BRPI0709340A2 - mutaÇço ras e composiÇÕes e mÉtodos de uso da mesma - Google Patents

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Abstract

MUTAÇçO RAS E COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE USO DA MESMA, onde são reveladas mutações Ras e combinações de mutações recém-descobertas; protrínas,peptídeos e proteínas de fusão que contê, tais mutações;moléculas de ácido nucléico que codificam tais protéinas, peptídeos e protéinas de fusão; e uma série de ferramentas e métodos diagnósticos, terapêuticos e de seleção associados ao uso de tais mutações.

Description

"MUTAÇÃO RAS E COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE USO DA MESMA"
Histórico da Invenção
A neoplasia - processo de proliferação celular rápida que resulta em crescimento novo ou anormal - é característica de muitas doenças que podem ser graves e, às vezes, fatais.
Geralmente, o crescimento neoplásico de células e tecidos caracteriza-se por uma proliferação celular maior do que o normal, em que as células continuam a crescer mesmo após o desaparecimento do fator de estímulo (p.ex., promotor de tumor, carcinógeno, vírus). O crescimento celular tende a apresentar uma falta de organização estrutural e/ou coordenação com o tecido normal e, em geral, cria uma massa de tecido (p.ex., um tumor) que pode ser benigna ou maligna.
As mutações Ras são comuns no adenocarcinoma pulmonar em humanos, camundongos, ratos e hamsters. De fato, as mutações na família do proto-oncogene ras são as mutações oncogênicas mais freqüentes no câncer humano e nos tumores de cobaias. Sabe-se que existem inúmeras mutações nos oncogenes da família do gene ras que podem ser associados ao fenótipo das células tumorais na natureza. As mutações no códon que codifica o aminoácido 12 na proteína Ras são encontradas em 78% dos cânceres pancreáticos; 34% dos cânceres colorretais, 40% dos adenocarcinomas pulmonares de células não pequenas e em 24% dos cânceres ovarianos. Mutações Ras nos aminoácidos 13, 59 e 61 também são encontradas em uma série de cânceres (p.ex., consultar Lu et al., Cartcer Res. 2004 Aug 1;64(15):5084-8; Abrams et al, Sem Oncol1996 23, 118-134; Friday and Adjei, Biochim Biophys Acta 2005 1756, 127-144). A sinalização anormal pela via do produto do oncogene Ras desempenha um papel importante na proliferação celular descontrolada e na tumorigênese. Estas mutações pontuais nos códons 12, 13 e 61 causam a ativação constitutiva de Ras.
O crescimento celular maligno, ou seja, os tumores malignos são uma das principais causas de morte em todo o mundo e o desenvolvimento de uma terapia eficaz para as doenças neoplásicas é o tema de um amplo corpo de pesquisa. Embora tenham sido propostas várias abordagens inovadoras para o tratamento e prevenção do câncer, muitos deles continuam a causar uma alta taxa de mortalidade e podem ser difíceis de tratar ou relativamente insensíveis às terapias convencionais. Portanto, existe uma necessidade persistente na matéria de identificar outros fatores de risco e novos métodos de diagnóstico precoce e terapia para cânceres.
Breve Descrição das Figuras
A Figura 1 é um gráfico que mostra a lista de mutações Ras encontradas através da genotipagem de tumores de pacientes portadores de câncer colorretal, pancreático ou pulmonar de células não pequenas.
As Figuras 2A e 2B são imagens digitais de um ensaio de crescimento celular em ágar semi-sólido que mostra a formação exemplar de colônias negativa (Fig. 2A, células BALB/3T3 de camundongo não transfectadas) e positiva (Fig. 2B, clone de células BALB/3T3 de camundongo transfectadas com Ras G12V + E76G) em ágar semi-sólido. Células epiteliais cancerosas ("transformadas") são capazes de crescer no ágar semi-sólido, ao passo que as células não-transformadas não crescem neste tipo de meio.
As Figuras 3A e 3B são gráficos mostrando dois experimentos distintos que demonstram sinergia oncogênica no crescimento de tumores portadores de mutações Ras nos códons 12 e 76 em camundongos atímicos Balb/c.
A Figura 3C é um detalhe ampliado do estudo apresentado na figura 3A para mostrar o crescimento de células transfectadas-mutadas E76 individuais em relação a células BALB/3T3 não transfectadas (de tipo selvagem). A Figura 4 é um desenho esquemático que
ilustra a estrutura cristalina de uma forma de H-Ras com mutação no códon 12 (G12D) (à esquerda), comparada à estrutura de uma forma de H-Ras com mutação no códon 61 (Q61L) (à direita). A seta indica a posição estimada dos aminoácidos 12, 61 e 76 nas estruturas terciárias representadas.
Sumário da Invenção
Uma configuração da presente invenção relaciona-se a uma molécula isolada de ácido nucléico contendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma seqüência de aminoácidos contendo pelo menos 5 aminoácidos contíguos de uma proteína Ras mutante. A seqüência de aminoácidos contém o aminoácido de posição 76 em relação a uma proteína K-ras, N-ras ou H-ras selvagem, caracterizada pelo fato de o aminoácido na posição 76 ser mutado em comparação com a proteína selvagem. Em um aspecto, o aminoácido na posição 76 sofre mutação de um glutamato para um resíduo de aminoácido não-glutamato selecionado a partir de um grupo formado por: glicina, Iisina e glutamina. Em um aspecto, o resíduo de aminoácido não-glutamato é glicina. Em um aspecto, a seqüência de aminoácidos difere de qualquer uma das SEQ ID N°. 3, SEQ ID N°. 5, SEQ ID N°. 7, SEQ ID N°. 9, SEQ ID N°. 11 ou SEQ ID N°. 13 em razão da substituição de um aminoácido não-glutamato por glutamato na posição 76 das mencionadas SEQ ID N°. 3, SEQ ID N°. 5, SEQ ID N°. 7, SEQ ID N°. 9, SEQ ID N°. 11 ou SEQ ID N°. 13. Em um aspecto, a seqüência de aminoácidos compreende ainda pelo menos 5 resíduos contíguos de aminoácidos de uma proteína Ras mutante, caracterizando-se pelo fato de a seqüência de aminoácidos conter o aminoácido de posição selecionada a partir do grupo formado por 12, 13, 59 e 61 em relação a uma proteína K-ras, N-ras ou H-ras de tipo selvagem, e caracterizando-se pelo fato de o aminoácido na posição ser mutado em comparação com a proteína selvagem.
Em um aspecto desta configuração, a seqüência de aminoácidos compreende ainda pelo menos 5 aminoácidos contíguos de uma proteína Ras mutante, caracterizando-se pelo fato de a seqüência de aminoácidos conter o aminoácido na posição 12 em relação a uma proteína K-ras, N-ras ou H-ras de tipo selvagem, e caracterizando-se pelo fato de o aminoácido na posição 12 ser mutado em comparação com a proteína selvagem. Em um aspecto, o aminoácido nas posições 12 ou 13 sofre mutação de uma glicina para um resíduo de aminoácido não-glicina. Em um aspecto, o resíduo de aminoácido não-glicina é selecionado a partir de valina, cisteína, aspartato, arginina, serina e alanina.
Em outro aspecto desta configuração, a
seqüência do ácido nucléico codifica uma proteína de fusão contendo dois ou mais domínios, caracterizada pelo fato de que um dos domínios contém pelo menos 5 aminoácidos da proteína Ras mutante abrigando a mutação na posição 76, e caracterizada pelo fato de cada domínio adicional consistir num imunógeno. Em um aspecto, o imunógeno é um antígeno tumoral. Em um aspecto, o antígeno tumoral é uma proteína Ras ou fragmento imunogênico da mesma incluindo pelo menos uma mutação em relação à seqüência de aminoácidos da Ras selvagem. Em um aspecto, o antígeno tumoral é uma proteína Ras ou fragmento imunogênico da mesma incluindo as posições 12 ou 13 em relação à seqüência de aminoácidos da Ras selvagem, caracterizada pelo fato de o aminoácido nas posições 12 ou 13 sofrer mutação de um resíduo de glicina para um resíduo não-glicina. Em outro aspecto, o antígeno tumoral é selecionado a partir do grupo formado por: (a) um peptídeo contendo pelo menos as posições 8-16 de uma proteína Ras1 caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido na posição 12 em relação à proteína Ras selvagem ser mutado; (b) um peptídeo contendo pelo menos as posições 9-17 de uma proteína Ras, caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido na posição 13 em relação à proteína Ras selvagem ser mutado; (c) um peptídeo contendo pelo menos as posições 55-63 de uma proteína Ras1 caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido na posição 59 em relação à proteína Ras selvagem ser mutado; (d) um peptídeo contendo pelo menos as posições 57-65 de uma proteína Ras, caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido na posição 61 em relação à proteína Ras selvagem ser mutado; (e) um peptídeo contendo pelo menos as posições 69-77 de uma proteína Ras, caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido na posição 73 em relação à proteína Ras selvagem ser mutado; (f) um peptídeo contendo pelo menos as posições 70-78 de uma proteína Ras1 caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido na posição 74 em relação à proteína Ras selvagem ser mutado; (g) um peptídeo contendo pelo menos as posições 71-79 de uma proteína Ras1 caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido na posição 75 em relação à proteína Ras selvagem ser mutado; (h) um peptídeo contendo pelo menos as posições 73-81 de uma proteína Ras1 caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido na posição 77 em relação à proteína Ras selvagem ser mutado; e (i) um peptídeo contendo pelo menos as posições 74-82 de uma proteína Ras1 caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido na posição 78 em relação à proteína Ras selvagem ser mutado. Em um aspecto desta configuração, a
seqüência de ácido nucléico codifica uma proteína de fusão que contém a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N0. 14. Em outro aspecto, a seqüência de ácido nucléico codifica uma proteína de fusão que contém a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N°. 15. Outra configuração da invenção relaciona-se
a uma molécula isolada de ácido nucléico contendo pelo menos 5 aminoácidos contíguos de uma seqüência de ácido nucléico codificando Ras (H-Ras, N-Ras ou K-Ras), caracterizada pelo fato de a prolina na posição 73 da Ras (P73), a treonina na posição 74 (T74), a glicina na posição 75 (G75), a glicina na posição 77 (G77) e/ou a fenilalanina na posição 78 (F78) da seqüência de aminoácidos serem mutadas. Também fazem parte do escopo da invenção as moléculas de ácido nucléico que codificam qualquer fragmento de Ras contendo qualquer uma ou mais destas mutações, cuja molécula de ácido nucléico é útil em qualquer aplicação diagnostica, terapêutica ou de seleção. Preferivelmente, o aminoácido em qualquer uma ou mais destas posições é substituído por um aminoácido diferente do que ocorre nesta posição na seqüência da Ras selvagem.
Em outra configuração, a invenção apresenta moléculas isoladas de ácido nucléico contendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica proteínas Ras (H-ras, N-ras ou K-ras) contendo uma ou mais mutações nas posições 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 ou 78 (ou em porção das mesmas), além de uma ou mais mutações numa posição diferente da proteína Ras. Uma configuração preferida das mutações é uma mutação G12 e/ou uma mutação G13 com qualquer uma ou mais mutações nas posições 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 ou 78. Em outra configuração, a invenção oferece uma combinação de diferentes moléculas de ácido nucléico, das quais pelo menos uma codifica Ras (ou uma porção da mesma) contendo uma ou mais mutações numa posição selecionada entre 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 ou 78 (e preferivelmente selecionada a partir de qualquer uma das posições 73-78), e uma ou mais moléculas de ácido nucléico contendo uma ou mais mutações adicionais, compreendendo, de modo não exaustivo, uma mutação em G12 e uma mutação em G13.
Em uma configuração da invenção, qualquer uma das moléculas de ácido nucléico descritas acima pode ser uma sonda de oligonucleotídeo ou um primer.
Outra configuração da invenção diz respeito a uma molécula de ácido nucléico recombinante contendo qualquer uma das moléculas de ácido nucléico descritas acima, operativamente relacionada à pelo menos uma seqüência de controle de expressão.
Uma outra configuração da invenção relaciona-se a uma célula recombinante que foi transfectada com qualquer uma das moléculas de ácido nucléico recombinante descritas acima. Em um aspecto, a célula recombinante da reivindicação 20, caracterizada pelo fato de a célula ser uma levedura.
Outra configuração da presente invenção relaciona-se a uma proteína ou peptídeo isolado codificado pela molécula de ácido nucléico isolado de qualquer das moléculas de ácido nucléico identificadas acima. Em uma configuração, a proteína ou peptídeo isolado é parte de uma proteína de fusão.
Outra configuração da invenção diz respeito a uma molécula de ácido nucléico isolado que é inteiramente complementar a qualquer uma das seqüências de ácido nucléico descritas anteriormente.
Uma outra configuração da invenção diz respeito a uma vacina contendo qualquer uma das moléculas de ácido nucléico descritas anteriormente. Outra configuração da invenção diz respeito
a uma vacina contendo qualquer uma das proteínas ou peptídeos descritos anteriormente. Em um aspecto, a vacina contém ainda um veículo tipo levedura. Em outro aspecto, o veículo tipo levedura expressa a proteína ou peptídeo de maneira recombinante. Em um aspecto, a vacina compreende também uma célula dendrítica, caracterizada pelo fato de a célula dendrítica ser carregada de forma intracelular com o veículo tipo levedura e a proteína ou peptídeo.
Uma outra configuração da invenção diz respeito a uma vacina contendo: (a) um veículo tipo levedura; e (b) uma proteína de fusão contendo uma proteína Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de a proteína ou fragmento da mesma conter o aminoácido de posição 76 em relação à proteína K-ras, N-ras ou H-ras de tipo selvagem, e caracterizada pelo fato de o aminoácido na posição 76 ser mutado em comparação com a proteína selvagem, caracterizada pelo fato de a expressão da proteína de fusão estar sob o controle do promotor Cup1. A proteína de fusão é expressa pelo veículo tipo levedura. Em um aspecto, a proteína de fusão compreende ainda uma segunda proteína Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de esta segunda proteína ou fragmento da mesma conter o aminoácido de posição 12 em relação à proteína K- ras, N-ras ou H-ras de tipo selvagem, e caracterizada pelo fato de o aminoácido na posição 12 ser mutado em comparação com a proteína selvagem.
Em um aspecto, a proteína de fusão compreende as seguintes proteínas ou fragmentos fundidos no quadro de leitura: (i) uma proteína Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de a proteína ou fragmento conter o aminoácido de posição 12 em relação a uma proteína K-ras, N-ras ou H-ras de tipo selvagem, e caracterizada pelo fato de a glicina na posição 12 ser substituída por uma cisteína; (ii) uma proteína Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de a proteína ou fragmento conter o aminoácido de posição 61 em relação a uma proteína K-ras, N-ras ou H-ras de tipo selvagem, e caracterizada pelo fato de a glutamina na posição 61 ser substituída por uma arginina; (iii) uma proteína Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de a proteína ou fragmento conter o aminoácido de posição 12 em relação a uma proteína K-ras, N-ras ou H-ras de tipo selvagem, e caracterizada pelo fato de a glicina da posição 12 ser substituída por um aspartato; (iv) uma proteína Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de a proteína ou fragmento conter o aminoácido de posição 12 em relação a uma proteína K-ras, N-ras ou H-ras de tipo selvagem, e caracterizada pelo fato de a glicina da posição 12 ser substituída por uma valina; (v) uma proteína Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de a proteína ou fragmento conter o aminoácido de posição 12 em relação a uma proteína K-ras, N-ras ou H-ras de tipo selvagem, e caracterizada pelo fato de a glicina da posição 12 ser substituída por uma arginina; e (vi) uma proteína Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de a proteína ou fragmento conter o aminoácido de posição 76 em relação a uma proteína K-ras, N-ras ou H-ras de tipo selvagem, e caracterizada pelo fato de o glutamato da posição 76 ser substituído por uma glicina.
Em um aspecto, a proteína de fusão compreende as seguintes proteínas ou fragmentos fundidos no quadro de leitura: (i) uma proteína Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de a proteína ou fragmento conter o aminoácido de posição 12 em relação a uma proteína K-ras, N-ras ou H-ras de tipo selvagem, e caracterizada pelo fato de a glicina da posição 12 ser substituída por uma arginina; e (ii) uma proteína Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de a proteína ou fragmento conter o aminoácido de posição 76 em relação a uma proteína K-ras, N-ras ou H-ras de tipo selvagem, e caracterizada pelo fato de o glutamato da posição 76 ser substituído por uma glicina.
Em um aspecto, a proteína de fusão
compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N°. 14. Em outro aspecto, a proteína de fusão compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N°. 15.
Uma outra configuração da invenção diz respeito a um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga seletivamente a qualquer uma das proteínas ou peptídeos Ras mutantes descritos acima.
Outra configuração da invenção refere-se a um aptâmero que se liga seletivamente a qualquer uma das proteínas ou peptídeos Ras mutantes descritos acima.
Uma outra configuração da invenção relaciona-se a uma molécula de siRNA que catalisa a clivagem seletiva de RNA transcrito por qualquer uma das moléculas de ácido nucléico descritas acima, ou do RNA transcrito por um gene ras codificando qualquer uma das proteínas Ras mutantes descritas acima e, especialmente, uma proteína Ras mutante contendo uma seqüência de aminoácidos que difere de uma seqüência de aminoácidos K-ras, N»ras ou H-ras de tipo selvagem em razão de pelo menos uma mutação na posição 76 em relação à seqüência selvagem de aminoácidos.
Outra configuração da invenção refere-se a uma ribozima que catalisa seletivamente a inativação das moléculas de ácido nucléico descritas anteriormente, ou a de um gene ras codificando qualquer uma das proteínas Ras mutantes descritas acima e, especialmente, a proteína Ras mutante contendo uma seqüência de aminoácidos que difere de uma seqüência de aminoácidos K-ras, N-ras ou H-ras de tipo selvagem em razão de pelo menos uma mutação na posição 76 em relação à seqüência selvagem de aminoácidos.
Uma outra configuração da invenção diz respeito a uma molécula de ácido nucléico anti-senso que promove hibridização sob condições de altíssima especificidade e inibe a expressão de qualquer uma das moléculas de ácido nucléico descritas acima ou de um gene ras codificando qualquer uma das proteínas Ras mutantes descritas acima, e especialmente a proteína Ras mutante contendo uma seqüência de aminoácidos que difere de uma seqüência de aminoácidos K-ras, N-ras ou H-ras de tipo selvagem em razão de pelo menos uma mutação na posição 76 em relação à seqüência selvagem de aminoácidos.
Outra configuração da invenção relaciona-se ao uso de qualquer uma das moléculas de ácido nucléico ou das proteínas ou peptídeos, ambas descritas anteriormente, na preparação de uma composição destinada à prevenção ou tratamento de câncer.
Outra configuração da invenção refere-se ao uso de qualquer uma das vacinas descritas acima na preparação de um medicamento destinado à prevenção ou tratamento de câncer. Outra configuração da invenção diz respeito
ao uso de qualquer um dos aptâmeros, dos siRNAs, das ribozimas ou das moléculas de ácido nucléico anti-senso - todos eles descritos acima - na preparação de um medicamento destinado à prevenção ou tratamento de câncer. Uma outra configuração da invenção refere-
se a um método para prevenir ou tratar um câncer, compreendendo a administração de qualquer uma das vacinas descritas acima a um animal que tenha ou esteja em risco de desenvolver um câncer.
Outra configuração da invenção refere-se a um método para prevenir ou tratar um câncer, compreendendo a administração de qualquer um dos aptâmeros, dos siRNAs, das ribozimas ou das moléculas de ácido nucléico anti-senso, todos descritos anteriormente, a um animal que tenha ou esteja em risco de desenvolver um câncer. Outra configuração da invenção refere-se a um método para prevenir ou tratar um câncer, compreendendo a administração, a um animal que tenha ou esteja em risco de desenvolver um câncer, de um composto que inibe a expressão de uma proteína Ras mutante, caracterizado pelo fato de que a proteína Ras mutante contém uma seqüência de aminoácidos que difere de uma seqüência de aminoácidos K-ras, N-ras ou H-ras de tipo selvagem em razão de pelo menos uma mutação na posição 76 em relação à seqüência selvagem de aminoácidos. Uma outra configuração da invenção refere-
se a um método para prevenir ou tratar um câncer, compreendendo a administração, a um animal que tenha ou esteja em risco de desenvolver um câncer, de um composto que inicia ou aciona a hidrólise de guanosina trifosfato (GTP) de uma proteína Ras mutante, caracterizado pelo fato de que a proteína Ras mutante contém uma seqüência de aminoácidos que difere de uma seqüência de aminoácidos K-ras, N-ras ou H-ras de tipo selvagem em razão de pelo menos uma mutação na posição 76 em relação à seqüência selvagem de aminoácidos. Outra configuração da invenção diz respeito
a um método para o diagnóstico de um tumor que compreende a detecção da expressão ou atividade de uma proteína Ras mutante ou seqüência de ácido nucléico codificando tal proteína Ras em uma amostra de teste de um paciente a ser diagnosticado, caracterizado pelo fato de que a proteína Ras contém uma mutação na posição 76 em relação à seqüência de aminoácidos da Ras selvagem. A detecção da proteína Ras mutante ou seqüência de ácido nucléico codificando tal proteína Ras na amostra de teste indica a presença de células tumorais, ou sua virtualidade, na amostra de teste. Em um aspecto, a proteína Ras compreende uma substituição de uma glicina pelo glutamato na posição 76 na proteína selvagem. Em um aspecto, o método compreende ainda detectar se a proteína Ras também inclui uma mutação na posição 12 em relação à seqüência de aminoácidos da Ras selvagem, caracterizando-se pelo fato de que a detecção de uma mutação na posição 76 e na posição 12 indica a presença de células tumorais ou sua virtualidade na amostra de teste, indicando ainda um tumor mais agressivo no paciente, em comparação com as células tumorais abrigando uma proteína Ras com somente uma ou nenhuma mutação nestas posições. Em um aspecto, a etapa de detecção compreende a detecção de uma seqüência de ácido nucléico codificando a mutação Ras na amostra de teste. Em um aspecto, a etapa de detecção compreende a amplificação por PCR de um molde de DNA genômico codificando a mutação ou amplificação por PCR in situ de seqüências de DNA codificando a mutação. Em um aspecto, a etapa de detecção é realizada através de uma técnica selecionada a partir do grupo formado por reação em cadeia da polimerase (PCR), reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR), hibridização in situ, northern blot, análise de seqüência, análise em microsséries de expressão gênica e detecção da expressão de um gene repórter. Em um aspecto, o nível da seqüência de ácido nucléico codificando a proteína Ras mutante é determinado através da realização de contato entre os ácidos nucléicos isolados a partir da amostra de teste e um primer ou sonda que se liga seletivamente à seqüência de ácido nucléico que codifica a proteína Ras mutante, detectando- se se a seqüência de ácido nucléico que codifica a proteína Ras mutada é ligada pelo primer ou sonda. Em um aspecto, o nível de proteína Ras mutante é determinado pela realização de contato entre a amostra de teste e um anticorpo, fragmento do mesmo ou aptâmero que se liga seletivamente à proteína Ras mutante, especificamente, detectando-se se o anticorpo, o fragmento ou o aptâmero ligou-se à proteína Ras mutante. Em um aspecto, a amostra de teste é oriunda de um paciente sendo diagnosticado para câncer e se caracteriza pelo fato de ser comparada a uma amostra de controle negativo. Em um aspecto, a amostra de teste é imobilizada em um substrato. Em um aspecto, o método é utilizado para diagnosticar câncer no paciente. Em um aspecto, o método é utilizado para determinar o prognóstico do câncer no paciente. Em outro aspecto, o método é utilizado para determinar a suscetibilidade do paciente a um tratamento terapêutico.
Outra configuração da invenção refere-se a um kit a ser usado nos métodos diagnósticos da presente invenção. Preferivelmente, o kit contém qualquer reagente útil para a detecção da presença ou ausência da mutação Ras (proteína) ou ras (ácido nucléico) de acordo com a presente invenção numa amostra de teste e, preferivelmente, inclui uma sonda de oligonucleotídeo, primers de PCRt ou um anticorpo, peptídeo de ligação ao antígeno ou aptâmero que se liga ao biomarcador (i.e., o gene ras mutado, RNA, DNA complementar ou proteína codificada pelos mesmos). O kit pode incluir qualquer reagente necessário à realização de um método diagnóstico delineado neste documento. Ademais, o kit pode incluir reagentes para a detecção de outros biomarcadores de câncer, tais como as mutações Ras previamente descritas ou qualquer outro alvo adequado para o diagnóstico de câncer, mesmo para cânceres que tenham causas ou recebam contribuições não associadas à mutação Ras descrita neste documento. Uma outra configuração da invenção diz respeito a um método para identificação de um composto para prevenir ou tratar câncer, compreendendo a identificação de um inibidor de uma proteína-alvo Ras ou ácido nucléico que codifica a proteína-alvo Ras1 caracterizado pelo fato de que a proteína-alvo Ras contém uma mutação na posição 76 em relação a uma proteína Ras selvagem. Em um aspecto, a mutação é uma substituição de um aminoácido não-glutamato, selecionado a partir do grupo formado por glicina, Iisina e glutamina, por glutamato na posição 76 da proteína selvagem. Em um aspecto, a etapa de identificação compreende a identificação de um inibidor de expressão ou atividade da proteína-alvo Ras. Em um aspecto, a etapa de detecção é selecionada a partir do grupo formado por: detecção da tradução ou atividade da proteína-alvo Ras na presença do composto regulador hipotético; e detecção da expressão de um gene que codifica a proteína-alvo Ras na presença do composto regulador hipotético. Em um aspecto, o método compreende as seguintes etapas: (a) realizar o contato entre uma célula hospedeira e um composto regulador hipotético, caracterizado pelo fato de a célula hospedeira expressar a proteína- alvo Ras ou um fragmento biologicamente ativo da mesma; e (b) detectar se o composto regulador hipotético aciona a hidrólise de GTP da proteína-alvo Ras ou do fragmento biologicamente ativo da mesma, caracterizado pelo fato de o composto regulador hipotético que aciona a hidrólise de GTP da proteína-alvo Ras ser um composto candidato para a prevenção ou tratamento de câncer, em comparação com a ausência do componente. Em um aspecto, a célula hospedeira é uma linhagem de células tumorais.
Outra configuração da invenção relaciona-se 17/153
a um método para identificação de um composto destinado à prevenção ou tratamento de câncer, compreendendo a identificação de composto que aciona a hidrólise de GTP numa célula que expressa uma proteína-alvo Ras mutada, mas não numa célula que expressa uma proteína Ras selvagem, caracterizado pelo fato de que a proteína Ras mutada contém uma mutação na posição 76 em relação a uma proteína Ras selvagem.
Em um aspecto de ambos os métodos de identificação acima, o composto regulador hipotético pode ser selecionado entre: um aptâmero, uma molécula de siRNA, uma molécula de ácido nucléico anti-senso, uma ribozima, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um antagonista conformacional e pequenas moléculas inibidoras.
Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção refere-se, de modo
geral, à descoberta pelos presentes inventores de uma recém- descoberta mutação na Ras humana que se acredita contribuir ou causar câncer em alguns indivíduos que tenham a mutação, o que inclui múltiplas variantes desta mutação em particular. Especificamente, os inventores descobriram que uma mutação no aminoácido de número 76 (i.e., codificado pelo códon 76) na seqüência da Ras humana (K-, N- ou H-Ras) pode ser identificada em uma porcentagem significativa de tumores de pacientes, e que tal mutação aumenta a oncogenicidade dos tumores. De acordo com o conhecimento dos presentes inventores, esta mutação Ras não foi identificada anteriormente. A invenção também se refere à descoberta, pelos presentes inventores, de que, quando esta mutação recém-descoberta está presente em uma célula tumoral ao mesmo tempo em que uma segunda mutação Ras previamente descrita, especialmente uma mutação no códon 12, a combinação destas mutações produz uma sinergia que aumenta a oncogenicidade dos tumores portadores destas mutações. Em particular, a combinação de mutações possui um efeito sinérgico em relação à intensificação do crescimento tumoral, quando comparado à presença de uma só mutação, o que foi demonstrado tanto in vitro quanto in vivo. Assim sendo, a presente invenção apresenta moléculas de ácido nucléico e proteínas que utilizam estas descobertas, além de uma série de ferramentas de pesquisa, diagnóstico e terapia e métodos de uso baseados nestas descobertas, conforme a descrição detalhada abaixo.
Especificamente, as seqüências de DNA de K-, N- e H-ras foram caracterizadas pela presença de mutações associadas a tumor através de amplificação por nested-PCR e seqüenciamento direto dos éxons 2 e 3 em tumores de 149 pacientes portadores de carcinoma pancreático (68% detectados com mutações ras nos códons 12, 13 ou 61), colorretal (40% detectados com mutações ras nos códons 12, 13 ou 61) ou pulmonar de células não pequenas (CPCNP) (9% detectados com mutações ras nos códons 12, 13 ou 61) em um estudo fase I de imunoterapia com leveduras totais mortas que expressam proteínas Ras mutadas (também chamadas Tarmogens neste documento). Uma nova mutação ras no códon 76 foi detectada em 24 indivíduos portadores destes três tipos de câncer, sendo que 22 tumores abrigavam mutações E76G, 1 tumor abrigava uma mutação E76K e 1 tumor abrigava uma mutação E76Q. Combinações duplas das mutações E76 e nos códons 12 ou 13, previamente descritas, foram identificadas em 8 tumores.
Mais especificamente, e conforme ilustrado na Tabela 1 (ver Exemplo 1), 5 dos 33 (-15%) tumores de pulmão, 12 dos 85 tumores colorretais (-14%) e 7 dos 31 (-22,5%) tumores de pâncreas - dos quais se obteve informações completas de seqüenciamento nos três genes da Ras (éxons 2 e 3) - apresentaram mutações no aminoácido de número 76 (i.e., codificado pelo códon 76) na seqüência Ras humana (mutação Ras E76). Um dos tumores colorretais/pulmão apresentou mutações no aminoácido 76 tanto em K-ras quanto em H-ras. No caso dos tumores colorretais, 10 das 12 mutações no aminoácido 76 consistiam na mutação de glutamato para glicina (E76G); uma consistia na mutação de glutamato para Iisina (E76K); e uma na mutação de glutamato para glutamina (E76Q). Todas as mutações E76 nos tumores de pulmão e pâncreas eram mutações E76G. No geral, a ocorrência de mutações no aminoácido Ras 76 nos tumores pesquisados neste estudo fase l foi inferior somente à ocorrência de mutações no aminoácido Ras 12 (ver Fig. 1). As freqüências das mutações Ras previamente conhecidas nas posições 12, 13 e 61 neste mesmo conjunto de amostras tumorais são apresentadas na Tabela 2 (ver Exemplo 1). As mutações E76 ocorreram principalmente no éxon 3 dos genes K-ras ou H-ras, embora a mutação E76K tenha ocorrido no éxon 3 do gene N-ras. Além disso, conforme mencionado acima, em 8 tumores foram identificadas combinações duplas da mutação E76 mais as mutações nos códons 12 ou 13 previamente descritas. Juntos, estes dados indicaram que as mutações no códon 76 do gene Ras causavam ou contribuíam para o câncer nestes indivíduos.
Outros estudos conduzidos pelos inventores demonstraram que, de fato, a expressão de uma mutação Ras no códon 76 do K-ras murino em células BALB/3T3 aumentou a formação de colônias em ágar semi-sólido por estas células in vitro. Especificamente, as mutações E76G e E76K foram confirmadas como mutações transformantes em estudos não-clínicos. De especial interesse, as mutações ligadas aos códons 76 e 12 resultaram em sinergia de crescimento tumoral (i.e., a combinação das mutações produziu uma sinergia que aumentou significativamente a oncogenicidade de tumores contendo Ras com estas mutações duplas). Ademais, quando vários genes K-ras mutantes foram injetados em camundongos atímicos BALB/c, a mutação dupla G12-E76 (especificamente neste experimento, uma mutação G12V-E76G) acarretou um crescimento tumoral significativamente acelerado em comparação com células tumorais abrigando uma única de qualquer das mutações. Tendo feito estas descobertas, os presentes inventores acreditam que, sem estar limitada pela teoria, a mutação E76 pode resultar numa oncoproteína Ras ativada.
As mutações no códon 12 ou no códon 61, descritas acima, bloqueiam a liberação de γ-fosfato da GTP ou impedem a proteína Ras-GAP Iigante a Ras de acionar a hidrólise de GTP1 respectivamente. Quando a estrutura cristalina conhecida da proteína Ras foi examinada pelos presentes inventores quanto à posição do aminoácido 76, foi observado que este resíduo está localizado na extremidade da alça designada "Switch 2" ou "Alça 4" (ver Fig. 4). Recorrendo à Fig. 4, a posição estimada dos aminoácidos 12, 13, 61 e 76 é destacada na estrutura terciária da proteína (p.ex., para aminoácidos posicionando-se na estrutura cristalina da Ras, ver as múltiplas estruturas no Banco de Dados de Proteínas RSSB ou Franken, SM et al, Biochemistry 1993, 32:8411- 20). Este desenho esquemático destaca a mudança na estrutura cristalina da proteína Ras devido a uma mutação no códon 12 em H-Ras (G12D) (à esquerda), comparada à seqüência selvagem (G12) para aquele domínio (à direita). Além disso, a estrutura alterada de um domínio abrigando uma forma mutante no códon 61 de H-Ras (Q61L) (à direita) é evidente em comparação com a seqüência selvagem para aquele domínio (à esquerda). A extremidade proximal da Alça 4 abriga o aminoácido 61, onde se definiu, antes da presente invenção, que as mutações ativam a oncoproteína Ras em cânceres animais e humanos (p.ex., ver Lu et al., Câncer Res. 2004 Aug 1;64(15):5084-8; ver também inúmeros estudos clínicos - dois pacientes com câncer colorretal participantes do atual estudo descrito no Exemplo 1 também apresentam mutações no códon 61 da Ras). Esta alça da proteína Ras está envolvida na ligação com proteínas ativadoras da GTPase (Ras-GAP) que acionam a hidrólise de GTP ligada à proteína Ras ativada, convertendo a Ras numa forma inativa ligada ao GDP. A incapacidade de acionar a hidrólise de GTP mantém a proteína Ras em estado ativado (ligada ao GTP) e, portanto, os sinais para a proliferação celular são enviados de modo constitutivo. Assim, a mutação no códon 61 impede as proteínas de interação de desligar o estado ativado. A mutação no códon 12 interfere na liberação do fosfato terminal, de modo que a proteína permanece no estado ativado. O estado ativado é, pois, uma conformação da proteína Ras (quando ligada ao GTP) que é capaz de se associar com proteínas efetoras downstream para enviar o sinal de proliferação para os ativadores upstream ou, no caso das proteínas Ras mutadas, de fornecer um sinal de ativação constitutiva.
O posicionamento do aminoácido 76 na outra "dobradiça" do importante domínio Switch 2/Alça 4 (ligante a GAP) é compatível com a crença dos presentes inventores de que as mutações neste aminoácido irão interferir de maneira similar na função da Ras. Por exemplo, uma mutação de glutamato para glicina (mutação Ras E76G) mudará a seqüência Ras de glicina- glutamato-glicina (GEG no código de uma letra dos códons 74-76) para glicina-glicina-glicina (GGG no código de uma letra dos códons "mutados" 74-76). Sabe-se que a introdução de glicinas nas estruturas alfa-helicoidais interfere bioquimicamente na manutenção das estruturas da alça alfa-helicoidal. Portanto, prevê-se que a mudança de GEG para GGG rompa a alfa-hélice da alça 4/Switch 2 e interfira nas alterações conformacionais necessárias para promover a hidrólise de GTP. De modo similar, a mudança de glutamato para Iisina ou de glutamato para glutamina no aminoácido 76 (E76K ou E76Q, respectivamente) irá alterar a carga do aminoácido, a qual também tem o potencial de romper a estrutura e a função da proteína se a carga negativa do glutamato fosse importante para as interações proteína-proteína intra ou intermoleculares. Assim, a observação realizada pelos presentes inventores de que uma fração significativa dos tumores possui a mutação Ras E76 pode ser explicada pelos estudos da função e da estrutura da proteína Ras. A identificação de mutações no códon 76 do gene ras em tumores humanos constitui, conseqüentemente, um novo alvo para a terapia do câncer.
