ES2396151T3 - Potenciamiento de la producción de etanol microbiana - Google Patents
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Abstract
Una bacteria termófila del género Bacillus que carece de actividad de lactato deshidrogenasa y que tiene actividadde piruvato formiato liasa, caracterizada porque la bacteria termófila contiene un gen que codifica una formiatodeshidrogenasa ligada a NAD.
Description
Potenciamiento de la producción de etanol microbiana
La presente invención se refiere a procedimientos de fermentación y microorganismos para su uso en ellos y en particular al potenciamiento de la producción de etanol microbiana. Más específicamente, la invención se refiere a la producción de etanol potenciada por bacterias termófilas tales como bacilos de azúcares mixtos derivados de la hidrólisis de biomasa. En particular, la invención prevé una ruta novedosa para la producción de etanol clonando un gen que codifica una enzima formiato deshidrogenasa ligada a NAD en una bacteria termófila del género Bacillus que posee un gen funcional que codifica un complejo de enzimas piruvato-formiato liasa pero que carece de actividad de lactato deshidrogenasa.
El bioetanol se prepara actualmente a partir de glucosa, maltosa o sacarosa derivada de almidón de cereal, caña de azúcar o remolacha azucarera, que todos tienen valor alimenticio. Las celulosas y hemicelulosas forman una parte importante de los subproductos agrícolas y podrían ser, en principio, una fuente importante de bioetanol renovable de bajo coste. Sin embargo, es difícil y caro derivar azúcares fermentables de la celulosa. A diferencia, las hemicelulosas son casi tan abundantes como la celulosa y son fáciles de hidrolizar, pero dan una mezcla de azúcares principalmente pentosa que no pueden fermentar levaduras.
Por este motivo, Hartley (véase la publicación internacional número WO 88/09379) propuso la producción de etanol por mutantes de un bacilo termófilo, que fermenta muy rápidamente todos los azúcares derivados de biomasa, a temperaturas de hasta 70ºC. Sin embargo, sólo se logra un alto rendimiento de etanol por células estresadas y moribundas.
Muchos microorganismos contienen una ruta de piruvato-formiato liasa (PFL) que convierte piruvato en acetil CoA y formiato (Figura 1A). Los microorganismos fermentativos de heterolactato son una de tal clase. Estos microorganismos convierten primero los azúcares de entrada en piruvato (generalmente por la ruta de EMP de glucólisis), que luego pueden tomar muchas rutas para producir lactato, formiato, acetato, etanol y CO2, en diversas proporciones, dependiendo de las condiciones de crecimiento.
En células completamente aerobias, el piruvato es normalmente metabolizado en H2O y CO2 por la ruta de piruvato deshidrogenasa (PDH), ciclo de ácido tri-carboxílico y la cadena de transporte de electrones. Sin embargo, en muchos de estos organismos, particularmente bacilos termófilos, la captación de azúcares y la glucólisis parecen estar sin regular y el lactato es un producto dominante a altas concentraciones de azúcar, incluso bajo condiciones aerobias. Esto sugiere que el flujo de PDH se ha saturado, y que el piruvato en exceso es desviado a una ruta de lactato deshidrogenasa de exceso. Ésta no se usa para el crecimiento, pero produce calor que hace que se eleve la temperatura ambiente y destruya competidores mesófilos, como puede apreciarse cuando césped fresco se pone sobre una pila de compost.
Si el gen ldh (que codifica lactato deshidrogenasa) se inactiva como se describe, por ejemplo, en el documento WO 02/29030, se detiene la producción de lactato y el piruvato es exceso es principalmente desviado a la ruta de PFL ligada al crecimiento (Figura 1A). Sin embargo, a concentraciones de azúcar muy altas y/o a pH ácido, el flujo de la ruta de PFL disminuye y entonces el piruvato en exceso se desborda a una ruta de PDH anaerobia, que sólo da etanol y CO2 (Figura 1B). Por tanto, las condiciones preferidas para obtener altos rendimientos de etanol son aquellas que reducen el flujo por la ruta de PFL y aumentan el flujo por la ruta de PDH (Hartley, B.S. y Shama, G. Proc. Roy. Soc. Lond. 321, 555-568 (1987)). Desafortunadamente, bajo tales condiciones, las células experimentan tensión metabólica, con producción de ATP reducida, y un posible desequilibrio en las relaciones de NAD/NADH y CoA/acetil CoA (Figura 1C).
Se han propuesto diversos protocolos de fermentación para intentar evitar o minimizar este problema tal como el de Hartley, B.S. como se trata anteriormente (véase la publicación internacional número WO 88/09379).
Hay dos clases de formiato deshidrogenasa. Una (codificada por el gen fdhF) convierte formiato en CO2 + H2 y es típica de enterobacterias tales como E. coli. La otra (codificada por el gen fdh1) convierte formiato + NAD en CO2 + NADH2 y está presente en muchos anaerobios facultativos. Berrios-Rivera y col. (Metabolic Engineering 4, 217-219 (2002)) sustituyeron el gen fdhF en E. coli con un gen fdh1 de levadura y encontraron que los productos anaerobios reducidos tales como etanol, lactato y succinato aumentaron con respecto a productos oxidados tales como acetato. Basándose en esta observación, San, K-Y. Berrios-Rivers, S.J. y Bennett, G.N. (véase la publicación internacional número WO 2003/040690) propusieron la introducción de un gen formiato deshidrogenasa ligada a NAD como procedimiento general para aumentar la potencia reductora en células que participaban en un amplio intervalo de bio-transformaciones. Posteriormente, San, K-Y. Bennett, G.N. y Sanchez, A. (solicitud de patente de EE.UU. 2005/0042736 A1) propusieron una aplicación específica de este concepto para la producción de succinato. Estos
estudios se llevaron a cabo en E. coli, un ejemplo de un mesófilo en el que la captación de azúcares está regulada. El fin de estos experimentos fue aumentar los niveles de NADH intracelular de manera que se proporcionara potencia reductora potenciada para las diversas bio-transformaciones.
