BRPI0712812A2 - biomarcadores úteis para diagnosticar esclerose múltipla e outras desordens e seus metodos - Google Patents

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Abstract

BIOMARCADORES úTEIS PARA DIAGNOSTICAR ESCLEROSE MúLTIPLA E OUTRAS DESORDENS E SEUS MéTODOS. A presente invenção descreve métodos o disgnóstico e diagnóstico diferencial das diferentes formas de esclerose múltipla. Os métodos medem as intensidades de moléculas pequenas específicas chamadas de metabólitos em amostras de pacientes clinicamnete diagnosticados com esclerose múltipla recidiva-remissão ou formas primárias-progressivas e comparar essas intensidades com intensidades observadas em uma população de indivíduos saudáveis, assim identificando marcadores de esclerose múltipla. Também é proporcionando um método para diagnóstico diferencial de sujeitos afetdaos de esclerose múltipla recidiva-remissão a partir de esclerose múltipla secundário-progressivo.

Description

BIOMARCADORES ÚTEIS PARA DIAGNOSTICAR ESCLEROSE MÚLTIPLA E OUTRAS DESORDENS E SEUS MÉTODOS
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere a pequenas moléculas ou metabólitos que se descobriu terem diferentes abundâncias ou intensidades entre a ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada ou outras desordens neurológicas, e pacientes normais. A presente invenção também se refere a métodos para diagnosticar a ESCLEROSE MÚLTIPLA e outras desordens neurológicas, ou indivíduos com risco de ter a ESCLEROSE MÚLTIPLA ou outras desordens neurológicas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A ESCLEROSE MÚLTIPLA é a mais comum desordem neurológica que afeta as pessoas abaixo dos trinta anos, e está em segundo lugar apenas em relação à epilepsia como a doença mais comum do sistema nervoso central (CNS) [1]. É geralmente aceito que a ESCLEROSE MÚLTIPLA é uma desordem auto-imune que resulta em áreas focais e distintas de inflamação e demyelination (perda de mielina) por toda a substância branca do CNS .
O índice de prevalência da ESCLEROSE MÚLTIPLA na América do Norte vai de 1 por 500 a 1 por 1000, afetando uma estimativa de 50.000 canadenses e 400.000 americanos; existem aproximadamente 2 milhões de pessoas afetadas no mundo todo. Estudos epidemiológicos revelaram que as fêmeas tem duas vezes mais probabilidades de desenvolver a doença, a idade de início é relativamente cedo (idade pico de 30 anos), e que existe uma grande suscetibilidade nas pessoas que descendem do norte da Europa [2] . Embora diferentes teorias tenham implicado o envolvimento de vários fatores ambientais {3,6], disfunção imune [3,4], e anomalias genéticas [3,4] no desenvolvimento dessa desordem, a etiologia ainda é desconhecida. É razoável presumir que qualquer fator que resulte em uma reação auto-imune contra as proteínas da mielina resulta em ESCLEROSE MÚLTIPLA. A teoria mais aceita envolvendo a sua etiologia leva em conta vários fatores e sugere que indivíduos geneticamente suscetíveis são expostos a uma entidade estranha, como um vírus ou uma toxina, e através de algum tipo de mimetismo molecular, uma reação auto-imune contra a mielina é iniciada. Aproximadamente de cinco a quinze anos mais tarde os primeiros sintomas clínicos se tornam aparentes/evidentes. [7],
A marca patológica da ESCLEROSE MÚLTIPLA são as áreas distintas e focais de perda de mielina, conhecidas como placas ou lesões. Essas placas podem consistir de quantidades variadas de demyelination (perda de mielina), gliose, inflamação, edema e degradação axonal [8] . Embora as localizações exatas dessas placas variem entre os pacientes, um padrão anatômico geral é evidente. As placas no interior do cérebro humano são localizadas periventriculares, no lóbulo temporal, corpo caloso, nervos óticos, tronco cerebral, e/ou cerebelo e tendem a circundar um ou mais vasos sangüíneos [7,9]. Mais da metade dos pacientes com ESCLEROSE MÚLTIPLA possui placas dentro da porção cervical do cordão espinhal [10]. A conseqüência fisiológica das placas é a transmissão reduzida ou bloqueada dos impulsos nervosos que se manifesta como uma incapacidade sensorial e/ou motora. Em 2000, Lucchinetti et al [11] descreveram quatro padrões distintos de placas de ESCLEROSE MÚLTIPLA em termos de seus aspectos histológicos. Dois desses padrões sugerem que a demyeliation (perda de mielina) resulta da destruição das células produtoras de mielina no interior do CNS, oligodendrócitos, enquanto que os outros dois padrões indicam que a destruição da mielina resulta da célula T ou célula mais anticorpo objetivando a bainha da mielina. Os dois padrões onde oligodendrócitos são destruídos diferem um do outro pela destruição seletiva de proteínas de mielina específicas em um padrão. As lesões de demyelination (perda de mielina) que contém células T diferem devido ao depósito contendo imunoglobulina e complemento ativado característico de um padrão. A descoberta dos quatro padrões de placas de ESCLEROSE MÚLTIPLA foi importante já que ela indica que o processo de demyelination (perda de mielina) nessa desordem pode ser alcançado de várias formas, e, assim, corrobora a noção de que qualquer processo que inicie a formação dessas placas resulta na manifestação clínica da ESCLEROSE MÚLTIPLA.
No entanto, o exame patológico das placas da ESCLEROSE MÚLTIPLA é problemático na medida em que é derivado primariamente de tecido post-mortem, o que representa apenas um instantâneo da doença em um dado momento. A maior parte desse tecido é adquirida de indivíduos que tiveram ESCLEROSE MÚLTIPLA por vários anos, e conseqüentemente representa tecido do estágio crônico da doença. 0 tecido post-mortem pode fornecer alguma informação sobre a patologia da doença, mas não pode elucidar como a doença progride ou onde as lesões começaram. 0 exame de ressonância magnética (MRI) é comumente utilizado para visualizar as lesões da ESCLEROSE MÚLTIPLA in vivo. A utilização do MRI para estudar as lesões da ESCLEROSE MÚLTIPLA é limitada, no entanto, porque não pode fornecer informação sobre a composição patológica das lesões.
0 diagnóstico inicial da ESCLEROSE MÚLTIPLA é tipicamente ou por recidiva-remitência (RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA) ou primário-progressivo (PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA) . PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA é o diagnostico inicial em 10-15% dos pacientes e é definido como uma piora gradual dos sintomas durante o curso da doença sem qualquer remissão [4,12]. A RR- ESCLEROSE MÚLTIPLA é a forma mais comum já que é o diagnóstico inicial em 80% dos pacientes, e é definido por ataques clínicos (recidivas) que duram pelo menos 24 horas seguidos por recuperação parcial ou completa (remissão). Dentro dos 20 anos do diagnóstico inicial, 90% dos pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA passarão para a forma secundária- progressiva de ESCLEROSE MÚLTIPLA (SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA), onde os sintomas pioram e os períodos de remissão eventualmente desaparecem. Alguns pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA dentro de um período de tempo de 15 anos experimentam poucas recidivas sem piora dos sintomas e longos períodos de remissão; esses pacientes teriam desenvolvido ESCLEROSE MULTIPLA-benigna (BN-ESCLEROSE MÚLTIPLA) . Atualmente, não há evidencia que indique porque um paciente manifestaria inicialmente ou a PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA ou a RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA. Em 2001, os Critérios McDonald [13] foram publicados para padronizar o diagnóstico da ESCLEROSE MÚLTIPLA. 0 aspecto fundamental dos critérios envolve a evidencia objetiva das lesões disseminadas tanto no tempo quanto no espaço. A evidencia clinica sozinha pode ser adequada a assegurar um diagnóstico se: 1) o indivíduo tiver passado por dois ataques/recidivas e 2) houver evidencia clinica de duas ou mais lesões separadas por tempo e espaço. Se o indivíduo não atingir esse critério clinico, são realizados testes para-clínicos adicionais de MRI, análise de fluido cerebroespinhal (CSF) e/ou potenciais visuais evocados (VEP).. 0 MRI é o teste para-clinico mais sensível e específico já que ele pode fornecer evidencia objetiva da disseminação de lesões tanto no tempo quanto no espaço. A análise CSF pode fornecer evidencia de reações imunes ou inflamatórias de lesões e pode auxiliar o diagnóstico quando a apresentação clinica e os critérios MRI não são alcançados, mas não pode fornecer informações sobre a disseminação de lesões ou eventos no tempo e no espaço. Os VEP em ESCLEROSE MÚLTIPLA são adiados, mas mostram uma ondulação bem preservada e podem ser utilizados para fornecer evidencia de uma segunda lesão se a primeira lesão não afetar o caminho visual. A evidencia suplementar fornecida pelos testes para-clínicos podem resultar em um diagnóstico de: a) ter ESCLEROSE MÚLTIPLA, B) não ter ESCLEROSE MÚLTIPLA, ou c) ter possível ESCLEROSE MÚLTIPLA. A maioria dos indivíduos diagnosticados com ESCLEROSE MÚLTIPLA exibem a forma RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA, de modo que a disseminação das lesões no tempo e espaço é muitas vezes evidente. No entanto, como não existem períodos de remissão na PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA, os testes para-clínicos são particularmente importantes para assegurar um diagnóstico. A análise CSF e ou o MRI ou os VEP devem ser obtidos para fornecer evidencia objetiva sobre o espaço, enquanto que a utilização do MRI e a contínua progressão dos sintomas clínicos durante um ano poderiam fornecer evidencia sobre a disseminação pelo tempo.
Antes da utilização desses testes para-clínicos, foram necessários aproximadamente sete anos até que um médico pudesse assegurar um diagnóstico. Hoje, a utilização desses testes pode assegurar um diagnóstico de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em meses. Os Critérios McDonald reduziram o tempo necessário para um diagnóstico substancialmente, mas para aqueles indivíduos que dão diagnosticados com possível ESCLEROSE MÚLTIPLA, ou eventualmente irão receber um diagnóstico de PP- ESCLEROSE MÚLTIPLA, não foi o suficiente.
Ao mesmo tempo em que o teste para-clínico pode auxiliar no diagnóstico da esclerose múltipla e fornecer informação referente à disseminação de lesões, não se obtém nenhuma informação específica com relação à composição patológica das lesões. Além disso, a interpretação dos resultados dos testes para-clínicos é subjetiva e requer a perícia de pessoal treinado. E mais ainda, instrumentos tais como o exame patológico de placas de esclerose múltipla e o teste para- clínico não fornecem qualquer informação sobre a suscetibilidade da doença, mas sim são utilizados uma vez que os sintomas se tornam aparentes. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere a pequenas moléculas ou metabólitos que se descobriu terem abundância ou intensidades significativamente diferentes entre pessoas com ESCLEROSE MÚLTIPLA ou outras desordens neurológicas, e pacientes normais. A presente invenção também se refere a pequenas moléculas ou metabólitos que tem abundancias ou intensidades significativamente diferentes entre pessoas com neuropatologias associadas à ESCLEROSE MÚLTIPLA e pessoas com a ausência de tal patologia de modo que essas pequenas moléculas ou metabólitos podem ser indicativos de um estado patológico pré-clinico. A presente invenção também se refere a métodos para diagnosticar a ESCLEROSE MÚLTIPLA e outras desordens neurológicas.
A presente invenção fornece novos métodos para descobrir, validar e implementar um método de diagnóstico para uma ou mais doenças ou determinados estados de saúde. Em particular, a presente invenção fornece um método para o diagnostico e diagnostico diferencial da ESCLEROSE MÚLTIPLA em humanos através da medição dos niveis de especificas pequenas moléculas presentes em uma amostra e comparando-as com niveis de referencia "normais".
O tipo de desordem neurológica diagnosticada pelo método acima pode ser a ESCLEROSE MÚLTIPLA, ou outro tipo de desordem de perda de mielina. A amostra obtida do humano pode ser uma amostra de sangue.
É fornecido um método para o diagnostico de sujeitos afligidos pela ESCLEROSE MÚLTIPLA (recidiva-remissão ou primaria-progressiva) e/ou para o diagnostico diferencial de sujeitos em transição da ESCLEROSE MÚLTIPLA recidiva-remissão para a primária-progressiva.
Os métodos da presente invenção, incluindo testes de filtragem de alta resolução (HTS), podem ser utilizados para o seguinte, aos quais o "estado de saúde" especifico deste pedido pode se referir, mas não está limitado a, ESCLEROSE MÚLTIPLA:
1. identificar biomarcadores de pequenas moléculas metabólitos que podem discriminar entre múltiplos estados de saúde utilizando qualquer amostra biológica retirada de um indivíduo;
2. diagnosticar especificamente um estado de saúde utilizando metabólitos identificados no soro, plasma, sangue integral, CSF, e/ou outra biópsia de tecido como descrito neste pedido;
3. selecionar o número mínimo de aspectos de metabólitos requeridos para a estatística de performance de teste de ótimo diagnostico utilizando métodos estatísticos supervisionados tais como aqueles mencionados neste pedido;
4. identificar características estruturais de metabólitos de biomarcadores selecionados de analise metabolômica não-direcionada utilizando LC-MS/MS, MSn e NMR;
5. desenvolver um método LC-MS/MS de alta resolução para analisar níveis selecionados de metabólitos em soro, plasma, sangue integral, CSF, saliva, urina, cabelo, e/ou outra biópsia de tecido; e
6. diagnosticar um determinado estado de saúde, ou risco de desenvolver um estado de saúde determinando os níveis de qualquer combinação de aspectos de metabólitos divulgados pela análise do Espectrômetro de Massa de Transformada Fourier (FTMS) do soro do paciente ou outro fluido ou tecido biológico, utilizando qualquer método incluindo, mas não limitado a, espectrometria de massa, NMR, detecção d UV, ELISA (teste imunosorvente ligado a enzima), reação química, análise de imagem, ou outro.
A presente invenção fornece a monitoração ou filtragem longitudinal da população em geral para um ou mais estados de saúde utilizando qualquer aspecto único ou combinação de aspectos divulgados no método descrito acima.
A presente invenção também fornece várias centenas de massas de metabólitos que possuem abundâncias diferenciais estatisticamente significativas entre RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada, PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada, SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada, e amostras normais, também chamadas aqui de amostras de referencia. Das massas de metabólitos identificadas, um ótimo painel de entre quatro e 45 massas de metabólitos pode ser utilizado, ou qualquer número entre esses; por exemplo, um ótimo painel de .4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, .23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, .38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, ou 45 massas de metabólitos podem ser utilizadas para diferenciar entre RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada, PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada, SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada e estados normais. Em um exemplo específico, não limitador, um ótimo painel de 36 massas de metabólitos pode ser utilizado.
