepicatequina (EC). As maiores concentrações estão, em ordemdecrescente, na EGCG, seguida por EGC, ECG, EC. Outrascatequinas, incluindo (+)galocatequina (GC), gaiato de (-)-galocateqüina (GCG), gaiato de (-)-catequina (CG) e (+)-catequina (C), estão presentes em quantidades menores.

Foram estudados muitos efeitos biológicos benéficos dascatequinas. Esses incluem atividades antioxidantes, efeitosantimutagênicos, efeitos anticarcinogênicos, inibição danitrosação e ações inibidoras do crescimento de célulastumorais e imortalizadas, mas sem efeito sobre célulasnormais. No entanto, outros grupos de constituintesquímicos também exibem efeitos biologicamente benéficos.

Por exemplo, os constituintes químicos do óleo essencial(EO) possuem atividade antioxidante, atividadeantiasmática, atividade antibacteriana, atividadeantiviral, atividade anticâncer, atividade imunológicaaumentada, atividade hipoglicêmica, atividadehipolipidêmica, atividade antiinflamatória, atividade anti-dermatítica, atividade antiacne e atividadeantiaterosclerose. A teanina (T) possui atividade redutorada ansiedade e de melhora do humor, atividade de aumentocognitivo, atividade anticâncer, atividade neuroprotetoracontra isquemia cerebral e acidente vascular cerebral eatividade de redução do peso. Além disso, ospolissacarídeos (P) do chá verde possuem atividadeantioxidante e de remoção de radical livre de oxigênio,atividade antidiabética e atividade de aumento imunológico.

Para resumir brevemente o valor terapêutico dosconstituintes químicos do chá verde, pesquisas científicase estudos clínicos recentes demonstraram os seguintesefeitos terapêuticos dos vários compostos químicos, fraçõesquímicas e produtos de extração grosseiros de chá verde queincluem os seguintes: poderosa ação antioxidante, remoçãode radical livre de oxigênio e inibição da nitrosação (EO,catequinas - basicamente ECGC e ECG, P, extrato) [4-7] ;atividade antimutagênica (EO, catequinas, extrato) [7-12];atividade anticarcinogênica, sem efeito sobre célulasnormais (EO, catequinas, T, extrato) [7-13]; atividadeprotetora da pele (EO, catequinas, P, extrato) [8, 10, 11,14, 15]; ação anti-doença cardiovascular (EO, catequinas,extrato) [4-7, 16, 17]; anti-hiperlipidemia (extrato) [16];atividade anti-acidente vascular cerebral e de proteçãocerebral (EO, catequinas, Τ, P, extrato) [18, 19] ;atividade anti-doença periodontal (extrato) [20]; atividadeanti-osteoporose (extrato) [21]; reforço imunológico(extrato) [22]; atividade antiviral, anti-HIV eantibacteriana (EO, catequinas, extrato) [23]; perda depeso e termogênese (catequinas, cafeína, T, extrato)[23,24]; ant!envelhecimento (catequinas - ECGC, extrato)[23]; redução da ansiedade, atividade de melhora do humor ede aumento cognitivo (T, extrato) [25,26]; e atividadeanti-diabetes (P, extrato) [27].

Embora o chá verde seja geralmente seguro e atóxico emdoses muito elevadas, um resultado potencial do consumo debebidas de chá verde e produtos medicinais é odesenvolvimento de distúrbios relacionados à cafeína, porexemplo, arritmias cardíacas, distúrbios gastrintestinais,e toxicidade da cafeína manifestada por jitteriness,ansiedade generalizada, insônia. Além disso, o consumoexcessivo de cafeína exagera o estresse e a liberação dehormônios relacionados ao estresse. A pressão arterial podeser elevada e os riscos de ataque cardíaco e acidentevascular cerebral estão aumentados quando a cafeína éconsumida em excesso.

Em vista da ausência de uma seletividade aumentada nosprocessos de extração atualmente disponíveis, os produtosde chá verde disponíveis atualmente são suspeitos emrelação às suas composições químicas. Dessa forma, sãonecessárias composições de extrato de chá verde inéditas ereprodutíveis que combinem óleo essencial purificado,catequinas com altas frações de constituintes químicos deECGC, teanina e de polissacarídeo com baixas concentraçõesde cafeína que possam ser produzidas com quantidadespadronizadas e confiáveis desses constituintes químicosbenéficos do chá verde que atuam sinergicamente [14, 28]fisiológica e medicamente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção está relacionada aum extrato de espécies de chá verde que compreende umafração que possui um cromatograma de espectrometria demassa por Análise Direta em Tempo Real (DART) de qualqueruma das Figuras 6 a 25.

Em uma modalidade adicional, o extrato compreende umcomposto selecionado do grupo que consiste em um óleoessencial, um polifenol, um polissacarideo, e combinaçõesdestes. Em uma modalidade adicional, o óleo essencial éselecionado do grupo que consiste em ácido n-hexadecanóico,ácido tetradecanóico, 9-hexadecanol, 1-undecanol, 1-hexadecanol, álcool oleílico, 9-octadecen-l-ol,nonadecanol, e combinações destes. Em uma modalidadeadicional, o polifenol é selecionado do grupo que consisteem catequinas, flavonóis, glicosideos de flavonol, ecombinações destes. Em uma modalidade adicional, acatequina é selecionada do grupo que consiste em catequina(C), epicatequina (EC), gaiato de epicatequina (ECG),galocatequina (GC), gaiato de epigalocatequina (EGCG),epigalocatequina (EGC), e combinações destes. Em umamodalidade adicional, o flavonol é selecionado do grupo queconsiste em quercetina e rutina. Em uma modalidadeadicional, o glicosídeo de flavonol é kaempferol. Em umamodalidade adicional, o polissacarideo é selecionado dogrupo que consiste em glicose, arabinose, galactose,ramnose, xilose, ácido urônico e combinações destes. Em umamodalidade adicional, as espécies de chá verde da presenteinvenção são substancialmente livres de cafeína, ácidooxálico ou taninos.

Em uma modalidade adicional, a quantidade de óleoessencial é maior do que 2% por peso. Em uma modalidadeadicional, a quantidade de óleo essencial é de 25% a 90%por peso. Em uma modalidade adicional, a quantidade de óleoessencial é de 50% a 90% por peso. Em uma modalidadeadicional, a quantidade de óleo essencial é de 75% a 90%por peso.

Em uma modalidade adicional, a quantidade de polifenolé maior do que 40% por peso. Em uma modalidade adicional, aquantidade de polifenol é de 50% a 90% por peso. Em umamodalidade adicional, a quantidade de polifenol é de 75% a90% por peso.

Em uma modalidade adicional, a quantidade depolissacarídeo é maior do que 15% por peso. Em umamodalidade adicional, a quantidade de polissacarídeo é de25% a 90% por peso. Em uma modalidade adicional, aquantidade de polissacarídeo é de 50% a 90% por peso. Emuma modalidade adicionàl, a quantidade de polissacarídeo éde 75% a 90% por peso.

Em uma modalidade adicional, o extrato de espécies dechá verde compreende um óleo essencial de 2% a 97% porpeso, uma catequina de 15% a 98% por peso, uma teanina de4% a 90% por peso e um polissacarídeo de 9% a 98% por peso.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaum alimento ou medicamento que compreende o extrato deespécies de chá verde da presente invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um método de preparação de um extrato de chá verde quepossui pelo menos uma característica predeterminada quecompreende a extração seqüencial de um material de plantade espécies de chá verde para gerar uma fração de óleoessencial, uma fração de polifenol e uma fração depolissacarídeo por: a) extração de um material de planta deespécies de chá verde por extração de dióxido de carbonosupercrítico para gerar uma fração de óleo essencial e umprimeiro resíduo; b) extração de um material de planta deespécies de chá verde ou do primeiro resíduo da etapa (a)por extração alcoólica para gerar a fração polifenólica eum segundo resíduo; e c) extração do segundo resíduo daetapa (a) por extração com água e precipitação dopolissacarídeo com álcool para gerar a fração depolissacarídeo.

Em uma modalidade adicional, o primeiro resíduo daetapa (a) é ainda descafeinado por extração de dióxido decarbono supercrítico. Em uma modalidade adicional, a fraçãopolifenólica é ainda purificada por cromatografia poradsorvente de afinidade.

Em uma modalidade adicional, etapa (a) compreende: 1)carregamento em um vaso de extração de material de plantatriturado de espécies de chá verde; 2) adição de dióxido decarbono sob condições supercríticas; 3) contato do materialde planta de espécies de chá verde e do dióxido de carbonopor um período de tempo; e 4) coleta de uma fração de óleoessencial em um vaso de coleta. Em uma modalidadeadicional, a etapa (a) ainda compreende a alteração dasproporções de composto químico de óleo essencial porfracionamento da fração de óleo essencial com um sistema deseparação fracionária supercrítica de dióxido de carbono.Em uma modalidade adicional, condições supercríticascompreendem 6 MPa a 8 0 MPa de pressão a 35°C a 90°C. Em umamodalidade adicional, condições supercríticas compreendem 6MPa a 50 MPa de pressão a 40°C a 80°C. Em uma modalidadeadicional, o tempo é de 30 minutos a 2,5 horas. Em umamodalidade adicional, o tempo é de 1 hora.

Em uma modalidade adicional, a etapa (b) compreende:

1) contato do material de planta triturado de espécies dechá verde ou do primeiro resíduo da etapa (a) com umsolvente alcoólico por um período de tempo suficiente paraextrair constituintes químicos de polifenol; 2) passagem deuma solução aquosa de constituintes químicos polifenólicosextraídos da etapa (1) através de uma coluna de resinaadsorvente por afinidade na qual os constituintespolifenólicos são adsorvidos; 3) eluição dos compostos decafeína pelo adsorvente de afinidade com o uso de umsolvente de eluição ácido; e 4) eluição dos constituintesquímicos polifenólicos da resina adsorvente por afinidadecom o uso de um solvente de eluição hidroalcoólico. Em umamodalidade adicional, a solução hidroalcoólica compreendeetanol e água, em que a concentração de etanol é de 10-95%por peso. Em uma modalidade adicional, a soluçãohidroalcoólica compreende etanol e água, em que aconcentração de etanol é de 25% por peso. Em uma modalidadeadicional, a etapa (1) é realizada a 30°C a 100°C. Em umamodalidade adicional, a etapa (1) é realizada entre 60°C a100°C. Em uma modalidade adicional, o tempo é de 1-10horas. Em uma modalidade adicional, o tempo é de 1-5 horas.

Em uma modalidade adicional, o tempo é de 2 horas.

Em uma modalidade adicional, a etapa (c) compreende:1) contato do segundo resíduo da etapa (b) com água por umperíodo de tempo suficiente para extrair polissacarídeos; e

2) precipitação dos polissacarídeos da solução de água porprecipitação com álcool. Em uma modalidade adicional, aágua está a 70°C a 90°C. Em uma modalidade adicional, aágua está a 80°C a 90°C. Em uma modalidade adicional, otempo é de 1-5 horas. Em uma modalidade adicional, o tempoé de 2-4 horas. Em uma modalidade adicional, o tempo é de 2horas. Em uma modalidade adicional, o álcool é etanol.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de chá verde preparado pelosmétodos da presente invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de chá verde que compreendepirogalol, teofilina/teobromina de 25 a 35% por peso dopirogalol, ácido chiquímico de 0,1 a 5% por peso dopirogalol, ácido cumárico de 0,1 a 5% por peso dopirogalol, e 3-metóxi-l-tirosina de 0,1 a 5% por peso dopirogalol.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de chá verde que compreendeteanina, teof ilina/teobromina de 20 a 30% por peso dateanina, catequina/epicatequina de 1 a 10% por peso dateanina, ácido gálico de 1 a 10% por peso da teanina,catequina quinona de 0,1 a 5% por peso da teanina,cinamaldeído de 0,1 a 5% por peso da teanina, e 3-metóxi-l-tirosina de 1 a 10% por peso da teanina.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de chá verde que compreendeteanina, teof ilina/teobromina de 45 a 55% por peso dateanina, catequina/epicatequina de 1 a 10% por peso dateanina, ácido carnósico de 0,1 a 5% por peso da teanina,ácido gálico de 1 a 10% por peso da teanina, catequinaquinona de 0,5 a 5% por peso da teanina, cinamaldeído de 1a 10% por peso da teanina, ácido metil cinâmico de 0,1 a 5%por peso da teanina, cinamida de 1 a 10% por peso dateanina, e 3-metóxi-l-tirosina de 1 a 10% por peso dateanina.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de chá verde que compreendepirogalol, teof ilina/teobromina de 1 a 10% por peso dopirogalol, teanina de 0,1 a 5% por peso do pirogalol,catequina/epicatequina de 1 a 10% por peso do pirogalol,kaempferol de 5 a 15% por peso do pirogalol, miricetina de0,1 a 5% por peso do pirogalol, galocatequina quinona de0,1 a 5% por peso do pirogalol, ácido gálico de 65 a 75%por peso do pirogalol, catequina quinona de 0,5 a 5% porpeso do pirogalol, ácido vanílico de 1 a 10% por peso dopirogalol, e 3-metóxi-l-tirosina de 1 a 5% por peso dopirogalol.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de chá verde que compreendekaempferol, teanina de 1 a 10% por peso do kaempferol,catequina/epicatequina de 95 a 105% por peso do kaempferol,quercetina de 20 a 30% por peso do kaempferol, miricetinade 5 a 15% por peso do kaempferol, galocatequina quinona de5 a 10% por peso do kaempferol, ácido gálico de 55 a 65%por peso do kaempferol, catequina quinona de 1 a 10% porpeso do kaempferol, ácido cumárico de 10 a 20% por peso dokaempferol, ácido vanílico de 1 a 10% por peso dokaempferol, e 3-metóxi-l-tirosina de 15 a 25% por peso dokaempferol.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de chá verde que compreendepirogalol, teof ilina/teobromina de 0,5 a 5% por peso dopirogalol, catequina/epicatequina de 95 a 105% por peso dopirogalol, kaempferol de 55 a 65% por peso do pirogalol,quercetina de 2 0 a 3 0% por peso do pirogalol, miricetina de10 a 20% por peso do pirogalol, galocatequina quinona de 20a 30% por peso do pirogalol, ácido gálico de 50 a 60% porpeso do pirogalol, catequina quinona de 15 a 25% por pesodo pirogalol, ácido cumárico de 15 a 25% por peso dopirogalol, ácido vanílico de 1 a 10% por peso do pirogalol,e 3-metóxi-l-tirosina de 0,5 a 5% por peso do pirogalol.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de chá verde que compreendepirogalol, teof ilina/teobromina de 0,5 a 5% por peso dopirogalol, catequina/epicatequina de 95 a 105% por peso dopirogalol, kaempferol de 55 a 65% por peso do pirogalol,quercetina de 20 a 30% por peso do pirogalol, miricetina de10 a 20% por peso do pirogalol, galocatequina quinona de 20a 3 0% por peso do pirogalol, ácido gálico de 50 a 60% porpeso do pirogalol, catequina quinona de 15 a 25% por pesodo pirogalol, ácido cumárico de 15 a 25% por peso dopirogalol, ácido vanílico de 1 a 10% por peso do pirogalol,e 3-metóxi-l-tirosina de 0,5 a 5% por peso do pirogalol.

Em outro aspecto, a presente invenção está relacionadaa um extrato de espécies de chá verde que compreendepirogalol, teanina por peso do pirogalol,catequina/epicatequina a 90 a 100% por peso do pirogalol,kaempferol de 65 a 75% por peso do pirogalol, quercetina de15 a 25% por peso do pirogalol, miricetina de 5 a 15% porpeso do pirogalol, galocatequina quinona de 5 a 15% porpeso do pirogalol, ácido gálico de 65 a 75% por peso dopirogalol, catequina quinona de 5 a 15% por peso dopirogalol, ácido cumárico de 10 a 20% por peso dopirogalol, ácido vanxlico de 1 a 10% por peso do pirogalol,e 3-metóxi-l-tirosina de 1 a 10% por peso do pirogalol.

As extrações da presente invenção são úteis nofornecimento de efeitos fisiológicos e médicos que incluem,sem limitação, atividade antioxidante, remoção de radicallivre de oxigênio, inibição da nitrosação, atividadeantimutagênica (prevenção do câncer), atividadeanticarcinogênica (terapia do câncer), proteção da pele,antienvelhecimento, anti-doença cardiovascular, prevenção eterapia do acidente vascular cerebral, proteção cerebral,anti-hiperlipidemia, anti-doença periodontal, anti-osteoporose, aumento imunológico, atividade antiviral,anti-HIV e antibacteriana, atividade antifúngica, atividadeantiviral, controle de peso e termogênese, anti-diabetes eredução da ansiedade, melhora do humor e melhora dasfunções cognitivas.

