BRPI0708868A2 - composiÇÕes e mÉtodos para imunizaÇço com o uso de ligantes de cd1d - Google Patents

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Abstract

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA IMUNIZAÇçO COM O USO DE LIGANTES DE CD1D. A invenção está relacionada a composições imunogênicas contendo ligantes de CD1d que induzem memória imunológica de longo prazo na ausência de doses de reforço e/ou na ausência de várias doses de sensibilização. A invenção ainda está relacionada às composições imunogênicas contendo ligantes de CD1d e antigenos de vírus influenza, estreptococos do grupo B e meningococo do sorogrupo B.

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA IMUNIZAÇÃO COM O USO DE LIGANTESDE CDlD
Todos os documentos aqui citados são incorporados porreferência em sua totalidade.
CAMPO TÉCNICO
Esta invenção está no campo das composições de vacinae métodos de imunização com o uso de composições de vacina.
FUNDAMENTOS DA TÉCNICA
A primeira administração de uma composição de vacinaque compreende um antigeno de um patógeno induz a respostaprimária contra o antigeno na forma de células ativadas ecélulas de memória. A exposição subseqüente ao antigeno(por exemplo, exposição ao patógeno) induz expansão decélulas de memória e uma resposta secundária que é maisrápida e maior do que a resposta primária, fornecendoproteção contra o patógeno.
Embora as células de memória possam persistir pormeses ou até mesmo anos após a exposição primária aoantigeno, geralmente é necessário fornecer uma dose dereforço do antigeno para assegurar a manutenção de memóriaimunológica de longo prazo. Dessa forma, os regimes devacinação freqüentemente incluem várias injeções desensibilização para gerar um banco inicial de células dememória e subseqüentes injeções de reforço em intervaloscrescentes para manter a memória imunológica. A necessidadede várias injeções de sensibilização e a freqüência com aqual uma injeção de reforço é necessária variam, dependendoda vacina e da idade do receptor.
Seria vantajoso ser capaz de reduzir o número de dosesde sensibilização e a freqüência e o número de doses dereforço, sem comprometer a manutenção da memóriaimunológica. Idealmente, seria preferível remover anecessidade de doses de sensibilização e doses de reforçoadicionais completamente e administrar as vacinas como umadose única. É, portanto, um objetivo da invenção fornecercomposições imunogênicas que induzem memória imunológica delongo prazo na ausência de doses de reforço e/ou naausência de várias doses de sensibilização.
É um objetivo adicional da invenção o fornecimento decomposições imunogênicas que compreendem antígenos do vírusinfluenza, estreptococos do grupo B e meningococo dosorogrupo B.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Vacinas freqüentemente incluem adjuvantes parareforçar a atividade imunológica. Exemplos de adjuvantesconhecidos incluem sais de alumínio, emulsões óleo-em-água,saponinas, citocinas, lipídeos e oligonucleotídeos CpG.Atualmente, somente os sais de alumínio, monofosforillipídeo A 3-des-O-acilado ("3dMPL") e MF59 são aprovadospara uso humano.
Outra molécula conhecida por ter propriedadesadjuvantes é a-galactosilceramida (α-GalCer ou α-GC), umglicolipídeo, mais especificamente uma glicosilceramida,isolada originalmente de esponjas marinhas [1]. α-GalCer éum ligante da molécula da classe MHC I-Iike, CDld, e éapresentada por moléculas de CDld às células T NaturalKiller (NKT) invariantes. α-GalCer foi investigadaoriginalmente por sua habilidade para induzir uma respostade células NKT contra células tumorais [2]. Demonstrou-setambém que as células NKT invariantes induzem ativação decélula Β, aumento da proliferação de células B e produçãode anticorpos [3,4] . Demonstrou-se que α-GalCer atua comoum adjuvante para diversos antígenos protéicos co-administrados [5] . Constatou-se que a co-administração deα-GalCer com esporozoítos irradiados ou vírusrecombinantes que expressam um antígeno de malária aumentaO nível de imunidade protetora antimalárica em camundongos[6] . α-GalCer também demonstrou atuar como um adjuvantepara uma vacina de DNA que codifica genes gag e env de HIV-1 [7] e induz uma resposta imunológica humoral e celular aovírus influenza, HÁ, quando administrada por via intranasal[8] .
Surpreendentemente, verificou-se agora que uso de umligante de CDld como, por exemplo, α-GalCer, como umadjuvante de vacina não apenas aumenta significativamente aresposta de anticorpos aos antígenos na vacina, mas tambéminduz um aumento no pool de memória de células B específicocontra aqueles antígenos. Especificamente, verificou-se quea administração de uma dose única de uma composição quecompreende α-GalCer e um antígeno é suficiente parapromover um aumento no pool de memória de células Bespecífico que aumenta a resposta de anticorpos ao ataquecom o antígeno um ano mais tarde. A habilidade desseligante de CDld para promover um aumento no pool de memóriade células B específico indica que o uso de ligantes deCDld como adjuvantes de vacina pode reduzir o número e afreqüência de doses de sensibilização e de reforçonecessárias para se obter memória imunológica de longoprazo.
Verificou-se também que ligantes de CDld sãoadjuvantes surpreendentemente eficazes para antígenosderivados de estreptococos do grupo B, meningococosorogrupo B e para certos antígenos do vírus influenza.
Métodos de indução de memória imunológica de longo prazo
A invenção fornece um método de indução de memóriaimunológica de longo prazo a um antígeno em um paciente quedela necessita, que compreende a administração ao referidopaciente de uma composição que compreende:
a) o referido antígeno; e
b) um ligante de CD1d,
de tal forma que o número e/ou a freqüência de doses dareferida composição necessária para que o referido pacienteseja capaz de desenvolver uma resposta imunológica àexposição subseqüente ao referido antígeno seja reduzido,comparado com a administração do referido antígeno naausência de um ligante de CDld.
De preferência, o método da invenção reduz o númeroe/ou a freqüência de doses da referida composiçãonecessária para que o referido paciente seja capaz dedesenvolver uma resposta imunológica protetora à exposiçãosubseqüente ao referido antígeno, comparada com aadministração do referido antígeno na ausência de umligante de CD1d. O termo "resposta imunológica protetora"significa que a resposta imunológica desenvolvida àexposição subseqüente ao antígeno é suficiente para evitarque o paciente contraia a doença associada ao antígeno. Aredução no número e/ou na freqüência de doses da composiçãonecessária para despertar uma resposta imunológicaprotetora a um antígeno pode ser medida por métodospadronizados conhecidos na técnica.O método da invenção pode reduzir o número de doses deuma composição que compreende um antlgeno necessárias parainduzir uma resposta imunológica protetora contra aexposição subseqüente àquele antígeno. Algumas imunizaçõesatualmente exigem três ou quatro doses de sensibilização deum antígeno para despertar uma resposta imunológicaprotetora à exposição subseqüente a um antígeno. Depreferência, o método da invenção reduz o número de dosesnecessárias para induzir uma resposta imunológica protetoracontra o antígeno a uma dose única de sensibilização.
Os métodos de imunização atuais freqüentemente tambémexigem imunizações de reforço em intervalos crescentes paramanter a resposta imunológica protetora à exposiçãosubseqüente a um antígeno. Por exemplo, imunizações dadasdurante a infância tipicamente envolvem doses de reforçodadas meses ou anos após a administração da dose inicial.De preferência, o método da invenção reduz a freqüência dedoses de reforço de uma composição que compreende umantígeno necessárias para manter uma resposta imunológicaprotetora contra a exposição subseqüente ao antígeno. Depreferência, o método da invenção permite que as doses dereforço sejam administradas em intervalos de mais de umano, preferivelmente mais de dois anos, preferivelmentemais de 5 anos, preferivelmente mais de 10 anos. De acordocom uma modalidade preferida da invenção, a necessidade dedoses de reforço é completamente eliminada, e uma doseúnica do antígeno é suficiente para induzir uma respostaimunológica protetora contra a exposição subseqüente aoantígeno.
De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido ummétodo de indução de uma resposta imunológica contra umantígeno em um paciente que compreende a administração aoreferido paciente:
a) do referido antígeno; e
b) de um ligante de CDld,-em que o referido antígeno e um ligante de CDld tambémseriam administrados ao referido paciente previamente, hámais de um ano.
A invenção também fornece o uso de um antígeno e de umligante de CDld na fabricação de um medicamento parainduzir uma resposta imunológica em um paciente, em que oreferido antígeno e um ligante de CDld também seriamadministrados ao referido paciente previamente, há mais de-1 ano.
De preferência, a resposta imunológica é uma respostaimunológica protetora. De preferência, o referido antígenoe um ligante de CDld seriam administrados ao referidopaciente mais de 18 meses previamente, preferivelmente maisde 2 anos, 5 anos ou 10 anos previamente.
0 antígeno e o ligante de CDld administrados aopaciente de acordo com esse aspecto da invenção podem seradministrados como uma mistura, ou seja, como umacomposição única que compreende tanto o antígeno quanto oligante de CDld. Alternativamente, o antígeno e o ligantede CDld podem ser administrados seqüencialmente ao pacientena mesma localização, com o antígeno ou com o ligante deCDld sendo administrado primeiro. O antígeno e o ligante deCDld também podem ser administrados ao pacienteseparadamente em diferentes localizações, por exemplo, emmembros diferentes. A dose inicial de ligante de CDld eantígeno administrada ao paciente previamente, há mais de 1ano, também pode ser administrada como uma composição únicado ligante de CDld e do antígeno, ou o ligante de CDld e oantígeno podem ser administrados seqüencial ouseparadamente.
A quantidade de ligante de CDld administrada aopaciente para induzir uma resposta imunológica pode variar,dependendo da idade e do peso do paciente ao qual acomposição é administrada, mas tipicamente conterá entre 1-100 pg/kg de peso corporal do paciente. Surpreendentemente,verificou-se que doses baixas do ligante de CDld sãosuficientes para aumentar a resposta imunológica a umantígeno co-administrado e promover memória imunológica delongo prazo àquele antígeno. A quantidade de ligante deCDld incluída nas composições da invenção pode, portanto,ser menos do que 50 pg/kg de peso corporal do paciente,menos de 20 pg/kg, menos de 10 pg/kg, menos de 5 pg/kg,menos de 4 pg/kg ou menos de 3 pg/kg.
De acordo com um aspecto adicional da invenção, éfornecido um método de indução de uma resposta imunológicacontra um antígeno em um paciente que compreende aadministração ao referido paciente:
a) do referido antígeno; e
b) de um ligante de CDld,
em que a quantidade de ligante de CDld incluída nacomposição é de menos de 10 pg/kg de peso corporal dopaciente, preferivelmente menos de 5 pg/kg, menos de 4pg/kg ou menos de 3 pg/kg.
A invenção também fornece o uso de um antígeno e de umligante de CDld na fabricação de um medicamento parainduzir uma resposta imunológica em um paciente, em que aquantidade de ligante de CDld é de menos de 10 pg/kg depeso corporal do paciente, preferivelmente menos de 5pg/kg, menos de 4 pg/kg ou menos de 3 pg/kg.
O antigeno e o ligante de CDld administrados aopaciente de acordo com esse aspecto da invenção podem seradministrados como uma mistura; administrados
seqüencialmente ao paciente na mesma localização (com oantigeno ou o ligante de CDld sendo administrado primeiro);ou administrados ao paciente separadamente em diferenteslocalizações, por exemplo, em membros diferentes.Ligantes de CDld
0 ligante de CDld incluído nas composições da invençãopode ser qualquer molécula que se ligue a uma molécula deCDld. Moléculas de CDld estão localizadas nas células NKTinvariantes (iNKT), células B, células dendríticas, célulasmononucleares e células T convencionais, e os ligantes deCDld da invenção podem se ligar às moléculas de CDldlocalizadas em qualquer uma dessas células. A ligação deligantes de CDld da invenção às moléculas de CDld podeativar células iNKT, células B, células dendríticas,células mononucleares e/ou células T convencionais. Depreferência, a ligação de ligantes de CDld às moléculas deCDld ativa células iNKT. A habilidade de uma molécula parase ligar a uma molécula de CDld pode ser determinada pormétodos padronizados conhecidos na técnica. A habilidade deum ligante de CDld para ativar células, em particularcélulas NKT invariantes, pode ser determinada medindo-se osníveis de citocinas liberados de células na presença de umligante de CDld, comparados com os níveis de citocinasliberados na ausência do ligante de CD1d. De preferência,os ligantes de CD1d incluídos nas composições da invençãoaumentam o nível de secreção de citocina por células NKTinvariantes, comparado como o nível de secreção de citocinapor células NKT invariantes na ausência do ligante de CD1d.
Os ligantes de CD1d da invenção podem promover a liberaçãodas citocinas Thl ou citocinas Th2. De preferência, osligantes de CDld da invenção aumentam os níveis de IFN-γ,IL-4 e IL-13 secretados por células NKT invariantes,comparados com os níveis de IFN-γ, IL-4 e IL-13 secretadospor células NKT invariantes na ausência do ligante de CDld.
Moléculas-candidatas que podem ser testadas quanto àhabilidade para atuar como ligantes de CDld que ativamcélulas NKT invariantes incluem peptídeos e sacarídeos. Depreferência, os ligantes de CDld da invenção sãoglicolipídeos. Uma revisão de antígenos glicolipídicosconhecidos por atuarem como ligantes de CDld que podem serincluídos nas composições da invenção é fornecida nareferência 9.
Exemplos de ligantes de CDld adequados para uso nascomposições da invenção incluem α-glicosilceramidas. As a-glicosilceramidas usadas nas composições da invenção sãopreferivelmente compostos de fórmula (I):
<formula>formula see original document page 10</formula>em que
A representa O, CH2, -CH2CH=CH, -CH=CHCH2,Q representa (CH2)n, em que η representa um númerointeiro de 0 ou 1,
R1 representa H ou OH,
X representa um número inteiro entre 1 e 30,R2 representa um substituinte selecionado do grupo queconsiste nos seguintes (a) a (e) (em que Y representa umnúmero inteiro entre 5 e 17) ;
(a) -CH2(CH2)yCH3
(b) -CH(OH) (CH2)yCH3
(C) -CH(OH)(CH2)yCH(CH3)2
(d) -CH=CH(CH2)yCH3
(e) -CH(OH) (CH2)yCH(CH3)CH2CH3,
R3 representa Η, 0H, NH2, NHCOCH3 ou um monossacarídeo,R4 representa OH ou um monossacarídeo,R5 representa H, OH ou um monossacarídeo,R6 representa H, OH ou um monossacarídeo, eR7 representa H, CH3, CH2OH ou -CH2-monossacarídeo.X está pref erivelmente entre 7 e 27, maispreferivelmente entre 9 e 24 e, mais preferivelmente, entre13 e 20. Y está pref erivelmente entre 7 e 15 e, maispreferivelmente, entre 9 e 13.
0 termo "monossacarídeo" significa uma molécula deaçúcar que possui uma cadeia de 3-10 átomos de carbono naforma de um aldeído (aldose) ou cetona (cetose).Monossacarídeos adequados para uso na invenção incluemtanto monossacarídeos de ocorrência natural quantosintéticos. Exemplos de monossacarídeos incluem trioses,por exemplo, glicerose e diidroxiacetona; textroses, porexemplo, eritanose e eritrulose; pentoses, por exemplo,xilose, arabinose, ribose, xilulose ribulose; metilpentoses (6-desoxihexoses), por exemplo, ramnose e frutose;hexoses, por exemplo, glicose, manose, galactose, frutose esorbose; heptoses, por exemplo, glicoheptose,galamanoheptose, sedoheptulose e manoheptulose.Monossacarídeos preferidos são hexoses.
Os grupos de monossacarídeos podem ser anexados àestrutura na posição R3, R4, R5, R6 ou R7, para formar umaligação glicosil. Tipicamente, o monossacarídeo é anexado àposição R3, R4, R5, R6 ou R7 por meio do oxigênio anexado aocarbono C-I do monossacarídeo, formando uma ligaçãoglicosídica.
Quando R3 for um monossacarídeo, ele preferivelmenteserá selecionado de α-D-galactopiranose, β-D-galactopiranose, α-D-glicopiranose ou β-D-glicopiranose.
Quando R4 for um monossacarídeo, ele preferivelmenteserá selecionado de β-D-galactofuranose ou N-acetil a-D-galactopiranose.
Quando R5 for um monossacarídeo, ele preferivelmenteserá selecionado de a-D-galactopiranose, β-D-galactopiranose, α-D-glicopiranose ou β-D-glicopiranose.
Quando R6 for um monossacarídeo, ele preferivelmenteserá selecionado de a-D-galactopiranose, β-D-galactopiranose, α-D-glicopiranose ou β-D-glicopiranose.
Quando R7 for um monossacarídeo, ele preferivelmenteserá selecionado de metil α-D-galactopiranosídeo, metil β-D-galactopiranosídeo, metil α-D-glicopiranosídeo ou metilβ-D-glicopiranosídeo.
De preferência, R5 e R6 são diferentes. Depreferência, um de R5 e R6 é Η.
Exemplos adicionais de α-glicosilceramidas adequadaspara inclusão nas composições da invenção são fornecidos nareferência 2.
De preferência, a α-glicosilceramida é a-galactosilceramida (α-GalCer), que possui a fórmulaapresentada abaixo, ou um análogo desta:
α-GalCer e análogos desta incluídas nas composições dainvenção podem ser isolados diretamente de esponjasmarinhas ou podem ser produtos sintetizados quimicamente.