Estas observações levaram os inventores a propor ainda, neste documento, que as mutações de interesse na região de dobradiça associadas ao E76 também podem conter mutações nos aminoácidos P73, T74, G75, E76, G77 e F78, e que as mutações nestas posições terão um efeito sobre a hidrólise de GTP da Ras e, portanto, sobre a proliferação celular (crescimento tumoral), semelhante ao da mutação E76 aqui descrita. Logo, as mutações nos códons 73, 74, 75, 77 e 78 também constituem novos alvos para a terapia do câncer.
Os resultados dos inventores também indicam que os tumores portadores de mutações duplas têm mais tendência a apresentar a característica de crescimento agressivo. Assim, acredita-se que o genótipo das mutações duplas nos códons 12 e 76 do gene ras em tumores de pacientes seja prognóstico de um fenótipo maligno acelerado, o que foi indicado pelos dados apresentados neste documento. A identificação de mutações combinadas, incluindo as mutações no códon 76 do ras, conseqüentemente representa um outro novo alvo para a terapia do câncer. Além disso, porque os dados dos inventores apresentados no Exemplo 1 também indicam que mutações no A59 ou Q61 da Ras também podem ser encontradas junto com mutações G12 ou G13, os inventores propõe aqui que outras combinações entre mutações em G12 ou G13 (interferindo na liberação do fosfato terminal) e qualquer uma ou mais em A59, Q61 ou E76 - ou, de fato, em qualquer dos outros aminoácidos da mesma região de Φ 20 dobradiça que o E76 (i.e., P73, T74, G75, E76, G77, F78) - também exacerbam a sinalização de proliferação celular através da inibição da hidrólise de GTP da Ras e, em conseqüência, conduzirão a um fenótipo de tumor mais agressivo, com aumento de potencial metastático. Isto se baseia na crença dos inventores de que a combinação entre a redução da capacidade de liberar GTP clivado (impacto de mutações nas posições 12/13) e a incapacidade de sinalizar a atividade da GTPase (impacto de mutações nas posições 59, 61, 73-78 em qualquer dos lados da região da Alça 4/Switch 2) irá exacerbar a sinalização de proliferação celular em ordem de magnitude, conforme é indicado pelos dados relativos à combinação de mutações em G12 e E76. Este fenótipo pode ocorrer através de duas mutações na mesma molécula de DNA (mesmo gene) e/ou mutações que ocorrem separadamente em cada um dos alelos de RAS1 embora os dados dos inventores indiquem que a combinação de mutações ocorrendo na mesma molécula de DNA resulte em fenótipo mais agressivo e possa potencializar metástases malignas. Em conseqüência, a presente invenção inclui moléculas de ácido nucléico tendo qualquer combinação das mutações na posição 12 ou 13 com mutações nas posições 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 ou 78 - com combinações entre as posições 12 ou 13 com as posições 59, 61 ou 76 sendo configurações especiais da invenção. A presente invenção abrange proteínas ou peptídeos contendo estas combinações e os usos das moléculas de ácido nucléico e proteínas (e ferramentas associadas), conforme será descrito em mais detalhes abaixo.
Portanto, uma configuração da presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolado contendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica a proteína Ras (H-Ras, N-Ras ou K-Ras), caracterizada pelo fato de o glutamato na posição 76 da seqüência de aminoácidos da Ras (E76) ser mutado. A invenção também abrange moléculas de ácido nucléico que codificam qualquer fragmento de Ras contendo a mutação na posição 76, molécula de ácido nucléico esta que seja útil em qualquer aplicação diagnostica, terapêutica ou de seleção. Preferivelmente, o aminoácido na posição 76 é substituído por outro aminoácido (um aminoácido que não seja glutamato, ou um "aminoácido não-glutamato") que pode incluir, de modo não exaustivo, uma substituição por glicina, uma substituição por Iisina
ι ou uma substituição por glutamina. Em outra configuração, a invenção oferece moléculas de ácido nucléico isolado contendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica Ras (H-Ras, N-Ras ou K-Ras) contendo uma mutação E76 (ou uma porção da mesma) e uma ou mais mutações em posições diferentes na proteína Ras. Uma combinação preferida de mutações é uma mutação E76 e uma mutação G12, embora este aspecto da invenção não se limite a esta combinação, conforme descrito acima. Em outra configuração, a invenção oferece uma combinação de diferentes moléculas de ácido nucléico, sendo que pelo menos uma delas codifica Ras contendo uma mutação E76 (ou uma porção da mesma) e uma ou mais moléculas de ácido nucléico contendo uma ou mais mutações adicionais, incluindo, de maneira não exaustiva, uma mutação em G12, uma mutação em G13, uma mutação em A59 e/ou uma mutação em Q61. As moléculas de ácido nucléico que codificam proteínas ou peptídeos Ras contendo a mutação na posição 76, isolada ou em conjunto com tais mutações adicionais, são úteis, por exemplo, como sondas ou primers para ferramentas de pesquisa ou diagnóstico, para preparar moléculas de siRNA ou de anti-senso (descritas abaixo) como reagentes diagnósticos ou terapêuticos, e/ou para codificar proteínas e peptídeos Ras para uso como reagentes diagnósticos, terapêuticos e/ou de pesquisa, todos descritos mais detalhadamente abaixo.
Outra configuração da invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico isolado contendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica Ras (H-Ras, N-Ras ou K-Ras), caracterizada pelo fato de a prolina na posição 73 da Ras (P73), a treonina na posição 74 (T74), a glicina na posição 75 (G75), a glicina na posição 77 (G77) e/ou a fenilalanina na posição 78 (F78) da seqüência de aminoácidos da Ras serem mutadas. A invenção abrange também as moléculas de ácido nucléico que codificam qualquer fragmento de Ras contendo qualquer uma ou mais destas mutações, moléculas estas que sejam úteis em qualquer aplicação diagnostica, terapêutica ou de seleção. Preferivelmente, o aminoácido em qualquer uma ou mais destas posições é substituído por um aminoácido diferente do que ocorre nesta posição na seqüência da Ras selvagem.
Em outra configuração, a invenção oferece moléculas de ácido nucléico isolado contendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica proteínas Ras (H-ras, N- ras ou K- ras) contendo qualquer uma ou mais das mutações na posição 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 ou 78 (ou uma porção das mesmas) e uma ou mais mutações adicionais em posições diferentes na proteína Ras. Uma combinação preferida de mutações é uma mutação G12 e/ou uma mutação G13 com qualquer uma ou mais das mutações nas posições 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 ou 78. Em outra configuração, a invenção oferece uma combinação de diferentes moléculas de ácido nucléico, sendo que pelo menos uma delas codifica Ras (ou uma porção da mesma) contendo uma ou mais mutações numa posição selecionada entre 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 ou 78 (e, preferivelmente, selecionada a partir de qualquer uma das posições 73-78), e uma ou mais moléculas de ácido nucléico contendo uma ou mais mutações adicionais, incluindo, de modo não exaustivo, uma mutação em G12 e uma mutação em G13.
Moléculas de ácido nucléico codificando proteínas ou peptídeos Ras contendo quaisquer das mutações acima e combinações das mesmas são úteis, por exemplo, como sondas ou primers para ferramentas de pesquisa ou diagnóstico, (
para preparar moléculas de siRNA ou de anti-senso (descritas abaixo) como reagentes diagnósticos ou terapêuticos, e/ou para codificar proteínas e peptídeos Ras para uso como reagentes diagnósticos, terapêuticos e/ou de pesquisa, todos descritos mais detalhadamente abaixo.
Também estão incluídas na presente invenção proteínas codificadas por quaisquer das moléculas de ácido nucléico acima identificadas, incluindo quaisquer fragmentos de uma proteína Ras que contenha uma mutação na posição 76 (ou qualquer uma ou mais das mutações nas posições 73, 74, 75, 77 ou 78), isolada ou em combinação com outras mutações, e que são úteis em qualquer aplicação diagnostica, terapêutica ou de pesquisa.
O uso da mutação Ras E76, assim como o uso de uma mutação na posição 73, 74, 75, 77 ou 78 ou em qualquer das combinações de mutações Ras descritas neste documento, pode ser expandido a fim de abranger uma série de ferramentas diagnosticas, terapêuticas e de pesquisa, entre elas o desenvolvimento de anticorpos que se ligam seletivamente a proteínas Ras tendo esta(s) mutação(ões) em particular; o desenvolvimento de aptâmeros que se ligam seletivamente a proteínas Ras tendo esta(s) mutação(ões) em particular; o desenvolvimento de seqüências de ácido nucléico anti-senso ou siRNA úteis como reagentes diagnósticos ou como ferramentas terapêuticas para inibição da expressão de Ras contendo esta(s) mutação(ões) em particular; o desenvolvimento de moléculas terapêuticas, incluindo antagonistas conformacionais, que acionam a hidrólise de GTP ou compensam as deficiências ou hiperatividade destas proteínas Ras mutantes nesse aspecto; e/ou o desenvolvimento de modelos animais, inclusive linhagens de células e animais transgênicos que expressem esta(s) mutação(ões).
Outra configuração da presente invenção refere-se ao uso da mutação Ras E76, ou de uma mutação na posição 73, 74, 75, 77 ou 78 ou de quaisquer das combinações de mutações Ras descritas neste documento, como marcador em ensaio diagnóstico ou prognóstico de câncer. Por exemplo, amostras biológicas podem ser obtidas de um paciente que está por fazer exames para câncer ou que apresenta risco de desenvolver um câncer, podendo ser analisada a expressão de uma proteína Ras contendo a mutação E76 (ou uma mutação na posição 73, 74, 75, 77 ou 78) tanto no nível do gene quanto no do RNA ou da proteína. Os pacientes que expressam uma proteína Ras contendo esta mutação serão considerados como tendo maior risco de desenvolver um câncer ou serão diagnosticados como tendo mais tendência a desenvolver um câncer, em comparação com uma pessoa que não apresenta tal mutação. Além disto, os pacientes que expressam uma proteína Ras contendo uma mutação em qualquer uma das posições 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 ou 78 junto com uma segunda mutação Ras, e particularmente uma mutação G12 ou G13 (com as combinações de mutações em E76 e G12 sendo de especial interesse) serão considerados como tendo um risco ainda maior de desenvolver um câncer, serão diagnosticados como tendo um câncer mais agressivo ou diagnosticados como tendo mais tendência a desenvolver um câncer, em comparação com uma pessoa que não apresenta tal combinação de mutações na proteína Ras. Ademais, a presença ou ausência de quaisquer das mutações nas posições 73-78 da proteína Ras (especialmente a mutação E76) e combinações destas mutações ou da mutação da posição 59 ou 61 com outras mutações podem ser utilizadas para determinar a terapia anticâncer para um paciente ou para prever o resultado da terapia de um paciente. Por exemplo, um paciente que apresente a mutação Ras E76G pode ser tratado de uma certa maneira ou com composições terapêuticas específicas, dependendo da presença da mutação Ras E76 (p.ex., pela seleção de compostos que afetam a hidrólise de GTP). Aliás, algumas das configurações da presente invenção descritas abaixo se destinam a abordagens imunoterapêuticas baseadas na identificação desta mutação em particular ou de quaisquer das mutações nas posições 73-78 ou de combinações de mutações aqui descritas. Pode-se prever que um paciente que apresente a combinação de uma mutação E76 com outra mutação, como a mutação G12, apresente um tumor especialmente agressivo e/ou possa promover a metástase do tumor primário a partir do sítio de origem, podendo ser tratado de acordo com estas previsões, incluindo abordagens imunoterapêuticas baseadas na lesão E76 ou nesta combinação de mutações. Conforme abordado anteriormente, prevê-se que outras combinações da mutação G12 ou G13 e mutações na região da Alça 4/ Switch 2 também indiquem tumores particularmente agressivos.
Uma outra configuração da presente invenção diz respeito ao uso da mutação Ras E76 (ou de uma mutação na posição 73, 74, 75, 77 ou 78 ou de quaisquer das combinações de mutações Ras descritas neste documento) como um alvo em abordagens terapêuticas para o tratamento de câncer num paciente. Tais abordagens terapêuticas podem incluir, de maneira não exaustiva, abordagens quimioterápicas e abordagens imunoterapêuticas. Por exemplo, com base no mecanismo de ação da mutação Ras E76 proposto e discutido acima, pode-se conceber ou propor estratégias quimioterápicas que, por exemplo, permitem a hidrólise de GTP da proteína Ras ou compensam sua incapacidade de acionar a hidrólise de GTP. Pode-se preferivelmente conceber um composto que seja capaz de regular a hidrólise de GTP de uma proteína Ras mutada, sem afetar a hidrólise de GTP por proteína Ras não-mutada de tipo selvagem (descrito mais detalhadamente a seguir). A título de ilustração, pode-se desenvolver uma variedade de moléculas, aptâmeros ou antagonistas conformacionais sintéticas usando as informações fornecidas neste documento para acionar a hidrólise de GTP de proteínas Ras ativas. Numa abordagem imunoterapêutica, a mutação Ras E76 (ou outras mutações nas posições 73-78) é utilizada na produção ou provisão de antígenos Ras mutados a fim de estimular uma resposta imune contra células tumorais que expressam tal Ras mutada. Combinações de mutações Ras (p.ex., E76 e G12) podem ser utilizadas de modo similar. A proteína ou peptídeo Ras mutado ou o ácido nucléico que codifica os mesmos podem ser utilizados como alvo em ensaios, a fim de identificar fármacos originais à base de peptídeos ou pequenas moléculas, previstos para modificar a expressão ou a atividade da proteína Ras numa célula tumoral, por exemplo. Os aspectos preferidos desta configuração são descritos abaixo.
Outra configuração da presente invenção diz
respeito a uma vacina ou composição profilática ou terapêutica e a um método de uso da mesma a fim de proteger um animal contra câncer. A vacina ou composição pode compreender um antígeno contendo uma ou mais porções imunogênicas de Ras abrigando a
li 'X mutação E76 descrita neste documento (ou uma ou mais porções imunogênicas de uma proteína Ras abrigando uma mutação na posição 73, 74, 75, 77 ou 78), isolado ou em combinação com outras porções imunogênicas de Ras abrigando outras mutações, ou em combinação com outros imunógenos relevantes para o tumor a ser tratado ou prevenido. A vacina ou composição também pode compreender um antígeno contendo uma ou mais porções imunogênicas de Ras abrigando quaisquer das combinações de mutações Ras aqui descritas, isolado ou em combinação com outros imunógenos relevantes para o tumor a ser tratado ou prevenido. Pode ser incluído na vacina ou composição qualquer veículo farmaceuticamente aceitável para liberar tal antígeno, incluindo qualquer adjuvante, carreador ou outro veículo de liberação. Em uma configuração preferida, o veículo é um veículo à base de levedura que será descrito em mais detalhes abaixo. O antígeno Ras pode ser fornecido numa composição para o tratamento de qualquer câncer contendo mutações Ras E76 (ou uma mutação na posição 73, 74, 75, 77 ou 78 ou quaisquer das combinações de mutações Ras descritas neste documento), e também como elemento de um produto à base de múltiplos epitopos e/ou múltiplos antígenos destinado ao tratamento de uma série de cânceres, o que pode incluir todos os cânceres contendo mutações Ras E76 (ou uma mutação na posição 73, 74, 75, 77 ou 78 ou quaisquer das combinações de mutações Ras aqui descritas). Como acima, outros antígenos Ras e/ou outros antígenos de câncer ou porções imunogênicas dos mesmos podem ser incluídas na vacina ou composição.
Técnicas Gerais
A prática da presente invenção empregará, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (inclusive técnicas de recombinação), microbiologia, biologia celular, bioquímica, química de ácidos nucléicos e imunologia que são bem conhecidas para os especialistas na matéria. Estas técnicas encontram-se completamente explicadas na literatura, como em Methods of Enzymology, Vol. 194, Guthrie et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); Biology and activities of yeasts, Skinner, et al., eds., Academic Press (1980); Methods in yeast genetics: a Iaboratoty course manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); The Yeast Saccharomyces: Cell Cycle and Cell Biology, Pringle et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997); The Yeast Saccharomyces: Gene Expressioni Jones et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993); The Yeast Saccharomyces: Genome Dynamics, Protein Synthesisl and Energetics, Broach et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) e Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel1 2001), (citados em comum neste documento como "Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, incluindo suplementos publicados até 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Harlow and Lane (1988) Antibodiesj A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications1 New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor1 NY (citados em comum neste documento como "Harlow e Lane"), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000); Casarett and Doull's Toxicology The
% Basic Science of Poisonsl C. Klaassen1 ed., 6th edition (2001), e Vaccinesi S. Plotkin and W. Orenstein, eds., 3rd edition (1999).
Definições Gerais
As referências gerais feitas neste documento à "mutação Ras" podem referir-se, salvo indicação em contrário, a uma mutação na seqüência de ácido nucléico do gene ras ou ácido nucléico obtido ou derivado do mesmo (p.ex., RNA, DNA), bem como a uma mutação na seqüência de aminoácidos da proteína Ras ou peptídeo da mesma. As referências a uma mutação em uma certa posição da seqüência de ácido nucléico ou da seqüência de aminoácidos de Ras podem ser descritas por referência ao códon ou número de posição do aminoácido no qual ocorre a mutação, e tais referências podem ser utilizadas de modo intercambiável (p.ex., a referência a "códon 76" ou "posição 76" ou Έ76" podem todas ser utilizadas para se referir ao códon da seqüência de ácido nucléico do gene ras que codifica o aminoácido 76 da proteína Ras ou o real resíduo de aminoácido (glutamato) na posição 76, onde se está descrevendo uma mutação na seqüência ou de ácido nucléico ou de aminoácidos).
De acordo com a presente invenção, uma
molécula de ácido nucléico isolado é uma molécula de ácido nucléico que foi retirada de seu meio natural (i.e., que foi submetida à manipulação humana), seu meio natural sendo o genoma ou cromossomo onde a molécula de ácido nucléico é encontrada na natureza. Desta forma, o termo "isolado" não indica necessariamente a extensão em que a molécula de ácido nucléico foi purificada, e sim que a molécula não inclui todo o genoma ou todo o cromossomo onde a molécula de ácido nucléico é encontrada na natureza. Além disso, uma molécula de ácido nucléico isolado não é uma biblioteca de moléculas de ácido nucléico, como a biblioteca de moléculas de ácido nucléico que é produzida a partir de uma amostra tumoral. Uma molécula de ácido nucléico isolado pode conter um gene. Uma molécula de ácido nucléico isolado que contém um gene não é um fragmento de um cromossomo que contém este gene; mais exatamente, tal molécula contém a região codificante e as regiões regulatórias associadas ao gene, mas nenhum outro gene que seja naturalmente encontrado no mesmo cromossomo. Uma molécula de ácido nucléico isolado também pode conter uma seqüência especificada de ácido nucléico flanqueada (i.e., na extremidade 5' e/ou 3' da seqüência) por outros ácidos nucléicos que normalmente não flanqueiam a seqüência especificada de ácido nucléico na natureza (i.e., seqüências heterólogas). A molécula de ácido nucléico isolado pode conter DNA1 RNA (p.ex., RNA mensageiro) ou derivados de DNA e RNA (p.ex., DNA complementar, siRNA). Embora a expressão "molécula de ácido nucléico" refira-se primariamente à molécula física de ácido nucléico e a expressão "seqüência de ácido nucléico" refira-se primariamente à seqüência de nucleotídeos na molécula de ácido nucléico, as duas expressões podem ser empregadas de modo intercambiável, principalmente em relação a uma molécula de ácido nucléico, ou seqüência de ácido nucléico, capaz de codificar uma proteína ou domínio ou porção de uma proteína.
O tamanho mínimo de uma molécula de ácido nucléico da presente invenção é um tamanho suficiente para formar uma sonda ou primer oligonucleotídeo que sejam capazes de formar um híbrido estável (p.ex., sob condições de especificidade moderada, alta ou muito alta) com a seqüência complementar de uma molécula de ácido nucléico da presente invenção, ou um tamanho suficiente para codificar uma seqüência de aminoácidos que sirva como epitopo imunogênico, seja suficiente para uso na produção de um anticorpo ou peptídeo de ligação ao antígeno ou tenha a atividade biológica de uma proteína natural codificada (p.ex., Ras) ou proteína mutada (p.ex. uma Ras mutante) ou fragmento das mesmas. Assim sendo, o tamanho da molécula de ácido nucléico que codifica tal proteína pode depender da composição do ácido nucléico e do percentual de homologia ou identidade entre a molécula de ácido nucléico e a seqüência complementar, podendo depender ainda das condições de hibridização em si (p.ex., temperatura, concentração de sal e concentração de formamida). Usualmente, o tamanho mínimo de uma molécula de ácido nucléico utilizada como primer oligonucleotídeo ou como sonda é de pelo menos 12 a 15 nucleotídeos de extensão, aproximadamente, se as moléculas de ácido nucléico são ricas em GC, e de pelo menos 15 a 18 bases de extensão aproximadamente se ricas em AT. Afora a limitação prática, não há limite para o tamanho máximo de uma molécula de ácido nucléico da presente invenção, no sentido de que a molécula de ácido nucléico possa conter uma seqüência suficiente para ser útil em quaisquer das configurações da invenção descritas neste documento.
Uma molécula de ácido nucléico isolado da presente invenção pode ser produzida através da tecnologia de DNA recombinante (p.ex., amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR), clonagem) ou síntese química. As moléculas de ácido nucléico isolado abrangem as moléculas de ácido nucléico naturais e as homólogas das mesmas, incluindo, de modo não exaustivo, variantes alélicas naturais e moléculas dè ácido nucléico modificadas nas quais tenham sido inseridos, suprimidos, substituídos e/ou invertidos nucleotídeos, de maneira tal que estas modificações forneçam o efeito desejado (p.ex., a introdução de uma mutação E76G numa seqüência de aminoácidos da Ras, conforme exposto neste documento).
Uma molécula homóloga de ácido nucléico pode ser produzida através de inúmeros métodos conhecidos entre os especialistas na matéria (consultar, por exemplo, Sambrook et aL, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press (1989)). Por exemplo, pode-se modificar moléculas de ácido nucléico usando-se uma série de técnicas que inclui, de modo não exaustivo, as técnicas clássicas de mutagênese e as técnicas de DNA recombinante, tal como mutagênese sítio-dirigida, tratamento químico de molécula de ácido nucléico para induzir mutações, clivagem por enzima de restrição de fragmento de ácido nucléico, ligação de fragmentos de ácido nucléico, amplificação por PCR e/ou mutagênese de regiões selecionadas da seqüência de ácido nucléico, síntese de misturas de oligonucleotídeos e ligação de grupos de misturas para "construir" uma mistura de moléculas de ácido nucléico e combinação das mesmas. Os homólogos de molécula de ácido nucléico podem ser selecionados a partir de uma mistura de ácidos nucléicos modificados através de seleção da função da proteína codificada pelo ácido nucléico e/ou de hibridização com um gene selvagem. Uma sonda de oligonucleotídeos, ou sonda,
é uma molécula de ácido nucléico cujo tamanho tipicamente varia de cerca de 8 nucleotídeos a várias centenas de nucleotídeos em extensão. Tal molécula geralmente é utilizada para identificar uma seqüência-alvo de ácido nucléico numa amostra por hibridização a esta seqüência-alvo de ácido nucléico sob condições rigorosas. As condições de hibridização foram descritas em detalhe acima.
Os primers de PCR também são seqüências de ácido nucléico, embora tipicamente sejam oligonucleotídeos de extensão bem menor do que os utilizados nas reações em cadeia da polimerase. Primers de PCR e sondas de hibridização podem ser prontamente desenvolvidos e produzidos pelos especialistas na matéria, usando as informações obtidas a partir da seqüência-alvo. (Consultar, por exemplo, Sambrook et al., supra ou Glick et al., supra).
Os aptâmeros são fitas curtas de ácidos nucléicos sintéticos (geralmente RNA, mas também D NA) selecionados a partir de bibliotecas combinatórias de ácidos nucléicos em virtude de sua capacidade de ligação com uma molécula-alvo específica predeterminada com alta afinidade e especificidade. Os aptâmeros assumem uma estrutura tridimensional definida e são capazes de discriminar compostos com pouquíssimas diferenças na estrutura.
A interferência por RNA (RNAi) é uma metodologia para inativação de genes por meio de silenciamento gênico, chamado "interferência por RNA" (RNAi). Ver1 por exemplo, Fire et al., Nature 391: 806-811 (1998) e patente norte-americana n. 6.506.559. A interferência por RNA refere-se a um evento que ocorre quando um polinucleotídeo de RNA atua, através de processos celulares endógenos, para suprimir especificamente a expressão de um gene cuja seqüência corresponde àquela do RNA. O silenciamento do gene-alvo ocorre após a degradação do RNA mensageiro pelas moléculas de RNA dupla-fita pelo animal hospedeiro, às vezes por meio de digestão por endonuclease ribonuclease III. A digestão resulta em moléculas com cerca de 21 a 23 nucleotídeos (ou bases) de extensão (ou tamanho), embora o tamanho molecular possa ser de até 30 bases. Este tipo pequeno de RNA (RNA interferente pequeno ou siRNA) media a degradação das mensagens e transcrições correspondentes do RNA, possivelmente por meio de um complexo de nuclease de RNAi1 chamado complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC, na sigla em inglês), o que ajuda os pequenos RNA dupla-fita a reconhecer RNA mensageiros complementares através de interações de pareamento de bases. Após a interação do siRNA com seu substrato, o RNA mensageiro é marcado para degradação, talvez por enzimas presentes no RISC. Este tipo de mecanismo aparenta ser útil aos organismos na inibição de infecções virais, salto de transposons e fenômenos semelhantes, e também para regular a expressão de genes endógenos. Até o momento, a atividade do RNAi foi documentada em plantas, insetos, nematóides e vertebrados, entre outros organismos. Para informações gerais, ver, por exemplo, Schutz et al., Virology 344(1):151-7 (2006); Leonard et al., Gene Ther. 13(6):532~40 (2006); Colbere-Garapin et al., Microbes Infect 7(4):767-75 (2005); Wall, Theriogenology 57(1): 189-201 (2002); El-Bashir, et al., Nature 411: 494-498 (2001); Fire, A., et al. Science 391: 806-811 (1998); Gitlin etal., Nature 418: 430-434 (2002); Gitlin, et al., J. Virol. 79:1027-1035 (2005); Kahana, et al., J. Gen. Virol. 85, 3213-3217 (2004); Kronke et al., J. Virol. 78: 3436-3446 (2004); Leonard et al., J. Virol. 79:1645-1654 (2005); e Yokota, et al., EMBO Rep. 4: 602-608 (2003).
Uma ribozima é um segmento de RNA capaz de realizar catálise biológica (p.ex., quebrando ou formando ligações covalentes). Mais especificamente, as ribozimas são moléculas de RNA anti-senso que funcionam ligando-se à fração de RNA-alvo e desativando-a através da clivagem do esqueleto fosfodiéster em um sítio de corte específico. Tais agentes derivados do ácido nucléico podem ser introduzidos em células hospedeiras ou tecidos e são utilizados para inibir a expressão e/ou a função de proteínas Ras mutadas.
De acordo com a invenção, uma molécula de ácido nucléico recombinante compreende um vetor recombinante e uma seqüência de ácido nucléico de interesse. Um vetor recombinante é uma molécula de ácido nucléico criada por engenharia genética (i.e., produzida artificialmente) que é empregada como uma ferramenta para manipular uma seqüência de ácido nucléico à escolha e para introduzir esta seqüência de ácido nucléico em uma célula hospedeira. O vetor recombinante é portanto adequado para uso em clonagem, seqüenciamento e/ou manipulação da seqüência de ácido nucléico escolhida, como através da expressão e/ou liberação da seqüência escolhida de ácido nucléico em uma célula hospedeira a fim de formar uma célula recombinante. Tipicamente, tal vetor contém seqüências heterólogas de ácido nucléico, ou seja, seqüências de ácido nucléico que naturalmente não são encontradas adjacentes à seqüência de ácido nucléico a ser clonada ou liberada, embora o vetor também possa conter seqüências regulatórias de ácido nucléico (p.ex., promotores, regiões não traduzidas) que naturalmente são encontradas adjacentes às moléculas de ácido nucléico da presente invenção ou que são úteis para a expressão das moléculas de ácido nucléico da presente invenção (a ser discutido em detalhe abaixo). O vetor pode ser DNA ou RNA1 procariótico ou eucariótico e, tipicamente, é um plasmídeo. O vetor pode ser mantido como elemento extracromossômico (p.ex., um plasmídeo) ou pode ser integrado ao cromossomo de um organismo recombinante (p.ex., um micróbio ou uma planta). O vetor inteiro pode permanecer instalado dentro da célula hospedeira ou, sob certas condições, o DNA plasmídeo pode ser suprimido, abandonando a molécula de ácido nucléico da presente invenção. A molécula de ácido nucléico instalada pode estar sob o controle de um promotor cromossômico, de um promotor plasmídeo ou nativo ou de uma combinação de vários promotores. Pode-se integrar uma ou múltiplas cópias da molécula de ácido nucléico ao cromossomo. Um vetor recombinante da presente invenção pode conter pelo menos um marcador passível de seleção.
Em uma configuração, um vetor recombinante utilizado numa molécula de ácido nucléico da presente invenção é um vetor de expressão. Conforme empregado neste documento, o termo "vetor de expressão" refere-se a um vetor que é adequado para a produção de um produto codificado (p.ex., uma proteína de interesse). Nesta configuração, uma seqüência de ácido nucléico codificando o produto a ser gerado é inserida no vetor recombinante a fim de produzir uma molécula de ácido nucléico recombinante. A seqüência de ácido nucléico codificando a proteína a ser produzida é inserida no vetor de um modo que, operativamente, associa a seqüência de ácido nucléico às seqüências regulatórias no vetor que possibilita a transcrição e a tradução da seqüência de ácido nucléico dentro da célula hospedeira recombinante.
Em outra configuração, um vetor recombinante utilizado numa molécula de ácido nucléico recombinante da presente invenção é um vetor de marcação. Conforme empregado neste documento, o termo "vetor de marcação" refere-se a um vetor que é utilizado para liberar uma certa molécula de ácido nucléico numa célula hospedeira recombinante, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucléico pode ser utilizada para suprimir, desativar ou substituir um gene endógeno ou porção de um gene dentro da célula hospedeira (i.e., utilizada para desabilitar o gene marcado ou tecnologia de "bloqueio" [knockout]). É possível que tal vetor também seja conhecido na matéria, em um aspecto, como vetor de "knockout. Em um aspecto desta configuração, uma porção do vetor - mas, mais geralmente - a molécula de ácido nucléico inserida no vetor possui uma seqüência de ácido nucléico que é homóloga a uma seqüência de ácido nucléico de um gene-alvo na célula hospedeira (i.e., um gene que é marcado para ser suprimido ou desativado). A seqüência de ácido nucléico do vetor inserido é concebida para se associar ao gene-alvo, de modo que o gene-alvo e o vetor inserido podem sofrer recombinação homóloga, através da qual o gene-alvo endógeno é suprimido, desativado, atenuado (i.e., no mínimo uma porção do gene-alvo endógeno é mutada ou suprimida) ou substituído.
Tipicamente, uma molécula de ácido nucléico recombinante contém pelo menos uma molécula de ácido nucléico da presente invenção operativamente associada a uma ou mais seqüências de controle de expressão. De acordo com a presente invenção, o termo "operativamente associado" refere-se à associação de uma molécula de ácido nucléico a uma seqüência de controle de expressão (p.ex., uma seqüência de controle de transcrição e/ou uma seqüência de controle de tradução), de modo tal que a molécula pode ser expressa quando transfectada (i.e., l
transformada, transduzida, transfectada, conjugada ou conduzida) para uma célula hospedeira. As seqüências de controle de transcrição são seqüências que controlam o início, a elongação ou o término da transcrição. Particularmente importantes são as seqüências de controle de transcrição que controlam o início da transcrição, como as seqüências promotoras, facilitadoras, operadoras e repressoras. Entras as seqüências de controle de transcrição adequadas estão quaisquer seqüências de controle de transcrição que possam funcionar em uma célula hospedeira ou organismo no qual a molécula de ácido nucléico recombinante deva ser introduzida.
As moléculas de ácido nucléico recombinante da presente invenção também podem conter outras seqüências reguladoras, como as seqüências reguladoras de tradução, origens de replicação e outras seqüências reguladoras compatíveis com a célula recombinante. Em uma configuração, uma molécula recombinante da presente invenção, incluindo aquelas que são integradas ao cromossomo da célula hospedeira, também contém sinais secretores (i.e., seqüências de ácido nucléico de segmento de sinal) para permitir que uma proteína expressa seja secretada pela célula que produz a proteína. Os segmentos de sinal adequados englobam segmentos de sinal naturalmente associados à proteína a ser expressa ou quaisquer segmentos de sinal heterólogos capazes de direcionar a secreção da proteína de acordo com a presente invenção. Em outra configuração uma molécula recombinante da presente invenção compreende uma seqüência líder para permitir que uma proteína expressa seja liberada e inserida na membrana de uma célula hospedeira. Entre as seqüências líderes adequadas estão aquelas que são X
naturalmente associadas à proteína, ou qualquer seqüência líder heteróloga capaz de direcionar a liberação e a inserção da proteína na membrana de uma célula.
De acordo com a presente invenção, o termo "transfecção" refere-se a qualquer método por meio do qual uma molécula de ácido nucléico exógeno (i.e., uma molécula de ácido nucléico recombinante) possa ser inserida numa célula. O termo "transformação" pode ser utilizado de modo intercambiável com o termo "transfecção" quando utilizado para fazer referência à introdução de moléculas de ácido nucléico em células microbianas, como bactérias e leveduras, ou em células vegetais. Em sistemas microbianos e vegetais, o termo "transformação" é utilizado para descrever uma alteração herdada devido à aquisição de ácidos nucléicos exógenos pelo microrganismo ou planta, sendo essencialmente um sinônimo do termo "transfecção". Em células animais, porém, a transformação adquiriu um segundo significado e pode se referir a alterações nas propriedades de crescimento de células em cultura após estas se tornarem cancerosas, por exemplo. Portanto, a fim de evitar confusão, o termo "transfecção" é empregado preferivelmente em relação à introdução de ácidos nucléicos exógenos em células animais; o termo "transfecção" será utilizado em geral para englobar a transfecção de células animais e a transformação de células microbianas ou vegetais, na medida que os termos dizem respeito à introdução de ácidos nucléicos exógenos numa célula. Portanto, as técnicas de transfecção compreendem, de modo não exaustivo, transformação, bombardeamento de partículas, difusão, transporte ativo, sonicação em banho, eletroporação, microinjeção, lipofecção, adsorção, infecção e fusão de protoplastos.