Essas modalidades da especificação, outras modalidadese seus recursos e características ficarão evidentes apartir da descrição, desenhos e reivindicações que serãoapresentados a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 descreve um diagrama esquemático exemplarda extração de dióxido de carbono supercrítico de óleoessencial (Etapa 1) e descafeinação de chá verde (Etapa 2)de acordo com a presente invenção.

A Figura 2 descreve um diagrama esquemático exemplarda extração de etanol da fração bruta dos constituintesquímicos catequina do chá verde de acordo com a presenteinvenção.

A Figura 3 descreve um diagrama esquemático exemplarde um processo de extração por adsorvente de afinidade deacordo com a presente invenção.

A Figura 4 descreve um diagrama esquemático exemplarda extração por lixiviação de água para L-teanina epolissacarldeos de acordo com a presente invenção.

A Figura 5 descreve um diagrama esquemático exemplarda purificação de frações de L-teanina e polissacarídeo deacordo com a presente invenção.

A Figura 6 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a fração de polissacarídeo do chá verde da etapa 6 dospresentes métodos (modo íon positivo).

A Figura 7 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a fração de polissacarídeo do chá verde da etapa 6 dospresentes métodos (modo íon negativo).

A Figura 8 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a fração de polissacarídeo do chá verde da etapa 6 dospresentes métodos (modo íon positivo).

A Figura 9 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a fração de polissacarídeo do chá verde da etapa 6 dospresentes métodos (modo íon negativo).

A Figura 10 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a fração de polissacarídeo do chá verde da etapa 6 dospresentes métodos (modo íon positivo).

A Figura 11 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a fração de polissacarídeo do chá verde da etapa 6 dospresentes métodos (modo íon negativo).

A Figura 12 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o chá verde disponível comercialmente (Kai Hua LongDing) (modo íon positivo).

A Figura 13 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o extrato de chá verde bruto por lixiviação de etanol95% da etapa 3 dos presentes métodos (modo íon positivo).

A Figura 14 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a alimentação de ácido fenólico de chá verde da etapa4 dos presentes métodos por cromatografia em coluna com ouso de material compactado de dessorção XAD 7HP (modo íonpositivo).

A Figura 15 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a fração purificada de chá verde F2 da etapa 4 dospresentes métodos por cromatografia em coluna com o uso dematerial compactado de dessorção XAD 7HP (modo íonpositivo).

A Figura 16 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a fração purificada de chá verde F3 da etapa 4 dospresentes métodos por cromatografia em coluna com o uso dematerial compactado de dessorção XAD 7HP (modo íonpositivo).

A Figura 17 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a fração purificada de chá verde F4 da etapa 4 dospresentes métodos por cromatografia em coluna com o uso dematerial compactado de dessorção XAD 7HP (modo íonpositivo).

A Figura 18 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a fração purificada de chá verde F5 da etapa 4 dospresentes métodos por cromatografia em coluna com o uso dematerial compactado de dessorção XAD 7HP (modo íonpositivo).

A Figura 19 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara o chá verde disponível comercialmente (Kai Hua LongDing) (modo íon negativo).

A Figura 20 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara extrato de chá verde bruto por lixiviação de etanol95% da etapa 3 dos presentes métodos (modo íon negativo).

A Figura 21 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a alimentação de ácido fenólico de chá verde da etapa4 dos presentes métodos por cromatografia em coluna com ouso de material compactado de dessorção XAD 7HP (modo íonnegativo).

A Figura 22 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a fração purificada de chá verde F2 da etapa 4 dospresentes métodos por cromatografia em coluna com o uso dematerial compactado de dessorção XAD 7HP (modo íonnegativo).

A Figura 23 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a fração purificada de chá verde F3 da etapa 4 dospresentes métodos por cromatografia em coluna com o uso dematerial compactado de dessorção XAD 7HP (modo íonnegativo).

A Figura 24 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a fração purificada de chá verde F4 da etapa 4 dospresentes métodos por cromatografia em coluna com o uso dematerial compactado de dessorção XAD 7HP (modo íonnegativo).

A Figura 25 descreve o Espectro de Massa AccuTOF-DARTpara a fração purificada de chá verde F5 da etapa 4 dospresentes métodos por cromatografia em coluna com o uso dematerial compactado de dessorção XAD 7HP (modo íonnegativo).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições

Os artigos "um" e "uma" são aqui usados para sereferir a um ou a mais de um (ou seja, a pelo menos um) dosobjetos gramaticais do artigo. Como exemplo, "um elemento"significa um elemento ou mais de um elemento.

Como aqui usado, o termo "partes aéreas" refere-se àspartes constituintes de C. sinensis que compreendem folhase caules.

Como aqui usado, o termo "fração de catequina"compreende os compostos de catequina hidrossolúveis esolúveis em etanol obtidos ou derivados de chá verde, quecompreendem ainda, sem limitação, compostos como, porexemplo, ECGC, EGC, ECG, EC, GC, GCC, GC e C.

Os termos "que compreende" e "còmpreénderido" sãousados no sentido aberto, inclusivo, significando que podemser incluídos elementos adicionais.

0 termo "que consiste" é usado para limitar oselementos àqueles especificados, exceto quanto às impurezasnormalmente a ele associadas.

0 termo "que consiste essencialmente em" é usado paralimitar os elementos àqueles especificados e àqueles quenão afetam materialmente as características básicas einéditas do material ou das etapas.

Como aqui usado, o termo "descafeinado" compreendecomposições de extração de chá verde que possuem umaconcentração de cafeína menor do que aquela encontrada nomaterial de planta de folha de chá verde.

0 termo "quantidade eficaz", como aqui usado, refere-se à quantidade necessária para despertar a respostabiológica desejada. Como será observado por aqueleshabilitados nesta técnica, a quantidade eficaz de umcomposto ou agente bioativo pode variar, dependendo defatores como o resultado biológico desejado, o agentebioativo a ser liberado, a composição da matriz deencapsulação, o tecido-alvo etc.

Como aqui usado, o termo "fração de óleo essencial"compreende compostos lipossolúveis, não hidrossolúveis,obtidos ou derivados de chá verde, incluindo, semlimitação, os compostos químicos classificados como ácidon-hexadecanóico, ácido tetradecanóico, 9-hexadecanol, E,álcool oleílico, 1-octadecaol, fitol e diidroactinidiolida.

Como aqui usado, o termo "matéria-prima" refere-segeralmente a uma matéria-prima de planta que compreendeplantas inteiras isoladamente ou em combinação com uma oumais partes constituintes de uma planta que compreendemfolhas, raízes, incluindo, sem limitação, raízesprincipais, raízes ramificadas e raízes de fibras, caules,folhas, sementes e flores, em que a planta ou as partesconstituintes podem compreender material que é bruto, seco,cozido, aquecido ou de algum outro modo submetido aprocessamento físico para facilitar o processamento, quepode ainda compreender material que esteja intacto,cortado, picado, cortado em cubos, triturado, moído ou dealgum outro modo processado para afetar o tamanho e aintegridade física do material de planta. Ocasionalmente, otermo "matéria-prima" pode ser usado para caracterizar umproduto de extração que deve ser usado como fonte dealimentação para processos de extração adicionais.

Como aqui usado, o termo "fração" significa acomposição de extração que compreende um grupo específicode compostos químicos caracterizados por certaspropriedades físico-químicas ou propriedades físicas ouquímicas.

Como aqui usado, o termo "chá verde" refere-se àsfolhas ou ao material de planta aéreo derivado da espéciebotânica Camellia sinensis. 0 termo "chá verde" também éusado de forma intercambiável com espécies de C. sinensis,e significa essas plantas, clones, variantes e cepas etc.Chá verde é o nome farmacêutico para produtos de extraçãoconvencionais do material de planta da espécie C. sinensisprocessado para produzir folhas de chá verde.

Como aqui usado, o termo "constituintes do chá verde"significa os compostos químicos encontrados em espécies dechá verde e engloba todos os compostos químicosidentificados acima, além de outros compostos encontradosem espécies de chá verde, incluindo, sem limitação, osconstituintes químicos do óleo essencial, catequinas,teanina e polissacarídeos.

Como aqui usado, o termo "um ou mais compostos"significa pelo menos um composto, por exemplo, ácido n-hexadecanóico (um constituinte químico lipídico solúvel doóleo essencial de chá verde) ou ECGC (uma catequinahidrossolúvel e solúvel em água-etanol do chá verde) outeanina (um aminoácido hidrossolúvel do chá verde) ou umamolécula de polissacarídeo hidrossolúvel ou solúvel emetanol do chá verde, ou significa mais de um composto, porexemplo, ácido n-hexadecanóico e ECGC. Como conhecido natécnica, o termo "composto" não significa uma únicamolécula, mas múltiplos ou moles de um ou mais composto.

Como conhecido na técnica, o termo "composto" significa umconstituinte químico específico que possui propriedadesquímicas e físicas distintas, enquanto "compostos" referem-se a um ou mais constituintes químicos.

Como aqui usado, o termo "fração de polissacarídeo"compreende compostos polissacarídicos hidrossolúveis einsolúveis em etanol obtidos ou derivados de chá verde.Exemplos não limitantes de polissacarídeos incluem glicose,arabinose, galactose, ramnose, xilosê, ácido urônico ecombinações destes.

Outros constituintes químicos de chá verde tambémpodem estar presentes nessas frações de extração.

Como aqui usado, o termo "perfil" refere-se àsproporções por percentual de peso de massa dos compostosquímicos dentro de uma fração de extração ou às proporçõesdo percentual do peso de massa de cada um dos quatroconstituintes químicos da fração de chá verde em umacomposição de extração de chá verde final.

Como aqui usado, o termo fração ou composição"purificada" significa uma fração ou composição quecompreende um grupo específico de compostos caracterizadospor certas propriedades físico-químicas ou propriedadesfísicas ou químicas que estão concentradas a mais de 50%dos constituintes químicos da fração ou da composição. Emoutras palavras, uma fração ou composição purificadacompreende menos de 50% de compostos químicos constituintesque não são caracterizados por certas propriedades físico-químicas ou propriedades físicas ou químicas desejadas quedefinem a fração ou composição.

0 termo "sinérgico" é reconhecido da técnica e refere-se a dois ou mais componentes que trabalham juntos de talforma que o efeito total é maior do que a soma doscomponentes.

Como aqui usado, o termo "fração de teanina"compreende teanina hidrossolúvel, um aminoácido obtido ouderivado do chá verde.

O termo "tratamento" é reconhecido na técnica erefere-se à cura, bem como à melhora, de pelo menos umsintoma de qualquer condição ou distúrbio.

Extrações

A presente invenção compreende extrações de fraçõesisoladas e purificadas de óleos essenciais, catequinas,teanina e polissacarídeos de uma ou mais matérias-primas dechá verde. Essas frações individuais podem ser combinadasem proporções específicas (perfis) para a geração decombinações benéficas, e podem fornecer produtos deextratos que não são encontrados em produtos de extratosconhecidos atualmente. Por exemplo, uma fração de óleoessencial de uma espécie pode ser combinada com uma fraçãode catequina da mesma espécie ou de espécies diferentes, eaquela combinação pode ou não ser combinada com uma fraçãode teanina ou com uma fração de polissacarídeo do mesmomaterial da matéria-prima de chá verde òu de um material damatéria-prima de chá verde diferente. Tais extraçõesincluem frações que possuem quantidades predeterminadas depelo menos um de óleo essencial, catequina, teanina, oufrações de polissacarídeo. As modalidades compreendemextrações de chá verde que são livres de ácido oxálico. Asmodalidades compreendem extrações de chá verde que sãodescafeinadas.

Modalidades adicionais compreendem extrações quecompreendem perfis alterados (distribuição de proporção)dos constituintes químicos do chá verde em relação àquelesencontrados no material de planta nativo ou em produtos deextrato de chá verde disponíveis atualmente. Por exemplo, aconcentração da fração de óleo essencial pode estaraumentada ou diminuída em relação às concentrações decatequina e/ou teanina e/ou polissacarídeo. Similarmente,as concentrações de catequinas ou de teanina ou depolissacarídeos podem estar aumentadas ou diminuídas emrelação às de outras frações constituintes do extrato parapermitir composições de um novo perfil de constituintesquímicos para efeitos biológicos específicos.

Em uma modalidade, uma extração da presente invençãopode compreender mais de 2% por peso de massa de

constituintes químicos de óleo essencial. Óutra modalidadedessas extrações compreende uma concentração predeterminadade catequina, em que a concentração de catequina é maior doque aquela encontrada no material de planta nativo ou emextratos convencionais de espécies de chá verde. Porexemplo, uma extração pode compreender novas catequinas dechá verde em uma concentração de mais de 3 0% por peso demassa da extração. Õutra modalidade dessas extrações podecompreender uma concentração de L-teanina de mais de 2% porpeso de massa, o que é maior do que a concentração de L-

teanina natural no chá verde no material de planta nativoou em produtos de extração disponíveis atualmente.

A alteração dos relacionamentos de concentração(perfis químicos) dos constituintes químicos benéficos dasespécies individuais de chá verde permite a formulação deprodutos de extração de espécies de chá verde únicos ouinéditos projetados para condições ou enfermidades humanasespecíficas. Por exemplo, uma composição de chá verdeinédita e potente para atividade antioxidante, de remoçãode radical livre de oxigênio e de inibição da nitrosaçãopoderia ter composições maiores de óleo essencialpurificado, catequina e polissacarídeo e uma composiçãoreduzida de L-teanina por % de peso de massa do que aquelasencontradas no material de planta nativo de chá verde ou emprodutos de extração convencionais conhecidos. Emcontraste, uma nova extração de chá verde para a prevençãodo câncer poderia ter frações maiores de óleo essencialpurificado e de catequina e frações reduzidas de L-teaninae polissacarídeo por % de peso de massa do que aquelasencontradas no material de planta nativo de chá verde ou emprodutos de extração convencionais conhecidos. Outroexemplo de um perfil de uma nova extração de chá verde paraatividade anti-acidente vascular cerebral e proteçãocerebral poderia ter um perfil de extração com composiçõesmaiores de óleo essencial purificado, catequina, L-teaninae polissacarídeo por % de peso de massa do que aquelasencontradas no material de planta nativo de chá verde ou emprodutos de extração de chá verde convencionais conhecidos.Para atividade antienvelhecimento, pode ser desejável umafração elevada de catequina e frações reduzidas de óleoessencial, teanina e de polissacarídeo por peso de massa doque aquelas encontradas no material de planta nativo de cháverde ou em produtos de extração convencionais. Emcontraste, para redução da ansiedade, melhora do humor emelhora das funções cognitivas, uma maior fração purificadade teanina e frações reduzidas de óleo essencial, catequinae polissacarídeo por % de peso de massa do que aquelasencontradas no material de planta nativo de chá verde ou emprodutos de extração convencionais podem constituir amelhor composição do produto.

Uma modalidade adicional da invenção é composta porextrações que compreendem novas subfrações dosconstituintes químicos de catequina em que as catequinastotais são altamente purificadas (por exemplo, > 95% porpeso de massa) e a concentração de compostos de catequinabioativos altamente específicos como, por exemplo, ECGC,tem sua concentração aumentada em relação aos outroscompostos de catequina (perfil das subfrações). Essas novasextrações de subfração de catequina purificada podem serusadas isoladamente ou em combinação com outras fraçõespurificadas de chá verde, outros constituintes químicosbotânicos ou compostos químicos farmacêuticos. Por exemplo,essas novas subfrações de catequina podem ter benefíciosubstancial para a prevenção de câncer e envelhecimento.

Os métodos da presente invenção compreendem ofornecimento de novas extrações de chá verde para otratamento e a prevenção de distúrbios humanos. Porexemplo, uma nova extração de chá verde com atividadeantioxidante e proteção cardiovascular pode ter umaconcentração aumentada da fração de catequina, umaconcentração aumentada da fração de óleo essencial, umaconcentração diminuída de teanina, e uma concentraçãoaumentada da fração de polissacarídeo, por % do peso, doque aquelas encontradas no material de planta nativo de cháverde ou em produtos de extração convencionais conhecidos.