La formiato deshidrogenasa de levadura recomendada por Sen. y col. (2004) es inactiva a 60ºC, que es la temperatura de crecimiento mínima para las bacterias termófilas potencialmente de uso en la producción de bioetanol. Las formiato deshidrogenasas más termoestables descritas hasta la fecha es la enzima 101 de Pseudomonas sp. (A. Rojkova, A. Galkin, L. Kulakova, A. Serov, P. Savitsky, V. Fedorchuk, V. Tishkov FEBS Letters, volumen 445, número 1, páginas 183-188, 1999).
La presente invención intenta resolver los problemas de producir altos rendimientos de etanol a partir de biomasa. En particular, en el presente documento se ha descrito por primera vez una ruta metabólica novedosa que permite que microorganismos termófilos, especialmente bacterias tales como Bacillus, produzcan rendimientos de etanol máximos. La invención se define en las reivindicaciones.
La invención se basa en bacterias termófilas del género Bacillus que carecen de actividad de lactato deshidrogenasa y, por tanto, requieren una ruta alternativa para la re-oxidación de la NADH en exceso producida por glucólisis. Ésta se proporciona por introducción en las bacterias termófilas del género Bacillus de un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD, tal como un gen fdh1. En microorganismos termófilos, y a diferencia de mesófilos tales como E. coli, la captación de azúcares están sin regular y esto conduce a la acumulación de NADH en presencia de altos niveles de azúcares. Esto conduce eventualmente a un colapso metabólico y a la llamada “muerte rédox” como se muestra esquemáticamente en la Figura 1C. La incorporación en el microorganismo de un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD ayuda a prevenir la muerte celular a altas concentraciones de azúcar conduciendo a una disminución en niveles de NADH y a un aumento en niveles de NAD. Esto es en parte restaurando un flujo por la ruta de piruvato deshidrogenasa (PDH), pero, y lo que es más importante, la inclusión de un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD crea una novedosa ruta de piruvato formiato liasa (PFL)-formiato deshidrogenasa ligada a NAD (FDH) para la producción de etanol. La Figura 1D muestra las posibilidades de esta ruta de PFL-FDH para restaurar el equilibrio rédox convirtiendo todo el piruvato producido por la rápida glucólisis en presencia de altos niveles de azúcar en etanol y CO2, especialmente bajo condiciones de pH neutro. Y, lo que es más importante, la ruta opera en condiciones que son opcionales para el crecimiento celular, conduciendo a la rápida producción de etanol y alto rendimiento, ya que la ruta de PFL es la principal ruta anaerobia ligada al crecimiento en microorganismos termófilos.
Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención proporciona una bacteria termófila del género Bacillus que carece de actividad de lactato deshidrogenasa (ldh), caracterizada porque la bacteria termófila contiene un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD (fdh).
En una realización, el microorganismo carece de actividad de lactato deshidrogenasa en virtud de una deleción de gen apropiada u otra mutación que elimina la actividad de lactato deshidrogenasa. Por tanto, preferentemente el gen ldh está delecionado o de otro modo se ha convertido en no funcional. Los procedimientos de inactivación y deleción de genes son muy conocidos en la técnica y ejemplos preferidos se describen en detalle en el presente documento. Además, cepas conocidas de bacterias que carecen de actividad de lactato deshidrogenasa (tales como TN-T9 depositada bajo el número de acceso NCIMB 41075 y TN-TK depositada bajo el número de acceso NCIMB 41115) pueden ser adecuadas para su uso en la presente invención.
La bacteria termófila de la invención normalmente contiene una ruta de piruvato formiato liasa activa. En particular, el microorganismo comprende preferentemente un gen que codifica una piruvato formiato liasa tal como el gen pf1. Los microorganismos de la invención también contienen normalmente una ruta de piruvato deshidrogenasa (PDH) activa.
En una realización preferida, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD está integrado en el genoma de la bacteria termófila. Sin embargo, también es posible lograr la expresión estable sin la integración, por ejemplo, por introducción de un plásmido adecuado. Un procedimiento preferido de integración es por recombinación. El gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD puede estar operativamente ligado a cualquier elemento regulador adecuado para dirigir la expresión de la formiato deshidrogenasa ligada a NAD. Por “operativamente ligado” se indica que existe un enlace funcional entre el elemento regulador y el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD. Por ejemplo, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD puede ligarse a un promotor adecuado que puede ser, por ejemplo, un promotor constitutivo o inducible. Se entiende que “promotor” en el presente documento incluye una región de ADN que participa en la unión de ARN polimerasa parar iniciar la transcripción.
Normalmente, el promotor es un promotor procariota y, por tanto, incluye las secuencias -10 y -35 apropiadas, las secuencias consenso del cual están bien definidas en la materia. El gen también puede estar operativamente ligado a otras secuencias reguladoras apropiadas tales como, por ejemplo, terminadores. “Terminador” se define como una
secuencia de nucleótidos que produce ARN polimerasa para terminar la transcripción. En una realización, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD se expresa a partir de su propio promotor. En una realización alternativa, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD se expresa a partir de un promotor de la bacteria termófila (debido a la integración en una localización apropiada en el genoma). También pueden preverse construcciones en las que la expresión del gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD es accionada por un promotor extraño. Esto puede hacerse para lograr, por ejemplo, niveles de expresión máximos o expresión inducible. Como un ejemplo, promotores de fago tales como T7 pueden utilizarse conjuntamente con una polimerasa de fago adecuada (que puede proporcionarse en una construcción de ADN separada o la misma).
En una realización particularmente preferida, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD está operativamente ligado a las regiones reguladoras apropiadas de un gen que codifica una lactato deshidrogenasa, en particular las regiones reguladoras en la dirección 5'. La región reguladora comprende preferentemente el promotor de un gen que codifica una lactato deshidrogenasa. Puede entenderse que el promotor incluye como unidad funcional mínima las secuencias -10 y -35 apropiadas. Por tanto, según una realización preferida de la invención, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD se inserta en el gen lactato deshidrogenasa de la bacteria termófila, inactivándose así la actividad de lactato deshidrogenasa de la bacteria termófila. Esta realización es particularmente preferida, ya que ambas modificaciones requeridas para producir una bacteria termófila de la invención se producen en la misma etapa. Construcciones adecuadas para lograr esto se describen en detalle en el presente documento.