Conforme utilizadas neste documento, as condições de hibridização referem-se a condições padrão de hibridização, sob as quais as moléculas de ácido nucléico são usadas para identificar moléculas de ácido nucléico similares. Tais condições padrão são reveladas, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manuali Cold Spring Harbor Labs Press, 1989. Sambrook et al., ibid., cujo inteiro teor é incorporado a este documento por citação (ver especificamente as páginas 9.31- 9.62). Além disso, as fórmulas utilizadas para calcular as condições apropriadas de hibridização e lavagem para se obter hibridização que admita graus variados de imperfeições de pareamento de nucleotídeos são reveladas, por exemplo, em Meinkoth et al., 1984, Anal. Biochem. 138, 267-284; Meinkoth et al., ibid., cujo inteiro teor é incorporado a este documento por citação. Condições de hibridização e lavagem de
baixa especificidade, conforme empregado neste documento, se referem a condições que admitem o isolamento de moléculas de ácido nucléico tendo no mínimo em torno de 70% de identidade entre a seqüência de ácido nucléico e a molécula de ácido nucléico utilizada como sonda na reação de hibridização (i.e., condições que admitem cerca de 30% ou menos de imperfeições de pareamento de nucleotídeos). Condições de hibridização e lavagem de especificidade moderada, conforme empregado neste documento, se referem a condições que admitem o isolamento de moléculas de ácido nucléico tendo no mínimo em torno de 80% de identidade entre a seqüência de ácido nucléico e a molécula de ácido nucléico utilizada como sonda na reação de hibridização (i.e., condições que admitem cerca de 20% ou menos de imperfeições de pareamento de nucleotídeos). Condições de hibridização e lavagem de alta especificidade, conforme empregado neste documento, se referem a condições que admitem o isolamento de moléculas de ácido nucléico tendo no mínimo em torno de 90% de identidade entre a seqüência de ácido nucléico e a molécula de ácido nucléico utilizada como sonda na reação de hibridização (i.e., condições que admitem cerca de 10% ou menos de imperfeições de pareamento de nucleotídeos). Condições de hibridização e lavagem de altíssima especificidade, conforme empregado neste documento, se referem a condições que admitem o isolamento de moléculas de ácido nucléico tendo no mínimo em torno de 95% de identidade entre a seqüência de ácido nucléico e a molécula de ácido nucléico utilizada como sonda na reação de hibridização (i.e., condições que admitem cerca de 5% ou menos de imperfeições de pareamento de nucleotídeos). Um especialista na matéria pode utilizar as fórmulas apresentadas em Meinkoth et al., ibid. a fim de calcular as condições apropriadas de hibridização e lavagem a fim de obter estes níveis de imperfeições de pareamento de nucleotídeos. Tais condições variarão, conforme estejam sendo formados híbridos DNA:RNA ou DNA:DNA. As temperaturas de fusão calculadas para híbridos DNA:DNA são 10°C mais baixas do que para os híbridos DNA:RNA. Em certas configurações, as condições de hibridização rígidas para híbridos DNA:DNA compreendem hibridização com tampão citrato de sódio (SSC) a uma força iônica de 6X (0,9 M Na+) a uma temperatura entre cerca de 20°C e cerca de 35°C (baixa especificidade), de preferência entre cerca de 28°C e cerca de 40°C (mais especificidade) e, em grau de preferência ainda maior, entre cerca de 35°C e cerca de 45°C (ainda mais especificidade), com condições apropriadas de lavagem. Em certas configurações, condições de hibridização rígidas para híbridos DNA:RNA compreendem hibridização a uma força iônica de 6X SSC (0,9 M Na+) a uma temperatura entre cerca de 30°C e cerca de 45°C, de preferência entre cerca de 38°C e cerca de 50°C e, em grau de preferência ainda maior, entre cerca de 45°C e cerca de 55°C, com condições de lavagem igualmente rígidas. Por outro lado, a temperatura de fusão pode ser calculada empiricamente conforme estabelecido em Sambrook et al., supra, páginas 9.31 a 9.62. Em geral, as condições de lavagem deveriam ser tão rigorosas quanto possível, e também deveriam ser apropriadas para as condições de hibridização escolhidas. Por exemplo, as condições de hibridização podem englobar uma combinação de condições de sal e temperatura que estão aproximadamente 20~25°C abaixo da temperatura de fusão calculada para um certo híbrido e, usualmente, as condições de lavagem englobam uma combinação de condições de sal e temperatura que estão aproximadamente 12- 20°C abaixo da temperatura de fusão calculada para um certo híbrido. Um exemplo de condições adequadas de hibridização para uso com híbridos DNA:DNA compreende uma hibridização por 2 a 24 horas em 6X SSC (formamida a 50%) a cerca de 42°C , seguida por etapas de lavagem que incluem uma ou mais lavagens em temperatura ambiente com cerca de 2X SSC, e outras lavagens a temperaturas mais altas e força iônica mais baixa (p.ex., pelo menos uma lavagem a cerca de 37°C em cerca de 0,1X-0,5X SSC, seguida de pelo menos uma lavagem a cerca de 68°C em cerca de 0,1X~0,5X SSC).
Na presente invenção, a referência a um polipeptídeo ou proteína isolada abrange proteínas totais, proteínas de fusão e qualquer fragmento, domínio, epitopo conformacional ou homólogo de tais proteínas. Mais especificamente, uma proteína isolada, de acordo com a presente invenção, é uma proteína (inclusive um polipeptídeo ou peptídeo) que foi retirada de seu meio natural (i.e., que foi submetida à manipulação humana), podendo abranger proteínas purificadas, proteínas parcialmente purificadas, proteínas produzidas por recombinação e proteínas produzidas sinteticamente, por exemplo. Assim sendo, "isolada" não reflete a extensão em que a proteína foi purificada.
Conforme utilizado neste documento, o termo "homólogo" refere-se a uma proteína ou peptídeo que difere da proteína ou peptídeo que ocorre naturalmente (i.e., a proteína "protótipo" ou "selvagem") em razão de uma ou mais mutações ou modificações menores em relação à proteína ou peptídeo que ocorre naturalmente, mas que mantém a estrutura global da cadeia lateral e da proteína básica da forma que ocorre naturalmente (i.e., de maneira tal que o homólogo possa ser identificado como estando relacionado à proteína selvagem). Tais modificações compreendem, de modo não exaustivo: alterações em uma ou algumas cadeias laterais de aminoácidos; mudanças em um ou alguns aminoácidos, inclusive supressões (p.ex., uma versão truncada da proteína ou peptídeo), inserções e/ou substituições; modificações na estereoquímica de um ou de alguns átomos; e/ou micro- derivatizações, incluindo, de modo não exaustivo: metilação, farnesilação, geranilgeranilação, glicosilação, carboximetilação, fosforilação, acetilação, miristoilação, prenilação, palmitoilação e/ou amidação. Um homólogo pode conter um agonista de uma proteína ou um antagonista de uma proteína. Um homólogo pode ter propriedades melhoradas, reduzidas, alteradas ou substancialmente similares em comparação com a proteína ou peptídeo que ocorre naturalmente. Registre-se que os homólogos podem englobar homólogos produzidos sinteticamente, variantes alélicas de uma certa proteína ou domínio ocorrendo naturalmente ou seqüências homólogas de organismos outros que o organismo do qual foi derivada a seqüência de referência. Os homólogos podem ser o resultado de uma variação alélica natural ou mutação natural. Os homólogos podem ser produzidos através de técnicas conhecidas na matéria para a produção de proteínas, incluindo, de modo não exaustivo, modificações diretas na proteína isolada ou sintética que ocorre naturalmente, síntese direta de proteínas ou modificações na seqüência de ácido nucléico codificando a proteína, usando-se, por exemplo, técnicas clássicas ou de DNA recombinante para efetuar mutagênese marcada ou aleatória.
Um homólogo de uma determinada proteína pode compreender, ser formado essencialmente ou ser formado por uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 45%, ou pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 55%, ou pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 65%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% idêntica, ou pelo menos cerca de 96% idêntica, ou pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 98% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica (ou qualquer percentual de identidade entre 45% e 99%, em acréscimos de números inteiros) à seqüência de aminoácidos da proteína de referência. Em uma configuração, o homólogo compreende, é formado essencialmente por ou é formado por uma seqüência de aminoácidos que é menos de 100% idêntica, menos de cerca de 99% idêntica, menos de cerca de 98% idêntica, menos de cerca de 97% idêntica, menos de cerca de 96% idêntica, menos
de cerca de 95% idêntica e assim por diante, em acréscimos de 1%, até menos de cerca de 70% idêntica à seqüência natural de aminoácidos da proteína de referência.
Conforme utilizada neste documento, salvo indicação em contrário, a menção a um percentual (%) de identidade refere-se a uma avaliação de homologia que é realizada por meio de: (1) uma pesquisa de homologia no programa BLAST 2.0 Basic BLAST usando blastp nas pesquisas de aminoácidos e blastn nas pesquisas de ácidos nucléicos com parâmetros-padrão predeterminados, onde, por padrão, a seqüência query é filtrada para regiões de baixa complexidade (descrito em Altschul1 S.F., Madden, T.L., Schãàffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, cujo inteiro teor é incorporado a este documento por citação); (2) um alinhamento no programa BLAST 2 (usando os parâmetros descritos abaixo); (3) e/ou no programa PSI- BLAST usando parâmetros-padrão predeterminados (BLAST iterativo de busca por posições específicas). Registre-se que, em função de algumas diferenças nos parâmetros-padrão dos programas BLAST 2.0 Basic BLAST e BLAST 2, duas seqüências específicas podem ser reconhecidas como tendo homologia significativa usando-se o programa BLAST 2, ao passo que uma pesquisa realizada no programa BLAST 2.0 Basic BLAST usando- se uma das seqüências como seqüência query pode não identificar a segunda seqüência nos principais resultados. Além disso, o programa PSI-BLAST oferece uma versão automática e fácil de usar de uma pesquisa de "perfil", que é uma maneira mais sensível de procurar homólogos de seqüências. O programa realiza primeiro uma busca no banco de dados BLAST-gapped. O programa PSI- BLAST usa as informações de quaisquer alinhamentos significativos devolvidos pela busca para construir uma matriz de escore específico por posição, substituindo a seqüência query na próxima fase de pesquisa no banco de dados. Portanto, deve-se compreender que o percentual de identidade pode ser determinado usando-se qualquer um destes programas.
Duas seqüências específicas podem ser alinhadas entre st usando-se a seqüência BLAST 2 conforme descrita em Tatusova and Madden, (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250, cujo inteiro teor é incorporado a este documento por citação. O alinhamento da seqüência pelo programa BLAST 2 é realizado em blastp ou blastn usando-se o algoritmo BLAST 2.0 para executar uma pesquisa entre as duas seqüências no Gapped BLAST (BLAST 2.0), que admite a introdução de gaps (supressões e inserções) no alinhamento resultante. Para fins de clareza neste documento, um alinhamento de seqüências no programa BLAST 2 é realizado usando-se os parâmetros-padrão predeterminados da maneira a seguir.
Para blastn, usando a matriz 0 BLOSUM62:
Reward for match = 1 [Pontos por
compatibilidade = 1]
Penalty for mismatch = -2 [Penalidade por
incompatibilidade = -2]
Open gap (5) and extension gap (2) penalties
[Penalidades pela abertura do gap (5) e pela
extensão do gap (2)]
gap x_dropoff (50) expect (10) word size (11) filter (on)
[ffap x_entrega (50) valor de corte (10) tamanho da palavra (11) filtro (ativado)]
Para blastp, usando a matriz 0 BLOSUM62: Open gap (11) and extension gap (1)
penalties
[Penalidades pela existência do gap (11) e pela extensão do gap (1)]
gap x_dropoff (50) expect (10) word size (3)
filter (on)
[gap x_entrega (50) valor de corte (10) tamanho da palavra (3) filtro (ativado)].
De acordo com a presente invenção, os termos "modificação" e "mutação" podem ser empregados de modo intercambiável, especialmente no que diz respeito às modificações/mutações nas seqüências primárias de aminoácidos de uma proteína ou peptídeo (ou seqüências de ácido nucléico), descritas neste documento. O termo "modificação" também pode ser empregado para descrever modificações pós-traducionais numa proteína ou peptídeo ou, por exemplo, misturando uma proteína ou peptídeo com outro composto ou acoplando a proteína, como através de uma âncora glicosil-fosfatidil-inositol (GPI). Tais modificações podem ser consideradas como mutações, por exemplo, se a modificação for diferente da modificação pós- traducional que ocorre na proteína ou peptídeo natural, selvagem.
As substituições conservadoras geralmente englobam substituições nos seguintes grupos: glicina e alanina; valina, isoleucina e leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina e glutamina; serina e treonina; Iisina e arginina; e fenilalanina e tirosina. As substituições também podem ser feitas com base nas propriedades de hidrofobicidade ou hidrofilicidade conservadas (Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105 (1982)), ou com base na capacidade de assumir uma estrutura secundária de polipeptídeos similar (Chou and Fasman, Adv. Enzymol. 47: 45 (1978)), ou estruturas terciárias ou quaternárias.
O uso geral neste documento do termo "antígeno" refere-se a: qualquer porção de uma proteína (peptídeo, proteína parcial, proteína completa), caracterizando-se pelo fato de que a proteína ocorre naturalmente ou é derivada sinteticamente; proteínas de fusão ou proteínas quiméricas; composição celular (célula total, Iisato ou células divididas); organismo (organismo total, lisato ou células divididas); carboidrato (como os expressos nas células do câncer); ou outra molécula ou qualquer porção da mesma. Um antígeno provoca uma resposta imune antígeno- específica (p.ex., uma resposta imune humoral e/ou mediada por células) contra os mesmos ou contra antígenos similares, encontrados dentro de células e tecidos de indivíduo para quem se administra o antígeno. Alternativamente, um antígeno pode atuar como um tolerógeno.
Quando se referir à estimulação de uma resposta imune, o termo "antígeno" pode ser empregado de modo intercambiável com o termo "imunógeno". Um imunógeno, conforme utilizado neste documento, descreve um antígeno que provoca uma resposta imune humoral e/ou mediada por células (i.e, é antigênico), de modo que a administração do imunógeno a um animal (p.ex., através de uma vacina da presente invenção) prepara uma resposta imune antígeno-específica contra os mesmos ou contra antígenos similares encontrados nos tecidos do animal. Um tolerógeno é empregado para descrever um antígeno fornecido numa forma, quantia ou via de administração tal que haja uma resposta imune reduzida ou alterada ao antígeno e, preferivelmente, não-reatividade substancial, anergia, outra inativação ou supressão de células do sistema imune em resposta ao contato com o tolerógeno ou com uma célula que expressa ou apresenta tal tolerógeno.
Um "antígeno da vacina" pode ser um imunógeno ou um tolerógeno, mas é um antígeno utilizado numa vacina (profilática ou terapêutica), em que uma resposta biológica (obtenção de uma resposta imune, tolerância) deve ser obtida contra o antígeno da vacina.
Um "domínio imunogênico" de um dado antígeno pode ser qualquer porção, fragmento ou epitopo de um antígeno (p.ex., um fragmento ou subunidade de peptídeo ou epitopo de anticorpo ou outro epitopo conformacional) que contenha pelo menos um epitopo que atue como imunógeno ao ser administrado a um animal. Por exemplo, uma única proteína pode conter diversos domínios imunogênicos. Os domínios imunogênicos devem não ser seqüências lineares em uma proteína, assim como no caso de uma resposta imune humoral.
Um epitopo define-se, neste documento, como um único sítio imunogênico em um dado antígeno que é suficiente para provocar uma resposta imune, ou ainda como um único sítio tolerogênico em um dado antígeno que é suficiente para suprimir, excluir ou tornar inativa uma resposta imune. Os especialistas na matéria reconhecerão que os epitopos de células T são diferentes dos epitopos de células B em tamanho e em composição, e que os epitopos apresentados via MHC (Complexo
Histocompatibilidade) de classe I diferem dos epitopos apresentados via MHC de classe II. Os epitopos podem ser seqüências lineares ou epitopos conformacionais (regiões Iigantes conservadas). Um antígeno pode ser pequeno como um único epitopo - ou maior - e pode conter vários epitopos. Assim sendo, o tamanho de um antígeno pode ser pequeno, entre cerca de 5 e 12 aminoácidos (p.ex., um peptídeo), e pode ser grande como uma proteína completa, inclusive multímero e proteínas de fusão, proteínas quiméricas, células totais, microrganismos totais ou porções dos mesmos (p.ex., Iisatos de células totais ou extratos de microrganismos).
"Vacinação" ou "imunização" refere-se à obtenção (indução) de uma resposta imune contra um antígeno ou porção imunogênica ou tolerogênica do mesmo, resultante da administração do antígeno, sozinho ou junto com um adjuvante. Preferivelmente, a vacinação acarreta um efeito protetor ou terapêutico, caracterizado pelo fato de que a exposição subseqüente ao antígeno (ou a uma fonte do antígeno) provoca uma resposta imune contra o antígeno (ou fonte) que reduz ou previne uma doença ou condição clínica no animal. O conceito de vacinação é amplamente conhecido na matéria. A resposta imune produzida pela administração de uma composição (vacina) da presente invenção pode ser qualquer alteração detectável em qualquer faceta da resposta imune (p.ex., resposta mediada por células, resposta humoral, produção de citocinas), comparada à ausência de administração da composição.
Um Tarmogen (imunógeno molecular marcado) geralmente se refere a um veículo tipo levedura que expressa um ou mais antígenos heterólogos de modo extracelular (em sua superfície ou como um antígeno secretado), intracelular (internamente ou no citosol) ou ambos. De modo geral, os Tarmogens já foram descritos. Ver, p.ex., patente norte-americana n. 5.830.463.
De acordo com a presente invenção,
"aminoácidos heterólogos" são uma seqüência de aminoácidos que não são encontrados naturalmente (i.e., não são encontrados na natureza, in vivo) flanqueando a seqüência de aminoácidos especificada, ou que não estão associados à função da seqüência de aminoácidos especificada, ou ainda que não seriam codificados pelos nucleotídeos que flanqueiam a seqüência de ácido nucléico que ocorre naturalmente e que codifica a seqüência de aminoácidos especificada do modo como ela ocorre no gene, se tais nucleotídeos da seqüência natural fossem traduzidos pelo padrão de uso dos códons do organismo do qual dada seqüência de aminoácidos foi derivada. Portanto, pelo menos dois resíduos de aminoácidos heterólogos ao antígeno são dois resíduos de aminoácidos não encontrados naturalmente flanqueando o antígeno.
De acordo com a presente invenção, as
menções a uma proteína "heteróloga" ou antígeno "heterólogo", inclusive proteína de fusão heteróloga, em conexão com um veículo tipo levedura da invenção significa que a proteína ou antígeno não é uma proteína ou antígeno naturalmente expressos pela levedura, embora a proteína de fusão possa conter seqüências de leveduras ou proteínas ou porções das mesmas que são naturalmente expressas pela levedura (p.ex., uma proteína Aga, conforme descrita neste documento). Por exemplo, para os fins da presente invenção, considera-se que uma proteína de fusão de uma proteína ΊΡ^ 56/153
Ras de célula tumoral e uma proteína Aga de levedura seja uma proteína heteróloga em relação ao veículo tipo levedura, já que tal proteína de fusão não é expressa naturalmente por uma levedura.
Quaisquer das seqüências de aminoácidos descritas neste documento podem ser produzidas com pelo menos um e até cerca de vinte aminoácidos heterólogos adicionais flanqueando cada uma das extremidades C- e/ou N-terminal da seqüência de aminoácidos especificada. A proteína ou polipeptídeo resultante pode ser referida como "formada essencialmente" pela seqüência de aminoácidos especificada. Os aminoácidos heterólogos são uma seqüência de aminoácidos que não são encontrados naturalmente (i.e., não encontrados na natureza, in vivo) flanqueando a seqüência de aminoácidos especificada, ou que não estão associados à função da seqüência de aminoácidos especificada, ou ainda que não seriam codificados pelos nucleotídeos que flanqueiam a seqüência de ácido nucléico que ocorre naturalmente e que codifica a seqüência de aminoácidos especificada do modo como ela ocorre no gene, se tais nucleotídeos da seqüência natural fossem traduzidos pelo padrão de uso de códons do organismo do qual dada seqüência de aminoácidos foi derivada. De modo semelhante, a expressão "formada essencialmente", quando utilizada neste documento em referência a uma seqüência de ácido nucléico, refere-se a uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma seqüência de aminoácidos especificada que pode ser flanqueada por pelo menos um e até cerca de 60 nucleotídeos heterólogos em cada extremidade 5' e/ou 3' da seqüência de ácido nucléico que codifica a seqüência de aminoácidos especificada. Os nucleotídeos heterólogos não são encontrados naturalmente (i.e., não CO 57/153
encontrados na natureza, in vivo) flanqueando a seqüência de ácido nucléico que codifica a seqüência de aminoácidos especificada do modo como ela ocorre no gene natural, ou não codificam uma proteína que transmita qualquer função adicional à proteína ou que altere a função da proteína contendo a seqüência de aminoácidos especificada.
De acordo com a presente invenção, a expressão "liga-se seletivamente a" refere-se à capacidade de um anticorpo, fragmento Iigante ao antígeno ou parceiro Iigante da presente invenção de preferiveímente se ligar a certas proteínas especificadas. Mais especificamente, a expressão "liga-se seletivamente" refere-se à ligação específica de uma proteína com outra (p.ex., um anticorpo, fragmento do mesmo, ou parceiro Iigante a um antígeno), caracterizada pelo fato de que o nível de ligação, conforme mensurado por qualquer ensaio padrão (p.ex., um imunoensaio), é estatística e significativamente mais alto do que o controle de fundo do ensaio. Por exemplo, quando se realiza um imunoensaio, tipicamente os controles incluem uma reação poço/tubo que contenha somente anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno (i.e., na ausência de antígeno), caracterizado pelo fato de que uma quantidade de reatividade (p.ex., ligação não- específica ao poço) pelo anticorpo ou fragmento Iigante ao antígeno do mesmo na ausência do antígeno é considerada como sendo de fundo. A ligação pode ser mensurada usando-se uma série de métodos padrão na matéria, entre eles imunoensaios enzimáticos (p.ex., ELISA), ensaios immunoblot, etc.
O termo "doença" refere-se a qualquer desvio em relação à saúde normal de um animal e inclui um estado em que os sintomas da doença estão presentes, além das condições nas quais tenha ocorrido um desvio (p.ex., infecção, mutação gênica, defeito genético, etc.) mas cujos sintomas ainda não se manifestaram.
Um "indivíduo" é um vertebrado, de preferência um mamífero, de preferência um humano. Os mamíferos englobam, de modo não exaustivo, animais de criação, animais de esportes, animais domésticos, primatas, camundongos e ratos. O termo "indivíduo" pode ser empregado de modo intercambiável com os termos "animal" e "paciente". Ao passo que as seguintes descrições de
aspectos da invenção são descritas sobretudo em relação à mutação Ras identificada no códon 76 e/ou em relação às combinações de mutações Ras incluindo uma mutação no códon 76, todos os aspectos da invenção abaixo podem ser aplicados igualmente à Ras contendo uma mutação em qualquer uma ou mais das posições 73, 74, 75, 77 ou 78, ou à Ras contendo quaisquer das combinações de mutações Ras descritas anteriormente e, em especial, qualquer combinação entre uma mutação na posição 12 e/ou 13 e uma mutação na posição 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 e/ou 78.
Moléculas de Ácido Nucléico e Proteínas da
Invenção
De acordo com a presente invenção, uma proteína Ras ou molécula de ácido nucléico codificante de Ras - úteis em vários aspectos da presente invenção - podem compreender proteínas Ras selvagens ou mutantes, ou uma ou mais porções das mesmas (p.ex., domínios ou porções úteis em qualquer método de pesquisa, diagnóstico, seleção ou terapêutico), bem como as moléculas ("senso") de ácido nucléico que codificam
estas proteínas ou porções das mesmas (p.ex., domínios ou porções úteis em qualquer método de pesquisa, diagnóstico, seleção ou terapêutico) ou a cadeia ("anti-senso") de hibridização de ácidos nucléicos com referidos domínios ou proteínas. A presente invenção dirige-se especialmente às proteínas Ras mutantes e às moléculas de ácido nucléico que codificam tais proteínas ou fragmentos das mesmas, caracterizando-se pelo fato de a seqüência de aminoácidos da proteína Ras mutante ou fragmento da mesma conter uma seqüência que inclui a posição 76, caracterizando-se pelo fato de haver uma mutação na posição 76 e, sobretudo, caracterizando-se pelo fato de haver uma substituição de um aminoácido não-glutamato pelo glutamato que existe naturalmente nesta posição. De acordo com a presente invenção, a menção a um aminoácido "não-glutamato" pode se referir à substituição de qualquer dos outros vinte aminoácidos comumente encontrados nas proteínas, os quais são amplamente conhecidos entre especialistas na matéria. Em configurações particularmente preferidas, o aminoácido não-glutamato é uma glicina (E76G), uma Iisina (E76K) ou uma glutamina (E76Q), embora outras substituições nesta posição, inclusive de qualquer outro aminoácido não-glutamato, estejam expressamente incluídas no escopo da invenção.
Uma molécula de ácido nucléico codificante de Ras pode conter ou ser derivada do todo ou porção de um gene ras selecionado entre os genes K-ras, N-ras ou H-ras. Em um aspecto, a molécula de ácido nucléico codificante de Ras codifica uma proteína Ras com a mutação única na posição 76. Em outro aspecto, a molécula de ácido nucléico codificante de Ras codifica uma proteína Ras contendo uma ou mais outras mutações além da mutação na posição 76, entre as quais estão (lista não exaustiva) as mutações nas posições 12, 13, 59 e/ou 61, sendo estas posições relativas a uma seqüência de aminoácidos de K-, H- ou N-Ras selvagem. Em outras configurações, várias outras mutantes de Ras e moléculas de ácido nucléico codificando tais mutantes são úteis à presente invenção (inclusive Ras mutantes contendo mutações na posição 12, 13, 59 e/ou 61 em relação a uma seqüência de aminoácidos de Ras selvagem) e podem ser combinadas a um outro peptídeo ou proteína Ras mutante em E76 ou a uma outra molécula de ácido nucléico codificando tal mutante. Em algumas configurações, a molécula de ácido nucléico codificante de Ras codifica uma proteína Ras com a mutação única na posição 73, 74, 75, 77 ou 78. Em algumas configurações, a molécula de ácido nucléico codificante de Ras codifica uma proteína Ras contendo qualquer combinação de duas ou mais mutações nas posições 12,
13, 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 ou 78, sendo preferidas combinações entre pelo menos uma mutação na posição 12 ou na posição 13 e pelo menos uma mutação na posição 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 ou 78. Novamente, todas as posições são relativas a uma seqüência
de aminoácidos de K-, H- ou N-Ras selvagem.
Em outro aspecto, uma proteína Ras útil à invenção (a qual pode ser codificada por uma molécula de ácido nucléico que é útil à invenção e que codifica uma proteína Ras) compreende fragmentos de, pelo menos, de modo não exaustivo, entre 15 e 17 ou entre 5 e 50 ou mais (5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, etc.) resíduos de aminoácidos contíguos de uma proteína Ras contendo as posições de aminoácido 12, 13, 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 e/ou 78 em relação à seqüência de aminoácidos da Ras selvagem, caracterizando-se pelo fato de ser mutado o resíduo de aminoácido nas posições 12, 13, 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 e/ou 78, preferivelmente pela substituição de um aminoácido diferente do aminoácido que ocorre nesta posição na forma selvagem ou não- tumorigênica de Ras, em relação à seqüência de Ras selvagem. Tipicamente, a proteína Ras tem a extensão máxima da proteína ras selvagem ou mutante de extensão completa que, no caso das SEQ ID N. 2-13 descritas neste documento, varia de 188 a 189 a 193, embora a proteína Ras de tamanho máximo não se limite a estas extensões.
Em uma configuração, um fragmento preferido de uma proteína Ras compreende entre cerca de 5 e 9 aminoácidos da seqüência natural de aminoácidos da Ras (a seqüência selvagem, ou seja, a seqüência associada à proteína Ras celular não-oncogênica) flanqueando cada lado da mutação na posição 12, 13, 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 e/ou 78 (p.ex., um fragmento de aminoácido 11 de Ras contendo o aminoácido de posição 76 flanqueado por cinco aminoácidos de cada lado da posição 76, caracterizando-se pelo fato de o aminoácido de posição 76 ser mutado em relação à Ras selvagem não-tumorigênica, ou um fragmento de aminoácido 17 de Ras contendo o aminoácido de posição 76, flanqueado por oito aminoácidos de cada lado da posição 76, caracterizando-se pelo fato de o aminoácido de posição 76 ser mutado em relação à seqüência Ras selvagem). Em uma configuração, uma proteína Ras útil à invenção abrange um fragmento de pelo menos cinco aminoácidos contíguos, ou de pelo menos 10 aminoácidos contíguos, ou de pelo menos 15, ou de pelo menos 20, ou de pelos menos 25, ou de pelos menos 30, ou de pelos menos 35, ou de pelos menos 40, ou de pelos menos 50, ou de pelos menos 60, ou de pelos menos 75, ou de pelos menos 100, ou de pelos menos 125, ou de pelos menos 150, ou de pelos menos 175 aminoácidos contíguos, até o limite da extensão completa da proteína Ras1 incluindo quaisquer fragmentos de tamanho interveniente de pelo menos 5 aminoácidos com acréscimos de números inteiros (5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 39, 40, 41, .... 46, 47, 48, etc.). Vários destes fragmentos, de extensões idênticas ou diferentes contendo mutações idênticas ou diferentes, podem ser combinados em uma única proteína quimérica, em uma configuração. Exemplos de tais proteínas são descritos na seção dos Exemplos.
Preferivelmente, o fragmento de uma molécula de ácido nucléico codificando a proteína ou peptídeo Ras mutante possui extensão suficiente para servir como primer ou sonda para fins de identificação de ou amplificação de uma molécula de ácido nucléico de Ras (p.ex., um gene de Ras ou uma molécula de RNA de Ras) que contenha a(s) mesma(s) mutação(ões).
Um fragmento de proteína ou peptídeo Ras
preferivelmente é de um tamanho suficiente para servir pelo menos como epitopo de célula T (no contexto do MHC de classe I ou de classe II) ou como epitopo de anticorpo, embora proteínas Ras que tenham outras qualidades funcionais possam ser úteis em algumas configurações, tal como uma proteína Ras associada com GTP1 uma proteína Ras que possa induzir sinalização celular associada à expressão gênica, proliferação celular e/ou motilidade ou uma proteína Ras que possa atuar como alvo num ensaio, a título de exemplo. Conseqüentemente, o fragmento (ácido nucléico ou rL 63/153
proteína) contém o suficiente do nucleotídeo ou seqüência de aminoácidos de Ras que ocorrem naturalmente flanqueando o sítio de determinada mutação, respectivamente, para ser útil aos fins de quaisquer método ou composição ou uso em pesquisa, diagnóstico, seleção ou terapia descritos neste documento.
As menções às posições em relação às proteínas Ras selvagens neste documento geralmente se referem à posição em proteínas Ras selvagem de mamíferos, ou pelo menos em relação à posição em K-Ras1 H-Ras ou N-Ras humana ou murina. Registre-se que as posições mencionadas acima também correspondem a quaisquer das seqüências para K-Ras, H-Ras ou N-Ras humana ou murina, já que as seqüências de aminoácidos de humanos e de camundongos são idênticas nesta região da proteína e já que K-Ras1 H-Ras e N-Ras são idênticas nesta região. Para seqüências de aminoácidos que possam diferir de outras espécies animais, um especialista na matéria será capaz de prontamente determinar as posições correspondentes, por meio de alinhamento simples com a seqüência humana ou murina, por exemplo. Tal fragmento pode ser de qualquer extensão, de pelo menos cerca de 5 resíduos de aminoácidos contíguos de uma proteína Ras até a extensão completa desta proteína, em acréscimos de números inteiros (p.ex., 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 45, 46, 47, etc.)·
O nucleotídeo e a seqüência de aminoácidos de uma série de membros da família Ras são amplamente conhecidos. A SEQ ID N°. 2 é a seqüência de ácido nucléico que codifica K-ras humana (depositada no GenBank sob o número de acesso NM_033360). A SEQ ID N0. 2 codifica K-ras humana, sendo representada neste documento como SEQ ID N°. 3. A SEQ ID N°. 4 é a seqüência de ácido nucléico que codifica K-ras murina (depositada no GenBank sob o número de acesso NM_021284). A SEQ ID N°. 4 codifica K-ras murina, sendo representada neste documento como SEQ ID N°. 5. A SEQ ID N°. 6 é a seqüência de ácido nucléico que codifica H-ras humana (depositada no GenBank sob o número de acesso NM_005343). A SEQ ID N°. 6 codifica H- ras humana, sendo representada neste documento como SEQ ID N°. 7. A SEQ ID N°. 8 é a seqüência de ácido nucléico que codifica H-ras murina (depositada no GenBank sob o número de acesso NM_008284). A SEQ ID N°. 8 codifica H-ras murina, sendo representada neste documento como SEQ ID N0. 9. A SEQ ID N0. é a seqüência de ácido nucléico que codifica N-ras humana (depositada no GenBank sob o número de acesso NM_002524). A SEQ ID N°. 10 codifica N-ras humana, sendo representada neste documento como SEQ ID N°. 11. A SEQ ID N0. 12 é a seqüência de ácido nucléico que codifica N-ras murina (depositada no GenBank sob o número de acesso NM_010937). A SEQ ID N0. 12 codifica N- ras humana, sendo representada neste documento como SEQ ID N°. 13. As SEQ ID N°. 2-13 são típicas de seqüências Ras de tipo "selvagem".
Conforme exposto anteriormente, Ras é exemplo de um oncogene no qual várias mutações são conhecidas por ocorrerem em certas posições e estarem associadas ao desenvolvimento de um ou mais tipos de câncer. A presente invenção relata a descoberta de uma nova mutação que não era conhecida nem havia sido descrita anteriormente para Ras, além de uma combinação entre esta mutação e uma mutação conhecida que entram em sinergia, aumentando significativamente a oncogenicidade de um tumor que abriga tal combinação de mutações. Portanto, pode-se construir proteínas de fusão úteis à presente invenção (descritas mais detalhadamente abaixo) que compreendem, são formadas essencialmente ou são formadas por peptídeos contendo este resíduo mutado e também outros resíduos específicos que são sabidamente mutados em certos cânceres, caracterizadas pelo fato de que cada domínio contém uma mutação diferente naquele sítio e/ou contém uma mutação em sítio diverso, a fim de cobrir várias ou todas as mutações conhecidas naquele sítio ou na proteína. Em relação à Ras, por exemplo, é possível proporcionar dois ou mais domínios imunogênicos compreendendo pelo menos 4 aminoácidos de cada lado da e incluindo a posição 76 (mas não limitado a 4 aminoácidos, já que se podem incluir trechos mais longos ou mais curtos de aminoácidos vizinhos), caracterizando-se pelo fato de que cada domínio possui uma substituição diferente do glutamato que ocorre normalmente proteína Ras não-mutada na posição 76. Uma das substituições desta posição é preferivelmente uma substituição por glicina, por Iisina ou por glutamina. Em um exemplo, a proteína ou peptídeo compreende fragmentos de pelo menos 5-9 resíduos de aminoácidos contíguos de uma proteína Ras selvagem, até o limite da proteína Ras inteira, em acréscimos de números inteiros, contendo os aminoácidos de posições 12, 13, 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 e/ou 78 em relação à proteína Ras selvagem, caracterizando-se pelo fato de os resíduos de aminoácidos nas posições 12, 13, 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 e/ou 78 serem mutados em relação à proteína Ras selvagem. Preferivelmente, a proteína ou peptídeo compreende pelo menos uma mutação na posição 76 e, em grau de preferência ainda maior, a mutação consiste na substituição de uma glicina, Iisina ou glutamina pelo glutamato que normalmente se encontra
naquela posição.
