BRPI0709357A2 - ampliação da produção de etanol microbiano - Google Patents
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Abstract
<B>AMPLIAçãO DA PRODUçãO DE ETANOL MICROBIANO<D>, onde um microorganismo termofihico tem falta de atividade lactato desidrogenase e contém preferivelmente um caminho piruvato formato liase ativo, O microorganismo termofihico contém um gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD. O gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD é preferivelmente uma versão otimizada de códon do gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD termoestável. A construção DNA permite a expressão estável do gene que codifica um formato clesidrogenase com ligação NAD no microorganismo termofihico. A construção DNA se baseia no uso de uma seqúência de inserção para obter a expressão ou recombinação estável para inserir o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD no gene lactato desidrogenase, obtendo assim o nocaute do gene c nova funcionalidade em uma única etapa. Os microorganismos são úteis na fermentação de açúcares para a produção do etanol.
Description
AMPLIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ETANOL MICROBIANO.
Campo da invenção
Esta invenção se refere aos procedimentos e microorganismos de fermentação para uso e, em particular à ampliação da produção do etanol microbiano. Mais especificamente, a invenção se refere à produção ampliada do etanol pelas bactérias termofílicas, como as Bacilli provenientes de açúcares misturados derivados da hidrólise de biomassa. Em particular, a invenção se refere a um novo caminho para a produção do etanol pela clonagem de um gene que codifica uma enzima formato desidrogenase com ligação NAD em um microorganismo que possui um gene funcional que codifica um complexo de enzima liase formato piruvato, mas não possui atividade lactato desidrogenase.
Histórico da invenção
O bioetanol é atualmente feito a partir da glicose, maltose ou 15 sacarose derivada de amido de cereal, cana de açúcar ou beterraba de açúcar, todas com valor nutricional. As celuloses e hemiceluloses formam uma principal parte de subprodutos da agricultura e podem, em princípio, ser uma fonte principal de bioetanol de baixo custo e renovável. Entretanto, é difícil e caro obter açúcares fermentáveis da celulose. Em contraste, as hemiceluloses são quase tão abundantes quanto a celulose e são fáceis para hidrolisar, mas produzem uma mistura de principalmente açúcares pentose que as leveduras não podem fermentar.
Por essa razão, Hartley (ver Número de Publicação Internacional WO 88/09379) propôs a produção de etanol por mutantes de um bacilo termofílico, que fermenta muito rapidamente todos os açúcares derivados de biomassa, em temperaturas de até 70°C. Entretanto, a alta produção de etanol é somente conseguida por células estressadas e moribundas.
Muitos microorganismos contêm um caminho liase formato piruvato (PFL) que converte o piruvato em acetil CoA e formato (Figura IA). Os microorganismos de fermentação heterolática são dessa classe. Essesmicroorganismos primeiro convertem os açúcares de entrada em piruvato (geralmente pelo caminho EMP de glicólise), que então podem tomar muitos caminhos para a produção de lactato, formato, acetato, etanol e CO2 em várias proporções, dependendo das condições de crescimento.
Em células totalmente aeróbicas, o piruvato é normalmentemetabolizado em H2O e CO2 pelo caminho piruvato desidrogenase (PDH), ciclo ácido tricarboxílico e pela cadeia de Transporte de Elétrons. Entretanto, em muitos desses microorganismos, particularmente nos bacilos termofílicos, a captação de açúcar e a glicólise parecem não estar reguladas e o lactato é um 10 produto dominante em altas concentrações de açúcar, mesmo em condições aeróbicas. Isto sugere que o fluxo PDH se tornou saturado, e que o excesso de piruvato é transformado em um caminho lactato desidrogenase de transbordamento. Isto não é usado para o crescimento, mas produz calor que provoca o aumento da temperatura ambiente e mata os competidores 15 mesofílicos, como pode ser visto quando grama nova é colocada em uma pilha composta.
Se o gene Idh (que codifica a lactato desidrogenase) estiver inativado, como descrito, por exemplo, em WO 02/29030, a produção de lactato pára e o excesso de piruvato é dirigido principalmente para o caminho 20 PFL ligado ao crescimento, (Figura IA). Entretanto, nas concentrações muito altas de açúcar e/ou em pH ácido, o fluxo do caminho PFL declina e o excesso de piruvato então transborda em um caminho PDH anaeróbico, que somente produz etanol e CO2 (Figura 1 B). Portanto, as condições preferidas para a obtenção de grandes produções de etanol são aquelas que reduzem o fluxo 25 pelo caminho PFL e aumentam o fluxo pelo caminho PDH (Hartley, B.S. and Shama, G. Proc. Roy. Soe. Lond. 321, 555-568 (1987)). Infelizmente, sob tais condições, as células passam por estresse metabólico, com produção reduzida de ATP, e um potencial desequilíbrio nas relações NAD/NADH e CoA/acetil CoA (Figura 1C).
Foram propostos vários protocolos .de fermentação para tentarevitar ou minimizar esse problema, como o de Hartley, B.S. discutido acima (ver Número de Publicação Internacional WO 88/09379).
Existem duas classes de formato desidrogenase. Uma (codificada pelo gene fdhF) converte formato em CO2 + H2 sendo típica das enterobactérias como E. coli. A outra (codificada pelo gene fdhl) converte formato + NAD em CO2 + NADH2 estando presente em muitos anaeróbios facultativos. Berrios-Rivera et al (Metabolic Engineering 4, 217-219 (2002) substituíram o gene fdhF em E. coli por um gene fdhl de levedura e acharam que os produtos anaeróbicos reduzidos como o etanol, lactato e succinato aumentaram com relação aos produtos oxidados como acetato. Com essa observação, San, K-Y. Berrios-Rivers, S.J. e Bennett, G.N. (ver Número •de Publicação Internacional WO 2003/040690) propuseram a introdução de um gene formato desidrogenase com ligação NAD como um método geral para o aumento da potência de redução nas células envolvidas em uma ampla 15 faixa de biotransformações. Depois, San, K-Y. Bennett, G.N. e Sanchez, A. (Pedido de Patente norte-americana US 2005/0042736 Al) propuseram uma aplicação específica desse conceito para a produção de succinato. Esses estudos foram realizados com o E. Coll, um exemplo de um mesófilo, em que a captação de açúcar é regulada. O propósito desses experimentos foi aumentar os níveis intracelulares de NADH de maneira a prover potência ampliada de redução para várias biotransformações.
O formato desidrogenase em levedura recomendado por Sen. et al (2004) é inativo a 60°C, que é a mínima temperatura de crescimento para as •bactérias termofílicas de uso potencial na produção do bioetanol. As formato desidrogenases mais termoestáveis até o presente descritas é a enzima Pseudomonas sp. 101 (A. Rojkova, A. Galkin, L. Kulakova, A. Serov, P. Savitsky, V. Fedorchuk, V. Tishkov FEBS Letters, Volume 445, Issue 1, Pages 183-188, 1999).
Sumário da invenção
A presente invenção tenta solucionar os problemas da produção paraaltos fornecimentos de etanol a partir da biomassa. Em particular, está descrito na presente pela primeira vez um novo caminho metabólico que permite que microorganismos termofílicos, especialmente bactérias como Bacillus, proporcionem grandes produções de etanol.
A invenção repousa nos microorganismos que não possuematividade lactato desidrogenase e assim exigem uma via alternativa para a reoxidação do NADH em excesso produzido pela glicólise. Isto é feito pela .introdução no microorganismo de um gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD, como um gene fdhl. Em microorganismos termofílicos e em contraste com mesófilos como o E. coli, a captação de açúcar não é regulada e isso leva ao acúmulo de NADH na presença de altos níveis de açúcares. Isto leva, eventualmente a um colapso metabólico e à denominada "morte redox" como mostrado esquematicamente na figura 1C. A incorporação no microorganismo de um gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD ajuda a evitar a morte celular em altas concentrações de açúcar, levando a uma redução nos níveis NADH e a um aumento dos níveis NAD. Isto se deve parcialmente pela restauração do fluxo pelo caminho do piruvato desidrogenase (PDH), mas mais importante, à inclusão de um gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD cria um novo caminho piruvato formato liase (PFL) - formato desidrogenase com ligação NAD (FDH) para a produção do etanol. A Figura ID mostra o potencial para esse caminho PFL-FDH restaurar o equilíbrio redox pela conversão de todo o piruvato produzido pela rápida glicólise na presença de altos níveis de açúcar em etanol e CO2, especialmente em condições de pH neutro. De forma importante, o caminho opera em condições que são ideais para o crescimento celular, levando a uma rápida geração de etanol com grande produção, já que o caminho PFL é o principal caminho anaeróbico ligado ao crescimento em microorganismos termofílicos.