La producción de etanol por bacterias termófilas es ventajosa, ya que puede llevarse a cabo a altas temperaturas. Mientras que los microorganismos termófilos tienen menor tolerancia al etanol que las levaduras, el etanol puede eliminarse continuamente y convenientemente de la fermentación a altas temperatura por membrana y/o evaporación a vacío suave. En condiciones anaerobias óptimas de crecimiento, la cepa LLD-R de Bacillus crece muy rápidamente a 70ºC casi exclusivamente por la ruta de PFL (Hartley y Shama, 1982). Puede imaginarse que el crecimiento por la novedosa ruta de PFL-FDH sería igualmente vigoroso, pero la temperatura de crecimiento máxima estaría limitada por la termoestabilidad de la formiato deshidrogenasa ligada a NAD introducida en el microorganismo termófilo. La bacteria termófila de la invención puede incorporar un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termostable y/o un gen cuya secuencia de nucleótidos ha sido optimizada por codones para facilitar la expresión por un microorganismo termófilo. La producción de una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termostable se describe en detalle en el presente documento. En una realización específica, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta como SED ID NO: 1. En otra realización, la bacteria termófila de la invención puede incorporar un gen que está optimizado por codones para la expresión en Bacillus, que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termostable que comprende o que consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 2. Esta secuencia incluye, además de la secuencia de deshidrogenasa ligada a NAD termostable básica, regiones promotoras y terminadoras y también sitios Xba1 para facilitar la clonación del gen en una construcción de ADN adecuada.
El gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD puede ser el gen fdh1. El gen fdh1 puede derivarse de cualquier fuente adecuada y está preferentemente optimizado por codones para la expresión en el microorganismo termófilo relevante.
La bacteria termófila de la invención puede producirse por transformación con cualquiera de las construcciones de ADN de la invención como se describe en más detalle en el presente documento. Por consiguiente, la discusión aquí proporcionada se aplica, cambiando lo que se deba cambiar, a esta realización de la invención.
El microorganismo termófilo de la invención es una bacteria termófila del género Bacillus y más preferentemente Bacillus stearothermophilus. El microorganismo termófilo de la invención puede derivarse de la cepa LLD-R o LLD15 (de Bacillus stearothermophilus) conocida. La bacteria termófila descrita en este documento puede ser Geobacillus thermoglucosidasius.
Los procesos de fermentación facilitados por la presente invención utilizan preferentemente una formiato deshidrogenasa ligada a NAD sintética diseñada para expresar una secuencia de aminoácidos termostable debido al uso de las preferencias de codón del microorganismo termófilo apropiado tal como la cepa LLD-R de Bacillus. El gen sintético contiene preferentemente sitios de restricción manipulados para ayudar en la inserción en el gen lactato deshidrogenasa. De este modo, la deleción de la ruta de LDH y la creación de la ruta de PFL-FDH se consiguen en una única operación. Por consiguiente, en el presente documento se describe una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termostable. Preferentemente, la formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable sigue siendo funcional a
o por debajo de una temperatura de 60ºC. Preferentemente, la enzima termostable está codificada por una secuencia de nucleótidos que ha sido optimizada por codones para la expresión en un microorganismo termófilo. La formiato deshidrogenasa puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en la secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID Nº: 3.
Se ha diseñado una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable específica basándose en la secuencia de aminoácidos de la formiato deshidrogenasa de 101 de Pseudomonas sp (SEC ID Nº: 3) y mediante el uso de
codones optimizados para Geobacillus thermoglucosidasius como se trata en más detalle en la descripción detallada más adelante. El experto apreciará que derivados de esta secuencia básica retendrán la funcionalidad. Por ejemplo, sustituciones conservativas y semi-conservativas pueden producir formiato deshidrogenasas ligadas a NAD termoestables que retienen actividad catalítica y termoestabilidad eficaces de forma que son útiles en la producción de etanol usando microorganismos termófilos. Similarmente, deleciones menores y/o adiciones de aminoácidos pueden producir derivados que retienen la funcionalidad apropiada.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a un gen sintético que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable. El gen comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 1. Esta secuencia representa una secuencia del gen fdh novedosa en la que los codones están optimizados para la producción de una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable. En una realización más específica, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 2. Esta secuencia incorpora la región codificante para la formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable junto con un promotor de Bacillus adecuado y terminador independiente de rho. La secuencia también incorpora sitios de restricción adecuados para ayudar en la clonación, en particular sitios Xba1. El experto apreciará fácilmente que pueden hacerse modificaciones menores a la secuencia de nucleótidos sin alterar la funcionalidad o termoestabilidad de la enzima resultante, por ejemplo, sustituyendo codones optimizados con otros codones que se prefieren en los sistemas de traducción del microorganismo termófilo apropiado.
En el presente documento también se describe una construcción de ADN que contiene un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD, en particular una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable, en la que el gen está flanqueado por sitios de restricción para facilitar la clonación del gen en una construcción de ADN adecuada, tal como un vector de expresión o plásmido.
En un aspecto relacionado, en el presente documento se describe una construcción de ADN que comprende una secuencia reguladora operativamente ligada a un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable. Por tanto, esta construcción de ADN facilita la transformación de bacterias termófilas del género Bacillus, en particular aquellas que carecen de actividad de lactato deshidrogenasa, con el fin de producir microorganismos termófilos que pueden fermentar eficientemente dando rendimientos de etanol máximos. Como se ha mencionado anteriormente, el término “operativamente ligado” como se usa en el presente documento se refiere a un enlace funcional entre la secuencia reguladora y el gen que codifica la formiato deshidrogenasa ligada a NAD, de forma que la secuencia reguladora puede influir en la expresión génica. Por ejemplo, una secuencia reguladora preferida es un promotor. Como se ha mencionado anteriormente, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD puede comprender preferentemente, consistir esencialmente en o consistir en la secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 1. Una secuencia reguladora preferida es un promotor, aunque la construcción de ADN puede incorporar adicionalmente secuencias terminadoras. El promotor puede comprender la secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 4. Otros promotores, como se trata anteriormente, pueden utilizarse para altos niveles y/o expresión inducible.
