BRPI0709306A2 - anticorpos monoclonal, imuniconjugados e composição farmacêutica - Google Patents

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Chie Sakanaka
Yan Wu
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Abstract

ANTICORPOS MONOCLONAL, IMUNOCONJUGADOS E COMPOSIçãO FARMACêUTICA. São fornecidos anticorpos anti-TAT226 e imunoconjugados destes. São fornecidos métodos de utilização dos anticorpos anti-TAT226 e imunoconjugados destes.

Description

"ANTICORPOS MONOCLONAL, IMUNOCONJUGADOS E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA"
Este pedido reivindica o pedido de Patente provisória US60/783,746, depositado em 17 de março de 2006, a descoberta do qual estáincorporada ao presente documento pela referência em sua totalidade.
Campo Da Invenção
A presente invenção refere-se aos anticorpos anti-TAT226 e seusimunoconjugados. A invenção refere-se ainda a métodos de uso dosanticorpos anti-TAT226 e seus imunoconjugados.
Antecedentes Da Invenção
Anticorpos que se ligam a polipeptídeos expressos na superfíciede células cancerosas provaram ser eficazes em terapias antineoplásica.Esses anticorpos agem através de vários mecanismos, incluindo, por exemplo,a ativação da citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo(ADCC); indução pelos anticorpos da citotoxicidade dependente decomplemento (CDC); melhor liberação de citocinas; e indução da apoptose.Vide, por exemplo, Cardarelltef ai (2002) Câncer Immunol. Immunother.51:15-24. Por exemplo, HERCEPTIN® e RITUXAN® (ambos da Genentech Inc.,South San Francisco, Califórnia, EUA) são anticorpos que têm sido usadoscom sucesso no tratamento do câncer de mama e Iinfoma não-Hodgkin,respectivamente. O HERCEPTIN® é um anticorpo monoclonal humanizadoderivado do DNA recombinante que se liga seletivamente ao proto-oncogeneno domínio extracelular do receptor do fator de crescimento epidérmicohumano 2 (HER2). A superexpressão da proteína HER2 é observada em 25-30% dos cânceres de mama primários. O RITUXAN® é um anticorpomonoclonal quimérico murino/humano geneticamente construído dirigido contrao antígeno CD20 encontrado na superfície de linfócitos B normais e malignos.Ambos os anticorpos são produzidos por células CHO recombinantes. OHERCEPTIN® parece atuar, pelo menos em parte, pela inibição daangiogênese (Izumi et al. (2002) Nature 416:279-280), e o RITUXAN® pareceatuar, pelo menos em parte, pela indução da apoptose (Cardarelli et al. (2002)Câncer Immunol. Immunother. 51:15-24).
Imunoconjugados, ou "conjugados anticorpo-droga" são úteispara a entrega local de agentes citotóxicos no tratamento do câncer. Vide, porexemplo, Syrigos et al. (1999) Anticancer Investigation 19:605-614; Niculescu-Duvaz et al. (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172; Patente US 4.975.278.
Os imunoconjugados permitem a entrega direcionada de uma fração da drogaao tumor, enquanto que a administração sistêmica de agentes citotóxicos nãoconjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade para as célulasnormais, além das células tumorais em que se procura eliminar. Vide Baldwinet al. (15 de Março, 1986) Lancet págs. 603-05; Thorpe (1985) "AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review ", em MonoclonalAntibodies '84: Biological and Clinicai Applications (Pinchera A. et al., Eds.)Pág. 475-506. Imunoconjugados direcionados contra polipeptídeos dasuperfície celular têm sido e continuam a ser desenvolvidos para o tratamentodo câncer. Para a análise, vide, por exemplo, Hamann et al. (2005) ExpertOpin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103.
Está claro que há uma necessidade contínua de agentesdirecionados contra polipeptídeos da superfície celular para diagnóstico e / oupara fins terapêuticos. A invenção aqui descrita satisfaz essa necessidade efornece outros benefícios.
Todas as referências citadas neste documento, incluindo ospedidos de patentes e publicações, são incorporadas ao mesmo pelareferência em sua totalidade.
Descrição Resumida da Invenção
A invenção fornece anticorpos anti-TAT226 e métodos para o usodo mesmo.
Em um aspecto, é fornecido um anticorpo que se liga a TAT226,no qual o anticorpo compreende de pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ouseis HVRs selecionados a partir de:
(1) uma HVR-H1, que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 4;
(2) uma HVR-H2, que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 5;
(3) uma HVR-H3 que compreende a seqüência de aminoácidosque está de acordo com a seqüência de consenso da SEQ ID No: 11;
(4) uma HVR-L1, que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 12;
(5) uma HVR-L2, que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 13; e
(6) uma HVR-L3 que compreende a seqüência de aminoácidosque está de acordo com a seqüência de consenso da SEQ ID No: 19.
Em outro aspecto, um anticorpo que se liga a TAT226 contém (a)uma HVR-H3 que compreende uma seqüência de aminoácidos que está deacordo com a seqüência de consenso SEQ ID No: 11, e (b) pelo menos um,dois, três, quatro ou cinco HVRs selecionados a partir de:
(1) uma HVR-H1, que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 4;
(2) uma HVR-H2, que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 5;
(3) uma HVR-L1, que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 12;
(4) uma HVR-L2, que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 13, e;(5) uma HVR-L3 que compreende a seqüência de aminoácidosque está de acordo com a seqüência de consenso da SEQ ID No: 19;
Em um exemplo de realização, o anticorpo contém uma HVR-L3que compreende uma seqüência de aminoácidos que está de acordo com aseqüência de consenso da SEQ ID No: 19. Em um exemplo de realização, oanticorpo possui ainda uma HVR-H1, que compreende a seqüência deaminoácidos da SEQ ID No: 4 e uma HVR-H2, que compreende a seqüênciade aminoácidos da SEQ ID No: 5. Em um exemplo de realização, o anticorpoinclui ainda uma HVR-L1, que compreende a seqüência de aminoácidos daSEQ ID No: 12 e uma HVR-L2 que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 13.
Em um exemplo de realização, o anticorpo consta de uma HVR-H3 que compreende uma seqüência de aminoácidos selecionados a partir daSEQ ID No:6-10. Em um exemplo de realização, o anticorpo consta ainda deuma HVR-L3 que compreende uma seqüência de aminoácidos selecionados apartir da SEQ ID No: 14-18. Em um exemplo de realização, a HVR-H3compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 9, e a HVR-L3compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 17. Em um exemplode realização, a HVR-H3 compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ IDNo: 10, e a HVR-L3 compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No:18. Em um exemplo de realização, o anticorpo inclui ainda uma HVR-H1, quecompreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 4 e uma HVR-H2,que compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 5. Em umexemplo de realização, o anticorpo inclui ainda uma HVR-L1, que compreendea seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 12 e uma HVR-L2 quecompreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 13.
Em um aspecto, é fornecido um anticorpo que se liga a TAT226,no qual o anticorpo consta de pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seisHVRs selecionadas a partir de:
(1) uma HVR-H1, que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 1;
(2) uma HVR-H2, que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 1;
(3) uma HVR-H3 que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 3;
(4) uma HVR-L1, que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 12;
(5) uma HVR-L2, que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 13; e
(6) uma HVR-L3 que compreende a seqüência de aminoácidos daSEQ ID No: 14.
Em outro aspecto, um anticorpo que se liga a TAT226compreende de (a) uma HVR-H3 compreendendo a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 3, e (b) de pelo menos um, dois, três, quatro ou cinco HVRsselecionados a partir de:
(1) uma HVR-H1, que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 1;
(2) uma HVR-H2, que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 1;
(3) uma HVR-L1 que compreende a seqüência de aminoácidos daSEQ ID No: 12;
(4) uma HVR-L2 que compreende a seqüência de aminoácidos daSEQ ID No: 13, e;
(5) uma HVR-L3 que compreende a seqüência de aminoácidos daSEQ ID No: 14.
Em um exemplo de realização, o anticorpo consta de uma HVR-L3 que compreende a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 14. Em umexemplo de realização, o anticorpo inclui ainda uma HVR-H1, que compreendea seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 e uma HVR-H2, que compreende aseqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 2. Em um exemplo de realização, oanticorpo consta ainda uma HVR-L1, que compreende a seqüência deaminoácidos da SEQ ID No: 12 e uma HVR-L2 que compreende a seqüênciade aminoácidos da SEQ ID No: 13.
Em certos exemplos de realização, qualquer um dos anticorposacima consta ainda de pelo menos uma região estrutural selecionada a partirde uma região estrutural de consenso VH subgrupo Ill e uma região estruturalde consenso VL subgrupo I.
Em um aspecto, é fornecido um anticorpo que se liga a TAT226,no qual o anticorpo compreende de um domínio variável de cadeia pesadatendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência de aminoácidos selecionados a partir da SEQ ID No :21-25. Em um exemplo de realização, oanticorpo compreende ainda de um domínio variável de cadeia leve tendo pelomenos 90% de identidade com a seqüência de aminoácidos selecionados apartir da SEQ ID No:26-31. Em um exemplo de realização, o anticorpocompreende um domínio variável de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 24. Em umexemplo de realização, o anticorpo compreende ainda de um domínio variávelde cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência deaminoácidos da SEQ ID No: 29. Em um exemplo de realização, o domíniovariável de cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 24, e o domínio variável de cadeia leve compreende a seqüência deaminoácidos SEQ ID No: 29. Em um exemplo de realização, o anticorpocompreende um domínio variável de cadeia pesada tendo pelo menos 90% deidentidade com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 25. Em umexemplo de realização, o anticorpo compreende ainda de um domínio variávelde cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência deaminoácidos da seqüência SEQ ID No: 30. Em um exemplo de realização, odomínio variável de cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácidosSEQ ID No: 25, e o domínio variável de cadeia leve compreende a seqüênciade aminoácidos SEQ ID NO: 30.
Em um aspecto, é fornecido um anticorpo que se liga a TAT226,no qual o anticorpo consta de um domínio variável de cadeia pesadacompreendendo pelo menos de 90% de identidade com a seqüência deaminoácidos da seqüência SEQ ID No: 20. Em um exemplo de realização, oanticorpo ainda consta de um domínio variável de cadeia leve compreendendopelo menos de 90% de identidade com a seqüência de aminoácidos daseqüência SEQ ID No: 26.
Em um exemplo de realização, o domínio variávelde cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 20,e o domínio variável de cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 26.
Em certos exemplos de realização, é fornecido umpolinucleotídeo que codifica qualquer um dos anticorpos descritos acima. Emum exemplo de realização, é fornecido um vetor que contém o polinucleotídeo.
Em um exemplo de realização, é fornecida uma célula hospedeira, quecontendo o vetor. Em um exemplo de realização, a célula hospedeira éeucariótica. Em um exemplo de realização, a célula hospedeira é uma célulaCHO. Em um exemplo de realização, é fornecido um método de produção doanticorpo anti-TAT226, caracterizado pelo fato do dito método compreender ocultivo da célula hospedeira sob condições adequadas para a expressão dopolinucleotídeo que codifica o anticorpo, e o isolamento do anticorpo.
Em um aspecto, é fornecido um anticorpo que se liga a TAT226expresso na superfície de uma célula. Em um exemplo de realização, oanticorpo liga-se a uma epítopo na região dos aminoácidos 21-115 da SEQ IDNo: 75 da TAT226. Em um exemplo de realização, a célula é uma célula decâncer. Em um exemplo de realização, as células cancerosas são células decâncer de ovário, células de tumor cerebral ou células de tumor de Wilm.
Em certos exemplos de realização, qualquer um dos anticorposacima é um anticorpo monoclonal. Em um exemplo de realização, o anticorpoé um fragmento de anticorpo selecionado a partir do fragmento Fab, Fab1-SH1FV, scFv, ou (Fab ')2. Em um exemplo de realização, o anticorpo é umanticorpo humanizado. Em um exemplo de realização, o anticorpo é umanticorpo humano. Em um exemplo de realização, o anticorpo liga-se aomesmo epítopo de um anticorpo selecionado a partir de YW0.32, YW0.49,YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, e YWO.49.H6.
Em um aspecto, é fornecido um método para a detecção dapresença de TAT226 em uma amostra biológica, o método compreende emexpor a amostra biológica com um dos anticorpos descritos acima emcondições permissivas para a ligação do anticorpo ao TAT226, e detectar seum complexo é formado entre o anticorpo e a TAT226 da amostra. Em umexemplo de realização, a amostra biológica compreende células de tumor de ovário, células de tumor cerebral ou células de tumor de Wilm.
Em um aspecto, é fornecido um método para o diagnóstico de umdistúrbio da proliferação celular associada ao aumento da expressão deTAT226, o método compreende em expor as células do ensaio com um dosanticorpos acima; e determinando o nível de expressão de TAT226 através dadetecção da ligação dos anticorpos ao TAT226, e comparando o nível deexpressão de TAT226 da célula do ensaio com o nível de expressão deTAT226 de células controle, no qual um maior nível de expressão de TAT226na célula de ensaio, quando comparada com a célula controle, indica apresença de um distúrbio da proliferação celular associada ao aumento daexpressão de TAT226. Em um exemplo de realização, a célula do ensaio éuma célula de um paciente com suspeita de ter um distúrbio da proliferaçãocelular. Em um exemplo de realização, o distúrbio da proliferação celular éselecionado a partir do câncer de ovário e do tumor de Wilm. Em um exemplode realização, o método compreende em determinar o nível de expressão deTAT226 na superfície da célula de ensaio e comparar o nível de expressão deTAT226 na superfície da célula de ensaio com o nível de expressão deTAT226 na superfície da célula controle.
A invenção fornece ainda imunoconjugados e métodos parautilizar o mesmo.
Em um aspecto, um imunoconjugado compreende qualquer umdos anticorpos anti-TAT226 referidos acima ligados covalente a um agentecitotóxico. Em um exemplo de realização, o agente citotóxico é selecionado apartir de uma toxina, um agente quimioterápico, um antibiótico, um isótoporadioativo, e uma enzima nucleolítica.
Em um aspecto, é fornecido um imunoconjugado que possuí afórmula Ab-(L-D)p, no qual:
(a) Ab é qualquer um dos anticorpos anti-TAT226 acima referidos,
(b) L é um ligante;
(c) D é uma droga da fórmula De ou Df.
<formula>formula see original document page 10</formula>
E no qual cada R2 e R6 são metil, cada R3 e R4 são isopropílicoR7é sec-butil, cada R8 é selecionado independente a partir de CH3, O-CH3, OH1e H; R9 é H; R10 é aril; Z é -O- ou -NH-; R11 é H1 C1-C8 alquila, ou -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH3; e R18é -C(R8)2-C(R8)2-arila; e(d) ρ varia entre cerca de 1 a 8.
Em um exemplo de realização, o anticorpo (Ab) compreende: 1)uma HVR-H3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que está deacordo com a seqüência de consenso SEQ ID No: 11 e 2) pelo menos um,dois, três, quatro, ou cinco HVRs selecionadas a partir de:
(i) uma HVR-H1 que compreende a seqüência de aminoácidos daSEQ ID No: 4;
(ii) uma HVR-H2 que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 5;
(iii) uma HVR-L1 que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 12;
(iv) uma HVR-L2 que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 13, e;
(v) uma HVR-L3 que compreende a seqüência de aminoácidosque está de acordo com a seqüência de consenso da SEQ ID No: 19.
Em um exemplo de realização, o anticorpo consta de uma HVR-L3 que compreende uma seqüência de aminoácidos de acordo com aseqüência de consenso da SEQ ID No: 19. Em um exemplo de realização, oanticorpo consta de uma HVR-H3 que compreende a seqüência deaminoácidos da SEQ ID No: 9 e uma HVR-L3 que compreende a seqüência deaminoácidos da SEQ ID No: 17. Em um exemplo de realização, o anticorpoconsta de uma HVR-H3 que compreende a seqüência de aminoácidos da SEQID No: 10 e uma HVR-L3 que compreende a seqüência de aminoácidos daSEQ ID No: 18. Em um exemplo de realização, o anticorpo possui ainda umaHVR-H1, que compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 4, umaHVR-H2, que compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 5, umaHVR-L1, que compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 12, euma HVR-L2 que compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 13.Em um exemplo de realização, o anticorpo possui uma região variável decadeia pesada que tenha pelo menos 90% de identidade com a seqüência deaminoácidos selecionada a partir das SEQ ID Nos:21-25 e uma região variávelde cadeia leve que tenha pelo menos 90% de identidade com a seqüência deaminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No:26-31. Em um exemplo derealização, o anticorpo compreende de uma região variável da cadeia pesadaque tenha pelo menos 90% de identidade com a seqüência de aminoácidos daSEQ ID No: 24, e uma região variável da cadeia leve que tenha pelo menos90% de identidade com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 29. Emum exemplo de realização, o anticorpo compreende uma região variável decadeia pesada, com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 24 e umaregião variável de cadeia leve, com a seqüência de aminoácidos da SEQ IDNo: 29. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende uma regiãovariável da cadeia pesada que tenha pelo menos 90% de identidade com aseqüência de aminoácidos da seqüência SEQ ID No: 25, e uma região variávelda cadeia leve que tenha pelo menos 90% de identidade com a seqüência deaminoácidos da seqüência SEQ ID No: 30. Em um exemplo de realização, oanticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada, com a seqüênciade aminoácidos da SEQ ID No: 25, e uma região variável de cadeia leve, coma seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 30.
Os exemplos de realizações seguintes são fornecidosadicionalmente para qualquer um dos imunoconjugados referidos acima. Emum exemplo de realização, um imunoconjugado possui uma atividade de mortecelular in vitro ou in vivo. Em um exemplo de realização, o Iigante é anexadoao anticorpo através de um grupo tiol no anticorpo. Em um exemplo derealização, o ligante é clivável por uma protease. Em um exemplo derealização, o ligante compreende um dipeptídeo val-cit. Em um exemplo derealização, o ligante compreende uma unidade p-aminobenzil. Em um exemplode realização, a unidade p-aminobenzil é disposta entre a droga e um sítio declivagem pela protease no ligante. Em um exemplo de realização, a unidade p-aminobenzil é p-aminobenziloxicarbonil (PAB). Em um exemplo de realização,o ligante compreende 6-maleimidocaproíl. Em exemplo de realização, o 6-maleimidocaproíl está diposto entre o anticorpo e o local de clivagem pelaprotease no ligante. Os exemplos de realizações acima podem ocorrerisoladamente ou em combinação com qualquer outro.
Em um exemplo de realização, a droga é selecionada a partir deMMAE e MMAF. Em exemplo de realização, o imunoconjugado tem a fórmula:
<formula>formula see original document page 13</formula>
no qual, Ab é um dos anticorpos anti-TAT226 descritos acima, S éum átomo de enxofre, e ρ varia de 2 a 5. Em exemplo de realização, oimunoconjugado tem a fórmula:
no qual, é um dos anticorpos anti-TAT226 descritos acima, S éum átomo de enxofre, e ρ varia de 2 a 5.
Em um aspecto, é fornecida uma composição farmacêuticacompreendendo qualquer um dos imunoconjugados descritos acima e umveículo farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto, é fornecido um métodopara o tratamento de um distúrbio da proliferação celular, no qual o métodocompreende em administrar a uma pessoa a composição farmacêutica. Em umexemplo de realização, o distúrbio da proliferação celular é selecionado a partirde câncer de ovário, câncer de útero, tumor cerebral, e tumor de Wilm. Em umexemplo de realização, o distúrbio da proliferação celular está associado a umaumento da expressão de TAT226 na superfície de uma célula.
Em um aspecto, é fornecido um método para inibir a proliferaçãoelular, no qual o método compreende a exposição de uma célula de qualquerdas situações descritas acima ao imunoconjugado em condições permissivapara a ligação do imunoconjugado ao TAT226. Em um exemplo de realização,a célula é uma célula tumoral. Em um exemplo de realização, a célula tumoralé uma célula de tumor de ovário, uma célula de tumor de útero, uma célula detumor cerebral ou um célula de tumor de Wilm. Em um exemplo de realização,a célula é um xenoenxerto . Em exemplo de realização, a exposição ocorre invitro. Em um exemplo de realização, a exposição ocorre in vivo.
Breve Descrição das Figuras
A Figura 1 exibe um alinhamento da TAT226 de humano, macacocinomolgo ("cyno"), camundongo e rato. Os resíduos sombreados sãoidênticos entre as espécies. Os resíduos não sombreados diferem entre pelomenos duas das quatro espécies. O percentual de identidade entre asseqüências de aminoácido do TAT226 em humano, macaco cinomolgo,camundongos e rato são exibidos na tabela abaixo do alinhamento. Opercentual de identidade foi calculado utilizando o programa ClustaIW.
A Figura 2 exibe as seqüências da região hipervariável (HVR) decadeia pesada H1, H2, H3 de anticorpos monoclonais anti-TAT226denominados YW0.32 e YW0.49, assim como descrito no Exemplo B. Asposições de aminoácidos são numeradas de acordo com o sistema denumeração de Kabat como descrito abaixo.
A Figura 3 exibe as seqüências da região hipervariável (HVR) decadeia leve L1, L2 e L3 de anticorpos monoclonais anti-TAT226 denominadosYW0.32 e YWO.49, assim como descrito no Exemplo B. As posições deaminoácidos são numeradas de acordo com o sistema de numeração de Kabatcomo descrito abaixo.
A Figura 4 exibe as seqüências HVR-H3 e HVR-L3 do YW0.49 eYWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, e YWO.49.H6, que foram gerados pelométodo de maturação por afinidade do YWO.49 utilizando bibliotecas de HVR-H3 e HVR-L3 levemente aleatorizadas, como descrito no Exemplo Β. Aseqüências de consenso HVR-H3 e HVR-L3 também são exibidas.
As Figuras 5A e 5B exibem de maneira exemplar a seqüência daestrutura aceptora humana variável pesada (VH) para o uso na execução dapresente invenção com identificadores da seqüência do seguinte modo:
Estrutura de consenso humano VH subgrupo I "A" menos CDRsde Kabat (SEQ ID Nos: 32, 33, 34, 35).
Estrutura de consenso humano VH subgrupo I "B", "C" e "D"menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID Nos: 36, 37, 34, 35; SEQ IDNos:36, 37, 38, 35; e SEQ ID Nos:36, 37, 39, 35).
Estrutura de consenso humano VH subgrupo Il "A" menos CDRsde Kabat (SEQ ID Nos:40, 41, 42, 35).
Estrutura de consenso humano VH subgrupo Il "B", "C" e "D"menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID Nos:43, 44, 42, 35; SEQ IDNos:43, 44, 45, 35; e SEQ ID Nos:43, 44, 46 e 35).
Estrutura de consenso humano VH subgrupo Ill "A" menos CDRsde Kabat (SEQ ID Nos:47, 48, 49, 35).
Estrutura de consenso humano VH subgrupo Ill "B", "C" e "D"menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID Nos:50, 51, 49, 35; SEQ IDNos:50, 51, 52, 35; e SEQ ID Nos:50, 51, 53, 35).
Estrutura aceptora VH Humano "A" menos CDRs Kabat (SEQ IDNo: 54, 48, 55, 35).
Estrutura aceptora VH Humano "B" e "C" menos regiõeshipervariáveis prolongadas (SEQ ID NOs:54, 48, 57, 35).
Estrutura aceptora 2 VH Humano "A" menos CDRs Kabat (SEQID No: 54, 48, 57, 35).
Estrutura aceptora 2 VH Humano "B", "C" e "D" menos regiõesi hipervariáveis prolongadas (SEQ ID Nos:50, 51, 57, 35; SEQ ID Nos:50, 51,58, 35; e SEQ ID Nos:50, 51, 59, 35).
As Figuras 6A e 6B exibem exemplarmente a seqüência daestrutura aceptora variável leve (VL) de consenso humano para o uso naexecução da presente invenção com identificadores da seqüência do seguintemodo::
Estrutura de consenso humano VL kappa subgrupo I (κν1): SEQID Nos: 60, 61, 62, 63
Estrutura de consenso humano VL kappa subgrupo Il (kv2): SEQID Nos:64, 65, 66, 63
Estrutura de consenso humano VL kappa subgrupo Ill (kv3): SEQID Nos:67, 68, 69, 63
Estrutura de consenso humano VL kappa subgrupo IV (kv4): SEQID Nos:70, 71, 72, 63.
A Figura 7 exibe as seqüências da região de estrutura dascadeias leve e pesadas do huMAb4D5-8. Os números em sobrescrito / negritoindicam as posições de aminoácidos de acordo com Kabat.
A Figura 8 exibe as seqüências da região de estrutura dascadeias leve e pesadas da huMAb4D5-8 com as modificações indicadas . Osnúmeros em sobrescrito / negrito indicam as posições de aminoácido deacordo com Kabat.
A Figura 9 exibe as seqüências da região variável da cadeiapesada (VH) do YW0.32, YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 eYWO.49.H6. As HVRs estão sublinhadas.A Figura 10 exibe as seqüências região variável da cadeia leve(VL) do YW0.32, YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 eYWO.49.H6. As seqüências VL do anticorpo monoclonal humanizado 4D5-8 ("huMAb4D5-8") e do huMAb4D5-8 "modificado" também são exibidos na SEQID No: 31 e SEQ ID No: 26, respectivamente. O YWO.32 e YWO.49 VL têm amesma seqüência VL como o huMAb4D5-8 "modificado" (SEQ ID No: 26), quecontém as seguintes substituições em relação à SEQ ID No: 31: N30S, R66G eH91S. As HVRs estão sublinhadas.
A Figura 11 exibe um alinhamento das seqüências da regiãovariável da cadeia pesada do YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9,YWO.49.H2 e YWO.49.H6. As HVRs estão dentro de quadrados. Os resíduosdas HVR-H3S do YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6 quediferem dos resíduos correspondentes da HVR-H3 do YWO.49 estãosombreados.
A Figura 12 exibe um alinhamento das seqüências da regiãovariável da cadeia leve do YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9,YWO.49.H2 e YWO.49.H6. As HVRs estão dentro de quadrados. Os resíduosda HVR-L3s do YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6 quediferem dos resíduos correspondentes da HVR-L3 do YWO.49 estão sombreados.
A Figura 13 exibe uma representação gráfica dos níveis deexpressão gênica do TAT226 humano em vários tecidos, como descrito noExemplo A.
A Figura 14 exibe uma representação gráfica dos níveis deexpressão gênica do TAT226 humano em ovário normal; tuba uterina normal;células claras, mucinosas e serosas de câncer de ovário, subtipos decistoadenocarcinoma; câncer de ovário metastático e outros tipos de cânceresde ovário, como descrito no Exemplo A.A Figura 15 exibe os resultados da seleção das células ativadaspela fluorescência (FACS) de células OVCAR3 na ausência ou na presençade anticorpos anti-TAT226, como descrito no Exemplo D.
A Figura 16 exibe a expressão do RNAm e da proteína TAT226determinado por um ensaio com uma nuclease 5' (TaqMan®) e imuno-histoquímica (IHQ) realizadas em células OVCAR3 e um painel de amostras decâncer de ovário, assim como descrito no Exemplo F.
A Figura 17 exibe a atividade in vitro de diversos conjugadosdroga-anticorpo YWO.49.H2 e YWO.49.H6 (ADC)1 em um ensaio de mortecelular com células OVCAR3, como descrito no Exemplo H.
A Figura 18 exibe a atividade in vitro de alguns ADCs YWO.49.H2e YWO.49.H6, em um ensaio de morte celular utilizando células HCT116#9-4transfectadas de forma estável, assim como descrito no Exemplo H.
A Figura 19 exibe a atividade in vivo do ADC YWO.49.H6 CDAutilizando um camundongo xenotransplantado, como escrito no Exemplo H.
A Figura 20 exibe a atividade in vivo do CDA YWO.49.H6utilizando xenotransplantes de camundongos derivados de tumores depacientes humanos, assim como descrito no Exemplo H.
Descrição Detalhada De Exemplo de Realizações da Invenção
São fornecidos anticorpos isolados que se ligam a TAT226. Sãoainda fornecidos imunoconjugados compreendendo anticorpos anti-TAT226.Os anticorpos e imunoconjugados da invenção são úteis, por exemplo, para odiagnóstico ou tratamento de doenças associadas com alteração daexpressão, por exemplo, aumento da expressão de TAT226. Em certosexemplos de realização, anticorpos ou imunoconjugados da invenção são úteispara o diagnóstico ou tratamento de um distúrbio da proliferação celular, comoum tumor ou câncer. Em determinados exemplos de realizações, anticorpos ouimunoconjugados da invenção são úteis para a detecção de TAT226, porexemplo, TAT226, expresso na superfície da célula.
É fornecido polinucleotídeos que codificam os anticorpos anti-TAT226. São fornecidos É fornecido vetores que compreendem ospolinucleotídeos que codificam os anticorpos anti-TAT226, e as célulashospedeiras que constam de tais vetores. É fornecido composições, incluindoformulações farmacêuticas, compreendendo um ou mais dos polinucleotídeos,anticorpos anti-TAT226, imunoconjugados da invenção.
I Técnicas Gerais
As técnicas e os procedimentos descritos ou aqui referenciadossão geralmente bem compreendida e comumente empregados usando ametodologia convencional para aqueles especialistas no assunto, como, porexemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Sambrook etal., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a edição (2001) Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor1 Nova Iorque; Current Protocolsin Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); as séries: Methods inEnzymology (Academic Press, Inc.): Pcr 2: A Practical Approach (M. J.MacPherson, B. D. Hames e G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow e Lane, eds.(1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R. I.Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Ed., 1984);Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A LaboratoryNotebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I.Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mathere P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: LaboratoryProcedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, e D. G. Newell, Eds., 1993-8) J. Wiley &Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir e C. C. Blackwell.);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller e Μ. P. Calos, eds.,1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994);Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); ShortProtocols in Molecular Biology (Wiley e Sons, 1999); Immunobiology (C. A.Janeway e P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: APractical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); MonoclonalAntibodies: A Practieal Approaeh (P. Shepherd e C. Dean, eds., OxfordUniversity Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow e D.Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanettie J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); e Câncer: Principiesand Practice of Oncology (V. T. DeVita et ai, eds., J.B. Lippincott Company,1993).
II. Definições E Abreviaturas
A. Definições
Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separadoe/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentescontaminantes de seu ambiente natural são materiais que podem interferir napesquisa, diagnóstico ou usos terapêuticos para o anticorpo, e podem incluirenzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos e não-proteináceos. Emuma realização, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso deanticorpo, conforme determinado, por exemplo, pelo método de Lowry, e emalgumas realizações, mais de 99% em peso, (2) a um grau suficiente para seobter pelo menos 15 resíduos de seqüência N-terminal ou de aminoácidosinterna, a partir do uso, por exemplo, de um seqüenciador de copo rotatório(spinning cup), ou (3) até homogeneidade por SDS-PAGE sob condiçõesredutoras ou não-redutoras, utilizando, por exemplo, azul de Coomassie oucoloração de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em célulasrecombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural doanticorpo não esteja presente. Geralmente, entretanto, o anticorpo isolado serápreparado por pelo menos uma etapa de purificação.
Uma molécula de ácido nucléico "isolada" é uma molécula deácidos nucléico que está separada de pelo menos uma molécula de ácidonucléico contaminante com a qual está comumente associada, por exemplo,em sua fonte no ambiente natural. Uma molécula de ácido nucléico isoladainclui uma molécula de ácido nucléico contida nas células que normalmenteexpressam a molécula de ácido nucléico, mas a molécula de ácido nucléicoesta presente extracromosomalmente ou em uma localização cromossômicaque é diferente de sua localização cromossômica natural.
"Purificado" significa que uma molécula esta presente em umaamostra em uma concentração de pelo menos 95% pelo peso, o pelo menos98% de peso da amostra na qual esta contida.
A expressão "substancialmente similar," "substancialmente omesmo" da forma utilizada no presente, refere-se a um grau suficientementealto de similaridade entre dois valores numéricos (por exemplo, um valorassociado com o anticorpo e o outro valor associado com o anticorpo dereferência/comparativo), de forma que um técnico no assunto consideraria adiferença entre os dois valores como tendo nenhuma ou pouca significânciaestatística e/ou biológica no contexto da característica biológica mensuradapelos mencionados valores (tal como, valores Kd). A diferença entre os ditosvalores, por exemplo, é menos de cerca de 50%, menos de cerca de 40%,menos de cerca de 30%, menos de cerca de 20% e/ou menos de cerca de10%, e função do valor de referência /comparativo.
A expressão "substancialmente reduzida" ou "substancialmentediferente", da forma utilizada no presente, refere-se a um grau suficientementealto de diferença entre dois valores numéricos (geralmente um associado comuma molécula e o outro associado com uma molécula dereferência/comparativa), de forma que o técnico no assunto consideraria adiferença entre os dois valores como sendo de significância estatística dentrodo contexto das características biológicas mensuradas pelos ditos valores(como, por exemplo, valores Kd). A diferença entre os ditos dois valores, porexemplo, é maior que cerca de 10%, maior que cerca de 20%, maior que cercade 30%, maior que cerca de 40%, e/ou maior que cerca de 50% em função dovalor para a molécula de referência/comparativa.
O termo "vetor", da forma utilizada no presente, refere-se a umamolécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qualele foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça(loop) de DNA de fita dupla circular, no qual segmentos de DNA adicionaispodem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor fago. Outro tipo de vetor éum vetor viral, no qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados nogenoma viral. Determinados vetores são capazes de realizar a replicaçãoautônoma na célula hospedeira a qual foram introduzidos (por exemplo,vetores bacterianos que possuem uma origem bacteriana de replicação evetores mamíferos epissomais). De outro modo, outros vetores (por exemplo,vetores mamíferos não-epissomais) podem ser integrados no genoma de umacélula hospedeira mediante a introdução na célula hospedeira, sendo, destaforma, replicado junto com o genoma hospedeiro. Adicionalmente,determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aosquais são operacionalmente ligados. Estes vetores são denominados, nopresente, como "vetores de expressão recombinantes" ou simplesmente,"vetores recombinantes". Em geral, os vetores de expressão para uso emtécnicas de DNA recombinante são freqüentemente presentes na forma deplasmídeos. De acordo com a presente especificação, "plasmídeo" e "vetor"podem ser utilizados de forma intercambiável, uma vez que o plasmídeo é aforma mais comum de vetor utilizada.
"Polinucleotídeo" ou "ácido nucléico", como utilizados de formaintercambiável no presente, referem-se a polímeros de nucleotídeos dequalquer comprimento, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem serdeoxiribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases,e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que pode ser incorporado em umpolímero pela DNA ou RNA polimerase, ou por uma reação sintética. Umpolinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais comonucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, a modificação àestrutura de nucleotídeo pode ser realizada antes ou após a formação dopolímero. A seqüência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentesque não nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode adicionalmente ser modificadoapós a síntese, tal como por conjugação com uma marcação. Outros tipos demodificações incluem, por exemplo, "caps", substituição de um ou mais dosnucleotídeos de ocorrência natural por um análogo, modificaçõesinternucleotídeos, como por exemplo, aquelas com ligações não-carregadas(por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos,etc.), e com ligações carregadas (tal como, fosforotioatos, fosforoditioatas,etc.), aqueles que contêm unidades pendentes, tal como, por exemplo,proteínas (como nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos sinais, ply-L-lisina,etc.), aqueles com intercalantes (por exemplo, acridina, psoralen, etc.), os quecontêm quelantes (tal como, metais, metais radioativos, boro, metaisoxidativos, etc.), os que contêm alquilantes, aqueles com ligações modificadas(tal como, ácidos nucléicos alfa anoméricos, etc.), bem como formas não-modificadas dos polinucleotídeos. Adicionalmente, qualquer um dos gruposhidroxila necessariamente presentes nos açúcares pode ser substituído, porexemplo, por grupos fosfonatos, grupos fosfatos, protegidos por grupos deproteção padrão, ou ativados para preparar ligações adicionais à nucleotídeosadicionais, ou pode ser conjugado à suportes sólidos ou semi-sólidos. Asextremidades OH 5' e 3' podem ser fosforiladas ou substituídas com unidadesaminas ou grupos de encapsulação orgânica dei a 20 átomos de carbono.Outras hidroxilas podem também ser substituídas por grupos de proteçãopadrões. Os polinucleotídeos podem também conter formas análogas deaçúcares ribose ou deoxiribose que são geralmente conhecidos na técnica,incluindo, por exemplo, 2'-0-metil-, 2'-0-alil, 2'-fluoro- ou 2'-azido-ribose,análogos de açúcares carbocíclicos, açúcares α-anoméricos, açúcaresepiméricos, tais como xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcaresfuranose, sedoheptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeobásicos , tais como metil ribosídeo. Uma ou mais ligações fosfodiéster pode sersubstituída por grupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligaçãoalternativos incluem, mas sem se limitar, realizações em que o fosfato ésubstituído por P(O)S ("tioata"), P(S)S ("ditioata"), (0)NR2 ("amidata"), P(O)R1P(O)OR', CO ou CH2 ("formacetal"), em que cada R ou R' éindependentemente H ou alquil (1-20 C) substituído ou não-substituído,contendo opcionalmente uma ligação éter (-0-), aril, alquenil, cicloalquil,cicloalquenil ou araldil. Nem todas as ligações presentes no polinucleotídeoprecisam ser identificadas. A descrição acima se aplica a todos ospolinucleotídeos referenciados no presente, incluindo RNA e DNA.
"Oligonucleotídeo", da forma utilizada no presente, geralmenterefere-se a uma seqüência curta, geralmente de fita simples, geralmentepolinucleotídeos sintéticos que possuem, em geral, mas não necessariamente,menos de cerca de 200 nucleotídeos de comprimento. Os termos"oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo" não são mutuamente exclusivos. Adescrição acima para polinucleotídeos é igualmente e completamente aplicávelpara oligonucleotídeos.
"Percentual (%) de identidade de seqüência de aminoácidos" nopresente é definido como o percentual de resíduos de aminoácidos na possívelseqüência que é idêntica aos resíduos de aminoácidos na seqüência dopolipeptídeos ou peptídeo específico, após o alinhamento das seqüências eintrodução de intervalos, se necessário, para atingir o percentual máximo deidentidade de seqüências, sem considerar nenhuma substituição conservadoracomo parte da identidade de seqüências. O alinhamento para propósitos dadeterminação do percentual de identidade de seqüências de aminoácidos podeser atingido de várias formas que se encontram dentro do conhecimento datécnica, tais como o uso de softwares de computador disponíveis ao público,tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN1 ALIGN-2 ou Megalign(DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetrosapropriados para medir o alinhamento, incluindo qualquer algoritmo necessáriopara atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total dasseqüências sendo comparadas. Para os propósitos do presente, entretanto, osvalores percentuais de identidade de seqüências de aminoácidos geradasutilizando o programa de computador para comparação de seqüências ALIGN-2. O programa de computador de comparação de seqüências ALIGN-2, deautoria da Genentech, Inc., foi depositado com a documentação do usuário noEscritório Norte-Americano de Direitos Autorais, Washington DC 20559,Estados Unidos, onde foi registrado com o n° de Registro de Direitos AutoraisNorte-Americano TXU510087. O programa ALIGN-2é disponível ao público pormeio da Genentech, Inc., Califórnia, Estados Unidos. O programa ALIGN-2deverá ser compilado para uso em sistema operativo UNIX, preferencialmenteUNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de seqüências sãoestabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Em situações no qual o ALIGN-2 foi empregado para acomparação das seqüências de aminoácidos, o percentual de identidade deseqüências de aminoácidos de uma dada seqüência de aminoácidos A, comou contra seqüência de aminoácidos B (que pode ser alternativamenteexpressa como uma dada seqüência de aminoácidos A que possui ou contemcerto percentual de identidade na seqüência de aminoácidos com uma dadaseqüência de aminoácidos B) é calculado da seguinte forma:100 vezes a fração X/Y
no qual, X é a quantidade de resíduos de aminoácidos avaliadoscomo coincidências idênticas pelo programa de alinhamento de seqüênciasALIGN-2 no alinhamento de A e B, e no qual Y é a quantidade total deresíduos de aminoácidos em B. Apreciar-se-á que, quando o comprimento daseqüência de aminoácidos A não for igual ao comprimento da seqüência deaminoácidos Β, o (%) percentual de identidade de seqüências de aminoácidosde A para B não seja igual ao percentual de identidade de seqüências deaminoácidos de B para A. A menos que especificamente indicado de outraforma, todos os valores percentuais de identidade de seqüências deaminoácidos obtidos são utilizados aqui, tal como descrito no parágrafoanterior utilizando o programa ALIGN-2.
O termo "TAT226," da forma como utilizado no presente, refere-se a qualquer TAT226 nativo a partir de qualquer fonte de vertebrado, incluindomamíferos como primatas (por exemplo, seres humanos) e roedores (porexemplo, camundongos e ratos), salvo quando indicado de outra forma. Otermo engloba TAT226 "de comprimento total" não transformado, bem comoqualquer forma de TAT226 resultante da transformação na célula. O termoengloba igualmente variantes de TAT226 de ocorrência natural, por exemplo,por splice alternativo ou variantes alélicas. A "forma madura" de TAT226 é umaforma de TAT226 que tenha sido submetida a um tratamento, por exemplo,uma forma de TAT226 que tenha sofrido clivagem da extremidade N-terminal(por exemplo, seqüência sinal) e / ou da extremidade C-terminal e / ou amodificação pelo acoplamento de âncora-GPI. Em uma realização, uma "formamadura" de TAT226 é expressa sobre a superfície celular.
"Anticorpos" (Abs) e "imunoglobulinas" (Igs) são glicoproteínasque possuem as mesmas características estruturais. Embora anticorposexibam uma especificidade de ligação a um antígeno específico, asimunoglobulinas incluem anticorpos e moléculas similares a anticorpo quegeralmente não tem especificidade ao antígeno. Polipeptídeos deste último tiposão, por exemplo, produzidos em baixos níveis pelo sistema linfático e em altosníveis por mielomas.
Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são utilizados de formaintercambiável no sentido mais amplo e inclui anticorpos monoclonais (taiscomo anticorpos monoclonais intactos ou de comprimento total), anticorpospoliclonais, anticorpos monovalentes, anticorpos multivalentes, anticorposmultiespecíficos (tais como anticorpos multiespecíficos a ponto de exibir aatividade biológica desejada), e pode ainda incluir determinados fragmentos deanticorpos (conforme descrito em maior detalhe abaixo). Um anticorpo podeser quimérico, humano, humanizado e/ou maturado por afinidade.
O termo "anticorpo anti-TAT226" ou "um anticorpo que se liga aTAT226" refere-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a TAT226 comafinidade suficiente de modo que o anticorpo torna-se útil para uso diagnósticoe / ou terapêutico direcionado contra o TAT226. Preferencialmente, a extensãode ligação de um anticorpo anti-TAT226 a u sem relação proteínas nãoTAT226 é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo para a TAT226mensurada, por exemplo, por um teste de radioimunoensaio (RIA). Em certasrealizações, um anticorpo que se liga a TAT226 tem uma constante dedissociação (Kd) < 1°μΜ, <°100nM, <°10nM, <°1 nM ou <°0,1nM. Em certasrealizações, um anticorpo anti-TAT226 se liga a um epítopo da TAT226 que éconservado entre a TAT226 de diferentes espécies.
A "região variável" ou "domínio variável" de um anticorpo refere-seaos domínios amino-terminal da cadeia pesada ou leve do anticorpo. Odomínio variável da cadeia pesada pode ser referido como "VH". O domíniovariável da cadeia leve pode ser referido como "VL". Estes domínios sãogeralmente as partes mais variáveis de um anticorpo, e contêm os sítios deligação de antígenos.
O termo "variável" é utilizado no presente para descrever certasporções dos domínios variáveis que diferem de seqüência entre os anticorpose são utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico para oseu antígeno específico. Entretanto, a variabilidade normalmente não édistribuída regularmente ao longo dos domínios variáveis de anticorpos. Ela étipicamente concentrada em três segmentos denominados regiõesdeterminantes de complementaridade (CDRs) ou regiões hipervariáveis(HVRs), tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como de cadeia pesada.
As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis sãodenominadas estruturas (FR). Cada um dos domínios variáveis de cadeia levee pesada nativos compreende quatro regiões FR1 que adotam em grande parteconfiguração de folha-beta, conectadas por três CDRs1 que formam alças(Ioops) que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha-beta. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em boa proximidade pelasregiões FR e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação dosítio de ligação de antígenos de anticorpos (vide Kabat,. et ai, Sepuences ofProteins of Immunolopical InterestAb0 Ed. National Institutes of Health,Bethesda MD, (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidosdiretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem váriasfunções efetoras, tais como a participação do anticorpo em toxicidade celulardependente de anticorpos.
As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquerespécie de vertebrado podem ser atribuídas a um dentre dois tipos claramentedistintos, denominados kappa (κ) e Iambda (λ), com base nas seqüências deaminoácidos dos seus domínios constantes.
Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constantedas suas cadeias pesadas, podem ser atribuídas classes diferentes aosanticorpos (imunoglobulinas). Existem cinco classes principais de anticorposintactos: IgA1 IgD1 IgE1 IgG e IgM1 e várias delas podem ser adicionalmentedivididas em subclasses (isoformas), por exemplo, IgGi, lgG2, lgG3, IgG4, IgAi,e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem àsclasses diferentes de anticorpos são denominados α, δ, ε, γ, e μ,respectivamente. As estruturas de subunidades e configuraçõestridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidase descritas, descritas, por exemplo, em Abbas et ai, Cellular and Mol.Immunoloav, 4a Ed (2000). Um anticorpo pode ser parte de uma grandemolécula de fusão, formada por associação covalente ou não-covalente doanticorpo com uma ou mais outras proteínas ou peptídeo.
Os termos "anticorpo de comprimento total", "anticorpo intacto" e"anticorpo completo" são utilizados no presente de forma intercambiável, parareferir-se a um anticorpo em sua forma substancialmente intacta, e não comofragmentos de anticorpos como descrito acima. Os termos particularmentereferem-se a um anticorpo com cadeias pesadas que contenha a região Fc.
"Fragmentos de anticorpos" compreendem apenas uma porçãode um anticorpo intacto, no qual esta porção retém pelo menos uma, muitas outodas as funções normalmente associadas com a mesma porção quandopresente no anticorpo intacto. Em uma realização, um fragmento de anticorpocompreende o sítio de ligação ao antígeno do anticorpo intacto e, desta forma,mantém a capacidade de se ligar ao antígeno. Em outra realização, umfragmento de anticorpo, por exemplo, um que compreenda a região Fc,mantém pelo menos uma das funções biológicas normalmente associadas coma região Fc quando esta está presente em um anticorpo intacto, tal como aligação do FcRn, modulação da meia vida do anticorpo, função ADCC eligação ao complemento. Em uma realização, um fragmento de anticorpo é umanticorpo monovalente que possui uma meia vida in vivo substancialmentesimilar a um anticorpo intacto. Por exemplo, um fragmento de anticorpo podeconter no braço de ligação ao antígeno uma seqüência Fc capaz de conferirestabilidade in vivo ao fragmento.
A digestão de anticorpos pela papaína produz dois fragmentos deligação de antígenos idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada qual comum único sítio de ligação de antígenos, e um fragmento "Fc" residual, cujonome reflete a sua capacidade de rápida cristalização. O tratamento compepsina gera um fragmento F(ab')2 que contém dois sítios de ligação deantígenos e ainda é capaz de reticular antígeno.
"Fv" é o fragmento mínimo de anticorpo que contém um sítio deligação e de reconhecimento de antígeno. Em uma realização, uma espécie deFv de duas cadeias consiste de um dímero de um domínio variável de cadeialeve e um de cadeia pesada unidas, através de uma ligação não-covalente. Naespécie Fv de cadeia simples (scFv), um domínio variável de cadeia leve e umdomínio variável de cadeia pesada podem ser covalentemente ligados atravésde um peptídeo Iigante flexível, de forma que as cadeias pesada e leve podemse associar em uma estrutura "dimérica" análoga à estrutura em uma espéciede Fv de duas cadeias. É nesta configuração que as três CDRs de cadadomínio variável interage para definir um sítio de ligação ao antígeno nasuperfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis CDRs conferemespecificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. Entretanto, mesmo umdomínio variável simples (ou metade de um Fv que compreende apenas trêsCDRs específicos para um antígeno), possui a capacidade de reconhecer eligar ao antígeno, por meio de uma afinidade mais baixa do que o sítio deligação inteiro.
O fragmento Fab também contém o domínio constante de cadeialeve e o primeiro domínio constante (CH1) de cadeia pesada. Os fragmentosFab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no carbóxi-terminal do domínio CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas apartir da região de articulação do anticorpo. Fab'-SH é a designação dapresente invenção para Fab' no qual o(s) resíduo(s) de cisteína do domínioconstante sustenta(m) um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpos F(ab')2originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab1 que possuempontes de cisteínas entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentosde anticorpos são também conhecidos.
Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou"scFv"compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, no qual estesdomínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Geralmente, opolipeptídeo scFv compreende adicionalmente um polipeptídeo Iigante entre osdomínios VH e VL1 que permitem que o scFv forme a estrutura desejada paraligação do antígeno. Para uma revisão de scFv vide Pluckthun, em ThePharmacolociv of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Eds Rosenburg e Moore.,Springer-Verlag, Nova Iorque, págs. 269-315 (1994).
O termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos deanticorpos com dois sítios de ligação de antígeno, que compreendem umdomínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável decadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). Por meio do usode um Iigante que é muito curto para permitir o pareamento entre os doisdomínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com osdomínios complementares de outra cadeia, e criar dois sítios de ligação deantígeno. Diacorpos são descritos mais detalhadamente em, por exemplo,Patentes EP 404.097; WO 93/1161; e Hollinger et ai, Proc. Nati Acad. Sei.USA 90: 6444-6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos também são descritos emHudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134.
O termo "anticorpo monoclonal", da forma utilizada no presente,refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorposhomogêneos substancialmente homólogos, tal como, os anticorpos individuaisque compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutaçõesde ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores.Desta forma, o indicativo "monoclonal" refere-se o caráter do anticorpo comonão sendo uma mistura de anticorpos distintos. Em algumas realizações, esteanticorpo monoclonal tipicamente inclui um anticorpo que compreende umaseqüência de polipeptídeo que liga a um alvo, no qual a seqüência dopolipeptídeo de ligação alvo foi obtida por um processo que inclui a seleção deuma única seqüência peptídica de ligação ao alvo a partir de uma série deseqüências de polipeptídeos. Por exemplo, o processo de seleção pode ser aseleção de um único clone de uma série de clones, tal como um pool de clonesde hibridoma, clones de fago ou clones de DNA recombinante. Deve-secompreender que a seqüência de ligação alvo selecionada pode seradicionalmente alterada, por exemplo, para aprimorar a afinidade ao alvo, parahumanizar a seqüência de ligação alvo, para aprimorar sua produção nacultura celular, para reduzir sua imunogenicidade in vivo, para criar umanticorpo multiespecífico, etc., e que um anticorpo que compreende aseqüência de ligação alvo alterada é também um anticorpo monoclonal dainvenção. Em contraste a preparação de um anticorpo policlonal que incluitipicamente diferentes anticorpos, direcionados a diferentes determinantes(epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpomonoclonal é direcionado a um único determinante antigênico. Além de suaespecificidade, a preparação de anticorpo monoclonal é vantajosa pelo fatodestas preparações serem tipicamente livre de contaminação por outrasimunoglobulinas.
O adjetivo "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendoobtido de uma população substancialmente homóloga de anticorpos, e nãodeve ser compreendido como uma necessidade de produção do anticorpo porqualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a seremutilizados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por umasérie de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (Kohler et ai,Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratorv Manual, (ColdSpring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et ai, em:Monoclonal Antibodies e T-Cell hvbridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)),métodos de DNA recombinante (vide, U.S. 4.816.567), tecnologias de exibiçãopor fago (vide Clackson et ai, Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et ai, J.Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et ai, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310(2004); Lee et ai, J. Moi Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl.Acad. Sei. USA 101(34): 12467-12472 (2004); e Lee et ai, J. ImmunoiMethods 284(1-2): 119-132(2004)), e tecnologias para a produção deanticorpos humanos ou similares a humanos, em animais que possuem partesde loci ou genes da imunoglobulina humana, codificando seqüências deimunoglobulina humana (vide, W098/24893; W096/34096; W096/33735;W091/10741; Jakobovits et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA 90: 2551 (1993);Jakobovits et ai, Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year inImmunol. 7:33 (1993); Patentes US 5.545.807; US 5.545.806; US 5.569.825;US 5.625.126; US 5.633.425; US 5.661.016; Marks et al., Bio.Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et ai, Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature368: 812-813 (1994); Fishwild et ai, Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996);Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) e Lonberg e Huszar, lntern. Rev.Immunol. 13: 65-93 (1995).
Os anticorpos monoclonais da presente invenção incluemespecificamente anticorpos "quiméricos" nos quais uma porção da cadeia levee/ou pesada é idêntica ou homóloga a seqüências correspondentes emanticorpos derivados de uma espécie especifica, ou pertencendo a uma classeou subclasse de anticorpo específica, enquanto o restante da cadeia é idênticoou homólogo a seqüências correspondentes em anticorpos derivados de outrasespécies, ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem comofragmentos destes anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológicadesejada (Patente US 4.816.567; e Morrison et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA81:6851-6855(1984)).
Formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (tal como,murino) são anticorpos quiméricos que contém uma seqüência mínimaderivada de uma imunoglobulina não humana. Em uma realização, umanticorpo humanizado é uma imunoglobulina humana (anticorpo receptor) emque resíduos de uma região hipervariável do receptor foram substituídos porresíduos de uma região hipervariável de uma espécie não-humana (anticorpodoador) como, por exemplo, rato, coelho ou primata não-humano, quepossuem a especificidade, afinidade e/ou capacidade desejadas. Em algumasrealizações, resíduos de região de estrutura (FR) da imunoglobulina humanasão substituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Adicionalmente,anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não sãoencontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificaçõessão produzidas para refinar a habilidade do anticorpo. Em geral, o anticorpohumanizado compreenderá substancialmente todos os dois ou pelo menos um,mas tipicamente dois, domínios variáveis, no qual todas ou substancialmentetodas das alças (Ioops) hipervariáveis correspondem aos de umaimunoglobulina não-humana e todos ou substancialmente todos FRs são deuma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado poderátambém compreender, opcionalmente, pelo menos uma porção de uma regiãoconstante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulinahumana. Para maiores detalhes, vide Jones et ai, Nature 321:522-525 (1986);Riechmann et ai, Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Bioi2:593-596 (1992). Vide também os seguintes artigos de revisão e referênciascitadas nos mesmos: Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol.1:105-115 (1998); Harris1 Biochem. Soe. Transactions 23:1035-1038 (1995);Hurle e Gross1 Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).
Um "anticorpo humano" é um anticorpo que possui umaseqüência de aminoácido que corresponde a seqüência de um anticorpoproduzido por um humano e/ou foi produzido pelo uso de qualquer técnica paraa produção de anticorpos humanos descrita no presente. Esta definição de umanticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado quecompreende resíduos de ligação de antígeno não-humanos.
O termo "região hipervariável", "HVR" ou "HV", quando utilizadono presente, refere-se às regiões de um domínio variável de anticorpo que sãohipervariáveis na seqüência e/ou forma estruturalmente definidas por alças(loops). Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis;três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). Em anticorpos nativos, H3 eL3 exibem a maior parte da diversidade das seis regiões hipervariáveis, eacredita-se que H3 em particular desempenha um papel único que confere aespecificidade mais sensível ao anticorpo. Xu et al. (2000) Immunity 13:37-45;Johnson e Wu (2003) em Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo1 ed.,Human Press, Totowa, NJ). De fato, anticorpos camelídeos de ocorrêncianatural constituído por uma única cadeia pesada são funcionais e estáveis naausência da cadeia leve. Hamers-Casterman et al. (1993) Nature 363:446-448;Sherifefa/. (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736.
Um número de delimitações da região hipervariável é utilizado e éenglobada pela presente invenção. As regiões determinantes decomplementaridade Kabat (CDRs) são baseadas na variabilidade da seqüênciae são as mais comumente utilizadas (Kabat et al., Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda1 MD. (1991)). Chothia refere-se ao lugar dos locais de alças(Ioops) estruturais (Chothia e Lesk J. Moi Biol. 196:901-917 (1987)). Asregiões hipervariáveis AbM representam um acordo entre as CDRs de Kabat eas alças (Ioops) estruturais de Chothia1 e são utilizadas pelo software demodulação de anticorpo AbM de Oxford Molecular (Oxford MoIecuIaijS AbMantibody modeling software). As regiões hipervariáveis de "contato" sãobaseadas na análise das estruturas de cristais complexas disponíveis. Osresíduos de cada uma das regiões hipervariáveis estão particularmentedescritas a baixo.
Alça Kabat AbM Chothia Contato
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
Η1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B(Numeração Kabat)
Η1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35(Numeração Chothia)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
As regiões hipervariáveis podem compreender "regiõeshipervariáveis estendidas" como segue: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56(L2) e 89-97 ou 89-96 (L3) no VL e 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102,94-102, ou 95-102 (H3) no VH. Os resíduos de domínio variáveis sãonumerados de acordo com Kabat et ai, acima, para cada uma destasdefinições.
Resíduos "de estrutura" ou "FR" são os resíduos do domíniovariável diferentes dos resíduos de região hipervariável definidos no presente.
O termo "numeração do resíduo de domínio variável como emKabat" ou "numeração da posição de aminoácido como em Kabat," e suasvariações, refere-se ao sistema de numeração utilizado para domíniosvariáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve dacompilação dos anticorpos em Kabat et al., Sepuences of Proteins ofImmunolopical Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda1 MD (1991). Utilizando este sistema de numeração, aseqüência de aminoácido linear atual pode conter menos aminoácidos, ouaminoácidos adicionais que correspondem a um encurtamento de, ou inserçãoem, um FR ou HVR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável decadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a, deacordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (tal comoresíduos 82a, 82b, e 82c, etc. de acordo com Kabat) após o resíduo 82 FR decadeia pesada. A numeração Kabat de resíduos pode ser determinada paraum dado anticorpo através do alinhamento nas regiões de homologia daseqüência do anticorpo com uma seqüência numerada "padrão" de Kabat.
Um anticorpo "maturado por afinidade" é um anticorpo que possuiuma ou mais alterações em um ou mais HVRs do mesmo que resulta emmelhora na afinidade de ligação do anticorpo ao antígeno, comparado aoanticorpo parental que não possui dita(s) alteração(ões). Em u exemplo derealização os anticorpos maturados por afinidades preferidos irão possuirafinidades nanomolares ou ainda picomolares ao antígeno alvo. Anticorposmaturados por afinidade são produzidos por procedimentos conhecidos. Vide,por exemplo, Marks, et al., Biotechnology 10:779-783 (1992) que descrevematuração por afinidade através da mistura (shuffling) do domínio VL e VH.Mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos de estrutura é descrita, porexemplo, em: Barbas, et ai, Proc. Nat. Acad. Sei, USA 91:3809-3813 (1994);Shier et ai, Gene 169:147-155 (1995); Yelton et ai, J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et ai, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins etai, J. Moi Biol. 226:889-896 (1992).
Um anticorpo de "bloqueio" ou um anticorpo "antagonista" éaquele que inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno ao qual se liga.Certos anticorpos de bloqueio preferidos ou anticorpos antagonistas inibem deforma substancial ou completa a atividade biológica do antígeno.
Um "anticorpo agonista", como utilizado no presente, é umanticorpo que mimetiza pelo menos uma das atividades funcionais de umpolipeptídeo de interesse.
A "função efetora" de um anticorpo refere-se a atividade biológicaatribuída a região Fc (uma seqüência nativa da região Fc ou uma seqüência deaminoácidos variantes da região Fe) de um anticorpo, e pode variar de acordocom o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras do anticorpo incluema ligação ao C1q e citotoxicidade dependente de complemento; ligação aoreceptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo(ADCC); fagocitose; regulação negativa dos receptores de superfície celular(por exemplo, receptor de células B) e ativação da célula B.
Os termos "receptor Fc" ou "FcR" descrevem um receptor que seliga a uma região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é uma seqüência nativade FcR humano. Adicionalmente, um FcR preferido é aquele que se liga a umanticorpo IgG (receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII,e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e formas submetidas a splicing alternativodestes receptores. Receptores FeyRII incluem FeyRIIA (uma "receptor deativação") e FeyRIIB (um "receptor inibidor"), que têm seqüências deaminoácidos similares que diferem principalmente nos domínioscitoplasmáticos. O receptor de ativação FeyRIIA possuí um motivo de ativaçãocom base em imunoreceptor tirosina (ITAM), no seu domínio citoplasmático. Oreceptor de inibição FcyRIIB possuí um motivo de inibição com base emimunoreceptor tirosina (ITIM) no seu domínio citoplasmático. (vide revisão emΜ. Daèron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs são revisadas emRavetch e Kinet1 Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capei et ai,Immunomethods 4:25-34 (1994); e deHaas et ai, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995). Outras FCRs1 incluindo aquelas a serem identificadas no futuro, sãoenglobadas pelo termo "FcR" na presente invenção.
O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn1 que éresponsável pela transferência de IgGs maternos ao feto (Vide Guyer etai, 1976, J. Immunol. 117:587 e Kim et ai, 1994, J. Immunol. 24:249) e regulahomeostase de imunoglobulinas. Métodos para mensurar a ligação ao FcRnsão conhecidos (vide, por exemplo, Ghetie 1997, Hinton 2004). A ligação aoFcRn humano in vivo e a meia vida da afinidade de ligação ao FcRn humanono soro podem ser analisadas, por exemplo, em camundongos transgênicos outransfectadas em linhagens de células humanas expressando o FcRn humano,ou administrado em primatas com polipeptídeos variantes de Fe.
O documento WO 00/42072 (Presta) descreve variantes deanticorpo com ligação ao FcRs melhoradas ou diminuídas. O conteúdo destapublicação de Patente é especialmente incorporada ao presente pelareferência. Vide, também, Shields et al. J. Bioi Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001).
"Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um oumais FcRs e realizam funções efetoras. Em alguns exemplos de realização, ascélulas expressam pelo menos o FcyRIII e realizam função efetora de ADCC.Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem célulasmononucleares do sangue periférico (PBMC), células natural killer (NK),monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos. As células efetoras podem serisoladas de uma fonte nativa, por exemplo, a partir do sangue.
"Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo" ou"ADCC" referem-se a uma forma de citotoxicidade no qual a Ig secretada seliga aos receptores Fc (FcRs) presentes em determinadas células citotóxicas(por exemplo, células natural killer (NK), neutrófiios e macrófagos) permitindoque estas células efetoras citotóxica se liguem especificamente a um antígenosobre a célula-alvo e, posteriormente, destroem a célula-alvo com citotoxinas.
As principais células mediadoras da ADCC, as células NK1 expressam apenasFcyRIII1 enquanto monócitos expressam FcyRI1 FcyRII e FcyRIII. A expressãoFcR em células hematopoiéticas é resumida na tabela 3, página 464 deRavetch et ai., Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Para acessar a atividadeADCC de uma molécula de interesse, um teste ADCC in vitro tal como odescrito nas Patentes US 5.500.362, US 5.821.337 ou o pedido de patente US6.737.056 podem ser realizadas. As células efetoras úteis para tais testesincluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células naturalMer(NK). Alternativamente ou adicionalmente, a atividade ADCC da moléculade interesse pode ser acessada in vivo, por exemplo, em um modelo animal talcomo descrito em Clynes et ai., PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
"Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-sea lise de uma células alvo na presença do complemento. A ativação da viaclássico do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente dosistema de complemento (C1q) a um anticorpo (da subclasse apropriada) quese liga com um antígeno cognato. Para determinar a ativação do complemento,pode ser realizado um teste de CDC, conforme descrito, por exemplo, emGazzano-Santoro et ai., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).
Variantes de polipeptídeos com seqüências de aminoácidos daregião Fc alteradas e capacidade de ligação de C1q aumentada ou reduzidasão descritas na patente US 6.194.551 B1 e no documento WO 99/51642. Oconteúdo destas publicações é incorporado especificamente ao presente pelareferência. Vide também Idusogie et ai, J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
O termo "polipeptídeo compreendendo a região Fc" refere-se aum polipeptídeo, tal como um anticorpo ou imunoadesina, que inclui umaregião Fe. A Iisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema denumeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante adepuração do polipeptídeo ou por engenharia recombinante de ácidosnucléicos na codificação do polipeptídeo. Assim, uma composição que incluaum polipeptídeo com uma região Fc de acordo com a presente invenção podecompreender polipeptídeos com K447, com todos os K447 removidos, ou umamistura de polipeptídeos com e sem os resíduos K447.
Uma "região estrutural receptora" para os fins do presente é umaregião estrutural composta por uma seqüência de aminoácidos de uma regiãoestrutural VL ou VH derivadas de uma região estrutural de imunoglobulinahumana, ou a partir de uma região estrutural de consenso humano. Umaregião estrutural receptora humana "derivada de" uma região estrutural deimunoglobulina humana ou região estrutural de consenso humano pode incluira mesma seqüência de aminoácidos, ou podem conter uma modificação naseqüência de aminoácido pré-existente. Em alguns exemplos de realização, onúmero de mudanças de aminoácidos pré-existentes é de 10 ou menos, 9 oumenos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 oumenos ou 2 ou menos. Quando modificações de aminoácidos pré-existentesestão presentes em um VH, de preferencialmente essas mudanças ocorremem apenas três, duas ou uma das posições 71 Η, 73H e 78H; por exemplo, osresíduos de aminoácido dessas posições podem ser 71 A, 73T e/ou 78A. Emum exemplo de realização, a região estrutural aceptora humana VL é idêntica aseqüência da região estrutural VL da imunoglobulina humana ou regiãoestrutural de consenso humano.
Uma "região estrutural de consenso humano" é uma regiãoestrutural que representa os resíduos de aminoácidos mais comumenteencontrados em uma seleção das seqüências de região estrutural daimunoglobulina humana VL ou VH. Geralmente, a seleção de seqüências deimunoglobulina humana VL ou VH é de um subgrupo de seqüências dedomínio variável. Geralmente, o subgrupo de seqüências é um subgrupo comoo de Kabat et al, Seguences of Proteins of Immunolopical Interest, 5a Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Emum exemplo de realização, para o VL1 o subgrupo I kappa é similar ao deKabat et al, Supra. Em um exemplo de realização, para o VH, o subgrupo Illkappa é similar ao de Kabat et al Supra.
Uma "região estrutural de consenso VH subgrupo IM" compreendea seqüência consenso obtida a partir de seqüências de aminoácidos nosubgrupo Ill variável pesado de Kabat et al, Supra. Em uma realização, aseqüência de aminoácido da região estrutural de consenso VH subgrupo Illinclui pelo menos uma parte ou a totalidade de cada uma das seguintesseqüências: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID No:50)-H1-WVRQAPGKGLEVW (SEQ ID No:51)-H2-RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID No: 59)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:35).
Uma "região estrutural de consenso VL subgrupo I" compreendea seqüência consenso obtida a partir de seqüências de aminoácidos nosubgrupo I variável leve de Kabat et al, Supra. Em um exemplo de realização,a seqüência de aminoácido da região estrutural de consenso VL subgrupo Iinclui pelo menos uma parte ou a totalidade de cada uma das seguintesseqüências: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID No: 60)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID No: 61)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID No: 62)-L3-FGQGTKVEIK (SEQ ID No: 63).
"Afinidade de ligação" refere-se, no geral, à força da soma total deinterações não-covalentes entre um sítio de ligação isolado de uma molécula(como, por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (como, porexemplo, um antígeno). A menos que indicado de outro modo, a "afinidade deligação", da forma como é utilizada no presente refere-se a afinidade deligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre os membros do parIigante (por exemplo, anticorpo e antígeno) A afinidade da molécula X para seuparceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação(Kd). A afinidade pode ser medida através de métodos conhecidos no estadoda técnica, incluindo os métodos descritos na presente invenção. Anticorpos debaixa afinidade ligam de forma fraca ao antígeno e tendem a se dissociarrapidamente, enquanto os anticorpos de alta afinidade ligam o antígeno deforma mais forte e permanecem ligados por mais tempo. Uma variedade demétodos para mensurar a afinidade de ligação é conhecida no estado datécnica, no qual qualquer um deles pode ser utilizado para as propostas dapresente invenção. Exemplos de realização especificamente ilustrativos sãodescritos a seguir.
Em um exemplo de realização, o "Kd" ou " valor de Kd " deacordo com a presente invenção é medida por um teste de ligação comantígeno radio-marcado (RIA) realizado com a versão Fab de um anticorpo deinteresse e os seus antígenos como descrito pelo seguinte ensaio. A soluçãoda afinidade de ligação dos Fabs pelos antígenos é mensurada pelo equilíbriodo Fab com uma mínima concentração de antígeno marcado com I125, napresença de uma titulação seriada de antígeno não marcado e, em seguida,capturando os antígenos ligados com uma placa com anticorpos anti-Fab(Chen, et ai, (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Para estabelecer as condiçõespara o ensaio, placas de microtitulação (Dynex) são revestidas por um períodode uma noite com 5 pg/ml de anticorpo anti-Fab (Cappel Labs), em 50 mM decarbonato de sódio (pH 9.6) e, subseqüente, bloqueio com albumina bovina 2%(p/v) em PBS por duas a cinco horas à temperatura ambiente (cerca de 23 °C).
Em uma placa não-adsorvente (Nunc # 269620), antígenos 100 pM ou 26 pM[I125] são misturadas em uma série de diluições Fab de interesse (por exemplo,consistente com a avaliação de anticorpos anti-VEGF, Fab-12, em Presta etal„ (1997) Câncer Res. 57:4593-4599). A Fab de interesse é, em seguida,incubada overnight, no entanto, a incubação pode continuar por um período mais longo (por exemplo, 65 horas) para se assegurar de que o equilíbrio éatingido. Posteriormente, as misturas são transferidas para a incubação naplaca de captura à temperatura ambiente (por exemplo, por uma hora). Asolução é então retirada e a placa é lavada oito vezes com 0,1% de Tween-20,em PBS. Quando as placas estão secas, 150 μΙ/poço de cintilante (MicroScint- 20; Packard) é adicionado, e as placas são contados em um contadorTopcount gamma (Packard) durante dez minutos. As concentrações de cadaFab que tiverem resultados igual ou inferior a 20% de ligação máxima sãoescolhidos para serem utilizados em ensaios de ligação competitiva.
De acordo com outro exemplo de realização ou Kd ou valor de Kd é mensurado pelo ensaio de ressonância plasmônica de superfície utilizando oBIAcore™-2000 ou um BIAcore™-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 0Ccom antígeno CM5 em chips a ~ 10 Unidades de Resposta (RU).Resumidamente, chips de biosensores de dextrano carboximetilados (CM5,BIAcore Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisucinimida (NHS) de acordo com as instruçõesdo fornecedor. O antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8,para 5 pg/ml (~ 0,2 μΜ) antes de injetar a uma velocidade de fluxo de 5μl/minuto para atingir aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) deproteína acoplada. Após a injeção do antígeno, etanolamina 1M é adicionada para bloquear grupos que não reagiram. Para a mediação cinética, diluiçõesseriadas em duplicatas de Fab (0,78 nM e 500 nM) são injetados em PBS com0,05% de Tween-20 (PBST) a 25 0C em uma taxa de fluxo de cerca de 25μΙ/min. A velocidade de associação (kon) e a velocidade de dissociação (k0ff)são calculadas utilizando um modelo de ligação simples um-para-um deLangmuir (BIAcore Evaluation Software version 3.2) pela montagem simultâneade sensogramas de associação e dissociação. A constante de dissociação emequilíbrio (Kd) é calculado como a relação k0ff/k0n· Vide, por exemplo, Chen, Y.,et al, (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Se a medida for superior a 106 M"1 S"1pelo ensaio de ressonância plasmônica acima, e depois, a medida pode serdeterminada por uma técnica de inibição (quenching) de fluorescência quemede o aumento ou a diminuição das emissões de intensidade defluorescência (excitação= 295 nm; Emissão = 340 nm, banda de passagem=16nm) a 25 0C de 20 nM de um anticorpo anti-antígeno (Na Forma Fab) em PBS1pH 7,2, na presença de concentrações crescentes do antígeno mensurado emespectrômetro, tal como um espectrofotômetro equipado com válvula stop-flow(Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-Aminco série 8000(ThermoSpectronic), com agitador de cuveta.
A "velocidade de entrada" ou "velocidade de associação" ou "kon",de acordo a presente invenção também pode ser determinada utilizando omesmo ensaio de ressonância plasmônica descrito acima usando umBIAcore™-2000 ou BIAcore™-3000 (BIAcore Inc., Piscataway1 NJ).
Um "distúrbio" é qualquer condição que poderá se beneficiadacom o tratamento com a substância/molécula ou método da presente invenção.Isto inclui doenças agudas e crônicas incluindo aquelas condições patológicasque predispõem o mamífero para o distúrbio em questão. Exemplos nãoIimitantes distúrbios que podem ser tratados no presente incluem condiçõescancerosa tais como tumores, por exemplo, carcinomas (tumores epiteliais) eblastomas (tumores derivados de tecido embriônico), e em algumasrealizações, câncer de ovário, câncer uterino (incluindo câncer de endométrio),tumores de cérebro (por exemplo, astrocitomas e gliomas) e câncer de rim,incluindo nefroblastomas (por exemplo, tumor de Wilm).A expressão "distúrbio da proliferação celular" e "desordemproliferativa" referem-se a distúrbios que estão associados com algum grau deproliferação de células anormais. Em um exemplo de realização, a distúrbio daproliferação celular é o câncer.
"Tumor", como é utilizado no presente, refere-se ao crescimento eproliferação de todas as células neoplásicas, quer sejam malignas oubenignas, e todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos. Ostermos "câncer", "cancerosos", "distúrbio da proliferação celular", "desordemproliferativa" e "tumor" não são mutuamente exclusivos da forma como referidono presente.
Os termos "câncer" e "canceroso" refere-se a ou descreve acondição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelocrescimento celular não regulado. Exemplos de câncer incluem, mas semlimitar-se a, carcinoma, Iinfoma (por exemplo, Iinfoma de Hodgkin e Iinfomanão- Hodgkin), blastoma, sarcoma, e leucemia. Exemplos mais particularesdestes cânceres incluem câncer de células escamosas, câncer do pulmão decélulas pequenas, câncer do pulmão de células rião-pequenas,adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, câncer deperitônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer pancreático,glioma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga,hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon, câncer colorretal, carcinomaendometrial ou uterino, carcinoma de glândulas salivares, câncer dos rins,câncer do fígado, câncer de próstata, câncer de vulva, câncer da tireóide,carcinoma hepático, leucemia e outras desordens linfoproliferativas, e váriostipos câncer de cabeça e pescoço.
Como usado no presente, "tratamento" refere-se à intervençãoclínica em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo ou da célulaque estão sendo tratados, e pode ser executado para a profilaxia ou durante apatologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem impedir aocorrência ou o retorno da doença, alívio dos sintomas, diminuição de qualquerconseqüência patológica direta ou indireta da doença, prevenindo oudiminuindo a metástase, diminuindo a velocidade de progressão da doença,melhorando o estado da doença ou melhorando o prognóstico. Em algumasrealizações, os anticorpos da invenção são usados para retardar odesenvolvimento de uma doença ou distúrbio.
Um "indivíduo" é um vertebrado. Em certos exemplos derealização, vertebrado é um mamífero. Mamíferos incluem, mas sem limitar-sea, animais (tais como vacas), animais esportivos, animais de estimação (taiscomo gatos, cães e cavalos), primatas, camundongos e ratos. Em certosexemplos de realização, os vertebrados são seres humanos.
Uma "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, emdosagens e por os períodos de tempo necessários para conseguir o resultadoterapêutico ou profilático desejado.
Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma substânciae/ou molécula da invenção, que pode variar de acordo com fatores tais como,o estado, idade, sexo e o peso do individual, e habilidade da substância e/oumolécula, agonista ou antagonista de eliciar uma resposta desejada noindivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma em quetodos os efeitos tóxicos ou prejudiciais da substância e/ou molécula, agonistaou antagonista são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.
Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz,em dosagens e por os períodos de tempo necessários, para se conseguir oresultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, desdeque a dose profilática é usada nos pacientes antes da doença ou em umestágio mais precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz serámenor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.A expressão "agente citotóxico", da forma utilizada no presente,indica uma substância que inibe ou evita o funcionamento das células e/oucausa destruição das células. A expressão destina-se a incluir isótoposradioativos (tais como At211, I131f I125, Y901 Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 eisótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos, por exemplo,metotrexato, adriamicina, alcalóides vinca (vincristina, vinblastina, etoposida),doxorubicina, melfalan, mitomicina C1 clorambucil, daunorubicina ou outrosagentes intercalantes, enzimas e fragmentos destes como, por exemplo,enzimas nucleotídicas, antibióticos e toxinas como, por exemplo, pequenasmoléculas de toxina ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana,fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos ou variantes destes, e váriosagentes antineoplasicos ou anti-tumor descritos abaixo. Outros agentescitotóxicos estão descritos abaixo. Um agente tumoricida causa destruição dascélulas tumorais.
A "toxina" é qualquer substância capaz de ter um efeito negativosobre o crescimento ou a proliferação de uma célula.
Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil notratamento do câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentesalquilantes, tais como tiotepa e CYTOXAN® ciclosfosfamida; alquil sulfonatostais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas tais como benzodopa,carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindoaltretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenetiofosforamida etrimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona);delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol;colchicinas; ácido betulínico; camptotecina (incluindo o análogo sintéticotopotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®),acetilcamptotecina, escopolectina, e 9-aminocamptotecina); briostatina;calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesin, carzelesine bizelesin); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposídeo; criptoficinas(particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina(incluindo os análogos sintéticos KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina;pancratistatina; sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio tais comoclorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida,mecloretamina, hidrocloreto óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina,fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrouréias taiscomo carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, eranimnustina; antibióticos tais como antibióticos de enedina (tais como,caliceamicina, especialmente caliceamicina gamall e caliceamicina ômega Il(vide, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluindodinemicina A; esperamicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina ecromóforos antibióticos de enedina cromoproteína relacionados),aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas,cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas,dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina,ADRIAMYCIN® doxorubicina (incluindo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina e deoxidoxorubicina), epirubicina,esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C,ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina,puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina,tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos tais comometotrexato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico, tais comdenopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de Purina, taiscomo fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos depirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina,dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tais comocalusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano,testolactona; anti- adrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano;ácido fólico reabastecedor, tais como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamidaglicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracila; amsacrina; bestrabucila;bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina;acetato de eliptínio; epotilona; etoglucídeo; nitrato de gálio; hidroxiuréia;lentinan; lonidainina; maitansinóides tais como maitansina e ansamitocinas;mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet;pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complexopolisacarídico PSK® (JHS Natural Products, Eugene1 OR); razoxano; rizoxina;sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A,roridina A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®);dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina;arabinosídeo ("Ara-C"); tiotepa; taxóides, tais como, TAXOL® paclitaxel(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANETM livre decromóforo, formulações de nanopartículas de paclitaxel produzidas comalbumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), eTAXOTERE® doxetaxel (Rhône-Poulenc Rorer1 Antony, France); cloranbucila;gemcitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato;análogos de platino, tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina(VELBAN®); platínio; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina(ONCOVIN®); oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®);novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor detopoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides tais comoácido retinóico; capecitabina (XELODA®); sais farmaceuticamente aceitáveis,ácidos ou derivados destes compostos acima, bem como as combinações dedois ou mais destes, tal como CHOP, uma abreviação para uma terapiacombinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, e prednisolona, eFOLFOX, uma abreviação para um tratamento com oxaliplatina(ELOXATINTM) combinada com 5-FU e leucovovina.
Também incluídos nesta definição estão agentes anti-hormonaisque atuam para regular, reduzir, bloquear, ou inibir os efeitos dos hormôniosque podem promover o crescimento do câncer, e são freqüentementeapresentados na forma de tratamento sistêmico ou do corpo inteiro. Elespodem ser os próprios hormônios. Exemplos incluem anti-estrogênios emoduladores de receptor de estrogênio seletivos (SERMs), incluindo, porexemplo, tamoxifen (incluindo NOLVADEX® tamoxifen), EVISTA® raloxifeno,droloxifeno, 4-hidroxitamoxifen, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, eFARESTON® toremifeno; anti-progesteronas; reguladores negativos dereceptores de estrogênio (ERDs); agentes que funcionam para suprimir ouparar os ovários, por exemplo, agonistas de hormônios de liberação dehormônios Ieutinizante (LHRH) tais como LUPRON® e ELIGARD® acetato deleuprolida, acetato de goserelina, acetato de buserelina e tripterelina; outrosanti-andrógenos, tais como flutamida, nilutamida e bicalutamida; e inibidoresde aromatase, que inibem as enzimas aromatase, que regulam a produção deestrogênio nas glândulas adrenais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazol,aminoglutetimida, MEGASE® acetato de megestrol, AROMAS IN®exemestano, formestania, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol, eARIMIDEX® anastrozol. Adicionalmente, esta definição de agentesquimioterápicos inclui bisfosfonatos, tais como clodronato (por exemplo,BONEFOS® ou OSTAC®), DIDROCAL® etidronato, NE-58095, ZOMETA®ácido zoledrônico / zoledronato, FOSAMAX® alendronato, AREDIA®pamidronato, SKELID® tiludronato, ou ACTONEL® risedronato; bem comotroxacitabina (análogo de 1,3-dioxolano nucleosídeo); oligonucleotídeosantisense, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes nas viasde sinalização implicam na proliferação celular aberrante, tais como, porexemplo, alfa-PKC, Rafl H-Ras1 e receptores do fator de crescimentoepidérmico (EGF-R); vacinas, tais como vacina THERATOPE® e vacinas deterapia gênica, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN®, evacina VAXID®; LURTOTECAN® inibidor de topoisomerase I; ABARELIX®rmRH; ditosilato de Iapatinib (inibidor de molécula pequena de tirosina quinasedupla ErbB-2 e EGFR também conhecidos como GW572016); e sais, ácidosou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos compostosdescritos acima.
Um "agente inibidor de crescimento" quando utilizado no presenterefere-se a um composto ou a uma composição que iniba o crescimento deuma célula (tal como uma célula expressando TAT226) in vitro e/ou in vivo.Assim, o agente inibidor de crescimento pode ser aquele que reduzsignificativamente a porcentagem de células (tal como uma célula expressandoTAT226) na fase S. Os exemplos de agentes inibidores do crescimentoincluem os agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em uma outrafase com exceção da fase S), como os agentes que induzem à parada do ciclocelular em G1 parada da fase M. Os bloqueadores clássicos da fase M incluemos vincas (vincristina e vimblastina), taxanos e inibidores da topoisomerase II1tais como, a doxorubicina, a epirubicina, a daunorubicina, a etoposida e ableomicina. Estes agentes que param o ciclo celular em G1 também sedifundem para a suspensão da fase S, por exemplo, agentes alquilantes doDNA como o tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina,metotrexato, 5-fluorouracil, e ara-C. Informações adicionais podem serencontradas em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e Israel, eds.,Capítulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplasticdrugs" por Murakami et ai (WB Saunders: Filadélfia, 1995), especialmente napg. 13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são os dois fármacos anti-neoplásicos derivados da árvore teixo. Docetaxel (TAXOTERE ®, Rhone-Poulenc Rorer), obtidas a partir de teixos europeus, é um análogo semi-sintético do paclitaxel (Taxol Bristol-Myers Squibb). Docetaxel e paclitaxelpromover a montagem dos microtúbulos dos dímeros de tubulina e estabilizaos microtúbulos, impedindo despolimerização, o que resulta na inibição damitose nas células.
O termo "metabolito intracelular" refere-se a um compostoresultante de um processo metabólico ou reação dentro de uma célula em umconjugado droga- anticorpo (ADC). O processo metabólico ou de reação podeser um processo enzimático, tais como a clivagem proteolítica de um peptídeoligante do ADC, ou a hidrólise de um grupo funcional, como uma hidrazona,éster ou amida. Metabolitos intracelulares incluem, mas não estão limitados a,anticorpos e drogas livres que tenham sido submetidos a clivagem intracelularapós a entrada, difusão, absorção e transporte em uma célula.
Os termos "clivada intracelularmente" e "clivagem intracelular"referem-se a um processo metabólico ou reação dentro de uma célula em umconjugado droga-anticorpo (ADC) segundo o qual a ligação covalente, ou seja,ligante, entre a molécula de droga (D) e o anticorpo (Ab ) é quebrada,resultando na droga livre dissociada do anticorpo dentro da célula. Asmoléculas clivadas do ADC são deste modo, denominadas, metabólitosintracelulares.
O termo "biodisponibilidade" refere-se à disponibilidade sistêmica(ou seja, em níveis sangüíneos / plasmático) de uma dada quantidade demedicamento administrado a um paciente. A biodisponibilidade absoluta é umtermo que indica tanto a medição de tempo (taxa) e quantidade total (nível) dedroga que atinge a circulação geral a partir de uma dosagem administrada.
O termo "atividade citotóxica" refere-se a destruição e morte deuma célula, efeito inibitório de crescimento ou citostáticos do conjugado droga-anticorpo ou metabolito intracelular do conjugado droga- anticorpo. A atividadecitotóxica pode ser expressa como valor IC50, que é a concentração (molar oumassa) por unidade de volume no qual a metade das células sobreviveria.
"Alquil" são hidrocarbonetos CrCi8contendo átomos de carbononormais, secundários, terciários ou cíclicos. Exemplos são (Me, -CH3), etil (Et,-CH2CH3), 1-propil (n-Pr, n-propil, -CH2CH2CH3), 2-propil (i-Pr, i-propil, -CH(CH3)2), 1-butil (n-Bu, n-butil, -CH2CH2CH2CH3), 2-metil-1-propil (i-Bu, i-butil, -CH2CH(CH3)2), 2-butil (s-Bu, s-butil, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propil (t-Bu, t-butil, -C(CH3)3), 1-pentil (n-pentil, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentil (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentil (-CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butil (- C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butil (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metil-1-butil (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil-1-butil (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-hexil (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-hexil (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-hexil (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentil (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2-pentil (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-metil-2-pentil (- CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentil (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentil(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetil-2-butil (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-
2-butil (-CH(CH3)C(CH3)3.
O termo "Ci-C8 alquila", como utilizado no presente refere-se auma cadeia reta ou ramificada, contendo hidrocarbonetos saturados ou insaturados, de 1 a 8 átomos de carbono. Grupos representativos de "CrC8alquila" incluem, mas não se limitam a, -metil, -etil, -n-propil, -n-butil, -n-pentil, -n-hexil, -n-heptil, -n-octil, -n-nonil e -n-decil; enquanto alquilas CrC8ramificadas incluem, mas não estão limitados a, -isopropil, -sec-butil, -isobutil, -tert-butil, -isopentil, 2-metilbutil, alquilas Ci-C8 não saturadas incluem sem selimitar a, -vinil, -allil, -1-butenil, -2-butenil, -isobutilenil, -1-pentenil, -2-pentenil, -3-metil-1-butenil, -2-metil-2-butenil, -2,3-dimetil-2-butenil, 1-hexil, 2-hexil, 3-hexil,-acetilenil, -propinil, -1-butinil, -2-butinil, -1-pentinil, -2-pentinil, -3-metil-1butinil. metil, etil, propil, isopropil, n-butil, isobutil, sec-butil, tert-butil, n-pentil,isopentil, neopentil, n-hexil, isohexil, 2-metilpentil, 3-metilpentil, 2,2-dimetilbutil,2,3-dimetilbutil, 2,2-dimetilpentil, 2,3-dimetilpentil, 3,3-dimetilpentil, 2,3,4-trimetilpentil, 3-metilhexil, 2,2-dimetilhexil, 2,4-dimetilhexil, 2,5-dimetilhexil, 3,5-dimetilhexil, 2,4-dimetilpentil, 2-metilheptil, 3-metilheptil, n-heptil, isoheptil, n-octil, and isooctil. Um grupo alquilas Ci-Cs pode ser não substituível ou podeser subistituido com um ou mais grupos incluindo, mas não se limitando a,alquilas C1-C8, -CHC1-C8 alquil), -aril, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2,-C(O)NHR', -C(O)N(R1)2 -NHC(O)R', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halogeno,-N3, -NH2, -NH(R'), -N(R1)2 e -CN; no qual cada R' é independente selecionadoa partir de H, CrCe-alquila e arila.
"Alquenil" são hidrocarbonetos C2-C18 contendo átomos decarbono normais, secundários, terciários ou cíclicos com pelo menos um localde insaturação, ou seja, uma ligação dupla de carbono-carbono, sp2. Osexemplos incluem, mas não estão limitados a: etileno ou vinil (-CH=CH2), alil(-CH2CH=CH2), ciclopentenil (-C5H7), e 5-hexenil (-CH2 CH2CH2CH2CH=CH2).
"Alquinil" são hidrocarbonetos C2-C18 contendo átomos decarbono normais, secundários, terciários ou cíclicos com pelo menos um localde não saturado, ou seja, uma ligação tripla sp de carbono-carbono. Osexemplos incluem, mas não estão limitados a: acetilênico (-C=CH) e propargil(-CH2CsCH).
"Alquileno" refere-se a uma cadeia saturada reta ou ramificada oucom radicais cíclicos de hidrocarbonetos de 1-18 átomos de carbono, epossuindo dois centros radicais monovalentes derivados da remoção de doisátomos de hidrogênio a partir da mesma ou de diferentes átomos de carbonode um alcano parental. Radicais alquilenos típicos incluem, mas não estãolimitados a: metileno (CH2) 1,2-etílico (CH2CH2)1 1,3-propil (CH2CH2CH2)1 1,4-butil (CH2CH2CH2CH2), e similares.
Um "alquileno C1-C10" é uma cadeia reta de um grupo dehidrocarbonetos saturados da fórmula -(CH2)1-10-. Exemplos de um alquilenoC1-C10 incluem metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno,heptileno, ocitileno, nonileno e decaleno.