Em um aspecto, uma construção de proteína de fusão na presente invenção consiste em pelo menos um peptídeo que é fundido no quadro de leitura com outro antígeno tumoral mutado, caracterizado pelo fato de o peptídeo ser selecionado a partir do grupo formado por: (a) um peptídeo contendo pelo menos as posições de 4 a 20 ou pelo menos as posições de 8 a 16 da SEQ ID N°. 3 (ou qualquer peptídeo de tamanho intermediário ou maior), caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido na posição 12 em relação à SEQ ID N0. 3 ser mutado em comparação com a SEQ ID N°. 3; (b) um peptídeo contendo pelo menos as posições de 5-21 ou pelo menos as posições de 9-17 da SEQ ID N°. 3 (ou qualquer peptídeo de tamanho intermediário ou maior), caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido na posição 13 em relação à SEQ ID N°. 3 ser mutado em comparação com a SEQ ID N°. 3; (c) um peptídeo contendo pelo menos as posições de 51-67 ou pelo menos as posições de 55-63 da SEQ ID N°. 3 (ou qualquer peptídeo de tamanho intermediário ou maior), caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido na posição 59 em relação à SEQ ID N°. 3 ser mutado em comparação com a SEQ ID N°. 3; (d) um peptídeo contendo pelo menos as posições de 53-69 ou pelo menos as posições de 57-65 da SEQ ID N°. 3 (ou qualquer peptídeo de tamanho intermediário ou maior), caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido na posição 61 em relação à SEQ ID N0. 3 ser mutado em comparação com a SEQ ID N°. 3; (e) um peptídeo contendo pelo menos as posições de 65-81 ou pelo menos as posições de 69-77 da SEQ ID N°. 3 (ou qualquer peptídeo de tamanho intermediário ou maior), caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido na posição 73 em relação à SEQ ID N°. 3 ser mutado em comparação com a SEQ ID N°. 3; (f) um peptídeo contendo pelo menos as posições de 66-82 ou pelo menos as posições de 70-78 da SEQ ID N°. 3 (ou qualquer peptídeo de tamanho intermediário ou maior), caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido na posição 74 em relação à SEQ ID N°. 3 ser mutado em comparação com a SEQ ID N°. 3; (g) um peptídeo contendo pelo menos as posições de 67-83 ou pelo menos as posições de 71-79 da SEQ ID N°. 3 (ou qualquer peptídeo de tamanho intermediário ou maior), caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido na posição 75 em relação à SEQ ID N°. 3 ser mutado em comparação com a SEQ ID N°. 3; (h) um peptídeo contendo pelo menos as posições de 69-84 ou pelo menos as posições de 73-81 da SEQ ID N0. 3 (ou qualquer peptídeo de tamanho intermediário ou maior), caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido na posição 77 em relação à SEQ ID N°. 3 ser mutado em comparação com a SEQ ID N°. 3; (i) um peptídeo contendo pelo menos as posições de 70-85 ou pelo menos as posições de 74-82 da SEQ ID N°. 3 (ou qualquer peptídeo de tamanho intermediário ou maior), caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido na posição 78 em relação à SEQ ID N0. 3 ser mutado em comparação com a SEQ ID N0. 3; e/ou a configuração preferida de (j) um peptídeo contendo pelo menos as posições de 68-84 ou pelo menos as posições de 72-80 da SEQ ID N°. 3 (ou qualquer peptídeo de tamanho intermediário ou maior), caracterizado pelo fato de o resíduo de aminoácido na posição 76 em relação à SEQ ID N°. 3 ser mutado em comparação com a SEQ ID N°. 3. Registre-se que estas posições também correspondem à qualquer das SEQ ID N°. 5, 7, 9, 11 ou 13, já que as seqüências de aminoácidos de humanos e de camundongos são idênticas nesta região da proteína e já que as proteínas K-Ras1 H-Ras e N-Ras são idênticas nesta região. Os fragmentos não se limitam aos mencionados acima, os quais são meramente exemplos, contanto que o fragmento tenha pelo menos cinco aminoácidos de extensão, contenha a mutação desejada e seja útil, ou codificado por molécula de ácido nucléico que seja útil, em um método de pesquisa, diagnóstico, seleção ou terapêutico, conforme descrito neste documento.
Em uma configuração, uma construção de
proteína de fusão útil à presente invenção compreende a proteína de fusão representada neste documento como SEQ ID N0. 14. Em outra configuração, uma construção de proteína de fusão útil à presente invenção compreende a proteína de fusão representada neste documento como SEQ ID N°. 15.
Conseqüentemente, a presente invenção abrange qualquer molécula de ácido nucléico que codifique, hibridize ou seja o complemento de uma molécula de ácido nucléico que codifique quaisquer das proteínas Ras ou fragmentos das mesmas, descritos neste documento, abrangendo ainda moléculas de ácido nucléico que codifiquem quaisquer das proteínas de fusão aqui descritas. A invenção também abrange moléculas de RNA e DNA anti-senso baseadas em seqüências de ácido nucléico da invenção, ribozimas baseadas em seqüências de ácido nucléico da invenção, RNAi baseado nas seqüências de ácido nucléico da invenção e/ou aptâmeros baseados na estrutura terciária da proteína Ras da invenção, os quais podem ser preparados através de qualquer método conhecido na literatura - entre eles, técnicas para sintetizar polinucleotídeos quimicamente que são amplamente conhecidas entre os especialistas na matéria, como a síntese química em fase sólida de fosforamidita. Opcionalmente, as moléculas de RNA podem ser geradas por transcrição in vitro e in vivo de seqüências de DNA codificando a molécula de RNA anti- senso. E possível incorporar tais seqüências de DNA a uma ampla variedade de vetores que incorporam promotores de polimerase de RNA adequados, como os promotores de polimerase T7 ou SP6. Construções de DNA complementar anti-senso que sintetizam RNA anti-senso de forma constitutiva ou induzida, dependendo do promotor utilizado, podem ser introduzidas em células hospedeiras de modo estável. Tais agentes à base de ácidos nucléicos podem ser introduzidos em tecidos ou células hospedeiras, sendo utilizados para inibir a expressão e/ou a função de proteínas Ras mutadas.
Outra configuração da presente invenção
compreende uma molécula de ácido nucléico recombinante contendo um vetor recombinante e uma seqüência de ácido nucléico derivada de um gene ras e/ou codificando uma proteína ou peptídeo Ras ou fragmento dos mesmos, conforme a descrição deste documento. Tipicamente, uma molécula de ácido nucléico recombinante compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico da presente invenção operativamente associada a uma ou mais seqüências de controle de expressão. Diversos tipos de vetores recombinantes que podem ser utilizados na invenção foram descritos acima.
Uma ou mais moléculas recombinantes da presente invenção podem ser utilizadas para gerar um produto codificado (p.ex., uma proteína Ras mutada ou porção da mesma). Em uma configuração, um produto codificado é gerado expressando-se uma molécula de ácido nucléico, conforme descrito neste documento, sob condições eficazes para produzir a proteína. Um método preferido para produzir uma proteína codificada consiste na transfecção de uma ou mais moléculas recombinantes numa célula hospedeira para formar uma célula recombinante. Células hospedeiras adequadas para a transfecção englobam, de modo não exaustivo, quaisquer células de bactéria, fungo (p.ex., leveduras), inseto, planta ou animal que possam ser transfectadas. Células hospedeiras podem ser tanto células não-transfectadas quanto células que já tenham sido transfectadas com pelo menos uma outra molécula de ácido nucléico recombinante.
Em uma configuração da invenção, uma célula hospedeira preferida é uma célula de levedura. As moléculas de ácido nucléico transformadas em veículos tipo levedura da presente invenção podem conter seqüências de ácido nucléico que codificam uma ou mais proteínas e/ou uma ou mais porções das mesmas. Tais moléculas de ácido nucléico podem conter, no todo ou em parte, regiões codificantes, regiões reguladoras ou combinações das mesmas. Uma vantagem das cepas de leveduras reside em sua capacidade de transportar inúmeras moléculas de ácido nucléico e no fato de serem capazes de produzir inúmeras proteínas heterólogas. Um número preferido de antígenos a serem produzidos pelo veículo tipo levedura da presente invenção consiste em qualquer número de antígenos que possa ser razoavelmente produzido por um veículo tipo levedura e, tipicamente, varia entre pelo menos um e pelo menos cinco ou mais, sendo preferido entre cerca de dois e cerca de cinco compostos. As leveduras hospedeiras preferidas serão expostas em detalhe abaixo.
Um especialista na matéria reconhecerá que o uso das tecnologias de DNA recombinante pode melhorar o controle da expressão de moléculas de ácido nucléico transfectadas manipulando-se, por exemplo, o número de cópias das moléculas de ácido nucléico na célula hospedeira, a eficiência com que tais moléculas de ácido nucléico são transcritas, a eficiência com que as transcrições resultantes são traduzidas e a eficiência das modificações pós-traducionais. Além disso, a seqüência do promotor pode ser criada por engenharia genética a fim de melhorar o nível de expressão, comparado ao promotor nativo. As técnicas recombinantes úteis para controlar a expressão de moléculas de ácido nucléico compreendem, de modo não exaustivo: integração de moléculas de ácido nucléico a um ou mais cromossomos da célula hospedeira; adição de seqüências de estabilidade de vetor a plasmídeos; substituições ou modificações dos sinais de controle de transcrição (p.ex., promotores, operadores, facilitadores); substituições ou modificações dos sinais de controle de tradução (p.ex., sítios Iigantes a ribossomo, seqüência Kozak, seqüência Shine-Dalgarno); modificação das moléculas de ácido nucléico para que correspondam ao padrão de uso de códons da célula hospedeira; e supressão de seqüências que desestabilizam os transcritos.
Proteínas de Fusão
Conforme exposto anteriormente, pode-se construir proteínas de fusão a serem utilizadas em diversas configurações da invenção, inclusive proteínas de fusão que contenham pelo menos um peptídeo ou proteína Ras abrigando o resíduo mutado na posição 76 (ou o resíduo mutado na posição 73, 74j 75, 77 ou 78 ou quaisquer das combinações descritas neste documento) (conforme se observou acima, a posição 76 refere-se à seqüência de aminoácidos da Ras selvagem de mamíferos, especialmente humanos ou murinos), e que podem conter também outros peptídeos ou proteínas Ras abrigando mutações em outros resíduos sabidamente mutados em certos cânceres. Outros antígenos diversos de Ras ou porções dos mesmos - inclusive outros antígenos de câncer e diversas formas mutantes de outras proteínas associadas ao câncer -, também podem figurar em tais fusões. As moléculas de ácido nucléico que codificam tais proteínas de fusão também estão compreendidas no escopo da invenção. Em um aspecto, os peptídeos e proteínas à
base de Ras da invenção, inclusive as combinações de diferentes peptídeos ou proteínas Ras e/ou outras proteínas e peptídeos mencionados acima, podem ser incluídos numa proteína de fusão que tenha sido desenhada para estabilizar a expressão da proteína heteróloga em um veículo tipo levedura e/ou prevenir a modificação pós-traducional da proteína heteróloga expressa. Tais proteínas de fusão foram descritas de modo geral na Publicação PCT n. WO 2004/058157 A2, cujo inteiro teor é incorporado a este documento por citação. Estas proteínas de fusão são mais comumente expressas como proteínas recombinantes por um veículo tipo levedura (p.ex., por uma levedura intacta ou esferoplasto de levedura, os quais podem ser então transformados, opcionalmente, em citoplasto de levedura, fantasmas de levedura ou extrato de membrana de levedura ou fração dos mesmos, descritos abaixo), embora seja uma configuração da invenção que uma ou mais destas proteínas de fusão possam ser transferidas para um veículo tipo levedura ou misturadas com um veículo tipo levedura, conforme descrito abaixo, a fim de formar uma vacina ou composição útil à presente invenção. Esta proteína de fusão útil à presente invenção é uma proteína de fusão que compreende: (a) pelo menos um antígeno Ras (inclusive peptídeo ou proteína) contendo a mutação na posição 76, conforme descrito neste documento; e (b) um peptídeo sintético. Em uma configuração, uma proteína de fusão útil à presente invenção compreende a proteína de fusão aqui representada pela SEQ ID N°. 14. Em outra configuração, uma proteína de fusão útil à presente invenção compreende a proteína de fusão aqui representada pela SEQ ID N0. 15. Em uma configuração, o peptídeo sintético é
ligado à extremidade N do antígeno, sendo que o peptídeo é formado por pelo menos dois resíduos de aminoácidos heterólogos ao antígeno, caracterizando-se pelo fato de o peptídeo estabilizar a expressão da proteína de fusão no veículo tipo levedura ou prevenir a modificação pós-traducional da proteína de fusão expressa. O peptídeo sintético e a porção N-terminal do antígeno formam juntos uma proteína de fusão com os seguintes requisitos: (1) o resíduo de aminoácido na posição um da proteína de fusão é uma metionina (i.e., o primeiro aminoácido do peptídeo sintético é uma metionina); (2) o resíduo de aminoácido na posição dois da proteína de fusão não é uma glicina nem uma prolina (i.e., o segundo aminoácido do peptídeo sintético não é uma glicina nem uma prolina); (3) nenhum dos resíduos de aminoácido nas posições 2-6 da proteína de fusão é uma metionina (i.e., os aminoácidos nas posições 2-6, no caso de serem parte do peptídeo sintético ou da proteína, se o peptídeo sintético tiver extensão menor do que seis aminoácidos, não contêm uma metionina); e (4) nenhum dos aminoácido nas posições 2-6 da proteína de fusão é uma Iisina nem uma arginina (i.e., os aminoácidos nas posições 2-6, no caso de serem parte do peptídeo sintético ou da proteína, se o peptídeo sintético tiver extensão menor do que cinco aminoácidos, não contêm uma Iisina nem uma arginina). O peptídeo sintético pode ter dois aminoácidos de extensão - mas é preferível que tenha pelo menos de 2 a 6 aminoácidos (incluindo os aminoácidos 3, 4 e 5) - e pode ser maior do que seis aminoácidos, em números inteiros, até cerca de 200 aminoácidos, 300 aminoácidos, 400 aminoácidos, 500 aminoácidos, ou mais.
Em uma configuração, uma proteína de fusão compreende a seqüência de aminoácidos de M-X2-X3-X4-X5- X6, onde M é metionina; onde X2 é qualquer aminoácido à exceção de glicina, prolina, Iisina e arginina; onde X3 é qualquer aminoácido à exceção de metionina, Iisina e arginina; onde X4 é qualquer aminoácido à exceção de metionina, Iisina e arginina; onde X5 é qualquer aminoácido à exceção de metionina, Iisina e arginina; e onde X6 é qualquer aminoácido à exceção de metionina, Iisina e arginina. Em uma configuração, o resíduo X6 é uma prolina. Uma seqüência sintética exemplar que facilita a estabilidade de expressão de um antígeno em célula de levedura e/ou previne a modificação pós-traducional da proteína na levedura compreende a seqüência M-A-D-E-A-P (SEQ ID N°. 1). A seqüência MADEAP pode ser utilizada com outros antígenos, além do antígeno. Afora a facilitação da estabilidade do produto de expressão, este parceiro de fusão não aparenta influenciar negativamente a resposta imune contra o antígeno da vacina na construção. Além disso, os peptídeos de fusão sintéticos podem ser desenhados para proporcionar um epitopo que possa ser reconhecido por um agente de seleção, como um anticorpo.
Em outra configuração da invenção, os ácidos nucléicos que codificam o sítio de início da tradução de um peptídeo sintético usado na invenção são A-C-C-A-T-G-G, de acordo com as regras de tradução da seqüência de Kozak, onde o ATG desta seqüência é o sítio inicial da tradução e codifica a metionina da M-A-D-E-A-P (SEQ ID N°. 1). Deve-se compreender que diversas configurações da invenção, conforme descritas neste documento, também podem ser combinadas. Por exemplo, em um aspecto da invenção, quando o peptídeo sintético for MA-D-E-A-P (SEQ ID N°. 1), os ácidos nucléicos que codificam o sítio de início para este peptídeo podem ser A-C-C-A-T-G-G. Várias outras combinações de configurações da invenção serão evidentes para os especialistas na matéria.
Em um aspecto da invenção, o veículo tipo levedura é manipulado de forma que o antígeno seja expresso ou fornecido por liberação ou translocação de um produto de antígeno expresso, no todo ou em parte, na superfície do veículo tipo levedura (expressão extracelular). Um método para a realização deste aspecto da invenção consiste em usar um braço espaçador para posicionar um ou mais antígenos na superfície do veículo tipo levedura. Uma forma de utilizar um braço espaçador consiste em criar uma proteína de fusão do(s) antígeno(s) de interesse com uma proteína que marca o(s) antígeno(s) para parede celular da levedura. Por exemplo, uma proteína que pode ser usada é uma proteína de levedura (p.ex., proteína 2 da parede celular (cwp2), proteína Aga2, Pir4 ou Flo1), que permite que o(s) antígeno(s) seja(m) marcado(s) para parede celular da levedura de forma que o antígeno seja localizado na superfície da levedura. É possível utilizar proteínas diversas da proteína de levedura no braço espaçador; no entanto, para qualquer proteína de braço espaçador, é desejável ter-se a resposta imunogênica dirigida contra o antígeno-alvo, e não para a proteína do braço espaçador. Assim sendo, se outras proteínas forem utilizadas no braço espaçador, a proteína do braço espaçador utilizada não deveria gerar uma resposta imune à proteína do braço espaçador em si tão grande que a resposta imune ao(s) antígeno(s)-alvo seja sobrepujada. Um especialista na matéria deveria ter como objetivo uma resposta imune à proteína do braço espaçador pequena em relação à resposta imune para o(s) antígeno(s)-alvo. 1 o Outro método para posicionar o(s)
antígeno(s)-alvo a ser exposto à superfície da levedura consiste em usar seqüências sinal como glicosil-fosfatidil-inositol (GPI) para ancorar o alvo à parede celular da levedura. Por outro lado, o posicionamento pode ser realizado acrescentando-se seqüências sinal marcadas para o(s) antígeno(s) de interesse na via secretora através de translocação no retículo endoplasmático (RE), de modo que o antígeno se ligue à proteína que está ligada à parede celular (p.ex., cwp).
Em um aspecto, a proteína do braço espaçador é uma proteína de levedura. A proteína de levedura pode ser formada por entre aproximadamente dois e aproximadamente 800 aminoácidos de uma proteína de levedura. Em uma configuração, a proteína de levedura tem de 10 a 700 aminoácidos. Em outra configuração, a proteína de levedura tem de 40 a 600 aminoácidos. Outras configurações da invenção contêm proteína de levedura formada por pelo menos 250 aminoácidos, por pelo menos 300 aminoácidos, pelo menos 350 aminoácidos, pelo menos 400 aminoácidos, pelo menos 450 aminoácidos, pelo menos 500 aminoácidos, pelo menos 550 aminoácidos, pelo menos 600 aminoácidos ou pelo menos 650 aminoácidos. Em uma configuração, a proteína de levedura tem pelo menos 450 aminoácidos de extensão.
Em outra configuração, a proteína de levedura estabiliza a expressão da proteína de fusão no veículo tipo levedura, previne a modificação pós-traducional da proteína de fusão expressa e/ou marca a proteína de fusão para um certo compartimento da levedura (p.ex., a ser expressa na superfície da célula de levedura). Para liberação na via secretora da levedura, as proteínas de levedura a serem utilizadas compreendem, de modo não exaustivo: Aga (inclusive, de modo limitativo, Agal e/ou Aga2); SUC2 (invertase de levedura); seqüência líder sinal fator-alfa; CPY; Cwp2p, por sua localização e retenção na parede celular; genes BUD, pela localização no broto das células de levedura na fase inicial de formação de célula-filha; Flol p; Pir2p; e Pir4p.
Em outro aspecto da invenção, outras seqüências podem ser utilizadas para marcar, manter e/ou estabilizar a proteína ou outras partes do veículo tipo levedura, por exemplo, no citosol ou na mitocôndria. Exemplos de proteínas de levedura adequadas para utilização em quaisquer das configurações acima compreendem, de modo não exaustivo: SEC7; produtos gênicos de fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PCK1), fosfoglicerato quinase (PGK) e triose-fosfato isomerase (TPI), por sua expressão reprimível em glicose e localização citosólica; as proteínas de choque térmico SSA1, SSA3, SSA4, SSC1, cuja expressão é induzida e cujas proteínas são mais termoestáveis quando as células são expostas a tratamento de calor; a proteína mitocondrial CYC1, pela importação para a mitocôndria; ACT1.
Anticorpos e Peptídeos de Ligação ao 9
Antígeno
Uma configuração da invenção refere-se a um anticorpo ou peptídeo de ligação ao antígeno que se liga seletivamente a uma proteína ou peptídeo Ras contendo a mutação E76 aqui descrita, compreendendo, de modo não exaustivo, uma mutação E76G, uma mutação E76K e/ou uma mutação E76Q. Outras configurações da invenção referem-se a um anticorpo ou peptídeo de ligação ao antígeno que se liga seletivamente a uma proteína Ras contendo uma mutação em quaisquer uma ou mais das posições 73, 74, 75, 77 ou 78, ou ainda a uma Ras contendo quaisquer das combinações de mutações Ras descritas acima e, sobretudo, qualquer combinação entre uma mutação na posição 12 e/ou 13 e uma mutação na posição 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 e/ou 78. Os anticorpos caracterizam-se pelo fato de compreenderem domínios de imunoglobulina e, como tal, serem membros da superfamília de proteínas imunoglobulinas. Um anticorpo da invenção compreende anticorpos policlonais e monoclonais, anticorpos bivalentes e monovalentes, anticorpos biespecíficos ou poliespecíficos, soro sangüíneo contendo tais anticorpos, anticorpos que foram purificados em graus variados e quaisquer equivalentes funcionais de anticorpos totais. Os anticorpos isolados da presente invenção podem abranger soro contendo tais anticorpos ou ainda anticorpos que foram purificados em graus variados. Os anticorpos totais da presente invenção podem ser policlonais ou monoclonais. Por outro lado, é possível empregar na presente invenção os equivalentes funcionais de anticorpos totais, como os fragmentos de ligação ao antígeno nos quais um ou mais domínios de anticorpos estejam truncados ou ausentes (p.ex., fragmentos Fv1 Fab, Fab1 ou F(ab)2), além de anticorpos criados por engenharia genética ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, inclusive anticorpos de cadeia única ou anticorpos que possam se ligar a mais de um epitopo (p.ex., anticorpos biespecíficos) ou anticorpos que possam se ligar a um ou mais antígenos diferentes (p.ex., anticorpos bi ou poliespecíficos).
Os anticorpos criados por engenharia genética da presente invenção compreendem aqueles produzidos através de técnicas comuns de recombinação de DNA que implicam a manipulação e a re-expressão de DNA codificando regiões variáveis e/ou constantes de anticorpos. Entre os exemplos específicos estão os anticorpos quiméricos - nos quais os domínios pesados e/ou leves provêm de diferentes fontes para o restante do anticorpo - e os anticorpos com enxertia na região determinante de complementaridade (anticorpos humanizados) (e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo) - nos quais pelo menos um segmento da região determinante de complementaridade e, opcionalmente, pelo menos um aminoácido da cadeia das regiões variáveis deriva(m) de uma fonte, enquanto as demais porções das regiões variáveis e constantes (conforme apropriado) derivam de uma fonte diversa. A construção de anticorpos quiméricos e humanizados é descrita, por exemplo, nos pedidos de patentes européias EP-A 0194276, EP-A 0239400, EP-A 0451216 e EP-A 0460617.
Geralmente, na produção de um anticorpo, um animal experimental adequado - como coelho, ovelha, hamster, porquinho-da-índia, camundongo, rato ou galinha (exemplos não exaustivos) - é exposto a um antígeno contra o qual se deseja um anticorpo. Tipicamente, um animal é imunizado com uma quantidade eficaz de antígeno, que é injetado no animal. Uma quantidade eficaz de antígeno refere-se a uma quantidade necessária para induzir a produção de anticorpos pelo animal. Aguarda-se então que o sistema imune do animal responda durante um intervalo predeterminado de tempo. O processo de imunização pode ser repetido até que se conclua que o sistema imune está produzindo anticorpos ao antígeno. A fim de se obter anticorpos policlonais específicos para o antígeno, coleta-se soro do animal que contenha os anticorpos desejados (ou, no caso de uma galinha, os anticorpos podem ser extraídos dos ovos). Este soro é útil como reagente. Os anticorpos policlonais podem ser então purificados a partir do soro (ou ovos) usando-se tratamento com sulfato de amônio, por exemplo.
É possível produzir anticorpos monocionais de acordo com a técnica de Kohler e Milstein (Nature 256:495-497, 1975). Por exemplo, linfócitos B são recuperados a partir do baço (ou qualquer outro tecido adequado) de um animal imunizado e, em seguida, fundidos com células de mieloma, a fim de se obter uma população de células de hibridoma capazes de crescimento contínuo em meio de cultura adequado. Os hibridomas que produzem os anticorpos desejados são selecionados testando-se a capacidade do anticorpo produzido pelo hibridoma de se ligar ao antígeno desejado.
A invenção também se estende a polipeptídeos não-anticorpos, às vezes chamados parceiros ligantes, os quais foram desenhados para se ligar especificamente e, conforme o caso, ativar ou inibir uma proteína Ras mutada da invenção. Encontram-se exemplos do desenho de tais polipeptídeos, que possuem uma especificidade de ligação determinada, em Beste et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. 96:1898-1903, 1999), cujo inteiro teor é incorporado a este documento por citação.
Pequenas Moléculas, Antagonistas Conformacionais e Outros Compostos
A invenção também abrange os compostos à base de pequenas moléculas (p.ex., produtos da descoberta de fármacos que utilizam a Ras mutada descoberta pelos inventores), como os antagonistas conformacionais e os ativadores da hidrólise de GTP. Em uma configuração, tais compostos podem ser formas miméticas ou modificadas de Ras-GAP1 capazes de interagir com as proteínas Ras mutadas a fim de acionar a hidrólise de GTP. Em outra configuração, tais compostos podem interagir diretamente com a Ras-GAP a fim de adaptar a proteína Ras-GAP endógena para acionar a hidrólise de GTP em mutantes Ras1 como os que foram descritos neste documento. Preferivelmente, tais compostos não acionam a hidrólise de GTP da Ras selvagem (não-mutada ou não-tumorigênica), de modo que os compostos são mais úteis como compostos tumor-específicos.
Tal agente pode ser obtido, por exemplo, a partir de estratégias de diversidade molecular (uma combinação de estratégias relacionadas que possibilita a rápida construção de bibliotecas de moléculas amplas e quimicamente diversas), bibliotecas de compostos naturais ou sintéticos, em especial a partir de bibliotecas químicas ou combinatórias (i.e., bibliotecas de compostos que diferem em seqüência ou tamanho, mas que têm os mesmos blocos de construção) ou pelo planejamento racional de fármacos. Ver, por exemplo, Maulik et ai., 1997, Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss, Inc., cujo inteiro teor é incorporado a este documento por citação. Os compostos candidates inicialmente identificados pelos métodos de planejamento de fármacos podem ser selecionados em função de sua capacidade de modular a hidrólise de GTP ou de servir como antagonista conformacional de uma proteína Ras mutada descrita neste documento. Em uma estratégia de diversidade molecular,
sintetizam-se grandes bibliotecas de compostos - por exemplo, para peptídeos, oligonucleotídeos, carboidratos e/ou moléculas orgânicas sintéticas - usando-se abordagens biológicas, enzimáticas e/ou químicas. Entre os parâmetros cruciais no desenvolvimento de uma estratégia de diversidade molecular estão a diversidade de subunidades, o tamanho molecular e a diversidade da biblioteca. O objetivo geral da seleção de tais bibliotecas consiste em utilizar a aplicação seqüencial da seleção combinatória a fim de obter-se Iigantes de alta afinidade contra o alvo desejado e, em seguida, otimizar as moléculas principais através de estratégias de planejamento direcionadas ou aleatórias. Os métodos de diversidade molecular são descritos detalhadamente em Maulik, et al., supra.
Em um procedimento de planejamento racional de fármacos, pode-se analisar a estrutura tridimensional de um composto regulador por meio de ressonância magnética nuclear (RMN) ou cristalografia de raios-X, por exemplo. Esta estrutura tridimensional pode então ser empregada para prever as estruturas de possíveis compostos, como os possíveis agentes reguladores, por meio de modelagem computacional, por exemplo. A estrutura prevista do composto pode ser utilizada para otimizar os compostos principais derivados, por exemplo, por meio de métodos de diversidade molecular. Além disso, a estrutura prevista do composto pode ser produzida por meio de síntese química ou tecnologia de DNA recombinante, por exemplo, ou isolando-se um mimotopo a partir de uma fonte natural (p.ex., plantas, animais, bactérias e fungos).
Vários outros métodos de planejamento de fármacos baseado na estrutura são revelados em Maulik et al., 1997, supra. Maulik et al. revelam, por exemplo, métodos de planejamento dirigido, em que o usuário dirige o processo de criação de moléculas originais a partir de uma biblioteca de fragmentos de fragmentos selecionados de modo adequado; planejamento aleatório, em que o usuário utiliza um algoritmo genético ou outro para provocar a mutação aleatória de fragmentos e suas combinações, ao mesmo tempo em aplica um critério de seleção para avaliar a adequação dos Iigantes candidatos; e uma técnica baseada em grade, na qual o usuário calcula a energia de interação entre as estruturas tridimensionais do receptor e as sondas dos pequenos fragmentos e, em seguida, liga entre si os sítios das sondas favoráveis.
Composições e Vacinas Conforme se discutiu anteriormente, uma configuração da invenção refere-se a composições ou vacinas que contenham proteínas Ras mutadas, moléculas de ácido nucléico que codifiquem as mesmas ou quaisquer dos ácidos nucléicos terapêuticos (p.ex., aptâmeros, ribozimas, RNAi) ou peptídeos ou pequenas moléculas (p.ex., antagonistas conformacionais, ativadores da hidrólise de GTP), conforme expostos acima. A presente invenção comporta uma configuração na qual as proteínas Ras mutadas aqui descritas podem ser empregadas numa vacina ou composição "convencional" ou em combinação com uma vacina à base de levedura (descrita abaixo, patentes norte-americanas de números 5.830.463 e 7.083.787, além da publicação de patentes norte-americanas de números 2004-0156858 A1 e 2006-0110755 A1). Cada tipo de composição ou vacina pode conter - além de quaisquer das proteínas Ras mutadas aqui descritas (p.ex., uma proteína ou peptídeo Ras portando uma mutação na posição 76 e, preferivelmente, uma mutação E76G, E76K ou E76Q, ou uma combinação entre a mutação Ras E76 e outra mutação, como uma mutação G12) - um carreador farmaceuticamente aceitável. Conforme empregado neste documento, um carreador farmaceuticamente aceitável refere-se a qualquer substância ou veículo adequados para a liberação de uma proteína Ras mutada, útil a um método da presente invenção, em um sítio in vivo ou ex vivo adequado. Este carreador pode compreender, de modo não exaustivo, um adjuvante, um excipiente ou qualquer outro tipo de carreador ou veículo de liberação.
De acordo com a presente invenção, os adjuvantes são tipicamente substâncias que em geral melhoram a resposta imune de um animal a um antígeno específico. Os adjuvantes adequados compreendem, de modo não exaustivo, adjuvante de Freund; outros componentes de parede celular de bactéria; sais à base de alumínio; sais à base de cálcio; sílica; polinucleotídeos; toxóides; proteínas séricas; proteínas do capsídeo; outras preparações derivadas de bactérias; interferon gama; adjuvantes de copolímeros em bloco, como adjuvante TiterMax de Hunter (CytRx™, Inc. Norcrosst GA); adjuvantes Ribi (disponibilizados por Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT); saponinas e seus derivados, como Quil A (disponibilizados por Superfos Biosector A/S, Dinamarca).
Os carreadores são, em geral, compostos que aumentam a meia-vida de uma composição terapêutica no animal tratado. Os carreadores adequados abrangem, de modo não limitativo, formulações poliméricas de liberação controlada, implantes biodegradáveis, lipossomos, óleos, ésteres e glicóis. As composições terapêuticas, inclusive as
vacinas, da presente invenção também podem conter um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Conforme empregado aqui, um excipiente farmaceuticamente aceitável refere-se a qualquer substância adequada para a liberação de uma composição farmacêutica, útil ao método da presente invenção, em um sítio in vivo ou ex vivo adequado. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis preferidos são capazes de manter uma composição (ou, em algumas configurações, um veículo tipo levedura ou célula dendrítica contendo o veículo tipo levedura) numa forma que, na chegada da composição na célula, tecido ou sítio alvos no corpo, a composição seja capaz de provocar uma resposta imune no sítio- alvo (observe-se que o sítio-alvo pode ser sistêmico). Os excipientes adequados da presente invenção abrangem excipientes ou fórmulas que transportam, mas que não direcionam especificamente a vacina para um sítio (também chamados neste documento de carreadores não-marcadores). Exemplos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, de forma não limitativa, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer, solução de glicose, soluções contendo soro sangüíneo, solução de Hank, outras soluções aquosas fisiologicamente equilibradas, óleos, ésteres e glicóis. Os carreadores aquosos podem conter quaisquer substâncias auxiliares adequadas necessárias para se assemelharem às condições fisiológicas do receptor melhorando, por exemplo, a estabilidade química e a isotonicidade. As substâncias auxiliares adequadas compreendem, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, Iactato de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio e outras substâncias empregadas para produzir tampão de fosfato, tampão Tris e tampão de bicarbonato. As substâncias auxiliares também podem compreender conservantes, como timerosal, metacresol ou ortocresol, formol e álcool benzílico.
Um componente de uma vacina ou composição terapêutica da presente invenção contém pelo menos um antígeno para vacinação de um animal e, especialmente, pelo menos um antígeno abrigando pelo menos uma porção de uma proteína Ras com a mutação na posição 76, conforme descrito neste documento. A vacina ou composição pode conter um, dois, alguns, vários ou uma pluralidade de antígenos, contendo um ou mais domínios imunogênicos de um ou mais antígenos, conforme desejado. De acordo com a presente invenção, um antígeno adequado para uso na composição ou vacina pode conter dois ou mais domínios imunogênicos ou epitopos da mesma célula, tecido ou organismo, ou ainda dois ou mais antígenos, domínios imunogênicos ou epitopos de diferentes células, tecidos ou organismos. Preferivelmente, o antígeno é heterólogo à cepa de levedura (i.e., não é uma proteína naturalmente produzida pela cepa de levedura na ausência de manipulação genética ou biológica). As proteínas Ras mutadas preferidas e as proteínas de fusão preferidas para uso numa vacina ou composição convencional ou com um veículo tipo levedura da presente invenção foram descritas acima.
Em uma configuração da presente invenção, uma composição ou vacina pode conter ainda compostos modificadores de resposta biológica, ou a capacidade de produzir estes modificadores (i.e., por transfecção com moléculas de ácido nucléico que os codifiquem), embora tais modificadores são sejam necessários para se obter uma resposta imune robusta quando se utiliza um veículo tipo levedura (exposto abaixo). Os modificadores de resposta biológica podem estimular uma resposta imune protetora, ao passo que outros podem suprimir uma resposta imune prejudicial. Alguns modificadores de resposta biológica preferivelmente melhoram uma resposta imune mediada por células, ao passo que outros preferivelmente melhoram uma resposta imune humoral (i.e., podem estimular uma resposta imune em que haja um nível aumentado de imunidade celular em comparação com imunidade humoral, ou vice-versa). Existem várias técnicas, conhecidas entre especialista na matéria, para mensurar a estimulação ou a supressão de respostas imunes, bem como para diferenciar a resposta imune celular da resposta imune humoral.