Uma nova extração de espécies de chá verde para prevenção eterapia de acidente vascular cerebral pode ter umaconcentração aumentada da fração de catequina, da fração deóleo essencial, da fração de teanina e da fração depolissacarídeo, por % do peso, do que aquelas encontradasno material de planta nativo de chá verde ou em produtos deextração convencionais conhecidos. Outro exemplo de umanova extração de chá verde para o tratamento de ansiedade edepressão compreende uma composição que possui umaconcentração aumentada da fração de teanina e umaconcentração reduzida da fração de óleo essencial e umaconcentração reduzida da fração de catequina e umaconcentração reduzida da fração de polissacarídeo do queaquelas encontradas no material de planta nativo de cháverde ou em produtos de extração convencionais conhecidos.Extrações em relação ao chá verde natural

As modalidades compreendem extrações de chá verde quepossuem pelo menos uma de uma concentração de óleoessencial, catequina, teanina ou polissacarídeo que está emuma quantidade acima daquela encontrada no material deplanta nativo de chá verde ou de produtos de extrato de cháverde disponíveis atualmente. As modalidades tambémcompreendem composições nas quais uma ou mais das frações,incluindo óleos essenciais, catequinas, teanina oupolissacarídeos, são encontradas em uma concentração que émaior do que aquela encontrada em material de planta nativode chá verde. As modalidades também compreendem extraçõesnas quais uma ou mais das frações, incluindo óleoessencial, catequinas, teanina ou polissacarídeos, sãoencontradas em uma concentração que é menor do que aquela encontrada em material de planta nativo de chá verde.Quantidades conhecidas das frações do constituinte químicobioativo de chá verde (Tabela 1) são usadas como um exemploda presente invenção. Por exemplo, as extrações da presenteinvenção compreendem frações nas quais a concentração de óleos essenciais é de 0,001 a 200 vezes a concentração dematerial de planta nativo e/ou composições de chá verde nasquais a concentração de catequinas é de 0,001 a 4 vezes aconcentração de material de planta nativo de chá verde,e/ou extrações em que a concentração de teanina é de 0,001 a 2 00 vezes a concentração no material de planta de cháverde e/ou extrações em que a concentração depolissacarídeos é de 0,001 a 40 vezes a concentração dematerial de planta nativo de chá verde, e/ou extrações emque a concentração de cafeína é 0,001 a 0,99 vez aconcentração de material de planta de chá verde. Extraçõesda presente invenção compreendem frações nas quais aconcentração de óleos essenciais é de 0,01 a 200 vezes aconcentração de chá verde nativo, e/ou extrações em que aconcentração de catequinas é de 0,01 a 4 vezes aconcentração de chá verde nativo, e/ou extrações em que aconcentração de teanina é de 0,01 a 200 a concentração dechá verde nativo, e/ou extrações em que a concentração depolissacarídeos é de 0,01 a 40 vezes a concentração dematerial de planta nativo de chá verde. Além disso,extrações da presente invenção compreendem subfrações dosconstituintes químicos de catequina que possuem pelo menosum ou mais dos compostos químicos presentes nosconstituintes químicos de catequina do material de plantanativo que estão em uma quantidade maior ou menor do queaquela encontrada nos constituintes químicos de catequinado material de planta nativo de chá verde. Por exemplo, ocomposto químico ECGC pode ter sua concentração aumentadaem uma subfração de catequina até 60% por % de peso demassa da subfração de sua concentração de 50% por % de pesode massa dos constituintes químicos totais de catequina nomaterial de planta nativo de chá verde. Em contraste, Cpode ter sua concentração reduzida em uma subfração decatequina até < 0,1% por % de peso de massa da subfração desua concentração de 2,2% por % de peso de massa dosconstituintes químicos totais de catequina no material deplanta nativo. Extrações da presente invenção compreendemextrações nas quais a concentração de compostos químicosespecíficos nessas novas subfrações de catequina estáaumentada em cerca de 1,1 a cerca de 2 vezes, ou diminuídaem cerca de 0,1 a 100 vezes em relação àquela concentraçãoencontrada nós constituintes químicos de catequina do cháverde nativo.

Uma modalidade adicional dessas extrações compreendeuma concentração predeterminada de polissacarídeosubstancialmente aumentada em relação àquela encontrada emmaterial de planta seco de espécies naturais de chá verdeou produtos convencionais de extrato de espécies de cháverde. Por exemplo, uma extração pode compreender asfrações hidrossolúveis e insolúveis em etanol depolissacarídeo de mais de 3% de peso de massa da extração.As modalidades também compreendem extrações nas quais umaou mais das frações, incluindo os compostos do óleoessencial, as catequinas, L-teanina ou os polissacarídeos,são encontradas em uma concentração que é menor do queaquela encontrada no material de planta nativo de cháverde. Por exemplo, as extrações da presente invençãocompreendem os óleos essenciais em uma concentração que éde 0,001 a 100 vezes a concentração no material de plantanativo de chá verde, e/ou extrações nas quais aconcentração de catequinas é de 0,001 a 14 vezes aconcentração no material de planta nativo de chá verde e/oua concentração de L-teanina é de 0,001 a 100 vezes aconcentração no material de planta nativo de chá verde,e/ou a concentração de polissacarideo é dé 0,001 a 80 vezesa concentração no material de planta nativo de chá verde.

Na produção de uma extração combinada, pode ser usado decerca de 0,001 mg a cerca de 200 mg de uma fração de óleoessencial. Adicionalmente, pode ser utilizado de cerca de0,001 mg a cerca de 500 mg de a fração purificada decatequina. Além disso, pode ser usado de cerca de 0,001 mga cerca de 500 mg de a fração purificada de L-teanina.Finalmente, pode ser utilizado de cerca de 0,001 mg a cercade 500 mg da fração hidrossolúvel e insolúvel em etanol depolissacarideo.

Pureza das extrações

Os métodos ensinados na presente invenção abaixopermitem a purificação (concentração) de uma fração de óleoessencial, uma fração de catequina, subfrações decatequina, uma fração de L-teanina e uma fração depolissacarideo, bem como a descaf einação das frações decatequina, L-teanina e polissacarídeo. Pode ser obtida umapureza da fração de óleo essencial de até 8 9% por peso demassa dos constituintes químicos desejados, com cafeínacomo o principal constituinte não-óleo essencial na fraçãopurificada. O SCCO2 provou ser um excelente meio para adescafeinação da matéria-prima de chá verde, removendocerca de 85% por peso de massa da cafeína no material damatéria-prima. Por combinação de todas as subfrações dacromatografia do processo purificação da fração decatequina, pode ser obtida uma pureza de catequinas totaisde 63-68% por peso de massa do extrato combinado, com umaconcentração de ECGC de 57-69% (perfil) por peso de massadas catequinas totais. Pela combinação de subfraçõesselecionadas por eluição de cromatografia do processoadsorvente por afinidade, são facilmente obtidas subfraçõesde catequina altamente purificadas que compreendem umapureza de catequina total de 91-99% por peso de massa dasubf ração com uma concentração de ECGC de 62-70% por pesode massa das catequinas totais, com um rendimentorazoavelmente elevado. Caso se sacrifique o rendimento,podem ser obtidas subfrações que compreendem níveis aindamaiores de pureza de catequina total e de concentração deECGC. Uma fração purificada de L-teanina que compreènde umaconcentração de L-teanina de 90% por peso de massa dafração e uma fração purificada de polissacarídeo quecompreende uma concentração de polissacarídeo de mais de90% por peso de massa da fração com rendimentos elevadostambém podem ser obtidas com a utilização dos métodosensinados na presente invenção. Os ambientes de extraçãoespecíficos, as taxas dê extração, os solventes e atecnologia de extração usados dependem do perfil doconstituinte químico de partida do material-fonte e donível de purificação desejado nos produtos finais deextração. Os métodos específicos ensinados na presente invenção podem ser facilmente determinados por aqueleshabilitados na técnica com o uso de experimentaçãorotineira típica para ajuste de um processo às variações daamostra aos atributos de materiais de partida que sãoprocessados até um material final que possua os atributos específicos. Por exemplo, em um lote específico de espéciesde material de planta de chá verde, as concentraçõesiniciais dos constituintes químicos do óleo essencial,cafeína, as catequinas, L-teanina e os polissacarídeos sãodeterminadas com a utilização de métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica, como ensinado na presenteinvenção. Aqueles habilitados na técnica podem determinar aquantidade de mudança a partir da concentração inicial dosconstituintes de catequina, por exemplo, até as quantidadespredeterminadas de constituintes químicos de catequina parao produto final da extração com a utilização dos métodos deextração, como aqui revelados, até alcançar a concentraçãodesejada no produto final da composição de espécies de cháverde. Similarmente, tais mudanças podem ser feitas para onível de descafeinação e para as composições de compostosdo óleo essencial, L-teanina e da fração de polissacarídeo.

Em geral, os métodos e composições da presenteinvenção compreendem métodos para a produção de umacomposição extraída de espécies de chá verde que possuemcaracterísticas predeterminadas. Uma composição extraída deespécies de chá verde desse tipo pode compreender quaisqueruma, duas, três ou todas as quatro das quatro fraçõesconcentradas do extrato, dependendo do efeito(s)biológico(s) benéfico(s) desejado(s) para certo produto.

Tipicamente, uma composição que contém todas as quatrofrações purificadas do extrato de espécies de chá verde égeralmente desejada, na medida em que essas novascomposições representam os primeiros produtos de extraçãoaltamente purificados de espécies de chá verde que contêmtodos os quatro dos principais químicos constituintesbiologicamente benéficos encontrados no material de plantanativo. Modalidades da invenção compreendem métodos nosquais as características predeterminadas compreendem umaconcentração predeterminada seletivamente aumentada doscompostos do óleo essencial, catequinas, L-teanina epolissacarídeos de espécies de chá verde em frações deextração separadas. A importância de ter todos os quatrodos grupos de constituintes químicos biologicamentebenéficos nas composições finais está relacionada àinteração sinérgica desses compostos na intensificação dosefeitos fisiológicos e médicos desejados dos constituintesquímicos do chá verde em relação àqueles encontrados comcompostos químicos isolados altamente purificados ou gruposde compostos relacionados.

Métodos de extração

O material de partida para extração é material deplanta de uma ou mais espécies de C. sinensis. O materialde planta pode ser qualquer porção da planta, embora aporção aérea da planta, que inclui as folhas, caules ououtra parte da planta, seja preferida. As folhas são omaterial de partida mais preferido.O material de planta de espécies de C. sinensis podeser submetido a etapas de pré-extração para fazer com que omaterial fique em qualquer forma em particular, e qualquerforma que seja útil para extração é contemplada pelapresente invenção. 0 material de folha de C. sinensis épreferivelmente cozinhado no vapor para inativar as enzimasque convertem as catequinas em flobafenos para a produçãode chá verde. Tais etapas de pré-extração incluem, semlimitação, aquela em que o material é cortado, picado,triturado, fragmentado, moido, pulverizado, cortado ourasgado, e o material de partida, antes das etapas de pré-extração, é material de planta seco ou fresco. Uma etapa depré-extração preferida compreende moagem e/ou pulverizaçãodo material de folhas de C. sinensis em um pó fino. 0material de partida, ou o material após as etapas de pré-extração, pode ser seco ou pode receber a adição deumidade. Após o material de planta de chá verde estar emuma forma adequada à extração, os métodos de extração sãocontemplados pela presente invenção.

Em geral, os métodos da presente invenção compreendem,em parte, métodos nos quais o material de planta de cháverde é extraído com a utilização de extração supercríticade líquidos (SFE), também denominado dióxido de carbonosupercrítico (SCCO2) , que é seguido por uma ou mais etapasde extração de solvente como, por exemplo, sem limitação,processos de extração aquosos, hidroalcoólicos eadsorventes por polímero de afinidade. Outros métodosadicionais contemplados pela presente invenção compreendema extração de material de planta de chá verde com o uso deoutros solventes orgânicos, substâncias químicasrefrigerantes, gases compressíveis, sonificação, extraçãode líquido por pressão, cromatografia contra corrente dealta velocidade, polímeros moleculares impressos, e outrosmétodos de extração conhecidos. Tais técnicas sãoconhecidas por aqueles habilitados na técnica. Em umaspecto, as composições da presente invenção podem serpreparadas por um método que compreende as etapasrepresentadas esquematicamente nas Figuras 1-5.

A invenção inclui métodos para uma concentração(purificação) e definição do perfil do óleo essencial e deoutros compostos solúveis em lipídeos do material de plantade chá verde com a utilização da tecnologia SCCO2. Ainvenção inclui a descafeinação do material de planta dechá verde com o uso de processamento por SCCO2. A extraçãodos constituintes químicos do óleo essencial e dedescafeinação do material de planta de chá verde com SCCO2,como ensinada na presente invenção elimina o uso desolventes orgânicos tóxicos. 0 dióxido de carbono é umproduto biológico natural e seguro e um ingrediente emmuitos alimentos e bebidas.

Óleos essenciais são substâncias aromáticas que sãoamplamente usadas nas indústrias de perfume, no setorfarmacêutico e nos alimentos e nutrição humana. Eles sãouma mistura de mais de 200 compostos, que podem seragrupados basicamente em duas frações, uma fração volátil,que constitui 90-95% do óleo inteiro e contém monoterpenose hidrocarboneto sesquiterpeno e seus derivados oxigenados,juntamente com aldeídos, alcoóis e ésteres alifáticos, e umresíduo não volátil, que constitui de 5-10% do óleo inteiroe contém hidrocarboneto, ácido graxo, esteróis,caroteróides, ceras, cumarinas, psoraleno e flavonóides.

O isolamento, a concentração e a purificação do óleoessencial foram processos importantes por muitos anos, emconseqüência do uso disseminado desses compostos. Os métodos comuns usados até agora são baseados principalmentena extração de solvente e destilação a vapor. 0 uso dessastécnicas convencionais possui uma desvantagem importante (orisco de perdas de compostos termolábeis) e também duasdesvantagens significativas (a impraticabilidade para automação e o longo tempo necessário para a extração) . Osmétodos comerciais usados para concentração são destilaçãofracionada a vácuo e extração seletiva de solvente eseparação cromatográfica. Todos esses métodos possuemdesvantagens importantes como, por exemplo, baixo rendimento, formação de subprodutos (em função do tempo deexposição a temperaturas elevadas) e a presença de resíduosorgânicos tóxicos nos extratos.

A extração de líquido supercrítico (SFE) tem sidousada recentemente para a extração de óleos essenciais deplantas, em uma tentativa de evitar as desvantagensassociadas à técnica convencional. Sua utilidade para aextração é decorrente da combinação de propriedades detransferência de massa semelhante a gás e característicasde solvatação semelhantes a líquidos com coeficientes dedifusão acima daqueles de solventes líquidos. A SFE tambémé uma técnica adequada ao aumento da qualidade dos óleosessenciais obtidos por métodos de extração convencionaispor meio de fracionamento.

A cafeína, o alcalóide mais consumido no mundo, éencontrada em alta concentração em alguns produtos naturaiscomo, por exemplo, grãos de cacau (0,2%), grãos de café(0,9-2,4%) e folhas de chá (1,5-2,5%). A cafeína écomumente obtida por extração com o uso de solventesorgânicos, por exemplo, diclorometano e hexano, que sãoconsiderados danosos à saúde humana e ao ambiente. A água éum solvente excelente, mas não seletivo, para a cafeína. Aextração com água leva à dissolução e subseqüente perda deoutros componentes valiosos como, por exemplo, ospolifenóis (catequinas) do chá verde.

Na presente invenção, o dióxido de carbonosupercrítico foi escolhido como o processo principal para aextração de cafeína (descafeinação do chá verde). Esseprocesso envolve o uso de um gás comprimido em altatemperatura como solvente para remover a cafeína. Em umaescala comercial, o dióxido de carbono é usado para extraira cafeína de grãos de café. O CO2 supercrítico é nãopoluente e atóxico, comparado com os solventes orgânicosusados tradicionalmente. Foram emitidas várias patentespara a extração de cafeína de grãos de café com CO2, eforam discutidas previamente. Zosel (Patente U.S.4.247.570) detalha a operação de descafeinação em umaescala comercial. 0 teor de cafeína nos grãos de café, quevaria de 0,7 a 3%, foi diminuído a cerca de 0,02 % decafeína. 0 processo de extração foi realizado a 70-90°C e160-20 MPa (densidade de CO2 de 0,4-0,65 g/cm3).

0 dióxido de carbono supercrítico é muito seletivopara cafeína, mas a solubilidade da cafeína é menor do queem solvente orgânico, o que uso de grandes quantidades deCO2 e, portanto, um aumento substancial tanto nos custosfixos quanto nos de operação. Como observado com grãos decafé, a água pode atuar como um co-solvente importante,levando a um rendimento substancialmente aumentado daextração.

Um diagrama esquemático dos métodos de extração dosconstituintes químicos biologicamente ativos do material deplanta de chá verde é ilustrado nas Figuras 1-5. 0 processode extração ocorre tipicamente, sem limitação, em 6 etapas.Para referência no texto, quando o número X em negritoaparece no texto, o número refere-se ao número nas Figuras1-5. Os métodos analíticos usados no processo de extraçãosão apresentados na seção de Exemplificação.

Etapa 1: Extração de dióxido de carbono líquidosupercrítico de óleo essencial de chá verde

Em função da natureza hidrofóbica do óleo essencial,solventes não polares, incluindo, sem limitação, SCCO2,hexano, éter de petróleo e acetato de etila, podem serusados para esse processo de extração. Na medida em quealguns dos componentes do óleo essencial são voláteis, adestilação a vapor também pode ser usada como um processode extração.