Assim, em um primeiro aspecto a invenção provê um microorganismo, em particular um microorganismo termofílico, que nãopossui atividade lactato desidrogenase (Idh), caracterizado pelo fato de que o microorganismo, preferivelmente um microorganismo termofílico, contém um gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD (fdh).
Em uma configuração, o microorganismo não tem atividade lactato desidrogenase em função de uma eliminação adequada de um gene ou de outra mutação que remova a atividade lactato desidrogenase. Portanto, preferivelmente o gene Idh gene é eliminado ou tornado não funcional. Os métodos para o nocaute e eliminação do gene são bem conhecidos na técnica, sendo descritos os exemplos preferidos em detalhes na presente. Além disso, as cepas conhecidas de bactérias que não possuem a atividade lactato desidrogenase (como a TN-T9 depositada sob número de acesso NCIMB 41075 e a TN-TK depositada sob número de acesso NCIMB 41115) podem ser adequadas para uso na presente invenção.
O microorganismo da invenção contém tipicamente um caminho piruvato formato liase ativo. Em particular, o microorganismo preferivelmente compreende um gene que codifica uma piruvato formato liase como o pfl. Os microorganismos da invenção também contêm tipicamente um caminho piruvato desidrogenase (PDH) ativo.
Em uma configuração preferida, o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD é integrado ao genoma do microorganismo termofílico. Entretanto, é também possível a obtenção da expressão estável sem a integração, por exemplo, pela introdução de um plasmídeo adequado. Um método preferido de integração é por recombinação. O gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD pode ser ligado operacionalmente a qualquer elemento regulador adequado para direcionar a expressão do formato desidrogenase com ligação NAD. Por "ligado operacionalmente" entende-se que existe uma ligação funcional entre o elemento regulador e o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD. Por exemplo, o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD pode estar ligado a um promotor adequado que pode serum promotor constitutivo ou induzível, por exemplo. "Promotor" é definido . na presente como incluindo uma região do DNA que está envolvida na ligação da RNA polimerase para iniciar a transcrição.
Tipicamente, o promotor é um promotor procariótico que inclui as seqüências adequadas - e -35, as seqüências de consenso que são bem definidas na técnica. O gene pode também estar ligado operacionalmente a outras seqüências reguladoras adequadas como, por exemplo, terminadores.
Terminador" é definido como uma seqüência de nucleotídeo que faz a RNA polimerase terminar a transcrição. Em uma configuração, o gene que codifica 10 um formato desidrogenase com ligação NAD é expresso a partir de seu próprio promotor. Em uma configuração alternativa, o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD é expresso a partir de um promotor do microorganismo termofílico (devido à integração em um local adequado . no genoma). Também podem ser previstas construções onde a expressão do 15 gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD é acionado por um promotor estranho. Isto pode ser feito para obter níveis máximos de expressão ou, por exemplo, expressão induzível. Como exemplo, fagopromotores como o T7 podem ser utilizados em conjunto com uma adequada fagopolimerase (que pode ser provida em construção DNA separada ou na mesma).
Em uma configuração particularmente preferida, o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD está ligado operacionalmente às adequadas regiões reguladoras de um gene que codifica um lactato desidrogenase, em particular as regiões reguladoras a montante. A região reguladora preferivelmente compreende o promotor de um gene que codifica um lactato desidrogenase. O promotor pode ser definido para incluir como unidade funcional mínima as seqüências -10 e -35 adequadas. Assim, de acordo com uma configuração preferida da invenção, o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD é inserido no gene lactato 30 desidrogenase do microorganismo termofílico, inativando assim a atividadelactato desidrogenase do microorganismo termofílico. Esta configuração é particularmente preferida, já que ambas as modificações necessárias para produzir um microorganismo termofílico da invenção são produzidas na mesma etapa. São descritas em detalhes na presente as construções adequadas 5 para a obtenção disto.
A produção de etanol por bactérias termofílicas é vantajosa, já que . pode ser realizada em altas temperaturas. Apesar de os organismos termofílicos terem menor tolerância ao etanol que as leveduras, o etanol pode ser removido contínua e convenientemente da fermentação em alta 10 temperatura por evaporação de membrana e/ou vácuo moderado. Em condições anaeróbicas de crescimento ideais, a cepa do bacilo LLD-R cresce muito rapidamente a 70°C, quase exclusivamente pelo caminho PFL (Hartley and Shama, 1982). Pode ser previsto que o crescimento pelo novo caminho PFL-FDH seja igualmente vigoroso, mas a temperatura de crescimento 15 máximo estaria limitada pela termoestabilidade do formato desidrogenase com ligação NAD introduzido no microorganismo termofílico. Assim, em uma configuração preferida, o microorganismo termofílico da invenção incorpora um gene que codifica um formato desidrogenase com ligação .NAD termoestável e/ou um gene cuja seqüência de nucleotídeo tiver sido 20 otimizada por códon para facilitar a expressão por um microorganismo termofílico. A produção desse formato desidrogenase com ligação NAD termoestável é descrita na presente em detalhes. Em uma configuração específica, o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD compreende, consiste essencialmente ou consiste da seqüência de 25 nucleotídeo especificada em SEQ. ID. N0 1. Em outra configuração, o microorganismo termofílico da invenção incorpora um códon otimizado para a expressão em Bacillus, gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD termoestável compreendendo, consistindo essencialmente ou consistindo na seqüência de nucleotídeo especificada na SEQ. ID. N0 2. Esta seqüência inclui, além da seqüência básica termoestável desidrogenase comligação NAD, regiões promotoras e terminadoras, e também sítios Xbal para facilitar a clonagem do gene em uma construção DNA adequada.
Em ainda outra configuração, o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD é o gene fdhl. O gene fdhl pode ser obtido a partir de qualquer fonte adequada, sendo preferivelmente códon otimizado para expressão no microorganismo termofílico pertinente.
O microorganismo termofílico da invenção pode ser produzido pela transformação de qualquer construção DNA da invenção, descrita em maiores detalhes na presente. Assim, a discussão presente se aplica, com as 10 modificações adequadas, a esta configuração da invenção.
O microorganismo termofílico da invenção pode ser qualquer microorganismo adequado para a produção de etanol a partir da biomassa. Preferivelmente, o microorganismo termofílico é um microorganismo de fermentação heterolática. Mais preferivelmente, o microorganismo 15 termofílico é uma bactéria termofílica, sendo mais preferivelmente do gênero Bacillus e ainda mais preferivelmente BaciUus stearothermophilus. Em uma configuração, o microorganismo termofílico da invenção é obtido a partir da cepa conhecida LLD-R ou LLD- (do Bacillus stearothermophilus). Em outra configuração, o microorganismo termofílico é o Geobacillus 20 thermoglucosidasius.
Os processos de fermentação facilitados pela presente invenção preferivelmente utilizam um formato desidrogenase sintético com ligação NAD, projetado para expressar uma seqüência aminoácida termoestável devido ao uso das preferências códon do adequado microorganismo 25 termofílico como a cepa Bacillus LLD-R. O gene sintético contém preferivelmente locais projetados de restrição para ajudarem na inserção no . gene lactato desidrogenase. Portanto, a eliminação do caminho LDH e a criação do caminho PFL-FDH são feitas em uma única operação. Assim, em um segundo aspecto, a invenção provê um formato desidrogenase com ligação NAD termoestável. Preferivelmente, o formato desidrogenase comligação NAD termoestável permanece funcional na temperatura de 60 °C, ou acima. Preferivelmente, a enzima termoestável é codificada por uma seqüência de nucleotídeo que foi códon otimizada para expressão em um •microorganismo termofllico. O formato desidrogenase pode compreender, consistir essencialmente ou consistir da seqüência aminoácida especificada na
SEQ. ID. N0 3 em uma configuração.
Um formato desidrogenase com ligação NAD termoestável específico foi projetado com base na seqüência aminoácida do formato desidrogenase Pseudomonas sp 101 (SEQ. ID. N0 3) e pelo uso de códons 10 otimizados do Geobacillus thermoglucosidasius como discutido em mais detalhes na descrição abaixo. Os técnicos no assunto apreciarão que os derivados desta seqüência básica manterão a funcionalidade. Por exemplo, as substituições conservadoras e semiconservadoras podem resultar em formato desidrogenases com ligação NAD termoestável e esses derivados devem se 15 situar dentro do escopo da invenção, desde que mantenham a efetiva •atividade catalítica e termoestabilidade, de maneira a serem úteis na produção do etanol usando organismos termofílicos. Similarmente, pequenas exclusões e/ou adições de aminoácidos podem produzir derivados que mantenham a funcionalidade adequada.