Entre os modificadores de resposta biológica adequados estão as citocinas, os hormônios, os derivados lipídicos, os fármacos à base de pequenas moléculas e outros moduladores de crescimento, tais como (listagem não exaustiva): interleucina 2 (IL-2), interleucina 4 (IL-4), interleucina 10 (IL-10), interleucina 12 (IL-12), interferon gama (IFN-gama), fator de crescimento insulina- símile I (IGF-I)t fator transformador de crescimento beta (TGF-beta), esteróides, prostaglandinas e leucotrienos. Outros modificadores de resposta biológica adequados compreendem, de modo não exaustivo, anticorpo anti-CTLA-4 (p.ex., para liberar células T anérgicas); co-estimuladores de células T (p.ex., anti-CD137, anti- CD28, anti-CD40); alemtuzumabe (p.ex., CamPath®), denileucina diftitox (p.ex., ONTAK®), anti-CD4, anti-CD25, anti-PD-1, anti-PD- L1, anti-PD-L2 ou agentes que bloqueiam FOXP3 (p.ex., para anular a atividade/matar células T reguladoras CD4+/CD25+); Iigante Flt3, imiquimode (AldaraTM), GM-CSF (Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos-Macrófagos ), sargramostima (Leukine®), agonistas de receptor Toll-símile 7 (TLR-7) ou agonistas de TLR-9 (p.ex., agentes que aumentam o número ou o estado de ativação de células dendríticas, macrófagos e outras células apresentadoras de antígenos profissionais). Tais modificadores de resposta biológica são amplamente conhecidos na matéria e encontram-se disponíveis ao público.
Composições ou Vacinas à Base de
Leveduras
Um aspecto da invenção refere-se a uma composição ou a uma vacina à base de leveduras compreendendo: (a) um veículo tipo levedura; e (b) um antígeno contendo pelo menos uma das proteínas ou peptídeos Ras mutados descritos neste documento (p.ex., a proteína Ras abrigando uma mutação na posição 76, ou uma proteína ou combinação de proteínas contendo a mutação E76 e outra mutação Ras, como uma mutação G12), ou múltiplos epitopos ou antígenos ou uma proteína de fusão aqui descritos, expressos pelo veículo tipo levedura. Conforme exposto anteriormente, além da mutação E76, estão compreendidas no escopo da invenção as mutações em qualquer uma ou mais das posições 73, 74, 75, 77 ou 78, ou quaisquer das combinações de mutações Ras descritas acima e, especialmente, qualquer combinação entre uma mutação na posição 12 e/ou 13 e uma mutação na posição 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 e/ou 78.
De acordo com a presente invenção, um veículo tipo levedura é qualquer célula de levedura (p.ex., uma célula total ou intacta) ou derivado da mesma (ver abaixo) que possa ser empregada junto com um antígeno em vacina ou composição terapêutica da invenção, ou como adjuvante. O veículo tipo levedura pode compreender, portanto, ainda que de modo não exaustivo, um microorganismo levedura intacto vivo (i.e., uma célula de levedura contendo todos os seus componentes, inclusive parede celular), um microorganismo levedura intacto morto, ou derivados do mesmo, entre os quais: esferoplasto de levedura (i.e., uma célula de levedura sem parede celular), um citoplasto de levedura (i.e., uma célula de levedura sem parede celular e núcleo), um "fantasma" de levedura (i.e., uma célula de levedura sem parede celular, núcleo e citoplasma), uma preparação de parede celular de levedura ou um extrato subcelular de membrana de levedura ou fração da mesma (também chamada partícula de membrana de levedura e, anteriormente, partícula subcelular de levedura).
Os esferoplastos de levedura são produzidos tipicamente pela digestão enzimática da parede celular da levedura. Tal método encontra-se descrito, por exemplo, em Franzusoff et al., 1991, Meth. Enzymoi 194, 662-674., cujo inteiro teor é incorporado a este documento por citação. Os citoplastos de levedura são produzidos tipicamente pela enucleação das células de levedura. Tão método encontra-se descrito, por exemplo, em Coon, 1978, NatL Câncer Inst. Monogr. 48, 45-55, cujo inteiro teor é incorporado a este documento por citação. Os fantasmas de levedura são produzidos
tipicamente vedando-se novamente uma célula Iisada ou permeabilizada e podem, mas não necessitam, conter pelo menos algumas das organelas daquela célula. Tal método encontra-se descrito, por exemplo, em Franzusoff et al., 1983, J. Biol. Chem. 258, 3608-3614 e Bussey et al., 1979, Biochim. Biophys. Acta 553, 185-196, ambos incorporados por citação em seu inteiro teor a este documento.
Uma partícula de membrana de levedura (extrato subcelular de membrana de levedura ou porção da mesma) refere-se a uma membrana de levedura sem citoplasma ou núcleo natural. A partícula pode ter qualquer tamanho, inclusive os que variam do tamanho de uma membrana de levedura natural a micropartículas produzidas por sonicação (ou outros métodos de ruptura de membrana conhecidos entre os especialistas na matéria) seguida de nova vedação. Um método para produção de extratos subcelulares de membrana de levedura encontra-se descrito, por exemplo, em Franzusoffet al., 1991, Meth. Enzymol. 194, 662-674. É igualmente possível utilizar frações de partículas de membrana de levedura que contenham porções de membrana de levedura e o antígeno de interesse - no caso de o antígeno ser expresso de forma recombinante pela levedura antes da preparação das partículas de membrana de levedura. Os antígenos podem ser transportados para dentro da membrana, ou na superfície da membrana ou em combinações disto (i.e., o antígeno pode estar tanto dentro quanto fora da membrana e/ou cruzando a membrana da partícula de membrana de levedura). Em uma configuração, uma partícula de membrana de levedura é uma partícula de membrana de levedura recombinante que pode ser uma membrana intacta, rompida ou rompida e vedada novamente, que contenha pelo menos um antígeno desejado na superfície da membrana ou pelo menos parcialmente embutido dentro da membrana.
Um exemplo de uma preparação de parede celular de levedura são as paredes celulares de levedura portando um antígeno em sua superfície ou pelo menos parcialmente embutido dentro da parede celular, de modo que a preparação de parede celular de levedura, quando administrada a um animal, estimula a resposta imune desejada (p.ex., protetora) contra o agente infeccioso.
Qualquer cepa de levedura pode ser utilizada para produzir um veículo tipo levedura da presente invenção. As leveduras são microorganismos unicelulares que pertencem a uma destas três classes: Ascomycetes, Basidiomycetes e Fungi Imperfecti. Uma consideração essencial para a seleção do tipo de levedura a ser empregado como modulador imune diz respeito à patogenicidade da levedura. Em uma configuração, a levedura é uma cepa não-patogênica, tal como Saccharomyces eerevisiae. A seleção de uma cepa não-patogênica de leveduras é feita para reduzir quaisquer efeitos adversos ao indivíduo para quem se administra o veículo tipo levedura. É possível utilizar leveduras patogênicas, no entanto, se a patogenicidade da levedura puder ser neutralizada por quaisquer meios conhecidos entre os especialistas na matéria (p.ex., cepas mutantes). Embora cepas patogênicas de leveduras ou mutantes não-patogênicos das mesmas tenham sido empregados no passado como adjuvantes ou modificadores de resposta biológica e possam ser empregados de acordo com a presente invenção, cepas não-patogênicas de levedura são preferidas.
Os gêneros preferidos de cepas de leveduras
compreendem Saccharomyees, Candida (que podem ser patogênicas), Cryptoeoceus, Hansenula, Kluyveromyces, Piehia, Rhodotorula, Schizosaeeharomyces e Yarrowia, sendo preferidos Saccharomyees, Candida, Hansenula, Piehia e Schizosaccharomyces, e sendo especialmente preferido Saccharomyces. As espécies preferidas de cepas de leveduras compreendem Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Candida albicans, Candida kefyr, Candida tropicalis, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus neoformans, Hansenuia anômala, Hansenuia poiymorpha, Kiuyveromyces fragiiis, Kiuyveromyces iaetis, Kiuyveromyces marxianus var. Iaetis7 Pichia pastoris, Rhodotoruia rubra, Schizosaccharomyces pombe e Yarrowia iipoiytica. Deve ser avaliado que algumas destas espécies abrangem uma série de subespécies, tipos, subtipos, etc. - os quais se pressupõe incluídos entre as espécies mencionadas anteriormente. As espécies de leveduras preferenciais são S. cerevisiae, C. albicans, H. poiymorpha, P. pastoris and S. pombe. S. cerevisiae é especialmente preferida em virtude de ser relativamente fácil de manipular e de possuir o estatuto "GRAS" ("reconhecido em geral como seguro") para uso em aditivos alimentícios (GRAS, Regra 62FR18938 proposta pela Agência Norte-Americana para Drogas e Alimentos (FDA)1 de 17 de abril de 1997).
Uma configuração da presente invenção é
uma cepa de levedura capaz de replicar plasmídeos em número de cópias especialmente alto, como a cepa S. cerevisiae cir°. A S. cerevisiae é uma cepa capaz de sustentar vetores de expressão que possibilitam que um ou mais antígeno(s)-alvo e/ou proteína(s) de fusão de antígeno sejam expressos em altos níveis. Além disso, quaisquer cepas mutantes podem ser utilizadas na presente invenção, inclusive aquelas que apresentam reduzidas modificações pós~traducionais dos antígenos-alvo expressos, como mutações nas enzimas que estendem a glicosilação associada a N. Em uma configuração, um veículo tipo levedura preferido da presente invenção é capaz de se fundir com o tipo de célula para o qual este veículo e o antígeno estão sendo liberados, como uma célula dendrítica ou macrófago, com isso afetando sobretudo a liberação eficaz, ao tipo de célula, do veículo tipo levedura e, em muitas configurações, do antígeno. Conforme empregada neste documento, a fusão entre um veículo tipo levedura e o tipo de célula marcado refere-se à capacidade da membrana da célula de levedura, ou partícula da mesma, de se fundir com a membrana do tipo de célula marcado (p.ex., célula dendrítica ou macrófago), levando à formação de sincícios. Conforme empregado neste documento, um sincício é uma massa multinucleada de protoplasma produzida pela fusão de células. Várias proteínas de superfície viral (inclusive aquelas de vírus da imunodeficiência, tal como HIV, os vírus influenza, poliovírus e adenovírus) e outros agentes de fusão (como aqueles envolvidos nas fusões entre óvulo e espermatozóide) revelaram-se capazes de efetuar a fusão entre duas membranas (i.e., entre membranas de células de mamíferos e de vírus ou entre membranas de células de mamíferos). Por exemplo, um veículo tipo levedura que produz um antígeno heterólogo gp120/gp41 de HIV em sua superfície é capaz de se fundir com um linfócito T CD4+. Registre-se, no entanto, que a incorporação de uma fração marcadora no veículo tipo levedura não é necessária, embora possa ser desejável em certas circunstâncias. Demonstrou-se anteriormente que os veículos tipo levedura da presente invenção são prontamente absorvidas por células dendríticas (e também por outras células, como macrófagos).
De acordo com a presente invenção, os termos "complexo antígeno-veículo tipo levedura" ou "complexo antígeno-levedura" são empregados genericamente para descrever qualquer associação entre um veículo do tipo levedura e um antígeno. Tal associação compreende a expressão de um antígeno pela levedura (uma levedura recombinante), a introdução de um antígeno numa levedura, a anexação física do antígeno à levedura e a mistura entre a levedura e o antígeno, como num tampão ou noutra solução ou formulação. Estes tipos de complexos são descritos em detalhe abaixo. Em uma configuração, uma célula de
levedura utilizada pra preparar o veículo tipo levedura é transfectada com uma molécula de ácido nucléico heterólogo codificando o antígeno, de modo que o antígeno seja expresso pela célula de levedura. Tal levedura também é referida neste documento como levedura recombinante ou veículo tipo levedura recombinante. A célula de levedura pode então ser transferida para a célula dendrítica na forma de célula intacta, ou pode ser morta, ou a partir dela podem ser preparados derivados como esferoplastos, citoplastos, fantasmas ou partículas subcelulares de levedura, qualquer um deles sendo subseqüentemente transferidos para dentro da célula dendrítica. Os esferoplastos de levedura também podem ser transfectados diretamente com uma molécula de ácido nucléico recombinante (p.ex., o esferoplasto é produzido a partir de uma levedura total e transfectado em seguida), a fim de se produzir um esferoplasto recombinante que expressa um antígeno.
Em um aspecto, a célula ou esferoplasto de levedura utilizados para preparar o veículo tipo levedura são transfectados com uma molécula de ácido nucléico codificando o(s) antígeno(s), de modo que o antígeno seja expresso de modo recombinante pela célula ou esferoplasto de levedura. Neste aspecto, utiliza-se a célula ou esferoplasto de levedura que expressa de modo recombinante o(s) antígeno(s) para produzir um veículo tipo levedura compreendendo um citoplasto de levedura, fantasma de levedura, partícula de membrana ou de parede celular de levedura, ou ainda uma fração dos mesmos.
Em geral, o veículo tipo levedura e o(s) antígeno(s) podem ser associados por meio de qualquer técnica descrita neste documento. Em um aspecto, o veículo tipo levedura foi carregado de forma intracelular com o(s) antígeno(s). Em outro aspecto, o(s) antígeno(s) foi(foram) anexado(s) de modo covalente ou não-covalente ao veículo tipo levedura. Já em outro aspecto, o veículo tipo levedura e o(s) antígeno(s) foram associados através de mistura. Em outro aspecto - e na configuração preferida - o(s) antígeno(s) é(são) expresso(s) de modo recombinante pelo veículo tipo levedura ou pela célula ou esferoplasto de levedura de que se derivou o veículo tipo levedura.
A expressão de um antígeno num veículo tipo levedura da presente invenção é realizada usando-se técnicas conhecidas entre os especialistas na matéria. De forma breve, uma molécula de ácido nucléico codificando pelo menos um antígeno desejado é inserida num vetor de expressão, de modo que tal molécula de ácido nucléico seja operativamente associada a uma seqüência de controle de transcrição, a fim de tornar-se capaz de efetuar a expressão constitutiva ou regulada da molécula de ácido de nucléico quando transformada numa célula hospedeira de levedura. As moléculas de ácido nucléico codificando um ou mais antígenos podem estar em um ou mais vetores de expressão operativamente associados a uma ou mais seqüências de controle ν
s
de expressão. Particularmente importantes são as seqüências de controle de expressão que controlam o início da transcrição, como a seqüência promotora e a seqüência de ativação upstream. Qualquer promotor adequado à levedura pode ser empregado na presente invenção e vários destes promotores são conhecidos entre os especialistas na matéria. Os promotores preferidos para a expressão em Saccharomyces cerevisiae compreendem, de modo não exaustivo, os promotores dos genes que codificam as seguintes proteínas de levedura: álcool desidrogenase l (ADH1) ou Il (ADH2), CUP1, fosfoglicerato quinase (PGK)1 triose-fosfato isomerase (TPI), fator de elongação traducional alfa-1 (TEF2), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH; também chamada TDH3, triose-fosfato desidrogenase), galactoquinase (GAL1), galactose-1 -fosfato uridiltransferase (GAL7), uridina difosfato galactose epimerase (GAL10), citocromo c1 (CYC1), proteína Sec7 (SEC7) e fosfatase ácida (PH05) - sendo preferidos os promotores híbridos como ADH2/GAPDH e CYC1/GAL10 e, em grau de preferência ainda maior, o promotor ADH2/GAPDH, o qual é induzido quando as concentrações de glicòse na célula estão baixas (p.ex., de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,2 por cento), além dos promotores CUP1 e TEF2. Do mesmo modo, são conhecidas inúmeras seqüências de ativação upstream (UAS), também chamadas facilitadoras. As seqüências de ativação upstream preferidas para a expressão em Saccharomyces cerevisiae compreendem, de modo não exaustivo, as UAS dos genes que codificam as seguintes proteínas: PCK1, TPI, TDH3, CYC1, ADH1, ADH2, SUC2, GAL1, GAL7 e GAL10, além de outras UAS ativadas pelo produto do gene GAL4 - sendo especialmente preferida a seqüência de ativação upstream ADH2. Uma vez que a ADH2 é ativada pelo produto do gene ADR1, é preferível superexpressar o gene ADR1 quando um gene heterólogo estiver operativamente associado à ADH2. As seqüências de término de transcrição preferidas para a expressão em Saccharomyces cerevisiae compreendem as seqüências de término dos genes fator-α, GAPDH e CYC1.
As seqüências de controle de transcrição preferidas para expressar genes em levedura metilotrófica compreendem as regiões de controle de transcrição dos genes que codificam álcool oxidase e formato desidrogenase.
Preocupações relativas à otimização e métodos para a expressão extracelular de antígenos por levedura foram discutidos em detalhe previamente neste documento.
A transfecção de uma molécula de ácido nucléico numa célula de levedura, de acordo com a presente invenção, pode ser realizada através de qualquer método pelo qual uma molécula de ácido nucléico seja administrada na célula, compreendendo, de modo não exaustivo, difusão, transporte ativo, sonicação em banho, eletroporação, microinjeção, lipofecção, adsorção, infecção e fusão de protoplastos. As moléculas de ácido nucléico transfectadas podem ser integradas a um cromossomo de levedura ou mantidas em vetores extracromossômicos, usando-se técnicas conhecidas entre os especialistas na matéria. Exemplos de veículos tipo levedura portando tais moléculas de ácido nucléico são detalhadamente revelados neste documento. Conforme exposto anteriormente, citoplasto de levedura, fantasma de levedura, partículas de membrana e preparações de parede celular de levedura podem ser igualmente produzidos por recombinação, transfectando-se microorganismos do tipo levedura intactos ou 98/153
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esferoplastos de levedura com as moléculas de ácido nucléico desejadas, produzindo aí o antígeno e, em seguida, manipulando os microorganismos ou esferoplastos através de técnicas conhecidas pelos especialistas na matéria a fim de produzir citoplasto, fantasma ou extrato subcelular de membrana de levedura ou frações dos mesmos que contenham os antígenos desejados.
As condições eficientes para produção de veículos tipo levedura recombinante e expressão do antígeno pelo veículo tipo levedura compreendem um meio eficaz, no qual a cepa de levedura possa ser cultivada. Um meio eficaz é, tipicamente, um meio aquoso que contenha fontes assimiláveis de carboidratos, nitrogênio e fosfato, além de sais, minerais, metais e outros nutrientes apropriados, como vitaminas e fatores de crescimento. O meio pode conter nutrientes complexos ou pode ser um meio mínimo definido. As cepas de levedura da presente invenção podem ser cultivadas em vários recipientes, entre eles biorreatores, frascos de Erlenmeyer, tubos de ensaio, placas para microtitulação e placas petri (listagem não exaustiva). A cultura é conduzida em temperatura, pH e teor de oxigênio apropriados para a cepa de levedura. Tais condições de cultura são bem conhecidas por quem tenha conhecimentos comuns na matéria (ver, por exemplo, Guthrie et al. (eds.), 1991, Methods in Enzymology, vol. 194, Academic Press, San Diego).
Em alguns aspectos da invenção e, especialmente, quando for desejável ter-se uma expressão de superfície ou quantidade suficientes de um antígeno, nas configurações em que se busca a indução de uma resposta imune, a levedura é cultivada em meio mantido em pH neutro. Conforme empregado aqui, o uso geral do termo "pH neutro" refere-se a uma < 99/153
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variação de pH entre cerca de 5,5 e cerca de 8 - preferivelmente entre cerca de 6 e cerca de 8. Um especialista na matéria reconhecerá que flutuações menores (p.ex., décimos ou centésimos) podem ocorrer quando da medição com medidor de pH. Sendo assim, o uso de pH neutro para a cultura de células de levedura significa que as células de levedura são cultivadas em pH neutro na maior parte do tempo em que permanecerem na cultura. Preferivelmente, a levedura é cultivada em meio mantido em nível de pH de pelo menos 5,5 - quer dizer, não se permite que o pH do meio de cultura caia para nível inferior a 5,5. O uso de um pH neutro no cultivo de leveduras promove vários efeitos biológicos que são características desejáveis para o uso de leveduras como veículos para imunomodulação.
Em uma configuração da presente invenção, como uma alternativa à expressão de um antígeno recombinado no veículo tipo levedura, um veículo tipo levedura é carregado de forma intracelular com o antígeno da proteína ou peptídeo, ou com carboidratos ou outras moléculas que sirvam como antígeno. Subseqüentemente, o veículo tipo levedura - que agora contém o antígeno dentro das células - pode ser administrado ao paciente ou carregado num carreador, tal como uma célula dendrítica (descrito abaixo). Conforme empregado neste documento, um peptídeo compreende uma seqüência de aminoácidos com menos ou igual a aproximadamente 30-50 aminoácidos, ao passo que uma proteína compreende uma seqüência de aminoácidos com mais de 30-50 aminoácidos; as proteínas podem ser multiméricas. Uma proteína ou peptídeo útil como antígeno pode ser pequena como um epitopo de célula T (i.e., maior do que cinco aminoácidos em extensão) e qualquer tamanho adequado maior do que esse, o que inclui vários epitopos, fragmentos de proteínas, proteínas totais, proteínas quiméricas ou proteínas de fusão. Os peptídeos e proteínas podem ser alterados natural ou sinteticamente, dando origem a derivados; tais modificações podem compreender, de modo não exaustivo, glicosilação, fosforilação, acetilação, miristilação, prenilação, palmitoilação, amidação e/ou adição de fosfatidilglicerol e fosfatidilinositol. Os peptídeos e as proteínas podem ser inseridos diretamente nos veículos tipo levedura da presente invenção por meio de técnicas conhecidas entre especialistas na matéria, tais como difusão, transporte ativo, fusão de lipossomos, eletroporação, fagocitose, ciclos de congelamento e degelo e sonicação em banho. Os veículos tipo levedura que podem ser diretamente carregados com peptídeos, proteínas, carboidratos ou outras moléculas englobam leveduras intactas, como esferoplastos, fantasmas ou citoplastos, os quais podem ser carregados com antígenos após a produção, porém antes de serem carregados nas células dendríticas. Opcionalmente, uma levedura intacta pode ser carregada com o antígeno e, daí em diante, é possível preparar esferoplastos, fantasmas, citoplastos e partículas subcelulares. É possível carregar qualquer número de antígenos num veículo tipo levedura desta configuração, de pelo menos 1, 2, 3, 4 ou qualquer número inteiro até centenas ou milhares de antígenos, caso fossem carregados em microorganismo, em célula tumoral de mamíferos ou em porções dos mesmos, por exemplo. Em outra configuração da presente invenção,
um antígeno é fisicamente anexado num veículo tipo levedura. A anexação física do antígeno no veículo tipo levedura pode ser realizada por meio de qualquer método adequado na matéria, inclusive métodos de associação covalente e não-covalente, os quais compreendem, de modo não exaustivo, a ligação cruzada, por meio químico, do antígeno à superfície externa do veículo tipo levedura ou a ligação do antígeno à superfície externa do veículo tipo levedura por meio biológico. A ligação cruzada por modo químico pode ser realizada, por exemplo, através de métodos que compreendam ligação com glutaraldeído, rotulagem de fotoafinidade, tratamento com carbodiimidas, tratamento com produtos químicos capazes de ligar ligações de dissulfeto, tratamento com outros produtos químicos de ligação cruzada comuns na matéria. Opcionalmente, é possível realizar o contato entre um produto químico e o veículo tipo levedura, alterando a carga da bicamada lipídica da membrana da levedura ou a composição da parede celular, de modo que a superfície externa da levedura torne-se mais propícia a fundir-se ou ligar-se com antígenos que tenham certas características de carga. Agentes marcadores tais como anticorpos, peptídeos de ligação, receptores solúveis e outros Iigantes também podem ser incorporados num antígeno como uma proteína de fusão, ou então ser associados a um antígeno para ligar o antígeno ao veículo tipo levedura. Já em outra configuração, o veículo tipo
levedura e o antígeno são associados entre si através de um mecanismo de ligação mais passivo, não-específico ou não- covalente - misturando-se delicadamente o veículo tipo levedura e o antígeno em um tampão ou outra formulação adequada (p.ex., aditivo).
Em uma configuração da invenção, o veículo tipo levedura e o antígeno são ambos carregados de forma intracelular em um carreador, como uma célula dendrítica ou macrófago, a fim de formar a composição terapêutica ou vacina da presente invenção. Opcionalmente, um antígeno da invenção (i.e., uma proteína de fusão Ras da invenção) pode ser carregado numa célula dendrítica na ausência do veículo tipo levedura.
Abaixo são expostas as várias formas pelas quais se pode realizar o carregamento de ambos os componentes. Conforme empregado neste documento, o termo "carregado" e seus derivados referem-se à inserção, introdução ou entrada de um componente (p.ex., o veículo tipo levedura e/ou o antígeno) numa célula (p.ex., uma célula dendrítica). Carregar um componente de forma intracelular refere-se à inserção ou introdução do componente em um compartimento intracelular da célula (p.ex., através da membrana plasmática e, no mínimo, no citoplasma, num fagossomo, num lisossomo ou em algum outro espaço intracelular da célula). Carregar um componente numa célula diz respeito a qualquer técnica pela qual o componente seja forçado a entrar na célula (p.ex., por eletroporação) ou colocado em um ambiente (p.ex., em contato ou próximo a uma célula) onde o componente terá substancial probabilidade de entrar na célula por algum processo (p.ex., fagocitose). As técnicas de carregamento englobam, de modo não exaustivo: difusão, transporte ativo, fusão de lipossomos, eletroporação, fagocitose e sonicação em banho. Em uma configuração preferida, são empregados mecanismos passivos para o carregamento de uma célula dendrítica com o veículo tipo levedura e/ou antígeno, entre eles a fagocitose do veículo tipo levedura e/ou antígeno por uma célula dendrítica.
Em uma configuração, a levedura intacta (com ou sem expressão de antígenos heterólogos) pode ser triturada ou processada de modo a produzir preparações de parede celular de levedura, partículas de membrana de levedura ou fragmentos de levedura (i.e., não intacta); em algumas configurações, os fragmentos de levedura podem ser fornecidos ou administrados com outras composições que contenham antígenos (p.ex., vacinas de DNA1 vacinas de subunidades de proteínas, patógenos mortos ou inativados) a fim de melhorar a resposta imune. Por exemplo, pode-se utilizar tratamento enzimático, tratamento químico ou força física (p.ex., sonicação ou deformação mecânica) para quebrar a levedura em partes que são empregadas como um adjuvante. Métodos Terapêuticos da Invenção
Uma configuração da invenção refere-se ao uso de quaisquer dos agentes descritos neste documento em referência à Ras mutada da invenção (p.ex., Ras contendo pelo menos uma mutação no códon 76, ou a combinação da mutação no códon 76 com outra mutação Ras1 como uma mutação no códon 12) na preparação de um medicamento ou composição ou vacina para proteger um animal de um câncer. Conforme exposto anteriormente, além da mutação E76, pertencem ao escopo da invenção mutações em qualquer uma ou mais das posições 73, 74, 75, 77 ou 78, ou quaisquer das combinações de mutações Ras descritas acima e, especialmente, qualquer combinação entre uma mutação na posição 12 e/ou 13 e uma mutação na posição 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 e/ou 78. Outras configurações da invenção dizem respeito a um método para proteger um animal de um câncer, compreendendo a administração de uma vacina ou composição terapêutica, descritas neste documento, a um animal que tenha ou esteja em risco de desenvolver um câncer a fim de reduzir ou prevenir pelo menos um sintoma do câncer no animal.
Em um aspecto, a vacina ou composições engloba quaisquer das vacinas ou composições descritas acima que contenham pelo menos o antígeno incluindo pelo menos uma proteína ou peptídeo Ras mutados que abriguem a mutação na posição 76 ou um antígeno ou antígenos que contenham uma combinação entre a mutação da posição 76 e outra mutação Ras1 tal como a mutação na posição 12 e, preferivelmente, que contenham os vários peptídeos, proteínas, construções quiméricas e/ou proteínas de fusão descritas acima. Outras mutações Ras e combinações das mesmas que possam ser utilizadas em uma vacina ou composição encontram-se descritas acima. Outras composições terapêuticas úteis a este método da invenção envolvem uma composição que contenha um composto ou agente que marquem as proteínas Ras mutadas identificadas pelos inventores e que inibam a expressão de tais proteínas pelos tumores, ou que iniciem ou regulem positivamente a hidrólise de GTP das proteínas Ras a fim de neutralizar ou compensar o efeito de proteínas Ras mutadas sobre a hidrólise de GTP. Tais compostos ou agentes podem abranger, de modo não exaustivo, vários ácidos nucléicos inibidores - como ribozimas, RNAi ou aptâmeros - e/ou vários peptídeos e compostos sintéticos ou à base de pequenas moléculas (p.ex., produtos da descoberta de fármacos que empregam a Ras mutada descoberta pelos inventores), tais como antagonistas conformacionais ou ativadores da hidrólise de GTP. Estes compostos ou agentes e os métodos para a identificação dos mesmos são expostos em outras seções deste documento. Em um aspecto da invenção, os produtos Ras mutados de extensão completa (p.ex., proteínas e moléculas de ácido nucléico) não são administrados a um indivíduo juntamente com os métodos terapêuticos e usos da invenção; em vez disso, são selecionados peptídeos e fragmentos de tais produtos Ras ou outras ferramentas associadas aos mesmos (p.ex., aptâmeros, RNAi, etc.). No contexto de uma composição para a obtenção de uma resposta imune, principalmente no contexto da expressão por veículo tipo levedura da invenção, a extensão completa da Ras pode ser utilizada - embora sejam preferidas porções imunogênicas e proteínas de fusão de múltiplos domínios.
A vacina ou composição compreende ainda um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável e, em uma configuração (p.ex., caracterizada pelo fato de a composição ser uma vacina), inclui o veículo tipo levedura que é descrito neste documento. Em um aspecto, as proteínas de fusão inclusas na vacina contêm pelo menos dois ou mais antígenos de câncer. Em outro aspecto, tal proteína de fusão compreende pelo menos um ou mais domínios imunogênicos de um ou mais antígenos de câncer.
Em outro aspecto, o antígeno de câncer é um antígeno associado a um câncer, compreendendo, de modo não exaustivo, melanomas, carcinomas de células escamosas, cânceres de mama, carcinomas de cabeça e pescoço, carcinomas de tireóide, sarcomas de tecido mole, sarcomas ósseos, cânceres testiculares, cânceres prostáticos, cânceres pancreáticos, cânceres ovarianas, cânceres de bexiga, cânceres de pele, cânceres de cérebro, hemangiossarcomas, tumores de células do manto, cânceres hepáticos primários, cânceres de pulmão (inclusive carcinoma pulmonar de células não pequenas), cânceres pancreáticos, cânceres gastrintestinais (inclusive câncer colorretal), carcinomas de células renais, neoplasias hematopoiéticas e cânceres metastáticos dos mesmos.
Em todos os aspectos, inclui-se na vacina ou composição pelo menos um antígeno que compreenda, seja formado essencialmente ou seja formado por um peptídeo de Ras abrigando a mutação 76, uma combinação entre a mutação da posição 76 e pelo menos uma outra mutação Ras1 como uma mutação na posição 12, uma Ras abrigando uma mutação na posição 73, 74, 75, 77 ou 78, uma Ras abrigando quaisquer das combinações de mutações descritas neste documento, ou ainda um agente de ácido nucléico ou outro agente que faça uso de tais mutações, conforme descrito anteriormente. A presente invenção abrange a liberação de
uma composição ou vacina da invenção a um animal. O processo de administração pode ser realizado ex vivo ou in vivo. A administração ex vivo se refere à realização de parte da etapa reguladora fora do paciente, por exemplo, administrando-se uma composição da presente invenção a uma população de células (células dendríticas) removidas de um paciente, sob condições tais que um veículo tipo levedura e um antígeno sejam carregados dentro da célula, devolvendo-se as células ao paciente. A composição terapêutica da presente invenção pode ser devolvida a um paciente, ou seja, administrada a um paciente, através de qualquer modo de administração adequado.
A administração de uma vacina ou composição pode ser sistêmica, transmucosa e/ou próxima ao local do sítio-alvo (p.ex., perto de um tumor). As vias de administração preferidas serão evidentes para os especialistas na matéria, dependendo do tipo de condição a ser tratada ou prevenida, do antígeno utilizado e/ou do tecido ou população de células-alvo. Os métodos de administração preferidos compreendem, de modo não exaustivo, administração intravenosa, administração intraperitoneal, administração intramuscular, administração intranodal, administração intracoronariana, administração intra-arterial (p.ex., numa artéria carótida), administração subcutânea, difusão transdérmica, administração intratraqueal, administração subcutânea, administração intra-articular, administração intraventricular, inalação (p.ex., aerossol), administração intracranial, intraespinhal, intraocular, auricular, intranasai, intrapulmonar, impregnação de um cateter e injeção direta em um tecido. As vias de administração especialmente preferidas são as seguintes: intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intradérmica, intranodal, intramuscular, transdérmica, inalável, intranasai, oral, intraocular, intra-articular, intracranial e intraespinhal. A difusão parenteral pode incluir as vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intrapleural, intrapulmonar, intravenosa, subcutânea, cateter arial e cateter venoso. A difusão por via auricular pode incluir gotas otológicas, a difusão intranasai pode incluir gotas nasais ou injeção intranasai e a difusão intraocular pode incluir colírios. A difusão por aerossol (inalação) também pode ser realizada usando-se métodos comuns na matéria (ver, por exemplo, Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 189:11277-11281, 1992, cujo inteiro teor é incorporado a este documento por citação). Por exemplo, em uma configuração, uma composição ou vacina da invenção pode ser formulada numa composição adequada para difusão por nebulizacao usando-se um aparelho de inalação ou nebulizador adequados. A administração oral - útil ao desenvolvimento da imunidade das mucosas - pode abranger sólidos e líquidos que possam ser ingeridos através da boca, já que as composições que contêm veículos tipo levedura podem ser facilmente preparadas para difusão oral na forma de comprimidos ou cápsulas, por exemplo, além de serem formuladas como produtos alimentícios. Outras vias de administração que modulam a imunidade das mucosas são úteis no tratamento de infecções virais. Tais vias compreendem a administração bronquial, intradérmica, intramuscular, intranasal, além de outras vias inaláveis, retais, subcutâneas, tópicas, transdérmicas, vaginais e uretrais.
De acordo com a presente invenção, um protocolo de administração eficaz (i.e., administrar uma vacina ou composição de uma maneira eficiente) compreende parâmetros de dosagem e modos de administração adequados, que resultem na obtenção de uma resposta imune em um animal que seja portador de uma doença ou condição clínica ou que esteja em risco de contrair uma doença ou condição clínica, no caso de administração de uma vacina (terapêutica ou profilática), preferivelmente de modo que o animal fique protegido da doença. Quando a composição contiver um agente ou composto terapêutico diversos, conforme descrito neste documento, um protocolo de administração eficaz compreende parâmetros de dosagem e modos de administração adequados, que resultem em alívio ou melhora detectável em pelo menos um sintoma ou indicador da doença ou condição clínica do paciente, tal como a redução do tamanho ou do nível tumoral, ou ainda na prevenção da doença, quando o paciente estiver em risco de contrair a doença ou condição clínica. Os parâmetros de dosagem eficazes podem ser determinados através de métodos comuns na matéria, para uma determinada doença. Tais métodos abrangem, por exemplo, a determinação de taxas de sobrevivência, efeitos colaterais (i.e., toxicidade) e a progressão ou regressão da doença.