A presente invenção também fornece um painel de cerca de 257 massas de metabólitos que pode ser utilizado como um indicador de diagnostico do curso da doença RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em amostras de soro em comparação com amostras normais (ver Tabela 1); em um outro exemplo, o painel pode conter cerca de 240 massas de metabólitos. Em um exemplo mais específico, um ótimo painel de nove massas de metabólitos pode ser extraído e utilizado como um indicador de diagnóstico do curso da doença RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em amostras de soro em comparação com amostras normais; por exemplo, o painel de nove metabólitos pode incluir aqueles com massas (medidas em Daltons) 452.3868, 496.4157, 524.4448,540.4387, 578.4923, 580.5089, 594.4848, 596.5012, 597.5062 onde uma diferença de +/-5 ppm indicaria o mesmo metabólito.
Também, a invenção fornece um painel de cerca de 100 massas de metabólitos que podem ser utilizados como um indicador de diagnostico do curso da doença PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA em amostras de soro em comparação com amostras normais (ver Tabela 2); em um outro exemplo, o painel pode conter cerca de 60 massas de metabólitos. Em um exemplo mais específico, um ótimo painel de cinco massas de metabólitos pode ser extraído e utilizado como um indicador de diagnostico do curso da doença PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA em amostras de soro em comparação com amostras normais; por exemplo, o ótimo painel de cinco metabólitos pode incluir aqueles com massas (medidas em Daltons) 202.0453, 216.04, .243.0719, 244.0559, 857.7516, onde uma diferença de +/-5 ppm indicaria o mesmo metabólito.
Além disso, a invenção fornece um painel de cerca de 226 massas de metabólitos que podem ser utilizadas como um indicador de diagnostico do curso da doença SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA em amostras de soro em comparação com amostras normais (ver Tabela 3) ; em um outro exemplo, o painel pode conter cerca de 129 massas de metabólitos. Em um exemplo mais especifico, um ótimo painel de dezoito massas de metabólitos pode ser extraído e utilizado como um indicador de diagnóstico do curso da doença SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA em amostras de soro em comparação com amostras normais; por exemplo, o ótimo painel de dezoito metabólitos pode incluir aqueles com massas (medidas em Daltons) 194.0803, 428.3653, .493.385, 541.3415, 565.3391, 576.4757, 578.4923, 590.4964, .594.4848, 495.4883, 596.5012, 596.5053, 597.5062, 597.5068, .805.5609, 806.5643, 827.5446, 886.5582, onde uma diferença de +/-5 ppm indicaria o mesmo metabólito.
Além do mais, a invenção fornece um painel de cerca de .142 massas de metabólitos que podem ser utilizados como um indicador de diagnostico do curso da doença RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em amostras de soro em comparação com amostras de SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA (ver Tabela 4); em um outro exemplo, o painel pode conter cerca de 135 massas de metabólitos. Em um exemplo mais especifico, um ótimo painel de seis massas de metabólitos que podem ser extraídos e utilizados como um indicador do curso da doença RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em amostras de soro em comparação com amostras de SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA, também chamada aqui de amostra de referencia; por exemplo, o ótimo painel de seis metabólitos pode incluir aqueles com massas (medidas em Daltons) 540. 4387, 576.4757, 594.4848, 595.4883, 596.5012, 597.5062, onde uma diferença de ? +/-5 ppm indicaria o mesmo metabólito.
A presente invenção também fornece um painel de cerca de 148 massas de metabólitos que podem ser utilizados como um indicador de diagnostico da transição de pacientes com RR- ESCLEROSE MÚLTIPLA para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA comparada com a RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA, também chamada aqui de amostra de referencia (ver Tabela 5) ; em um exemplo mais especifico, um ótimo painel de 5 massas de metabólitos pode ser extraído e utilizado como um indicador de alterações neuropatológicas iniciais na transição de pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA comparada com a RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA; por exemplo, o ótimo painel de cinco metabólitos pode incluir aqueles com massas (medidas em Daltons) 576.4757, 578.4923, 594.4848, 596.5012, 597.5062, onde uma diferença de +/-5 ppm indicaria o mesmo metabólito.
Além disso, a invenção fornece um painel de cerca de 309 massas de metabólitos que podem ser utilizados como um indicador de diagnóstico da transição de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA comparada com SP- ESCLEROSE MÚLTIPLA (ver Tabela 6), também chamada aqui de uma amostra de referencia; em um outro exemplo, o painel pode conter cerca de 42 massas de metabólitos. Em um exemplo mais especifico, um ótimo painel de oito massas de metabólitos pode ser extraído e utilizado como um indicador de alterações neuropatológicas iniciais na transição de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA comparado com SP- ESCLEROSE MÚLTIPLA; por exemplo, o ótimo painel de oito metabólitos pode incluir aqueles com massas (medidas em Daltons) 617.0921, 746.5118, 760.5231, 770.5108, 772.5265, .784.5238, 786.5408, e 787.5452, onde uma diferença de +/-5 ppm indicaria o mesmo metabólito.
A presente invenção também fornece um método para diagnosticar a RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA, PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA, e a SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA, compreendendo os passos de: introduzir uma ou mais amostras de um ou mais pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada, PP- ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada, ou SP- ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada, introduzindo a dita amostra contendo uma pluralidade de metabólitos em um espectrômetro de massa de alta resolução, por exemplo, um Espectrômetro de Massa de Ressonância Ciclotrônica de ion com Transformada de Fourier (FTICR-MS); obter, identificar e quantificar dados para os metabólitos; criar um banco de dados dos ditos dados identificados e quantificados; comparar, identificar e quantificar dados da amostra com os dados correspondentes de uma amostra de um paciente normal (um que não tenha ESCLEROSE MÚLTIPLA); identificar um ou mais metabólitos que diferem; e selecionar o número minimo de marcadores de metabólitos necessários para um ótimo diagnostico.
Em outra representação da presente invenção é fornecido um método para identificar biomarcadores específicos para RR- ESCLEROSE MÚLTIPLA, PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA, e SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA, compreendendo os passos de: introduzir uma ou mais amostras de um ou mais pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada, PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA
clinicamente diagnosticada, ou SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada, a dita amostra contendo uma pluralidade de metabólitos em um FTICT-MS; obter, identificar e quantificar dados para os metabólitos; criar um banco de dados dos ditos dados identificados e quantificados; comparar os dados identificados e quantificados da amostra com dados correspondentes de uma amostra de um paciente normal (um que não tenha ESCLEROSE MÚLTIPLA); identificar um ou mais metabólitos que diferem; e selecionar o número mínimo de marcadores de metabólitos necessário para um ótimo diagnostico. Os marcadores de metabólitos necessários para um ótimo diagnostico de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em uma amostra de soro podem ser selecionados do grupo consistindo de metabólitos com massas exatas (medidas em Daltons) 452.3868, 496.4157, 524.4448, 540.4387, 578.4923, 580.5089, 594.4848, 596.5012, , 597.5062, onde uma diferença de +/- 5 ppm indicaria o mesmo metabólito. Os marcadores de metabólitos necessários para um ótimo diagnostico de PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA em uma amostra de soro podem ser selecionados do grupo consistindo de metabólitos com massas exatas (medidas em Daltons) 202.0453, 216.04, 243.0719, 244.0559, 857.7516, onde uma diferença de +/- 5 ppm indicaria o mesmo metabólito. Os marcadores de metabólitos necessários para um ótimo diagnostico de SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA em uma amostra de soro podem ser selecionados do grupo consistindo de metabólitos com massas exatas (medidas em Daltons) 194.0803, 428.3653, 493.385, 541.3415, 565.3391, 576.4757, 578.4923, 590.4964, 594.4848, 495.4883, 596.5012, 596.5053, 597.5062, 597.5068, 805.5609, 806.5643, 827.5446, 886.5582, onde uma diferença de + /- 5 ppm indicaria o mesmo metabólito. Os marcadores de metabólitos necessários para uma ótima diferenciação de pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA de SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA em uma amostra de soro podem ser selecionados do grupo consistindo de metabólitos com massas exatas (medidas em Daltons) 540.4387, 576.4757, 594.4848, 595.4883, 596.5012, 597.5062, onde uma diferença de +/- 5 ppm indicaria o mesmo metabólito. Os marcadores de metabólitos necessários para uma ótima diferenciação da transição de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA (RR-SP) em comparação com SP- ESCLEROSE MÚLTIPLA em uma amostra de soro podem ser selecionados do grupo consistindo de metabólitos com massas exatas (medidas em Daltons) 617.0921, 746.5118, 760.5231, 770.5108, 772.5265, 784.5238, 786.5408, e 787.5452, onde uma diferença de +/- 5 ppm indicaria o mesmo metabólito. Os marcadores de metabólitos necessários para uma ótima diferenciação da transição de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA para SP- ESCLEROSE MÚLTIPLA (RR-SP) em comparação com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em uma amostra de soro podem ser selecionados do grupo consistindo de metabólitos com massas exatas (medidas em Daltons) 576.4757, 578.4923, 594.4848, 596.5012, 597.5062, onde uma diferença de +/- 5 ppm indicaria o mesmo metabólito. Em outra representação da presente invenção é fornecido um método para diagnosticar um paciente em relação a RR- ESCLEROSE MÚLTIPLA, PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA, e SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA, compreendendo os passos de: analisar uma amostra do dito paciente para a quantificação de um ou mais marcadores de metabólitos e comparar as quantidades de marcadores de metabólitos com os dados correspondentes de uma amostra de um paciente normal (um que não tenha esclerose múltipla) . Os marcadores de metabólitos para o diagnostico de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em uma amostra de soro podem ser selecionados do grupo consistindo de metabólitos com massas exatas (medidas em Daltons) 452.3868, 496.4157, 524.4448, 540.4387, 578.4923, 580.5089, 594.4848, 596.5012, 597.5062, onde uma diferença de + /- 5 ppm indicaria o mesmo metabólito. Os marcadores de metabólitos para o diagnostico da PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA em uma amostra de soro podem ser selecionados do grupo consistindo de metabólitos com massas exatas (medidas em Daltons) 202.0453, 216.04, 243.0719, 244.0559, 857.7516, onde uma diferença de + /- 5 ppm indicaria o mesmo metabólito. Os marcadores de metabólitos para o diagnostico da SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA em controles saudáveis em uma amostra de soro podem ser selecionados do grupo consistindo de metabólitos com massas exatas (medidas em Daltons) 194 .0803, 428.3653, 493.385, 541.3415, 565.3391, 576.4757, 578.4923, 590 .4964, 594.4848, 495.4883, 596.5012, 596.5053, 597.5062, 597.5068, 805.5609, 806.5643, 827.5446, 886.5582, onde uma diferença de +/- 5 ppm indicaria o mesmo metabólito. Os marcadores de metabólitos para o diagnostico de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA a partir de SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA em uma amostra de soro podem ser selecionados do grupo consistindo de metabólitos com massas exatas (medidas em Daltons) 540.4387, 576.4757, .594.4848, 595.4883, 596.5012, 597.5062, onde uma diferença de +/- 5 ppm indicaria o mesmo metabólito. Os marcadores de metabólitos necessários para uma ótima diferenciação da transição de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA (RR-SP) em comparação com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA em uma amostra de soro podem ser selecionados do grupo consistindo de metabólitos com massas exatas (medidas em Daltons) 617.0921, 746.5118, 760.5231, 770.5108, 772.5165, .784.5238, 786.5408, e 787.5452, onde uma diferença de +/- 5 ppm indicaria o mesmo metabólito. Os marcadores de metabólitos necessários para uma ótima diferenciação da transição de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA (RR-SP) em comparação com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em uma amostra de soro podem ser selecionados do grupo consistindo de metabólitos com massas exatas (medidas em Daltons) .576.4757, 578.4923, 594.4848, 596.5012, 597.5062, onde uma diferença de +/- 5 ppm indicaria o mesmo metabólito.
As formulas moleculares e estruturas propostas para alguns dos biomarcadores de ESCLEROSE MÚLTIPLA referidos acima foram determinados em uma representação da presente invenção. Eles estão resumidos abaixo. De acordo com os resultados os biomarcadores poderiam ser derivativos de açúcares, fosfolipidios, e tocoferóis. RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em comparação com um paciente normal
<table>table see original document page 19</column></row><table> PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA em comparação com um paciente normal
<table>table see original document page 20</column></row><table>
SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA em comparação com um paciente normal
<table>table see original document page 20</column></row><table> <table>table see original document page 21</column></row><table> RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em comparação com um paciente com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA <table>table see original document page 21</column></row><table>
Transição de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA em comparação com um paciente com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA <table>table see original document page 21</column></row><table> Transição de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA em comparação com um paciente com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA
<table>table see original document page 22</column></row><table>
A identificação de biomarcadores específicos para ESCLEROSE MÚLTIPLA em soro humano é extremamente útil já que é minimamente invasivo, e podem ser utilizados para detectar a presença da patologia da ESCLEROSE MÚLTIPLA antes da manifestação de sintomas clínicos. Um teste de soro é minimamente invasivo e seria aceito pela população em geral. Descobriu-se que as massas de metabólitos atualmente identificadas tem abundancias significativamente diferenciais estatisticamente entre RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA, PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA, SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA e soro normal, do qual um ótimo painel pode ser extraído e utilizado como um indicador de diagnostico da presença da doença. Um teste diagnostico baseado em pequenas moléculas ou metabólitos em soro pode ser transformado em um teste relativamente simples e de custo efetivo que seja capaz de detectar metabólitos específicos. A tradução do método em um teste clinico, compatível com o atual equipamento laboratorial de química clinica, é comercialmente aceitável e efetivo, e poderia resultar em uma rápida distribuição mundial. Além disso, a exigência de pessoal altamente treinado para realizar e interpretar o teste seria eliminada.
Como a presente invenção se refere a painéis de moléculas que são aumentadas em indivíduos com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA e PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA em comparação com indivíduos saudáveis, o teste pode ser utilizado como um indicador de suscetibilidade para o tipo especifico de ESCLEROSE MÚLTIPLA ou, alternativamente, um indicador da doença em fase bem inicial. A possibilidade de um teste de predisposição para ESCLEROSE MÚLTIPLA altamente preciso em soro seria o primeiro do gênero.
0 impacto da presente invenção no diagnostico da ESCLEROSE MÚLTIPLA seria enorme, já que literalmente todo mundo poderia ser analisado longitudinalmente durante a vida para avaliar o risco. Dado que as características de performance do teste da presente invenção são representativas para a população em geral, esse teste sozinho poderia ser superior a qualquer outro método de analise atualmente disponível, já que pode ter o potencial de detectar a progressão da doença antes do surgimento de sintomas clínicos.
Esse sumário da invenção não descreve necessariamente todos os aspectos da invenção. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Esses e outros aspectos da invenção ficarão mais claros a partir da seguinte descrição na qual é feita referencia aos desenhos em anexo, nos quais:
A FIGURA IA mostra um diagrama de erro de treinamento da Análise de Prognostico de Micro-ordenação (PAM) e a FIGURA IB mostra um diagrama de erro de classificação validado, de acordo com uma representação da presente invenção.
