BRPI0709176A2 - biomarcadores úteis para diagnosticar o cáncer de próstata e seus métodos - Google Patents

Abstract

BIOMARCADORES úTEIS PARA DIAGNOSTICAR O CáNCER DE PRóSTATA, E SEUS MéTODOS. A presente invenção descreve um método para prever um indicativo de estado saudável da presença de câncer de próstata. O método mede as intensidades de pequenas e especificas biomoléculas, denominadas metabólitos, em uma amostra de sangue de um paciente com um estado indeterminado de saúde, e compara essas intensidades com as intensidades observadas em uma população de individuos saudáveis e/ou com as intensidades previamente observadas em uma população de indivíduos com câncer de próstata positivo confirmado, O método permite determinar a probabilidade de um paciente selecionado ser positivo para câncer de próstata.

Description

BIOMARCADORES ÚTEIS PARA. DIAGNOSTICAR O CÂNCER DE PRÓSTATA,

E SEUS MÉTODOS

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a pequenas moléculas oumetabólitos que se descobriu terem abundâncias ouintensidades significativamente diferentes entre pacientesclinicamente diagnosticados positivos para câncer depróstata e pacientes normais. A presente invenção também serefere a métodos para diagnosticar o câncer de próstata, ouo risco de desenvolver câncer de próstata.ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O câncer de próstata afetará um em cada seis homensdurante a vida, com mais de 200.000 diagnósticos e 30.000óbitos por ano somente nos EUA (1) . É a segunda principalcausa de mortalidade devido ao câncer em homens. Os atuaismétodos de investigação para câncer de próstata incluem oteste de antigeno próstata-especifico (PSA), que detecta osníveis de antigenos próstata-especificos em uma amostra desangue, e o exame retal digital (DRE). Apesar de 60 a 70%de homens em risco nos EUA passarem por exames de PSA desdeque o teste foi adotado, as taxas de mortalidade por câncerde próstata foram reduzidas apenas ligeiramente. Isso sedeve em grande parte a duas razões: 1) o fato de que oteste de PSA não consegue identificar um subconjunto decânceres agressivos, e 2) que apenas cerca de 30% doshomens com um teste de PSA positivo tem uma biópsiapositiva. O diagnóstico é ainda mais complicado pelo fatode que de todos os homens tratados com câncer de próstata,cerca de 25% têm recorrência da doença e requeremtratamento adicional, enquanto que em outros casos algunstumores nunca chegam a progredir e é melhor que sejamdeixados sem tratamento. Conseqüentemente, um problemachave em relação ao diagnóstico do câncer de próstata hojeem dia é a incapacidade de se prever o curso da doença. Emconjunto, essas estatísticas tornaram o exame de próstatacom métodos convencionais um problema controverso. Osbiomarcadores ideais de câncer de próstata seriamconseqüentemente adequados para uma detecção prematura, bemcomo teriam a capacidade de prever a agressividade dadoença e idealmente ser capaz de monitorar a progressão dadoença durante a terapia ou pós-cirurgia.

Atualmente, o PSA é reconhecido como o melhor marcadorde soro disponível para câncer de próstata, entretantoexiste um espaço substancial para um aprimoramento. 0impacto do exame de PSA, começando no início da década de1990, pode ser visto pela redução dos números de homensdiagnosticados com metástase, juntamente com uma reduçãogeral da mortalidade (2). No entanto, isso pode ser devidoao fato de que o teste de PSA aumentou a conscientização docâncer de próstata, o que em última instância estimulou aanálise de mais biópsias. Calcular as características dedesempenho (sensibilidade e especificidade) do teste de PSAé difícil por causa da diferença da incidência relacionadaà etnia, e que na maioria dos estudos, a percentagem debiópsias realizadas é mais alta do que seria normalmenterealizada na prática clínica. No Prostate Câncer PreventionTrial (PCPT) (3), o índice de falso-negativo para adetecção de tumores de alto grau foi de pelo menos 15%, comum índice de falso-positivo de 70% (i.e., apenas 30% doshomens com PSA elevado tem uma biópsia positiva) . Em outroestudo, o Physician's Health Study (4), a sensibilidadepara câncer agressivo durante um período de quatro anos foide 87%, mas caiu para 53% para cânceres não-agressivos.Muitos outros estudos tem sido realizados para avaliar asensibilidade do PSA, mas as últimas descobertas afirmamser a sensibilidade em geral de no máximo 75% (5). Reduziro início do PSA detectaria mais cânceres, mas ao custo demais falso-positivos e conseqüentemente mais biópsias. Paracomplicar ainda mais, parece que devido à crescenteprevalência da hiperplasia prostática benigna (BPH) napopulação masculina mais idosa, a sensibilidade do teste dePSA com um ponto de corte de 4ng/ml diminui com a idade.

o PSA sozinho não pode diagnosticar o câncer depróstata. O diagnóstico é um processo complexo que envolvea integração dos resultados de um exame físico, um testePSA, a graduação Gleason (avaliando a arquitetura glandularem biópsia) e possivelmente outros testes laboratoriais.

Está claro que existe uma necessidade para aprimorar adetecção do câncer de próstata. Um teste que seja capaz dedetectar o risco de, ou a presença de câncer de próstata ouque possa prever a doença agressiva com alta especificidadee sensibilidade seria muito benéfico e causaria impacto naincidência do câncer de próstata. A invenção reivindicadadescreve a descoberta de moléculas presentes em amostras desoro que mostram um padrão diferencial de abundancias entrepacientes com câncer de próstata e indivíduos normais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOA presente invenção se refere a pequenas moléculas oumetabólitos que se descobriu terem abundancias ouintensidades significativamente diferentes entre pacientesclinicamente diagnosticados positivos para câncer depróstata e pacientes normais. A presente invenção também serefere a métodos para diagnosticar o câncer de próstata, ouo risco de desenvolver câncer de próstata.

A presente invenção fornece um método paraidentificar, validar, e implementar uma análise defiltragem de alta capacidade (HTS) para o diagnóstico de umestado de saúde indicativo de câncer de próstata. Em umdeterminado exemplo, o método abrange a análise de amostrasbiológicas câncer de próstata-positivas e normaisutilizando tecnologia FTMS não-direcionada para identificartodos os aspectos de metabólitos estatisticamentesignificativos que diferem entre amostras biológicasnormais e câncer de próstata-positivas, seguido pelaseleção do subconjunto de aspectos ótimo utilizandoestatísticas e propriedades químicas das moléculas, e acaracterização do conjunto de aspectos utilizando métodosincluindo, mas não limitada a, separação cromatográfica,espectrometria de massa (MS/MS), e ressonância magnéticanuclear (NMR), com o objetivo de:

1) separar e identificar tempos de retenção dosmetabólitos;

2) produzir padrões descritivos de fragmentação MS/MSespecíficos para cada metabólito;

3) caracterização de estruturas moleculares; e4) desenvolver um ensaio de diagnóstico baseado emMS/MS quantitativo ou semi-quantitativo de alto rendimento.

A presente invenção também fornece um método para odiagnóstico de câncer de próstata ou do risco dedesenvolver câncer de próstata em humanos medindo os niveisde pequenas moléculas especificas presentes em uma amostrae comparando-os a niveis de referência normais. 0 métodomede as intensidades de pequenas moléculas especificas,também chamadas de metabólitos, na amostra de um paciente ecompara essas intensidades com as intensidades observadasem uma população de indivíduos saudáveis.

A presente invenção fornece um método para identificarum ou mais de um marcador de metabólito para diagnosticar ocâncer de próstata, compreendendo as etapas de:

(a) introduzir uma ou mais de uma amostra de um oumais de um paciente com câncer de próstata, dita amostracontendo uma pluralidade de metabólitos, em umespectrômetro de massa de alta resolução;

(b) obter dados quantificados para os metabólitos;

(c) criar um banco de dados dos ditos dadosquantificados ;

(d) comparar os dados identificados e quantificados daamostra com os dados correspondentes de uma amostra de umaou mais de uma amostra de referencia; e

(e) identificar um ou mais de um marcador demetabólito que difere entre a dita amostra e a dita uma oumais de uma amostra de referência.

Os marcadores de metabólitos são selecionados dosmetabólitos listados na Tabela 1, ou qualquer combinaçãodeles. O método pode ainda compreender selecionar um númeromínimo de marcadores de metabólitos necessários para umdiagnóstico ótimo. 0 espectrômetro de massa de altaresolução pode ser um Espectrômetro de Massa de RessonânciaCiclotrônica de íon com transformada de Fourier (FTMS).

A presente invenção também fornece um método paradiagnosticar câncer de próstata ou o risco de câncer depróstata em um paciente, o método compreendendo as etapasde:

(a) obter uma amostra do dito paciente;

(b) analisar a dita amostra para obter dadosquantificados para um ou mais de um marcador de metabólito;

(c) comparar os dados quantificados para o dito um oumais de um marcador de metabólito com os dadoscorrespondentes obtidos de uma ou mais de uma amostra dereferencia; e

(d) utilizar a dita comparação para diagnosticardiferencialmente o câncer de próstata ou o risco de câncerde próstata.

0 um ou mais de um marcador de metabólito éselecionado entre os metabólitos listados na Tabela 1, ouqualquer combinação deles. 0 método de diagnóstico acimapode compreender analisar a amostra por espectrometria demassa de cromatografia líquida (LC-MS) na etapa b) .

Alternativamente, quando o método é um método de altorendimento, a etapa b) pode compreender analisar a amostratanto por cromatografia líquida quanto por injeção diretaseguida por espectrometria de massa em tandem de íon-traplinear.No método como descrito acima, a amostra ou mais deuma amostra de referencia pode ser uma pluralidade deamostras obtidas de indivíduos controle; uma ou mais de umaamostra de base obtida do paciente em uma data anterior; ouuma combinação deles.

Em outra representação da presente invenção, éfornecido um método para diagnosticar câncer de próstata ouo risco de câncer de próstata em um paciente, o métodocompreendendo as etapas de:

(a) obter uma amostra do dito paciente;

(b) analisar a dita amostra para obter dadosquantificados para um ou mais de um marcador de metabólito;

(c) obter um índice para cada um ou mais de ummarcador de metabólito em relação a um metabólito decontrole interno;

(d) comparar cada índice do dito um ou mais de ummarcador de metabólito em relação ao metabólito de controleinterno com os dados correspondentes obtidos de uma ou maisde uma amostra de referencia; e

(e) utilizar a dita comparação para diagnosticar ocâncer de próstata ou o risco de câncer de próstata.

O método de diagnóstico acima pode compreender um oumais de um marcador de metabólito selecionado entre osmetabólitos listados na Tabela 1, ou qualquer combinaçãodeles. O método de diagnóstico acima pode compreenderanalisar a amostra por espectrometria de massa decromatografia líquida (LC-MS) na etapa b) .

Alternativamente, quando o método é um método de altorendimento, a etapa b) pode compreender analisar a amostratanto por injeção direta quanto por cromatografia liquida eespectrometria de massa em tandem de ion-trap linear.

No método descrito acima, a amostra ou mais de umaamostra de referencia pode ser uma pluralidade de amostrasobtidas de indivíduos controle; uma ou mais de uma amostrade base obtida do paciente em uma data anterior; ou umacombinação delas.

A presente invenção ainda fornece um método paraavaliar a eficácia de uma terapia para tratar o câncer depróstata em um paciente, compreendendo:

(a) obter uma amostra do dito paciente;

(b) analisar a dita amostra para obter dadosquantificados para um ou mais de um marcador de metabólito;

(c) comparar os ditos dados quantificados com os dadoscorrespondentes obtidos de uma ou mais de uma amostra dereferencia; e

(d) utilizar a dita comparação para determinar se aterapia está melhorando o estado de saúde do paciente,

no qual o um ou mais de um marcador de metabólito éselecionado entre os metabólitos listados na Tabela 1, ouqualquer combinação deles. 0 método de diagnóstico acimapode compreender analisar a amostra por espectrometria demassa de cromatografia liquida (LC-MS) na etapa b).

Alternativamente, quando o método for um método de altorendimento, a etapa b) pode compreender analisar a amostrapor injeção direta ou cromatografia liquida eespectrometria de massa em tandem de ion-trap linear.

No método descrito acima, a uma ou mais de uma amostrade referência pode ser uma pluralidade de amostras obtidasde indivíduos controle; uma ou mais de uma amostra de basepré-terapia obtida de um paciente; ou uma combinação delas.

Ainda em outra representação da presente invenção, éfornecido um método para avaliar a eficácia de uma terapiapara tratar o câncer de próstata em um paciente,compreendendo:

(a) obter uma amostra do dito paciente;

(b) analisar a dita amostra para obter dadosquantificados para um ou mais de um marcador de metabólito;

(c) obter um índice para cada um ou mais de ummarcador de metabólito em relação a um metabólito decontrole interno;

(d) comparar cada índice do dito um ou mais demarcador de metabólito em relação ao metabólito de controleinterno com os dados correspondentes obtidos de uma ou maisde uma amostra de referencia; e

(e) utilizar a dita comparação para determinar se aterapia está melhorando o estado de saúde do paciente,

no qual o um ou mais de um marcador de metabólito éselecionado entre os metabólitos listados na Tabela 1, ouqualquer combinação deles. O método de diagnostico acimapode compreender analisar a amostra por espectrometria demassa de cromatografia liquida (LC-MS) na etapa b).Alternativamente, quando o método for um método de altorendimento, a etapa b) pode compreender analisar a amostrapor injeção direta ou cromatografia líquida eespectrometria de massa em tandem de íon-trap linear.

No método como descrito acima, a amostra ou mais deuma amostra de referencia pode ser uma pluralidade deamostras obtidas de indivíduos controle; uma ou mais de umaamostra de base pré-terapia obtida de um paciente; ou umacombinação delas.

Os métodos descritos aqui podem ser combinados comoutros métodos para monitorar o câncer de próstata, porexemplo o teste de PSA.