En el presente documento se describe una construcción de ADN que comprende un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD y una secuencia de inserción, en la que la secuencia de inserción facilita la integración del gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD en el genoma de una bacteria termófila transformada con la construcción de ADN. Por “secuencia de inserción” se indica un elemento de ADN transponible que puede integrarse en el genoma del microorganismo termófilo apropiado. Las secuencias de inserción también pueden denominarse elementos de secuencia de inserción (EI) y pueden producirse naturalmente. La secuencia de inserción puede derivarse de la cepa LLD-R o LLD-15 de Bacillus stearothermophilus.
La secuencia de inserción puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en la secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 5 (Figura 3). La secuencia de inserción preferida puede generarse por amplificación usando cebadores que comprenden, consisten esencialmente en o que consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 6 y 7. En este caso, el ADN genómico de la cepa LLD-15 de Bacillus stearothermophilus conocida puede usarse como molde. Una construcción de ADN particularmente preferida es el plásmido pUB-ISF1 (como se describe en la sección experimental más adelante y en la Figura 5).
En el presente documento se describe una construcción de ADN que comprende un gen (fdh) que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD operativamente ligada a regiones reguladoras apropiadas de un gen que codifica una lactato deshidrogenasa, en particular las regiones reguladoras en la dirección 5'. Las regiones reguladoras preferentemente comprenden el promotor de un gen que codifica una lactato deshidrogenasa (ldh). Puede entenderse que el promotor incluye como unidad funcional mínima las secuencias -10 y -35 apropiadas para permitir la unión de ARN polimerasa eficaz. El promotor del gen lactato deshidrogenasa es adecuado para accionar altos niveles de expresión en bacterias termófilas tales como bacilos y también puede usarse ventajosamente como parte de la estrategia de clonación para lograr tanto la deleción de actividad de lactato deshidrogenasa como la introducción de actividad de formiato deshidrogenasa ligada a NAD en la misma etapa. Por tanto, también puede definirse que la construcción de ADN comprende un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD operativamente ligada a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor de un gen que codifica una lactato deshidrogenasa (ldh).
La construcción de ADN también contiene preferentemente parte de la secuencia codificante del gen lactato deshidrogenasa huésped en la dirección 3' del gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD. Esto facilita la integración del gen en un microorganismo transformado con la construcción de ADN. Por “al menos parte” se indica una parte del gen de longitud suficiente para permitir la integración del gen en el genoma de un microorganismo que contiene el gen lactato deshidrogenasa por recombinación (preferentemente por cruce doble). La parte de la secuencia codificante incorpora preferentemente el extremo del gen lactato deshidrogenasa. Al menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 ó 750 nucleótidos del gen lactato deshidrogenasa pueden incorporarse en la dirección 3' del gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD. Por tanto, la construcción de ADN puede comprender un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD en la que el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD está flanqueado por la secuencia de nucleótidos de un gen que codifica una lactato deshidrogenasa (derivado del microorganismo termófilo de interés). Las secuencias flanqueantes son de longitud suficiente para permitir la integración del gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD en el gen huésped que codifica una lactato deshidrogenasa para de esta forma introducir actividad de formiato deshidrogenasa ligada a NAD e inactivar la actividad de lactato deshidrogenasa en una única etapa de clonación. Preferentemente, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD está flanqueado en la dirección 5' por al menos la región promotora del gen que codifica una lactato deshidrogenasa, de manera que tras la integración por recombinación el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD es operativamente ligado al promotor. La porción en la dirección 3' del gen lactato deshidrogenasa puede ser una obtenible por amplificación del gen ldh usando cebadores que comprenden, consisten esencialmente en o que consisten en la secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 8 y 9, usando la cepa LLD-R como molde. La región flanqueante en la dirección 5' que incorpora preferentemente el promotor ldh comprende preferentemente al menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 ó 750 nucleótidos de las regiones en la dirección 5' de ldh apropiadas para maximizar la eficiencia de integración por recombinación con el genoma del huésped. Esta región en la dirección 5' puede ser dependiente tras el contexto de la secuencia del gen ldh en el microorganismo termófilo específico de interés, como sería fácilmente determinado por un experto habitual. Por tanto, el experto con conocimiento de la secuencia del gen ldh determinaría fácilmente regiones flanqueantes apropiadas para permitir la integración por recombinación. Por ejemplo, pueden estudiarse secuencias genómicas publicadas, reacciones de secuenciación llevadas a cabo o regiones flanqueantes amplificadas por PCR usando cebadores derivados de la secuencia del gen. Por tanto, el gen fdh se interpone entre dos secuencias de nucleótidos derivadas del gen ldh de forma que el gen fdh sustituye, en el marco, al menos parte del gen ldh.
Por tanto, la construcción de ADN generalmente comprende un casete de integración del gen en el que el gen de interés (gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD) se inserta dentro de la secuencia codificante (ORF) de un gen que va a inactivarse durante la integración (gen lactato deshidrogenasa en este caso). Tras la integración mediante recombinación, la expresión del gen de interés está en efecto bajo el control del gen inactivado. Una construcción tal puede ser de aplicabilidad general en la circunstancia en la que un gen necesite inactivarse a favor de la expresión de un gen heterólogo. En una realización preferida, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable. Por tato, la discusión de las formiato deshidrogenasas ligadas a NAD termoestables proporcionadas en el presente documento se aplica, cambiando lo que se deba cambiar, a este aspecto de la invención. En particular, en una realización, el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 1 ó 2. Una construcción de ADN particularmente preferida es el plásmido pUCK-LF1 (como se describe en la sección experimental más adelante y en la Figura 8).
Para todas las construcciones de ADN de la invención, una forma preferida es un vector de expresión. Por tanto, las construcciones de ADN permiten la expresión fidedigna del gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable en una bacteria termófila del género Bacillus transformada con la construcción.
La construcción de ADN puede ser un plásmido. Preferentemente, la construcción de ADN sólo puede replicarse en el microorganismo termófilo huésped mediante recombinación con el genoma del microorganismo termófilo huésped.