A FIGURA 2 mostra probabilidades de diagnóstico validado para pacientes clinicamente diagnosticados com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA e controles, de acordo com uma representação da presente invenção.
A FIGURA 3 mostra uma curva característica receptor- operador (ROC) com base em probabilidades validadas, de acordo com uma outra representação da presente invenção.
A FIGURA 4 mostra predições diagnosticas para um equipamento de teste cego, de acordo com uma outra representação da presente invenção.
A FIGURA 5 mostra uma curva ROC em equipamento de teste previsto de pacientes clinicamente diagnosticados com RR- ESCLEROSE MÚLTIPLA e controles, de acordo com uma outra representação da presente invenção.
A FIGURA 6 mostra uma curva ROC baseada em pacientes clinicamente diagnosticados com PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA e controles, de acordo com outra representação da presente invenção.
A FIGURA 7 mostra uma curva ROC baseada em pacientes clinicamente diagnosticados com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA e controles, de acordo com uma outra representação da presente invenção.
A FIGURA 8 mostra uma curva ROC baseada em RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA e SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticadas de acordo com outra representação da presente invenção.
A FIGURA 9 mostra uma curva ROC baseada em pacientes clinicamente diagnosticados com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA e a transição de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA, de acordo com outra representação da presente invenção.
A FIGURA 10 mostra uma curva ROC baseada em SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada e a transição de pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA, de acordo com uma outra representação da presente invenção.
A FIGURA 11 mostra um sinal-de-ruído +/-SEM médio do painel de 9 biomarcadores de soro de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em relação a controles, de acordo com outra representação da presente invenção.
A FIGURA 12 mostra um sinal-de-ruido +/-SEM médio do painel de 5 biomarcadores de soro de PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA em relação a controles, de acordo com outra representação da presente invenção.
A FIGURA 13 mostra um sinal-de-ruido +/-SEM médio do painel de 18 biomarcadores de soro de SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA em relação a controles, de acordo com outra representação da presente invenção. A FIGURA 14 mostra um sinal-de-ruído +/-SEM médio do painel de 6 biomarcadores de soro de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em relação à SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA, de acordo com uma outra representação da presente invenção.
A FIGURA 15 mostra um sinal-de-ruido +/-SEM médio do painel de 5 biomarcadores de soro de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em relação a pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em transição para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA, , de acordo com outra representação da presente invenção.
A FIGURA 16 mostra um sinal-de-ruido +/-SEM médio da transição de pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA para SP- ESCLEROSE MÚLTIPLA painel de 8 biomarcadores de soro em relação à SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA, de acordo com uma outra representação da presente invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA
A presente invenção se refere a pequenas moléculas ou metabólitos que se descobriu terem abundancias ou intensidades significativamente diferentes entre pacientes clinicamente diagnosticados com ESCLEROSE MÚLTIPLA ou outras desordens neurológicas, e pacientes normais. A presente invenção também se refere a métodos para diagnosticar a ESCLEROSE MÚLTIPLA e outras desordens neurológicas.
A presente invenção fornece novos métodos para descobrir, validar e implementar um método de diagnóstico para uma ou mais doenças ou determinados estados de saúde. Em particular, a presente invenção fornece um método para o diagnóstico e o diagnóstico diferencial da ESCLEROSE MÚLTIPLA em humanos medindo os níveis de pequenas moléculas especificas presentes em uma amostra e comparando-as com níveis "normais" de referencia. Uma amostra de referencia pode ser uma amostra normal ou uma amostra de um paciente com outras formas de ESCLEROSE MÚLTIPLA. A amostra pode ser qualquer amostra biológica, incluindo, mas não exclusiva a sangue, urina, saliva, cabelo, fluido cerebroespinhal (CSF), amostras de biópsia ou autópsia. Os métodos medem as intensidades de pequenas moléculas especificas, também chamadas de metabólitos, na amostra de pacientes com ESCLEROSE MÚLTIPLA e comparam essas intensidades com as intensidades observadas em uma população de indivíduos saudáveis (não-ESCLEROSE MÚLTIPLA).
As pequenas moléculas medidas em uma amostra também podem ser chamadas aqui de "marcadores", "biomarcadores", ou "metabólitos". Os metabólitos podem ser caracterizados de qualquer forma conhecida, por exemplo mas não limitado a, pela massa (também chamada de "massa de metabólito" ou "massa exata"), formula molecular, polaridade, propriedades ácido/base, espectros NMR, espectros MS/MS ou MS", estrutura molecular, ou qualquer combinação deles. 0 termo "aspecto de metabólito" se refere a um metabólito, um fragmento dele, um análogo, ou um seu equivalente químico.
0 diagnostico ou a exclusão de quaisquer tipos de desordens neurológicas é contemplado pela presente invenção, utilizando todos ou um subconjunto de metabólitos divulgados aqui. Os tipos de desordens neurológicas incluem, mas não estão limitadas a: doença de Alzheimer (AD), demência com corpos Lewy (DLB), demência do lóbulo frontotemporal (FTD), demência induzida vascular (ex. , demência multi-infarto), demência induzida por evento anóxico (ex., parada cardíaca), demência induzida por trauma cerebral (ex., demência pugilístíca [demência de boxeur]), demência resultante de exposição a um agente infeccioso (ex., Doença de Creutzfeldt- Jakob), ou tóxico (ex., demência induzida por álcool), Encefalomielite Disseminada Aguda, Sindrome de Guillain- Barré, Adrenoleucodistrofia, Adrenomieloneuropatia,
Neuropatia Ótica Hereditária de Leber, Mielopatia associada a HTLV, Doença de Krabbe, fenilocetonuria, Doença de Canavan, Doença de Pelizaeus-Merzbacher, Doença de Alexander, Neuromielite Ótica, Mielinólise Pontino Central, Leucodistrofia Metacromática, Doença de Schilder, Autismo, Esclerose Múltipla, Doença de Parkinson, Transtorno Bipolar, Isquemia, Coréia de Huntington, Transtorno Depressivo Principal, Dano de Crânio Fechado, Hidrocefalia, Amnésia, Transtorno de Ansiedade, Dano Cerebral Traumático, Transtorno Obsessivo Compulsivo, Esquizofrenia, Retardamento Mental, Epilepsia e/ou outro transtorno que esteja associado a uma resposta imune, demyelination, mielite ou encefalomielite,
A presente invenção fornece um método para diagnosticar a ESCLEROSE MÚLTIPLA e os seus subtipos medindo os níveis de pequenas moléculas específicas presentes em uma amostra obtida de um humano e comparando-os a níveis "normais" de referencia.
De modo a determinar se existem marcadores bioquímicos de um determinado estado de saúde em uma população em particular, um grupo de pacientes representativos do estado de saúde (i.e., uma determinada doença) e um grupo de correspondentes "normais" são requeridos. Amostras biológicas retiradas dos pacientes em uma determinada categoria de estado de saúde são então comparadas com as mesmas amostras retiradas da população normal bem como pacientes em categorias de estados de saúde similares para identificar diferenças bioquímicas entre os dois grupos, analisando a bioquímica presente nas amostras utilizando FTMS e/ou LC-MS. As amostras biológicas poderiam se originar de qualquer parte do corpo, incluindo, mas não limitado a, sangue (soro/plasma), fluido cerebroespinhal (CSF), urina, fezes, saliva, ou a biopsia de qualquer tecido sólido incluindo tumor, normal adjacente, musculatura lisa e esquelética, tecido adiposo, fígado, pele, cabelo, cérebro, rim, pâncreas, pulmão, cólon, estomago, ou outro. De particular interesse são as amostras de soro. Quando o termo "soro" for utilizado aqui, os especialistas reconhecerão que plasma, sangue integral, ou uma subfração de sangue integral podem ser utilizados.
0 método da presente invenção, baseado em pequenas moléculas ou metabólitos em uma amostra, cria um teste de filtragem ideal já que o desenvolvimento de análises capaz de detectar metabólitos específicos é relativamente simples e de custo efetivo. 0 teste é minimamente invasivo e é indicativo da patologia da ESCLEROSE MÚLTIPLA, e pode ser útil para diferenciar subtipos de ESCLEROSE MÚLTIPLA uns dos outros. A tradução do método em um teste clinico compatível com o atual equipamento laboratorial de química clinica é comercialmente aceitável e efetivo. Além disso, o método da presente invenção não requer pessoal altamente treinado para realizar e/ou interpretar o teste.
A presente invenção também fornece centenas de massas de metabólitos que se descobriu terem abundancias diferenciais significativas estatisticamente entre a RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada, a PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada, a SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada e o soro normal.
Estratégias Metabolômícas Não-Direcionadas. Múltiplas estratégias metabolômícas não-direcionadas tem sido descritas na literatura científica incluindo estratégias NMR [14], GC- MS [15-17], LC-MS, e FTMS [14, 18-20]. A estratégia de perfil metabólico empregada para a descoberta de metabólitos diferencialmente expressos neste pedido foi a estratégia FTMS não-direcionada desenvolvida por Phenomenome Discoveries [17, 20-23; ver também Pedido Publicado US N0 2004-0029120 Al, Pedido Canadense N0 2.298.181, e WO 01/57518]. A análise não- direcionada envolve a medição de tantas moléculas em uma amostra quanto possível, sem qualquer prévio conhecimento ou seleção de componentes antes da análise. Conseqüentemente, o potencial da análise não-direcionada para descobrir novos biomarcadores de metabólitos é alto versus métodos direcionados, que detectam uma lista predefinida de moléculas. A presente invenção utiliza um método não- direcionado para identificar componentes de metabólitos em amostras de soro que diferem entre: .1. Pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada e controles saudáveis;
.2. Pacientes com PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada e controles saudáveis;
.3. Pacientes com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente
diagnosticada e controles saudáveis;
.4. Pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada e pacientes com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada;
.5. Pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada em transição para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA e pacientes com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada; e
.6. Pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em transição para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA e pacientes clinicamente diagnosticados com RR-ES CLEROSE MÚLTIPLA.
Processamento de Amostras. Quando uma amostra de sangue é retirada de um paciente existem várias maneiras pelas quais essa amostra pode ser processada. O âmbito do processamento pode ser tão restrito quanto nenhum (i.e., sangue integral congelado) ou tão complexo quanto o isolamento de um determinado tipo de célula. Os procedimentos mais comuns e rotineiros envolvem a preparação de soro ou plasma do sangue integral. Todos os métodos de processamento de amostras de sangue, incluindo salpicar amostras de sangue sobre apoios de fase sólida, tais como papel de filtro ou outros materiais imóveis, também são contemplados pela presente invenção. Extração de Amostras. A amostra de sangue processado descrita acima é então novamente processada para torná-la compatível com a técnica de analise metódica a ser empregada na detecção e medição da bioquímica contida na amostra de soro processada. Os tipos de processamento podem ir de tão pouco quanto nenhum processamento a tão complexo quanto a extração diferencial e derivação química. Os métodos de extração podem incluir a sonicação, extração soxhlet, extração assistida por microondas (MAE), extração de fluido supercrítico (SFE), extração por solvente acelerado (ASE), extração de liquido pressurizado (PLE), extração por água quente pressurizada (PHWE) , e/ou extração assistida por surfactante (PHWE) em solventes comuns como o metanol, etanol, misturas de álcoois e água, ou solventes orgânicos como o etil acetato ou hexano. 0 método preferido de extração de metabólitos para análise não-direcionada FTMS é o de realizar uma extração líquido/líquido através da qual os metabólitos não-polares se dissolvem em um solvente orgânico e os metabólitos polares se dissolvem em um solvente aquoso.
Analise de extratos por Espectrometria de Massa. Extratos de amostras biológicas são receptivos a analise em essencialmente qualquer plataforma de espectrometria de massa, seja por injeção direta ou seguindo a separação cromatográfica. Típicos espectrômetros de massa compreendem uma fonte, que ioniza moléculas dentro da amostra, e um detector para detectar as moléculas ionizadas ou fragmentos de moléculas. Exemplos de fontes comuns incluem impacto por elétron, ionização por eletrospray (ESI), ionização química por pressão atmosférica (APPI), ionização por desabsorção de laser assistido na matriz (MALDI), ionização por desabsorção de laser de superfície aumentada (SELDI), e seus derivados. Sistemas comuns de separação e detecção podem incluir quadrupolo, quadrupolo íon trap, tempo-de-vôo (TOF), setor magnético, íon ciclotrônico (FTMS), Orbitrap, e suas derivações e combinações. A vantagem do FTMS sobre outras plataformas com base em MS é a sua alta capacidade de resolução que permite a separação de metabólitos diferindo por apenas centésimos de um Dalton, muitos dos quais seriam perdidos por instrumentos de menor resolução.
Classificador de treinamento. 0 classificador de treinamento validado foi criado utilizando o algoritmo da Analise de Prognostico de Microsistemas (PAM) (http://www- stat.stanford.edu/~tibs/PAM/) [24]. 0 método envolve treinar um algoritmo classificador utilizando amostras com diagnostico conhecido que podem então ser aplicadas a amostras diagnosticadas às cegas (i.e., um conjunto de testes). Existem vários métodos supervisionados, dos quais qualquer um poderia ter sido usado para identificar o melhor conjunto de aspectos, incluindo redes neurais artificiais (ANNs), maquinas de apoio vetor (SVMs), análise parcial discriminatória de mínimos quadrados (PLSDA), métodos de associação sub-linear, métodos de inferência Bayesianos, analise de componente de princípio supervisionado, centróides encolhidos, ou outros (ver [25] para revisão).
Com referencia aos Exemplos 1 a 4, e com base na similaridade da formula molecular, padrões de fragmentação MS/MS, e dados NMR, os metabólitos identificados no soro, ou seus subconjuntos, compreendendo o conjunto de aspectos de diagnostico pode ser quimicamente relacionado. Além disso, existem muitos outros compostos relacionados presentes no conjunto de dados FTMS que também mostram uma maior abundancia na população com esclerose múltipla, e que compartilham formulas moleculares similares ao subconjunto identificado. Conseqüentemente, o resultado sugere que uma família inteira de metabólitos compartilhando propriedades estruturais em comum é anormal em pacientes com ESCLEROSE MÚLTIPLA. Sem querer se prender pela teoria, o caminho bioquímico responsável por regular os níveis desses metabólitos pode ser perturbado em pacientes com ESCLEROSE MÚLTIPLA, e conseqüentemente pode ser um alvo intervencional putativo para o tratamento. Possíveis tipos de intervenção incluem o desenvolvimento de combatentes ou antagonistas para as proteínas envolvidas nos caminhos implicados e/ou o desenvolvimento de suplementos nutricionais que diminuiriam a concentração dos metabólitos implicados ou o desenvolvimento de pró-drogas ou pró-nutrientes para diminuir a concentração desses metabólitos.