Uma descrição generalizada da extração dosconstituintes químicos do óleo essencial das folhas de cháverde com o uso de SCCO2 é representada na forma dediagrama na Figura I-Etapa 1. A matéria-prima [10] é folhassecas cortadas de chá verde (tamanho acima de 105 pm) . 0solvente de extração [210] é dióxido de carbono puro. Podeser usada água como co-solvente. A matéria-prima écarregada em um vaso de extração SFE [20] . Após limpeza eteste quanto a possíveis vazamentos, o processo compreendefluxo de CO2 liqüefeito a partir de um vaso dearmazenamento através de um refrigerador até uma bomba deCO2. O CO2 é comprimido até a pressão desejada e fluiatravés da matéria-prima no vaso de extração, onde apressão e a temperatura são mantidas no nível desejado. As pressões para a extração variam de cerca de 6 MPa a 80 MPa,e a temperatura varia de cerca de 350C a cerca de 90°C. Asextrações de SCCO2 aqui ensinadas são realizadaspref erivelmente em pressões de pelo menos 10 MPa e umatemperatura de pelo menos 35 0C e, mais pref erivelmente, emuma pressão de cerca de 6 MPa a 30 MPa e em uma temperaturade cerca de 4O0C a cerca de 60°C. 0 tempo para extraçãopara um único estágio de extração varia de cerca de 3 0minutos a cerca de 2,5 horas, a cerca de 1 hora. Aproporção de solvente em relação à alimentação étipicamente de cerca dê 20-60 a 1 para cada uma dasextrações de SCCO2. O CO2 é reciclado para processamento deextração comercial. Os constituintes químicos extraídos,purificados e com perfil definido do óleo essencial [30]são então coletados em um coletor ou separador, salvos emuma garrafa de vidro que protege da luz e armazenados em umrefrigerador escuro a 4°C. Ô material de matéria-prima dechá verde [10] pode ser extraído em um processo de umaetapa (Figura 1, Etapa IA) , em que a fração de óleoessencial do chá verde [30] extraída e purificadaresultante é coletada em um sistema coletor de SFE ou SCCO2[2 0] . Alternativamente, como em um sistema de SFEfracionado, o material da matéria-prima de chá verdeextraído por SCCO2 pode ser segregado em vasos coletores(separadores), de tal forma que dentro de cada coletor hajauma composição com percentagem relativa diferente doconstituinte químico de óleo essencial (perfil) em cada umadas subfrações purificadas de óleo essencial coletada. 0resíduo (restante) [40] é coletado, salvo e usado paraprocessamento posterior para incluir, sem limitação,descafeinação e processamento, para a obtenção de fraçõespurificadas das catequinas, teanina e polissacarídeos dochá verde. Uma modalidade da invenção compreende a extraçãodo material da matéria-prima de chá verde com o uso deextração por SCCO2 em multiestágios em uma pressão de 6 MPaa 80 MPa e em uma temperatura entre 35°C e 9Ò°C, e a coletado material de chá verde extraído após cada estágio. Umasegunda modalidade da invenção compreende a extração dasespécies de material da matéria-prima de chá verde com ouso de extração por SCCO2 por fracionamento em pressões de6 MPa a 80 MPa e em uma temperatura entre 35°C e 90°C, e acoleta do material de chá verde extraído em diferentesvasos coletores em condições predeterminadas (pressão,temperatura e densidade) e em intervalos predeterminados(tempos). As composições da subfração de óleo essencialpurificada extraída de chá verde resultantes de cada um dosextratores multiestágios ou em diferentes vasos coletores(sistema fracionado) podem ser recuperadas e usadasindependentemente, ou podem ser combinadas para formar umaou mais composições de óleo essencial de chá verde quecompreendem uma concentração predeterminada do constituintequímico de óleo essencial que é maior ou menor do queaquela encontrada no material de planta nativo.

Tipicamente, o rendimento total da fração de óleo essencialde material de planta de chá verde com o uso de uma únicaetapa extração por SCCO2 é de cerca de 0,4% (> 95% dosconstituintes químicos do óleo essencial) por % do peso,possuindo uma pureza do constituinte químico de óleoessencial de mais de 85% por peso de massa do extrato. Osresultados desses processos de extração são apresentadosabaixo nas Tabelas 2-4. 0 procedimento pode ser encontradono Exemplo 1.

Tabela 2. Resultados do processamento dé 1° estágio a 40°Ce 2 0 MPa.

<table>table see original document page 41</column></row><table>

1 Fl = Chá verde chinês; F4 = Chá verde chinês; JPGT =Chá verde japonês.

2 Cafeína extraída da alimentação = cafeína emextratos/cafeína na alimentação χ 100.

Tabela 3. Composição dos extratos de óleo essencial do cháverde.

<table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44</column></row><table><table>table see original document page 45</column></row><table><table>table see original document page 46</column></row><table>

Tabela 4. Distribuição dos compostos do óleo essencial dechá verde (% da área de pico de GC-MS) de diferentesmatérias-primas de chá verde.

<table>table see original document page 46</column></row><table><table>table see original document page 47</column></row><table><table>table see original document page 48</column></row><table>Um total de 73 compostos em frações de óleo essencialde folha de chá verde foi extraído com o uso de SCCO2 a40°C e 10-20 MPa. Independentemente do fato de a extraçãopor SCCO2 ser feita a partir de folhas secas ou úmidas dechá verde, a cafeína é extraída nesse processo. Aconcentração de cafeína nessas frações de óleo essencialvaria de cerca de 11-80% por % de peso de massa da fraçãode óleo essencial. Além da cafeína, outros compostosimportantes encontrados na fração de óleo essencial incluemalcoóis graxos saturados como, por exemplo, 1-undecanol, 1-hexadecanol, álcool oleílico e nonadecanol, e ácidos graxoscomo, por exemplo, ácido hexadecanóico. Curiosamente, foramencontrados muito poucos na forma de compostos químicos deóleo essencial no chá verde chinês Fl. Em contraste,constatou-se que os chás verdes chineses F2, F3 e F4possuem mais de 50% por peso de massa de alcoóis graxos eácidos graxos que compreendem as frações de extração porSCCO2 de óleo essencial. Na fração de SCCO2 de óleoessencial de matéria-prima de chá verde japonês, menos de40% por peso de massa de alcoóis graxos e ácidos graxoscompunham a fração do extrato.

Etapa 2. Descafeinação por dióxido de carbono supercríticodo chá verde.

Uma descrição generalizada da descafeinação dosconstituintes químicos das folhas de chá verde com o uso deSCCO2 é representada na forma de diagrama na Figura I-Etapa2. A matéria-prima [10 ou 40], folhas secas cortadas de cháverde (tamanho acima de 105 μπι) ou o resíduo após aextração da fração de óleo essencial da Etapa 1, é imersaem um volume de leito de água destilada. 0 solvente deextração [210] é dióxido de carbono puro. Pode ser usadaágua como co-solvente. A matéria-prima é carregada em umvaso de extração SFE [50] . Após limpeza e teste quanto apossíveis vazamentos, o processo compreende fluxo de CO2liqüefeito a partir de um vaso de armazenamento através deum refrigerador até uma bomba de CO2. 0 CO2 é comprimidoaté a pressão desejada e flui através da matéria-prima novaso de extração, onde a pressão e a temperatura sãomantidas no nível desejado. As pressões para a extraçãovariam de cerca de 6 MPa a 80 MPa, e a temperatura varia decerca de 35°C a cerca de 90°C. As extrações de SCCO2 aquiensinadas são realizadas preferivelmente em pressões depelo menos 20 MPa e em uma temperatura de pelo menos 350Ce, mais preferivelmente, em uma pressão de cerca de 3 MPa a7 0 MPa e em uma temperatura de cerca de 600C a cerca de8 0°C. 0 tempo para extração para um único estágio deextração varia de cerca de 2 a cerca de 6 horas, a cerca de4 horas. A proporção de solvente em relação à alimentação étipicamente de cerca de 24 0 a 1 para cada uma das extraçõesde SCCO2. O CO2 é reciclado para processamento de extraçãocomercial. Os constituintes químicos de cafeína extraídos[7 0] são então coletados, medidos quanto ao teor decafeína, e descartados. 0 resíduo (restante) ou o extratode chá verde descafeinado [60] é coletado, salvo e usadopara processamento posterior para incluir, sem limitação,processamento para a obtenção de frações purificadas dascatequinas, teanina e polissacarídeos do chá verde.Tipicamente, o rendimento total da cafeína do material deplanta de chá verde com o uso de uma única etapa extraçãopor SCCO2 é de cerca de 4,5% (cerca de 85% dosconstituintes químicos de cafeína presentes na matéria-prima) por % do peso, possuindo uma pureza do constituintequímico de cafeína de cerca de 2 9% por peso de massa doextrato de cafeína. Esse processo de descafeinação reduz oteor de cafeína na matéria-prima descafeinada de chá verdeem cerca de 55-85% por peso de massa do teor de cafeína nomaterial da matéria-prima. Na matéria-prima de chá verdeque possui um baixo teor de cafeína, 83-85% de peso demassa da cafeína podem ser removidos. A fim de reduzir oteor de cafeína na matéria-prima de chá verde com alto teorde cafeína, são necessárias proporções maiores desolvente/alimentação para descafeinar o material damatéria-prima acima de 8 0% por peso de massa. Os resultadosdesses processos de extração são apresentados abaixo nasTabelas 5 e 6. 0 procedimento pode ser encontrado no

Exemplo 2.

Tabela 5. Resultados do rendimento da extração total e decafeína com diferentes co-solventes e matérias-primas.

<table>table see original document page 51</column></row><table><table>table see original document page 52</column></row><table>

1 Cafeína extraída da alimentação = cafeína emextratos/cafeína na alimentação χ 100.

2 Os resultados são a média de três rodadas repetidas(desvio padrão +/- 5%).<table>table see original document page 53</column></row><table>O rendimento da extração de cafeína aumentou com aadição de co-solvente. A solubilidade da cafeína na misturade dióxido de carbono líquido supercrítico/co-solvente é 3-5 vezes maior do que a em dióxidó de carbono puroisoladamente (Kopcak 2005) . Do ponto de vista da extraçãode cafeína, etanol 75%/água é muito eficiente. No entanto,além de 9,3% por peso de massa de cafeína no extrato dedescafeinação, também são extraídos valiosos compostosquímicos de ácido fenólico da matéria-prima como, por exemplo, EGCG 4%, EGC 2,6% e ECG 0,9% por % de peso demassa do extrato de descafeinação. A água é um co-solventemelhor do que o etanol para a descafeinação da folha dematerial da matéria-prima de chá verde. Com o uso de folhasúmidas de chá verde, água como co-solvente e uma proporçãoS/F de 240, mais de 80% da cafeína na matéria-prima Fl e namatéria-prima de chá verde japonês (JPGC) podem serremovidos (descafeinados), sem remoção de qualquer um dosácidos fenólicos ou teanina valiosos do material damatéria-prima. Isso eqüivale a uma redução do teor de cafeína de 1,3% de peso de massa na matéria-prima Fl para0,18% no material Fl descafeinado ou uma redução do teor decafeína de 2,2% por peso de massa na matéria-prima JPGTpara 0,36% no material descafeinado de chá verde, umadiminuição de 6-7 vezes do teor de cafeína. No caso dafolha de matéria-prima de chá verde F4 de alto teor decafeína de 3,3% por peso de massa, a redução da cafeínatotal foi menor; 1,46% de peso de massa da matéria-prima deF4 descafeinada. No entanto, as valiosas catequinas eteanina foram preservadas no material do resíduodescafeinado. Dessa forma, o resíduo descafeinado que retémos valiosos constituintes químicos de catequina e teaninapode então ser usado para processamento posterior paraobter frações purificadas de catequina, teanina e depolissacarídeo.

Curiosamente, foi observada uma descafeinação deapenas cerca de 55% para a matéria-prima F4 de alto teor decafeína sob as mesmas condições de descafeinação por SFE. Adiferença parece ser causada pelo maior teor de cafeína oupor uma estrutura de matriz diferente das folhas de cháverde de F4 ou ambos. Com base na observação, as folhas damatéria-prima F4 são menos umedecidas pela imersão em água.

Em outras palavras, a água tende a permanecer na superfíciedas folhas, em vez de penetrar na matriz interna da folhade F4. Portanto, as folhas de chá verde F4 necessitarão demais água e/ou terão que ser imersas mais vezes para seobter mais de 80% descaf einação, além de possivelmente umamaior proporção de solvente/alimentação.

Etapa 3. Extração de etanol da fração bruta dosconstituintes químicos de catequina do chá verde.

Em um aspecto, a presente invenção compreende aextração e concentração dos constituintes químicosbioativos de catequina. Uma descrição generalizada dessaetapa é representada na forma de diagrama na Figura 2-Etapa3. Esse processo de extração da Etapa 3 é um processo delixiviação de solvente. A matéria-prima para essa extraçãoé material de folhas cortadas de chá verde [10] ou oresíduo da extração da Etapa 1 por SCCO2 da fração de óleoessencial [30] ou da descaf einação por SCCO2 da Etapa 2 domaterial de folha de chá verde [60]. 0 solvente de extração220 é etanol 95%. 0 solvente de extração pode ser álcoolaquoso 10-95%, embora etanol 95% aquoso seja preferido.Nesse método, o material da matéria-prima de chá verde e osolvente de extração são carregados em um vaso de extração100 que é aquecido e agitado. Ele pode ser aquecido até90°C, até cerca de 80°C, até cerca de 70°C ou até cerca de60-900C. A extração é realizada por cerca de 1-10 horas,por cerca de 1-4 horas, por cerca de 2 horas. 0 extratolíquido resultante é centrifugado [110] e filtrado [120]. 0filtrado (sobrenadante) [300, 310] é coletado como produto,medido quanto ao volume e teor de massa seca sólida apósevaporação do solvente. O material do resíduo da extração[130 ou 140] é retido e salvo para processamento posterior(veja Etapa 4) . A extração pode ser repetida quantas vezesforem necessárias ou desejadas. Ela pode ser repetida 2 oumais vezes, 3 ou mais vezes, 4 ou mais vezes etc. Quandofor usado mais de um estágio para a extração, as fraçõesbrutas de catequina de cada estágio podem ser combinadas[320] para o produto ou retidas para purificação posteriorda fração de catequina (veja Etapa 4) . Por exemplo, aFigura 2-Etapa 3 mostra um processo em dois estágios, emque o segundo estágio usa os mesmos métodos e condições. Osresultados são apresentados nas Tabelas 7 e 8 abaixo. 0procedimento pode ser encontrado no Exemplo 3.<table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page 58</column></row><table>Esses resultados demonstram que o processo dedescafeinação por SFE removeu a cafeína da matéria-prima dechá verde, sem afetar os outros compostos químicos valiososno resíduo. Além disso, a extração do resíduo com o uso deetanol 95% preserva a L-teanina e os polissacarídeoshidrossolúveis-insolúveis em etanol no resíduo que podemser usados para processamento posterior para fraçõespurificadas de teanina e de polissacarídeo. Finalmente, oprocesso de lixiviação em dois estágios aumenta aconcentração das quatro catequinas principais (PA, Tabela8) de cerca de 7-12% por peso de massa na matéria-prima defolha nativa de chá verde a cerca de 26-39% por peso demassa no extrato, um aumento de cerca de 3,5 vezes napureza. 0 rendimento da extração variou de 19 a 3 6% porpeso de massa, com base na matéria-prima de chá verdeoriginal. A pureza adicional da fração do constituintequímico de catequina pode ser obtida com a utilização de umprocesso de cromatografia por adsorvente de afinidade (vejaabaixo).

Etapa 4. Processo de extração por absorvente de afinidade

Como aqui ensinado, pode ser obtido um extrato dafração altamente purificada de catequina de chá verde porcontato de um extrato hidroalcoólico de matéria-prima dechá verde (Etapa 3) com uma resina adsorvente sólida deafinidade de polímero, de forma a adsorver as catequinasativas contidas no extrato hidroalcoólico sobre oadsorvente de afinidade. Os constituintes químicos ligadossão subseqüentemente eluídos pelos métodos aqui ensinados.Antes da eluição da fração de constituintes químicos decatequina, o adsorvente de afinidade com os constituintesquímicos desejados nele adsorvidos pode ser separado dorestante do extrato por qualquer meio conveniente;preferivelmente, o processo de contato com o adsorvente e aseparação são efetuados passando-se o extrato aquosoatravés de uma coluna ou um leito de extração de materialadsorvente. Além disso, antes da eluição da fração deconstituintes químicos de catequina, quaisquer compostos decafeína adsorvidos sobre o adsorvente de afinidade podemser separados das catequinas com a utilização de um solvente específico que irá eluir os compostos de cafeína,mas não irá eluir os compostos de catequina (descafeinaçãodas frações purificadas de catequina).