Exemplos de análogos de α-GalCer adequados para usonas composições da invenção, e métodos de síntese dessesprodutos, são fornecidos nas referências 10 e 11. Umanálogo de α-GalCer preferido é KRN7000, que possui afórmula (2S,3S,4R)-1-0-(α-D-galactopiranosil)-2-(N-
hexacosanoilamino)-1,3,4-octadecanetriol. A síntese deKRN7 000 é descrita na referência 12.
Análogos de α-GalCer preferidos adicionais sãoanálogos ligados ao C de α-GalCer como, por exemplo,aqueles descritos nas referências 13, 14 e 15. Um análogoligado ao C preferido de α-GalCer é CRONY-101, cuja sínteseé descrita na referência 13.
Análogos truncados de α-GalCer nos quais a cadeiagraxa acil e/ou a cadeia esfingosina está truncada,comparada com α-GalCer, também podem ser usados nainvenção. Exemplos de análogos truncados de α-GalCer sãofornecidos na referência 16. Um análogo truncado preferidode α-GalCer é "OCH", no qual a cadeia graxa acil tem umtruncamento de dois hidrocarbonetos, e a cadeia esfingosinatem um truncamento de nove hidrocarbonetos, comparado com aα-GalCer preferida (ou seja, R1 = Hf X= 21, R2 =CH(OH) (CH2)4CH3, R3 = OH, R4 = OH, R5 = OH, R6 = H e R7 =CH2OH) .
Análogos truncados de α-GalCer preferidos adicionaisincluem análogos nos quais a cadeia graxa acil possui umtruncamento de dois hidrocarbonetos, e a cadeia esfingosinapossui um truncamento de sete ou três hidrocarbonetos,comparados com α-GalCer (ou seja, R1 = H, X = 21, R3 = OH,R4 = OH, R5 = OH, R6 =H, R7 = CH2OH e R2 é CH(OH) (CH2)6CH3 ouCH(OH) (CH2) I0CH3) .
α-GalCer, KRN7000 e OCH são, todos, a-glicosilceramidas que contêm fitoesfingosina. No entanto, ainvenção também inclui o uso de análogos de KRN700, OCH eoutras α-glicosilceramidas descritos acima que contêmesfinganina. A síntese de análogos de KRN7000 e OCH quecontêm esfinganina é descrita na referência 17.
Os ligantes de CDld usados nas composições da invençãotambém podem incluir análogos de sulfatida, tais comoaqueles descritos na referência 18. Um análogo de α-GalCerpreferido é 3"-O-sulfo-galactosilceramida.
Embora α-GalCer tenha sido isolada originalmente deesponjas marinhas, foram isolados recentemente ligantes deCDld de estrutura similar à α-GalCer de bactérias gram-negativas. Dessa forma, ligantes de CDld adicionais quepodem ser incluídos nas composições da invenção sãoglicolipídeos de origem bacteriana e, em particular,glicosilceramidas bacterianas isoladas da membrana externade Sphingomonas e Ehrlichia. Exemplos dessasglicosilceramidas incluem α-glicuronosilceramida e a-galacturonsilceramida de Sphingomonas, cuja produção édescrita na referência 19. A produção de ligantes de CDldadicionais de Sphingomonas e de Borrelia é descrita nareferência 18.
A invenção também inclui o uso de ligantes de CDld quenão pertencem à família dos glicoesfingolipídeos. Emparticular, a invenção inclui o uso de ligantes de CDld quesão lipídeos de glicoglicerol. Lipídeos de glicoglicerolque podem ser usados na invenção incluem diacilgliceróis,em particular monogalactosil diacilgliceróis.
Monogalactosil diacilgliceróis adequados para uso nainvenção são descritos na referência 20.Componentes antigênicos da composição
0 antígeno incluído na composição para a indução dememória imunológica de longo prazo descrita acima pode serqualquer antígeno conhecido para uso na indução de umaresposta imunológica. 0 antígeno pode compreender umantígeno protéico ou um antígeno sacarídico.Antígenos sacarídicos
Quando o antígeno for um antígeno sacarídico, elepreferivelmente será conjugado a uma proteínatransportadora. De preferência, o antígeno sacarídico é umsacarídeo bacteriano e, em particular, um sacarídeocapsular bacteriano.
Exemplos de sacarídeos capsulares bacterianos quepodem ser incluídos nas composições da invenção incluemsacarídeos capsulares de Neisseria meningitidis (sorogruposA, B, C, W135 ou Υ), Streptococcus pneumoniae (sorotipos 4,6B, 9V, 14, 18C, 19F ou 23F) , Streptococcus agalactiae(tipos Ia, Ibi II, III, IV, V, VI, VII ou VIII),Haemophilus influenzae (cepas tipáveis: a, b, c, d, e ouf), Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus etc.Outros sacarídeos que podem ser incluídos nas composiçõesda invenção incluem glucanos (por exemplo, glucanosfúngicos, tais como aqueles em Candida albicans, esacarídeos capsulares fúngicos, por exemplo, da cápsula deCryptocoeeus neoformans).
A cápsula do sorogrupo A de N. meningitidis (MenA) éum homopolímero de N-acetil-D-manosamina-l-fosfato ligadoem (al->6) , com O-acetilação parcial nas posições C3 e C4.A cápsula do sorogrupo B de N. meningitidis (MenB) é umhomopolímero de ácido siálico ligado em (α2->8) . Osacarídeo capsular do sorogrupo C de N. meningitidis (MenC)é um homopolímero de ácido siálico ligado em (α2->9) , comO-acetilação variável nas posições 7 e/ou 8. O sacarídeo dosorogrupo W135 de N. meningitidis é um polímero queconsiste em unidades de dissacarídeo de ácido siálico-galactose [->4) -D-Neup5Ac (7/90Ac) -a- (2->6) D-Gal-a- (l->] . Elepossui O-acetilação variável nas posições 7 e 9 do ácidosiálico [21]. O sacarídeo do sorogrupo Y de N. meningitidisé similar ao sacarídeo do sorogrupo W135, exceto que aunidade de dissacarídeo de repetição inclui glicose, em vezde galactose, [->4) -D-Neup5Ac (7/90Ac) -a- (2^6) -D-Glc-a-(!_>]. Ele também possui O-acetilação variável nas posições7 e 9 do ácido siálico.O sacarídeo capsular Η. influenzae do tipo b (Hib) éum polímero de ribose, ribitol e fosfato ["PRP", (poli-3-β-D-ribose-(1,1)-D-ribitol-5-fosfato)].
As composições da invenção podem conter misturas deconjugados de antígenos sacarídicos. De preferência, ascomposições da invenção compreendem antígenos sacarídicosde mais de um sorogrupo de N. meningitidis, por exemplo, ascomposições podem compreender conjugados sacarídicos dossorogrupos A+C, A+W135, A+Y, C+W135, C+Y, W135+Y, A+C+W135,A+C+Y, C+W135+Y, A+C+W135+Y etc. Composições preferidascompreendem conjugados sacarídicos dos sorogrupos CeY.Outras composições preferidas compreendem conjugadossacarídicos dos sorogrupos C, W135 e Y.
Quando uma mistura compreender sacarídeosmeningocócicos do sorogrupo A e pelo menos um sacarídeo deoutro sorogrupo, a proporção (p/p) de sacarídeo de MenApara o sacarídeo de qualquer outro sorogrupo poderá sermaior do que 1 (por exemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 oumaior). Proporções preferidas (p/p) para sacarídeos dossorogrupos A:C:W135:Y são: 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1;4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1;4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; e 2:2:2:1.
Composições preferidas da invenção adicionaiscompreendem um conjugado sacarídico de Hib e um conjugadosacarídico de pelo menos um sorogrupo de N. meningitidis,preferivelmente de mais de um sorogrupo de N. meningitidis.Por exemplo, uma composição da invenção pode compreender umconjugado de Hib e conjugados de sorogrupos A, C, Wl35 e Yde N. meningitidis.
A invenção ainda inclui composições que compreendemconjugados sacarídicos de Streptococcus pneumoniae. Depreferência, as composições compreendem conjugadossacarídicos de mais de um sorotipo de Streptococcuspneumoniae. Composições preferidas compreendem conjugadossacarídicos dos sorotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F (7-valente) de Streptoeoeeus pneumoniae. As composições podemainda compreender conjugados sacarídicos dos sorotipos 4,6B, 9V, 14, 18C, 19F 23F, 1 e 5 (9-valente) deStreptoeoeeus pneumoniae ou podem compreender conjugadossacarídicos dos sorotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1,5, 3 e 7F (11-valente) de Streptoeoeeus pneumoniae.
Composições preferidas da invenção adicionaiscompreendem conjugados sacarídicos pneumocócicos econjugados sacarídicos de Hib e/ou N. meningitidis. Depreferência, as composições da invenção podem compreenderconjugados sacarídicos dos sorotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C,19F e 23F de S. pneumoniae e um conjugado sacarídico deHib. De preferência, as composições da invenção podemcompreender conjugados sacarídicos dos sorotipos 4, 6B, 9V,14, 18C, 19F e 23F de S. pneumoniae e conjugadossacarídicos dos sorogrupos A, C, W13 5 e Y de N.meningitidis. Composições de acordo com a invenção tambémpodem compreender conjugados sacarídicos dos sorotipos 4,6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F de S. pneumoniae, um conjugadosacarídico de Hib e conjugados sacarídicos dos sorogruposA, C, W13 5 e Y de N. meningitidis.
Prefere-se que a eficácia protetora de conjugadosindividuais de antígenos sacarídicos não seja removida porsua combinação, embora a imunogenicidade real (por exemplo,titulações de ELISA) possa ser reduzida.Preparação de antígenos sacarídicos capsulares
Métodos para a preparação de antígenos sacarídicoscapsulares são bem conhecidos. Por exemplo, a referência 22descreve a preparação de antígenos sacarídicos de N.meningitidis. A preparação de antígenos sacarídicos de H.influenzae é descrita no capítulo 14 da referência 86. Apreparação de antígenos sacarídicos e de conjugados de S.pneumoniae é descrita na técnica. Por exemplo, Prevenar euma vacina 7-valente de conjugado pneumocócico. Processospara a preparação de antígenos sacarídicos de S. agalactiaesão descritos em detalhe nas referências 23 e 24.
Os antígenos sacarídicos podem ser modificadosquimicamente. Por exemplo, eles podem ser modificados parasubstituir um ou mais grupos hidroxil com grupos debloqueio. Isso é particularmente útil para sorogrupomeningocócico A, em que os grupos acetil podem sersubstituídos com grupos de bloqueio para evitar hidrólise[25]. Esses sacarídeos modificados ainda são sacarídeos dosorogrupo A dentro do significado da presente invenção.
Sacarídeos capsulares podem ser usados na forma deoligossacarídeos. Esses são formados convenientemente porfragmentação de polissacarídeo capsular purificado (porexemplo, por hidrólise), que normalmente será seguida porpurificação dos fragmentos do tamanho desejado.
A fragmentação de polissacarídeos é feitapreferivelmente para gerar um grau médio de polimerização(DP) final no oligossacarídeo de menos de 30. 0 DP pode serconvenientemente medido por cromatografia por troca iônicaou por ensaios colorimétricos [26].
Caso seja realizada a hidrólise, o hidrolisado serágeralmente dimensionado a fim de remover oligossacarídeosde comprimento curto [27] . Isso pode ser obtido de váriasformas, por exemplo, por ultrafiltração seguida porcromatografia por troca iônica. Oligossacarídeos com umgrau de polimerização de menos ou igual a cerca de 6 sãopreferivelmente removidos para o sorogrupo A, e aqueles commenos de aproximadamente 4 são preferivelmente removidospara os sorogrupos W13 5 e Y.
Veículos
De preferência, o veículo é uma proteína. Proteínastransportadoras preferidas às quais os antígenossacarídicos estão conjugados nas composições da invençãosão toxinas bacterianas, por exemplo, toxóide diftérico outoxóide tetânico. Proteínas transportadoras adequadasincluem o mutante CRM197 da toxina diftérica [28-30],toxóide diftérico, a proteína da membrana externa de N.meningitidis [31], peptídeos sintéticos [32, 33], proteínasde choque térmico [34, 35], proteínas de pertussis [36,37], citocinas [38], linfocinas [38], hormônios [38],fatores do crescimento [38] , proteínas artificiais quecompreendem múltiplos epitopos de célula T CD4 + humana devários antígenos derivados de patógenos [3 9] como, porexemplo, a proteína N19 [40], a proteína D de H. influenzae[41, 42] , a proteína pneumocócica de superfície PspA [43] ,pneumolisina [44] , proteínas de captação de ferro [45] ,toxina A ou B de C. difficile [46] , albumina sérica humana(preferivelmente recombinante) etc.
A adesão do antígeno sacarídico ao veículo ocorrepref erivelmente por meio de um grupo -NH2, por exemplo, nacadeia lateral de um resíduo de lisina em uma proteínatransportadora, ou de um resíduo de arginina. Quando umsacarídeo tiver um grupo aldeído livre, esse poderá reagircom uma amina no veiculo para formar um conjugado poraminação redutiva. A adesão também pode ocorrer por meio deum grupo -SH, por exemplo, na cadeia lateral de um resíduode cisteína.
Quando a composição contiver mais de um antígenosacarídico, será possível usar mais de um veículo, porexemplo, para reduzir o risco de supressão do veículo.Dessa forma, podem ser usados diferentes veículos paradiferentes antígenos sacarídicos. Por exemplo, sacarídeosdo sorogrupo A de Neisseria meningitidis podem serconjugados a CRM197, enquanto sacarídeos do tipo C podemser conjugados ao toxóide tetânico. Também é possível usarmais de um veículo para um antígeno sacarídico emparticular. Os sacarídeos podem estar em dois grupos, comalguns conjugados ao CRMl97 e outros conjugados ao toxóidetetânico. Em geral, no entanto, prefere-se usar o mesmoveículo para todos os sacarídeos.
Uma única proteína transportadora pode carregar maisde um antígeno sacarídico [47, 48]. Por exemplo, uma únicaproteína transportadora pode ter a ela conjugada sacarídeosde diferentes patógenos ou de diferentes sorogrupos domesmo patógeno. Para se atingir esse objetivo, diferentessacarídeos podem ser misturados, antes da reação deconjugação. Em geral, no entanto, prefere-se ter conjugadosseparados para cada sorogrupo, com os diferentes sacarídeossendo misturados após a conjugação. Os conjugados separadospodem ser baseados no mesmo veículo.
Os conjugados com uma proporção de sacarídeo:proteína(p/p) entre 1:5 (ou seja, proteína em excesso) e 5:1 (ouseja, sacarídeo em excesso) são preferidos. Proporçõesentre 1:2 e 5:1 são preferidas, bem como proporções entre1:1,25 e 1:2,5.
Os conjugados podem ser usados em conjunto com veículolivre [4 9] . Quando certa proteína transportadora estiverpresente tanto na forma livre quanto na conjugada em umacomposição da invenção, a forma não conjugada serápreferivelmente no máximo 5% da quantidade total daproteína transportadora na composição como um todo e, maispreferivelmente, estará presente em menos de 2% por peso.
Qualquer reação de conjugação adequada pode ser usada,com qualquer vinculador adequado, quando necessário.
0 sacarídeo tipicamente será ativado oufuncionalizado, antes da conjugação. A ativação podeenvolver, por exemplo, reagentes de cianilação, porexemplo, CDAP (por exemplo, l-ciano-4-dimetilaminopiridínio tetrafluorborato [50, 51 etc.]). Outras técnicasadequadas utilizam carbodiimidas, hidrazidas, ésteresativos, norborano, ácido p-nitrobenzóico, N-hidroxissuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU (veja também aintrodução à referência 52).
Podem ser feitas ligações por meio de um grupovinculador usando qualquer procedimento conhecido, porexemplo, os procedimentos descritos nas referências 53 e54. Um tipo de ligação envolve a aminação redutiva dopolissacarídeo, acoplamento do grupo amino resultante comuma extremidade de um grupo vinculador ácido, e depois oacoplamento de uma proteína à outra extremidade do grupovinculador ácido [55, 56] . Outros vinculadores incluem B-propionamido [57] , nitrofenil-etilamina [58] , haletos dehaloacila [59] , ligações glicosídicas [60] , ácido 6-aminocapróico [61], ADH [62], porções C4 a C12 [63] etc.Como alternativa ao uso de um vinculador, pode ser usada aligação direta. Ligações diretas à proteína podemcompreender a oxidação do polissacarídeo, seguida poraminação redutiva com a proteína, como descrito, porexemplo, nas referências 64 e 65.
Um processo que envolve a introdução de grupos aminono sacarídeo (por exemplo, por substituição de grupos =0terminais com -NH2) , seguida por derivatização com umdiéster adípico (por exemplo, diéster adípico de ácido N-hidroxissuccinimido) e a reação com proteínatransportadora, é preferido.
Após a conjugação, podem ser separados sacarídeoslivres e conjugados. Há muitos métodos adequados, incluindocromatograf ia hidrofóbica, ultrafiltração tangencial,diafiltração etc. [veja também as referências 66 e 67etc.] .
Quando a composição da invenção incluir um sacarídeodespolimerizado, prefere-se que a despolimerização precedaa conjugação.
A preparação de antígenos adequados de conjugadosacarídico adequados à inclusão nas composições da invençãoé descrita na referência 68.Antígenos protéicos
Quando o antígeno incluído nas composições da invençãofor um antígeno protéico, ele poderá ser selecionado de:
um antígeno protéico do sorogrupo B de N.meningitidis, tais como aqueles nas referências 69 a 75.Com o uso da nomenclatura-padrão da referência 73, NMB2132,NMB1870 e NMB0992 são três proteínas preferidas que podemser usadas como base de um antígeno adequado.