A presente invenção também fornece as características estruturais dos metabólitos utilizados para o diagnóstico diferencial da RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA, PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA, e SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA, que pode incluir a determinação da massa exata e da formula molecular, polaridade, propriedades ácido/base, espectros NMR, e espectros MS/MS ou MS". As técnicas utilizadas para determinar essas características incluem, mas não estão limitadas a, fase reversa LC-MS usando uma coluna C18 seguida pela análise por MS, fragmentação MS/MS utilizando dissociação induzida por colisão (CID), ressonância magnética nuclear (NMR), e extração. As características dos metabólitos obtidas por vários métodos são então usadas para determinar a estrutura dos metabólitos.
A presente invenção também fornece métodos de alta resolução para o diagnostico diferencial da ESCLEROSE MÚLTIPLA e estados normais. 0 método envolve a fragmentação da molécula matriz; em um exemplo não limitador, isso pode ser conseguido por um sistema Q-Trap tm. A detecção dos metabólitos pode ser realizada utilizando-se uma ou mais plataformas de teste, incluindo testes químicos colorimétricos (UV, ou outro comprimento de onda), testes imunosorventes ligados a enzimas com base em anticorpos (ELISAs) , testes baseados em chip e PCR para detecção de ácido nucléico, métodos de detecção de ácido nucléico baseados em cordão, testes químicos de varetas ou outra reação química, análises de imagem tais como a imagem por ressonância magnética (MRI), exame de tomografia por emissão de positron (PET) , exame de tomografia computadorizada (CT) , ressonância magnética nuclear (NMR), e vários sistemas baseados em espectrometria de massa..
Os metabólitos e os métodos da presente invenção também podem ser combinados com as atuais ferramentas de diagnostico da ESCLEROSE MÚLTIPLA, o que inclui a história clínica, análise por neuroimagem, potenciais evocados, e análise do fluido cerebroespinhal de proteináceos e componentes infl amatórios dentro do fluido cerebroespinhal. As técnicas de imagem incluem, mas não estão limitadas a, imagem por ressonância magnética estrutural (MRI), MRI por contraste aumentado, tomografia por emissão de positron (PET), tomografia computadorizada (CT), imagem por ressonância magnética funcional (fMRI), eletroencefalografia (EEG), tomografia por emissão de positron único (SPECT), potenciais relacionados a evento, magnetoencefalografia, e/ou imagem muiti-moda1. A avaliação clinica pode incluir, mas não está limitada a, escala de situação de incapacidade prolongada de Kurtzke (EDSS), escala de impacto da esclerose múltipla (MSIS), a escala de graduação neurológica de Scripps (NRS), o índice de ambulação (AI), escala de sintomas relacionados a MS, escala de atividades de 15 itens de auto-cuidado diário para Pessoas MS, escala de situação de Incapacidade, medida de independência funcional, e/ou oftalmoplegia internuclear. Um especialista reconheceria que a combinação de metabólitos e métodos como descrito aqui com as técnicas atuais tem o potencial de diagnosticar ou diferenciar qualquer forma de esclerose múltipla e/ou a sua patologia.
A presente invenção será ainda ilustrada nos exemplos seguintes.
Exemplo 1: Identificação de Metabólitos Expressos Diferencialmente
Metabólitos expressos diferencialmente são identificados em indivíduos com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada, PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada, SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente
diagnosticada, bem como em controles saudáveis.
Amostras Clinicas. Para o teste diagnostico de soro da ESCLEROSE MÚLTIPLA descrito, foram obtidas amostras de populações representativas de indivíduos saudáveis e aqueles com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada, PP- ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada, e pacientes com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada. Os marcadores bioquímicos de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA descritos na invenção foram derivados da analise de 93 amostras de soro de pacientes clinicamente diagnosticados com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA, amostras de soro de 18 pacientes com PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada, amostras de soro de 22 pacientes com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada, e 51 amostras de soro de controles. Os 93 pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA foram ainda divididos em um de dois grupos: aqueles ainda exibindo um curso de doença de recidiva-remissão (duração média da doença de 5,9 anos, η = 46) e aqueles transitando para o curso crônico da doença secundário-progressivo (duração média da doença de 11,4 anos, η = 47). As amostras nos quatro grupos foram de uma população diversa de indivíduos, variando em idade, demografia, peso, ocupação, e exibindo variados estados de saúde não relacionados à ESCLEROSE MÚLTIPLA. Todas as amostras foram coletas de um único tempo-ponto.
Os metabólitos contidos nas 184 amostras de soro utilizadas neste exemplo foram separadas em extratos polares e não-polares através de sonicação e mixagem vigorosa (mixagem por vórtice).
A análise de extratos de soro coletados de 184 indivíduos (93 clinicamente diagnosticados com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA, 18 clinicamente diagnosticados com PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA, 22 clinicamente diagnosticados com SP-ESCLEROSE- MULTIPLA, e 51 controles saudáveis) foi realizada por injeção direta em um FTMS e ionização ou por ESI ou por ionização química por pressão atmosférica (APCI) em ambos os modos positivo e negativo. As amostras de extratos foram diluídas três ou seis vezes em metanol:0.1% (v/v) hidróxido de amônio (50:50, v/v) para modos de ionização negativos, ou em metanol:0.1% (v/v) ácido fórmico (50:50, v/v) para modos de ionização positivos. Para APCI, os extratos de amostras foram diretamente injetados sem diluir. Todas as análises foram realizadas em um espectrômetro de massa de ressonância ciclotrônica de íon e transformada de Fourier Bruker Daltonics APEX III equipado com um magneto supercondutor ativamente blindado 7,0 T (Bruker Daltonics, Billerica, MA). As amostras foram diretamente injetadas usando ionização por sletrospray (ESI) e APCI a um índice de fluxo de 1200 ul por hora. Os parâmetros de transferência/detecção de íon foram otimizados utilizando uma mistura padrão de serina, tetra- alanina, reserpina, mistura de sintonização Hewlett-Packard e o fragmento hormonal adrenocorticorticotrópico 4-10. Além disso, as condições do instrumento foram sintonizadas para otimizar a intensidade do íon e acumulação de banda larga pela extensão de massa de 100-1000 amu de acordo com as recomendações do fabricante do instrumento. Uma mistura dos padrões acima mencionados foi utilizada para calibrar internamente cada espectro de amostra para exatidão da massa pela extensão de aquisição de 100-1000 amu.
No total seis análises separadas compreendendo combinações de extratos e modos de ionização foram obtidos para cada amostra: Extrato Aquoso
1. ESI positivo (modo de análise 1101)
2. ESI negativo (modo de análise 1102) Extrato orgânico
3. ESI positivo (modo de análise 1201)
4. ESI negativo (modo de análise 1202)
5. APCI positivo (modo de análise 1203)
6. APCI negativo (modo de análise 1204) Processamento de Dados da Espectrometria de Massa.
Utilizando uma linha de regressão linear de mínimos quadrados, os valores de eixo da massa foram calibrados de modo a cada pico de massa padrão interno ter um erro de massa de <1 ppm comparado com a sua massa teórica. Utilizando o software XMASS de Bruker Daltonics Inc., tamanhos de arquivos de dados de 1 megaword foram adquiridos e zero-filled para 2 megawords. Uma transformação de dados sinm foi realizada antes da transformada de Fourier e dos cálculos de magnitude. Os espectros de massa de cada análise foram integrados, criando uma lista de pico que continha a massa exata e intensidade absoluta de cada pico. Compostos na extensão de .100-2000 m/z foram analisados. De modo a comparar e sumarizar os dados através de diferentes modos de ionização e polaridades, todos os picos de massa detectados foram convertidos às suas massas neutras correspondentes assumindo a formação de aduzir hidrogênio. Um sistema auto-gerado bidimensional (massa vs. intensidade da amostra) foi então criado usando o software DlSCOVAmetrics tm (Phenomenome Discoveries Inc., Saskatoon, SK, Canadá). Os dados de múltiplos arquivos foram integrados, e esse arquivo combinado foi então processado para determinar todas as massas únicas. A média de cada massa única foi determinada, representando o eixo y. Esse valor representa a média de todas as massas exatas detectadas que foram estatisticamente determinadas como equivalentes. Considerando que a exatidão da massa do instrumento para os padrões de calibração é de aproximadamente 1 ppm, um especialista reconhecerá que essas massas médias podem incluir massas individuais que caiam dentro de +/- 5 ppm dessa massa media. Foi criada uma coluna para cada arquivo que foi originalmente selecionado para ser analisado, representando o eixo χ. A intensidade de cada massa encontrada em cada um dos arquivos selecionados foi então inserida na sua coordenada x, y representativa. Coordenadas que não contem um valor de intensidade foram deixadas em branco. Uma vez no sistema, os dados foram então processados, visualizados e interpretados, e foram designadas identidades químicas putativas. Foi então tomado o pico de cada um dos espectros para obter a massa e intensidade de todos os metabólitos detectados. Esses dados de todos os modos foram então fundidos para criar um arquivo de dados por amostra. Os dados de 184 amostras foram então fundidos e alinhados para criar um sistema de metabólitos bidimensional no qual cada amostra é representada por uma coluna e cada único metabólito é representado por uma única fileira. Na célula correspondente a uma dada combinação de amostras de metabólitos, a intensidade do metabólito naquela amostra é exibida. Quando os dados são representados nesse formato, os metabólitos mostrando diferenças entre grupos de amostras podem ser determinados.
Interpretação de Dados Avançados — Biomarcadores de Soro. O teste-T de um estudante foi utilizado para selecionar os metabólitos que diferiam significativamente entre os seguintes diferentes grupos clínicos em soro:
1. pacientes clinicamente diagnosticados com RR- ESCLEROSE MÚLTIPLA (n=46) e controles (n=51), [240 metabólitos, ver Tabela 1];
2. pacientes clinicamente diagnosticados com PP- ESCLEROSE MÚLTIPLA (n=18) e controles (n=51), [60 metabólitos, ver Tabela 2];
3. pacientes clinicamente diagnosticados com SP- ESCLEROSE MÚLTIPLA (n=22) e controles (n=51), [129 metabólitos, ver Tabela 3];
4. pacientes clinicamente diagnosticados com RR- ESCLEROSE MÚLTIPLA (n=46) e pacientes clinicamente diagnosticados com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA (n=22), [135 metabólitos, ver Tabela 4];
5. pacientes clinicamente diagnosticados com RR- ESCLEROSE MÚLTIPLA (n=46) e pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA transitando para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA [RR-SP] (n=47), [148 metabólitos, ver Tabela 5];
6. pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA transitando para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA [RR-SP] (n=47) e pacientes com SP- ESCLEROSE MÚLTIPLA (n=22) , [42 metabólitos, ver Tabela 6].
Metabólitos que eram menos de p<0.05 foram considerados significativos.
As Tabelas de 1-6 mostram aspectos de metabólitos cujas concentrações ou quantidades em soro são significativamente diferentes (p<0.05) entre as populações testadas e conseqüentemente tem utilidade de diagnóstico em potencial para identificar cada uma das populações mencionadas. Os aspectos são descritos pela sua massa exata e modo de análise, que juntos são suficientes para fornecer as formulas moleculares putativas e características químicas (tais como polaridade e grupos funcionais putativos) de cada metabólito.
Para cada emparelhamento clinico, um classificador de treinamento validado foi criado utilizando o algoritmo PAM, previamente descrito. 0 algoritmo classificador foi treinado usando amostras com diagnostico conhecido e então a amostra cega (i.e. conjunto de teste).
0 mais baixo classificador de treinamento obtido com o menor número de metabólitos foi selecionado para cada emparelhamento clinico. 0 gráfico na Figura IA mostra o número de metabólitos requerido para alcançar um dado erro de treinamento em vários valores de entrada (um parâmetro PAM definível de usuário). 0 diagrama mostra que um classificador de treinamento com menos de 22% de índice de erro (0.22 erro de treinamento) é possível com cinco aspectos de metabólitos (valor de entrada de aproximadamente 3.59, ver seta). 0 gráfico na Figura IB é conceitualmente similar ao da IA, entretanto, o gráfico em IB mostra o erro de classificação do classificador treinado para pacientes clinicamente diagnosticados com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA e pacientes controle seguindo o procedimento de validação integral ao programa PAM. A linha conectada pelos diamantes espelha o resultado anterior, mostrando que um erro mínimo de classificação validado foi alcançado utilizando-se apenas cinco metabólitos. Também mostra que pacientes clinicamente diagnosticados com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA, descritos pelos quadrados, foram diagnosticados como tendo RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA com uma precisão de 93% utilizando apenas um aspecto de três metabólitos, mas no seu inicio, o erro de classificação para os controles foi de 66% (ver setas). As probabilidades de diagnostico individual validado para cada um dos pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA e controles são mostradas na Figura 2. Todos os pacientes clinicamente diagnosticados com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA estão listados no lado direito do gráfico, e os controles estão à esquerda. Cada amostra contem dois pontos no gráfico, um mostrando a probabilidade de se ter RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA (quadrados), e um mostrando a probabilidade de não se ter RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA (i.e., diamantes normais). Pelo gráfico, seis amostras de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA foram classificadas como não-ESCLEROSE MÚLTIPLA, e cinco amostras controle foram classificadas como RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA. Os cinco metabólitos estão listados na Tabela 7. As probabilidades previstas foram então utilizadas para criar a curva característica receptor-operador (ROC) na Figura 3 usando JROCFIT
(http://www.rad.jhmi.edu/jeng/javarad/roc/JROCFITi.html), que mostra a verdadeira fração positiva (aqueles com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA sendo prognosticados como tendo RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA) versus a fração falso-positiva (indivíduos controle prognosticados como tendo RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA). A área sob a curva é de 81.4%, com uma sensibilidade de 94.3%, e uma especificidade de 72.5%. No total, a precisão do diagnostico é de 81.4% com base no projeto validado.
A analise acima do primeiro componente principal permitiu a identificação inicial dos metabólitos ótimos para cada emparelhamento clinico. De modo a confirmar essas descobertas, uma segunda analise PAM foi realizada. Para cada emparelhamento clinico, a segunda analise (discutida abaixo) geralmente forneceu um numero maior de metabólitos do que a análise do primeiro componente. A partir desse conjunto expandido de metabólitos, os melhores candidatos para a diferenciação entre estados de saúde clínicos, que geralmente correspondem aos metabólitos inicialmente identificados, foram identificados.