Podem ser utilizados diversos adsorventes de afinidadepara purificar os constituintes químicos de catequina do material de planta de chá verde, tais como, sem limitação,uAmberlite XAD-2" (Rohm & Hass), "Duolite S-30" (DiamondAlkai Co.), "SP2 07" (Mitsubishi Chemical), ADS-5 (NankaiUniversity, Tianjin, China), ADS-17 (Nankai University,Tianjin, China), Dialon HP 20 (Mitsubishi, Japão), e Amberlite XAD7 HP (Rohm & Hass). Amaberlite XAD 7HP é usadopreferivelmente em função da alta afinidade pelosconstituintes químicos de catequina do chá verde. Ele é umpolímero acrílico alifático não iônico com tamanho departícula de 560-710 μη que deriva suas propriedadesabsortivas de sua estrutura macro-reticular (que contémtanto uma fase contínua de . polímero quanto uma fasecontínua de poro), da alta área de superfície e da naturezaalifática de sua superfície. Com essa estrutura macro-reticular que possui grupos éster poliméricos, o XAD 7HPpode adsorver compostos polares, gerando uma afinidadeelevada por ácidos fenólicos (catequinas).

Embora possam ser empregados vários eluentes pararecuperar os constituintes químicos de catequina doadsorvente, em um aspecto da presente invenção, o eluentecompreende alcoóis de baixo peso molecular, incluindo, semlimitação, metanol, etanol ou propanol. Em um segundoaspecto, o eluente compreende álcool de baixo pesomolecular misturado com água. Em um terceiro aspecto, oeluente compreende álcool de baixo peso molecular, umsegundo solvente orgânico e água. Em outro aspecto, umeluente usado para descafeinação das catequinas adsorvidasno absorvente compreende um solvente ácido como, porexemplo, sem limitação, H2SO4 5% em etanol 10%. Dessaforma, foi projetado um processo de êluição em doisestágios para purificação da fração do constituinte químicode catequina do chá verde. 0 primeiro estágio consiste nouso de uma solução ácida para descafeinar os constituintesquímicos adsorvidos na coluna, explorando as propriedadesde base da cafeína e a propriedade ácida das catequinas. 0segundo estágio consiste na utilização de um eluenteetanol/água para eluir as catequinas da descafeinação.

A matéria-prima de chá verde pode ou não ter passadopor um ou mais processos de purificação preliminares como,por exemplo, sem limitação, os processos descritos nasEtapas 1, 2 e 3, antes do contato do constituinte químicoaquoso de catequina que contém o extrato com o materialadsorvente de afinidade.

A utilização dos processos adsorventes por afinidadeensinados na presente invenção resulta em frações deconstituintes químicos de catequina do chá verde altamentepurificadas, com perfil definido e descafeinadas que sãoacentuadamente isentas de outros constituintes químicos quenormalmente estão presentes no material de planta naturalou em produtos comerciais de extração disponíveis. Por exemplo, os processos ensinados na presente invenção podemresultar em extratos purificados de catequina que contêmconstituintes químicos de catequina total em excesso de 95%por peso de massa seco.

Uma descrição generalizada da extração e purificação das cat eqüinas das folhas do chá verde com o uso deglóbulos de resina de polímero adsorvente por afinidade érepresentada na forma de diagrama na Figura 3-Etapa 4. Amatéria-prima para esse processo de extração pode ser amatéria-prima natural de chá verde [10] ou a solução aquosa que contém as cat eqüinas da Etapa 3 - Extração porlixiviação de etanol 95% [320] . 0 peso apropriado dosglóbulos de resina adsorvente (12 mg de catequinas porgrama de resina adsorvente) é lavado com 4-5 volumes deleito (BV) de etanol [22 0] e 4-5 BV de água destilada[230], antes e depois de serem carregados na coluna 410,420. Os glóbulos limpos de resina adsorvente sãocompactados em uma coluna [430]. A solução aquosa quecontém catequina [320] é então carregada na coluna [440] emuma taxa de fluxo de 2 a 4 volumes de leito/hora. Após a coluna estar completamente carregada, ela é lavada [450]com água destilada [230] em uma taxa de fluxo de 2-3BV/hora para remover quaisquer impurezas das catequinasadsorvidas. O resíduo do efluente [500] e o resíduo delavagem [510] foram coletados, medidos quanto ao teor demassa, teor de catequina, teor de cafeína, e descartados. Aeluição dos compostos de cafeína adsorvidos [460] é feitade forma isocrática com H2SO4 5% em etanol 10% como soluçãode eluição [240] em uma taxa de fluxo de 2-4 BV/hora. 0eluato [520] é coletado, medido quanto ao teor de massa,teor de catequina, teor de cafeína, e descartado. Após esseestágio de descafeinação, a coluna é lavada [470] com 8 BVde água destilada [230] em uma taxa de fluxo de 10 BV/hora.

A lavagem [53 0] é testada por papel de pH até que estejaneutra, é coletada e descartada. A eluição das catequinasadsorvidas [480] é feita de forma isocrática com solução deetanol 80%/água como solução de eluição [250] em uma taxade fluxo de 2-4 BV/hora, e a curva de eluição foi gravadapara o extrato do eluato [540]. Os volumes de eluição 480podem ser coletados aproximadamente a cada 15-30 minutos, eessas amostras são analisadas com o uso de HPLC e testadasquanto ao teor de sólidos e pureza. Os resultados sãoapresentados nas Tabelas 9-11. O procedimento pode serencontrado no Exemplo 4.<table>table see original document page 64</column></row><table><table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table>

Tabela 11. Resultados analiticos da cromatongrafiacoluna XAD - 7HP do processo de extrato descafeinadodelixiviacaode etanol 95% JPGT por SFE de cha verde.<table>table see original document page 67</column></row><table><table>table see original document page 68</column></row><table>Um solvente de eluição ácido provou ser um excelenteprocesso para descafeinação adicional das catequinas,reduzindo a concentração de cafeína nos produtos finais amenos de 1% a até mesmo 0,2% por peso de massa do extrato.

Pode ser obtida uma fração purificada de catequinas compureza de > 90%, com um rendimento total de 1,9% por % depeso de massa da matéria-prima de chá verde original. Alémdisso, também pode ser conseguida uma subfração em que aconcentração de EGCG é aumentada a > 60% com uma pureza decatequina de > 95%, independentemente da matéria-prima dechá verde original usada. Um resumo da pureza de catequinae do perfil de ECGC nos eluatos combinados da cromatografiado processo de Fl, F4 e JPGT é mostrado na Tabela 12.Tabela 12. Comparação de pureza de catequina e perfil deEGCG * em eluatos combinados (F2-F5 ou F6) da cromatografiado processo derivados de lixiviação em dois estágios deetanol 95% de três matérias-primas descafeinadas por SFEdiferentes de chá verde.

<table>table see original document page 69</column></row><table> Perfil % de peso de massa das quatro catequinasprincipais

Em outros experimentos típicos, as soluções detrabalho eram a solução aquosa transparente obtida após aextração por lixiviação de etanol 95% da Etapa 3 dematerial da matéria-prima de folha bruta ou original de cháverde. Para esses experimentos, 25 g de resíduo bruto dechá verde foram extraídos por lixiviação usando doisestágios de 250 ml de etanol 95% a 700C com 2 horas em cadaestágio (proporção de solvente/alimentação de 20/1). Asduas soluções de sobrenadante dessa extração em doisestágios foram combinadas, e o solvente de extração deetanol foi removido usando um evaporador rotatório. Apósremoção do etanol (destilação), ocorreu um pouco deprecipitação de sólido, que foi removido com o uso decentrifugação e filtração, como descrito na Etapa 3. 0sobrenadante foi coletado, e a seguir foi adicionada águadestilada ao sobrenadante concentrado para obter umaconcentração final de 16-30 mg/ml. Essa solução aquosatransparente contendo as catequinas foi então utilizadapara purificação adicional usando os métodos decromatografia com adsorvente de afinidade do processo da

Etapa 4. Os resultados dessa extração por lixiviação daEtapa 3 são apresentados na Tabela 13, em que a lixiviaçãode folhas brutas ou originais de chá verde é comparada coma lixiviação do resíduo descafeinado de SFE da Etapa 2.

Deve-se observar que, no caso do material de planta brutode chá verde, ocorreu uma precipitação durante a destilaçãode etanol que não foi observada com o resíduo de SFEdescafeinado. Portanto, a centrifugação e a filtração desseprecipitado reduziram o rendimento total de 32,8% para26,9% por % de peso de massa, com base no material damatéria-prima original. Embora o rendimento total sejamaior na matéria-prima bruta de chá verde extraída porlixiviação, a pureza dos constituintes químicos decatequina é similar. Além disso, a concentração de cafeínaé muito alta no produto de extração por lixiviação de cháverde bruto. Ós resultados dessa lixiviação em doisestágios de etanol 95% estão tabulados nas Tabelas 13 e 14.<table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table>Os experimentos de adsorção típicos foram realizadosem temperatura ambiente em um sistema de batelada aberta.Aproximadamente 3 0 g de PA XAD7HP foram lavados com etanolpara remover monômeros e impurezas, e depois imersos emágua destilada por 16 horas, antes da compactação. Aseguir, os glóbulos de resina PA limpos foram compactadosem uma coluna de vidro de 10 mm (ID) χ 350 mm (L) . Cem mlsolução aquosa (solução de lixiviação desetanolizada) comuma concentração de 16-30 mg/ml foram carregados na colunacompactada em uma taxa de fluxo de 1,8 ml/min, 2 BV/hora.Após a carga, 150 ml de água destilada foram usados paralavar a coluna em uma taxa de fluxo de 10 BV/hora. Aseguir, 200 ml de ácido sulfúrico 5% em etanol 10% foramusados para eluir (descafeinar) a coluna em uma taxa defluxo de 2,2 BV/hora. Após essa eluição, 250 ml de águadestilada foram utilizados para lavar a coluna a 10BV/hora, até que as lavagens da coluna alcançassem um pH de7. A seguir, 100 ml de etanol 80% foram usados para eluir(desadsorção) a coluna em uma taxa de fluxo de 2 BV/hora. Otempo de processamento total foi de 3 00 minutos. Foramcoletadas frações seqüenciais de eluentes. Cada fração deeluato foi testada por HPLC, e os resultados são mostradosnas Tabelas 15-17.<table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table>Na purificação por adsorvente de afinidade da Etapa 4das catequinas, partindo com material de planta bruto (nãodescafeinado) de chá verde, 95% da cafeína pode serremovida com o uso de um solvente de eluição ácido, aomesmo tempo em que se preserva a ligação das catequinas aoadsorvente. Por exemplo, é possível descafeinar extratosbrutos de lixiviação contendo cerca de 12% de cafeína por %de peso de massa até 0,3% em uma fração do extrato decromatografia do processo. Quanto maior a concentração decafeína na matéria-prima, maior o volume de eluente desolução ácido necessário para descafeinar as frações deextração.

Curiosamente, a eluição das catequinas com o uso deetanol 8 0% resulta em um rendimento maior da EGCG, ECG e Cdo que de EGC por % de peso de massa nas frações doextrato. Os maiores rendimentos e purezas são encontradosnas frações de 0,6 a 2 BV. A pureza total das fraçõesaltamente purificadas de catequina foi cerca de 1,7 vezaquela dos extratos brutos de lixiviação. O nível de purezade catequina não foi tão alto quanto aquele obtido com acromatografia do processo da Etapa 4 do resíduodescafeinado de SFE. No entanto, são obtidos rendimentostotais da fração de extrato de mais de 11% de peso de massacom base na matéria-prima de chá verde original com purezastotais de catequina de 71% a 93%, dependendo da matéria-prima de chá verde. Finalmente, o perfil da distribuiçãoquímica das quatro catequinas principais é alterado com umaumento preferencial no % de peso de massa de EGCG, ECG eC, e uma diminuição de EGC. Por exemplo, EGCG é tipicamentede mais de 65% por peso de massa das catequinas totais nasfrações combinadas do extrato, e pode ser de até 75% porpeso de massa nas subfrações do extrato.

Mediante análise quanto ao ácido oxálico nas frações esubfrações purificadas de catequina, não pode ser detectadonenhum ácido oxálico em qualquer uma dessas frações ousubfrações, apesar da presença de ácido oxálico na matéria-prima de lixiviação de etanol 95%. Na verdade, verificou-seque o ácido oxálico era de até 6% por peso de massa nassoluções da matéria-prima. No entanto, os compostos deácido oxálico não foram adsorvidos sobre o adsorvente deafinidade e foram encontrados no efluente.

Etapa 5. Lixiviação de água para teanina e polissacarídeos.

A fração de polissacarídeo do extrato dosconstituintes químicos de chá verde foi definida naliteratura científica como a "fração de extraçãohidrossolúvel, insolúvel em etanol". Tanto L-teanina quantoos polissacarídeos são hidrossolúveis. Uma descriçãogeneralizada da extração de teanina e dos polissacarídeosde extratos de material de planta de chá verde com o uso delixiviação de solvente aquoso é representada na forma dediagrama na Figura 4-Etapa 5 (Apêndice 1). A matéria-prima140 é o resíduo sólido do processo de extração porlixiviação de etanol 95% da Etapa 3. Essa matéria-prima éextraída por lixiviação em dois estágios. 0 solvente é águadestilada 260. Nesse método, o resíduo do extrato de cháverde 140 e o solvente de extração 260 são carregados em umvaso de extração 600 e aquecidos e agitados. Eles podem seraquecidos até 100°C, até cerca de 80°C ou até cerca de 60-80°C. A extração é realizada por cerca de 1 hora, por cercade 2-4 horas ou por cerca de 2 horas. As soluções dosobrenadante do extrato 700 são centrifugadas 610,filtradas 620 e coletadas. O resíduo 630 é retido e salvopara processamento posterior. A extração pode ser repetidano resíduo tantas vezes quanto for necessário ou desejado.

Ela pode ser feita 2 ou mais vezes, 3 ou mais vezes, 4 oumais vezes etc. Por exemplo, a Figura 4-Etapa 5 mostra umprocesso em dois estágios, em que o segundo estágio usa osmesmos métodos e condições. O resíduo final [650] édescartado. Um exemplo dessa etapa de extração é encontradono Exemplo 5, e os resultados da medida de massa e análisepor HPLC quanto ao teor de L-teanina são apresentados naTabela 18.<table>table see original document page 82</column></row><table><table>table see original document page 83</column></row><table>O rendimento total do processo de lixiviação de águafoi de 3,6-12,5% por peso de massa do material da matéria-prima original de chá verde. A concentração de L-teaninafoi de 13,2-18,2% por peso de massa do extrato delixiviação. Mais de 85% do rendimento por peso de massa dateanina na folha de matéria-prima original de chá verdepode ser extraído com o processo de lixiviação em doisestágios. Consistente com a literatura científica (29), osoutros constituintes químicos devem em grande parte ser depolissacarídeos. Uma Etapa 6 adicional pode ser usada paraseparação da teanina dos constituintes químicos depolissacarídeo.

Etapa 6. Purificação das frações de L-teanina e depolissacarídeos.

Uma descrição generalizada da extração e purificaçãodas frações de polissacarídeo e de teanina dos extratos dechá verde com o uso de processos com solvente aquoso érepresentada na forma de diagrama na Figura 5-Etapa 6. Asmatérias-primas são as soluções de sobrenadante delixiviação de água [700 + 710] da extração por lixiviaçãode água da Etapa 5. As soluções combinadas são evaporadas[800] para remover 60% da água. O solvente etanol absoluto[280] é então adicionado à solução concentrada para geraruma concentração final de etanol a 75%. Deixa-se a soluçãoem repouso e é observado um grande precipitado [810]. Asolução é centrifugada [820], decantada [830], e osobrenadante [910] é coletado para processamento posteriore purificação da fração de teanina. O produto precipitado[900] é a fração purificada de polissacarídeo que pode seranalisada quanto aos polissacarídeos com o uso do métodocolorimétrico usando dextrana de peso molecular 5.000-410.000 como padrões de referência. A pureza da fração depolissacarídeo extraída é de cerca de 23-50%, com base emdiferentes pesos moleculares de dextrana, com um rendimento total de 1,15% por % de peso de massa da matéria-primaoriginal nativa de folha de chá verde (Tabela 18) . Acombinação das várias purezas de dextrana equivalentes éconsistente com uma pureza global de polissacarídeo de maisde 90% por peso de massa da fração purificada de polissacarídeo.

A pureza de teanina na solução do sobrenadante é decerca de 31-42%. Para se obter um nível maior de pureza deteanina, é necessário processamento adicional. A solução dosobrenadante [910] é seca. O produto seco é dissolvido emágua destilada suficiente [260] para gerar uma solução 10%[850] . A essa solução, são adicionados e misturados 4volumes de etanol absoluto [270] . Permite-se que essasolução hidroalcoólica fique em repouso por cerca de 1hora, e depois ela é centrifugada [860], e qualquer precipitado [910] é descartado. O sobrenadante [920] éconcentrado usando evaporador rotatório a vácuo [87 0] acerca de 60°C, para se obter uma solução a 80%. Permite-seque essa solução a 80% resfrie até a temperatura ambiente edepois são adicionados 4 volumes de etanol absoluto [2 80] à solução, que é refrigerada [880] a 0°C por 24 horas. Oscristais que se formam são coletados e secos a vácuo [890]a 60°C para gerar a fração purificada de teanina [930]. 0rendimento da fração purificada de teanina é de cerca de0,51-1,95% por % de peso de massa da matéria-prima de chá verde original, com uma pureza de cerca de 90-92% (Tabela18) . O procedimento real pode ser encontrado no Exemplo 6.