- um antígeno protéico de S. pneumoniae (por exemplo,de PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25,SplOl, Spl28, Spl3 0 e Spl33, como revelado na referência 76) .
- um antígeno do vírus da hepatite A, por exemplo,vírus inativado [por exemplo, 77, 78; capítulo 15 dareferência 86].
- um antígeno do vírus da hepatite B, por exemplo, osantígenos da superfície e/ou centrais [por exemplo, 78, 79;capítulo 16 da referência 86].
- um antígeno do vírus da hepatite C [por exemplo,80] . Antígenos do vírus da hepatite C que podem ser usadospodem incluir um ou mais dos seguintes: proteínas El e ouE2 do HCV, complexos de heterodímero E1/E2, proteínascentrais e proteínas não estruturais ou fragmentos dessesantígenos, em que as proteínas não estruturais podemopcionalmente ser modificadas para remover a atividadeenzimática, mas reter a imunogenicidade (por exemplo,referências 81, 82 e 83).
- um antígeno de Bordetella pertussis, por exemplo,holotoxina de pertussis (PT) e hemaglutinina filamentosa(FHA) de B. pertussis, opcionalmente também em combinaçãocom pertactina e/ou aglutinógenos 2 e 3 [por exemplo,referências 84 e 85; capítulo 21 da referência 86].
um antígeno diftérico, por exemplo, um toxóidediftérico [por exemplo, capítulo 13 da referência 86].
um antígeno tetânico, por exemplo, um toxóidetetânico [por exemplo, capítulo 27 da referência 86].
- um antígeno de N. gonorrhoeae [por exemplo, 69, 70,71] .
- um antígeno de Chlamydia pneumoniae [por exemplo,87, 88, 89, 90, 91, 92, 93] .
- um antígeno de Chlamydia trachomatis [por exemplo,94] .
um antígeno de Porphyromonas gingivalis [porexemplo, 95].
- antígeno(s) da pólio [por exemplo, 96, 97; capítulo24 da referência 86], por exemplo, WV.
- antígeno(s) da raiva [por exemplo, 98], por exemplo,vírus inativado liofilizado [por exemplo99, RabAvert™] .antígenos do sarampo, caxumba e/ou rubéola [porexemplo, capítulos 19, 20 e 26 da referência 86].
- antígenos de Helicobacter pylori, por exemplo, CagA[100 a 103], VacA [104, 105], NAP [106, 107, 108], HopX[por exemplo, 109], HopY [por exemplo, 109] e/ou urease.
- antígeno(s) de influenza [por exemplo, capítulos 17e 18 da referência 86] , por exemplo, as proteínas desuperfície hemaglutinina e/ou neuraminidase.
- um antígeno de Moraxella catarrhalis [por exemplo,110] .
- um antígeno protéico de Streptococcus agalactiae(estreptococo do grupo B) [por exemplo, 111, 112] .
- um antígeno de Streptococcus pyogenes (estreptococodo grupo A) [por exemplo, 112, 113, 114].
- um antígeno de Staphyloeoeeus aureus [por exemplo,115] .
- antígeno(s) de um paramixovírus, por exemplo, vírussincicial respiratório (RSV [116, 117]) e/ou vírusparainfluenza (PIV3 [118]).
- um antígeno de Bacillus anthracis [por exemplo, 119,120, 121].
um antígeno de um vírus na família flaviviridae(gênero flavivírus), por exemplo, do vírus da febreamarela, vírus da encefalite japonesa, quatro sorotipos dovírus da Dengue, vírus da encefalite adquirida porcarrapato, vírus do oeste no Nilo.
- um antígeno de pestivírus, por exemplo, do vírus dafebre suína clássica, vírus da diarréia viral bovina e/ou ovírus da doença da fronteira.
um antígeno de parvovírus, por exemplo, doparvovírus Bl9.
- Um antígeno do vírus do herpes simples (HSV). Umantígeno do HSV preferido para uso com a invenção é aglicoproteína da membrana gD. Prefere-se utilizar gD de umacepa HSV-2 (antígeno "gD2"). A composição pode usar umaforma de gD na qual a região de ancoragem da membrana doterminal C foi eliminada [122], por exemplo, uma gDtruncada que compreende os aminoácidos 1-306 da proteínanatural com a adição de aparagina e glutamina no terminalC. Essa forma da proteína inclui o peptídeo sinalizador queé clivado para gerar uma proteína madura de 283aminoácidos. A eliminação da âncora permite que a proteínaseja preparada em forma solúvel.
- um antígeno do papilomavírus humano (HPV). Antígenosdo HPV preferidos para uso com a invenção são as proteínasdo capsídeo LI, que podem se juntar para formaremestruturas conhecidas como partículas virus-Iike (VLPs). AsVLPs podem ser produzidas por expressão recombinante de Llem células de levedura (por exemplo, em S. cerevisiae) ouem células de inseto (por exemplo, em células deSpodoptera, por exemplo, S. frugiperda, ou em células deDrosophila). Para células de levedura, vetores de plasmídeopodem carregar o(s) gene(s) LI; para células de inseto,vetores de baculovírus podem carregar o(s) gene(s) LI. Maispreferivelmente, a composição inclui VLPs de Ll das cepasHPV-16 e HPV-18. Constatou-se que essa combinação bivalenteé altamente eficaz [123]. Além das cepas HPV-16 e HPV-18,também é possível incluir VLPs de Ll das cepas HPV-6 e HPV-11. 0 uso de cepas de HPV oncogênicas também é possível.Uma vacina pode incluir entre 20-60 μg/ml (por exemplo,cerca de 4 0 pg/ml) de Ll por cepa de HPV.
A composição pode compreender um ou mais dessesantígenos, que podem ser detoxifiçados, quando necessário(por exemplo, detoxificação da toxina de pertussis pormeios químicos e/ou genéticos).
Quando um antígeno diftérico for incluído na mistura,será preferido também incluir antígeno tetânico e antígenosde pertussis. Similarmente, quando um antígeno tetânico forincluído, será preferido também incluir antígenos dedifteria e de pertussis. Similarmente, quando um antígenode pertussis for incluído, será preferido também incluirantígenos de difteria e de tétano.
Os antígenos na mistura estarão tipicamente presentesem uma concentração de pelo menos 1 pg/ml cada. Em geral, aconcentração de qualquer antígeno em particular serásuficiente para despertar uma resposta imunológica contraaquele antígeno.Como alternativa ao uso de antígenos protéicos namistura, pode ser utilizado o ácido nucléico que codifica oantígeno. Os componentes protéicos da mistura podem, dessaforma, ser substituídos por ácido nucléico (preferivelmenteDNA, por exemplo, na forma de um plasmídeo) que codifica aproteína. Similarmente, as composições da invenção podemcompreender proteínas que mimetizam antígenos, por exemplo,mimotopos [124] ou anticorpos anti-idiotipo.
Alternativamente ou em adição aos antígenos listadosacima, a composição pode compreender uma preparação devesícula da membrana externa (OMV) do sorogrupo B de N.meningitidis, tais como aquelas reveladas nas referências125, 126, 127, 128 etc.Composições adicionais
Um objetivo adicional da invenção é o fornecimento decomposições de vacina que fornecem proteção contraestreptococos do grupo B, sorogrupo B de N. meningitidise/ou vírus influenza. Verificou-se que ligantes de CDld sãoadjuvantes surpreendentemente eficazes para antígenosdesses patógenos.
As composições descritas abaixo incluem pelo menos umantígeno de estreptococo do grupo B, sorogrupo B de N.meningitidis ou vírus influenza. Essas composições podemcompreender antígenos adicionais. Por exemplo, essascomposições também podem incluir um ou mais antígenossacarídicos conjugados a um ou mais veículos, tais comoaqueles descritos acima para inclusão em composições parauso na indução de memória imunológica de longo prazo.Alternativamente, ou em adição, essas composições podemcompreender um ou mais dos antígenos protéicos descritosacima.
Estreptococo do grupo B
Portanto, a invenção fornece uma composição quecompreende: a) um ligante de CDld; e b) um antigeno deestreptococos do grupo B.
Exemplos de antígenos de estreptococos do grupo B(Streptococcus agalactiae) para inclusão na composição sãoencontrados nas referências 111 e 112. Dessa forma, acomposição pode incluir uma proteína que compreende um oumais de: (i) as seqüências de aminoácidos de S. agalactiaena referência 112 (IDS. DE SEQ. de números pares Nos: 2 a10.960 da referência 112); (ii) uma seqüência deaminoácidos que possui pelo menos 80% de identidade deseqüência para uma seqüência de aminoácidos de S.agalactiae de (i) ; uma seqüência de aminoácidos quecompreende um epitopo de uma seqüência de aminoácidos de S.agalactiae de (i) . De preferência, a composição compreendeuma ou mais das proteínas GBSl a GBS689, como descrito nareferência 112 (veja Tabela IV nesta referência). Maispreferivelmente, a composição compreende um antigenoprotéico GBS80.Meningococo
A invenção também fornece uma composição quecompreende: a) um ligante de CDld; e b) um antigeno deNeisseria meningitidis.
o antigeno de N. meningitidis incluído na composiçãopode ser um antigeno protéico ou uma preparação de vesículada membrana externa (OMV). Exemplos de preparações de OMVque podem ser incluídas na composição incluem preparaçõesde OMV dos sorogrupos A, B, C, W135 ou Y de N.meningitidis. Exemplos de antígenos protéicos de N.meningitidis que podem ser incluídos na composição tambémsão fornecidos acima. De preferência, o antígeno protéico éderivado do sorogrupo B de N. meningitidis e que, quandoadministrado a um paciente, desperta uma respostaimunológica que reage de forma cruzada com células de N.meningitidis do sorogrupo B. Antígenos protéicos preferidosque despertam uma resposta imunológica que reage de formacruzada com células de N. meningitidis do sorogrupo Bincluem os antígenos protéicos "AG287nz-953", "936-741" e"961c" [129] . De preferência, a composição compreende maisde um antígeno de N. meningitidis. De preferência, acomposição compreende todos os três antígenos protéicos"AG287nz-953", "936-741" e "961c". Outros antígenosprotéicos úteis são baseados em NMB2132, NMB 1870 eNMB 0 992.Vírus influenza
A invenção também fornece uma composição quecompreende: a) um ligante de CDld; e b) um antígeno dovírus influenza.
0 antígeno do vírus influenza tipicamente serápreparado de vírions influenza, mas, alternativamente,antígenos como, por exemplo, hemaglutinina, podem serexpressos em um hospedeiro recombinante (por exemplo, emuma linhagem de célula de inseto com o uso de um vetor debaculovírus) , e usados em forma purificada [130, 131] . Emgeral, no entanto, os antígenos serão de vírions.
O antígeno pode assumir a forma de um vírus vivo ou,mais preferivelmente, um vírus inativado. Quando um vírusinativado for usado, a vacina poderá compreender vírioninteiro, virion dividido ou antígenos de superfíciepurificados (incluindo hemaglutinina e, normalmente, tambémincluindo neuraminidase). Antígenos de influenza tambémpodem ser apresentados na forma de virossomas [132].
O vírus influenza pode ser atenuado. O vírus influenzapode ser sensível à temperatura. O vírus influenza pode seradaptado ao frio. Essas três possibilidades se aplicam emparticular para vírus vivos.
As cepas do vírus influenza para uso em vacinas mudamde estação para estação. No período interpandêmico atual,as vacinas tipicamente incluem duas cepas de influenza A(H1N1 e H3N2) e uma cepa de influenza B, e vacinastrivalentes são típicas. A invenção também pode usar vírusde cepas pandêmicas (ou seja, cepas às quais o receptor davacina e a população humana geral são imunologicamentevirgens), por exemplo, cepas dos subtipos H2, H5, H7 ou H9(em particular do vírus de influenza A) , e vacinas deinfluenza para cepas pandêmicas podem ser monovalentes oupodem ser baseadas em uma vacina trivalente normalsuplementada por uma cepa pandêmica. Dependendo da estaçãoe da natureza do antígeno incluído na vacina, no entanto, ainvenção pode proteger contra um ou mais dos subtipos de HAHl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, HlO, Hll, H12, H13,
H14, H15 ou H16.
Outras cepas que podem ser incluídas com utilidade nascomposições são cepas que são resistentes à terapiaantiviral (por exemplo, resistentes a oseltamivir [133]e/ou zanamivir), incluindo cepas pandêmicas resistentes[134] .
As composições com adjuvantes da invenção sãoparticularmente úteis para a imunização contra cepaspandêmicas. As características de uma cepa de influenza quefornecem o potencial para que ela cause um surto pandêmicosão: (a) ela contém uma nova hemaglutinina, comparada comas hemaglutininas em cepas humanas atualmente circulantes,ou seja, uma que ainda não era evidente na população humanapor mais de uma década (por exemplo, H2), ou que ainda nãotenha sido observada previamente de forma alguma napopulação humana (por exemplo, H5, H6 ou H9, que geralmentesó foram encontradas em populações de pássaros) , de talforma que a população humana será imunologicamente virgempara a hemaglutinina da cepa; (b) ela é capaz de ser,transmitida horizontalmente na população humana; e (c) elaé patogênica para os seres humanos. Um vírus com o tipo H5de hemaglutinina é preferido para imunização contrainfluenza pandêmica, por exemplo, uma cepa H5N1. Outrascepas possíveis incluem H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 e H7N7, equaisquer outras cepas pandêmicas potencialmenteemergentes.
As composições da invenção podem incluir antígeno(s)de uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou mais) cepas dovírus influenza, incluindo vírus de influenza A e/ou vírusde influenza B. Quando uma vacina incluir mais de uma cepade influenza, as diferentes cepas serão tipicamentedesenvolvidas separadamente, e serão misturadas após ovírus ter sido coletado e os antígenos terem sidopreparados. Dessa forma, um processo da invenção podeincluir a etapa de mistura de antígenos de mais de uma cepade influenza.
O vírus influenza pode ser uma cepa reordenada, e podeter sido obtido por técnicas de genética reversa. Astécnicas de genética reversa [por exemplo, 135-139]permitem que sejam preparados virus influenza com ossegmentos de genoma desejados in vitro com o uso deplasmideos. Tipicamente, elas envolvem a expressão de: (a)moléculas de DNA que codificam as moléculas de RNA viraldesejadas, por exemplo, de promotores poli, e (b) moléculasde DNA que codificam proteínas virais, por exemplo, depromotores polll, de tal forma que a expressão de ambos ostipos de DNA em uma célula leve à montagem de um vírioninfeccioso intacto completo. 0 DNA preferivelmente fornecetodo o RNA e todas as proteínas virais, mas também épossível usar um vírus auxiliar (helper) para fornecer umaporção do RNA e das proteínas. São preferidos métodosbaseados em plasmídeo que usam plasmideos separados para aprodução de cada RNA viral [140-142], e esses métodostambém envolverão o uso de plasmideos para expressar todasou parte (por exemplo, somente as proteínas PBl, PB2, PA eNP) das proteínas virais, com até 12 plasmideos sendousados em alguns métodos. Para reduzir o número deplasmideos necessários, uma abordagem recente [143] combinadiversos cassetes de transcrição de RNA polimerase I (parasíntese de RNA viral) no mesmo plasmídeo (por exemplo,seqüências que codificam 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todos os 8segmentos de vRNA de influenza A) , e diversas regiões decodificação de proteína com promotores de RNA polimerase IIno outro plasmídeo (por exemplo, seqüências que codificamIf 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todos os 8 transcritos de mRNA deinfluenza A) . Aspectos preferidos do método da referência143 envolvem: (a) regiões de codificação de PBl, PB2 e PAmRNA em um único plasmídeo; e (b) todos os 8 segmentos decodificação de vRNA em um único plasmídeo. É possível usarpromotores duplos poli e polll para codificarsimultaneamente os RNAs virais e para mRNAs passíveis deexpressão a partir de um único modelo [144,145].
Dessa forma, o vírus pode incluir um ou mais segmentosde RNA de um vírus A/PR/8/34 (tipicamente 6 segmentos deA/PR/8/34, com os segmentos HA e N sendo de uma cepa devacina, ou seja, uma reordenação 6:2), particularmentequando os vírus se desenvolvem em ovos. Ele também podeincluir um ou mais segmentos de RNA de um vírus A/WSN/33,ou de qualquer outra cepa viral útil para a geração devírus reordenado para a preparação de vacina. Tipicamente,a invenção protege contra uma cepa que é capaz detransmissão de humano para humano e, portanto, o genoma dacepa normalmente incluirá pelo menos um segmento de RNA quese originou em um vírus influenza de mamífero (por exemplo,
em um ser humano).
O vírus usado como a fonte dos antígenos pode crescerem ovos ou em cultura de células. O método-padrão atualpara o crescimento do vírus influenza utiliza ovos degalinha embrionados, com o vírus sendo purificado doconteúdo do ovo (fluido alantóico). Mais recentemente, noentanto, o vírus cresceu em cultura de célula animal e, porrazões de velocidade e alergias do paciente, esse método decrescimento é preferido.