No segundo método PAM, as amostras para cada emparelhamento clinico foram divididas aleatoriamente ao meio, usando uma metade para gerar um classificador e outra metade como um "conjunto de teste" cego para diagnostico. Como o primeiro método cria o classificador usando mais amostras, a precisão prognostica deveria ser mais alta do que a segunda abordagem, e conseqüentemente requer um menor numero de metabólitos para uma alta precisão de diagnostico. Seguindo o exemplo anterior de todos os pacientes clinicamente diagnosticados com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA e controles, o conjunto de treinamento compreendia 30 pacientes clinicamente diagnosticados com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA e 26 controles. As probabilidades prognosticadas das amostras de teste cegas como sendo ou RR-ESCLEROSE MULTIPLA-especificas ou controles estão traçadas na Figura 4. Os resultados mostram que quatro das amostras clinicamente diagnosticadas como RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA teriam uma maior probabilidade de serem controles e quatro dos controles teriam uma maior probabilidade de serem RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA. 0 numero ótimo de metabólitos requerido para o menor erro de classificação utilizando essas amostras foi de 16, listados na Tabela 8. O classificador foi então utilizado para predizer o diagnostico das amostras remanescentes (cego; 17 pacientes clinicamente diagnosticados com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA e 25 controles). A Tabela 9 contém os pacientes que foram utilizados no conjunto de teste e seus diagnósticos atuais e prognosticados. As probabilidades da Figura 4 foram então traduzidas em uma curva ROC (Figura 5). As características de performance -baseadas na classificação do conjunto de teste cego foram sensibilidade de 76.5%, especificidade de 84,0%, e precisão geral do diagnostico de 81,0%.
A analise PAM foi repetida para cada um dos pares clínicos. Os números de amostra usados em cada conjunto de treinamento bem como o numero ótimo de metabólitos requerido para o menor erro de classificação estão listados na Tabela
10. Os classifiçadores para os conjuntos de treinamento foram então utilizados para predizer o diagnostico das amostras remanescentes para cada par clinico.
i)Pacientes clinicamente diagnosticados com PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA e controles. A Tabela 11 contem o conjunto expandido de metabólitos do diagnostico atual e prognosticado dos pacientes que foram utilizados no conjunto de teste. As probabilidades da Tabela 11 foram traduzidas em uma curva ROC (Figura 6) . As características de performance baseadas na classificação do conjunto de teste cego foram: sensibilidade de 44,4%, especificidade de 92%, e precisão geral do diagnostico de 79,4%.
ii) Pacientes clinicamente diagnosticados com SP- ESCLEROSE MÚLTIPLA e controles. A Tabela 12 contem o conjunto expandido de metabólitos e o diagnostico atual e prognosticado dos pacientes que foram utilizados no conjunto de teste. As probabilidades da Tabela 12 foram traduzidas em uma curva ROC (Figura 7). As características de performance baseadas na classificação do conjunto de teste cego foram: sensibilidade de 63,6%, especificidade de 100%, e precisão geral do diagnóstico de 88,9%.
iii) Pacientes clinicamente diagnosticados com RR- ESCLEROSE MÚLTIPLA e pacientes com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA. A Tabela 13 contem o conjunto expandido de metabólitos e o diagnostico atual e prognosticado dos pacientes que foram utilizados no conjunto de teste. As probabilidades da Tabela .13 foram traduzidas em uma curva ROC (Figura 8) . As características de performance baseadas na classificação do conjunto de teste cego são: sensibilidade de 88,9%, especificidade de 100%, e precisão geral do diagnostico de .97,1% .
iv) Pacientes clinicamente diagnosticados com RR- ESCLEROSE MÚLTIPLA em transição para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA [RR-SP] e pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA. A Tabela 14 contem o conjunto expandido de metabólitos e o diagnostico atual e prognosticado dos pacientes que foram utilizados no conjunto de teste. As probabilidades da Tabela 14 foram traduzidas em uma curva ROC (Figura 9). As características de performance baseadas na classificação do conjunto de teste cego foram: sensibilidade de 100%, especificidade de 92,3%, e precisão geral do diagnostico de 95,7%.
v) Pacientes clinicamente diagnosticados com RR- ESCLEROSE MÚLTIPLA em transição para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA [RR-SP] e pacientes com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA. A Tabela 15 contem o conjunto expandido de metabólitos e o diagnostico atual e prognosticado dos pacientes que foram utilizados no conjunto de teste. As probabilidades da Tabela 15 foram traduzidas em uma curva ROC (Figura 10). As características de performance baseadas na classificação do conjunto de teste cego foram: sensibilidade de 72,7%, especificidade de 95,5%, e precisão geral de diagnostico de 87,9%.
Utilizando um painel inicial de cerca de 240 metabólitos, e um conjunto expandido de cerca de 16 metabólitos, foi determinado que uma combinação de nove metabólitos satisfaz os critérios para um teste de diagnostico de soro de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA comparado com amostras normais. A melhor combinação de nove metabólitos inclui os metabólitos com massas (medidas em Daltons) .452.3868, 496.4157, 524.4448, 540.4387, 578.4923, 580.5089, .594.4848, 596.5012, 597.5062. Embora essas sejam as massas reais, um especialista nesta tecnologia reconheceria que uma diferença de +/- 5 ppm indicaria o mesmo metabólito.
Utilizando um painel inicial de cerca de 60 metabólitos, e um conjunto expandido de cerca de 7 metabólitos, foi determinado que uma combinação de cinco metabólitos satisfaz os critérios para um teste de diagnostico de soro de PP- ESCLEROSE MÚLTIPLA comparado com amostras normais. A melhor combinação de cinco metabólitos inclui os metabólitos com massas (medidas em Daltons) 202.0453, 216.04, 243.0719, .244.0559, 857.7516, onde uma diferença de +/- 5 ppm indicaria o mesmo metabólito.
Utilizando um painel inicial de cerca de 129 metabólitos, e um conjunto expandido de cerca de 16 metabólitos, foi determinado que uma combinação de dezoito metabólitos satisfaz os critérios para um teste de diagnostico de soro de SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA comparado com amostras normais. A melhor combinação de dezoito metabólitos inclui os metabólitos com massas (medidas em Daltons) 194. .0803, 428.3653, 493.385, 541.3415, 565.3391, 576.4757, .578.4923, 590.4964, 594.4848, 495.4883, 596.5012, 596. 5053, .597.5062, 597.5068, 805.5609, 806.5643, 827.5446, 886.5582, onde uma diferença de +/- 5 ppm indicaria o mesmo metabólito. Utilizando um painel inicial de cerca de 135 metabólitos, e um conjunto expandido de cerca de 16 metabólitos, foi determinado que uma combinação de seis metabólitos satisfaz os critérios para um indicador de soro de RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA comparado com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA. A melhor combinação de seis metabólitos inclui os metabólitos com massas (medidas em Daltons) 540.4387, 576,4757, 594.4848,595.4883, 596.5012, 597.5062, onde uma diferença de +/- 5 ppm indicaria o mesmo metabólito.
Utilizando um painel inicial de cerca de 148 metabólitos, e um conjunto expandido de cerca de nove metabólitos, foi determinado que uma combinação de cinco metabólitos satisfaz os critérios para um indicador de soro de pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em transição para SP- ESCLEROSE MÚLTIPLA [RR-SP] em comparação com pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA. A melhor combinação de cinco metabólitos inclui os metabólitos com massas (medidas em Daltons) 576.4757, 578.4923, 594.4848, 596.5012, 597.5062, onde uma diferença de +/- 5 ppm indicaria o mesmo metabólito.
Utilizando um painel inicial de cerca de 42 metabólitos, e um conjunto expandido de cerca de 17 metabólitos, foi determinado que uma combinação de 8 metabólitos satisfaz os critérios para um indicador de soro de pacientes com RR- ESCLEROSE MÚLTIPLA em transição para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA [RR-SP] em comparação com pacientes com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA. A melhor combinação de oito metabólitos inclui os metabólitos com massas (medidas em Daltons) 617.0921,746.5118, 760.5231, 770.5108, 772.5265, 784.5238, 786.5408, .787.5452, onde uma diferença de +/- 5 ppm indicaria o mesmo metabólito.
Gráf icos de barra representando a média+/- SEM dos biomarcadores para os diferentes grupos clínicos são mostrados nas Figuras 11-16. com relação a indivíduos controle, os três estados não-controle podem ser descritos da seguinte forma:
RR -ESCLEROSE MÚLTIPLA vs, controle: a. Biomarcador 452 . 3868 - aumentado b. Biomarcador 496. 4157 - aumentado c. Biomarcador 524 . 4448 - aumentado d. Biomarcador 540. 4387 - aumentado e. Biomarcador 578 . 4923 - aumentado f. Biomarcador 580 . 5089 - aumentado g· Biomarcador 594 . 4848 - aumentado h. Biomarcador 596. 5012 - aumentado i. Biomarcador 597 . 5062 - aumentado .2.PP- -ESCLEROSE MÚLTIPLA vs. controle: a. Biomarcador 202 . 0453 - aumentado b. Biomarcador 216. 0400 - aumentado c. Biomarcador 243. 0719 - aumentado d. Biomarcador 244 . 0559 - aumentado e. Biomarcador 857 . 7516 - aumentado SP- -ESCLEROSE MÚLTIPLA vs. controle: a. Biomarcador 194 . 0803 - diminuído b. Biomarcador 428. 3653 - aumentado c. Biomarcador 493. 3850 - diminuído d. Biomarcador 541. 3415 - diminuído e. Biomarcador 565. 3391 - diminuído f. Biomarcador 576. 4757 - diminuído g. Biomarcador 578 . 4923 - diminuído h. Biomarcador 590. 4964 - diminuído i. Biomarcador 594 . 4848 - diminuído j. Biomarcador 595. 4883 - diminuído k. Biomarcador 596. 5012 - diminuído 1. Biomarcador 596. 5053 - diminuído m. Biomarcador 597 . 5062 - diminuído n. Biomarcador 597 . 5068 - diminuído 0. Biomarcador 805. 5609 - aumentado P. Biomarcador 806. 5643 - aumentado q. Biomarcador 827 . 5446 - aumentado r. Biomarcador 886. 5582 - diminuído
Com relação aos pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA, os dois grupos clínicos crônicos podem ser descritos da seguinte forma:
1. SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA vs. RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA:
a. Biomarcador 540.4387 - diminuído b. Biomarcador 576.4757 - diminuído C. Biomarcador 594.4848 - diminuído d. Biomarcador 595.4883 - diminuído e. Biomarcador 596.5012 - diminuído f. Biomarcador 597.5062 - diminuído
2. RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em transição para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA [RR-SP] vs. RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA:
a. Biomarcador 576.4757 - diminuído
b. Biomarcador 578.4923 - diminuído C. Biomarcador 594.4848 - diminuído d. Biomarcador 596.5012 - diminuído e. Biomarcador 597.5062 - diminuído
Com relação aos pacientes com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA, os pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em transição para SP- ESCLEROSE MÚLTIPLA [RR-SP] podem ser descritos da seguinte forma:
1. RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em transição para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA [RR-SP] vs. SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA:
a. Biomarcador 617.0921 - aumentado
b. Biomarcador 746.5118 - aumentado
C. Biomarcador 760.5231 - aumentado
d. Biomareador 770.5108 - aumentado
e. Biomarcador 772.5265 - aumentado
f. Biomarcador 784.5238 - aumentado
g. Biomarcador 786.5408 - aumentado
h. Biomarcador 787.5452 - aumentado
Os painéis de biomarcadores foram então aplicados aos vários grupos clínicos e os dez pacientes para cada grupo clínico que mostraram a melhor separação foram selecionados.
O teste-T de um estudante foi realizado em todos os metabólitos de soro utilizando apenas dez pacientes por grupo clínico.
1. Pacientes clinicamente diagnosticados com RR- ESCLEROSE MÚLTIPLA (n=10) e controles (n=10), [257 metabólitos, ver Tabela 16];
2. Pacientes clinicamente diagnosticados com PP- ESCLEROSE MÚLTIPLA (n=10) e controles (n=10), [100 metabólitos, ver Tabela 17];
3. Pacientes clinicamente diagnosticados com SP- ESCLEROSE MÚLTIPLA (n=10) e controles (n=10), [226 metabólitos, ver Tabela 18];
4. Pacientes clinicamente diagnosticados com RR- ESCLEROSE MÚLTIPLA (n=10) e clinicamente diagnosticados com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA (N=IO), [142 METABÓLITOS, VER Tabela 19];
5. Pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em transição para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA [RR-SP] (n=10) e pacientes clinicamente diagnosticados com RR- ESCLEROSE MÚLTIPLA (n=10), [148 metabólitos, ver Tabela 20];
6. Pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em transição para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA [RR-SP] (n=10) e pacientes clinicamente diagnosticados com SP- ESCLEROSE MÚLTIPLA (n=10), [309 metabólitos, ver Tabela 19].
O conjunto de amostras (184 indivíduos) utilizadas para esse exemplo compreendeu indivíduos de vários antecedentes geográficos, e de várias idades e situações de saúde. Assim, espera-se que as descobertas sejam representativas da população geral com ESCLEROSE MÚLTIPLA.
Exemplo 2: Confirmação de Método Independente de Metabólitos Descobertos Os metabólitos e suas associações com as variáveis clinicas descritas nesta invenção são também confirmadas usando um sistema de espectrometria de massa independente. Extratos de amostras representativos de cada grupo variável são re-analisados por LC-MS utilizando uma cromatografia liquida de alta performance HP 1050 (HPLC), ou equivalente, interfaceado com um ABI Q-Star, ou equivalente, espectrômetro de massa para obter informações de massa e intensidade com o objetivo de identificar metabólitos que diferem em intensidade entre as variáveis clinicas sob investigação.
Através da determinação dos níveis dos metabólitos identificados no sangue de uma pessoa e comparando-se esses níveis com níveis em uma população de "referencia" normal, é feito um prognostico de se a pessoa tem RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA, PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA, ou estágios iniciais de SP- ESCLEROSE MÚLTIPLA. Isso é realizado de uma entre várias maneiras: 1)Utilizar um algoritmo de prognostico para classificar a amostra de teste, como anteriormente descrito, que fornece uma porcentagem de probabilidade de ter uma forma de ESCLEROSE MÚLTIPLA. Uma introdução de prognostico funcionaria independente do método de analise, desde que as intensidades dos metabólitos sejam medidas. 2) Aplicar um método baseado em estabelecer um nível de intensidade inicial do espectrômetro de massa, e determinar se o perfil de uma pessoa está acima ou abaixo do inicial, o que indica a sua situação de doença. 3) Utilizar uma analise quantitativa para determinar a concentração molar dos 36 metabólitos de soro na população normal e doente. Uma concentração inicial absoluta. é então determinada para ESCLEROSE MULTIPLA-positividade versus não-ESCLEROSE MULTIPLA-positividade. Em uma colocação clinica, isso significa que se os niveis medidos dos metabólitos, ou combinação dos metabólitos, estiverem acima de uma certa concentração, haveria uma probabilidade associada de que o indivíduo seja positivo para um tipo de ESCLEROSE MÚLTIPLA.