Las construcciones de ADN descritas en el presente documento también incorporan preferentemente un gen indicador adecuado como un indicador de transformación satisfactoria. El gen indicador puede ser un gen de resistencia a antibióticos tal como un gen de resistencia a kanamicina o ampicilina. Pueden utilizarse otros indicadores, tales como la proteína fluorescente verde (GFP) y beta-galactosidasa (lacZ), según convenga. Las construcciones de ADN pueden incorporar múltiples genes indicadores, según convenga. La pérdida de la función indicadora es, en generaciones posteriores, indicativa de la integración del gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable, junto con regiones flanqueantes apropiadas.
En todavía otro aspecto, la invención se refiere a una bacteria termófila del género Bacillus que comprende una construcción de ADN de la invención. Microorganismos receptores preferidos son microorganismo fermentativo de heterolactato. En particular, la invención se refiere preferentemente a Bacillus stearothermophilus. La bacteria puede derivarse, por ejemplo, de la cepa LLD-R o LLD-15. El microorganismo termófilo puede ser Geobacillus thermoglucosidasius.
En el presente documento se desvela adicionalmente el uso de una bacteria termófila del género Bacillus de la invención en fermentación, y en particular para la producción de etanol.
Similarmente, la invención se refiere a un proceso de fermentación para la producción de etanol que comprende suministrar a una bacteria termófila del género Bacillus de la invención azúcares. Los microorganismos construidos según la presente invención son particularmente adecuados para el alto rendimiento y productividad volumétrica de etanol bajo condiciones de crecimiento óptimas. Por consiguiente, cualquier microorganismo de la invención puede usarse en cualquier configuración de fermentador tal como procesos de fermentación por lotes, por lotes alimentados o continuos. El proceso de fermentación puede ser un procedimiento por lotes alimentados.
Uno de los principales beneficios del uso de microorganismos tales como bacterias termófilas para producir bioetanol es que, a diferencia de las levaduras, pueden fermentar una amplia gama de azúcares derivados de productos de residuos agrícolas tales como hemicelulosas. Los azúcares usados en los procedimientos de fermentación de la invención pueden derivarse de biomasa. La fermentación puede ser de azúcares mixtos. Los azúcares mixtos pueden incluir azúcares de pentosa, preferentemente una mayoría de azúcares de pentosa.
El proceso de fermentación puede mantenerse en equilibrio rédox. Esto es particularmente crítico con termófilos ya que, a diferencia de los mesófilos, la captación de azúcares parece estar sin regular en estos microorganismos. Preferentemente, esto se logra mediante el uso de sensores de retroalimentación.
Aunque las bacterias termófilas tienen baja tolerancia al etanol, esto puede vencerse convenientemente en los procesos de fermentación de la invención por eliminación regular o continua de etanol. Esto garantiza que la concentración de etanol en la fermentación se mantenga por debajo de la tolerancia del etanol de las bacterias termófilas de la invención. El etanol puede eliminarse continuamente y convenientemente de la fermentación a alta temperatura mediante evaporación o destilación tal como, por ejemplo, evaporación en membrana y/o a vacío suave.
La invención se describirá ahora con referencia a la siguiente descripción no limitante y figuras.
La Figura 1 muestra el efecto de diversas condiciones sobre las rutas metabólicas en un microorganismo termófilo en el que ha sido inactivada la ruta de lactato deshidrogenasa. La sombra y el espesor de las flechas indican la dominancia relativa de las rutas metabólicas respectivas.
A. Rutas metabólicas activas a pH neutro y en presencia de bajos azúcares. Aquí domina la ruta de piruvato formiato liasa.
B. Rutas metabólicas activas a bajo pH y en presencia de bajos azúcares. Aquí domina una ruta de piruvato deshidrogenasa aerobia.
C. Rutas metabólicas activas a bajo pH y en presencia de altos azúcares. Aquí, las células experimentan estrés metabólico y rompen con el equilibrio rédox conduciendo a la llamada “muerte rédox”.
D. Rutas metabólicas activas en microorganismos termófilos de la presente invención, a pH neutro y en presencia de altos azúcares. Aquí, la ruta de PFL-FDH novedosa es dominante y los únicos productos anaerobios son etanol y CO2.
La Figura 2 expone la secuencia de nucleótidos del gen fdh sintético producido por optimización de codones para maximizar la termoestabilidad. La secuencia de ADN del marco de lectura abierto de fdh está flanqueada por regiones promotoras y terminadoras (cursiva). Los recuadros de -35 y -10 del promotor están subrayados. Para clonar la construcción en un vector adecuado, los sitios de Xba1 se introdujeron en ambos lados de la secuencia.
La Figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos de la secuencia de inserción (SI) de la cepa LLD-15 de B. stearothermophilus. Los extremos de repeticiones invertidas de 9 pb se muestran en negrita.
La Figura 4 es una representación esquemática del plásmido derivado de pCR-Blunt pCR-F1. El plásmido incluye un gen fdh1 optimizado por codones bajo el control del promotor ldh, clonado en pCR-Blunt en el único sitio de Xba1.
La Figura 5 es una representación esquemática del plásmido derivado de pUB110 pUB-ISF1. El plásmido incluye un gen fdh1 optimizado por codones bajo el control del promotor ldh, derivado del plásmido pCR-F1, y también una secuencia de inserción (SI) derivada de la cepa LLD-15 de Bacillus conocida.
La Figura 6 es una representación esquemática del plásmido derivado de pUC18 llamado pUCK. El plásmido incluye un gen de resistencia a kanamicina clonado a partir del plásmido pUB110 en el único sitio
de restricción Zra1 en pUC18.
La Figura 7 es una representación esquemática del derivado de pUCK pUCK-LC. El plásmido lleva un gen ldh con una deleción de 363 pb en el centro del ORF.
La Figura 8 es una representación esquemática del derivado de pUCK pUCK-ldhB. El plásmido contiene 750 pb del gen ldh, que incluye la región en la dirección 3' del gen.
La Figura 9 es una representación esquemática del plásmido pUCK-LF1. Este plásmido es un derivado de pUCK que incorpora un casete integrante del gen que contiene el gen fdh bajo el control del promotor de ldh.