O substrato celular será tipicamente uma linhagemcelular mamífera, por exemplo, MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero;MRC-5; PER.C6; WI-38; etc. Linhagens de células demamíferos preferidas para o crescimento do vírus influenzaincluem: células MDCK [146-149] , derivadas de rim de cãesMadin Darby; células Vero [150-152] , derivadas de rim demacaco verde africano (Cercopithecus aetiops); ou célulasPER.C6 [153], derivadas de retinoblastos embriônicoshumanos. Essas linhagens celulares são amplamentedisponíveis, por exemplo, na coleção da "American Type CellCulture" (ATCC) [154], dos "Coriell Cell Repositories"[155] , ou da "European Collection of Cell Cultures"(ECACC). Por exemplo, a ATCC fornece várias células Verodiferentes sob números de catálogo CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 e CRL-1587, e fornece células MDCK sob número decatálogo CCL-34. PER.C6 é disponível pela ECACC sob onúmero de depósito 96022940. Como alternativa menospreferida às linhagens de células de mamíferos, os víruspodem crescer em linhagens celulares aviárias [por exemplo,referências 156-158], incluindo linhagens celularesderivadas de patos (por exemplo, retina de pato) ougalinhas, por exemplo, fibroblastos de embriões de galinha(CEF) etc.
Quando os vírus crescem em uma linhagem celularmamífera, a composição será vantajosamente isenta deproteínas de ovos (por exemplo, ovalbumina e ovomucóide) ede DNA de galinha, reduzindo, dessa forma, aalergenicidade.
Para crescimento em uma linhagem celular, por exemplo,em células MDCK, o vírus pode crescer em células emsuspensão [146] ou em cultura aderente. Uma linhagem decélulas MDCK adequada à cultura em suspensão é MDCK 33016(depositada como DSM ACC 2219) . Como alternativa, pode serusada cultura em micro-veículo.Quando o vírus crescer em uma linhagem celular, acultura para crescimento será preferivelmente isenta de (ouseja, terá sido testada e possuirá um resultado negativoquanto ã contaminação por) vírus do herpes simples, vírussincicial respiratório, vírus parainfluenza 3, coronavírusSARS, adenovírus, rinovírus, reovírus, poliomavírus,birnavírus, circovírus e/ou parvovírus. A ausência do vírusdo herpes simples é particularmente preferida.
Quando o vírus crescer em uma linhagem celular, acomposição preferivelmente conterá menos de 10 ng(preferivelmente menos de 1 ng e, mais preferivelmente,menos de 100 pg) de DNA residual da célula hospedeira pordose, embora quantidades residuais do DNA da célulahospedeira possam estar presentes. Em geral, o DNA dacélula hospedeira que é desejável que seja excluído decomposições da invenção é o DNA que possui no máximo 100bp.
A medida do DNA residual da célula hospedeira é agorauma exigência reguladora de rotina para substânciasbiológicas, e está incluída nas capacidades normaisdaqueles habilitados na técnica. 0 ensaio usado para mediro DNA tipicamente será um ensaio validado [159, 160] . Ascaracterísticas de desempenho de um ensaio validado podemser descritas em termos matemáticos e quantificáveis, esuas possíveis fontes de erro foram identificadas. 0 ensaiogeralmente terá sido testado quanto às característicascomo, por exemplo, exatidão, precisão, especificidade. Apósum ensaio ter sido calibrado (por exemplo, contraquantidades padronizadas conhecidas de DNA da célulahospedeira) e testado, as medições quantitativas de DNApodem ser realizadas da forma habitual. Podem ser usadastrês técnicas principais para a quantificação de DNA:métodos de hibridização, por exemplo, Southern blots ouslot blots [161]; métodos de imunoensaio, por exemplo, osistema Threshold™ [162] ; e PCR quantitativa [163] . Todosesses métodos são familiares para aqueles habilitados natécnica, embora as características precisas de cada métodopossam depender da célula hospedeira em questão, porexemplo, da escolha das sondas para hibridização, daescolha de iniciadores e/ou sondas para amplificação etc. 0sistema Threshold™ de "Molecular Devices" é um ensaioquantitativo para níveis de picogramas de DNA total, e temsido usado para o monitoramento dos níveis de DNAcontaminante em produtos biofarmacêuticos [162]. Um ensaiotípico envolve a formação sem especificidade de seqüênciade um complexo de reação entre uma proteína de ligaçãobiotinilada de ssDNA, um anticorpo anti-ssDNA conjugado àurease, e DNA. Todos os componentes do ensaio estãoincluídos no Kit completo de Ensaio de DNA Total disponívelpelo fabricante. Vários fabricantes comerciais oferecemensaios de PCR quantitativa para detecção do DNA residualda célula hospedeira, por exemplo, AppTec™ de "LaboratoryServices", BioReliance™, "Althea Technologies" etc. Umacomparação entre um ensaio de hibridização
quimioluminescente e o sistema de DNA total Threshold™para medida da contaminação por DNA da célula hospedeira deuma vacina viral humana pode ser encontrada na referência164 .
0 DNA contaminante pode ser removido durante apreparação da vacina com o uso de procedimentos depurificação padronizados, por exemplo, cromatografia etc. Aremoção de DNA residual da célula hospedeira pode seraumentada por tratamento com nuclease, por exemplo, pelautilização de uma DNase. Um método conveniente para reduçãoda contaminação do DNA da célula hospedeira é revelado nasreferências 165 e 166, que envolve um tratamento em duasetapas, usando primeiro uma DNase (por exemplo, Benzonase)e depois um detergente catiônico (por exemplo, CTAB).
Vacinas que contêm < 10 ng (por exemplo, < 1 ng, <100pg) de DNA da célula hospedeira por 15 pg de hemaglutininasão preferidas, bom como vacinas que contêm < 10 ng (porexemplo, < 1 ng, < 100 pg) de DNA da célula hospedeira porvolume de 0,25 ml. Vacinas que contêm < 10 ng (por exemplo,<i 1 ng, < 100 pg) de DNA da célula hospedeira por 50 pg dehemaglutinina são mais preferidas, bom como vacinas quecontêm < 10 ng (por exemplo, < 1 ng, < 100 pg) de DNA dacélula hospedeira por volume de 0,5 ml.
Linhagens de células que suportam a replicação dovírus influenza são preferivelmente desenvolvidas em meiosde cultura isentos de soro e/ou meios isentos de proteína.Um meio é considerado isento de soro no contexto dapresente invenção quando não há aditivos de soro de origemhumana ou animal. "Isento de proteínas" significa culturasnas quais a multiplicação das células ocorre com a exclusãode proteínas, fatores do crescimento, outros aditivosprotéicos e proteínas não-soro, mas pode opcionalmenteincluir proteínas tais como tripsina ou outras proteasesque possam ser necessárias para o crescimento viral. Ascélulas que crescem nessas culturas contêm, elas próprias,naturalmente, proteínas.Linhagens celulares que suportam a replicação do vírusinfluenza crescem preferivelmente abaixo de 37°C [167], porexemplo, a 30-36°C.
Hemaglutinina (HA) é o imunógeno principal em vacinasde influenza inativadas, e as doses de vacina sãopadronizadas por referência aos níveis de HA, tipicamentecomo medidos por um único ensaio de imunodifusão radial(SRID). As vacinas tipicamente contêm cerca de 15 pg de HApor cepa, embora doses menores também sejam usadas, porexemplo, para crianças, ou em situações pandêmicas. Dosesfuncionais, tais como %2 (ou seja, 7,5 pg de HA por cepa),1/4 e 1/8 foram usadas [168, 169] , bem como doses maiores(por exemplo, doses de 3x ou 9x [170, 171]). Dessa forma,as vacinas podem incluir entre 0,1 e 150 pg de HA por cepade influenza, pref erivelmente entre 0,1 e 50 pg, porexemplo, 0,1-20 pg, 0,1-15 pg, 0,1-10 pg, 0,1-7,5 pg, 0,5-5pg etc. Doses específicas incluem, por exemplo, cerca de15, cerca de 10, cerca de 7,5, cerca de 5, cerca de 3,8,cerca de 1,9, cerca de 1,5 etc. por cepa. Dessa forma, asvacinas podem incluir entre 0,1 e 20 pg de HA por cepa deinfluenza, preferivelmente entre 0,1 e 15 pg, por exemplo,0,1-10 pg, 0,1-7,5 pg, 0,5-5 pg etc. Doses específicasincluem, por exemplo, cerca de 15, cerca de 10, cerca de7,5, cerca de 5, cerca de 3,8, cerca de 1,9 etc. Essasdoses menores são mais úteis quando um adjuvante estápresente na vacina, como ocorre com a invenção.
A HA usada com a invenção pode ser uma HA natural,como encontrada em um vírus, ou pode ter sido modificada.Por exemplo, é conhecida a modificação de HA para removerdeterminantes (por exemplo, regiões hiper-básicas) quefazem com que um vírus seja altamente patogênico emespécies de aves, na medida em que esses determinantespodem, de outra forma, evitar que um vírus cresça em ovos.
Uma vacina inativada, mas de célula não inteira (porexemplo, uma vacina de vírus dividido ou uma vacina deantígeno de superfície purificado), pode incluir proteínada matriz, a fim de se beneficiar dos epitopos de células Tadicionais que estão localizados dentro desse antígeno.Dessa forma, uma vacina de célula não inteira(particularmente uma vacina dividida) que incluihemaglutinina e neuraminidase pode adicionalmente incluirproteínas da matriz Ml e/ou M2. Quando uma proteína damatriz estiver presente, a inclusão de níveis detectáveisde proteína da matriz M2 será preferida. Nucleoproteínatambém pode estar presente.Formulação de composições farmacêuticas
Os antígenos e ligantes de CDld descritos acima sãoparticularmente adequados à inclusão em composiçõesimunogênicas e vacinas. Um processo da invenção pode,portanto, incluir a etapa de formulação de um antígeno e umligante de CDld como uma composição imunogênica ou vacina.A invenção fornece uma composição ou vacina que pode serobtida dessa forma.
As composições imunogênicas e vacinas da invençãocompreenderão, além do(s) antígeno(s) e ligantes de CDld,tipicamente "veículos farmaceuticamente aceitáveis", queincluem qualquer veículo que, por si próprio, não induza aprodução de anticorpos danosos ao indivíduo que recebe acomposição. Veículos adequados são tipicamentemacromoléculas grandes, lentamente metabolizadas, porexemplo, proteínas, polissacarídeos, ácidos poliláticos,ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolíraerosde aminoácidos, trehalose [172] , agregados lipidicos (porexemplo, gotícuias de óleo ou lipossomos) e partículasvirais inativas. Esses veículos são bem conhecidos poraqueles habilitados na técnica. As vacinas também podemconter diluentes, por exemplo, água, solução salina,glicerol etc. Adicionalmente, substâncias auxiliares, porexemplo, agentes umidificantes ou emulsificantes,substâncias de tamponamento do pH, e semelhantes, podemestar presentes. Uma discussão detalhada de excipientesfarmaceuticamente aceitáveis está disponível na referência173 .
As composições imunogênicas usadas como vacinascompreendem uma quantidade imunologicamente eficaz deantígeno, além de quaisquer outros dos componentesmencionados acima, como for necessário. O termo "quantidadeimunologicamente eficaz" significa que a administraçãodaquela quantidade a um indivíduo, seja em uma dose únicaou como parte de uma série, é eficaz para tratamento ouprevenção. Essa quantidade varia, dependendo da saúde e dacondição física do indivíduo a ser tratado, da idade, dogrupo taxonômico do indivíduo a ser tratado (por exemplo,primata não humano, primata etc.), da capacidade do sistemaimunológico do indivíduo para sintetizar anticorpos, dograu de proteção desejado, da formulação da vacina, daavaliação do médico assistente da situação médica, e deoutros fatores relevantes. Espera-se que a quantidade caiaem uma faixa relativamente ampla que pode ser determinadapor meio de experimentos de rotina.A vacina pode ser administrada em conjunto com outrosagentes imunorreguladores. 0 ligante de CDld atua como umadjuvante dentro das composições imunogênicas da invenção.A vacina pode incluir adjuvantes adicionais. Essesadjuvantes incluem, sem limitação:
Adjuvantes que podem ser usados com a invençãoincluem, sem limitação:
- uma composição que contém mineral, incluindo sais decálcio e sais de alumínio (ou misturas destes) . Sais decálcio incluem fosfato de cálcio (por exemplo, aspartículas "CAP" reveladas na referência 174) . Sais dealumínio incluem hidróxidos, fosfatos, sulfatos etc., comos sais assumindo qualquer forma adequada (por exemplo,gel, cristalina, amorfa etc.). A adsorção desses sais épreferida. As composições que contêm minerais também podemser formuladas como uma partícula de sal metálico [175].Adjuvantes de sal de alumínio são descritos com maisdetalhe abaixo.
- uma emulsão óleo-em-água, como descrito com maisdetalhe abaixo.
- um oligonucleotídeo imunoestimulante, por exemplo,um que contém um motivo CpG (uma seqüência dedinucleotídeos que contém uma citosina não metilada ligadapor uma ligação fosfato a uma guanosina), um motivo TpG
[176] , um RNA de fita dupla, um oligonucleotídeo que contémuma seqüência palindrômica ou um oligonucleotídeo quecontém uma seqüência poli(dG). Oligonucleotídeosimunoestimulantes podem incluir modificações/análogos denucleotídeos como, por exemplo, modificações defosforotioato, e podem ser de fita dupla ou (exceto paraRNA) de fita simples. As referências 177 a 179 revelamsubstituições de análogos possíveis, por exemplo,substituição de guanosina com 21-desoxi-7-deazaguanosina. 0efeito adjuvante dos oligonucleotldeos CpG é aindadiscutido nas referências 180-185. Uma seqüência CpG podeser dirigida a TLR9, por exemplo, o motivo GTCGTT ou TTCGTT[186] . A seqüência CpG pode ser específica para a induçãode uma resposta imunológica de Thl, por exemplo, como umODN CpG-A (oligodesoxinucleotídeo) , ou ela pode ser maisespecífica para a indução de uma resposta de célula B, porexemplo, um ODN CpG-B. ODNs CpG-A e CpG-B são discutidosnas referências 187-189. De preferência, o CpG é um ODNCpG-A. De preferência, o oligonucleotídeo CpG é construídode tal forma que a extremidade 5' seja acessível parareconhecimento de receptor. Opcionalmente, duas seqüênciasde oligonucleotídeos CpG podem ser anexadas em suasextremidades 31, para formar "imunômeros" . Veja, porexemplo, as referências 190-192. Um adjuvante de CpG útil éCpG7 909, também conhecido como ProMune™ (ColeyPharmaceutical Group, Inc.). Os oligonucleotídeosimunoestimulantes tipicamente compreenderão pelo menos 20nucleotídeos. Eles podem compreender menos de 100nucleotídeos.
- monofosforil lipídeo A 3-0-desacilado ("3dMPL",também conhecido como "MPLTM") [193-196] . 3dMPL foipreparado a partir de um mutante sem heptose de Salmonellaminnesota, e é quimicamente similar ao lipídeo A, mas nãopossui um grupo fosforil ácido-lábil e um grupo acil base-lábil. A preparação de 3dMPL foi descrita originalmente nareferência 197. 3dMPL pode assumir a forma de uma misturade moléculas relacionadas, variando por sua acilação (porexemplo, com 3, 4, 5 ou 6 cadeias acil, que podem ser decomprimentos diferentes). Os dois monossacarideos deglucosamina (também conhecidos como 2-desoxi-2-amino-glicose) são N-acilados em seus carbonos da posição 2 (ouseja, nas posições 2 e 2'), e há também 0-acilação naposição 31.
um composto de imidazoquinolina, por exemplo,Imiquimod ("R-837") [198,199], Resiquimod ("R-848") [200],e seus análogos; e sais destes (por exemplo, os sais decloridrato). Detalhes adicionais sobre imidazoquinolinasimunoestimulantes podem ser encontrados nas referências 201a 205.
um composto de tiossemicarbazona, por exemplo,aqueles revelados na referência 206. Métodos de formulação,fabricação e rastreamento para compostos ativos também sãodescritos na referência 206. As tiossemicarbazonas sãoparticularmente eficazes na estimulação de célulasmononucleares do sangue periférico humano para a produçãode citocinas, por exemplo, TNF-α.