"Alquenileno" refere-se a uma cadeia insaturada ramificada oureta ou de radicais cíclicos de hidrocarbonetos de 2-18 átomos de carbono,possuindo dois centros radicais monovalentes derivados da remoção de doisátomos de hidrogênio a partir da mesma ou de diferentes átomos de carbonode um de um alquenil parental. Radicais alquenileno típicos incluem, mas nãoestão limitados a: 1,2-etileno (CH=CH).
"Alquinileno" refere-se a uma cadeia insaturada ramificada ou reta oude radicais cíclicos de hidrocarbonetos de 2-18 átomos de carbono, possuindo doiscentros radicais monovalentes derivados da remoção de dois átomos de hidrogênioa partir da mesma ou de diferentes átomos de carbono de um de um alquinilparental. Radicais alquinileno típicos incluem, mas não estão limitados a: acetileno(C=C)1 propargílico (CH2C=C), e 4-pentinil (CH2CH2CH2C=C).
"Arila" refere-se a um grupo carbocíclico aromático. Exemplos degrupos aril incluem, mas não se limitam a, fenil, naftil e antracenil. Um grupocarbocíclico aromático ou um grupo heterocíclico aromático pode sersubstituído ou não substituído com um ou mais grupos, incluindo mas não selimitado a, -Ci-C8 alquila, -0-(Ci-C8 alquila), -aril, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR',-C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R1)2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halogeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN; no qual cada R' é independenteselecionado a partir de H, Ci-Ce-alquila e arila.
Um "arileno" é um grupo que tem duas ligações covalentes dearila e pode estar na configuração orto, meta ou para como mostra asseguintes estruturas:
<formula>formula see original document page 56</formula>no qual o grupo fenil pode ser substituído ou não substituído comaté quatro grupos, incluindo mas não limitado a, -Ci-Cs alquila, -O-íCrCsalquila), -arila, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2 , -C(O)NHR', -C(0)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH1 -halogeno, -N3, -NH2, -NH(R1)1 - N(R')2 e -CN, no qual cada R' é independente selecionado a partir de H, CrCs-alquila e arila.
"Arilalquil " refere-se a um radical alquila acíclico no qual os umdos átomos de hidrogênio é ligado a um átomo de carbono, tipicamente umátomo de carbono terminal ou SP3, é substituído por um radical arila. Gruposarilalquil típicos incluem, mas não se limitam a, benzílico, feniletan-2-1-il,fenileten-2-1-il, naftilmetil, naftiletano-2-1-il, naftileteno-2-1-il, naftobenzil, 2 -naftofeniletano-1-il e similares. O grupo arilalquil inclui 6 a 20 átomos decarbono, por exemplo, o grupamento alquila, incluindo grupos alcano, alquenilou alquinil, o grupo arilalquil é de 1 a 6 átomos de carbono e os grupo aril é de5 a 14 átomos de carbono.
"Heteroarilalquil" refere-se a um radical alquila acíclico na qual umdos átomos de hidrogênio é ligado a um átomo de carbono, tipicamente umátomo de carbono terminal ou sp3, é substituído por um radical heteroaril.Grupos típicos de heteroarilalquil incluem, mas não se limitam a, 2-benzimidazolilmetil, 2-furiletil, e similares. O grupo heteroarilalquil inclui 6 a 20átomos de carbono, por exemplo, o agrupamento alquila, incluindo os gruposalcanil, alquenil ou alquinil, heteroarilalquil é de 1 a 6 átomos de carbono e ogrupamento heteroaril é de 5 a 14 átomos de carbono e de 1 a 3 heteroátomosselecionados a partir de Ν, O, P, e S. A molécula heteroaril do grupo heteroarilalquil pode ser um anel monocíclico de 3 a 7 membros (2 a 6 átomosde carbono ou um bicíclico com 7 a 10 anéis membros (4 a 9 átomos decarbono e de 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de Ν, O, P, e S), porexemplo: um sistema bicíclico [4,5], [5,5], [5,6], ou [6,6],"Alquila substituídos", "arila substituído" e "arilalquil substituído",significa alquil, aril, e arilalquil, respectivamente, na qual um ou mais átomos dehidrogênio são independentemente substituídos com um substituinte.Substituintes típicos incluem, mas não se limitam a, -X, -R, -O", -OR, -SR, -S",i -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO1-NO2, =N2l -N3,NC(=0)R, -C(=0)R, -C(=0)NR2, -SO3-, -SO3H1 -S(=0)2R, -0S(=0)20R, -S(=0)2NR, -S(=0)R, -0P(=0)(0R)2i -P(=0)(0R)2, -PO3, -PO3H2, -C(=0)R,-C(=0)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2', -C(=S)OR, -C(=0)SR, -C(=S)SR, -C(=0)NR2,-C(=S)NR2, -C(=NR)NR2, no qual cada X é independentemente de umahalogêneo: F, Cl, Br, ou I1 e cada R é independente um heterociclo -H, C2-Ci8alquil, Ce-C2O aril, C3-Cu1 protegendo o grupo ou a fração da pró-droga. Gruposalquilenos, alquenilenos e alquinilenos como descrito anteriormente tambémpodem ser igualmente substituídos.
"Heteroaril" e "heterociclo" referem-se a um sistema em anel emque um ou mais átomos do anel é um heteroátomo, por exemplo, nitrogênio,oxigênio e enxofre. O radical heterociclo consta de 1 a 20 átomos de carbono ede 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, O1 P e S. Um heterociclopode ser um monociclo contendo de 3 a 7 membros anel (2 a 6 átomos decarbono e de 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N1 O, P e S) ou umabiciclo com 7 a 10 membros de anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3heteroátomos selecionados a partir de Ν, O1 P e S), por exemplo: um sistemabiciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6],
Heterociclos são descritos em Paquette, Leo A.; "Principies ofModern Heterocyclic Chemistry " (WA Benjamin1 Nova Iorque, 1968),especialmente nos capítulos 1, 3, 4, 6, 7 e 9; "The Chemistn/ of HeterocyclicCompounds, A series of Monopraphs "(John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1950ao presente), em especial os Volumes 13, 14, 16, 19, e 28, e J. Am. Chem.Soe. (1960) 82:5566.Exemplos de heterociclos incluem, apenas a título de exemplo enão se limitando a; piridil, dihidroypiridil, tetrahidropiridil (piperidil), tiazolil,tetrahidrotiofenil, sulfur oxidized tetrahidrotiofenil, pirimidinil, furanil, tienil,pirrolil, pirazolil, imidazolil, tetrazolil, benzofuranil, tianaftalenil, indolil, indolenil,quinolinil, isoquinolinil, benzimidazolil, piperidinil, 4-piperidonil, pirrolidinil, 2-pirrolidonil, pirrolinil, tetrahidrofuranil, bis-tetrahidrofuranil, tetrahidropiranil, bis-tetrahidropiranil, tetrahidroquinolinil, tetrahidroisoquinolinil, decahidroquinolinil,octahidroisoquinolinil, azocinil, triazinil, 6H-1,2,5-tiadiazinil, 2H,6H-1,5,2-ditiazinil, tienil, tiantrenil, piranil, isobenzofuranil, chromenil, xantenil, fenoxatinil, 2H-pirrolil, isotiazolil, isoxazolil, pirazinil, piridazinil, indolizinil, isoindolil, 3H-indolil, 1H-indazolil, purinil, 4H-quinolizinil, ftalazinil, naftiridinil, quinoxalinil,quinazolinil, cinnolinil, pteridinil, 4aH-carbazolil, carbazolil, β-carbolinil,fenantridinil, acridinil, pirimidinil, fenantrolinil, fenazinil, fenotiazinil, furazanil,fenoxazinil, isochromanil, chromanil, imidazolidinil, imidazolinil, pirazolidinil, pirazolinil, piperazinil, indolinil, isoindolinil, quinuclidinil, morfolinil, oxazolidinil,benzotriazolil, benzisoxazolil, oxindolil, benzoxazolinil, and isatinoil.
A título de exemplo, e não se limitando, heterociclos ligados acarbono são ligados na posição 2, 3, 4, 5, 6 ou de uma piridina, posição 3, 4, 5ou 6 de um piridazina, posição 2, 4, 5, ou 6 de uma pirimidina, posição 2, 3, 5 ou 6 de um pirazina, posição 2, 3, 4 ou 5 de um furano, tetrahidrofurano,tiofurano, tiofeno, pirrolo ou tetrahidropirrolo, posição 2, 4 ou 5 de uma oxazole,imidazol ou tiazol, posição 3, 4 ou 5 de uma isoxazol, pirazol, ou isotiazol,posição 2 ou 3 de um aziridina, posição 2, 3 ou 4 de uma azetidina, posição 2,3, 4, 5, 6, 7 ou 8 de quinolina ou posição 1, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 de umaisoquinolina. Ainda mais tipicamente, incluem heterociclos ligados a aocarbono 2-piridil, 3-piridil, 4-piridil, 5-piridil, 6-piridil, 3-piridazinil, 4-piridazinil, 5-piridazinil, 6-piridazinil, 2-pirimidinil, 4-pirimidinil, 5-pirimidinil, 6-pirimidinil, 2-pirazinil, 3-pirazinil, 5-pirazinil, 6-pirazinil, 2-tiazolil, 4-tiazolil, ou 5-tiazolil.A título de exemplo sem se limitar, heterociclos ligados ahidrogênio são ligados na na posição 1, de uma aziridina, azetidina, pirrolo,pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina,indol, indolina, 1H-indazol, posição 2 de uma isoindol, ou isoindolina, posiçãode 4 uma morfolina, e posição 9 de um carbazol, ou β-carbolina. Ainda maistipicamente, heterociclos ligados ao hidrogênio incluem 1-aziridil, 1-azetedil, 1-pirrolil, 1-imidazolil, 1-pirazolile 1-piperidinil.
A "heterociclo C3-C8" refere-se a um carbociclo C3-C8 aromáticoou não aromático no qual de um a quatro átomos de carbono do anel sãosubstituídos por um heteroátomo independentemente de o grupo composto porP, S e N. Exemplos representativos de um heterociclo C3-C8 incluem, mas nãose limitam a, benzofuranil, benzotiofene, indolil, benzopirazolil, coumarinil,isoquinolinil, pirrolil, tiofenil, furanil, tiazolil, imidazolil, pirazolil, triazolil,quinolinil, pirimidinil, piridinil, piridonil, pirazinil, piridazinil, isotiazolil, isoxazolil etetrazolil. Um heterociclo C3-C8 pode ser substituído ou não substituído com atésete grupos, incluindo, mas não se limitado a, -Ci-C8 alquila, -0-(CrC8 alquila),-arila, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2 , -C(O)NHR', -C(0)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halogeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN; no qual cada R' é selecionado independentemente a partir de H, -CrC8alquila e arila.
"Heterociclo C3-C8" refere-se a um heterociclo C3-C8 definidoacima no qual um dos átomos de hidrogênio do grupo do heterociclo ésubstituído com uma ligação. Um heterociclo C3-C8 pode ser substituído ou nãosubstituído com até seis grupos, incluindo, mas não se limitado a: -CrC8alquila, -0-(CrC8 alquila), -arila, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2 , -C(O)NHR', -C(0)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halogeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN; no qual cada R' é selecionado independentementea partir de H, -Ci-Ce alquila e arila.
"Carbociclo", refere-se a um anel saturados ou insaturados quepossui de 3 a 7 átomos de carbono como um monociclo ou biciclo de 7 a 12átomos de carbono. Carbociclos monocíclicos possuem de 3 a 6 átomos noanel, ainda mais tipicamente 5 ou 6 átomos no anel. Carbociclos biciclos têm 7a 12 átomos no anel, por exemplo, organizados como um sistema biciclo [4,5],[5,5], [5,6] ou [6,6], ou de 9 ou 10 átomos no anel organizado como um sistemabiciclo [5,6] ou [6,6]. Exemplos de carbociclos monocíclico inclui ciclopropil,ciclobutil, ciclopentil, 1-ciclopent-1-enil, 1-ciclopent-2-enil, ciclopent-3-1-enil,ciclohexil, 1-ciclohex-1-enil, 1-ciclohex-2 - enil, ciclohex-1-3-enil, cicloheptil, eciclooctil.
Um "carbociclo C3-C8" é um anel carbocíclico aromático 3-, 4-, 5-,6-, 7- ou 8-membros não-saturados ou insaturados. Carbociclos C3-C8representativos incluem, mas não estão limitados a,-ciclopropil, ciclobutil-de-ciclopentil,-ciclopentadienil, ciclohexil-de-ciclohexenil, -1,3-ciclohexadienil, -1,4-ciclohexadienil,-cicloheptil, -1 ,3-Cicloheptadienil, -1,3,5-cicloheptatrienil,-ciclooctil e -ciclooctadienil. Um grupo carbociclo C3-C8 pode ser substituído ounão substituído por um ou mais grupos, incluindo, mas não limitado a: -Ci-Cealquila, -CHC1-C8 alquila), -arila, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2 , - C(O)NHR', -C(O)N(R1)2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halogeno, -N3 , -NH2, -NH(R1)1 -N(R1)2 e -CN; no qual cada R' é selecionado independentementea partir de H, -Ci-C8 alquila e arila.
A " carbociclo C3-C8" refere-se a um grupo carbociclo C3-C8definido acima no qual um dos átomos de hidrogênio do grupo carbociclo ésubstituído com uma ligação.
"Ligante" refere-se a um composto químico que compreende umaligação covalente ou uma cadeia de átomos que se liga covalentemente a umanticorpo ou fração de uma droga. Em vários exemplos de realizações, Iigantesincluem um radical divalente como um alquildil, um arildil, um heteroarildil,moléculas, tais como -(CR2)nO(CR2)n-, unidades repetidas de alquiloxi (porexemplo, polietilenoxi, PEG1 polimetileneoxi) e alquilamino ( polietilenamino porexemplo, Jeffamine™), e éteres diácidos e amidas incluindo sucinato,sucinamida, diglicolato, malonato e caproamida.
O termo "quiral" se refere a moléculas que têm a propriedade deserem não sobreponíveis à sua própria imagem, enquanto que o termo"aquiral" refere-se a moléculas que são superponíveis em suas imagensespelho parental.
O termo "estereoisômeros" refere-se aos compostos químicosque têm idêntica constituição, mas diferem no que diz respeito ao arranjo dosátomos ou grupos no espaço.
"Diastereômeros" refere-se a um estereoisômero com dois oumais centros de quiralidade e cuja molécula de um não é imagem especular deoutro. Diastereômeros têm diferentes propriedades físicas, por exemplo, pontode fusão diferente, ponto de ebulição diferente, e diferentes propriedadesespectrais e de reatividade. Misturas de diastereômeros podem ser separadassob procedimentos de alta resolução analítica, tais como eletroforese ecromatografia.
"Enantiômeros" refere-se a dois estereoisômeros de umcomposto que são imagens no espelho não sobreponíveis um ao outro.
Definições estereoquímicas e convenções utilizadas no presentegeralmente seguem SP Parker, Ed., McGraw-HiII Dictionarv of Chemical Terms(1984) McGraw-HiII Book Company, Nova Iorque, e Eliel, E. e wilen, S.,Stereochemistrv of Oraanic Compounds (1994 ) John Wiley & Sons, NovaIorque. Muitos compostos orgânicos existem em formas opticamente ativas, ouseja, eles têm a capacidade de rodar o plano do plano de luz polarizada. Aodescrever um composto opticamente ativo, os prefixos D e L, ou R e S, sãousados para denotar a configuração absoluta da molécula sobre o seu(s)centro(s) quiral(ais). Os prefixos d e I ou (+) e (-) é utilizado para designar osinal de rotação do plano de luz polarizada pelo composto, significando que ocomposto com (-) ou 1 é levorotatório. Um composto prefixado com (+) ou d édextrorotatório. Para uma determinada estrutura química, essesestereoisômeros são idênticos exceto por eles serem um espelho da imagemum do outro. Um estereoisômero específico podem também ser referido comoum enantiômero, e uma mistura de isômeros é muitas vezes denominada demistura enantiomérica. Uma mistura de enantiômeros 50:50 é referida comouma mistura racêmica ou um racemato, que pode ocorrer quando não houvequalquer estereoseleção ou estéreoespecíficidade em uma reação química ouprocesso. Os termos "mistura racêmica" e "racemato" referem-se a umamistura equimolar enantiomérica de duas espécies, destituída de atividadeóptica.
"Grupo abandonador" refere-se a um grupo funcional que podeser substituído por um outro grupo funcional. Certos grupos abandonadoressão bem conhecidos no estado da arte, e os exemplos incluem, mas não selimitam a, haletos (por exemplo, cloreto, brometo, iodeto), metanosulfonil(mesil), p-toluenesulfonil (tosil), trifluorometilsulfonil (triflato), etrifluorometilsulfonato.
B. Abreviaturas
COMPONENTES LIGANTES:
MC = 6-maleimidocaproil
Val-Cit ou "vc" = valina-citrulina (um exemplo de dipeptídeo emum Iigante clivável por protease).
Citrulina = ácido 2-amino- 5- ureído pentanóico.
PAB = p-aminobenziloxicarbonil (um exemplo de um componenteIigante com " auto-imolação ")63
Me-Val-Cit = N-metil-valina-citrulina (no qual o peptídeo Iiganteligado foi alterado de modo a evitar a sua clivagem pela catepsina B).
MC (PEG) 6-0H = maleimidocaproil polietileno-glicol (podem serassociadas as cisteínas dos anticorpos).
DROGAS CITOTÓXICASMMAE = mono-metil auristatina E (MW 718).MMAF = variante da auristatina E (MMAE) com uma fenilalanina,no C-terminal da droga (MW 731,5).
MMAF-DMAEA = MMAF com DMAEA (dimetilaminoetilamina), emuma ligação da amida ao C-terminal da fenilalanina (MW 801,5).
MMAF-TEG = MMAF com tetraetileno-glicol esterificado nafenilalanina.
MMAF-NtBu = N-t-butil, que ligado como uma amida no C-terminal do MMAF.
Outras abreviaturas são as seguintes: AE é auristatina E, Boc é
N-(f-butoxicarbonil), cit é citrulina, dap é dolaproina, DCC é 1,3-diciclohexilcarbodiimida, DCM é diclorometano, DEA é dietilamina, DEAD édietilazodicarboxilato, DEPC é dietilfosforilcianidato, DIAD édiisopropilazodicarboxilato, DIEA éN,N-diisopropiletilamina, dil édolaisoleucina, DMA é dimetilacetamida, DMAP é 4-dimetilaminopiridina, DMEé etileneglicol dimetil eter (ou 1,2-dimetoxietano), DMF é N,N-dimetilformamida,DMSO é dimetilsulfoxide, doe é dolafenina, dov é N,N-dimetilvalina, DTNB é5,5-ditio bis(ácido 2-nitrobenzóico), DTPA é ácidodietilenetriaminapentaacético, DTT é ditiotreitol, EDCI é hidrocloreto 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimide, EEDQ é 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina, ES-MS é espectrometria de massa com ionização porElectrospray, EtOAc é etil acetato, Fmoc é N-(9-fluorenilmetoxicarbonil), gli églicina, HATU é 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N,N,-tetrametiluroniohexafluorofosfato, HOBt é 1-hidroxibenzotriazol, HPLC é cromatografia líquidade alta pressão, ile é isoleucina, lis é lisina, MeCN (CH3CN) é acetonitrila,MeOH é metanol, Mtr é 4-anisildifenilmetil (or 4-metoxitritil),nor é (1S, 2R)-(+)-norefedrina, PBS é tampão salina fosfato (pH 7,4), PEG é polietileneglicol, F éfenil, Pnp é p-nitrofenil, MC é 6-maleimidocaproíl, fe é L-fenilalanina, PiBrop ébromo írís-pirrolidino fosfonio hexafluorofosfato, SEC é cromatografia deexclusão por tamanho, Su é sucinimida, TFA é ácido trifluoroacético, TLC écromatografia em camada delgada, UV é ultravioleta, e vai é valina.fornecidos imunoconjugados composto de anticorpos anti-TAT226. Osanticorpos e imunoconjugados da invenção são úteis, por exemplo, para odiagnóstico ou tratamento de doenças associadas com a alteração naexpressão, por exemplo, aumento da expressão, de TAT226. Em certosexemplos de realizações, anticorpos ou imunoconjugados da invenção sãoúteis para o diagnóstico ou tratamento de um distúrbio da proliferação celular,assim como o câncer.
proteína que é processada e expressa na superfície de certos tipos de células,incluindo células tumorais. Especificamente, foi previamente reportado que aTAT226 humana se encontra super-expressada em certos tipos de tumores,incluindo tumores de ovário, útero, endométrio, rim, pulmão, pâncreas, adrenal,e tumores hepatocelulares. Vide, por exemplo, Pedidos de Patentes US2003/0148408 A1, US 2004/0229277 A1 e US 2003/0100712 A1 (referindo-seao TAT226 como "PR09917"); e Patente US 6710170 B2 (SEQ ID No: 215).Outras bases de dados e informações relacionadas com a TAT226 são asseguintes: NCBI número de acesso. AY358628_1 (referindo-se a TAT226
III. Composições E Métodos De Produção Dos Mesmos
São fornecidos anticorpos que se ligam a TAT226. São
A. Anticorpo Anti-TAT226
TAT226 ("Alvo Antigênico Associado ao Tumor N0 226") é umahumana como "PSCA Hlog"); NCBI número de acesso: AAQ88991.1 e "g.i"número: 37182378 (referindo-se a TAT226 humana como "PSCA Hlog"); RikencDNA 2700050C12; US 2003/0096961 A1 (SEQ ID No: 16); US 2003/0129192A1 (SEQ ID No: 215); US 2003/0206918 A1 (Exemplo 5; SEQ ID No: 215); USi 2003/0232056 A1 (SEQ ID No: 215); US 2004/0044179 A1 (SEQ ID No: 16);US 2004/0044180 A1 (SEQ ID No: 16); US 2005/0238649 A1 (referindo-se aoTAT226 humano como "PSCA Hlog"); Documento WO 2003/025148 (SEQ IDNo: 292); Documento WO 2003/105758 (SEQ ID No: 14) e Documento EP1347046 (SEQ ID No: 2640).
O TAT226 de comprimento total passa por um processamento nacélula para gerar uma forma madura da proteína que se expressa na superfíciecelular. Por exemplo, um TAT226 humano de comprimento total como exibidona SEQ ID No: 75 contêm uma seqüência de peptídeos sinal precedidas pelosaminoácidos 1-20 ou 1-22, a qual se prevê que venham a ser clivada daproteína. Prevê-se que o C-terminal dos aminoácidos 116-141 venha a serclivado da proteína, e que uma fração GPI seja anexada à proteína noaminoácido 115. È previsto que na forma madura da TAT226 humana, a partirdos aminoácidos 21-115 ou 23-115 da SEQ ID No: 75, venha a ser ancorada àsuperfície da célula através da molécula GPI. A TAT226 de macacos eroedores (vide, por exemplo, SEQ ID Nos:76-78) são muito semelhantes aTAT226 humana e, portanto, acredita-se que são clivadas e modificas emposições de aminoácidos equivalentes. Vide a Figura 1. As formas madurasresultantes de TAT 226 de humanos, macacos, roedores, dos aminoácidos 21-115 ou 23-115 (como mostra a Figura 1) são 100% idênticas.
Outras características do TAT226 humano inclui um sítio de N-glicosilação que foi previsto no aminoácido 45, que foi empiricamenteconfirmada, e um domínio Ly6/u-PAR que foi previsto nos aminoácidos 94-107da SEQ ID No: 75. O TAT226 humano tem cerca de 32% homologia com osaminoácido do antígeno de célula tronco prostática (PSCA), um alvo antigênicode tumor específico para o câncer de próstata que está expresso na superfícieda célula através de uma ligação GPI. Vide, Reiter et al. (1998) Proc. Nat.Acad. Sei. USA 95:1735-1740. PSCA está superexpresso em mais de 80% doscânceres de próstata. Id. Assim como o TAT226, o PSCA contém um domínioLy6/u-PAR previsto, que tem sido implicado em funções celulares, tais comotransdução de sinal e a adesão celular.
Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos que se ligam aTAT226. Em certos exemplos de realizações, são fornecidos anticorpos que seligam a uma forma de TAT226 madura. Em alguns destes exemplos derealização, uma forma madura de TAT226 tem uma seqüência de aminoácidodos aminoácidos 21-115 ou 23-115 da SEQ ID No: 75. Em alguns exemplos derealização, um anticorpo para TAT226 se liga a uma forma madura de TAT226,expressa na superfície da célula. Em algumas realizações, um anticorpo quese liga a uma forma madura de TAT226 expressada sobre a superfície celularinibe o crescimento da célula. Em algumas realizações, um anticorpo anti-TAT226 se liga a um TAT226 maduro expresso na superfície da célula e inibea proliferação celular. Em certos exemplos de realização, um anticorpo anti-TAT226 se liga a uma forma madura de TAT226 expressa sobre a superfíciecelular e induz a morte celular. Em alguns exemplos de realização, umanticorpo anti-TAT226 se liga a uma forma madura de TAT226 expressa nasuperfície de células cancerosas. Em alguns exemplos de realização, umanticorpo anti-TAT226 se liga a uma forma madura de TAT226 que estásuperexpresso na superfície de células cancerosas quando comparadas comcélulas normais no mesmo tecido de origem.
Em um aspecto, um anticorpo anti-TAT226 é um anticorpomonoclonal. Em um aspecto, um anticorpo anti-TAT226 é um fragmento deanticorpo, por exemplo, um fragmento Fab, Fab1-SH, FV, scFv ou (Fab1)2. Emum aspecto, um anticorpo anti-TAT226 é um anticorpo quimérico, humanizadoou anticorpo humano. Em um aspecto, qualquer um dos anticorpos anti-TAT226 aqui descritos são purificados.
Exemplos de anticorpos monoclonais derivados de uma bibliotecade fago estão previstos no presente, tal como descrito no Exemplo Β. Oantígeno utilizado para selecionar a biblioteca foi um polipeptídeo com aseqüência dos aminoácidos 1-115 da SEQ ID No: 75, que corresponde a umaforma do TAT226 com ausência dos aminoácidos C-terminais do sítio deligação ao GPI putativo. Os anticorpos resultantes da biblioteca selecionadaforam denominados YW0.32 e YW0.49. YWO.49 foi maturado por afinidadepara gerar YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6. Oalinhamentos das seqüências dos domínios variáveis das cadeias leves epesadas do YW0.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, eYWO.49.H6 são exibidos nas Figuras 11 e 12, respectivamente.
Em um aspecto, são fornecidos anticorpos monoclonais quecompetem com o YW0.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2,ou YWO.49. H6 pela ligação ao TAT226. Também são fornecidos anticorposmonoclonais que se ligam ao mesmo epítopo como o YW0.32, YWO.49,YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 ou YWO.49.H6.
Em um aspecto da invenção, são fornecidos polinucleotídeos quecodificam anticorpos anti-TAT226. Em certos exemplos de realização, sãofornecidos vetores compreendendo os polinucleotídeos que codificam osanticorpos anti-TAT226. Em certos exemplos de realização, são fornecidascélulas hospedeiras contendo estes vetores. Em outro aspecto da invenção,são fornecidas composições contendo anticorpos anti-TAT226 oupolinucleotídeos que codificam anticorpos anti-TAT226. Em certos exemplosde realização, uma composição da invenção é uma formulação farmacêuticapara o tratamento de um distúrbio da proliferação celular, tais com aquelasenumeradas no presente.
Uma descrição detalhada dos anticorpos anti-TAT226 exemplaresé a seguinte:
1. Realizações Específicas De Anticorpos Anti-TAT226
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo contendo pelomenos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a)um HVR-H1, que compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 1ou SEQ ID No: 4; (b) uma HVR-H2, que compreende a seqüência deaminoácidos da SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 5; (c) um HVR-H3 compreende aseqüência de aminoácidos selecionados a partir da SEQ ID No: 3 e 6-11; (d)um HVR-L1, que compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 12;(e) um HVR-L2 que compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No:13; e (f) um HVR-L3 que compreende uma seqüência de aminoácidoselecionada a partir da SEQ ID No: 14-19.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226contendo de pelo menos um, pelo menos, dois, três ou todas as seqüênciasVH HVR selecionados a partir de (a) um HVR-H1, que compreende aseqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 1 ou SEQ ID No: 4; (b) uma HVR-H2, que compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 2 ou SEQ IDNo: 5; e (c) um HVR-H3 que compreende a seqüência de aminoácidosselecionados a partir da SEQ ID Nos: 3 e 6-11. Em um aspecto, a invençãofornece um anticorpo anti-TAT226 que contem um HVR-H1, que compreende aseqüência de aminoácidos SEQ ID No: 1 ou SEQ ID No: 4. Em um aspecto, ainvenção fornece um anticorpo anti-TAT226 contem um HVR-H2, quecompreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 5.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226 que contém umHVR-H3 que compreende uma seqüência de aminoácidos selecionados apartir da SEQ ID No: 3 e 6-11. Em um aspecto a invenção fornece umanticorpo anti-TAT226 que contem um HVR-H3 que compreende a seqüênciade aminoácidos da SEQ ID No: 9 ou 10.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226que contém um HVR-H3 que compreende uma seqüência de aminoácidosselecionada a partir da SEQ ID No: 3 e 6-11 e uma HVR-H1 que compreendeuma seqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 1 e SEQ IDNo: 4. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226 quecontém um HVR-H3 que compreende uma seqüência de aminoácidosselecionada a partir da SEQ ID No:6-11 e um HVR-H1 que compreende a SEQID No: 4. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226 quecontem um HVR-H3 que compreende a SEQ ID No: 9 ou 10 e uma HVR-H1compreendendo a SEQ ID No: 4. Em um aspecto, a invenção fornece umanticorpo anti-TAT226 que contem um HVR-H3 compreendendo a SEQ ID No:3 e um HVR-H1 compreendendo SEQ ID No: 1.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226que contem um HVR-H3 que compreende uma seqüência de aminoácidosselecionada a partir da SEQ ID No: 3 e 6-11 e uma HVR-H2 que compreendeuma seqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 2 e SEQ IDNo: 5. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226 quecontém um HVR-H3 que compreende uma seqüência de aminoácidosselecionada a partir da SEQ ID No: 6-11 e um HVR-H2 que compreende aSEQ ID No: 5. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226que contem um HVR-H3 compreendendo a SEQ ID No: 9 ou 10 e uma HVR-H2 compreendendo a SEQ ID No: 5. Em um aspecto, a invenção fornece umanticorpo anti-TAT226 que contem um HVR-H3 compreendendo a SEQ ID No:3 e um HVR-H2 compreendendo a SEQ ID No: 2.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226que contem um HVR-H1, que compreende a seqüência de aminoácidos SEQID No: 1 ou SEQ ID No: 4; um HVR-H2, que compreende a seqüência deaminoácidos SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 5; e um HVR-H3 que compreende aseqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 3 e 6-11. Emuma realização, a HVR-H1 compreende a seqüência de aminoácidos SEQ IDNo: 4; o HVR-H2 compreende a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 5; e osHVR-H3 compreende a seqüência de aminoácidos selecionados a partir daSEQ ID No: 6-11. Em uma realização, a HVR-H1 compreende a seqüência deaminoácidos SEQ ID No: 4; o HVR-H2 compreende a seqüência deaminoácidos SEQ ID No: 5; e a HVR-H3 compreende a seqüência deaminoácidos SEQ ID No: 9 ou 10. Em uma realização, a HVR-H1 compreendea seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 1; o HVR-H2 compreende aseqüência de aminoácidos SEQ ID No: 2; e os HVR-H3 compreende aseqüência de aminoácidos SEQ ID No: 3.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226contendo pelo menos um, pelo menos, dois, três ou todas as seqüências VLHVR selecionadas a partir de (a) um HVR-L1, que compreende a seqüência deaminoácidos SEQ ID No: 12; (b) um HVR-H2, que compreende a seqüência deaminoácidos SEQ ID No: 13; e (c) um HVR-H3 que compreende umaseqüência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID Nos: 14-19. Em umaspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226 contendo um HVR-L3compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir das SEQID Nos: 14-19. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226contendo um HVR-L3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos da SEQID No: 17 ou 18.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226contendo (a) um HVR-H3 que compreende uma seqüência de aminoácidosselecionada a partir das SEQ ID Nos: 3 e 6-11 e (b) uma HVR-L3 quecompreende uma seqüência de aminoácidos selecionada da SEQ ID Nos:14-19. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226 contendo
(a) um HVR-H3 compreendendo a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 3 e
(b) uma HVR-L3 compreendendo a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 14.
Em algumas realizações, o anticorpo TAT226 contendo adicionalmente (a) umHVR-H1 compreendendo a SEQ ID No: 1 e uma HVR-H2 compreendendo aSEQ ID No: 2.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226contendo (a) um HVR-H3 que compreende uma seqüência de aminoácidosselecionada a partir das SEQ ID Nos: 6-11 e (b) uma HVR-L3 que compreendeuma seqüência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID Nos: 14-19.
Em algumas realizações, a HVR-H3 compreende a seqüência de aminoácidosSEQ ID No: 9 e a HVR-L3 compreende a seqüência de aminoácidos SEQ IDNo: 17. Em algumas realizações, a HVR-H3 compreende a seqüência deaminoácidos SEQ ID No: 10 e a HVR-L3 compreende a seqüência deaminoácidos SEQ ID No: 18. Em algumas realizações, o anticorpo TAT226contém ainda uma HVR-H1 compreendendo a SEQ ID No: 4 e um HVR-H2compreendendo a SEQ ID No: 5.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226contendo (a) um HVR-H1, que compreende a seqüência de aminoácidos SEQID No: 1 ou SEQ ID No: 4; (b) uma HVR-H2 que compreende a seqüência deaminoácidos da SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 5; (c) um HVR-H3 quecompreende uma seqüência de aminoácidos selecionados a partir das SEQ IDNos: 3 e 6-11; (d) um HVR-L1, que compreende a seqüência de aminoácidosSEQ ID No: 12; (e) um HVR-L2 que compreende a seqüência de aminoácidosSEQ ID No: 13; e (f) um HVR-L3 compreende uma seqüência de aminoácidosselecionados a partir das SEQ ID Nos: 14-19.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226contendo (a) um HVR-H1, que compreende a seqüência de aminoácidos SEQID No: 1; (b) uma HVR-H2, que compreende a seqüência de aminoácidos SEQID No: 2; (C) um HVR-H3 que compreende a seqüência de aminoácidos SEQID No: 3; (d) um HVR-L1, que compreende a seqüência de aminoácidos SEQID No: 12; (e) um HVR-L2 que compreende a seqüência de aminoácido SEQID No: 13; e (f) um HVR-L3 que compreende a seqüência de aminoácidos SEQID No: 14.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226contendo (a) um HVR-H1, que compreende a seqüência de aminoácidos SEQID No: 4; (b) uma HVR-H2, que compreende a seqüência de aminoácidos SEQID No: 5; (c) um HVR-H3 que compreende uma seqüência de aminoácidosselecionada a partir das SEQ ID Nos: 6-11; (d) um HVR-L1, que compreende aseqüência de aminoácidos SEQ ID No: 12; (e) um HVR-L2 que compreende aseqüência de aminoácidos SEQ ID No: 13; e (f) um HVR-L3 que compreendeuma seqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 14-19.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226que contém (a) um HVR-H1, que compreende a seqüência de aminoácido SEQID No: 4; (b) uma HVR-H2, que compreende a seqüência de aminoácidos SEQID No: 5 ; (c) um HVR-H3 que compreende a seqüência de aminoácidos SEQID No: 9; (d) um HVR-L1, que compreende a seqüência de aminoácidos SEQID No: 12; (e) um HVR-L2 que compreende a seqüência de aminoácidos SEQID No: 13; e (f) um HVR-L3 que compreende a seqüência de aminoácidos daSEQ ID No: 17.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226que contém (a) um HVR-H1, que compreende a seqüência de aminoácido SEQID No: 4; (b) uma HVR-H2, que compreende a seqüência de aminoácidos SEQID No: 5; (c) um HVR-H3 que compreende a seqüência de aminoácidos SEQID No: 10; (d) um HVR-L1, que compreende a seqüência de aminoácidos SEQID No: 12; (e) um HVR-L2 que compreende a seqüência de aminoácidos SEQID No: 13; e (f) um HVR-L3 que compreende a seqüência de aminoácidos daSEQ ID No: 18.
Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-TAT226 ématurado por afinidade para se obter a afinidade de ligação desejada. Emalguns exemplos de realização, qualquer um ou mais aminoácidos de umanticorpo são substituídos nas seguintes posições da HVR (numeração deKabat): H98, H99, H100, H100B, L90, L92, L93, L96 e L97. Por exemplo, emalgumas realizações, qualquer um ou mais das seguintes substituições podemser feitas em qualquer combinação:
- na HVR-H3 (SEQ ID No: 6): V98I; S99T; R100L ou I; G100bA, S, ou P
- na HVR-L3 (SEQ ID No: 14): Q90R, Κ, H, ou N; Y92V; T93F, N1G, ou A; P96F; T97I ou A.
Todas as combinações possíveis das substituições acima sãoenglobadas pelas seqüências de consenso SEQ ID No: 11 (HVR-H3) e SEQ IDNo: 19 (HVR-L3).
Um anticorpo anti-TAT226 pode conter qualquer seqüência dedomínio variável da região estrutural adequada, desde que o anticorpomantenha a capacidade de se ligar ao TAT226. Por exemplo, em algumasrealizações, os anticorpos anti-TAT226 humano da invenção compreende umaseqüência consenso da região estrutural de cadeia pesada subgrupo III. Emum exemplo de realização destes anticorpos, seqüência consenso da regiãoestrutural de cadeia pesada contém substituição(ões) na(s) posição(ões) 71,73 e/ou 78. Em uma realização destes anticorpos, a posição 71 é A, a posição73 é T, e/ou posição 78 é A. Em uma realização, esses anticorpos contém aseqüência consenso do domínio variável de cadeia pesada da huMAb4D5-8,por exemplo, SEQ ID No: 50, 51, 59, 35 (FR1, 2, 3, 4, respectivamente). AhuMAb4D5-8 é comercialmente conhecida como HERCEPTIN®, Genentech,Inc., São Francisco, CA, EUA.; também referido na Patente US 6407213 e5821337, e Lee et ai, J. Mol. Biol. (2004), 340 (5): 1073-93. Em uma dessasrealizações, esses anticorpos compreendiam adicionalmente de umaseqüência de consenso da região estrutural da cadeia leve Dl humana. Emuma dessas realizações, esses anticorpos contém uma seqüência deconsenso da região estrutural do domínio variável de cadeia leve dahuMAb4D5-8.
Em um exemplo de realização, um anticorpo anti-TAT226 contémum domínio variável de cadeia pesada que compreendendo uma seqüência daregião estrutural e uma região hipervariável, no qual a região estruturalcompreende a seqüência FR1-FR4 selecionadas daquelas indicadas nasFiguras 5A e 5B, a HVR H1 compreende a seqüência de aminoácido da SEQID No: 4; o HVR-H2 compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No:e o HVR-H3 compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada apartir das SEQ ID Nos: 6-11. Em um exemplo de realização destes anticorpos,a HVR-H3 compreende a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 9 ou 10. Emum exemplo de realização, um anticorpo anti-TAT226 contém um domíniovariável de cadeia leve que compreende uma seqüência da região estrutural eregiões hipervariáveis, no qual o a região estrutural compreende as seqüênciasFR1-FR4 selecionadas entre as indicadas nas Figuras 6A e 6B, a HVR-L1compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 12; o HVR-L2compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 13; e o HVR-L3compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ IDNos: 14-19. Em uma realização destes anticorpos, a HVR-L3 compreende aseqüência de aminoácidos SEQ ID No: 17 ou 18.
Em um exemplo de realização, um anticorpo anti-TAT226 contemum domínio variável de cadeia pesada que compreenda uma seqüência daregião estrutural e regiões hipervariáveis, no qual a região estruturalcompreende a seqüência FR1-FR4 da SEQ ID No: 50, 51, 59, e 35, comoexibido na Figura 7; o HVR H1 compreende a seqüência de aminoácidos SEQID No: 4; o HVR-H2 compreende a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 5; eo HVR-H3 compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada a partirdas SEQ ID Nos: 6-11. Em uma realização destes anticorpos, a HVR-H3compreende a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 9 ou 10. Em umarealização, um anticorpo anti-TAT226 contém um domínio variável de cadeialeve que compreende uma seqüência da região estrutural e regiõeshipervariáveis, no qual a região estrutural compreende a seqüências FR1-FR4da SEQ ID No: 60, 61, 62, e 63, como exibido na Figuras 6A e 6B, a HVR-L1compreende a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 12; o HVR-L2compreende a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 13; e os HVR-L3compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ IDNos: 14-19. Em uma realização destes anticorpos, a HVR-L3 compreende aseqüência de aminoácidos SEQ ID No: 17 ou 18.
Em um exemplo de realização, um anticorpo anti-TAT226 contemum domínio variável de cadeia pesada que compreenda uma seqüência daregião estrutural e regiões hipervariáveis, no qual a região estruturalcompreende a seqüência FR1-FR4 da SEQ ID No: 50, 51, 53 e 35, comoexibido na figura 8, o HVR H1 compreende a seqüência de aminoácidos SEQID No: 4; o HVR-H2 compreende a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 5; eo HVR-H3 compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada a partirdas SEQ ID Nos: 6-11. Em uma realização destes anticorpos, a HVR-H3compreende a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 9 ou 10. Em umarealização, um anticorpo anti-TAT226 contém um domínio variável de cadeialeve que compreende uma seqüência da região estrutural e regiõeshipervariáveis, no qual a região estrutural compreende a seqüências FR1-FR4da SEQ ID No:60, 61, 62 e 74, como exibido na Figuras 8, a HVR-L1compreende a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 12; o HVR-L2compreende a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 13; e os HVR-L3compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ IDNos: 14-19. Em uma realização destes anticorpos, a HVR-L3 compreende aseqüência de aminoácidos SEQ ID No: 17 ou 18.
Em alguns exemplos de realizações, a invenção fornece umanticorpo anti-TAT226 que contém um domínio variável de cadeia pesadacompreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 90%,91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%; 98%, ou 99% de similaridade naseqüência com a seqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ IDNos: 20-25. Em algumas realizações, uma seqüência de aminoácidos quetenha pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%de similaridade na seqüência contém substituições, inserções ou deleções comrelação à seqüência de referência, mas um anticorpo que compreende estaseqüência de aminoácido retém a capacidade de se ligar ao TAT226. Emalgumas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos,inseridos ou deletados da seqüência selecionada das SEQ ID Nos: 20-25. Emalgumas realizações, as substituições, inserções ou deleções ocorrem emregiões fora das HVRs (ou seja, nos FRs). Em algumas realizações, umanticorpo anti-TAT226 compreende um domínio variável de cadeia levecompreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQID No:20-25.
Em algumas realizações, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226 contendo um domínio variável de cadeia leve do anticorpohumanizado 4D5 (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., SãoFrancisco, CA, E.U.A.) (também referido na Patente US 6407213 e Lee et a/.,J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93), conforme ilustrado na SEQ ID No: 31abaixo.1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu SerAIa SerVal Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln AspVal Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly LysAla Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr SerGly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe AlaThr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tvr Thr Thr Pro Pro Thr PheGly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 108 (SEQ ID No:31)
(Os resíduos HVR estão sublinhados)
Em algumas realizações, a seqüência do domínio variável dacadeia leve do huMAb4D5-8 é modificada em uma ou mais das posições 30,66 e 91 (Asn, Arg e Seu como indicado acima em negrito / itálico,respectivamente). Em uma realização, a modificação da seqüência dehuMAb4D5-8 compreende em Ser na posição 30, Gly na posição 66 e / ou Serna posição 91. Sendo assim, em uma realização, um anticorpo da invençãocontem um domínio variável da cadeia leve que compreende a seqüênciailustrada na SEQ ID No: 26 abaixo:
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala SerVal Glv Asp Arg Val Thr Ile Thr Cvs Arq Ala Ser Gln Asp
Val Ser ThrAIaVaIAIa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly LysAla Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr SerGly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr AspPhe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe AlaThr Tyr Tyr Cys Gln Gln SerTvr Thr Thr Pro Pro Thr Phe
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 108 (SEQ IDNo:26)
(Os resíduos HVR estão sublinhados)Resíduos substituídos com relação ao huMAb4D5-8 estãoindicados acima em negrito/itálico.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226contendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma seqüênciade aminoácidos que tenha pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,97%; 98%, ou 99% a identidade na seqüência com a seqüência deaminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 26-31. Em algumasrealizações, uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade na seqüênciacontém substituições, adições ou deleções com relação à seqüência dereferência, mas um anticorpo que compreende esta seqüência de aminoácidoretém a capacidade de se ligar ao TAT226. Em algumas realizações, um totalde 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos ou deletados daseqüência selecionada das SEQ ID Nos: 26-31. Em algumas realizações, assubstituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora das HVRs (ouseja, nos FRs). Em algumas realizações, um anticorpo anti-TAT226compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo umaseqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 26-31.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226contendo (a) um domínio variável de cadeia leve compreendendo umaseqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%; 98% ou 99% de identidade na seqüência com a seqüência deaminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 20-25, e (b) um domíniovariável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos quetenha pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%; 98%, ou 99%a identidade na seqüência com a seqüência de aminoácidos selecionada apartir da SEQ ID No: 26-31. Em algumas realizações, uma seqüência deaminoácidos que tenha pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,97%, 98%, ou 99% de identidade na seqüência contém substituições, adiçõesou deleções com relação à seqüência de referência, mas um anticorpo quecompreende esta seqüência de aminoácido retém a capacidade de se ligar aoTAT226. Em algumas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foramsubstituídos, inseridos ou deletados da seqüência de referência. Em algumasrealizações, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões foradas HVRs (ou seja, nos FRs). Em algumas realizações, um anticorpo anti-TAT226 compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendouma seqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 20-25 eum domínio variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência deaminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 26-31.