Em um terceiro aspecto, a invenção se refere a um gene sintético quecodifica um formato desidrogenase com ligação NAD termoestável. Preferivelmente, o gene compreende, consiste essencialmente ou consiste da seqüência de nucleotídeo especificada na SEQ. ID. N0 1. Esta seqüência representa uma nova seqüência de gene fdh onde os códons são otimizados 25 para produção de um formato desidrogenase com ligação NAD termoestável. Em uma configuração mais específica, o gene que codifica a formato desidrogenase com ligação NAD termoestável compreende, consiste •essencialmente ou consiste da seqüência de nucleotídeo especificada na SEQ. ID. N0 2. Esta seqüência incorpora a região de codificação do formato desidrogenase com ligação NAD termoestável, em conjunto com umpromotor Bacillus adequado e o terminador independente rho. A seqüência também incorpora sítios adequados de restrição para auxiliar na clonagem, em particular sítios Xbal. O especialista verá prontamente que podem ser feitas pequenas modificações na seqüência de nucleotídeo sem alterar a funcionalidade ou termoestabilidade da enzima resultante, por exemplo, pela substituição de códons otimizados por outros códons que são preferidos nos sistemas de translação do microorganismo termofílico adequado.
A invenção também se refere a uma construção DNA contendo um gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD, em particular um formato desidrogenase com ligação NAD termoestável, em que o gene é flanqueado por sítios de restrição para facilitar a clonagem do gene em uma construção DNA adequada, como um vetor de expressão ou um plasmídeo.
Em um aspecto relacionado, a invenção também provê uma construção DNA compreendendo uma seqüência reguladora ligada operacionalmente a um gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD termoestável. Essa construção DNA facilita assim a transformação dos microorganismos termofílicos, em particular aqueles que não possuem atividade lactato desidrogenase, para produzir microorganismos termofílicos capazes de fermentação eficiente, resultando em produções máximas de etanol. Como acima mencionado, o termo "ligado operacionalmente" como ora usado se refere a uma ligação funcional entre a seqüência reguladora e o gene que codifica o formato desidrogenase com ligação NAD, de maneira que a seqüência reguladora pode influenciar a expressão do gene. Por exemplo, uma seqüência reguladora preferida é um promotor. Como acima mencionado, o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD preferivelmente compreende, consiste essencialmente ou consiste da seqüência de nucleotídeo especificada na SEQ. ID. N0 1. Uma seqüência reguladora preferida é um promotor, apesar de a construção DNA poder também incorporar seqüências terminadorasadequadas. Em uma configuração específica, o promotor compreende a seqüência de nucleotídeo especificada na SEQ. ID. N0 4. Outros promotores, como discutido acima, podem ser utilizados para expressão de altos níveis e/ou induzível.
Em outro aspecto da invenção, é provida uma construção DNAcompreendendo um gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD e uma seqüência de inserção, em que a seqüência de inserção facilita a integração do gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD no genoma de um microorganismo termofílico transformado com a 10 construção DNA. Por "seqüência de inserção" entende-se um elemento DNA transponível que é capaz de integração no genoma do microorganismo termofílico adequado. As seqüências de inserção também podem ser denominadas como elementos de seqüência de inserção (IE) e podem ter ocorrência natural. Em uma configuração específica da invenção, a seqüência 15 de inserção é obtida a partir da cepa Bacillus stearothermophilus LLD-R ou LLD-15.
Em uma configuração mais específica, a seqüência de inserção compreende, consiste essencialmente ou consiste da seqüência de nucleotídeo especificada na SEQ. ID. N0 5 (Figura 3).
A seqüência preferida de inserção pode ser gerada pelaamplificação usando primers compreendendo, consistindo essencialmente ou consistindo na seqüência de nucleotídeo especificada na SEQ. ID. N0 6 e 7. Nesse caso, o DNA genômico da conhecida cepa Bacillus stearothermophilus LLD-15 pode ser usada como modelo. Uma construção DNA particularmente preferida é o plasmídeo pUB-ISFl (descrito na seção experimental abaixo e na figura 5).
Em ainda outro aspecto, a invenção se refere a uma construção DNA compreendendo um gene (fdh) que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD ligado operacionalmente às adequadas regiões reguladoras . de um gene que codifica um lactato desidrogenase, em particular as regiõesreguladoras a montante. As regiões reguladoras preferivelmente compreendem o promotor de um gene que codifica um lactato desidrogenase (ldh). O promotor pode ser definido para incluir como unidade funcional mínima as adequadas seqüências - e -35 para permitir a efetiva ligação 5 RNA polimerase. O promotor do gene lactato desidrogenase é adequado para acionar altos níveis de expressão nos microorganismos termofílicos como Bacilli, como também pode ser usado vantajosamente como parte da estratégia de clonagem para obter tanto a retirada da atividade lactato desidrogenase como a introdução da atividade formato desidrogenase com 10 ligação NAD na mesma etapa. A construção DNA pode assim ser também definida como compreendendo um gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD ligado operacionalmente a uma molécula de ácido nucléico que compreende o promotor de um gene que codifica um lactato desidrogenase (ldh).
A construção DNA preferivelmente também contém parte daseqüência de codificação do gene hospedeiro lactato desidrogenase a jusante do gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD. Isto facilita a integração do gene em um microorganismo transformado na construção DNA. Por "pelo menos parte" entende-se uma porção do gene com comprimento suficiente para permitir a integração do gene no genoma de um microorganismo contendo o gene lactato desidrogenase por recombinação (preferivelmente por duplo cross-over). A parte da seqüência de codificação preferivelmente incorpora o final do gene lactato desidrogenase. Em uma configuração, pelo menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 ou 750 nucleotídeos do gene lactato desidrogenase estão incorporados a jusante do gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD. Assim, em uma configuração da invenção, a construção DNA compreende um gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD, em que o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD é flanqueado pela seqüência de nucleotídeo de um gene que codifica um lactato desidrogenase(obtido a partir do microorganismo termofílico de interesse). As seqüências de flanqueamento têm comprimento suficiente para permitir a integração do gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD no gene hospedeiro que codifica um lactato desidrogenase para aí introduzir a atividade do formato desidrogenase com ligação NAD e fazer o nocaute da atividade lactato desidrogenase em uma única etapa de clonagem. Preferivelmente, o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD é flanqueado a montante por pelo menos a região do promotor do gene que codifica um lactato desidrogenase, de maneira que, seguindo a integração por recombinação, o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD está ligado operacionalmente ao promotor. Em uma configuração particularmente preferida, a porção a jusante do gene lactato desidrogenase pode ser obtida pela amplificação do gene Idh usando primers compreendendo, consistindo essencialmente ou consistindo na seqüência de nucleotídeo especificada na SEQ. ID. N0 8 e 9, usando a cepa LLD-R como modelo. A região de flanqueamento a montante, que preferivelmente incorpora o promotor ldh, preferivelmente compreende pelo menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 ou 750 nucleotídeos das adequadas regiões ldh a montante para maximizar a eficiência de integração pela recombinação com o genoma hospedeiro. Essa região a montante pode ser dependente do contexto da . seqüência do gene ldh no microorganismo termofílico específico de interesse, como seria prontamente determinado por um especialista. Assim, o especialista com conhecimento da seqüência do gene ldh determinaria prontamente as regiões adequadas de flanqueamento, para permitir a integração por recombinação. Por exemplo, as seqüências genômicas publicadas podem ser estudadas, realizadas as reações de seqüenciamento ou as regiões de flanqueamento amplificadas por PCR usando primers obtidos a partir da seqüência do gene ldh. Assim, o gene fdh se interpõe entre duas seqüências nucleotídeas obtidas a partir do gene fdh, de maneira que o gene fdh 30 substitui, no frame, pelo menos parte do gene ldh.A construção DNA, portanto, geralmente compreende a integração do gene cassete em que o gene de interesse (gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD) é inserido na seqüência de codificação (ORF) de um gene a ser nocauteado durante a integração (neste exemplo, o gene lactato desidrogenase). Com a integração pela recombinação, a expressão do gene de interesse se efetua sob o controle do gene nocauteado. Essa construção pode ter aplicação geral nas circunstâncias em que um gene precise ser nocauteado em favor da expressão de um gene heterólogo. Em uma configuração preferida, o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD codifica um formato desidrogenase com ligação NAD termoestável. A discussão dos formatos desidrogenase com ligações NAD termoestáveis ora providas se aplica com as modificações adequadas a este aspecto da invenção. Em particular, em uma configuração, o gene que codifica a formato desidrogenase com ligação NAD termoestável compreende, consiste essencialmente ou consiste da seqüência de nucleotídeo especificada na SEQ. ID. N0 1 ou 2. Uma construção DNA particularmente preferida é o plasmídeo pUCK-LFl (como descrito na seção experimental abaixo e na figura 8).