- um composto de triptantrina, por exemplo, aquelesrevelados na referência 207. Métodos de formulação,fabricação e rastreamento para compostos ativos também sãodescritos na referência 207. As tiossemicarbazonas sãoparticularmente eficazes na estimulação de célulasmononucleares do sangue periférico humano para a produçãode citocinas, por exemplo, TNF-α.
um análogo de nucleosídeo, por exemplo: (a)Isatorabina (ANA-245; 7-tia-8-oxoguanosina):<formula>formula see original document page 45</formula>
e pró-drogas deste; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380;(e) os compostos revelados nas referências 208 a 210; (f)um composto que possui a fórmula:
<formula>formula see original document page 45</formula>
R1 e R2 são, cada um independentemente, H, halo,NRaRb, -0H, Ci-6 alcóxi, Ci-6 alcóxi substituído,heterociclil, heterociclil substituído, C6-I0 aril, C6-I0aril substituído, Ci-6 alquil ou Ci-6 alquil substituído;
R3 está ausente, H, Ci_6 alquil, Ci-6 alquilsubstituído, C6-I0 aril, C6-10 aril substituído, heterociclilou heterociclil substituído;
R4 e R5 são, cada um independentemente, H, halo,heterociclil, heterociclil substituído, -C(O)-Rd, Ci_6alquil, Cx-e alquil substituído, ou ligados em conjunto paraformar um anel de 5 membros como em R4-S =
<formula>formula see original document page 45</formula>
a ligação sendo obtida nas ligações indicadas por um
X1 e X2 são, cada um independentemente, N, C, 0 ou S;R8 é Hf halo, -OH, C1-C6 alquil, C2-C6 alquenil, C2-6alquinil, -0H, -NRaRb, -(CH2)n-O-Rc, -O- (C1-C6 alquil),S(O)pRe ou -C(O) -Rd;
R9 é H, C1-C6 alquil, C1-C6 alquil substituído,heterociclil, heterociclil substituído ou R9a, em que R9a é:
a ligação sendo obtida na ligação indicada por um .R10 e R11 são, cada um independentemente, H, halo, C1-C6alcóxi, C3-C6 alcóxi substituído, - NRaRb ou -0H;
Cada Ra e Rb é independentemente H, C1-6 alquil, C1-C6alquil substituído, -C(O)Rd, C6-10 aril;
Cada Rc é independentemente H, fosfato, difosfato,trifosfato, C1-C6 alquil ou C1-6 alquil substituído;
Cada Rd é independentemente H, halo, C1-C6 alquil,substituído C1-C6 alquil, C1-C6 alcóxi, C1-C6 alcóxi substituído,-NH2, -NH (C1-6 alquil), -NH(C1-C6 alquil substituído), -N(C1-C6alquil) 2, -N(Ci-S alquil substituído) 2, C6-C10 aril ouheterociclil;
cada Re é independentemente H, C1-C6 alquil, C1-6 alquilsubstituído, C6-C10 aril, C6-C10 aril substituído, heterociclilou heterociclil substituído;
cada Rf é independentemente H, C1-C6 alquil, C1-6 alquilsubstituído, -C(O)Rd, fosfato, difosfato ou trifosfato;cada ? é independentemente 0, 1, 2 ou 3;cada ? é independentemente 0, 1 ou 2;
ou (g) um sal farmaceuticamente aceitável de qualquerum de (a) a (f) , um tautômero de qualquer um de (a) a (f) ,ou um sal farmaceuticamente aceitável do tautômero.- Loxoribina (7-alil-8-oxoguanosina) [211].
- Compostos revelados na referência 212, incluindo:compostos de acilpiperazina, compostos de indoldiona,compostos de tetrahidraisoquinolina (THIQ), compostos debenzociclodiona, compostos de aminoazavinil, compostos deaminobenzimidazol quinolinona (ABIQ) [213, 214] , compostosde hidraftalamida, compostos de benzofenona, compostos deisoxazol, compostos de esterol, compostos de quinazilinona,compostos de pirrol [215], compostos de antraquinona,compostos de quinoxalina, compostos de triazina, compostosde pirazalopirimidina e compostos de benzazol [216].
- Compostos revelados na referência 217, incluindo3,4-di(IH-indol- 3 -il)-IH-pirrol-2,5-dionas, análogos deestaurosporina, piridazinas derivatizadas, cromen-4-onas,indolinonas, quinazolinas e análogos de nucleosídeos.
- um derivado de fosfato de aminoalquil glicosaminida,por exemplo, RC-529 [218, 219].
um fosfazeno, por exemplo,
poli[di(carboxilatofenoxi)fosfazeno] ("PCPP"), como
descrito, por exemplo, nas referências 220 e 221.
- imunopotencializadores de pequena molécula (SMIPs),por exemplo:
N2-metil-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
N2,N2-dimetil-1-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
N2-etil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
N2-metil-l-(2-metilpropil)-N2-propil-IH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina1-(2-metilpropil)-N2-propil-lH-imidazo[4,5-c]quinolina- 2 , 4-diamina
N2-butil-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
N2-but i1-N2-me t i1-1-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
N2-metil-l-(2-metilpropil)-N2-pentil-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
N2-metil-l-(2-metilpropil)-N2-prop-2-enil-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
1-(2-metilpropil)-2-[(fenilmetil)tio]-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
1-(2-metilpropil)-2-(propiltio)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
2-[[4-amino-l-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-2-il](metil)amino]etanol
Acetato de 2-[ [4-amino-l-(2-metilpropil)-IH-
imidazo[4,5-c]quinolin-2-il] (metil)amino] etil
4-amino-l-(2-metilpropil)-1,3-diidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona
N2-butil-l-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-IH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
N2-butil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2 , 4-diamina
N2-metil-l-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-IH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
N2 , N2-dimetil-l-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
1-{4-amino-2-[metil(propil)amino]-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il}-2-metilpropan-2-ol1-[4-amino-2-(propilamino)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]-2-metilpropan-2-ol
N4,N4-dibenzil-l-(2-metóxi-2-metilpropil)-N2-propil-lH-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina.
- Saponinas [capítulo 22 da referência 249] , que sãoum grupo heterólogo de glicosídeos de esterol e glicosídeosde triterpenóide que são encontrados na casca, folhas,caules, raízes e até mesmo nas flores de uma ampla gama deespécies de plantas. A saponina da casca da árvore Quillaiasaponaria Molina foi amplamente estudada como adjuvante. Asaponina também pode ser obtida comercialmente de Smilaxornata (sarsaprilla), Gypsophilla paniculata (brides veil),e Saponaria officianalis (soap root) . Formulações deadjuvante de saponina incluem formulações purificadas, porexemplo, QS21, além de formulações de lipídeos, por
exemplo, ISCOMs. QS21 é comercializada como Stimulon .Composições de saponina têm sido purificadas com o uso deHPLC e RP-HPLC. Foram identificadas frações purificadasespecíficas com a utilização dessas técnicas, incluindoQS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QHB e QH-C. De preferência, asaponina é QS21. Um método de produção de QS21 éapresentado na referência 222. Formulações de saponinatambém podem compreender um esterol, por exemplo,colesterol [223]. Combinações de saponinas e colesteróispodem ser usadas para formar partículas únicas denominadascomplexos imunoestimulantes (ISCOMs) [capítulo 23 dareferência 249]. ISCOMs tipicamente também incluem umfosfolipídeo, por exemplo, fosfatidiletanolamina oufosfatidilcolina. Qualquer saponina conhecida por ser usadaem ISCOMs. De preferência, o ISCOM inclui um ou mais deQuiIA, QHA e QHC. ISCOMs são ainda descritos nasreferências 223-225. Opcionalmente, os ISCOMS podem serdesprovidos de detergente adicional [226]. Uma revisão dodesenvolvimento de adjuvantes baseados em saponina pode serencontrada nas referências 227 e 228.
toxinas bacterianas de ribosilação de ADP (porexemplo, a enterotoxina termolábil de E. coli "LT", toxinacolérica "CT" ou toxina de pertussis »pt") e derivadosdetoxifiçados destas, por exemplo, as toxinas mutantesconhecidas como LT-K63 e LT-R72 [229]. 0 uso de toxinas deribosilação de ADP detoxifiçadas como adjuvantes mucosos édescrito na referência 23 0, e como adjuvantes parenteraisna referência 231.
Bioadesivos e mucoadesivos, por exemplo,microesferas de ácido hialurônico esterificado [232] ouquitosana e seus derivados [233] .
Micropartículas (ou seja, uma partícula deaproximadamente 100 nm até aproximadamente 150 μπι dediâmetro, mais pref erivelmente -200 nm a -30 μιη dediâmetro, ou -500 nm a 10 μτη de diâmetro) , formadas pormateriais que são biodegradáveis e atóxicos (por exemplo,um poli(ácido α-hidróxi), um ácido poli-hidróxi butírico,um poliortoéster, um polianidrido, uma policaprolactonaetc.), com poli(lactida-co-glicolida) sendo preferida,opcionalmente tratadas para ter uma superfície carregadanegativamente (por exemplo, com SDS) ou uma superfíciecarregada positivamente (por exemplo, com um detergentecatiônico, por exemplo, CTAB).
- Lipossomos (capítulos 13 e 14 da referência 249) .Exemplos de formulações de lipossomo adequadas para usocomo adjuvantes são descritos nas referências 234-236.
- Éteres de polioxietileno e ésteres de polioxietileno[23 7]. Essas formulações ainda incluem tensoativos de ésterde polioxietileno sorbitano em combinação com um octoxinol[238] , além de tensoativos de éteres ou éster depolioxietileno alquil em combinação com pelo menos umtensoativo não iônico adicional como, por exemplo, umoctoxinol [239] . Éteres de polioxietileno preferidos sãoselecionados do seguinte grupo: polioxietileno-9 -lauriléter (laureth 9) , polioxietileno-9-esteoril éter,polioxietileno-8-esteoril éter, polioxietileno-4-lauriléter, polioxietileno-35-lauril éter e polioxietileno-23-lauril éter.
- Muramil peptídeos, por exemplo, N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina ("thr-MDP"), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-
acetilglucosamini1-N-acetilmuramiI-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida ("DTP-DPP", ou "Theramide™) , N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(11 -2 ' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina("MTP-PE").
uma preparação de proteossoma da proteína damembrana externa preparada a partir de uma primeirabactéria gram-negativa em combinação com uma preparação delipossacarideo (LPS) derivada de uma segunda bactéria gram-negativa, em que as preparações de proteossoma da proteínada membrana externa e LPS formam um complexo adjuvante nãocovalente estável. Esses complexos incluem "IVX908", umcomplexo composto por membrana externa de Neisseriameningitidis e LPS.- Metil inosina 5'-monofosfato ("MIMP") [240],
- um composto de pirrolizidina polihidroxilada [241],por exemplo, um que possui a fórmula:
<formula>formula see original document page 52</formula>
em que R é selecionado do grupo que compreende hidrogênio,grupos acil, alquil (por exemplo, cicloalquil) , alquenil,alquinil e aril lineares ou ramificados, não substituídosou substituídos, saturados ou insaturados, ou um salfarmaceuticamente aceitável ou derivado destes. Exemplosincluem, sem limitação: casuarina, casuarina-6-a-D-glicopiranose, 3-epi-casuarina, 7-epi-casuarina, 3,7-diepi-casuarina etc.
Uma gama inulina [242] ou derivado desta, porexemplo, algamulina.
- Um composto de fórmula I, II ou III, ou um saldestes:
<formula>formula see original document page 52</formula>
como definidos na referência 243, por exemplo, "ER 803058","ER 803732", "ER 804053", "ER 804058", "ER 804059", "ER804442", "ER 804680", "ER 804764", "ER 803022" OU "ER804057", por exemplo:<formula>formula see original document page 53</formula>
- Derivados de lipídeo A de Escherichia coli, porexemplo, OM-174 (descrito nas referências 244 e 245).
- Uma formulação de um lipideo catiônico e um co-lipideo (normalmente neutro), por exemplo, brometo deaminopropildimetil-miristoleiloxi-propanamínio-
diftanoilfosfatidil-etanolamina ("Vaxfectin™" ) ou brometode aminopropi1-dime til-bis-dodec iIoxo-propanamínio-
dioleoilfosfatidil-etanolamina ("GAP-DLRIE:DOPE").
Formulações que contêm sais de (±)-N(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceneiloxi)-1-propanamínio sãopreferidas [246] .
Compostos que contêm lipídeos ligados a umaestrutura central acíclica contendo fosfato, por exemplo, oantagonista de TLR4 E5564 [247, 248]:
Essas e outras substâncias adjuvantes ativas sãodiscutidas com mais detalhe nas referências 249 e 250.Métodos e usos médicos
Uma vez formuladas, as composições da invenção podemser administradas diretamente ao indivíduo. Os indivíduos aserem tratados podem ser animais; em particular, podem sertratados indivíduos humanos. As vacinas são particularmenteúteis para a vacinação de crianças e adolescentes. Asvacinas mostraram ser eficazes em modelos animais MHC II-/-e considera-se, portanto, que serão úteis para o tratamentode indivíduos imunocomprometidos. Elas são liberadas porvias sistêmicas e/ou mucosas.
Tipicamente, as composições imunogênicas sãopreparadas como injetáveis, tanto como soluções oususpensões líquidas; formas sólidas adequadas para soluçãoou suspensão em veículos líquidos, antes da injeção, tambémpodem ser preparadas. A preparação também pode seremulsificada ou encapsulada em lipossomos para aumento doefeito adjuvante. A liberação direta das composições serágeralmente parenteral (por exemplo, por injeção, por viasubcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular,ou liberada no espaço intersticial de um tecido). Ascomposições também podem ser administradas em uma lesão.Outros modos de administração incluem administração oral epulmonar, supositórios e aplicações transdérmicas outranscutâneas (por exemplo, veja a referência 251), agulhase hiposprays. A dosagem do tratamento pode ser um esquemade dose única ou um esquema de doses múltiplas (porexemplo, incluindo doses de reforço).
As vacinas da invenção são preferivelmente estéreis.Elas são preferivelmente isentas de pirogênio; sãopreferivelmente tamponadas, por exemplo, em um pH entre 6 e8, geralmente em torno de pH 7 .
As vacinas da invenção podem compreender detergentes(por exemplo, um Tween, como, por exemplo, Tween 80) e.mníveis baixos (por exemplo, < 0,01%). As vacinas dainvenção podem compreender um álcool de açúcar (porexemplo, manitol) ou trehalose, por exemplo, em torno de 15mg/ml, particularmente caso devam ser Iiofilizadas.
Doses ótimas de antígenos individuais podem sertestadas empiricamente. Em geral, no entanto, os antígenosda invenção serão administrados em uma dose entre 0,1 e 100pg de cada antígeno por dose, com um volume de dosagemtípico de 0,5 ml. A dose é tipicamente entre 5 e 20 pg porantígeno por dose.
A quantidade de ligante de CDld administrada aopaciente para induzir uma resposta imunológica pode variar,dependendo da idade e do peso do paciente ao qual acomposição será administrada, mas tipicamente conterá entre1-100 pg/kg de peso corporal do paciente.Surpreendentemente, verificou-se que doses baixas doligante de CDld são suficientes para aumentar a respostaimunológica a um antígeno co-administrado e promovermemória imunológica de longo prazo àquele antígeno. Aquantidade de ligante de CDld incluída nas composições dainvenção pode, portanto, ser menos do que 50 pg/kg de pesocorporal do paciente, menos de 20 pg/kg, menos de 10 pg/kg,menos de 5 pg/kg, menos de 4 pg/kg ou menos de 3 pg/kg.
As vacinas de acordo com a invenção podem serprofiláticas (ou seja, para evitar a infecção) outerapêuticas (ou seja, para tratar a doença após ainfecção), mas serão tipicamente profiláticas.
A invenção fornece um ligante de CDld e um antígeno deestreptococos do grupo B para uso em medicamento. Ainvenção fornece um ligante de CDld e um antígeno dosorogrupo B de N. meningitidis para uso em medicamento. Ainvenção fornece um ligante de CDld e um antígeno de vírusinfluenza selecionado de uma cepa de influenza que é capazou possui o potencial para causar um surto pandêmico parauso em medicamento.
A invenção também fornece um método de despertar umaresposta imunológica em um paciente que compreende aadministração a um paciente de uma vacina de acordo com ainvenção. Em particular, a invenção fornece um método dedespertar uma resposta imunológica em um paciente quecompreende a administração a um paciente de um ligante deCDld e de um antígeno de estreptococos do grupo Β. Ainvenção fornece um método de despertar uma respostaimunológica em um paciente que compreende a administração aum paciente de um ligante de CDld e de um antígeno dosorogrupo B de N. meningitidis. A invenção fornece ummétodo de despertar uma resposta imunológica em um pacienteque compreende a administração de um ligante de CDld e deum antígeno de vírus influenza selecionado de uma cepa deinfluenza que é capaz ou possui o potencial para causar umsurto pandêmico.
0 antígeno e o ligante de CDld podem ser administradossimultânea, seqüencial ou separadamente. Por exemplo, oligante de CDld pode ser administrado para sensibilizar omamífero, antes da administração do antígeno ou após aadministração do antígeno, para reforçar a respostaimunológica do mamífero àquele conjugado. Quando mais de umantígeno estiver sendo administrado, os antígenos poderãoser administrados simultaneamente, com o ligante de CDldsendo administrado separada, simultânea ou seqüencialmenteã mistura de antígenos. 0 método de despertar uma respostaimunológica pode compreender a administração de umaprimeira dose de um antígeno e de um ligante de CDld, esubseqüentemente a administração de uma segunda doseopcional, sem adjuvante, do antígeno. A primeira dose doantígeno e o ligante de CDld podem ser administradossimultânea, seqüencial ou separadamente.
A resposta imunológica é preferivelmente uma respostaprotetora, e pode compreender uma resposta imunológicahumora1 e/ou uma resposta imunológica celular. 0 pacientepode ser um adulto ou uma criança. 0 paciente pode ter aidade de 0-6 meses, 6-12 meses, 1-5 anos, 5-15 anos, 15-55anos ou maior do que 55 anos. De preferência, o paciente éuma criança.
0 paciente pode ser imunocomprometido. 0 paciente podeter um distúrbio associado à ausência de função do sistemaimunológico e, em particular, um distúrbio associado àausência de função em respostas de células T CD4. Exemplosde tais distúrbios incluem, sem limitação, AIDS, ataxia-telangiectasia, síndrome de DiGeorge,
panhipogamaglobulinemia, síndrome de Wiscott-Aldrich edeficiências de complemento.