O rendimento de polissacarídeo do chá verde foi de1,2-8,5% por peso de massa, com base na matéria-prima defolha de chá verde original. A pureza da fração depolissacarídeo foi de 23-50%, com base em diferentes pesosmoleculares de dextrana, indicando uma pureza global > 90%de constituintes químicos do chá verde de polissacarídeo nafração. Com base no grande número e na variedade deabordagens experimentais, é bem razoável concluir que 1,2-8,5% de rendimento por peso de massa é maior do que 90% dospolissacarídeos hidrossolúveis, insolúveis em etanol, nomaterial da matéria-prima de espécies naturais de cháverde.

O rendimento da L-teanina de chá verde foi de 0,5-2,0%por peso de massa, com base na matéria-prima de chá verdeoriginal, o que eqüivale a cerca de 70% da teanina namatéria-prima original. Pode ser obtida uma pureza deteanina de 90% com o uso desses métodos.

São conhecidos muitos métodos na técnica para remoçãode álcool da solução. Caso se deseje manter o álcool parareciclagem, o álcool pode ser removido das soluções, apósextração, por destilação sob pressão atmosférica normal oupressões atmosféricas reduzidas. 0 álcool pode serreutilizado. Além disso, também há muitos métodosconhecidos na técnica para remoção de água de soluções,tanto soluções aquosas quanto soluções nas quais o álcoolfoi previamente removido. Tais métodos incluem, semlimitação, secagem por spray das soluções aquosas em umveículo adequado como, por exemplo, sem limitação,carbonato de magnésio ou maltodextrina ou,alternativamente, o líquido pode ser levado até a securapor liofilização ou secagem por janela refrativa.

Na realização dos métodos de extração descritospreviamente, verificou-se que mais de 90% de rendimento porpeso de massa dos constituintes químicos do óleo essencialque possuem mais de 8 0% de pureza dos constituintesquímicos do óleo essencial presentes na matéria-prima defolha seca original de chá verde e espécies relacionadaspodem ser extraídos na fração do extrato de SCCO2 de óleoessencial (Etapa 1). Utilizando-se os métodos ensinados naEtapa 2 (processo de descafeinação por SCCO2), o rendimentototal da cafeína do material de planta de chá verde é decerca de 4,5% por peso de massa (cerca de 85% dos compostosde cafeína presentes na matéria-prima de chá verdeoriginal), possuindo uma pureza química de cafeína de cercade 29% por peso de massa do extrato de cafeína. Esseprocesso de descafeinação reduz o teor de cafeína namatéria-prima descafeinada de chá verde a menos de 0,2% por% de peso de massa do material descafeinado de chá verde.

Além disso, com o uso dos métodos ensinados na presenteinvenção, pode ser obtido 8 0% de descafeinação do materialda matéria-prima de chá verde, mantendo-seos valiososconstituintes químicos de catequina, teanina epolissacarídeo na matéria-prima que podem ser usados paraprocessamento posterior para a obtenção de fraçõespurificadas de catequina, teanina e de polissacarídeo.

Utilizando-se os métodos ensinados na Etapa 3 destainvenção, é obtida uma fração de lixiviação de etanol comum rendimento de 19-31% por peso de massa da matéria-primaoriginal de espécies de chá verde. 0 rendimento dosconstituintes químicos de catequina é maior do que 90% porpeso de massa das catequinas presentes na matéria-prima dechá verde original (veja Tabelas 8 e Al - Apêndice 1). Alémdisso, o processo de lixiviação de etanol aumenta aconcentração (pureza) das quatro catequinas principais de7-12% por peso de massa na matéria-prima de folha nativa dechá verde estudada até cerca de 25-39% por peso de massa nafração de catequina do extrato, um aumento de 3,5 vezes naconcentração de catequinas (soma de ECGC, ECG, EGC e C) . Finalmente, a extração por lixiviação de etanol preserva oscompostos químicos de teanina e polissacarídeo no resíduosólido que podem ser usados para processamento posteriorpara frações purificadas de teanina e de polissacarídeo(Etapas 5 e 6).

Utilizando-se os métodos ensinados na Etapa 4 destainvenção (Processos de Extração Adsorvente por Afinidade) ,podem ser obtidas frações de catequina com purezas de maisde 90% por % de massa seca da fração de extração. Épossível extrair 56-86% das catequinas da matéria-prima do extrato de lixiviação de etanol 95%. Isso eqüivale a umrendimento de 50-77% dos constituintes químicos decatequina encontrados no material de planta nativo deespécies de chá verde com o uso de ECGC, ECG, EGC e C comoas referências do constituinte químico de catequina. Com base na análise por HPLC dessa fração de ácido fenólicocomo o uso dessas referências, a pureza dos constituintesquímicos de ácido fenólico é de cerca de 40% dos produtosde extração da fração de ácido fenólico. Além disso, umsolvente de eluição ácido provou ser um excelente processo para descafeinação adicional da fração purificada decatequina, reduzindo a cafeína nos produtos finais dafração de catequina a menos de 1%, até mesmo 0,2% por pesode massa da fração do extrato. Além disso, podem serobtidas subfrações nas quais a concentração de EGCG é aumentada até 65-75% por peso de massa, com uma pureza decatequina de mais de 95% pòr peso de massa da subfração doextrato. Os dados apoiam a habilidade da cromatografia poradsorvente de afinidade do processo para definir o perfildas frações de catequina do extrato, aumentando preferencialmente o % de peso de massa de EGCG, ECG e C ediminuindo EGC na fração do extrato.

Utilizando-se os métodos ensinados na Etapa 5(Processo de lixiviação de água), um rendimento elevado deconstituintes químicos hidrossolúveis de cerca de 3,6% porpeso de massa com base na matéria-prima de folha de cháverde original. A concentração de L-teanina nesse extratobruto é de cerca de 17% por peso de massa. Os compostoshidrossolúveis restantes são em grande partepolissacarídeos, o que é consistente com ós resultados deoutros estudos (29), os quais relataram que a concentraçãode polissacarídeo em folhas de chá verde era de cerca de2,42% por peso de massa, com uma pureza de 86,8% usandoprecipitação de etanol 60%.

Utilizando-se os métodos ensinados na Etapa 6 destainvenção (Processos de extração e purificação de L-teaninae de polissacarídeos), o rendimento total depolissacarídeos hidrossolúveis-insolúveis ém etanol é decerca de 1,2% pôr peso de massa com base na matéria-primaoriginal. A pureza da fração de polissacarídeo do extrato éde cerca de 56-76%, com base em um método colorimétricôusando diferentes pesos moleculares de dextrana comopadrões de referência. Esses dados são consistentes com umapureza total de polissacarideos de mais de 95%.

Além disso, usando os métodos ensinados na Etapa 6, orendimento de L-teanina é de cerca de 0,8% por peso demassa, com base na matéria-prima de folha de chá verdeoriginal, que é maior do que 55% da L-teanina presente namatéria-prima original. Pode ser obtida uma pureza deteanina de 90% por peso de massa da fração purificada deteanina do extrato com a utilização desses métodos.

Alimento e medicamentos

Como uma forma de alimentos da presente invenção, elespodem ser formulados em quaisquer formas opcionais, porexemplo, em forma de grânulos, em forma de grãos, em formade pasta, em forma de gel, em forma sólida ou em formaliquida. Nessas formas, vários tipos de substânciasconvencionalmente conhecidas por aqueles habilitados natécnica que podem ser adicionadas aos alimentos, porexemplo, um ligante, um desintegrante, um espessante, umdispersante, um agente promotor de reabsorção, um agenteflavorizante, um tampão, um tensoativo, um auxílio paradissolução, um conservante, um emulsificante, um agente deisotonicidade, um estabilizante ou um controlador do pHetc., podem estar opcionalmente presentes. Uma quantidadedo extrato de elderberry a ser adicionada aos alimentos nãoé especificamente limitada e, por exemplo, ela pode ser decerca de 10 mg a 5 g, preferivelmente 50 mg a 2 g por diacomo uma quantidade ingerida por um adulto com peso decerca de 60 kg.

Em particular, quando é utilizado como alimentos parapreservação da saúde, alimentos funcionais etc., prefere-seque contenha o ingrediente eficaz da presente invenção emuma quantidade tal que os efeitos predeterminados dapresente invenção sejam suficientemente mostrados.

Os medicamentos da presente invenção podem seropcionalmente preparados de acordo com os métodosconvencionalmente conhecidos, por exemplo, como um agentesólido, por exemplo, um comprimido, um grânulo, pó, umacápsula etc., ou como um agente líquido, por exemplo, umainjeção etc. Para esses medicamentos, podem ser formuladosquaisquer materiais geralmente usados como, por exemplo, umligante, um desintegrante, um espessante, um dispersante,um agente promotor de reabsorção, um agente flavorizante,um tampão, um tensoativo, um auxílio para dissolução, umconservante, um emulsificante, um agente de isotonicidade,um estabilizante ou um controlador do pH.

Uma quantidade de administração do ingrediente eficaz(extrato de chá verde) nos medicamentos pode variar,dependendo do tipo, da forma do agente, da idade, do pesocorporal ou de um sintoma a ser aplicado a um paciente, esemelhantes; por exemplo, quando ele é administradooralmente, ele é administrado uma ou várias vezes por diapara um adulto que pesa cerca de 60 kg, e administrado emuma quantidade de cerca de 10 mg a 5 g, preferivelmentecerca de 50 mg a 2 g por dia. 0 ingrediente eficaz pode serum ou vários componentes do extrato de chá verde.

Os métodos também compreendem a administração dessesextratos mais de uma vez por dia, mais de duas vezes pordia, mais de três vezes por dia, e em uma faixa de 1 a 15vezes por dia. Essa administração pode ser continuamente,como em todos os dias por um período de dias, semanas,meses ou anos, ou pode ocorrer em momentos específicos paratratar ou evitar condições específicas. Por exemplo, umapessoa pode receber a administração de extratos de espéciesde chá verde pelo menos uma vez ao dia por anos paraaumentar a concentração mental, as funções cognitivas e amemória, ou para evitar ou tratar diabetes melito do tipo2, para evitar acidente vascular cerebral por doençacardiovascular ou para tratar distúrbios gastrintestinais, ou para tratar distúrbios inflamatórios e artrite,incluindo gota, ou para tratar o resfriado comum, infecçõesbacterianas e fúngicas.

A descrição anterior inclui o melhor modo atualmentecontemplado para realização da presente invenção. Estadescrição tem a finalidade de ilustrar os princípios geraisda invenção, e não deve ser considerada em um sentidolimitante. Esta invenção é ainda ilustrada pelos exemplos aseguir, que não devem ser considerados, de forma alguma,como imposição de limitações ao escopo desta. Pelo contrário, deve-se entender claramente que podem serutilizadas várias outras modalidades, modificações eequivalentes destas, as quais, após leitura da descriçãoaqui apresentada, podem, elas mesmas, ser sugeridas poraqueles habilitados na técnica, sem se afastar do espíritoda presente invenção.

Todos os termos aqui utilizados devem serinterpretados no seu sentido normalmente aceito por aqueleshabilitados na técnica. Todas as patentes e pedidos depatentes ou referências aqui citados são incorporados porreferência em suas totalidades.Exemplificação

Materiais

Produtos botânicos: foram usados nesta invenção quatrotipos de chá verde chinês e um tipo de chá verde japonês.

Fl: folhas de chá verde chinês foram adquiridas de NamWan Tea Co Pte Ltd., Singapura.

F2: chá verde chinês de grau superior "BaifuTea"produzido por Jiangsu Province, China.

F3: chá verde chinês de grau superior uKai Hua LongDing" produzido por Zhejing Kai Hua Co. e colhido naprimavera.

F4: chá verde chinês de grau superior "Kai Hua LongDing" produzido por Zhejing Kai Hua Co. e colhido nooutono.

JPGT: chá verde japonês de grau superior.

Tabela 19. Componentes ativos do chá verde*.

<table>table see original document page 93</column></row><table><table>table see original document page 94</column></row><table>

* O óleo essencial foi estimado por extração ultra-sônicade 1 g de matéria-prima em hexano por 2 horas; catequinas,cafeína, cafeína, teobromina e ácido clorogênico foramestimados por extração ultra-sônica de 1 g de matéria-primaem metanol por 2 horas; L-teanina e ácido oxálico foramestimados por extração ultra-sônica de 1 g de matéria-primaem água por 2 horas.

SOLVENTES ORGÂNICOS

Acetonitrila (75-05-8), para HPLC, grau de gradiente >99,9% (GC) (000687); hexano (110-543), 95+%, grauespectrofotométrico (248878), etanol, desnaturado comisopropanol 4,8% (02853); etanol (64-17-5), absoluto,(02883); metanol (67-56-1), 99,93%, grau de ACS HPLC,(4391993); e água (7732-18-5), grau de HPLC, (95304); todosforam adquiridos de Sigma-Aldrich Co.ÁCIDOS E BASES

Ácido fórmico (64-18-6), solução 50% (09676) ; fenol(108-95-2) (P3653) ; ácido sulfúrico (7664-93-9), reagenteACS, 95 - 97% (44719) ; ácido trifluoracético (76-05-1) ,99,8% grau espectrofotométrico (302031); ácido fosfórico(7664-38-2), solução 85% em água (438081); todos foramadquiridos de Sigma-Aldrich Co.; fosfato de potássio,monobásico (7778-77-0), pureza >99% (205925000, Lote #:A019842601) foi adquirido de Acros Organics Co.PADRÕES QUÍMICOS DE REFERÊNCIA

(+)-cateqüina (154-23-4), 95% de pureza(03310); (-)-epicatequina (490-46-0), 93,6% de pureza (05125); (-)-gaiato de epicatequina (1257-08-5), 99% de pureza (05135);(-)-epigalocatequina (97074-1), 98,3% de pureza (05145); (-)-gaiato de epigalocatequina (989-51-5), 94% de pureza(05151); L-téanina (3086-61-6), pureza: 99,0% (20250-001);todos foram adquiridos de Chromadex (www.chromadex.com).Cafeína (58-0802), pura, anidra, >99% (27600); Teobromina(83-67-0), pureza >99%, (T4500); e ácido clorogênico (327-97-9), titulação mínima de 95% (C3878); foram adquiridos deSigma-Aldrich Co. Padrões de dextrana 5000 (00269), 50.000(00891) e 410.000 (00895) certificados de acordo com DINforam adquiridos de Fluka Co. Ácido oxálico (144-62-7), 98%de pureza (194131) foi adquirido de Sigma-Aldrich Co. Asestruturas dos padrões são mostradas na Tabela 20.<table>table see original document page 96</column></row><table><table>table see original document page 97</column></row><table>MÉTODOS

Métodos de HPLC

Análise de catequina e alcalóide.

Sistema cromatográfico: sistema de cromatografialiquida de alto rendimento Shimadzu LC-IOAVP equipado combomba LC10ADVP com detector de arranjo de fotodiodo SPD-M1OAVP. Os produtos de extração obtidos foram medidos em umacoluna de fase reversa Júpiter C18 (250 χ 4,6 mm I.D., 5 μ,300 Â) (Phenomenex, Código do produto: OOG-4053-E0, N0 desérie: 2217520-3, Lote N°: 5243-17). A fase móvel consistiuem A (solução aquosa de ácido fórmico 0,5% (v/v)) e B(acetonitrila). O gradiente foi programado da seguinteforma: dentro dos primeiros 6 minutos, A mantém a 100%, 6-10 minutos, solvente B aumentado linearmente de 0% a 12%, e10-35 minutos, B linear de 12% a 21%, depois 35-40 minutos,B linear de 21% a 25%, e depois 40-50 min, B linear até100%. O volume de injeção foi de 10 μΐ, e a taxa de fluxoda fase móvel foi de 1 ml/min. A temperatura da coluna foide 500C.

Foram preparadas soluções de estoque de metanol de C(catequina), EGC (epigalocatequina), ECG (gaiato deepicatequina), EGCG (gaiato de epigalocatequina) , cafeína,teobromina, ácido clorogênico em uma concentração de 1mg/ml. Alíquotas de um mililitro de solução-padrão foramtransferidas em um frasco volumétrico de 10 ml para geraruma solução-padrão mista. A solução mista do padrão dereferência foi então diluída, etapa por etapa, para geraruma série de soluções em concentrações finais de 0,5, 0,2,0,1, 0,05 e 0,01 mg/ml, respectivamente. As curvas-padrãoforam preparadas sobre essas cinco concentrações, e a áreade pico foi tabulada contra as concentraçõescorrespondentes usando regressão linear para gerar a curva-padrão. Os resultados são resumidos na Tabela 21.Tabela 21

<table>table see original document page 100</column></row><table><table>table see original document page 101</column></row><table>Análise de teanina.