De acordo com a presente invenção, o Μ7
Pf
tamanho adequado para uma dose única é aquele capaz de provocar, em um animal, uma resposta imune específica ao antígeno ou de provocar uma melhora em pelo menos um sintoma ou indicar da doença, quando a dose é administrada uma ou mais vezes durante um período de tempo adequado. As doses podem variar em função da doença ou condição clínica que estiver sendo tratada. Por exemplo, em uma configuração, quando um antígeno for liberado com um veículo tipo levedura, uma dose única de um veículo tipo levedura da presente invenção varia entre cerca de 1 χ 105 e cerca de 5 χ 107 equivalentes de células de levedura por quilograma do peso corporal do organismo que receber a composição. Em uma configuração preferida, as células de levedura por dose não são ajustadas em função do peso do organismo. Nesta configuração, uma dose única de um veículo tipo levedura da presente invenção varia entre cerca de 1 χ 104 e cerca de 1 χ 109 células de levedura por dose. Em grau de preferência ainda maior, uma dose única de um veículo tipo levedura da presente invenção varia entre cerca de 0,1 U.L. (1 χ 106 células) e cerca de 100 U.L. (1 χ 109 células) por dose (i.e., por organismo), incluindo qualquer dose intermediária, em acréscimos de 0,1 χ 106 células (i.e., 1,1 χ 106, 1,2 χ 106, 1,3 χ 106, ...). Esta faixa de doses pode ser empregada de modo eficaz em qualquer organismo de qualquer dimensão, incluindo camundongos, macacos, humanos, etc. Quando a vacina for administrada carregando-se o veículo tipo levedura e antígeno em células dendríticas, uma dose única preferida de uma vacina da presente invenção varia entre cerca de 0,5 χ 106 e cerca de 40 χ 106 células dendríticas por indivíduo por administração. Preferivelmente, uma dose única varia entre cerca de 1 χ 106 e cerca de 20 χ 106 células dendríticas por indivíduo e, em grau maior de preferência, entre cerca de 1 χ 106 e cerca de 10 χ 106 células dendríticas por indivíduo.
Uma dose única preferida de uma vacina de ácido nucléico varia de cerca de 1 nanograma (ng) a cerca de 100 pg, dependendo da via de administração e/ou do método de difusão, podendo ser determinada por especialistas na matéria. Os métodos de difusão adequados compreendem, por exemplo, injeção, gotas, aerossol e/ou uso tópico. Em uma configuração, construções de DNA puro revestem a superfície de partículas de ouro (1 to 3 pm de diâmetro) e são projetadas em células da pele ou músculo com uma "pistola gênica".
Uma dose única apropriada de um complexo lipossomo-ácido nucléico varia entre cerca de 0,1 pg e cerca de 100 pg por quilograma de peso corporal do paciente que recebe o complexo. Em outra configuração, uma dose única apropriada varia entre cerca de 1 pg e cerca de 10 pg por quilograma de peso corporal. Em outra configuração, uma dose única apropriada de um complexo lipídio-ácido nucléico tem pelo menos cerca de 0,1 pg de ácido nucléico e, preferivelmente, pelo menos cerca de 1 pg de ácido nucléico; em grau ainda maior de preferência, pelo menos cerca de 10 pg de ácido nucléico e, em grau ainda maior de preferência, pelo menos cerca de 50 pg de ácido nucléico e, em grau ainda maior de preferência, pelo menos cerca de 100 pg de ácido nucléico.
Quando a composição contiver uma proteína,
pequena molécula (i.e, os produtos do planejamento de fármacos) ou anticorpo, uma dose única preferida de tal composto em geral contém entre cerca de 0,01 micrograma χ quilograma-1 e cerca de miligramas χ quilograma-1 do peso corporal de um animal. Em grau maior de preferência, uma dose única de tal agente contém entre cerca de 1 micrograma χ quilograma-1 e cerca de 10 miligramas χ quilograma-1 do peso corporal de um animal. Em grau ainda maior de preferência, uma dose única de um agente contém entre cerca de 5 microgramas χ quilograma-1 e cerca de 7 miligramas χ quilograma-1 do peso corporal de um animal. Em grau ainda maior de preferência, uma dose única de um agente contém entre cerca de 10 microgramas χ quilograma-1 e cerca de 5 miligramas χ quilograma-1 do peso corporal de um animal. Outra dose única de um agente especialmente preferida contém entre cerca de 0,1 micrograma χ quilograma-1 e cerca de 10 microgramas χ quilograma-1 do peso corporal de um animal, se o agente for liberado por via parenteral.
Os "amplificadores" de uma composição terapêutica que seja uma vacina são administrados preferivelmente quando a resposta imune contra o antígeno tiver sua intensidade enfraquecida, ou ainda conforme sejam necessários para se obter uma resposta imune ou induzir uma resposta de memória contra um determinado antígeno ou antígenos. Os amplificadores podem ser administrados entre cerca de duas semanas e vários anos após a primeira administração. Em uma configuração, um programa de administração é aquele em que cerca de 1 χ 105 e cerca de 5 χ 107 equivalentes de células de levedura de uma composição por quilograma de peso corporal do organismo são administrados entre uma e aproximadamente quatro vezes durante um período de tempo que varia entre cerca de 1 e cerca de 6 meses. A administração de outras composições terapêuticas descritas neste documento pode ser determinada pelo médico com base na reavaliação do paciente após a administração e na avaliação da JQ
situação da doença ou condição clínica ou sintomas ou indicadores da mesma.
Em uma configuração da invenção, um paciente identificado como portador de uma mutação Ras descrita neste documento recebe terapia gênica, separadamente ou em associação com outra terapia aqui descrita, a fim de fornecer Ras selvagem ou "saudável" (não-mutada) ao paciente. Os métodos para se administrar uma molécula de ácido nucléico em um protocolo de terapia gênica são conhecidos na matéria. Os métodos e usos dirigidos a composições
terapêuticas e vacinas da invenção são destinados primariamente ao uso na prevenção e/ou tratamento de uma doença ou condição clínica. O termo "proteger" pode ser empregado de modo geral para comunicar prevenção e/ou tratamento. Uma composição terapêutica ou vacina da presente invenção, quando administradas a um indivíduo, pode prevenir a ocorrência de uma doença; curar a doença; retardar o início da doença; e/ou aliviar (reduzir, retardar, diminuir) sintomas, sinais ou causas da doença (p.ex., reduzir um ou mais sintomas da doença; reduzir a ocorrência da doença; aumentar a sobrevivência do indivíduo que tenha ou desenvolva a doença; e/ou reduzir a severidade da doença). Assim sendo, a invenção abrange tanto a prevenção da ocorrência de doença (tratamento profilático ou vacina profilática) quanto o tratamento de animal que tenha uma doença ou que apresente sintomas de uma doença (tratamento terapêutico ou vacina terapêutica). Em uma configuração, os métodos da invenção são eficazes para provocar uma resposta imune no indivíduo pela indução de uma resposta imune benéfica ou protetora que além disso pode, em alguns casos, suprimir (p.ex., reduzir, inibir ou bloquear) uma resposta imune excessiva ou prejudicial. Em outro aspecto, os métodos da invenção são eficazes para resultar em pelo menos uma melhora ou benefício detectável em pelo menos um sintoma ou indicador da doença ou condição clínica - os quais podem compreender, no caso de câncer, a redução da carga tumoral, p.ex., redução da dimensão do tumor, redução dos níveis tumorais, redução da taxa de crescimento tumoral e/ou redução nas metástases e/ou adiamento do início da doença e/ou maior sobrevivência do paciente (listagem não exaustiva). Métodos Diagnósticos e Prognósticos da
invenção
Outra configuração da invenção refere-se ao uso das proteínas Ras mutadas ou das moléculas de ácido nucléico ras da invenção, e porções das mesmas, como biomarcadores em ensaio ou kit diagnóstico ou prognóstico para câncer. Em uma configuração preferida, a invenção diz respeito à detecção de ácidos nucléicos (genes ou RNA) que codifiquem as proteínas Ras mutadas em um ensaio diagnóstico ou prognóstico para câncer. Em uma configuração, o método compreende a determinação da presença e/ou do nível do marcador mutante E76 (também chamado genericamente, neste documento, de biomarcador) numa amostra de ácido nucléico ou proteína. A mutação E76 pode compreender qualquer mutação em E76 de acordo com a descrição aqui apresentada e, preferivelmente, compreende a mutação E76G, a mutação E76K ou a mutação E76Q, embora deva ser entendido que é possível que outros tumores tenham outras mutações nesta posição da Ras, em comparação com a proteína ou gene de tipo selvagem. O biomarcador pode ser identificado detectando-se a proteína Ras mutada, mas, preferivelmente, é identificado detectando-se uma molécula de ácido nucléico que codifique tal proteína Ras mutada (RNA ou DNA). Em outra configuração, o método compreende ainda a detecção (concomitante ou subseqüente) da presença e/ou do nível de outro biomarcador mutante de Ras1 inclusive as mutações previamente conhecidas nas posições (códons) 12, 13, 59 ou 61 da proteína Ras. Em uma configuração, o método compreende a detecção da presença e/ou do nível tanto da mutação E76 quanto da mutação G12 em amostra única de um paciente (ácido nucléico ou proteína). Em outra configuração, o método pode compreender a determinação da presença e/ou do nível de qualquer uma ou mais das posições 73, 74, 75, 77 ou 78, ou de quaisquer das combinações de mutações Ras descritas acima e, especialmente, qualquer combinação entre uma mutação na posição 12 e/ou 13 e uma mutação na posição 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 e/ou 78. Os aspectos abaixo serão descritos em relação à mutação E76 visando à simplicidade, mas devem ser ampliados a fim de englobar quaisquer destas mutações ou combinações das mesmas.
A primeira etapa deste método da presente invenção compreende a detecção da presença do gene ras mutado (contendo a mutação que resulta na mutação Ras E76) e/ou da expressão ou atividade biológica da Ras E76 em uma amostra de teste de um paciente (também chamada amostra de paciente). Os métodos apropriados para a coleta de uma amostra de paciente são conhecidos por especialistas na matéria. Uma amostra de paciente pode abranger quaisquer tecidos ou fluidos corporais do paciente que possam conter células tumorais ou proteínas de células tumorais. Mais especificamente, de acordo com a presente invenção, os termos "amostra de teste" e "amostra de paciente" podem ser empregados em geral para referir-se a uma amostra de qualquer tipo que contenha células ou produtos que tenham sido secretados ou estejam contidos em células a serem avaliadas pelo presente método, compreendendo, de modo não exaustivo, uma amostra de células isoladas, uma amostra de tecido, uma amostra de fluido corporal ou, por exemplo, uma amostra de ácidos nucléicos obtidos a partir de uma amostra de células coletada do paciente.
De acordo coma presente invenção, uma amostra de células isoladas é um espécime de células, geralmente em suspensão ou separadas do tecido conjuntivo que eventualmente as conectava em um tecido in vivo, as quais foram coletadas de órgão, tecido ou fluido por meio de qualquer método apropriado que resulte na coleção de um número adequado de células para avaliação pelo método da presente invenção. As células da amostra de células não são necessariamente de mesmo tipo, embora possam ser empregados métodos de purificação a fim de melhorar a quantidade do tipo de células que são avaliadas preferivelmente. As células podem ser obtidas, por exemplo, fragmentando-se um tecido, processando-se uma amostra de tecido para que libere células individuais ou isolando-as a partir de um fluido corporal.
Embora semelhante a uma amostra de células isoladas, uma amostra de tecido define-se neste documento como a seção de um órgão ou tecido do corpo, os quais contêm geralmente vários tipos de células e/ou de estrutura citoesquelética que agrupa as células. Um especialista na matéria reconhecerá que o termo "amostra de tecido" pode ser empregado, em alguns casos, de modo intercambiável com o termo "amostra de células", embora » 116/153
OQ -r
seja preferivelmente empregado para designar uma estrutura mais complexa do que uma amostra de células. Uma amostra de tecido pode ser coletada por biópsia, por exemplo, compreendendo incisão, corte ou punção. Uma amostra de fluido corporal, assim como
a amostra de tecido, contém as células a serem avaliadas quanto à expressão ou atividade biológica do marcador e/ou pode conter um biomarcador solúvel que secretado pelas células. Este tipo de amostra consiste num fluido obtido através de qualquer método adequado em função do fluido corporal a ser coletado. Os fluidos corporais apropriados para coleta de amostra compreendem, de modo não exaustivo, sangue, muco, líquido seminal, saliva, leite materno, bile e urina.
Em geral, o tipo da amostra (i.e., célula, tecido ou fluido corporal) é selecionado com base na acessibilidade e na estrutura do órgão ou tecido a ser avaliado quanto à presença ou crescimento de células tumorais e/ou com base no tipo de câncer a ser avaliado. Por exemplo, se o órgão/tecido a ser avaliado for o seio, a amostra pode ser uma amostra de células epiteliais de uma biópsia (i.e., uma amostra de células) ou uma amostra de tecido mamário de uma biópsia (uma amostra de tecido). A amostra mais útil à presente invenção consiste em células, tecidos ou fluidos corporais (e componentes dos mesmos, como DNA), retirados de um paciente por biópsia ou cirurgia ou coleta laboratorial de fluidos.
Assim que for coletada do paciente, a amostra é avaliada a fim de detectar-se a presença do gene ras mutado, ou a fim de detectar-se a expressão ou atividade biológica da Ras E76, isolada ou em combinação com outras mutações, tais como outras mutações Ras ou ras e, especialmente, uma mutação G12 (p.ex., pela detecção do RNA mensageiro que codifica o produto gênico mutado ou pela detecção da proteína Ras mutada) da presente invenção nas células da amostra.
Por exemplo, a presença e/ou o nível do
biomarcador ras podem ser determinados através de métodos convencionais, como os métodos de detecção de RNA ou gene (p.ex., seqüenciamento de DNA, hibridização com oligonucleotídeos, amplificação por PCR com primers específicos à mutação) e os métodos de detecção de proteínas (p.ex., imunoensaios ou ensaios bioquímicos para determinar o nível do produto gênico). Em geral, a seqüência de ácido nucléico do gene ras ou do RNA numa amostra de paciente pode ser detectada através de qualquer método ou técnica adequados para mensurar ou identificar seqüência ou expressão gênica. Tais métodos compreendem, de modo não exaustivo, PCR, PCR via transcriptase reversa (RT-PCR), PCR in situ, hibridização in situ, southern blot, northern blot, análise de seqüência, análise em microsséries de expressão gênica e detecção da expressão de um gene repórter, ou outras plataformas de hibridização de DNA/RNA. A expressão pode ser avaliada pela presença da(s) seqüência(s) ras mutada(s), simplesmente, e/ou comparada a amostras isoladas de indivíduos saudáveis ou outro controle negativo.
Por exemplo, uma amostra de biópsia tumoral de um paciente, contida num bloco de parafina, pode ser seccionada e corada com hematoxilina, após o que as células patológicas da amostra podem ser isoladas por microdissecação por captura a laser. O DNA genômico das células isoladas é utilizado, então, como um padrão para reação por PCR a fim de amplificar o fragmento de DNA que abriga a seqüência do ras especificado no éxon 3, usando-se primers que flanqueiam a seqüência de interesse. Alternativamente, as seções da biópsia tumoral podem ser analisadas por PCR in situ, de modo que a amplificação dependa da hibridização com primers que se liguem à seqüência mutada, e elongadas com nucleotídeos rotulados, de modo que uma seqüência amplificada seja especificamente detectada dentro das células tumorais. Já outra alternativa consistiria em sondar as seções com oligonucleotídeos que hibridizam especificamente com uma ou mais mutações R76, mas não com as seqüências ras selvagem.
Quando se detectar a proteína mutante E76 (ou combinação de mutações Ras na forma descrita neste documento), a expressão da proteína pode ser identificada em tecidos apropriados, como tecido tumoral e material celular obtido por biópsia. Por exemplo, a amostra de biópsia tumoral do paciente, a qual pode ser imobilizada, pode ser posta em contato com um anticorpo, com um fragmento de anticorpo ou com um aptâmero, que se liga seletivamente à proteína Ras a ser detectada, determinando-se se o anticorpo, fragmento do mesmo ou aptâmero se ligou à proteína Ras. A ligação pode ser mensurada usando-se uma variedade de métodos padrão na matéria, os quais compreendem, de modo não exaustivo: western blot, immunoblot, ensaio imunoadsorvente enzima-associado (ELISA), radioimunoensaio, imunoprecipitação, ressonância de plasmônio de superfície, quimioiuminescência, polarização fluorescente, fosforescência, análise imunoistoquímica, espectometria de massa por desorção-ionização de laser em matriz por tempo de vôo (MALDI-TOF), microcitometria, análise em microsséries, microscopia, separação de células ativadas por fluorescência (FACS) e citometria de fluxo. Em dado imunoensaio, determina-se a ligação à proteína Ras usando-se um primeiro anticorpo monoclonal, que se liga especificamente à proteína Ras mutada, e um segundo anticorpo que se liga ao primeiro.
Nos métodos diagnósticos/prognósticos da invenção, se a mutação ras ou Ras E76 (ou combinação de mutações Ras ou ras descritas neste documento) for detectada (por detecção do ácido nucléico ou da proteína), considera-se que tal detecção da mutação é indicativa da presença de células tumorais ou da predisposição do paciente para desenvolver células tumorais, à medida que não se espera encontrar esta mutação em indivíduos "saudáveis" (i.e., indivíduos que não apresentam e não parecem predispostos para câncer causado ou estimulado por esta mutação Ras). No entanto, pode-se comparar a detecção da mutação Ras ou ras à "situação da Ras" (i.e., a seqüência de genes ou proteínas Ras) em um indivíduo saudável ou normal, caso se deseje.
Ao passo que a detecção da mutação E76 é suficiente para concluir um diagnóstico positivo da presença de células tumorais ou da predisposição do paciente para desenvolver células tumorais, acredita-se que a detecção da combinação, na amostra tumoral, entre E76 e outra mutação Ras ou ras e, principalmente, uma mutação G12, seja indicativa não apenas da presença de células tumorais ou da predisposição para desenvolver células tumorais, mas igualmente de um tumor que se acredita ser mais agressivo (p.ex., apresenta crescimento tumoral de volume maior ou mais rápido, maior invasividade, maior propensão a crescimento metastático, maior prognóstico de resultado insuficiente), comparado à detecção da mutação E76 somente, à detecção da outra mutação Ras somente (p.ex., uma mutação G12) e/ou a nenhuma detecção de mutação.
De acordo com a presente invenção, um "nível basal" é um nível de controle - e, em algumas configurações (mas não todas as configurações, dependendo do método), um nível normal - da expressão ou atividade do biomarcador (p.ex., Ras ou ras) em relação ao qual é possível comparar um nível de teste da expressão ou atividade do biomarcador (i.e., na amostra de teste). O termo "controle negativo" empregado em relação a um nível basal de expressão ou atividade biológica de biomarcador refere-se, em geral, a um nível basal estabelecido numa amostra do paciente ou de uma população de indivíduos que se acredita serem normais (i.e., não portadores de tumor, não portadores de câncer, não portadores de transformação neoplásica, não apresentando a presença de células tumorais ou crescimento celular inadequado). Em uma configuração, pode-se estabelecer um nível basal ou controle a partir de um tecido não-envolvido do paciente que estiver sendo testado (i.e., tecido que se acredita não ser afetado pelo câncer), de forma que a situação do tumor (carga, crescimento, volume tumoral, etc.) de um paciente possa ser monitorada ao longo do tempo e/ou de forma que a eficácia de um certo protocolo terapêutico possa ser avaliada ao longo do tempo. Os métodos para a detecção da expressão ou atividade biológica do biomarcador Ras encontram-se descritos detalhadamente acima. Um "controle positivo" pode abranger qualquer controle que confirme a detecção positiva do biomarcador, tal como um nível de expressão ou atividade do marcador estabelecido para um tumor confirmado, ou qualquer outros indicador positivo do parâmetro que estiver sendo avaliado em relação ao biomarcador. Quando for utilizado um valor basal ou de controle, um especialista na matéria reconhecerá que não é necessário que tais valores sejam estabelecidos para todo ensaio que estiver sendo realizado; em vez disso, pode-se estabelecer um valor basal ou de controle recorrendo-se a uma forma de armazenagem de informações relativas a um nível basal de expressão de biomarcador determinado previamente para uma dada amostra de controle, como um nível basal estabelecido por quaisquer dos métodos descritos acima. Tal forma de armazenagem de informações pode compreender, por exemplo, uma tabela de referência, lista ou arquivo eletrônico de dados populacionais ou individuais relativos à expressão de biomarcador "saudável" (controle negativo) ou tumor-positivo (incluindo tumores estadiados); um formulário médico para registro de dados de avaliações anteriores do paciente; ou qualquer outra fonte de dados relativos à expressão basal de biomarcador que seja útil ao diagnóstico do paciente (listagem não exaustiva).
Depois que a presença ou ausência das proteínas Ras mutadas ou de gene ou RNA codificando as mesmas for detectada na amostra a ser avaliada para células tumorais, pode-se realizar a última etapa - que consiste em fazer um diagnóstico, monitorar ou estadiar o paciente - e prescrever-se um tratamento ou protocolo de prevenção ou ainda um protocolo de rastreamento. Além disso, se for detectada a presença da mutação Ras, o paciente pode ser avaliado por outros métodos diagnósticos de câncer a fim de confirmar o diagnóstico inicial.
Em uma configuração da invenção, o método diagnóstico pode ser empregado para determinar o diagnóstico de um paciente, o prognóstico de um paciente e também para determinar o protocolo de terapia apropriado e prever o sucesso ou resultado do paciente com um determinado protocolo de câncer. Por exemplo, se se suspeita que um paciente tenha um câncer ou esteja em risco de desenvolver um câncer, o método pode ser empregado para determinar se o paciente tem uma mutação Ras associada a câncer e, assim, diagnosticar um câncer. Ademais, se se acredita que o paciente tenha um tumor, é possível que a identificação da mutação Ras - comparada à identificação de outra mutação ou, pelo menos, à não-identificação de uma mutação Ras - indique ao médico quão agressivo provavelmente seja o tumor do paciente, possibilitando assim um prognóstico mais específico do câncer. Conforme exposto anteriormente, sem estarem limitados pela teoria, os presentes inventores acreditam que a detecção da combinação de uma mutação Ras E76 em combinação com uma mutação G12 seja preditiva de um tumor mais agressivo e, conseqüentemente, é possível que o prognóstico do paciente seja pior do que o de um paciente que não apresente tal combinação, e/ou que o paciente portador de tal combinação possa ser tratado de forma mais agressiva do que um paciente que não seja portador de tal combinação de mutações. Enfim, a identificação de uma mutação Ras ou combinação de mutações no tumor do paciente pode ser utilizada para desenvolver um protocolo específico de terapia do câncer, com base no conhecimento de como esta mutação em particular afeta a atividade celular, além de poder ser utilizada para prever a resposta ou suscetibilidade do paciente a um determinado tipo de terapia.
A presente invenção também compreende um kit que utiliza os métodos diagnósticos da presente invenção. Preferivelmente, o kit contém qualquer reagente útil à detecção da presença ou ausência da mutação Ras (proteína) ou ras (ácido nucléico) de acordo com a presente invenção em uma amostra de teste e, preferivelmente, compreende uma sonda de oligonucleotídeos, primers de PCR, ou um anticorpo, peptídeo de ligação ao antígeno ou aptâmero que se ligam ao biomarcador (i.e., o gene ras mutado, RNA1 DNA complementar ou proteína codificada pelos mesmos). O kit pode conter qualquer reagente necessário à realização de um método diagnóstico previsto neste documento. O kit pode conter também reagentes para a detecção de outros biomarcadores de câncer, como as mutações Ras previamente descritas, ou qualquer outro alvo adequado para o diagnóstico de câncer, mesmo para cânceres que tenham causas ou recebam contribuições não associadas à mutação Ras aqui descrita. Os reagentes (p.ex., sonda, anticorpo, aptâmero) podem ser conjugados em outra unidade - por exemplo, um marcador - ou imobilizados em um carreador sólido (substrato). Em uma configuração, o kit pode conter um reagente para a detecção de um biomarcador de controle característico de um tipo de célula presente na amostra de teste. É possível que o reagente esteja presente em forma livre ou imobilizado em um substrato, tal como uma placa de plástico, uma plaqueta para análise de microsséries, um tubo de ensaio, um bastão de teste e assim por diante. O kit pode conter também reagentes adequados para a detecção do reagente e/ou para a rotulagem de controles positivos ou negativos, soluções de lavagem, soluções-tampão de diluição e assemelhados. O kit também pode conter um conjunto de instruções escritas para uso do kit e interpretação dos resultados. Em uma configuração, o kit é formulado para ser um ensaio de alto rendimento. Mais especificamente, de acordo com a presente invenção, um reagente para detectar presença, expressão ou atividade biológica de biomarcador pode ser qualquer reagente adequado que possa ser utilizado em um método de detecção da presença, expressão ou atividade biológica do biomarcador Ras, conforme descrito previamente neste documento. Tais reagentes compreendem, de modo não exaustivo: uma sonda que hibridiza sob condições rigorosas de hibridização com uma molécula de ácido nucléico codificando o biomarcador ou um fragmento do mesmo; primers para a amplificação de ácidos nucléicos codificando o biomarcador ou um fragmento do mesmo; um aptâmero que se liga especificamente a um sítio conformacionalmente distinto na molécula-alvo (i.e., capaz de distinguir a Ras contendo uma mutação E76, inclusive uma mutação E76 em particular, como E76G, E76K ou E76Q, de uma Ras que não contenha tal mutação); e/ou um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou outro peptídeo de ligação ao antígeno que se liga seletivamente ao biomarcador. Os anticorpos (compreendendo, de modo não exaustivo, anticorpos policlonais e monoclonais, anticorpos bivalentes e monovalentes, anticorpos biespecíficos ou poliespecíficos, soro sangüíneo contendo tais anticorpos, anticorpos que foram purificados em graus variados e quaisquer equivalentes funcionais de anticorpos totais) que se ligam seletivamente a uma proteína Ras mutada na amostra também podem ser produzidos usando-se informações disponíveis na matéria (descritas acima).
Em uma configuração, um reagente para detecção de um biomarcador de controle característico do tipo de célula presente na amostra pode ser, em geral, qualquer tipo de reagente que possa ser utilizado num método de detecção, numa amostra, da presença de um marcador conhecido (em nível de ácidos nucléicos ou proteínas), como através de um método para detectar a presença de um biomarcador descrito previamente neste documento. Especificamente, o reagente caracteriza-se pelo fato de identificar um marcador específico ao tipo de célula que está sendo analisado e de identificar positivamente o tipo de célula. Por exemplo, em um ensaio de tumor de mama, é desejável rastrear as células epiteliais mamárias quanto ao nível de expressão e/ou atividade biológica do biomarcador. Portanto, o reagente para detecção de um marcador de controle identifica um marcador que seja característico de uma célula epitelial e, preferivelmente, uma célula epitelial mamária, de modo que a célula seja distinguida de outros tipos de células, como os fibroblastos. Tal reagente aumenta a acurácia e a especificidade do ensaio da presente invenção. Tal reagente para a detecção de um marcador de controle compreende, de modo não exaustivo: uma sonda que hibridiza sob condições rigorosas de hibridização com uma molécula de ácido nucléico codificando um marcador protéico; primers de PCR que amplificam tal molécula de ácido nucléico; um aptâmero que se liga especificamente a um sítio conformacionalmente distinto na molécula-alvo; e/ou um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou peptídeo de ligação ao antígeno que se liga seletivamente ao marcador de controle na amostra. As seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos que para muitos marcadores de células são conhecidas na matéria e podem ser utilizadas para produzir tais reagentes de detecção.
O reagente para a detecção de um biomarcador Ras e/ou marcador de controle do kit de ensaio da presente invenção pode ser conjugado a um rótulo detectável ou marcador detectável. Tal rótulo pode ser qualquer rótulo que permita a identificação dos reagentes utilizados para detectar o biomarcador ou marcador de controle e compreende, de modo não exaustivo, qualquer composição ou rótulo detectável por meio espectroscópico, fotoquímico, bioquímico, imunoquímico, elétrico, óptico ou químico. Os rótulos úteis à presente invenção compreendem biotina usada como corante com conjugado rotulado de estreptavidina, partículas magnéticas (p.ex., Dynabeads®), corantes fluorescentes (p.ex., fluoresceína, texas red, rodamina, proteína fluorescente verde, e assemelhados), radioisótopos (p.ex., 3H, 1251, 35S, 14C ou 32P), enzimas (p.ex., peroxidase do rábano silvestre, fosfatase alcalina e outras, comumente usadas em ELISA) e marcadores colorimétricos, como ouro coloidal e partículas coloridas vítreas ou plásticas (p.ex., poliestireno, polipropileno, látex, etc.).
Além disso, o reagente de detecção do kit de ensaio da presente invenção pode ser imobilizado em um substrato. Tal substrato pode compreender qualquer substrato adequado para a imobilização de um reagente de detecção, como os que seriam utilizados em quaisquer dos métodos de detecção anteriormente descritos. De modo breve, um substrato adequado para a imobilização de um reagente de detecção compreende qualquer suporte sólido, como qualquer suporte sólido orgânico, biopolimérico ou inorgânico, que possa formar uma ligação com o reagente de detecção sem afetar significativamente a atividade e/ou a capacidade do reagente de detectar a molécula-alvo desejada. Entre os suportes orgânicos exemplares estão polímeros como poliestireno, náilon, resinas de fenol-formaldeído, copolímeros acrílicos (p.ex., poliacrilamida), células totais intactas estabilizadas e homogenatos brutos estabilizados de membrana/célula total. Entre os suportes biopoliméricos exemplares estão a celulose, os géis de polidextrano (p.ex., Sephadex®), agarose, colágeno e chitina. Entre os suportes inorgânicos exemplares estão as partículas vítreas (porosas e não-porosas), aço inoxidável, óxidos metálicos (p.ex., cerâmicas porosas como Zr02, Ti02, AI203, e NiO) e areia.
Métodos de Seleção da Invenção Uma configuração da presente invenção diz
respeito a métodos para a identificação de compostos úteis para proteger pacientes contra câncer, compostos estes que comportam um gene Ras mutante ou que expressam uma proteína Ras contendo a mutação E76 aqui descrita, ou ainda uma combinação da mutação E76 com outra mutação Ras, como a G12. O método compreende o uso do peptídeo ou proteína Ras E76, ou de uma molécula de ácido nucléico codificando tal peptídeo ou proteína, como alvo em um ensaio para rastrear e selecionar um composto químico e/ou um composto biológico com atividade terapêutica antitumoral, com base na capacidade do composto de regular negativamente a expressão do gene ras mutado, de inibir a atividade do produto deste gene, ou de reverter ou compensar a atividade biológica da proteína Ras mutada, tal como um composto que aciona a hidrólise de GTP da Ras apesar da presença da mutação aqui identificada. Em uma configuração, o método compreende a utilização como alvo de um peptídeo ou proteína Ras, ou de uma molécula de ácido nucléico codificando tal peptídeo ou proteína, caracterizando-se pelo fato de que o peptídeo ou proteína Ras possui uma mutação em qualquer uma ou mais das posições 73, 74, 75, 77 ou 78, ou quaisquer das combinações de mutações Ras descritas acima e, especialmente, qualquer combinação entre uma mutação na posição 12 e/ou 13 e uma mutação na posição 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 e/ou 78.
Por exemplo, um composto candidato para
tal identificação inclui um composto que acione a atividade da GTPase de modo que a GTP ligada à Ras mutante seja hidrolisada para GDP apesar da presença da mutação, por meio do que a atividade "constitutiva" da Ras seja desativada, extinguindo, assim, os sinais desregulados para proliferação celular. As referências feitas neste documento à inibição de um alvo podem referir-se tanto à inibição da expressão de gene-alvo quanto à inibição da tradução e/ou atividade do produto correspondente desta expressão (proteína), ou a ambos os tipos de inibição. Os compostos que modificam a atividade biológica de um alvo - a exemplo dos compostos mencionados acima, que acionam ou iniciam a hidrólise de GTP da Ras mutada da invenção - também estão no escopo do método de identificação. Tais compostos podem ser chamados, neste documento, como compostos terapêuticos. Em uma configuração, os compostos a
serem identificados englobam compostos que regulam, adaptam ou mimetizam Ras-GAP, caracterizando-se pelo fato de que a Ras- GAP regulada, adaptada ou mimetizada tem a capacidade de ativar a hidrólise de GTP associada a quaisquer das proteínas Ras mutantes aqui descritas (p.ex., uma mutante Ras E76, qualquer mutante Ras 73-78 ou quaisquer das combinações mutantes aqui descritas), mas não ativa a hidrólise de GTP associada à Ras selvagem. Neste aspecto, as mutações originais descritas neste documento são utilizadas para identificar compostos que podem on
restaurar a função da hidrólise de GTP da Ras nas células (p.ex., células tumorais) que abrigam uma ou mais mutações Ras aqui descritas, interrompendo, assim, a proliferação descontrolada e as metástases destas células, ao mesmo tempo em as células "normais" (células não-cancerosas) permanecem intactas. Tal estratégia permite a identificação de compostos direcionados às células tumorais que não causam problemas relacionados à interrupção das funções celulares normais da Ras nas células não- tumorais. Nesta configuração, os compostos são identificados através da seleção de compostos que restauram a hidrólise de GTP em células que expressam (naturalmente ou por métodos recombinantes) um alvo Ras mutado, mas não provocam a hidrólise de GTP em células que expressam Ras não-mutada (selvagem).
Em um aspecto desta configuração, os compostos terapêuticos são identificados através da exposição de uma proteína-alvo (p.ex., Ras E76G) da presente invenção (ou uma célula que expressa a proteína de modo natural ou recombinante) a um composto candidato, mensurando-se a capacidade do composto de inibir (reduzir, diminuir, bloquear) uma atividade biológica da proteína ou, mais especificamente, a capacidade da proteína de contribuir para o crescimento celular desenfreado ou proliferação de uma célula. Em uma configuração, um composto candidato é identificado através de sua capacidade de iniciar ou acionar a hidrólise de GTP e de efetivamente neutralizar ou compensar a presença de uma Ras mutante da presente invenção. Os métodos utilizados para mensurar a hidrólise de GTP e a atividade da GTPase são amplamente conhecidos.
Em outro aspecto desta configuração, uma linhagem celular que naturalmente expresse o gene ras mutante ou
que tenha sido transfectada com o gene ou outra molécula de ácido nucléico recombinante codificando a proteína Ras mutada é incubada com vários compostos - também chamados compostos candidatos, compostos teste ou compostos reguladores hipotéticos. Uma redução da expressão do gene ras mutado ou uma modificação nas atividades de seu produto codificado podem ser utilizadas para identificar um composto terapêutico. Por exemplo, pode-se realizar o contato entre a célula que expressa a Ras mutante e o composto candidato, identificando-se os compostos que acionam a atividade da GTPase1 conforme expostos anteriormente. É possível que tais compostos sejam identificados por sua capacidade de se ligar à Ras e ativar a GTPase em condições sob as quais a Ras-GAP endógena esteja impedida de se ligar à Ras pelas mutações Ras1 e/ou possam permitir a liberação do γ-fosfato da Ras GTP quando a hidrólise é iniciada. Dito de outra forma, o ensaio procura detectar compostos que superem os efeitos da mutação Ras ou da combinação de mutações. Alternativamente, vários ensaios semelhantes, do tipo livre de células, podem ser empregados para identificar tais compostos terapêuticos. Os compostos terapêuticos identificados desta forma podem então ser testados novamente, se se desejar, usando-se outros ensaios, a fim de confirmar suas atividades. Preferivelmente, seleciona-se um composto que não acione também a hidrólise de GTP em células que expressam Ras selvagem (que não expressam uma Ras mutada).