Para todas as construções DNA da invenção, uma forma preferida é um vetor de expressão. Assim, as construções DNA permitem a expressão confiável do gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD termoestável em um microorganismo transformado pela construção. Em uma configuração particularmente preferida, a construção DNA é um plasmídeo. Preferivelmente, a construção DNA somente pode replicar no microorganismo termofílico hospedeiro pela recombinação com o genoma do microorganismo termofílico hospedeiro.
As construções DNA da invenção também incorporam preferivelmente um gene repórter adequado como indicador de transformação com sucesso. Em uma configuração, o gene repórter é um gene de resistência antibiótica, como um gene de resistência à canamicina ou ampicilina. Outrosrepórteres, como a proteína fluorescente verde (GFP) e a beta-galactosidase (IacZ) podem ser utilizados como adequado. A construção DNA pode incorporar múltiplos genes repórteres, como adequado. A perda da função repórter é, em gerações subseqüentes, indicativa de integração do gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD termoestável, junto com as adequadas regiões de flanqueamento.
Em ainda outro aspecto, a invenção se refere a um .microorganismo compreendendo uma construção DNA da invenção.
Os microorganismos recipientes preferidos são microorganismos de fermentação heterolática. Em particular, a invenção preferivelmente se refere às bactérias termofílicas, como as do gênero Bacillus e especialmente Bacillus stearothermophilus. A bactéria pode ser obtida, por exemplo, da cepa LLD-R ou LLD-15. Em outra configuração, o microorganismo termofílico é o Geobacillus thermoglucosidasius.
Em ainda outro aspecto, a invenção se refere ao uso de ummicroorganismo da invenção ou de um microorganismo termofílico da invenção em fermentação, e em particular para a produção de etaol.
De forma similar, a invenção se refere a um processo de fermentação para a produção de etanol, compreendendo o fornecimento de um 20 microorganismo termofílico da invenção ou um microorganismo da invenção com açúcares. Os microorganismos construídos de acordo com a presente invenção são particularmente adequados para alta produção de etanol e produtividade volumétrica em condições ideais de crescimento. Assim, qualquer microorganismo da invenção pode ser usado em qualquer 25 configuração de fermentador, como em processos de lote, de lote alimentado ou de fermentação contínua. Em uma configuração preferida, o processo de fermentação é um processo de lote alimentado.
Um dos principais benefícios do uso de microorganismos como o de bactérias termofílicas para a produção de bioetanol é que, diferentemente das 30 leveduras, estes são capazes de fermentar uma ampla gama de açúcares obtidosa partir de produtos de resíduos de agricultura como as hemiceluloses. Assim, em uma configuração, os açúcares usados nos processos de fermentação da invenção são obtidos a partir da biomassa. Em outra configuração, a fermentação é de açúcares misturados. Em uma configuração específica, os 5 açúcares misturados incluem açúcares de pentose, preferivelmente uma maioria de açúcares de pentose.
Em outra configuração, o processo de fermentação é mantido em equilíbrio redox. Isto é particularmente fundamental com os termófilos já que, diferentemente dos mesófilos, a captação do açúcar parece não ser 10 regulada nesses microorganismos. Preferivelmente, isto é obtido com o uso de sensores de feedback.
Apesar de as bactérias termofílicas terem baixa tolerância ao etanol, isto pode ser superado de forma conveniente nos processos de fermentação da invenção por meio da remoção regular ou continuada do etanol. Isto 15 garante que a concentração de etanol na fermentação seja mantida abaixo da tolerância ao etanol do microorganismo termofílico ou do microorganismo da invenção. O etanol pode ser contínua e convenientemente removido da fermentação em alta temperatura por evaporação ou destilação, como, por . exemplo, evaporação por membrana e/ou vácuo moderado. 20 A invenção será agora descrita com referência às seguintes descrições e figuras sem limitações.
Breve descrição das figuras
As FIGURAS IA até ID mostram o efeito de várias condições em caminhos metabólicos de um microorganismo termofílico, em que o caminho 25 lactato desidrogenase foi inativado. O sombreamento e a espessura das flechas indicam o domínio relativo dos respectivos caminhos metabólicos, sendo que a:
FIGURA A são caminhos metabólicos ativos com pH neutro e na
presença de baixos açúcares. Aqui, domina o caminho piruvato 30 formato liase;FIGURA B são caminhos metabólicos ativos com pH baixo e na presença de baixos açúcares. Aqui, domina um caminho piruvato desidrogenase anaeróbico;
FIGURA C são caminhos metabólicos ativos com baixo pH e na presença de altos açúcares. Aqui, as células passam por stress metabólico e se situam fora do equilíbrio redox, levando à denominada "morte redox"; e a
FIGURA D são caminhos metabólicos ativos nos microorganismos termofílicos da presente invenção, com pH neutro e na presença de altos açúcares. Aqui, o novo caminho PFL-FDH é dominante e o
etanol e o CO2 são os únicos produtos anaeróbicos. A Figura 2 estabelece a seqüência de nucleotídeo do gene fdh sintético produzido por otimização de códon para maximizar a termoestabilidade. A seqüência do DNA do frame de leitura aberta fdh é 15 flanqueada pelo promotor e pelas regiões de terminador (em itálico). As caixas -35 e - do promotor estão sublinhadas.
Para clonar a construção em um vetor adequado, foram introduzidos os sítios Xbal em ambos os lados da seqüência.
A Figura 3 mostra a seqüência de nucleotídeo da Seqüência de 20 Inserção (IS) da Cepa B. stearothermophilus LLD-15. As extremidades de repetição invertida 9 bp são mostradas com letras em negrito.
A Figura 4 é uma representação esquemática do derivado plasmídeo pCR-Fl com extremidades Blunt pCR. O plasmídeo inclui um gene fdhl com códon otimizado sob controle do promotor Idh, clonado no pCR com 25 extremidades Blunt no sítio Xbal exclusivo.
A Figura 5 é uma representação esquemática do derivado pUBllO plasmídeo pUB-ISFl. O plasmídeo inclui um gene fdhl códon otimizado sob controle do promotor Idh, derivado do plasmídeo pCR-Fl e também uma seqüência de inserção (IS) derivada da conhecida cepa Bacillus LLD-15.
A Figura 6 é uma representação esquemática do derivado pUC18plasmídeo denominado pUCK. O plasmídeo inclui um gene de resistência à canamicina clonado a partir do plasmídeo pUB 110 em um sítio de restrição exclusiva Zral no pUC18.
A Figura 7 é uma representação esquemática do derivado pUCK pUCK-LC. O plasmídeo leva um gene Idh com uma deleção de 363 bp no meio do ORF.
A Figura 8 é uma representação esquemática do derivado pUCK pUCK-ldhB. O plasmídeo contém 750 bp do gene Idh, incluindo a região a jusante do gene.
A Figura 9 é uma representação esquemática do plasmídeo pUCK-
F1. Este plasmídeo é um derivado pUCK que incorpora um cassete integrador de gene, contendo o gene fdh sob o controle do promotor Idh.
Descrição da invenção
Materiais
Meios e tampões
Meio LB: Triptona 10 g; Extrato de Levedura 5 g; NaCl 10 g; água deionizada até 1 L
pH ajustado para 7 e autoclavado para esterilizar.
Para o meio de placa, 20 g/l de agar foram adicionados ao meio antes da autoclavagem, resfriado até 55°C e colocados em placas estéreis de Petri (aprox. 20 ml/placa).
Em placas LB-amp, foi adicionada solução de ampicilina filtro-esterilizada até a concentração final de 50 μg /ml antes da colocação nas placas de Petri.
Meio SOC: Triptona 2.0 g; Extrato de Levedura 0,5 g; NaCl 0,05 g;MgCl2.6H20 0,204 g; MgS04.7H20 0,247 g; Glicose 0,36 g; H2O deionizada até 100 ml. Dissolver, ajustar o pH em 7,0 e filtrar esterilizado.
Meio TGP: Triptona 17 g; Peptona de soja 3 g; K2HPO4 2,5 g; NaCl 5 g; piruvato Na 4 g; glicerol 4 ml; água deionizada até 1 L. pH ajustado em 7 e autoclavado para esterilizar. Para meio de placa, foram adicionados 20 g/lde agar no meio antes de autoclavar, resfriado a 5 50C e colocado nas placas de Petri estéreis (aprox. 25 ml/placa).
Para as placas TGP-kan, foi adicionada solução de canamicina filtro-esterilizada até a concentração final de 10 μ§ /ml antes da colocação nas placas de Petri.