Em algumas realizações, um anticorpo anti-TAT226 contém umaregião variável de cadeia pesada, compreendendo a seqüência deaminoácidos SEQ ID No: 20 e uma região variável de cadeia leve,compreendendo a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 26. Em algumasrealizações, o anticorpo anti-TAT226 contém uma região variável de cadeiapesada, com a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 21 e uma regiãovariável de cadeia leve com a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 26. Emalgumas realizações, o anticorpo anti-TAT226 contém uma região variável decadeia pesada, com a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 22 e uma regiãovariável de cadeia leve com a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 27. Emalgumas realizações, o anticorpo anti-TAT226 contém uma região variável decadeia pesada, com a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 23 e uma regiãovariável de cadeia leve com a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 28. Emalgumas realizações, o anticorpo anti-TAT226 contém uma região variável decadeia pesada, com a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 24 e uma regiãovariável de cadeia leve com a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 29. Emalgumas realizações, o anticorpo anti-TAT226 contém uma região variável decadeia pesada, com a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 25 e uma regiãovariável de cadeia leve com a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 30.
Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TAT226compreendendo (a) um, dois, três ou VH HVRs selecionadas entre asindicadas nas Figuras 2 e 4 e/ou (b) um, dois, três ou VL HVRs selecionadasentre as exibidas nas Figuras 3 e 4. Em um aspecto, a invenção fornece umanticorpo anti-TAT226 que contém um domínio variável de cadeia pesadaselecionado entre as exibidas nas Figuras 9 e 11 e um domínio variável decadeia leve selecionado entre as indicadas nas Figuras 10 e 12.
2. Fragmentos De Anticorpos
A presente invenção abrange fragmentos anticorpos. Fragmentosde anticorpos podem ser produzidos por meios tradicionais como ,por exemplo,digestão enzimática ou por técnicas recombinantes. Em determinadascircunstâncias há uma vantagem maior de se usar fragmentos de anticorpos aoinvés de anticorpos. O menor tamanho dos fragmentos permite rápida difusão,e pode conduzir melhor acesso aos tumores sólidos. Para uma revisão defragmentos de anticorpos, vide Hudson etal. (2003) Nat. Med. 9:129-134.
Foram desenvolvidas diversas técnicas para a produção defragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivadospor meio de digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide por exemplo,Morimoto et ai, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117(1992); e Brennan et ai, Science 229: 81 (1985)). Entretanto, essesfragmentos podem ser agora produzidos diretamente por células hospedeirasrecombinantes. Os fragmentos Fab, Fv e ScFv podem ser expressosdiretamente de E. coli e assim permitindo a produção de grandes quantidadesdestes fragmentos. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados, porexemplo, a partir das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima.Alternativamente, fragmentos Fab-SH podem ser recuperados diretamente deE. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et ai,Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem,fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes. Fragmentos Fab e F(ab')2 com maiormeia-vida in vivo que compreendem resíduos de epítopos de ligação dereceptores recuperados são descritos na patente US 5.869.046. Outrastécnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para ostécnicos no assunto. Em outras realizações, o anticorpo selecionado é umfragmento Fv de cadeia única (scFv). Vide documento WO 93/16185; aspatentes US 5.571.894; e US 5.587.458. Fv e sFv são as únicas espécies comsítios de combinação intactos que são desprovidas de regiões constantes; porisso, elas são apropriadas para reduzir ligações não-específicas durante autilização in vivo. Proteínas de fusão sFv podem ser construídas para gerar a fusão de uma proteína efetora no amino ou carbóxi terminal de um sFv. VideAntibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. O fragmento de anticorpo podetambém ser um "anticorpo linear", conforme descrito, por exemplo, na patenteUS 5.641.870. Ditos fragmentos de anticorpos lineares podem sermonoespecíficos ou biespecíficos.
3. Anticorpos Humanizados
A invenção abrange anticorpos humanizados. Vários métodos dehumanização de anticorpos não-humanos são conhecidos no estado datécnica. Por exemplo, um anticorpo humanizado contém um ou mais resíduosde aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que não é humana.Esses resíduos de aminoácidos não-humanos são muitas vezes denominadosresíduos "importados", que são tipicamente retirados de um domínio variável"importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se ométodo de Winter e colaboradores (Jones et ai, Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et ai, Science,239:1534-1536 (1988)), por meio de substituição de seqüências de regiõeshipervariáveis pelas seqüências correspondentes de anticorpo humano.Conseqüentemente, esses anticorpos "humanizados" são anticorposquiméricos (Patente US 4.816.567), em que substancialmente menos de umdomínio variável humano intacto tenha sido substituído pela seqüênciacorrespondente de uma espécie não-humana. Na prática, os anticorposhumanizados são tipicamente anticorpos humanos, em que alguns resíduos deregiões hipervariáveis e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídospor resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.
A seleção de domínios variáveis humanos, tanto leves quantopesados, a serem utilizados na fabricação dos anticorpos humanizados é muitoimportante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado métodode "melhor adequação" (best-fit), a seqüência do domínio variável de umanticorpo de roedor é selecionada em comparação com toda a biblioteca deseqüências de domínio variável humanas conhecida. A seqüência humana queé mais próxima da seqüência do roedor é então aceita como a região deestrutura humana para o anticorpo humanizado (Sims et ai, (1993) J.Immunol., 151: 2296; Chothia et ai, (1987) J. Moi Bioi, 196: 901). Outrométodo utiliza uma região estrutural específica derivada da seqüência deconsenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico decadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para váriosanticorpos humanizados diferentes (Carter et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sei.USA, 89: 4285; Presta etal., (1993) J. Immunoi, 151: 2623).
É adicionalmente importante que os anticorpos sejamhumanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outraspropriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo comum método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por meio deum processo de análise das seqüências parentais e diversos produtoshumanizados conceituais, utilizando modelos tridimensionais das seqüênciasparental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais sãocomumente disponíveis e familiares para os técnicos no assunto. Estãodisponíveis programas para computadores que ilustram e exibem prováveisestruturas de conformação tridimensional das seqüências de imunoglobulinascandidatas selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise dopapel provável dos resíduos no funcionamento da seqüência deimunoglobulina candidata, ou seja, a análise dos resíduos que influenciam acapacidade da imunoglobulina candidata de ligar o seu antígeno. Desta forma,os resíduos da FR podem ser selecionados e combinados a partir dasseqüências receptora e importada, de forma que seja atingida a característicadesejada do anticorpo, tal como maior afinidade para o(s) antígeno(s)desejado(s). Geralmente, os resíduos da região hipervariável são diretamentee mais substancialmente envolvidos na influência da ligação de antígenos.
4. Anticorpos Humanos
Anticorpos anti- TAT226 da invenção podem ser construídos pelacombinação da seqüência do domínio variável do clone Fv selecionado a partirde uma biblioteca de exposição por fagos com as seqüências conhecidas dodomínio constante humano, como descrito acima. Alternativamente, osanticorpos monoclonais anti- TAT226 humano podem ser preparados atravésdo método de hibridoma. Linhagens celulares de mieloma humano eheteromieloma humano/de camundongos para a produção de anticorposmonoclonais humanos foram descritas, por exemplo, por Kozbor, J. Immunol.1 33, 3001 (1984), e Brodeur et ai, Monoclonal Antibodv ProductionTechnigues and Applications, págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque,Estados Unidos, 1987) e Boerner et ai, J. Immunol., 147: 86 (1991).
É agora possível produzir animais transgênicos (por exemplo,camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir umrepertório de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulinaendógena. Descreveu-se, por exemplo, que a deleção homozigótica do geneda região de ligação de cadeia pesada de anticorpos (Jh) em camundongosquiméricos e mutantes de linhagem germinativa resulta na inibição completa daprodução de anticorpos endógenos. A transferência do conjunto de genes deimunoglobulina da linhagem germinativa humana nestes camundongos commutação da linhagem germinativa resultará na produção de anticorposhumanos mediante ao desafio com antígenos. Vide, por exemplo, Jakobovits etal, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 90, 2551-255 (1993); Jakobovits et ai, Nature,362: 255-258 (1993), Bruggermann et ai, Yearin Immunoi, 7: 33 (1993).
A alteração de genes pode também ser utilizada para derivaranticorpos a partir de não humano, por exemplo, anticorpos de roedores, emque o anticorpo humano possui afinidades e especificidades similares aoanticorpo não humano inicial. De acordo com este método, que também édenominado "impressão de epítopos", cada região variável de cadeia leve epesada do fragmento de anticorpo não humano obtido através da técnica deexibição por fago como descrito acima é substituído com um repertório degenes de domínio V humanos, criando scFv ou Fab quiméricos de cadeia não-humana/cadeia humana. A seleção com antígeno resulta no isolamento doscFv ou Fab quimérico cadeia não-humana/cadeia humana capaz de restaurarum sítio de ligação do antígeno destruído após a remoção da cadeia não-humana correspondente na exibição do clone no primeiro fago, ou seja, oepítopo governa (imprime) a escolha da cadeia humana parceira. Quando oprocesso for repetido, a fim de substituir a cadeia não-humana remanescente,um anticorpo humano é obtido (vide documento WO 93/06213, publicado em 1de abril de 1993). Ao contrário da humanização tradicional de anticorpos nãohumanos através de enxerto de CDR, esta técnica fornece anticorposcompletamente humanos, que não possuem resíduos de CDR ou FR deorigem não humana.
5. Anticorpos BiespecíficosOs anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais, quepossuem especificidades de ligação para pelo menos dois antígenosdiferentes. Em exemplos de realização os anticorpos biespecíficos sãoanticorpos humanos ou humanizados. Em certos exemplos de realização, umadas especificidades de ligação é para TAT226 e a outra é para qualquer outroantígeno. Em um exemplo de realização, o anticorpo biespecífico pode se ligara dois epítopos diferentes de TAT226. Anticorpos biespecíficos também podeser usados para localizar agentes citotóxicos para células que expressamTAT226. Estes anticorpos possuem um braço de ligação ao TAT226 e umbraço que se liga ao agente citotóxico (por exemplo, saporina, anti-interferon-a,alcalóides da vinca, cadeia da rícina A, metotrexato ou isótopo radioativohapteno).Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos decomprimento total ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpo F(ab')2biespecífico).
Os métodos para a produção de anticorpos biespecíficos sãoconhecidos no estado da técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos é baseada na co-expressão de dois pares decadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeiaspesadas possuem especificidades diferentes (Milstein e Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). Devido à seleção aleatória de cadeias leve e pesada deimunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma misturapotencial de 10 moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas umapossui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, quenormalmente é realizada através de etapas de cromatografia de afinidade, éum tanto problemática e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentossimilares estão descritos no documento WO 93/08829 publicado em 13 demaio de 1993 e em Traunecker et aí., EMBO J. 10, 3655-2659 (1991).
De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis deanticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinaçãode antígeno e anticorpo) são fundidos a seqüências de domínios constantes deimunoglobulina. A fusão ocorre preferencialmente com um domínio constantede cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte dasregiões de articulação, CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constantede cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para ligação de cadeialeve presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam asfusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve deimunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são co-transfectados em um organismo hospedeiro apropriado. Isso proporcionagrande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos depolipeptídeos em realizações quando razões desiguais das três cadeias depolipeptídeos utilizadas na construção fornecem os rendimentos ideais. Épossível, entretanto, inserir as seqüências de codificação para duas ou todasas três cadeias de polipeptídeos em um vetor de expressão quando aexpressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeos em razões iguaisresultar em altos rendimentos ou quando os valores não foram de significânciaespecífica.
Em uma realização preferida da presente abordagem, osanticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada deimunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em umbraço, e um par de cadeias leve e pesada da imunoglobulina híbrida (quefornece uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Descobriu-seque essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecíficodesejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, pois apresença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade damolécula biespecífica fornece uma forma fácil de separação. Esta abordagemestá descrita no documento WO 94/04690. Para saber mais detalhes sobre aprodução de anticorpos biespecificos vide, por exemplo, Suresh et ai, Methodsin Enzymology, 121:210(1986).
De acordo com outra abordagem, a interface entre um par demoléculas de anticorpos pode ser construída de forma a maximizar opercentual de heterodímeros que é recuperado da cultura celularrecombinante. A interface preferida compreende pelo menos uma parte dodomínio CH3 de um domínio constante de anticorpo. Neste método, uma oumais cadeias laterais pequenas de aminoácidos da superfície intermediária daprimeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores(tais como tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanhoidêntico ou similares à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas sobre ainterface da segunda molécula de anticorpo, por meio da substituição degrandes cadeias laterais de aminoácidos com cadeias menores (tais comoalanina ou treonina). Isso proporciona um mecanismo de aumento norendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados, taiscomo homodímeros.
Os anticorpos biespecificos incluem anticorpos reticulados ou"heteroconjugados". Um dos anticorpos no heteroconjugado pode seracoplado, por exemplo, a avidina e o outro a biotina. Esses anticorpos forampropostos, por exemplo, para dirigir células do sistema imune a célulasindesejadas (Patente US 4.676.980) e para o tratamento de infecções por HIV(documentos WO 91/00360, WO 92/200373 e Patente EP 03.089). Anticorposheteroconjugados podem ser fabricados utilizando qualquer método reticulanteconveniente. Agentes reticulantes apropriados são bem conhecidos na técnicae são descritos na Patente US 4.676.980 juntamente com uma série detécnicas reticulantes.
Técnicas para produção de anticorpos biespecíficos a partir defragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Anticorposbiespecíficos podem ser preparados, por exemplo, utilizando ligaçõesquímicas. Brennan et ai, Science, 229: 81 (1985) descrevem um procedimentoem que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerarfragmentos F(ab')2- Estes fragmentos são reduzidos na presença do agentearsenito de sódio formador de complexo de ditiol para estabilizar ditióisvizinhos e evitar a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab'gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Umdos derivados de Fab'-TNB é então novamente convertido em Fab'-tiol pormeio de redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidadeeqüimolar do outro derivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico.Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizados como agentespara a imobilização seletiva de enzimas.
Progressos recentes possibilitaram a recuperação direta dosfragmentos Fab'-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente paraformar anticorpos biespecíficos. Shalaby et ai, J. Exp. Med., 175: 217-225(1992) descrevem a produção de uma molécula F(ab')2 de anticorpobiespecífico totalmente humanizado. Cada fragmento Fab' foi secretado da E.coli separadamente e submetido ao acoplamento químico dirigido in vitro paraformar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foicapaz de ligar-se a células que superexpressam o receptor HER2 e células Thumanas normais, bem como iniciar a atividade lítica de linfócitos citotóxicoshumanos contra alvos de tumor de mama humano.
Diversas técnicas de produção e isolamento de fragmentos deanticorpos biespecíficos diretamente a partir de cultura de célulasrecombinante também foram descritas. Anticorpos biespecíficos foramproduzidos, por exemplo, utilizando zíperes de leucina. Kostelny et ai, J.Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Os peptídeos de zíper de leucina dasproteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorposdiferentes por meio de fusão gênica. Os homodímeros de anticorpos foramreduzidos na região de articulação para formar monômeros e, em seguida,novamente oxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. Este métodopode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpos. Atecnologia de "diacorpo" descrita por Hollinger et ai, Proc. Nati Acad. Sei.USA, 90: 6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para afabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentoscompreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a umdomínio variável de cadeia leve (VL) por um Iigante que é curto demais parapermitir o emparelhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia.Conseqüentemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados aemparelhar-se com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento,de maneira a formar dois sítios de ligação de antígenos. Outra estratégia defabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos utilizando dímeros Fv decadeia simples (sFv) também foi relatada. Vide Gruber et ai, J. Immunoi, 152:5368 (1994).
São contemplados anticorpos com mais de duas valências.Podem ser preparados, por exemplo, anticorpos triespecíficos. Tutt et ai, J.Immunoi 147: 60 (1991).
6. Anticorpos Multivalentes
Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/oucatabolizado) mais rapidamente que um anticorpo bivalente por uma célula queexpresse um antígeno ao quais os anticorpos sé ligam. Os anticorpos deacordo com a presente invenção podem ser anticorpos multivalentes (que sãodiferentes dos da classe IgM) com três ou mais sítios de ligação de antígenos(por exemplo, anticorpos tetravalentes), que podem ser facilmente produzidosatravés da expressão recombinante de ácido nucléico que codifica cadeias depolipeptídeo do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender umdomínio de dimerização e três ou mais sítios de ligação de antígeno. Odomínio de dimerização preferido compreende (ou consiste de) uma região Fcou uma região de articulação. Nessas condições, o anticorpo compreenderáuma região Fc e três ou mais sítios de ligação de antígenos amino-terminaispara a região Fe. O anticorpo multivalente preferido do presente compreende(ou consiste de) três a cerca de oito sítios de ligação de antígenos. O anticorpomultivalente compreende pelo menos uma cadeia polipeptídica (por exemplo,duas cadeias polipeptídicas), em que a(s) cadeia(s) polipeptídica(s)compreende(m) dois ou mais domínios variáveis. A(s) cadeia(s) polipeptídica(s)pode(m) compreender, por exemplo, VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, em que VD1 éum primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é umacadeia polipeptídica de uma região Fc, X1 e X2 representam um aminoácidoou polipeptídeo e η é 0 ou 1. A(s) cadeia(s) polipeptídica(s) pode(m)compreender, por exemplo: cadeia VH-CH1-ligação flexível -VH-CH1-regiãoFc; ou cadeia VH-CH1-VH-CH1-região Fe. O anticorpo multivalente dapresente invenção compreende adicionalmente de pelo menos 2 (por exemplo,4) polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. O anticorpo multivalenteda presente invenção pode compreender, por exemplo, cerca de dois a cercade oito polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. Os polipeptídeos dedomínio variável de cadeia leve, contemplados na presente invenção,compreendem um domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente, umdomínio CL.
7. Anticorpos de Domínios Únicos
Em alguns exemplos de realização, um anticorpo da invenção éum anticorpo de domínio único. Um anticorpo de domínio único é umpolipeptídeo de cadeia única compreendendo toda ou uma parte do domíniovariável da cadeia pesada ou a totalidade ou parte do domínio variável dacadeia leve de um anticorpo. Em certas realizações, um anticorpo de domínioúnico é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA;vide, por exemplo, Patente US 6248516 B1). Em um exemplo de realização,um anticorpo de domínio único é constituído da totalidade ou de parte dodomínio variável de cadeia pesada de um anticorpo.
8. Anticorpos Variantes
Em alguns exemplos, é(são) contemplada(s) modificação(ões)na(s) seqüência(s) de aminoácido(s) dos anticorpos aqui descritos. Porexemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outraspropriedades biológicas do anticorpo. Variantes da seqüência de aminoácidodo anticorpo são preparados pela introdução de nucleotídeos adequadosmodificando o ácido nucléico do anticorpo, ou pela síntese de peptídeo. Taisalterações incluem, por exemplo, supressão, e/ou inserção e/ou substituição,de resíduos dentro das seqüências de aminoácido do anticorpo. Qualquercombinação de deleção, inserção ou substituição podem ser feitas para sechegar a construção final, desde que o produto final tenha as característicasdesejadas. As alterações nos aminoácidos podem ser introduzidas noanticorpo no momento em que seqüência é feita.
Um método útil para a identificação de certos resíduos ou regiõesdo anticorpo que são locais preferidos para mutagênese é denominado"mutagênese de varredura de alanina", conforme descrito por Cunningham eWells, Science, 244: 1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduosalvo é identificado (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his,Iys e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado(de maior preferência alanina ou polialanina) para afetar a interação dosaminoácidos com antígeno. Esses locais de aminoácidos que demonstramsensibilidade funcional às substituições são refinados em seguida pelaintrodução de outras variantes ou variantes adicionais nos sítios desubstituição ou para estes. Desta forma, embora o sítio para introdução deuma variação de seqüência de aminoácidos seja previamente determinado, anatureza intrínseca da mutação per se necessita ser previamente determinada.Para analisar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, por exemplo,varredura de ala ou mutagênese aleatória é conduzida no códon ou região alvoe as variantes de antagonistas expressas são selecionadas para a atividadedesejada.
As inserções de seqüências de aminoácidos incluem fusões decarbóxi e/ou amino-terminal que variam de comprimento de um resíduo atépolipeptídeos que contenham cem ou mais resíduos, bem como inserçõesintra-seqüenciais de resíduos de aminoácidos isolados ou múltiplos. Exemplosde inserções terminais incluem um antagonista com um resíduo de metionila N-terminal ou o anticorpo fundido a um polipeptídeo citotóxico. Outras variantesde inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N- ou C-terminal doanticorpo (por exemplo, para o ADEPT) de uma enzima ou um polipeptídeoque aumente a meia vida do anticorpo no soro.
Em certos realizações, um anticorpo da invenção é modificadopara aumentar ou diminuir a extensão a medida em que o anticorpo églicosilado. A glicosilação de polipeptídeos é tipicamente tanto N-Iigada quantoO-ligada. N-Iigada refere-se à ligação da unidade de carboidrato à cadeialateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeosasparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácidoexceto prolina, são as seqüências de reconhecimento para a ligaçãoenzimática da unidade de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Destaforma, a presença de qualquer destas seqüências de tripeptídeos nopolipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial. A glicosilação O-Iigadarefere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ouxilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser utilizados.
A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é acompanhada,5 de forma conveniente, pela alteração da seqüência de aminoácido de forma aseqüência conter uma ou mais das seqüências de tripeptídeos descritas acima(para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração pode também ser feitaatravés da adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina outreonina à seqüência do anticorpo ou polipeptídeo original (para sítios de10 glicosilação O-ligados).
Quando o anticorpo compreende uma região Fc, os carboidratosligados a estes podem ser alterados. Por exemplo, anticorpos com umaestrutura de carboidratos maduros que carecem de fucose anexada a umaregião Fc do anticorpo são descritos no Pedido de Patente US 2003/015710815 (Presta, L.). Vide também US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd).Anticorpos com uma N-acetilglucosamina cortada (GIcNAc) nos carboidratosassociados a uma região Fc do anticorpo são referenciados no documento WO2003/011878, Jean-Mairet et al. e Patente US 6.602.684, Umana et al.Anticorpos com pelo menos um resíduo galactose no oligossacarídeo anexado20 a uma região Fc do anticorpos está descrito no documento WO 1997/30087,Patel et al. Vide também, o documento WO 1998/58964 (Raju, S.) e WO1999/22764 (Raju, S.), relativo a anticorpos com alterações nos carboidratosassociadas à região Fe. Vide também US 2005/0123546 (Umana et al.) emmoléculas ligadas a antígenos com glicosilação modificada.25 Em certas realizações, a glicosilação variante compreende
em uma região Fc1 onde uma estrutura de carboidrato associada à regiãoFc carece de fucose. Tais variantes resultam em uma melhor funçãoADCC. Opcionalmente, a região Fc inclui ainda um ou mais substituiçõesaminoácidos que melhoram ainda mais a função ADCC1 por exemplo,substituições nas posições 298, 333, e/ou 334 da região Fc (numeraçãode resíduos Eu). Exemplos de publicações relacionadas com anticorpos"defucosilados" ou "com deficiência de fucose" incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704;US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; W02005/053742;Okazaki et al. J. MoL Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al.Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens celulares queproduzem anticorpos defucosilados incluem células Lecl3 CHO deficientena fucosilação de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Pedido de Patente US 2003/0157108 A1, Presta, L; edocumento WO 2004/056312 A1, Adams et al., Especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares knockout, tais como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO knockout (Yamane-Ohnuki et al.Biotech. Bioeng. 87 : 614 (2004)).
Outro tipo de variante é uma variante de substituição deaminoácidos. Estas variantes contêm pelo menos um resíduo de aminoácido20 na molécula de anticorpo substituída por um resíduo diferente. Os sítios demaior interesse para mutagênese de substituição incluem as regiõeshipervariáveis, mas também são contempladas alterações de FR. Substituiçõesconservadoras são exibidas na Tabela 1 sob o título de "substituiçõespreferidas". Caso essas substituições resultem em mudança da atividade biológica, então mudanças mais substanciais, denominadas "exemplos desubstituições" na Tabela 1, ou conforme descrito adicionalmente abaixo comreferência a classes de aminoácidos podem ser introduzidas e os produtos sãoselecionados.Tabela 1
<table>table see original document page 96</column></row><table>Modificações substanciais das propriedades biológicas doanticorpo são atingidas por meio da seleção de substituições que diferemsignificativamente no seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura da cadeiaprincipal de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, na forma defolha ou em conformação helicoidal; (b) da carga ou hidrofobicidade damolécula no sítio desejado; ou (c) do volume da cadeia lateral. Os aminoácidospodem ser agrupados de acordo com similaridades nas propriedades de suascadeias laterais (em A. L. Lehninger, em Biochemistry, segunda Ed., pp. 73-75,Worth Publishers, Nova Iorque (1975)):
(1) Apolares: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp(W)1 Met (M)
(2) Sem carga polar: Gly (G), Ser (S)1 Thr (T)1 Cys (C)1 Tyr (Y),Asn (N)1 Gln (Q)
(3) Ácido: Asp (D), Glu (E)
(4) Básico: Lys (K), Arg (R), His(H)
Alternativamente, os resíduos de ocorrência natural podem serdivididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral:
(1) Hidrofílicos: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie;
(2) Hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) Ácido: Asp1 Glu;
(4) Básico: His1 Lys, Arg;
(5) Resíduos que influenciam na orientação das cadeias: Gly, Pro;
(6) Aromático: Trp, Tyr, Phe.
Substituições não-conservadoras causarão a substituição de ummembro de uma dessas classes por outra classe. Tais resíduos substituídostambém podem ser introduzidos nos locais conservados da substituição ou,mais preferivelmente, nos locais (não-conservados) restantes.
Um tipo particularmente preferido de variante de substituiçãoenvolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de umanticorpo parental (por exemplo, anticorpo humano e humanizado).Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para desenvolvimentoadicional terá(ão) propriedades biológicas modificadas (por exemplo,aprimoradas) com relação ao anticorpo parental do qual é(são) gerado(s).Resumidamente, diversos sítios de regiões hipervariáveis (por exemplo, 6 a 7sítios) sofrem mutações para gerar todas as substituições amino possíveis emcada sítio. Os anticorpos assim gerados são exibidos a partir de partículas defagos filamentosos fundidos a pelo menos uma parte da proteína da cápsidedo fago (por exemplo, o produto do gene Ill de M13). As variantes exibidas porfago são, então, selecionadas de acordo com a sua atividade biológica (porexemplo, afinidade de ligação) conforme descrita na presente invenção. A fimde identificar possíveis sítios de regiões hipervariáveis para modificação,mutagênese por varredura (por exemplo, varredura de alanina) pode serrealizada para identificar resíduos de regiões hipervariáveis que contribuemsignificativamente para a ligação de antígenos. Alternativamente ouadicionalmente, pode ser benéfico analisar a estrutura cristalina do complexoantígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e oantígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos àsubstituição de acordo com as técnicas conhecidas no estado da arte,incluindo aquelas elaboradas no presente. Uma vez que tais variantes sãoproduzidos, o painel de variantes é submetido à seleção utilizando técnicasconhecidas no estado da arte, incluindo aquelas descritas no presente, e osanticorpos com propriedades superiores em um ou mais testes relevantespodem ser selecionados para desenvolvimento adicional.
Moléculas de ácidos nucléicos que codificam variantes daseqüência de aminoácidos do anticorpo são preparadas por meio de uma sériede métodos conhecidos no estado da técnica. Estes métodos incluem, masnão se limitam a, o isolamento a partir de uma fonte natural (no caso devariantes de seqüências de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparaçãopor meio de mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio-dirigida),mutagênese por PCR e cassete de mutagênese de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não-variante do anticorpo.
Pode ser desejável introduzir uma ou mais modificações deaminoácidos em uma região Fc do anticorpo da invenção, gerando assim umaregião Fc variante. A região Fc variante humana pode compreender umaseqüência da região Fc (por exemplo, seqüência da região Fc da lgG1, lgG2,lgG3 ou lgG4) que inclui uma modificação de aminoácido (por exemplo, umasubstituição) em um ou mais posições de aminoácidos incluindo o de umadobradiça de cisteína.
De acordo com esta descrição e os ensinamentos no estado datécnica, contempla-se em alguns exemplos de realização, que um anticorpo dainvenção pode constar de uma ou mais alterações em comparação com oanticorpo homólogo do tipo selvagem, por exemplo, na região Fc. Estesanticorpos, porém, mantém sensivelmente as mesmas características exigidaspara a utilidade terapêutica, comparativamente ao seu homólogo do tiposelvagem. Por exemplo, podem ser feitas algumas alterações na região Fc,que alteraram (isto é, ou melhoram ou diminuem) a ligação ao C1q e/ou acitotoxicidade dependente do complemento (CDC), por exemplo, como descritono documento W099/51642. Vide também Duncan e Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente US 5648260; Patente US. 5624821, e documentoW094/29351 relativas a outros exemplos de região Fc variantes. O documento WO00/42072 (Presta) e WO 2004/056312 (Lowman) descrevem variantes deanticorpos com ligação ao FcRs melhorada ou diminuída. O conteúdo dessaspublicações de patentes são especificamente incorporadas ao presente pelareferência. Vide, também, Shields et ai J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).Anticorpos com a meia vida aumentada e ligação ao receptor Fc neonatal(FcRn) melhorada, que é responsável pela transferência de IgGs matenos parao feto (Guyer et ai, J. Immunoi 117:587 (1976) e Kim et ai , J. Immunoi24:249 (1994)), são descritos na Patente US 2005/0014934A1 (Hinton et ai).
5 Estes anticorpos Fc constam de uma região com uma ou mais substituiçõesque melhoram a ligação da região Fc ao FcRn. Variantes de polipeptídeos coma seqüências de aminoácidos da região Fc alteradas e capacidade de ligaçãoao C1q aumentada ou diminuída são descritos na Patente US 6194551B1,documento W099/51642. O conteúdo dessas publicações de patentes está10 especificamente incorporada ao presente pela referência. Vide, também,Idusogie et al. J. Immunoi 164: 4178-4184 (2000).
Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos possuemmodificações na interface dos polipeptídeos Fc que compreendem a região Fc,onde as modificações facilitam e/ou promovem a heterodimerização. Estas15 alterações incluem a introdução de uma protuberância em um primeiropolipeptídeo Fc e uma cavidade em um segundo polipeptídeo de Fc1 onde aprotuberância é posicionada na cavidade de modo a promover o complexoentre o primeiro e segundo polipeptídeo de Fe. Métodos para produção deanticorpos com estas modificações são conhecidas no estado da técnica, por20 exemplo, como descrito na Patente US 5.731.168.
9. Anticorpos DerivativosOs anticorpos da invenção podem ainda ser modificados paraconter moléculas adicionais não-proteinácias que são conhecidos na técnica eprontamente disponíveis. Moléculas preferenciais adequadas para25 derivatização do anticorpo são polímeros hidrossolúveis. Exemplos nãoIimitantes de polímeros hidrossolúveis incluem, mas não se limitando a,polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etileno-glicol/propilenoglicol,carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, policloreto pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero etileno/maleica anidrido,poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona) polietileno-glicol, homopolímeros de propropileno glicol, co-polímeros de oxido de prolipropileno oxido de etileno, poliálcool polióis (por5 exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e suas misturas. O polietilenoglicolpropionaldeído pode ter vantagens no processo de fabricação devido à suaestabilidade na água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e podeser ramificada ou sem ramificação. O número de polímeros acoplados poranticorpo pode variar, e se mais de um polímero encontra-se anexo, os10 polímeros podem ser a mesma molécula ou moléculas diferentes. Em geral, onúmero e/ou tipo de polímeros utilizado para derivatização pode serdeterminado com base em considerações, incluindo, mas não se limitado a,propriedades específicas ou funções do anticorpo de ser melhorado, se osanticorpos derivados serão utilizados no âmbito de uma terapia, etc.15 Em outro exemplo de realização, são fornecidos conjugados de
anticorpo e fração não-proteinácia que podem ser seletivamente aquecida porexposição à radiação. Em um exemplo de realização, o grupamento não-proteinácio é um nanotubo de carbono (Kam et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. 102:11600-11605 (2005)). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda,20 e inclui, mas não se limita a, comprimento de ondas que não prejudicamcélulas normais, mas que aquece o grupamento não-proteinácio a umatemperatura no qual as células próximas ao conjugado anticorpo-agrupamentonão-proteinácio são mortas.
B. métodos de Produção de Anticorpos25 1. Métodos Baseados em Hibridomas
Os anticorpos monoclonais anti-TAT226 da invenção pode serproduzidos utilizando o método de hibridoma descrito primeiramente por Kohleret ai, Nature, 256:495 (1975), ou pode ser produzido por métodos de DNArecombinante (Patente US 4.816.567).
No método do hibridoma, um camundongo ou outro animalhospedeiro adequado, tal como um hamster, é imunizado para suscitarlinfócitos que produzem ou que são capazes de produzir anticorpos que se5 ligam especificamente à proteína utilizada na imunização. Os anticorpos anti-TAT226 são preferencialmente elevados em animais por meio de múltiplasinjeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) de TAT226 e um adjuvante.O TAT226 pode ser preparado usando métodos bem conhecidos na arte,alguns dos quais estão adicionalmente descritos no presente. Por exemplo, a10 produção de TAT226 recombinante está adicionalmente descrita abaixo. Emum exemplo de realização, os animais são imunizados com um derivado deTAT226 que contém o domínio extracelular (DCE) do TAT226 fundidos naporção Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Em um exemplo derealização preferida, os animais são imunizados com uma proteína de fusão15 TAT226-lgG1. Os animais normalmente são imunizados com derivativosimunogênicos de TAT226 em uma solução com monofosforil lipídico A(MPL)/trealose dicrinomicolato (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc.,Hamilton, MT) e a solução é injetada intradermicamente em vários locais. Apósduas semanas os animais são estimulados. Após 7 a 14 dias os animais são20 sangrados e é analisado o título de anti- TAT226 no soro. Os animais sãoestimulados até título platô.
Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro.Linfócitos são então fundidos com células de mieloma usando um agente defusão adequado, tal como o polietileno-glicol, de modo a formar uma célula de25 hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, págs.59-103 (Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma assim preparadas podem ser semeadase cultivadas em um meio de cultura apropriado que contém, preferencialmente,uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência dascélulas de mieloma parentais não-fundidas. Por exemplo, se as células demieloma parentais não contenham a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para oshibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meioHAT), substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência emHGPRT.
Em alguns exemplos de realização, células de mieloma sãoaquelas que se fundem eficientemente, suportam a produção estável em altonível de anticorpos pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e sãosensíveis a um meio, assim como o meio HAT. Células exemplares de célulasincluem, mas não se limitam a; linhagens de mieloma murino, tais como asderivadas de tumores de camundongos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis peloSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, Estados Unidos,células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis a pelo American Type CultureCollection, Rockville, Maryland USA. Linhagens celulares de mieloma humanoe heteromieloma humano/camundongo também foram descritas para aprodução de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001(1984); e Brodeur et ai, Monoclonal Antibody Production Technipues andApplications, págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)).
O meio de cultura em que são cultivadas células de hibridoma étestado para determinar a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contrao antígeno. Preferencialmente, a especificidade de ligação de anticorposmonoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada através deimunoprecipitação ou de um ensaio de ligação in vitro, tais comoradioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoenzimático (ELISA). A afinidade deligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pelaanálise de Scatchard e Munson et ai, Anal. Biochem., 107:220 (1980).Após a identificação de células de hibridoma que produzemanticorpos de especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clonespodem ser subclonados através da limitação de procedimentos de diluição ecultivados através de métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies:Principies and Practice, págs.59-103 (Academic Press, 1986)). Meios decultura apropriados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ouRPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivona forma de tumores ascíticos em animais. Os anticorpos monoclonaissecretados pelos sub-clones são apropriadamente separados do meio decultura, liquido ascítico ou soro por meio de procedimentos convencionais depurificação de imunoglobulina, tais como, por exemplo, proteína A-Sefarose,cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografiapor afinidade.
2. Métodos de Seleção de Bibliotecas
Anticorpos anti-TAT226 da invenção podem ser produzidosutilizando bibliotecas combinatórias para selecionar anticorpos com a atividadeou atividades desejada. Por exemplo, uma variedade de métodos é conhecidano estado arte para a produção de bibliotecas de exibição por fago e a seleçãotais bibliotecas para anticorpos que possuam as características de ligaçãodesejadas. Esses métodos estão descritos, em geral, em Hoogenboom et ai(2001) Methods in Molecular Bioloav 178:1-37 (0'Brien et ai, Ed., HumanPress, Totowa, NJ), e, em certos exemplos de realização, em Lee et ai (2004)J. Mol. Bioi 340:1073-1093.
Em princípio, os clones sintéticos de anticorpos são selecionadospela triagem de bibliotecas de fago contendo fagos que exibem váriosfragmentos da região variável de anticorpos (Fv) fundidos na proteína dacápside do fago. Essas bibliotecas de fago são testadas por cromatografia deafinidade contra o antígeno desejado. Clones expressando fragmentos Fvcapazes de se ligar ao antígeno desejado são absorvidos pelo antígeno e,assim, separados dos clones que não se ligam na biblioteca. Os clones que seligam são então eluídos do antígeno e podem ainda ser enriquecidos por ciclosadicionais de adsorção/eluição de antígenos. Qualquer um dos anticorpos anti-TAT226 da invenção pode ser obtido pela concepção de um procedimento deseleção adequado para selecionar o clone do fago de interesse seguido pelaconstrução de um anticorpo anti-TAT226 de comprimento total usando asseqüências Fv a partir do clone de fago de interesse e a seqüência adequadada região constante (FC) descrita em Kabat et al., Seguences of Proteins ofImmunoloqical Interest quinta edição, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD(1991), vols. 1-3.
Em certos exemplos de ligação, o domínio de ligação de antígenode um anticorpo é formado por duas regiões variáveis (V) de cerca de 110aminoácidos, selecionados, cada um, de cadeias leve (VL) e pesada (VH), queapresentam, ambos, três alças hipervariáveis (HVRs) ou regiões determinantesde complementaridade (CDRs). Os domínios variáveis podem ser exibidosfuncionalmente no fago, tanto como fragmentos Fv de cadeia simples (scFv),em que VH e VL são covalentemente ligados por meio de um peptídeo flexívele curto, quanto como fragmentos Fab, em que são, cada um, fundidos a umdomínio constante, e interagem de forma não-covalente, conforme descrito emWinter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Da forma utilizada nopresente, clones fagos que codificam scFv e clones fagos que codificam Fabsão coletivamente referenciados como "clones fagos Fv" ou "clones Fv".
Repertórios de genes VH e VL podem ser clonadosseparadamente por meio de reação em cadeia da polimerase (PCR) erecombinados de forma aleatória em bibliotecas de fagos, que podem entãoser localizados como clones de ligação de antígeno, conforme descrito emWinter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Bibliotecas de fontesimunizadas fornecem anticorpos de alta afinidade para o imunógeno, sem anecessidade de construção de hibridomas. Alternativamente, o repertório inicial(naive) pode ser clonado para fornecer uma única fonte de anticorposhumanos, para uma faixa ampla de antígenos não-próprios (non-self) etambém próprios (se//), sem qualquer imunização, conforme descrito porGriffiths et ai, EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, bibliotecas iniciais(naive) podem também ser produzidas sinteticamente por meio de clonagemde segmentos de gene V não rearranjados a partir de células tronco, eutilizando primers de PCR que contém seqüência aleatória para codificar asregiões CDR3 altamente variáveis e para realizar o rearranjo in vitro, conformedescrito por Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).
Em certos exemplos de realização, fagos filamentosos sãoutilizados para exibir fragmentos de anticorpos pela fusão com a proteína derevestimento menor plll. Os fragmentos de anticorpos podem ser exibidoscomo fragmentos Fv de cadeia simples, em que os domínios VH e VL sãoconectados na mesma cadeia polipeptídica por um espaçador de polipeptídeoflexível, tal como descrito por Marks et ai, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991),ou como fragmentos Fab, em que uma cadeia é fundida a plll e a outra ésecretada no periplasma de células hospedeiras bacterianas, onde ocorre ajunção de uma estrutura de proteína de revestimento-Fab exibida na superfíciedo fago através da exibição de algumas proteínas de revestimento do tiposelvagem, conforme descrito em Hoogenboom et ai, Nucl. Acids Res., 19:4133-4137 (1991).
Em geral, ácidos nucléicos que codificam fragmento gênico doanticorpo são obtidos a partir de células imunes coletadas de humanos eanimais. Se uma biblioteca influenciada a favor de clones anti-TAT226, sedesejado, o sujeito é imunizado com TAT226 para gerar uma resposta aoanticorpo, e células do baço e/ou células B circundante ou outros linfócitos dosangue periférico (PBLs) são recuperadas da construção da biblioteca. Emuma realização, uma biblioteca de fragmento de gene de anticorpo humano,influenciada a favor de clones anti- TAT226 humano é obtida pela geração derespostas de anticorpos anti- TAT226 humano em camundongos transgênicosque contêm um arranjo gênico de imunoglobulina humana funcional (ecarecem de um sistema de produção de anticorpo endógeno funcional), tal quea imunização a TAT226 leva as células B à produção de anticorpos humanoscontra TAT226. A geração de camundongos transgênicos que produzemanticorpos humanos está descrita abaixo.
Enriquecimento adicional para populações de células reativasanti- TAT226 pode ser obtida pelo uso de um procedimento de seleçãoapropriado, para isolar células B que expressam anticorpo de ligação demembrana específica de TAT226, tal como pela separação celular comcromatografia por afinidade de TAT226 ou adsorção de células em TAT226marcado com fluorocromo, seguida pela seleção das células ativadas pelafluorescência (FACS).
Alternativamente, o uso de células do baço e/ou células B ououtras PBLs de um doador não-imunizado fornece uma melhor representaçãodo repertório de anticorpo possível, e também permite a construção de umabiblioteca de anticorpo pelo uso de qualquer espécie animal (humana ou não-humana) em que TAT226 não é antigênico. Para bibliotecas que incorporamconstrução gênica de anticorpo in vitro, as células tronco são coletadas dosujeito para fornecer ácidos nucléicos que codificam segmentos gênicos deanticorpo não rearranjados. As células imunes de interesse podem ser obtidasde uma série de espécies animais, tal como humano, camundongo, rato,lagomorfos, luprinos, caninos, felinos, porcos, bovinos e espécies de aves.
Ácidos nucléicos que codificam segmentos gênicos variáveis deanticorpos (incluindo segmentos VH e VL) são recuperados de células deinteresse e amplificados. No caso de bibliotecas gênicas VH e VL rearranjadas,o DNA desejado pode ser obtido pelo isolamento de DNA genômico ou mRNAde linfócitos, seguido pela reação em cadeia da polimerase (PCR) com primersque reconhecem as extremidades 5' e 3' de genes VH e VL rearranjados ,conforme descrito em Orlandi et ai, Proc. Nati Acad. Sei. (USA), 86: 3833-3837 (1989), produzindo, desta forma, repertories diversos de gene V paraexpressão. Os genes V podem ser amplificados de cDNA e DNA genômico,com primers reversos na extremidade 5' do exon que codifica o domínio Vmaduro, e primers diretos com base no segmento J, conforme descrito em Orlandi et al. (1989) e em Ward et ai, Nature, 341: 544-546 (1989). Entretanto,para a amplificação de cDNA, primers reversos podem também ser baseadosno exon líder, conforme descrito por Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991),e primers diretos na região constante, conforme descrito em Sastry et ai, Proc.Natl. Acad. Sei. (USA), 86: 5728-5732 (1989). Para maximizar a complementaridade, degeneração pode ser incorporada nos primers, conformedescrito em Orlandi et al. (1989) ou Sastry et al. (1989). Em algumasrealizações, a diversidade da biblioteca é maximizada pelo uso de primers dePCR alvos para cada família de gene V, para amplificar todos os arranjos VH eVL disponíveis presentes na amostra de ácido nucléico de células imunes, porexemplo, conforme descrito no método de Marks et ai, J. Mol. Bioi, 222: 581-597 (1991), ou conforme descrito no método de Orum et ai, Nucleic AcidsRes., 21: 4491-4498 (1993). Para a clonagem do DNA amplificado em vetoresde expressão, sítios de restrição raros podem ser introduzidos no primer dePCR como uma marca em uma extremidade, conforme descrito em Orlandi etai (1989), ou pela amplificação por PCR adicional com um primer marcado,conforme descrito em Clackson et ai, Nature, 352: 624-628 (1991).