A invenção fornece o uso de um antígeno deestreptococos do grupo B na fabricação de um medicamentopara despertar uma resposta imunológica em um paciente, emque o medicamento é administrado com um ligante de CDld. Ainvenção fornece o uso de um ligante de CDld na fabricaçãode um medicamento para despertar uma resposta imunológicaem um paciente, em que o medicamento é administrado com umantígeno de estreptococos do grupo Β. A invenção fornece ouso de um antígeno de estreptococos do grupo B e de umligante de CDld na fabricação de um medicamento paradespertar uma resposta imunológica em um paciente. Ainvenção também fornece o uso de um antígeno deestreptococos do grupo B na fabricação de um medicamento
para despertar uma resposta imunológica em um paciente, emque o paciente foi pré-tratado com um ligante de CDld. Ainvenção fornece o uso de um ligante de CDld na fabricaçãode um medicamento para despertar uma resposta imunológicaem um paciente, em que o paciente foi pré-tratado com umantígeno de estreptococos do grupo Β. A invenção fornece ouso de um antígeno de estreptococos do grupo B nafabricação de um medicamento para despertar uma respostaimunológica em um paciente, em que o referido paciente foipré-tratado com um antígeno de estreptococos do grupo B eum ligante de CDld.A invenção também fornece o uso de um antígeno dosorogrupo B de N. meningitidis na fabricação de ummedicamento para despertar uma resposta imunológica em umpaciente, em que o medicamento é administrado com umligante de CDld. A invenção também fornece o uso de umligante de CDld na fabricação de um medicamento paradespertar uma resposta imunológica em um paciente, em que omedicamento é administrado com um antígeno do sorogrupo Bde N. meningitidis. A invenção também fornece o uso de umantígeno de estreptococos do grupo B e de um ligante deCDld na fabricação de um medicamento para despertar umaresposta imunológica em um paciente. A invenção tambémfornece o uso de um antígeno do sorogrupo B de N.meningitidis na fabricação de um medicamento para despertaruma resposta imunológica em um paciente, em que o pacientefoi pré-tratado com um ligante de CDld. A invenção aindafornece o uso de um ligante de CDld na fabricação de ummedicamento para despertar uma resposta imunológica em umpaciente, em que o paciente foi pré-tratado com um antígenodo sorogrupo B de N. meningitidis. A invenção também
fornece o uso de um antígeno do sorogrupo B de N.meningitidis na fabricação de um medicamento para despertaruma resposta imunológica em um paciente, em que o referidopaciente foi pré-tratado com um antígeno de N. meningitidissorogrupo B e um ligante de CDld.
A invenção também fornece o uso de um antígeno de umvírus influenza (como descrito acima) na fabricação de ummedicamento para despertar uma resposta imunológica em umpaciente, em que o medicamento é administrado com um
ligante de CDld. A invenção também fornece o uso de umligante de CDld na fabricação de ura medicamento paradespertar uma resposta imunológica em um paciente, em que omedicamento é administrado com um antígeno de um vírusinfluenza (como descrito acima). A invenção também forneceo uso de um antígeno de um vírus influenza (como descritoacima) e de um ligante de CDld na fabricação de ummedicamento para despertar uma resposta imunológica em umpaciente. A invenção também fornece o uso de um antígeno devírus influenza (como descrito acima) na fabricação de ummedicamento para despertar uma resposta imunológica em umpaciente, em que o paciente foi pré-tratado com um ligantede CDld. A invenção ainda fornece o uso de um ligante deCDld na fabricação de um medicamento para despertar umaresposta imunológica em um paciente, em que o paciente foipré-tratado com um antígeno de um vírus influenza (comodescrito acima) . A invenção também fornece o uso de umantígeno de um vírus influenza (como descrito acima) nafabricação de um medicamento para despertar uma respostaimunológica em um paciente, em que o referido paciente foipré-tratado com um antígeno de um vírus influenza (comodescrito acima) e um ligante de CDld.
0 medicamento é preferivelmente uma composiçãoimunogênica (por exemplo, uma vacina). 0 medicamento épreferivelmente para a prevenção e/ou o tratamento de umadoença causada por estreptococo do grupo B, Neisseria
weningitidis (por exemplo, meningite, septicemia etc.) oupor vírus influenza.
As vacinas podem ser testadas em modelos animaispadronizados (por exemplo, veja a referência 252).
A invenção ainda fornece um kit que compreende: umantígeno estreptocócico do grupo B e um ligante de CDld. Ainvenção ainda fornece um kit que compreende um antígeno dosorogrupo B de N. meningitidis e um ligante de CDld. Ainvenção ainda fornece um kit que compreende um antígeno devírus influenza e um ligante de CDld. 0 antígeno e oligante são fornecidos preferivelmente como componentesseparados do kit, de tal forma que sejam adequados àadministração separada, por exemplo, em membros diferentes.Definições
O termo "que compreende" engloba "que inclui", bemcomo "que consiste", por exemplo, uma composição "quecompreende" X pode consistir exclusivamente em X ou podeincluir algo adicional, por exemplo, X + Y.
0 termo "cerca de" em relação a um valor numérico χsignifica, por exemplo, χ ± 10%.
A palavra "substancialmente" não exclui
"completamente"; por exemplo, uma composição que é"substancialmente isenta" de Y pode ser completamenteisenta de Y. Quando necessário, a palavra"substancialmente" pode ser omitida da definição dainvenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 mostra titulações geométricas de Ig.
A) Titulações séricas de anticorpos proteína-específicos em Camundongos C57/BL6 imunizados por viaintramuscular com α-GC e proteínas bacterianas (TT, toxóidetetânico ou DT, toxóide diftérico) ou virais (H3N2, asubunidade de hemoaglutinina-neuroaminidase da cepa deinfluenza A) . Camundongos imunizados com proteínas e a-GC(caixas fechadas) exibiram titulações de anticorpos maioresdo que camundongos imunizados somente com proteínas (caixasabertas). O eixo X mostra o tempo em dias.
B) Camundongos que abrigam células iNKT (Jal8+/+)imunizados com H3N2 e α-GC (caixas fechadas) mostramaumento da titulação sérica de anticorpos específicos paraH3N2, comparados com camundongos que abrigam células iNKTimunizados somente com H3N2 (caixas abertas). Camundongosdesprovidos de células iNKT (Jal8-/-) imunizados com H3N2 eα-GC (caixas fechadas) não mostram aumento na titulação
sérica de anticorpos específicos para H3N2, comparados comcamundongos desprovidos de células iNKT imunizados somentecom H3N2 (caixas abertas). Todas as imunizações foramsubcutâneas.
A Figura 2 mostra a média geométrica das titulações deIgG.
A) α-GC é tão potente quanto CFA, CpG, MF59 e Alume naprodução de anticorpos IgGl e IgG2a. O antígeno foi TT.
B) camundongos MHC-II-/- imunizados por via subcutâneacom H3N2 montaram titulações detectáveis de anticorpo
(IgG), enquanto camundongos MHC-II-/- imunizados por via
subcutânea somente com H3N2 ou em alume não o fizeram.
A Figura 3: comparação de α-GC e MF59 em um modelo emcamundongo de infecção pelo vírus influenza. Todas asimunizações foram por via intramuscular.
A) Titulações de IgG específicas para HlNl (média
geométrica). Camundongos imunizados com HlNl e α-GC possuemtitulações de anticorpos que são comparáveis àquelas decamundongos imunizados com HlNl e MF59 e que sãosignificativamente maiores do que titulações encontradas em
camundongos imunizados somente com vacina de proteína.Β) Percentagem de sobrevida vs. dias após o ataque.80% dos camundongos imunizados com HlNl e α-GC e 100% doscamundongos imunizados com HlNl e MF59 estão vivos apósataque com vírus influenza.
A Figura 4 mostra titulações de Ig contra H3N2 (médiageométrica). As caixas brancas são isentas de adjuvante; ascaixas sombreadas possuem a-GC:
A) resposta de IgGl e IgG2a de camundongos WT, IL-4-/-e IFN-yR -/- à imunização subcutânea com H3N2 e a-GC(mostrada em preto, quando presente) ou imunizaçãosubcutânea somente com H3N2 (mostrada em branco, quandopresente). A imunização de camundongos do tipo selvagemsomente com H3N2 induziu uma resposta de IgGl (Th2) ,enquanto a imunização com H3N2 e α-GC induziu uma respostade IgGl e IgG2a (ThO). A imunização de camundongos IL4-/-somente com H3N2 não induziu uma resposta de IgG, enquantoa imunização com H3N2 e α-GC induziu uma resposta de IgGl eIgG2a (ThO). A imunização de camundongos IFN-yR -/- somentecom H3N2 induziu uma resposta de IgGl (Th2), e a imunizaçãocom H3N2 e α-GC induziu uma resposta de IgGl (Th2)significativamente maior. A linha pontilhada mostra adiluição mínima dos soros testada.
B) Camundongos tratados com o anticorpo monoclonalanti-CD4 0L, antes e durante imunização subcutânea com H3N2e α-GC, exibem titulações de anticorpos de H3N2 que sãosignificativamente menores do que aquelas observadas emcamundongos tratados com IgG de controle.
Figura 5:
A) Camundongos foram sensibilizados em 0 e 2 semanassomente com H3N2 ou H3N2 e α-GC. Trinta semanas após aprimeira imunização, ambos os grupos de camundongosreceberam reforço somente com proteína H3N2. A Figuramostra a titulação de Ig H3N2 (média geométrica) vs. Tempo(semanas). As setas mostram o tempo das imunizações.
Camundongos sensibilizados com duas doses de H3N2 e α-GC esubseqüentemente reforçados somente com proteína (caixasfechadas) exibiram titulações de anticorpos
significativamente maiores do que camundongossensibilizados e reforçados somente com H3N2 (caixasabertas). As imunizações foram subcutâneas.
B) Freqüência de precursores de células que secretamH3N2-anticorpo em camundongos sensibilizados de acordo coma Figura 5A (precursores de ASC de H3N2-IgG por milhão decélulas Β) . A freqüência de precursores de células quesecretam H3N2-anticorpo na 30a semana foi
significativamente maior em camundongos imunizados duasvezes com H3N2 e α-GC (sombreado) do que em camundongosimunizados duas vezes somente com H3N2 (branco).
Figura 6: titulação de H3N2-Ig (média geométrica) vs.
tempo (semanas). Queda de anticorpos específicos para H3N2
em camundongos desprovidos de células iNKT (Jaa 18-/-) ecamundongos que abrigam células iNKT (Jaa 18+/+)imunizados duas vezes por via subcutânea somente com H3N2.Os anticorpos antígeno-específicos caem mais rápido emcamundongos desprovidos de células iNKT (triângulos) do queem camundongos que abrigam células iNKT (círculos).
A Figura 7 mostra a freqüência de precursores de ASC(ou seja, células B de memória) em camundongos C57BL/6, 6semanas após a última (de duas) imunização com toxóide
tetânico +/- adjuvantes, como número por milhão de célulasΒ. Os camundongos C57BL/6 foram imunizados por viaintramuscular no dia 0 e no dia 14 com toxóide tetânico semadjuvante, α-GC ou alume. Os camundongos imunizados comtoxóide tetânico e α-GC exibiram uma freqüênciasignificativamente maior de células B de memóriaespecíficas para o TT do que camundongos imunizados somentecom toxóide tetânico, enquanto camundongos imunizados comtoxóide tetânico em alume não o fizeram. * indica p<0,05vs. administração sem antígeno e ** indica p<0,01. ***indica p<0,05 vs. TT sem adjuvante.
Figura 8: esquema de imunização usado para avaliar seα-GC deve estar presente em todas as doses de vacina usadascomo sensibilização. Vinte fêmeas de camundongos C57BL/6,com idade de 6-8 semanas, foram divididas em 4 grupos de 5camundongos. 0 Grupo 1 foi imunizado com H3N2 em PBS nasemana 0 e H3N2 + α-GC 2 semanas mais tarde. 0 Grupo 2 foiimunizado com H3N2 + α-GC na semana 0 e H3N2 em PBS 2semanas mais tarde. 0 Grupo 3 foi imunizado com H3N2 em PBSna semana 0 e semana 2. 0 Grupo 4 foi imunizado com H3N2 eα-GC na semana 0 e 2 semanas mais tarde. 56 semanas após aimunização inicial, os camundongos em todos os grupos foramatacados com 3 pg de H3N2 em PBS, e a resposta de memóriafoi avaliada em 58 semanas. Todas as imunizações foram porvia intramuscular.
Figura 9: comparação da resposta de anticorpo de H3N2dos camundongos no grupo 3 da Figura 8 (imunizados duasvezes com H3N2 em PBS) com: A) as respostas em camundongosdo grupo 4 da Figura 8 (imunizados duas vezes com H3N2 emα-GC) ; B) a resposta de camundongos no grupo 1 da Figura 8(imunização com H3N2 em PBS e depois com H3N2 em α-GC) ; eC) as respostas em camundongos no grupo 2 da Figura 8(imunização com H3N2 em α-GC e depois com H3N2 em PBS). Nãohouve diferenças na meia-vida do anticorpo.
Figura 10: comparação da resposta de anticorpo de H3N2observada após: A) imunização duas vezes com α-GC (grupo 4)versus a-GC somente na segunda imunização (grupo 1) ; B)camundongos imunizados duas vezes com α-GC (grupo 4) versusα-GC somente na primeira imunização (grupo 2); e C)imunização com α-GC somente na primeira imunização (grupo2) versus imunização com α-GC somente na segunda imunização(grupo 1).
Figura 11: resposta de memória de camundongosimunizados, como descrito na Figura 8. Duas semanas apósuma imunização de reforço somente com H3N2 (dada na semana56), camundongos sensibilizados com uma ou duas doses de a-GC exibiram respostas de memória maiores do que oscamundongos sensibilizados com 2 doses somente de H3N2. Osdados são titulações de Ig de H3N2 (média geométrica) nassemanas 56 e 58.
Figura 12: foram determinadas as freqüências decélulas B de memória específicas para MenB no baço doscamundongos imunizados, como descrito na Figura 13.Freqüências maiores de células B de memória específicaspara MenB foram encontradas nos baços de camundongosimunizados com α-GC ou MF59, comparado com alume. 0 gráficomostra células B de memória de IgG específicas para MenBpor milhão de linfócitos B. * e **: p<0,05 e p<0,01 vs. Semadjuvante.
Figura 13: os camundongos foram imunizados com umamistura de 3 antígenos de MenB, AG287nz-953, 936-741 e 961c(20 pg/dose, 5 pg/dose ou 2,5 pg/dose de cada) misturadoscom 0,1 pg de α-GC, 0,6 mg de alume, 100 μΐ de MF59 ou semadjuvante. Uma série de três imunizações foi dada nos dias0, 21 e 35, e as titulações de IgG para cada antígeno foramavaliadas após cada imunização, até o dia 105. Tanto a-GCquanto MF59 induziram titulações maiores de anticorposbactericidas do que alume.
Figura 14: comparação da resposta de células T CD4contra antígenos recombinantes de MenB em camundongosimunizados por via intramuscular no dia 0 e 21 com: a) umavacina combinada contendo 3 antígenos de MenB e α-GC; b)uma vacina combinada contendo 3 antígenos de MenB e alume;ou c) com uma vacina combinada contendo somente 3 antígenosde MenB. A resposta de células T CD4 foi avaliada duassemanas após a segunda imunização por incubação deesplenócitos totais com a quantidade indicada de proteínasrecombinantes de MenB por 16 horas (as últimas 14 das quaisna presença de Brefeldina A). O número de células T CD4 queproduzem TNFa foi determinado por coloração intracelular eanálise FACS. Camundongos imunizados com combinação de trêsantígenos de MenB e α-GC exibiram consistentemente umaresposta de CD4 maior, comparados com camundongosimunizados com uma combinação de antígenos de MenB e alumeou sem adjuvante. Como controle positivo, foi testada aresposta de todos os três grupos de camundongos àestimulação policlonal. Todos os três grupos de camundongosmostraram a mesma resposta à estimulação policlonal com umanticorpo anti-CD3 (IaCD3), como mostrado no anexo daFigura. O eixo Y mostra células T CD4 que produzem TNFacomo uma percentagem de todas as células T CD4+.Figura 15: titulações (média geométrica). Comparaçãode titulações de IgGi IgGl e IgG2a em camundongosimunizados com antígenos de GBS. Camundongos imunizados com1 pg de GBS80 e α-GC mostraram titulaçõessignificativamente maiores de IgGl e IgG2a do quecamundongos imunizados com 1 pg de GBS80 isoladamente,enquanto camundongos imunizados com GBS8 0 em alume nãoapresentaram. Camundongos imunizados com 20 pg de GBS80 eα-GC mostraram titulações de IgGl equivalentes aoscamundongos imunizados com 2 0 μg de GBS8 0 e alume etitulações maiores de IgG2a. *, ** p<0,05, p<0,01 vs GBS80sem adjuvante.
Figura 16: os camundongos foram imunizados no dia 0 eno dia 21 com um de três antígenos de MenB (DG287nz-953,936-741 ou 961c) ou uma mistura de todos os três antígenosem combinação com: a) α-GC; b) Alume; ou c) sem adjuvante.Os níveis de anticorpos bactericidas contra as cepas deMenB MC58, 2996, H44/76 e NZ98/254 foram testados duassemanas após a segunda imunização e duas semanas após aterceira imunização. Os anticorpos bactericidas foramsignificativamente maiores quando a vacina combinada eraadministrada com α-GC como o adjuvante, comparado comalume. Todas as imunizações foram por via intramuscular.
Figura 17: freqüências de células B de memória no baçode mães imunizadas com GBS8 0. As freqüências de célulasplasmáticas que produzem anticorpos específicos para GBS80foram significativamente maiores em baços de mãesimunizadas com GBS 8 0 e α-GC do que nos baços de mãesimunizadas com GBS80 isoladamente ou com alume. 0 gráficomostra o número de células plasmáticas de IgG de GBS8 0 pormilhão de linfócitos B.