Exemplo 3: Elucidação Estrutural dos Biomarcadores de Metabólitos Primários
Características que podem ser utilizadas para a elucidação estrutural dos metabólitos incluem massa exata e formula molecular, polaridade, propriedades ácido/base, espectros NMR, e espectros MS/MS ou MSn. Esses dados podem ser utilizados como impressões digitais de um determinado metabólito e são identificadores únicos de um determinado metabólito independentemente de se a sua estrutura completa tenha sido determinada. Os dados incluem:
1. Tempo de retenção LC. Os extratos contendo os metabólitos de interesse são sujeitos à fase reversa LC-MS usando uma coluna C18 e analise por MS para determinar seu tempo de retenção sob condições padronizadas.
2. Espectros MS/MS. Metabólitos de interesse são também caracterizados pela realização de fragmentação MS/MS utilizando dissociação induzida por colisão (CID). Essa analise MS/MS é realizada em tempo real (i.e., durante o processo de elução cromatográfica) ou off-line em frações coletadas do processo de separação cromatográfica. A estrutura de uma dada molécula dita um padrão de fragmentação especifico sob condições definidas e é especifico para aquela molécula (equivalente à impressão digital de uma pessoa). Até mesmo pequenas mudanças na estrutura da molécula podem resultar em um padrão diferente de fragmentação. Além de fornecer uma impressão digital da identidade da molécula, os fragmentos gerados por CID são utilizados para obter conhecimento sobre a estrutura de uma molécula, e para gerar um método muito especifico de detecção quantitativa de alta resolução (ver [26-29] para exemplos).
3. Espectros NMR. A fragmentação fornece informação descritiva altamente especifica sobre um metabólito. Entretanto, NMR pode solucionar e confirmar as estruturas das moléculas. Como as técnicas de analise NMR são tipicamente menos sensíveis do que as técnicas de espectrometria de massa, são realizadas injeções múltiplas no HPLC e a janela de tempo de retenção correspondente aos metabólitos de interesse coletada e combinada. 0 extrato combinado é então evaporado até secar e reconstituído no solvente apropriado para analise NMR.
Múltiplas técnicas e instrumentos de NMR estão disponíveis, por exemplo, dados espectrais de NMR são registrados no espectrômetro Bruker Avance 600 MHz com sonda criogênica após a separação cromatográfica e purificação dos metabólitos de interesse. IH NMR, 13C NMR, especulação sem- diferença, bem como 2-D NMR técnicas como correlação de quantum múltiplo heteronuclear (HMQC), e correlação de ligação múltipla heteronuclear (HMBC) são utilizadas para o trabalho de elucidação estrutural nos biomarcadores.
4. Condições de extração. As condições de extração também fornecem informações sobre as propriedades químicas dos biomarcadores. Todos os nove metabólitos no soro (do Exemplo 1) foram ionizados no modo negativo (APCI), o que é indicativo de uma molécula contendo uma metade ácida como um ácido carboxílico ou fosfato. Qualquer metade capaz de perder um átomo de hidrogênio pode ser detectada no modo de ionização negativo. Os marcadores de metabólitos foram extraídos em uma fração de acetato etil orgânico, indicando que esses metabólitos são não-polares sob condições ácidas.
Toda química e os meios foram adquiridos de Sigma- Aldrich Canadá Ltd., Oakville, ON., Canadá. Todos os solventes eram de grau HPLC. As análises HPLC foram realizadas com um cromatógrafo liquido de alta performance equipado com bomba quaternária, injetor automático, degaseificador, e uma coluna Hypersil ODS (5um tamanho de partícula de sílica, 4.6 i.d χ 200mm) com um filtro alinhado. Fase móvel: gradiente linear H20-Me0H para 100% MeOH em um período de 52 min a um índice de fluxo de 1.0 ml/min. Espectros de massa (MS) de alta resolução (HR) foram registrados em espectrômetro de ressonância (FT-ICR) ciclotrônica de íon e transformada de Fourier Bruker apex 7T e dados MS/MS coletados usando um espectrômetro de massa QStar XL TOF com ionização química por pressão atmosférica (APCI) e fontes de ionização por eletrospray (ESI) em ambos os modos positivo e negativo.
Dados de Caracterização de Metabólitos
Biomarcador 1 HRAPCI-MS m/z\ [Μ - Η], C28H5104 medido; 451.3795, calcd. 451.3793. MS/MS m/z (intensidade relativa): 451 ([M - H], 20%), 433 (100%), 407 (30%), 389 (90%), 281 (10%), 279 (25%), 183 (20%), 169 (10%), 153 (10%), 125 (20%), 111 (25%), 97 (25%) .
Biomarcador 2
HRAPCI-MS m/z: [Μ - Η] , C30H5505 medido; 495.4054 calcd; 495.4055 MS/MS m/z (intensidade relativa): 495 ([M - Η], 5%), 451 (5%), 477 (15%), 433 (15%), 415 (5%), 307 (5%), 297 (45%), 279 (100%), 235 (5%), 223 (20%), 215 (70%), 197 (90%), 179 (50%), 181 (10%), 169 (100%), 157 (25%), 155 (10%), 153 (5%), 141 (10%), 139 (5%), 127 (10%), 125 (10%), 113 (5%).
Biomarcador 3
HRAPCI-MS m/z: [Μ - Η] , C32H5905medido; 523.4375, calcd; 523.4368. MS/MS m/z (intensidade relativa): 523 ([M - Η] ,30%), 505 (100%), 487 (25%), 479 (40%), 463 (40%), 461 (45%), 443 (40%), 365 (30%), 337 (20%), 299 (25%), 297 (25%), 281 (25%), 279 (40%), 271 (65%), 269 (20%), 253 (35%), 251 (55%), 243 (30%), 225 (65%), 197 (55%), 171 (20%), 169 (25%), 157 (20%), 155 (10%), 143 (10%), 141 (20%), 139 (20%).
Biomarcador 4
HRAPCI-MS m/z: [Μ - Η], C32H5906 medido; 539.4312, calcd; 539.4317. MS/MS m/z (intensidade relativa): 539 ([M - H], 20%), 521 (100%), 503 (50%), 495 (40%), 477 (40%), 461 (30%), 459 (40%), 419 (30%), 335 (70%), 315 (40%), 313 (40%), 297 (60%), 279 (60%), 259 (40%), 255 (40%), 253 (20%), 243 (20%), 241 (30%), 225 (20%), 223 (30%), 213 (30%), 179 (20%), 171 (40%), 155 (30%), 141 (50%), 127 (40%). Biomarcador 5
HRAPCI-MS τα/ζ [Μ - Η] , C36H6305 medido; 575.4678, calcd; 575.4681. MS/MS m/z (intensidade relativa): 575 ([M - Η] , 45%), 557 (75%), 539 (70%), 531 (30%), 513 (60%), 495 (100%), 417 (50%), 403 (60%), 371 (25%), 297 (15%), 279 (40%).
Biomareador 6
HRAPCI-MS m/z [Μ - Η] , C36H6505 medido; 577.4850, calcd; 577.4837. MS/MS m/z (intensidade relativa): 577 ([M - Η], 45%), 559 (75%), 541 (70%), 533 (30%), 515 (60%), 497 (100%), 419 (50%), 405 (60%), 387 (25%), 373 (25%), 297 (15%), 281 (25%), 279 (40%).
Biomarcador 7
HRAPCI-MS m/z: [Μ - Η] , C36H6705 medido; 579.5016, calcd; 579.4994. MS/MS m/z (intensidade relativa): 579 ([M - Η] , 45%), 561 (90%), 543 (40%), 535 (25%), 517 (60%), 499 (100%), 421 (20%), 407 (20%), 389 (20%), 375 (20%), 299 (25%), 281 (30%), 279 (40%), 263 (10%), 253 (15%), 185 (10%), 171 (25%) .
Biomarcador 8
HRAPCI-MS m/z: [Μ - Η], C36H6506 medido; 593.4775, calcd; 593.4787. MS/MS m/z (intensidade relativa): 593 ([M - H], 50%), 575 (55%), 557 (30%), 549 (15%), 531 (20%), 513 (25%), 495 (10%), 421 (15%), 371 (30%), 315 (50%), 297 (100%), 279 (90%), 201 (30%), 171 (60%), 141 (25%), 127 (25%) .
Biomarcador 9
HRAPCI-MS m/z: [Μ - Η] , C36H6706 medido; 595.4939, calcd; 595.4943. MS/MS m/z (intensidade relativa): 595 ([M - Η], 20%), 577 (20%), 559 (15%), 551 (5%), 515 (15%), 497 (5%), 423 (5%), 373 (15%), 315 (75%), 297 (70%), 281 (40%), 279 (100%), 269 (5%), 251 (5%), 171 (25%), 155 (15%), 153 (10%), 141 (15%), 139 (10%), 127 (15%).
Biomarcador 10
HRAPCI-MS m/z: [Μ - Η], C43H78010P medido; 785.5329, calcd; 785.5338. MS/MS m/z (intensidade relativa): 758 ([M - H], 100%), 529 (10%), 425 (20%), 273 (73%), 169 (5%), 125 (100%), 97 (5%).
Biomarcador 11
HRAPCI-MS m/z: [Μ - H], C5H1207P medido; 215.0322, calcd; 215.0326. MS/MS m/z (intensidade relativa): 215 ([M - H], 100%), 197 (30%), 171 (40%), 153 (90%), 135 (20%).
Biomarcador 12
HRAPCI-MS m/z: [Μ - Η] , C25H51N09P medido; 540.3337, calcd; 540.3301. MS/MS m/z (intensidade relativa): 540 ([M - H], >1%), 480 (17%), 255 (100%), 242 (>1%), 224 (5%), 168 (>1%), 153 (>1%), 78 (>1%).
Biomarcador 13
HRAPCI-MS m/z: [Μ - Η] , C27H51N09P medido; 564.3313, calcd; 564.3307. MS/MS m/z (intensidade relativa): 564 ([M - Η], >1%), 504 (10%), 279 (100%), 242 (>1%), 224 (5%), 168 (>1%), 153 (>1%), 78 (>1%).
Biomarcador 14
HRAPCI-MS m/z: [M + H]+, C6H1206Na+ medido; 203.0531, calcd; 205.0526. MS/MS m/z (intensidade relativa): 203 ([M + H]+, 100%), 159 (15%), 115 (23%), 89 (38%), 97 (5%).
Biomarcador 15 HRAPCI-MS m/z: [Μ + H]+, C8H1307Na+ medido; 245.0637, calcd; 245.0631. MS/MS m/z (intensidade relativa): 245 ([M + H]+, 100%), 227 (5%), 209 (5%), 155 (10%), 125 (15%), 83 (5%) .
Biomarcador 16
HRAPCI-MS m/z: [M + H]+, C29H4902+ medido; 429.3732, calcd; 429.3727. MS/MS m/z (intensidade relativa): 429 ([M + H] +, 1%) , 205 (5%), 165 (100%) .
Biomarcador 17
HRAPCI-MS m/z: [M + H]+, C49H81N08P+ medido; 806.5687, calcd; 806.5694. MS/MS m/z (intensidade relativa): 806 ([M + H]+, 21%), 478 (>1%), 237 (>1%), 184 (100%).
Biomarcador 18
HRAPCI-MS m/z: [M + H]+, C7H1506+ medido; 195.0881, calcd; 195.0863. MS/MS m/z (intensidade relativa): 195 ([M + H]+, 2%), 177 (>1%), 165 (>1%), 163 (>1%), 138 (100%), 123 (6%) .
Biomarcador 19
HRAPCI-MS m/z: [M + H]+, C54H100NO+ medido; 858.7594, calcd; 858.7545. MS/MS m/z (intensidade relativa): 858 ([M + H]+, 100%), 576 (10%), 314 (12%), 165 (7%), 151 (10%), 95 (2%) .
As massas exatas dos biomarcadores foram usadas para deduzir as fórmulas moleculares. Espectrometria de massa tandem nos biomarcadores foi usada para propor as estruturas que estão sumarizadas na Tabela 22. Os biomarcadores seriam derivados de açúcares, fosfolipidios e tocoferóis. Os dados espectrais MS/MS obtidos para cada um dos biomarcadores de esclerose múltipla foram utilizados para deduzir as suas estruturas. Ao se comparar os padrões de fragmentação MS/MS dos biomarcadores MS 1 - 9 com aqueles do painel CRC (ver pedido co-pendente do requerente PCT/CA 2006/001502; publicado como WO/CA2007/030928 em 22 de março de 2007) uma quantidade de similaridades foi observada. Além dos modos de ionização comuns para ambos os biomarcadores CRC e MS, os seus espectros MS/MS também mostraram sinais devido aos fragmentos de ions correspondentes às entidades de ácido graxo tipo cadeia de fitil, C18:l ou C18:2 (m/z 281, 279) para todos os biomarcadores detectados bem como as perdas de fragmentos devido a [M-H-C02], [M-H-H20] e [M-H- C02-H20]. outra similaridade é que, os espectros MS/MS dos biomarcadores MS 1 - 9 mostraram fragmentos de ions deduzidos como perda do sistema anelar tipo cromo após a divisão da cadeia lateral de fitil [(153 (1), 197 (2), 225 (2,3), 279 (5,6,7) e 281 (8,9), Tabelas 23 - 31)]. Essas observações levaram à designação de estruturas tipo tocoferol para os biomarcadores 1-9. A(s) perda (s) de água e dióxido de carbono sugerem a presença de livre hidroxil e grupos de ácido carboxilico. As principais diferenças entre biomarcadores MS e os CRC's como observado nos espectros MS/MS são o sistema anelar de cromo aberto e o alongamento em cadeia proposto na posição 1.
A formula molecular de 1 foi determinada como C28H5204 por HRAPCI-MS, com três graus de não-saturação. Como indicado acima, os espectros MS/MS de 1 mostraram fragmentos de ions devido à perda de água (m/z 433), dióxido de carbono (m/z 407) e a presença de cadeia lateral de fitil (m/z 279). O fragmento de ion observado em m/z 153 foi designado como um sistema anelar de ciclohexenil gerado após a perda da cadeia late ral de fitil. Com base nessas deduções a estrutura do metabólito 1 foi designada como mostrado na Tabela 22.