As análises de teanina foram realizadas em uma colunade fase reversa Júpiter C18 (250 χ 4,6 mm I.D., 5 μ, 300 Á)(Phenomenex, Código do produto: OOG-4053-E0, N0 de série:2217520-3, Lote N°: 5243-17). A fase móvel foi águaregulada com ácido trifluoracético em uma concentração de0,1%. A taxa de fluxo da fase móvel foi de 1 ml/min. 0detector foi ajustado em um comprimento de ondade 203 nm.

Análise de ácido oxálico

As análises de ácido oxálico foram feitas em umacoluna de fase reversa Júpiter C18 (250 χ 4,6 mm I.D., 5 μ,300 Á) (Phenomenex, Código do produto: OOG-4053-E0, N0 desérie: 2217520-3, Lote N°: 5243-17). A fase móvel consistiuem A (solução aquosa de KH2PO4 0,5% (p/v)) e B(acetonitrila). A fase móvel de solução aquosa de KH2PO40,5% (p/v) foi preparada dissolvendo-se KH2PO4 sólido emágua destilada. A seguir, ela foi ajustada até o pH 2,80com uma solução de 1,0 mól/1 de H3PO4. 0 gradiente foiprogramado da seguinte forma: solvente B aumentadolinearmente de 10% a 4 0% em 15 minutos e depois diminuídode 40% a 10% em outros 5 minutos. 0 volume de injeção foide 10 μl, e a taxa de fluxo da fase móvel foi de 1 ml/min.

A temperatura da coluna foi de 25°C. 0 comprimento de ondadetectado foi de 262 nm. Foram testadas diferentesconcentrações de ácido oxálico em água de 0,1 mg/ml a 10mg/ml. As curvas-padrão foram preparadas sobre essasconcentrações, e a área de pico foi tabulada contra asconcentrações correspondentes usando regressão linear paragerar a curva-padrão. Os teores de ácido oxálico na soluçãoda amostra foram quantificados comparando-se a área de picona solução da amostra com a de padrões conhecidos.

MÉTODOS DE GC-MS

Foram feitas análises GC-MS usando um sistema ShimadzuGCMS-QP2010. O sistema inclui uma cromatografia a gás dealto rendimento, interface GC/MS direta acoplada, fonteiônica de impacto de elétrons (EI) com controleindependente da temperatura, filtro de massa de quadripoloe outros. O sistema é controlado com o software de soluçãode GCMS Versão 2 para aquisição de dados e análise pós-execução. A separação foi realizada em uma coluna capilarde sílica fundida Agilent J&W DB-5 (30 m χ 0,25 mm i.d.,0,25 pm de espessura da película) (catálogo: 1225032, N° desérie: US5285774H) com o uso do seguinte programa detemperatura: a temperatura inicial foi de 60°C, mantida por1 min, e depois aumentada até 180°C em uma taxa de 3°C/min,mantida por 35 minutos, com tempo de execução total de 76minutos. A temperatura de injeção da amostra foi de 220°C,e 1 μΐ de amostra foi injetado por auto-injetor em modosplitless em 1 minuto. 0 gás transportador foi hélio e ataxa de fluxo foi controlada por pressão a 40,1 kPa. Sobessa pressão, a taxa de fluxo foi de 0,79 ml/min e avelocidade linear foi de 32,5 cm/min. A temperatura dafonte iônica de MS foi de 230°C, e a temperatura dainterface GC/MS foi de 230°C. 0 detector de MS foiescaneado entre m/z de 50 e 500, em uma velocidade devarredura de 1.000 AMU/segundo. O valor de corte datemperatura do solvente foi de 3,5 minutos.Análise de polissacarideos

Sistema de espectrofotômetro: foi usado nesse estudoum espectrofotômetro de ultravioleta visível Shimadzu UV-1700 (190-1.100 nm, resolução de 1 mm). Foi utilizado ométodo colorimétrico (Dubois, M., Gilles, K.A., Hamilton,J. K., Rebers, P.A. e Smith, F., "Colorimetric Method forDeteirmination of Sugars and related substances", Analyticalchemistry, 1956, 28(3), 350-356) para análise depolissacarídeos. Fazer soluções de estoque de dextrana de0,1 mg/ml (PM = 5.000, 50.000 e 410.000). Fazer 0,08, 0,16,0,24, 0,32, 0,4 0 ml de solução de estoque e completar ovolume até 0,4 ml com água destilada. A seguir, adicionarem 0,2 ml de solução de fenol 5% e 1 ml de ácido sulfúricoconcentrado. Permitir que as misturas fiquem em repouso por10 minutos, antes de realizar a varredura por UV. Aabsorbância máxima foi encontrada a 488 nm. Depois, ajustaro comprimento de onda a 488 nm e medir a absorbância paracada amostra. Os resultados são mostrados na Tabela 22.

Foram obtidas curvas de calibração-padrão para cada uma dassoluções de dextrana da seguinte forma: Dextrana 5.000,Absorbância = 0,01919 + 0,027782 C (pg), R2 = 0,97 (N= 5);Dextrana 50.000, Absorbância = 0,0075714 + 0,032196 C (pg),R2 = 0,96 (N = 5); e Dextrana 410.000, Absorbância =0,03481 + 0,036293C (pg), R2 = 0,98 (N= 5).<table>table see original document page 105</column></row><table>Análise DART-MS de extratos de chá verde

Um espectrômetro de massa JEOL AccuTOF-DART (Jeol EUA,Peabody, MA) foi usado na análise espectrométrica de massade extratos de chá verde. Essa tecnologia de espectrômetro de massa tempo de vôo ("Time-of-Flight" - TOF) não exigepreparação da amostra (ou exige preparação mínima) , e geramassas com precisões de até 0,00001 unidade de massa. Parao modo íon positivo (DART+) , a voltagem da agulha foiajustada em 3.500 V, o elemento de aquecimento em 300°C, o Eletrodo 1 em 150 V, o Eletrodo 2 em 250 Veo fluxo de gáshélio em 3,69 litros por minuto (LPM). Para o espectrômetrode massa, foram carregados òs seguintes ajustes: Orifício 1ajustado em 20 V, voltagem da lente do anel ajustada em 5 Ve o Orifício 2 ajustado em 5 V. A voltagem dos picos foi ajustada em 1.000 V a fim de gerar poder de resoluçãocomeçando em aproximadamente 100 m/z. A voltagem dodetector de micro-canal de placa (MCP) foi ajustada em2.550 V. As calibrações foram realizadas internamente, comcada amostra usando uma solução de 10% de PEG 600, o queforneceu marcadores de massa por toda a gama necessária de100-1.000 unidades de massa.

As amostras de chá verde foram introduzidas no plasmade hélio de DART na forma de pós, usando a extremidadefechada de um tubo capilar de ponto de fusão de vidro deborossilicato. A amostra é coletada como uma película finano tubo capilar, permitindo que uma área de superfíciehomogênea seja exposta ao feixe de plasma de He, o quemaximiza a liberação no TOF. O tubo capilar é mantido noplasma de He por aproximadamente 3-5 segundos por análise.Não foi observada nenhuma pirólise da amostra durante aanálise.

Para o modo íon negativo (DART-), o DART e AccuTOF-MSforam mudados para o modo ion negativo. A voltagem daagulha foi de 3.500 V, o elemento de aquecimento 300°C,Eletrodo 1 - 150 V, Eletrodo 2 -250 Veo fluxo de gáshélio 3,69 LPM. Para o espectrômetro de massa, foramcarregados os seguintes ajustes: Orifício 1 ajustado em -20V, voltagem da lente em anel ajustada em -5 V e orifício 2ajustado em -5 V. A voltagem dos picos foi ajustada em 600V, para se obter poder de resolução apropriado em faixasmenores de m/ζ ranges no modo íon negativo. A voltagem deMCP foi ajustada em 2.600 V. As amostras foram introduzidasno DART exatamente da mesma forma que no modo íon positivo.

As calibrações foram realizadas internamente, com cadaamostra usando uma solução de ácidos carboxílicosperfluorinados.

As fórmulas moleculares foram confirmadas porprogramas de composição de elementos e de combinação deisótopos fornecidos com o JEOL AccuTOF DART-MS. Foidesenvolvida uma base de dados pesquisável de constituintesdo chá verde com base na literatura. Todas asidentificações químicas (identificadas e não identificadas)nos espectros de massa são atribuídas com um nível deconfiança acima de 90%.

Exemplo 1

Exemplo da Etapa 1: extração por SFE em etapa única epurificação de óleo essencial de chá verde.

Todas as extrações por SFE foram realizadas em SFT 250(Supercritical Fluid Technologies, Inc., Newark, Delaware,EUA) designado para pressões e temperaturas de até 690 bare 200°C, respectivamente. Esse aparelho permite extraçõessimples e eficientes em condições supercríticas comflexibilidade para operar tanto no modo dinâmico quantoestático. Esse dispositivo consiste em três módulos: umforno, uma bomba e um módulo de controle e de coleta. 0forno possui uma coluna pré-aquecida e um vaso de extraçãode 100 ml. 0 módulo da bomba é equipado com uma bombaacionada por ar comprimido com capacidade de fluxoconstante de 3 00 ml/min. 0 módulo de coleta é um frasco devidro de 4 0 ml, lacrado com tampas e septos para arecuperação de produtos extraídos. Ele ainda é fornecidocom válvulas micrométricas e um medidor de fluxo. A pressãoe a temperatura do vaso de extração são monitoradas econtroladas em +/- 3 bar e +/- I0C.

Em um exemplo experimental típico, 25 gramas de folhascortadas de chá verde com tamanho acima de 105 μιηpeneirados por uma tela com trama 14 0 foram carregados emum vaso de extração de 100 ml para cada experimento. 0forno foi pré-aquecido até a temperatura desejada, antes deo vaso comprimido ser carregado. Após o vaso ter sidoconectado ao forno, o sistema de extração foi testadoquanto a vazamentos por pressurização do sistema com CO2(5.860 MPa/g), e depurado. O sistema foi fechado epressurizado até a pressão de extração desejada com o usoda bomba de líquido acionada a ar. O sistema foi entãodeixado para equilíbrio por aproximadamente 3 minutos. Umfrasco de coleta de amostra (40 ml) foi pesado e conectadoà entrada de coleta de amostras. A extração foi iniciadapor fluxo de CO2 em uma taxa de 5 SLPM (9,8 g/min) , que écontrolado por uma válvula metrificada. A proporção desolvente/alimentação, definida como a proporção de peso deCO2 total usado em relação ao peso de material brutocarregado, foi calculada. Durante o processo de extração, aamostra extraída foi pesada a cada 5 minutos. A extraçãosupostamente terminava quando o peso da amostra não sealterava mais de 5% entre duas medidas de peso. 0rendimento foi definido como sendo a proporção de peso detotal exata para a alimentação de material bruto dematéria-prima.

Nesse exemplo experimental, as condições de extraçãoajustadas foram: temperatura ajustada em 4O0C e pressãoajustada em 20 MPa. A taxa de fluxo CO2 foi de 9,8 g/min.

Exemplo 2

Exemplo da Etapa 2: descafeinação por SFE em etapa única dematerial de planta de chá verde

Todas as extrações por SFE foram realizadas em SFT 250(Supercritical Fluid Technologies, Inc., Newark, Delaware,EUA) . Em um exemplo experimental típico, o resíduo dos 25gramas do óleo essencial extraído de folhas cortadas de cháde chá verde umedecidas com 25 gramas de co- solvente deágua destilada foi carregado em um vaso de extração de 100ml para cada experimento. O forno foi pré-aquecido até atemperatura desejada, antes de o vaso comprimido sercarregado. Após o vaso ter sido conectado ao forno, osistema de extração foi testado quanto a vazamentos porpressurização do sistema com CO2 (5,860 MPa/g) , e depurado.p sistema foi fechado e pressurizado até a pressão deextração desejada com o uso da bomba de líquido acionada aar. O sistema foi então deixado para equilíbrio poraproximadamente 3 minutos. Um frasco de coleta de amostra(40 ml) foi pesado e conectado à entrada de coleta deamostras. A extração foi iniciada por fluxo de CO2 em umataxa de 5 SLPM (9,8 g/min), que é controlado por umaválvula metrificada. Três ml de co-solvente foram dosadosno sistema a cada minuto. O tempo de extração foi de 4horas. A proporção de solvente/alimentação, definida como aproporção de peso de CO2 total usado em relação ao peso dematerial bruto carregado, foi calculada. 0 rendimento foidefinido como sendo a proporção de peso de total exata paraa alimentação de material bruto de matéria-prima. Ascondições de extração foram ajustadas em 700C e 50 MPa.

Exemplo 3

Exemplo da Etapa 3: extração por lixiviação de etanol 95%.

Exemplos típicos de extrações de solvente em 2estágios dos constituintes químicos de catequina domaterial de folha de chá verde são o seguinte: a matéria-prima era composta por 25 gramas de folha cortadas de cháde resíduo de SFE de chá verde da descafeinação por SCCO2da Etapa 2 ou matéria-prima de folha bruta de chá verde. 0solvente foi 250 ml de etanol 95%. Nesse método, o materialda matéria-prima e 250 ml etanol 95% foram carregadosseparadamente em um vaso de extração de 500 ml, emisturados em um banho de água aquecida a 70°C por 2 horas.

A solução de extração foi filtrada com a utilização depapel de filtro Fisherbrand P4, que possui um tamanho deretenção de partículas de 4-8 pm, centrifugada a 3.000 rpmpor 20 minutos, e o resíduo particulado usado para extraçãoposterior. O filtrado (sobrenadante) foi coletado paracálculo do rendimento e análise por HPLC. 0 resíduo doEstágio 1 foi extraído por 2 horas (Estágio 2) utilizando-se os métodos mencionados anteriormente. Os extratos dosobrenadante foram combinados, e o etanol removido usandoum evaporador rotatório. Caso seja desejada uma purificaçãoadicional da fração de catequina, o produto de extração de catequina bruto sem álcool é dissolvido em 250 ml de águadestilada para processamento da Etapa 4. 0 resíduo daextração do Estágio 2 foi o mesmo para processamentoposterior para frações de teanina e de polissacarídeo (vejaEtapa 5).

Exemplo 4

Exemplos da Etapa 4: extração adsorvente por afinidade defrações de catequina.

Em experimentos típicos, as soluções de trabalho erama solução aquosa transparente do extrato de lixiviação de

etanol 95% em dois estágios de chá verde na Etapa 3. Paraesses exemplos, 25 g do resíduo descafeinado por SFE de cháverde foram extraídos por lixiviação em dois estágiosusando 250 ml de etanol 95% a 70 0C (proporção desolvente/alimentação 20/1), como descrito na Etapa 3. Os extratos em dois estágios foram combinados, e o etanol foiremovido usando evaporação rotatória. Foi então adicionadaágua destilada para reconstituir a concentração original dasolução (volume de 500 ml).

A resina de polímero adsorvente de afinidade foi XAD7HP (veja Apêndice 1) . Trinta gramas de adsorvente deafinidade foram pré-lavados com etanol 95% (4-5 BV) e águadestilada (4-5 BV) , antes e depois da compactação em umacoluna de vidro com um ID de 10 mm e comprimento de 350 mm.O BV (volume de leito) de adsorvente foi de 35 ml. Cem mlde solução aquosa (solução de lixiviação desetanolizada daetapa 3) com uma concentração em solução = 4,8-9,6 mg/mlforam carregados na coluna compactada em uma taxa de fluxode 1,2 ml/min (2 BV/hora). 0 tempo de carga foi de 85minutos. A coluna carregada foi lavada com 150 ml de águadestilada em uma taxa de fluxo de 10 BV/hora, com um tempode lavagem de 25 minutos. Para descafeinar a colunacarregada, foram usados 100 ml de H2SO4 5% em etanol 10%para eluir os compostos de cafeína em uma taxa de fluxo de2,2 ml/min (2 BV/hora). O eluato foi descartado. A seguir,foram usados 250 ml de água destilada para lavar a colunaem uma taxa de fluxo de 6 ml/min (12 BV/hora) ou até que assoluções de lavagem ficassem com pH neutro. Foramutilizados 100 ml de etanol 80% para eluir as catequinas dacoluna carregada, em uma taxa de fluxo de 1,2 ml/min (2BV/hora) com um tempo de eluição de 85 minutos. Durante aeluição, foram coletadas 6 frações (F1-F6) a 0-0,7 (Fl),0,8-1,0 (F2) , 1,0-1,1 (F3), 1,1-1,3 (F4), 1,3-1,6 (F5) e1,6-3 (F6) BV, respectivamente. A seguir, 3 BV de etanolabsoluto foram usados para limpar as substâncias químicasrestantes na coluna, em uma taxa de fluxo de 3,6 BV/hora,seguido por lavagem com 3 BV de água destilada a 3,8BV/hora. Os eluatos de carga, efluente, de lavagens e decafeína eluato foram coletados, medidos quanto ao teor demassa e analisados com o uso de HPLC para medir ascatequinas (EGCG, EGC, ECG, C), cafeína, teobromina e ácidoclorogênico. Cada fração de eluição foi coletada eanalisada por HPLC.