Tampão TH: Trealose 272 mM; HEPES (pH 7,5 com KOH) 8 mM; H2O duplo esterilizada até 1 L
Cepas microbianas
Células quimicamente competentes E. coli DH5-alfa foram adquiridas da Invitrogen (Cat. 18265-017).
Coleção de cultura alemã de Bacillus subtilis subesp. Subtilis, DSMZ (DSMNo. 10).
Bacillus stearothermophilus. cepa LLD-R - Depositada como NCIMB 12403.
Bacillus stearothermophilus. cepa LLD-15 - Depositada como
NCIMB 12428.
Plasmídeos
Foram adquiridos o plasmídeo pCR-Blunt e pCR-TOP02 da Invitrogen.
Plasmídeo pUBllO - Bacillus subtilis cepa BD170 alojando esteplasmídeo foi adquirido da coleção de cultura alemã, DSMZ (DSM N0 4514).
O plasmídeo pUC18 foi adquirido da Sigma-Aldrich.
Exemplo 1
Construção de um gene formato desidrogenase sintético (Fig. 2)
Uma seqüência aminoácida (NCBI Protein Database Accession N0P33160 - SEQ. ID. N0 3) de formato desidrogenases Pseudomonas sp 101 foi retro traduzida em seqüência DNA com códons otimizados para Geobacillus thermoglucosidasius. Foram adicionados um promotor e uma região de terminador rho-independente de uma cepa Bacillus, a montante e a jusante da seqüência traduzida, respectivamente (Figura 2). A nova seqüência mostroumenos de 40% de similaridade com as conhecidas seqüências de gene fdh (37% de identidade com o gene fdhl conhecido). Os sítios Xbal foram estabelecidos em ambos os lados da construção para facilitar sua clonagem em vetores adequados. A seqüência desejada foi sintetizada usando o método de Gao et al (ver Xinxin Gao, Peggy Yo, Andrew Keith, Timothy J. Ragan and Thomas K. Harris (2003). Nucleic Acids Research, 31 (22), el43) e clonada em pCR-Blunt em sua posição exclusiva Xbal. O vetor resultante pCR-Fl (Figura 4) foi introduzido nas células alfa DH5 E. coli e os clones positivos foram confirmados por análise PCR e de restrição.
Existem duas estratégias alternativas para inserir e expressareste gene fdh sintético no genoma dos Bacilli alvo, como mostrado nos exemplos a seguir.
Exemplo 2
Inserção do geno, fdh nos múltiplos sítios (IS)
Esta estratégia se aplica às cepas como a cepa Bacillusstearothermophilus LLD-R que contém uma Seqüência de Inserção (IS) que freqüentemente recombina em múltiplos sítios de inserção. Espera-se que o vetor que transporta o gene fdh e esta seqüência IS se integre de maneira estável em uma ou mais dessas locações.
Construção de plasmídeo pUB-ISFl (Figura 5)
Primeiramente, a conhecida Seqüência de Inserção da cepa LLD-R (SEQ. ID. N9 5 e Figura 3) e amplificada por PCR usando um primer para frente (AGTACTGAAATCCGGATTTGATGGCG - SEQ. ID. Ns 6) e um primer reverso (AGTACTGCTAAATTTCCAAGTAGC - SEQ. ID. N2 7) com B. stearothermophilus cepa LLD-15 como modelo. Foram introduzidos sítios de restrição Scal e ambas as extremidades da seqüência. O produto PCR é primeiro clonado em plasmídeo pCR-TC)P02.1 e o plasmídeo pCR-IS resultante é então introduzido em células alfa E.coli DH5 e usado para isolar a região IS por digestão de restrição Seal. O IS isolado é então clonado em pUBllO em seu sítio exclusivo Seat, e o plasmídeo resultante pUB-IS éintroduzido no Bacillus subtilis.
Depois, um fragmento de 1,5 kb contendo o promotor Idh e o gene fdh são digeridos do plasmídeo pCR-Fl usando a enzima de restrição Xbal, e clonado em plasmídeo pTJB-IS que já estava linearizado com a mesma enzima. O plasmídeo resultante pUB-ISFl (Figura 5) é então introduzido no B. subtilis e os clones positivos são selecionados em placas TGP-kan e confirmados por análise PCR e de restrição.
Integração do gene fdh na cepa LLD-R
O plasmídeo pUB-ISFl é então metilado in vitro com enzima 10 . metilase HaeIII, e então a cepa Bacillus stearothermophilus LLD-R ou suas células das cepas com Idh deletado (ver Exemplo 3) são transformadas com o plasmídeo pUB-ISFl metilado. São selecionados os clones positivos após 48 horas em placas TGP-Kan a 50°C, e analisados por amplificação PCR do gene fdh.
O gene fdh é então integrado ao cromossomo pelo crescimento deum clone transformado em meio TGP-Kan a 60 - 65°C por algumas gerações e selecionados em placas TGP-Kan. Os clones positivos são analisados quanto à presença do genQ fdh e então triados para a produção do etanol e da utilização do açúcar C5 (pentose) e C6 (hexose) nos frascos de agitação e em fermentadores.
Exemplo 3
Construção de cepas Idh deletadas.
A primeira etapa é clonar um marcador (kan) de Bacillus resistentes à canomicina e um cassete que transporte o gene Idh da B .stearothermophilus 25 cepa LLD-R no plasmídeo pUC18, que somente pode replicar em microorganismos gram-negativos.
Construção de um vetor de clonagem Bacillus. Plasmídeo pUCK
(Figura 6).
Foi clonado um gene resistente à canamicina (kan) em plasmídeo 30 pUC18 em seu sítio exclusivo Zral, que está fora de qualquer região decodificação e do gene repórter (IacZ) no plasmídeo. Para clonar o gene kan, foi amplificado por PCR um fragmento de 1,13 kb contendo o gene resistente à canamicina com os primers:
Ican-BsZ-F (ACACAGACGTCGGCGATTTGATTCATAC - SEQ. ID. Ns 10), e kan-BsZ-R(CGCCATGACGTCCATGATAATTACrAATACTAGG- SEQ. ID. N9 11) usando plasmídeo pUB 110 como modelo. Os sítios Zral foram introduzidos em ambas as extremidades do gene kan por meio dos primers. O produto PCR foi então digerido com enzima endonuclease de restrição Zral e ligado com o plasmídeo pUC18 previamente digerido Zral e defosforilado. O 10 plasmídeo resultante pUCK (Figura 6) foi então introduzido nas células alfa E. coli DH5. Foram selecionados os clones positivos em placas LB-amp e "confirmados por análise PCR e de restrição.
Construção de plasmídeo pUCK-LC (Fig. 7) que transporta um gene Idh deletado
Um cassete Idh de 1,36 kb foi projetado para conter todo o geneIdh da cepa LLD-R, do qual 363 bp de seu ORF foi deletado mais seus flancos. O cassete foi construído por amplificação PCR das regiões superior e inferior do gene Idh usando a cepa LLD-R como modelo. Essas regiões foram então ligadas e clonadas em plasmídeo pUCK. Os sítios BglII 20 foram introduzidos nos primers internos. A região superior foi amplificada por PCR usando os seguintes primers:
LC-U-Fl (AGGGCAATCTGAAAGGAAGGGAAAATTCC - SEQ. ID. Ns 12) e LC-UB-Rl TGCACAGATCTCCACCAAATCGGCGTC - SEQ. ID. Ns 13).
A região inferior foi amplificada por PCR usando os seguintesprimers:
LC-DB-Fl (TTGAGCAGATCTTGATGCAAAACGATAAC - SEQ. ID. Ns 14) e LC-D-Rl (TAAAGCCGATGAGCAGCAGTTGAAG - SEQ. ID. N9 15).
Os produtos PCR foram digeridos com enzima endonuclease de restrição BglII e ligados usando enzima ligase T4 DNA. Usando o ligado 30 como modelo, o cassete Idh foi então amplificado por PCR usando comoprimers:
LC-UX-F2 (ATATTATCTAGACATrACGGAAATGATAATGGC - SEQ. BD. N916) e LC-DX-R2 (TCACAATCTAGACAATCGGCCATAAAC - SEQ. ID. N5 17).
Os sítios XbaI foram introduzidos em ambas as extremidades do cassete por meio de primers. O produto PCR foi então digerido com enzima Xbal e clonado em plasmídeo pUCK pré-digerido com a mesma enzima e defosforilado. O plasmídeo resultante pUCK-LC foi então introduzido no E. coli DH5 alfa. Os clones positivos foram selecionados em placas LB-amp e confirmados por análise PCR e de restrição.