Como indicado acima, os metabólitos 2-9 possuem todas as similaridades estruturais com 1 e hidroxilações adicionais e alongamentos de cadeia via ligações de éter com o átomo de oxigênio na posição 1. Δ unidade anelar de ciclohexenil deixada após a divisão das cadeias laterais de fitil desses biomarcadores deu fragmentos de ions únicos com alguma variação nos graus de não-saturação e no numero de hidroxilações. Esses ions observados em m/z 197 para 2, m/z 225 para 3 e 4, m/z 279 para 5, 6 e 8 e m/z 281 para 7 e 9 (Ver Tabelas 23 - 31) foram utilizados para designar os diferentes alongamentos de cadeia de alquil; etil, butil e octil respectivamente com as hidroxilações apropriadas. Em detalhe, esses padrões de fragmentação mostram claramente as diferenças entre cada sistema anelar de ciclohexenil. Para 1 onde não há alongamento de cadeia na posição 1, o fragmento anelar de ciclohexenil resultou quando dividido em C2-C3, gerando a formula C10H170 (m/z 153) . Em 2 onde a etilação ocorreria na posição 1, e com um grupo hidroxi adicional no anel, a formula do fragmento anelar de ciclohexenil mostrou um aumento por entidade C2H40 comparado com 1, assim o fragmento tendo C12H2102 (m/z 197) como formula. Essas predições estavam de acordo com a observação nos espectros MS/MS de 2 validando assim as designações estruturais. Em 3 e 4, o alongamento de cadeia ocorreria com uma unidade de butil (C4H9), assim um aumento por entidade C2H4 com formula C14H2502 (m/z 225) observado quando comparado com 2. Para os biomarcadores 5 - 9 o alongamento da cadeia alcoxi na posição 1 foi por entidade C8H17. Comparando-se as suas formulas e espectros MS/MS, 7 e 9 (C36H6805 e C39H6806) mostraram aspectos similares exceto por um átomo de oxigênio adicional em 9. Isso foi conseqüentemente designado na cadeia de fitil. Assim para 7 e 9 o fragmento de ion componente do anel de ciclohexenil foi observado em m/z 281 (C18H3302). Na mesma palheta, os biomarcadores 6 (C36H6605) e 8 (C36H6606) mostraram similaridade como 7 e 9, a única diferença sendo uma não-saturação acrescentada, assim seu fragmento de ciclohexenil foi em m/z 279 (C18H3102). Um grau adicional de não-saturação em 5 (C36H6405) comparado com 6 e 8 mas com fragmento anelar m/z 279 (C18H3102) sugeriu que a não- saturação adicional era na cadeia de fitil. Com base nessas deduções, as estruturas dos metabólitos 2 a 9 foram designadas como mostrado na Tabela 22.
0 biomarcador 10 que foi detectado no mesmo modo que 1 - 9 sugeriu uma diferente classe de metabólito com base nos dados da formula molecular FT-ICRMS. A formula obtida, C43H79010P sugere uma estrutura tipo diacilglicerol- fosfolipidio hidroxilado. A estrutura proposta e os fragmentos MS/MS são dados nas Tabelas 22 e 32 respectivamente. Os dados MS/MS obtidos nos extratos aquosos de soro no modo negativo com ionização por eletrospray para os biomarcadores 11 - 13 foram individualmente analisados para deduzir as suas estruturas. Os biomarcadores identificados nesse painel estavam com as formulas de C5H1307P, C25H52N09P, e C27H52N09P. Os dados MS/MS de 11 (C5H1307P) mostram os fragmentos devido à perda de duas moléculas de água bem como um grupo HP03 (Tabela 33) , que pode ser designado utilizando- se a estrutura proposta. Descobriu-se que os biomarcadores 12 e 13, (m/z 541.3415, C25H52N09P e m/z 565.3391, C27H52N09P) eram os mesmos que dois biomarcadores de câncer de próstata (ver pedido co-pendente do requerente PCT/CA 2007/000469, depositado em 23 de março de 2007). No modo negativo com ionização por eletrospray (ESI), os ions mais comumente observados são os fosfolipidios ácidos como glicerofosfoinisitol, glicerofosfoserina, ácido
glicerofosfatidico, e glicerofosfoetanolamina. Mas sob determinadas circunstâncias é possível que as fosfocolinas possam ser detectadas como um adutor de [M + Cl] ou [M + acetato/formato] como espécies de íon no modo ESI negativo. Como o procedimento laboratorial das extrações aquosas de ESI envolve o uso de ácido fórmico existe uma grande probabilidade de que esses ions pudessem ser formato aduzido de fosfocolinas. Como resultado da adição do grupo de formato forma um agrupamento neutro de glicerofosfocolina que forma o íon molecular correspondente ([M -H+]) quando sujeito a ESI negativo agora que o local de ionização é o grupo fosfatídico. Isso sugere a desprotonização do grupo de fosfato deixando o íon de fosfato negativamente carregado como o ion matriz. As analises de fragmentação dos biomarcadores 12 e 13 são dadas nas Tabelas 34 e 35.
Os dados MS/MS foram obtidos em extratos orgânicos e aquosos de soro em modo positivo com ESI e APCI para os biomarcadores 14 - 19. Os biomarcadores 14 e 15 (extrato aquoso) foram identificados como adutores de sódio de pequenos metabólitos relacionados com monossacarideos utilizando suas impressões digitais de fragmento MS/MS (Tabelas 36 e 37), 0 biomarcador 16 (Tabela 38), (m/z 428.3653, C29H4802) de extratos orgânicos foi designado como um derivado de a tocoferol já que os seus espectros MS/MS eram bastante similares àqueles do padrão a tocoferol exceto por um grau adicional de não-saturação. 0 biomarcador 17 (Tabela 39), (m/z 805.5609, C46H80N08P) também de extratos orgânicos de soro foi proposto como Oleyl, eicosapentenóico (EPA), N-metil fosfoetanolamina já que os dados MS/MS mostraram fragmentos de ions para a presença de EPA e grupos de oleyl bem como o N-metil substituiu a espinha dorsal de fosfoetanolamina. Os dados de espectros MS/MS dos
metabólitos 18 (Tabela 40) e 19 (Tabela 41) utilizando fonte APCI, foram designados putativamente como biomarcadores derivados de monossacarideos e esfingolipidios respectivamente.
Exemplo 4: Desenvolvimento de Método Comercial de Alta Resolução
Para analise de rotina de um subconjunto de metabólitos descritos, é desenvolvido um método de analise de alta resolução. Existem múltiplos tipos de opções de plataformas de análise de custo efetivo atualmente disponíveis dependendo das moléculas sendo detectadas. Esses incluem analises químicas colorimétricas (UV, ou outro comprimento de onda), analises imunosorventes ligadas a enzimas baseadas em anticorpos (ELISAs), análises baseadas em chips e PCR para detecção de ácido nucléico, métodos de detecção de ácido nucléico baseados em cordão, analises químicas de varetas, análises de imagem como imagem por ressonância magnética (MRI) , tomografia por emissão de positron (PET) tomografia computadorizada (CT), e vários sistemas baseados em espectrometria de massa.
O método envolve o desenvolvimento de um método MS/MS de alta resolução que é compatível com a atual instrumentação laboratorial e espectrômetros de massa triplo-quadrupolo que estão instalados em vários laboratórios em todo o mundo. Um sistema Q-Trap tm é utilizado para isolar a molécula matriz, fragmentá-la; e então os fragmentos são medidos.
Todas as citações estão aqui incorporadas a titulo de referencia.
A presente invenção foi descrita em relação a uma ou mais representações. Entretanto, ficará evidente para os especialistas que muitas variações e modificações podem ser feitas sem se afastar do âmbito da invenção como definida nas reivindicações. Tabela 1: Aspectos de massas exatas diferindo entre pacientes clinicamente diagnosticados com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA e controles (p<0,05).
<table>table see original document page 68</column></row><table> <table>table see original document page 69</column></row><table> <table>table see original document page 70</column></row><table> <table>table see original document page 71</column></row><table> 71
Tabela 2: Aspectos de massas exatas diferindo entre pacientes clinicamente diagnosticados
com PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA e controles (p<0,05).
<table>table see original document page 72</column></row><table> <table>table see original document page 73</column></row><table> Tabela 3: Aspectos de massas exatas diferindo entre pacientes clinicamente diagnosticados
com SP-ESCLEROSE MULRIPLA e controles (p<0,05).
<table>table see original document page 74</column></row><table> <table>table see original document page 75</column></row><table> <table>table see original document page 76</column></row><table> 76
Tabela 4: Aspectos de massas exatas diferindo entre pacientes clinicamente diagnosticados com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA e pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA (p<0,05).
<table>table see original document page 77</column></row><table> <table>table see original document page 78</column></row><table> <table>table see original document page 79</column></row><table> Tabela 5: Aspectos de massas exatas diferindo entre pacientes clinicamente diagnosticados com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em transição para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA e pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA (p<0,05).
<table>table see original document page 80</column></row><table> <table>table see original document page 81</column></row><table> <table>table see original document page 82</column></row><table> Tabela 6: Aspectos de massas exatas diferindo entre pacientes clinicamente diagnosticados com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em transição para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA e pacientes com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA (p<0,05).
<table>table see original document page 83</column></row><table>
.5 Tabela 7: Metabólitos identificados em primeira análise de componente de princípio ativo para RR-esclerose múltipla
<table>table see original document page 84</column></row><table>
Table 8: Expanded set of metabolites identified in second PAM analysis for RR-multiple sclerosis.
<table>table see original document page 84</column></row><table> 84
Tabela 9: Pacientes clinicamente diagnosticados com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA controles utilizados no conjunto de teste e seu diagnóstico real e previsto.
<table>table see original document page 85</column></row><table> Tabela 10: Números de amostra e números ótimos de metabólitos utilizados em conjuntos de treinamento para cada par clinico.
<table>table see original document page 86</column></row><table> Tabela 11: Número ótimo de metabólitos e resultados de previsão para PP-ESCLEROSE
MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada e controles.
<table>table see original document page 87</column></row><table>
Paciente ID Real Previsto BB000816 PP-MS control BB000879 PP-MS PP-MS BB000929 PP-MS control BB001827 PP-MS PP-MS BB000840 PP-MS control BB001432 PP-MS control BB001924 PP-MS PP-MS BB001925 PP-MS control BB002927 PP-MS control BB003021 control control BB003023 control control BB003026 control control BB003027 control control BB003028 control control BB003030 control control BB003032 control control BB003034 control control BB003037 control control BB002858 control control BB002856 control control BB002857 control control BB002861 control control BB002870 control control BB002874 control control BB003013 control control BB003016 control control BB003017 control control BB003018 control control BB003019 control control BB003022 control PP-MS BB003031 control control BB003033 control control BB003035 control PP-MS BB002851 control control Tabela 12: Número ótimo de metabólitos e resultados de previsão para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA clinicamente diagnosticada e controles
<table>table see original document page 88</column></row><table>
Paciente ID Real Previsto Paciente ID Real Previsto BB000786 SP-MS SP-MS BB002862 control control BB000787 SP-MS control BB002865 control control BB000847 SP-MS SP-MS BB002866 control control BB000829 SP-MS SP-MS BB002856 control control BB000906 SP-MS control BB002857 control control BB001744 SP-MS SP-MS BB002861 control control BB001826 SP-MS control BB002870 control control BB001928 SP-MS control BB002874 control control BB001942 SP-MS SP-MS BB003007 control control BB002759 SP-MS control BB003011 control control BB002878 SP-MS control BB003012 control control BB003014 control control BB003013 control control BB003021 control control BB003016 control control BB003023 control control BB003004 control control BB003026 control control BB003015 control control BB003027 control control BB003022 control control BB002858 control control BB003031 control control BB002859 control control BB003033 control control 88
Tabela 13: Número ótimo de metabólitos e resultados de previsão para pacientes clinicamente diagnosticados com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA e SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA
<table>table see original document page 89</column></row><table> Tabela 14: Número ótimo de metabólitos e resultados de previsão para pacientes com RR- ESCLEROSE MÚLTIPLA em transição para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA e pacientes clinicamente diagnosticados com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA
<table>table see original document page 90</column></row><table> 90
Tabela 15: Número ótimo de metabólitos e resultados de previsão para pacientes com RR- ESCLEROSE MÚLTIPLA em transição para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA e pacientes clinicamente diagnosticados com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA.
<table>table see original document page 91</column></row><table> Tabela 16: Aspectos de massas exatas diferindo entre 10 pacientes clinicamente diagnosticados com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA e 10 controles (p<0,05).
<table>table see original document page 92</column></row><table> <table>table see original document page 93</column></row><table> <table>table see original document page 94</column></row><table> <table>table see original document page 95</column></row><table> <table>table see original document page 96</column></row><table> Tabela 17: Aspectos de massas exatas diferindo entre 10 pacientes clinicamente diagnosticados com PP-ESCLEROSE MÚLTIPLA e 10 controles (p<0,05)
<table>table see original document page 97</column></row><table> <table>table see original document page 98</column></row><table> Tabela 18: Aspectos de massas exatas diferindo entre 10 pacientes clinicamente diagnosticados com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA e 10 controles (p<0,05)
<table>table see original document page 99</column></row><table> <table>table see original document page 100</column></row><table> <table>table see original document page 101</column></row><table> <table>table see original document page 102</column></row><table> Tabela 19: Aspectos de massas exatas diferindo entre 10 pacientes clinicamente diagnosticados com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA e controles SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA (p<0,05)
<table>table see original document page 103</column></row><table> <table>table see original document page 104</column></row><table> <table>table see original document page 105</column></row><table> Tabela 20: Aspectos de massas exatas diferindo entre 10 pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em transição para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA e 10 pacientes clinicamente diagnosticados com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA (p<0,05)
<table>table see original document page 106</column></row><table> <table>table see original document page 107</column></row><table> <table>table see original document page 108</column></row><table> Tabela 21: Aspectos de massa exata diferindo entre pacientes com RR-ESCLEROSE MÚLTIPLA em transição para SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA e 10 pacientes clinicamente diagnosticados com SP-ESCLEROSE MÚLTIPLA (p<0,05).
<table>table see original document page 109</column></row><table> <table>table see original document page 110</column></row><table> <table>table see original document page 111</column></row><table> <table>table see original document page 112</column></row><table> <table>table see original document page 113</column></row><table> Tabela 22: Massas exatas, modo de ionização, formulas moleculares putativas e estruturas propostas para múltiplos biomarcadores de esclerose detectados em extratos aquosos e orgânicos de soro humano.
<table>table see original document page 114</column></row><table> Π 216.04 216.0399 1102 C5H13O7P <formula>formula see original document page 115</formula>
.12 541.3415 541.3379 1102 C25H52NO9P <formula>formula see original document page 115</formula>
.13 565.3391 565.3380 1102 C27H52NO9P <formula>formula see original document page 115</formula>
.14 202.0453 202.0453 1101 C6HllO6Na <formula>formula see original document page 115</formula>
.15 244.0559 244.0559 1101 C8Hl3O7Na <formula>formula see original document page 115</formula>
.16 428.3653 428.3654 1201 C29H48O7 <formula>formula see original document page 115</formula>
.17 805.5609 805.5621 1201 C46H80NO8P <formula>formula see original document page 115</formula> .18 194.0803 194.0790 1203 C7Hi4O6 <formula>formula see original document page 115</formula>
.19 857.7516 857.7472 1203 C54H99NO6 <formula>formula see original document page 115</formula> 115
Tabela 23: Fragmentação MS/MS do biomarcador 1 de esclerose múltipla, 452.3868 (C28H52O4).