Exemplo 5

Exemploedo processo de lixiviação de água para extração depolissacarideos e ta.Em um exemplo de experimento típico do processo delixiviação de água, 20 g do resíduo do processo delixiviação de etanol 95% da Etapa 3 e 400 ml de águadestilada foram carregados separadamente em um vaso deextração de 500 ml e misturados em um banho de água a 700Cpor 2 horas. A camada transparente de cima foi decantada euma extração do segundo estágio do resíduo sólido foiextraída com 4 00 ml de água destilada usando os mesmosmétodos. As soluções de extração em dois estágios foram

centrifugadas a 2.000 rpm por 10 minutos e filtradas compapel Fisherbrand P4 (tamanho de retenção de partícula de4-8 μπι) . As soluções de sobrenadante decantadas em doisestágios foram coletadas e combinadas para cálculo dorendimento e análise por HPLC quanto ao teor de teanina.

Exemplo 6

Exemplo da Etapa 6: extração e purificação da fração depolissacarídeo e de teanina.

Um exemplo experimental típico de extração de solventee precipitação dos constituintes químicos hidrossolúveis,

insolúveis em etanol, da fração purificada depolissacarídeo e dos constituintes químicos de teanina dechá verde é o seguinte: 20 gramas do resíduo sólido daextração por lixiviação de etanol 95% em 2 estágios daEtapa 3 foram extraídos com o uso de lixiviação de água

destilada 2 estágios, como descrito acima na Etapa 5. Assoluções do extrato de dois estágios da Etapa 5 foramcombinadas. Foi usada evaporação rotatória a vácuo paraconcentrar a solução transparente do extrato dosobrenadante, removendo 60% do solvente de água. A seguir,foi acrescentado etanol anidro para completar umaconcentração final de etanol de 75%. Deixou-se essa soluçãoem repouso por 1 hora, e foi observado um precipitado. Asolução de extração foi centrifugada a 2.000 rpm por 10minutos, e o sobrenadante decantado, liofilizado e salvopara processamento posterior. O precipitado depolissacarídeo foi coletado e liofilizado. A fração depolissacarideo seca foi pesada e dissolvida em água paraanálise da pureza do polissacarídeo com o métodocolorimétrico, usando dextrana como padrões de referência.

Além disso, a espectrometria de massa Ac c uTO F-DART foiusada para refinar o perfil dos pesos moleculares doscompostos que compreendem as frações de polissacarídeo. Osresultados são mostrados nas Figuras 6-11.0 produto seco dosobrenadante contendo L-teanina foi dissolvido em águadestilada para constituir uma solução de 10%. A essasolução, foram adicionados 4 volumes de etanol absoluto,misturados, e ela permaneceu em repouso por 1 hora. Asolução foi então centrifugada a 6.000 rpm por 10 minutos,e decantada. Os precipitados foram descartados. A soluçãodo sobrenadante coletada foi concentrada usando evaporaçãorotatória a vácuo a 60°C até uma solução de etanol 80%.Deixou-se essa solução de etanol 80% resfriar até atemperatura ambiente. A seguir, foram adicionados 4 volumesde etanol à solução. Essa solução foi colocada em umrefrigerador a 0°C por 24 horas para cristalização docomposto de teanina. A solução foi centrifugada a 2.000 rpmpor 10 minutos, e os cristais foram então coletados e secosa 600C sob vácuo.

Exemplo 7

Os seguintes ingredientes foram misturados para a<table>table see original document page 115</column></row><table>

O novo extrato de chá verde compreende uma fraçãopurificada de óleo essencial, uma fração de catequina, umafração de teanina e uma fração de polissacarídeo por % depeso de massa acima daquela encontrada no material de rizoma natural ou em produtos de extração convencionais. Asformulações podem ser feitas em qualquer forma de dosagemoral, e administradas diariamente ou em até 15 vezes pordia, como necessário para os efeitos fisiológicos,psicológicos e médicos desejados (atividades antioxidante,de remoção de radical livre de oxigênio e de inibição danitrosação, aumento imunológico, anti-osteoporose,prevenção e terapia de doença cardiovascular, prevenção eterapia de doença cerebrovascular, atividade de redução docolesterol, prevenção e tratamento de câncer, tratamento deHIV e de doenças virais, perda de peso e termogênese,prevenção do envelhecimento, tratamento do diabetes melito,aumento da memória e da cognição, redução da ansiedade emelhora do humor).

Exemplo 8

Os ingredientes a seguir foram misturados para aseguinte formulação:

<table>table see original document page 116</column></row><table>

Fração de óleo essencial (5 mg, 3% do peso seco)Fração de ácido fenólico (90,0 mg, 60% do peso seco)Teanina (10,0 mg, 7% do peso seco)

<table>table see original document page 116</column></row><table>

A nova composição de extrato de chá verde compreendefrações de constituintes químicos de óleo essencialpurificado, catequina, teanina e polissacarídeo por % depeso de massa acima daquela encontrada no material deplanta natural ou em produtos de extração convencionais. Aformulação pode ser feita em qualquer forma de dosagemoral, e administrada com segurança até 15 vezes por dia,como necessário para os efeitos fisiológicos, psicológicose médicos desejados.

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Claims

1. Extrato de espécies de chá verde, caracterizado porcompreender uma fração que possui um cromatograma deespectrometria de massa por Análise Direta em Tempo Real(DART) de qualquer uma das Figuras 6 a 25.

2. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o extratocompreende um composto selecionado do grupo que consiste emum óleo essencial, um polifenol, um polissacarídeo, ecombinações destes.

3. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o óleoessencial é selecionado do grupo que consiste em ácido n-hexadecanóico, ácido tetradecanóico, 9-hexadecanol, 1-undecanol, 1-hexadecanol, álcool oleilico, 9-octadecen-l-ol, nonadecanol, e combinações destes.

4. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o polifenolé selecionado do grupo que consiste em catequinas,flavanóis, glicosideos de flavonol, e combinações destes.

5. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a catequinaé selecionada do grupo que consiste em catequina (C),epicatequina (EC), gaiato de epicatequina (ECG),galocatequina (GC), gaiato de epigalocatequina (EGCG),epigalocatequina (EGC), e combinações destes.

6. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 4, caracterizadas pelo fato de que o flavanolé selecionado do grupo que consiste em quercetina e rutina.

7. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 4, caracterizadas pelo fato de que oglicosídeo de flavonol é kaempferol.

8. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 2, caracterizadas pelo fato de que opolissacarídeo é selecionado do grupo que consiste emglicose, arabinose, galactose, ramnose, xilose, ácidourônico, e combinações destes.

9. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 1, caracterizadas por serem substancialmentelivres de cafeína, ácido oxálico ou taninos.

10. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 2, caracterizadas pelo fato de que aquantidade de óleo essencial é maior do que 2% por peso.

11. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de óleo essencial é de 25% a 90% por peso.

12. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de óleo essencial é de 50% a 90% por peso.

13. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de óleo essencial é de 75% a 90% por peso.

14. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de polifenol é maior do que 40% por peso.

15. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de polifenol é de 50% a 90% por peso.

16. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de polifenol é de 75% a 90% por peso.

17. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de polissacarídeo é maior do que 15% por peso.

18. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de polissacarídeo é de 25% a 90% por peso.

19. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de polissacarídeo é de 50% a 90% por peso.

20. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que aquantidade de polissacarídeo é de 75% a 90% por peso.

21. Extrato de espécies de chá verde, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o extratocompreende um óleo essencial de 2% a 97% por peso, umacatequina de 15% a 98% por peso, uma teanina de 4% a 90%por peso, e um polissacarídeo de 9% a 98% por peso.

22. Alimento ou medicamento, caracterizado porcompreender o extrato de espécies de chá verde dareivindicação 1.

23. Método de preparação de um extrato de espécies dechá verde que possui pelo menos uma característicapredeterminada, caracterizado por compreender a extraçãoseqüencial de um material de planta de espécies de cháverde para gerar uma fração de óleo essencial, uma fraçãode polifenol e uma fração de polissacarídeo por:a) extração de um material de planta de espécies dechá verde por extração supercrítica de dióxido de carbonopara gerar uma fração de óleo essencial e um primeiroresíduo;b) extração de um material de planta de espécies dechá verde ou do primeiro resíduo da etapa (a) por extraçãoalcoólica, para gerar a fração polifenólica e um segundoresíduo; ec) extração do segundo resíduo da etapa (b) porextração com água e precipitação do polissacarídeo comálcool para gerar a fração de polissacarídeo.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que o primeiro resíduo da etapa(a) é ainda descafeinado por extração supercrítica dedióxido de carbono.

25. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que a fração polifenólica éainda purificada por cromatografia por afinidadeadsorvente.

26. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende:-1) carregamento em um vaso de extração de material deplanta triturado de espécies de chá verde;-2) adição de dióxido de carbono sob condiçõessupercríticas;-3) contato do material de planta de espécies de cháverde e do dióxido de carbono por um período de tempo; e-4) coleta de uma fração de óleo essencial em um vasode coleta.

27. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado ainda por compreender a etapa de alteraçãodas proporções de composto químico de óleo essencial porfracionamento da fração de óleo essencial com um sistema deseparação fracionária supercritico de dióxido de carbono.

28. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que as condições supercríticascompreendem 6 MPa a 80 MPa de pressão a 35°C a 90°C.

29. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que as condições supercríticascompreendem 6 MPa a 50 MPa de pressão a 40°C a 80°C.

30. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que o tempo é de 3 0 minutos a2,5 horas.

31. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que o tempo é de 1 hora.

32. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que a etapa (b) compreende:1) contato do material de planta triturado de espéciesde chá verde ou do primeiro resíduo da etapa (a) com umsolvente alcoólico por um período de tempo suficiente paraextrair constituintes químicos polifenólicos;2) passagem de uma solução aquosa de constituintesquímicos polifenólicos extraídos da etapa (1) através deuma coluna de resina adsorvente por afinidade na qual osconstituintes polifenólicos são adsorvidos;3) eluição dos compostos de cafeína pela afinidadeadsorvente com o uso de um solvente de eluição ácido; e4) eluição dos constituintes químicos polifenólicos daresina adsorvente por afinidade com o uso de um solvente deeluição hidroalcoólico.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que a solução hidroalcoólicacompreende etanol e água, em que a concentração de etanol éde 10-95% por peso.

34. Método, de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que a solução hidroalcoólicacompreende etanol e água, em que a concentração de etanol éde 25% por peso.

35. Método, de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que a etapa (1) é realizada a30°C a 100°C.

36. Método, de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que a etapa (1) é realizada a60°C a 100°C.

37. Método, de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que o tempo é de 1-10 horas.

38. Método, de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que o tempo é de 1-5 horas.

39. Método, de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que o tempo é de 2 horas.

40. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende:1) contato do segundo resíduo da etapa (b) com águapor um período de tempo suficiente para extrairpolissacarídeos; e2) precipitação dos polissacarídeos da solução de águapor precipitação com álcool.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40,caracterizado pelo fato de que a água está a 70°C a 90°C.

42. Método, de acordo com a reivindicação 40,caracterizado pelo fato de que a água está a 80°C a 90°C.

43. Método, de acordo com a reivindicação 40,caracterizado pelo fato de que o tempo é de 1-5 horas.

44. Método, de acordo com a reivindicação 40,caracterizado pelo fato de que o tempo é de 2-4 horas.

45. Método, de acordo com a reivindicação 40,caracterizado pelo fato de que o tempo é de 2 horas.

46. Método, de acordo com a reivindicação 40,caracterizado pelo fato de que o álcool é etanol.

47. Extrato de espécies de chá verde, caracterizadopor ser preparado pelo método da reivindicação 23.

48. Extrato de espécies de chá verde, caracterizadopor compreender pirogalol, teofilina/teobromina de 25 a 35%por peso do pirogalol, ácido chiquímico de 0,1 a 5% porpeso do pirogalol, ácido cumárico de 0,1 a 5% por peso dopirogalol, e 3-metóxi-l-tirosina de 0,1 a 5% por peso dopirogalol.

49. Extrato de espécies de chá verde, caracterizadopor compreender teanina, teofilina/teobromina de 20 a 30%por peso da teanina, catequina/epicatequina de 1 a 10% porpeso da teanina, ácido gálico de 1 a 10% por peso dateanina, catequina quinona de 0,1 a 5% por peso da teanina,cinamaldeído de 0,1 a 5% por peso da teanina, e 3-metóxi-l-tirosina de 1 a 10% por peso da teanina.

50. Extrato de espécies de chá verde, caracterizadopor compreender teanina, teofilina/teobromina de 45 a 55%por peso da teanina, catequina/epicatequina de 1 a 10% porpeso da teanina, ácido carnósico de 0,1 a 5% por peso dateanina, ácido gálico de 1 a 10% por peso da teanina,catequina quinona de 0,5 a 5% por peso da teanina,cinamaldeído de 1 a 10% por peso da teanina, ácido metilcinâmico de 0,1 a 5% por peso da teanina, cinamida de 1 a-10% por peso da teanina, e 3-metóxi-1-tirosina de 1 a 10%por peso da teanina.

51. Extrato de espécies de chá verde, caracterizadopor compreender pirogalol, teofilina/teobromina de 1 a 10%por peso do pirogalol, teanina de 0,1 a 5% por peso dopirogalol, catequina/epicatequina de 1 a 10% por peso dopirogalol, kaempferol de 5 a 15% por peso do pirogalol,miricetina de 0,1 a 5% por peso do pirogalol, galocatequinaquinona de 0,1 a 5% por peso do pirogalol, ácido gálico de-65 a 75% por peso do pirogalol, catequina quinona de 0,5 a-5% por peso do pirogalol, ácido vanílico de 1 a 10% porpeso do pirogalol, e 3-metóxi-l-tirosina de 1 a 5% por pesodo pirogalol.

52. Extrato de espécies de chá verde, caracterizadopor compreender kaempferol, teanina de 1 a 10% por peso dokaempferol, catequina/epicatequina de 95 a 105% por peso dokaempferol, quercetina de 20 a 30% por peso do kaempferol,miricetina de 5 a 15% por peso do kaempferol, galocatequinaquinona de 5 a 10% por peso do kaempferol, ácido gálico de-55 a 65% por peso do kaempferol, catequina quinona de 1 a-10% por peso do kaempferol, ácido cumárico de 10 a 20% porpeso do kaempferol, ácido vanilico de 1 a 10% por peso dokaempferol, e 3-metóxi-l-tirosina de 15 a 25% por peso dokaempferol.

53. Extrato de espécies de chá verde, caracterizadopor compreender pirogalol, teofilina/teobromina de 0,5 a 5%por peso do pirogalol, catequina/epicatequina de 95 a 105%por peso do pirogalol, kaempferol de 55 a 65% por peso dopirogalol, quercetina de 20 a 30% por peso do pirogalol,miricetina de 10 a 20% por peso do pirogalol, galocatequinaquinona de 20 a 30% por peso do pirogalol, ácido gálico de-50 a 60% por peso do pirogalol, catequina quinona de 15 a25% por peso do pirogalol, ácido cumárico de 15 a 25% porpeso do pirogalol, ácido vanilico de 1 a 10% por peso dopirogalol, e 3-metóxi-l-tirosina de 0,5 a 5% por peso dopirogalol.

54. Extrato de espécies de chá verde, caracterizadopor compreender pirogalol, teofilina/teobroraina de 0,5 a 5%por peso do pirogalol, catequina/epicatequina de 95 a 105%por peso do pirogalol, kaempferol de 55 a 65% por peso dopirogalol, quercetina de 20 a 30% por peso do pirogalol,miricetina de 10 a 20% por peso do pirogalol, galocatequinaquinona de 20 a 30% por peso do pirogalol, ácido gálico de-50 a 60% por peso do pirogalol, catequina quinona de 15 a-25% por peso do pirogalol, ácido cumárico de 15 a 25% porpeso do pirogalol, ácido vanilico de 1 a 10% por peso dopirogalol, e 3-metóxi-l-tirosina de 0,5 a 5% por peso dopirogalol.

55. Extrato de espécies de chá verde, caracterizadopor compreender pirogalol, teanina por peso do pirogalol,catequina/epicatequina a 90 a 100% por peso do pirogalol,kaempferol de 65 a 75% por peso do pirogalol, quercetina de-15 a 25% por peso do pirogalol, miricetina de 5 a 15% porpeso do pirogalol, galocatequina quinona de 5 a 15% porpeso do pirogalol, ácido gálico de 65 a 75% por peso dopirogalol, catequina quinona de 5 a 15% por peso dopirogalol, ácido cumárico de 10 a 20% por peso dopirogalol, ácido vanilico de 1 a 10% por peso do pirogalol,e 3-metóxi-l-tirosina de 1 a 10% por peso do pirogalol.