Repertórios de genes V rearranjados sinteticamente podem serderivados in vitro de segmentos de gene V. A maior parte dos segmentos degene VH humanos pode ser clonada e seqüenciada (relatada em Tomlinson etai, J. Moi Biol., 227: 776-798 (1992)), e mapeada (relatado em Matsuda et al.,Nature Genet., 3: 88-94 (1993); estes segmentos clonados (incluindo todas asconformações principais da alça H1 e H2) podem ser utilizados para gerardiversos repertórios de gene VH com primers de PCR que codificam alças H3de diversas seqüências e comprimentos, conforme descrito em Hoogenboom eWinter1 J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Repertórios de VH podem tambémser produzidos com toda a diversidade de seqüência, focada em uma alça(Ioop) H3 longa de um único comprimento , conforme descrito em Barbas et al.,Proc. Nati Acad. Sei. USA, 89: 4457-4461 (1992). Segmentos Vk e VAhumanos foram clonados e seqüenciados (descrito em Williams e Winter1 Eur.J. Immunoi, 23: 1456-1461 (1993)) e podem ser utilizados para produzirrepertórios de cadeia leve sintéticos. Os repertórios de gene V sintéticos , combase na faixa de vezes de VH e VL, e comprimento de L3 e H3, codificarãoanticorpos de diversidade estrutural considerável. Seguindo a amplificação dosDNAs que codificam o gene V1 segmentos de gene V de linhagem germinativapodem ser rearranjados in vitro de acordo com métodos de Hoogenboom eWinter1 J. Mol. Bioi, 227: 381-388 (1992).
Repertórios de fragmentos de anticorpo podem ser construídospela combinação de repertórios de gene VH e VL juntos em diversas formas.Cada repertório pode ser criado em diferentes vetores, e vetores recombinadosin vitro, por exemplo, conforme descrito em Hogrefe et ai, Gene, 128: 119-126(1993), ou in vivo por infecção combinatória, por exemplo, o sistema IoxPdescrito em Waterhouse et al., Nuci Acids Res., 21: 2265-2266 (1993). Ométodo de recombinação in vivo explora a natureza de cadeia dupla defragmentos Fab para superar o limite no tamanho de biblioteca imposto pelaeficiência de transformação em E. coli. Repertórios VH e VL iniciais (naive) sãoclonados de forma separada, um em um fagomídeo e o outro em um vetor defago. As duas bibliotecas são então combinadas por infecção de fago debactéria contendo fagomídeo, de forma que cada célula contém umacombinação diferente, e o tamanho da biblioteca é limitado apenas pelonúmero de células presente (cerca de1012 clones). Ambos os vetores contêmsinais de recombinação in vivo, de forma que os genes VH e VL sejamrecombinados em um único replicon, e são co-embalados em vírion de fago.Estas diversas bibliotecas fornecem um grande número de anticorpos diversosde boa afinidade (Kd"1 de cerca de 10"8 M).
Alternativamente, os repertórios podem ser clonados de formaseqüencial no mesmo vetor, tal como descrito em Barbas et ai., Proc. NatiAcad. Sei. USA, 88: 7978-7982 (1991), ou unidos por PCR e então clonados,conforme descrito em Clackson et ai., Nature, 352: 624-628 (1991). A junçãopor PCR pode também ser utilizada para unir DNAs VH e VL com DNA quecodifica um espaçador peptídico flexível para formar repertórios de Fv decadeia simples (scFv). Em ainda outra técnica, "junção por PCR em célula" (inceii PCR assembiy) é utilizada para combinar genes VH e VL nos linfócitos porPCR e então os repertórios dos genes ligados são clonados, conforme descritoem Embleton et ai., Nuci. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992).
Os anticorpos produzidos por bibliotecas iniciais (naive) (tantonaturais quanto sintéticos) podem ser de afinidade moderada (Kd"1 de cerca de106 a 107 M"1), mas maturação da afinidade pode também ser mimetizada invitro pela construção e nova seleção de bibliotecas secundárias, conformedescrito em Winter et ai. (1994), acima. Por exemplo, uma mutação pode serintroduzida de forma aleatória in vitro pelo uso de polimerase passível de erro(descrito em Leung et ai., Technique, 1: 11-15 (1989)) no método de Hawkinset ai., J. Moi. Bioi., 226: 889-896 (1992) ou no método de Gram et ai., Proc.Nati. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Adicionalmente, a maturação daafinidade pode ser realizada por mutação aleatória de uma ou mais CDRs, porexemplo, pelo uso de PCR com primers que carregam seqüências aleatórias,transportando um CDR de interesse, nos clones Fv individuais selecionados eseleção para clones de afinidade mais alta. O documento WO 9607754(publicado em 14 de março de 1996) descreveu um método para indução damutagênese em uma região determinante de complementaridade de umacadeia leve de imunoglobulina para criar uma biblioteca de genes de cadeialeve. Outra realização eficaz é recombinar os domínios VH ou VL selecionadospela exibição por fago com repertórios de variantes de domínio V de ocorrêncianatural, obtidos a partir de doadores não-imunizados, e seleção para altaafinidade em diversos ciclos de reorganização da cadeia, conforme descrito emMarks et ai., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite a produçãode anticorpos e fragmentos de anticorpos com afinidade na faixa de 10"9 M.
A seleção das bibliotecas pode ser realizada por qualquer técnicaconhecida no estado da técnica. Por exemplo, TAT226 pode ser utilizado pararevestir as paredes das placas de adsorção, expressas em células hospedeirasfixadas a placas de adsorção ou utilizado na seleção de células, ou conjugadocom biotina para captura com esferas revestidas com estreptoavidina, ouutilizado em qualquer outro método conhecido no estado da técnica paraselecionar (panning) bibliotecas de exibição por fago.
As amostras de biblioteca de fago são colocadas em contatoTAT226 imobilizado sob condições apropriadas para a ligação de pelo menosuma porção das partículas de fago com o adsorvente. Normalmente, ascondições, incluindo pH, força iônica, temperatura e similares, sãoselecionadas de forma a imitar condições fisiológicas. Os fagos ligados à fasesólida são lavados e então eluídos por ácido, tal com descrito em Barbas et ai,Proc. Nati Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), ou por álcali, conformedescrito em Marks et ai, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), ou por competiçãode antígeno de TAT226, por exemplo, em um procedimento similar ao métodode competição de antígeno de Clackson et ai., Nature, 352: 624-628 (1991).Fagos podem ser enriquecidos de 20-1.000 vezes em um único ciclo deseleção. Adicionalmente, os fagos enriquecidos podem ser crescidos emculturas bacterianas e submetidos a etapas adicionais de seleção.
A eficiência de seleção depende de diversos fatores, incluindo ascinéticas de dissociação durante a lavagem, e se múltiplos fragmentos deanticorpos em um único fago podem se engajar simultaneamente com oantígeno. Anticorpos com rápida dissociação cinética (e fraca afinidade deligação) podem ser retidos pelo uso de lavagens curtas, exibição por fagomultivalente e alta densidade de revestimento de antígeno na fase sólida. Aalta densidade não apenas estabiliza o fago por meio de interaçõesmultivalente, mas favorece a nova ligação do fago que foi dissociado. Aseleção de anticorpos com cinéticas de dissociação lentas (e boa afinidade deligação) pode ser promovida pelo uso de longas lavagens e exibição por fagomonovalente, conforme descrito em Bass et aí., Proteins, 8: 309-314 (1990) eno documento WO 92/09690, e uma baixa densidade de revestimento deantígeno, conforme descrito em Marks et ai, Biotechnol., 10: 779-783 (1992).
É possível selecionar entre anticorpos de fago de diferentesafinidades para TAT226, mesmo com afinidades que diferem levemente.
Entretanto, mutação aleatória de um anticorpo selecionado (por exemplo,conforme realizado em algumas das técnicas de maturação da afinidade) écomum de gerar diversos mutantes, a maioria ligando ao antígeno, e poucoscom alta afinidade. Com a limitação de TAT226, fagos de alta afinidade rarospodem estar fora da competição (competed out). Para reter todos os mutantesde alta afinidade, fagos podem ser incubados com excesso de TAT226biotinilado, mas com o TAT226 biotinilado a uma concentração de molaridademais baixa que a constante de afinidade molar alvo para TAT226. Os fagos deligação de alta afinidade podem então ser capturados por esferasparamagnéticas revestidas com estreptoavidina. Esta "captura de equilíbrio"permite que os anticorpos sejam selecionados de acordo com suas afinidadesde ligação, com uma sensibilidade que permite o isolamento de clonesmutantes com uma afinidade tão pequena quanto duas vezes maior a partir deum grande excesso de fagos com afinidade mais baixa. As condiçõesutilizadas na lavagem de fagos ligados a uma fase sólida podem também sermanipuladas para discriminar com base nas cinéticas de dissociação.
Clones anti- TAT226 podem ser selecionados com base em suaatividade. Em um exemplo de realização, a invenção fornece anticorpos anti-TAT226 que se liga a células vivas que expressam naturalmente TAT226. Emum exemplo de realização, a invenção fornece anticorpos anti- TAT226 quebloqueiam a ligação entre um Iigante de TAT226 e o TAT226, mas nãobloqueia a ligação entre o TAT226 e uma segunda proteína. Clones Fv quecorrespondem aos ditos anticorpos anti- TAT226 podem ser selecionados pelo(1) isolamento de clones anti- TAT226 de uma biblioteca de fago, conformedescrito acima, e opcionalmente a amplificação da população de clones defago isolada por meio do crescimento da população em um hospedeirobacteriano apropriado; (2) seleção do TAT226 e uma segunda proteína contraos quais são desejados atividades de bloqueio e não-bloqueio,respectivamente; (3) adsorção dos clones de fago anti- TAT226 para imobilizarTAT226; (4) uso de um excesso da segunda proteína para eluir quaisquerclones indesejados que reconheçam determinantes de ligação de TAT226 quesobrepõe ou compartilham determinantes de ligação da segunda proteína; e(5) eluição dos clones que permaneceram adsorvidos após a etapa (4).
Opcionalmente, os clones com as propriedades de bloqueio/não-bloqueiodesejadas podem ser adicionalmente enriquecidos por meio da repetição dosprocedimentos de seleção descritos uma ou mais vezes no presente.
O DNA que codifica o anticorpo monoclonal derivado dohibridoma ou os clones Fv exibidos por fago da invenção são facilmenteisolados e seqüenciados pelo uso de procedimentos convencionais (porexemplo, pelo uso de primers de oligonucleotídeos desejados para amplificarespecificamente as regiões codificantes da cadeia leve e pesada de interessea partir de um molde (template) de DNA de hibridoma ou fago). Uma vezisolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são entãotransfectados em células hospedeiras, tais como células E. coli, células COSde símios, células do ovário de hamster chinês (CHO), ou células de mielomaque não produzem de outra forma proteína de imunoglobulina, para obter asíntese dos anticorpos monoclonais desejados nas células hospedeirasrecombinantes. Artigos de revisão de expressão recombinante em bactérias deDNA que codifica anticorpo incluem Skerra et ai, Curr. Opinion in Immunol., 5:256 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992).
O DNA que codifica os clones Fv de acordo com a presenteinvenção pode ser combinado com seqüências de DNA conhecidas quecodificam regiões constantes de cadeia leve e/ou pesada (por exemplo, asseqüências de DNA apropriadas podem ser obtidas a partir de Kabat et ai,Supra), para formar clones que codificam cadeias leve e/ou pesada, de formaparcial ou integral. Aprecia-se que regiões constantes de qualquer isotipopossa ser utilizada para este propósito, incluindo regiões constantes de IgG1IgM, IgA, IgD1 e IgE, e que estas regiões constantes possam ser obtidas apartir de qualquer espécie animal ou humana. Um clone Fv derivado do DNAde domínio variável de uma espécie animal (tal como humana) e então fundidoao DNA da região constante de outras espécies animais para formarseqüências de codificação para "híbrido", cadeia leve e/ou cadeia pesada decomprimento total é incluída na definição de anticorpo "quimérico" e "híbrido",conforme utilizado no presente. Em uma realização, um clone Fv derivado deDNA variável humano é fundido a DNA de região constante humano paraformar seqüências de codificação para cadeias leve e/ou pesada humana decomprimento total ou parcial.
O DNA que codifica o anticorpo anti- TAT226 derivado de umhibridoma da invenção também pode ser modificado, por exemplo, substituindoa seqüência de codificação para o domínio constante de cadeia leve e pesada,por seqüências homólogas derivadas de clones hibridomas murinos (porexemplo, como no método de Morrison et aí., Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 81:6851-6855 (1984)). O DNA que codifica o hibridoma ou o anticorpo derivado doclone Fv ou fragmentos podem ainda ser modificados por junção covalente àseqüência codificadora de imunoglobulina na totalidade ou em parte daseqüência de codificação para um polipeptídeo não-imunoglobulina. Destaforma, anticorpo "quimérico" ou "híbrido" são preparados tendo aespecificidade de ligação do clone Fv ou anticorpo derivado do clone dohibridoma da invenção.
3. Vetores, Células Hospedeiras ε Métodos Recombinantes
Para a produção recombinante de um anticorpo da invenção, osácidos nucléicos que codificam o anticorpo são isolados e inseridos em umvetor replicável para a clonagem (amplificação do DNA) ou para a expressão.
O DNA que codifica o anticorpo é facilmente isolado e seqüenciado utilizandoprocedimentos convencionais (por exemplo, pela utilização de sondas deoligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos genescodificadores das cadeias leves e pesadas do anticorpo). Muitos vetores estãodisponíveis. A escolha do vetor depende, em parte, da célula hospedeira queserá utilizada. Células hospedeiras incluem, mas sem limitar-se a, células deorigem procariótica ou eucariótica (geralmente de mamíferos). Será apreciadoque regiões constante de qualquer isotipo possam ser utilizados para este fim,incluindo as regiões constantes de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, e que tais regiõesconstantes possam ser obtidas a partir de humano ou qualquer espécie animal.A) Produção de Anticorpos Utilizando Células Hospedeiras Procarióticas
(1) Construção De Vetores
Seqüências polinucleotídicas codificadores de componentespolipeptídicos do anticorpo da invenção podem ser obtidas utilizando técnicaspadrões de recombinação. As seqüências polinucleotídicas desejadas podemser isoladas e seqüenciadas de células produtoras de anticorpos, como célulasde hibridomas. Alternativamente, polinucleotídeos podem ser sintetizadosutilizando sintetizadores de nucleotídeos ou técnicas de PCR. Uma vezobtidas, as seqüências codificadoras de polipeptídeos são inseridas em umvetor recombinante capaz de replicar e expressar os polinucleotídeosheterólogos em hospedeiros procarióticos. Muitos vetores que estãodisponíveis e são conhecidos no estado da técnica podem ser utilizados paraos fins da presente invenção. A seleção de um vetor apropriado vai dependerprincipalmente do tamanho dos ácidos nucléicos a serem inseridos no vetor e acélula hospedeira específica a ser transformada com o vetor. Cada vetorcontém diversos componentes, dependendo de sua função (amplificação ouexpressão de polinucleotídeos heterólogos, ou ambos), e de suacompatibilidade com a célula hospedeira particular na qual este reside. Oscomponentes dos vetores geralmente incluem, mas não estão limitados a: umaorigem de replicação, um gene marcador de seleção, um promotor, um sítio deligação do ribossomo (RBS), uma seqüência sinal, a inserção do ácido nucléicoheterólogo e uma seqüência de terminação de transcrição.
Geralmente, vetores plasmidiais que contêm seqüências decontrole e replicon que são derivadas de espécies compatíveis com a célulahospedeira, são utilizados na conexão com estas hospedeiras. O vetornormalmente conduz um sítio de replicação, bem como seqüências demarcação que são capazes de fornecer seleção fenotípica em célulastransformadas. Por exemplo, a E. coli é tipicamente transformada utilizando umpBR322, um plasmídeo obtido a partir de uma espécie E. coli. pBR322 possuios genes que conferem a resistência a ampicilina (Amp) e a tetraciclina (Tet) e,portanto, fornece meios fáceis para a identificação de células transformadas.
As pBR322, seus derivados, ou outros plasmídeos microbianos oubacteriófagos também podem conter, ou serem modificados por, promotoresque podem ser utilizados pelo organismo microbiano para a expressão deproteínas endógenas. Exemplos de derivados de pBR322 utilizados para aexpressão de anticorpos específicos são descritos em detalhes em Carter et al,Patente US 5.648.237.
Além disso, vetores de fagos que contêm seqüências de controlee replicon que são compatíveis com o microorganismo hospedeiro podem serutilizados como vetores de transformação em conexão com esses hospedeiros.Bacteriófago tal como ÀGEM.TM.-11, por exemplo, pode ser utilizado nafabricação de um vetor recombinante que pode ser utilizado para transformarcélulas hospedeiras suscetíveis tais como a E. coli LE392.
O vetor de expressão da invenção pode compreender dois oumais pares promotores de cístrons, codificando cada componente dopolipeptídeo. O promotor é uma seqüência de regulação não traduzidalocalizada à montante (5') de um cístron, que modula a sua expressão.
Promotores de procariotos geralmente se enquadram em duas classes, osinduzíveis e os constitutivos. Os promotores induzíveis são promotores queiniciam níveis aumentados de transcrição do cístron sob seu controle, emresposta a mudanças na condição de cultura, por exemplo, a presença ouausência de um nutriente ou de uma mudança na temperatura.
Uma grande quantidade de promotores reconhecida por umasérie de células hospedeiras potenciais é bem conhecida. O promotorselecionado pode estar operacionalmente ligado a um DNA cístron que codificaa cadeia leve ou pesada, ao remover o promotor do DNA fonte por meio dedigestão com enzimas de restrição, e inserindo a seqüência do promotorisolado no vetor da invenção. Tanto a seqüência promotora nativa quantomuitos promotores heterólogos podem ser utilizados para direcionar aamplificação e/ou expressão dos genes alvos. Em algumas realizações,promotores heterólogos são utilizados, pois eles geralmente permitem maiortranscrição e rendimentos mais altos do gene alvo expresso, quandocomparado com o promotor do polipeptídeo alvo nativo.
Os promotores apropriados para uso com hospedeirosprocarióticos incluem o promotor phoA, sistemas promotores de Iactose e β-galactamase, sistema promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos, assimcomo o promotor tac ou trc. Entretanto, outros promotores que são funcionaisem bactérias (tais como outros promotores de fagos ou bacterianosconhecidos) também são apropriados. Suas seqüências de nucleotídeos forampublicadas, de forma a permitir que os técnicos no assunto as liguemoperacionalmente a cistrons que codificam cadeias leve e pesada alvo(Siebenlist et al, Cell, 20: 269 (1980)), utilizando Iigantes ou adaptadores parafornecer quaisquer sítios de restrição necessários.
Em um aspecto da invenção, cada cístron no vetor recombinantecompreende um componente da seqüência sinal de secreção que leva atranslocação dos polipeptídeos expressos através de uma membrana. Deforma geral, a seqüência sinal pode ser um componente do vetor ou pode seruma parte do DNA do polipeptídeo alvo que é inserido no vetor. A seqüênciasinal selecionada para os propósitos de acordo com a presente invençãodeverá ser uma que seja reconhecida e processada (ou seja, clivada por umapeptidase sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticasque não reconhecem e processam as seqüências sinal nativas para ospolipeptídeos heterólogos, a seqüência sinal é substituída por uma seqüênciasinal procariótica selecionada, por exemplo, a partir do grupo que consiste defosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou líderes de enterotoxina Il estáveis aocalor (STII)1 LamB1 PhoE1 PeIB1 OmpA e MBP. Em uma realização dainvenção, a seqüência sinal utilizada em ambos os cístrons do sistema deexpressão é uma seqüência sinal STII ou variante desta.
Em outro aspecto, a produção de imunoglobulinas de acordo coma invenção pode ocorrer no citoplasma das células hospedeiras, e assim, nãonecessitam da presença das seqüências sinais de secreção dentro de cadacístron. A este respeito, as cadeias leve e pesada da imunoglobulina sãoexpressas, dobradas e reunidas para formar imunoglobulinas funcionais nocitoplasma. Determinadas linhagens hospedeiras (por exemplo, cepas deE.Coli trxB) fornecem condições citoplásmicas que favorecem a formação depontes de dissulfeto, permitindo desta forma a dobra e união apropriada dassubunidades das proteínas expressas. (Proba e Plukthun, Gene, 159:203 (1995))
Os anticorpos de acordo com a presente invenção podemtambém ser produzidos pelo uso de um sistema de expressão em que a taxaquantitativa dos componentes de polipeptídeos expressos pode ser moduladaa fim de maximizar o rendimento de anticorpos secretados e apropriadamentereunidos de acordo com a presente invenção. A dita modulação é realizadapelo menos em parte pela modulação simultânea das forças de tradução paraos componentes do polipeptídeo.
Uma técnica para a modulação das forças de tradução estádescrita em Simmons et ai, Patente US 5.840.523. A dita técnica utilizavariantes da região de início da tradução (TIR) em um cístron. Para uma dadaTIR, uma série de variantes de seqüências de aminoácidos e ácidos nucléicospode ser criada com uma faixa de forças de tradução, fornecendo, destaforma, meios convenientes para ajustar este fator para o nível de expressãodesejado da cadeia específica. Variantes de TIR podem ser geradas portécnicas de mutagênese convencionais que resultam em alterações de códonque podem alterar a seqüência de aminoácido. Em algumas realizações,alterações na seqüência de nucleotídeos são silenciosas. Alterações na TIRpodem incluir, por exemplo, alterações no número ou espaçamento deseqüências Shine-Dalgarno1 junto com alterações na seqüência sinal. Ummétodo para a geração de seqüências sinais mutadas é a geração de um"banco de códon" no começo de uma seqüência codificadora que não altera aseqüência de aminoácido da seqüência sinal (por exemplo, as alterações sãosilenciosas). Esta realização pode ser realizada por alteração da posição doterceiro nucleotídeo de cada códon; adicionalmente, alguns aminoácidos taiscomo leucina, serina, e arginina possuem primeira e segunda posiçõesmúltiplas que podem adicionar complexidade na produção do banco. Estemétodo de mutagênese é descrito em Yansura et al. (1992) METHODS: A
Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158.
Em uma realização, um conjunto de vetores é gerado com umafaixa de forçar TIR para cada cístron do presente. Este conjunto limitadofornece uma comparação dos níveis de expressão de cada cadeia, bem comoo rendimento dos produtos de anticorpo desejados sob várias combinações deforças TIR. Forças TIR podem ser determinadas por quantificação do nível deexpressão de um gene repórter conforme descrito em detalhes em Simmons etal. Patente US 5. 840.523. Com base na comparação da força de tradução, osTIRs individuais desejados são selecionados para ser combinado naconstrução de vetor de expressão da presente invenção.
As células hospedeiras procariontes apropriados para aexpressão dos anticorpos da presente invenção incluem arquebactéria eeubactérias, tais como organismos gram-negativos ou gram-positivos.Exemplos de bactérias úteis incluem Escherichia (por exemplo, E. coli), bacilos(por exemplo, B. subtilis), Enterobactérías, espécies de Pseudomonas (porexemplo, Ρ. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans,Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizóbia, Vitreoscilla ou Paracoccus. Em umexemplo de realização, células gram-negativas são usadas. Em um exemplode realização, células E. coli são usadas como hospedeiras para a invenção.
Exemplos de linhagens de E. coli incluem a linhagem W3110 (Bachmann,Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American SocietyforMicrobiologyl 1987), págs. 1190-1219; Depósito ATCC No. 27.325) e seusderivados, incluindo as linhagens 33D3 possuindo os genótipos W3110 Δ fhuA(Δ tonA) ptr3 Iac Iq lacL8 Δ ompT Δ (nmpc-fepE) degP41 kanR (Patente US5.639.635). Outras cepas e derivados destas, tais como E. coli 294 (ATCC31446), E. coli Β, E. coli λ 1776 (ATCC 31537) e E. coli RV308 (ATCC 31608)também são adequadas. Estes são exemplos preferencialmente ilustrativos doque limitadores. Métodos para a construção de derivados de qualquer uma dasbactérias acima mencionadas que possuem o genótipo definido sãoconhecidas no estado da técnica, por exemplo, em Bass et ai, Proteins, 8:309-314 (1990). Geralmente é necessário selecionar as bactérias adequadaslevando em consideração a replicabilidade do replicon nas células bacterianas.Por exemplo, as espécies E. coli, Serratia ou Salmonella podem serdevidamente utilizadas como hospedeiras, quando plasmídeos bemconhecidos, tais como os plasmídeos pBR322, pBR325, pACYC177 oupKN410 são utilizados para a construção do replicon. Normalmente a célulahospedeira deve secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas, eadicionalmente inibidores da protease podem ser incorporadas na culturacelular.
(2) Produção de Anticorpos
As células hospedeiras são transformadas com os vetores deexpressão descritos acima e cultivadas em meios nutrientes convencionaismodificados conforme apropriado para a indução de promotores, seleção detransformantes ou amplificação dos genes que codificam as seqüênciasdesejadas.
Transformação significa a introdução de DNA em hospedeiroseucarióticos a fim de que o DNA seja replicável, quer como um elemento extra-cromossômico ou integrado ao cromossomo. Dependendo da célulahospedeira utilizada, a transformação é feita utilizando técnicas padrãoadequada para tais células. O tratamento com cálcio empregando cloreto decálcio é geralmente utilizado para células bacterianas que contêm paredecelular. Outro método de transformação emprega polietileno-glicol / DMSO.
Outra técnica ainda utilizada é eletroporação.
As células procarióticas utilizadas para produzir os polipeptídeosde acordo com a presente invenção são cultivadas em meios conhecidos natécnica e são apropriadas para cultivo das células hospedeiras selecionadas.Exemplos de meios apropriados incluem caldo lúria (LB) mais os suplementosnutrientes necessários. Em algumas realizações preferidas, os meios tambémcontêm um agente de seleção, selecionado com base na construção do vetorde expressão, para permitir seletivamente o crescimento de célulasprocarióticas que contenham o vetor de expressão. A ampicilina é adicionadaaos meios, por exemplo, para crescimento de células que expressam o generesistente à ampicilina.
Quaisquer suplementos necessários além de fontes de carbono,nitrogênio e fosfato inorgânico podem também ser incluídos em concentraçõesapropriadas, introduzidas isoladamente ou na forma de uma mistura com outrosuplemento ou meio, tal como uma fonte de nitrogênio complexa.
Opcionalmente, o meio de cultivo pode conter um ou mais agentes redutoresselecionados a partir do grupo que consiste de glutationa, cisteína, cistamina,tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.
As células hospedeiras procarióticas são cultivadas sobtemperaturas apropriadas. Para crescimento da E. coli, por exemplo, ocrescimento ocorre a uma faixa de temperatura que inclui, mas sem se limitar,cerca de 20 °C a 39 °C, de maior preferência, entre 25 °C a 37 °C, e cerca de30 °C. O pH do meio pode ser qualquer pH que esteja entre 5 a 9, dependendoprincipalmente do organismo hospedeiro. Para a E. coli, o pH épreferencialmente cerca de 6,8 a 7,4, de preferencialmente é 7,0.
Se um promotor induzível é utilizado no vetor de expressão dainvenção, a expressão da proteína é induzida em condições adequadas para aativação do promotor. Em um aspecto da invenção, promotores PhoA sãousados para controlar a transcrição de polipeptídeos. Assim, as célulashospedeiras transformadas são cultivadas em um meio limitante de fosfatopara a indução. Em um exemplo de realização, o meio limitante de fosfato é omeio C.R.A.P. (vide, por exemplo, Simmons et ai, J. Immunol Methods.(2002), 263:133-147). Uma variedade de outros indutores pode ser utilizada,de acordo com a construção do vetor utilizado, como é conhecido no estado datécnica.
Em um exemplo de realização, os polipeptídeos expressos dapresente invenção são secretados e recuperados do periplasma das célulashospedeiras. A recuperação de proteína envolve tipicamente o rompimento domicroorganismo, geralmente por meios tais como choque osmótico, sonicaçãoou lise. Após a Iise das células, fragmentos celulares ou células inteiras podemser removidas por meio de centrifugação ou filtragem. As proteínas podem seradicionalmente purificadas, por exemplo, por cromatografia de resina deafinidade. Alternativamente, as proteínas podem ser transportadas no meio decultivo, e nele isoladas. As células podem ser removidas do cultivo e osobrenadante de cultivo filtrado e concentrado para purificação adicional dasproteínas produzidas. Os polipeptídeos expressos podem ser adicionalmenteisolados e identificados utilizando métodos comumente conhecidos, tais comoeletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) e teste Western Blot.
Em um aspecto da invenção, o anticorpo pode ser produzido emgrande quantidade por meio de processos de fermentação. Váriosprocedimentos de fermentação de alimentação de lotes em larga escala sãodisponíveis para a produção de proteínas recombinantes. As fermentações emlarga escala possuem capacidade de pelo menos 1000 litros,preferencialmente de cerca de 1000 a 100.000 litros de capacidade. Estesfermentadores utilizam impulsionadores agitadores para distribuir oxigênio enutrientes, especialmente glicose (uma fonte de carbono e energia comum). Afermentação em pequena escala refere-se geralmente a fermentação emfermentador que possui uma capacidade volumétrica de não mais que cercade 100 litros, e pode variar de cerca de um 1 litro a 100 litros.
No processo de fermentação, a indução da expressão de proteínaé tipicamente iniciada após o crescimento das células sob condiçõesapropriadas até densidade desejada, tal como OD55O de cerca de 180 a 220,no qual as células estão no início da fase estacionária. Uma série de indutorespode ser utilizada, de acordo com a construção de vetor empregado, como éconhecido no estado da arte e descrito acima. As células podem ser cultivadaspor períodos mais curtos antes da indução. As células são normalmenteinduzidas por cerca de 12 a 50 horas, embora um tempo maior ou menor deindução possa ser utilizado.
Para aumentar o rendimento de produção e a qualidade dopolipeptídeo da presente invenção, várias condições de fermentação podemser modificadas. Para melhorar a união e o enovelamento apropriado doanticorpo secretado, por exemplo, vetores adicionais que superexpressamproteínas chaperonas, tais como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbDe/ou DsbG) ou FkpA (peptidilprolil eis, trans-isomerase com atividade dechaperona), podem ser utilizados para co-transformar as células procarióticashospedeiras. Demonstrou-se que as proteínas de chaperona facilitam aformação de dobras e solubilidade adequadas de proteínas heterólogasproduzidas em células hospedeiras bacterianas. Chen et aí, J. Bio. Chem., 274:19601-19605 (1999); Patentes US 6.083.715 e 6.027.888; Bothmann ePluckthun1 J. Biol. Chem., 275: 17100-17105 (2000); Ramm e Pluckthun, J.Biol. Chem., 275: 17106-17113 (2000); Arie et ai, Mol. Microbiol., 39: 199-210(2001).
Para minimizar a proteólise de proteínas heterólogas expressas(especialmente as que são proteoliticamente sensíveis), certas linhagenshospedeiras com deficiência para enzimas proteolíticas podem ser utilizadaspara a presente invenção. Por exemplo, linhagens de células hospedeiraspodem ser modificadas para efetuar mutação(ões) genética(s) nos genes quecodificam proteases bacterianas conhecidas, tais como Protease III, OmpT1DegP, Tsp1 Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease Vl e suascombinações. Algumas linhagens de E. Coii com deficiência de protease sãodisponíveis e descritas, por exemplo, em Joly et al, (1998) supra; Georgiou etai Patente US 5.264.365, Georgiou et al. Patente US 5.508.192; Hara et al,MicrobiaIDrug Resistance, 2:63-72 (1996).
Em um exemplo de realização, as linhagens de E. coli deficientesde enzimas proteolíticas e transformadas com um ou mais plasmídeos quesuperexpressam proteínas chaperonas, são utilizadas como célulashospedeiras no sistema de expressão da invenção.
(3) Purificação de Anticorpo
Em uma realização, a proteína de anticorpo produzida nopresente é adicionalmente purificada para obter preparações que sãosubstancialmente homogêneas para ensaios e usos adicionais. Podem serempregados métodos padrões de purificação de proteínas conhecidos noestado de técnica. Os procedimentos a seguir são exemplos de procedimentosde purificação apropriados: através de fracionamento em uma coluna de trocaiônica ou imuno-afinidade; precipitação em etanol, HPLC de fase reversa;cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônica, tal como DEAE;cromatofocusação; SDS-PAGE; precipitação em sulfato de amônio; gelfiltração utilizando, por exemplo, Sephadex G-75.
Em um aspecto, a proteína A imobilizada em uma fase sólida éutilizada para a purificação por imunoafinidade dos produtos do anticorpo dainvenção. A proteína A é um proteína da parede celular de 41 kD doStaphylococcus áureos que se liga com alta afinidade a região Fc dosanticorpos. Lindmark1 et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. A fase sólidapara o qual a proteína A é imobilizada pode ser uma coluna que compreendeuma superfície de vidro ou de sílica, ou uma coluna de vidro porosa controladaou coluna de ácido silícico. Em algumas aplicações, a coluna é revestida comum reagente, tal como o glicerol, possivelmente para evitar a aderênciainespecífica de contaminantes.
Tal como a primeira etapa de purificação, a preparação derivadada cultura celular, como descrito acima, pode ser aplicada a uma fase sólidade proteína A imobilizada para permitir a ligação do anticorpo específico deinteresse, para proteína A. A fase sólida passaria então a ser lavada pararemover os contaminantes não ligados especificamente à fase sólida. Porúltimo, o anticorpo de interesse é recuperado da fase sólida por eluição.
(b) Produção de Anticorpos Utilizando Células Hospedeiras Eucarióticas
Os componentes do vetor geralmente incluem, mas sem se limitara, uma ou mais dos seguintes: uma seqüência sinal, uma origem de replicação,um ou mais genes marcadores, um componente amplificador, um promotor, euma seqüência de terminação da transcrição.
(D Componente de Seqüência Sinal
Um vetor para uso em uma célula hospedeira eucarióticastambém pode conter uma seqüência sinal ou outro polipeptídeo que possuí umsítio de clivagem específico no N-terminal da proteína madura ou polipeptídeode interesse. A seqüência sinal heteróloga selecionada geralmente é aquelaque é reconhecida e processada (ou seja, clivada por uma peptidase sinal)pela célula hospedeira. Em expressão em células de mamíferos, estãodisponíveis as seqüências sinais de mamíferos, bem como líderes de secreçãoviral, tais como o sinal gD da herpes simplex. O DNA para essa regiãoprecursora é ligado em estrutura de leitura a DNA codificador do anticorpo.
(2) Componente De Origem De Replicação
Geralmente, a origem do componente de replicação não énecessária para vetores de expressão em mamíferos. Por exemplo, a origemSV40 pode ser tipicamente utilizada somente porque contém o promotor inicial.
(3) Componente Genético De Seleção
Os vetores de clonagem e de expressão podem conter um geneâ 15 de seleção, também denominado marcador de seleção. Os genes de seleçãotípicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ououtras toxinas, tais como ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina; (b)complementam deficiências autotróficas; ou (c) fornecem nutrientesfundamentais não-disponíveis no meio.
Um exemplo de esquema de seleção utiliza uma droga parainterromper o crescimento de uma célula hospedeira. As células que sãotransformadas com sucesso com um gene heterólogo que produz umaproteína que confere resistência a drogas e, desta forma, sobrevivem aoregime de seleção. Exemplos de tal seleção dominante utilizam as drogasneomicina, ácido micofenólico e higromicina.
Outro exemplo de marcadores de seleção apropriados paracélulas de mamíferos são os que permitem a identificação de célulascompetentes para a absorção do ácido nucléico de anticorpo, tal como DHFR1timidina quinase, metalotioneína-l e II, preferencialmente genes metalotioneínade primatas, adenosina deaminase, ornitina decarboxilase, e etc.
Por exemplo, em algumas ralizações, células transformadas como gene de seleção DHFR, por exemplo, são identificadas, em primeiro lugar,através do cultivo de todos os transformantes em um meio de cultura quecontenha metotrexato (Mtx), concorrente antagonista de DHFR. Em algumasrealizações, é utilizada uma célula hospedeira apropriada que possuí DHFR dotipo selvagem, que é a linhagem celular de ovário de hamster chinês (CHO)com deficiência na atividade de DHFR (por exemplo, ATCC CRL-9096).
Alternativamente, células hospedeiras (particularmente, célulashospedeiras do tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ouco-transformadas com seqüências de DNA que codificam o anticorpo, aproteína DHFR do tipo selvagem e outro marcador selecionável tal comoaminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas através decrescimento celular em um meio que contém um agente de seleção para omarcador selecionável tal como antibiótico aminoglicosídico, por exemplocanamicina, neomicina ou G418. Vide a Patente US 4.965.199.
(4) Componente Promotor
Os vetores de clonagem e de expressão normalmente contêm umpromotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é operacionalmenteligado ao ácido nucléico do polipeptídeo (por exemplo, um anticorpo).Asseqüências promotoras para eucariontes são conhecidas. Por Exemplo, todosos genes eucariontes possuem virtualmente uma região rica em AT localizadaa cerca de 25 a 30 bases a montante do sítio em que se inicia a transcrição.
Outra seqüência encontrada a 70 até 80 bases a montante do início datranscrição de muitos genes é uma região CNCAAT, em que N pode serqualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucariontes,encontra-se uma seqüência AATAAA que pode ser o sinal para adição dacauda poli A na extremidade 3' da seqüência codificadora. Todas essasseqüências são inseridas de forma apropriada em vetores de expressãoeucarióticos.
A transcrição de polipeptídeos do anticorpo a partir de vetores emcélulas hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotoresobtidos a partir dos genoma viral tais como vírus de polioma, vírus da catapora,adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírus desarcoma aviário, citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatite B e, de maiorpreferência, Vírus Símio 40 (SV40), a partir de promotores de mamíferosheterólogos, tais como o promotor de actina ou um promotor deimunoglobulina, de promotores de choque térmico, desde que essespromotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.
O promotor inicial e final do vírus SV40 são obtidosconvenientemente na forma de fragmento de restrição SV40 que tambémcontém a replicação de origem viral do SV40. O promotor inicial imediato docitomegalovírus humano é obtido convenientemente na forma de fragmento derestrição Hindlll E. Um sistema de expressão de DNA em hospedeirosmamíferos utilizando o vírus de papiloma bovino como vetor é descrito naPatente US 4.119.446. Uma modificação deste sistema é descrita na PatenteUS 4.601.978. Vide também Reyes et ai, Nature 297:598-601 (1982) em:Expression of human β-interferon cDNA in mouse cells under the control of athymidine kinase promoter from herpes simplex virus. Alternativamente, arepetição terminal longa de vírus do sarcoma de Rous pode ser utilizada comopromotor.
(5) Componente Elemento Amplificador
A transcrição de um DNA codificador do polipeptídeo do anticorpode acordo com a presente invenção por eucariontes superiores éfreqüentemente aumentada através da inserção de uma seqüênciaamplificadora no vetor. Muitas seqüências amplificadoras são agoraconhecidas de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, a-fetoproteína e insulina). Tipicamente, entretanto, será utilizado um amplificadorde um vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem o amplificador SV40 sobreo lado posterior da origem de replicação (bp 100-270), o amplificador promotorinicial de citomegalovírus, o amplificador de polioma sobre o lado terminal daorigem de replicação e amplificadores de adenovírus. Vide também Yaniv,Nature 297: 17-18 (1982) sobre elementos de promoção para a ativação depromotores eucarióticos. O amplificador pode também sofrer splicing no vetorna posição 5' ou 3' para a seqüência codificadora de anticorpo, mas encontra-se localizado, preferencialmente, em um sítio 5' do promotor.
(6) Componente De Término De Transcrição
Os vetores de expressão utilizados em células hospedeiraseucariontes também irão conter seqüências necessárias para a terminação datranscrição e estabilização do mRNA. Ditas seqüências são normalmentedisponíveis a partir das regiões 5' não-traduzidas, ocasionalmente 3', dosDNAs ou cDNAs virais ou eucariontes. Estas regiões contêm segmentos denucleotídeos transcritos na forma de fragmentos poliadenilados na porção não-traduzida do mRNA codificador do anticorpo. Um componente de terminaçãode transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio de crescimentobovino. Vide o documento WO 94/11026 e o vetor de expressão nele descrito.
(7) Seleção E Transformação De Células Hospedeiras
As células hospedeiras apropriadas para clonagem ou expressãodo DNA nos vetores do presente incluem as células eucarióticas superioresdescritas neste documento, incluindo células hospedeiras de vertebrados.Propagação de células hospedeiras de vertebrados em cultura (cultura detecido) tornou-se um procedimento rotineiro. Exemplos de linhagens de célulashospedeiras de mamíferos úteis é a linhagem CV1 de rim de macacotransformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônicahumano (293 ou células 293 sub-clonadas para crescimento em cultura desuspensão, Graham et al., J. Geri. Virol. 36: 59 (1977)); células de rim defilhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA. 77: 4216 (1980));células de sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251(1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim demacaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinomacervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCCCCL 34); células de fígado de rato buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); célulasde pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (HepG2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51);células TRI (Mather et al., Annals Ν. Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); célulasMRC 5; células FS4; linhagem de hepatoma humano (Hep G2).
As células hospedeiras são transformadas com os vetores declonagem ou expressão descritos acima para a produção de anticorpos ecultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conformeapropriado para a indução de promotores, seleção de transformantes ouamplificando os genes codificadores das seqüências desejadas.
(8) Cultivo Das Células Hospedeiras
As células hospedeiras utilizadas para a produção do anticorpode acordo com a presente invenção podem ser cultivadas em uma série demeios disponíveis comercialmente, tais como HarrTs F10 (Sigma), MeioEssencial Mínimo ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio EagleModificado da Dulbecco ((DMEM), Sigma) que são apropriados para o cultivodas células hospedeiras. Além disso, qualquer meio descrito em Ham et al.,Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980),Patentes US 4.767.704; US 4.657.866; US 4.927.762; US 4.560.655; ou US5.122.469; documentos WO 90/03430 e WO 87/00195 ou o pedido de PatenteUS US 30.985 podem ser utilizados como meios de cultura para as célulashospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado conformenecessário com hormônios e/ou outros fatores do crescimento (tais comoinsulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (como, cloretode sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES),nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como drogaGentamycin®), traços de elementos (definidos como compostos inorgânicosnormalmente presentes em concentrações finais na faixa micromolares) eglicose ou uma fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplementonecessário pode também ser incluído em concentrações apropriadasconhecidas dos técnicos no assunto. As condições de cultura, tais comotemperatura, pH e similares, são as utilizadas anteriormente com a célulahospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para os técnicos noassunto.
(9) Purificação Do Anticorpo
A partir do uso de técnicas recombinantes, o anticorpo pode serproduzido de forma intracelular ou secretado diretamente no meio. Caso oanticorpo seja produzido de forma intracelular, como uma primeira etapa, osfragmentos particulados, sejam eles células hospedeiras ou fragmentoslisados, são removidos, por exemplo, através de centrifugação ou ultra-filtragem. Quando o anticorpo for secretado para o meio, sobrenadantesdesses sistemas de expressão são geralmente concentrados em primeiro lugarutilizando um filtro de concentração de proteínas disponível comercialmente,por exemplo, uma unidade de ultrafiltragem Amicon ou Millipore Pellicon. Uminibidor de protease, tal como PMSF, pode ser incluído em qualquer dasetapas acima para inibir a proteólise e antibióticos podem ser incluídos paraevitar o crescimento de contaminantes imprevistos.A composição de anticorpo preparada a partir das células podeser purificada através do uso, por exemplo, de cromatografia de hidroxilapatita,eletroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, sendo acromatografia por afinidade a técnica de purificação preferida. A adequação daproteína A como Iigante de afinidade depende da espécie e do isotipo dequalquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. AProteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que se baseiem emcadeias pesadas γ1, γ2 ou γ4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Recomenda-se Proteína G para todos os isotipos decamundongos e para γ3 humano (Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)).A matriz ao qual o Iigante de afinidade é anexado é freqüentemente a agarose,mas outras matrizes são disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, taiscomo vidro de poros controlados ou poli-(estirenodivinil)-benzeno, permitemvelocidades de fluxo maiores e tempos de processamento mais curtos do queos que podem ser atingidos com agarose. Quando o anticorpo constar de umdomínio CH3, a resina Bakerbond ABX® (J. T. Baker, Phillipsburg NJ1 EstadosUnidos) é útil para a purificação. Outras técnicas de purificação de proteínas,tais como fracionamento sobre uma coluna de troca iônica, precipitação emetanol, HPLC de Fase Reversa, cromatografia em sílica, cromatografia emheparina SEPHAROSE™, cromatografia em uma resina de troca aniônica oucatiônica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE e precipitação de sulfato de amônio também são disponíveis,dependendo do anticorpo a ser recuperado.