Materiales
Medio LB: Triptona 10 g; extracto de levadura 5 g; NaCl 10 g; agua desionizada hasta 1 l
Ajustado a pH 7 y esterilizado en autoclave
Para el medio de la placa, 20 g/l de agar se añadieron al medio antes de la esterilización en autoclave, se
enfriaron a 55ºC y se vertieron en placas de Petri estériles (aprox. 20 ml/placa).
Para placas de LB-amp, disolución de ampicilina esterilizada por filtración a concentración final de 50 µg/ml
se añadió antes de verter las placas de Petri.
Medio SOC: Triptona 2,0 g; extracto de levadura 0,5 g; NaCl 0,05 g; MgCl2·6H2O 0,204 g;
MgSO4·7H2O 0,247 g; glucosa 0,36 g; H2O desionizada hasta 100 ml. Disuelto, ajustado a pH 7,0 y
esterilizado en autoclave.
Medio TGP: Triptona 17 g; peptona de soja 3 g; K2HPO4 2,5 g; NaCl 5 g; piruvato de Na 4 g; glicerol 4 ml;
agua desionizada hasta 1 l. Ajustado a pH 7 y esterilizado en autoclave.
Para el medio de la placa, 20 g/l de agar se añadieron al medio antes de la esterilización en autoclave, se
enfriaron a 55ºC y se vertieron en placas de Petri estériles (aprox. 25 ml/placa).
Para placas de TGP-kan, la disolución de kanamicina esterilizada por filtración a concentración final de 10
µg /ml se añadió antes de verter las placas de Petri.
Tampón TH: Trehalosa 272 mM; HEPES (pH 7,5 con KOH) 8 mM; H2O doblemente destilada hasta 1 l
Células químicamente competentes DH5-alfa de E. coli se compraron de Invitrogen (Cat. 18265-017).
Colección de cultivos alemana de Bacillus subtilis subsp. subtilis, DSMZ (DSM nº 10)
Bacillus stearothermophilus. Cepa LLD-R - Depositada como NCIMB 12403
Bacillus stearothermophilus. Cepa LLD-15 - Depositada como NCIMB 12428
Se obtuvieron plásmido pCR-Blunt y pCR-TOP02 de Invitrogen
Plásmido pUB110 – La cepa BD170 de Bacillus subtilis que aloja este plásmido se obtuvo de la Colección
de cultivos alemana, DSMZ (DSM nº 4514).
El plásmido pUC18 se obtuvo de Sigma-Aldrich.
Ejemplo 1. Construcción de una formiato deshidrogenasa sintética (Fig. 2)
Una secuencia de aminoácidos (nº de acceso de la base de datos de proteínas NCBI P33160 - SEC ID Nº: 3) de formiato deshidrogenasas de 101 de Pseudomonas sp se retrotradujo en la secuencia de ADN con codones optimizados para Geobacillus thermoglucosidasius. Se añadieron una región promotora y terminadora independiente de rho de Bacillus, en la dirección 5' y en la dirección 3' de la secuencia traducida, respectivamente (Figura 2). La secuencia novedosa mostró menos del 40% de similitud con secuencias del gen fdh conocidas (37% de identidad con el gen fdh1 conocido). Se diseñaron sitios Xba1 en ambos lados de la construcción para facilitar su clonación en vectores adecuados.
La secuencia deseada se sintetizó usando el procedimiento de Gao y col. (véase Xinxin Gao, Peggy Yo, Andrew Keith, Timothy J. Ragan y Thomas K. Harris (2003). Nucleic Acids Reseach, 31 (22), e143) y se clonaron en pCR-Blunt en su única posición Xba1. El vector pCR-F1 resultante (Figura 4) se introdujo en células DH5-alfa de E. coli y los clones positivos se confirmaron por PCR y análisis de restricción.
Están disponibles dos estrategias alternativas para insertar y expresar este gen fdh sintético en el genoma de bacilos diana como se muestra en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 2. Inserción del gen fdh en múltiples sitios (SI)
Esta estrategia se aplica a cepas tales como la cepa LLD-R de Bacillus stearothermophilus que contienen una secuencia de inserción (SI) que frecuentemente se recombina en múltiples sitios de inserción. Se espera que un vector que lleva el gen fdh y esta secuencia SI se integre establemente en una o más de tales localizaciones.
Construcción del plásmido pUB-ISF1 (Figura 5)
En primer lugar, la secuencia de inserción conocida de la cepa LLD-R (SEC ID Nº: 5 y Figura 3) se amplifica por PCR usando un cebador directo (AGTACTGAAATCCGGATTTGATGGCG - SEC ID Nº: 6) y un cebador inverso (AGTACTGCTAAATTTCCAAGTAGC - SEC ID Nº: 7) con la cepa LLD-15 de B. stearothermophilus como molde. Los sitios de restricción Sca1 se introducen en ambos extremos de la secuencia. El producto de PCR se clona primero en el plásmido pCR-TOPO2.1 y el plásmido pCR-IS resultante se introduce luego en células DH5-alfa de E. coli y se usa para aislar la región de SI por digestión con restricción de Sca1. Entonces, la SI aislada se clona en pUB110 en su único sitio Sca1 y el plásmido resultante pUB-IS se introduce en Bacillus subtilis.
Entonces, un fragmento de 1,5 kb que contiene el promotor ldh y el gen fdh se digieren a partir del plásmido pCR-F1 usando la enzima de restricción Xba1, y se clona en el plásmido pUB-IS que ya se había linealizado con la misma enzima. Entonces, el plásmido pUB-ISF1 resultante (Figura 5) se introduce en B. subtilis y los clones positivos se seleccionan sobre placas de TGP-kan y se confirman por PCR y análisis de restricción.
Integración del gen fdh en la cepa LLD-R
Entonces, el plásmido pUB-ISF1 se metila in vitro con la enzima metilasa HaeIII y luego la cepa LLD-R de Bacillus stearothermophilus o sus células de cepas delecionadas en ldh (véase el Ejemplo 3) se transforman con el plásmido pUB-ISF1 metilado. Los clones positivos se seleccionan después de 48 horas sobre placas de TGP-kan a 50ºC y se analizan por amplificación por PCR del gen fdh.