Construção de cepas Idh deletadas
O plasmídeo pUCK-LC é metilado in vitro com enzima metilase HaeIII e células termófilas do tipo selvagem (ex., cepa LLD-R) são transformadas no plasmídeo metilado por eletroporação (1000 V, 201 ohms, 25 micro-Faraday, e 5 milissegundos). Os clones positivos são selecionados em placas TGP-Kan a 65°C e confirmados como simples eventos cross-over por amplificação PCR do gene kan.
Para obter a deleção do gene por duplo cross-over, os clones positivos são cultivados em meio TGP por algumas gerações (cerca de 5 subculturas) e são selecionados os clones que podem crescer em placas TGP, mas não em placas TGP-kan. Os clones positivos são então confirmados como deleções de gene Idh e pela ausência do gene canamicina por análise PCR. Os clones são então caracterizados para a produção do etanol e a utilização dos Açúcares C5 e C6 em frascos de agitação e em fermentadores.
Exemplo 4
Inserção simultânea do genQ fdh e deleção do gene Idh.
Esta estratégia alternativa é amplamente aplicável a uma ampla classe de microorganismos de fermentação heterolática, assim como a bacilos termofílicos, apesar destes últimos serem usados como ilustração.
Construção de plasmídeo pUCK-LF (Fig. 9)
Um cassete de integração de genes contendo o gene fdh mais todo ogene Idh e cerca de 300 bp de regiões de flanqueamento a montante e a jusante são clonados no plasmídeo pUCK. Nessa construção, os primeiros 450 bp do frame de leitura aberta Idh são substituídos pelo gene fdh, de maneira que a expressão do gene fique sob controle do gene promotor Idh.
Para tanto, um fragmento de DNA com cerca de 750 bpcontendo a região a jusante do gene Idh é amplificada por PCR usando: LDHB-X-Fl (GAACGATTCTAGATACAGCAAGATTCCGC SEQ. ID. Ns 8) e LDHB-E-Rl (GTITGCGAAinrCATAGACGGACGCAG - SEQ. ID. Ns 9) como primers e cepa Bacillus stearothermophilus LLD-R como 10 modelo. Os sítios Xbal e EcoRl são assim introduzidos nas extremidades do fragmento PCR. O fragmento PCR é então digerido e clonado direcionalmente no plasmídeo pUCK, entre os sítios Xbal e EcoRl. O plasmídeo resultante, pUCK-ldhB (Figura 8) é introduzido no E. coli DH5 alfa e clones positivos são selecionados em placas LB-amp e 15 confirmados por PCR e restrição.
Então, um fragmento 1,5 kb contendo o promotor Idh e o gene fdh são digeridos do plasmídeo pCR-Fl usando a enzima de restrição Xbal e clonados no plasmídeo pUCK-ldhB (Figura 8) que já foi linearizado com a mesma enzima. O plasmídeo resultante pUCK-LFl (Figura 9) é introduzido 20 nas células do E.coli DH5 alfa, sendo selecionados clones nas placas LB-Amp. Os clones positivos e a orientação correta da construção são confirmados por análise PCR e de restrição.
Construção de cepas que produzem etanol pelo novo caminho PFL-FDH.
O plasmídeo pUCK-LFl é metilado in vitro com enzima metilaseHaeIII e células alvo do tipo selvagem (por ex. células da cepa LLD-R) são transformadas com o plasmídeo metilado e selecionadas nas placas TGP-Kan a 60°C. Os clones positivos representam simples eventos cross-over e são analisados por amplificação PCR do gene fdh.
Para obter dupla integração cross-over do gene, são selecionados osclones que crescem nas placas TGP, mas não nas placas TGP-Kan. Os clones positivos são então confirmados quanto à presença do gene fdh e à ausência do gene canamicina. Finalmente, os clones são triados para a produção do etanol e a utilização dos açúcares C5 e C6 em frascos de agitação e em 5 fermentadores.
Todas as referências estão incorporadas na totalidade à presente. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA "<110> Bioconversion Technologies Limited <120> Aumento da produção de etanol microbiano 10 <130> P868O6WOOO <150> GB 0605890.3 <151> 24.03.2006 <160> 17
<170> Patentin version 3.3 15 <210> 1 <211> 1170 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> gene sintético fdh <400> 1
atggcaaaag tactttgcgt tctttatgat gatccggtag atggctatcc gaagacgtat 60 gcccgagatg atttaccgaa gatagatcac tatccaggag ggcaaacatt gccgacgccg 120 aaagcaattg acttcacgcc tgggcaattg ttaggaagcg tatctggcga gctgggactt 180 agaaagtatc ttgagtccaa tggacatacg ttagtggtaa ctagcgataa ggatgggcca 240 gactcagtgt ttgaacggga gttagtggat gccgatgttg tcattagtca accgttctgg 300 cctgcatatc ttacgccgga aagaatcgca aaagcgaaga acttgaaact agccctgaca 360 gcaggaattg gaagcgatca tgtggatttg caaagcgcta ttgatcgcaa tgttaccgtg 420 gcagaggtga catattgtaa ttctattagt gtagctgagc atgtggtaat gatgatttta 480 tccttagtta gaaattactt gccgagccac gaatgggctc gtaaaggcgg gtggaatatt 540gcagattgcg tttctcatgc ttatgattta gaggcgatgc atgttggcac ggttgcggcg 600ggacgtatag gcttggcagt cttgcgtcga ctagcaccgt ttgacgttca tttacactat 660actgatcgac atcgtcttcc agagtccgtt gagaaagaac ttaacttaac ctggcatgca 720acgcgtgaag atatgtatcc ggtgtgtgac gtggtaacat tgaattgccc gttacatcct 780gaaactgaac acatgatcaa tgacgaaacg ttgaaactgt ttaaacgagg cgcttatatc 840gtaaacacag ccagagggaa actttgtgat cgggatgctg tagccagagc acttgagagc 900ggacgcttag ccgggtatgc aggcgacgtg tggtttccac aacctgcccc gaaagatcat 960ccgtggagaa cgatgccgta taatggaatg acgccacata tttcaggcac tacgttaaca 1020gcacaagcac gttatgcggc cggcacccgt gaaattcttg agtgcttctt cgaaggccgt 1080ccgatccgag atgaatattt gattgtacaa ggtggcgcat tagctgggac aggagcacat 1140agttatagca aaggcaatgc tacgggaggc 1170
<210> 2 <211>1558 <212> DNA 15 <213> Seqüência artificial ·<220>
<223> gene sintético fdh, incluindo promovedor e terminador <400>2
gcctctagaa gggcaatctg aaaggaaggg aaaattcctt tcggattgtc cttttagtta 60 tttttatggg gagtgaatat tatataggca ttacggaaat gataatggca gagttttttc 120 atttattaga ctgcttgatg taattggatg tgatgataca aaaataatgt tgtgtaaaca 180 aaatgttaac aaaaaagaca aatttcattc atagttgata cttgataaag attgtgaaat 240 aatgcacaat atatcaatgt atgagcagtt tcacaaattc attttttgga aaggatgaca 300 gacagcgatg gcaaaagtac tttgcgttct ttatgatgat ccggtagatg gctatccgaa 360 gacgtatgcc cgagatgatt taccgaagat agatcactat ccaggagggc aaacattgcc 420 gacgccgaaa gcaattgact tcacgcctgg gcaattgtta ggaagcgtat ctggcgagct 480 gggacttaga aagtatcttg agtccaatgg acatacgtta gtggtaacta gcgataagga 540 tgggccagac tcagtgtttg aacgggagtt agtggatgcc gatgttgtca ttagtcaacc 600 gttctggcct gcatatctta cgccggaaag aatcgcaaaa gcgaagaact tgaaactagc 660 cctgacagca ggaattggaa gcgatcatgt ggatttgcaa agcgctattg atcgcaatgt 720taccgtggca gaggtgacat attgtaattc tattagtgta gctgagcatg tggtaatgat 780gattttatcc ttagttagaa attacttgcc gagccacgaa tgggctcgta aaggcgggtg 840gaatattgca gattgcgttt ctcatgctta tgatttagag gcgatgcatg ttggcacggt 900tgcggcggga cgtataggct tggcagtctt gcgtcgacta gcaccgtttg acgttcattt 960acactatact gatcgacatc gtcttccaga gtccgttgag aaagaactta acttaacctg 1020gcatgcaacg cgtgaagata tgtatccggt gtgtgacgtg gtaacattga attgcccgtt 1080acatcctgaa actgaacaca tgatcaatga cgaaacgttg aaactgttta aacgaggcgc 1140ttatatcgta aacacagcca gagggaaact ttgtgatcgg gatgctgtag ccagagcact 1200tgagagcgga cgcttagccg ggtatgcagg cgacgtgtgg tttccacaac ctgccccgaa 1260agatcatccg tggagaacga tgccgtataa tggaatgacg ccacatattt caggcactac 1320gttaacagca caagcacgtt atgcggccgg cacccgtgaa attcttgagt gcttcttcga 1380aggccgtccg atccgagatg aatatttgat tgtacaaggt ggcgcattag ctgggacagg 1440agcacatagt tatagcaaag gcaatgctac gggaggcagc gaggaagcag ctaaatttaa 1500gaaagcggtt taacacagca ggggctgatc ggcccctgtt atgtttcatt ctagagcc 1558
15 <210> 3 <211> 401 <212> PRT
<213> Pseudomonas sp. 101 <400>3
20 Met Ala Lys Val Leu Cys Val Leu Tyr 1 5
Pro Lys Thr Tyr Ala Arg Asp Asp Leu 20 25
Gly Gly Gln Thr Leu Pro Thr Pro Lys 25 35 40