Nos métodos de diagnóstico e métodos para avaliar aeficácia do tratamento como descrito acima, o um ou mais deum marcador de metabólito pode ser selecionado do grupoconsistindo de lisofosfolipidios, incluindo

lisofosfatidilcolinas, lisofosfatidiletanolaminas,

lisofosfatidildimetiletanolaminas, lisofosfatidilserinas,lisosfingosilfosforilcolinas, lisofosfatildilgliceróis,

lisofosfatidilinositóis, fatores de ativação de plaquetas(PAFs), e suas combinações. Por exemplo, o um ou mais de ummarcador de metabólito pode compreender metabólitos commassas exatas medidas em Daltons de, ou substancialmenteequivalentes a, a) 495.3328, b) 517.3148, c) 519.3328, d)521.3480, e) 523.3640, f) 541.3148, g) 545.3460, h)481.3171, i)531.3123, j) 541.3422, k) 555.3101, 1)565.3394, m) 567.3546, e n) 569.3687. Em métodos onde osdados quantificados para um ou mais de um metabólito sãocomparados, observa-se que esses metabólitos são reduzidosem pacientes com câncer de próstata. Em métodos onde umíndice para o um ou mais de um metabólito em relação aometabólito de controle interno é comparado, o índice dometabólito em relação ao metabólito de controle interno éreduzido em pacientes com câncer de próstata.Os metabólitos de a) a g) são compostos relacionados alisofosfatidilcolina e os metabólitos de h) a n) sãosupostamente compostos relacionados a N,N-dimetillisofosfatidiletanolamina. Os metabólitos de a) a n) podemser ainda caracterizados por um espectro MS/MS comomostrado em a) Figura 7, e/ou como descrito na Tabela 3; b)Figura 8, e/ou como descrito na Tabela 4; c) Figura 9, e/oucomo descrito na Tabela 5; d) Figura 10, e/ou como descritona Tabela 6; e) Figura 11, e/ou como descrito na Tabela 7;f) Figura 12, e/ou como descrito na Tabela 8; g) Figura 13,e/ou como descrito na Tabela 9; h) Figura 14, e/ou comodescrito na Tabela 12; i) Figura 15, e/ou como descrito naTabela 13; j) Figura 16, e/ou como descrito na Tabela 14;k) Figura 17, e/ou como descrito na Tabela 15; 1) Figura18, e/ou como descrito na Tabela 16; m) Figura 19, e/oucomo descrito na Tabela 17; e n) Figura 20, e/ou comodescrito na Tabela 18, respectivamente.

Adicionalmente, o um ou mais de um metabólito acimapode ser também caracterizado por fórmula molecular a)C24H50NO7P, b) C26H48NO7P, c) C26H50NO7P, d) C26H52NO7P, e)C26H54NO7P, f) C28H48NO7P, g) C28H52NO7P, h) C23H48NO7P, i)C30H46NO5P, j) C25H52NO9P, k) C25H50NO10P, 1) C27H52NO9P, m)C27H54NO9P, e n) C27H56NO9P, respectivamente. As estruturas doum ou mais de um metabólito podem ser caracterizadas daseguinte forma:

<formula>formula see original document page 12</formula><formula>formula see original document page 13</formula><formula>formula see original document page 14</formula>

respectivamente.

A presente invenção também fornece novos compostos.Esses compostos são selecionados do grupo consistindo dosmetabólitos com massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalentes a, a) 531.3123, b) 541.3422,

c) 555.3101, d) 565.3394, e) 567.3546, e f) 569.3687.

Os compostos descritos acima podem ser aindacaracterizados por um espectro MS/MS como mostrado em

a) Figura 15, e/ou como descrito na Tabela 13;

b) Figura 16, e/ou como descrito na Tabela 14;

c) Figura 17, e/ou como descrito na Tabela 15;

d) Figura 18, e/ou como descrito na Tabela 16;

e) Figura 19, e/ou como descrito na Tabela 17; e

f) Figura 20, e/ou como descrito na Tabela 18,respectivamente.

Da mesma forma os compostos descritos acima podem sertambém caracterizados por um espectro MS/MS como mostradonas Tabelas de 12 a 18, respectivamente.

Os compostos também podem ser caracterizados porformula molecular a) C30H46NO5P, b) C25H52NO9P, c) C25H50NO10P,

d) C27H52NO9P, e) C27H54NO9P, e f) C27H56NO9P, respectivamente.Além disso, os compostos descritos acima também podem sercaracterizados pelas estruturas putativas

<formula>formula see original document page 14</formula><formula>formula see original document page 15</formula>

respectivamente.

Os novos compostos da presente invenção podem serutilizados para o diagnóstico do câncer de próstata, oupara avaliar a eficácia do tratamento de câncer de próstataem um paciente.

A presente invenção pode causar impacto significativona capacidade de se detectar o câncer de próstata ou orisco de se desenvolver o câncer de próstata, e pode salvarvidas. O desempenho estatístico de um teste baseado nessasamostras sugere que o teste suplantará o teste de PSA, oúnico outro teste de diagnóstico baseado em soro paracâncer de próstata. Alternativamente, uma combinação dosmétodos descritos aqui com o teste de PSA pode melhorar odesempenho geral de diagnóstico de cada teste.Os métodos da presente invenção, incluindo análisesHTS, podem ser utilizados para o seguinte, no qual o"estado de saúde" especifico se refere, mas não estálimitado ao câncer de próstata:

1. identificar pequenas moléculas de biomarcadores demetabólitos que podem discriminar entre indivíduos câncerde próstata-positivos e câncer de próstata-negativosutilizando qualquer amostra biológica, assim como umaamostra de soro, retirada do indivíduo;

2. diagnosticar especificamente o câncer de próstatautilizando metabólitos identificados em uma amostra comosoro, plasma, sangue integral, e/ou outra biópsia de tecidocomo descrita aqui;

3. selecionar o número mínimo de aspectos demetabólitos exigido para uma estatística de desempenho deanálise de ótimo diagnóstico utilizando métodosestatísticos uni- ou multivariados e informações químicasrelevantes a respeito das moléculas tais como aquelasmencionadas aqui;

4. identificar características estruturais demetabólitos de biomarcadores selecionados da análisemetabolomica não-direcionada utilizando LC-MS/MS, MSn eNMR;

5. desenvolver um método MS/MS triplo-quadrupolo dealta capacidade para analisar níveis de metabólitosselecionados em uma amostra.

6. diagnosticar o câncer de próstata, ou o risco dedesenvolver câncer de próstata, determinando os níveis dequalquer combinação de aspectos de metabólitos divulgadospela análise FTMS da amostra do paciente, utilizandoqualquer método incluindo, mas não limitado aespectrometria de massa, NMR, detecção UV, ELISA (análiseimunosorvente enzima-ligada), reação química, análise deimagem, ou outro;

7. monitorar qualquer tratamento terapêutico decâncer de próstata, incluindo medicamento (quimioterapia),terapia de radiação, cirurgia, dietética, efeitos de estilode vida ou outro; e/ou

8. monitoração longitudinal ou filtragem da populaçãoem geral com relação ao câncer de próstata utilizandoqualquer aspecto único ou combinação de aspectos divulgadosno método.

O impacto da presente invenção no diagnóstico docâncer de próstata seria enorme, já que literalmentequalquer pessoa poderia ser examinada longitudinalmentedurante a vida para avaliar o risco. Dado que ascaracterísticas de performance do teste da presenteinvenção são representativas para a população em geral,esse teste sozinho pode ser superior a qualquer outrométodo de análise atualmente disponível, já que ele podeter o potencial de detectar a progressão da doençaanteriormente ao surgimento dos sintomas clínicos.

Esse sumário da invenção não descreve necessariamentetodos os aspectos da invenção.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Esses e outros aspectos da invenção ficarão maisclaros a partir da seguinte descrição na qual é feitareferencia aos desenhos em anexo nos quais:A FIGURA 1 mostra um sumário dos passos envolvidos nadescoberta, identificação e caracterização dos metabólitos,incluindo aqueles relacionados a espécies delisofosfolipidios, que estão associados à presença decâncer de próstata.

A FIGURA 2 mostra um diagrama de análise de componentede principio ativo (PCA) gerado das 492 massas com p-valores menores do que 0.05. Cada ponto no diagramarepresenta a amostra de um único paciente, enquanto que alinha pontilhada representa o limite no qual a maior partedos pacientes com câncer de próstata (em preto) e oscontroles (cinza) podem estar separados.

A FIGURA 3 mostra um diagrama de PCA gerado de umsubconjunto de 14 massas selecionado das 492 com p-valores< 0.05. Um alto grau de discriminação entre os pacientescom câncer de próstata (pontos pretos) e os pacientescontrole (pontos cinza) é evidente utilizando-se apenas as14 massas. A linha pontilhada mostra o limite entre os doisgrupos, que quando utilizado como um valor de corte resultaem 84% de sensibilidade (84% de cânceres detectados) e 100%de especificidade (nenhum controle sendo classificado comocâncer, ou falso-positivos).

A FIGURA 4 mostra um gráfico de barras dasintensidades relativas médias das 14 massas selecionadasnos pacientes controle (cinza) e os pacientes com câncer depróstata (preto). Barras de erro = +1 s.d.

A FIGURA 5 mostra uma serie de espectros de massaextraída para metabólitos eluíndo entre 16 e 18 minutos deseparação cromatográfica em HPLC, como detectado utilizandoMS tempo-de-vôo (TOF). A caixa indica uma região de massasde metabólitos detectados entre 450 e 600 daltons em sorocontrole (A), mas ausente de soro câncer de próstata-positivo (B). O painel inferior (C) indica a diferençaliquida entre os espectros de câncer de próstata econtrole.

A FIGURA 6 mostra um gráfico dos ditos 14 metabólitoscomo detectados utilizando TOF-MS seguindo HPLC. Barras deerro = + 1 s.d.

A FIGURA 7 mostra os espectros de massa extraída MS/MSpara 495.3328 (496.3401 [M+H]), em voltagens de energia decolisão de 20 (A), 35 (B) e 50 (C) volts, respectivamente.

A FIGURA 8 mostra os espectros de massa extraída MS/MSpara 517.3148 (518.3219 [M+H]), em voltagens de energia decolisão de 20 (A), 35 (B) e 50 (C) volts, respectivamente.

A FIGURA 9 mostra os espetros de massa extraída MS/MSpara 519.3328 (520.3401 [M+H]), em voltagens de energia decolisão de 20 (A), 35 (B) e 50 (C) volts, respectivamente.

A FIGURA 10 mostra os espectros de massa extraídaMS/MS para 521.3480 (522.3554 [M+H]), em voltagens deenergia de colisão de 20 (A), 35 (B) e 50 (C) volts,respectivamente.

A FIGURA 11 mostra os espectros de massa extraídaMS/MS para 523.3640 (524.3713 [M+H]), em voltagens deenergia de colisão de 20 (A), 35 (B) e 50 (C) volts,respectivamente.

A FIGURA 12 mostra os espectros de massa extraídaMS/MS para 541.3148 (542.3219 [M+H]), em voltagens deenergia de colisão de 20 (A), 35 (B) e 50 (C) volts,respectivamente.

A FIGURA 13 mostra os espectros de massa extraídaMS/MS para 545.3460 (546.3534 [M+H]), em voltagens deenergia de colisão de 20 (A), 35 (B) e 50 (C) volts,respectivamente.

A FIGURA 14 mostra os espectros de massa extraída para481.3171 (480.3091 [M+H]), em voltagens de energia decolisão de 20 (A), 35 (B) e 50 (C) volts, respectivamente.

A FIGURA 15 mostra os espectros de massa extraídaMS/MS para 531.3123 (530.3035 [M+H]), em voltagens deenergia de colisão de 20 (A), 35 (B) e 50 (C) volts,respectivamente.

A FIGURA 16 mostra os espectros de massa extraídaMS/MS para 541.3422 (540.3335 [M+H]), em voltagens deenergia de colisão de 20 (A), 35 (B) e 50 (C) volts,respectivamente.

A FIGURA 17 mostra os espectros de massa extraídaMS/MS para 555.3101 (554.3013 [M+H]) em voltagens deenergia de colisão de 20 (A), 35 (B) e 50 (C) volts,respectivamente.

A FIGURA 18 mostra os espectros de massa extraídaMS/MS para 565.3394 (564.3306 [M+H]), em voltagens deenergia de colisão de 20 (A), 35 (B) e 50 (C) volts,respectivamente.

A FIGURA 19 mostra os espectros de massa extraídaMS/MS para 567.3546 (566.3459 [M+H]), em voltagens deenergia de colisão de 20 (A), 35 (B) e 50 (C) volts,respectivamente.A FIGURA 20 mostra os espectros de massa extraídaMS/MS para 569.3687 (5683598 [M+H]), em voltagens deenergia de colisão de 20 (A), 35 (B) e 50 (C) volts,respectivamente.

A FIGURA 21 mostra A) a lista de transições de íonmatriz-filial utilizadas para o método positivo ESI triplo-quadrupolo HTS bem como o coeficiente de correlação R-squared resultante do cálculo de linearidade através decinco amostras diluídas. B) Desvio padrão para a transição496.3/184.2al. C) O índice médio (biomarcador:IS área depico) para cada transição nos pacientes próstata (preto) econtrole (cinza).

A FIGURA 22 mostra A) um diagrama disperso dascontagens positivas ESI HTS dos pacientes para 147controles machos (quadrados cinza) e 24 pacientes comcâncer de próstata (triângulos pretos). B) histograma defreqüência mostrando a distribuição da população controle(cinza) e pacientes com câncer de próstata (preto) deacordo com contagens compartimentadas de pacientes.

A FIGURA 23 mostra A) a lista das transições de íonmatriz-filial utilizadas para o método negativo ESI triplo-quadrupolo HTS bem como o coeficiente de correlação R-squared resultante do calculo de linearidade através decinco amostras diluídas. B) Desvio padrão para transição480.3/255.4al. C) 0 índice médio (biomarcador:IS area depico) para cada transição nos pacientes próstata (preto) econtrole (cinza).