Entonces, el gen fdh se integra en el cromosoma cultivando un clon transformado en medio TGP-kan a 60-65ºC para algunas generaciones y seleccionando sobre placas de TGP-kan. Los clones positivos se analizan para la presencia del gen fdh y luego se criban para la producción de etanol y utilización de azúcares C5 (pentosa) y C6 (hexosa) en matraces agitados y fermentadores.
Ejemplo 3. Construcción de cepas delecionadas en ldh
La primera etapa es clonar marcador de resistencia de kanamicina de Bacillus (kan) y un casete que lleva el gen ldh de la cepa LLD-R de B. stearothermophilus en el plásmido pUC18, que sólo puede replicarse en microorganismos Gram-negativos.
Construcción de un vector de clonación de Bacillus. Plásmido pUCK (Figura 6)
Se clonó un gen de resistencia a kanamicina (kan) en el plásmido pUC18 en su único sitio Zra1 que está fuera de cualquier región codificante y del gen indicador (lacZ) en el plásmido. Para clonar el gen kan, un fragmento de 1,13 kb que contiene el gen de resistencia a kanamicina se purificó por PCR con los cebadores:
kan-BsZ-F (ACACAGACGTCGGCGATTTGATTCATAC - SEC ID Nº: 10) y
kan-BsZ-R (CGCCATGACGTCCATGATAATTACTAATACTAGG - SEC ID Nº: 11)
usando el plásmido pUB110 como molde. Los sitios Zra1 se introdujeron en ambos extremos del gen kan mediante los cebadores. Entonces, el producto de PCR se digirió con la enzima endonucleasa de restricción Zra1 y se ligó con el plásmido pUC18 previamente digerido con Zra1 y desfosforilado. Entonces, el plásmido pUCK resultante (Figura 6) se introdujo en células DH5-alfa de E. coli. Se seleccionaron clones positivos sobre placas de LB-amp y se confirmaron por PCR y análisis de restricción.
Construcción del plásmido pUCK-LC (Fig. 7) que lleva un gen ldh delecionado
Se diseñó un casete de ldh de 1,36 kb para contener el gen ldh completo de la cepa LLD-R de la que se delecionaron 363 pb de su ORF más sus flancos. El casete se construyó por amplificación por PCR de las regiones superiores e inferiores del gen ldh usando la cepa LLD-R como molde. Entonces, estas regiones se ligaron y se clonaron en el plásmido pUCK. Los sitios BglII se introdujeron en los cebadores internos. La región superior se amplificó por PCR usando los siguientes cebadores:
LC-U-F1 (AGGGCAATCTGAAAGGAAGGGAAAATTCC -SEC ID Nº: 12) y
LC-UB-R1 TGCACAGATCTCCACCAAATCGGCGTC - SEC ID Nº: 13).
La región inferior se amplificó por PCR usando los siguientes cebadores:
LC-DB-F1 (TTGAGCAGATCTTGATGCAAAACGATAAC -SEC ID Nº: 14) y
LC-D-R1 (TAAAGCCGATGAGCAGCAGTTGAAG - SEC ID Nº: 15).
Los productos de PCR se digirieron con la enzima endonucleasa de restricción BglII y se ligaron usando la enzima T4 ADN ligasa. Usando el ligando como molde, el casete de ldh se amplificó luego por PCR usando como cebadores:
LC-UX-F2 (ATATTATCTAGACATTACGGAAATGATAATGGC - SEC ID Nº: 16) y
LC-DX-R2 (TCACAATCTAGACAATCGGCCATAAAC - SEC ID Nº: 17).
Los sitios XbaI se introdujeron en ambos extremos del casete mediante los cebadores. Entonces, el producto de PCR se digirió con la enzima XbaI y se clonó en el plásmido pUCK previamente digerido con la misma enzima y se desfosforiló. Entonces, el plásmido pUCK-LC resultante se introdujo en DH5-alfa de E. coli. Los clones positivos se seleccionaron sobre placas de LB-amp y se confirmaron por PCR y análisis de restricción.
Construcción de cepas delecionadas en ldh
El plásmido pUCK-LC se metila in vitro con la enzima metilasa HaeIII y células termófilas naturales (por ejemplo, cepa LLD-R) se transforman en el plásmido metilado por electroporación (1000 V, 201 ohmios, 25 micro-faradios y 5 mili-segundos). Se seleccionan clones positivos sobre placas de TGP-kan a 65ºC y se confirman como acontecimientos de cruces individuales por amplificación por PCR del gen kan.
Para lograr la deleción de genes por cruce doble, los clones positivos se cultivan en medio TGP durante algunas generaciones (aproximadamente 5 sub-cultivos) y se seleccionan los clones que pueden cultivarse sobre placas de TGP, pero no sobre placas de TGP-kan. Entonces, los clones positivos se confirman como deleciones del gen ldh y para la ausencia del gen kanamicina por análisis por PCR. Entonces, los clones se caracterizan para la producción de etanol y la utilización de azúcares C5 y C6 en matraces agitados y en fermentadores.
Ejemplo 4. Inserción simultánea del gen fdh y deleción del gen ldh
Esta estrategia alternativa es ampliamente aplicable a una amplia clase de microorganismos fermentativos de heterolactato, además de bacilos termófilos, aunque los últimos se usarán como ilustración.
Construcción del plásmido pUCK-LF (Fig. 9)
Un casete integrante del gen que contiene el gen fdh más el gen ldh completo y aproximadamente 300 pb de regiones flanqueantes en la dirección 5' y en la dirección 3' se clona en el plásmido pUCK. En esta construcción, los primeros 450 pb del marco de lectura abierto de ldh se sustituyen con el gen fdh de tal forma que la expresión génica esté bajo el control del promotor del gen ldh.
Para lograr esto, un fragmento de ADN de aproximadamente 750 pb que contiene la región en la dirección 3' del gen ldh se amplifica por PCR usando; LDHB-X-F1 (GAACGATTCTAGATACAGCAAGATTCCGC - SEC ID Nº: 8) y LDHB-E-R1 (GTTTGCGAATTCATAGACGGACGCAG - SEC ID Nº: 9) como cebadores y la cepa LLD-R de Bacillus stearothermophilus como molde. Por tanto, los sitios Xba1 y EcoR1 se introducen en los extremos del fragmento del PCR. Entonces, el fragmento de PCR se digiere y se clona direccionalmente en el plásmido pUCK entre los sitios Xba1 y EcoR1. El plásmido resultante, pUCK-ldhB (Figura 8) se introduce en DH5-alfa de E. coli y los clones positivos se seleccionan sobre placas de LB-amp y se confirman por PCR y restricción.