Em uma configuração desta invenção, os inibidores do crescimento descontrolado de células são identificados expondo-se um gene-alvo ou porção do mesmo (i.e., um gene ras E76G mutado) a um composto teste, mensurando-se a expressão de um alvo (Ras E76G) e, finalmente, selecionando um composto que regula negativamente (reduz, diminui, inibe, bloqueia) a expressão ou modifica a atividade do alvo. Por exemplo, o suposto inibidor pode ser exposto a uma célula que expressa o gene-alvo (de modo endógeno ou recombinante). Uma célula preferida a ser utilizada em um ensaio inclui uma célula de mamífero que expressa o gene alvo naturalmente ou que foi transformada com um forma recombinante do gene-alvo, tal como uma molécula de ácido nucléico recombinante contendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica a proteína-alvo ou um fragmento útil da mesma. Os métodos empregados para determinar os níveis de expressão de um gene são amplamente conhecidos. Os métodos empregados no desenho e identificação de moléculas de ácido nucléico que inibem a expressão de genes ou as atividades biológicas das proteínas codificadas pelos mesmos são amplamente conhecidos.
Em uma configuração da invenção, os compostos terapêuticos são identificados expondo-se um alvo (p.ex., Ras-GTP E76G) a um composto candidato, mensurando-se a ligação do composto candidato ao alvo e, finalmente, selecionando um composto que se liga ao alvo na concentração, afinidade ou avidez desejada. Em uma configuração preferida, o ensaio é realizado sob condições propícias à promoção da interação ou ligação do composto ao alvo. Um especialista na matéria é capaz de determinar tais condições com base no alvo e no compostos utilizados no ensaio. Em uma configuração, uma máquina BIAcore pode ser utilizada para determinar a ligação constante de um complexo formado pela proteína-alvo (uma proteína codificada pelo gene-alvo) e um Iigante natural na 132/153 Xs^ presença e na ausência do composto candidato. Por exemplo, a proteína-alvo ou o fragmento Iigante da mesma pode ser imobilizado em um substrato. Um Iigante natural ou sintético é posto em contato com o substrato a fim de formar um complexo. A constante de dissociação do complexo pode ser determinada monitorando-se as alterações no índice de refração em função do tempo, enquanto a solução-tampão passa sobre o chip (O1Shannessy et al. Anal. Biochem. 212:457-468 (1993); Schuster et al., Nature 365:343-347 (1993)). A realização de contato entre o composto candidato e o complexo em diversas concentrações e o monitoramento da função de resposta (p.ex., a alteração no índice de refração em função do tempo) possibilitam que a constante de dissociação do complexo seja determinada na presença do composto teste, além de indicar se o composto candidato é um inibidor ou um agonista do complexo. Por outro lado, o composto candidato pode ser posto em contato com a proteína-alvo imobilizada ao mesmo tempo em que o ligante, a fim de verificar se o composto candidato inibe ou estabiliza a ligação do ligante à proteína-alvo.
Os compostos a serem selecionados através
dos métodos da invenção abrangem compostos orgânicos conhecidos, tais como produtos de bibliotecas de peptídeos, moléculas de ácido nucléico (p.ex., RNAi, ribozimas, aptâmeros, anti-senso), anticorpos e produtos de bibliotecas combinatórias químicas. Os compostos também podem ser identificados usando- se dependendo da estrutura do produto de um gene, sozinho ou formando um complexo com outro componente (p.ex., Ras mutante com GTP). Tais métodos, conhecidos por especialistas na matéria, implicam o uso de programas de software de tratamento de ν
imagens tridimensionais. A Fig. 4 ilustra as alterações conformacionais tridimensionais que ocorrem na Ras em virtude de duas mutações Ras conhecidas, por exemplo. Vários métodos de planejamento de fármacos, que ajudam a planejar ou selecionar miméticos ou outros compostos terapêuticos úteis à presente invenção, são revelados em Maulik et ai., 1997, Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss1 Inc., cujo inteiro teor é incorporado a este documento por citação.
Conforme empregados neste documento, os termos "composto teste", "composto de inibição hipotético" ou "composto reguladores hipotético" se referem a compostos cuja atividade reguladora em certo processo é desconhecida ou não foi avaliada anteriormente. Assim sendo, o termo "identificar" - usado em relação a métodos para identificar compostos - destina-se a abranger todos os compostos cuja utilidade como composto regulador para os fins de inibição do crescimento celular é determinada através de um método da presente invenção.
As condições sob as quais uma célula, Iisato celular, molécula de ácido nucléico ou proteína da presente invenção são expostos ou postos em contato com um composto regulador hipotético, como por mistura, são quaisquer condições adequadas de ensaio ou cultura. No caso de um ensaio à base de células, tais condições compreendem um meio eficaz no qual a célula possa ser cultivada ou no qual o lisato celular possa ser avaliado na presença e na ausência de um composto regulador hipotético. As células da presente invenção podem ser cultivadas em uma série de recipientes, os quais incluem, de modo não exaustivo, frascos para cultura de tecidos, tubos de ensaio, placas para microtitulação e placas petri. A cultura é realizada em temperatura, pH e teor de dióxido de carbono apropriados para a célula. Tais condições de cultura também são conhecidas entre os especialistas na matéria. As células são postas em contato com um composto regulador hipotético sob condições que levam em consideração o número de células por recipiente de mistura, a concentração do(s) composto(s) regulador(es) hipotético(s) administrado(s) à célula, o tempo de incubação do composto regulador hipotético com a célula e a concentração de composto administrado à célula. A determinação de protocolos eficazes pode ser realizada pelos especialistas na matéria com base em variáveis tais como o tamanho do recipiente, o volume de líquido no recipiente, condições reconhecidas como sendo adequadas para a cultura do tipo das células usadas no ensaio e a composição química do composto regulador hipotético (i.e., tamanho, carga, etc.) que está sendo testado. Uma quantidade preferida de composto(s) regulador(es) hipotético(s) pode compreender entre cerca de 1 nM e cerca de 10 mM de composto(s) regulador(es) hipotético(s) por poço de uma placa com 96 poços.
Conforme empregado neste documento, o termo "expressão" - quando associado à detecção da expressão de um alvo da presente invenção - pode se referir à detecção da transcrição do gene-alvo e/ou à detecção da tradução da proteína- alvo codificada pelo gene-alvo. "Detectar a expressão de um alvo" refere-se ao ato de determinar ativamente se um alvo é ou não expresso, o que pode englobar a determinação de se a expressão do alvo é regulada positivamente em comparação com um controle, se é regulada negativamente em comparação com um controle ou se permanece inalterada em comparação com um controle. Portanto, a etapa que consiste em detectar a expressão não exige que a expressão do gene seja realmente regulada positiva ou negativamente, já que também pode incluir a detecção de que a expressão do alvo não se alterou (i.e., não detectar nenhuma expressão do alvo ou nenhuma alteração na expressão do alvo). A expressão de transcritos e/ou proteínas é mensurada através de qualquer um de uma série de métodos conhecidos entre os especialistas. Para a expressão de RNA1 os métodos compreendem, de modo não exaustivo: extração do RNA mensageiro celular e northern blot usando sondas rotuladas que se hibridizam com os transcritos que codificam todo ou parte de um ou mais genes desta invenção; amplificação do RNA mensageiro expresso por um ou mais genes desta invenção usando primers específicos ao gene, reação em cadeia da polimerase (PCR) e reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT- PCR), seguida por detecção quantitativa do produto por qualquer um de uma série de meios; extração do RNA total das células, as quais são então rotuladas e usadas como sondas de DNA complementar ou oligonucleotídeos codificando todo ou parte dos genes desta invenção, preparadas em quaisquer de uma série de superfícies; hibridização in situ; detecção de um gene repórter. Quando empregado no contexto da quantificação dos níveis de transcrição de um gene, o termo "quantificar" pode se referir à quantificação absoluta ou à quantificação relativa. É possível realizar a quantificação absoluta através da inclusão de concentração(ões) conhecida(s) de um ou mais ácidos nucléicos- alvo, indicando-se a intensidade de hibridização dos desconhecidos com os ácidos nucléicos-alvo conhecidos (p.ex., através da geração de uma curva padrão). A quantificação relativa, por sua vez, pode ser realizada através da comparação dos sinais de hibridização de dois ou mais genes, ou de dois ou mais tratamentos, a fim de quantificar as alterações na intensidade de hibridização e, por dedução, o nível de transcrição.
Em uma configuração preferida, a expressão do gene-alvo é mensurada pela reação em cadeia da polimerase. Em outra configuração, a expressão do gene-alvo é mensurada por análise em gel de poliacrilamida, cromatografia ou espectroscopia.
Em outra configuração preferida, a expressão do gene-alvo é mensurada através da medição da produção da proteína codificada (medindo-se a tradução da proteína). A medição da tradução de uma proteína pode ser feita através de qualquer método adequado para detectar e/ou mensurar proteínas a partir de uma célula ou extrato de células. Tais métodos incluem, de modo não exaustivo, immunoblot (p.ex., western blot), ensaio imunoadsorvente enzima-associado (ELISA), radioimunoensaio, imunoprecipitação, imunoistoquímica, imunofluorescência, separação de células ativadas por fluorescência (FACS) e microscopia de fluorescência. Os métodos especialmente preferidos para a detecção de proteínas incluem quaisquer ensaios realizados a partir de uma única célula, entre eles imunoistoquímica e imunofluorescência. Por exemplo, pode-se utilizar um agente de detecção, como um anticorpo que reconhece especificamente (liga-se seletivamente) a proteína codificada pelo gene. Tais métodos são amplamente conhecidos. Os compostos candidatos identificados ou
desenhados através dos métodos descritos anteriormente podem ser sintetizados usando-se técnicas conhecidas entre os especialistas na matéria, que dependem do tipo do composto. As técnicas de síntese para a produção de compostos não-protéicos, inclusive compostos orgânicos e inorgânicos, também são amplamente conhecidas. Por exemplo, para os peptídeos menores, preferem-se os métodos de síntese química. Estes métodos, por exemplo, incluem técnicas químicas amplamente conhecidas, como a síntese de peptídeos em fase sólida ou em solução e a semi- síntese em solução começando com fragmentos de proteínas acoplados por métodos convencionais de solução. Tais métodos são amplamente conhecidos e podem ser encontrados em textos gerais e em artigos da área, tais como: Merrifield, 1997, Methods EnzymoL 289:3-13; Wade et al., 1993, Australas BiotechnoL 3(6):332-336; Wong et al., 1991, Experientia 47(11-12): 1123-1129; Carey et al., 1991, Ciba Found Symp. 158:187-203; Plaue et al., 1990, Biologicals 18(3):147-157; Bodanszky, 1985, Int J, Pept Protein Res. 25(5):449-474; ou H. Dugas and C. Penney, BIOORGANIC CHEMISTRY, (1981), páginas 54-92 - todos incorporados por citação em seu inteiro teor a este documento. Por exemplo, é possível sintetizar peptídeos através da técnica em fase sólida usando-se um sintetizador de peptídeos disponível comercialmente e ciclos de síntese fornecidos pelo fabricante. Um especialista na matéria reconhece que a síntese em fase sólida também poderia ser realizada usando-se a estratégia Fmoc [9- fluorenilmetoxicarbonila] e uma solução de clivagem de ácido trifluoracético/depurador. Além disso, um composto que seja uma proteína ou peptídeo pode ser produzido usando-se a tecnologia de DNA recombinante e métodos comuns na área, sobretudo quando se deseja obter grandes quantidades de uma proteína.
Todos os compostos identificados por estes métodos podem ser empregados na preparação de um medicamento destinado ao tratamento ou à prevenção de câncer, bem como em outros métodos ou usos descritos neste documento.
Os resultados experimentais a seguir são apresentados para fins de ilustração e não se destinam a limitar o escopo da invenção.
Exemplos
Exemplo 1
O exemplo a seguir descreve a identificação de uma nova mutação Ras em tumores avaliados durante um estudo fase I de imunoterapia com leveduras totais mortas que expressam proteínas Ras mutadas (Tarmogens).
Materiais e Métodos (Utilizados nos
Exemplos 1 e 2):
Pacientes. 149 pacientes com câncer colorretal, pancreático ou pulmonar de células não pequenas foram incluídos em um estudo fase I (Globelmmune, Inc.) de imunoterapia molecular alvo-específica com leveduras totais mortas que expressam proteínas Ras mutadas (Tarmogens). Amostras de biópsias de tumores de pacientes foram submetidas à genotipagem para mutações ras a fim de identificar os indivíduos portadores de mutações associadas ao produto que seriam incluídos no estudo de imunoterapia.
Amostras de tecidos e extração do DNA genômico. Uma amostra tumoral de cada paciente foi recebida na forma blocos de parafina ou slides montados com seções cortadas a partir do bloco de parafina. As células tumorais foram isoladas por MCL (microdissecção por captura a laser) ou dissecção microscópica desgastando secções coradas (HistoGene Staining Solution, Arcturus1 CA) com espessura de 6-8pm; o DNA genômico destas células tumorais foi extraído através de tratamento com SDS-proteinase K e digestão com RNase A, seguido de precipitação com isopropanol.
PCR e seqüenciamento do gene ras. Realizou-se a técnica de nested-PCR para os éxons 2 e 3 dos genes K-ras, N-ras e H-ras usando um kit "Platinum Taq DNA polimerase de alta fidelidade" (Invitrogen1 CA). Os 25 μΙ_ da mistura de reação contêm 100 ng de DNA molde, tampão 1 X PCR, 50-100 pmol de MgS04, 5 nmol de dNTPs, 10 pmol de cada primer externo e 2,5 unidades de Taq DNA polimerase de alta fidelidade. Iniciou-se o ciclo térmico com desnaturação a 94 0C por 5 min, seguida de 35 ciclos de três etapas a 94 0C por 30 s, 55 0C por 30 s e 68 0C por 50 s e uma incubação final por 10 min a 68 0C. As reações internas foram realizadas em um total de misturas de 50 μ!_ com 1 μΙ_ dos produtos externos da PCR como molde e 20 pmol de cada primer interno. Foram utilizados os seguintes primers:
Primer direto externo no éxon 2 do K-ras: 5'-AGGTGAGTTTGTATTAAAAG-3' (SEQ ID
N°. 16);
Primer reverso externo no éxon 2 do K-ras: 5'-TCATGAAAATGGTCAGAG-3' (SEQ ID
N°. 17);
Primer direto interno no éxon 2 do K-ras: 5'-
TAATACGACTCACTATAGGGTGTGTGACATGTTCTAAT-3' (SEQ ID N0. 18);
Primer reverso interno no éxon 2 do K-ras 5'-
ATTTAGGTGACACTATAGAAGAATGGTCCTGCACCAGTAA-3' (SEQ ID N°. 19); Primer direto externo no éxon 3 do K-ras: 5'-TGAGTTGTATATAACACC~3' (SEQ ID
N°. 20);
Primer reverso externo no éxon 3 do K-ras: 5'-GGCATTAGCAAAGACTCA-3' (SEQ ID
N°. 21);
Primer direto interno no éxon 3 do K-ras: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG TGCACTGTAATAATCCAG-3' (SEQ ID N0. 22); Primer reverso interno no éxon 3 do K-ras:
5'-ATTTAGGTGACACTATAGAA ATTACTCCTTAATGTCAGC-3' (SEQ ID N°. 23);
Primer direto externo no éxon 2 do N-ras: 5'- ATGGAAGGTCACACTAGGG-3' (SEQ ID
N°. 24);
Primer reverso externo no éxon 2 do N-ras: 5'- AAGATGATCCGACAAGTG-3' (SEQ ID
N°. 25);
Primer direto interno no éxon 2 do N-ras: 5'-
TAATACGACTCACTATAGGGAGTACTGTAGATGTGGCTCG-3' (SEQ ID N0. 26);
Primer reverso interno no éxon 2 do N-ras: 5'-
ATTTAGGTGACACTATAGAAGAGACAGGATCAGGTCAGCG-3' (SEQ ID N°. 27);
Primer direto externo no éxon 3 do N-ras: 5'- TGGCAATAGCATTGCATTC-3' (SEQ ID
N°. 28); Primer reverso externo no éxon 3 do N-ras: 5'- GGTAACCTCATTTCCCCA-3'(SEQ ID
N°. 29);
Primer direto interno no éxon 3 do N-ras: 5'-
TAATACGACTCACTATAGGGTTGAACTTCCCTCCCTCCCTG- 3'(SEQ ID N°. 30);
Primer reverso interno no éxon 3 do N-ras: 5'-
ATTTAGGTGACACTATAGAATTCAGAACACAAAGATCA-3'(SEQ ID N°. 31);
Primer direto externo no éxon 2 do H-ras: 5'- TTGGCAGGTGGGGCAGGAGA-3' (SEQ
ID N°. 32),
Primer reverso externo no éxon 2 do H-ras:
5-CCTATCCTGGCTGTGTCC-3' (SEQ ID
N°. 33),
Primer direto interno no éxon 2 do H-ras: 5'-
TAATACGACTCACTATAGGGAGGAGACCCTGTAGGAG-3' (SEQ ID N°. 34),
Primer reverso interno no éxon 2 do H-ras: 5'-
ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGCCCGCAGCAGCTGC-3' (SEQ ID N°. 35),
Primer direto externo no éxon 3 do H-ras: 5'-ACCAGGGAGAGGCTGGC-3' (SEQ ID
N°. 36),
Primer reverso externo no éxon 3 do H-ras: Olf
4
5-CTCCCGGGCCAGCCTCAC-3' (SEQ ID
N°. 37),
Primer direto interno no éxon 3 do H-ras: 5TAATACGACTCACTATAGGGTG AACTCC CCCCACGGAAGG-3' (SEQ ID N°. 38), e
Primer reverso interno no éxon 3 do H-ras: 5'-
ATTTAGGTGACACTATAGAAGTTCACCTGTACTGGTGGA-3' (SEQ ID N°. 39).
Todos os primers diretos internos foram
complementados com a seqüência do primer T7 na ponta 5', e todos os primers reversos internos foram complementados com a seqüência do primer SP6 na ponta 5'. Os produtos internos da PCR foram purificados com um kit de extração "QIA quick gel" (Qiagen, CA) após eletroforese em gel de agarose 1,5%. O DNA purificado foi encaminhado ao CU Câncer Center DNA Sequencing & Analysis Core para o seqüenciamento de filamento duplo utilizando os primers T7 e SP6.
Construção de vetores de expressão do gene K-ras murino. O RNA total foi extraído da linhagem celular epitelial E9 do pulmão de camundongos utilizando-se reagente Trizol da Invitrogen (Invitrogen, CA). O DNA complementar do gene K-ras murino foi gerado por transcrição reversa a partir de 2,5 pg de RNA total utilizando-se o primer reverso do m-kras: 5'-
GCTCGGCTGCGGCCGCTCACTACATAACTGTACACCTTGTCCT- 3' (SEQ ID N°. 40) e um kit "SuperScript™ Ill Reverse Transcriptase" (Invitrogen, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, um décimo das alíquotas produzidas foi amplificado por PCR com o primer direto do m-kras:
5'-
GAATTCACCATGGGCACTGAGTATAAACTTGTGGTG-3' (SEQ ID N0. 41) e o primer reverso do m-kras, desenhados para cobrir toda a região codificante do DNA complementar do gene K-ras murino. Os ciclos térmicos foram iniciados com incubação por 5 minutos a 94 0C1 seguida por 35 ciclos de três etapas a 94°C por 25 segundos, 55 0C por 25 segundos e 68 0C por 30 segundos. O produto da PCR foi clonado em vetor pGEM-T (Promega, Wl), de acordo com as instruções do fabricante. Este gene k-ras murino contém a mutação no Q61R; assim, o gene k-ras murino de tipo selvagem e o gene k- ras murino contendo as mutações G12V, E76G, E76K e G12V- E76G foram produzidos por mutagênese sítio-dirigida e clonados no vetor de expressão pUP para células de mamíferos nos sítios EcoRI e Notl. Além dos primers reverso e direto do m-kras, foram empregados os seguintes primers:
rasQ6± 5'-TACTCCTCTTGACCTGCTGT-3', (SEQ ID N°. 42) rasG76 5'-AAGAAAGCCCCCCCCAGTTCTC-3'; (SEQ ID N°. 43) rasV 12
5'ACGGAATTCACCATGACTGAGTATAAACTTGTGGTGGTTGGA GCTGTTGGCGTAG-3', (SEQ ID N0. 44)
rasK76 5'-AAGAAAGCCCTTCCCAGTTCTC-3'. (SEQ ID N0. 45)
Cultura celular e transfecção. Células BALB/3T3 foram cultivadas em meio DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 50 U/ml de penicilina e 50 pg/ml de estreptomicina. Os plasmídeos de expressão WT (selvagem), G12V, E76G, E76K e G12V+E76G foram transfectados em células BALB/3T3 utilizando- se o kit "Effectene Transfection Reagent" (Qiagen, CA). As células transfectadas foram selecionadas com G418 e purificadas através da seleção de clones a partir da placa de cultura (tipo selvagem) ou do ágar semi-sólido (G12V, E76G, E76K, G12V+E76G). A expressão dos genes K-ras de tipo selvagem (WT) transfectado ou K-ras mutante foi confirmada por RT-PCR e immunoblot de proteína Ras. O RNA total foi extraído a partir de cada clone de célula transfectada utilizando-se reagente Trizol e o DNA complementar do gene ras foi submetido à amplificação reversa usando-se o kit "SuperScript™ Ill Reverse Transcriptase" (Invitrogen1 CA) e o primer reverso do m-kras; em seguida, o gene ras exógeno foi amplificado por PCR utilizando-se os primers reverso e direto do m- kras no promotor do vetor pUP 5'- TTGGGTCGCGGTTCTTGT-3' (SEQ ID N°. 46). A proteína total foi extraída utilizando-se tampão de Iise RIPA (Upstate, NY) de cada clone de célula transfectada e as proteínas foram resolvidas em gel SDS-PAGE a 12% (Invitrogen, CA) e, em seguida, transferidas para uma membrana de nitrocelulose para a realização de blot com anticorpo anti-Ras (Oncogene, MA) e anticorpo anthGAPDH (Abcam, MA), respectivamente. Teste em ágar semi-sólido. Foram suspensas 5 X 104 células em meio DMEM contendo agarose de baixo ponto de fusão a 0,35% (SeaPIaque agarose, Cambres BioScience Rockland Inc, me) e 10% de soro fetal bovino (SFB)1 revestindo a base de uma camada de agarose de baixo ponto de fusão a 0,5% contendo 10% de SFB. Após um crescimento de 2 a 4 semanas, as colônias foram observadas ou selecionadas em meio líquido DMEM contendo 10% de SFB. Teste de tumorigenicidade. Todos os clones transfectados foram cultivados, colhidos e suspensos em tampão PBS. Foram injetadas 5 X 106 células por via subcutânea em camundongos atímicos Balb/c com idade entre 4 e 6 semanas. As células injetadas foram monitoradas duas vezes por semana durante um período de 30 dias; os tumores foram mensurados e o volume tumoral foi calculado como 3,142 χ (comprimento) χ (largura)2 / 6.
Resultados
Neste estudo, as seqüências de DNA dos
genes K-ras, N-ras e H-ras foram caracterizadas pela presença de mutações associadas a tumores através de amplificação por nested-PCR e seqüenciamento direto dos tumores de 149 indivíduos portadores de câncer pancreático (68% abrigando mutações), colorretal (40% com mutações) ou pulmonar de células não pequenas (9% com mutação) em um estudo fase I de imunoterapia com leveduras totais mortas que expressam proteínas Ras mutadas (Tarmogens). Uma nova mutação no gene ras no códon 76 foi detectada em 24 indivíduos portadores dos três tipos de câncer, sendo que 22 tumores abrigavam a mutação E76G, enquanto as mutações E76K e E76Q foram detectadas em 1 tumor cada uma. Combinações duplas de mutações E76 e nos códons 12 ou 13 foram identificadas em 8 tumores. Consultar as Tabela 1 e 2 e a Fig. 1.
Tabela 1. Sumário de Mutações no Códon 76
Colorretal (85) Pulmonar (33) Pancreático (31) Total (149) K-ras N-ras H-ras K-ras N-ras H-ras K-ras N-ras H-ras E76G 2* 3* 3 1 2 Possível E76G# 5 1 1 4 1 E76K 1 E76Q 1 Total 8 * 1 4* 3 0 2 6 0 1 24 *l)ma amostra apresentou mutação E76G em K-ras e H-ras; #detectado sinal mais fraco para a mutação E76, provavelmente devido à pequena quantidade de células tumorais na amostra da biópsia.
Tabela 2. Sumário de mutações altamente
suscetíveis no gene ras (códons 12, 13 e 61)
10
15
20
25
CD
SL
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CO
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CD
O
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Q
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ο Exemplo 2
O Exemplo a seguir demonstra que as mutações Ras E76 são transformantes e, além disso, que as mutações Ras E76 agem em sinergia com as mutações Ras G12, aumentando a oncogenicidade de um tumor.
As mutações Ras E76G e E76K foram confirmadas como sendo transformantes em estudos não-clínicos. De especial interesse, as mutações ligadas aos códons 76 e 12 resultaram em sinergia de crescimento tumoral. As mutações simples G12V, E76G e E76K ou as mutações duplas G12V-E76G foram introduzidas no gene K-ras murino e, em seguida, transfectadas nos fibroblastos BALB/3T3. As células transfectadas com gene ras abrigando mutações somente em G12V ou E76K ou mutação dupla G12V-E76G formaram colônias em ágar semi-sólido (consultar as Fig. 2A e 2B e a Tabela 3).
Tabela 3. E76 como Mutação Transformante
20
25
Clone (células BALB/3T3 transfectadas com genótipo K-ras) Transcrição do mRNAdo gene ras transfectado (por RT-PCR) Expressão da proteína Ras exógena (western blot) Formação de colônias em ágar semi-sólido Tipo selvagem (WT) + + - G12V + + ++++ G12V + E76G + + +++++ E76G + + - E76K + + ++ pUP (vetor vazio) - - - Balb/3T3 (não- transfectada) As células BALB/3T3 transfectadas com genes K-ras de tipo selvagem ou mutante foram injetadas por via subcutânea (s.c.) em camundongos atímicos BALB/c. As Figs. 3A e 3B são repetições do ensaio. As barras indicam desvios-padrão de 3 camundongos por grupo. A Fig. 3C é um detalhe ampliado do estudo apresentado na Fig. 3A que mostra o crescimento das células individuais E76 mutadas-transfectadas em relação às células BALB/3T3 não transfectadas (tipo selvagem).
As células portadoras de mutações simples E76G ou E76K no gene K-Ras resultaram em crescimento detectável nos camundongos atímicos através da comparação com as células transfectadas com o gene K-Ras selvagem, embora o crescimento tumoral com mutações simples E76 tenha sido significativamente menor do que o das células transfectadas para expressar o gene K-Ras mutado G12V (consultar a Fig. 3C). As células transfectadas com Ras abrigando a mutação dupla G12V+E76G levaram a um crescimento tumoral acelerado, em comparação com as células portadoras de qualquer mutação simples (consultar as Figs. 3A-3C). Exemplo 3
O experimento a seguir descreve uma vacina à base de levedura contendo um veículo tipo levedura e uma proteína de fusão contendo uma mutação Ras E76.
A levedura Saccharomyces cerevisiae foi criada por engenharia genética para expressar uma proteína de fusão Ras mutante de múltiplos domínios sob o controle do promotor induzido por cobre CUP1. A proteína de fusão é um polipeptídeo simples com os seguintes elementos de seqüência fundidos no quadro de leitura, do N-terminal ao C-terminal (a seqüência de aminoácidos da proteína de fusão sendo representada neste documento por SEQ ID N°. 14): 1) a seqüência MADEAP (SEQ ID N°. 1), a fim de conferir estabilidade à proteína heteróloga nascente expressa por levedura durante a cultura celular (posições 1 a 6 da SEQ ID N°. 14); 2) um fragmento de Ras contendo o aminoácido de posição 12 em relação à proteína Ras selvagem, caracterizado pelo fato de a glicina na posição 12 ser substituída por uma cisteína (posições 7-52 da SEQ ID N°. 14; com a mutação na posição 12 estando na posição 17 da SEQ ID N°. 14); 3) um fragmento de Ras contendo o aminoácido de posição 61 em relação à proteína Ras selvagem, caracterizado pelo fato de a glicina na posição 61 ser substituída por uma arginina (posições 53- 91 da SEQ ID N°. 14; com a mutação na posição 61 estando na posição 66 da SEQ ID N°. 14); 4) um fragmento de Ras contendo o aminoácido de posição 12 em relação à proteína Ras selvagem, caracterizado pelo fato de a glicina na posição 12 ser substituída por um aspartato (posições 92-137 da SEQ ID N0. 14; com a mutação na posição 12 estando na posição 102 da SEQ ID N°. 14); 5) um fragmento de Ras contendo o aminoácido de posição 12 em relação à proteína Ras selvagem, caracterizado pelo fato de a glicina na posição 12 ser substituída por uma valina (posições 138- 183 da SEQ ID N°. 14; com a mutação na posição 12 estando na posição 148 da SEQ ID N°. 14); 6) um fragmento de Ras contendo o aminoácido de posição 12 em relação à proteína Ras selvagem, caracterizado pelo fato de a glicina na posição 12 ser substituída por uma arginina (posições 184-229 da SEQ ID N°. 14; com a mutação na posição 12 estando na posição 194 da SEQ ID N°. 14); e 7) um fragmento of Ras contendo o aminoácido de posição 76 em relação à proteína Ras selvagem, caracterizado pelo fato de o glutamato na posição 76 ser substituído por uma glicina (posições 230-275 da SEQ ID N0. 14; com a mutação na posição 76 estando na posição 258 da SEQ ID N°. 14).
Realizou-se crescimento e indução das leveduras que expressam a proteína de fusão Ras1 detectando-se a expressão da proteína.
Estas leveduras foram administradas a camundongos da linhagem A/J nos quais 25-50 tumores de pulmão foram espontaneamente induzidos por exposição à uretana, a qual desencadeia mutações Ras no códon 61 (80-90% dos tumores) e no códon 12 (~10% dos tumores), ou tumores que surgem independentemente de mutações Ras (<10% dos tumores). A administração das vacinas foi realizada por via subcutânea nos parâmetros de 2 ou 5 semanas após a indução por uretana. A vacina reduziu a carga tumoral nos camundongos de maneira estatisticamente significativa, em comparação com camundongos que não receberam vacina, indicando que a vacina à base de leveduras é capaz de produzir uma resposta imune antitumoral que tem como alvo os tumores que abrigam pelo menos uma das mutações codificadas pela construção da proteína de fusão.
Em outro experimento realizado para testar a indução de uma resposta imune a Ras abrigando uma mutação na posição 76, estas leveduras foram administradas a camundongos nos quais os tumores foram ou estavam para ser iniciados, caracterizando-se pelo fato de que as células tumorais haviam sido criadas por engenharia genética para expressar Ras contendo uma mutação E76G ou naturalmente expressar Ras contendo uma mutação E76G. Avaliou-se o efeito da vacina sobre a redução da carga tumoral. Além disso, células T dos camundongos foram isoladas e testadas quanto à sua capacidade de destruir células- alvo que expressam uma Ras contendo a mutação E76G (em teste de linfócitos T citotóxicos), e/ou de se proliferarem em resposta a Ras contendo a mutação E76G apresentada por uma célula apresentadora de antígeno. Espera-se que a carga tumoral seja reduzida nos camundongos, comparada à ausência de administração da vacina. De forma similar, espera-se que as células T isoladas destes camundongos sejam capazes de destruir os alvos que expressam a proteína Ras mutada e/ou de se proliferar em resposta à proteína Ras mutada, de modo específico ao antígeno
Exemplo 4
O experimento a seguir descreve uma vacina à base de levedura contendo um veículo tipo levedura e uma proteína de fusão contendo uma mutação Ras E76. Uma levedura Saccharomyces cerevisiae foi
criada por engenharia genética para expressar uma proteína de fusão Ras mutante de dois domínios sob o controle de um promotor. A proteína de fusão é um polipeptídeo simples com os seguintes elementos de seqüência fundidos no quadro de leitura, do N-terminal ao C-terminal (a seqüência de aminoácidos da proteína de fusão sendo representada neste documento por SEQ ID N°. 15): 1) a seqüência MADEAP (SEQ ID N°. 1), a fim de conferir estabilidade à proteína heteróloga nascente expressa por levedura durante a cultura celular (posições 1 a 6 da SEQ ID N°. 15); 2) um fragmento de Ras contendo o aminoácido de posição 12 em relação a uma proteína Ras selvagem, caracterizado pelo fato de a glicina na posição 12 ser substituída por uma arginina (posições 7-52 da SEQ ID N°. 15, com a mutação na posição 12 estando na posição 17 da SEQ ID N°. 15); e 7) um fragmento de Ras contendo o aminoácido de posição 76 contendo o aminoácido de posição 12 em relação a uma proteína Ras selvagem, caracterizado pelo fato de o glutamato na posição 76 ser substituído por uma glicina (posições 53-98 da SEQ ID N°. 15; com a mutação na posição 76 estando na posição 81 da SEQ ID N°. 15).
Realizou-se crescimento e indução das leveduras que expressam a proteína de fusão Ras1 detectando-se a expressão da proteína.
Em um experimento realizado para testar a indução de uma resposta imune a Ras abrigando uma mutação na posição 76, estas leveduras são administradas em camundongos nos quais os tumores foram ou estão para ser iniciados, caracterizando-se pelo fato de as células tumorais terem sido criadas por engenharia genética para expressar Ras contendo uma mutação E76G, ou para expressar naturalmente Ras contendo uma mutação E76G. Avaliou-se o efeito da vacina sobre a redução da carga tumoral. Além disso, células T dos camundongos foram isoladas e testadas quanto à sua capacidade de destruir células- alvo que expressam Ras contendo a mutação E76G (em teste de linfócitos T citotóxicos), e/ou de se proliferarem em resposta ao Ras contendo a mutação E76G apresentada por uma célula apresentadora de antígeno. Espera-se que a carga tumoral seja reduzida nos camundongos, comparada à ausência de administração da vacina. De forma similar, espera-se que as células T isoladas destes camundongos sejam capazes de destruir os alvos que expressam a proteína Ras mutada e/ou de se proliferar em resposta à proteína Ras mutada, de modo específico ao antígeno.
O inteiro teor da divulgação do pedido provisório de patente nos Estados Unidos de n. 60/786568 é incorporado a este documento por citação.