Gln Leu Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu 50 55
Glu Ser Asn Gly His Thr Leu Val Val 65 70
30 Asp Ser Val Phe Glu Arg Glu Leu Val
85
Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Leu Thr 100 105
Asp Asp Pro Val Asp Gly Tyr 10 15
Pro Lys Ile Asp His Tyr Pro 30
Ala Ile Asp Phe Thr Pro Gly 45
Leu Gly Leu Arg Lys Tyr Leu 60
Thr Ser Asp Lys Asp Gly Pro 75 80
Asp Ala Asp Val Val Ile Ser 90 95
Pro Glu Arg Ile Ala Lys Ala 110Lys Asn Leu Lys Leu Ala Leu Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Val 115 120 125
Asp Leu Gln Ser Ala Ile Asp Arg Asn Val Thr Val Ala Glu Val Thr 130 135 140
Tyr Cys Asn Ser Ile Ser Val Ala Glu His Val Val Met Met Ile Leu 145 150 155 160
Ser Leu Val Arg Asn Tyr Leu Pro Ser His Glu Trp Ala Arg Lys Gly 165 170 175
Gly Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Ser His Ala Tyr Asp Leu Glu Ala 10 180 185 190
Met His Val Gly Thr Val Ala Ala Gly Arg Ile Gly Leu Ala Val Leu 195 200 205
Arg Arg Leu Ala Pro Phe Asp Val His Leu His Tyr Thr Asp Arg His 210 215 220
15 Arg Leu Pro Glu Ser Val Glu Lys Glu Leu Asn Leu Thr Trp His Ala 225 230 235 240
Thr Arg Glu Asp Met Tyr Pro Val Cys Asp Val Val Thi- Leu Asn Cys 245 250 255
Pro Leu His Pro Glu Tlir Glu His Met Ile Asn Asp Glu Thr Leu Lys 20 260 265 270
Leu Phe Lys Arg Gly Ala Tyr Ile Val Asn Thr Ala Arg Gly Lys Leu 275 280 285
Cys Asp Arg Asp Ala Val Ala Arg Ala Leu Glu Ser Gly Arg Leu Ala 290 295 300
Gly Tyr Ala Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Lys Asp His 305 310 315 320
Pro Trp Arg Thr Met Pro Tyr Asn Gly Met Thr Pro His Ile Ser Gly 325 330 335
Thr Thr Leu Thr Ala Gln Ala Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Arg Glu Ile 30 340 345 350
Leu Glu Cys Phe Phe Glu Gly Arg Pro Ile Arg Asp Glu Tyr Leu Ile 355 360 365
Val Gln Gly Gly Ala Leu Ala Gly Thr Gly Ala His Ser Tyr Ser Lys 370 375 380
Gly Asn Ala Tlir Gly Gly Ser Glu Glu Ala Ala Lys Phe Lys Lys Ala 385 390 395 400Val
<210> 4 <211> 307 <212> DNA
<213> Cepa Bacillus stearothermophilus LLD-R <400>4 gcctctagaa gggcaatctg aaaggaaggg aaaattcctt tcggattgtc cttttagtta 60 Ittttatggg gagtgaatat tatataggca ttacggaaat gataatggca gagttttttc 120 atttattaga ctgcttgatg taattggatg tgatgataca aaaataatgt tgtgtaaaca 180 aaatgttaac aaaaaagaca aatttcattc atagttgata cttgataaag attgtgaaat 240 aatgcacaat atatcaatgt atgagcagtt tcacaaattc attttttgga aaggatgaca 300 gacagcg 307 <210> 5 <211> 3006 <212> DNA <213> Cepa Bacillus stearothermophilus LLD-R <400> 5 tgtaaattat cactttattt ccgcacaaaa aagactcttt tttgcacatt ccttcggaat 60 atccctctcc ccctttccga aagaatgtgc taaatttttt gtgaattatt tcggaatggg 120 acatgggtga tttccagagg ggggacgagg acgtgattcg gtttcatgac tttcaggtcg 180 atgtccagac atatgcccag cggggaaaac aaaacgactt tccccttctt aagcggtgcc 240 ctcattgcca ggcaaaacgc cctctttatc gccatgggta ctacgaacga aatgccgtga 300 cgtcgcatca gtcttatcgc atttggatcg ctcggtatcg ctgcccggag tgcaggagga 360 CggtggCCgt gttgccttca tttcttctcc cttattttca gtatacgttg cccaccatat 420 ggagagtggt gaaagaacgg ttgggcctga ctccgaaacg ggggatggag gaggctccac 480 tccttcctac ggatgaaggg gttttatttt atgtcccgac gtttattccg aaatttgaac 540 caccttcatt ggttttttgc ggagcgctgg agaaaaattg gtcctgccat cgcccaagcc 600 gagagaacga gccctatggt ggatccagac gatggaggag atcggcctct ttttcgtcat 660 ccaagagata tgggagcacc gatcgacgca tctttttgca cgtacattca gttcctgatt 720 tacttatatc cccttatatg gaatcattta tagattccca aacctttcct ctcgacggtc 780gggggaatga tccgatagga tagagacagg atggaccgat aaggtcctag aatgggatga 840 acgaaggagg agatcgaaat gaatgagtcg atgagacagg agatcgcttt atttcggtat 900 ggattgatcg ctccattggt gaatggacaa gtcgatccaa aacgtacttg aaggaagtag 960 cggaacggat ccatcaagtt ccccaccatg gagagaaacg catcgccgcc aaaacgatcc 1020 tcgactggtg cacgcagtac aaaaaagggg gctttgaggc gctgaagccg aaacgacggt 1080 cggaccgtgg ccattcccgg aggctgtcac ctgaagaaga ggatcacatt ttagccctga 1140 gaaaaaaaca cccccacatg cccgtgacgg tgttttacca acaccttatc gagcaggggg 1200 aaatccaatc catctcttat ttcactatat accgactttt aaaaaaatac aacctcgtgg 1260 ggaaagaaat tttaccgatt cctgaacgaa aacgattcgc gtacgatcag gtcaatgagc 1320 tctggcaagg tgatttgtcc catggcccgt tgattcgcgt gaatggcaaa acgcaaaaaa 1380 cgtttttgat tgcctatatc gatgactgct cgcgggtcgt gccgtacgct cagtttttct 1440 cttccgagaa atttgacggg ttgcggatcg taaccgcgcg gagttaggga tcaccttgat 1500 ccatacccag ccgtacgatc cgcaaagcaa agggaaaatc gaacgatttt tccgcaccgt 1560 acagacgcgg ttttacccgt tgctcgaaat gaattcaccg aagtcgctcg aagagctaaa 1620 cgagcgattt tggaagtggt tggaggaaga ttaccatcga aaaccgcatg cctegttgaa 1680 cgggaagacg ccacatgaag tgtttcaatc gcaagtccat ttggtgtcgt tcgtcgagga 1740 ttcggattgg ctcgactcga tctttttgaa acgcgaatac cgtaaagtga aggccgatgg 1800 tacggtcacg ttgaacaagc agctgtatga agttccgccc cggttcatcg gacaatcgat 1860 cgaactccgt tatgatgaac aaggcgtgta tgtgtacgaa gacggtcaac gggtcgccga 1920 agcggtcctt gttcgcttcg aggacaatgc ctatgtgaaa cgccatcggt caccgtttgc 1980 ggcggttccg gtagagggag gcgaaaacga tgtataaaac gttttattcc ctttcccgag 2040 agccgttttc gaaggagacg aatccaccag aggcttatca aggggcctcg tatcaagagg 2100 ccctcgccgc tttggactac gtgaaacgaa caagagggat cgggctattg atcggtgaac 2160 caggggccgg caagacattc gcccttcggg cgtttaagga atccctgaat ccgtcactgt 2220 atcacgtcgt ttattttcca ttgtcaacgg gaagcgtgat ggacttttat cgcggccttg 2280 ccttcgggct cggggaagag ccgaaatacc gcaaggtcga cttgttttat caaatccaac 2340 aagggatcga gcgcttgtat catgaacaac gggtaacgtc agtgttcatc ctcgatgaaa 2400 tgcatttagc gaaggatgcc tttctgcagg atatcgcgat cctgttcaac tttcacatgg 2460 actcaacaaa tccgtttgtc ttgattttgg CggggCtgCC ccatttacag gcaaaactac 2520 ggttgaatca acaccgtccg cttcaccaac gaateateat gegataccag atggggcctc 2580ttgataagga agaagtggta ggatatatcgacccgatttt taccccagct gccttagaagggatcatcaa caacctcgcc accacttgcctgattgacga agacattgtg cgtatggcaggctgatcggc ccctgttatg tttcatcccgataatgtgca aatgttcgga aataatctgcacattatttc cgaatccgtc cgaaataatttttaca
<210> 6 10 <211> 26 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> prinier 15 <400> 6
agtactgaaa tccggatttg atggcg <210> 7 <211> 24 <212> DNA 20 <213> Seqüência artificial <220>
<223> primer <400>7
agtactgcta aatttccaag tagc 25 <210> 8 <211> 29 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220> 30 <223> primer
aacaccgcct gaaacaggeg ggggcgaaac 2640
cgatcgccct geagtegeag gggtggccgc 2700
tgttatacgg egeteaatta aaaaaacata 2760
ccgaagaaat ggggtactga cacagcaggg 2820
atccatcctc attetagtta ateateegaa 2880
aaaacctgga ataattegea aagattttge 2940
tgaaaaaggg attetgaaat aatgtgctaa 3000
3006
26
24<400> 8
gaacgattct agatacagca agattccgc <210>9 <211>26 <212>DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> primer <400> 9 gtttgcgaat tcatagacgg acgcag <210> 10 <211> 28 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> primer <400> 10
acacagacgt cggcgatttg attcatac <210> 11 <211> 34 <212> DNA
<213> Artificialsequence <220>
<223> primer <400> 11
cgccatgacg tccatgataa ttactaatac tagg <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Seqüência artificial
29
26
28<220>
<223> primer <400> 12
agggcaatct gaaaggaagg gaaaattcc
<210> 13 <211> 27 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> primer <400> 13 tgcacagatc tccaccaaat cggcgtc <210>14 <211> 29 15 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> primer <400> 14 20 ttgagcagat cttgatgcaa aacgataac <210>
<211> 29
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> primer
<400> 14<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> primer
<400> 16
atattatcta gacattacgg aaatgataat ggc <210> 17 <211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> primer <40017
tcacaatcta gacaatcggc cataaac
27