Após qualquer etapa(s) de purificação preliminar, a mistura quecompreende o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida acromatografia de interação hidrofóbica de baixo pH utilizando uma eluiçãotamponada em um pH de cerca de 2,5 a 4,5, preferencialmente realizada sobbaixas concentrações de sal (tal como, de cerca de 0 a 0,25 M de sal).Em geral, técnicas e metodologias para a preparação deanticorpos para uso na presente invenção, ensaio e utilização clínica estãobem estabelecidas no estado da técnica, de maneira coerente com asmetodologias descritas acima e/ou considerado adequado pelos técnicos noassunto para o anticorpo específico de interesse.
C. Imunoconjugados
A invenção fornece também imunoconjugados (denominado deforma intercambiável como "conjugados anticorpo-droga" ou "ADCs"),compreendendo um dos anticorpos anti-TAT226 descrito no presente,conjugado a um agente citotóxico como um agente quimioterápicos, umadroga, um agente inibidor do crescimento, uma toxina (por exemplo, toxinabacteriana enzimaticamente ativa de origem fúngica, vegetal, animais oufragmentos destas), ou um isótopo radioativo (ou seja, um radioconjugado).
O uso anticorpos conjugados com drogas para a entrega local deagentes citotóxicos ou citostático, isto é, drogas para matar ou inibir célulastumorais no tratamento do câncer (Syrigos e Epenetos (1999) AnticancerResearch 19:605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev.26:151-172; Patente US 4.975.278). Imunoconjugados permitem a entrega damolécula da droga a célula alvo do tumor, e o acúmulo intracelular desta, ondea administração sistêmica destas drogas não conjugadas podem resultar emníveis inaceitáveis de toxicidade em células normais bem como em células dotumor que precisam ser eliminadas (Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (15 deMarço de 1986):603-05; Thorpe, (1985)"Antibody Carriers OfCytotoxicAgentsIn Câncer Therapy. Uma revisão em,"Monoclonal Antibodies '84: Biological AndClinicai Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). Tanto osanticorpos policlonais quanto os anticorpos monoclonais foram relatados comoúteis nestas estratégias (Rowland et al., (1986) Câncer Immunoi Immunother.,21:183-87). As drogas usadas nestes métodos incluem a daunomicina,doxorubicina, metotrexato e a vindesina (Rowland et ai, (1986) Supra). Astoxinas usadas em conjugados anticorpo-toxina incluem as toxinas bacterianastais como a toxina da difteria, toxina de plantas tais como a ricina, pequenasmoléculas de toxinas tais como a geldanamicina Mandler et al (2000) Jour. ofthe Nat. Câncer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic &Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem.13:786-791), maitansinóides (Patente EP 1391213; Liu et ai, (1996) Proc. NatLAcad. Sei. USA 93:8618-8623), e caliceamicina (Lode et al (1998) CancerRes.58:2928; Hinman et al (1993) Câncer Res. 53:3336-3342). As toxinas podemrealizar seus efeitos citotóxicos e citostáticos por mecanismos incluindo aligação da tubulina, a ligação do DNA ou a inibição da topoisomerase. Algumasdrogas citotóxicas tendem a ser inativadas ou menos ativas quandoconjugadas com anticorpos ou a proteínas Iigantes de receptores.
ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/ldec) é um conjugadoanticorpo-radioisótopo composto de um anticorpo monoclonal IgGI kappamurino dirigido contra ao antígeno CD20 encontrado na superfície de linfócitosnormais e malignos e ligado ao radioisótopo In111 ou Y90 por um quelanteIigante a uma tiourea (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nuci Med. 27(7):766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al (2002) J. Clin.Oncoi 20(10):2453 -63; Witzig ef al (2002) J. Clin. Oncoi 20(15):3262-69).
Embora ZEVALIN tenha a atividade contra o Iinfoma de célula B não Hodgkin(NHL), a administração resulta em citopenias graves e prolongadas na amaioria dos pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, WyethPharmaceuticals), um anticorpo conjugado a droga composto de um anticorpohu CD33 ligado a caliceamicina, foi aprovado em 2000 para o tratamento daleucemia mielóide aguda por injeção (Drugs of the Future (2000) 25(7):686;Patente US 4970198; US 5079233; US 5585089; US 5606040; US 5693762;US 5739116; US 5767285; US 5773001). Cantuzumab mertansina(Immunogen, Inc.), um conjugado anticorpo-droga composto pelo anticorpohuC242 ligado através do Iigante SPP a fração maitansinóide da droga, DM1do bissulfeto, está avançando em experimentações de pesquisa clínica de faseII para o tratamento dos cânceres que expressam CanAg como, por exemplo,pancreático, gástrico entre outros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZLBiologics, Immunogen Inc.), um conjugado anticorpo-droga composto peloanticorpo monoclonal específico para antígeno de membrana anti-prostático(PSMA) ligado a fração maitansinóide da droga, DM1, está sob odesenvolvimento para o tratamento potencial de tumores de próstata. Ospeptídeos da auristatina, auristatina E (AE) e a monometilauristatina (MMAE),análogos sintéticos da dolastatina, foram conjugados aos anticorposmonoclonais quimérico cBR96 (específico para o carcinoma de Lewis Y) ecAC10 (específico para o CD30 em malignidades hematológicas) (Doronina etal (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784) e estão sob desenvolvimentoterapêutico.
Em certas realizações, uma imunoconjugado compreende umanticorpo anti-TAT226 e um agente quimioterápico ou outras toxinas.Quimioterápicos úteis para a geração de imunoconjugados estão descritosneste documento (por exemplo, acima). Toxinas enzimaticamente ativas efragmentos destas também podem ser utilizadas e são descritas no presente.
Em alguns exemplos de realização, um imunoconjugadocompreende um anti-TAT226 e uma ou mais toxinas de moléculas pequenas,incluindo mas não se limitando a; caliqueamicina, maitansinóides, tricoteno eCC1065 e seus derivados que também apresentam atividade citotóxica.Exemplos destes imunoconjugados são discutidos em mais detalhes abaixo.
1. Exemplos de Imunoconjugados
Um imunoconjugado (ou "conjugado droga-anticorpo" ("ADC")) dainvenção pode ser de Fórmula I, abaixo, no qual um anticorpo anti-TAT226 éconjugado (ou seja, ligado covalentemente) a uma ou mais moléculas dedrogas (D) através de um Iigante opcional (L).
Ab-(L-D)p I
Assim, o anticorpo anti-TAT226 pode ser conjugado com a droga,quer diretamente quer através de um ligante. Na Fórmula I, ρ é o númeromédio de moléculas de droga por anticorpos, que podem variar, por exemplo,de cerca de 1 a cerca de 20 moléculas de droga por anticorpo e, em certasrealizações, a partir de 1 molécula a cerca de 8 moléculas de droga poranticorpo.
a) Ligantes Exemplares
O ligante pode ser composto por um ou mais componentesligante. Exemplos componentes de Iigantes incluem 6-maleimidocaproil ("MC"),maleimidopropanoil ("MP"), valina-citrulina ("val-cit" ou "vc"), alanina-fenilalanina ("Ala-phe"), p-aminobenziloxicarbonil ("PAB"), N-Succinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-Suecinimidol 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato ("SMCC"), e Succinimidil N-(4-iodo-acetil) aminobenzoato("SIAB"). Componentes de Iigantes adicionais são conhecidos na arte e algunsestão descritos abaixo.
Um ligante pode ser um "ligante clivável", facilitando a liberaçãode uma droga na célula. Podem ser utilizados, por exemplo, um ligante ácido-lábil (por exemplo, hidrazona), Iigantes sensíveis a protease (por exemplo,sensíveis a peptidase), Iigantes fotolábeis, Iigantes dimetil ou Iigantes contendodissulfeto (Chari et ai, Câncer Investigation 52:127-131 ( 1992); Patente US5208020).
Em algumas realizações, um componente ligante pode incluiruma "unidade extensora" que liga um anticorpo a outro componente ligante oua uma fração droga. Unidades extensoras exemplares são exibidas abaixo (noqual a linha ondulada indica sítios de ligação covalente a um anticorpo):<formula>formula see original document page 138</formula>
Em algumas realizações, um componente Iigante pode incluiruma unidade de aminoácido. Em uma dessas realizações, a unidade deaminoácido permite a clivagem do Iigante por uma protease, facilitando assim aliberação da droga a partir do imunoconjugado após a exposição a proteasesintracelulares, tais como enzimas lisossomais. Vide, por exemplo, Doronina etal (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784. Exemplos de unidades de aminoácidosincluem, mas não se limitam a, um dipeptídeo, um tripeptídeo, umtetrapeptídeo e um pentapeptídeo. Exemplos de dipeptídeos incluem: valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ou Ala-Phe); fenilalanina-lisina(fk ou Phe-Lys), ou N-metil-valina-citrulina (Me-val-cit). Exemplos detripeptídeos incluem: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) e glicina-glicina-glicina(gly-gly-gly). Uma unidade aminoácido pode incluir resíduos de aminoácidosque ocorrem naturalmente, assim como pequenos aminoácidos e análogos deaminoácidos que não ocorrem naturalmente, como, por exemplo, a citrulina.Unidade aminoácido pode ser desenvolvido e otimizado em sua seletividadepara a clivagem enzimática por uma enzima específica, por exemplo, em umtumor associados a uma protease, catepsina B1 C1 D, ou uma proteaseplasmina.
Em algumas realizações, um Iigante pode incluir um componente"espaçador" que liga o anticorpo a uma porção da droga, quer de forma direta,quer por via de uma unidade extensora e/ou de uma unidade aminoácido. Umaunidade espaçadora pode ser "auto-immolative" ou um "não auto-immolative".
Uma unidade de espaçador "não auto-immolative" no qual parte ou toda aunidade espaçadora permanece ligada a droga após a clivagem enzimática (por exemplo, proteolítica) do ADC. Exemplos de unidades espaçadoras não"auto-immolative" incluem, mas não se limitam a, unidade espaçadora glicinaunidade espaçadora glicina-glicina. Outras combinações peptídicas deunidades espaçadoras suscetíveis a clivagem enzimática em seqüênciasespecíficas são também contempladas. Por exemplo, a clivagem enzimática deum ADC contendo uma unidade espaçadora glicina-glicina por uma célula detumor associada a protease iria resultar na libertação da glicina-glicina-droga apartir da fração restante do ADC. Em uma dessas realizações, a glicina-glicina-droga é então submetida a uma etapa no sentido de separação por hidrólisenas células tumorais, levando assim a clivagem da unidade espaçadora glicina-glicina da molécula de droga.
Uma unidade espaçadora "auto-immolative" permite a liberaçãoda droga sem uma etapa de hidrólise separada. Em certas realizações, umaunidade espaçadora de um Iigante compreende uma unidade de p-aminobenzil. Em uma dessas realizações, um álcool p-aminobenzil é anexadoa uma unidade aminoácido através de uma ligação amida e um carbamato,metilcarbamato, ou carbonato que é feita entre o álcool benzílico e o agentecitotóxico. Vide, por exemplo, Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents(2005) 15:1087-1103. Em uma realização, a unidade espaçadora é p-aminobenziloxicarbonil (PAB). Em certas realizações, a porção de uma fenilenode uma unidade p-aminobenzil é substituída com Qm1 no qual Q é C1-C8-alquila,-0-(Ci-C8 alquila), -halogênio, - nitro ou -ciano, e m é um número inteirovariando de 0-4. Exemplos de unidades espaçadoras "auto-immolative"incluem, mas não se limitam a, compostos aromáticos que são eletronicamentesimilares ao álcool p-aminobenzil (vide, por exemplo, Patente US2005/0256030 A1), tais como derivados de 2-5-aminoimidazol-metanol ( Hay etal. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) e orto- ou para-amínobenzilacetal.
Espaçadores que podem ser usados sofrem ciclização mediante a hidrólise daligação de amida, tais como amida de ácidos 4-aminobutírico substituídas enão substituídas (Rodrigues et ai, Chemistry Biology, 1995, 2, 223); sistemade anéis biciclos adequadamente substituídos [2.2.1] e biciclo [2,2 .2] (Storm,et al, J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94, 5815); e amida de ácidos 2-aminofenilpropiônico (Amsberry, et al., J. Org. Chem. 1990, 55, 5867). Aeliminação de medicamentos que contenham aminas são substituídas naposição "a" da glicina (Kingsbury, et ai, J. Med. Chem., 1984, 27, 1447)também são exemplos de espaçadores "auto-immolative" úteis em ADCs.
Em uma realização, uma unidade espaçadora é uma unidadebis(hidroximetil) estireno (BHMS) ramificada, como ilustrado abaixo, que podeser utilizada para incorporar e liberar múltiplas drogas.
<formula>formula see original document page 140</formula>No qual, Q é C1-C8-alquila,-0-(C1-C8 alquila), -halogenio, -nitro ou-ciano; m é um número inteiro variando de 0-4; ? é 0 ou 1, e ? varia a partir de1 a cerca de 20.
Um Ligante pode incluir qualquer um ou mais dos componentesLigantes acima. Em certas realizações, um Iigante é como exibido a seguir,entre colchetes, no ADC da Fórmula II.
<table>table see original document page 141</column></row><table>
em que A é uma unidade extensora, e a é um número inteiro de 0 a 1; W éuma unidade aminoácido, e w é um número inteiro de 0 a 12; Y é uma unidade espaçadora, e y é 0, 1, ou 2; e Ab, D, e ? são definidas como acima para aFórmula I. Realizações exemplares desses Iigantes estão descritos na PatenteUS 2005-0238649 A1, que é expressamente incorporadas ao presente pelareferência.
Componentes Iigantes exemplares e suas combinações sãoexibidas a seguir no contexto dos ADCs da Fórmula II:
<formula>formula see original document page 141</formula><formula>formula see original document page 142</formula>
Componentes ligantes, incluindo unidades extensoras,espaçadoras e de aminoácidos, podem ser sintetizadas por métodosconhecidos na arte, tais como as descritas na Patente US 2005-0238649 A1.
b) Moléculas de Drogas Exemplares
1) Maitansina ε Maitansinóides
Em alguns exemplos de realizações, um imunoconjugadocompreende um anticorpo da invenção conjugado a uma ou mais moléculasmaitansinóides. Maitansinóides são inibidores mitóticos que agem através dainibição da polimerização de tubulina. Maitansina foi isolada pela primeira vez apartir do arbusto leste africano Maytenus serrata (Patente US 3.896.111).
Descobriu-se em seguida que determinados micróbios também produzemmaitansinóides, tais como maitansinol e ésteres C-3 de maitansinol (PatenteUS 4.151.042). Maitansinol sintético, seus derivados e análogos são descritos,por exemplo, nas Patentes US 4.137.230, US 4.248.870, US 4.256.746, US4.260.608, US 4.265.814, US 4.294.757, US 4.307.016, US 4.308.268, US4.308.269, US 4.309.428, US 4.313.946, US 4.315.929, US 4.317.821, US4.322.348, US 4.331.598, US 4.361.650, US 4.364.866, US 4.424.219, US4.450.254, US 4.362.663 e US 4.371.533.
Frações da droga dos maitansinóides são frações atrativas dadroga em conjugados droga-anticorpo porque são: (i) relativamente acessíveispara serem preparadas pela modificação por fermentação ou modificaçãoquímica, derivada de produtos da fermentação, (ii) por serem receptivos àderivatização com os grupos funcionais apropriados para a conjugação atravésde ligações não dissulfeto aos anticorpos, (iii) o estáveis no plasma, e (iv)eficazes contra uma variedade de linhagens de células tumorais.
Compostos adequados de maitansina para uso como frações dedroga maitansinóide são bem conhecidas na arte e podem ser isolados a partirde fontes naturais, de acordo com métodos conhecidos ou produzidasutilizando técnicas de engenharia genética (vide Yu et al (2002) PNAS99:7968-7973). Maitansinol e análogos do maitansinol podem também serpreparados sinteticamente, de acordo com métodos conhecidos.
Moléculas de drogas maitansinóides exemplares incluem aquelascom um anel aromático modificado, tais como: C-19-decloro (Patente US4.256.746) (preparado pela redução de lítio alumínio hidreto da ansamitocinaP2), C-20-hidroxi (ou C-20-demetil) +/-C-19-decloro (Patente US 4361650 e US4307016) (preparado pela desmetilação usando Streptomyces ou Actinomycesou declorinação usando LAH) e C-20-demetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), +/-decloro (Patente US 4.294.757) (preparado pela acilação usando cloreto dealcil). e aqueles que apresentam alterações nas outras posições.
Moléculas de drogas maitansinóides exemplares incluem tambémaquelas que apresentam alterações, tais como: C-9-SH (Patente US4.424.219) (preparado pela reação de maitansinol com H2S ou P2S5), C-14-alcoximetil (demetoxi/CH2 OR) (Patente US 4.331.598); C-14-hidroximetil ouaciloxymetil (CH2OH ou CH2OAc) (Patente US 4.450.254) (preparado a partirda Nocardia); C-15-hidroxi/aciloxi (Patente US 4.364.866) (preparado pelaconversão de maitansinol por Streptomyces ), C-15-metoxi (Patente US4313946 e Patente US 4315929) (isoladas de Trewia nudlflora), C-18-N-demetil (Patente US 4362663 e Patente US 4322348) (preparado peladesmetilação de maitansinol por Streptomyees ); e 4,5-deoxi (Patente US4.371.533) (preparado pelo tricloreto de titânio / redução por LAH domaitansinol).
Realizações exemplares de moléculas de drogas maitansinóidesincluem: DM1; DM3 e DM4, possuindo as estruturas:
<formula>formula see original document page 144</formula>
No qual, a linha ondulada indica a ligação covalente do átomo deenxofre da droga ao Iigante (L)-do conjugado droga -anticorpo. HERCEPTIN®(trastuzumab) ligado a SMCC a DM1 foram relatados (documento WO2005/037992; Patente US 2005/0276812 A1).
Outros exemplos de conjugado anticorpo-droga maitansinóidetem as seguintes estruturas e abreviaturas, (onde Ab é anticorpo e ρ é cercade 1 a 8):
<formula>formula see original document page 145</formula>
Outros exemplos de conjugado anticorpo-droga maitansinóidequando DM1 está ligado através de um Iigante BMPEO ao grupo tiol doanticorpo tem a seguinte estrutura e abreviaturas:
<formula>formula see original document page 146</formula>
No qual, Ab é anticorpo; η é O, 1, ou 2, e ρ é 1, 2, 3 ou 4.
Imunoconjugados contendo maitansinóides e seus usosterapêuticos são descritos, por exemplo, nas patentes US 5.208.020, US5.416.064, US 2005/0276812 A1e patente EP 0 425 235 B1, cujos conteúdossão expressamente incorporados ao presente como referência. Liu et aí., Proc.Λ/aí/. Acad. Sei. USA 93: 8618-8623 (1996), descreveram imunoconjugadosque compreendem um maitansinóide denominado DM1 ligado ao anticorpomonoclonal C242 dirigido a câncer colo-retal humano. Concluiu-se que oconjugado é altamente citotóxico com relação a células cancerígenas do cóloncultivadas e exibiu atividade antitumoral em teste de crescimento tumoral invivo. Chari et ai, Câncer Research 52: 127-131 (1992) descrevemimunoconjugados em que um maitansinóide foi conjugado por meio de umaligação dissulfeto ao anticorpo A7 murino que se liga a um antígeno sobrelinhagens de células cancerígenas de cólon humano ou a outro anticorpo TA-1monoclonal murino que liga o oncogene HER-2/netv. A citotoxicidade doconjugado TA.1- maitansinóide foi testado in vitro em células da linhagemhumana SK-BR-3 de câncer de mama, que expressa 3 χ 105 antígenos desuperfície HER-2 por célula. O conjugado da droga conseguiu um grau decitotoxicidade similar a droga maitansinóide livre, que poderia ser aumentadapelo aumento no número de moléculas maitansinóide por a molécula deanticorpo. Os conjugados A7- maitansinóide demonstrou baixa citotoxicidadesistêmica nos camundongos.
Os conjugados anticorpo-maitansinóide são preparadosquimicamente ligando um anticorpo a uma molécula de maitansinóide semdiminuir significativamente a atividade biológica do anticorpo ou da moléculamaitansinóide. Vide, por exemplo, a Patente US 5.208.020 (a divulgação doqual é expressamente incorporada a este pela referência). Uma média de 3-4moléculas maitansinóide conjugada por a molécula de anticorpo mostroueficácia em amplificar a citotoxicidade em células alvo sem afetarnegativamente a função ou a solubilidade do anticorpo, embora mesmo umamolécula de anticorpo/toxina se esperasse amplificar a citotoxicidade sobre ouso de um anticorpo nú. Maitansinóide são bem conhecidos no estado datécnica e podem ser sintetizados por técnicas conhecidas ou isolados defontes naturais. Maitansinóide apropriados são descritos, por exemplo, napatente US 5.208.020 e outras atentes e publicações não patentes referidasabaixo no presente. Os maitansinóides preferidos são maitansinol e análogosdo maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições damolécula do maitansinol, tais como vários ésteres do maitansinol.
Existem diversos grupos de ligação conhecidos no estado datécnica para a fabricação de conjugados de anticorpo e maitansinóide, queincluem, por exemplo, os descritos na patente US 5.208.020 ou Patente EP0.425.235 B1 e Chari et ai, CancerResearch 52: 127-131 (1992) e Patente US2005/016993 A1, a divulgação dos quais são expressamente incorporadas aopresente pela referência. Conjugados anticorpo-maitansinóide contendo ocomponente Iigante SMCC pode ser preparado conforme divulgado na PatenteUS 2005/0276812 A1, "Conjugados anticorpo-droga e métodos". Os Iigantescompreendem grupos dissulfeto, grupos tioéter, grupos de ácidos lábeis,grupos fotolábeis, grupos lábeis de peptidase ou grupos lábeis de esterase,conforme descrito nas patentes identificadas acima. Grupos de ligaçãoadicionais são descritos e exemplificados no presente.
Os conjugados do anticorpo e maitansinóide podem serfabricados através da utilização de uma série de agentes acopladoresprotéicos bifuncionais, tais com propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio)(SPDP), cicloexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometi!a)(SMCC)1 iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais comoadipimidato de dimetila HCI), ésteres ativos (tais como suberato dedisuccinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (taiscomo bis-(para-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (taiscomo bis-(para-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Os agentes acopladores particularmente preferidosincluem propionato de N-succinimidil-3-(2-piridiltio) (SPDP) (Carlsson et ai,Biochem. J. 173: 723-737 (1978)) e pentanoato de N-succinimidil-4-(2-piridiltio)(SPP) para proporcionar ligação dissulfeto.
O Iigante pode estar unido à molécula de maitansinóide emdiversas posições, dependendo do tipo da ligação. Uma ligação éster pode serformada, por exemplo, através da reação com um grupo hidroxila, utilizando-setécnicas convencionais de acoplamento. A reação pode ocorrer na posição C-3que possui um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetila,na posição C-15 modificada com um grupo hidroxila e na posição C-20 quepossui um grupo hidroxila. Em uma realização preferida, a ligação é formadana posição C-3 de maitansinol ou um análogo do mesmo.
(2) Auristatina ε Dolostatina
Em alguns exemplos de realização, o imunoconjugadocompreende um anticorpo da invenção conjugado com dolastatinas oupeptídicos análogos da dolastatinas ou derivados, por exemplo, auristatinas(Patentes US 5.635.483; US 5.780.588). Dolastatinas e auristatinas mostraraminterferir com a dinâmica do microtúbulo, hidrólise da GTP e divisão nuclear ecelular (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) e possuem atividade antineoplásica (Patente US 5.663.149) eantifúngica (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). Afração da droga dolastatina ou auristatina pode ser unida covalentemente a umanticorpo através do (amino) N-terminal ou do C (carboxila) terminal da fraçãopeptídica da droga (documento WO 02/088172).
Realizações exemplares de auristatina incluem a molécula dadroga monometilauristatina ligada ao N-terminal DE e DF, divulgados emuMonomethyIvaIine Compounds Capable of Conjugation to Ligands", volume45, Número do resumo 623, apresentado em 28 de março de 2004, adivulgação do qual é expressamente incorporada ao presente pela referênciaem sua totalidade.
Uma fração da droga peptídica poderá ser selecionada a partirdas Fórmulas De e Df abaixo:
No qual, a linha ondulada do De e Df indica o sítio de ligaçãocovalente a um anticorpo ou componente Iigante do anticorpo, de formaindependente em cada local:
R2 é selecionado a partir de H e CrC8 alquila;R3 é selecionado a partir de H1 Ci-C8 alquila, C3-C8 carbociclo,aril, C1-C8 alquila-arila, Ci-C8 alquila-(C3 - C8 carbociclo), C3-C8 heterociclo eCi-C8-alquila-(C3 - C8 heterociclo);
R4 é selecionado a partir de H1 Ci-C8 alquila, C3-C8 carbociclo,aril, Ci-C8 alquila-arila, Ci-C8-alquila (C3-C8 carbociclo), C3-C8 heterociclo e C1-C8-alquila-(C3 - C8 heterociclo);
R5 é selecionado a partir de H e metila;
ou R4 e R5 formam em conjunto um anel carbociclico e têm afórmula (CRaRb)n onde Ra e Rb são selecionados independentemente de H, C1- C8 alquila e Ci-C8 carbociclo e η é selecionado a partir de 2, 3, 4, 5 e 6 ;
R6 é selecionado a partir de H e C1-C8 alquila;
R7 é selecionado a partir de H, C1-C8 alquila, C3-C8 carbociclo,arila, C1-C8 alquila-arila, C1-C8 alquila-(C3 - C8 carbociclo), C3-C8 heterociclo eC^Cs-alquila-ÍCs - C8 heterociclo);
Cada R8 é selecionado independente a partir de H, OH, C1-C8alquila, C3-C8 carbociclo e CMC1-C8 alquila);
R9 é selecionado a partir de H e C1-C8 alquila;
R10 é selecionado a partir de arila ou C3-C8 heterociclo;
Z é O, S1 NH, ou NR12, onde R12 é C1-C8 alquila;
R11 é selecionado a partir de H, Cl-C20 alquila, arila, C3-C8heterociclo, -(R13O)m-R14, ou -(R13O)m-CH (R15)2;
m é um número inteiro variando de 1-1000;
R13 é C2-C8 alquila;
R14 é H ou C1-C8 alquila;
Cada ocorrência de R15 é independente H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, ou -(CH2)n-SO3-C1-C8aIquiIa;
Cada ocorrência de R16 é independente H, C1-C8 alquila, ou-(CH2)n-COOH;R18 é selecionado a partir de -C(R8)2-C(R8)2-arila,-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 heterociclo), e -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 carbociclo); eη é um número inteiro variando de 0 a 6.
Em uma realização, R31 R4 e R7 são independentementeisopropílico ou sec-butil e R5 é -H ou metil. Em uma realização exemplar, cadaR3 e R4 são isopropila, R5 é -H1 e R7 é sec-butil.
Em outra realização, cada R2 e R6 são metila, e R9 é -H.
Em outra realização ainda, cada ocorrência de R8 é -OCH3.
Em uma realização exemplar, cada R3 e R4 são isopropil, R2 e R6são metilo, R5 é -H, R7 é sec-butil, cada ocorrência de R8 é -OCH3, e R9 é -H.
Em uma realização, Z é -O- ou -NH-.
Em uma realização, R10 é arila.
Em uma realização exemplar, R10 é -fenil.
Em uma realização exemplar, quando Z é -O-, R11 é -H1 metil ou t-butil.
Em uma realização, quando Z é -NH1 R11 é -CH(R15)2, onde R15é-(CH2)nN(R16)2, e R16 é -C1-C8 alquila ou -(CH2)n-COOH.
Em outra realização, quando Z é -NH, R11 é -CH(R15)2, onde R15 é-(CH2)n-SO3H.
Uma realização de auristatina exemplar da Fórmula De é MMAE,onde a linha ondulada indica a ligação covalente a um ligante (L) de umconjugado droga-anticorpo:
<formula>formula see original document page 151</formula>
Uma realização de auristatina exemplar da Fórmula Df é MMAF,no qual a linha ondulada indica a ligação covalente a um ligante (L) de umconjugado droga-anticorpo (vide, Patente US 2005/0238649 e Doronina et al.(2006) Bioconjugate Chem. 17:114 -124):
<formula>formula see original document page 152</formula>
Outras drogas incluem as seguintes moléculas derivadas deMMAF1 no qual a linha ondulada indica a ligação covalente a um Iigante (L) deum conjugado droga-anticorpo:
<formula>formula see original document page 152</formula><formula>formula see original document page 153</formula>
Em um aspecto, grupos hidrofílicos incluindo, mas não limitado a,ésteres trietileno glicol (TEG)1 como mostrado acima, podem ser anexados amolécula da droga no R11. Sem estar ligado por qualquer teoria particular, osgrupos hidrofílicos podem ajudar na interiorização e não-aglomeração damolécula de droga.
Realizações exemplares de ADCs da Fórmula I compreendemuma auristatina/ dolastatina ou derivado destes estão descritos na Patente US2005-0238649 Α1 e Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124,que é expressamente incorporadas ao presente pela referência. Realizaçõesexemplares de ADCs da Fórmula I compreendendo MMAE ou MMAF ecomponentes Iigantes têm as seguintes estruturas e abreviaturas (onde "Ab" éum anticorpo; ρ é cerca de 1 a 8, "Val-Cit" é um dipeptídeo valina-citrulina; e"S" é um átomo de enxofre:
<formula>formula see original document page 154</formula>
Realizações exemplares de ADCs da Fórmula I compreendendoMMAF e vários componentes Iigantes incluem adicionalmente Ab-MC-PAB-MMAF e Ab-PAB-MMAF. De maneira interessante, imunoconjugadoscompreendendo MMAF ligado a um anticorpo com um Iigante que não sejaclivável proteoliticamente demonstram possuir atividade comparável aosimunoconjugados que compreendiam MMAF ligado a um anticorpo com umIigante clivável proteoliticamente. Vide, Doronina et al. (2006) BioconjugateChem. 17:114-124. Em tais casos, acredita-se que a liberação da droga doanticorpo poderá ser feita pela degradação na célula. Id.
Tipicamente, frações da droga baseadas em peptídeo podem serpreparadas formando uma ligação de peptídeos entre dois ou maisaminoácidos e/ou fragmentos de peptídeos. Tais ligações de peptídeos podemser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de faselíquida (vide, E. Schrõder e K. Lübke, "The Peptides", volume 1, págs 76-136,1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química depeptídeos. As moléculas das drogas auristatina/dolastatina podem serpreparadas de acordo com os métodos da Patente 2005-0238649 A1, PatenteUS 5.635.483; Patente US 5.780.588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soe.111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-CancerDrug Design 13:243-277; Pettit,GR, et al. Syntesis, 1996, 719-725; e Pettit et al (1996) J. Chem. Soe. PerkinTrans. 1 5:859-863. Vide também Doronina (2003) Nat Biotechnol 21 (7):778-784.
Particularmente, moléculas de drogas auristatina / dolastatina daFórmula Df, tais como MMAF e seus derivados, podem ser preparados usandométodos descritos na Patente US 2005-0238649 A1 e Doronina et al. (2006)Bioconjugate Chem. 17:114-124. Moléculas de drogas Auristatina / dolastatinada Fórmula De, tais como MMAE e seus derivados, podem ser preparadosusando métodos descritos em Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784.
Moléculas Iigantes de drogas MC-MMAF, MC-MMAE, MC-VC-PAB-MMAF eMC-VC-PAB-MMAE podem ser convenientemente sintetizados por métodos derotina, por exemplo, como descrito em Doronina et al. (2003) Nat. Biotech.21:778-784, e Pedido de Patente US 2005/0238649 A1 e, em seguida,conjugado com um anticorpo de interesse.
(3) Caliqueamicina
Em outro exemplo de realização, o imunoconjugado compreendeum anticorpo da invenção conjugado a uma ou mais moléculas decaliqueamicina. A família caliqueamicina de antibióticos é capaz de produzirquebras de DNA de fita dupla em concentrações sub-picomolares. Para apreparação de conjugados da família de caliqueamicina, vide as patentes US5.712.374, US 5.714.586, US 5.739.116, US 5.767.285, US 5.770.701, US5.770.710, US 5.773.001 e US 5.877.296 (todas da American CyanamidCompany). Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser utilizadosincluem, mas sem limitar-se a, γι1, α2', α3', N-acetil-γι1, PSAG e θ'ι (Hinman etai., CancerResearch 53: 3336-3342 (1993), Lode et ai., CancerResearch 58:2925-2928 (1998) e as patentes US da American Cyanamid citadas acima).Outra droga antitumoral à qual o anticorpo pode ser conjugado é QFA, que éum antifolato. Tanto caliqueamicina quanto QFA contêm sítios intracelulares deação e não atravessam facilmente a membrana plasmática. Portanto, aabsorção celular desses agentes através de internalização mediada poranticorpos aumenta grandemente seus efeitos citotóxicos.
c) Outros Agentes Citotóxicos
Outros agentes antitumor que podem ser conjugados aosanticorpos da invenção incluem BCNU, estreptozocina, vincristina e 5-fluorouracil, a família do complexo de agentes conhecidos coletivamente comoLL-E33288 descrito nas patentes US 5.053.394 e US 5.770.710, bem como asesperamicinas (Patente US 5.877.296).
Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podemser utilizados incluem cadeia A de difteria, fragmentos ativos não-ligantes datoxina de difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeiaA rícina, cadeia A de abrina, cadeia A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas deAleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytoiaca americana (PAPI,PAPII e PAP-S), inibidor Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor deSapaonaria officinaiis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina,enomicina e os tricotecenos. Vide1 por exemplo, o documento WO 93/21232,publicado em 28 de outubro de 1993.
A presente invenção contempla adicionalmente um antagonistaconjugado a um composto com atividade nucleolítica (por exemplo,ribonuclease ou uma endonuclease de DNA1 tal como deoxirribonuclease;DNase).
Em alguns exemplos de realização, um imunoconjugado podeconter um átomo altamente radioativo. Uma série de isótopos radioativos édisponível para a produção de antagonistas radioconjugados. Exemplosincluem At211, I1311 I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P321 Pb212 e isótoposradioativos de Lu. Quando o conjugado for utilizado para diagnóstico, ele podecompreender um átomo radioativo para estudos cintilográficos, por exemplo,tc OU 1 , ou uma marcação "spiri" para formação de imagem através deressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como formação deimagem por ressonância magnética, MRI), tal como iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ouferro.
A radiomarcação ou outras marcações podem ser incorporadasao conjugado de formas conhecidas. O peptídeo pode ser, por exemplo,biosintetizado ou pode ser sintetizado através de síntese química deaminoácidos, utilizando precursores de aminoácidos apropriados, envolvendo,por exemplo, flúor-19 no lugar de hidrogênio. Marcadores tais como tc99m, I123,Re , Re e In podem ser ligadas através de um resíduo de cisteína nopeptídeo. ítrio-90 pode ser ligado através de um resíduo de lisina. O métodoIodogen (Fraker et ai (1978), Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)pode ser utilizado para a incorporação de iodo-123. Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy (Chatal, CRC Press, 1989) descreve outros métodos emdetalhes.Em certas realizações, um imunoconjugado pode incluir umanticorpo anti-TAT226 da invenção conjugada a uma pró-droga ativando umaenzima que converte a pró-droga (por exemplo, um agente quimioterápicopeptidil, vide documento WO 81/01145) para uma droga ativa, como umadroga antineoplásica. Tais imunoconjugados são úteis na Terapia de Pró-Droga de Enzimas Dirigidas a Anticorpos ("ADEPT"). Enzimas que podem serconjugadas com um anticorpo anti-TAT226 da invenção incluem, mas não selimitam a, fosfatases alcalinas, que são úteis para converter pró-drogascontendo fosfato em drogas livres; arilsulfatases, que são úteis para aconversão de pró-drogas contendo sulfato em drogas livres;Citosina-deaminase, que é útil para a conversão da 5-fluorocitosina não-tóxicasem droga antineoplásica, 5-fluorouracilo; proteases, tais como a protease daSerratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais comocatepsinas B e L), que são úteis para converter pró-drogas contendo peptídeosem drogas livres; D-alanilcarboxipeptidases, que são úteis para a conversão depró-drogas contendo D-aminoácidos substituintes; enzimas que clivamcarboidratos como a β-galactosidase e neuraminidase, que são úteis para aconversão de pró-drogas glicosilada em drogas livres; β-lactamases, que é útilpara converter as drogas derivatizadas com β-lactâmicos em drogas livres;amidases e penicilina, tais como a penicilina V amidase e penicilina Gamidase, que são úteis para a conversão de drogas derivatizadas em seusnitrogênios com grupos aminas fenoxiacetil ou fenilacetil, respectivamente, emdrogas livres. As enzimas podem estar ligadas covalentemente a anticorposanti-TAT226 da invenção por técnicas de DNA recombinante bem conhecidasna técnica. Vide, por exemplo, Neuberger etal., Nature 312:604-608 (1984).
d) Incorporação De Fármacos
A incorporação de fármacos é representada por ρ, o númeromédio de fármacos por moléculas de anticorpo em uma molécula da Fórmula I.A incorporação de fármacos pode variar entre 1 a 20 moléculas de fármacos(D) por anticorpos. ADCs da Fórmula I incluem coleções de anticorposconjugados com uma série de moléculas de drogas, a partir de 1 até 20. Onúmero médio de moléculas de fármacos por moléculas de anticorpospresente nas preparações de ADC a partir de reações conjugação podem sercaracterizadas por métodos convencionais, tais como espectroscopia demassa, teste de ELISA e HPLC. A distribuição quantitativa de ADC, em termosdo ρ também pode ser determinada. Em alguns casos, a separação,purificação e caracterização de homogeneidade do ADC onde ρ é valor deADC com outras incorporações de fármacos podem ser obtidas através demeios como, por exemplo, HPLC de fase inversa ou eletroforese.
Para alguns conjugados anticorpo-droga, o ρ pode ser limitadopelo número de sítios de ligação com o anticorpo. Por exemplo, quando aligação é uma cisteína tiol, como no exemplo de realização acima, umanticorpo pode ter apenas um ou vários grupos tiol cisteína, ou podem terapenas um ou vários grupos tiol suficientemente reativos através do qual umligante pode ser anexado. Em certas realizações, uma maior incorporação defármacos, por exemplo, p> 5, pode causar agregação, insolubilidade,toxicidade ou perda da permeabilidade celular de certos conjugados anticorpo-droga. Em certas realizações, a incorporação de fármacos para um ADC dainvenção varia de 1 a cerca de 8; de cerca 2 a cerca de 6 ou 3 a cerca de 5. Defato, demonstrou-se que, para certos ADCs1 o relação ótima de droga pormoléculas anticorpo pode ser inferior a 8, e poderá ser cerca de 2 a cerca de 5.Vide US 2005-0238649 A1.
Em certos exemplos de realizações, menos do que o máximoteórico de moléculas de drogas são conjugados para um anticorpo duranteuma reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, resíduosIisina que não reagem com o Iigante intermediário com a droga ou reagentesligante, como discutido abaixo. Geralmente, os anticorpos não contêm muitosgrupos cisteína tiol livres ou reativos que podem ser ligados a uma molécula dedroga; de fato, existem mais resíduos cisteína tiol em anticorpos como pontesde dissulfeto. Em certas realizações, um anticorpo pode ser reduzido com umagente redutor como ditiotreitol (DTT) ou tricarboniletilfospina (TCEP), sobcondições de redução parcial ou total, para gerar grupos cisteína tiol reativos.Em certas realizações, um anticorpo é submetido a condições de desnaturaçãopara revelar os grupos nucleofílicos reativos, tais como Iisina ou cisteína.
A incorporação (relação droga / anticorpo) de um ADC pode sercontrolada de diversas formas, por exemplo: (i) limitando o excesso de liganteintermediário de droga ou reagentes Iigantes em relação aos anticorpos, (ii)limitando o temo de reação de conjugação ou temperatura, e (iii) limitando ascondições redutoras para modificações de cisteína tiol.
Deve ser compreendido que quando mais um grupo nucleofílicoreage com um ligante intermediário de droga ou reagente ligante seguido peloagrupamento reagente da droga e, em seguida, o produto resultante é umamistura de compostos ADC com uma distribuição de uma ou mais moléculasde droga ligadas a moléculas anticorpo. O número médio de medicamentospor anticorpos podem ser calculados a partir da mistura com um ensaio comanticorpos por de ELISA duplo, que é específico para anticorpos e específicospara a droga. Moléculas ADC individuais podem ser identificadas na misturapor espectroscopia de massa e separados por HPLC, por exemplo,cromatografia de interação hidrofóbica (vide, por exemplo, Hamblett, KJ, et al."Effect of drug Ioading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity ofan anti-CD30 antibody-drug conjugate", resumo n°. 624, American Associationfor Câncer Research, Reunião Anual de 2004, março 27-31, 2004, Atas doAACR, Volume 45 de março de 2004; Alley, SC, et al. "Controlar a localizaçãoda droga anti-droga em penhora conjugados," Resumo No. 627, Encontroanual do American Association for Câncer Research, 27-31 março de 2004,Atas do AACR, Volume 45 de março de 2004). Em realizações específicas, umADC homogêneo, com um único valor de incorporação pode ser isolado apartir da mistura de conjugação por eletroforese ou cromatografia.
e) Métodos De Preparação De Imunoconjügados
O ADC da fórmula I pode ser preparado por diversos protocolos,empregando reações de química orgânica, circunstancias e reagentesconhecidos por hábeis na técnica, incluindo: (1) reação de um gruponucleofílico de um anticorpo com um reagente Iigante bivalente para formar Ab-L, através de uma ligação covalente, seguida pela reação com a fração dedroga D; e (2) reação de um grupo nucleofílico de uma fração da droga comum reagente Iigante bivalente, para formar D-L, através de uma ligaçãocovalente, seguida pela reação com o grupo nucleofílico de um anticorpo.Métodos adicionais para preparação de ADC da Fórmula I, através da últimarota são descritos na US 2005-0238649 A1, que é expressamenteincorporadas ao presente pela referência.
Os grupos nucleofílico nos anticorpos incluem, mas não sãolimitados: (i) grupos amino N-terminal, (ii) grupos amino da cadeia lateral, porexemplo lisina, (iii) grupos tiol da cadeia lateral, por exemplo cisteína, e (iv)hidroxila do açúcar ou grupos amino onde o anticorpo é glicosilado. Os gruposamino, tiol e hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir às ligações deforma covalente com os grupos eletrofílicos em frações dos Iigantes ereagentes Iigantes incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres de NHS,ésteres de HOBt1 haloformatos, e halides ácidos; (ii) Alquilas e halides benziltais como haloacetamidas; (iii) grupos dos aldeídos, das cetonas, carboxil emaleimida. Determinados anticorpos têm intercadeias dissulfeto reduzidas, istoé, pontes de cisteína. Os anticorpos podem ser feitos reativos pela conjugaçãocom os reagentes Iigantes pelo tratamento com um agente redutor, tal comoDTT (ditiotreitol). Cada ponte do cisteína dará forma assim, teoricamente, adois tióis nucleofílicos reativos. Os grupos nucleofílicos adicionais podem serintroduzidos em anticorpos pela reação das Iisinas com 2-iminotiolano(reagente de Traut) tendo por resultado a conversão de uma amina em um tiol.Grupos reativos de tiol podem ser introduzidos no anticorpo (ou fragmentodeste) pela introdução de um, dois, três, quatro, ou mais resíduos de cisteína(por exemplo, preparando anticorpos mutantes compreendendo um ou maisresíduos de aminoácidos não-nativos).
Os conjugados de anticorpos com drogas da invenção podemtambém ser produzidos pela reação entre um grupo eletrofílico em umanticorpo como, por exemplo, grupo aldeído ou carbonil cetona, com um gruponucleofílico no reagente Iigante ou na droga. Grupos nucleofílicos úteis com umreagente Iigante incluem, mas não se limitam a, hidrazida, oxima, amino,hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato hidrazina, e arilhidrazida. Em umarealização, um anticorpo é modificado para introduzir moléculas eletrofílicasque são capazes de reagir com substituintes nucleofílicos sobre um reagenteIigante ou droga. Em outra realização, os açúcares de anticorpos glicosiladospodem ser oxidados, por exemplo, com reagentes de oxidação periodato, paradar forma ao aldeído ou aos grupos cetona que podem reagir com o grupoamino dos Iigantes reagentes ou moléculas da droga. Os grupos iminasresultantes de Schiff do podem dar forma a uma ligação estável, ou podem serreduzidos, por exemplo, pelo reagente borohidrido para formar ligações aminoestáveis. Em um exemplo de realização, a reação da porção do hidrato decarbono de um anticorpo glicosilado com a galactose oxidase ou ometaperiodato de sódio pode formar grupos carbonil (aldeído e cetona) naproteína que desta forma pode reagir com os grupos apropriados na droga(Hermanson, Bioconjugate Techniques). Em outro exemplo de realização, asproteínas que contêm a serina N-terminal ou os resíduos do treonina podemreagir com o meta-periodato de sódio, tendo por resultado a produção de umaldeído no lugar do primeiro aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992)Bioconjugate Chem. 3:138-146; Patente US 5362852). Tal aldeído pode reagircom um ligante reagente ou uma fração da droga nucleofílica.