Entonces, un fragmento de 1,5 kb que contiene el promotor de ldh y el gen fdh se digieren fuera del plásmido pCR-F1 usando la enzima de restricción Xba1 y se clonan en el plásmido pUCK-ldhB (Figura 8) que ya se había linealizado con la misma enzima. El plásmido pUCK-LF1 resultante (Figura 9) se introduce en células DH5-alfa de E. coli y los clones se seleccionan sobre placas de LB-Amp. Los clones positivos y la orientación correcta de la construcción se confirman por PCR y análisis de restricción.
Construcción de cepas que producen etanol por la novedosa ruta de PFL-FDH
El plásmido pUCK-LF1 se metila in vitro con la enzima metilasa HaeII y células naturales diana (por ejemplo, células de la cepa LLD-R) se transforman con el plásmido metilado y se seleccionan sobre placas de TGP-kan a 60ºC. Los clones positivos representan acontecimientos de cruce individuales y se analizan por amplificación por PCR del gen fdh.
Para lograr la integración de cruce doble se seleccionan clones que se cultivan sobre placas de TGP, pero no sobre placas de TGP-kan. Entonces, los clones positivos se confirman para la presencia del gen fdh y la ausencia del gen kanamicina. Finalmente, los clones se criban para la producción de etanol y la utilización de azúcares C5 y C6 en matraces agitados y en fermentadores.
LISTADO DE SECUENCIAS
5
<110> Bioconversion Technologies Limited
<120> Potenciamiento de la producción de etanol microbiana 10 <130> P86806WO00
<150> GB 0605890.3
<151> 24/03/2006 15 <160> 17
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1 20 <211> 1170
<212> ADN
- <213>
- Secuencia artificial 25 <220>
<223> gen fdh sintético
<400> 1
<210> 2
<211> 1558
<212> ADN
- <213>
- secuencia artificial 5
<220>
<223> gen fdh sintético que incluye promotor y terminador
<400> 2 10
<210> 3 15 <211> 401
<212> PRT
<400> 3 20
<210> 4
5 <211> 307
<212> ADN
<213> Cepa LLD-R de Bacillus stearothermophilus
<400> 4 10
<210> 5
<211> 3006
<212> ADN
<213> Cepa LLD-R de Bacillus stearothermophilus
<400> 5
<210> 6
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 6 agtactgaaa tccggatttg atggcg 26
<210> 7
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 7 agtactgcta aatttccaag tagc 24
<210> 8
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 8 gaacgattct agatacagca agattccgc 29
<210> 9
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 9 gtttgcgaat tcatagacgg acgcag 26
<210> 10
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 10
acacagacgt cggcgatttg attcatac 28
<210> 11
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 11
cgccatgacg tccatgataa ttactaatac tagg 34
<210> 12
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 12
agggcaatct gaaaggaagg gaaaattcc 29
<210> 13
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 13
tgcacagatc tccaccaaat cggcgtc 27
<210> 14
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 14
ttgagcagat cttgatgcaa aacgataac 29
<210> 15
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 15 taaagccgat gagcagcagt tgaag 25
<210> 16
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
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<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 17 tcacaatcta gacaatcggc cataaac 27
Claims (13)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Una bacteria termófila del género Bacillus que carece de actividad de lactato deshidrogenasa y que tiene actividad de piruvato formiato liasa, caracterizada porque la bacteria termófila contiene un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD.
-
- 2.
- La bacteria termófila de la reivindicación 1, en la que el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD está integrado en el genoma de la bacteria termófila.
-
- 3.
- La bacteria termófila de la reivindicación 1 ó 2, en la que el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD se expresa a partir de su propio promotor o a partir de un promotor de la bacteria termófila.
-
- 4.
- La bacteria termófila de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD se inserta en el gen lactato deshidrogenasa de la bacteria termófila, inactivándose así la actividad de lactato deshidrogenasa de la bacteria termófila.
-
- 5.
- La bacteria termófila de cualquier reivindicación precedente, en la que el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD comprende la secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 1 ó 2.
-
- 6.
- La bacteria termófila de cualquier reivindicación precedente que ha sido transformada con una construcción de ADN que comprende un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD operativamente ligado a una región en la dirección 5' de un gen que codifica una lactato deshidrogenasa, en la que la región en la dirección 5' incluye el promotor y que comprende además al menos parte del gen lactato deshidrogenasa en la dirección 3' del gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD de forma que el gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD está interpuesto entre una porción suficiente del gen lactato deshidrogenasa sobre cualquier lado para facilitar la integración del gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD por recombinación con un gen lactato deshidrogenasa en el genoma de la bacteria termófila.
-
- 7.
- Un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 1.
-
- 8.
- Una construcción de ADN que comprende una secuencia reguladora operativamente ligada a un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 1.
-
- 9.
- Una construcción de ADN que comprende un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD, opcionalmente una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable, y un elemento de ADN transponible que puede integrarse en el genoma de una bacteria termófila del género Bacillus que facilita la integración del gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD en el genoma de la bacteria termófila transformado con la construcción de ADN.
-
- 10.
- Una construcción de ADN que comprende un gen que codifica una formiato deshidrogenasa ligada a NAD, opcionalmente una formiato deshidrogenasa ligada a NAD termoestable, operativamente ligado a una región en la dirección 5' de un gen que codifica una lactato deshidrogenasa, en la que la región en la dirección 5' incluye el promotor.
-
- 11.
- Una bacteria termófila del género Bacillus que comprende la construcción de ADN como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.
-
- 12.
- Uso de una bacteria termófila como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o según la reivindicación 11 para la producción de etanol.
-
- 13.
- Un proceso de fermentación para la producción de etanol que comprende suministrar una bacteria termófila como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o según la reivindicación 11 con azúcares.
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