A FIGURA 24 mostra A) um diagrama disperso dascontagens negativas ESI HTS dos pacientes para 147controles machos (quadrados cinza) e 24 pacientes comcâncer de próstata (triângulos pretos). B) histograma defreqüência mostrando a distribuição da população controle(cinza) e pacientes com câncer de próstata (preto) deacordo com contagens compartimentadas de pacientes.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A presente invenção se refere a pequenas moléculas oumetabólitos que se descobriu terem diferentes abundânciasou intensidades entre pacientes câncer de próstata-positivos clinicamente diagnosticados e pacientes normais.

A presente invenção também se refere a métodos paradiagnosticar o câncer de próstata, ou o risco de sedesenvolver o câncer de próstata.

A presente invenção fornece novos métodos paradescobrir, validar e implementar um método de diagnosticopara câncer de próstata. Em uma representação da presenteinvenção, é fornecido um método para identificarbiomarcadores específicos para diagnosticar o câncer depróstata compreendendo os passos de: introduzir uma ou maisde uma amostra de um ou mais de um paciente com câncer depróstata, dita amostra contendo uma pluralidade demetabólitos em um espectrômetro de massa de alta resolução(por exemplo, e sem o intuito de limitar, um Espectrômetrode Massa de Ressonância Ciclotrônica de íon comTransformada de Fourier (FTMS)); obter, identificar equantificar dados para os metabólitos; criar um banco dedados dos ditos dados quantificados; comparar os dadosquantificados da amostra com dados correspondentes obtidosde uma ou mais de uma amostra de um paciente controle;identificar um ou mais de um metabólitos que diferem. Osmarcadores de metabólitos identificados utilizando o métododa presente invenção podem incluir os metabólitos listadosna Tabela 1. O método pode ainda compreender selecionar onumero mínimo de marcadores de metabólitos necessário paraum ótimo diagnóstico.

De modo a determinar os marcadores bioquímicos de umdado estado de saúde em uma população em particular, umgrupo de pacientes representativo do estado de saúde (i.e.,uma determinada doença) e/ou um grupo de correlativos"normais" ou "controle" (i.e., indivíduos que não sofremdaquele determinado estado de saúde) são requeridos.Amostras biológicas tiradas de pacientes naqueledeterminado estado de saúde podem então ser comparadas comas mesmas amostras tiradas da população normal bem como comas de pacientes em categoria similar de estado de saúde naesperança de identificar diferenças bioquímicas entre osdois grupos, analisando a bioquímica presente nas amostrasutilizando métodos analíticos incluindo, mas não limitadoa, FTMS e/ou LC-MS.

O método para a descoberta de marcadores demetabólitos como descrito acima pode ser realizadoutilizando-se estratégias ou métodos metabolômicos não-direcionados. Múltiplas estratégias metabolômicas não-direcionadas tem sido descritas na literatura científicaincluindo NMR (6), GC-MS (7), LC-MS (8), e estratégias FTMS(9-11). A estratégia de perfil metabólico empregada para adescoberta de metabólitos diferencialmente expressos napresente invenção foi a estratégia não-direcionada FTMS porPhenomenome Discoveries [21,24-27; ver também PedidoPublicado US No. 2004-0029120 AI, Pedido Canadense No.2.298.181, e WO 0157518]. A análise não-direcionada envolvea medição de tantas moléculas em uma amostra quantopossível, sem qualquer prévio conhecimento ou seleção decomponentes anterior à análise. Conseqüentemente, opotencial da análise não-direcionada para descobrir novosbiomarcadores de metabólitos é alto versus métodosdirecionados, que detectam uma lista pré-definida demoléculas. A presente invenção utiliza um método não-direcionado para identificar componentes de metabólitos emamostras de soro que diferem entre indivíduos com câncer depróstata e indivíduos controle (i.e., indivíduos que nãotem câncer de próstata).

Entretanto, uma pessoa especialista no assuntoreconheceria que outras estratégias de perfil metabólitopoderiam ser utilizadas para descobrir alguns ou todos osmetabólitos diferencialmente regulados divulgados napresente invenção e que os metabólitos descritos aqui,embora descobertos ou medidos, representam entidadesquímicas únicas que são independentes da tecnologiaanalítica que pode ser utilizada para medi-los. Porexemplo, e sem o intuito de ser limitador de forma alguma,outros métodos de detecção de metabólitos poderiam serutilizados, por exemplo outras plataformas MS-baseadas,ELISAs, testes colorimétricos, etc.

A presente invenção também fornece um método paradiagnosticar o câncer de próstata ou o risco de sedesenvolver câncer de próstata em um paciente, o métodocompreendendo as etapas de:

a) obter uma amostra do dito paciente;

b) analisar a dita amostra para obter dadosquantificados para um ou mais de um marcador de metabólito;

c) comparar os dados quantificados para o dito um oumais de um marcador de metabólito com os dadoscorrespondentes obtidos de uma ou mais de uma amostra dereferencia; e

d) utilizar a dita comparação para diagnosticar ocâncer de próstata ou o risco de se desenvolver câncer depróstata.

O passo de analisar a amostra (passo b) podecompreender analisar a amostra utilizando um espectrômetrode massa (MS) . Por exemplo, e sem o intuito de limitar,esse espectrômetro de massa poderia ser dos tipos FTMS,orbitrap, tempo-de-vôo (TOF) ou quadrupolo.

Alternativamente, o espectrômetro de massa poderia serequipado com um filtro de massa pré-detector adicional. Porexemplo, e sem o intuito de ser limitador, essesinstrumentos são comumente chamados de quadrupolo-FTMS (Q-FTMS), quadrupolo-TOF (Q-TOF) ou triplo quadrupolo (TQ ouQQQ)· Além disso, o espectrômetro de massa poderia seroperado no modo de detecção de ion matriz (MS) ou no modoMSn, onde n>=2. MSn se refere à situação onde o ion matrizé fragmentado por dissociação induzida por colisão (CID) ououtros procedimentos de fragmentação para criar fragmentosde ions, e então um ou mais de um dos ditos fragmentos sãodetectados pelo espectrômetro de massa. Esses fragmentospodem ser então novamente fragmentados para criar outrosfragmentos. Alternativamente, a amostra poderia serintroduzida no espectrômetro de massa utilizando um sistemacromatográfico a liquido ou a gás ou por injeção direta.

Nos métodos da presente invenção, qualquer tipo deamostra biológica que se origine de qualquer parte docorpo, por exemplo mas não limitado a, sangue(soro/plasma), CSF, urina, hálito, saliva, ou biópsia dequalquer tecido sólido incluindo tumor, normal adjacente,músculo liso ou esquelético, tecido adiposo, fígado, pele,cabelo, cérebro, rim, pâncreas, pulmão, cólon, estomago ououtro pode ser utilizado. De particular interesse são asamostras de soro. Quando o termo "soro" for utilizadoaqui, os especialistas no assunto reconhecerão que plasmaou sangue integral ou uma sub-fração de sangue integraltambém pode ser utilizada.

As amostras biológicas podem ser obtidas tanto emgrupos normais quanto em câncer de próstata-positivos deuma população diversa de indivíduos, variando em idade,etnia, peso, ocupação, e apresentando variados estados desaúde não relacionados ao câncer de próstata. A escolha depacientes dessa forma introduz maior variabilidade em umconjunto de dados, entretanto, reduz uma tendênciapotencial a confundir que em última análise resulta em umconjunto mais robusto de biomarcadores (já que ainda podedetectar a doença na presença de muitas outras variáveis).

Em um exemplo não-limitador, quando uma amostra desangue é retirada de um paciente existem várias maneiraspelas quais a amostra pode ser processada. 0 âmbito doprocessamento pode ser tão pequeno quanto nenhum (i.e.sangue integral congelado) ou tão complexo quanto oisolamento de um determinado tipo de célula. Osprocedimentos mais comuns e rotineiros envolvem apreparação de sangue ou de plasma do sangue integral. Todosos métodos de processamento de amostras de sangue,incluindo salpicar amostras de sangue sobre apoios de fase-sólida, tais como papel filtro ou outros materiais imóveis,também são contemplados pela presente invenção.

Sem o intuito de ser limitador de forma alguma, osangue processado ou soro ou amostra descrita cima podeentão ser novamente processada para torná-la compatível coma técnica de análise metódica a ser empregada na detecção emedição dos metabólitos contidos no soro processado ouamostra de sangue. Os tipos processamento podem variar detão pequeno quanto processamento nenhum a tão complexoquanto a extração diferencial e derivatização química.Métodos de extração poderiam incluir sonicação, extraçãosoxhlet, extração assistida por microondas (MAE), extraçãopor fluido supercrítico (SFE), extração por solventeacelerado (ASE), extração por liquido pressurizado (PLE),extração por água quente pressurizada (PHWE) e/ou extraçãoassistida por surfactante (PHWE) em solventes comuns como ometanol, etanol, misturas de álcoois e água, ou solventesorgânicos como etil acetato ou hexano. Um método departicular interesse para extrair metabólitos para análisenão-direcionada FTMS bem como para injeção direta emespectrômetros de massa de triplo quadrupolo, é o derealizar uma extração líquido/líquido pela qual metabólitosnão-polares se dissolvem em um solvente orgânico emetabólitos polares se dissolvem em um solvente aquoso.

As amostras extraídas podem ser analisadas utilizandoqualquer método adequado conhecido. Por exemplo, e sem ointuito de ser limitador de forma alguma, extratos deamostras biológicas são receptivos à análise emessencialmente qualquer plataforma de espectrometria demassa, seja por injeção direta ou seguindo a separaçãocromatográfica. Típicos espectrômetros de massa compreendemuma fonte que ioniza moléculas na amostra, e um detectorpara detectar as moléculas ionizadas ou fragmentos demoléculas. Exemplos não-limitadores de fontes comunsincluem impacto por elétron, ionização por eletrospray(ESI), ionização química por pressão atmosférica (APCI),foto ionização por pressão atmosférica (APPI), ionizaçãopor desabsorção a laser assistido por matriz (MALDI),ionização por desabsorção a laser em superfície ampliada(SELDI), e suas derivações. Sistemas comuns de separação edetecção de massa podem incluir quadrupolo, quadrupolo íontrap, tempo-de-vôo (TOF), setor magnético, íon ciclotron(FTMS), Orbitrap, e suas derivações e combinações. Avantagem do FTMS sobre outras plataformas MS-baseadas é asua alta capacidade de resolução que permite a separaçãodos metabólitos diferindo por apenas centésimos de umDalton, muito dos quais seriam perdidos por instrumentos deresolução inferior.

Com o termo "metabólito", queremos dizer pequenasmoléculas específicas, cujos níveis ou intensidades sãomedidos em uma amostra, e que podem ser utilizados comomarcadores para diagnosticar um estado de doença. Essaspequenas moléculas também podem ser chamadas aqui de"marcador de metabólito", "componente de metabólito","biomarcador", "marcador bioquímico", ou aspecto demetabólito".

Os metabólitos são geralmente caracterizados pela suamassa exata, como medidos pela técnica de espectrometria demassa utilizada no método acima. A massa exata também podeser chamada de "massa neutra exata" ou "massa neutra". Amassa exata de um metabólito é dada aqui em Daltons (Da),ou uma massa substancialmente equivalente a ele. Com"substancialmente equivalente a ele", queremos dizer queuma diferença de +/- 5ppm (parte por milhão) na massa exataindicaria o mesmo metabólito, como reconheceria umespecialista no assunto. A exatidão da massa é a diferençaque é observada entre a massa teórica e a massa medida:delta exatidão da massa (Am)= mreal - mmedida, que é muitasvezes expressa em partes por milhão (ppm). Ppm é definidocomo 1.000,000 * Am exatidão / mmedida (por exemplo, massateórica: 1000, massa medida: 999.9 erro: 100 ppm).

A massa exata é dada como a massa do metabólitoneutro. Como reconheceria um especialista no assunto, naionização dos metabólitos, que ocorre durante a análise daamostra, o metabólito causará ou uma perda ou um ganho deum ou mais átomos de hidrogênio e uma perda ou ganho de umelétron. Isso transforma a massa exata em "massa ionizada",que difere da massa exata pela massa de hidrogênios eelétrons perdidos ou ganhos durante a ionização. Salvoespecificação em contrário, será feita aqui referencia àmassa neutra.

Similarmente, quando um metabólito é descrito pela suaformula molecular ou estrutura, a formula molecular ouestrutura do metabólito neutro será dada, salvoespecificação em contrário. Naturalmente, a formulamolecular ou estrutura do metabólito ionizado diferirá daformula molecular neutra ou estrutura pelo numero dehidrogênios perdidos ou ganhos durante a ionização.

São coletados dados durante a análise e são obtidosdados quantificados para um ou mais de um metabólito."Dados quantificados" são obtidos pela medição dos níveisou intensidades de metabólitos específicos presentes em umaamostra. A própria medição poderia ser uma medição relativa(ex. comparação de intensidade com outra amostra oudistribuição), ou uma medição quantitativa (ex. umaconcentração como X mg/ml).

Os dados quantificados são comparados a dadoscorrespondentes de uma ou mais de uma amostra dereferencia. A "amostra de referencia", também chamada aquide "amostra controle", é qualquer amostra de referenciaapropriada para o estado de doença em particular. Porexemplo, e sem o intuito de ser limitador de forma alguma,na presente invenção a amostra de referencia pode ser umaamostra de um indivíduo controle, i.e., uma pessoa que nãosofra de câncer de próstata (também chamada aqui deindivíduo ou paciente "normal", "controle", ou"referencia"); a amostra de referencia também pode ser umaamostra obtida de um paciente com câncer de próstata. Comodeve ser compreendido por qualquer especialista no assunto,mais de uma amostra de referencia pode ser utilizada paracomparação com os dados quantificados. Por exemplo, e sem ointuito de limitar, a amostra ou mais de uma amostra dereferencia pode ser uma primeira amostra de referenciaobtida de um indivíduo controle. A uma ou mais de umaamostra de referencia também pode ser uma amostra obtida deum paciente em uma data anterior; isso permitiria umamonitoração longitudinal do estado de saúde de um pacientedurante a sua vida. Essas amostras poderiam ser coletadasdurante sucessivos intervalos de tempo. Em outro exemplo, aamostra de referencia poderia também ser obtida de umpaciente com câncer de próstata anteriormente à terapia(i.e., pré-terapia) de modo a monitorar a eficácia daterapia administrada. Uma pessoa especialista no assuntotambém reconheceria que uma combinação dessas amostras dereferencia poderia ser utilizada nos métodos da presenteinvenção.