Do mesmo modo, os grupos nucleofílicos em uma molécula dadroga incluem, mas não se limitam a: grupos amino, tiol, hidroxila, hidrazida,oxime, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina e gruposarilhidrazida capazes de reagir na forma de ligações covalente com os gruposelectrofílicos em frações do ligante e reagente do ligante incluindo: (i) ésteresativos, tais como, ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformatos e halidesácidos; (ii) Alquilas e halides benzil tais como haloacetamidas;; (iii) grupos dosaldeídos, das cetonas, carboxil e maleimida.
Os compostos da invenção contemplam expressamente, mas nãosão limitados a, ADC preparados com reagentes reticulantes: BMPS, EMCS,GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH1 SBAP, SIA1 SIAB, SMCC, SMPB1SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que sãodisponíveis comercialmente (por exemplo, pela Pierce Biotechnology Inc.,Rockford, IL., EUA). Vide as páginas 467-498 de Applications Handbook andCatalog 2003-2004.
Imunoconjugados compreendendo anticorpos e agentescitotóxicos também podem ser produzidos através da utilização de uma sériede agentes acopladores protéicos bifuncionais como, por exemplo, propionatode N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), cicloexano-1-carboxilato desuccinimidil-4-(N-maleimidometila) (SMCC), iminotiolano (IT)1 derivadosbifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCI), ésteresativos (tais como suberato de disuccinimidila), aldeídos (tais comoglutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis-(para-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(para-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato detolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina rícina pode ser preparadacomo descrito em Vitetta et ai, Science 238:1098 (1987). O 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno ácido triaminopentaacetico marcado comcarbono 14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para a conjugação deradionucleotídeos ao anticorpo. Vide documento W094/11026.
Alternativamente, pode ser feita uma proteína de fusãocompreendendo um anticorpo e um agente citotóxico, por exemplo, portécnicas recombinantes ou por síntese de peptídeos. Uma molécula de DNArecombinante pode compreender regiões que codifica o anticorpo e porçõescitotóxicas do conjugado tanto unido um ao outro, como separados por umaregião que codifica um peptídeo Iigante que não destrói as propriedadesdesejadas do conjugado.
Em outro exemplo de realização, o anticorpo pode estarconjugado a um "receptor" (como, por exemplo, a estreptoavidina) para autilização no tumor pré-alvo em que o conjugado anticorpo- receptor éadministrado ao paciente, seguido pela remoção de conjugado não ligado dacirculação usando um agente de limpeza e então a administração de um"ligante" (por exemplo, avidina) que é conjugado a um agente citotóxico (porexemplo, um radionucleotídeo).
D. Formulações Farmacêuticas
Em um aspecto, a invenção fornece ainda formulaçõesfarmacêuticas compreendendo pelo menos um anticorpo anti-TAT226 dainvenção e / ou, pelo menos, um imunoconjugado. Em algumas realizações,uma formulação farmacêutica compreende: 1) um anticorpo anti-TAT226 e/ouimunoconjugado deste, e 2) um veículo farmaceuticamente aceitável. Emalgumas realizações, uma formulação farmacêutica compreende: 1) umanticorpo anti-TAT226 e/ou um imunoconjugado deste e, opcionalmente, 2),pelo menos mais um agente terapêutico. Agentes terapêuticoscomplementares incluem, mas não se limitam a, aqueles descritos abaixo, naseção E.2.
Formulações terapêuticas compreendendo o anticorpo dainvenção são preparadas são preparadas para o armazenamento através damistura de um anticorpo que tenha o grau desejado de pureza com veículos,excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), naforma de formulações liofilizadas, soluções aquosas ou outras formulaçõessecas. Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são atóxicos parapacientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões taiscomo fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos, antioxidantes que incluemácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto deoctadecildimetilbenzilamônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio,cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquilparabenos taiscomo metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol emeta-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas;polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais comoglicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos,dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas;agentes quelantes tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol,trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sais tais como sódio;complexos metálicos (por exemplo, complexos protéicos de Zn); e/outensoativos não-iônicos, tais como TWEEN ™, PLURONICS™ oupolietilenoglicol (PEG). As formulações a serem utilizadas para administraçãoin vivo devem ser estéreis. O que é seguido por filtração através dasmembranas de filtração.
Os ingredientes ativos podem também ser armazenados emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas conservação oupolimerização interfacial, tais como microcápsulas de hidroximetilcelulose oumicrocápsulas de gelatina e de poli-(metacrilato de metila), respectivamente,em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos,microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ouem macroemulsões. Ditas técnicas são descritas em Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada.
Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem
matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham o
anticorpo ou o imunoconjugado da invenção, que se encontram na forma de
artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes det.
liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (tais como poli-(metacrilatode 2-hidroxietila) ou álcool poli-(vinílico)), poli-lactídeos (Patente US3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de g etila, acetatode etilenovinila não-degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico eácido glicólico, tal como LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveiscompostas de copolímero de ácido láctico e ácido glicólico e acetato deleuprolide) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Embora polímeros tais comoetilenovinilacetato e ácido láctico-ácido glicólico permitam a liberação demoléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas porperíodos de tempo mais curtos. Quando anticorpos encapsuladospermanecem no organismo por um longo período de tempo, eles podemdesnaturas ou agregar como resultado da exposição à umidade a 37°C,resultando em uma perda da atividade biológica e possíveis mudanças naimunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planejadas paraestabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se omecanismo de agregação for descoberto para ser a formação de ligação S-Sintermolécula através intercadeia tio-sulfeto, a estabilização pode seralcançada por resíduos sulfidrila, liofilização de soluções ácidas, controle doteor da umidade, utilizando aditivos apropriados, e desenvolvimento decomposições específicas de matrizes de polímero.
E. Métodos de Uso dos Anticorpos Anti-TAT226 ε Imunoconjugados
1. Métodos diagnósticos ε Métodos de Detecção
Em um aspecto, anticorpos anti-TAT226 e imunoconjugados dainvenção são úteis para detectar a presença de TAT226 em uma amostrabiológica. O termo "detectar", como utilizado no presente engloba a detecçãoquantitativa ou qualitativa. Em certas realizações, uma amostra biológicacompreende uma célula ou tecido, tais como os tecidos enumerados na Figura13. Em algumas realizações, tais tecidos incluem tecidos normais e/ou tecidoscancerosos que expressam TAT226 em níveis mais elevados comparado aoutros tecidos, por exemplo, ovário, rins, cérebro, endométrio, supra-renal,ossos, pulmões, pele e tecidos moles.
Em um aspecto, a invenção fornece um método para a detecçãoda presença de TAT226 em uma amostra biológica. Em algumas realizações,o método compreende em expor a amostra biológica ao anticorpo anti-TAT226em condições permissivas para a ligação do anticorpo anti-TAT226 aoTAT226, e assim detectar se um complexo foi formado entre o anticorpo anti-TAT226 e TAT226.
Em um aspecto, a invenção fornece um método diagnóstico deuma doença associada ao aumento da expressão de TAT226. Em certasrealizações, o método compreende expor uma célula de ensaio a um anticorpoanti-TAT226; determinando o nível de expressão (tanto quantitativa comoqualitativamente) do TAT226 na célula de ensaio, detectando a ligação doanticorpo anti-TAT226 a TAT226, e comparando os níveis de expressão deTAT226 na célula de ensaio com o nível de expressão de TAT226 em célulascontrole (por exemplo, uma célula normal do mesmo tecido de origem da célulade ensaio ou uma célula que expressa TAT226 em níveis comparáveis a deuma célula normal), no qual, um maior nível de expressão de TAT226 na célulade ensaio, em comparação com a célula controle indica a presença de umadoença associada ao aumento de expressão de TAT226. Em algumasrealizações, a célula de ensaio é obtida a partir de um paciente com suspeitade ter uma doença associada ao aumento da expressão de TAT226. Emalgumas realizações, o distúrbio é um distúrbio da proliferação celular, comoum câncer ou tumor.
Exemplos de distúrbio da proliferação celular que podem serdiagnosticados usando um anticorpo da invenção incluem condições, comotumores cancerígenos, por exemplo, carcinomas (tumores epiteliais) eblastomas (tumores derivados de tecidos embrionários), e, em certosrealizações, câncer de ovário, câncer de útero, ( incluindo câncer doendométrio) e câncer de rim, incluindo nefroblastomas (por exemplo, tumor deWilm). Câncer de ovário, em especial, engloba um grupo heterogêneo detumores malignos derivados do ovário. Cerca de 90% dos tumores malignos doovário são de origem epitelial; o resto são tumores de células germinativas eestromais. Tumores epiteliais de ovário são classificados em três subtiposhistológicos: adenocarcinomas serosos (que constituem cerca de 50% dostumores epiteliais do ovário); adenocarcinoma endometrióide (~ 20%);adenocarcinoma mucinoso (~ 10%); carcinomas de células claras 5-10%);Tumores de Brenner (transição de células) (relativamente incomum). Oprognóstico do câncer de ovário, que é o sexto câncer mais comum emmulheres, tem geralmente prognóstico pobre, com taxas de sobrevida em cincoanos variando de 5-30%. Para exames de cânceres de ovário, vide Fox et ai(2002), "Pathology of epithelial ovarían câncer" em Ovarian Câncer , cap. 9(Jacobs et ai, Ed Oxford University Press, Nova Iorque); Morin et al (2001)"Ovarían Câncer" em Encyclopedic Reference of Câncer, págs.654-656(Schwab, Ed. Springer-Verlag, Nova Iorque). A presente invenção contemplamétodos diagnósticos ou de tratamento para qualquer subtipo de tumorovariano epitelial descrito acima, e, particularmente, o adenocarcinoma subtiposeroso.
Em certas realizações, um método diagnóstico ou para detecção,tais como os acima descritos, compreende em detectar a ligação do anticorpoanti-TAT226 ao TAT226 expresso na superfície de uma célula ou em umamembrana preparada obtida a partir de uma célula que expressa TAT226 emsua superfície. Em certas realizações, o método compreende em expor umcélula com um anticorpo anti-TAT226 em condições permissivas para a ligaçãodo anticorpo anti-TAT226 ao TAT226, e assim detectando se um complexo foiformado entre o anticorpo anti-TAT226 e o TAT226 na superfície da célula. Umteste exemplar para a detecção da ligação do anticorpo anti-TAT226 aoTAT226 expresso na superfície de uma célula é uma o ensaio de "FACS",como o descrito no Exemplo D, abaixo.
Alguns outros métodos podem ser usados para detectar a ligaçãodos anticorpos anti-TAT226 ao TAT226. Tais métodos incluem, mas não selimitam a, ensaios de ligação ao antígeno que são bem conhecidas no estadoda técnica, como o Western blots, radio-imunoensios, ELISA (ensaio deimunoabsorção enzimática), imunoensaios do tipo "sanduíche", ensaios deimunoprecipitação, imuno-ensaio fluorescente, imunoensaios de proteína A eimuno-histoquímica
(IHC).
Em certas realizações, anticorpos anti-TAT226 são marcados. Osmarcadores incluem, mas não estão limitados a, marcadores ou moléculas quesão detectados diretamente (como marcadores fluorescentes, cromofóricos,elétron-densos, quimioluminescentes, radioativos), bem como moléculas, taiscomo as enzimas ou ligantes, que são detectados indiretamente, por exemplo,por uma reação enzimática ou interação molecular. Exemplos de marcadoresincluem, mas não se limitam a, radioisótopos P321 C14, I125, H3 e I1311 fluorofórostal como quelatos raros ou fluoresceínas e seus derivados, rodamina e seusderivados, dansil, umbeliferona, luceriferase, por exemplo, Luciferase fírefly eLuciferases bacterianas (Patente US 4.737.456), Luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas, peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicoamilase, lisozima, sacarina oxidases, por exemplo, glicoseoxidase, galactose oxidase, e glicose-6-fosfato-desidrogenase, oxidasesheterocíclicas tais como uricase e xantina oxidase, conjugada com uma enzimaque emprega peróxido de hidrogênio para oxidar um corante precursor comoHRP, Iactoperoxidase ou microperoxidase, biotina/avidina, maracadores spin,bacteriófagos marcadores, radicais livres estáveis, e similares
Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-TAT226são imobilizados em uma matriz insolúvel. A imobilização implica na separaçãodos anticorpos anti-TAT226 a partir de qualquer TAT226 que permanece livrena solução. Isto é realizado convencionalmente, por qualquer insolubilizaçãodo anticorpo anti-TAT226 antes do procedimento de ensaio, como pelaadsorção em uma matriz ou superfície insolúvel em água (Bennich et al,Patente US 3720760), pelo acoplamento covalente (por exemplo, utilizandoreticulação em glutaraldeído) ou por insolubilização do anticorpo anti-TAT226 após, por exemplo, a imunoprecipitação.
Quaisquer situações das realizações referidas acima dediagnóstico ou detecção pode ser realizada utilizando um imunoconjugado dainvenção, no lugar ou em adição ao anticorpo anti-TAT226.2. Métodos Terapêuticos
Um anticorpo ou imunoconjugado da invenção pode ser utilizado,por exemplo, em métodos terapêuticos in vitro, ex vivo e in vivo. Em umaspecto, a invenção fornece métodos para inibir o crescimento ou aproliferação de células, tanto in vivo quanto in vitro, compreendendo o métodoem expor uma célula a um anticorpo anti-TAT226 ou imunoconjugado desteem condições permissivas para a ligação do imunoconjugado ao TAT226."Inibir o crescimento ou a proliferação celular" significa uma diminuição nocrescimento ou proliferação da célula em, pelo menos, 10%, 20%, 30%, 40%,50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 100%, e inclui induzir a morte celular. Emcertas realizações, a célula é uma célula tumoral. Em certas realizações, acélula é um tumor de células de ovário, um tumor células de útero, um tumorde células de cérebro, células de rim ou células tumorais. Em certasrealizações, a célula é uma xenoenxerto, por exemplo, como exemplificado nopresente.
Em um aspecto, um anticorpo ou imunoconjugado da invenção éutilizado para tratar ou prevenir um distúrbio da proliferação celular. Em certasrealizações, o distúrbio da proliferação celular está associado ao aumento daexpressão e/ou atividade de TAT226. Por exemplo, em determinadosrealizações, o distúrbio da proliferação celular está associado a um aumentoda expressão de TAT226 na superfície de uma célula. Em certas realizações, odistúrbio da proliferação celular é um tumor ou câncer. Exemplos de distúrbiosda proliferação celular que pode ser tratada pelos anticorpos ouimunoconjugados da invenção incluem, mas não se limitam a, condições cancerosas como, tais como tumores, por exemplo, carcinomas (tumoresepiteliais) e blastomas (tumores derivados de tecido embrionário), e, em certasrealizações, câncer de ovário, câncer de útero, incluindo câncer do endométrio;tumores cerebrais (por exemplo, astrocitomas, englobando gliomas de estágioavançado, também referido como glioblastoma multiforme) e câncer de rim,incluindo nefroblastoma (por exemplo, tumor de Wilm).
Em um aspecto, a invenção fornece métodos para o tratamentode um distúrbio da proliferação celular compreendendo em administrar a umindivíduo uma quantidade eficaz de anticorpo anti-TAT226 ou imunoconjugado.Em certas realizações, um método para o tratamento de um distúrbio daproliferação celular compreende em administrar a um indivíduo umaquantidade eficaz de uma formulação farmacêutica que inclua o anticorpo anti-TAT226 e, facultativamente, pelo menos um agente terapêutico adicional, taiscomo os abaixo fornecidos. Em realizações específicas, um método paratratamento de um distúrbio da proliferação celular compreende em administrarao indivíduo uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica queinclua: 1) um imunoconjugado compreendendo um anticorpo anti-TAT226 e umagente citotóxico; e, opcionalmente, 2), pelo menos, um agente terapêuticoadicional, tais como os fornecidos abaixo.
Em um aspecto, pelo menos alguns dos anticorpos ouimunoconjugados da invenção pode se ligar a TAT226 de espécies nãohumanas. Assim, anticorpos ou imunoconjugados da invenção podem serutilizados para ligar ao TAT226, por exemplo, em uma cultura de célulascontendo TAT226, de seres humanos ou de outros mamíferos possuindoTAT226 com o qual um anticorpo ou imunoconjugado da invenção reagecruzadamente (por exemplo, chimpanzé, babuíno, mico, cinomolgo e macacosRhesus, porco ou rato). Em uma realização, um anticorpo anti-TAT226 ouimunoconjugado pode ser usada para inibir uma atividade de TAT226 pelocontato do anticorpo ou imunoconjugado com TAT226 de modo que aatividade de TAT226 é inibida. Em uma realização, o TAT226 é TAT226humano.
Em uma realização, um anticorpo anti-TAT226 ouimunoconjugado podem ser utilizados em um método para ligar ao TAT226 emum indivíduo que sofre de uma doença associada ao aumento da expressãoe/ou atividade de TAT226, compreendendo o método em administrar aoindivíduo o anticorpo ou imunoconjugado de modo que estes se liguem ao TAT226. Em uma realização, o TAT226 é TAT226 humano, e o indivíduo é umindivíduo humano. Alternativamente, o indivíduo pode ser um mamíferoexpressando TAT226 ao qual o anticorpo anti-TAT226 se liga. O indivíduopode ser ainda um mamífero no qual o TAT226 tenha sido introduzido (porexemplo, através da administração de TAT226 ou a expressão de umtransgene que codifica TAT226).
Um anticorpo anti-TAT226 ou imunoconjugado pode seradministrado a um humano para fins terapêuticos. Além disso, um anticorpoanti-TAT226 ou imunoconjugado pode ser administrado a um mamífero não-humano expressando TAT226 com o qual o anticorpo reage cruzadamente(por exemplo, um primata, porco, rato ou camundongo) para fins veterináriosou como um modelo animal de doenças humanas. Co relação a este último,estes modelos animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica dosanticorpos ou imunoconjugados da invenção (por exemplo, testes de dosagense cursos de tempo da administração).
Anticorpos ou imunoconjugados da invenção podem ser usadosisoladamente ou em combinação com outras composições em uma terapia.Por exemplo, um anticorpo ou imunoconjugado da invenção pode ser co-administrado com pelo menos mais um agente terapêutico e/ou adjuvante. Emcertas realizações, um agente terapêutico é um agente citotóxico, um agente quimioterápicos ou um agente inibidor do crescimento. Em uma dessasrealizações, um agente quimioterápico é um agente ou uma combinação deagentes utilizados no tratamento de câncer de ovário, como um composto deplatina (por exemplo, cisplatina ou carboplatina); um taxanos (por exemplo,paclitaxel ou docetaxel); topotecano; uma antraciclina (por exemplo, adoxorrubicina (AD RIAMYC IN®) ou doxorubicina lipossómica (DOXIL®));gemcitabina; ciclofosfamida; vinorelbina (NAVELBINE ®); hexametilmelamina;lfosfamida; e etoposídeo. Em outras dessas realizações, um agentequimioterápico é um agente ou uma combinação de agentes utilizados notratamento do câncer de endométrio ou de útero, tais como a cisplatina,carboplatina, doxorrubicina, paclitaxel, metotrexato, fluorouracilo emedroxiprogesterona. Em outra realização, um agente quimioterápico é umagente ou combinação de agentes utilizados no tratamento de tumorescerebrais, tais como um nitrosourea (por exemplo, carmustina ou lomustina),um agente citotóxico (por exemplo, irinotecano ou temozolamida); um agenteanti-angiogênico (por exemplo, talidomida, PNT-470, fator 4 plaquetário,interferon e endostatina); agente de diferenciação (por exemplo, por retinóides,fenilbutirato, fenilacetato e anti-neoplastons agente anti-invasivos (porexemplo, inibidores da metaloproteinase da matriz como marimastat); ummodulador de sinal de transdução (por exemplo, tamoxifeno, briostatina, e 0-6benziguanina), um inibidor da topoisomerase (por exemplo, irinotecano outopotecan) e um fator inibidor do crescimento (por exemplo, um inibidor datirosina quinase). Em outra realização, um agente quimioterápico é um agenteou uma combinação de agentes utilizados no tratamento do câncer de rim (porexemplo, tumor de Wilm), tais como a vincristina, actinomicina D, adriamicina,doxorrubicina, ciclofosfamida, lfosfamida, etoposídeo, e carboplatina. Emcertas realizações, um anticorpo da invenção pode ser combinado com umantiinflamatório e/ou anti-séptico.
Esta combinação referida acima abrange terapias deadministração combinadas (quando dois ou mais agentes terapêuticos sãoincluídos na mesma formulação ou em formulações distintas), e aadministração separada, e nesse caso, a administração do anticorpo ouimunoconjugado da invenção pode ocorrer antes, de maneira simultânea, e/ouposteriormente, a administração adicional do agente terapêutico e/ouadjuvante. Anticorpos ou imunoconjugados da invenção também podem serusados em combinação com a radioterapia.
O anticorpo ou imunoconjugado da invenção (e qualquer agenteterapêutico ou adjuvante adicional) podem ser administrados por qualquermeio apropriado, que inclui a via parenteral, subcutâneo, intraperitoneal,intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, administraçãointralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular,intravenosa, intraarterial, intraperitoneal ou subcutânea. Além disso, oantagonista é administrado adequadamente por meio de pulso de infusão,particularmente com doses decrescentes do anticorpo ou imunoconjugado.Preferencialmente, a dosagem é fornecida por meio de injeções, de maiorpreferência injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo, em parte dese a administração é breve ou crônica.
Quando o alvo de ligação está localizado no cérebro, certasrealizações da invenção prevêem que o anticorpo ou imunoconjugadoatravessa a barreira hematoencefálica. Diversas abordagens bem conhecidasno estado da técnica existem para o transporte de moléculas através dabarreira hematoencefálica, incluindo, mas não se limitado a, métodos físicos,métodos a base de lipídios, e métodos de receptores à base de canal.
Métodos físicos para o transporte do anticorpo ouimunoconjugado através da barreira hematoencefálica incluem, mas não selimitam a, contornar a barreira hematoencefálica, inteiramente, ou através dacriação de aberturas na barreira hematoencefálica. Métodos de evasão queincluem, mas não se limitam a, injeção direta no cérebro (vide, por exemplo,Papanastassiou et al. GeneTherapy, 9: 398-406 (2002)), entraga por perfusão /convecção intersticial de realce (vide, por exemplo, Bobo et al., Proc. NatiAcad. Sei. USA. 91: 2076-2080 (1994)), e um implante de um dispositivo deentrega no cérebro (vide, por exemplo, Gill et al., Nature Med. 9:589-595 (2003); e Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical). métodos para a criaçãode aberturas na barreira hematoencefálica incluem, mas não se limitam a,ultra-som (vide, por exemplo, Patente Publicada 2002/0038086), pressãoosmótica (por exemplo, através da administração de manitol hipertônico(Neuwelt, EA, Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vol 1e 2, Plenum Press, Nova Iorque (1989)), permeabilização, por exemplo, porbradicinina ou permeabilizante A-7 (vide, por exemplo, Patentes US 5.112.596,US 5.268.164, US 5.506.206 e Us 5.686.416), E transfecções de neurôniosque transpõe a barreira hematoencefálica com vetores contendo genes quecodificam o anticorpo (vide, por exemplo, Pedido de Patente Publicada2003/0083299).
Métodos baseados em lipídeos para o transporte do anticorpo ouimunoconjugado por toda a barreira hematoencefálica incluem, mas não selimitam a, englobar o anticorpo ou imunoconjugado em Iipossomas que estãoacoplados aos fragmentos Iigantes de anticorpo que se ligam aos receptoressobre o endotélio vascular da barreira hematoencefálica (vide, por exemplo,Pedido de Patente US 2002/0025313), e o revestimento do anticorpo ouimunoconjugado em partículas de lipoproteína de baixa densidade (vide, porexemplo, Pedido de Patente US 2004/0204354) ou apo-lipoproteína E (vide,por exemplo, Pedido de Patente US 20040131692).
Métodos de transporte de um anticorpo ou imunoconjugadobaseados em célula-tronco através da barreira hematoencefálica implica emcélulas progenitoras neurais geneticamente modificadas (NPCs), paraexpressar o anticorpo ou imunoconjugado de interesse e, em seguida, aimplantação de células-tronco no cérebro do indivíduo a ser tratado. VideBehrstock et al. (2005) Gene Ther. 15 de Dezembro de 2005, publicação on-line (relata que NPCs modificadas por engenharia genética expressam o fatorneurotrófico GDNF reduzindo os sintomas da doença de Parkinson quandoimplantados no cérebro de modelos roedores e primatas).
Os métodos baseados em receptores e canais para o transportedo anticorpo ou imunoconjugado através da barreira hematoencefálicaincluem, mas não estão limitados a, utilização de bloqueadores glicocorticóidepara aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica (vide, porexemplo, pedidos de Patentes US 2002/0065259, US 2003/0162695, US2005/0124533); ativando canais de potássio (vide, por exemplo, pedido dePatente US 2005/0089473), drogas inibidoras de transportadores ABC (vide,por exemplo, pedido de Patente US 2003/0073713); anticorpos com umrevestimento de transferrina que modulam a atividade de um ou maisreceptores de transferrina (vide, por exemplo, pedido de Patente US2003/0129186), e anticorpos cationizantes (vide, por exemplo, Patente US5.004.697).
A composição de anticorpos ou imunoconjugados devem serformuladas, dosadas e administradas de uma forma consistente com as boaspráticas médicas. Fatores para consideração neste contexto incluem adisfunção particular a ser tratado, o mamífero específico a ser tratado, acondição clínica do paciente, o local de fornecimento do agente, o esquema deadministração e outros fatores conhecidos pelos médicos. O anticorpo ouimunoconjugado não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um oumais agente normalmente utilizado para prevenir ou tratar a disfunção emquestão. A quantidade eficaz destes outros agentes depende da quantidade doanticorpo presente na formulação, do tipo de disfunção ou tratamento, e outrosfatores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmasdosagens e com vias de administração conforme descritas acima ou cerca de 1a 99% das dosagens descritas no presente, ou em qualquer dosagem e porqualquer via de administração descrita que é empiricamente/ clinicamentedeterminada como sendo apropriada.
Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagemapropriada de anticorpo ou imunoconjugado (quando utilizado isoladamente ouem combinação com outros agentes tais como agentes quimioterápicos)dependerá do tipo de doença a ser tratado, do tipo de anticorpo ouimunoconjugado, da severidade e do curso da doença, se o anticorpo ouimunoconjugado é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos,terapia anterior, histórico clínico do paciente e reação ao anticorpo ouimunoconjugado e do critério do médico atendente. O anticorpo ouimunoconjugado é adequadamente administrado ao paciente em uma vez ouao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade dadoença, cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg (tal como 0,1 mg/kg a 10 mg/kg) deanticorpo ou imunoconjugado é uma possível dose inicial para administraçãoao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administraçõesseparadas ou por meio de infusão contínua. Uma dosagem diária típica poderávariar de cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatoresmencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias oumais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorrasupressão desejada de sintomas da doença. Uma dosagem exemplar doanticorpo ou imunoconjugado estará na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cercade 10 mg/kg. Desta forma, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer de suas combinações) podem seradministradas ao paciente. Essas doses podem ser administradasintermitentemente, tal como semanalmente ou a cada três semanas (porexemplo, de tal forma que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte,tal como cerca de seis doses do anticorpo ou imunoconjugado). Uma dose deataque inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas, pode seradministrada. Exemplo de regime de dosagem compreende a administração deuma dose de ataque inicial de cerca de 4 mg/kg, seguida por dose demanutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo. Entretanto, outrosregimes de dosagens podem ser úteis. O andamento desta terapia éfacilmente monitorado por meio de técnicas e testes convencionais.
3. Ensaios
Anticorpos anti-TAT226 e imunoconjugados da invenção podemser caracterizados pelas suas propriedades físicas / químicas e/ou atividadesbiológicas por diversos ensaios conhecido no estado da técnica.
a) Ensaios de Atividade
Em um aspecto, são fornecidos ensaios para a identificação deanticorpos anti-TAT226 ou imunoconjugados destes tendo atividade biológica.
A atividade biológica pode incluir, por exemplo, a capacidade de inibir ocrescimento ou proliferação celular (por exemplo, atividade de "matar células"),ou a capacidade de induzir a morte celular, incluindo a morte programada decélulas (apoptose). São também fornecidos anticorpos ou imunoconjugadosque têm essa atividade biológica in vivo e/ou in vitro.
Em certos exemplos de realizações, um anticorpo anti-TAT226 ouimunoconjugado deste é testado pela sua capacidade de inibir o crescimentoou a proliferação de células in vitro. Ensaios de inibição do crescimento ouproliferação celular são bem conhecidos no estado da técnica. Certos ensaiospara a proliferação celular, por exemplo, ensaios de "matar células" descrito nopresente, medem a viabilidade celular. Uma destes ensaios é o ensaio deviabilidade celular Iuminescente CeIITiter-GIoTM, que é comercialmentedisponível por Promega (Madison, Wl). Esse teste determina o número decélulas viáveis na cultura baseada na quantificação do ATP presente, que éuma indicação de células metabolicamente ativas. Vide, Crouch et al (1993) J.Immunol. Meth. 160:81-88, Patente US 6602677. O ensaio pode ser realizadoem placas de 96 ou 384 poços, submetendo-as a uma Seleção de AltoRendimento automatizada (HTS). Vide Cree et al (1995) AntiCancer Drugs6:398-404. O processo do ensaio envolve a adição de um único reagente(reagente CelITiter-GLO®) diretamente nas células cultivadas. Isto resulta nalise celular e a geração de um sinal luminescente produzido por uma reaçãocom Luciferase. O sinal Iuminescente é proporcional a quantidade de ATPpresente, que é diretamente proporcional ao número de células viáveispresentes na cultura. Os dados podem ser registrados por um luminômetro ouum dispositivo de imagem com câmera CCD. A luminescência de saída éexpressa em unidades relativa de luz (RLU).
Outro ensaio para a proliferação celular é o ensaio "MTT", umensaio colorimétrico que as mede a oxidação de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio brometo por formazan pela redutase mitocondrial. Tal como oteste CelITiter-GIo™, este teste indica o número de células metabolicamenteativas presentes em uma cultura de células. Vide, por exemplo, Mosmann(1983) J. Immunol. Meth. 65:55-63, e Zhang et al. (2005) CancerRes. 65:3877-3882.
Em um aspecto, um anticorpo anti-TAT226 é testado pela suacapacidade de induzir a morte celular in vitro. Ensaios para a indução da mortecelular são bem conhecidos no estado da técnica. Em algumas realizações,tais ensaios medem, por exemplo, a perda da integridade da membrana, assimcomo indicado pela captação de iodeto de propídio (PI), azul tripan (vide Mooreet al. (1995) Cytotechnology, 17:1-11), ou 7AAD. Em um ensaio de captaçãode Pl exemplar, as células são cultivadas em meio Dulbecco's Modified Eagle(D-MEM):Ham's F-12 (50:50) complementado com 10% de FBS inativo pelocalor (HycIone) e 2 mM de L-glutamina. Assim, o teste é realizado na ausênciade sistema complemento e células imuno efetoras. As células são semeadasem uma densidade de 3 χ 106 por placa em placas de 100 χ 20 mm e ascélulas deixadas aderir a placa overnight. O meio é removido e substituídoapenas por meio (puro) ou meio fresco com várias concentrações do anticorpoou imunoconjugado. As células são incubadas por um período de tempo de 3dias. Após o tratamento, monocamadas são lavadas com PBS e soltas portripsinização. As células são então centrifugadas a 1200 rpm durante 5 minutosa 4 0C1 o sedimento é resuspenso em 3 ml de tampão de ligação Ca2+ frio(10mM de Hepes, pH 7,4, 140 mM NaCI, 2,5 mM CaCI2) e aliquotado em 35mm tubos 12x75 mm strainer-capped (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo detratamento) para a remoção da massa celular. Os tubos então recebem Pl (10 Mg/ml). As amostras são analisadas através de um citômetro de fluxoFACScan™ e software FACSCONVERT CelIQuest™ (Becton Dickinson).Anticorpos ou imunoconjugados que induziram a morte celular de maneiraestatisticamente significante, conforme determinado pela captação de Pl foramentão identificados.
Em um aspecto, um anticorpo anti-TAT226 ou imunoconjugado étestado pela sua capacidade de induzir a apoptose (morte celular programada)in vitro. Um ensaio exemplar para pesquisa de anticorpos ou imunconjugadosque induzem a apoptose é um ensaio de ligação da anexina. Em um ensaio deligação da anexina exemplar, as células são cultivadas e semeadas em placas como discutido no parágrafo anterior. O meio é removido e substituído pormeio puro apenas ou médio fresco contendo 0,001 a 10 pg/ml do anticorpo ouimunoconjugado. Após um período de incubação de três dias, monocamadassão lavadas com PBS e soltas por tripsinização. As células são entãocentrifugadas, resuspensas em tampão de ligação Ca2+, e aliquotadas emtubos como discutido no parágrafo anterior. Os tubos então recebem a anexinamarcada (por exemplo, anexina V-FITC) (1 pg/ml). As amostras são analisadasatravés de um citômetro de fluxo FACScan™ e software FACSCONVERT™CelIQuest (BD Biosciences). Anticorpos ou imunoconjugados que induzem aligação da anexina de maneira estatisticamente significante em relação aocontrole são dessa maneira identificados. Outro ensaio exemplar parapesquisa de anticorpos ou imunoconjugados que induzem a apoptose é umensaio colorimétrico de ELISA para DNA-histonas para a detecçãointernucleosomal da degradação do DNA genômico. O referido ensaio pode serrealizado utilizando, por exemplo, o kit de ELISA "Cell Death Detection ELISAkit' (Roche, Palo Alto, Califórnia).
As células para uso em qualquer uma dos ensaios in vitroreferidos acima incluem células ou linhagens de células que expressamnaturalmente TAT226 ou que tenham sido modificadas para expressarTAT226. Essas células incluem células tumorais que superexpressam TAT226em relação a células normais do mesmo tecido de origem. Essas célulastambém incluir linhagem celulares (incluindo linhagem de células tumorais) queexpressam TAT226 e linhagem celulares que normalmente não expressamTAT226 mas foram transfectadas com ácidos nucléicos que codificam TAT226.
Exemplos de linhagens celulares previstas para o uso em qualquer um dosensaios referidos acima incluem a linhagem de células de câncer de ováriohumano OVCAR3, que expressa TAT226, e a linhagem de células de câncerde cólon humano HCT116 transfectadas com ácidos nucléicos que codificamTAT226.
Em um aspecto, um anticorpo anti-TAT226 ou imunoconjugadodeste é testado pela sua capacidade de inibir o crescimento ou proliferaçãocelular in vivo. Em certas realizações, um anticorpo anti-TAT226 ouimunoconjugado deste é testado pela sua capacidade de inibir o crescimentotumoral in vivo. Nos sistemas de modelo iη vivo, modelos como dexenoenxertos, podem ser utilizados para tais testes. Em um sistema dexenoenxerto exemplar, células tumorais humanas são introduzidas em umanimal não-humano convenientemente imunocomprometido, por exemplo, umcamundongo "nude" atímico. Um anticorpo ou imunoconjugado da invenção éadministrado ao animal. A capacidade do anticorpo ou imunoconjugado deinibir ou diminuir o crescimento tumoral é mensurado. Em certos exemplos derealizações no sistema de xenoenxerto acima, as células tumorais humanassão células tumorais de um homem doente. Esses modelos de xenoenxertossão comercialmente disponíveis pela Oncotest GmbH (Frieberg, Alemanha).Em certas realizações, as células tumorais humanas são células tumoraishumanas a partir de uma linhagem celular como, Poe exemplo, células0VCAR3, como exemplificado no presente. Em certas realizações, as célulastumorais humanas são introduzidas em um animal convenientementeimunocomprometido não-humano por injeção subcutânea ou por transplanteem um local adequado, como no panículo adiposo mamário.
b. Ensaios de Ligação ε Outros Ensaios
Em um aspecto, um anticorpo anti-TAT226 é testado pela suaatividade de ligação com o antígeno. Por exemplo, em determinadasrealizações, um anticorpo anti-TAT226 é testado por sua capacidade de seligar a TAT226 expresso na superfície de uma célula. Um ensaio FACS como odescrito no Exemplo D pode ser usada para esses testes.
Em um aspecto, um ensaio por competição pode ser utilizadopara identificar um anticorpo monoclonal que concorre com YW0.32, YW0.49,YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 ou YWO.49.H6 pela ligação comTAT226. Em certas realizações, um anticorpo concorrente liga-se ao mesmoepítopo (por exemplo, um epítopo linear ou epítopo conformacional) que éligado por YW0.32, YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 ouYWO.49.H6. Ensaios por competição exemplares incluem, mas não se limitama, ensaios rotina, tais como os descritos em Harlow e Lane (1988) Antibodies:A Laboratory Manual, Cap.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, NY). Métodos exemplares detalhados para mapeamento de epítoposao qual um anticorpo se liga são fornecidos em Morris (1996) "Epitope MappingProtocols", em Methods in Molecular Biology , Vol. 66 (Human Press, Totowa1NJ). Dois anticorpos são ditos como Iigantes de um mesmo epítopo se cadaum bloqueia a ligação do outro em 50% ou mais.
Em um ensaio por competição exemplar, o TAT226 imobilizado éincubado em uma solução que contenha um primeiro anticorpo marcado quese liga a TAT226 (por exemplo, YW0.32, YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9,YWO.49.H2 ou YWO.49.H6) e um segundo anticorpo marcado que terá a suacapacidade de competir pela ligação ao TAT226 com o primeiro anticorpotestado. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante dehibridomas. Como um controle, o TAT226 imobilizado é incubado em umasolução que contenha o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundoanticorpo marcado. Após a incubação em condições permissivas para aligação do primeiro anticorpo ao TAT226, o excesso de material de anticorponão ligado é removido, e a quantidade de marcador associado ao TAT226imobilizado é mensurada. Se a quantidade de marcador ao TAT226imobilizado está associado a uma redução substancial na amostra do teste emrelação a amostra controle, indica que o segundo anticorpo compete pelaligação ao TAT226 com o primeiro anticorpo. Em certas realizações, aTAT226 imobilizada está presente na superfície de uma célula ou napreparação de uma membrana obtida a partir de uma célula que expressaTAT226 em sua superfície.
Os anticorpos anti-TAT226 purificados podem ser aindacaracterizados por uma série de ensaios, incluindo, mas não se limitado a,seqüenciamento do N-terminal, análise de aminoácidos, exclusão por tamanhosem desnaturalização por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC),espectrometria de massa, cromatografia de troca iônica e digestão porpapaína.Em um exemplo de realização, a invenção contempla umanticorpo modificado que possuí alguma, mas não todas as funções efetoras,que torna este anticorpo um candidato desejável para muitas aplicações noqual a meia vida do anticorpo in vivo é importante ainda que certas funçõesefetoras (como complemento e ADCC) são desnecessárias ou prejudiciais. Emcertos exemplos de realização, as atividades Fc do anticorpo são medidas paraassegurar que só as propriedades desejadas sejam mantidas. Um ensaio decitotoxicidade in vitro ou in vivo pode ser conduzido para confirmar a redução /depleção dos CDC e/ou atividades ADCC. Por exemplo, ensaios de ligaçãocom o receptor Fc (FcR) podem ser realizados a fim de garantir que oanticorpo não tenha ligação ao FcyR (e portanto carece da atividade ADCC),mas mantém a capacidade de ligação ao FcRn. As células primárias para amediação de ADCC, células NK, expressam unicamente FcyRIII, enquantomonócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR sobrecélulas hematopoiéticas é resumida na Tabela 3, pág. 464, de Ravetch e Kinet,Annu. Rev. immunol. 9: 457-92 (1991). Um exemplo de ensaio para sedeterminar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, está descritona Patente US 5.500.362 ou US 5.821.337. Células efetoras úteis para essestestes incluem células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMC) e célulasNatural Killers (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC damolécula de interesse pode ser determinada in vivo, tal como em um modeloanimal como o descrito em Clynes et ai., PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).Ensaios de ligação de C1q também podem ser realizados para confirmar que oanticorpo é incapaz de se ligar a C1q e, portanto, carece de atividade CDC.
Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaioCDC, conforme descrito, por exemplo, em Gazzano-Santoro et ai., J. Immunol.Methods, 202: 163 (1996). A determinação da ligação de FcRn e a depuração/meia vida in vivo também pode ser realizada utilizando métodos conhecidos noestado da técnica.
F. Artigos Manufaturados
Em outro aspecto da invenção, é fornecido um artigomanufaturado, contendo os materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico das desordens acima descritas. O artigo manufaturado consta deum recipiente e rótulo ou uma bula sobre ou associado ao recipiente. Osrecipientes apropriados incluem, por exemplo, frascos, seringas, blisters, etc.Os recipientes podem ser feitos de uma variedade de materiais tais como ovidro ou plástico. O recipiente guarda uma composição a qual está sozinha ouestá combinada com outra composição eficaz para tratar prevenir e/oudiagnosticar a condição e que possa ter uma porta de acesso estéril (porexemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frascoque possui um controlador (stopper pierceable) colocado através de umaagulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição éum anticorpo ou imunoconjugado. O rótulo ou a bula indicam que acomposição é útil para o tratamento de escolha. Adicionalmente, o artigomanufaturado pode compreender (a) um primeiro recipiente com umacomposição nele contida, onde a composição compreende um anticorpo ouimunoconjugado, e (b) um segundo recipiente com uma composição nelecontida que compreende um agente citotóxico ou outro agente terapêutico. Oartigo manufaturado nesta realização da invenção pode ainda compreender umfolheto informativo indicando que a composição pode ser usada para trataruma condição específica. Alternativamente, ou adicionalmente, o artigomanufaturado pode ainda compreende de um segundo (ou terceiro) recipientecontendo um tampão farmaceuticamente aceitável, como água bacteriostáticapara injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringere solução de dextrose. Pode-se incluir ainda outros materiais desejáveis apartir de uma perspectiva comercial e de uso, que inclui outros tampões,diluentes, filtros, agulhas e seringas.
IV Exemplos
O que se segue são exemplos de métodos e composições dainvenção. Entende-se que vários outros exemplos de realização podem serpraticados, dada a descrição geral fornecida acima.
A. Análise da Expressão Gênica do TAT226
A expressão do gene TAT226 humano foi analisada utilizando umbanco de dados patenteado contendo informações de expressão gênica(GeneExpress®, Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD). Análise gráfica do bancode dados GeneExpress® foi realizada utilizando um visualizador de perfil demicroarranjos. A Figura 13 é uma representação gráfica da expressão gênicade TAT226 em vários tecidos, os quais estão listados no lado esquerdo. Aescala e em toda a parte superior do gráfico indica expressão gênica baseadaem níveis de intensidade de sinal da hibridização. Pontos aparecem acima eabaixo da linha adjacente de cada tecido listado. Os pontos que aparecemacima da linha representam a expressão gênica em tecidos normais, e ospontos que aparecem abaixo da linha representam expressão gênica emtecidos tumorais ou doentes. A Figura 13 exibe uma tendência para o aumentoda expressão gênica de TAT226 em tecidos tumorais ou doentes em relaçãoaos seus homólogos normais. Em particular, a TAT226 se mostra substancialsuperexpressão no ovário tumoral e doente em relação ao ovário normal e notumor de Wilm em relação ao rim normal. Outros tecidos que apresentamsuperexpressão nos tecidos tumorais ou doentes em relação aos tecidosnormais incluem endométrio, supra-renal, ossos, pulmões, pele e tecidosmoles. Além disso, TAT226 é fortemente expresso no tecido cerebral normal(como rinencéfalo, hipocampo, e gânglios basais) e no tecido cerebral tumoralou doente, como gliomas.
O banco de dados GeneExpress® também foi usado para aanálise da expressão gênica de TAT226 humano em ovário normal; tubasuterinas normais; câncer de ovário de células claras, cistoadenocarcinomasubtipos mucinoso e seroso; câncer de ovário metastático e outros tipos decâncer de ovário. Os resultados são relatados graficamente na Figura 14, comos tipos de tecido indicados abaixo do gráfico. A escala sobre o eixo y dográfico indica a expressão gênica baseada em níveis de intensidade de sina dehibridização. O cistoadenocarcinoma seroso e o câncer de ovário metastáticoapresentaram um forte superexpressão de TAT226 comparado ao ovárionormal. O subtipo de células claras e mucinoso mostraram uma expressãocomparável ao ovário normal. Tubas uterinas normais também apresentaramsignificativa expressão de TAT226. Notavelmente, a o câncer de ovário dosubtipo seroso assemelha-se histologicamente ao epitélio das tubas, e ambosos ovários e de tubas uterinas são derivadas do mesmo tecido embrionário.Vide Fox et al. (2002), "Pathology of epithelial ovarian câncerJ' em OvarianCâncer.Cap 9 (Jacobs et al., Ed. Oxford University Press, Nova Iorque).