Claims (35)
1. Um microorganismo termofílico sem atividade lactato desidrogenase caracterizado pelo fato de que o microorganismo termofílico contém um gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD.
2. Microorganismo termofílico de acordo com a reivindicação 1, que expressa um piruvato formato liase.
3. Microorganismo termofílico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD está integrado no genoma do microorganismo termofílico.
4. Microorganismo termofílico de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD é expresso a partir de seu próprio promotor ou de um promotor do microorganismo termofílico.
5. Microorganismo termofílico de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD está inserido no gene lactato desidrogenase do microorganismo termofílico, inativando assim a atividade lactato desidrogenase do microorganismo termofílico.
6. Microorganismo termofílico de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD codifica um formato desidrogenase com ligação NAD termoestável.
7. Microorganismo termofílico de qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD compreende a seqüência de nucleotídeo especificada na SED ID N0 1 ou 2.
8. Microorganismo termofílico de qualquer reivindicação anterior que foi transformado com a construção DNA, compreendendo uma seqüência reguladora ligada operacionalmente a um gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD termoestável compreendendo a seqüência denucleotídeo especificada na SEQ. ID. N0 1.
9. Microorganismo termofílico de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, que foi transformado com uma construção DNA, compreendendo um gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD e uma seqüência de inserção, caracterizado pelo fato de que a seqüência de inserção facilita a integração do gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD no genoma do microorganismo termofílico transformado com a construção DNA.
10. Microorganismo termofílico de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, que foi transformado com a construção DNA, compreendendo um gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD ligado operacionalmente a uma região a montante de um gene que codifica um lactato desidrogenase, caracterizado pelo fato de que a região a montante inclui o promotor.
11. Microorganismo termofílico de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a construção DNA também compreende pelo menos parte do gene lactato desidrogenase a jusante do gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD, de maneira que o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD se interpõe entre uma porção suficiente do gene lactato desidrogenase em um dos lados para facilitar a integração do gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD pela recombinação com um gene lactato desidrogenase no genoma do microorganismo termofílico.
12. Microorganismo termofílico de qualquer reivindicação anterior que seja uma bactéria termofílica.
13. Microorganismo termofílico de acordo com a reivindicação 12 que seja do gênero Bacillus.
14. Microorganismo termofílico de acordo com a reivindicação 13 que seja Bacillus stearothermophilus ou Geobacillus thermoglucosidasius.
15. Microorganismo termofílico de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o Bacillus stearothermophilus é obtido a partir da cepa LLD-R ou LLD-15.
16. Gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD termoestável, compreendendo a seqüência de nucleotídeo especificada na SEQ. ID. N0 1.
17. Construção DNA compreendendo uma seqüência reguladora ligada operacionalmente a um gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD termoestável compreendendo a seqüência de nucleotídeo especificada na SEQ. ID. N0 1.
18. Construção DNA de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a seqüência reguladora é um promotor.
19. Construção DNA de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o promotor compreende a seqüência de nucleotídeo especificada na SEQ. ID. N0 4.
20. Construção DNA compreendendo um gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD e uma seqüência de inserção, caracterizado pelo fato de que a seqüência de inserção facilita a integração do gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD no genoma de um microorganismo termofílico transformado com a construção DNA.
21. Construção DNA de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a seqüência de inserção é obtida a partir da cepa Bacillus stearothermophilus LLD-R ou LLD-15.
22. Construção DNA de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a seqüência de inserção compreende a seqüência de nucleotídeoespecificada na SEQ. ID. N0 5.
23. Construção DNA de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a seqüência de inserção é gerada pela amplificação usando primers compreendendo a seqüência de nucleotídeo especificada na SEQ. ID. N0 6 e 7 e a cepa Baeillus stearothermophilus LLD-15 como modelo.
24. Construção DNA compreendendo um gene que codifica um formatodesidrogenase com ligação NAD ligado operacionalmente a uma região a montante de um gene que codifica um lactato desidrogenase, caracterizada pelo fato de que a região a montante inclui o promotor.
25. Construção DNA de acordo com a reivindicação 24 caracterizada pelo 5 fato de que a construção DNA também compreende pelo menos parte do gene lactato desidrogenase a jusante do gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD, de maneira que o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD se interpõe entre uma porção suficiente do gene lactato desidrogenase em um dos lados para facilitar a 10 integração do gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD pela recombinação com um gene lactato desidrogenase no genoma de um microorganismo termofílico.
26. Construção DNA de acordo com qualquer das reivindicações 17 a 25, caracterizada pelo fato de que o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD é um gene que codifica a formato desidrogenase com ligação NAD termoestável.
27. Construção DNA de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o gene que codifica um formato desidrogenase com ligação NAD termoestável compreende a seqüência de nucleotídeo especificada na SEQ.ID. N0 1.
28. Construção DNA de acordo com qualquer das reivindicações 17 a 27, que seja um vetor de expressão.
29. Construção DNA de acordo com qualquer das reivindicações 17 a 28, que seja um plasmídeo.
30. Microorganismo compreendendo uma construção DNA, conforme definida de acordo com uma das reivindicações 17 a 29.
31. Microorganismo de acordo com a reivindicação 30, que seja uma bactéria termofílica.
32. Microorganismo de acordo com a reivindicação 31 que seja do gênero 30 Bacillus.
33. Microorganismo de acordo com a reivindicação 32, que seja Bacillus stearothermophilus ou Geobacillus thermoglucosidasius.
34. Uso de um microorganismo termofílico de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 15 ou um microorganismo como reivindicado de acordo com qualquer das reivindicações 30 a 33 para a produção de etanol.
35. Processo de fermentação para a produção de etanol, compreendendo o fornecimento de um microorganismo termofílico de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 15 ou de um microorganismo de acordo com qualquer das reivindicações 30 a 33 com açúcares.
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