A presente invenção também fornece novos compostos,identificados utilizando os métodos da presente invenção.Os novos compostos podem ser utilizados como marcadores demetabólitos no diagnóstico do câncer de próstata ou dorisco de desenvolver câncer de próstata, como descritoacima.

Em uma representação, os compostos podem serselecionados dos metabólitos listados na Tabela 1, ouqualquer combinação deles. Um ótimo painel de metabólitospode ser selecionado do grupo de 4 92 metabólitos mostradosna Tabela 1. por exemplo, e sem o intuito de limitar, oótimo painel de marcadores de metabólitos pode ser demetabólitos com massas exatas (medidas em Daltons) de519.3328, 541.3148, 545.3460, 555.3101, 541.3422, 565.3394,521.3480, 517.3148, 567.3546, 523.3640, 531.3123, 481.3171,495.3328, 569.3687, onde uma diferença de +/- 5ppmindicaria o mesmo metabólito. Em particular, épresentemente mostrado que os 14 metabólitos recémdescritos, quando medidos em soro ou tecido, mostram umaconcentração mais baixa em pacientes câncer de próstata-positivos em relação a indivíduos controle (livres dedoença).

Os 14 marcadores de metabólitos descritos acima podemser categorizados em um de dois grupos, com base em suadetecção em um extrato aquoso e sua propensão a ionizartanto positivamente quanto negativamente. Os metabólitoscom massas exatas (medidas em Daltons) de 495.3328,517.3148, 519.3328, 521.3480, 523.3640, 541.3148, e545.34 60, onde uma diferença de +/- 5ppm indicaria o mesmometabólito, foram detectados como íons positivosutilizando-se métodos presentemente descritos; metabólitoscom massas exatas (medidas em Daltons) de 481.3171,531.3123, 541.3422, 555.3101, 565.3394, 567.3546, e569.3687, onde uma diferença de +/- 5ppm indicaria o mesmometabólito, foram detectados como íons negativosutilizando-se os métodos presentemente descritos.

Os 14 metabólitos descritos acima da classe delisofosfolipídios, por exemplo, lisofosfatidilcolina,lisofosfatidiletanolaminas,

lisofosfatidildimetiletanolaminas, lisofosfatidilserinas,lisosfingosilfosforilcolinas, lisofosfatidilgliceróis,lisofosfatidiIinositóis, fatores de ativação de plaquetas(PAFs), e suas combinações.

A concentração de metabólitos específicos descritosacima, incluindo espécies de lisofosfolipídios, é detectadade modo a diagnosticar o câncer de próstata ou o risco dese desenvolver câncer de próstata. Qualquer combinação dosmetabólitos acima poderia ser medida simultaneamente, deuma maneira serial, ou em diferentes combinações parachegar a um resultado de diagnóstico.

A caracterização estrutural dos metabólitos acima podeser realizada utilizando métodos bem conhecidos pelosespecialistas na área. As principais características quepodem ser utilizadas para caracterizar os metabólitos podemincluir, mas não estão limitadas à massa exata, fórmulamolecular, polaridade, propriedades ácido/base, espectrosNMR, e espectros MS/MS ou MSN. Técnicas utilizadas paradeterminar essas características incluem, mas não estãolimitadas à fase reversa LC-MS utilizando uma coluna C18seguida por análise por fragmentação MS, MS/MS utilizandodissociação induzida por colisão (CID), NMR e extração. Osdados obtidos podem ser utilizados como impressões digitaisou identificadores únicos de um metabólito em particularsob condições experimentais especificadas. Qualquer um outodos os metabólitos descritos pelo presente pedido podemser identificados por impressão digital sob váriascondições para fornecer informações adicionais sobre osmetabólitos, por exemplo, a estrutura ou natureza damolécula.Os metabólitos dentro do ótimo painel de marcadores demetabólitos descrito acima podem ser ainda caracterizadospelos seus padrões de fragmentação resultantes dedissociação induzida por colisão. Em particular, metabólitocom:

massa exata 495.3328 possui uma massa ionizada de496.3401 ([M + H]+, calcd. 496.3398 para C24HsiNO7P+). Osfragmentos MS/MS (MS/MS m/z) (intensidade relativa) são:496 ([M + H]90%), 478 (5%), 419 (1%), 313 (1%), 283(1%), 258 (1%), 239 (1%), 184 (90%), 166 (1%), 104 (100%),86 (70%); ver Figura 7, Tabela 3.

massa exata 517.3148 possui uma massa ionizada de518.3219 ([M + H]+, calcd. 518.3241 para C26H49NO7P+). Osfragmentos MS/MS (MS/MS m/z) (intensidade relativa) são:518 ([M + H]+, 90%), 459 (10%), 415 (1%), 359 (1%), 341(1%), 313 (1%), 281 (1%), 221 (1%), 104 (100%), 86 (30%);ver Figura 8, Tabela 4.

massa exata 519.3328 possui uma massa ionizada de520.3401 ([M + H]+, calcd. 520.3398 para C26HsiNO7P+). Osfragmentos MS/MS (MS/MS m/z) (intensidade relativa) são:520 ([M + H]+, 10%), 502 (1%), 461 (5%), 281 (1%), 221(1%), 184 (100%), 166 (5%), 124 (1%), 86 (30%); ver Figura9, Tabela 5.

massa exata 521.3480 possui uma massa ionizada de522.3554 ([M + H]+, calcd. 522.3554 para C26H53NO7P+). Osfragmentos MS/MS (MS/MS m/z) (intensidade relativa) são:522 ([M + H]+, 100%), 504 (7%), 478 (1%), 357 (1%), 258(1%), 221 (1%), 184 (60%), 124 (5%), 104 (80%), 86 (30%);ver Figura 10, Tabela 6.massa exata 523.3640 possui uma massa ionizada de524 .3713 ([M + H]+, calcd. 524.3711 para C26HssNO7P+). Osfragmentos MS/MS (MS/MS m/z) (intensidade relativa) são:524 ([M + H]+, 100%), 506 (5%), 496 (1%), 478 (1%), 331(1%), 313 (1%), 285 (1%), 258 (1%), 184 (70%), 166 (2%),124 (5%), 104 (70%), 86 (30%); ver Figura 11, Tabela 7.

massa exata 541.3148 possui uma massa ionizada de542.3219 ([M + H]+, calcd. 542.3241 para C28H49NO7P+). Osfragmentos MS/MS (MS/MS m/z) (intensidade relativa) são:542 ([M + H]+, 80%), 483 (25%), 284 (1%), 225 (1%), 184(1%), 104 (100%), 86 (30%); ver Figura 12, Tabela 8.

massa exata 545.3460 possui uma massa ionizada de5463534 ([M + H]+, calcd. 546.3554 para C28H35NO7P+). Osfragmentos MS/MS (MS/MS m/z) (intensidade relativa) são:546 ([M + H]+, 90%), 528 (1%), 514 (1%), 487 (30%), 104(100%), 86 (30%); ver Figura 13, Tabela 9.

massa exata 481.3171 possui uma massa ionizada de480.3091 ([M - H]-, calcd. 480.3081 para C23H47NO7P"). Osfragmentos MS/MS (MS/MS m/z) (intensidade relativa) são:480 ([M - H]-, 100%), 255 (100%), 242 (10%), 224 (15%), 168(10%), 153 (10%), 79 (25%); ver Figura 14, Tabela 12.

massa exata 531.3123 possui uma massa ionizada de530.3035 ([M - H]", calcd. 531.3114 para C30H46NO5P). Osfragmentos MS/MS (MS/MS m/z) (intensidade relativa) são:530 (100%), 480 (100%), 255 (100%), 242 (10%), 224 (15%),168 (10%), 153 (10%), 79 (25%); ver Figura 15, Tabela 13.

massa exata 541.3422 possui uma massa ionizada de540.3335 ([M - H]", calcd. 540.3293 para C25HsiNO9P")- Osfragmentos MS/MS (MS/MS m/z) (intensidade relativa) são:540 ([M - Η]", 10%), 480 (100%), 255 (100%), 242 (10%), 224(15%), 168 (10%), 153 (10%), 79 (25%); ver Figura 16,Tabela 14.

massa exata 555.3101 possui uma massa ionizada de554.3013 ([M - H]", calcd. 555.3172 para C25H50NO10P). Osfragmentos MS/MS (MS/MS m/z) (intensidade relativa) são:554 ([M - Η]', 10%), 494 (100%), 269 (100%), 242 (10%), 224(15%), 168 (10%), 153 (10%), 79 (25%); ver Figura 17,Tabela 15.

massa exata 565.3394 possui uma massa ionizada de564 .3306 ([M - H]", calcd. 564.3293 para C27HsiNO9P). Osfragmentos MS/MS (MS/MS m/z) (intensidade relativa) são:564 ([M - Η]", 100%), 504 (100%), 279 (100%), 242 (10%),224 (15%), 168 (10%), 153 (10%), 79 (25%); ver Figura 18,Tabela 16.

massa exata 567.354 6 possui uma massa ionizada de566.3459 ([M - H]", calcd. 566.3449 para C27H53NO9P). Osfragmentos MS/MS (MS/MS m/z) (intensidade relativa) são:566 ([M - H]', 10%), 506 (100%), 281 (100%), 242 (10%), 224(15%), 168 (10%), 153 (10%), 79 (25%); ver Figura 19,Tabela 17.

massa exata 569.3687 possui uma massa ionizada de568.3598 ([M - H]", calcd. 568.3605 para C27H55NO9P"). Osfragmentos MS/MS (MS/MS m/z) (intensidade relativa) são:568 (m/z representa a massa [M + H]+), 10%), 508 (100%),283 (100%), 242 (10%), 224 (15%), 168 (10%), 153 (10%), 79(25%); ver Figura 20, Tabela 18.

Com base na caracterização estrutural dos 14marcadores de metabólitos selecionados para o diagnósticode câncer de próstata, foi determinado que os metabólitossão moléculas relacionadas a lisofosfolipidios.Especificamente esses incluem, mas não estão limitados a,lisofosfatidiIcoIina (IysoPC) , lisofosfatidiletanolamina(IysoPE), lisofosfatidildimetiletanolamina (IysoPdmE),lisofosfatidilserina (IysoPS), lisofosfatidilinositol

(IysoPI), e lisofosfatidilglicerol (IysoPG), e fatores deativação de plaquetas (PAFs), nos quais a espinha dorsal doglicerol está ligada a um ácido graxo em SNl ou SN2, porexemplo, 16:0, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:3, 20:4, 20:5,22:6, ceramida, ou outro, e uma colina contendo fosfato,etanolamina, dimetiletanolamina, serina, glicerol, ouinositol está presente em SN3.

A fosfatidilcolina (PC) e a fosfatidiletanolamina (PE)representam os dois principais componentes de lipidios dasmembranas biológicas. PC e PE compreendem uma espinhadorsal de glicerol contendo um grupo de fosfato ligado aetanolamina ou colina na posição SN3, e dois ácidos graxosligados às posições SNl e SN2 através de um acil, éter, oucadeias de vinil-éter. Os ácidos graxos podem ser saturados(mais comum em SNl), ou insaturados (mais comum em SN2) .Quando f osf olipidios como PC e PE são hidrolizados porvárias fosfolipases, um lisofosfolipidio como IysoPC égerado juntamente com um ácido graxo livre. Oslisofosfolipidios foram implicados em numerosos caminhosbiológicos e doenças, tais como sinalização de cálcio,arteriosclerose e inflamação (12).

0 Pedido de Patente US2004/0137541 (Mills et al.) seconcentra na elevação de IysoPCs como eventos chave na oudurante a progressão do câncer. Em particular, Mills et al.Descreve a elevação de IysoPCs nos cânceres ginecológicos.Isso está em contraste com a presente invenção, que mostraque o painel de 14 biomarcadores (i.e., metabólitos commassas exatas de 519.3328, 541.3148, 545.3460, 555.3101,541.3422, 565.3394, 521.3480, 517.3148, 567.3546, 523.3640,531.3123, 481.3171, 495.3328, 569.3687) são reduzidos nosoro de pacientes com câncer de próstata.

A presente invenção também fornece métodos de altorendimento para o diagnóstico do câncer de próstata. 0método envolve fragmentação da molécula matriz; em umexemplo não-limitador, isso pode ser realizado por umsistema Q-Trap tm. A detecção dos metabólitos pode serrealizada utilizando-se uma das várias plataformas deteste, incluindo testes químicos colorimétricos (UV, ououtro comprimento de onda), testes imunosorventes ligados aenzimas e baseados em anticorpos (ELISAs), testes baseadosem chip e reação de cadeia de polimerase para detecção deácido nucléico, métodos de detecção de ácido nucléicobaseado em glóbulo, testes químicos de vareta ou outrasreações químicas, análises de imagem tais como imagem porressonância magnética (MRI), análise de tomografia poremissão de positron (PET), análise de tomografiacomputadorizada (CT), ressonância magnética nuclear (NMR),e vários sistemas baseados em espectrometria de massa.

Em outra representação da presente invenção, éfornecido um método para diagnosticar o câncer de próstataou o risco de câncer de próstata em um paciente. 0 métodocompreendendo as etapas de:a) obter uma amostra do dito paciente;

b) analisar a dita amostra para obter dadosquantificados para um ou mais de um marcador de metabólito;

c) obter um índice de um ou mais de um marcador demetabólito para um metabólito de controle interno;

d) comparar cada índice do dito um ou mais de ummarcador de metabólito para o metabólito de controleinterno com os dados correspondentes obtidos de uma ou maisde uma amostra de referencia; e

e) utilizar a dita comparação para diagnosticar ocâncer de próstata ou o risco de câncer de próstata.

O passo de analisar a amostra (etapa b) podecompreender analisar a amostra utilizando um espectrômetrode massa (MS). Por exemplo, e sem o intuito de limitar,esse espectrômetro de massa poderia ser dos tipos FTMS,orbitrap, tempo-de-vôo (TOF) ou quadrupolo.