Embora várias configurações da presente invenção tenham sido descritas em detalhe, é evidente para os especialistas na matéria que ocorrerão modificações e adaptações destas configurações. Deve ser expressamente compreendido, no entanto, que tais modificações e adaptações estão no escopo da presente invenção, conforme estabelecido nas reivindicações a seguir. SEQUENCE LISTING <110> Globelmmune, Inc. Guo, Zhimin Lu, Yingnian Bellgrau1 Donald Franzusoff1 Alex
<120> RAS MUTATIONS AND COMPOSITIONS AND METHODS RELATED
THERETO
<130> 3923-13-PCT
<150> 60/786,568
<151> 2006-03-27
<160> 46
<170> Patentln version 3.4 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> synthetic <400> 1
MetAIa Asp GIuAIa Pro 1 5
<210> 2 <211> 570 <212> DNA <213> Homosapiens <220> <221 > CDS . <222> (1)..(570) <400> 2
atg act gaa tat aaa ctt gtg gta gtt gga gct ggt ggc gta ggc aag 48 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 10 15 agt gcc ttg acg ata cag cta att cag aat cat ttt gtg gac gaa tat 96 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
25 30
gat cca aca ata gag gat tcc tac agg aag caa gta gta att gat gga 144 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
40 45
gaa acc tgt ctc ttg gat att ctc gac aca gca ggt caa gag gag tac 192 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
agt gca atg agg gac cag tac atg agg act ggg gag ggc ttt ctt tgt 240 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80
gta ttt gcc ata aat aat act aaa tca ttt gaa gat att cac cat tat 288 Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
aga gaa caa att aaa aga gtt aag gac tct gaa gat gta cct atg gtc 336 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
cta gta gga aat aaa tgt gat ttg cct tct aga aca gta gac aca aaa 384 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
cag gct cag gac tta gca aga agt tat gga att cct ttt att gaa aca 432 Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
tca gca aag aca aga cag aga gtg gag gat gct ttt tat aca ttg gtg 480 Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu VaI 145 150 155 160
agg gag ate cga caa tac aga ttg aaa aaa ate age aaa gaa gaa aag 528 Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys
165 170 175
act cct ggc tgt gtg aaa att aaa aaa tgc att ata atg taa 570
Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met
180 185
<210> 3 <211> 189
<212> PRT
<213> Homosapiens
<400> 3
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 10 15
Ser Aia Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
25 30
Asp Pro Thr IIe Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys
165 170 175
Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met
180 185
<210> 4 <211> 567 <212> DNA <213> MusmuscuIus <220> <221 > CDS <222> (1)..(567) <400> 4
atg act gag tat aaa ctt gtg gtg gtt gga gct ggt ggc gta ggc aag 48 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly VaI Giy Lys 10 15
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25 30
gac cct acg ata gag gac tcc tac agg aaa caa gta gta att gat gga 144 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Va! Val Ile Asp Gly
40 45
gaa acc tgt ctc ttg gat att ctc gac aca gea ggt caa gag gag tac 192 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
agt gea atg agg gac cag tac atg aga act ggg gag ggc ttt ctt tgt 240 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80
gta ttt gcc ata aat aat act aaa tca ttt gaa gat att cac cat tat 288 Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
aga gaa caa att aaa aga gta aag gac tet gaa gat gtg cct atg gtc 336 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
ctg gta ggg aat aag tgt gat ttg cct tet aga aca gta gac acg aaa 384 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
cag gct cag gag tta gea agg agt tac ggg att ccg ttc att gag acc 432 Gln Ala Gln Glu Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
tca gea aag aca aga cag ggt gtt gac gat gcc ttc tat aca tta gtc 480 Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160
cga gaa att cga aaa cat aaa gaa aag atg age aaa gat ggg aag aag 528 Arg Glu Ile Arg Lys His Lys GIu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175
aag aag aag aag tca agg aca agg tgt aca gtt atg tga 567
Lys Lys Lys Lys Ser Arg Thr Arg Cys Thr Val Met
180 185
<210> 5 <211> 188 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln lie Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Glu Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys
165 170 175
Lys Lys Lys Lys Ser Arg Thr Arg Cys Thr Val Met
180 185
<210> 6 <211> 570
<212> DNA
<213> Homosapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(570)
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atg acg gaa tat aag ctg gtg gtg gtg ggc gcc ggc ggt gtg ggc aag 48 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 10 15
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25 30
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40 45
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50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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165 170 175
agt ggc ccc ggc tgc atg age tgc aag tgt gtg ctc tcc tga 570
Ser Gly Pro Gly Cys Met Ser Cys Lys Cys Val Leu Ser
180 185
<210> 7 <211> 189 <212> PRT <213> Homosapiens <400> 7
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
25 30
Asp Pro Thr lie Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His Gln Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Ala AIa Arg Thr Val Glu Ser Arg
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Tyr Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160 Arg Glu Ile Arg Gln His Lys Leu Arg Lys Leu Asn Pro Pro Asp Glu
165 170 175
Ser Gly Pro Gly Cys IVlet Ser Cys Lys Cys Val Leu Ser
180 185
<210> 8 <211> 570 <212> DNA <213> Musmusculus <220> <221 > CDS <222> (1)..(570) <400> 8
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25 30
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40 45
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50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185
<210> 9 <211> 189 <212> PRT <213> Musmusculus <400> 9
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25 30
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100 105 110
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165 170 175
Ser Gly Pro Gly Cys Met Ser Cys Lys Cys Val Leu Ser
180 185
<210> 10 <211> 570 <212> DNA <213> Homosapiens <220> <221 > CDS <222> (1)..(570) <400> 10
atg act gag tac aaa ctg gtg gtg gtt gga gca ggt ggt gtt ggg aaa 48 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 10 15
age gca ctg aca ate cag cta ate cag aac cac ttt gta gat gaa tat 96 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
25 30
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40 45
gaa acc tgt ttg ttg gac ata ctg gat aca gct gga caa gaa gag tac 192 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
agt gcc atg aga gac caa tac atg agg aca ggc gaa ggc ttc ctc tgt 240 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80
gta ttt gcc ate aat aat age aag tca ttt gcg gat att aac ctc tac 288 Val Phe Ala Ile Asn Asn Ser Lys Ser Phe Ala Asp Ile Asn Leu Tyr 85 90 95
agg gag cag att aag cga gta aaa gac tcg gat gat gta cct atg gtg 336 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
cta gtg gga aac aag tgt gat ttg cca aca agg aca gtt gat aca aaa 384 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Thr Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
caa gcc cac gaa ctg gcc aag agt tac ggg att cca ttc att gaa acc 432 Gln Ala His Glu Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ife Glu Thr
130 135 140
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aga gaa ata cgc cag tac cga atg aaa aaa ctc aac age agt gat gat 528 Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Met Lys Lys Leu Asn Ser Ser Asp Asp
165 170 175
ggg act cag ggt tgt atg gga ttg cca tgt gtg gtg atg taa 570
Gly Thr Gln Gly Cys Met Gly Leu Pro Cys Val Val Met
180 185
<210> 11 <211> 189 <212> PRT <213> Homosapiens <400> 11
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp SerTyrArg Lys Gln VaIVaI Ile Asp Gly
40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 Val Phe Ala Ile Asn Asn Ser Lys Ser Phe Ala Asp Ile Asn Leu Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Thr Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala His Glu Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Met Lys Lys Leu Asn Ser Ser Asp Asp
165 170 175
Gly Thr Gln Gly Cys Met Gly Leu Pro Cys VaI Val Met
180 185
<210> 12 <211> 582 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(582) <400> 12
atg act gag tac aaa ctg gtg gtg gtt gga gca ggt ggt gtt ggg aaa 48 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 10 15
age gcc ctg acg ate cag cta ate cag aac cac ttt gtg gat gaa tat 96 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
25 30
gat ccc acc ata gag gat tet tac cga aag caa gtg gtg att gat ggt 144 Asp Pro Thr Ile Glu Asp SerTyrArg Lys Gln ValVaI Ile Asp Gly
40 45
gag acc tgc ctg ctg gac ata ctg gac aca gct gga caa gag gag tac 1 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr 50 55 60 agt gcc atg aga gac cag tac atg agg aca ggc gaa ggg ttc ctc tgt 240 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly GIu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80
gta ttt gcc ate aat aat age aaa tca ttt gea gat att aac ctc tac 288 Val Phe Ala Ile Asn Asn Ser Lys Ser Phe Ala Asp Ile Asn Leu Tyr
85 90 95
agg gag caa att aag cgt gtg aaa gat tet gat gat gtc ccc atg gtg 336 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
ctg gta ggc aac aag tgt gac ttg cca aca agg aca gtt gac aca aag 384 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Thr Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
caa gcc cac gaa ctg gcc aag agt tac gga att cca ttc att gag acc 432 Gln Ala His Glu Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
tca gcc aag acc cga cag ggt gtg gag gat gcc ttt tac aca ctg gta 480 Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160
agg gag ata cgc cag tac cga ttg aaa aag ctc aac age agt gac gat 528 Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Leu Asn Ser Ser Asp Asp
165 170 175
ggc act caa ggt tgt atg ggg tcg ccc tgt gtg ctg atg tgt aag aca 576 Gly Thr Gln Gly Cys Met Gly Ser Pro Cys Val Leu Met Cys Lys Thr
180 185 190
ctt tga 582
Leu
<210> 13
<211> 193
<212> PRT
<213> Musmusculus
<400> 13
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
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Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly GIu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80
Val Phe Ala lie Asn Asn Ser Lys Ser Phe Ala Asp Ile Asn Leu Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln lie Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val GIy Asn Lys Cys Asp Leu Pro Thr Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala His Glu Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Leu Asn Ser Ser Asp Asp
165 170 175
Gly Thr Gln Gly Cys Met Gly Ser Pro Cys Val Leu Met Cys Lys Thr 180 185 190
Leu
<210> 14 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> synthetic <400> 14
Met Ala Asp Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala
10 15
Cys Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr lie Gln Leu He Gln Asn His
25 30
Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gin 40 45
Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala
50 55 60
Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly 65 70 75 80
Glu Gly Phe Leu Cys Val Phe AIa Ile Asn Asn Thr Glu Tyr Lys Leu
85 90 95
Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln
100 105 110
Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp
115 120 125
Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val
130 135 140
Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile 145 150 155 160
Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr
165 170 175
Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly
180 185 190
Ala Arg Giy Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr lie Gln Leu Ile Gln Asn
195 200 205
His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys
210 215 220
Gln Val Val lie Asp Gly Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr 225 230 235 240
AIa Gly Gln Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr
245 250 255
Gly Gly Gly Phe Leu Cys Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe
260 265 270
Glu Asp Ile
275 <210> 15 <211> 98 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> synthetic <400> 15
IVlet Ala Asp Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala
10 15
Arg Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His
25 30
Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln
40 45
Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala
50 55 60
Gly Gln Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly 65 70 75 80
Gly Gly Phe Leu Cys Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe GIu 85 90 95
Asp Ile <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 16 aggtgagttt gtattaaaag <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 17 tcatgaaaat ggtcagag <210> 18 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> synthetic <400> 18
taatacgact cactataggg tgtgtgacat gttctaat <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> synthetic <400> 19
atttaggtga cactatagaa gaatggtcct gcaccagtaa <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> synthetic <400> 20 tgagttgtat ataacacc <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> synthetic <400> 21
ggcattagca aagactca <210> 22 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> synthetic <400> 22
taatacgact cactataggg tgcactgtaa taatccag <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> synthetic <400> 23
atttaggtga cactatagaa attactcctt aatgtcagc
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic <400> 24
atggaaggtc acactaggg <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> synthetic <400> 25
aagatgatcc gacaagtg <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> 19/23
<223> synthetic <400> 26
taatacgact cactataggg agtactgtag atgtggctcg
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic <400> 27
atttaggtga cactatagaa gagacaggat caggtcagcg <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> synthetic <400> 28
tggcaatagc attgcattc
<210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> synthetic <400> 29 ggtaacctca tttcccca <210> 30 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> synthetic <400> 30 taatacgact cactataggg ttgaacttcc ctccctccct g
<210> 31
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic <400> 31
atttaggtga cactatagaa ttcagaacac aaagatca <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> synthetic <400> 32
ttggcaggtg gggcaggaga <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> synthetic <400> 33 cctatcctgg ctgtgtcc <210> 34 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> synthetic <400> 34
taatacgact cactataggg aggagaccct gtaggag <210> 35 <211> 38
<212> DNA <213> Artificiai <220>
<223> synthetic <400> 35
atttaggtga cactatagaa ctcgcccgca gcagctgc <210> 36 <211> 17 <212> DNA <213> Artificia! <220>
<223> synthetic <400> 36
accagggaga ggctggc
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic <400> 37
ctcccgggcc agcctcac <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> synthetic <400> 38
taatacgact cactataggg tgaactcccc ccacggaagg <210> 39 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> synthetic <400> 39
atttaggtga cactatagaa gttcacctgt actggtgga
<210> 40
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic <400> 40
gctcggctgc ggccgctcac tacataactg tacaccttgt cct <210> 41 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> synthetic <400> 41
ggaattcacc atgggcactg agtataaact tgtggtg <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> synthetic <400> 42 tactcctctt gacctgctgt <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 43
aagaaagccc cccccagttc tc 22
<210> 44 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> synthetic <400> 44
acggaattca ccatgactga gtataaactt gtggtggttg gagctgttgg cgtag <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> synthetic <400> 45
aagaaagccc ttcccagttc tc 22
<210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> synthetic <400> 46
ttgggtcgcg gttcttgt 18

Claims (67)

1. "UMA MOLÉCULA" de ácido nucléico contendo uma seqüência de ácido nucléico que codifique uma seqüência de aminoácidos compreendendo pelo menos 5 aminoácidos contíguos de uma proteína Ras mutada, caracterizada pelo fato de a seqüência de aminoácidos conter o aminoácido de posição 76 em relação a uma proteína K-ras, N-ras ou H-ras de tipo selvagem, e caracterizada pelo fato de o aminoácido na posição 76 ser mutado em comparação com a proteína selvagem.
2. "A MOLÉCULA" de ácido nucléico isolado da Reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o aminoácido na posição 76 ser mutado de glutamato para um resíduo de aminoácido não-glutamato selecionado a partir de um grupo formado por: glicina, Iisina e glutamina.
3. "A MOLÉCULA" de ácido nucléico isolado da Reivindicação 2, caracterizada pelo fato de o resíduo de aminoácido não-glutamato ser glicina.
4. "A MOLÉCULA" de ácido nucléico isolado da Reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a seqüência de aminoácidos diferir de qualquer uma das SEQ ID N°. 3, SEQ ID N°. 5, SEQ ID N°. 7, SEQ ID N0. 9, SEQ ID N°. 11 ou SEQ ID N°. 13 em razão da substituição de um aminoácido não-glutamato pelo glutamato na posição 76 das citadas SEQ ID N°. 3, SEQ ID N°. 5, SEQ ID N0. 7, SEQ ID N0. 9, SEQ ID N°. 11 ou SEQ ID N°. 13.
5. "A MOLÉCULA" de ácido nucléico isolado da Reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a seqüência de aminoácidos compreender ainda pelo menos 5 resíduos de aminoácidos contíguos de uma proteína Ras mutante, caracterizada pelo fato de a seqüência de aminoácidos conter a posição do aminoácido selecionada a partir do grupo formado por 12, 13, 59 e 61 em relação a uma proteína K-ras, N-ras ou H-ras selvagem, e caracterizada pelo fato de o aminoácido na posição ser mutado em comparação com a proteína selvagem.
6. "A MOLÉCULA" de ácido nucléico isolado da Reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a seqüência de aminoácidos compreender ainda pelo menos 5 aminoácidos contíguos de uma proteína Ras mutante, caracterizada pelo fato de a seqüência de aminoácidos conter o aminoácido na posição 12 em relação a uma proteína K-ras, N-ras ou H-ras selvagem, e caracterizada pelo fato de o aminoácido na posição 12 ser mutado em comparação com a proteína selvagem.
7. "A MOLÉCULA" de ácido nucléico isolado da Reivindicação 6, caracterizada pelo fato de o aminoácido nas posições 12 ou 13 ser mutado de uma glicina para um resíduo de aminoácido não-glicina.
8. "A MOLÉCULA" de ácido nucléico isolado da Reivindicação 6, caracterizada pelo fato de o aminoácido na posição 12 ser mutado de uma glicina para um resíduo de aminoácido não-glicina.
9. "A MOLÉCULA" de ácido nucléico isolado da Reivindicação 7 ou da Reivindicação 8, caracterizada pelo fato de o resíduo de aminoácido não-glicina ser selecionado a partir do grupo formado por valina, cisteína, aspartato, arginina, serina e alanina.
10. "A MOLÉCULA" de ácido nucléico isolado da Reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a seqüência de ácido nucléico codifica uma proteína de fusão compreendendo dois ou mais dominios, caracterizada pelo fato de um dos dominios compreender pelo menos 5 aminoacidos da proteina Ras mutante abrigando a mutagao na posigao 76, e caracterizada pelo fato de cada dominio adicional consistir num imun0geno.
11. "A MOLECULA" de acido nucleico isolado da Reivindicagao 10, caracterizada pelo fato de ο imunogeno ser um antigeno tumoral.
12. "A MOLECULA" de acido nucleico isolado da Reivindicagao 11, caracterizada pelo fato de ο antigeno tumoral ser uma proteina Ras ou fragmento imunogenico da mesma abrigando pelo menos uma mutagao em relapao a sequencia de aminoacidos da Ras selvagem.
13. "A MOLECULA" de acido nucleico isolado da Reivindicagao 12, caracterizada pelo fato de ο antigeno tumoral ser uma proteina Ras ou fragmento imunogenico da mesma compreendendo as posigoes 12 ou 13 em relagao a sequencia de aminoacidos da Ras selvagem, caracterizada pelo fato de ο aminoacido nas posigoes 12 ou 13 ser mutado de um residuo glicina para um residuo nao-glicina.
14. "A MOLECULA" de acido nucleico isolado da Reivindica^ao 10, caracterizada pelo fato de ο antigeno tumoral ser selecionado a partir do grupo consistindo em: (a) um peptideo compreendendo pelo menos as posigoes de 8 a 16 de uma proteina Ras1 caracterizado pelo fato de ο residuo de aminoacido na posigao 12 em relagao a proteina Ras selvagem ser mutado; (b) um peptideo compreendendo pelo menos as posigoes de 9 a 17 de uma proteina Ras1 caracterizado pelo fato de ο residuo de aminoacido na posigao 13 em relagao a proteina Ras selvagem ser mutado; (c) um peptideo compreendendo pelo menos as pos\goes de 55 a 63 de uma proteina Ras1 caracterizado pelo fato de ο residuo de aminoacido na posigao 59 em relagao a proteina Ras selvagem ser mutado; (d) um peptideo compreendendo pelo menos as posigoes de 57 a 65 de uma proteina Ras1 caracterizado pelo fato de ο residuo de aminoacido na posigao 61 em relagao a proteina Ras selvagem ser mutado; (e) um peptideo compreendendo pelo menos as posigoes de 69 a 77 de uma proteina Ras1 caracterizado pelo fato de ο residuo de aminoacido na posigao 73 em reIa^ao a proteina Ras selvagem ser mutado; (f) um peptideo compreendendo pelo menos as posigoes de 70 a 78 de uma proteina Ras1 caracterizado pelo fato de ο residuo de aminoacido na posigao 74 em relagao a proteina Ras selvagem ser mutado; (g) um peptideo compreendendo pelo menos as posigoes de 71 a 79 de uma proteina Ras, caracterizado pelo fato de ο residuo de aminoacido na posigao 75 em relagao a proteina Ras selvagem ser mutado; (h) um peptideo compreendendo pelo menos as posigoes de 73 a 81 de uma proteina Ras1 caracterizado pelo fato de ο residuo de aminoacido na posigao 77 em relagao a proteina Ras selvagem ser mutado; e (i) um peptideo compreendendo pelo menos as posigoes de 74 a 82 de uma proteina Ras, caracterizado pelo fato de ο residuo de aminoacido na posigao 78 em relagao a proteina Ras selvagem ser mutado.
15. "A MOLECULA" de acido nucleico isolado da Reivindica^ao 1，caracterizada pelo fato de que a sequencia de acido nucleico codifica uma proteina de fusao compreendendo a sequencia de aminoacidos de SEQ ID N°. 14.
16. "A MOLECULA" de acido nucleico isolado da Reivindicagao 1, caracterizada pelo fato de que a sequencia de acido nucleico codifica uma proteina de fusao compreendendo a sequencia de aminoacidos de SEQ ID NT. 15.
17. 11UMA MOLECULA" de acido nucleico isolado, caracterizada pelo fato que seja inteiramente complementar a sequencia de acido nucleico de qualquer uma das Reivindicagoes 1 a 16.
18. "A MOLECULA" de acido nucleico isolado de qualquer uma das Reivindicagoes 1 a 17, caracterizada pelo fato da molecula de acido nucleico ser um primer ou sonda de oligonucleotideos.
19. 11UMA MOLECULA" de acido nucleico recombinante compreendendo a molecula de acido nucleico de qualquer uma das Reivindicagoes 1 a 16，caracterizada pelo fato de ser operativamente associada a pelo menos uma sequencia de controle de expressao.
20. 11UMA CELU LA" recombinante, caracterizada pelo fato de que foi transfectada com a molecula de acido nucleico recombinante da Reivindicagao 19.
21. "A CELULA" recombinante da Reivindicagao 20’ caracterizada pelo fato de a celula ser uma levedura.
22. "UMA PROTEiNA" ou peptide。, caracterizada pelo fato de ser isolado e codificado pela molecula de acido nucleico isolado de qualquer uma das Reivindicagoes 1 a 16.
23. "A PROTEfNAn ou peptideo isolados da Reivindicagao 22, caracterizando-se pelo fato de a proteina ou peptideo isolados serem parte de uma proteina de fusao.
24. "UMA VACINAn, caracterizada pelo fato de compreender a molecula de acido nucleico de qualquer uma das Reivindicagoes 1 a 16.
25. "UMA VACINA", caracterizada pelo fato de compreender a proteina ou peptideo da Reivindicagao 22.
26. "A VACINA" da Reivindicagao 25, caracterizada pelo fato de a vacina compreender ainda um veiculo tipo levedura.
27. "A VACINA" da Reivindicagao 26, caracterizada pelo fato de ο veiculo tipo levedura expressar de modo recombinante a proteina ou peptideo.
28. 11A VACINA" da Reivindicagao 26’ caracterizada pelo fato de a vacina compreender ainda uma celula dendritica, caracterizada pelo fato de a celula dendritica haver sido carregada de forma intracelular com ο veiculo tipo levedura e com a proteina ou peptideo.
29. "UMA VACINA", caracterizada pelo fato de compreender: um veiculo tipo levedura; e uma proteina de fusao contendo uma proteina Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de a proteina ou fragmento da mesma conter ο aminoacido de posi^ao 76 em relagao a uma proteina K- ras, N-ras ou H-ras selvagem, e caracterizada pelo fato de ο aminoacido na posigao 76 ser mutado em compara9ao com a proteina selvagem, caracterizada pelo fato de a expressao da proteina de fusao estar sob ο controle do promotor Cwp7; caracterizada pelo fato de a proteina de fusao ser expressa pelo veiculo tipo levedura.
30. "A VACINA" da Reivindicagao 29, caracterizada pelo fato de a proteina de fusao compreender ainda uma segunda proteina Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de a segunda proteina ou fragmento da mesma conter ο aminoacido de posigao 12 em rela^ao a uma proteina K-ras, N-ras ou H-ras selvagem, e caracterizada pelo fato de ο aminoacido na posigao 12 ser mutado em comparagao com a proteina selvagem.
31. "A VACINA*' da Reivindicagao 29， caracterizada pelo fato de a proteina de fusao compreender as seguintes proteinas ou fragmentos fundidos no quadro de leitura: i) uma proteina Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de a proteina ou fragmento conter ο aminoacido de posigao 12 em relagao a uma proteina K-ras, N-ras ou H-ras selvagem, e caracterizada pelo fato de a glicina na posigao 12 ser substituida por uma cisteina; ii) uma proteina Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de a proteina ou fragmento conter ο aminoacido de posi^ao 61 em relagao a uma proteina K-ras, N-ras ou H-ras selvagem, e caracterizada pelo fato de a glutamina na posigao 61 ser substituida por uma arginina; iii) uma proteina Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de a proteina ou fragmento conter ο aminoacido de posigao 12 em relagao a uma proteina K-ras, N-ras ou H-ras selvagem, e caracterizada pelo fato de a glicina na posigao 12 ser substituida por um aspartato; iv) uma proteina Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de a proteina ou fragmento conter ο aminoacido de posigao 12 em rela^ao a uma proteina K-ras, N-ras ou H-ras selvagem, e caracterizada pelo fato de a glicina na posigiao 12 ser substituida por uma valina; v) uma proteina Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de a proteina ou fragmento conter ο aminoacido de posigao 12 em relagao a uma proteina K-ras, N-ras ou H-ras selvagem, e caracterizada pelo fato de a glicina na posigao 12 ser substituida por uma arginina; e vi) uma proteina Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de a proteina ou fragmento conter ο aminoacido de posigao 76 em relagao a uma proteina K-ras, N-ras ou H-ras selvagem, e caracterizada pelo fato de ο glutamato na posigao 76 ser substituido por uma glicina.
32. "A VACINAm da Reivindicagao 29, caracterizada pelo fato de a proteina de fusao compreender as seguintes ρ rote in as ou fragmentos fundidos no quadra de Ieitu ra: i) uma proteina Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de a proteina ou fragmento conter ο aminoacido de posigao 12 em relagao a uma proteina K-ras, N-ras ou H-ras selvagem, e caracterizada pelo fato de a glicina na posigao 12 ser substituida por uma arginina; ii) uma proteina Ras mutante ou fragmento da mesma, caracterizada pelo fato de a proteina ou fragmento conter ο aminoacido de posigao 76 em relagao a uma proteina K-ras, N-ras ou H-ras selvagem, e caracterizada pelo fato de ο glutamato na posigao 76 ser substituido por uma glicina.
33. "A VACINA" da Reivindicagao 29， caracterizada pelo fato de a proteina de fusao compreender a sequencia de aminoacidos de SEQ ID N°. 14.
34. "A VACINA" da Reivindicagao 29, caracterizada pelo fato de a proteina de fusao compreender a seqiiencia de aminoacidos de SEQ ID N°. 15.
35. mUM ANTICORPO" ou fragmento de Iigagao ao antigeno do mesmo, caracterizada pelo fato que se Iiga seletivamente a proteina ou peptideo isolados da Reivindicagao 22.
36. 11UM APTAmERO", caracterizado pelo fato que se Iiga seletivamente a proteina ou peptideo isolados da Reivindicagao 22.
37. "UMA MOLECULA" siRNA catalisa a clivagem seletiva de RNA transcrito pela molecula de acido nucleico de qualquer uma das Reivindicagoes 1 a 16, ou de RNA transcrito por um gene ras que codifique uma proteina Ras mutante, caracterizada pelo fato de a proteina Ras mutante compreender uma sequencia de aminoacidos que d if ere de uma sequencia de aminoacidos de K-ras, N-ras ou H-ras selvagem em razao de pelo menos uma mutagao na posigao 76 em relagao a seqdencia de aminoacidos de tipo selvagem.
38. "UMA Rl BOZI MAm que catalisa seletivamente a inativagao da molecula de acido nucleico de qualquer uma das Reivindicagoes 1 a 16 ou de uma gene ras que codifique uma proteina Ras mutante, caracterizada pelo fato de a proteina Ras mutante compreender uma sequencia de aminoacidos que difere de uma sequencia de aminoacidos de K-ras, N-ras ou H- ras selvagem em razao de pelo menos uma mutagao na posiyao 76 em relagao a sequencia de aminoacidos de tipo selvagem.
39. mUMA MOLECULA" de acido nucleico anti-senso que hibridiza sob condigoes de altissima especificidade e inibe a expressao da molecula de acido nucleico de qualquer uma das Reivindicagoes 1 a 16 ou de um gene ras que codifique uma proteina Ras mutante, caracterizada pelo fato de a proteina Ras mutante compreender uma sequencia de aminoacidos que difere de uma seqCiencia de aminoacidos de K-ras, N-ras ou H-ras selvagem em razao de pelo menos uma mutagao na posigao 76 em relagao a sequencia de aminoacidos de tipo selvagem.
40. "USO DA MOLECULA" de acido nucleico de qualquer uma das Reivindicagoes 1 a 16 ou da proteina ou peptideo da Reivindicagao 22 ou 23, caracterizada pelo fato de ser utilizado na preparagao de uma composigao para a prevengao ou ο tratamento de cancer.
41. mUSO DA VACINA" de qualquer uma das Reivindicagdes 24 a 34, caracterizada pelo fato de ser utilizado na preparaqiao de um medicamento para a prevengao ou ο tratamento de cancer.
42. 11USO DO APTAMEROn da Reivindicagao 36, do siRNA da Reivindicapao 37, da ribozima da Reivindicagao 38 ou da molecula de acido nucleico anti-senso da Reivindicagao 39，caracterizada pelo fato de ser usado na preparagao de um medicamento para a prevengao ou ο tratamento de cancer.
43. "UM METODO" para prevenir ou tratar um cancer, caracterizado pelo fato de compreender a administragao, a um animal que tenha ou esteja em risco de desenvolver um cancer, de uma vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicagoes 24 a 34.
44. "UM METODO" para prevenir ou tratar um cancer, caracterizado pelo fato de compreender a administragao, a um animal que tenha ou esteja em risco de desenvolver um cancer, do aptamero da Reivindicagao 36, do siRNA da Reivindicagao 37, da ribozima da Reivindicagao 38 ou da molecula de acido nucleico anti-senso da Reivindicagao 39.
45. 11UM METODO" para prevenir ou tratar um cancer, caracterizado pelo fato de compreender a administragao, a um animal que tenha ou esteja em risco de desenvolver um cancer, de um composto que inibe a expressao de uma proteina Ras mutante, caracterizado pelo fato de a proteina Ras mutante compreender uma sequencia de aminoacidos que d if ere de uma sequencia de aminoacidos de K-ras, N-ras ou H-ras selvagem em razao de pelo menos uma mutagao na posigao 76 em rela^ao a seqtiencia de aminoacidos de tipo selvagem.
46. "UM METODO" para prevenir ou tratar um cancer, caracterizado pelo fato de compreender a administragao, a um animal que tenha ou esteja em risco de desenvolver um cancer, de um composto que inicia ou aciona a hidrolise de GTP de uma proteina Ras mutante, caracterizado pelo fato de a proteina Ras mutante compreender uma seqtiencia de aminoacidos que difere de uma seqtiencia de aminoacidos de Κ» ras, N-ras ou H-ras selvagem em razao de pelo menos uma mutagao na posigao 76 em relaqao a sequencia de aminoacidos de tipo selvagem.
47. "UM M白TODO" para ο diagnostico de um tumor caracterizado pelo fato de compreender a detecgiao da expressao ou atividade de uma proteina Ras mutante ou sequencia de acido nucleico que codifique a citada proteina Ras em uma amostra de teste de um paciente a ser diagnosticado, caracterizado pelo fato de que a proteina Ras contem uma mutagao na posigao 76 em relagao a sequencia de aminoacidos da Ras selvagem; caracterizado pelo fato de a detecgao da proteina Ras mutante ou sequencia de acido nucleico que codifique a citada proteina Ras na amostra de teste indicar a presenga de celulas tumorais ou potencial para tan to na amostra de teste.
48. Ό METODO" da Reivindicagao 47, caracterizado pelo fato de a proteina Ras conter uma substituigao de glicina por gIutamato na posigao 76 da proteina selvagem.
49. "O METODO" da Reivindicagao 47, caracterizado pelo fato de que ο metodo compreende ainda detectar se a proteina Ras tambem contem uma mutagao na posigao 12 em relagiao a seqiiencia de aminoacidos da Ras selvagem, caracterizado pelo fato de a detecgao de uma mutagao na posigao 76 e na ροεϊςεο 12 indicar a presenga de celulas tumorals ou potencial para tanto na amostra de teste, alem de indicar um tumor mais agressivo no paciente em comparagao com celulas tumorals que abriguem uma proteina Ras com somente uma mutagao ou nenhuma mutagao nestas posigoes.
50. ”O METODO" da Reivindicagao 47’ caracterizado pelo fato de que a eta pa de detecgao compreende a detec9ao de uma seqijencia de acido nucleico que codifique a mutagao Ras na amostra de teste.
51. "O METODO" da Reivindicagao 50, caracterizado pelo fato de que a eta pa de detecgao compreende a amplificagao por PCR de um molde de DNA genomico que codifique a mutagao ou a amplifica^ao por PCR in situ das sequencias de DNA que codifiquem a mutagao.
52. mO METODO" da Reivindica^o 50, caracterizado pelo fato de que a eta pa de detecgao e realizada por um metodo selecionado a partir do grupo formado por reagao em cadeia da polimerase (PCR)1 PCR via transcriptase reversa (RT- PCR), hibridizagao in situ, northern blot, analise de seqQencia, analise em microsseries de expressao genica e detecgao de um gene reporter.
53. ■■〇 METODO" da Reivindicagao 47, caracterizado pelo fato de ο nivel da seqijencia de acido nucleico que codifica a proteina Ras mutante ser determinado realizando-se ο contato entre acidos nucleicos isolados de uma amostra de teste e um primer ou sonda que se Iiga seletivamente a seqijencia de acido nucleico que codifica a proteina Ras mutante, e detecta η do- se se a seqiiencia de acido nucleico que codifica a proteina Ras mutada e Iigada pelo primer ou sonda.
54. ■_〇 METODO" da Reivindicagao 47， caracterizado pelo fato de ο nivel da proteina Ras mutante ser determinado realizando-se ο contato entre a amostra de teste e um anticorpo ou um f ragmen to do mesmo ou um aptamero que se Iiga seletivamente a proteina Ras mutante, e detectando-se se ο anticorpo ou fragmento do mesmo ou aptamero se ligou a proteina Ras mutante.
55. "O METODO" da Reivindicagao 47’ caracterizado pelo fato de que a amostra de teste e de um paciente sendo diagnosticado para cancer e caracterizado pelo fato de a amostra de teste ser comparada a uma amostra de controle negativo.
56. Ό METODO" da Reivindica^ao 47’ caracterizado pelo fato de a amostra de teste ser imobilizada em um substrato.
57. Ό METODO" da Reivindicagao 47, caracterizado pelo fato de ο metodo ser empregado para diagnosticar cancer no paciente.
58. Ό METODO" da Reivindicagao 47, caracterizado pelo fato de ο metodo ser empregado para determinar ο prognostico do cancer no paciente.
59. "O METODO" da Reivindicagao 47， caracterizado pelo fato de ο metodo ser empregado para determinar a suscetibilidade do paciente a um tratamento terapeutico.
60. "UM METODO" para identificar um composto para prevengao ou tratamento de cancer, caracterizado pelo fato de compreender a identificagao de um inibidor de uma proteina-alvo Ras ou de uma molecula de acido nucleico que codifique a proteina-alvo Ras1 caracterizado pelo fato de que a proteina-alvo Ras contem uma mutagao na posiqao 76 em relagao a uma proteina Ras selvagem.
61."〇 METODO" da Reivindicagao 60, caracterizado pelo fato de que a mutagao e uma substituigao de um aminoacido nao-glutamato — selecionado a partir do grupo formado por glicina, Iisina e glutamina - por glutamato na posigao 76 da proteina selvagem.
62. "O METODO" da Reivindica^o 60, caracterizado pelo fato de que a eta pa de identificagao compreende identificar um inibidor de expressao ou atividade da proteina-alvo Ras.
63. "O METODO" da Reivindicagao 62, caracterizado pelo fato de que a eta pa de detecgao e selecionada a partir do grupo formado por: detecgao de tradugao ou atividade da proteina-alvo Ras na presenga do composto regulador hipotetico; e detecgao de expressao de um gene que codifique a proteina-alvo Ras na presengia do composto regulador hipotetico.
64. "O METODO" da Reivindica^o 62’ caracterizado pelo fato de compreender as eta pas de: a) reaIizar ο contato entre uma celula hospedeira e um composto regulador hipotetico, caracterizado pelo fato de a celula hospedeira expressar a proteina-alvo Ras ou um fragmento biologicamente ativo da mesma; e b) detectar se ο composto regulador hipotetico aciona a hidrolise de GTP da proteina-alvo Ras ou fragmento biologicamente ativo da mesma, caracterizado pelo fato de um composto regulador hipotetico que acione a hidrolise de GTP da proteina-alvo Ras, comparado a ausencia do composto, ser indicado a composto candidato para a prevengao ou tratamento de cancer.
65. Ό METODO" da Reivindicagao 64, caracterizado pelo fato de que a celula hospedeira e uma Iinhagem de celulas tumorais.
66. mUM METODO" para identificar um composto para prevengao ou tratamento de cancer, caracterizado pelo fato de compreender a identificagao do composto que aciona a hidrolise de GTP numa celula que expresse a proteina-alvo Ras mutada, mas nao numa celula que expresse a proteina Ras selvagem, caracterizado pelo fato de que a proteina-alvo Ras mutada contem uma mutagao na posi^ao 76 em relagao a uma proteina Ras selvagem.
67. "O METODO" de qualquer uma das Reivindicagoes 60 a 66，caracterizado pelo fato de que ο composto regulador hipotetico e selecionado a partir do grupo formado por: um aptamero, uma molecula de siRNA, uma molecula de acido nucleico anti—senso, uma ribozima, um anticorpo ou fragmento de Iigagao ao antigeno do mesmo, um antagonista conformacional e pequenas moleculas inibidoras.
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