<table>table see original document page 116</column></row><table> Tabela 24: Fragmentação MS/MS do biomarcador 2 de esclerose múltipla, 496.4157 (C30H56O5)
<table>table see original document page 117</column></row><table> <table>table see original document page 118</column></row><table> 118
Tabela 25: Fragmentação MS/MS do biomarcador 3 de esclerose múltipla, 524.4448
(C32H60O5)
<table>table see original document page 119</column></row><table> <table>table see original document page 120</column></row><table> <table>table see original document page 121</column></row><table> Tabela 26: Fragmentação MS/MS do biomarcador 4 de esclerose múltipla, 540.4390
(C32H60O6)
<table>table see original document page 122</column></row><table> <table>table see original document page 123</column></row><table> Tabela 27: Fragmentação MS/MS do biomarcador 5 de esclerose múltipla, 576.4757
(C36H64O5)
<table>table see original document page 124</column></row><table> <table>table see original document page 125</column></row><table> <table>table see original document page 126</column></row><table> <table>table see original document page 127</column></row><table> Tabela 30: Fragmentação MS/MS do biomarcador 8 de esclerose múltipla, 594.4848(C36H66O6).
<table>table see original document page 128</column></row><table> <table>table see original document page 129</column></row><table> <table>table see original document page 130</column></row><table> <table>table see original document page 131</column></row><table> <table>table see original document page 132</column></row><table> Tabela 34: Fragmentação MS/MS do biomarcador 12 de esclerose múltipla, 541.3415 (C25H52NO9P).
<table>table see original document page 133</column></row><table> Tabela 35: Fragmentação MS/MS do biomarcador 13 de esclerose múltipla, 565.3391 (C47H83NO13P).
<table>table see original document page 134</column></row><table> Tabela 36: Fragmentação MS/MS do biomarcador 14 de esclerose múltipla, 202.0453 (C6H11O6Na)
<table>table see original document page 135</column></row><table> <table>table see original document page 136</column></row><table> Tabela 38: Fragmentação MS/MS do biomarcador 16 de esclerose múltipla, 428.3653
(C29H48O2).
<table>table see original document page 137</column></row><table>
Tabela 39: Fragmentação MS/MS do biomarcador 17 de esclerose múltipla, 805.5609 (C46H80NO8P).
<table>table see original document page 137</column></row><table> Tabela 40: Fragmentação MS/MS do biomarcador 18 de esclerose múltipla, 194.0803 (C7H14O6).
<table>table see original document page 138</column></row><table> <table>table see original document page 139</column></row><table>
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Claims (40)

1. Método para diagnosticar a esclerose múltipla ou outra desordem de perda de mielina (demyelinating) ou o risco de esclerose múltipla ou outra desordem de perda de mielina (demyelinating) em um paciente, o método caracterizado por compreender as etapas de: (a) analisar uma amostra obtida de um paciente para obter dados quantificados para um ou mais de um marcador de metabóllito; (b) comparar os dados quantificados para o dito um ou mais de um marcador de metabólito com os dados correspondentes obtidos de uma ou mais de uma amostra de referencia, na qual a dita comparação pode ser usada para diagnosticar a esclerose múltipla ou outra desordem de perda de mielina (demyelinating) ou o risco de esclerose múltipla ou de outra desordem de perda de mielina (demyelinating), Onde um ou mais de um marcador de metabólito é selecionado entre os metabólitos listados nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou qualquer combinação deles.
2. Método para diagnosticar a esclerose múltipla ou outra desordem de perda de mielina (demyelinating) ou o risco de esclerose múltipla ou de outra desordem de perda de mielina (demyelinating) em um paciente caracterizado por compreender as epatas de: analisar a amostra do dito paciente em relação à presença ou ausência de um ou mais marcadores de metabólitos selecionados do grupo consistindo da listagem de metabólitos nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou uma combinação deles, onde a diferença de intensidade de um ou mais de um dos ditos marcadores de metabólitos indica a presença de esclerose múltipla ou outra desordem de perda de mielina (demyelinating) ou o risco de esclerose múltipla ou de outra desordem de perda de mielina (demyelinating) no dito paciente.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizado por a amostra é sangue integral, plasma, soro ou uma sub-fração de sangue integral.
4. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a etapa (a) compreender a extração dos ditos metabólitos em um solvente orgânico.
5. Método de acordo com a reivindicação caracterizado por a etapa (a) compreender a extração dos ditos metabólitos em um solvente aquoso.
6. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizado por o método compreender analisar a amostra por espectrometria de massa.
7. Método de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por o espectrômetro de massa ser ura Espectrômetro de Massa de Ressonância Ciclotrônica de íu. ... Transformada de Fourier (FTMS).
8. Método de acordo com a reivindicação caracterizado por o método compreender analisar a amost..... por ionização por eletrospray positiva, ionização ρ eletrospray negativa, ionização quimica por pressão atmosférica positiva, ou ionização quimica por pressão atmosférica negativa.
9. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a dita uma ou mais de uma amostra de referencia ser uma pluralidade de amostras obtidas de indivíduos controle; uma ou mais de uma amostra de base obtida de um paciente em uma data anterior; ou uma combinação delas.
10. Método de acordo com reivindicação 1 ou 2 caracterizado por os marcadores de metabólitos de escl múltipla serem selecionados do grupo consistindo de: recidiva-remissão em comparação com uma amostra de referencia normal e os metabólitos são listados na Tabela primário-progressivo em comparação com uma amostra de referencia normal e os metabólitos são listados na Tabela -2,secundário-progressivo em comparação com uma amostra de referencia normal e os metabólitos são listados na Tabela -3, recidiva-remissão em comparação com secundário- progressivo e os metabólitos são listados na Tabela 4, recidiva-remissão em transição para secundário-progressivo em comparação com recidiva-remissão e os metabólitos são listados na Tabela 5, e recidiva-remissão em transição para secundário-progressivo em comparação com secundá^. progressivo e os metabólitos são listados na Tabela 6.
11. Método para diagnosticar a esclerose múltipla γ,-.ί outra desordem de perda de mielina (demyelinating) co- risco de esclerose múltipla ou de outra desordem de pt de mielina (demyelinating) em um paciente, o método caracterizado por compreender as etapas de: (a) analisar a amostra obtida de um paciente para obter dados quantificados para um ou mais de um marcador de metabólito; (b) comparar os dados quantificados do dito um ou mais de um marcador de metabólito com os dados correspondentes obtidos de uma ou mais de uma amostra de referencia, na qual a dita comparação pode ser utilizada para diagnosticar a esclerose múltipla ou outra desordem de perda de mie-'a,, (demyelinating) ou o risco de esclerose múltipla ou de outra desordem de perda de mielina (demyelinating), onde um ou mais de um marcador de metabólito é selecionado dos metabólitos listados na Tabela 22.
12. Método de acordo com a reivindicação 11 caracterizado por os marcadores de metabólitos da esclerose múltipla serem remitentes-recorrentes em comparação com uma amostra de referência normal e os marcadores de metabólitos compreenderem metabólitos com massas exatas em Daltons de , ou substancialmente equivalentes a, (a) 496.4157, (b)524.4448, (c) 540.4387, (d) 580.5089, (e) 594.4848, (f)596.5012 ou (g) 578.4923.
13. Método de acordo com a reivindicação 11 caracterizado por um ou mais de um metabólito ser tambor, caracterizado pela fórmula molecular (a) C30H56O5, fb^ C32H60O5, (c) C32H60O6, (d) C36H68O5, (e) C36H66O6, (f) C36H68O6 ou (g) C36H66O5, respectivamente.
14. Método de acordo com a reivindicação 13 caracterizado por um ou mais de um marcador de metabólito ser ainda definido pelos dados de fragmentação MS/MS como mostrado nas Tabelas 24, 25, 26, 29, 30, 31 ou 28, respectivamente.
15. Método de acordo com a reivindicação 13 caracterizado por um ou mais de um marcador de metabólito ser também definido pelas estruturas moleculares: <formula>formula see original document page 147</formula>
16. Método de acordo com a reivindicação 11 caracterizado por os marcadores de metabólitos da esclerose múltipla serem primário-progressivo em comparação com uma amostra de referência normal e os marcadores de metabólitos compreendem metabólitos com massas exatas em Daltons de, ou substancialmente equivalentes a, (a) 216.04, (b) 202.0453, (c) 244.0559, ou (d) 857.7516.
17. Método de acordo com a reivindicação 16 caracterizado por um ou mais de um marcador de metabc ' ■ ser também definido pela fórmula molecular (a) C5H13O7P, {!:>) C6HnO6Na, (c) C8Hi3O7Na ou (d) C54H99NO6, respectivamente.
18. Método de acordo com a reivindicação 17 caracterizado por um ou mais de um metabólito ser ainda definido pelos dados de fragmentação MS/MS como mostrado nas Tabelas 33, 36, 37 ou 41, respectivamente.
19. Método de acordo com a reivindicação 17 caracterizado por um ou mais de um metabólito ser também definido pela estrutura: a) <formula>formula see original document page 149</formula> b) <formula>formula see original document page 149</formula> c) <formula>formula see original document page 149</formula>
20. Método de acordo com a reivindicação 11 caracterizado por os marcadores de metabólitos da esc]: múltipla serem secundário-progressivo em comparação com uma amostra de referência normal e os marcadores de metabólitos compreenderem metabólitos com massas exatas em Daltons Je, ou substancialmente equivalentes a, (a) 541.3415, (b)565.3391, (c) 428.3653, (d) 805.5609, (e) 194.0803 ou (f)578.423.
21. Método de acordo com a reivindicação 20 caracterizado por um ou mais de um marcador de metabólito ser também definido pela fórmula molecular (a) C25H52NO9P, (b) C27H52NO9P, (c) C29H48O2, (d) C48H80NO8P, (e) C7H14O6 ou (f) C36H66O5, respectivamente.
22. Método de acordo com a reivindicação 21 caracterizado por um ou mais de um marcador de metabólito ser ainda definido pelos dados de fragmentação MS/MS como mostrado nas Tabelas 34, 35, 38, 39, 40 ou 28, respectivamente.
23. Método de acordo com a reivindicação 21 caracterizado por um ou mais de um marcador de metabólito ser também definido pela estrutura: a)<formula>formula see original document page 150</formula> b)<formula>formula see original document page 150</formula> C)<formula>formula see original document page 150</formula>
24. Método de acordo com a reivindicação 11 caracterizado por os marcadores de metabólitos da esclerose múltipla serem remitente-recorrente em comparação com uma amostra de referência secundário-progressivo e os marcadores de metabólitos compreendem metabólitos com massas exatas em Daltons de, ou substancialmente equivalentes a, (a) 540.4387 ou (b) 576.4757.
25. Método de acordo com a reivindicação 24 caracterizado por um ou mais de um marcador de metabólito ser também definido pela fórmula molecular (a) C32H6OO6 ou (b) C36H64O5.
26. Método de acordo com a reivindicação 25 caracterizado por um ou mais de um metabólito ser ainda definido pelos dados de fragmentação MS/MS como mostrado nas Tabelas 26 ou 27, respectivamente.
27. Método de acordo com a reivindicação 25 caracterizado por um ou mais de um marcador de metabólito ser também definido pela estrutura:
28. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por os marcadores de metabólitos da esclerose múltipla serem remitente-recorrente em transição para secundário-progressivo em comparação com uma amostra de referência secundário-progressivo e os marcadores de metabólitos compreenderem metabólitos com massas exatas em Daltons de, ou substancialmente equivalentes a (a) .786.5408.
29. Método de acordo com a reivindicação 28 caracterizado por um ou mais de um metabólito ser também definido pela fórmula molecular (a) C43H79Oi0P.
30. Método de acordo com a reivindicação 2 9 caracterizado por um ou mais de um metabólito ser ainda definido pelos dados de fragmentação MS/MS como mostrado na Tabela 32.
31. Método de acordo com a reivindicação 29 caracterizado por um ou mais de um metabólito ser também definido pela estrutura: <formula>formula see original document page 153</formula>O
32. Método de acordo com a reivindicação 11 caracterizado por os marcadores de metabólitos da esclerose múltipla serem remitente-recorrente em transição para secundário-progressivo em comparação com uma amostra de referência remitente-recorrente e os marcadores de metabólitos compreenderem metabólitos com massas exatas em Daltons de, ou substancialmente equivalentes a, (a)576.4757 ou (b) 578.4923.
33. Método de acordo com a reivindicação 32 caracterizado por um ou mais de um metabólito ser também definido pela fórmula molecular (a) C36H6405 ou (b) C36H66O5, respectivamente.
34. Método de acordo com a reivindicação 33 caracterizado por um ou mais de um metabólito ser ainda definido pelos dados de fragmentação MS/MS como mostrado nas Tabelas 27 ou 28, respectivamente.
35. Método de acordo com a reivindicação 33 caracterizado por um ou mais de um metabólito ser também definido pela estrutura: <formula>formula see original document page 154</formula>
36. Composto caracterizado por ser selecionado do grupo consistindo de metabólitos com massas exatas medidas em Daltons de, ou substancialmente equivalentes a, (a) -452.3868, (b) 496.4157, (c) 524.4448, (d) 540.4387, (e) -576.4757, (f) 578.4923, (g) 580.5089, (h) 594.4848, (i) -596.5012, (j) 786.5408, (k) 216.04, (1) 541.3415, (m) -565.3391, (n) 202.0453, (o) 244.0559, (p) 428.3653, e (s) -857.7516.
37. Composto de acordo com a reivindicação 36 caracterizado por ser definido também pela fórmula molecular (a) C28H52O4, (b) C30H56O5, (c) C32H60O5, (d) C32H60O6, (e) C36H64O5, (f) C36H66O5, (g) C36H6805, (h) C36H66O6, (i) C36H68O6, (j) C43H79O10P, (k) C5Hi3O7P, (1) C25H52NO9P, (m) C27H52NO9P, (n) C6Hi1O6Na, (o) C8Hi3O7Na, (p) C29H48O2, (s) C54H99NO6, respectivamente.
38. Composto de acordo com a reivindicação 37, caracterizado ainda pelos dados de fragmentação MS/MS como mostrado nas Tabelas 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, -32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, ou 41, respectivamente.
39. Composto de acordo com a reivindicação 37, caracterizado também pela estrutura: <formula>formula see original document page 155</formula> g)<formula>formula see original document page 156</formula> h)<formula>formula see original document page 156</formula> i)<formula>formula see original document page 156</formula> j)<formula>formula see original document page 156</formula> k)<formula>formula see original document page 156</formula> 1)<formula>formula see original document page 156</formula> <formula>formula see original document page 157</formula>
40. Uso de um ou mais de um composto como definido ^r;. qualquer uma das reivindicações 36 a 39 para o diagnósti χ da esclerose múltipla ou outra desordem de perda de mie· i .na (demyelinating).
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