Alternativamente, o espectrômetro de massa poderia serequipado com um filtro de massa pré-detector adicional. Porexemplo, e sem o intuito de limitar, esses instrumentos sãocomumente chamados de quadrupolo-FTMS (Q-FTMS), quadrupolo-TOF (Q-TOF), ou triplo quadrupolo (TQ ou QQQ). Além disso,o espectrômetro de massa poderia ser operado ou no modo dedetecção de íon matriz (MS) ou no modo MSn, onde n>=2. MSnse refere à situação na qual o íon matriz é fragmentado pordissociação induzida por colisão (CID) ou outrosprocedimentos de fragmentação para criar fragmentos deíons, e então um ou mais de um dos ditos fragmentos sãodetectados pelo espectrômetro de massa. Esses fragmentospodem então ser novamente fragmentados para criar outrosfragmentos. Alternativamente, a amostra poderia serintroduzida no espectrômetro de massa utilizando um sistemade cromatográfico a liquido ou gás ou por injeção direta.

No método descrito acima, a amostra ou mais de umaamostra de referencia pode ser uma primeira amostrareferencia de base obtida de um indivíduo controle.

No método descrito acima, o um ou mais de um marcadorde metabólito pode ser selecionado dos metabólitos listadosna Tabela 1, ou os metabólitos podem ser os 14 metabólitosdescritos acima. 0 "metabólito de controle interno" serefere a um metabólito endógeno naturalmente presente nopaciente, contanto que o metabólito não esteja associadocom a doença e não varie segundo estados de doenças;alternativamente, o "metabólito de controle interno" podetambém se referir a um padrão externo introduzido em umaamostra de soro anteriormente à análise. Por exemplo, e semo intuito de limitar, o índice pode ser utilizado paradeterminar uma contagem de diagnóstico para o paciente deteste.

A utilização do índice do marcador de metabólito parao metabólito de controle interno oferece medições que sãomais estáveis e reproduzíveis do que as medições de níveisabsolutos do marcador de metabólito. Como o metabólito decontrole interno está presente em todas as amostras e nãovaria segundo estados de doenças, a variabilidade amostra-a-amostra (devido ao manuseio, extração. etc.) éminimizada.

Nos métodos de diagnóstico da presente invenção, amedição dos marcadores de metabólitos poderia ser feitalongitudinalmente por ura período de tempo em um paciente deteste para determinar a alteração nas concentrações demetabólitos e a probabilidade do câncer de próstata, ou orisco de desenvolvimento do câncer de próstata. 0 pacientede teste forneceria uma amostra inicialmente, estabelecendoessencialmente um valor de base; o paciente de testepoderia então fornecer amostras durante um período de tempoque seriam comparadas à amostra inicial. Por exemplo, e semo intuito de limitar, um aumento na intensidade dos 14metabólitos descritos acima indicaria um risco reduzido decâncer de próstata, enquanto que uma redução na intensidadeindicaria um risco maior de câncer de próstata.

Ainda em outra representação da presente invenção, éfornecido um método para avaliar a eficácia de uma terapiapara tratar o câncer de próstata em um paciente,compreendendo:

a) obter uma amostra do dito paciente;

b) analisar a dita amostra para obter dadosquantificados para um ou mais de um marcador de metabólito;

c) comparar os ditos dados quantificados com dadoscorrespondentes obtidos de uma ou mais de uma amostra dereferencia; e

d) utilizar a dita comparação para determinar se aterapia está melhorando o estado de saúde do paciente.

Opcionalmente, após o passo de analisar (etapa b) ,pode ser obtido um índice para cada um ou para mais de ummarcador de metabólito para um metabólito de controleinterno. Nesse caso, cada índice do dito um ou mais de ummarcador de metabólito com o metabólito de controle internocom os dados correspondentes obtidos de uma ou mais de umaamostra de referência é comparado para avaliar a eficáciada terapia.

O passo de analisar (passo b) pode compreenderanalisar a amostra por espectrometria de massa decromatografia liquida (LC-MS), ou alternativamente podecompreender analisar a amostra por injeção direta oucromatografia liquida e espectrometria de massa em tandemde ion trap linear quando o método for um método de altorendimento.

O termo "terapia" ou "tratamento", significa qualquercurso de terapia apropriado que possa tentar melhorar oestado de saúde do paciente sendo avaliado. Quando daavaliação da eficácia da terapia, o efeito da terapia emparticular em melhorar ou piorar o estado de saúde de umpaciente será medida. Dessa forma, uma pessoa especialistano assunto seria capaz de determinar se a terapia é eficazpara tratar o câncer de próstata. Esses tratamentos podemincluir, mas não estão limitados a, imunoterapia (porexemplo, injeção de Bacillus Calmette-Guerin),prostatectomia radical, quimioterapia, terapia de radiação,terapia hormonal, (incluindo anti-andrógenos) , ou outros.

No método descrito acima, a amostra ou mais de umaamostra de referencia pode ser qualquer amostra dereferencia apropriada. Por exemplo, e sem o intuito delimitar de forma alguma, a amostra de referencia pode seruma pluralidade de amostras obtidas de indivíduos controleou uma ou maus de uma amostra de base pré-terapia dopaciente; ou qualquer combinação delas. Uma amostra de basepré-terapia do paciente é particularmente útil, já que avariação nos metabólitos será então especifica ao paciente.

No método descrito acima, o um ou mais de um marcadorde metabólito pode ser selecionado dos metabólitos listadosna Tabela 1, ou os metabólitos podem ser os 14 metabólitosdescritos acima.

A eficácia de uma terapia como descrita acima éavaliada com base na medição dos metabólitos e comparaçãocom a amostra de referencia, pela qual uma restauração dosmetabólitos na direção de um índice especificado normalseria indicativa de um efeito positivo do tratamento.

Em um método alternativo de avaliar a eficácia de umaterapia para tratar o câncer de próstata, um índice paracada um ou mais de um marcador de metabólito para ummetabólito de controle interno pode ser obtido na etapa b);cada índice do um ou mais de um marcador de metabólito parao metabólito d controle interno poderia então ser comparadocom dados correspondentes obtidos de uma ou mais de umaamostra de referencia na etapa c).

A presente invenção também fornece métodos de altorendimento para o diagnóstico do câncer de. próstata. 0método pode envolver a fragmentação da molécula matriz; emum exemplo não-limitador, isso pode ser realizado por umsistema Q-Trap tm. A detecção dos metabólitos pode serrealizada utilizando-se uma das várias plataformas deteste, incluindo testes químicos colorimétricos (UV, ououtro comprimento de onda), testes imunosorventes ligados aenzimas e baseados em anticorpos (ELISAs), testes baseadosem chips e reação de cadeia de polimerase para a detecçãode ácido nucléico, métodos de detecção de ácido nucléicobaseados em cordão, testes químicos de vareta ou outrareação química, análise por imagem como imagem porressonância magnética (MRI), análise de tomografia poremissão de positron (PET), análise por tomografiacomputadorizada (CT), ressonância magnética nuclear (NMR),e vários sistemas baseados em espectrometria de massa.

0 método HTS pode envolver a medição da intensidade,área de pico ou análises somadas de cada íon filialselecionado por biomarcador, bem como íons filiais para umou mais de um padrão interno adicionado a cada amostra. Umíndice pode ser então gerado dividindo-se cada transição debiomarcador por uma transição padrão interna. 0 padrãointerno fornece uma indicação da sensibilidade doinstrumento, e permite a normalização dos sinais detransição do biomarcador através de múltiplas amostragens.Os índices gerados para a população livre de doença ousaudável tornam-se o parâmetro definidor para adistribuição "normal". Um conjunto de amostras de validaçãocompreendendo normais e próstata-positivos é entãoanalisado e comparado com a distribuição normal. Issoresulta essencialmente em duas distribuições, uma para apopulação normal e uma para a população próstata-positiva.Um índice de corte entre as duas distribuições é entãoselecionado para determinar a sensibilidade eespecificidade do teste do biomarcador.

Nos métodos da presente invenção, qualquer metabólitoindividual ou combinação de metabólitos descrita aquipoderia ser combinado com marcadores de câncer existentespara chegar a um resultado de diagnóstico/prognóstico.Esses marcadores existentes podem incluir, mas não estãolimitados a antigenos específicos para próstata (PSA),antigeno carcinoembriônico (CEA), antígeno de câncer (CA)19-9, C15-3, ou CA125.

Os métodos acima podem fornecer a profissionaismédicos um teste para melhor determinar o regime detratamento apropriado para um paciente com base no estágiono qual o câncer é detectado. Como os métodos dediagnóstico são relativamente não-invasivos, um grandenúmero de casos não diagnosticados poderia seridentificado, particularmente casos iniciais, para os quaisintervenções específicas podem ser administradas porprofissionais médicos. Os métodos da presente invençãotambém podem ser utilizados para detectar a recorrência decâncer, possivelmente antes dos sintomas clínicos darecorrência. Esse conhecimento poderia ser subseqüentementeutilizado para direcionar adequadamente regimes detratamento que podem ter maiores chances de prevenir arecorrência.

0 impacto da presente invenção no diagnóstico docâncer de próstata seria enorme, já que literalmente todospoderiam ser analisados longitudinalmente durante a vidapara avaliar o risco. Dado que as características deperformance do teste da presente invenção sãorepresentativas para a população em geral, esse testesozinho poderia ser superior a qualquer outro método deanálise disponível atualmente, já que ele pode ter opotencial de detectar a progressão da doença antes dosurgimento de sintomas clínicos.

A presente invenção será ainda ilustrada nos seguintesexemplos. Um perfil da presente invenção incluindo cada umdos exemplos listados abaixo é mostrado na Figura 1.

Exemplo 1: Descoberta e Identificação de MetabólitosDiferencialmente Expressados

Metabólitos diferencialmente expressos sãoidentificados em pacientes clinicamente diagnosticados comocâncer de próstata-positivos e em pacientes normais.

Amostras Clínicas. Para o teste de filtragem de câncerde próstata descrito, amostras de soro foram obtidas depopulações representativas de indivíduos saudáveis livresde câncer de próstata e de pacientes profissionalmentediagnosticados como câncer de próstata-positivos (SeraCareLifeSciences, Inc.). Os marcadores bioquímicos de câncer depróstata descritos abaixo foram derivados da análise de 24amostras de soro de pacientes positivos para câncer depróstata e de 25 amostras de soro de controles saudáveis.

As amostras em ambos os grupos vieram de uma populaçãodiversificada de indivíduos, variando em idade, etnia,peso, ocupação, e exibindo variados estados de saúde nãorelacionados ao câncer de próstata. Todas as amostras foramcoletas de um único ponto de tempo, e as amostras de câncerde próstata foram coletadas ou imediatamente antes ouimediatamente após a ressecção cirúrgica de um tumor. Todasas amostras foram coletadas anteriormente à terapia porquímica ou radiação.Os metabólitos contidos nas 4 9 amostras de soro foramseparados em extratos polares e não-polares por sonicatione mixagem vigorosa (mixagem por vórtice).

A análise das amostras de soro (24 câncer de próstata,25 normais) foi feita por injeção direta em um FTMS eionização por ionização por eletrospray (ESI) ou porionização química por pressão atmosférica (APCI) tanto nomodo positivo quanto no negativo. Os extratos de amostrasforam diluídos ou em metanol triplicado ousextuplicado:0.1% (v/v) hidróxido de amônio (50:50, v/v)para modos de ionização negativos, ou em metanol:0.1% (v/v)ácido fórmico (50:50, v/v) para modos de ionizaçãopositivos. Para APCI, os extratos de amostras foraminjetados diretamente sem diluir. Todas as análises foramrealizadas em um espectrômetro de massa de ressonânciaciclotrônica de íon com transformada de Fourier BrukerDaltonics APEX III equipado com um magneto supercondutorativamente blindado 7.0 T (Bruker Daltonics, Billerica,MA) . As amostras foram diretamente injetadas utilizandofontes ESI e APCI a um índice de fluxo de 600 ul por hora.Os parâmetros de transferência/detecção de íons foramotimizados utilizando-se uma mistura padrão de serina,tetra-alanina, reserpina, mistura de sintonização Hewlett-Packard e o fragmento de hormônio adenocorticotrópico 4-10.Além disso, as condições do instrumento foram sintonizadaspara otimizar a intensidade do íon e a acumulação de banda-larga através do índice de massa de 100-1000 de acordo comas recomendações do fabricante do instrumento. Uma misturados padrões acima mencionados foi utilizada para calibrarinternamente cada espectro de amostra para exatidão demassa através do índice de aquisição de 100-1000 amu.

No total seis análises separadas compreendendocombinações de extratos e modos de ionização foram obtidaspara cada amostra:

Extrato Aquoso

1. Positivo ESI (modo de análise 1101)

2. Negativo ESI (modo de análise 1102)

Extrato Orgânico

3. Positivo ESI (modo de análise 1201)

4. Negativo ESI (modo de análise 1202)

5. Positivo APCI (modo de análise 1203)

6. Negativo APCI (modo de análise 1204)

Processamento de Dados de Espectrometria de Massa.

Utilizando uma linha de regressão linear de mínimosquadrados, os valores de eixo da massa foram calibrados demodo que cada pico de massa de padrão interno tivesse umerro de massa de <1 p.p.m. comparado com a sua massateórica. Utilizando o software XMASS de Brubaker DaltonicsInc., tamanhos de arquivos de dados de 1 megaword foramadquiridos e zero-filled para 2 megawords. Umatransformação de dados sinm foi realizada antes datransformada de Fourier e cálculos de magnitude. Osespectros de massa de cada análise foram integrados,criando uma lista de pico que continha a massa exata e aintensidade absoluta de cada pico. Compostos no âmbito de100-2000 m/z foram analisados. De modo a comparar esumarizar os dados através de diferentes modos de ionizaçãoe polaridades, todos os picos de massa detectados foramconvertidos às suas massas neutras correspondentesassumindo a formação aduzida de hidrogênio. Um teste bi-dimensional auto-gerado (massa vs. intensidade da amostra)foi então criado utilizando o software DISCOV Anetrics tm(Phenomenome Discoveries Inc., Saskatoon, SK, Canadá). Osdados de múltiplos arquivos foram integrados e esse arquivocombinado foi então processado para determinar todas asmassas únicas. A média de cada massa única foi determinada,representando o eixo y. Esse valor representa a média detodas as massas exatas detectadas que foramestatisticamente determinadas como equivalentes.