Figura 18: comparação de freqüências de célulasplasmáticas de mães imunizadas com GBS80 e α-GC e mãesimunizadas com GBS80 e alume. As freqüências de célulasplasmáticas foram significativamente maiores em mãesimunizadas com GBS8 0 e α-GC. 0 gráfico mostra o número decélulas plasmáticas de IgG de GBS8 0 por milhão delinfócitos B.
Figura 19: os camundongos foram imunizados com umamistura de 3 antígenos de MenB, AG287nz-953, 936-741 e 961c(20 pg/dose de cada) isoladamente, misturados com 0,1 pg deα-GC, ou misturados com 0,6 mg de alume. Uma série de trêsimunizações foi dada nos dias 0, 21 e 35, e as titulaçõesde IgG para cada antígeno foram avaliadas após cadaimunização. α-GC foi tão eficaz quanto alume no aumento daresposta de anticorpos para todos os três dos antígenos deMenB na vacina combinada. Todas as imunizações foram porvia intramuscular.
MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO
Informações adicionais em relação aos modos derealização da invenção podem ser encontradas na referência253 .
Exemplo 1: células NKT auxiliares ajudam nas respostas deanticorpo protetor in vivo e contribuem para a manutençãode memória de células BSumário
Células T natural killer invariantes (iNKT) restritaspor CDld são semelhantes a linfócitos inatos que reconhecemantígenos glicolipídicos como, por exemplo, a-
galactosilceramida (α-GC). Para investigar os efeitos dosistema imunológico inato sobre respostas imunológicasadaptativas in vivo, avaliamos se as células iNKTinfluenciavam características críticas da resposta deanticorpos tais como proteção contra infecções e memória decélulas B. Imunizamos camundongos com proteínas bacterianasou virais em combinação com α-GC e verificamos quecamundongos imunizados com proteínas e α-GC desenvolvemtitulações de anticorpos que são um a dois Iogs maiores doque titulações induzidas por proteínas isoladamente e, maisimportante, estão mais protegidos contra infecções como,por exemplo, influenza. Camundongos desprovidos de MHCclasse II não produzem anticorpos quando imunizados comproteínas e adjuvantes convencionais; no entanto, aimunização desses camundongos com proteínas e α-GC despertaIgG detectável específica para a proteína, o que demonstraque as células iNKT podem substituir parcialmente o auxíliode células B por células T CD4 + restritas à classe II.Finalmente, verificamos que camundongos imunizados comproteínas e α-GC possuem uma freqüência de células B dememória específicas para proteína que é maior do que afreqüência observada em camundongos imunizados somente comas proteínas. Além disso, camundongos desprovidos decélulas iNKT exibem uma queda das titulações de anticorposcirculantes que é mais rápida do que a queda observada emcamundongos do tipo selvagem, o que sugere uma influênciainesperada de células iNKT na expectativa de vida decélulas plasmáticas. Em conjunto, esses achados apontampara um papel importante das células iNKT na regulação daresposta de anticorpos e na manutenção da memória decélulas B in vivo.Resultados
A ativação de células iNKT aumenta a resposta de anticorposaos antígenos protêicos in vivo.
Demonstramos recentemente que células iNKT humanaspodem ajudar os linfócitos B a proliferar e a produzirimunoglobulinas in vitro. Para determinar a relevância invivo desse achado, imunizamos camundongos C57/BL6 comproteínas bacterianas (TT, toxóide tetânico ou DTi toxóidediftérico) ou virais (H3N2, a subunidade de hemaglutinina-neuroaminidase de cepas de influenza A) com ou sem oglicolipídeo específico para NKT, α-GC, e avaliamos astitulações séricas de anticorpos específicos para proteínaem vários pontos do tempo. A Figura IA mostra que, comtodos os antígenos, os camundongos imunizados com proteínase α-GC (caixas fechadas) exibiram titulações de anticorposum a dois Iogs maiores do que as titulações de camundongosimunizados somente com proteínas (caixas abertas). Foramobtidos resultados similares em camundongos BALB/c, CDl eC3H/HeJ (dados não mostrados).
Para provar que a atividade adjuvante de α-GC eracausada pela ativação de células iNKT, imunizamoscamundongos que possuem (Jal8+/+ e Jal8+/-) ou não possuem(Jal8-/-) células iNKT com as proteínas Flu H3N2, com ousem α-GC. Como mostrado na Figura IB, todos os camundongosimunizados somente com H3N2 (caixas abertas) desenvolveramrespostas de anticorpos comparáveis, independentemente dapresença de células iNKT. No entanto, a figura IB mostraque, quando a imunização é feita com H3N2 e α-GC (caixasfechadas), camundongos que abrigam células iNKT mostram umaumento significativo na titulação sérica de anticorposespecíficos para H3N2, enquanto camundongos desprovidos deiNKT não apresentam. Esses resultados foram reforçados peloachado (dados não mostrados) de que α-GC não apresentouatividade adjuvante em camundongos desprovidos de CDld (CDl-/-) , o elemento de restrição que apresenta α-GC aoreceptor de célula T das células iNKT.
Para comparar a atividade de α-GC com a de adjuvantesmais convencionais, os camundongos foram imunizados comdoses crescentes de TT dado isoladamente, com α-GC ou comuma dose ótima de um dos seguintes adjuvantes: CFA (um dosadjuvante mais fortes usados em camundongos [254]), CpG (umforte imunoestimulador ThO/Thl que é atualmente testado nohomem 255) , MF59 e Alume (dois adjuvantes licenciados parauso humano [256, 257], ambos considerados indutoresTh0/Th2). Como mostrado na figura 2A, α-GC é, no geral, tãopotente quanto os adjuvantes de referência acima no auxílioda produção de anticorpos IgGl e IgG2a.
Finalmente, avaliamos se as respostas de anticorposaos antígenos protéicos poderiam se desenvolver com oauxílio de linfócitos iNKT na ausência do auxílio de célulaT CD4 + convencional, uma situação em que os adjuvantesconvencionais não conseguem ajudar. Dessa forma, doisgrupos de camundongos C57BL/6 desprovidos de moléculas MHCda classe II (MHC-II -/-) foram imunizados duas vezes comH3N2, dado isoladamente ou com α-GC ou com Alume. Comoesperado, camundongos MHC-II -/- imunizados somente comH3N2 ou em Alume não apresentaram nenhum anticorpoespecífico para antígeno (figura 2B). Em vez disso,camundongos MHC-II -/- imunizados com H3N2 e α-GCdesenvolveram titulações detectáveis de anticorpo (IgG).Em conjunto, esses resultados demonstram que célulasiNKT ativadas in vivo por α-GC potencializam as respostasde anticorpos aos antígenos protéicos de uma formacomparável àquela de adjuvantes convencionais. Ao contráriodesses adjuvantes, α-GC não exige que linfócitos T CD4restritos à MHC classe II gerem uma resposta de anticorpos.
Células iNKT ajudam na imunidade
Tendo demonstrado que α-GC aumenta a resposta deanticorpos às proteínas do patógeno, investigamos aqualidade da resposta e perguntamos se esses anticorposseriam capazes de proteger contra infecções. Para essafinalidade, comparamos o efeito adjuvante de α-GC com o deMF59 (um adjuvante licenciado para uso humano com vacinasde Flu) em um modelo em camundongo de infecção pelo vírusinfluenza. Camundongos C57BL/6 adultos foram imunizados, nodia O e 15, com as proteínas HlNl (do vírus influenzahumano A/NewCaledonia/20/99) isoladamente, com α-GC ou comMF59. Duas semanas após a última imunização, os camundongosforam atacados com uma dose 90% letal (LD) do vírus A/WS/33Flu adaptado ao camundongo, e sua sobrevida foi acompanhadapor duas semanas. Como mostrado na figura 3A, um dia antesdo ataque, os camundongos imunizados com HlNl e α-GCpossuem titulações de anticorpos que são comparáveisàquelas de camundongos imunizados com HlNl e MF59 e que sãosignificativamente maiores do que titulações encontradas emcamundongos imunizados somente com a vacina de proteína.Além disso, a figura 3B mostra que, duas semanas após oataque, 80% dos camundongos imunizados com HlNl e α-GC, e100% de camundongos imunizados com proteínas e MF59,estavam vivos, enquanto apenas 10% dos camundongos queforam imunizados com a vacina baseada nas proteínasisoladamente ainda estavam vivos ao final do período deacompanhamento.
No conjunto, a partir desses resultados, concluímosque a ativação de célula iNKT dependente de α-GC podeaumentar a eficácia de vacinas contra doenças infecciosas.Mecanismo de células iNKT ajuda as células B
A seguir, examinamos os mecanismos que fazem com queas células iNKT ajudem as células B in vivo.
Em primeiro lugar, para investigar o papel dascitocinas, avaliamos o efeito adjuvante de α-GC, tanto emcamundongos C57BL/6 quanto em camundongos congênicosdesprovidos da citocina IL-4 ou do receptor para IFN-γ(IFN-yR) . A Figura 4A (painel da esquerda) mostra que, emcamundongos do tipo selvagem, a imunização com as proteínasflu H3N2 isoladamente (mostrada em branco) induziu umaresposta Th2, como indicado pela presença de IgGl e pelaausência de IgG2a, enquanto a imunização com proteína e a-GC despertou uma resposta ThO equilibrada, como demonstradopela presença tanto de IgGl quanto de IgG2a (mostrado empreto). O painel do meio da Figura 4A mostra quecamundongos desprovidos de IL-4 não apresentaram nenhumaresposta de anticorpos quando imunizados com a proteínaisoladamente, enquanto montaram uma resposta ThOequilibrada quando imunizados com proteína e α-GC (mostradoem preto). Finalmente, camundongos desprovidos de receptorde IFN-γ (Fig 4A, painel da direita) exibem uma respostaTh2 (anticorpos IgGl), quando imunizados somente com aproteína (mostrado em branco). Embora as titulações de IgGlaumentem significativamente em camundongos imunizados comproteína e α-GC (mostrado em preto) , não há aumento nosanticorpos IgG2a acima dos níveis de base. No conjunto,esses achados demonstram que IL-4 é individualmentedispensável para que as células iNKT dependentes de a-GCajudem os linfócitos B, enquanto IFN-γ é essencial para umefeito auxiliar equilibrado (ThO) das células iNKT.
Em segundo lugar, perguntamos se eram necessáriasinterações CD40/CD40L para o auxílio de células iNKTdependente de α-GC in vivo. Avaliamos, portanto, asrespostas de anticorpos ao H3N2 em camundongos tratados comquantidades de saturação de um mAb neutralizante anti-CD4 0L. Como mostrado na figura 4B, após imunização com H3N2e α-GC, os camundongos tratados com o mAb anti-CD40Lexibiram titulações de anticorpos de H3N2 que sãosignificativamente menores do que aquelas observadas emcamundongos tratados com IgG de controle.
α-GC aumenta as respostas de memória de anticorpos econtribui para manter a memória de células B.
Uma característica fundamental do sistema imunológicoadaptativo é a habilidade para montar uma resposta "dememória" mais rápida a um antígeno que ele encontroupreviamente. Para avaliar se o efeito adjuvante de α-GCinfluenciava as respostas de memória de anticorpos, oscamundongos foram imunizados duas vezes, na semana 0 e 2,somente com H3N2 ou com α-GC. Uma terceira imunização (dememória) somente com H3N2 foi então dada a todos oscamundongos na semana 30. A Figura 5A mostra que, emconcordância com os dados relatados na Figura 1, após asprimeiras duas doses, os camundongos imunizados com H3N2 eα-GC exibiram titulações de anticorpos significativamentemaiores do que as titulações de caraundongos que recebemH3N2 isoladamente. Os anticorpos específicos para H3N2caíram ao longo do tempo, alcançando os níveis de base emambos os grupos em torno da semana 30, quando todos oscamundongos receberam reforço com uma terceira imunizaçãosomente com H3N2. Duas semanas mais tarde, avaliamos asrespostas de anticorpos e verificamos que os camundongosque receberam proteína e α-GC nas primeiras duasimunizações exibiram titulações de anticorpos após aterceira imunização significativamente maiores do queaquelas de camundongos que foram imunizados em todas astrês imunizações somente com a proteína (figura 5A).Consistente com esses resultados, em um experimentoparalelo, verificamos que a freqüência de precursores decélulas que secretam H3N2-anticorpo (ASC) detectados nasemana 30 (imediatamente antes da terceira imunização) nobaço de camundongos imunizados duas vezes com H3N2 e a-GCera significativamente maior do que a freqüência observadano baço de camundongos imunizados duas vezes somente comH3N2 (figura 5B).
Para investigar ainda mais o papel das células iNKT naregulação da memória de células B, avaliamos a persistênciade anticorpos antígeno-específicos induzidos por umaproteína (H3N2) isoladamente nos soros de camundongos quepossuem (Jal8+/+ e Jal8+/-) ou que não possuem (Jal8-/-)células iNKT. Em todos os grupos de camundongos, astitulações de anticorpos antígeno-específicos alcançaramníveis de pico comparáveis duas semanas após a segundaimunização. No entanto, a figura 6 mostra que, embora emcamundongos que abrigam células iNKT os anticorposantígeno-específicos tenham decaído com uma taxa lentasimilar, a queda da titulação de anticorpos em camundongosdesprovidos de células iNKT foi significativamente maisrápida. Como nenhum desses camundongos recebeu α-GC,concluímos que algum nível de atividade "espontânea" deiNKT pode influenciar a meia-vida dos anticorposcirculantes.
No conjunto, esses achados demonstram que a ativaçãode células iNKT resulta em uma resposta de anticorpos maiora uma imunização de memória e que isso ocorre emconseqüência de uma expansão aumentada do pool de células Bde memória antígeno-específicas. Além disso, a atividadeespontânea de iNKT in vivo parece ter um papel homeostáticona manutenção dos níveis circulantes de anticorpos.
Exemplo 2: a sensibilização com α-GalCer na ausência de umreforço aumenta significativamente a resposta de anticorpos
Como discutido acima, a freqüência de Precursores decélulas que secretam H3N2-anticorpo (ASC) (ou seja, célulasB de memória) detectada na semana 3 0 (imediatamente antesda terceira imunização) no baço de camundongos imunizados
duas vezes com H3N2 e α-GC foi significativamente maior doque a freqüência observada no baço de camundongosimunizados duas vezes somente com H3N2 (Figura 5B).
Foram obtidos resultados similares em experimentosefetuados em camundongos imunizados com toxóide tetânico(Figura 7 e 18). A Figura 7 mostra a freqüência deprecursores de ASC em camundongos C57BL/6, 6 semanas após aúltima das duas imunizações no dia 0 e no dia 14 comtoxóide tetânico sem adjuvante, com adjuvante de α-GC oucom adjuvante de alume. O uso de α-GC como adjuvanteaumentou significativamente a freqüência de precursores deASC, comparado com o uso de um adjuvante de alume. Da mesmaforma, a Figura 18 mostra que a freqüência de precursoresde ASC em camundongos CDl foi significativamente maior trêsmeses após a última das duas imunizações com GBS80 e a-GC,comparada com imunizações com GBS80 e alume.
A habilidade de α-GC para aumentar significativamentea freqüência de células B de memória, comparada com alume,quando administrada como adjuvante em uma série de duasimunizações, sugeriu que α-GC talvez seja capaz de induzirum aumento nas células B de memória especificas, quandousada como adjuvante em uma única imunização. Portanto, foirealizado um experimento para avaliar o efeito de uma doseúnica de α-GC e de antigeno H3N2 sobre o pool específico decélulas B de memória (Figuras 8-11).
A Figura 8 mostra o esquema de imunização usado noexperimento. Vinte fêmeas de camundongos C57BL/6, com idadede 68 semanas, foram divididas em 4 grupos de 5camundongos. 0 Grupo 1 foi imunizado com H3N2 em PBS nasemana 0 e H3N2 + α-GC 2 semanas mais tarde. O Grupo 2 foiimunizado com H3N2 + α-GC na semana 0 e H3N2 em PBS 2semanas mais tarde. O Grupo 3 foi imunizado com H3N2 em PBSna semana 0 e na semana 2. O Grupo 4 foi imunizado com H3N2e α-GC na semana 0 e 2 semanas mais tarde. 5 6 semanas apósa imunização inicial, os camundongos em todos os gruposforam atacados com 3 pg de H3N2 em PBS. Todas asimunizações foram por via intramuscular.
A Figura 9 compara a resposta de anticorpo de H3N2 doscamundongos no grupo 3 (imunizados com H3N2 em PBS) com asrespostas nos camundongos imunizados com α-GC em ambas asimunizações (painel A), α-GC somente na primeira imunização(painel B) e α-GC somente na segunda imunização (painel C).Verificou-se que α-GC aumenta a resposta de anticorpos, atémesmo quando dados apenas na primeira ou segundaimunização. Não foram observadas diferenças na meia-vida doanticorpo entre os quatro grupos.
A Figura 10 fornece comparações pareadas da respostade anticorpos observada após: A) imunização duas vezes comα-GC versus α-GC somente na segunda imunização; B)camundongos imunizados duas vezes com α-GC vs α-GC somentena primeira imunização; e C) imunização com α-GC C somentena primeira imunização versus imunização com α-GC somentena segunda imunização. A eficácia máxima foi observadaquando α-GC foi dada na primeira dose de vacina. Ofornecimento de α-GC na primeira dose de vacina produziuuma resposta de anticorpos elevada em relação ao seufornecimento na segunda dose da vacina (Figura 10C) , e aresposta de anticorpos quando α-GC era fornecida naprimeira dose de vacina foi similar à resposta obtidaquando α-GC era fornecida em ambas as doses de vacina(Figura 10B).