B. Produção De Anticorpos Anti-Tat226
Anticorpos contra o TAT226 foram gerados por uma seleção emuma biblioteca de exibição por fagos com uma proteína de fusão "TAT226-His"recombinante composta dos aminoácidos 1-115 da SEQ ID No: 75 e ummarcador polihistidina C-terminal. A biblioteca de exibição por fago foi umabiblioteca de (Fab)2 sintética produzida utilizando um sistema de biblioteca defagos Fab-zip. Vide Lee et al. (2004) J. Immunol. Meth. 284:119-132. Abiblioteca compreendia uma biblioteca de HVRs de cadeia pesada na regiãoestrutural da região variável de cadeia pesada do huMAb4D5-8 (vide Figuras5A e 5B, segundo aceptor "B", SEQ ID Nos: 50, 51, 57, 35) e uma regiãovariável de cadeia leve da huMAb4D5 -8 fixa conforme exibido na SEQ ID No:26. Os clones selecionados através da exibição por fago foram rastreadoscontra TAT226-His utilizando fago ELISA (vide, por exemplo, Sidhu et al.(2004) J. MoL Biol. 338:299-310). Os clones YW0.32 e YW0.49 foramselecionados para uma análise mais aprofundada.
Para melhorar a afinidade do YW0.49, bibliotecas de exibição porfagos foram geradas com base no YW0.49, com HVR-H3 e HVR-L3 marcados por aleatorização leve, no qual resíduos de aminoácidos selecionados nasHVRs designadas foram mantidas constante enquanto outras foramsubmetidas a mutagênese. Clones foram selecionados por fago ELISA.Anticorpos maturados por afinidade designados YWO.49.B7, YWO.49.C9,YWO.49.H2, e YWO.49.H6 foram selecionados para uma análise mais aprofundada. As seqüências nucleotídicas e polipeptídeo codificados dasregiões VH e VL do YW0.32, YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2e YWO.49.H6 foram determinados, como exibido nas Figuras 9 e 10. Asseqüências HVR de cadeias pesadas e leves do YW0.32, YW0.49,YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6 são exibidas nas Figuras2-4. As seqüências consenso HVR-H3 e HVR-L3 derivadas do YW0.49,YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, e YWO.49.H6 também são exibidas naFigura 4. YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, e YWO.49.H6foram "refeitos" como IgGs de comprimento total por enxertia de fragmentosFab' para em uma região constante adequada utilizando técnicas recombinantes. Os experimentos descritos a seguir foram realizados utilizandoanticorpos refeitos.
c. Caracterização Da Afinidade de Ligação Para o Antígeno Recombinante
A afinidade de ligação do YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9,YWO.49.H2, e YWO.49.H6 para o antígeno recombinante foi determinada pelo ensaio de ressonância plasmônica de superfície utilizando um sistemaBlAcore® 3000 (BlAcore, Inc., Piscataway, NJ). Resumidamente, chips debiosensores de destrano carboximetilados (CM5, BlAcore Inc.) foram ativadoscom cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisucinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. Oanticorpo anti-TAT226 foi diluído para 5 pg/ml com 10 mM de acetato de sódio,pH 4,8, e injetado a uma velocidade de fluxo de 5 μΙ/minuto para atingiraproximadamente 500 unidades de resposta (RU) de anticorpo acoplado. Emseguida, foi injetado 1M etanolamina para bloquear grupos não reativos. Para amedição da cinética, diluições seriadas em duas vezes de TAT226-His (0.7nMa 500nM) foram injetadas em PBS com 0,05% Tween a 20 - 25 0C em umavelocidade de fluxo de 25pl/min. A velocidade de associação (kon) e avelocidade de dissociação (k0ff) são calculadas como a relação k0ff/k0n· Osresultados deste experimento são exibidos na Tabela 2 abaixo.
Tabela 2
<table>table see original document page 190</column></row><table>
p. Caracterização Da Ligação Do Anticorpo Ao Tat226 Na Superfície
Celular
Foi avaliada a capacidade dos anticorpos anti-TAT226 se ligarem ao TAT226 expresso na superfície de OVCAR3, uma linhagem de célulashumanas de câncer de ovário. A seleção das células ativadas pelafluorescência (FACS) foi realizada em células OVCAR3 na ausência e napresença de YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 ou YWO.49.H6.Resumidamente, células destacadas foram incubadas com 5 pg/ml deanticorpo primário no gelo durante 1 hora, lavadas, e incubadas com anticorposecundário (IgG anti-humano conjugado a ficoeritrina) durante 30 minutos nogelo. A FACS foi realizada utilizando um citômetro de fluxo FACScan™ (BDBiosciences1 San Josel Califórnia).
Os resultados da análise por FACS YW0.49, YWO.49.H2 eYWO.H6 são exibidos na Figura 15. Os picos no lado esquerdo do gráficorepresentam cada um "background" de ligação, ou seja, a ligação do anticorposecundário apenas. Os picos do lado direito de cada gráfico representam aligação do anticorpo anti-TAT226 indicado. O YWO.49.B7 não se ligou deforma significativa as células 0VCAR3 por FACS, apesar de deixar o antígenorecombinante com um Kd dentro do intervalo de Kds observado para oYW0.49 e outros anticorpos maturados por afinidade (vide resultados daanálise BIACORE®, Tabela 2 acima). A ligação do YWO.49.C9 foi comparávelà observada para o YWO.49.H2 e YW0.H6.
E Caracterização Da Afinidade De Ligação Para O Antígeno Da Superfície
Celular
A afinidade de ligação do YW0.49.H2 e YWO.49.H6 paraTAT226 expresso na superfície de células 0VCAR3 foi analisada através deuma análise de competição. Resumidamente, YWO.49.H2 ou YWO.49.H6marcados (iodado) foi permitido se ligar a células OVCAR3 na presença doanticorpo marcado. A afinidade de ligação dos anticorpos foi determinada deacordo com a análise Scatchard, metodologia inicialmente descrita em Munsonet al., Anal. Biochem. 107:220 (1980). Os resultados deste experimento sãoexibidos na Tabela 3 abaixo.
Tabela 3
<table>table see original document page 191</column></row><table>
A Kd do YWO.49.H2 e YWO.49.H6 é mais elevada para TAT226expresso na superfície de células OVCAR3 quando comparado com TAT226-His recombinante (compare Kds para YWO.49.H2 e YWO.49.H6 3 na Tabela2), indicando que YWO.49.H2 e YWO.49.H6 se ligam com afinidadeligeiramente maior com o TAT226-His recombinante do que com TAT226expresso na superfície de células OVCAR3.
f. RNAm E Expressão Protéica De TAT226
A expressão de RNAm de TAT226 em células e em um painel deamostras de câncer de ovário foram analisadas usando uma nuclease 5'(TaqMan®) e análise de PCR em tempo real quantitativo. As amostras decâncer de ovário, designadas "HF ####" na figura 16, foram submetidas acortes de congelação. RNA foi isolado a partir dos cortes de tecido,amplificados utilizando o kit Ambion's Message Amp Il kit (Ambion, Austin, TX),e transcritos reversamente em cDNA. O RNA foi isolado de células OVCAR3 etranscritos reversamente em cDNA. O cDNA do TAT226 foi amplificado porPCR em tempo real a presença de sondas específicas não-extensíveis para aamplificação do produto. O ciclo limiar ou "Ct" (ciclo no qual o sinal gerado apartir de clivagem da sonda excedeu o de fundo "background") foi determinadoe usado para calcular o nível inicial de RNAm de TAT226. O nível de mRNA deTAT226 no painel de amostras de câncer de ovário foi expresso em relação aonível de mRNA de TAT226 em células OVCAR3, como exibido no gráfico debarras na Figura 16.
A expressão da proteína TAT226 em células OVCAR3 e no painelde amostras de câncer de ovário acima foi analisada utilizando a imuno-histoquímica (IHC) da seguinte forma. Cortes de tecidos seções (congeladosou emblocado em parafina), de amostras de câncer de ovário foram fixadaspor 5 minutos em acetona/etanol. Os cortes foram lavados em PBS,bloqueados com avidina e biotina (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA)durante 10 minutos cada, e novamente lavados em PBS. Em seguida, oscortes foram bloqueados com soro a 10% durante 20 minutos e apagados pararemover o excesso soro. O anticorpo primário (YWO.49.H2 ou YWO.49.H6) foientão adicionados ao cortes em uma concentração de 10 pg/ml durante 1 hora.Os cortes foram então lavados em PBS. O anticorpo secundário anti-humanobiotinilado foi adicionado nos cortes por 30 minutos, e, em seguida, os cortesforam lavados com PBS. Os cortes foram então expostos aos reagentes do kitVetor ABC kit (Vector Inc., Burlingame1 CA) durante 30 minutos e entãolavados com PBS. Os cortes foram então expostos a diaminobenzidina (Pierce)por 5 minutos e depois lavados em PBS. Os cortes foram então contra-coradoscom hematoxilina de Mayer, coberto com uma lamínula, e visualizados. A IHCfoi realizada em células OVCAR3 utilizando o mesmo protocolo, exceto que ascélulas foram primeiro peletizadas, congeladas, e então cortadas. Os cortesforam então submetidos ao protocolo referido.
Os resultados são demonstrados qualitativamente na Figura 16,os níveis de expressão foram categorizados como "-", "+/-" ou "+". Em geral,houve uma correlação entre o nível global de expressão de mRNA de TAT226e de expressão da proteína TAT226 na superfície das células 0VCAR3. Osexperimentos com IHC também confirmou que os anticorpos reconhecem oTAT226 na superfície da célula. A histologia de cada célula no câncer deovário e no painel de células também é exibida na Figura 16, com a abreviatura"adenoca." denotando "adenocarcinoma".
g. Produção de ADCs Anti-TAT226
ADCs Anti-TAT226 foram produzidos conjugando YWO.49.H2 eYWO.49.H6 para as seguinte moléculas Iigantes de droga: MC-vc-PAB-MMAE;MC-vc-PAB-MMAF; e MC-MMAF, que estão descritas acima na secçãoIII.C.1.b.2. Antes da conjugação, os anticorpos foram parcialmente reduzidoscom TCEP utilizando métodos padrão de acordo com a metodologia descritano documento WO 2004/010957 A2. Os anticorpos parcialmente reduzidosforam conjugados com a molécula Iigante de droga descrita acima usandométodos padrões, de acordo com a metodologia descrita em Doronina et al.(2003) Nat. BiotechnoL 21:778-784 e US 2005/0238649 Α1. Resumidamente,os anticorpos parcialmente reduzidos foram combinados com as moléculasIigantes de droga para permitir a conjugação das moléculas aos resíduoscisteína. As reações de conjugação foram apagadas, e os ADCs forampurificados. A incorporação de fármaco (número médio de droga por moléculasde anticorpos) para cada ADC foi determinada por HPLC, como segue:
<table>table see original document page 194</column></row><table>
h. Ensaios de Morte Celular
Conjugados droga-anticorpo (ADC) foram testados pelacapacidade de inibir a proliferação de células que expressam TAT226 nosseguintes ensaios de morte celular irt vitro e in vivo:
1 Ensaio De Morte De Células OVCAR3 In VitroADCs YWO.49.H2 e YWO.49.H6 foram testadas pela capacidadede inibir a proliferação de células OVCAR3. Células OVCAR3 foram semeadasem placas de 96 poços em meio RPMI com 20% de FBS. Células OVCAR3 emuma densidade de 3000 células por poço foram incubadas com diferentesconcentrações de ADC1 como exibido na Figura 17. O anticorpo Anti-MUC16/CA125 conjugado com a MC-vc-PAB-MMAE foi usado como umcontrole positivo. MUC16/CA125 é conhecido como um antígeno de câncer deovário. Vide, por exemplo, Yin et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:27371-27375. Oanticorpo anti-IL-8 conjugado com a MC-vc-PAB-MMAE foi utilizado comocontrole negativo. Após 5 dias de incubação, a viabilidade celular foi194mensurada utilizando o ensaio de viabilidade celular Iuminescente CeIITiter-Glo™ (Promega, Madison1 Wl), de acordo com as instruções do fabricante. Aescala sobre o eixo-y da Figura 17 indica a unidade de luz relativa, ou "RLU" apartir da luminescência da Luciferase, que é uma medida de viabilidade celular.
A Figura 17 exibe que, assim como o controle positivo,YW0.49.H2-MC-vc-PAB-MMAF e YW0.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF tinham umanotável atividade de matar células, especialmente em concentrações e emtorno 0,01 e 0,1 Mg/ml. O YW0.49.H2-MC-vc-PAB-MMAE e YW0.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE também apresentaram atividade de matar células, mas em menor grau do que a verificada com o YW0.49.H2-MC-vc-PAB-MMAF eYW0.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF. O IC50 para YW0.49.H2-MC-vc-PAB-MMAF eYW0.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF foi de cerca de 0,005 nM, e o IC50 paraYW0.49.H2-MC-vc-PAB - MMAE e YW0.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE foi decerca de 0,2 nM. O IC5o para o MMAE livre foi de cerca de 0,1 nM. YW0.49.H2-MC-MMAF e YW0.49.H6-MC-MMAF não demonstram atividadede matar células significativa neste ensaio. Neste sistema de ensaio particular,é de salientar que em altas concentrações de ADC, incluindo o controlonegativo de ADC1 a viabilidade celular diminui substancialmente devido àelevada concentração de MMAE e MMAF.
2. Ensaio De Morte Celular In Vitro Usando Células HCT116
Transfectadas
YWO.49.H2 e YWO.49.H6 CDA foram testados pela capacidadede inibir a proliferação de células HCT116, uma linhagem de celular de câncerde cólon, que tem sido estável quando transfectadas com ácidos nucléicos quecodificam TAT226 humano. Células HCT116 não transfectadas sãonormalmente cerca de 5-6 vezes menos sensíveis à MMAE livre (nãoconjugada) do que as células OVCAR3.
Resumidamente, células HCT116 foram transfectadas daseguinte forma. Ácidos nucléicos que codificam o epítopo-marcado humanoTAT226 foi utilizado para construir o vetor de expressão em mamíferospcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad1 Califórnia). O epítopo tag é consistido dosaminoácidos 1-53 da glicoproteína D (o tag "gD")do vírus herpes simples tipo 1,que substituiu a seqüência sinal de aminoácidos 1-22, no N-terminal doTAT226 humano. O vetor recombinante foi transfectado em células HCT116usando Lipofectamine200 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante.
As células HCT116 transfectadas foram cultivadas em meio McCoy1S 5a com10% de FBS e 0,4 mg/ml de G418. As células foram coradas utilizandoanticorpos anti-gD e selecionadas por FACS para selecionar clones individuaisrecombinantes expressando a proteína de fusão gD:TAT226 humana. Um dosclones, designado HCT116 # 9-4, foi selecionada para uma análise posterior.
Para realizar o ensaio de morte celular, células HCT116 # 9-4foram semeadas em placas de 96 poços. As células HCT116 # 9-4 em uma1densidade de 1000 células por poço foram incubadas com diferentesconcentrações do ADC, como exibido na Figura 18. Os anticorpos anti-gp120conjugado com MC-vc-PAB-MMAE foram utilizados como controle negativo.
Depois de 3 dias de incubação, a viabilidade celular foi mensurada utilizando oensaio de viabilidade celular Iuminescente CelITiter-GIo™ (Promega, Madison,Wl), de acordo com as instruções do fabricante.
Figura 18 mostra que YW0.49.H2-MC-vc-PAB-MMAF eYW0.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF tinha uma notável atividade de matar células,especialmente em cerca de 0,01 pg/ml, e até as concentrações mais elevadastestadas. O IC50 para YWO,49.H2-MC-vc-PAB-MMAF e YW0.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF foi de cerca de 0,05 nM, e os IC50 da MMAE livre foi de cerca de0,9 nM. YW0.49.H2-MC-vc-PAB-MMAE e YW0.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE nãotiveram uma atividade substancial de matar células comparado ao controlonegativo, particularmente neste ensaio. A diferença entre a atividade de matarcélulas do YW0.49.H2-MC-vc-PAB-MMAE e YW0.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE,neste ensaio, em comparação com a atividade de matar células OVCAR3(acima) pode ser atribuível a uma variedade de fatores como, por exemplo, adensidade celular e/ou diferenças de sensibilidade a droga.
Nota-se que, para algumas outras linhagens de células testadasque normalmente expressam mRNA ou proteína TAT226, o ADC YWO.49.H2e YWO.49.H6 não mostrou atividade significativa em matar células. Isto podeser devido a uma variedade de fatores como, por exemplo, efeitos específicosao tipo de células, níveis de expressão do TAT226 na superfície celular, e/oudiferenças de sensibilidade à droga.
3. Ensaio in vivo utilizando xenoenxerto de HCT116 # 9-4
Um modelo in vivo de xenoenxerto já foi utilizado para testarYWO.49.H6 conjugado e não conjugado pela capacidade de inibir aproliferação de células tumorais expressando TAT226 in vivo. Os tumoresforam induzidos em camundongos atímicos "nude" por injeção subcutânea decerca de 5x106 células HCT116 # 9-4 nos flancos dorsal dos camundongos.Foi permitido que os tumores crescessem até chegarem a um volume médiode 200 mm3. Esse ponto de tempo foi denominado como "dia 0". Assim comoindicado na Figura 19, os camundongos receberam injeções intravenosas de 3 mg/kg do anticorpo não conjugado indicado ou ADC nos dias 0, 7, e 16.Anticorpos anti-ragweed (Ab) não conjugados e conjugados serviram comocontrole negativo. A média do volume tumoral foi medida nos dias 3, 7, 10, 16e 21. Assim como ficou demonstrado na Figurai9, YW0.49. H6-MC-VC-PAB-MMAF demonstraram uma atividade de matar células tumorais significativa,mesurada pela média do volume do tumor, em comparação com o anti-ragweed Ab-MC-vc-PAB-MMAF, neste modelo de xenoenxerto específico. OYW0.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE não mostrou atividade significativa de matarcélulas tumorais em relação à atividade do anti-ragweed Ab-MC-vc-PAB-MMAE neste modelo de xenoenxerto específico. No entanto, este modelo dexenoenxerto pode não refletir a atividade de morte celular do YW0.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE observado in vitro por uma variedade de fatores, como porexemplo, devido as diferenças de sensibilidade à droga, aos níveis deexpressão da TAT226 na superfície celular e microambiente do tumorxenoenxertado.
4. Outros Modelos de Xenoenxerto
Outros modelos de xenoenxerto podem ser usados para testaranticorpos anti-TAT226 conjugados e não-conjugados pela capacidade de inibir a proliferação de células tumorais que expressam TAT226 in vivo. Porexemplo, modelos de xenoenxerto para tumores de ovário e cerebrais podemser fornecidos por fontes públicas como Oncotest GmbH (Frieberg, Alemanha)e Southern Research Institute (Birmingham, AL). Os modelos da Oncotestforam desenvolvidos, em particular foram desenvolvidos pelo crescimento detumores de pacientes em camundongos "nude" com deficiência de imunidade.Xenotransplantes que expressam mRNA e/ou proteínas TAT226 podem serúteis para a demonstração da atividade de morte celular pelos anticorpos anti-TAT226 in vivo.
O YWO.49.H6 conjugado foi testado no modelo da OncotestOVXF1023 pela capacidade de inibir a proliferação de células tumorais doovário in vivo. O modelo Oncotest OVXF1023 foi obtido a partir de umcarcinoma de ovário adenomatoso papilar seroso mal diferenciadometastizado, estádio M1. Os camundongos OVXF1023 foram tratados com oADC1 indicados na Figura 20. Na figura 20, o YWO.49.H6 é designado como"H6"; o anticorpo anti-ragweed (controle) é designado como "RW', assim comoLigante -MC-VC-PAB-é abreviado como "vc". Os ADCs foram administradosnos dias e nas concentrações indicadas na Figura 20. O resultado apresentadona Figura 20 indica que o YW0.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF e YW0.49.H6-MC-MMAF reduziram significativamente o volume tumoral em relação a outros ADCs.
O experimento acima foi repetido com OVXF1023 em condiçõessemelhantes, mas com alterações na dosagem e no controle de ADCs. Noexperimento repetido, os camundongos foram tratados com uma dose maiselevada (5 mg kg) de YW0.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE e com doses maisbaixas (5 mg/kg) de YW0.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF e YW0.49.H6-MC-MMAF.
Os resultados demonstraram que o ADC H6 (e, em especial YW0.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE) revelou uma redução no volume do tumor em relação aos seusrespectivos ADC controles (anti-gp120-MC-vc-PAB-MMAE a 6,4 mg/kg; anti-gp120-MC-vc-PAB-MMAF a 7,2 mg/kg; e anti-gp120-MC-MMAF a 5,4 mg/kg),embora a diferença de eficácia entre as o ADC H6 e o seu respectivo ADCcontrole não foi estatisticamente significante para alguns pontos de dados.(Dados não apresentados). A diferença entre esses resultados e os resultadosobtidos no primeiro experimento OVXF1023 podem ser atribuídas àsdiferenças de dosagem do ADC H6 e a observação de que o ADC controleanti-gp120 CDA mostrou inesperada atividade na redução do volume do tumor.
Adicionalmente, o ADC H6 foi também testado em outro modeloda Oncotest, OVXF899, que é derivado de um carcinoma de ovário papilarseroso moderadamente diferenciado (tumor primário). O ADC H6 não reduziu ovolume do tumor neste modelo. (Dados não apresentados). No entanto, estemodelo particular da Oncotest apresentou uma baixa expressão de TAT226, oque pode explicar o resultado observado.
I. ThioMAbs
Anticorpos construídos com cisteínas ou "thioMAbs", foramcriados no qual um resíduo do YWO.49.H6 selecionado foi substituído porcisteína, a fim de proporcionar mais um sítio para a ligação de uma moléculaligante-droga. Especificamente, uma substituição no A118C (Numeração deEU) foi feita na cadeia pesada do YWO.49.H6, ou uma substituição no V205C(numeração de Kabat) foi feita na cadeia do YWO.49.H6. A thioMAb A118Cresultante foi, então, conjugada com MC-MMAF, e a thioMAb V205C resultantefoi, então, conjugada a um ou outro MC-MMAF ou MC-vc-PAB-MMAE. Todosos thioMAbs foram capazes de se ligar nas células 0VCAR3 pela análise deFACS. (Dados não apresentados).
Apesar de a respectiva invenção ter sido descrita com detalhes atítulo de ilustração e de exemplo para fins de clareza do entendimento, asdescrições e exemplos não devem ser entendidas como uma limitação doescopo de aplicação da invenção. As divulgações de todas as patentes eliteraturas científicas citadas no presente são expressamente incorporadas emsua totalidade pela referência.Listagem de Seqüências
<110> GENENTECH, INC.Liang, Wei-ChingSakanaka, ChieWu, Yan
<120> ANTI-TAT226 ANTICORPOS E IMUNOCONJUGADOS
<130> P2324R1
<141> 16-03-2007
<150> US 60/783,746<151> 2006-03-17
<160> 78
<210> 1<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-Hl<400> 1
Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His
5 10
<210> 2<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-H2<400> 2
Ala Arg Ile Thr Pro Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 3<211> 13<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-H3
<400> 3Cys Ile Leu Cys Phe Gly Pro
<210> 4<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-Hl
<400> 4Gly Phe Thr Ile Thr Asn Tyr
<210> 5<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-H2<400> 5
Gly Arg Ile Tyr Pro Asp Ser1 5
Val Lys Gly
Leu Trp Ala Met Asp Tyr10
Gly Ile His10
Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser10 15
<210> 6<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-H3<400> 6
Lys Leu Trp Val Ser Arg Ala Gly Met Asp Tyr
5 10
<210> 7<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-H3
<400> 7
Lys Leu Trp Val Ser Leu Ala Ala Met Asp Tyr
5 10<210> 8<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-H3<400> 8
Lys Leu Trp Val Thr Leu Ala Ser Met Asp Tyr
5 10
<210> 9<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-H3<400> 9
Lys Leu Trp Val Ser Leu Ala Pro Met Asp Tyr
5 10
<210> 10<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-H3<400> 10
Lys Leu Trp Ile Ser Ile Ala Gly Met Asp Tyr
5 10
<210> 11<211> 11<212> PRT<213> Seqüência artificial<220> <223> Seqüência consenso de<220> <221> Outro<222> 4<223> Xaa=Val ou Ile<220> <221> Outro<222> 5<223> Xaa=Ser ou Thr<220>
<221> Outro<222> 6
<223> Xaa=Argf Leu, ou Ile<220>
<221> Outro<222> 8
<223> Xaa=Gly, Ala, Ser, ou Pro<400> 11
Lys Leu Trp Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Met Asp Tyr
5 10
<210> 12<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-Ll<400> 12
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
5 10
<210> 13<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-L2
<400> 13Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
5
<210> 14<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-L3<400> 14
Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
5
<210> 15<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-L3<400> 15
Gln Arg Ser Val Phe Thr Pro Pro Ala
5
<210> 16<211> 9<212> PRT
<21Β> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-L3<400> 16
Gln Lys Ser Tyr Asn Thr Pro Pro Thr
5
<210> 17<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-L3<400> 17
Gln Gln Ser Tyr Gly Thr Pro Phe Ile
5
<210> 18<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> HVR-L3<400> 18
Gln His Ser Tyr Ala Thr Pro Phe Thr
5
<210> 19<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência consenso de HVR-L3<220>
<221> Outro<222> 2
<223> Xaa=Arg, Lys1 His1 Asn, ou Gln<220>
<221> Outro<222> 4
<223> Xaa=Tyr ou Val<220>
<221> Outro<222> 5
<223> Xaa=Thr, Phe, Asn, Gly, ou Ala<220>
<221> Outro<222> 8
<223> Xaa=Pro ou Phe<220>
<221> Outro<222> 9
<223> Xaa=Thr, lie, ou Ala<400> 19
Gln Xaa Ser Xaa Xaa Thr Pro Xaa Xaa
5
<210> 20<211> 122<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Região variável da cadeia pesada do YW0.32<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser
20 25 30
Ser Ser Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ala Arg Ile Thr Pro Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Cys Ile Leu Cys Phe Gly Pro
95 100 105
Leu Trp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val110 115 120
Ser Ser
<210> 21<211> 120<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Região variável da cadeia pesada do YW0.49<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr
20 25 30
Asn Tyr Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Arg Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Leu Trp Val Ser Arg Ala
95 100 105
Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115 120
<210> 22<211> 120<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Região variável da cadeia pesada do YW0.49.B7<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr
20 25 30
Asn Tyr Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Arg Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Leu Trp Val Ser Leu Ala
95 100 105
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
<210> 23<211> 120<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Região variável da cadeia pesada do YW0.49.C9<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr
20 25 30
Asn Tyr Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Arg Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Leu Trp Val Thr Leu Ala
95 100 105
Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 120<210> 24<211> 120<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Região variável da cadeia pesada do YW0.49.H2<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr
20 25 30
Asn Tyr Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Arg Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Leu Trp Val Ser Leu Ala
95 100 105
Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115 120
<210> 25<211> 120<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Região variável da cadeia pesada do YW0.49.H6<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr
20 25 30
Asn Tyr Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Arg Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr
50 55 60Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
65
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn
80
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys
95
Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr110
<210> 26<211> 108<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Região variável da cadeia leve do YW0.32, YW0.49, ehuMAb4D5-8 modificado
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys Arg
<210> 27<211> 108<212> PRT
<213> Seqüência artificial
Ile Ser Ala Asp Thr Ser70 75
Ser Leu Arg Ala Glu Asp85 90
Leu Trp Ile Ser Ile Ala100 105
Leu Val Thr Val Ser Ser115 120
<220>
<223> Região variável da cadeia leve do YW0.49.B7<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg
80 85 90
Ser Val Phe Thr Pro Pro Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys Arg
<210> 28<211> 108<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Região variável da cadeia leve do YW0.49.C9<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys
80 85 90
Ser Tyr Asn Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105Ile Lys Arg
<210> 29<211> 108<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Região variável da cadeia leve do YW0.49.H2<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Ser Tyr Gly Thr Pro Phe Ile Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys Arg
<210> 30<211> 108<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Região variável da cadeia leve do YW0.49.H6<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His
80 85 90
Ser Tyr Ala Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys Arg
<210> Bl<211> 108<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Região variável da cadeia leve do huMAb4D5-8<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys Arg
<210> 32<211> 30<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 33<211> 14<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 33
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
5 10
<210> 34<211> 32<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 34
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met1 5 10 15
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala Arg
<210> 35<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 35
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 36<211> 25<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 37<211> 13<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 37
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
5 10
<210> 38<211> 31<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 38
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met1 5 10 15
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala
<210> 39<211> 30<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 39
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met15 10 15Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 40<211> 30<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada
<400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
15 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser
20 25 30
<210> 41<211> 14<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 41
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
5 10
<210> 42<211> 32<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 42
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu15 10 15
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala Arg
<210> 43<211> 25<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 43
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser1 5 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser
20 25
<210> 44<211> 13<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 44
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
5 10
<210> 45<211> 31<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 45
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu15 10 15
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala
<210> 46<211> 30<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 46
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu1 5 10 15
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30<210> 47<211> BO<212> PRT
<21Β> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 48<211> 14<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 48
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
5 10
<210> 49<211> 32<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada
<400> 49Arg Phe Thr Ile Ser Arg1 5
Gln Met Asn Ser Leu Arg
20
Ala Arg
<210> 50<211> 25<212> PRT<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência é sintetizada
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
10 15
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
25 30<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 51<211> 13<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 51
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
5 10
<210> 52<211> 31<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 52
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu15 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala
<210> 53<211> 30<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 53
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu15 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 54<211> 30<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
20 25 30
<210> 55<211> 32<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 55
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu1 5 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ser Arg
<210> 56<211> 31<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 56
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu15 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ser
<210> 57<211> 32<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 57
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu1 5 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala Arg
<210> 58<211> 31<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 58
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu15 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala
<210> 59<211> 30<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 59
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu1 5 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 60<211> 23<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 61<211> 15<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 61
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr15 10 15
<210> 62<211> 32<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 62
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe15 10 15
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
20 25 30
Tyr Cys
<210> 63<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 63
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
5 10
<210> 64<211> 23<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 64
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro1 5 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 65<211> 15<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 65
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr15 10 15
<210> 66<211> 32<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 66
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe15 10 15
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
20 25 30
Tyr Cys
<210> 67<211> 23<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 67
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro15 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
20<210> 68<211> 15<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 68
Trp Tyr Gln Cln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr1 5 10 15
<210> 69<211> 32<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada
<400> 69Gly Ile Pro Asp Arg1 5
Thr Leu Thr Ile Ser
20
Tyr Cys
<210> 70<211> 23<212> PRT<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 70
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu1 5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20
<210> 71<211> 15<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
10 15
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr
25 30<400> 71
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr1 5 10 15
<210> 72<211> 32<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Seqüência é sintetizada
<400> 72Gly Val Pro Asp1
Thr Leu Thr Ile
Tyr Cys
<210> 73<211> 32<212> PRT<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência é sintetizada
<400> 73Gly Val Pro Ser1
Thr Leu Thr Ile
Tyr Cys
<210> 74<211> 10<212> PRT<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência é sintetizada<400> 74
Phe Arg Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
5 10
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
5 10 15
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr
20 25 30
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe
5 10 15
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
20 25 30
<210> 75<211> 141<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 75
Met Trp Val Leu Gly Ile Ala Ala Thr Phe Cys Gly Leu Phe Leu1 5 10 15
Leu Pro Gly Phe Ala Leu Gln Ile Gln Cys Tyr Gln Cys Glu Glu
20 25 30
Phe Gln Leu Asn Asn Asp Cys Ser Ser Pro Glu Phe Ile Val Asn
35 40 45
Cys Thr Val Asn Val Gln Asp Met Cys Gln Lys Glu Val Met Glu
50 55 60
Gln Ser Ala Gly Ile Met Tyr Arg Lys Ser Cys Ala Ser Ser Ala
65 70 75
Ala Cys Leu Ile Ala Ser Ala Gly Tyr Gln Ser Phe Cys Ser Pro
80 85 90
Gly Lys Leu Asn Ser Val Cys Ile Ser Cys Cys Asn Thr Pro Leu
95 100 105
Cys Asn Gly Pro Arg Pro Lys Lys Arg Gly Ser Ser Ala Ser Ala110 115 120
Leu Arg Pro Gly Leu Arg Thr Thr Ile Leu Phe Leu Lys Leu Ala125 130 135
Leu Phe Ser Ala His Cys140
<210> 76<211> 141<212> PRT
<213> Macaca fascicularis<400> 76
Met Trp Val Leu Gly Ile Ala Ala Thr Phe Cys Gly Leu Phe Leu15 10 15
Leu Pro Gly Phe Ala Leu Gln Ile Gln Cys Tyr Gln Cys Glu Glu
20 25 30
Phe Gln Leu Asn Asn Asp Cys Ser Ser Pro Glu Phe Ile Val Asn
35 40 45
Cys Thr Val Asn Val Gln Asp Met Cys Gln Lys Glu Val Met Glu
50 55 60
Gln Ser Ala Gly Ile Met Tyr Arg Lys Ser Cys Ala Ser Ser Ala
65 70 75Ala Cys Leu Ile Ala Ser Ala Gly Tyr Gln Ser Phe Cys Ser Pro
80 85 90
Gly Lys Leu Asn Ser Val Cys Ile Ser Cys Cys Asn Thr Pro Leu
95 100 105
Cys Asn Gly Pro Arg Pro Lys Lys Arg Gly Ser Ser Ala Ser Ala110 115 120
Leu Arg Pro Gly Leu Pro Thr Thr Ile Leu Leu Leu Lys Leu Ala125 130 135
Leu Phe Ser Ala His Cys140
<210> 77<211> 141<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 77
Met Trp Val Leu Gly Ile Ala Ala Thr Phe Cys Gly Leu Phe Trp15 10 15
Leu Pro Gly Leu Ala Leu Gln Ile Gln Cys Tyr Gln Cys Glu Glu
20 2 5 30
Phe Gln Leu Asn Asn Asp Cys Ser Ser Pro Glu Phe Ile Val Asn
35 40 45
Cys Thr Val Asn Val Gln Asp Met Cys Gln Lys Glu Val Met Glu
50 55 60
Gln Ser Ala Gly Ile Met Tyr Arg Lys Ser Cys Ala Ser Ser Ala
65 70 75
Ala Cys Leu Ile Ala Ser Ala Gly Tyr Gln Ser Phe Cys Ser Pro
80 85 90
Gly Lys Leu Asn Ser Val Cys Ile Ser Cys Cys Asn Thr Pro Leu
95 100 105
Cys Asn Gly Pro Arg Pro Lys Lys Arg Gly Ser Ser Ala Ser Ala110 115 120
Ile Arg Pro Gly Leu Leu Thr Thr Leu Leu Phe Phe His Leu Ala125 130 135
Leu Cys Leu Ala His Cys140
<210> 78<211> 141<212> PRT
<213> Rattus norvegicus<400> 78
Met Trp Val Leu Gly Ile Ala Ala Thr Phe Cys Gly Leu Phe Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Leu Ala Leu Gln Ile Gln Cys Tyr Gln Cys Glu Glu
20 25 30
Phe Gln Leu Asn Asn Asp Cys Ser Ser Pro Glu Phe Ile Val Asn
35 40 45
Cys Thr Val Asn Val Gln Asp Met Cys Gln Lys Glu Val Met Glu
50 55 60
Gln Ser Ala Gly Ile Met Tyr Arg Lys Ser Cys Ala Ser Ser Ala
65 70 75
Ala Cys Leu Ile Ala Ser Ala Gly Tyr Gln Ser Phe Cys Ser Pro
80 85 90
Gly Lys Leu Asn Ser Val Cys Ile Ser Cys Cys Asn Thr Pro Leu
95 100 105
Cys Asn Gly Pro Arg Pro Lys Lys Arg Gly Ser Ser Ala Ser Ala
110 115 120
Ile Arg Pro Gly Leu Leu Thr Thr Leu Leu Phe Phe His Leu Ala
125 130 135
Leu Cys Leu Ala His Cys140

Claims (38)

1. ANTICORPO MONOCLONAL, que se liga a TAT226,caracterizado pelo fado do anticorpo compreender:(1) uma HVR-H1, compreendendo a seqüência de aminoácidosSEQ ID No: 4;(2) uma HVR-H2, compreendendo a seqüência de aminoácidosSEQ ID No: 5;(3) uma HVR-H3, compreendendo a seqüência de aminoácidosque está de acordo com a seqüência de consenso SEQ ID No: 11;(4) uma HVR-L1, compreendendo a seqüência de aminoácidosSEQ ID No: 12;(5) uma HVR-L2, compreendendo a seqüência de aminoácidosSEQ ID No: 13; e(6) uma HVR-L3, compreendendo a seqüência de aminoácidosque está de acordo com a seqüência de consenso SEQ ID No: 19.
2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato do anticorpo conter uma HVR-H3 compreendendo aseqüência de aminoácido a partir da SEQ ID No: 6-10, e uma HVR-L3compreendendo a seqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ IDNo: 14-18.
3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato da HVR-H3 compreender a seqüência de aminoácidosSEQ ID No: 9, e a HVR-L3 compreender a seqüência de aminoácidos SEQ IDNo: 17.
4. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato da HVR-H3 compreender a seqüência de aminoácidosSEQ ID No: 10, e a HVR-L3 compreender a seqüência de aminoácidos SEQ IDNo: 18.
5. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente de pelo menos umaregião estrutural selecionado a partir de uma região estrutural de consenso VHsubgrupo Ill e uma região estrutural de consenso VL subgrupo I.
6. ANTICORPO MONOCLONAL, que se liga a TAT226,caracterizado pelo fato do anticorpo compreender um domínio variável decadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência deaminoácidos selecionados a partir da SEQ ID No :21-25 e um domínio variávelde cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência deaminoácidos selecionados a partir da SEQ ID No:26-31.
7. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de compreender um domínio variável de cadeia pesadatendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência de aminoácidos daSEQ ID No: 24 e um domínio variável de cadeia leve tendo pelo menos 90% deidentidade com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 29.
8. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato do domínio variável de cadeia pesada compreende aseqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 24; e um domínio variável de cadeialeve compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 29.
9. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de compreender um domínio variável de cadeia pesadatendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência de aminoácidos daSEQ ID No: 25 e um domínio variável de cadeia leve tendo pelo menos 90% deidentidade com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 30.
10. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato do domínio variável de cadeia pesada compreende aseqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 25; e um domínio variável de cadeialeve compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No: 30.
11. ANTICORPO, de acordo com as reivindicações 1 ou 6,caracterizado pelo fato do anticorpo ser um fragmento de anticorposelecionado a partir de um fragmento Fab1 Fab1-SH1 Fv1 scFv ou (Fab1)2.
12. ANTICORPO, de acordo com as reivindicações 1 ou 6,caracterizado pelo fato do anticorpo ser um anticorpo humanizado.
13. ANTICORPO, de acordo com as reivindicações 1 ou 6,caracterizado pelo fato do anticorpo ser um anticorpo humano.
14. ANTICORPO MONOCLONAL, caracterizado pelo fato dese ligar ao mesmo epítopo como um anticorpo selecionados a partir deYW0.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6.
15. IMUNOCONJUGADO, compreendendo um anticorpo quese liga TAT226 como na reivindicação 1 ou 6, ligado covalentemente a umagente citotóxico.
16. IMUNOCONJUGADO, de acordo com as reivindicações 15,caracterizado pelo fato do agente citotóxico ser selecionado a partir de umatoxina, agente quimioterápico, antibiótico, isótopo radioativo e uma enzimanucleolítica.
17. IMUNOCONJUGADO, tendo a fórmula Ab-(L-D)p, no qual:(a) Ab é um anticorpos que se liga a TAT226 e que compreende:(i) uma HVR-H1 que compreende a seqüência de aminoácidos daSEQ ID No: 4;(ii) uma HVR-H2 que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 5;(iii) uma HVR-H3 que compreende uma seqüência deaminoácidos que está de acordo com a seqüência de consenso de SEQ IDNO:11;(iv) uma HVR-L1 que compreende a seqüência de aminoácidosda SEQ ID No: 12;(ν) uma HVR-L2 que compreende a seqüência de aminoácidos daSEQ ID No: 13, e;(vi) uma HVR-L3 que compreende a seqüência de aminoácidosque está de acordo com a seqüência de consenso da SEQ ID No: 19.(b) L é um ligante;(c) D é uma droga da fórmula De ou Df.<formula>formula see original document page 232</formula>e no qual cada R2 e R6 são metila, cada R3 e R4 são isopropílico,R7é sec-butil, cada R8 é selecionado independente a partir de CH3, O-CH3, OH1e H; R9 é H; R10 é aril; Z é -O- ou -NH-; R11 é H1 C1-C8 alquila, ou -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH3; e R18é -C(R8)2-C(R8)2-arila; e(d) ρ varia entre cerca de 1 a 8.
18. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato do anticorpo compreender um HVR-H3 quecompreende uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ IDNo: 6-10, e uma HVR-L3 que compreende uma seqüência de aminoácidosselecionada a partir da SEQ ID No: 14-18.
19. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato da HVR-H3 compreender a seqüência de aminoácidosSEQ ID No: 9, e a HVR-L3 compreender a seqüência de aminoácidos SEQ IDNo: 17.
20. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato da HVR-H3 compreender a seqüência de aminoácidosSEQ ID No: 10, e a HVR-L3 compreender a seqüência de aminoácidos SEQ IDNo: 18.
21. IMUNOCONJUGADO, tendo a fórmula Ab-(L-D)p, no qual:(a) Ab é um anticorpo que se liga a TAT226 e que compreendeuma região variável de cadeia pesada que tenha pelo menos 90% deidentidade com a seqüência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ IDNos:21-25 e uma região variável de cadeia leve que tenha pelo menos 90% deidentidade com a seqüência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ IDNo:26-31.(b) L é um ligante;(c) D é uma droga da fórmula De ou Df.<formula>formula see original document page 233</formula>no qual, cada Rz e R6 são metila, cada R3 e R4 são isopropílico,R7é sec-butil, cada R8 é selecionado independente a partir de CH3, O-CH3, OH,e H; R9 é H; R10 é aril; Z é -O- ou -NH-; R11 é H, C1-C8 alquila, ou -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH3; e R18é -C(R8)2-C(R8)2-arila; e(d) ρ varia entre cerca de 1 a 8.
22. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato do anticorpo compreender um domínio variável decadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência deaminoácidos selecionados a partir da SEQ ID No: 24 e um domínio variável decadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência deaminoácidos selecionados a partir da SEQ ID No:29.
23. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato do anticorpo compreender uma região variável decadeia pesada que compreenda a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No:-24; e uma região variável de cadeia leve que compreenda a seqüência deaminoácidos da SEQ ID No: 29.
24. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato do anticorpo compreender uma região variável decadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência deaminoácidos selecionados a partir da SEQ ID No: 25 e uma região variável decadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência deaminoácidos selecionados a partir da SEQ ID No: 30.
25. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato do anticorpo compreender uma região variável decadeia pesada que compreenda a seqüência de aminoácidos da SEQ ID No:-25; e uma região variável de cadeia leve que compreenda a seqüência deaminoácidos da SEQ ID No: 30.
26. IMUNOCONJUGADO, de acordo com as reivindicações 17ou 21, caracterizado pelo fato do Iigante estar acoplado ao anticorpo por umgrupo tiol no anticorpo.
27. IMUNOCONJUGADO, de acordo com as reivindicações 17ou 21, caracterizado pelo fato da droga ser selecionada a partir de MMAE e MMAF.
28. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato da droga ser MMAE.
29. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato da droga ser MMAF.
30. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato do Iigante ser clivável por uma protease.
31. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado pelo fato do Iigante compreender um dipeptídeo val-cit.
32. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado pelo fato do Iigante compreender uma unidade p-aminobenzil.
33. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado pelo fato do Iigante compreender 6-maleimidocaproíl.
34. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato do imunoconjugado ter a fórmula:<formula>formula see original document page 235</formula>no qual, S é um átomo de enxofre, e ρ varia de 2 a 5.
35. IMUNOCONJUGADO, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato do imunoconjugado ter a fórmula:<formula>formula see original document page 235</formula>no qual, S é um átomo de enxofre, e ρ varia de 2 a 5.
36. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, compreendendo umimunoconjugado que possuí a fórmula Ab-(L-D)p, no qual:(a) Ab é um anticorpo que se liga a TAT226,(b) L é um ligante;(c) D é uma droga da fórmula De ou Df.<formula>formula see original document page 235</formula><formula>formula see original document page 236</formula>no qual, cada R2 e R6 são metila, cada R3 e R4 são isopropílico,R7é sec-butil, cada R8 é selecionado independente a partir de CH3, O-CH3, OH1e H; R9 é H; R10 é aril; Z é -O- ou -NH-; R11 é H, C1-C8 alquila, ou -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH3; e R18é -C(R8)2-C(R8)2-arila; e(d) ρ varia entre cerca de 1 a 8,para uso no tratamento de um distúrbio da proliferação celular.
37. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com areivindicação 36, caracterizada pelo fato do distúrbio ser selecionado a partirdo câncer de ovário, câncer de útero, tumor cerebral e tumor de Wilm.
38. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com areivindicação 36, caracterizada pelo fato do imunoconjugado ser oimunoconjugado da reivindicação 17 ou 21.
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