Considerando que a exatidão da massa do instrumento para ospadrões de calibração é de aproximadamente lppm, ficariaevidente para qualquer especialista no assunto que essasmassas médias incluiriam todas as massas que estejam dentrode +/- 2 ppm dessa massa média, ou mesmo +/- 5 ppm dessamassa média. Foi criada uma coluna para cada arquivo quefoi originalmente selecionado para ser analisado,representando o eixo χ. A intensidade de cada massaencontrada em cada um dos arquivos selecionados foi entãoarquivada na sua coordenada representativa x,y. Coordenadasque não continham um valor de intensidade foram deixadas embranco. Uma vez na ordem, os dados foram ainda processados,visualizados e interpretados, e foram designadasidentidades químicas putativas. Cada um dos espectros teveentão o seu pico captado para obter a massa e a intensidadede todos os metabólitos detectados. Esses dados de todos osmodos foram então fundidos para criar um arquivo de dadospor amostra. Então, os dados de todas as 90 amostras foramfundidos e alinhados para criar uma ordem de metabólitosbi-dimensional na qual cada amostra é representada por umacoluna e cada único metabólito é representado por uma únicafileira. Na célula correspondente a uma dada combinação deamostra de metabólito, a intensidade naquela amostra foiapresentada. Quando os dados foram representados nesseformato, metabólitos apresentando diferenças entre gruposde amostras (i.e., normal e câncer) foram determinados.

Interpretação de Dados Avançados. 0 T-teste de umestudante foi utilizado para selecionar metabólitos quediferem entre amostras normais e câncer de próstata-positivas (p<0.05). 492 metabólitos atenderam a essecritério (como listado na Tabela 1). Cada um dessesaspectos difere estatisticamente entre as duas populações econseqüentemente cada um possui potencial utilidade dediagnóstico. Os aspectos são descritos pela sua massa exatae modo de análise, que juntos são suficientes para forneceras fórmulas moleculares putativas e característicasquímicas (tais como polaridade e grupos funcionaisputativos) de cada metabólito. A capacidade dos 4 92metabólitos de discriminar entre o soro controle e câncerde próstata é mostrada pelo diagrama PCA na Figura 2. Umadistinção relativamente clara (como mostrado pela linhapontilhada) entre os controles (em cinza) e o câncer depróstata (em preto) pode ser obtida, o que indica que os492 metabólitos juntos podem diagnosticar uma amostra desoro câncer de próstata-positiva em relação a um sorocontrole.Entretanto, a incorporação e desenvolvimento de 4 92sinais em um teste comercialmente útil não é prática,conseqüentemente uma combinação de análises não-variáveis einformação química foi utilizada para selecionar também umsubconjunto de 14 metabólitos dos 492 para caracterizaçãoadicional. O subconjunto de 14 metabólitos selecionadosforam detectados em dois modos diferentes: aqueles commassas exatas (medidas em Daltons) de 495.3328, 517.3148,519.3328, 521.3480, 523.3640, 541.3148, e 545.3460, ondeuma diferença de +/- 5 ppm indicaria o mesmo metabólito,foram detectados como íons positivos utilizando métodosdescritos neste pedido e metabólitos com massas exatas(medidas em Daltons) de 481.3171, 531.3123, 541.3422,555.3101, 565.3394, 567.3546, e 569.3687 foram detectadoscomo íons negativos utilizando os métodos descritos nestepedido. Todas as massas de metabólitos representammoléculas 12C.

A exatidão do diagnóstico das 14 massas é mostradaatravés de um diagrama PCA na Figura 3, que ilustra umaclara separação entre doença e controles. Na verdade,separar os controles dos cânceres de próstata utilizando alinha pontilhada resulta em uma sensibilidade de 84% e umaespecificidade de 100%. Um gráfico das intensidadesrelativas das 14 massas como detectadas no FTICR é mostradana Figura 4 (utilizando dados calculados entre Oel paracada massa). Cada um dos marcadores parece mostrar umaredução ou deficiência de aproximadamente 50% (em média) nosoro de câncer de próstata versus soro de controle.Com base nesses resultados, pode ser feita uma claradistinção entre o soro de pacientes câncer de próstata-positivos e indivíduos saudáveis (câncer de próstata-negativos). Conseqüentemente, esses marcadores, que sãocapazes de identificar e distinguir soro câncer depróstata-positivo e câncer de próstata-negativo, podemformar a base para um teste de diagnóstico de câncer depróstata como presentemente descrito.

Exemplo 2:_Método Independente de Confirmação deMetabólitos Descobertos

Os metabólitos e suas associações com as variáveisclínicas descritas no Exemplo 1 foram ainda confirmadosutilizando um sistema de espectrometria de massaindependente. Extratos representativos de amostras aquosasde cada grupo variável (10 controles e 9 cânceres depróstata) foram re-analisados por LC-MS utilizando umacromatografia líquida de alta performance HP 1050, ouequivalente em interface com um ABI Q-Star, ouespectrômetro de massa equivalente para obter informação demassa e intensidade com o objetivo de identificarmetabólitos que diferem em intensidade entre as variáveisclínicas sob investigação. Os dados foram adquiridosutilizando exploração total nos modos ESI positivo enegativo, e os dados espectrais resultantes calibrados ealinhados utilizando o software Phenomenome Profiler.

Identificamos uma janela de tempo de retenção (tempo noqual espécies moleculares são eluídas da coluna HPLC), deaproximadamente 28 a 34 minutos sob as condiçõescromatográficas especificadas. A Figura 5 mostra osespectros de massa extraídos dentro desse limite de tempode retenção para os controles (A) , cânceres de próstata(B) , e a diferença liquida entre os controles e os cânceresde próstata (C) . A região enquadrada mostra o âmbito damassa onde o subconjunto de 14 massas anteriormentedescrito foi re-detectado. Como observado anteriormente,essas moléculas eram significativamente mais baixas emintensidade nos soros de câncer de próstata em comparaçãocom os controles. Um gráfico de barras das intensidadesnaturais médias (calculadas entre 0 e 1) para cada um dos14 metabólitos detectadas utilizando-se HOLC-acoplado TOF-MS, é mostrado na Figura 6.

Exemplo 3: Caracterização MS/MS do Subconjunto de 14Metabólitos

Várias características podem ser utilizadas para aelucidação estrutural dos metabólitos incluindodeterminação da massa exata e formula molecular,polaridade, propriedades ácido/base, espectros NMR, eespectros MS/MS ou MSN. Esses dados podem ser utilizadoscomo impressões digitais de um determinado metabólito e sãoidentificadores únicos de um determinado metabólitoindependentemente de sua completa estrutura ter sidodeterminada. Os dados incluem:

1. Tempo de retenção LC. Os extratos contendo osmetabólitos de interesse são sujeitos à fase reversa LC-MSutilizando uma coluna C18 e análise por MS para determinaro seu tempo de retenção sob condições padronizadas. Quandoos extratos foram sujeitos à análise LC/MS, todos os 14metabólitos co-eluiram dentro de um âmbito de 26-34minutos.

2. Espectros MS/MS. Os 14 metabólitos de interesseforam também caracterizados pela realização de fragmentação5 MS/MS utilizando dissociação induzida por colisão (CID).Essa análise MS/MS foi realizada em tempo real (i.e.,durante o processo de eluição cromatográfica) ou off-lineem frações coletadas do processo de separaçãocromatográfica.

Frações aquosas de 9 extratos de amostras de câncer de

próstata e de 10 extratos de amostras normais foramevaporadas até secar sob gás de nitrogênio e reconstituídasem 100 μΐί de água: metanol: ácido fórmico (97.9:2:0.1). 5 μ]1da amostra reconstituída foram utilizados para HPLC(sistema Agilent 1100 com MetaSil AQ 3 um, coluna C18, 100x 2.0 mm. Varian Inc.) para exame total e MS/MS. A fasemóvel consistiu de água:metanol:ácido fórmico (97.9:2:0.1)como solvente A, e 0.1% de ácido fórmico em metanol comosolvente Β. A um índice de fluxo de 0.2 ml/min., ogradiente do solvente foi o seguinte: Solvente A foimantido a 100% pelo primeiro minuto, então alterado para20% A e 80% B utilizando um gradiente linear acima de 10min., e então mantido a 20% A e 80% B por 9 min.; então amistura do solvente foi alterada para 100% B durante os 10min. seguintes utilizando um gradiente linear, e foimantido a 100% B por 15 minutos. Finalmente, a mistura dosolvente foi mantida a 100% A para equilibrar a coluna paraduração total de 20 minutos (tempo total transcorrido de 65min.). A elução do HPLC foi analisada utilizando umespectrômetro de massa ABI QSTARr XL equipado com uma fonteESI (TurbolonSpray tm) no modo positivo e negativo.

Para o modo de exame completo tempo-de-vôo, o tipo deexame "TOF-MS" foi utilizado com um tempo de acomodação de1.0 seg., um índice de exame de massa de 50 a 1500 Da, etempo de duração de 60 min. Os parâmetros de fonte no modoESI positivo foram os seguintes: Fonte de íon gás 1 (GSl)55; Fonte de íon gás 2 (GS2) 90; Gás cortina (CUR) 40;Corrente nebulizadora (NC) 3.0; Temperatura 400°C;Potencial de declustering (DP) 60; Potencial deconcentração (FP) 265; Potencial de declustering 2 (DP2)15. Os parâmetros de fonte no modo ESI negativo foram osseguintes: Fonte de íon gás 1 (GSl) 55; Fonte de íon gás 2(GS2) 70; Gás cortina (CUR) 40; Corrente nebulizadora (NC)0; Temperatura 400°C; Potencial de declustering (DP) -55;Potencial de concentração (FP) -265; Potencial dedeclustering 2 (DP2) -15.

No modo MS/MS, o tipo de exame "Produto íon" foiutilizado com um tempo de acumulação de 1.0 seg., um índicede exame de 50 a 650 Da, e um tempo de duração de 60 min.Todas os parâmetros de fonte são os mesmos que acima, com acomposição de energia de colisão (CE) de 20V, 35V, 50V nomodo positivo e -20V, -35V e -50V no modo negativo. 0 gásde colisão (CAD, nitrogênio) foi estabelecido em 5.

A estrutura de uma determinada molécula dita um padrãoespecífico de fragmentação sob condições definidas e éúnico para aquela molécula (equivalente à impressão digitalde uma pessoa) - até mesmo leves alterações à estrutura damolécula podem resultar em um padrão diferente defragmentação. Além de fornecer uma impressão digital daidentidade da molécula, os fragmentos gerados por CID foramutilizados para obter informações relativas à estrutura dosmetabólitos.

Ao se elaborar possíveis fórmulas moleculares para opainel de biomarcadores do modo positivo (i.e., metabólitoscom massas exatas de 495.3328, 517.3148, 519.3328,521.3480, 523.3640, 541.3148, e 545.3460), descobriu-se quetodos os sete biomarcadores possuíam formulas similares deRN07P, onde R é o tipo de ácido graxo variável, indicandoque poderiam ser compostos fosfolipídio colina-relacionados. Um sumário das estruturas propostas com baseem interpretações MS/MS é mostrado na Tabela 2. Osespectros de fragmentação para os sete metabólitosdetectados no modo de ionização positivo são mostrados nasFiguras de 7 a 13 (energias de colisão de 20 (A) , 35 (B) e50 (C) volts) , e as massas dos fragmentos e designações deformulas moleculares nas Tabelas de 3 a 9. Cada tabelalista os íons filiais resultantes de CID, bem como asestruturas propostas dos íons fragmentados e das perdas defragmentos.

Os dados de MS/MS obtidos no modo ESI positivo indicaque cada um dos sete metabólitos abstraiu um próton,resultando no íon molecular correspondente ([M + H]+) nosseus espectros MS/MS. Isso sugere a protonização do grupode fosfato deixando o íon de amônio quaternáriopositivamente carregado como o íon matriz. A evidência paraperder o grupo de amina quaternário, (CH3)3NH+, [Μ + H -60]+) foi observada para todos os metabólitos confirmando apresença do grupo principal de colina nesses metabólitos.íons fragmentados devido à fosfocolina (C5Hi5NO4P+, m/z 184)e amina etanol-quaternário (C5Hi4NO+, m/ζ 104) onde outrasindicações sugerindo estruturas tipo fosfocolina. A perdade H2O dos ions moleculares também foi observadaconfirmando a presença de grupos livres de hidroxi emposições sn-2 inerentes a estruturas tipo lisolipidios.

Ions fragmentados, apesar de fracos, foram observadostanto para uma cadeia lateral de ácidos graxos sn-1 ou suasperdas. Por exemplo, para o metabólito 495.3328, onde oácido palmitico supostamente seria o ácido graxo sn-1, oion fragmentado representando m/z 458 foi determinado comoplausivelmente devido à perda da unidade Ci6H32O. Outro ionfragmentado em m/z 239 (Ci6H3i04) embora baixo emintensidade também estava presente significando o próprioácido graxo sn-1. Com base nessas deduções, a estrutura foiproposta como 2-hidroxy-l-palmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (padrão comercial) por comparação dos seusdados espectrais LC/MS e MS/MS (comparações de ionsfragmentados mostrados na Tabela 10).

Os dados espectrais MS/MS dos seis metabólitosremanescentes eram muito similares àqueles de 495.3328, aúnica diferença sendo as diferenças nas cadeias laterais deácido graxo sn-1. Para os metabólitos 519.3328 (520 M-H),521.3481 (522 M-H), e 523.3640 (524 M-H), a perda de H2O deseus ions matriz resultou em ions fragmentados m/ζ 518,520 e 522 respectivamente sugerindo que suas cadeiaslaterais de ácidos graxos variavam com um crescente grau deinsaturação. Para 520, a cadeia lateral sn-1 foi deduzidacomo ácido linoléico devido ao ion fragmentado em m/z 281.