A Figura 11 confirma que camundongos sensibilizadoscom α-GC exibem uma resposta de memória elevada àvacinação, mesmo se a α-GC só for incluída na primeira ouna segunda dose de duas injeções de sensibilização. Essesresultados sugerem que a inclusão de α-GC como adjuvante emcomposições de vacina pode reduzir o número de imunizaçõesde sensibilização necessárias para se obter memóriaimunológica de longo prazo e reduzir a freqüência e onúmero de imunizações de reforço.Exemplo 3: α-GC alimenta as respostas protetoras deanticorpos em um modelo em camundongo de sépsis neonatalinduzida por Streptococcus agalatiae
α-GC foi testada quanto à sua habilidade para aumentaras respostas protetoras de anticorpos em um modelo decamundongo de sépsis neonatal induzida por infecção porStreptococcus agalactiae.
As fêmeas de camundongos foram divididas em 3 grupos.0 Grupo 1 foi sensibilizado no dia 0 com 20 pg de GBS80 naausência de adjuvante, e reforçado no dia 21 com a mesmacomposição. Os camundongos acasalaram no dia 23 e foramsangrados nos dias 43-36 para permitir a avaliação dastitulações de IgG de GBS8 0, antes da nascimento da prole nodia 50-53. A prole foi atacada com uma dose 90% letal de S.agalactiae 0-48 horas após o nascimento. Três meses após adose de reforço, as mães foram sacrificadas, os baços foramremovidos e as freqüências de precursor de célulaplasmática GBS80-IgG foram avaliadas. O mesmo esquema deimunização foi seguido para os grupos 2 e 3, exceto que oscamundongos no grupo 2 foram sensibilizados e reforçadoscom GBS 8 0 e alume, e os camundongos no grupo 3 foramsensibilizados e reforçados com GBS80 e 0,1 pg de α-GC.
Os resultados foram os seguintes:
<table>table see original document page 80</column></row><table>** ρ<0,01 vs GBS-80; § ρ<0,001 vs GBS-80 em Alume
Dessa forma, ο uso de α-GC como adjuvante induziu umaresposta de IgG de GBS8 0 nas mães que foi 8 vezes maior doque a resposta de IgG induzida por alume. A resposta deanticorpos maior na mãe resultou em uma proteção aumentadade sua prole contra a infecção por GBS. 70% da prole da mãeimunizada com GBS8 0 e α-GC sobreviveu ao ataque com S.galactiae, comparados com apenas 3 0% da prole de mãesimunizadas com GBS80 e alume.O experimento foi repetido com os camundongos sendo
imunizados com 20 pg ou 1 pg de GBS80. Todos os camundongosforam sensibilizados no dia 0, reforçados no dia 20,acasalados no dia 34 e sangrados no dia 48, antes danascimento da prole nos dias 54-58. A prole foiimediatamente atacada com uma dose 90% letal de S.agalactiae, e a sobrevida foi avaliada em 48 horas. As mãesforam sacrificadas 3 meses após o reforço, e os baços foramremovidos para avaliação das freqüências de precursor decélula plasmática GBS8 0-IgG. Os camundongos foramimunizados com: 1 pg de GBS80 com alume, α-GC ou semadjuvante; 20 pg de GBS8 0 com alume, α-GC ou sem adjuvante;ou com PBS ou adjuvante de alume isoladamente.
Como mostrado na Figura 15, os camundongos imunizadoscom 1 pg de GBS8 0 e α-GC apresentaram titulaçõessignificativamente maiores de IgGl e IgG2a do quecamundongos imunizados com 1 pg de GBS80 e alume. Oscamundongos imunizados com 20 pg de GBS80 e α-GC mostraramtitulações de IgGl equivalentes aos camundongos imunizadoscom 20 pg de GBS80 e alume, e titulações maiores de IgG2a.
Os resultados foram os seguintes:<table>table see original document page 82</column></row><table>
Teste de Fischer one-tail: * p<0,05 vs GBS80 sem adjuvante
Dessa forma, o % de sobrevida em camundongosimunizados com GBS80 e α-GC foi equivalente à sobrevida emcamundongos imunizados com GBS80 e alume.
Os baços de mães imunizadas com GBS80 e α-GC tambémcontinham freqüências significativamente maiores de célulasplasmáticas de IgG de GBS8 0 e células B de memória (figuras17 e 18, respectivamente). As freqüências de Célulasplasmáticas GBS80-especificas e células B de memória foramdeterminadas avaliando-se a presença de anticorposespecíficos para GBS80 em sobrenadantes de 10 dias deculturas de diluição limitante de esplenócitos incubadossomente em meio ou na presença de CpG e IL-2, como descritona referência 258.
Em um experimento adicional, fêmeas prenhas decamundongos CDl foram imunizadas com PBS, GBS8 0, GBS80 +Alume ou GBS8 0 + α-GC. Os soros coletados uma semana antesdo parto de cada grupo de fêmeas CDl imunizadas, ou defêmeas CDl virgens, foram reunidos em pool e injetados porvia subcutânea (30/dose, em um volume final de 20 μΐ) emneonatos com 24 horas de idade nascidos de mães CDlvirgens. Após 3 horas, todos os neonatos foram atacados porvia intraperitoneal com 1 LD90 de Streptococcus agalactiaevivo. A sobrevida dos filhotes foi acompanhada por 2 dias.Os filhotes imunizados com soros de mães imunizadas comGBS80 também morreram (28 filhotes em 28) , e apenas 1 dos27 filhotes imunizados com soros de mães imunizadas com PBSsobreviveu. A presença de adjuvantes (alume ou a-GC)aumentou a sobrevida, com a imunização com α-GC sendo maiseficaz do que alume no aumento da sobrevida. A sobrevida defilhotes imunizados com soros de mães imunizadas com GBS +α-GC foi 165% maior do que a sobrevida de filhotesimunizados com soros de mães imunizadas com GBS + alume.
Esses dados demonstram que α-GC é, de formasurpreendente, significativamente mais eficaz do que alumena indução de uma resposta imunológica protetora ao S.agalactiae.
Exemplo 4: α-GC aumenta a resposta de anticorpos ã vacinacombinada que contém vários antígenos protéicos dosorogrupo B de N. meningitidis
Foi avaliada a habilidade de α-GC para atuar comoadjuvante para combinações de antígenos de antígenos dosorogrupo B de N. meningitidis (MenB).
Os camundongos foram imunizados com uma mistura de 3antígenos de MenB, AG287nz-953, 936-741 e 961c (20 pg/dosede cada) misturados com 0,1 pg de α-GC, ou misturados com0,6 mg de alume. Uma série de três imunizações foi dada nosdias 0, 21 e 35, e as titulações de IgG para cada antígenoforam avaliadas após cada imunização. Como mostrado naFigura 19, α-GC foi tão eficaz quanto alume no aumento daresposta de anticorpos para todos os três dos antígenos deMenB na vacina combinada.
α-GC também aumentou a resposta bactericida a essesantígenos. A Figura 16 compara as respostas de anticorposbactericidas às cepas de MenB MC58, 2996, H44/76 e NZ98/254em amostras de soro de camundongos imunizados com umamistura dos 3 antígenos de MenB AG287nz-953, 936-741 e961c, ou com cada um desses antígenos individualmente emcombinação com alume, α-GC ou sem adjuvante. As respostasbactericidas à imunização com antígenos de MenB e α-GCforam consistentemente maiores do que a resposta àimunização com antígenos de MenB e alume.
Foi realizado um segundo experimento para avaliar aresposta de células T CD4 ex vivo aos antígenos de MenB.Grupos de 6 fêmeas de camundongos CDl foram imunizados duasvezes com a mistura de antígenos de MenB, formulada em PBS1alume ou α-GC. Dez dias após a segunda imunização, 3camundongos/grupo foram sacrificados, e seus baços foramremovidos. Suspensões de esplenócitos inteiros decamundongos individuais foram cultivadas com os antígenos
de MenB por 16 horas, das quais as últimas 12 foram napresença de brefeldina A para permitir o acúmulointracelular de citocinas. Os esplenócitos estimuladosforam fixados, permeabilizados e corados com anticorposmonoclonais anti-CD3, anti-Cd4, anti-CD69, anti-IFNg eanti-TNFa. As percentagens de células
CD3+CD4+CD69+citocina+ na população total de células CD4+foram determinadas por análise FACS.
Os resultados são mostrados na Figura 14. Verificou-seque α-GC era mais eficaz do que alume na expansão de
células T CD4 que produzem TNFa em resposta aos antígenosde MenBi demonstrando que α-GC é capaz de induzir umaresposta imunológica mediada por células aos antígenos deMenB que é pelo menos equivalente ao alume. Como controlepositivo, foi testada a resposta de todos os três grupos decamundongos à estimulação policlonal. Todos os três gruposde camundongos mostraram a mesma resposta à estimulaçãopoliclonal com um anticorpo anti-CD3 (IaCD3), como mostradono anexo da Figura 14.
Foi efetuado um experimento adicional para avaliar ahabilidade de α-GC para atuar como adjuvante para os mesmostrês antigenos de MenB, comparada com alume ou MF59. Oscamundongos foram imunizados com uma mistura de 3 antigenosde MenB, AG287nz-953, 936-741 e 961c (20 μg/dose, 5 μg/doseou 2,5 μg/dose de cada), misturados com 0,1 μg de α-GC, 0,6mg de alume, 100 μΐ de MF59 ou sem adjuvante. Uma série detrês imunizações foi dada nos dias 0, 21 e 35, e astitulações de IgG para cada antigeno foram avaliadas apóscada imunização. Como mostrado na Figura 13, tanto α-GCquanto MF5 9 induziram titulações de anticorpos bactericidasmaiores do que alume. As freqüências de células B dememória específicas para MenB no baço dos camundongosimunizados também foram determinadas. Como mostrado naFigura 12, freqüências maiores de células B de memóriaespecíficas para MenB foram encontradas nos baços decamundongos imunizados com α-GC ou MF59, comparado comalume. Esses dados mostram que α-GC é mais eficaz do quealume e tão eficaz quanto MF59 na indução de uma respostaimunológica bactericida contra antígenos de MenB e naindução de células B de memória específicas para MenBnecessárias para a memória imunológica de longo prazo.Será subentendido que a invenção foi descrita apenascomo forma de exemplo, e que podem ser feitas modificaçõesde detalhes, sem se afastar do espirito e do escopo dainvenção.
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Claims (41)

1. Composição caracterizada por compreender: a) umligante CDld; e b) um antígeno do grupo streptococcus B.
2. Composição caracterizada por compreender: a) umligante CDld; e b) um antígeno de Neisseria meningitidis.
3. Composição caracterizada por compreender: a) umligante CDld; e b) um antígeno do virus da gripe.
4. Ligante CDld e antígeno do grupo streptococcusB caracterizado por ser para uso na medicina.
5. Ligante CDld e antígeno de Neisseriameningitidis caracterizado por ser para uso na medicina.
6. Ligante CDld e antígeno do virus da gripecaracterizado por ser para uso na medicina.
7. Método de suscitar uma resposta imune em umpaciente, caracterizado por compreender administrar a umpaciente um ligante CDld e um antígeno do grupostreptococcus B.
8. Método de suscitar uma resposta imune em umpaciente, caracterizado por compreender administrar a umpaciente um ligante CDld e um antígeno de Neisseriameningitidis.
9. Método de suscitar uma resposta imune em umpaciente, caracterizado por compreender administrar a umpaciente um ligante CDld e um antígeno do virus da gripe.
10. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 7-9, caracterizado pelo fato de que oantígeno e o ligante CDld são administradossimultaneamente, seqüencialmente ou separadamente.
11. Uso de um antígeno do grupo streptococcus B,de um antígeno de Neisseria meningitidis ou de um antígenodo virus da gripe caracterizado por ser para suscitar umaresposta imune em um paciente, onde o antígeno éadministrado com um ligante CDld.
12. Uso de um ligante CDld caracterizado por serpara suscitar uma resposta imune em um paciente, onde oligante CDld é administrado com um antígeno do grupostreptococcus B, um antígeno de Neisseria meningitidis ouum antígeno do virus da gripe.
13. Uso de a) um antígeno do grupo streptococcusB, um antígeno de Neisseria meningitidis ou um antígeno dovirus da gripe; e b) um ligante CDld caracterizado por serpara levantar uma resposta imune em um paciente.
14. Uso de um antígeno do grupo streptococcus B,de um antígeno de Neisseria meningitidis ou de um antígenodo virus da gripe caracterizado por ser para levantar umaresposta imune em um paciente, onde o paciente foi pre-tratado com um ligante CDld.
15. Uso de um ligante CDld caracterizado por serpara levantar uma resposta imune em um paciente, onde opaciente foi pre-tratado com um antígeno do grupostreptococcus B, um antígeno de Neisseria meningitidis ouum antígeno do virus da gripe.
16. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 7-15, caracterizado pelo fato de que aquantidade de ligante CDld administrada ao paciente é menosque 10 pg/kg do peso do corpo do paciente.
17. Kit caracterizado por compreender: (a) umantígeno do grupo streptococcus B, um antígeno de Neisseriameningitidis ou um antígeno do virus da gripe; e (b) umligante CDld.
18. Método de induzir a memória imunológica alongo prazo a um antigeno em um paciente em necessidadedisso caracterizado por compreender administrar a pacienteuma composição que compreende:a) o antigeno; eb) um ligante CDld,tal que o número e/ou a freqüência das doses dacomposição necessária para que o paciente seja capazes delevantar uma resposta imune ao antigeno subseqüente daexposição estivessem reduzidos comparou ã administração doantigeno na ausência de um ligante CDld.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que o número e/ou a freqüênciadas doses da composição necessária para que o paciente sejacapazes de levantar uma resposta imune protetora aoantigeno subseqüente da exposição são reduzidos comparou àadministração do antigeno na ausência de um ligante CDld.
20. Método, que concorda a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que o número de doses dacomposição necessária para que o paciente seja capaz delevantar uma resposta imune protetora ao antigenosubseqüente da exposição é reduzido comparou àadministração do antigeno na ausência de um ligante CDld.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que o número de doses exigidaspara induzir uma resposta imune protetora é reduzido a umaúnica dose da escorva.
22. Método, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que a freqüência de doses deimpulsionador da composição necessária para que o pacienteseja capaz de levantar uma resposta imune protetora aoantígeno subseqüente da exposição é reduzida comparou àadministração do antígeno na ausência de um ligante CDld.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que as doses de impulsionadorsão administradas em intervalos de mais de um ano.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que a exigência para doses deimpulsionador é eliminada completamente.
25. Método de induzir uma resposta imune deencontro a um antígeno em um paciente caracterizado pelofato de que compreende a administração ao paciente:a) o antígeno; eb) um ligante CDld,onde o antígeno e um ligante CDld eram pacientepreviamente igualmente administrado mais de um ano.
26. Uso de um antígeno e de um ligante CDldcaracterizado pelo fato de ser para induzir uma respostaimune em um paciente, onde o antígeno e um ligante CDlderam paciente previamente igualmente administrado mais de1 ano.
27. Método, de acordo com a reivindicação 25, ouuso, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelofato de que a resposta imune é uma resposta imuneprotetora.
28. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 25-27, caracterizado pelo fato de que oantígeno e um ligante de CDld são administradossimultaneamente, seqüencialmente ou separadamente.
29. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 18-28, caracterizado pelo fato de que aquantidade de ligante CDld administrada a paciente é menosque 10 pg/kg do peso do corpo do paciente.
30. Método de induzir uma resposta imune deencontro a um antigeno em um paciente caracterizado pelofato de que compreende a administração ao paciente:a) o antigeno; eb) um ligante CDld,onde a quantidade de ligante de CDld incluída nacomposição é menos de 10 pg/kg do peso do corpo dopaciente.
31. Uso de um antigeno e de um ligante CDldcaracterizado pelo fato de ser para induzir uma respostaimune em um paciente, onde a quantidade de ligante CDld émenos de 10 pg/kg do peso do corpo do paciente.
32. Método ou uso, de acordo com a reivindicação-30 ou 31, caracterizado pelo fato de que a resposta imune éuma resposta imune protetora.
33. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 30-32, caracterizado pelo fato de que oligante CDld e o antigeno são administradossimultaneamente, seqüencialmente ou separadamente.
34. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-33, caracterizado pelo fato de que oantigeno é um antigeno do sacárido conjugado a uma proteínade portador.
35. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-34, caracterizado pelo fato de que oantigeno é um antigeno da proteína.
36. Método, uso, composição ou kit, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1-35, caracterizado pelofato de que o ligante CDld ativa células invariant de NKT.
37. Método, uso, composição ou kit, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1-36, caracterizado pelofato de que o ligante CDld aumenta os níveis de IFN-γ, IL-4e IL 13 segregaram pelas células invariant de NKTcomparadas aos níveis de IFN-γ, de IL-4 e de IL 13segregados por células invariant de NKT na ausência doligante de CDld.
38. Método, uso, composição ou kit, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1-37, caracterizado pelofato de que o ligante CDld é um glicolipídeo.
39. Método, uso, composição ou kit, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1-38, caracterizado pelofato de que o ligante CDld é um α-glicosilceramida.
40. Método, uso, composição ou kit, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1-39, caracterizado pelofato de que o ligante CDld é galactosilceramida do a- ou umanálogo dele.
41. Método, uso, composição ou kit, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1-4 0, caracterizado pelofato de que o ligante CDld é um análogo da a-galactosilceramida selecionado de KRN7000, de OCH ou deCRONY-101.
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