Em 522 e 524, um ion fragmentado comum em m/z 258, seriasupostamente devido à perda de substituintes de oleil(Ci8H33O) e estearil (Ci8H35O) dos seus ions matrizconfirmando assim as cadeias laterais de ácido oléico eesteárico respectivamente. Para o metabólito 541.3148 (542M-H) , o ion fragmentado em m/z 225 foi deduzido como perdada cadeia lateral eicosapentenóica. Utilizando os dadosMS/MS acima discutidos, as estruturas desses 7biomarcadores de câncer de próstata como mostrado na Tabela 2.

Os espectros de fragmentação dos sete metabólitosdetectados no modo de ionização negativo (i.e., metabólitoscom massas exatas de 481.3171, 531.3123, 541.3422,555.3101, 565.3394, 567.3546, e 569.3687), são mostradosnas Figuras de 14 a 20 (energias de colisão de 20, 35 e 50volts). As fórmulas moleculares sugeriram que quatro(541.3422, 565.3394, 567.3546, 569.3687) de setebiomarcadores possuiriam formulas similares a RN09P, onde Ré o tipo de ácido graxo variável, indicando que elespoderiam ser compostos relacionados a fosfolipidios deetanolamina. A Tabela 11 sumariza as formulas moleculares eestruturas putativas das moléculas com base nos dadosMS/MS. As Tabelas de 12 a 18 listam as massas de ionsfragmentados, formulas putativas dos fragmentos e perdas defragmentos bem como as estruturas putativas para cadafragmento.

No modo negativo com ionização por eletrospray (ESI),cada uma das sete moléculas perde um próton resultando noion molecular correspondente ([M-H+] ) nos seus espectrosMS/MS. Isso sugere a de-protonizaçao do grupo de fosfato,deixando o íon de fosfato carregado negativamente como oion matriz. fons fragmentados foram observados para acadeia lateral de ácido graxo sn-1 para os marcadores481.3168 e 541.3422 (palmitil, Ci6H3i02, m/z 255), 565.3394(linoleil, Ci8H3i02, m/z 279), 567.3546 (oleil, Ci8H33O2, m/z281), e 569.3687 (estearil, Ci8H35O2, m/z 283) como sinaisproeminentes nos seus espectros MS/MS. Ao comparar osespectros MS/MS de 569.3687 com o seu correlativo delisofosfolipidio de etanolamina correspondente, 2-hidroxi-l-estearil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (C23H48NO7P, massaexata: 481.317) (padrão comercial), uma quantidade desemelhanças foi observada (Tabela 19). A perda de fragmentoinicial do ion matriz [M + H]" de 569.3687 eracorrespondente a uma perda de massa de 60 unidades deDalton que está associada à formula C2H4O2. Essa perda defragmento foi consistente com todos os marcadores do painelacima com exceção de 4 81.3171 que tem uma formula deC23H48NO7P similar à formulação geral dos tipos sn2-hidroxifosfoetanolamina. Ao comparar o fragmento m/z 508 de569.3687 com o ion matriz do seu padrão comercial delisofosfoetanolamina (m/z 480), uma diferença de apenas 28unidades de Dalton foi observada, o que leva à derivação dotipo de estruturas de Ν,Ν-dimetil fosfoetanolamina para opainel de biomarcadores. As perdas de fragmentos após aperda de ácido graxo sn2, m/z 242, 168, 153 e 79 sãoconstantemente observadas para todos os sete biomarcadoresconfirmando ainda um plausível tipo dimetil etanolamina deespinha dorsal na molécula.

Enquanto os dados MS/MS relatados são consistentes commoléculas da espécie lisofosfolipidio, a presente invençãotambém inclui estruturas onde grupos funcionais oufragmentos relatados são conectados de maneiras que não sãopresentemente indicadas.

Exemplo 4: Desenvolvimento de Método Comercial de AltoRendimento

Um método de análise de alto rendimento (HTS) foidesenvolvido para diagnosticar o câncer de próstata. Ométodo descrito abaixo é compatível com a atualinstrumentação laboratorial e espectrômetros de massatriplo-quadrupolo que se encontram, em muitos laboratóriosglobalmente (13,14).

Uma análise de alto rendimento (HTS) foi realizada comum espectrômetro de massa de íon trap linear (Q-trap 4000,Applied Biosystem) acoplado com o sistema Agilent 1100 LC.Amostras de soro foram extraídas como descrito no Exemplo1. A fração aquosa foi misturada 1:3 com acetonitrilo paraprecipitar proteínas antes de usar para a análise de cadaamostra. 15ul de padrão interno (reserpina em metanol:lOOug/mL para ESI negativo; lug/mL para ESI positivo) e108μΙϋ de 3:1 (acetonitrilo) : 1% de ácido fórmico em ddH20)foi adicionado a cada alíquota de amostra de 12 μΙ, para umvolume total de 135μΙα. O auto-classificador injetou ΙΟΟμΙ;da amostra por análise de injeção de fluxo (FIA) em um ABI4000 QTRAP. O solvente catalisador foi 60:40 (metanol):(1%de ácido fórmico em ddH20), com um índice de fluxo de450uL/min na fonte APCI.

Os métodos HTS MS/MS (ESI negativo e positivo) foramdesenvolvidos em um espectrômetro de massa ABI 4000 QTRAPde íon trap linear quadrupolo equipado com uma fonte TurboVtm com uma sonda de ionspray. Os parâmetros de gás da sondaforam os seguintes: ESI negativo: (CUR: 10.0, CAD: 6, IS: -4500, TEM: 500, GSl: 50, GS2: 60, com aquecedor deinterface. Os ajustes do "composto" foram os seguintes:potencial de entrada (EP) : -10, e potencial de saída decélula de colisão (CXP): -10.0); ESI positivo: (CUR: 10.0,CAD: 6, IS: 5500, TEM: 500, GSl: 30, GS2: 60, com aquecedorde interface. Os ajustes do "composto" foram os seguintes:potencial de entrada (EP) : 10, e potencial de saída decélula de colisão (CXP): 15.0).

Os métodos foram baseados na monitoração de reaçãomúltipla (MRM) de 2 transições MRM para cada biomarcador, e2 transições MRM para o padrão interno (reserpina, emboraoutros compostos possam ser usados) para um total de 16MRMs para cada método. Cada uma das transições foimonitorada por IOOmseg ou 70mseg para os modos ESI positivoe negativo, respectivamente. 0 tempo de aquisição total poramostra foi de aproximadamente 1 min. Resumidamente, cadamétodo mediu as intensidades de cada uma das 14 transiçõesMRM de biomarcadores (de 7 matrizes) e 2 padrões internos(IS) transições MRM (de i matriz) como mostrado na Tabela20. Foi gerada então uma contagem para o pacientedeterminando-se o mais baixo índice transformado médio-normalizado Iog(2) dos sete biomarcadores medidos:transições IS por paciente. Esse valor foi então comparadocom uma distribuição de contagens geradas de indivíduosnormais, e dessa forma foi determinado um fator de riscopara câncer de próstata. Foi confirmado que o ABI 4000QTRAP foi capaz de medir precisamente as áreas de pico detransição MRM utilizando o método descrito acima ao traçaras áreas de pico das transições de biomarcadores versus astransições de padrão interno para cada um dos setebiomarcadores para cada método. Além disso, o método HTStambém incorpora uma série de diluições de material de sorode referencia humano extraído, o que permitiu adeterminação e certeza da linearidade do instrumento. Se acurva de calibração possui um valor R2 <0;98, então apassagem da amostra é considerada falha e a amostra precisaser repassada.

Segundo descrição acima, o método triplo-quad. HTSpara câncer de próstata compreende dois componentes deaquisição de dados independentes devido ao fato de quemetade das moléculas é detectada no modo negativo, e aoutra metade no modo positivo.

Para as sete moléculas de lisofosfatidilcolinadetectadas no modo positivo (i.e., metabólitos com massasexatas de 495.3328, 517.3148, 519.3328, 521.3480, 523.3640,541.3148, e 545.3460), as transições utilizadas paramedição são mostradas na Figura 21A, e compreendem duastransições de íon filial por molécula para cada um dosbiomarcadores (a e b, com a exceção de 546.3, na qual umaúnica transição foi usada), e duas transições padrãointernas por amostra (1 e 2) . Dividindo cada transição debiomarcador por cada transição padrão interna resultouconseqüentemente em 2 6 índices por biomarcador. Uma amostrade soro de referencia normal também é analisada emdiluições variadas para avaliar a linearidade doinstrumento, para os quais o coeficiente R-squared pode sercalculado. Os valores médios R-squared para os dadosobtidos abaixo para cada índice de transição são mostradosna Figura 21A. Um gráfico de amostra das intensidadesmédias das diluições para 496.3/184.2al é mostrado naFigura 21B. Os dados de índices foram então normalizadospara o meio da população controle e Iog (2) transformado. 0valor de índice mais baixo por paciente foi entãoselecionado como o resultado final de contagem. Asdistribuições dessas contagens de pacientes foram entãovisualizadas para determinar o ponto de corte do ótimodiagnóstico.

As mesmas 24 amostras de soro de câncer de próstatautilizadas para a fase de descoberta foram re-analisadasutilizando esse método, juntamente com um conjuntoindependente expandido de 147 amostras controle de machos.0 índice médio (não Iog transformado) para cada uma das 26transições nos grupos controle e câncer de próstata émostrado na Figura 21C. Como esperado, a intensidade decada índice é mais baixa no grupo de câncer de próstata emcomparação com os controles.

As contagens finais de pacientes (o índice Iog maisbaixo detectado por paciente) para esses pacientes sãomostradas no diagrama disperso na Figura 22A. Os resultadosmostram claramente que as contagens de pacientes dos 24pacientes com câncer de próstata (triângulos pretos) foramsignificativamente mais baixas do que a maioria dospacientes machos livres da doença (quadrados cinza claro).

Traçar as distribuições dos pacientes com base na contagemdo paciente, como mostrado na Figura 22B, refletiu asdescobertas anteriores e mostrou um desvio na distribuiçãodos pacientes com câncer de próstata (barras pretas) para aesquerda, indicando uma contagem geral de pacientes maisbaixa na maioria dos pacientes com câncer de próstata emrelação aos controles. A determinação de uma contagem decorte do paciente de -1.25, indicada pela linha pontilhadana Figura 22A, resultou em aproximadamente 75% desensibilidade (isto é, 75% dos pacientes com câncer depróstata tem contagens de menos de -1.25), e 91% deespecificidade (isto é, 91% da população controle masculinatem uma contagem maior do que -1.25). O valor-p gerado deum t-teste utilizando as contagens dos pacientes foi de1.09E-14 entre as amostras controle e câncer de próstata.

Para as sete espécies de lisolipidios detectadas nomodo negativo (481.3171, 531.3123, 541.3422, 555.3101,565.3394, 567.3546, e 569.3687), as transições do ionfilial para o método HTS são mostradas na Figura 23A. Ométodo é similar ao modo positivo, com quatro Índices (deduas medições padrão internas) gerados por ion matriz,resultando em 28 índices totais por amostra de paciente. Osvalores médios R-squared resultantes da análise demúltiplas amostras de soro diluídas para cada um dosíndices são também mostrados na Figura 23A. Um diagrama dodesvio padrão para o primeiro índice de transição(480.3/255.4al) é mostrado na Figura 23 B como um exemplo.Como esperado, os índices para cada uma das transiçõesforam mais baixos no grupo de câncer de próstata em relaçãoaos controles, como mostrado no gráfico de barras na Figura23C.

As contagens finais dos pacientes (índice Iog maisbaixo detectado por paciente) para os sete metabólitosdetectados no modo negativo são mostrados no diagramadisperso na Figura 24A. Os resultados mostram claramenteque as contagens de pacientes dos 24 pacientes com câncerde próstata (triângulos pretos) foram significativamentemais baixas do que na maioria dos pacientes machos livresda doença (quadrados cinza claro). Traçar as distribuiçõesdos pacientes com base na contagem do paciente, comomostrado na Figura 24B, refletiu as descobertas anteriorese mostrou um desvio na distribuição dos pacientes comcâncer de próstata (barras pretas) para a esquerda,indicando uma contagem geral mais baixa por paciente namaioria dos pacientes com câncer de próstata em relação aoscontroles. A determinação de uma contagem de corte depaciente de -1.00, indicada pela linha pontilhada na Figura24A, resultou em aproximadamente 79% de sensibilidade (istoé, 79% dos pacientes com câncer tem contagens de menos que-1.00), e 81% de especificidade (isto é, 81% da populaçãocontrole masculina tem uma contagem maior do que 1.25). 0valor-p gerado de um teste-t utilizando as contagens dospacientes foi de 4.11E-14 entre as amostras controle ecâncer de próstata.Como seria do conhecimento de um especialista noassunto, o valor de corte poderia ser alterado para cima oupara baixo para favorecer a sensibilidade ou aespecificidade, respectivamente. Essa performance ésuperior àquela alcançada com o teste de PSA. Como estemétodo é preciso e pode ser realizado rapidamente em umaamostra de soro, com a análise da população masculina seriapossível identificar casos não detectados, econseqüentemente haveria um enorme impacto na mortalidadepor câncer de próstata.

Como também seria do conhecimento de um especialista,vários subconjuntos de suas transições e índices medidospoderiam ser utilizados para otimizar a precisão dodiagnóstico. Da mesma forma, realizar uma análise serial decada um dos modos positivo e negativo e então ordenar oucombinar os resultados também pode melhorar a sensibilidadee a especificidade. Por exemplo, pacientes incorretamentediagnosticados utilizando apenas um método (modo positivo)podem ser corretamente classificados com o método negativo,ou vice versa. Alternativamente, dados de ambos os modospositivo e negativo poderiam ser adquiridos primeiro,seguidos pela geração de uma única contagem de paciente combase no conjunto de dados cumulativos totais.

Todas as citações são aqui incorporadas a título dereferencia.

A presente invenção foi descrita com relação a uma oumais representações. Entretanto, ficará evidente aosespecialistas no assunto que uma quantidade de variações emodificações podem ser feitas sem se afastar do âmbito dainvenção como definido nas reivindicações.

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<table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table><table>table see original document page 71</column></row><table><table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table><table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table>Tabela 2: Massas exatas, formulas moleculares putativas eestruturas propostas para os 7 biomarcadores de câncer depróstata detectados em extratos aquosos (ionização químicapositiva) de soro humano

<table>table see original document page 79</column></row><table>Tabela 3: Fragmentação MS/MS de biomarcadores de câncer depróstata 495.3328, C24H50NO7P (m/z representa a massa [M + M} + )

<table>table see original document page 80</column></row><table>Tabela 4: Fragmentaçao MS/MS de S/MS de biomarcadores de câncer depróstata 517.3147, C26H48N07P (Wz representa a massa [M + M)+)

<table>table see original document page 81</column></row><table><table>table see original document page 82</column></row><table>Tabela 6: Fragmentação MS/MS de biomarcadores de câncer Cpróstata 521.3481, C26H53NO7P* (m/z representa a massa [Η + H}

<table>table see original document page 83</column></row><table><table>table see original document page 84</column></row><table><table>table see original document page 85</column></row><table>Tabela 9: Fragmentação MS/MS depróstata

biomarcadores de câncer de

545.3460, C2eH53NO7P* (m/z representa a massa [M ♦ M)

<table>table see original document page 86</column></row><table>Tabela 10 : Comparacao dos padroes de fragmentos de ions para2-hidroxi-1-paqlmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina e 495.3328

<table>table see original document page 87</column></row><table>Tabela 11: Massas exatas, formulas moleculares putativas eestruturas propostas para os 7 biomarcadores de câncer depróstata detectados em extratos aquosos (ionização deeletrospray negativa) de soro humano

<formula>formula see original document page 88</formula>Tabela 12: Fragmentação MS/MS de biomarcador de câncer depróstata 481.3171, C23H48NO7P (m/z representa a massa [Μ - H}_)

<table>table see original document page 89</column></row><table>Tabela 13: Fragmentação MS/MS de biomarpróstata 531.3123, C30H46NO5P (m/z representa a massa (M-H)-)

<table>table see original document page 90</column></row><table>Tabela 14: Fragmentação MS/MS de

biomarcador de câncer de;;r,;",ta Ml.«80, C25H52NO9P O/z «presente a ^assa 1» - H1",

<table>table see original document page 91</column></row><table>Tabela 15: Fragmentação MS/MS de biomarcador de câncer depróstata 555.3172, C26H54NO9P (m/z representa a massa [Μ - H} )

<table>table see original document page 92</column></row><table>Tabela 16: Fragmentação MS/MS de biomarcador de câncer depróstata 565.3394, C27H52NO9P (m/z representa a massa [M - H)-)

<table>table see original document page 93</column></row><table>Tabela 17: Pra^enta^o MS/MS Ce Marcador de câncer de567 .3546, C21H51NO5P ,m/z representa a ,assa [Μ - Η)

<table>table see original document page 94</column></row><table>Tabela 18: Fragmentação MS/MS de Mercador de câncerpróstata 569.368, C21H56NO5P (m/z representa a massa [Η - H) )

<table>table see original document page 95</column></row><table><table>table see original document page 96</column></row><table>Tabela 20

Transições filiais adicionais listadastambém poderiam ser usadas em outros métodos no futuro.

<table>table see original document page 97</column></row><table>

Claims (14)

1. Método para diagnosticar câncer de próstata ou orisco de câncer de próstata em um paciente, o métodocaracterizado pelas etapas de:a) analisar uma amostra do paciente para obter dadosde quantificação para um ou mais do que um marcadormetabólito;b) comparar os dados de quantificação para um ou maisdo que um do dito marcador metabólito com dadoscorrespondentes obtidos a partir de uma ou mais do que umaamostra de referência, onde a dita comparação pode serusada para diagnosticar câncer de próstata ou o risco decâncer de próstata,onde um ou mais do que um marcador metabólito é selecionadoa partir dos metabólitos listados na Tabela 1, ou qualquercombinação dos mesmos.

2. Método para diagnosticar câncer de próstata ou orisco de câncer de próstata em um paciente, o métodocaracterizado pelas etapas de:a) analisar uma amostra do paciente para obter dadosde quantificação para um ou mais do que um marcadormetabólito;b) obter uma proporção para cada um dos um ou mais doque um marcador metabólico em relação a um metabólito decontrole interno;c) comparar cada proporção do dito um ou mais do queum do marcador metabólito para metabólito de controleinterno com dados correspondentes obtidos a partir de umaou mais do que uma amostra de referência, onde a ditacomparação pode ser usada para diagnosticar câncer depróstata ou o risco de câncer de próstata,onde um ou mais do que um marcador metabólito é selecionadoa partir dos metabólitos listados na Tabela 1, ou qualquercombinação dos mesmos.

3. Método para avaliar a eficácia de uma terapia paratratar câncer de próstata em um paciente caracterizado porcompreender:a) analisar uma amostra do paciente para obter dadosde quantificação para um ou mais do que um marcadormetabólito;b) comparar os dados de quantificação com dadoscorrespondentes obtidos a partir de uma ou mais do que umaamostra de referência, onde a dita comparação pode serusada para determinar se a terapia está melhorando o estadode saúde do paciente,onde um ou mais do que um marcador metabólito é selecionadoa partir dos metabólitos listados na Tabela 1, ou qualquercombinação dos mesmos.

4. Método para avaliar a eficácia de uma terapia paratratar câncer de próstata em um paciente, caracterizado porcompreender:a) analisar uma amostra do paciente para obter dadosde quantificação para um ou mais do que um marcadormetabólito;b) obter uma proporção para cada um dos um ou mais doque um marcador metabólico em relação a um metabólito decontrole interno;c) comparar cada proporção do dito um ou mais do queum do marcador metabólito para metabólito de controleinterno com dados correspondentes obtidos a partir de umaou mais do que uma amostra de referência, onde a ditacomparação pode ser usada para determinar se a terapia estámelhorando o estado de saúde do paciente,onde um ou mais do que um marcador metabólito é selecionadoa partir dos metabólitos listados na Tabela 1, ou qualquercombinação dos mesmos.

5. Método para diagnosticar câncer de próstata ou orisco de câncer de próstata em um paciente, caracterizadopor compreender as etapas de:a) selecionar uma amostra de um paciente para apresença ou ausência de um ou mais do que um marcadormetabólico selecionado do grupo consistindo de metabólitoslistados na Tabela 1 ou fragmentos ou derivados dos mesmos,onde uma diferença de intensidade em um ou mais do que umdos ditos marcadores metabólicos indica a presença decâncer de próstata ou o risco de câncer de próstata.

6. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5 caracterizado por a etapa (a)compreender analisar a amostra por espectrometria de massaacoplada a cromatografia liquida (LC-MS).

7. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5 caracterizado por o método ser ummétodo de alto rendimento e a etapa (a) compreenderanalisar a amostra por injeção direta ou espectrometria demassa por cromatografia liquida e espectrometria de massaem tandem de ion-trap linear.

8. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5 caracterizado por uma ou mais do queuma da amostra de referência ser uma pluralidade deamostras obtidas a partir de indivíduos de controle; uma oumais do que uma amostra base obtida a partir de paciente emuma data anterior; ou uma combinação das mesmas.

9. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5 caracterizado por o dito um ou mais doque um marcador metabólito ser selecionado do grupoconsistindo de lisofosfolipidios incluindolisofosfatidilcolinas, lisofosfatidiletanolaminas,lisofosfatidil-dimetiletanolaminas, lisofosfatidlserinas,lisosphingosilfosforil-colinas, lisofosfatidilgliceróis,lisofosfatidilinositóis, fatores ativadores de plaqueta(PAFs) e combinações dos mesmos.

10. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5 caracterizado por o dito um ou mais doque um marcador metabólito compreender metabólitos commassas exatas medidas em Daltons de, ou substancialmenteequivalente a (a)495.3328, (b) 517.3148, (c) 519.3328, (d)-521.3480, (e) 523.3640, (f) 541.3148, (g) 545.3460, (h)-481.3171, (i) 531.3123, (j) 541.3422, (k) 555.3101, (1)-565.3394, (m) 567.3546, e (n) 569.3687; e onde osmetabólitos estão diminuídos em pacientes com câncer depróstata.

11. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5 caracterizado por o dito um ou mais doque um marcador metabólito compreender metabólitos commassas exatas medidas em Daltons de, ou substancialmente a(a) 495.3328, (b) 517.3148, (c) 519.3328, (d) 521.3480, (e)- 523.3640, (f) 541.3148, (g) 545.3460, (h) 481.3171, (i)- 531.3123, (j) 541.3422, (k) 555.3101, (1) 565.3394, (m)- 567.3546, (n) 569.3687, onde os metabólitos (a) até (n)estão diminuídos em pacientes com câncer de próstata; eonde os metabólitos (a) até (g) são compostos relacionadosà lisofosf atidilcolina e os metabólitos (h) até (n) sãocompostos relacionados a N,N-dimetil-lisofosfoetanolamina.

12. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5 caracterizado por o dito um ou mais doque um metabólito ser definido por:a) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 495.3328; e um espectro deMS/MS como mostrado na Figura 7, e/ou como descrito naTabela 3;b) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 517.3148; e um espectroMS/MS como mostrado na Figura 8, e/ou como descrito naTabela 4;c) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 519.3328; e um espectroMS/MS como mostrado na Figura 9, e/ou como descrito naTabela 5;d) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 521.3480; e um espectroMS/MS como mostrado na Figura 10, e/ou como descrito naTabela 6;e) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 523.3640; e um espectroMS/MS como mostrado na Figura 11, e/ou como descrito naTabela 7;f) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 541.3148; e um espectroMS/MS como mostrado na Figura 12, e/ou como descrito naTabela 8;g) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 545.3460; e um espectroMS/MS como mostrado na Figura 13, e/ou como descrito naTabela 9;h) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 481.3171; e um espectroMS/MS como mostrado na Figura 14, e/ou como descrito naTabela 12;i) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 531.3123; e um espectroMS/MS como mostrado na Figura 15, e/ou como descrito naTabela 13;j) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 541.3422; e um espectroMS/MS como mostrado na Figura 16, e/ou como descrito naTabela 14;k) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 555.3101; e um espectroMS/MS como mostrado na Figura 17, e/ou como descrito naTabela 15;1.) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 565.3394; e um espectroMS/MS como mostrado na Figura 18, e/ou como descrito naTabela 16;m) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 567.354 6; e um espectroMS/MS como mostrado na Figura 19, e/ou como descrito naTabela 17; en) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 569.3687; e um espectroMS/MS como mostrado na Figura 20, e/ou como descrito naTabela 18,respectivamente; onde os metabólitos (a) até (n) estãodiminuídos em pacientes com câncer de próstata; e onde osmetabólitos (a) até (g) são relacionados a compostos delisof osf atidilcolina e os metabólitos (h) até (n) sãocompostos relacionados a N,N-dimetil-lisofosfoetanolamina.

13. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5 caracterizado por um ou mais do que ummetabólito ser definido por:a) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 4 95.3328; um espectro MS/MScomo mostrado na Figura 7, e/ou como descrito na Tabela 3;e fórmula molecular C24H50NO7P;b) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 517.3148; um espectro MS/MScomo mostrado na Figura 8, e/ou como descrito na Tabela 4;e fórmula molecular C26H48NO7P;c) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 519.3328; um espectro MS/MScomo mostrado na Figura 9, e/ou como descrito na Tabela 5;e fórmula molecular C26H50NO7P;d) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 521.3480; um espectro MS/MScomo mostrado na Figura 10, e/ou como descrito na Tabela 6;e fórmula molecular C26H52NO7P;e) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 523.3640; um espectro MS/MScomo mostrado na Figura 11, e/ou como descrito na Tabela 7;e fórmula molecular C26H54NO7P;f) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 541.3148; um espectro MS/MScomo mostrado na Figura 12, e/ou como descrito na Tabela 8;e fórmula molecular C28H48NO7P;g) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 545.3460; um espectro MS/MScomo mostrado na Figura 13, e/ou como descrito na Tabela 9;e fórmula molecular C28H52NO7P;h) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 481.3171; um espectro MS/MScomo mostrado na Figura 14, e/ou como descrito na Tabela12; e fórmula molecular C23H48NO7P;i) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 531.3123; um espectro MS/MScomo mostrado na Figura 15, e/ou como descrito na Tabela13; e fórmula molecular C30H46NO5P;j) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 541.3422; um espectro MS/MScomo mostrado na Figura 16, e/ou como descrito na Tabela-14; e fórmula molecular C25H52NO9P;k) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 555.3101; um espectro MS/MScomo mostrado na Figura 17, e/ou como descrito na Tabela-15; e fórmula molecular C25H50NOioP;-1) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 565.3394; um espectro MS/MScomo mostrado na Figura 18, e/ou como descrito na Tabela-16; e fórmula molecular C27H52NO9P;m) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 567.3546; um espectro MS/MScomo mostrado na Figura 19, e/ou como descrito na Tabela-17; e fórmula molecular C27H54NO9P; en) massas exatas medidas em Daltons de, ousubstancialmente equivalente a 569.3687; um espectro MS/MScomo mostrado na Figura 20, e/ou como descrito na Tabela-18, e fórmula molecular C27H56NO9P,onde os metabólitos (a) até (n) estão diminuídos empacientes com câncer de próstata; e onde os metabólitos (a)até (g) são relacionados a compostos delisofosf atidilcolina e os metabólitos (h) até (n) sãocompostos relacionados a N,N-dimetil-lisofosfoetanolamina.

14. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5 caracterizado por um ou mais do que ummetabólito ser definido pela estrutura:<formula>formula see original document page 106</formula><formula>formula see original document page 107</formula>respectivamente; e onde os metabólitos (a) a (n)diminuídos em pacientes com câncer de próstata.